univerza v ljubljani - ffa.uni-lj.si · comparison of one and two step determination of ......

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

DUNJA RUSTJA

PRIMERJAVA ENOSTOPENJSKEGA IN DVOSTOPENJSKEGA DOLOČANJA KONCENTRACIJE KRVOTVORNIH MATIČNIH CELIC PO ISHAGE

PROTOKOLU

COMPARISON OF ONE AND TWO STEP DETERMINATION OF HAEMATOPOIETIC STEM CELLS CONCENTRATIONS BY ISHAGE

PROTOCOL

DIPLOMSKA NALOGA

Ljubljana, 2009

Diplomsko nalogo sem opravljala v Specializiranem laboratoriju Kliničnega oddelka za hematologijo v Ljubljani, pod vodstvom doc.dr. Uroša Mlakarja, dr.med. in somentorstvom doc.dr. Helene Podgornik, spec.med.biok. Vrednosti enostopenjske in dvostopenjske metode za določevanje števila KMC, ter statistično vrednotenje so opravili v Specializiranem hematološkem laboratoriju v Ljubljani.

Zahvaljujem se doc.dr. Urošu Mlakarju, dr.med. in doc.dr. Heleni Podgornik, spec.med.biok. za strokovno pomoč in nasvete pri nastajanju diplomske naloge. Posebna zahvala gre tudi Darji Žontar, Ivanki Nerad in Alenki Babnik, ki so mi pomagale pri določanju absolutnega števila KMC.

Največja zahvala pa gre mojima staršema, ki sta mi vedno stala ob strani, me podpirala in vse skozi verjela vame.

.

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom doc. dr. Uroša Mlakarja dr. med. in somentorstvom doc. dr. Helene Podgornik, spec.med.biok.

Ljubljana, november 2009

Predsednik diplomske komisije: izr. prof. dr. Darko Černe, mag. farm., spec. med. biokem. Član diplomske komisije: doc. dr. Mitja Kos, mag. farm.

I. POVZETEK ..................................................................................................................... 5

II. SEZNAM OKRAJŠAV.................................................................................................. 6

1. UVOD ............................................................................................................................... 8

1.1. KRVOTVORNE MATIČNE CELICE....................................................................... 8 1.2. BOLEZNI, NASTALE ZARADI OKVARE KRVOTVORNIH MATIČNIH CELIC......................................................................................................................................... 10 1.3. ZDRAVLJENJE S KRVOTVORNIMI MATIČNIMI CELICAMI ......................... 11 1.4. NAČINI ZBIRANJA KRVOTVOTRNIH MATIČNIH CELIC............................... 12

1.4.2. KARDIOLOŠKI BOLNIKI................................................................................. 14 1.5. DOLOČANJE ŠTEVILA CD34 CELIC+ ................................................................ 15

1.5.2. DOLOČANJE CELIC CD34 Z ENOSTOPENJSKO IN DVOSTOPENJSKO METODO

+

.................................................................................................................... 15 1.5.3. RAZVOJ METOD ZA ŠTETJE CELIC CD34+.................................................. 17 1.5.4. ISHAGE PROTOKOL ....................................................................................... 18 1.5.5. KVALITATIVNI NADZOR IN STANDARDIZACIJA CITOMETRIČNEGA ŠTETJA CELIC CD34+ ............................................................................................... 21 1.5.6. KLINIČNA UPORABNOST ŠTETJA CELIC CD34+ ........................................ 22

1.6. VALIDACIJA S STRANI PROIZVAJALCA.......................................................... 23 1.7. PRETOČNA CITOMETRIJA ................................................................................. 24

1.7.1. PRIKAZ REZULTATOV PRETOČNE CITOMETRIJE..................................... 26

2. NAMEN DELA.............................................................................................................. 28

3. PREISKOVANCI IN METODE DELA...................................................................... 29

3.1. PREISKOVANCI ..................................................................................................... 29 3.2. POSTOPEK DOLOČANJA KRVOTVORNIH MATIČNIH CELIC ...................... 29

3.2.1. VZOREC ............................................................................................................ 29 3.2.2. ODVZEM IN DOSTAVA VZORCA ................................................................... 30 3.2.3. PRINCIP DOLOČANJA.................................................................................... 30 3.2.4. REAGENTI, KALIBRATORJI, KONTROLE ..................................................... 30 3.2.5. INSTRUMENTI IN OPREMA............................................................................ 32 3.2.6. DELOVNI POSTOPEK ..................................................................................... 32 Označimo tri epruvete: ................................................................................................ 32 3.2.7. KONTROLA KAKOVOSTI ................................................................................ 33 3.2.8. ODČITAVANJE REZULTATOV S PRETOČNIM CITOMETROM .................. 34

3.2.8.1. Določanje v venski krvi in koncentratu po citoferezi................................. 34 3.2.8.2. Določanje števila krvotvornih matičnih celic po pozitivni selekciji z Isolexom .................................................................................................................. 34 3.2.8.3. Določanje matičnih celic v pozitivnih kontrolah in mednarodnih kontrolah kakovosti.................................................................................................................. 34

3.2.9. PODAJANJE REZULTATOV............................................................................ 34 3.3. STATISTIČNA ANALIZA REZULTATOV........................................................... 35

4. REZULTATI.................................................................................................................. 37

4.1. VPLIV NEKATERIH SPREMENLJIVK NA DOLOČITEV CELIC CD34+ .......... 37 4.1.1. PRIMERJAVA SREDSTEV ZA LIZIRANJE CELIC.......................................... 37 4.1.2. ČASOVNA STABILNOST VZORCA .................................................................. 38 4.1.3. VPLIV REDČITVE VZORCA ........................................................................... 39

4.2. PRIMERJAVA MED ENOSTOPENJSKO IN DVOSTOPENJSKO METODO..... 40

5. RAZPRAVA................................................................................................................... 47

5.1. OCENA VPLIVA NEKATERIH SPREMENLJIVK NA ŠTEVILČNO

KONCENTRACIJO KMC .............................................................................................. 47 5.2. PRIMERJAVA ENOSTOPENJSKE IN DVOSTOPENJSKE METODE................ 48

6. SKLEPI .......................................................................................................................... 50

7. LITERATURA .............................................................................................................. 51

Rustja D. Primerjava enostopenjskega in dvostopenjskega določanja koncentracije krvotvornih …. Dipl. naloga.Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Lab. biomedicina, 2009

5

I. POVZETEK

Absolutno število CD34 pozitivnih celic (CD34+) je pomemben podatek za bolnike in

darovalce, ki zbirajo krvotvorne matične celice (KMC). Ta rezultat je ključen za odločitev,

če lahko bolnik ali darovalec začne z zbiranjem KMC oziroma ali je zbral dovolj CD34+

celic za postopek presaditve.

Cilj diplomske naloge je bil, da primerjamo dve metodi določanja absolutnega števila celic

CD34+. V praksi uporabljamo dvostopenjsko metodo, imenovano tudi metoda z dvojno

platformo, ki smo jo primerjali z enostopenjsko (imenovano tudi metoda z eno platformo).

V analizo smo vključili 418 rezultatov določanja KMC. Glede na izvor vzorcev smo

rezultate razdelili v štiri skupine: hematološki bolniki (70), kardiološki bolniki (8),

darovalci (15) in popkovnična kri (183). Rezultatov vzorcev kardioloških bolnikov in

darovalcev nismo ločeno statistično analizirali zaradi premajhnega števila preiskovancev.

Smo pa dodatno ločeno analizirali rezultate vzorcev, ki so bili odvzeti pred zbiranjem

KMC in po njem (koncentrat celic CD34+).

Rezultati statistične analize so pokazali, da sta enostopenjska in dvostopenjska metoda

primerljivi in med njima ni večjih odstopanj, ne glede na izvor vzorcev in ne glede na to,

ali gre za vensko kri oziroma koncentrat

Glede na rezultate bi enostopenjsko metodo lahko vpeljali v vsakdanje določanje

absolutnega števila celic CD34+. Zamenjala bi dvostopenjsko metodo, pri kateri je

potrebna uporaba dveh različnih analizatorjev, zaradi uporabe več parametrov v končnem

izračunu pa vključuje tudi večjo možnost napake.


6

II. SEZNAM OKRAJŠAV

Abs. št. - absolutno število

7-AAD - Amino Aktinomicin D

CD - cluster of differentiation

CPD - citrat - fosfat - dekstroza

CR (1, 2, 3) - popolna remisija bolezni (prva, druga, tretja)

DNA - deoksiribonukleinska kislina

FITC - fluorescein-izo-tiocianat

FS - Forward Scatter (direktna svetloba)

Izoklonska kontrola - negativna kontrola, s katero eliminiramo nespecifično fluorescenco

HLA - humani levkocitni antigeni

K-EDTA - kalijeva sol etil - diamin - tetraocetne kisline

KM - kostni mozeg

KMC - krvotvorne matične celice

KV- koficient variacije

Me - mediana

mPt - monoklonsko protitelo

NHL - ne-Hodgkinov limfom

PBS - puferirana fiziološka raztopina

PE - fikoeritrin


7

RNA - ribonulkeinska kislina

SHL - Specializirani hematološki laboratorij

SS - Side Scatter (sipana svetloba pod kotom 90º)


8

1. UVOD

1.1. KRVOTVORNE MATIČNE CELICE

Krvne celice nastanejo iz krvotvornih matičnih celic. Pri človeku nastajajo krvne celice v

krvotvornem ali hematopoetskem tkivu. Pri odraslem človeku sta to rdeči kostni mozeg in

limfatično tkivo. V kostnem mozgu nastajajo eritrociti, granulociti, monociti,

megakariociti in limfociti. Kostni mozeg je v kosteh že v petem fetalnem mesecu. Rdeči

kostni mozeg je v vseh kosteh že ob rojstvu, po četrtem letu pa ga začne nadomeščati

rumeni kostni mozeg, ki ga tvorijo predvsem maščobne celice. Pri zdravem odraslem

človeku je rdeči kostni mozeg v vretencih, rebrih, lobanji, medenici in proksimalnih

epifizah stegnenic in nadlahtnic. Rdeči kostni mozeg se nahaja med trabekulami

spongioze. Krvotvorne celice ležijo v mrežju opornega tkiva in žil. Oporno tkivo tvorijo

retikulinska vlakna in retikulumske celice. Kapilarno mrežje v kostnem mozgu tvori

sinusoide, prek katerih prestopajo dozorele krvne celice v kri. Te strukture tvorijo

hematopoetsko mikro okolje, ki omogoča proliferacijo in diferenciacijo krvotvone matične

celice (KMC). Vse celice nastajajo v kostnem mozgu iz matičnih celic, ki jih morfološko

ne moremo prepoznati. Glede na izsledke kultiviranja celic kostnega mozga v gojiščih in

po nekaterih spremembah pri posameznih boleznih, predvsem levkemijah, lahko sklepamo

o njihovem obstoju in lastnostih (1).


