Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Master rad

Odredjivanje antioksidativnih karakteristika odabranih gljiva

roda Lactarius

Mentor: Student:

dr Violeta Mitić Ana Vitković

Eksperimentalni deo ovog master rada je urađen u

istraživačkim labaratorijama katedre za Analitičku hemiju, Departmana

za hemiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu.

Veliku i iskrenu zahvalnost, ovom prilikom, upućujem svojoj

mentorki profesorki dr Violeti Mitić na izboru teme, stručnim savetima,

ukazanom strpljenju i razumevanju.

Posebnu zahvalnost bih ovom prilikom iskazala divnoj

doktorantkinji Mariji Dimitrijević na nesebičnoj pomoći i beskrajnom

strpljenju, na celokupnom "vođenju" tokom svih faza izrade ovog master

rada.

Zahvaljujem se i asistentkinji Jeleni Nikolić, na sugestijama

prilikom izrade eksperimentalnog dela ovog master rada.

Takođe bih se zahvalila i svojoj drugarici, koleginici na

neizmernoj podršci i ukazanim savetima tokom studiranja kao i pri

izradi ovog master rada.

Na kraju se zahvaljujem svojim roditeljima na svestranoj

pomoći i na tome što su mi pomogli da shvatim da je u životu važno

postavljati ciljeve i ne odustajati od započetog.

Sadržaj

1. Uvod____________________________________________________________________ 1

2. Nutritivni sastav gljiva _____________________________________________________ 3

3. Vrste gljiva Lactarius ______________________________________________________ 5

3.1. Lactarius piperatus _____________________________________________________ 5

3.2. Lactarius volemus ______________________________________________________ 6

3.3. Lactarius sanguifluus ____________________________________________________ 8

3.4. Lactarius semisanguifluus ________________________________________________ 9

4. Antioksidativna aktivnost ____________________________________________________ 11

4.1. Oksidativni stres _______________________________________________________ 11

4.2. Slobodni radikali ______________________________________________________ 13

4.3. Antioksidansi _________________________________________________________ 17

4.3.1. Primarna antioksidativna zastita ________________________________________ 19

4.3.2. Sekundarna antioksidativna zaštita ______________________________________ 21

4.3.2.1. Fenolna jedinjenja ________________________________________________ 22

4.3.2.1.1. Fenolne kiseline ______________________________________________ 25

4.3.2.1.2. Flavonoidi___________________________________________________ 29

5. UV-VIS spektrofotometrija __________________________________________________ 32

5.1. Nastajanje UV-VIS spektara _____________________________________________ 32

5.2. Konstrukcija i funkcija UV-VIS spektrofotometra __________________________ 35

6. Metode za određivanje antioksidativne aktivnosti ________________________________ 37

6.1. Metode koje ukjlučuju H-transfer reakcije _________________________________ 39

6.1.1. ORAC metoda (Oxygen radical absorbance capacity) _______________________ 39

6.1.2. TRAP metoda (Total radical trapping antioxidant parameter) _________________ 40

6.2. Elektron transfer metode (ET) ___________________________________________ 40

6.2.1. ABTS metoda (Scavengig of 2,2’-azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) Radical

Assay) _________________________________________________________________ 41

6.2.2. FRAP- metoda (Ferric Ion Reducing Antioxidant Power Assay) _______________ 41

6.2.3. DPPH metoda (Scavengig of 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil Radical Assay) ________ 42

6.2.4. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity) __________________________ 44

6.2.5. Metoda za određivanje ukupnog sadrţaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content-

TPC) ili FCR metoda (Folin Ciocalteu Reducing Capacity Assay) __________________ 44

7. Ekstrakcija rastvaračima različite polarnosti ____________________________________ 46

8. Priprema ekstrakta pečuraka_________________________________________________ 49

8.1. Aparatura i pribor _____________________________________________________ 49

8.2. Korišćeni reagensi _____________________________________________________ 49

9. Metode određivanja antioksidativne aktivnosti ___________________________________ 50

9.2. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity) __________________________ 50

9.3. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno radikalskog kapaciteta prema

2,2’-azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) (ABTS) radikalu _______________________ 50

9.4. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno-radikalskog kapaciteta prema

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikalu ___________________________________ 50

9.5. Odredjivanje antioksidacione aktivnosti merenjem ukupne redukcione moći ____ 51

10. Hemometrijska analiza ____________________________________________________ 52

11. Rezultati i diskusija _______________________________________________________ 54

11.1. Određivanje ukupnog sadržaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content-TPC)54

11.2. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity) _________________________ 55

11.3. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno radikalskog kapaciteta prema

2,2’-azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) (ABTS) radikalu _______________________ 58

11.4. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno radikalskog kapaciteta prema

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikalu ___________________________________ 60

11.5. Odredjivanje antioksidacione aktivnosti merenjem ukupne redukcione moći (TRP

metoda) __________________________________________________________________ 62

11.6. Klaster analiza _______________________________________________________ 64

12. Zaključak _______________________________________________________________ 67

13. Literatura _______________________________________________________________ 70

Uvod

1

1. Uvod

Gljive su organizmi koji se svrstavaju u posebno carstvo – carstvo gljiva,

Fungi (lat.). One su pričvršćene za podlogu, kao i biljke, ali nemaju hlorofil i ne mogu da vrše

fotosintezu. Hrane se heterotrofno, kao i ţivotinje, razlaţući gotovu hranu i upijajući hranljive

materije. Zbog ovakvih karakteristika nisu mogle biti svrstane ni u carstvo biljaka, ni u carstvo

ţivotinja, te su zato svrstane u posebno carstvo. Gljive po broju vrsta spadaju u organizme na

Zemlji, i predstavljaju posebno carstvo eukariota. Zajedničko za gljive i biljke su biljni hormoni,

a zajedničko za gljive i ţivotinje su hitinski ćelijski zid, pigment melanin i enzimi prisutni u

mitohondrijama.

Danas je poznato oko 100.000 vrsta gljiva, a pretpostavlja se da ih ima 15 puta više.

Nauka o gljivama - mikologija (od grčkog μύκης - gljiva, λόγος - nauka) - prošla je dug razvojni

put. Njenim rodonačelnikom smatra se grčki filozof Aristotel, koji je dao prve opise gljiva.

(Simpson DP., 1979).

Proučavanje lekovitosti gljiva je skorijeg datuma, bar kada je u pitanju naša, Zapadna

civilizacija. Kinezima su ta svojstva poznata već oko 4000 godina, a pisani dokumenti o

lekovitim dejstvima datiraju od pre 2000 godina. Najnovija istraţivanja, koja se danas sprovode

u Japanu, Kini, SAD, Rusiji pokazuju da su gljive koje su do sada smatrane samo konzumnim

delikatesima, ali i one druge, nejestive, tvrde i drvenaste izuzetno bitan faktor u podizanju

imuniteta u organizmu sisara. Sve vrste gljiva, koje danas nauka svrstava među lekovite, imaju

izrazito anti-bakterijsko, antioksidativno, antivirusno i antikancerogeno svojsto. Sva nabrojana

svojstva gljivama daju polisaharidi, triterpeni, razne kiseline (npr. ganodermička kiselina), ß-

glukan, vitamini, alkaloidi.

Gljive kao reducenti imaju izuzetno značajnu ulogu u prirodi. Razlaţući organsku

materiju, one dolaze u neposredni kontakt sa mnogim otrovima, koji su za ţive organizme veoma

opasni. Kako bi uspešno mogle da ostvare svoju ulogu koju imaju u ţivom svetu, gljive su

stvorile odbrambene mehanizme u odnosu na mnoge otrove iz prirodnog okruţenja u kome se

nalaze.

Gljive se u prirodi, razlaţući organsku materiju, a pre svega drvenaste otpatke, susreću sa

velikim količinama slobodnih radikala. Danas nauka zna da su slobodni radikali, kojih ima u

svakom ţivom organizmu odgovorni za mnoge procese starenja i brţeg propadanja tih

organizama. U drvetu ih ima najviše, kreću se kroz ţivo stablo udarajući molekule lignina.

Putem lančanih sudara među njma, brţe nastaju čvrsti delovi stabla, neophodni za rast u visinu,

ka sunčevoj svetlosti. Dok razlaţu lignin, gljive se bore sa tim slobodnim radikalima i fenolnim

jedinjenjima na koje se on raspada. Gljive imaju izrazito antioksidativno dejstvo i inhibiraju

slobodne radikale (Marjana Davidović, 2006).

Cilj ovog master rada je određivanje antioksidativnih karakteristika odabranih gljiva iz

roda Lactarius (Lactarius volemus, Lactarius piperatus, Lactarius semisanguifluus i Lactarius

sanguifluus) u rastvaračima različite polarnosti. Rastvarači različite polarnosti ekstrahuju

različite aktivne komponente, tj. antioksidanse.

2

Teorijski deo

3

2. Nutritivni sastav gljiva

Tokom čitave ljudske civilizacije, gljive su konzumirane uglavnom zbog dopadljivog i

jedinstvenog ukusa (Wani i sar., 2010). Danas su gljive cenjene ne samo zbog toga već i zbog

njihovih hemijskih i nutritivnih karakteristika (Ouzouni i sar., 2009). Pored visokokvalitetnih

proteina gljive su dobar izvor hranljivih supstanci: masti, vlakana, fosfora, kalijuma, kalcijuma,

gvoţđa (Manzi i sar., 2001; Mendil i sar., 2005; Soylak i sar., 2005) i vitamina prvenstveno B

grupe (tiamin, riboflavin, niacin i ergosterol (provitamin D2)) (Barros i sar., 2008a, b). Gljive su

izvor nezasićenih masnih kiselina, koje su bitne i značajne za ishranu i zdravlje, a koje čine

najmanje 70% ukupnog sadrţaja masnih kiselina gljiva. Različite studije na različitim vrstama

gljiva su opisane kao namirnice bogate vodom, mineralima, proteinima i ugljenim hidratima sa

niskim nivoom masti koje ih iz tog razloga čine pogodnim za niskokaloričnu ishranu.

Pored nutritivnog bogatstva, gljive se odlikuju bogatstvom specifične arome i teksture.

Budućnost široke upotrebe gljiva bazira se upravo na ekonomski pristupačnoj proizvodnji,

značajnoj nutritivnoj vrednosti gljiva i sadrţaju medicinski aktivnih materija koje povoljno utiču

na ljudski organizam (Barros i sar., 2008b). Veoma su prilagodljive na različitim staništima,

zbog izuzetnog metaboličkog potencijala, a pre svega zbog raznovrsnosti i brojnosti enzimskih

reakcija koje se odvijaju u njima. Mogu da sintetišu različite sekundarne metabolite, među

kojima su neki otrovni, a neki lekoviti za čoveka.

Hemijski sastav gljiva određuje njihovu hranljivu vrednost i organoleptičke osobine, a

razlikuje se u zavisnosti od vrste gljive, podloge na kojoj se razvija, atmosferskih uslova, starosti

i faze sakupljanja (Miles i Chang, 2004).

Smatra se da gljive sadrţe gotovo sve aminokiseline, a raspon ukupnih aminokiselina

kreće se od 93,6‐230 g/kg, i od 39,7‐86,8 g/kg za esencijalne aminokiseline. Pored nutritivnog

značaja aminokiseline u gljivama doprinose i ukusu gljiva. Sadrţaj proteina zavisi od vrste

gljiva, od supstrata na kome se razvijaju i vremena sakupljanja. Sastav i sadrţaj proteina i

aminokiselina se značajno menja sa procesom prezervacije i kuvanja. Sadrţaj proteina tokom

sušenja gljiva pri temperaturi od 40°C je skoro stabilan, dok se procesom termičke obrade sveţih

gljiva sadrţaj proteina značajno menja, odnosno smanjuje (Barros i sar., 2007).

Sadrţaj ukupnih lipida u gljivama je nizak. Ukupni lipidi gljiva sadrţe predstavnike svih

klasa lipidnih jedinjenja uključujući: slobodne masne kiseline, monogliceride, digliceride,

trigliceride, sterole, sterolne estre i fosfolipide. Desetine masnih kiselina su identifikovane u

lipidnim frakcijama gljiva. Visok udeo nezasićenih masnih kiselina u gljivama jeste značajan

faktor u pogledu osobine koje ukazuju da gljive predstavljaju zdravu hranu (Miles i Chang,

2004).

Procenat ugljenih hidrata je značajan i predstavlja od 50 do 65% sadrţaja gljiva (Wani i

sar., 2010). Od ugljenih hidrata najviše su zastupljene pentoze (ksiloze, riboze) i heksoze

4

(glukoza, fruktoza, galaktoza, manoza), dominantan je šećerni alkohol manitol, šećerne kiseline,

amino‐šećeri i hitin (Miles i Chang, 2004).

Mineralne komponente gljiva mogu se podeliti na makroelemente i mikroelemente.

Makroelementi su: K, Na, Mg, P i S, dok su mikroelementi: Cu, Co, Fe, J, Mn, Mo, Zn i Se.

Mikroelementi, su esencijalni sastojci hrane, neophodni za normalno funkcionisanje organizma,

a potrebni su u vrlo malim količinama. Sadrţaj makro konstituenata kao što su: natrijum, kalijum

i fosfor je pribliţno konstantan, dok se sadrţaj kalcijuma, magnezijuma i sumpora menja u

zavisnosti od sastava supstrata na kome se gljiva razvija (Rudawska i Laski, 2005).

5

3. Vrste gljiva Lactarius

Mlečnice (Lactarius) imaju prljavo beo do bledo smedj šešir. Listići ne dopiru do drške.

Sve vrste imaju u svim delovima mlečni sok (beo, ţuckast, narandţast, zelen, ljubičast, bezbojan-

u zavisnosti od vrste), koji pri minimalnoj povredi gljive curi u vidu kapljica. Mlečni sok se

obično oksiduje u kontaktu sa vazduhom u zelenkastu ili tamno braon boju. Gljive sa belim

sokom su ljute i slabijeg kvaliteta, one sa narandţastim su delikatesne. Krte su i lomljive.

3.1. Lactarius piperatus

Među ljutim mlečnicama postoji jedna sekcija piperate - paprenjače, koja se smatra

jestivom. To su bele, ne mnogo velike gljive, čiji su šeširi postavljeni na visokim i tankim

drškama. Predstavnik je Lactarius piperatus (Slika 1 i 2).

Slika 1. Taksonomija gljive Lactarius piperatus

Klobuk je od 5-15cm. U mladosti je konveksan, kasnije se raširi i udubi poput levka.