9

Slika 1.: Histološka slika kostnega mozga

KMC so nespecializirane celice, ki so sposobne samoobnove, se delijo in imajo sposobnost

diferenciacije v krvne celice in celice imunskega sistema ter v možganske celice,

hepatocite, mišične celice ali celice endotelija. Nahajajo se predvsem v kostnem mozgu. V

periferni krvi je prisotnih zelo malo matičnih celic, v popkovnični pa več (2).

Slika 2: Mikroskopska slika krvotvornih matičnih celic


10

Osnovna matična celica je pluripotentna. Z delitvijo se obnavlja, istočasno pa dozoreva v

multipotentno. Poznamo dve vrsti multipotentnih matičnih celic: v mieloično in limfatično

vrsto usmerjene matične celice. Obe sta sposobni samoobnove in dozorevanja v usmerjene

matične celice. Multipotentna matična celica mieloične vrste dozoreva v usmerjene

matične celice rdeče vrste, eozinofilne, bazofilne, megakariocitno - trombocitne in

nevtrofilno - monocitne vrste. Iz teh celic se po več zaporednih delitvah in z dozorevanjem

razvijejo zrele krvne celice, ki se nato izplavljajo v kri. Iz multipotentne matične celice

limfatične vrste se v limfatičnem tkivu oziroma kostnem mozgu razvijejo limfociti vrste B

in T ter plazmatke. Nastajanje novih in nadomeščanje propadlih krvnih celic je natančno

uravnano. Delitev in dozorevanje pluripotentne, multipotentne in usmerjene matične celice

ter dozorevanje že diferenciranih krvotvornih celic uravnava vrsta humoralnih dejavnikov.

Imenujemo jih citokini. Na zorenje celic kostnega mozga vplivajo še drugi dejavniki:

interlevkini ter interferoni, ki spodbujajo ali zavirajo zorenje krvnih celic (1).

1.2. BOLEZNI, NASTALE ZARADI OKVARE KRVOTVORNIH MATIČNIH

CELIC

Bolezni, ki lahko nastanejo zaradi okvare KMC, delimo glede na osnovni patogenetski

mehanizem na poliklonske in monoklonske. Poliklonske bolezni so posledica okvare KMC

iz različnih vzrokov. Klonske bolezni KMC pa so posledica razmnoževanja klona

bolezensko spremenjenih celic, potomk ene matične celice.

Poliklonski bolezni sta:

- aplastična anemija

- čista aplastična anemija

Klonske bolezni so:

- akutne in kronične levkemije

- mielodisplastični sindrom

- kronične mieloproliferativne bolezni

- paroksizmalna nočna hemoglobinurija (1)


11

1.3. ZDRAVLJENJE S KRVOTVORNIMI MATIČNIMI CELICAMI

KMC lahko zberemo iz kostnega mozga ali venske krvi, nato pa njihovo številčno

koncentracijo določimo s pomočjo značilnih označevalcev. Celični označevalci so

določene površinske molekule, ki jih imenujemo molekule CD (3). Za KMC sta

najznačilnejša celična označevalca CD34/CD45 (2). Te celice nato uporabljamo za

zdravljenje.

Matične celice z enako sposobnostjo rasti in diferenciacije lahko shranjujemo v tekočem

dušiku na –196 0C, za več desetletij. To metodo shranjevanja imenujemo kriogensko

shranjevanje in pri njem z nizko temperaturo zaustavimo vse biokemične procese, ki bi

sicer povzročili staranje ali poškodovanje celic (10).

Princip delovanja matičnih celic je v njihovi sposobnosti, da nadomestijo maligno

spremenjene celice:

- Rakave celice predhodno uničimo (npr. kemoterapija, obsevanje), s presaditvijo pa

zdrave celice nadomestijo odstranjene celice;

- Potomci presajenih matičnih celic (limfociti) lahko učinkujejo na maligno

spremenjene celice in jih dodatno odstranijo (4).

Poznamo dva načina presaditve KMC in sicer avtologno in alogenično presaditev KMC.

Pri avtologni presaditvi v najprimernejšem obdobju zdravljenja odvzamemo bolnikove

lastne KMC, ki jih lahko zberemo iz periferne krvi ali kostnega mozga. Pri alogenični

presaditvi je dajalec KMC oseba, ki je z bolnikom skladna v sistemu tkivnih humanih

levkocitnih antigenov (HLA) (5).

Darovalec KMC je lahko vsaka zdrava oseba, ki izpolnjuje pogoje darovalca in se vpiše v

register darovalcev. Darovalci so lahko ožji sorodniki, če pa med družinskimi člani ni

ustreznega darovalca, pride v poštev presaditev KMC, ki jih daruje darovalec, ki ni v

sorodu s prejemnikom. Darovalec se mora v antigenih HLA ujemati z bolnikom, kar

pomeni, da morajo biti izsledki tipizacij preiskovanih genskih zapisov za antigene HLA A,

B in DR pri obeh enaki. Če izbiramo med več enakovrednimi kandidati, upoštevamo

starost in včasih spol možnih darovalcev (6).


12

Bolezni, ki jih zdravimo z alogenično presaditvijo KMC (1)

- akutna mieloična levkemija: popolna remisija 1 (CR1), CR2, CR3, začetna

ponovitev bolezni

- akutna limfoblastna levkemija: CR1 (če so prisotni neugodni napovedni dejavniki),

CR2, začetna ponovitev

- kronična mieloična levkemija: kronično obdobje, preobrazba bolezni

- visoko maligni NHL (ne-Hodkinov limfom): CR1

- Hodgkinova bolezen: CR1, CR2

- mielodisplastični sindrom: napredovana obdobja bolezni

- aplastična anemija: huda oblika bolezni pri bolnikih do 45. leta starosti

Bolezni, ki jih zdravimo z avtologno presaditvijo KMC

- akutna mieloična levkemija: CR1, CR2, CR3

- akutna limfoblastna levkemija: CR2, začetna ponovitev bolezni

- nekateri nizko maligni NHL

- visoko maligni NHL: CR1, CR2, CR3

- Hodgkinova bolezen: CR2, CR3, začetna ponovitev

- diseminirani plazmocitom

1.4. NAČINI ZBIRANJA KRVOTVOTRNIH MATIČNIH CELIC

KMC najpogosteje zbiramo iz venske krvi, lahko pa tudi iz kostnega mozga, kadar je

izplavljanje matičnih celic v vensko kri premajhno (7). Osamimo jih tako, da z levkoferezo

ločujemo mononuklearne celice od ostalih celic venske krvi. Število KMC ocenjujemo

imunofenotipsko, to je na podlagi CD34+, lahko pa tudi na podlagi njihovega

proliferativega potenciala, z določanjem števila granulocitno-makrofagnih kolonij, ki

rastejo na gojišču. Pred zbiranjem se koncentracijo KMC poveča z dajanjem krvotvornih

rastnih dejavnikov. Tako dosežemo zadostno število celic za zbiranje. Odmerek

mononuklearnih celic pri presaditvi mora vsebovati od 1,0x106 do 5,0x106 CD34+/kg

telesne mase prejemnika. Število zbranih celic CD34+ naj bi bilo sorazmerno njihovi

koncentraciji v krvi bolnika/darovalca pred levkoferezo (8). Pred predvidenim zbiranjem

določamo število matičnih celic v popkovnični krvi, punktatu kostnega mozga ali v venski

krvi. Za KMC sta značilna antigena CD34 in CD45. Ko je število levkocitov najmanj


13

3.0x109/L, lahko začnemo določati delež matičnih celic. Iz števila levkocitov in dobljenega

deleža (%) izračunamo absolutno število matičnih celic, ki mora biti vsaj 20x106/L, da

začnemo z levkoferezo. Včasih zadostuje že ena levkofereza, včasih pa je potrebno

postopek dvakrat ali trikrat ponoviti (7).

Slika 3: Klasičen odvzem kostnega mozga

Preiskava kostnega mozga je zelo pomembna preiskava v klinični hematologiji, ki jo lahko

opravimo ambulantno. S punkcijo kostnega mozga dobimo vzorec tkiva za citološko

analizo. Kostni mozeg se punktira v predelu zadnjega črevničnega trna ali redkeje iz

prsnice pri odraslih, pri otrocih pa tik pod pogačico. Vsrkano vsebino izbrizgamo na urno

stekelce, kjer je nekaj kapljic sredstva proti strjevanju krvi. Nato poiščemo delce tkiva in

jih s krovnim stekelcem prenesemo na objektno stekelce in naredimo stisnjenec s pomočjo

drugega objektnega stekelca. Stisnjenec kostnega mozga je nepogrešljiv za zanesljivo

oceno sprememb (1).


14

1.4.1. POPKOVNIČNA KRI

Popkovnična kri je bogat vir KMC, ki se po presaditvi naselijo v kostnem mozgu in

pričnejo tvoriti krvne celice (9). KMC, odvzete v zgodnjih stadijih razvoja, imajo večjo

možnost samoobnove. Pri njih obstaja tudi manjša verjetnost, da bi jih imunski sistem

zavrnil, zato so bolj uporabne za terapevtsko presaditev (2). Spremenljivke, ki vplivajo na

količino, kakovost in skupinsko sestavo matičnih celic, pridobljenih iz popkovnične krvi,

so:

- starost porodnice (mlajša kot je porodnica več je matičnih celic)

- koncentracija celic se manjša s številom rojenih otrok

- teža novorojenčka (pri težjih novorojenčkih naj bi bilo v popkovnični krvi več

matičnih celic)

- popkovnična kri je najbolj bogata z matičnimi celicami v 39. in 40. tednu

nosečnosti (4)

Glavna pomanjkljivost popkovnične krvi je, da količina KMC večinoma zadostuje za

presajanje le pri otrocih. Popkovnično kri lahko uporabljamo za zdravljenje bolezni z

alogenično in avtologno presaditvijo. Odvzem popkovnične krvi se izvaja neposredno po

porodu, ko se popkovnica prereže in preneha utripati (9).

1.4.2. KARDIOLOŠKI BOLNIKI

Avtologne KMC zaenkrat predvsem v raziskovalne namene presajajo v srce bolnikov z

napredovanim srčnim popuščanjem. Celice srčne mišice imajo ob poškodbi omejeno

sposobnost obnavljanja, kar privede do zmanjšane krčljivosti srčne mišice in srčnega

popuščanja. Nasprotno pa imajo KMC zelo veliko sposobnost obnavljanja in razvijanja v

različne tipe somatskih celic. Učinki presaditve matičnih celic v srčno mišico temeljijo na

spreminjanju v specialne celice, razvoju ožilja in izločanju hormonov. Pri presajanju

uporabljamo KMC iz periferne krvi. Za njihovo zadostno količino v periferni krvi

spodbujamo kostni mozeg s citokinom, ki je rekombinanten dejavnik za pospešitev

nastanka in dozorevanja granulocitov. Spodbujanje poteka štiri dni, peti dan pa je raven

KMC v periferni krvi tudi do štiridesetkrat večja od začetne. Za zbiranje se odločimo na

podlagi števila CD34 pozitivnih celic v krvi. KMC zbiramo z levkoferezo. Z odvzemom


15

matičnih celic iz 1,5-2-kratnega volumna krvi zberemo do 80 % CD34+ celic v krvnem

obtoku. Ko z levkoferezo enojedrne celice zberemo, jih z aparatom za imunomagnetno

selekcijo, npr. Isolex, očistimo preostalih celic. S tem postopkom postopno pridobimo

suspenzijo CD34 pozitivnih celic, ki se lahko vbrizga v venčne arterije ali skozi endokard

(11).

1.5. DOLOČANJE ŠTEVILA CD34+ CELIC

Število CD34+ celic določamo v vzorcih venske in popkovnične krvi, koncentratu, ter v

punktatu kostnega mozga. Delež CD34+ celic začnemo določati takrat, kadar je število

levkocitov najmanj 3,0x 109/L. S pretočnim citometrom določamo delež KMC s

kombinacijo mPt anti CD34 in CD45, ki sta značilna za te celice. Absolutno število

matičnih celic, ki mora biti vsaj 20x 106/L, izračunamo na podlagi števila levkocitov in

dobljene relativne vrednosti (%) (18). CD45 je normalno izražen na vseh hematopoetskih

celicah, razen na zrelih eritrocitih in njihovih vmesnih prekurzorjih. Na ne-

hematopoetskem tkivu še ni bil ugotovljen. Antigen CD34 je izražen na krvotvornih

zarodnih celicah vseh celičnih linij, na primitivnih pluripotentnih matičnih celicah CD34,

ter na endotelijskih celicah žil in na celicah strome v KM (13).

1.5.2. DOLOČANJE CELIC CD34+ Z ENOSTOPENJSKO IN DVOSTOPENJSKO

METODO

Absolutno število celic CD34+, kot tudi število celic CD34+ na enoto volumna (številčna

koncentracija), sta klinično pomembna parametra. Najprej so se razvile tako imenovane

metode z dvojno platformo, pri katerih se je odstotek CD34+ celic glede na levkocite ali

celice, ki imajo jedro, določal s pretočno citometrijo. Ta rezultat in absolutno število

levkocitov ali celic z jedrom, ki ga je dal hematološki analizator, se uporablja za izračun

celic CD34+. Pri metodah z eno platformo se absolutno število celic CD34+ pridobi

neposredno s pretočno citometrijo. Teste z eno platformo izvedemo z uporabo močno

fluorescentnih zrnc za štetje celic. Vzorcu se na koncu doda znano število zrnc za štetje

(Stem-Count, Immunotech Beckman-Coulter, Marscille, Francija) ali pa se jih da v

namenske epruvete v obliki liofiliziranih pelet (TruCount, BD Biosciences, San Jose,


16

CA). Razmerja med številom zrnc in celicami CD34+ je osnova izračuna absolutnega

števila celic CD34+. Pri testih z eno platformo je delo enostavno: testni vzorec

inkubiramo z mPt, temu sledi liza eritrocitov, postopek pa je opravljen brez izpiranja.

Prednosti testov z eno platformo sta:

- izločitev morebitnih nepravilnih ali nenatančnih absolutnih števil levkocitov,

pridobljenih s pomočjo hematološkega analizatorja,

- izognemo se izražanju deleža celic CD34+ kot frakcije levkocitov ali celic, ki imajo

jedro.

Eritrociti z jedrom lahko predstavljajo precejšnjo populacijo v transplantatih periferne in

popkovnične krvi ter kostnega mozga. Hematološki analizator jih v število levkocitov

vključuje do določene mere, s čimer pride do napak pri absolutnem številu celic CD34+,

pri uporabi dvojne platforme. Pri testih, v katerih so uporabljali eno platformo, je bila

dokazana zmanjšana varianca pri določanju celic CD34+ v medlaboratorijskih primerjavah

(12).

Izbira optimalnih mPt CD34

CD34 je močno glikozilirana molekula, pri kateri polipeptidni del predstavlja le ~40 kD.

Epitope, ki jih prepozna mPt CD34, lahko razvrstimo v tri razrede, odvisno od njihove

občutljivosti na encimsko razgradnjo z nevraminidazami in glikoproteazami. Epitopi

razreda I so razgradljivi z obema encimoma, za klinično uporabo so neprimerni zaradi

svoje odvisnosti od učinkovite vezave na sladkorni del, ki je prisotna le na nekaterih

oblikah molekule CD34. Epitopi razreda II so razgradljivi z glikoproteazami, epitopi

razreda III pa niso razgradljivi z nobenim od dveh encimov. Tako mPt, specifična za

epitope CD34 razreda II in III, zaznavajo primerljiva števila celic CD34+. Večino

konjugatov mPt CD34 razreda II in III s fluorescein izotiocianatom (FITC) ali

fikoeritrinom (PE) je mogoče zanesljivo uporabiti, z izjemo mPt razreda II, konjugiranega

s FITC. Ta protitelesa imajo neto negativni naboj, kar ovira njihovo vezavo na epitop

razreda II, ki je prav tako negativno nabit (12).


17

+ 1.5.3. RAZVOJ METOD ZA ŠTETJE CELIC CD34

Prva objavljena metoda za štetje celic CD34+ je bila zasnovana na postopku obogatitve

enojedrnih celic z gradientom, ločevanjem in uporabo mPt My10 CD34 razreda I. Ko so

postala dostopna konjugirana mPt CD34 razreda III, je bila ta metoda spremenjena.

Strategija tega t.i. protokola Milan-Mulhouse temelji na zamejitvi levkocitov na podlagi

disperzije svetlobe (FS (Forward Scatter)/SS (Side Scatter) , Slika 4A). Območje

pozitivnih celic je tisto z nizkim do srednjim stranskim sipanjem svetlobe (SS). V vzorcu,

obarvanem z mPt CD34, se preštejejo dogodki, ki spadajo v območje R2 (Slika 4C) in

odštejejo dogodki izmerjeni v vzorcu obarvanim z izotipskim kontrolnim mPt (Slika 4B –

R2). Na sliki 4 in 5 so celice CD34+, ki vsebujejo jedro obarvane rdeče, druge celice, ki

vsebujejo jedro, so obarvane zeleno, preostanek (ki vsebuje trombocite, nerazkrojene rdeče

krvničke in odpad) pa črno.

Slika 4: Milan – Mulhouse metoda za štetje CD34+ celic (12)

Majhen delež celic CD34+ (med 0,1 in 0,2 % levkocitov v večini vzorcev periferne,

popkovnične krvi ali aferez) je spodbudil razvoj strategij večbarvne analize. Pri tribarvnem

protokolu, ki ga uporablja Nizozemska fundacija za določanje imunofenotipov na področju

hematoonkologije (Dutch Foundation for Immuniphenotyping in Hemato-Oncology –

SIHON), se za identifikacijo celic z jedrom uporablja zamejitev s predhodnim obarvanjem

nukleinskih kislin z barvilom LDS-751 (Slika 5A). CD14/66e ali negativne (Slika 5B) so

izhodišče za nadaljnjo analizo (ostalo so zrele mielomonocitne celice), med katerimi se z


18

uporabo protitelesa CD34 izloči matične celice (Slika 5C – R3). Ponovno se odšteje

vrednost izotipske kontrole (Slika 5D – R3).

Slika 5: Sihon metoda za štetje CD34+ celic (12)

1.5.4. ISHAGE PROTOKOL

Za določanje matičnih celic uporabljamo v SHL tribarvni (CD34/CD45/7-AAD) pet

parametrski ISHAGE protokol. Po splošnem mnenju je ISHAGE protokol najbolj

natančen, občutljiv in zanesljiv. Za dvostopenjsko metodo je značilno, da s hematološkim

analizatorjem najprej določamo število levkocitov v vzorcu. Iz dobljenega števila

levkocitov in odstotka KMC, ki ga določimo s pomočjo pretočnega citometra, izračunamo

absolutno število KMC. Enostopenjska metoda pa temelji na dodajanju Stem-Count

fluorosfer v vzorec, ki ga analiziramo s pretočnim citometrom. Tako neposredno dobimo

podatek o številu KMC v volumski enoti vzorca.

Vsaka metoda ima svoje prednosti in slabosti.

Prednost enostopenjske metode je v tem, da neposredno po analizi dobimo podatek o

številčni koncentraciji KMC. Slabost enostopenjske metode pa je svetlobna nestabilnost

Stem-Count fluorosfer, nujnost zelo natančnega pipetiranja, homogenosti reagenta.

Prednost dvostopenjske metode je v tem, da lahko primerjamo številčno koncentracijo

levkocitov, določenih s hematološkim analizatorjem in pretočnim citometrom. Tako lahko

hitro vidimo, ali je prišlo do napake. Zato pa za določitev številčne koncentracije KMC


19

uporabljamo več parametrov kot pri enostopenjski metodi, s tem pa je povečana možnost

napak.