Koţica klobuka je glatka, moţe biti sa sitnim naborima bez sjaja. Klobuk je potpuno bele boje,

vrlo mesnat i suv. Listići neobično gusti, uski, prema rubu klobuka mogu biti toliko stisnuti da se

vijaju, račvaju i lagano se spuštaju niz stabljiku, U početku su bele boje, starenjem poprimaju

krem - ţutu nijansu, a kasnije mogu biti smeđe sa zelenkastim mrljama. Stabljika je visoka do

12cm, debljine do 3cm, puna, tvrda, gola i glatka. Meso je prilično debelo, tvrdo, zrnasto i trošne

strukture. Na povređenim mestima ispušta dosta belog mlečnog soka, koji obično oksiduje u

kontaktu sa vazduhom u zelenkastu ili tamno braon boju. Mlečni sok i meso su jako ljutog ukusa,

bez mirisa.

Lactarius piperatus

Klasa

Agaricomycetes

Red

Russulales

Porodica

Russulaceae

Rod

Lactarius

Vrsta

piperatus

6

Njeno stanište je takvo da raste svuda po šumama od jula do kraja jeseni. Jestiva je ali

zbog drastično ljutog ukusa koji zadrţava i nakon kuvanja, dosta istraţivača piše da je sumnjiva.

Moţe se osušiti i samleti u prah pa se koristiti kao začin u jelima (Romano Božac, 1978).

Slika 2. Lactarius piperatus

3.2. Lactarius volemus

Presnac ili presna mlečnica ( Lactarius volemus) je vrsta jestive gljiva iz porodice

Russulaceae (Slika 3 i 4).

Slika 3. Lactarius volemu

7

Klobuk je narandţastosmeđ, kasnije svetliji, u sredini tamniji i udubljen. U početku ima

uvijen gladak rub, podvijen, i širok od 5-12cm. Listići su bledoţuti, kasnije potamne. Jako su

gusti i tanki. Stabljika je visine do 12 cm a debljine do 3cm. Ona je valjkastog i pravilnog oblika,

čvrsta, puna, a pre svega glatke površine. Stabljika je sličnih boja kao i klobuk, ali obično

svetlijih nijansi, a u vrhu klobuka blizu listića belkaste boje. U samoj bazi stabljika je obično

malo suţena i na tom mestu je isto beličaste boje. Meso je prilično debelo, čvrsto, kompaktno, na

jači pritisak lako puca i odvaja se u većim komadima. Na povređenim mestima ispušta beli

mlečni sok, koji obično oksiduje u kontaktu sa vazduhom u blago smeđu boju. Mleko je lepljivo,

i vrlo karakterističnog mirisa koji podseća na ribe (najviše na haringe), kuvane rakove ili školjke.

Ukus mesa je sladak, blag i prijatan (Matija Josipović, 2012).

Rasprostranjena je u Evropi, Aziji i Severnoj Americi. Raste pojedinačno ili u grupama.

U Aziji se prodaje i na pijacama.

Jestiva je, vrlo cenjena, moţe se jesti i sirova. Slabo podnosi zamrzavanje i sušenje.

Slika 4. Taksonomija gljive Lactarius volemus

Lactarius volemus

Klasa

Agaricomycetes

Red

Russulales

Porodica

Russulaceae

Rod

Lactarius

Vrsta

volemus

8

3.3. Lactarius sanguifluus

Lactarius sanguifluus poznatija kao Krvna mlečnica ili Vrsovnica. Jedna je od najukusnijih

gljiva iz porodice Russulaceae (Slika 5 i 6).

Slika 5. Lactarius sanguifluus

Klobuk je veličine od 6-15cm, širok. Pojedini primerci mogu biti bledo narandţasti, dok

drugi mogu biti dosta tamniji. Kod starijih primeraka javljaju se zelenkaste mrlje, sa manje ili

više vidljivim koncentričnim krugovima. Listići su vrlo gusti, lagano se spuštaju niz stabljiku. U

mladosti su listići narandţaste boje, dok starenjem poprimaju srvenoljubičastu nijansu. Stabljika

visine do 7cm a debljine do 3 cm, bela, sa narandţastom nijansom a često i boje mesa. Zrnaste

strukture koja na povređenim mestima ispusta mleko crvene boje poput krvi, koje obično

oksiduje u kontaktu sa vazduhom u smeđecrvenu boju. Raste tokom leta i jeseni, isključivo u

borovoj šumi (Heilman-Clausen J. i sar., 1998). Na stabljici se nalaze nepravilne jame tamnije

boje po kojima se razlikuje od vrste Lactarius semisanguifluus.

Jestiva je, slatkog (voćnog) ukusa, mada za pojedince preslatka. Ne podnosi kuvanje,

mogu se zamrznuti ali su najbolje ako se pripreme sveţe (pečenje, pohovanje ili ukiseljavanje).

9

Slika 6. Taksonomija gljive Lactarius sanguifluus

3.4. Lactarius semisanguifluus

Lactarius semisanguifluus je jestiva gljiva iako nema preterano lep ukus. Sinonim za nju

je polukrvava mlečnica ili Brinovka (Slika 7 i 8). Spada u porodicu Russulaceae.

Slika 7. Lactarius semisanguifluus

Klobuk je širine od 3 do 6 cm, izrazito išaran koncentričnim krugovima. Udubljen, sa

podvijenim ivicama. Boja klobuka je narandţasta, dok starenjem preovladava zelena boja. Listići

Lactarius sanguifluus

Klasa

Agaricomycetes

Red

Russulales

Porodica

Russulaceae

Rod

Lactarius

Vrsta

sangifluus

10

gusti, silaze niz stabljiku. Narandţaste su boje a prema osnovi crvenkasti. Stabljika je kratka 2-

3cm, u nijansama klobuka. Meso je relativno tanko, pastelno narandţasto a prema ivicama

narandţasto, a u jezgru stabljike bele boje. Na preseku meso ispusta naranđasto mleko, koje

nakon par minuta postaje krvavo crveno, nakon toga prelazi u vinsko crveno, i na kraju pozeleni.

Mleka ima najviše u donjem delu stabljike. Gorkog, ljutkastog ukusa, koje prilikom prţenja gubi

ţestinu i dobija na kvalitetu.

Njeno stanište je pvenstveno u planinskoj oblasti, kao i u jelinim i borovim šumama.

Raste naročito sa spoljne strane šume, gde se moţe grupisati u linije i od nekoliko kilometara

(Uzelac B., 2009).

Slika 8. Taksonomija gljive Lactarius semisanguifluus

Lactarius semisanguifluus

Klasa

Agaricomycetes

Red

Russulales

Porodica

Russulaceae

Rod

Lactarius

Vrsta

semisangiufluus

11

4. Antioksidativna aktivnost

4.1. Oksidativni stres

Opstanak aerobnih organizama na Zemlji uslovljen je prisustvom molekulskog kiseonika

(O2). U metaboličkim procesima u ćelijama ovih organizama najveći deo kiseonika potpuno se

redukuje do vode u respiratornom lancu ili se transformiše enzimskim reakcijama (Kojić, 2009).

Međutim, jedan mali deo (2-3 %) ukupnog kiseonika u ćeliji se transformiše u reaktivne

kiseonične oblike (ROS - Reactive Oxygen Species, Slika 9), koji su u stanju da reaguju sa

osnovnim ćelijskim biomolekulima i strukturama i da izazovu njihovu inaktivaciju (Halliwell i

Gutteridge, 1985, Mimica - Dukić, 1997). To su metaboliti nastali iz moleklula kiseonika, sadrţe

atome kiseonika i poseduju veću reaktivnost od kiseonika u osnovnom molekulskom stanju (Hu,

2001).

Slika 9. Uzrok nastajanja ROS-a i njegovo dejstvo

Produkcija kiseoničnih radikala u organizmu odvija se u nizu kataboličkih i anaboličkih

procesa: u respiratornom lancu, oksidacijom ćelijskih biomolekula (tiola, hidrohinona,

kateholamina, oksihemoglobina), dejstvom enzima (ksantin oksidaze, lipooksigenaze,

prostaglandin sintetaze i dr.), dejstvom dvovalentnih metalnih jona. (Sayre i sar., 1999; Cadenas

12

i Davies, 2000; Božin, 2009). Hiperprodukcija reaktivnih kiseoničnih oblika moţe biti

indukovana različitim endogenim (process respiracije, aktivnost fagocita, autooksidacija

biomolekula) i egzogenim (jonizujuće i UV-zračenje, kontaminirani vazduh, alkohol,

ksenobiotici, pojedini lekovi, itd.) faktorima (Gutteridge i sar., 1985; Arai i sar., 1987).

Nekoliko jakih oksidanasa se formira u toku odvijanja metaboličkih procesa, u krvnim i

drugim ćelijama oranizma: superoksidni anjon radikal (O2•-), vodonik peroksid (H2O2), peroksil

radikal (ROO•) i hidroksil radikal (OH

•).

Hemijska jedinjenja koja mogu da se transormišu u potencijalno toksične kiseonične vrste

u organizmu nazivaju se pro-oksidansi. Sa druge strane, jedinjenja koja smanjuju štetan uticaj

pro-oksidanasa, njihovo stvaranje i reakcije su antioksidansi (NADPH, GSH, vitamin C i vitamin

E).

Tokom evolucije razvijeni su zaštitni mehanizmi koji sprečavaju nastanak ili razlaţu već

nastale prooksidativne vrste, popravljaju i menjaju oštećene molekule. Pod normalnim uslovima

produkcija prooksidativnih vrsta je u ravnoteţi sa antioksidativnom zaštitom organizma.

Međutim, pod uticajem različitih endogenih i/ili egzogenih faktora koji deluju stresno, ova

ravnoteţa moţe da se naruši, odnosno moţe da dođe do povećane produkcije prooksidanata i/ili

smanjenja antioksidativne zaštite organizma. Ovakvo stanje naziva se oksidativni stres (Slika

10), i uzrok je mnogih oboljenja (arteroskleroza, kancer, kardiovaskularna oboljenja, astma,

artitis, gastritis, dermatitis, dijabetes, bolesti jetre, bolesti bubrega, zapaljenski procesi,

Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest itd).

Slika 10. Oksidativni stress

13

4.2. Slobodni radikali

Slobodni radikali su hemijske vrste koje poseduju jedan (ili više) nesparenih elektrona.

Zbog toga što imaju nesparene elektrone vrlo su reaktivni i neselektivni. Mogu biti

elektroneutralni ali i pozitivno ili negativno naelektrisani (radikal katjoni i radikal anjoni).

Slobodni radikali nastaju homolitičkim raskidanjem postojeće hemijske veze (termolizom,

fotolizom, zračenjem visoke energije) ili oksidoredukcionim procesima.

Reaktivne vrste se dele na reaktivne slobodnoradikalske i neradikalske (oksidaciona

sredstva koja lako prelaze u slobodne radikale) vrste. Najvaţnije reaktivne vrste kiseonika (ROS

-od engl. reactive oxygen species), hlora (RCS - od engl. reactive chlorine species) i azota (RNS

- od engl. reactive nitrogen species) date su u Tabeli 1. (Halliwel i Whiteman, 2004).

Tabela 1. Najvaţnije reaktivne vrste

Slobodni radikali Neradikalski oblici

Reaktivne kiseonične vrste (ROS)

superoksid anjon, O2•-

hidroksi radikal, OH•

hidroperoksidni radikal, HO2•

peroksi radikal, RO2•

alkoksi radikal, RO•

karbonatni radikal, CO3•

ugljendioksidni radikal, CO2•

vodonik peroksid, H2O2

hipobromna kiselina, HOBr

hipohlorna kiselina, HOCl

ozon, O3

singletni kiseonik, 1

O2

organski peroksid, ROOH

peroksinitrit, ONOO

peroksinitritna kiselina, ONOOH

Reaktive hloridne vrste (RCS)

atomski hlor, Cl•

hipohlorna kiselina, HOCl

nitril (nitronijum) hlorid, NO2Cl

hloramini

Reaktivne azotne vrste (RNS)

azotmonoksidni radikal, NO•

azotdioksidni radikal, NO2

azotasta kiselina, HNO2

nitrozo katjon, NO+

nitroksidni anjon, NOdinitrogen

tetroksid, N2O4

dinitrogen trioksid, N2O3

peroksinitrit, ONOO

peroksinitritna kiselina, ONOOH

nitronijum (nitril) katjon, NO2+

alkilperoksinitriti, ROONO

nitril (nitrinijum) hlorid, NO2Cl

14

Nastanak slobodnih radikala u ţivim ćelijama je vezan kako za različite procese u

spoljašnjoj sredini (jonizujuće, ultraljubičasto i toplotno zračenje, biohemija azotovih oksida i

dr.) tako i za procese koji se odigravaju u samoj ćeliji. Ti procesi obuhvataju:

- oksidativnu fosforilaciju (u mitohondrijama),

- oksidativnu hidroksilaciju (u mikrozomima),

- fagocitozu,

- katalitiĉke reakcije nekih enzima (oksidaza),

- procese lipidne peroksidacije,

- reakcije oksidoredukcije u prisustvu metala sa promenljivom valencom i dr. (Koraćević i

sar., 2003)

Slobodni radikali kao izuzetno reaktivne hemijske vrste dovode do oksidativnog

oštećenja ćelijskih struktura velikim brojem mehanizama:

- peroksidacija polinezasidenih masnih kiselina praćena je poremećajem propustljivosti i

fluidnosti membrana,

- oksidacija tiolnih grupa enzima dovodi do inaktivacije enzima,

- obrazovanje unakrsnih veza između MDA i fosfolipida odnosno proteina u ćelijskoj

membrani menja adaptivnu sposobnost biomembrana,

- oksidativno cepanje molekula nukleinskih kiselina dovodi do mutacija i kancerogeneze.

Svaki tip molekula moţe biti oštećen ovim procesom, što moţe imati mnoge negativne

posledice. Lipidna peroksidacija je najizrazitiji negativni fenomen u delovanju slobodnih

radikala i predstavlja autokatalitički, najčešće ireverzibilan proces. Peroksidacija polinezasićenih

masnih kiselina prolazi kroz stadijum inicijacije, stadijum propagacije (stadijum dalje

peroksidacije i grananja reakcija oksidacije) i stadijum terminacije (Slika 11). Ovaj

autokatalitički ciklus se moţe propagirati sve dok se lanac reakcija ne prekine sjedinjavanjem

dva radikala u neradikalski proizvod. Međutim, najčešće dolazi do stacionarnog, ali ne i do

trajnog zaustavljanja procesa jer akumulirani proizvodi lipidne peroksidacije mogu biti sami po

sebi reaktivni.

Inicijaciju lipidne peroksidacije moţe pokrenuti bilo koji oksidans sposoban da oduzme

atom vodonika koji se nalazi u α-poloţaju od mesta dvostruke veze u molekulu masne kiseline iz

lipidne membrane. Od svih kiseoničnih radikala najveći oksidacioni potencijal ima

hidroksilradikal pa je on najčešće odgovoran za inicijaciju ovog procesa.