Očitna pomanjkljivost uporabe obarvanih vzorcev mPt z izotipsko kontrolo za nastavitev

področja pozitivne analize fluorescence je, da je lahko število celic CD34+ precenjeno, če

se mPt izotipske kontrole nespecifično vežejo, (npr. na agregate trombocitov in mrtve

celice). Nespecifična vezava mPt izotipske kontrole lahko vodi do negativnih rezultatov

določanja deleža celic CD34+. Zato je Sutherland s kolegi razvil zaporedno Booleanovo

strategijo aktiviranja, ki jo je nato Mednarodno društvo za hematoterapijo in

transplantacijski inženiring (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering

– ISHAGE) prevzelo kot smernico. Analitični protokol je sestavljen iz štirih zaporednih

aktivacijskih korakov. Najprej določimo levkocite CD45+, z razponom fluorescence od

šibke do močne) (Slika 6A). V drugem koraku se iz levkocitov izloči celice CD34+ (Slika

6B). Nato se izmed dogodkov z nizkim CD45, (Slika 6A-R1) in CD34+ (Slika 6B-R2)

izberejo KMC, ki imajo nizko SS (Slika 6C). V četrtem koraku pa se izključijo vsi dogodki, ki

sodijo izven skupine KMC (Slika 6C), ki imajo nizko do srednjo FS (kot so predhodniki

limfocitov B in apoptotske celice, Slika 6D). Za izotipsko kontrolo uporabimo mIgG1 PE

+ CD45 FITC (ni prikazano) na enak način, kot je opisano za vzorec. Vrednosti

izotipske kontrole se odšteje od določene vrednosti koncentracije KMC. Poleg tega je

bila po protokolu ISHAGE razvita metoda z eno platformo na podlagi zrnc za štetje, ki je

bila nato vključena v test Stem-Kit (Immunotech Beckman-Coulter). Protokol je bil

razširjen z določitvijo živih celic z uporabo 7-AAD (12). 7-AAD (Amino Aktinomicin D)

je anolog aktinomicina D. Aktinomicini so biološko aktivne spojine, ki vsebujejo: 2-

amino-4,6-dimetilfenoksazon-3 kromofor in dva ciklična penta-peptida. So bakteriocidne

substance (antibiotiki) prvotno odkrite v askomicetah iz zemlje. Aktinomicini tvorijo

stabilne spojine z dvojno ali enojno verigo DNA, ne pa z RNA (13).


20

Slika 6: ISHAGE protokol štetja CD34+ celic


21

Funkcijski graf 6A (SS, CD45 FITC) prikazuje vse dogodke. Funkcijski graf 6B prikazuje

izključno viabilne levkocite (to so celice CD45+ (področje R1), brez mrtvih celic

obarvanih s 7-AAD+ (Slika 6H) in krvotvorne matične celice (KMC). V grafu 6D pa so

prikazane celice z uporabo razpršene svetlobe (SS) in FS na področju limfocitov in nedozorelih

celic (področje R4) . Funkcijski graf 6E določa spodnjo mejo vrednosti CD45+ glede na celice

CD34+ z analizo QuadStat. Celice CD34-, CD45- so na ta način izključene. Funkcijski graf

6F prikazuje značilnosti z razpršeno svetlobo osvetljenih limfocitov zbranih v

področju R5. Funkcijski graf 6G prikazuje zrnca za štetje celic, (področje R6 na

funkcijskem grafu 6E); področje R7 obsega enojna zrnca (12).

V ISHAGE protokolu je izotipska kontrola preprosto uporabljena za štetje nespecifično

obarvanih celic, ki kažejo značilnosti pravih CD34+ celic (fluorescenca in nizka stopnja

granuliranosti). Mrtve celice so izključene s strategijo zaporednega dodatnega

zamejevanja, ki je bistvo tega protokola. Strategija zamejevanja celic z uporabo protitelesa

CD45 pomeni izgubo CD34+/CD45- celic. Vendar vse nemaligne CD34+celice izražajo

CD45, čeprav je intenziteta fluorescence nižja kot na limfocitih. ISHAGE protokol lahko

dopolnimo z vključevanjem tretjega protitelesa s tretjim barvilom, da določimo poreklo

matičnih celic. Pri vzorcih za nesorodno transplantacijo lahko v tribarvno analizo

vključujemo mPt CD3. S tem protokolom določimo število CD34+ celic in ocenimo

kontaminacijo s T-limfociti v celičnih suspenzijah s pozitivno selekcijo CD34+ celic

(Isolex). K osnovnemu dvobarvnemu ali tribarvnemu protokolu lahko dodamo

fluorescentne mikrosfere za dodatno absolutno štetje CD34+celic z enostopenjsko metodo,

ne da bi uporabljali avtomatiziran hematološki analizator. Ta protokol je zelo prilagodljiv

in ga lahko uporabljamo v različnih kliničnih preiskavah in raziskovalnem delu za

normalne in za abnormalne krvne vzorce (14).

1.5.5. KVALITATIVNI NADZOR IN STANDARDIZACIJA CITOMETRIČNEGA

ŠTETJA CELIC CD34+

Preproste (npr. protokol Milan-Mulhouse) in bolj zahtevne (npr. protokol ISHAGE)

metode štetja celic CD34+ dajo podobne rezultate, če so za določanje na voljo sveži vzorci

v optimalnem stanju. Booleanova strategija aktivacije, ki se osredotoča na »prave« KMC

(t.j. celice FSnizko do srednje, SSnizko, CD45+, CD34+) in predstavlja jedro protokola ISHAGE ter


22

njegovih kasnejših prilagoditev, se je izkazala za nepogrešljivo, kadar je potrebno analizirati vzorce,

ki niso povsem brezhibni, kot so na primer produkti afereze, ki vsebujejo precejšnje število mrtvih

celic in agregatov trombocitov. Za standardizacijo absolutnega štetja celic CD34+ si je

prizadevala delovna skupina EWGCCA. Tri enake stabilizirane krvne vzorce, ki so

vsebovale 150-200 celic CD34+/μL so razdelili različnim laboratorijem trikrat zaporedoma.

S standardizacijo protokolov se je zmanjšal KV med laboratoriji (s 23 na 11%). Pri prvem

razpošiljanju je bil KV znotraj laboratorija <5% (trije enaki vzorci) pri 39% laboratorijev,

pri zadnjem razpošiljanju pa že pri 65% laboratorijev.

Ugotovili so tudi, da so laboratoriji, ki so uporabljali protokole z eno platformo (kot na

primer metodi ISHAGE in ProCount), dosegli najnižje variacijske koeficiente pri

medlaboratorijskih primerjavah. To poudarja učinkovitost takih protokolov pri

zmanjševanju variacij pri štetju celic CD34+ med laboratoriji (12).

1.5.6. KLINIČNA UPORABNOST ŠTETJA CELIC CD34+

Število celic CD34+, ki jih je potrebno presaditi na kilogram telesne teže prejemnika,

predstavlja klinično najkoristnejši podatek za oceno ustreznosti presadka KMC. Toda

razširjena uporaba presadkov KMC iz periferne krvi in količinska opredelitev KMC sta se

razvili brez kakršnega koli konsenza glede načina štetja celic CD34+. V zadnjih desetih

letih se je minimalni odmerek celic CD34+ za transplantacijo, ki je bil splošno sprejet kot

varen, zmanjšal z ~10 x 106/kg na 2 – 2,5 x 106/kg, čeprav še vedno ni bilo doseženo

soglasje glede zadnje številke. Reinfuzija se pri manjših koncentracijah KMC (v razponu

od 0,5 - 2 x 106/kg) ne opravlja pogosteje zaradi počasne obnove populacije nevtrofilcev in

trombocitov, ter zaradi slabšega dolgoročnega delovanja transplantata. Po drugi strani pa

so klinične prednosti zaradi povišanja odmerka celic CD34+ na ravni >5 x 106/kg pri

avtolognih presadkih nezanesljive. Pri alogenskih presadkih z zmanjšanim deležem T-celic

pa so višji odmerki celic CD34+ povezani z zmanjšano umrljivostjo in zmanjšano

pogostostjo ponovitve levkemije, medtem ko mega-odmerki celic CD34+ (>10 x 106/kg)

izboljšajo stopnjo in popolnost regeneracije pri presadkih z manjšo

histokompatibilnostjo.

Število celic CD34+, določenih v periferni krvi, je zanesljiv napovedovalec za zbiranje

ustrezne količine celic CD34+ z levkoferezo. Če vzorec krvi pred levkoferezo vsebuje <10


23

celic CD34+/µl, je mogoče, da bo zbranih premalo CD34+ celic/kg (<0,5 x 106). Števila

celic CD34+ v periferni krvi, ki znašajo med 10 in 20 celic CD34+/µL, običajno

napovedujejo donose levkofereze od 0,5 - 1 x 106/kg. Števila med 20 in 40 celic CD34+/µL

pomenijo dobro sproščanje oziroma, da en sam odvzem pogosto zadostuje, da se zagotovi

transplantat z 1-2 x 106 celic/kg. Točno načrtovanje odvzema KMC je še posebno

pomembno pri bolnikih z oslabljenim delovanjem KM zaradi prejšnje obsežne

citoreduktivne terapije. Dnevno spremljanje števila celic CD34+ v periferni krvi je lahko še

posebno koristno, saj lahko zagotovi zgodnje odvzeme pri predhodno intenzivno

zdravljenih bolnikih z diseminiranim plazmocitomom, pri katerih so lahko produkti

levkofereze okuženi z malignimi celicami, kadar se odvzemi opravljajo kasneje po začetku

sproščanja (12).

1.6. VALIDACIJA S STRANI PROIZVAJALCA

Vzorci so bili označeni s CD45-FITC/CD34-PE-7AAD. Vrednosti, določene s pretočno

citometrijo, predstavljajo CD45+ celice in CD45+/ CD34+ celice, določene z uporabo Stem-

Count fluorosfer. Vrednosti so izražene v odstotkih in so samo vzorčne. Vsak laboratorij

mora določiti lastne pričakovane vrednosti na lastni populaciji zdravih darovalcev.

Tabela 1 prikazuje vrednosti določene s FC500 znotraj pričakovanih vrednosti, določenih s

StemONE sistemom na 117-ih vzorcih polne krvi zdravih darovalcev moškega in ženskega

spola (13).

Tabela 1: Normalne vrednosti polne krvi: CD45+/CD34+, N=20(13).

Min Max X̄

CD45+ (celice/µL) 3565 9543 5521

CD34+ (celice/µL) 1 9 3

CD34+ (%) 0,02 0,16 0,05


24

Proizvajalec zagotavlja linearnost metode v območju od 0 do 5000 celice/μL.

Točnost metode je bila potrjena na dveh aparatih, kjer so dobili enake rezultate.

Med laboratorijska natančnost je bila preverjena v treh različnih laboratorijih, na treh

različnih FC500 pretočnih citometrih. Testirani so bili trije vzorci, v nizkem, srednjem in

visokem območju, od 0 do 5000 celice/μL. Vrednosti so izražene v odstotkih in absolutnim

številom.

Vrednosti so v posameznih območjih natančnosti med laboratoriji primerljive.

Antigenska specifičnost mPt CD45 in CD34, ki ju vsebuje StemKit, je bila potrjena na peti

mednarodni delavnici za tipizacijo levkocitov (13).

1.7. PRETOČNA CITOMETRIJA

Metoda pretočne citometrije je v osnovi podobna metodi fluorescentne mikroskopije. Od

fluorescentne mikroskopije se razlikuje v tem, da je odčitavanje odstotka celic, ki

fluorescirajo avtomatizirano, hitrejše in objektivnejše. Sodobni pretočni citometri so se

razvili na osnovi dosežkov laserske in računalniške tehnologije, proizvodnje mPt in kemije

fluorokromov. Da lahko analiziramo celice s pretočnim citometrom, morajo biti celice

porazdeljene v suspenziji. Celični suspenziji se doda mPt, ki je označeno s fluorescenčnim

barvilom. mPt se vežejo na celične antigene. Tako pripravljeno suspenzijo analiziramo s

pretočnim citometrom. Pri analizi s pretočnim citometrom potujejo celice v tankem curku

druga za drugo mimo vira svetlobe. Svetlobni žarek, ki zadene celico, se lahko lomi, odbije

ali pa absorbira v določenih fluorokromih, ki sevajo svetlobo večjih valovnih dolžin.

Sistem fotosprejemnikov beleži svetlobo, ki jo osvetljena celica odda (16).

Glavni sestavni deli pretočnega citometra so:

- vir svetlobe,

- pretočna celica

- optični sistem ogledal, leč in filtrov,

- elektronika, ki spreminja svetlobne impulze v električne in te v digitalne,

- računalnik, ki zbira, analizira in usklajuje podatke in uravnava delovanje aparata.

Vir svetlobe je navadno laserski žarek, ki je lahko argonski, kriptonski ali kombiniran

helij-kadmijski ali helij-neonski. Pretočni sistem je zgrajen iz pretočne celice, skozi katero

tečejo celice v izotonični tekočini. Pri prehodu snopa žarkov odda posamezna celica signal


25

(17). Svetlobni signali, ki imajo enake valovne dolžine kot obsevalna (laserska) svetloba,

nastanejo zaradi sipanja svetlobe na celičnih strukturah. Tisti svetlobni signali, ki pa imajo

večje valovne dolžine kot obsevalna svetloba, nastanejo zaradi fluorescence. Fotodetektorji

zbirajo signale preko sistema leč in filtrov in jih selekcionirajo (16). Dva fotodetektorja

merita odboj ali lom svetlobe, eden iz smeri vira FS, drugi pravokotno na smer vpadne

svetlobe SS. FS detektor je pomemben za ugotovitev velikosti celic. SS detektor pa

sprejema od celice odbito svetlobo, skladno z granuliranostjo in površinsko strukturo celice

(17). Granuliranost celice je odraz količine in lastnosti membranskih struktur celice -

lizosomov, endoplazemskega retikuluma, fagosomov, citoplazemske in jedrne membrane.

Poleg detektorjev FS in SS, ki prejemata razpršeno svetlobo, ima pretočni citometer še več

fluorescenčnih detektorjev, ki merijo svetlobo večjih valovnih dolžin od vzbujevalne

(laserske) svetlobe. Pretočni citometri imajo navadno do šest fluorescenčnih

fotodetektorjev, od katerih prejema vsak fluorescenčno svetlobo določene valovne dolžine

in tako meri signal, ki ga oddaja določeno fluorescenčno barvilo. Fotodetektorji pretvorijo

svetlobne signale v električne. Računalnik zabeleži električne signale in jih nato grafično

in matematično prikaže. Tako dobimo podatke o relativni velikosti in zrnatosti celic ter o

vrstah in jakostih oddanih fluorescenčnih signalov. V postopku računalniške analize

razvrščamo celice glede na posamezne lastnosti (velikost, zrnatost, izražanje antigenskih

molekul). Glede na velikost in zrnatost omogoči razločitev belih krvnih celic na limfocite,

monocite in granulocite. Za razločevanje med podvrstami limfocitov je potrebno razvrščati

limfocite glede na to, kako izražajo posamezne označevalske (markerske) molekule,

katerih navzočnost ugotavljamo s specifičnimi protitelesi (16).


26

Slika 7: Shematičen prikaz pretočnega citometra

1.7.1. PRIKAZ REZULTATOV PRETOČNE CITOMETRIJE

Rezultat pri pretočni citometriji je točkovni diagram, na katerem predstavlja vsaka točka

celico, ki na poti skozi laserski žarek sprejme vzbujevalno svetlobo, nato odda razpršeno

svetlobo in različne vrste fluorescenčne svetlobe.

Rezultat pretočne citometrije lahko predstavimo kot:

- odstotek pozitivnih celic

- povprečno celično svetilnost

Pozitivne celice so celice, ki fluorescirajo po reakciji s fluorescenčno označenimi

monoklonskimi protitelesi. Odstotek pozitivnih celic lahko izračunamo v primeru, da

razločimo med pozitivnimi in negativnimi celicami.

Povprečna svetilnost ali fluorescenca opazovanih celic je podatek, ki ga dobimo s

statistično obdelavo fluorescenčnih signalov, ki jih izsevajo opazovane celice. Sorazmerna

je povprečni količini antigenskih molekul na posamezni celici. Na ta način predstavimo

rezultate v primerih, ko ne moremo jasno razločiti pozitivne celice od negativnih. To je


27

zlasti takrat, ko se opazovane molekule izražajo na celicah v večjem ali manjšem številu,

zato med celičnimi populacijami ni jasnih razmejitev (16).


28

2. NAMEN DELA

Določanje absolutnega števila celic CD34+ se v Specializiranem hematološkem

laboratoriju Kliničnega oddelka za hematologijo rutinsko izdeluje z dvostopenjsko metodo.

Ta način določanja KMC ima svoje prednosti in slabosti. Slabost takega načina določanja

je, da se za določanje številčne koncentracije KMC uporablja več parametrov in s tem je

povečana možnost napak. Zaradi čim bolj natančnega in pravilnega določanja KMC smo

se odločili za primerjavo med enostopenjsko in dvostopenjsko metodo.

Namen diplomske naloge je:

1. Validacija nekaterih parametrov določanja celic CD34+ s pretočno citometrijo.

2. Določitev števila KMC z enostopenjsko in dvostopenjsko metodo po ISHAGE

protokolu.

3. Primerjava rezultatov, dobljenih z enostopenjsko in dvostopenjsko metodo.


29

3. PREISKOVANCI IN METODE DELA

3.1. PREISKOVANCI

V raziskavo smo vključili 276 preiskovancev, in sicer hematološke in kardiološke bolnike,

darovalce in popkovnično kri. Imeli smo 418 vzorcev. Preiskovanci so bili različnih

starostnih skupin. Raziskava zajema podatke o določanju števila KMC, in sicer od

decembra 2007 do maja 2009. Vse rezultate določanja števila KMC smo izvajali v

Specializiranem hematološkem laboratoriju Kliničnega oddelka za hematologijo UKC

Ljubljana. Število KMC smo določali v periferni krvi, koncentratu, popkovnični krvi,

levkocitnem pripravku popkovnične krvi ter kostnem mozgu. Število preiskovancev,

razdeljenih v različne skupine, način zbiranja in število vzorcev predstavlja Tabela 2.

Tabela 2: Razvrstitev preiskovancev po skupinah in načinu zbiranja

Skupine preiskovancev

Število preiskovancev

Število vzorcev

Pred zbiranjem Po zbiranju Skupaj Hematološki

bolniki 70

121 78 199

Kardiološki bolniki 8 12 5 17

Darovalci 15 5 14 19

Popkovnična kri Levkocitni pripravek Popkovnična kri

novorojenčkov 183

157 26

183

3.2. POSTOPEK DOLOČANJA KRVOTVORNIH MATIČNIH CELIC

3.2.1. VZOREC

KMC določamo v vzorcih venske krvi, popkovnične krvi, punktatu kostnega mozga in v

koncentratu.


30

3.2.2. ODVZEM IN DOSTAVA VZORCA

Za določanje števila KMC uporabimo kot antikoagulant K – EDTA. Vensko kri ali punktat

kostnega mozga odvzamemo direktno v 4 mL Vacutainer epruveto s K – EDTA.

Popkovnično kri odvzamemo s CPD (citrat-fosfat-dekstroza). Prenos vzorca mora biti

opravljen čimprej, najpozneje 24 ur po odvzemu, pri sobni temperaturi.

3.2.3. PRINCIP DOLOČANJA

V vzorcu določamo delež KMC s kombinacijo mPt anti CD34 in CD45, ki sta značilni za

te celice, z odčitavanjem na pretočnem citometru.

3.2.4. REAGENTI, KALIBRATORJI, KONTROLE

Za liziranje eritrocitov uporabljamo amonijev klorid (NH4Cl).

Matična raztopina (10X koncentrirana):

- 82,60 g NH4Cl

- 10,00 g KHCO3

- 0,37 g EDTA

Soli raztopimo v 1000 mL deonizirane vode.

Delovna raztopina:

matično raztopino razredčimo z deonizirano vodo tik pred uporabo, in sicer v razmerju

1:10.

Priprava matične raztopine PBS (10x koncentrirana):

- 40,00 g NaCl

- 1,00 g KCl

- 1,00 g KH2PO4

- 7,60 g Na2HPO4x2H2O

Soli raztopimo v 300 mL demineralizirane vode in dopolnimo v merilni bučki do 500 mL.


31

Delovna raztopina:

100 mL matične raztopine razredčimo z 900 mL demineralizirane vode in dodamo 1,00 g

NaN3 (natrijev azid služi kot konzervans).

Stem – Kit: CD34+ HPC Enumeration Kit (IMMUNOTECH)

Kit vsebuje:

- CD45 – FITC (fluorescin-izo-tio-cianat)/CD34 – PE (fikoeritrin)

- CD45 - FITC/izoklonska kontrola - PE

- barvilo 7-AAD (Amnino Aktinomicin D) za dokaz vitalnosti celic

- reagent za liziranje: (NH4Cl – 10x konc.)

- Stem-Count fluorosfere za absolutno štetje

Reagent za liziranje pripravimo tik pred uporabo iz enega volumskega dela

koncentriranega NH4Cl in devetih delov deionizirane vode. Za enkratno določanje števila

matičnih celic pripravimo za vsak posamezen vzorec 10 mL delovne raztopine. Preostanek

zavržemo.