U fazi inicijacije pored alkil radikala nastaju i drugi primarni produkti lipidne

peroksidacije (konjugovani dieni, peroksidni radikali i lipidni hidroperoksidi).

Druga faza ovog procesa predstavlja degradaciju nestabilnih primarnih produkata pri

čemu se dobijaju brojni sekundarni produkti: kratkolančani ugljovodonici, aldehidi i ketoni, kao i

krajnji proizvod lipidne peroksidacije – malon dialdehid (MDA). Pored brojnih sekundarnih

proizvoda stvaraju se i novi radikali koji omogućavaju nastavak slobodnoradikalske reakcije i

uslovljavaju da se lipidna peroksidacija lančano ponavlja. Vrlo reaktivni sekundarni proizvodi,

posebno MDA, reaguju sa slobodnim SH i NH2 grupama aminokiselina, peptida, proteina,

15

nukleotida i fosfolipida dovodeći do kovalentne modifikacije ovih makromolekula što za

posledicu ima gubitak njihove funkcije.

Slika 11. Lipidna peroksidacija

Lipidna peroksidacija se moţe kontrolisati ili ukloniti korišćenjem sintetičkih

antioksidanasa kao što je BHT (butilovani hidroksi toluen) i BHA (butilovani hidroksi anizol)

koji se hrani dodaju kao aditivi.

Slobodni radikali nastaju:

- termolizom,

- elektromagnetnom radijacijom,

- redoks reakcijama,

- enzimskim reakcijama,

- hemijskim procesima.

Slobodni radikali nastaju (Slika 12) pucanjem veza unutar molekula u ćelijama

organizma, a pod uticajem različitih faktora, kao što su: pušenje, izloţenost jonizirajućem

zračenju, UV zracima, zagađenom vazduhu, kao posledica metaboličkih procesa i upale.

16

Slika 12. Nastajanje slobodnih radikala

Kako bi se što efikasnije odbranili od negativnih efekata slobodnih radikala, potrebno je

izbegavanje izlaganja delovanju slobodnih radikala, kao i unošenju što većih količina

antioksidansa u organizam.

Slobodni radikali oštećuju sve ćelijske strukture: ćelijsku membranu, ćelijske organele, a

najveća šteta nastaje kada dođe do oštećenja genetskog materijala, DNK (Slika 13). Promene u

genima vode ka mutacijama, a mutacije ćelija mogu dovesti i do nastanka malignh oboljenja.

Oštećenjem zidova krvnih sudova omogućava se razvoj i napredovanje ateroskleroze. Ako

kancerogene ćelije počnu da se razvijaju neograničeno nastaju tumori. U poslednje vreme došlo

je do epidemije malignih oboljenja, a pretpostavlja se da je to velikim delom zbog mnogo veće

izloţenosti stanovništva zagađenjima vode, vazduha, hrane i ţivotom pod stalnim stresom.

Slika 13. Delovanje slobodnih radikala na zdravu ćeliju

Slobodni radikali se neprekidno stvaraju i neutrališu u organizmu. Problem nastaje kada

se oni stvaraju većom brzinom nego što organizam moţe da ih neutrališe, a do toga dolazi u

uslovima stresa, kod povećanih fizičkih i umnih naprezanja, pod dejstvom otrova, pesticida,

herbicida, duvanskog dima, zračenja, izduvnih gasova, prekomernog sunčanja, nekih lekova.

Kada se slobodni radikali stvaraju većom brzinom nego što organizam moţe da ih neutrališe,

17

nastaju uslovi za propadanje čelija i razvoj bolesti. Mnoga oboljenja nerava, krvnih sudova, srca,

tumori povezuju se upravo sa povećnom izloţenošću nekim štetnim agensima, koji su preko

stvaranja slobodnih radikala doveli do razvoja bolesti. Slobodni radikali takođe ubrzavaju

starenje organizma, jer dovode do ubrzanog propadanja ćelija (Todorović M. i sar., 1997).

4.3. Antioksidansi

Najšire prihvaćena definicija bioloških antioksidanasa jeste ona koju je dao Halliwell

(1990), a prema kojoj su antioksidansi "supstance koje prisutne u malim koncentracijama u

odnosu na supstrat (biomolekul) koji se oksiduje, značajno usporavaju ili sprečavaju oksidaciju

tog supstrata". Antioksidansi neutrališu slobodne radikale donirajući im jedan svoj elektron, ali

otpuštanjem elektrona oni ne postaju slobodni radikali (Slika 14).

Slika 14. Mehanizam stabilizacije slobodnog radikala antioksidansom

Delovanje antioksidanasa (Aruoma, 1996) zasniva se na njihovoj sposobnosti da:

- deluju kao "skevindţeri" slobodnih radikala, odnosno donori elektrona ili H-atoma,

- kompleksiraju jone metala, sprečavajuci njihovu katalitičku funkciju u procesima,

- razgrađuju hidro-perokside lipida, transformišuci ih u neradikalske vrste,

- sprečavaju dejstvo singletnih oblika kiseonika,

- inhibiraju neke enzime,

- pokazuju sinergističke efekte,

- redukuju neka jedinjenja.

Shi i sar. (2001) klasifikovali su antioksidanse prema nivou i načinu delovanja u

ljudskom organizmu na: preventivne antioksidante, "skevndţer" antioksidanse i "reparacione"

antioksidanse.

Preventivni antioksidansi sprečavaju nastanak slobodnih radikala. "Skevendţer"

antioksidansi poseduju sposobnost da "hvataju" slobodne radikale. "Reparacioni" antioksidansi

18

deluju posebnim mehanizmima, obnavljujući ili uklanjajući oštećene vitalne biomolekule koji

nastaju u uslovima oksidativnog stresa. U "reparacione" antioksidanse ubrajaju se fosfolipaze,

proteaze, enzimi koji obnavljaju DNK, transferaze, itd.

Prema rastvorljivosti ovi antioksidansi se dele na hidrosolubilne (vitamin C, mokraćna

kiselina, bilirubin, albumin, glutation, neki polifenoli) i liposolubilne (vitamini E i A,

karotenoidi, neki polfenoli) (Vaya i sar., 2001).

Prema mestu nastajanja antioksidansi značajni za ljudski organizam dele se na: endogene

i egzogene. Endogeni antioksidansi predstavljaju antioksidanse koji nastaju u ljudskom

organizmu, dok se egzogeni unose putem hrane ili lekova. Fenolna jedinjenja su jedna od

najvaţnijih grupa prirodnih egzogenih antioksidanasa, čija je aktivnost uslovljena strukturnim

karakteristikama.

Skorija istraţivanja pokazuju da što je ishrana bogatija prirodnim antioksidansima to je

manja učestalost bolesti u ispitivanoj populaciji (Krishnaiah i sar. 2011). Takođe je pokazana

veza između reaktivnih kiseoničnih vrsta i raznih degenerativnih bolesti uključujući: dijabetes,

kancer, artritis, kardiovaskularne bolesti, Alchajmerove i Parkinsonove bolesti, Daunovog

sindroma, starenja i dugih (Aruoma, 2003). Brojne studije su potvrdile korisno dejstvo prirodnih

antioksidanasa (Denisov i Afanasev, 2005).

Antioksidansi mogu biti prirodne ili sintetičke supstance koje imaju sposobnost da se

suprotstave oksidaciji ili da inhibiraju reakcije koje iniciraju reaktivne vrste. Zbog toksikoloških

razloga prekomerna upotreba sintetičkih antioksidanasa je dovedena u pitanje, a zahtevi

potrošača su usmereni ka korišćenju prirodnih antioksidanasa (Slika 15) (Moure i sar., 2001).

Vitamin C Vitamin E (α-Tokoferol)

Kvercentin Koenzim Q10 (ubihinon)

Slika 15. Neki prirodni antioksidansi

19

Najčešće korišceni sintetički antioksidansi u prehrambenim proizvodima su butilovani

hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), propilgalat (PG) i tercbutilhidrohinon

(TBHQ) (Slika 16).

Slika 16. Neki sintetički antioksiodansi

4.3.1. Primarna antioksidativna zastita

Ţivot u sredini bogatoj kiseonikom i odvijanje aerobnog metabolizma ne bi bili mogući

bez prisustva antioksidativnih sistema zaštite od reaktivnih kiseoničnih metabolita. Tokom

evolucije došlo je do razvoja enzima, koji zajedno sa određenim jedinjenjima manje molekulske

mase sačinjavaju sistem zaštite od oksidacionih oštećenja. Superoksid dismutaza, glutation

peroksidaza i katalaza čine enzimske siteme koji učestvuju u primarnoj antioksidativnoj zaštiti.

Superoksid-dismutaze (SOD) predstavljaju grupu enzima prisutnih u svim aerobnim

organizmima. Imaju ulogu u procesima katalize reakcije dismutacije superoksid anjon-radikala

do vodonik peroksida i molekulskog kiseonika (Reakcija 1). Premda obavljaju istu funkciju,

postoji više vrsta superoksid-dismutaza koje se razlikuju po vrsti metala koji se nalazi u

aktivnom centru (Cu, Mn, Zn, Ec).

2O2-

+ 2H+→ H2O2 + O2

Cu, Zn-SOD (Citosolna superoksid dismutaza) se nalazi u svim ćelijama, gde je

uglavnom locirana u citosolu, dok aktivno dejstvo ispoljava i u lizozomima, peroksizomima,

jedru i prostoru između unutrašnje i spoljašnje membrane mitohondrija. Cu predstavlja aktivno

redoks mesto, a Zn je vaţan za strukturnu stabilizaciju aktivnog mesta.

20

Mn-SOD (Mitohondrijska superoksid dismutaza) ima formu tetramera i lokalizovana je u

mitohondrijama. Funciju ispoljava u procesima diferencijacije ćelija, genezi tumora, kao i zaštiti

od plućne intoksikacije izazvane hiperoksijom.

Ec-SOD (Vanćelijska (ekstracelularna dismutaza)) je lokalizovana u vanćelijskom

prostoru. Ova forma takođe sadrţi Cu i Zn u svom aktivnom centru. Novija istraţivanja ukazuju

na činjenicu da je ovaj enzim prisutan u dva oblka, ali da je samo jedan od njih aktivan.

Katalaza (CAT) je tetramer koji u svakoj subjedinici sadrţi hem grupu kao deo aktivnog

centra enzima. Katalizuje razgradnju vodonik-peroksida do molekulskog kiseonika i vode.

Reakcija je dvostepena i iziskuje vezivanje dva molekula vodonik-peroksida:

CAT + H2O2 → Jedinjenje I

Jedinjenje I + H2O2 → CAT + H2O + O2

Peroksidaze su velika grupa enzima koje katalizuju reakciju razgradnje vodonik-

peroksida i drugih organskih peroksida:

H2O2 + 2GSH GPx 2H2O + GSSG

Glutation peroksidaza (GPx) je tetramerni enzim sa selenom u aktivnom centru koji

uklanja vodonik-peroksid i pri niskim koncentracijama (kada je mala verovatnoća za odigravanje

Reakcija 2). Da bi mogla kontinuirano da se odvija Reakcija 3 neophodna je stalna regeneracija

oksidovanog oblika glutationa (GSSG) što se postiţe reakcijom koju katalizuje glutation-

reduktaza (GR) :

GSSG + 2NADPH + H+ GR 2GSH + NADP

+

Glutation S-transferaza je enzim koji katalizuje vezivanje glutationa preko sulfhidrilnih

grupa za elektrofilne centre hidrofobnih molekula. Na ovaj način molekuli postaju rastvorljiviji u

vodi i lakše se transportuju do vakuole ili apoplasta. Među supstratima ovih enzima se nalaze

neki sekundarni biomolekuli biljaka kao i veliki broj ksenobiotika. Ovi enzimi su odgovorni za

detoksifikaciju elektrofilnih i veoma citotoksičnih proizvoda lipidne peroksidacije izazvane

oksidativnim stresom (Stojković M., 2014).

U sistem primarne antioksidativne zaštite ubrajaju se i neenzimske supstance kao što su

proteini transferin i ceruloplazmin koji imaju bitnu ulogu u transportu metalnih jona, zatim

albumin, mokraćna kiselina i bilirubin. Svi navedeni primarni antioksidanti čine koordiniranu

odbranu organizma od reaktivnih radikalskih oblika.

21

4.3.2. Sekundarna antioksidativna zaštita

Sistem sekundarne antioksidativne zaštite čine brojna niskomolekularna jedinjenja

različitog porekla i karaktera, kao što su ubihinon, L-askorbinska kiselina, tokoferoli,

karotenoidi, fenoli i njihove kiseline, flavonoidi, derivati hidroksicinamata i dr. (Mimica-Dukić,

1997). Kako je struktura ovih jedinjenja veoma raznovrsna, tako su različiti i mehanizmi kojima

ona ostvaruju svoju aktivnost u sistemu antioksidativne zaštite. Najčešće su to hvatači

("skevendţeri") slobodnih radikala, donori protona, inhibitori enzimskih sistema, helatori jona

prelaznih metala, itd. U sistem sekundarne antioksidativne zaštite mogu se ubrojiti i enzimi koji

aktivno učestvuju u otklanjanju oksidativnih oštećenja nukleinskih kiselina, lipida i proteina, kao

što su: endo i egzonukleaze, DNK polimeraze i ligaze, fosfolipaza A2, GSHPx i fosfolipid-

zavisna GSHPx, glikozilaze, kao i brojni proteolitički enzimi. Ovi enzimi "popravljaju" oštećene

molekule DNK, uklanjaju oksidovane masne kiseline membranskih lipida i kroz procese

resinteze obnavljaju oksidovane aminokiseline i proteine.

Askorbinska kiselina (vitamin C) uklanja superoksid anjon-radikal i vodonik-peroksid pri

čemu nastaje semidehidro-askorbat koji je radikal ali nije reaktivan. Reakcijom dva molekula

dobija se askorbinska i dehidro-askorbinska kiselina.

Slika 17. Oksidacija askorbinske kiseline

-tokoferol (vitamin E) kao liposolubilna komponenta zaštite od oksidacionih oštećenja

reaguje sa slobodnim radikalima u ćelijskoj membrani i pri tome nastaje radikal vitamina E.

Slaba reaktivnost ovog radikala je posledica delokalizacije nesparenog elektrona u aromatičnom

jezgru. Vitamin C redukuje radikal vitamina E na prelazu iz lipidne u vodenu fazu (Stojković M.,

2014).

Slika 18. -tokoferol

22

4.3.2.1. Fenolna jedinjenja

Fenolna jedinjenja predstavljaju široko rasprostranjenu grupu biljnih metabolita koja

mogu biti vrlo jednostavne strukture, kao što su fenolne kiseline ili vrlo sloţene strukture, kao

što su kondenzovani tanini. Zajednička karakteristika fenolnih jedinjenja je da sadrţe aromatičan

prsten sa jednom ili više hidroksilnih grupa (koje mogu biti metilovane ili esterifikovane). Do

danas je identifikovano više od hiljadu različitih prirodnih fenola, u slobodnom obliku ili češće u

obliku glikozida (Leucuta i sar., 2005). Monosaharidi koji najčešće ulaze u sastav glikozida su:

glukoza, galaktoza, arabinoza, ramnoza, ksiloza, manoza, glukuronska i galakturonska kiselina,

pored toga šećeri mogu biti prisutni u obliku: mono-, di-, tri-, ili tetra-saharida.

Fenolna jedinjenja su veoma značajna kako za organoleptičke osobine hrane tako i za

njene pozitivne zdravstvene efekte. Najvaţnija dejstva fenolnih jedinjenja su: antioksidativno,

antibakterijsko i antivirusno (Lampe, 1999). Neka polifenolna jedinjenja imaju ulogu biljnih

pigmenata. Fenolna jedinjenja su integralni deo strukture ćelijskog zida, uglavnom kao polimeri

(lignini). Ove strukture sluţe kao mehanička barijera u odbrani od mikroorganizama. Lignini su,

posle celuloze, najzastupljenije organske strukture na Zemlji (Wallace i Fry, 1994; Strack,

1997).

Fenolna jedinjenja se akumuliraju uglavnom u ćelijskim zidovima (Guern i sar., 1987;

Monties, 1989) i to najvećim delom na površini ploda (epidermalni i subepidermalni slojevi), jer

biosinteza ovih jedinjenja zavisi od svetlosti (Wollenweber, 1994; Macheix i sar., 1990).

Akumulacija fenolnih jedinjenja varira i u zavisnosti od fiziološkog stanja biljke, kao rezultat

ravnoteţe između biosinteze i daljeg metabolizma (Macheix i sar., 1990; Harborne, 1994).

Brojna istraţivanja potvrđuju da je koncentracija polifenolnih jedinjenja manja u zrelom plodu,

osim kod crvenih plodova kod kojih se flavonoidi i antocijani akumuliraju tokom sazrevanja

(Britton, 1983; Macheix i sar., 1990).

Iz stabljika, lišća, cvetova i plodova nekih biljaka, klica kukuruza, zobi, pirinčanog

semena, kao i mnogih začinskih biljaka ekstrahovani su sirovi ekstrakti jakih antioksidativnih

osobina. U ovim ekstraktima, prisutna su različita organska jedinjenja, od kojih dominantnu

ulogu pri oksidativnom delovanju imaju fenolna jedinjenja. Smatra se da se deo antioksidativnog

potencijala mnogih vrsta biljaka moţe pripisati prisustvu fenolnih jedinjenja. Biljni polifenoli se

ne smatraju uvek pravim antioksidansima, ali je u mnogim in vitro istraţivanjima dokazan

antioksidativni potencijal fenolnih materija u vodenoj fazi, "skevendţing" radikala, kao i

pojačanje rezistentnosti prema oksidaciji lipoproteina male gustine, koji ukazuju na patogenezu u

slučaju koronarnih bolesti.

23

Postoje različite klasifikacije fenolnih jedinjenja i većina je zasnovana na hemiskoj

strukturi mada su za svaku klasu poznati i putevi njihove biosinteze. Ova jedinjenja se mogu

podeliti u sledeće grupe (Hurtado-Fernández i sar. 2010):

1. Prosti fenoli

- Fenolne kiseline (derivati benzoeve i cimetne kiseline)

- Kumarini

2. Polifenoli

- Flavonoidi (flavanoni, flavoni, flavonoli, katehini, antocijani )

- Tanini (hidrolizabilni i kondenzovani)

Međutim, najčešća klasifikacija se zasniva na broju ugljenikovih atoma vezanih za

osnovni skelet fenola (Robards i sar., 1999), što je prikazano u Tabeli 2.

U literaturi se najčešće kao prirodni izvori polifenolnih jedinjnja spominju začinsko i

lekovito bilje. Biosinteza i akumulacija polifenolnih jedinjenja se kontroliše, endogeno, tokom

rasta (Macheix i sar., 1990; Strack, 1997) ili se reguliše egzogenim faktorima kao što su svetlost,

temperatura, oštećenja i drugi stresni faktori (Dixon i Paiva, 1995). Fenilalanin, koji nastaje

biosintetskim putem šikimske kiseline, je prekursor većine polifenolnih jedinjenja u biljkama.

Hidroksicimetne kiseline, naročito njihovi estri sa koenzimom A, su najčešće strukturni elementi

polifenolnih jedinjenja, kao što su estri i amidi cimetne kiseline, lignini, flavonoidi i

kondenzovani tanini (Macheix i sar., 1990).

24

Tabela 2. Klasifikacija fenolnih jedninjena

Osnovni skelet

Klasa Primer jedinjenja

C6

prosti fenoli

benzohinoni

katehol, hidrohinon, rezorcinol

C6 -C1 fenolne kiseline 4-hidroksibenzoeva, salicilna

C6 - C2 fenilsirćetna kiselina 4-hidroksifenilsirćetna kiselina

C6 - C3

cimetna kiselina

fenilpropeni

kumarini

hromoni

ferulna, kafena, kumarna

eugenol, miristicin,

umbeliferon, eskuletin

eugenin

C6 - C4 naftohinoni juglon

C6 - C1 -C6 ksantoni

C6 - C2 - C6

stilbeni

antrahinoni resveratrol

C6 - C3 - C6

flavonoidi

flavanoni

flavoni

flavonoli

katehini

antocijani

halkoni

naringenin, hesperetin

apigenin, luteolin

kvercetin, kaempferol

katehin, epikatehin

galokatehin, epigalokatehin

pelargonodin, cijanidin

(C6 - C3)2 lignini pinoresinol

(C6 - C3- C6)2 biflavonoidi agatisflavon

Polifenolna jedinjenja ispoljavaju antioksidativnu aktivnost u biološkim sistemima na

više načine i to:

- predajom H– atoma, direktnim vezivanjem ("hvatanjem") slobodnih kiseoničnih i azotnih

radikala,

- heliranjem prooksidativnih metalnih jona (Fe2+

, Cu2+

, Zn2+

i Mg2+

),

- aktiviranjem antioksidacijskih enzima,

- inhibicijom prooksidativnih enzima (lipoksigenaza, NAD(P)H oksidaza, ksantinoksidaza,

oksidaza, enzimi citohroma P-450).

25

4.3.2.1.1. Fenolne kiseline

Fenolne kiseline su sekundarni metaboliti rasprostranjeni iskljuĉivo u biljnom svetu. Ova

jedinjenja su zasluţna za jedinstven ukus i aromu povrća i voća (Tomas-Barberan i Espin, 2001).

Fenolne kiseline su jedinjenja koja obuhvataju veliku gupu široko rasprostranjenih hidroksi

derivata cimetne (Slika 19) i benzoeve kiseline (Slika 20). Hidroksicimetne kiseline se u biljkama

mogu naći u slobodnom obliku ili u obliku mnogobrojnih estara, kao na primer sa hinskom

kiselinom (hlorogenska kiselina), vinskom kiselinom (kaftarna kiselina), glukozom (1 O

cinamoilglukoza), holinom (sinapin) i drugim. Galna kiselina ulazi u sastav mnogih tanina

(galotanini, kao što je pentagaloilglukoza), jedinjenja nađenih u biljkama, a korišćenih od

davnina za štavljenje koţe (Dewick, 2002).

Cimetna kiselina p-Kumarinska kiselina Kafena kiselina

Ferulna kiselina Sinapinska kiselina

Hlorogenska kiselina Kaftarna kiselina

1-O-Cinamoilglukoza Sinapin

Slika 19. Cimetna kiselina i njeni derivati

26

Benzoeva 4-hidroksibenzoeva Protokatehinska Galna kiselina

kiselina kiselina kiselina kiselina

Siringinska kiselina Salicilna kiselina Vanilinska kiselina

Slika 20. Benzoeva kiselina i njeni derivati

Fenolne kiseline su prisutne u ţitaricama - pšenici, raţu, ječmu, kukuruzu, pirinču

(Zielinski i sar., 2001; Irakli i sar., 2012). Ima ih u lekovitom bilju: kamilici - Matricaria

chamomilla (Nováková i sar, 2010), nani - Mentha piperita (Dorman i sar., 2003), majčinoj

dušici – Thymus serpyllum (Boros i sar., 2010), matičnjaku - Melissa officinalis (Marques i

Farah, 2009; Barros I sar., 2013), ţalfiji - Salvia officinalis (Santos-Gomes i sar., 2002) i

drugim. U velikoj količini su nađene u voću i povrću: jabuci (Dragovic-Uzelac i sar., 2005),

krušci (Escarpa i González, 1999), groţđu (Gómez-Alonso i sar., 2007), malini, kupini, jagodi

(Häkkinen i sar., 1999), višnji (Usenik i sar., 2008), paradajezu (Sánchez-Rodríguez isar., 2012),

crnom luku (Prakash i Singh, 2007), peršunu (Kaiser i sar., 2013), zelenoj salati (Romani i sar.,

2002).

Brojne su studije poslednjih decenija istraţivale bioaktivni potencijal gljiva koje se

pripisuje različitim molekulima, uključujući i fenolne kiseline (Ferreira i sar., 2009). U Tabeli 3.

prikazane su izolovane fenolne kiseline u različitim vrstama gljiva u poslednjoj deceniji.

27

Tabela 3. Pregled fenolnih kiselina detektovanih u različitim vrstama gljiva

Fenolna kiselina Vrsta gljive Referenca

Galna

kiselina

Termitomyces heimii, Termitomyces mummiformis, Lactarius

deliciosos, Pleurotus sajorcaju, Hydnum repandum, Lentinus

squarrulosus, Sparassis crispa, Morchella conica, Russula

brevipes, Geastrum arenarius, Cantharellus cibarius,

Lactarius sanguifluus, Cantharellus clavatus, Auricularia

polytricha...

Puttaraju i sar.,

2006;

Kim i sar., 2008;

Stojković i sar,

2013;

Karaman, 2012

p‐Hidroksi

benzoeva

kiselina

Agaricus bisporus (beli), Agaricus bisporus (smeđi), Lentinus

edodes, Lactarius deliciosus, Lepista nuda, Lycoperdon

molle, Sarcodon imbricatus, Sparassis crispa, Phellinus

linteus, Inonotus obliquus Lactarius bertillonii, Lactarius

vellereus, Amanita crocea, Amanita mairei, Boletus

poliporus, Boletus regius, Helvella lacunosa, Russula aurea,

Laccaria amethystina...

Mattila i sar., 2001;

Ribeiro i sar., 2006,

a2007;

Heleno i sar., 2012a,

2012b, 2013a,

2013b; Leal i sar.,

2013;

Nowacka i sar., 2014

Protokatehinska

kiselina

Agaricus bisporus (beli), Agaricus bisporus (smeđi), Lentinus

edodes, Termitomyces mummiformis, Boletus edulis,

Lactarius deliciosos, Pleurotus sajorcaju, Lentinus

squarrulosus, Lactarius sanguifluus, Macrolepiota procera,

Cantharellus clavatus, Termitomyces shimperi, Ganoderma

lucidum, Lactarius bertillonii, Lactarius vellereus, Rhodotus

palmatus, Xerocomus chrysenteron, Morchella esculenta,

Clavulina cinerea, Clitocybe gibba, Craterellus

cornucopiodes, Leccinum scabrum...

Mattila i sar.,2001;

Puttaraju i sar.,

2006;

Kim i sar., 2008;

Heleno i sar., 2012b,

2013a, 2013b;

Karaman, 2012;

Nowacka i sar., 2014

Vanilinska

kiselina

Pleurotus sajor‐caju, Hydnum repandum, Lentinus

squarrulosus, Morchella conica, Russula brevipis, Lactarius

sanguifluus, Macrolepiota procera, Cantharellus clavatus,

Auricularia polytricha, Pleurotus djamor, Helvella crispa,

Termitomyces microcarpus, Termitomyces shimperi, Lentinus

sajor‐caju, Termitomyces heimii, Lycoperdon molle,

Tricholoma acerbum, Craterellus cornucopiodes, Agrocybe

aegerita.

Puttaraju i sar.,

2006.;

Barros i sar., 2009;

Karaman, 2012

Siriginska

kiselina

Termitomyces mummiformis, Hydnum repandum, Morchella

conica, Russula brevipes, Lactarius sanguifluus,

Macrolepiota procera, Cantharellus clavatus, Pleurotus

djamor, Lentinus sajor‐caju, Termitomyces tylerance,

Morchella angusticeps, Termitomyces microcarpus, Agaricus

blazei, Sparassis crispa

Puttaraju i sar.,

2006;

Kim i sar., 2008.

Cimetna kiselina

Agaricus bisporus (beli), Agaricus bisporus (braon),

Termitomyces heimii, Termitomyces mummiformis,

Termitomyces shimperi, Pleurotus sajor‐caju, Hydnum

repandum, Lentinus squarrulosus, Sparassis crispa,

Lactarius sanguifluus, Cantharellus clavatus, Pleurotus

djamor, Agaricus arvensis, Agaricus silvicola, Agaricus

romagnesii, Cantharellus cibarius, Lycoperdon perlatum,

Macrolepiota procera, Agaricus blazei, Ganoderma lucidum,

Coprinopsis atramentaria, Lactarius bertillonii, Lactarius

Puttaraju i sar.,

2006;

Kim i sar., 2008;

Heleno i sar.,

2012a,2012b;

Leal i sar., 2013

28

vellereus, Rhodotus palmatus, Xerocomus chrysenteron,

Boletus regius, Russula aurea, Russula virescens.

p‐Kumarna

kiselina

Cantharellus cibarius, Termitomyces heimii, Boletus edulis,

Sparassis crispa, Geastrum arinarius, Lactarius sanguifluus,

Macrolepiota procera, Pleurotus djamor, Lentinus

sajor‐caju, Fistulina hepatica, Agaricus arvensis, Lepista

nuda, Sparassis crispa, Ganoderma lucidum, Coprinopsis

atramentaria, Lactarius bertillonii, Lactarius vellereus,

Xerocomus chrysenteron, Morchella esculenta, Calvatia

excipuliformis, Craterellus cornucopiodes, Leccinum

scabrum, Pholiota mutabilis, Psilocybe capnoides,

Ganoderma applanatum

Valentao i sar.,

2005; Puttaraju i

sar., 2006; Ribeiro i

sar., 2007; Kim i

sar., 2008; Heleno i

sar., 2012a, 2012b,

2013a, 2013b;

Karaman, 2012;

Nowacka i sar., 2014

Ferulna kiselina

Termitomyces heimii, Termitomyces microcarpus,

Termitomyces shimperi, Lactarius deliciosus, Pleurotus

sajor‐caju, Lentinus squarrulosus, Sparassis crispa,

Morchella conica, Cantharellus cibarius, Lactarius

sanguifluus, Macrolepiota procera, Cantharellus clavatus,

Pleurotus djamor, Flammulina velutipes, Inonotus obliquus.