Stem-Count fluorosfere za absolutno štetje matičnih celic: s plastenke popolnoma

odstranimo aluminijevo zaščitno folijo pri prvem odpiranju. Po uporabi jo tudi trdno

zapremo, da preprečimo izhlapevanje. Hranimo jo pri 2-80C v temi, v pokončnem

položaju. Pred vsako uporabo je potrebno Stem-Count reagent dobro premešati na mešalcu

(10-12 sekund) in ga pipetirati z isto pipeto in na enak način kot vzorec. Uporabimo

reverzibilni način pipetiranja.

Vsak dan je pred uporabo obvezna optična uravnava citometra. Enkrat na dva meseca je

obvezna standardizacija.

Reagenta za optično uravnavo pretočnega citometra:

- Flow-Check [email protected]

- Flow-Check FC770(-)

mailto:[email protected]


32

Reagenta za standardizacijo pretočnega citometra:

- Flow-Set

- Flow-Set 770

Enkrat tedensko napravimo kontrole določanja števila matičnih celic, in sicer tri, ki so na

različnih nivojih relativnih in absolutnih vrednosti (Streck CD-Chex CD34 Level 1, 2, 3):

- level 1 (območje nizkih vrednosti rezultatov)

- level 2 (območje srednjih vrednosti rezultatov)

- level 3 (območje visokih vrednosti rezultatov)

3.2.5. INSTRUMENTI IN OPREMA

Hematološki analizator LH 750 (Beckman Coulter).

Pretočni citometer Beckman Coulter Cytomics FC500.

avtomatske pipete 20 µL, 100 µL, 1000 µL

3.2.6. DELOVNI POSTOPEK

Označimo tri epruvete:

1. CD45-FITC/CD34-PE/7-AAD (20 µL protitelesa, 20 µL 7-AAD barvila in 100 µL

vzorca)

2. CD45-FITC/CD34-PE/7-AAD (20 µL protitelesa, 20 µL 7-AAD barvila in 100 µL

vzorca)

3. CD45-FITC/izoklonska kontrola-PE/7-AAD (20 µL izoklonske kontrole, 20 µL 7-

AAD barvila in 100 µL vzorca)

Protitelo, barvilo in vzorec pipetiramo na dno epruvete.

Inkubacija poteka 20 minut v temi, pri sobni temperaturi (18-250C).

Po inkubaciji pipetiramo v epruvete po 2 mL razredčene (1X) raztopine NH4Cl za liziranje

in močno premešamo. Nato ponovno inkubiramo 10 minut v temi, pri sobni temperaturi,


33

tik pred vrednotenjem na pretočnem citometru dodamo v vsako epruveto po 100 µL Stem-

Count fluorosfer.

Pred uporabo Stem-Count fluorosfere dobro premešamo. Pipetiramo reverzibilno, zelo

previdno, da ne vsrkamo zračnih mehurčkov.

Najprej določamo število levkocitov v koncentratu krvotvornih matičnih celic, nato vzorec

primerno razredčimo do koncentracije celic 20-30x109/L.

Uporabljamo isto pipeto za pipetiranje vzorca in fluorosfer. Po liziranju eritrocitov celic ne

spiramo, ampak takoj odčitamo vrednost. Vzorci po navodilih proizvajalca lahko stojijo do

vrednotenja rezultatov s pretočnim citometrom največ 60 minut, v temi, pri temperaturi 2-

80C (18).

3.2.7. KONTROLA KAKOVOSTI

CD-Chex CD34 Immunology Control for Cluster Designation (Streck) uporabljamo kot

kontrolo protiteles in postopka. Približno 15 minut pred uporabo vzamemo stekleničke s

kontrolami iz hladilnika in jih pustimo stati na sobni temperaturi, da se segrejejo. Nato jih

premešamo tako, da držimo stekleničke med dlanmi, in sicer v navpičnem položaju,

valjamo jih naprej in nazaj 20-30 sekund, nato jih premešamo še z izmeničnim obračanjem

dlani levo in desno 8-10 krat. Ker so kontrolni vzorci stabilizirana venska kri in celice niso

žive, ne smemo uporabljati 7-AAD barvila za določanje vitalnosti na kontrolnih celicah,

ostali postopki označevanja s protitelesi in čas inkubacije so popolnoma enaki kot za krvne

vzorce. Inkubacija poteka v temi, pri sobni temperaturi, 20 minut, nato liziramo 10 minut z

1x NH4Cl. Brez vmesnega spiranja odčitamo vrednosti CD34 na pretočnem citometru.

Rezultati kontrol so podani v odstotkih in kot absolutno število. Dovoljeno odstopanje

kontrol je +/-2σ. Če je odstopanje večje, postopek ponovimo. Rezultati so zabeleženi v

računalniku (18).


34

3.2.8. ODČITAVANJE REZULTATOV S PRETOČNIM CITOMETROM

3.2.8.1. Določanje v venski krvi in koncentratu po citoferezi

V posameznem vzorcu preštejemo najmanj 75000 celic. Po končanem štetju se izpiše

rezultat v grafični in številčni obliki in sicer kot relativna vrednost (%) in absolutno število

matičnih celic na µL. Rezultat merjenja je povprečna vrednost dveh zaporednih štetij, od

katerih odštejemo izoklonske kontrole. Če je razlika rezultatov paralelnih vzorcev večja od

10%, moramo ponoviti celoten postopek, vključno s pipetiranjem vzorca (18).

3.2.8.2. Določanje števila krvotvornih matičnih celic po pozitivni selekciji z

Isolexom

Vzorci, dobljeni po koncentriranju matičnih celic z Isolexom, so popolnoma prozorni, ker

v njih ni eritrocitov, zato postopek lize ni potreben. Tudi redčenje ni potrebno, ker je

število levkocitov zelo nizko, običajno okoli 1.0x109/L. Ko poteče inkubacija, dodamo

vzorcu matičnih celic v Isolexu le 0,5 mL PBS. Ostali postopki priprave so popolnoma

enaki kot za druge vzorce. Protokol odčitavanja rezultatov s pretočnim citometrom je za

vse prečiščene produkte citafereze nekoliko drugačen. Uporabljamo metodo ročnega in ne

avtomatskega zamejevanja celic (18).

3.2.8.3. Določanje matičnih celic v pozitivnih kontrolah in mednarodnih kontrolah

kakovosti

Postopek odčitavanja rezultatov s pretočnim citometrom je enak kot za krvne vzorce (18).

3.2.9. PODAJANJE REZULTATOV

Rezultate, ki jih dobimo s pretočnim citometrom, vnesemo v računalniški program, in sicer

v ločena polja za vpis določanja števila matičnih celic pred zbiranjem in po njem. V

posamezna polja vpišemo datum, delež CD34+ celic v področju analize, število levkocitov

v venski krvi (hematološki analizator) in odstotek CD34+ celic. Iz števila levkocitov in


35

deleža CD34+ celic izračunamo koncentracijo matičnih celic x106/L. Če je matičnih celic

za levkoferezo premalo, nadaljujemo z določanjem, dokler se ne začne zbiranje.

Ko določamo matične celice v koncentratu, vpišemo rezultate pod isto zaporedno številko

bolnika v programu kot štetje pred odvzemom: najprej 1. odvzem, če mu sledi drugi, pod

2. odvzem itd. Vnašamo vrednosti za volumen koncentrata, števila levkocitov v

koncentratu deleža CD34+ in telesne teže prejemnika. Izračunamo število matičnih celic na

kg bolnikove telesne teže. Ta vrednost je ključna za odločanje zdravnika o nadaljnjem

zdravljenju (18).

3.3. STATISTIČNA ANALIZA REZULTATOV

S statistično analizo smo primerjali vrednosti dobljene z enostopenjsko in dvostopenjsko

metodo. Dobljenim vrednostim smo določili Me in kvantile. Prvi kvantil (Q1), imenovan

tudi 25 centil, je vrednost, pod katero se nahaja 25% vseh vrednosti. Drugi kvantil (Q2) je

istočasno tudi Me. Me je mera srednje vrednosti, ki ranžirno vrsto razdeli na dva enaka

dela. Polovica vrednosti je od nje manjših ali enakih, druga polovica pa večjih ali enakih.

Tretji kvantil (Q3) imenovan tudi 75 centil je vrednost, od katere je manjših ali njej enakih

75% vrednosti.

Vrednosti obeh metod smo za vsako skupino preiskovancev grafično prikazali v obliki

kvantilnega diagrama. Okvirji so zaporedno nanizani s po dvema ročajema. Vsak okvir z

ročajema določa pet točk: pogojni minimum (min) in pogojni maksimum (max) ter

kvantile Q1 in Q3. Mediana predstavlja majhen kvadratek znotraj okvirja. Ročaja

ponazarjata porazdelitev ostalih vrednosti, ki niso presegle 1,5-kratne višine okvirja (t.i.

medkvantilnega območja). V posameznem kvantilnem območju so lahko prisotni zgornji

in spodnji osamelci (°) (iztopajoče vrednosti), ter zgornji in spodnji ekstremni osamelci (*)

(ekstremno iztopajoče vrednosti) (15).

Z analizo rezultatov smo dobili neparametrično porazdelitev rezultatov.

Spearmanov koeficient korelacije je statistični kazalec, ki prikazuje stopnjo povezanosti

dveh spremenljivk pri neparametrski porazdelitvi oziroma predstavlja kakovost opisa


36

povezanosti med spremenljivkama (19). Spearmanov koeficient korelacije mora biti >0,9,

da lahko sklepamo na dobro korelacijo metod.

Wilcoxonov test je statistični neparametrski hipotezni test, za primerjavo dveh metod in

vključuje primerjave razlik med meritvami. Uporabljamo ga, kadar domnevamo, da

populacija ni normalno porazdeljena (20). Za statistično primerljivost metod morajo biti

rezultati Wilcoxonovega testa >0,05.


37

4. REZULTATI

4.1. VPLIV NEKATERIH SPREMENLJIVK NA DOLOČITEV CELIC CD34+

V laboratoriju smo preverjali vplive naslednjih spremenljivk na končno številčno

koncentracijo KMC:

- primerjava sredstev za liziranje

- časovna stabilnost vzorcev

- vpliv redčitve vzorcev

4.1.1. PRIMERJAVA SREDSTEV ZA LIZIRANJE CELIC

Proizvajalec Immunotech Beckman Coulter v navodilih navaja, da lahko rezultate

odčitamo v 1 uri po dodatku sredstva za liziranje.