Puttaraju i sar.,

2006;

Kim i sar., 2008.

Kafena kiselina

Termitomyces heimii, Termitomyces tylerance, Termitomyces

microcarpus, Termitomyces shimperi, Boletus edulis,

Lentinus squarrulosus, Morchella conica, Russula brevipes,

Cantharellus cibarius, Lactarius sanguifluus, Macrolepiota

procera, Cantharellus clavatus, Pleurotus djamor, Lentinus

sajor‐caju, Morchella angusticeps, Fistulina hepatica,

Flammulina velutipes, Sparassis crispa, Phellinus linteus,

Pholiota mutabili.

Puttaraju i sar.,

2006; Ribeiro

i sar., 2007; Kim i

sar., 2008;

Nowacka i sar.,

2014.

29

4.3.2.1.2. Flavonoidi

Flavonoidi su jedinjenja biljnog porekla. Preko 4000 razliĉitih flavonoidnih jedinjenja je

do sada identifikovano u biljnim tkivima i njihov sadrţaj (kvalitativni i kvantitativni) varira u

zavisnosti od starosti biljke i uslova sredine u kojoj je biljka rasla (Cook i Samman, 1996).

Flavonoidi su najzastupljenija grupa fenolnih jedinjenja u biljkama sa 15 atoma ugljenika u

osnovnoj C6-C3-C6 strukturi, od kojih devet pripada benzopiranskom prstenu (benzenski prsten A

kondenzovan sa piranskim prstenom C) a ostalih šest ugljenik ovih atoma čine benzenski prsten

B povezan sa benzopiranskim prstenom na poziciji dva. Osnovni skelet flavonoida sa

obeleţavanjem atoma dat je na Slici 21.

Slika 21. Osnovni skelet flavonoida

Iz biljaka je izolovano i proučeno preko 3000 flavonoida koji su, s obzirom na stepen

oksidacije centralnog piranskog prstena, podeljeni u dvanaest klasa: flavoni, izoflavoni,

flavanoni, flavonoli, flavanoli, flavani, katehini, antocijanidini, leukoantocijanidini, halkoni,

dihidrohalkoni i auroni. Najzastupljeniji flavonoli su kvercetin, kampferol i miricetin, a od

flavona najpoznatiji su luteolin i apigenin. Halkoni, auroni, flavanoni, dihidrohalkoni i izoflavoni

se pojavljuju mestimično i u manjem broju biljnih vrsta. Flavanoni i izoflavoni su bezbojni, dok

halkoni i auroni predstavljaju ţute pigmente.

Flavonoidi su rasprostranjen i u svim zelenim biljkama, a nađeni 29ui u niţim orga-

nizmima. Najrasprostranjeniji su flavonoli i flavoni. Njihova glavna uloga u biljkama još uvek

nije razjašnjena iako je utvrđeno da se ponašaju kao: antioksidansi, inhibitori enzima,

fotosenzibilizatori i prenosioci energije, respiratori u biosintezama, a takođe imaju i estrogene i

antikancerogene osobine (Laišić i Gruić-Injac, 1998).

Svi flavonoidi mogu biti hidroksilovani, alkilovani i glikolizovani sa monosaharidima i

oligosaharidima, a često imaju i acil grupe u različitim poloţajima na osnovnoj flavonoidnoj

strukturi ili glikozidnom delu (Harborne i sar., 1999). Neki flavonoidai (tanini pre svega)

ispoljavaju i veliku sklonost ka umreţavanju i polimerizaciji (Winkel–Shirley, 2001). Promenom

oksidacionog stanja alifatičnog niza, odnosno heterocikličnog prstena, nastaju različite klase

flavonoida (Slika 22).

30

Slika 22. Različite klase flavanoidnih jedinjena

Osim što predstavljaju biljne pigmente, flavonoidi takođe doprinose ukusu, najčešće

gorčini, i oporosti biljaka u kojima se nalaze. Ova klasa jedinjenja nesumnjivo učestvuje i u

odbranbenom ("defensive chemistry") sistemu biljaka, jer su oporost i gorčina koju daju

biljkama neprijatni biljojedima, a takođe štite biljku i od štetnog dejstva UV zračenja. Dokazano

je da se sintetišu kao odgovor na povećanu koncentraciju nekih metala u zemljištu (na primer

aluminijuma) (Harborne i sar., 2000).

Pozitivni efekti flavonoida na zdravlje doprineli su naglom porastu upotrebe biljnih

flavonoida kao konstituenata funkcionalne hrane. Međutim, povećan i nekontrolisan unos

flavonoida moţe da ima prooksidativnu aktivnost, prouzrokuje mutagene procese i inhibira

ključne enzime u metabolizmu hormona (Skibola i Smith, 2000).

Antioksidativni mehanizmi koji su karakteristični za flavonoide su otpuštanje vodonika,

"hvatanje" radikala i helatizacija metala. Kao i kod ostalih polifenolnih antioksidanasa, broj i

poloţaj hidroksilnih grupa utiče na antioksidativnu aktivnost. Kao snaţni antioksidansi, fenolna

jedinjenja različitim mehanizmima neutrališući slobodne radikale u ćelijama, umanjuju lipidnu

peroksidaciju ćelijske membrane, mogu da spreče oksidativna oštećenja DNK i širenje tumora

(Havsteen, 2002). Osim toga, flavonoidi mogu uticati i na primarni proces starenja, mogu biti

efikasni inhibitori oksidacije LDL, a epidemiološka proučavanja pokazuju inverzni odnos

između unosa hrane bogate flavonoidima i kardiovaskularnih oboljenja. Svi ovi podaci ukazuju

na to da povećana konzumacija voća i povrća bogatog nutritivnim sastojcima koji ispoljavaju

antioksidativna svojstva moţe doprineti poboljšanju kvaliteta ţivota. Nutricionisti procenjuju da

je dnevni unos flavonoida putem hrane oko 1-2 grama (Havsteen, 2002).

31

U Tabeli 4 prikazani su flavonoidi prisutni u različitim vrstama gljiva.

Tabela 4. Pregled identifikovanih flavonoida u gljivama

Flavonodi Vrsta gljive Referenca

Kvercetin

Suillus luteus, Suillus granulatus, Flammulina velutipes,

Agaricus blazei, Sparassis crispa, Ganoderma lucidum,

Ionotus obliquus, Lactarius sanguifluus, Lactarius

semisanguifluus, Russula delica, Suillus bellinii.

Ribeiro i sar., 2006;

Kim i sar., 2008;

Kalogeropoulos i sar., 2013

Rutin Cantharellus cibarius, Pleurotus ostreatus. Valentao i sar., 2005;

Jayakumar i sar., 2011

Kempferol Sparassis crispa, Ganoderma lucidum, Inonotus

obliquus, Suillus bellinii, Lactarius deliciosus, Lactarius

sanguifluus, Lactarius semisanguifluus.

Kim i sar., 2008;

Kalogeropoulos i sar., 2013

Miricetin Pleurotus ostreatus, Agaricus bisporus, Agaricus blazei,

Ganoderma lucidum Kim i sar., 2008

Krisin Pleurotus ostreatus, Lactarius deliciosus, Lactarius

sanguifluus, Lactarius semisanguifluus, Russula delica,

Suillus bellinii

Jayakumar i sar., 2011;

Kalogeropoulos i sar., 2013

Katehin Lentinus edodes, Agaricus blazei, Ganoderma lucidum Kim i sar., 2008

Hesperetin Ganoderma lucidum Kim i sar., 2008

Naringenin Sparassis crispa Kim i sar., 2008

Naringin Pleurotus ostreatus, Agaricus bisporus, Pleurotus

eryngii, Ganoderma lucidum, Inonotus obliquus Kim i sar., 2008

Formometin Ganoderma lucidum Kim i sar., 2008

Biohanin Ganoderma lucidum Kim i sar., 2008

Pirogalol Agaricus bisporus, Flammulina velutipes, Agaricus

blazei, Sparassis crispa, Ganoderma lucidum, Phellinus

linteus

Kim i sar., 2008

Resveratrol Sparassis crispa, Inonotus obliquus, Kim i sar., 2008

Genistein Lactarius sanguifluus Russula delica, Suillus bellinii Kalogeropoulos i sar., 2013

32

5. UV-VIS spektrofotometrija

5.1. Nastajanje UV-VIS spektara

Spektrofotometrija je apsorpciona metoda koja se zasniva na proučavanju zavisnosti

apsorpcije svetlosti od talasne duţine zračenja pri prolasku kroz supstancu. Apsorpcija se moţe

pratiti kako u ultraljubičastoj (UV) i vidljivoj (VIS) oblasti tako i u infracrvenoj (IC),

mikrotalasnoj i radiofrekventnoj oblasti. U analitičkoj praksi od interesa je oblast od 200 do 1000

nm.

Slika 23. Elektronski prelazi i UV-VIS spektar molekula

Prilikom interakcije elektromagnetnog zračenja sa materijom mogući su mnog i procesi

(refleksija, rasipanje, apsorpcija, fluorescencija/fosforescencija, fotohemijske reakcije).

Uopšteno, pri merenju UV-VIS spektara poţeljno je da svi procesi osim apsorpcije budu

zanemarljivi. Pošto je svetlost jedan od oblika energije, apsorpcija svetlosti od strane materije

dovodi do povećanja energetskog sadrţaja atoma ili molekula. Ukupna potencijalna energija

molekula moţe se uopšteno predstaviti kao suma elektronske (Ee) vibracione (Ev) i rotacione (Er)

energije:

E = Ee + Ev +Er

pri čemu je Ee > Ev > Er

Količina energije koju svaki molekul moţe da poseduje je serija diskretnih vrednosti.

Energija kvanta apsorbovane svetlosti odgovara energiji potrebnoj za prelazak elektrona sa niţeg

33

na viši energetski nivo. U slučaju molekula, vibracioni i rotacioni energetski nivoi se

superponiraju sa elektronskim i zbog toga što postoji mnogo mogućih elektronskih prelaza u

apsorpcionom spektru se pojavljuju trake (Slika 23). Zbog interakcija sa rastvaračem apsorpcione

trake su šire ako je supstanca rastvorena.

Slika 24. Apsorpcija UV-VIS zračenja

Kada svetlost prolazi kroz kivetu (Slika 24) u kojoj se nalazi uzorak za analizu, količina

apsorbovane svetlosti predstavlja razliku između intenziteta upadne svetlosti (Io) i propuštene

svetlosti (Ip) i izraţava se transparencom ili apsorbancom. Transparenca predstavlja odnos

inteziteta propuštene i upadne svetlosti:

T = Ip / Io

Apsorbanca se definiše kao:

A = - log T

Odnosno

A = - log T = - log ( Ip / Io ) = ε·l·c

gde je:

A - apsorbanca

I0 - intenzitet upadnog zraka

I - intezitet zraka po prolasku kroz uzorak

e - molarna apsorptivnost

l - debljina sloja [cm]

c - koncentracija apsorbujuće supstance [mol/l].

Lambert-Beer-ov zakon je osnova kvantitativne spektrofotometrijske analize: apsorbanca

rastvora direktno je proporcionalna koncentraciji apsorbujuće vrste i debljini sloja kroz koje

34

zračenje prolazi. Za kvantitativnu analizu je bitno da se merenja apsorbance vrše sa najvećom

mogućom tačnošću i osetljivošću.

U rastvoru koji sadrţi više komponenti koje apsorbuju elektromagnetno zračenje, a koje

međusobno ne reaguju, apsorbanca ratsvora jednaka je zbiru pojedinačnih apsorbanci svih

komponenti:

A = Σ Ai = A1 + A2 + A3 + … + An

Molarna apsorptivnost (naziva se još i ekstinkcioni koeficijent) je karakteristika

analizirajuće supstance. Predstavlja konstantnu vrednost za konstantne uslove snimanja (talasna

duţina, temperatura i rastvarač). U praksi, vrednost molarne apsorptivnosti takođe zavisi i od

karakteristika upotrebljenog aparata. Zbog toga se u kvantitativnoj analizi najčešće ne koristi

određena tablična vrednost, nego se svaki put snima kalibraciona prava koristeći standardni

rastvor ispitivane supstance.

Boja je vaţno svojstvo svake supstance i usko je povezana sa apsorpcijom i refleksijom

svetlosti. Ljudsko oko vidi komplementarnu boju onoj koja je apsorbovana (Slike 25 i 26). U

praksi, nastajanje i opaţanje boja su veoma kompleksni procesi koji zavise takođe i od spektra

upadne svetlosti i od površinske strukture posmatranog predmeta.

Slika 25. Apsorpcija i doţivljaj boje Slika 26. Apsorpcija i doţivljaj boje

35

5.2. Konstrukcija i funkcija UV-VIS spektrofotometra

Spektrofotometar je instrument koji sluţi za merenje apsorbance (ili transparence) uzorka

u funkciji od talasne duţine upotrebljenog elektromagnetnog zračenja (Slika 27). Ključne

komponente spektrofotometra su:

- izvor koji generiše širok spektar elektromagnetnog zračenja,

- disperzioni element koji iz datog spektra izdvaja usku oblast talasnih duţina,

- uzorak za analizu,

- jedan ili više detektora koji mere intenzitet propuštenog zračenja,

- optički delovi-prizme, sočiva i ogledala koji sluţe da usmere svetlosni snop.

Slika 27. Osnovni delovi UV-VIS spektrofotometra

Idealni izvor zračenja treba da daje svetlost konstantnog intenziteta u celom opsegu

talasnih duţina, sa malim šumom i velikom stabilnosti. Na ţalost, takav izvor ne postoji. U UV-

VIS spektrofotometriji od izvora zračenja najčešće se upotrebljavaju obična volframova lampa

(300 - 2500 nm), i deuterijumska lampa koja pokriva i ultraljubičastu oblast (190 - 400 nm).

Savremene deuterijumske lampe daju mali šum, ali tokom vremena intezitet zračenja koji daje

ova lampa lagano opada. Kao alternative ovim dvema lampama moguća je primena ksenonske

lampe (160 - 2000 nm) koja daje dobar kontinuum talasnih duţina u celoj oblasti UV-VIS

spektra, ali ima ograničenja u pogledu znatno većeg šuma u odnosu na dve najkorišćenije lampe,

pa nije pogodna za kvantitativna određivanja.

36

Disperzioni element ima funkciju da snop polihromatskog zračenja razloţi na

pojedinačne talasne duţine, odnosno uske oblasti talasnih duţina. U te svhe se najčešće koriste

prizma i difrakciona rešetka. Pošto su prizme proste i jeftine, a disperzija svetlosti je ugaono i

temperaturno zavisna, u modernim spektrofotometrima uglavnom se koriste difrakcione rešetke.

Detektori pretvaraju svetlosni signal u električni signal. Idealni detektor poseduje

linearnu osetljivost u širokom opsegu talasnih duţina i intenziteta svetlosti, sa malim šumom i

velikom osetljivošću. Moderni spektrofotometri sadrţe fotomultiplikator ili fotodiodni niz.

Fotomultiplikator ima dobru osetljivost u celom UV-VIS područiju pri malom intenzitetu

svetlosti. To omogućava da se sa većom sigurnošću mogu detektovati male razlike između slepe

probe i uzorka za analizu, što znači da se mogu određivati male količine supstance. Fotodiodni

niz kao detektor ima široki opseg detekcije talasnih duţina, što ga čini idealnim za snimanje

celog UV-VIS spektra u kratkom vremenskom intervalu.

Pošto se UV-VIS sprektrofotometrom najčešće snimaju tečni uzorci potrebno je da kiveta

u kojoj se oni nalaze bude transparentna za UV-VIS zračenje. Kivete su obično pravougaonog

oblika, najčešće unutrašnje širine 1cm. U nekim instrumentima umesto kiveta mogu se koristiti

epruvete. Najčešćese primenjuju kivete izrađene od visoko kvalitetnih jedinjenja silicijuma ili

kvarca, materijala koji su dobro transparentni za UV-VIS i blisku infracrvenu oblast.

37

6. Metode za određivanje antioksidativne aktivnosti

Postoji veliki broj metoda za ispitivanje antioksidativnog kapaciteta pojedinih molekula.

Metode za određivanje antioksidativne aktivnosti se mogu podeliti na više načina: prema sistemu

ispitivanja (in vivo i in vitro), prema metodi detekcije (hemiluminiscentne, spektrofotometrijske,

fluorometrijske, spektroskopske-ESR), prema direktnosti određivanja (direktne i indirektne).

Podela metoda za određivanje antioksidativne aktivnosti moţe se bazirati i na prisustvu lipida u sistemu

i prema mehanizmu reakcije koja se odigrava između antioksidativnih jedinjenja i slobodnih radikala na

koje se antioksidasciona aktivnost određuje (Sanchez-Moreno, 2002., Aruoma, 2003).

Najčešće korišćena podela metoda koje se koriste za određivanje antioksidativnog

kapaciteta predstavljena je u Tabeli 5.

In vitro analitičke metode za određivanje antioksidantnog kapaciteta oslanjaju se na dva

različita pristupa: konkurentna i nekonkurentna reakcija (Slika 28).

Slika 28. Konkurentna i nekonkurentna reakcija

U konkurentnoj reakciji ciljna vrsta - meta (biomolekuli koji mogu biti napadnuti in vivo)

i antioksidansi se takmiče za reaktivno jedinjenje (radikal ili neradikal). Procena antioksidativne

sposobnosti (kapaciteta) se zasniva kvantifikaciji, tj. određivanju količine jedinjenja koje

olakšava analitičko merenje i definiše se kao proba. Kod konkurentnih testova proba je ciljna

vrsta ili oksidovani oblik. Proba moţe biti i neka vrsta koja se dodaje nakon navedenih reakcija

koje prate kvantifikaciju preostalih reaktivnih vrsta ili ciljnih molekula.

38

Tabela 5. Metode za određivanje antioksidativnog kapaciteta.

Metode in vitro određivanja antioksidatinog kapaciteta

Metode koje uključuju H-transfer

reakcije (HAT)

ROO• + AH → ROOH + A•

ROO• +LH → ROOH + L•

1.ORAC metoda (Oxygen radical

absorbance capacity)

2.LPIC metoda (Lipid peroxidation

inhibition capacity)

3.TRAP metoda (Total radical

trapping antioxidant parameter)

4. IOC metoda (Inhibited oxygen

uptake)

5.SASA metoda (Scavenging of super

oxide radical formation by alkaline)

Elektron transfer metode (ET)

M(n) + e- (iz AH) →

AH• + M(n-1)

1. TEAC metoda (Trolox equivalent

antioxidant capacity)

2. FRAP metoda (Ferric Ion

Reducing Antioxidant Power Assay)

3. DPPH metoda (Scavengig of 2,2-

difenil-1-pikrilhidrazil Radical Assay)

4. CUPRAC metoda (Copper (II)

reduction capacity)

5. FCR metoda (Folin-Ciocalteu

Reducing Capacity Assay)

Ostale metode

1.TOSC metoda (Total oxidant

scavenging capacity)

3.ECL metoda (Enhanced

chemiluminescence)

4TLC bioautography

5.CAA metoda (Cellular antioxidant

activity assay)

U ovim testovima, antioksidativni kapacitet testiranih jedinjenja zavisi od:

- brzine reakcije između njih i reaktivnih vrsta,

- brzine reakcije ciljnih molekula i reaktivnih vrsta i

39

- koncentracionog odnosa između antioksidanasa i ciljnog molekula.

Za izvođenje ovih testova neophodno je ispuniti uslove:

- test proba mora biti reaktivna sa antioksidansom pri niskim koncentracijama,

- maksimalna osetljivost u spektroskopskom ispitivanju između polaznog i oksidovanog

oblika - ne smeju postojati sporedne reakcije,

- antioksidans ne bi trebalo da reaguje sa ciljnim molekulom.

U nekonkurentnim testovima, postoji reakcija između antioksidansa i reaktivne vrste u

odsustvu ciljnih molekula, što u početnoj smeši, uključuje dve kompenente, koje takođe mogu

biti probe za praćenje reakcije. Preostale reaktivne vrste se mogu meriti dodatkom pogodnog

reagensa (Vertuani, 2004).

6.1. Metode koje ukjlučuju H-transfer reakcije

Ove metode baziraju se na činjenici da antioksidans predaje atom vodonika i na taj način

stabilizuje radikal:

Slika 29. Princip H-transfera reakcije

6.1.1. ORAC metoda (Oxygen radical absorbance capacity)

ORAC metoda je spektrofotometrijska metoda merenja antioksidativnog kapaciteta

uzorka. Metoda se bazira na sposobnosti test-supstance da spreči oksidaciju β-fikoeritrina

(fluorescein) od strane kiseoničnih slobodnih radikala (ROS). Rezultati merenja inhibicije

oksidativne degradacije molekula fluoresceina delovanjem antioksidansa se očitavaju iz

standardne krive zasnovane na antioksidantnoj aktivnosti različitih koncentracija Trolox-a.

Merenja se vrše pomoću fluorimetra. Metodu su razvili naučnici Tufts Univerziteta iz Bostona u

saradnji sa Ministarstvom poljoprivrede SAD, radi procene vrednosti pojedinih namirnica u

40

zaštiti organizma od oksidativnog stresa. Što je ORAC vrednost veća, veća je i antioksidaciona

sposobnost nekog jedinjenja (Cvetković J., 2012).

6.1.2. TRAP metoda (Total radical trapping antioxidant parameter)

TRAP je metoda koja se zasniva na merenju smanjenja fluorescencije R-fikokretina

prilikom kontrolisane reakcije peroksidacije. TRAP vrednosti izračunavaju se pomoću

kalibracione prave, koja se konstruiše na osnovu dobijenih vrednosti za standard – Trolox,

(Huang, 2005). Prednost ove metode je što se moţe koristiti i kao in vivo metoda.

6.2. Elektron transfer metode (ET)

ET- metode su veoma korišćene metode za određivanje antioksidativnog kapaciteta in

vitro. Ove metode podrazumevaju prisustvo dve komponente u reakcionoj smeši: oksidans

(proba) i antioksidans, kao i odvijanje elektron - transfer reakcije (Slika 30):

Oksidans (proba) + e- (iz antioksidansa) → Redukovana oksidans + Oksidovani

Slika 30. Princip elektron-transfer reakcija

Proba, odnosno oksidans, uzima elektron iz antioksidansa i dovodi do promene boje

rastvora. Promena intenziteta obojenosti rastvora je proporcionalna koncentraciji antioksidansa.

Reakcija između antioksidansa i oksidansa je završena onda kada boja rastvora prestane da se

menja. U svim metodama spektrofotometrijski se meri apsorbancija ispitivanog rastvora i prati

njena zavisnost od molarne koncentracije. Zavisnost između promene asorbancije i koncentracije

antioksidansa je linearna. Nagib krive daje kapacitet antioksidansa koji se predstavlja kao Trolox

ekvivalent (TE) ili kao ekvivalent galne kiseline (GAE).

41

6.2.1. ABTS metoda (Scavengig of 2,2’-azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat)

Radical Assay)

ABTS metoda uključuje stvaranje dugo-ţivećih radikala, 2,2’-azobis-(3-

etillbenzotiazolin-6-sulfat) radikal-katjon (ABTS•+

) koji ima apsorpcione maksimume na

talasnim duţinama od 414, 645, 734 i 815 nm (Slika 31).

Slika 31. Mehanizam delovanja ABTS•+

Svako jedinjenje koje ima niţi redoks potencijal od ABTS• moţe reagovati sa radikalom

(Re i sar.,1999). Rezulati se izraţavaju kao Trolox ekvivalenti. Askorbinska kiselina (vitamin C)

se takođe koristi kao referentno jedinjenje umesto Troloxa a rezulati se izraţavaju kao masa

askorbinske kiseline na 100 g ili 100 ml testiranog uzorka (VCEAC- vitamin C equivalent

antioxidant capacity).

6.2.2. FRAP- metoda (Ferric Ion Reducing Antioxidant Power Assay)

FRAP metoda se zasniva na sposobnosti antioksidanasa da redukuju gvoţđe - 2,4,6-

tripiridil-S-triazin kompleks [Fe(III)-(TPTZ)2]3+

do intenzivno plavo obojenog kompleksa

[Fe(II)-(TPTZ)2]2+

u kiseloj sredini (Slika 32). FRAP vrednosti se izračunavaju merenjem rasta

apsorpcije na 593 nm i upoređivanjem istih sa standardnim rastvorom obojenih jona, ili

standardnim rastvorom antioksidansa (npr. askorbinska kiselina). Svako jedinjenje sa redoks

potencijalom niţim od redoks potencijala para Fe(III)/Fe(II), teorijski moţe redukovati Fe(III) do

Fe (II) i usloviti znatno visoke rezultate FRAP- vrednosti. Sa druge strane, mnogi antioksidansi

42

ne mogu dovoljno brzo redukovati Fe(III) kako bi se brzina reakcije mogla meriti u

posmatranom vremenskom interval (obično 4 minuta). U zavisnosti od vremena analize red

njihove reaktivnosti se menja. Polifenoli sa takvim ponašanjem su: kvercetin, feruminska

kiselina, kofeinska kiselina, taninska kiselina.

Slika 32. Redukcija kompleksa [Fe(III)-(TPTZ)2]3+

do kompleksa [Fe(II)-(TPTZ)2]2+

Jedinjenja koja apsorbuju na talasnoj duţini određivanja mogu interferirati i izazvati

precenjivanje FRAP vrednosti. Niska vrednost pH, koja je neophodna za metodu, moţe da

dovede do precipitacije nekih proteina, kao što je kazein iz mleka (Kranl i sar., 2005).

Antioksidansi koji deluju kao "gasioci" radikala (transferi H-atoma) ne mogu se određivati ovom

metodom.

6.2.3. DPPH metoda (Scavengig of 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil Radical

Assay)

DPPH test je najrasprostranjenija metoda za ispitivanje antioksidativne aktivnosti mnogih

prirodnih antioksidanasa. Prvi put je opisana 1958. godine (Blois, 1958), a kasnije je

modifikovana od strane brojnih istraţivača. PubMed baza podataka pokazuje da je DPPH test od

1969. do 2010. godine bio uključen u više od 850 istraţivanja (Tirzitis & Bartosz, 2010).

DPPH• je stabilan slobodni radikal zbog delokalizacije nesparenog elektrona u celom

molekulu, tako da molekuli ne dimerizuju, kao što bi to bio slučaj sa ostalim vrstama slobodnih

radikala. Ovaj molekul ima tamnoljubičastu boju, koja se karakteriše apsorbancijom u etanolnom

rastvoru na 515-517 nm (Slika 33). Kada antioksidans reaguje sa DPPH•, u prisustvu vodonika

kao donora elektrona, ovaj radikal se redukuje u DPPH i posledica toga je apsorpcija na manjim

talasnim duţinama nego DPPH•. Pritom dolazi do obezbojavanja (mada se moţe očekivati

43

prisustvo blede ţute boje koja potiče od pikril grupe), što je proporcionalno prisutnim

elektronima: veći stepen obezbojavanja označava veću redukcionu sposobnost (Slika 34).

Slika 34. Redukcija DPPH•

Slika 33. Promena apsorbancije u toku redukcije DPP•

Jedan od parametara koji je uveden za tumačenje DPPH metode je "efikasna

koncentracija" ili EC50 vrednost (ili IC50), a ona se definiše kao koncentracija supstrata koja

izaziva gubitak 50% DPPH• aktivnosti, odnosno boje. Niţe IC50 vrednosti odgovaraju jačoj

antioksidantnoj aktivnosti i obrnuto.

44

6.2.4. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity)

CUPRAC metoda se zasniva na praćenju redukcije bakar(II) jona koji sa neokuproinom

(2,9-dimetil-1,10-fenantrolin), pri pH=7 gradi bezbojan bis(neokuproin)bakar(II) helatni

komleks, Cu(II)-Nc. Cu(II)-Nc predstavlja redoks reagens u CUPRAC metodi. U prisustvu

redukcionog sredstva nastaje Cu(I)-Nc, komleksno jedinjenje narandţasto-crvene boje koje

pokazuje maksimum apsorbancije na 450 nm (Slika 35) (Ak & Gulcin, 2008).

U poređenju sa drugim metodama za određivanje antioksidativne aktivnosti na redoks

reakciju u CUPRAC metodi ne utiču parametri kao što su prisustvo vazduha, sunčeva svetlost i

vlaţnost jer je Cu(II)-Nc reagens stabilniji od DPPH-a i ABTS-a. Redoks reakcija u CUPRAC

metodi se odvija pri pH 7 (pribliţno fiziološki uslovi) za razliku od kisele sredine koja se mora

obezbediti u FRAP metodi (pH 3,6) gde redukciona moć moţe biti suprimirana zbog reakcije

hidroksilne grupe ispitivanog jedinjenja sa H+ jonom (Apak et al., 2008).