Zanimala nas je stabilnost vzorcev v tem času, glede na uporabljeno sredstvo za liziranje,

glede na rezultate viabilnosti in deleža CD34+ celic. Primerjali smo dve sredstvi za

liziranje eritrocitov. To sta NH4Cl, ki je v pakiranju Stem Kit reagentov, in Versa Lyse. Za

primerjavo smo uporabljali svežo vensko kri istega preiskovanca. Primerjavo smo izvedli v

eni uri. Viabilnost in številčno koncentracijo KMC pa smo odčitali v časovnih razmikih 10

minut po dodatku sredstva za liziranje. Delež CD34+ prikazujemo glede na začetno

vrednost (ta je 100%), viabilnost (delež živih celic) pa kot odčitano vrednost.


38

Slika 8: Vpliv izbranega sredstva za liziranje celic na viabilnost in številčno koncentracijo KMC v časovnem območju 1 ure po dodatku sredstva za liziranje

4.1.2. ČASOVNA STABILNOST VZORCA

Primerjali smo časovni vpliv na delež celic CD34+ in viabilnost (%) celic, ko izoliran

vzorec dalj časa stoji. Najprej smo izmerili delež celic CD34+ in viabilnost (%) celic v času

0, nato po 12-ih in 24-ih urah. Vzorec smo medtem hranili v hladilniku. Delež CD34+

prikazujemo glede na začetno vrednost, viabilnost pa kot odčitano vrednost.

85

90

95

100

105

110

0 10 20 30 40 50 60

Čas (min)

De

lež

CD

34

+ g

led

e n

a zače

tno

vre

dn

ost

(%

)

87888990919293949596

Via

biln

ost

%

CD34+ NH4Cl CD34+ Versa Lyse

viabilnost NH4Cl viabilnost Versa Lyse

80

85

90

95

100

105

0 12 24

Čas (ura)

De

lež

CD

34

+ g

led

e n

a

zače

tno

vre

dn

ost

(%

)

95

96

97

98

99

100

Via

biln

ost

%

CD34+ viabilnost

Slika 9: Časovna stabilnost vzorca


39

Z redčitvijo vzorca viabilnost celic praviloma nekoliko pada.

4.1.3. VPLIV REDČITVE VZORCA

Redčitve smo izvedli pri dveh različnih vzorčnih koncentratov po zbiranju KMC. Vsak

vzorec smo redčili: 1:10, 1:20 in 1:30. Določili smo delež celic CD34+ in njihovo

viabilnost (%) pri različnih redčitvah. Ustrezno koncentracijsko območje za določanje

številčne koncentracije celic CD34+ namreč zahteva redčenje vzorcev. Sliki 10 in 11

prikazujeta viabilnost in % CD34+ v odvisnosti od redčitve vzorcev.

Slika 10: Vpliv redčitev na delež celic CD34+ glede na začetno vrednost; dva različna vzorca

98

100

102

104

106

108

110

1:10 1:20 1:30

Redčitve

Del

ež

CD

34+

gle

de

na

zače

tno

vred

no

st (

%)

97

98

99

100

1:10 1:20 1:30

Redčitve

Via

biln

ost

(%

)

Slika 11: Vpliv redčitve na viabilnost (%); dva različna vzorca


40

OPENJSKO METODO

v.

Razdelili smo jih po skupinah: na hematološke bolnike, kardiološke bolnike, darovalce in

4.2. PRIMERJAVA MED ENOSTOPENJSKO IN DVOST

Za primerjavo enostopenjske in dvostopenjske metode smo vključili 276 preiskovance

popkovnično kri. Od 276 preiskovancev smo imeli 418 vzorcev. Te smo razdelili na vzorce

pred zbiranjem KMC in po njem.

Slika 12: Korelacija med določitvijo CD34+/μL z dvostopenjsko in enostopenjsko metodo

očeno smo analizirali še rezultate bolnikov pred zbiranjem in po njem ter pri popkovnični

krvi nativno popkovnično kri in levkocitni pripravek popkovnične krvi. Vzorce darovalcev

L

in kardioloških bolnikov smo vključili v analizo vseh vzorcev pred zbiranjem in po njem.

Ločene statistične analize omenjenih skupin nismo naredili zaradi majhnega števila

preiskovancev.


41

A B

Slika 13: Primerjava enostopenjske (Enost.) in dvostopenjske (Dvost.) metode pri hematoloških preiskovancih pred zbiranjem kvantilni diagram (A) in korelacijski diagram

(B). Vrednosti na y osi predstavljajo številčno koncentracijo CD34+/μL.

Slika 13 prikazuje porazdelitev vrednosti med enostopenjsko in dvostopenjsko metodo

vseh hematoloških preiskovancev pred zbiranjem v venski krvi. Vidimo, da imamo pri

obeh metodah nekaj zgornjih osamelcev (°), ter po en zgornji ekstremni osamelec (*).

Vrednosti za enostopenjsko metodo se nahajajo med 14 in 74,62 celic/μL, za

dvostopenjsko metodo pa med 14,41 in 77,45 celic/μL. Mediana pri enostopenjski metod

je 31,75 celic/μL pri dvostopenjski 32,33 celic/μL.


42

A B

Slika14: Primerjava enostopenjske (Enost.) in dvostopenjske (Dvost.) metode vseh hematoloških preiskovancev po zbiranju kvantilni diagram (A) in korelacijski diagram (B).

Vrednosti na y osi predstavljajo številčno koncentracijo CD34+/μL.

Slika 14 prikazuje primerjavo enostopenjske in dvostopenjske metode vseh hematološkoh

preiskovancev po zbiranju KMC v venski krvi (koncentrat). Vrednosti se nahajajo pri

enostopenjski metodi med 695 in 2789,25 celic/μL pri dvostopenjski pa 671,97 in 2618,17

celic/μL. Mediana je pri enostopenjski 1495 celic/μL in dvostopenjski metodi 1358

celic/μL. Pri obeh metodah so prisotni štirje zgornji ekstremni osamelci (*), ter štirje

zgornji osamelci (°) pri dvostopenjski metodi pri enostopenjski metodi pa trije.


43

A B

Slika 15: Primerjave enostopenjske (Enost.) in dvostopenjske (Dvost.) metode v vzorcih popkovnične krvi kvantilni diagram (A) in korelacijski diagram (B). Vrednosti na y osi

predstavljajo številčno koncentracijo CD34+/μL.

Slika 15 prikazuje primerjavo med enostopenjsko in dvostopenjsko metodo v vzorcih

popkovnične krvi. Vrednosti se nahajajo v kvantilih med 19,39 in 47,84 celic/μL za

dvostopenjsko metodo in za enostopenjsko med 16,50 in 43,25 celic/μL. Mediana je pri

dvostopenjski metodi 31,36 celic/μL, pri enostopenjski metodi pa pri 27 celic/μL. Vidimo,

da imamo pri obeh metodah po tri zgornje ekstremne osamelce (*) in veliko zgornjih

osamelcev (°).


44

A B

Slika 16: Primerjave enostopenjske (Enost.) in dvostopenjske (Dvost.) metode v

levkocitnem pripravku popkovnične krvi kvantilni diagram (A) in korelacijski diagram (B). Vrednosti na y osi predstavljajo številčno koncentracijo CD34+ /μL.

Slika 16 prikazuje primerjavo med enostopenjsko in dvostopenjsko metodo v levkocitnem

pripravku popkovnične krvi. Vrednosti pri dvostopenjski metodi so v območju med 48,98

in 134,69 celic/μL in enostopenjski metodi med 42,62 in 124,50 celic/μL. Mediana je pri

dvostopenjski 100,40 celic/μL in enostopenjski metodi 95,25 celic/μL. Pri dvostopenjsi

metodi sta dva zgornja osamelca (°).

Vrednosti pri metodah lahko odstopajo zaradi nepravilnega shranjevanja vzorca,

nepravilnega pipetiranja, svetlobne nestabilnosti Stem-Count fluorosfer ali homogenosti

reagenta.


45

S Spearmanovim koeficientom korelacije, smo primerjali ujemanje metod za vse podatke

in po posameznih skupinah. Vrednosti prikazuje Tabela 3.

Tabela 3: Spearmanov koeficient korelacije za analizirane skupine vzorcev

Število vzorcev

Spearmanov koeficient

korelacije

Enostopenjska VSI VZORCI 418

Dvostopenjska 0.984

HEMATOLOŠKI BOLNIKI

Enostopenjska Pred zbiranjem 121

Dvostopenjska 0.992

Enostopenjska Po zbiranju 67

Dvostopenjska 0.980

POPKOVNIČNA KRI NOVOROJENČKOV

Enostopenjska Popkovnična kri 157

Dvostopenjska 0.949

Enostopenjska Levkocitni pripravek 26

Dvostopenjska 0.976


46

Za primerjavo več med seboj odvisnih rezultatov smo uporabljali Wilcoxonov test.

Rezultati Wilcoxonovega testa so primerjava mediane med enostopenjsko in

dvostopenjsko metodo v posameznih skupinah. Rezultati testa so zbrani v tabeli 4.

Tabela 4: Rezultati statistične analize

25.

percentila Mediana

75. percentila

Wilcoxonov test

Enostopenjska 14,00 31,75 74,62 HEMATOLOŠKI BOLNIKI- Pred

zbiranjem Dvostopenjska 14,41 32,33 77,45 0,13

Enostopenjska 695,00 1495,00 2789,25 HEMATOLOŠKI BOLNIKI- Po

zbiranju Dvostopenjska 671,97 1358,00 2618,17 0,00

Enostopenjska 16,50 27,00 43,25 POPKOVNIČNA KRI

NOVOROJENČKOV Dvostopenjska 19,93 31,36 47,84 0,00

Enostopenjska 42,62 95,25 124,50 POPKOVNIČNA KRI

NOVOROJENČKOV Levkocitni pripravek

Dvostopenjska 48,98 100,40 134,69 0,00


47

5. RAZPRAVA

5.1. OCENA VPLIVA NEKATERIH SPREMENLJIVK NA ŠTEVILČNO

KONCENTRACIJO KMC

Med seboj smo primerjali dve sredstvi za liziranje in sicer NH4Cl in Versa Lyse.

Viabilnost celic, ki so lizirane z NH4Cl, izrazito pade v prvih desetih minutah, nato pa

počasi linearno pada. Viabilnost celic, liziranih z Versa Lyse, linearno pada za približno

0,50 %/10 min. Delež celic CD34+, liziranih z NH4Cl in z Versa Lyse, nekoliko niha

znotraj 1 ure, vendar so odčitane vrednosti v okviru pričakovanih odstopanj (± 5%).