Slika 35. Redukcija Cu(II) do Cu(I)

6.2.5. Metoda za određivanje ukupnog sadržaja fenolnih jedinjenja (Total

Phenolic Content-TPC) ili FCR metoda (Folin Ciocalteu Reducing Capacity

Assay)

Sadrţaj ukupnih fenola u uzorcima je određivan Folin-Ciocalteau-ovom metodom

(Singleton i Rossi, 1965). Metoda je bazirana na oksidaciji prisutnih fenola Folin-Ciocalteau-vim

reagensom. Sam reagens predstavlja smešu fosfomolibdenske i fosfovolframove kiseline I moţe

se predstaviti formulama:

45

3H2O × P2O5 × 13WO3 × 5MoO3 × 10H2O i

3H2O × P2O5 × 14WO3 × 4MoO3 × 10H2O (Peterson, 1979)

Pri tome se sam reagens redukuje a intenzitet dobijene plave boje srazmeran je koliĉini

fenola u rastvoru:

Mo(VI) (ţuto obojen) + e– → Mo(V) (plavo obojen)

Prilikom izvođenja ove metode, dolazi do prenosa elektrona u alkalnoj sredini sa fenolne

komponente i drugih redukcionih vrsta na molibden (Mo) pri čemu se formira plavi kompleks

koji se moţe detktovati spektrofotometrijski na 750-765nm.

Galna kiselina se koristi kao standard i rezultati se prikazuju kao ekvivalenti galne

kiseline (mg/l). Plavi kompleksi, koji se formiraju su nezavisni od strukture fenolnih jedinjenja

što isključuje mogućnost postojanja koordinacionih kompleksa koji se formiraju između metala i

fenolnih jedinjenja.

Korišćeni reagens je nespecifičan za fenolna jedinjenja, jer moţe biti redukovan od strane

mnogih nefenolnih jedinjenja kao što su aromatični amini, sumpor dioksid, vitamin C, Cu(I),

Fe(II). U tom slučaju treba ukloniti ometajuće supstance i podestiti pH rastvora (pH ≈ 10).

46

7. Ekstrakcija rastvaračima različite polarnosti

Najpopularnija, najčešća jednostavna i efikasna metoda koja je se koristi se za

pripremanje biljnih ekstarakata je ekstrakcija rastvaračima različite polarnosti. Upotreba

rastvarača različite polarnosti omogućava razdvajanje nepolarnih od polarnih sastojaka i

smanjenje kompleksnosti ekstrakta. Prinos biljnog ekstarkta pri ekstrakciji zavisi od vrste

rastvarača, tj. njegove polarnosti, od vremena i temperature ekstrakcije, kao i od hemijskih i

fizičkih karakteristika uzorka.

Osnovni parametri koji utiču na kvalitet ekstrakta:

- deo biljke koji se koristi kao startni materijal,

- rastvarač koji se koristi za ekstrakciju,

- postupak ekstrakcije.

Osobine komponenata koje se ekstrahuju iz biljnog materijala zavise od:

- prirode biljnog materijala,

- njegovog porekla,

- stepena obrade,

- sadrţaja vlage,

- usitnjenost biljnog materijala.

Dobar rastvarač treba da poseduje određene osobine kao što su:

- mala toksičnost,

- ispraljivost na niskim temperaturama,

- pospešivanje brze fiziološke apsorpcije ekstrakta,

- zaštitna funkcija,

- sprečavanje ekstrahovanih jedinjenja da grade komplekse ili da disosuju.

Faktori od kojih zavisi odabir rastvarača za ekstrakciju su:

- količina fitokomponenata koje se ekstrahuju,

- brzina ekstrakcije,

- raznovrsnost komponenata prisutnih u ekstraktu kao i raznovrsnost komponenata koje

su potencijalni inhibitori aktivnih jedinjenja,

- jednostavnost u daljem manipulisanju ekstraktima,

- toksičnost procesa ekstrakcije i moguće pozitivne osobine ekstrakta,

- kao i od ciljnih vrsta koje se ekstrahuje.

47

Najčešće korišćeni rastvarači koji za ekstrakciju su:

Voda: Voda je univerzalni rastvarač, koristi se za ekstrakciju fitokomponenata koje

pokazuju antimikrobnu aktivnost. Ona rastvara i flavonoide (uglavnom antocijane) kao i fenole

koji su odgovorni za antioksidativnu aktivnost.

Aceton: Aceton rastvara mnoge liposolubilne i hidrosolubilne komponente. aceton se

meša sa vodom, isparljiv je i nisko toksičan. Veoma je koristan ekstraktant, naročito za

ispitivanje antimikrobne aktivnosti kada se očekuje ekstrakcija fenolnih jedinjenja. U nekim

studijama je opisano da je ekstrakcija tanina i drugih fenola efikasnija u vodenom rastvoru

acetona nego li u vodenom rastvoru metanola. I aceton i metanol ekstrahuju saponine koji

pokazuju antimikrobnu aktivnost.

Alkohol: Veća aktivnost etanolnih ekstrakata u poređenju sa aktivnošću vodenih

ekstrakata objašnjava se prisutnošću veće količine polifenola, ekstahovanu iz vodenih rastvora.

Alkoholi su efikasniji za oslobađanje polifenola iz ćelija. Visoka koncentracija mnogih

flavonoida je detektovana u etanolnim ekstraktima. Otkriveno je da je etanol rastvarač koji lakše

prolazi kroz ćelijsku membranu da bi ekstrahovao intracelularne komponente iz biljnog

materijala. Metanol je polarniji rastvarač od etanola ali je zbog svoje citotoksičnosti nepogodan

za neke vrste ekstrakcija jer moţe da dovede do netačnih rezltata.

Etil-acetat: rastvarač koji se najčešće koristi u hromatografiji i prilikom ekstrakcije

aktivnih komponenti. Iako je nestabilam i njegovi ekstrakti ne sadrţe velike količine flavonoida,

često se koristi zbog niske cene i male toksičnosti.

Etar: Etar se često koristi za ekstrakciju kumarina i masnih kiselina.

Dihlorometan se koristi za selektivnu ekstrakciju terpenoida

Rastvarači, kao što su metanol, etanol, etil-acetat, aceton i njihova kombinacija koriste se

za ekstrakciju fenola iz biljnog materijala. Odabir odgovarajućeg rastvarača bitno utiče na prinos

ekstrahovanih fenola. Otkriveno je da je metanol najefikasniji rastvarač za ekstrakciju polifenola

male molekulske mase, dok se za ekstrakciju flavonola velike molekulske mase koristi vodeni

rastvor acetona. Etanol je drugi dobar rastvarač za ekstrakciju polifenola i siguran je za

ispitivanje hrane. Za pripramanje ekstrakata koji sadrţe antocijane najčešće se koriste metanol i

etanol. Ovi rastvarači denaturišu ćelisku membranu, istovremeno rastvaraju antocijane i

stabilizuju ih. Najbolji prinos pri ekstarakciji antocijana dobija se korišćenjem slabih organskih

kiselina, kao što je mravlja, sirćetna, limunska, vinska i fosforna kiselina ili jake kiseline vrlo

male koncentracije: trifluorsirćetna i hlorovodonična (Dimitrijević M., 2012).

48

Eksperimentalni deo

49

8. Priprema ekstrakta pečuraka

Pečurke su brane tokom septembra i oktobra, 2016. godine u retkoj, mladoj borovoj šumi

i u bukovoj šumi na teritoriji Zaplanja, u okolini Gadţinog Hana. Uzorci su prikupljani na pet

lokaliteta. Nakon ćišenja od ostataka lišća i zemlje, pečurke su sušene do konstantne mase na

vazduhu, usitnjene, a zatim je odmerena masa (10g) ekstrahovana na ultrazvučnom kupatilu.

Uzorak je ekstrahovan dva puta po 30 minuta, sa sveţim porcijama rastvarača. Odnos pečurakai

rastvarača je 1 : 10. Rastvarači koji su korišćeni za ekstrakciju su metanol, aceton i etil-acetat.

Dobijeni ekstrakti su profiltrirani i koncentrovani na rotacionom vakuum uparivaču do suva.

Masa suvog ostatka je merena na analitičkoj vagi i rastvorena u dimetil sulfoksidu (DMSO), a

krajnja koncentracija ekstrakta je bila 20 mg/ml izraţena u odnosu na masu suvog ekstrakta (SE).

8.1. Aparatura i pribor

- UV/Vis spektrofotometar, Perkin Elmer Lambda 15

- vaga, Shimadzu AX20

- ultrazvučno kupatilo, Maget Bela Palanka

- vodeno kupatilo, Baths HH-S114

- vakuum uparivač, IKA RV 05 basic Werke

- aparat za dejonizovanu vodu, TKA MICROMED

8.2. Korišćeni reagensi

- 1%-tni rastvor K3[Fe(CN)6] (Merck, Nemačka)

- 10%-tna trihlorsirćetna kiselina (Merck, Nemačka)

- 0,1% FeCl3 (Merck, Nemačka)

- Askorbinska kiselina (vitamin C) (Seharlau, Nemačka)

- Pufer NaH2PO4-Na2HPO4 (0,2 mol/L, pH=6,6) (NaH2PO4-Na2HPO4 Zorka, Srbija)

- Rastvor CuCl2 ; 0,01M

- Pufer NH4OAc (pH=7)

- Butil hidroksi toluen (BHT) (Zorka, Srbija)

- 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) (La Chema, Nemačka)

- kalijum persulfat (K2S2O8) (Merck, Nemačka)

- Trolox (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina) (Sigma Aldrich,

Nemačka)

- metanol (100%, VWR International S.A.S, Francuska)

- 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS)

- 2,9-dimetill-1,10-fenantrolin (neokuproin) (Merck, Nemačka)

- dimetil sulfoksid (DMSO) (Sigma Aldrich, Nemačka)

50

9. Metode određivanja antioksidativne aktivnosti

9.1. Određivanje ukupnog sadržaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content-TPC)

Određivanje ukupnog sadrţaja fenolnih jedinjenja u analiziranim gljivama rađeno je po metodi

Singleton (Singleton i sar., 1999) korišćenjem Folin–Ciocalteu reagensa. 0,05 ml ekstrakta

pomešano je sa 0,5 ml Folin–Ciocalteu reagensom, 2 ml Na2CO3 i dopunjeno vodom do

zapremine od 7,55 ml. Dobijena smeša je promešana i ostavljena da stoji 30 minuta u mraku, na

sobnoj temperature nakon čega je merena apsorbanca na talasnoj duţini od 750 nm.

9.2. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity)

U smešu koja sadrţi 0.05 ml uzorka i 1.05 ml vode, 1 ml amonijum-acetatnog pufera

(pH=7) i 1 ml rastvora neokuproina dodato je 1 ml rastvora Cu(II)-hlorida. Dobijena smeša je

dobro promešana i ostavljena da stoji 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, merena je

apsorbanca na talasnoj duţini od 450 nm, pri čemu je slepu probu prestavljala smeša reagensa

bez dodatog uzorka.

9.3. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno

radikalskog kapaciteta prema 2,2’-azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) (ABTS) radikalu

ABTS test je izveden metodom (TEAC) koju su opisali Re (Re i sar., 1999) i Arts (Arts i

sar., 2004) uz male izmene. ABTS je rastvoren u metanolu do koncentracije 7٠10-3

mol/l.

ABTS˙+

radikal katjon nastaje kao proizvod reakcije između ABTS rastvora i 2,4٠10-3

mol/l

K2S2O8 Radni rastvor se priprema mešanjem ova dva u odnosu 1:1 (10+10). Stavlja se da stoji u

mraku na sobnoj temperaturi 12 sati pre upotrebe. 14,8 ml ovog rastvora (ABTS˙+

) je razblaţen

sa 240 ml metanola do aposrobance od 0,7 ± 0,02 na talasnoj duţini od 734 nm. 0,1 ml ekstrakta

je pomešano sa 1,8 ml rastvora ABTS˙+ i sa 2,1 ml metanola. Nakon 6 minuta reakcije na sobnoj

temperaturi meri se smanjenje apsorbance na talasnoj duţini od 734 nm (ΔA=Ablank-A).

9.4. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno-radikalskog

kapaciteta prema 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikalu

51

"Scavening" radikalski kapacitet uzoraka određen je pomoću DPPH radikala. Pripremane

su reakcione smeše istih koncentracija ekstrakta (20 mg/ml). Za izvođenje ovog testa rastvor

DPPH reagensa (1·10-4

mol/l) je pripremljen u metanolu. 1,4 ml DPPH i 0,1 ml ekstrakta je

pomešano sa 2,4 ml metanola. Reakciona smeša je ostavljena da stoji u mraku 1h. Apsorbanca

rastvora je merena nakon stajanja na talasnoj duţini od 515 nm.

9.5. Odredjivanje antioksidacione aktivnosti merenjem ukupne redukcione

moći

Reakcione smeše su pripremane mešanjem odgovarajuće količine ekstrakta, 1 ml 1%-

tnog rastvora K3[Fe(CN)6] i fosfatnog pufera (NaH2PO4-Na2HPO4 , pH=6,6), tako da je ukupna

zapremina 3.7 mL. Smeše su inkubirane na 50°C 30 minuta i nakon toga je dodato 1 ml 10%-tne

trihlorsirćetne kiseline i 0.6 ml 0,1% FeCl3. Apsorbancija dobijenih smeša merena je na talasnoj

duţini od 700 nm. Redukciona moć gljiva je izaţena preko redukcione moći askrobinske

kiseline.

52

10. Hemometrijska analiza

Hemometrijski pristup hemiji omogućava da na osnovu matematičkih i statističkih

metoda pojasnimo dobijene rezultate. Takođe omogućava vizuelnu ilustraciju eksperimentalnih

rezultata; prikupljanja informacija iz različitih područja; vezu između varijabli; određivanje

sličnosti i različitosti između uzoraka. (Abollimo i sar., 2011).

Klaster analiza je hemomemtrijska metoda koja za cilj ima grupisanje uzoraka na osnovu

karakteristika koje oni imaju.

Klasterska analiza se moţe podeliti u dve grupe: a) hijerarhijsku, gde su klasteri dobijeni

povezivanjem jednog objekta koji je sukcesivno povezivan u veće grupacije ili počevši od

jednog klastera koji obuhvata sve objekte i deljenjem u manje i homogenije klastere i b)

nehijerarhijsku, kod koje objekti nisu sukcesivno povezani već se klasteri određuju direktno.

Najćešće korišćena jeste hijerarhijska klaster analiza (HKA), kod koje se uzorci klasifikuju na

osnovu sličnosti sa drugima u klasteru na osnovu nekog utvrđenog kriterijuma.