Ugotavljamo, da Versa Lyse sredstvo za liziranje celic manj vpliva na viabilnost celic kot

NH4Cl. Daljši časovni razmaki do analize vplivajo na določitev viabilnosti celic.

Določanje viabilnosti je ključno predvsem pri vzorcih, ki se konzervirajo (popkovnična

kri). Ugotovili smo, da viabilnost in delež celic CD34+ s časom padata klub navodilom

proizvajalca, da lahko rezultate odčitamo v času 1 ure. Celice moramo po končanem

delovnem postopku čim prej analizirati na pretočnem citometru, ko je viabilnost celic po

liziranju največja.

Iz tega sklepamo, da je delež CD34+ tudi pri kasnejših določitvah precej konstanten,

viabilnost celic pa po pričakovanjih pade. Menimo, da bi bilo potrebno poskuse še

ponoviti.

Delež celic CD34+ z redčitvijo nekoliko narašča. Verjetno zaradi manjše gostote celic

aparat lažje loči žive in nežive celice in natančneje določi delež CD34+.

S preverjanjem opisanih parametrov smo ugotovili, da je najbolj primerno sredstvo za

liziranje celic raztopina Versa Lyse. Vzorec, ki ga dobimo v laboratorij, je potrebno čim

prej analizirati in ko ga pripravimo, rezultat čim prej odčitamo na pretočnem citometru. Pri

predpripravi vzorca je bolje uporabiti nekoliko večjo kot pa manjšo redčitev. Na določeno

viabilnost redčenje vzorcev nima bistvenega vpliva.


48

5.2. PRIMERJAVA ENOSTOPENJSKE IN DVOSTOPENJSKE METODE

Namen našega dela je bila primerjava določanja števila KMC z enostopenjsko in

dvostopenjsko metodo po ISHAGE protokolu. Delež KMC v vzorcih smo določali s

kombinacijo mPt CD34+ in CD45+, ki sta značilni za te celice. V rutini uporabljamo

dvostopenjsko metodo za določanje števila KMC. Absolutno število celic CD34+

(CD34+/μL) dobimo z izračunom, pri katerem vnesemo število levkocitov (109/L),

dobljenih s hematološkim analizatorjem, in delež CD34+ celic, dobljenih s pretočnim

citometrom. Pri enostopenjski metodi, ki smo jo izvajali za primerjavo, pa pretočni

citometer da vrednosti številčne koncentracije celic CD34+ (CD34+/μL).

S Spearmanovim koeficientom korelacije, smo pri primerjavi vseh rezultatov in v

posameznih skupinah dobili vrednosti večje od 0,9 iz česa sledi, da metodi dobro korelirata

znotraj vseh podatkov. Glede na rezultate v tabeli 3 lahko zaključimo, da metodi zelo

dobro korelirata tako za vse podatke, kot znotraj posamezne skupine.

Vzorce vseh preiskovancev smo razdelili po skupinah in jih statistično analizirali.

Rezultate smo tudi grafično prikazali. Mediana je v vseh primerih skoraj v središču

kvartilov Q1 in Q3. Vrednosti dobljene z Wilcoxonovim testom potrjujejo, da sta metodi v

primeru hematološki bolniki pred zbiranjem (venska kri) statistično med seboj primerljivi.

Vrednosti so v tem primeru >0,05. Da sta metodi statistično primerljivi le tej skupini

vzorcev, gre verjetno pripisati dejstvu, da gre za številčno najbolj homogeno skupino. Pri

ostalih skupinah je razpon rezultatov bistveno večji.

V ostalih skupinah so vrednosti <0,05 iz česar izhaja, da se metodi statistično razlikujeta.

Želeli smo preveriti, če je statistična različnost metod tudi klinično pomembna. Primerjali

smo rezultate enostopenjske in dvostopenjske metode v posameznih skupinah. Zanimalo

nas je, koliko vzorcev je po dvostopenjski in enostopenjski metodi v venski krvi manjših

ali večjih od 20x109/L. To število je ključno za odločanje, če se začne zbiranje KMC.

Od 137 določanj se je v 6 primerih rezultat razlikoval pri vrednosti 20x106/L 5 krat je

bil z enostopenjsko metodo večji, 1 krat pa z dvostopenjsko metodo. Pri 4,4% vzorcev

bi bila klinična odločitev za zbiranje različna.


49

Prav tako smo primerjali rezultate vzorcev hematoloških bolnikov, darovalcev in

kardioloških bolnikov po zbiranju (koncentrat). Pri koncentratih nimamo številčne

vrednosti, ki bi nam služila za neposredno oceno rezultatov. Zato smo kot merilo privzeli

relativno odstopanje metod za več kot 10%. Pri 28 vzorcih, ki so odstopali za več kot 10%,

je bilo 24 vzorcev, kjer je bil rezultat manjši pri dvostopenjski metodi in 4 vzorci, kjer je

bil rezultat manjši pri enostopenjski metodi. Več je vrednosti, kjer so rezultati z

dvostopenjsko metodo manjši od enostopenjske. Če privzamemo, da je za bolnika

bistveno, da zanesljivo dobi dovolj celic, potem je v splošnem zanesljiveje uporabljati

rezultat dvostopenjske metode. Vendar to seveda ne pomeni da je le ta natančnejša.


50

6. SKLEPI

Številčno koncentracijo celic CD34+ in njihovo viabilnost je potrebno določiti čimprej po

dostavi vzorca v laboratorij. Za lizo eritrocitov bi bilo priporočljivo uporabljati raztopino

Versa Lyse in po njenem dodatku čim hitreje odčitati rezultate s pretočnim citometrom.

Za določanje številčne koncentracije CD34+ celic (CD34+/μL) smo primerjali

enostopenjsko in dvostopenjsko metodo.

Določitev Spearmanovega koeficienta korelacije je pokazala dobro ujemanje rezultatov

med enostopenjsko in dvostopenjsko metodo. Z uporabo Wilcoxonovega testa smo

ugotovili, da sta metodi statistično primerljivi pri hematoloških bolnikih pred zbiranjem

(venska kri), v ostalih primerih pa se metodi statistično razlikujeta. Glede na oceno

klinične pomembnosti bi za analizo vzorcev hematoloških bolnikov v venski krvi gotovo

lahko uporabljali enostopenjsko metodo. Za določitev koncentracije CD34+ celic v

koncentratu, pa bi bilo potrebno dodatno preveriti, zakaj so rezultati dvostopenjske metode

večkrat manjši od enostopenjske.


51

7. LITERATURA

1. Pretnar J., Zver S., Andoljšek D., Černelč P., Podgornik H., Pajič T., Mlakar U.,

Modic M., Preložnik Zupan I.: Kostni mozeg in matične krvne celice; Bolezni krvi

in krvotvornih organov, Interna medicina, glavni uredniki Kocijančič, A., Mrevlje,

F., Štajer, D., 3. izdaja, Littera picta, d.o.o., 2005: 1172-73, 1183-84, 1191, 1284

2. Vidmar A. 2005. Seminarska naloga pri predmetu Imunologija v farmaciji.

http://www.farma-drustvo.si (25.02.2009)

3. Rožman P., Strbad M., Knežević M.: Uporaba matičnih celic v medicini; Razvoj

znanosti in vloga izobraževanja za družbo prihodnosti, Genialna prihodnost:

genetika, determinizem in svoboda, Zavod RS za šolstvo, Ljubljana, 2007: 2008

4. Ringaraja. Matične celice.

http://www.ringaraja.net/maticne-celice_13&55.html (25.02.2009)

5. Škoda I. K., Božjak M., Dobrovoljc A., Pretnar J.: Bolnik pred presaditvijo

krvotvornih matičnih celic in po njej. Obzornik zdravstvene nege (Strokovno

glasilo zbornice zdravstvene nege Slovenije), 1998; 91: 116-16

6. Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino.

http://www.ztm.si (25.02.2009)

7. Žontar D.: Določanje števila matičnih celic v presadku, Zbornik predavanj

(Hematološko društvo laoratorijskih tehnikov), Radenci, 1999

8. Domanović D.: Napovedna vrednost števila celic CD34+ v krvi bolnika/darovalca

pred zbiranjem krvotvornih matičnih celic z levkaferezami. Zdravniški vestnik

(Številka ob 2. kongresu hematologov in transfuziologov Slovenije z mednarodno

udeležbo), 2004; 187: 64

9. Domanović D.: Zbiranje in predelava krvotvornih matičnih celic iz placentne krvi.

Zdravljenje s krvjo, transfuzijska medicina v porodništvu (6. podiplomski seminar)

2004; 154:113-14

http://www.farma-drustvo.si/

http://www.ringaraja.net/maticne-celice_13&55.html


52

10. Neocelica. Matične celice.

http://www.neocelica.si (25.02.2009)

11. Sever M., Vrtovec B., Domanović D., Ležaič L., Fettich J.,Černelč P.:Presaditev

avtolognih krvotvornih matičnih celic v srce bolnikov z napredovalim srčnim

popuščanjem. Zbornik predavanj (Pridobivanje krvotvornih matičnih celic –

zdravljenje in zdravstvena nega bolnika ob presaditvi KMC); Zreče 2007; 42-43

12. Gratama J. W., Sutherland D. R., Keeney M., Papa S.: Flow cytometris

enumeration and immunophenotyping of hematopoietic stem and progenitor cells.

J. Biolo. Reg. Homeostatic Agents 2001;14-20

13. Beckman Coulter: stemCXP Operator Manuals CD-ROM, Ireland, 2005: 1-17

14. Sutherland D. R. 1996.

http://www.cyto.purdue.edu/hmarchiv/1996/2471.htm (12.01.2009)

15. Košmelj K. Uporaba statistike, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta,

Ljubljana, 2001: 43-49, 53-61

16. Ihan A.: Klinična uporaba analize limfocitnih populacij s pretočnim citometrom,

Kemomed, Ljubljana, 1999: 11-14

17. Ihan A.: Imunologija, Priročnik za vaje, Ljubljana, 2001: 13

18. Beckman Coulter: Stem-Kit Reagents,Copyright Beckman Coulter, Inc., France,

2007: 2-10

19. Wikipedija. Prosta enciklopedija.

http://sl.wikipedia.org (7.10.2009)

20. Wikipedia. The Free Encyclopedia.

http://en.wikipedija.org (7.10.2009)

http://www.neocelica.si/

http://www.cyto.purdue.edu/hmarchiv/1996/2471.htm

http://sl.wikipedia.org/

http://en.wikipedija.org/

univerza v ljubljani - ffa.uni-lj.si · comparison of one and two step determination of ......

Documents