Jedan on načina merenja sličnosti između dva objekta u HKA jeste Euklidova (Euclidean)

udaljenost:

𝑑𝑖𝑗 = 𝑥𝑖𝑣 − 𝑥𝑗𝑣 2𝑛

𝑣=1

gde je n broj varijabli. Što je manja Euklidova udaljenost to je veća sličnost između objekata.

53

Rezultati i diskusija

54

11. Rezultati i diskusija

11.1. Određivanje ukupnog sadržaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic

Content-TPC)

Određivanje ukupnog sadrţaja fenolnih jedinjenja (TPC) u različitim vrstama gljiva

vršeno je pomoću Folin-Ciocalteu reagensa, pri čemu je kao rastvarač za ekstrakciju korišćen

metanol. Standardna serija galne kiseline kao i metanolni ekstrakti svih analiziranih vrsta gljiva

snimljeni su na spektrofotometru na talasnoj duţini od 750 nm. Kalibraciona prava za galnu

kiselinu prikazana je na Slici 36.

Slika 36. Kalibraciona prava za određivanje sadrţaja fenolnij jedinjenja

Ukupan sadrţaj fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima ispitivanih gljiva prikazan

je na Slici 37. Rezultati su prikazani kao mikrogram ekvivalenta galne kiseline po mg suvog

ekstrakta (µg GAE/mg SE). Određivanje ukupnih polifenolnih jedinjenja nije bilo moguće

uraditi iz acetonskih i etil-acetatnih ekstrakata jer je prilikom mešanja sa Folin-Ciocalteu-ovim

reagenssom došlo po zamućenja i stvaranja taloga.

y = 0.016x + 0.012

R² = 0.975

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0 1 2 3 4 5 6 7

A

C

55

Slika 37. Ukupan sadrţaj fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima analiziranih gljiva

Ono što se sa Slike 37. moţe uočiti jeste da metanolni ekstrakti gljiva L.volemus i L.

piperatus pokazuju slične vrednosti (41,8956 µg GAE/mg SE i 43,1693 µg GAE/mg SE,

respektivno), koje su skoro duplo manje od vrednosti metanolnih ekstrakata gljiva L.

semisanguifluus i L. sanguifluus (70,4976 µg GAE/mg i 75,2453µg GAE/mg, respektivno).

Imajući u vidu postojanje direktno proporcionalne veze između sadrţaja polifenolnih

jedinjenja i antioksidativne sposobnosti, očekuje se da će naredne metode za ispitivanje

antioksidativne aktivnosti pokazati da ekstrakti gljiva L. semisanguifluus i L. sanguifluus

ispoljavaju najbolju antioksidativnu aktivnost

11.2. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity)

CUPRAC metoda je vrlo jednostavna metoda za određivanje hidrofilnih i lipofilnih

antioksidanasa u hrani. Promena boje iz plave u ţuto-narandţastu posledica je redukcije Cu2+

jona antioksidansima do Cu+

pri čemu se gradi stabilan kompleks čiji je maksimum apsorpcije na

450 nm (Slika 38).

56

Slika 38. UV-VIS spektar Neo2Cu+

(λmax=450 nm)

Za određivanje antioksidativne aktivnosti korišćen je troloks kao standard. Tačnim

odmeravanjem zapremine standardnog rastvora i dodavanja ostalih reagenasa koji se koriste u

ovoj metodi dobijeni su rastvori tačno poznate koncentracije. Merenjem apsorbance u zavisnosti

od koncentracije dobijena je kalibraciona prava koja sluţi za određivanje nepoznate

koncentracije antioksidanasa u analiziranim gljivama (Slika 39):

Slika 39. Kalibraciona prava za određivanje sposobnosti redukcije jona Cu2+

u Cu+

CUPRAC metoda korišćena je za ispitivanje antioksidativne aktivnosti metanolnog,

acetonskog i etil-acetatnog ekstrakta gljive L. volemus, L. piperatus, L. semisanguifluu i L.

sanguifluus, sa ciljem pronalaţenja najboljeg rastvarača za ekstrakciju antioksidanasa iz

pomenutih gljiva. Dobijeni rezultati prikazani su na Slici 40.

y = 0,345x - 0,192

R² = 0,992

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

0 1 2 3 4 5 6 7

A

C

57

Slika 40. Antioksidativna aktivnost analiziranih gljiva određena CUPRAC metodom u

ekstraktima rastvarača različite polarnosti

Prilikom ispitivanja antioksidativne aktivnosti svih vrsta gljiva, korišćena je ista početna

koncentracija svih ekstrakata od 20 mg/ml. Na osnovu dobijenih rezultata moţe se uočiti da sva

tri ekstrakta (metanolni, acetonski i etila-cetatni) gljive L. semisanguifluus i L. sanguifluus

pokazuju znatno veću aktivnost u poređenju sa vrstama L. piperatus i L. volemus. Takođe, moţe

se uočiti da acetonski ekstrakti svih vrsta gljiva sa izuzetkom L. volemusa pokazuju najveću

aktivnost i to 19,2584 µg TE/mg SE za L. sanguifluus, 12,7669 µg TE/mg SE za L.

semisanguifluus i 8,2854 µg TE/mg SE za L. piperatus. Pored ovog zapaţanja moţe se uočiti da

ukoliko se poredi antioksidstivna aktivnost ekstrakata u funkciji izbora rastvarača moţe se

zaključiti da prilikom izbora rastvarača za ovu metodu treba izbegavati etil-acetat jer ti ekstrakti

pokazuju najmanju aktivnost.

58

11.3. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno

radikalskog kapaciteta prema 2,2’-azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) (ABTS) radikalu

ABTS metoda se koristi za određivanje antioksidativne aktivnosti i kao tehnika je veoma

brza i jednostavna. Antioksidansi u ekstraktu redukuju ABTS˙+

radikal katjon po metodi koju su

opisali Ozgen i saradnici (2006). Kako je metanolni rastvor ABTS˙+ radikal plave boje sa

maksimumom apsorpcije na 734 nm (Slika 41), usled redukcije dolazi do smanjenja intenziteta

boje, što za posedicu ima manju apsorbancu.

Slika 41. UV-VIS spektar ABTS˙+ radikala (λmax=734 nm)

"Hvatanje" ABTS˙+

radikala određivano je na osnovu kalibracione prave koja je dobijena

korišćenjem troloksa kao standardnog reagensa i rezultati su prikazani kao mikrogram troloks

ekvivalenta po miligramu suvog ekstrakta (µg TE/mg SE) (Slika 42).

59

Slika 42. Kalibraciona prava za određivanje antioksidativne aktivnosti ABTS˙+ radikalom

Slika 43. ABTS “hvatačka” sposobnost ekstrakata različite polarnosti analiziranih vrsta gljiva

Na osnovu Slike 43, moţe se uočiti određena pravilnost kod analiziranih ekstrakata

gljiva. Metanolni ekstrakti svih analiziranih vrsta gljiva pokazuju veću "hvatačku" sposobnost

ABTS˙+

radikala u odnosu na acetonske i etil-acetatne ekstrakte. Poređenjem antioksidavne

y = 0,032x - 0,014

R² = 0,999

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0 1 2 3 4 5

A

C

60

aktivnosti metanolnih ektrakata najveću sposobnost hvatanja ABTS radikala pokazuje metanolni

ekstrakt L. sanguifluus i to 8,9890 µg TE/mg SE a najmanju L. piperatus 6,0507 µg TE/mg SE.

Takođe, kod svih analiziranih vrsta gljiva antioksidativna sposobnost ekstrakta opada u nizu

metanolni > acetonski > etil-acetatni ekstrakt. Ovakav redosled se objašnjava i najvećom

polarnošću metanola u odnosu na ostale primenjene rastvarače, i njegovom sposobošću da u

većoj meri rastvori polifenolna jedinjenja. Etil-acetatni ekstrakti imaju najmanje vrednosti

sadrţaja polifenolnih jedinjenja. Aceton je po svojoj polarnosti između metanola i etil-acetata,

tako da je i sadrţaj polifenola u acetonskom ekrtaktu manji od sadrţaja tih jedinjenja u

metanolnim, ali veći od sadrţaja polifenola u etil-acetatnim ekstraktima.

11.4. Određivanje "scavenging" antioksidansnog slobodno

radikalskog kapaciteta prema 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH)

radikalu

Kapacitet “hvatanja” slobodnih radikala ispitivanih uzoraka određivan je merenjem

njihove sposobnosti da redukuju DPPH˙ radikale (DPPH test) (Brand-Williams i sar., 1995). 1,1-

difenil-2-pikrilhidrazil radikal (DPPH˙) je stabilan radikal čiji je maksimum apsorpcije na 515

nm (Slika 44).

Slika 44. UV-VIS spektar metanolnog rastvora DPPH˙ radikala

Antioksidansi reaguju sa stabilnim DPPH˙ radikalom i transformišu ga pri čemu dolazi

do smanjenja ljubičaste boje rastvora radikala. Što je veće obezbojavanje rastvora DPPH˙, to je

koncentracija antioksidanasa u uzorku veća. Nivo obezbojavanja rastvora DPPH˙ radikala

61

ukazuje na "skevindţer" potencijal antioksidanasa. Upravo je ova metoda primenjena za

određivanje antioksidativne aktivnosti ekstrakata različite polarnosti ispitivanih gljiva.

Kalibracione prava je dobijena korišćenjem standardnog rastvora troloksa pri čemu je

antioksidativna aktivnost izraţena kao mikrogram troloks ekvivalenta na miligram suvog

ekstrakta (µg TE/mg SE) (Slika 45).

Slika 45. Kalibraciona prava za određivanje antioksidativne aktivnosti DPPH˙ metodom

Izvršeno je ispitivanje antioksidativne aktivnosti metanolnog, acetonskog i etil-acetatnog

ekstrakta gljiva L. volemus, L. piperatus, L. sanguifluus i L. semisanguifluus. Dobijeni rezultati

prikazani su na Slici 46.

y = 0.040x - 0.049

R² = 0.996

-0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 2 4 6 8 10

A

C

62

Slika 46. DPPH "hvatačka" sposobnost ekstrakata različite polarnosti analiziranih vrsta gljiva

Na osnovu dobijenog grafika moţe se zaključiti da je acetonski ekstrakt gljive L.

sanguifluus pokazao najveću antioksidativnu aktivnost i to 2,4968 μg TE/mg SE. Za razliku od

gljiva L. sanguifluus, L. semisanguifluus i L.piperatus, acetonski i etil-acetatni ekstrakt gljive L.

volemus pokazuje znatno manju aktivnost dok metanolni ekstrakt pokazuje vrednost od 1,8355

μg/mg SE. Prema DPPH testu najmanju aktivnost pokazuje etil-acetatni ekstrakt gljive L.

piperatus i to 0,0679 μg TE/mg SE .

11.5. Odredjivanje antioksidacione aktivnosti merenjem ukupne

redukcione moći (TRP metoda)

Moć redukcije Fe3+

jona u Fe2+

jon je još jedno merilo antioksidativne sposobnosti neke

ispitivane vrste. Redukciona moć metanolnog, acetonskog i etil-acetatnog ekstrakta je određena

korišćenjem askorbinske kiseline kao standarda i rezultati su prikazani kao mikrogram

ekvivalenta askorbinske kiseline po miligramu suvog ekstrakta (µg AAE/mg SE). Uzorci su

63

zajedno sa stadardom serijom askorbinske kiseline snimljeni na talasnoj duţini od 700 nm i

kalibraciona prava je prikazana na Slici 47.

.

Slika 47. Kalibraciona prava standardong rastvora askorbinske kiseline za određivanje

sposobnosti redukcije jona Fe3+

u Fe2+

Među rastvaračima različite polarnosti najbolju redukcionu moći pokazuju acetonski

ekstrakti svih analiziranih vrsta. Acetonski ekstrakt L. sanguifluus pokazuje najveću redukcionu

moć od 0,6029 µg AAE/mg SE, zatim sledi acetonski ekstrakt L. piperatus sa 0,4872 µg AAE/mg

SE, za njim acetonski ekstrakt L. semisanguifluus 0,4599 µg AAE/mg SE, dok acetonski ekstrakt

L.volemus pokazuje slabu redukcionu moć. Što se tiče ostalih ekstrakata vrednosti za redukcionu

moć variraju od uzorka do uzorka i ne postoji velika razlika u brojčanim vrednostima između

metanolnih i etil-acetatnih ekstrakata analiziranih vrsta, što se moţe videti sa grafikona (Slika

48).

y = 0.105x - 0.045

R² = 0.985

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0 1 2 3 4 5 6 7

A

C

64

Slika 48. Ukupna redukciona moć ekstrakata različite polarnosti analiziranih vrsta gljiva

11.6. Klaster analiza

Hijerarhijska klaster analiza je primenjena na četri različite metode za određivanje

antioksidativne aktivnosti (CUPRAC,ABTS, DPPH i TRP), sa ciljem grupisanja uzoraka gljiva

na osnovu njihove antioksidativne sličnosti. Klaster aniliza rađena je korišćenjem Wardove

metode i sličnost među uzorcima je određena na osnovu Euklidove udaljenosti.

Rezultati dobijeni korišćenjem HKA metode prikazani su na dendrogramu (Slika 49).

Kao što se moţe uočiti, analizirane gljive su podeljene u dva statistički značajna klastera,

(Dlink/Dmax) × 100 < 50, klaster A i klaster B.

65

Prvi klaster (A) čine metanolni, acetonski i etil-acetatni ekstrakti gljive L. sanguifluus i L.

semisanguifluus. U okviru ovog klastera postoje i dva podklastera. Svaki podklaster obuhvata

eksreakte različite polarnosti jedne vrste gljiva. Najveću sličnost pokazuju acetonski i etil-

acetatni ekstrakti gljive L. semisanguifluus (0,1-Euklidovo rastojanje). Ovi ekstrakti zajedno sa

metanolnim ekstraktom ove gljive čine jedan podklaster klastera A. Drugi podklaster čine

metanolni i etil-acetatni ekstrakt gljive L. semisanguifluus (1,5-Euklidovo rastojanje), što je i

očekivano jer ovi ekstrakti pokazuju sličnu antioksidativnu aktivnost, dok je acetonski ekstrakt

izdvojen jer pokazuje bolju aktivnost u odnosu na pomenute.

Metanolni, acetonski i etil-acetatni ekstrakti gljive L. volemus i L. piperatus čine drugi

klaster (B). Drugi klster podeljen je u dva podklastera; prvi podklaster sadrţi acetonski ekstrakt

L.volemus, etil-acetatni ekstrakt L.piperatus (0,7-Euklidovo rastojanje), etil-acetatni ekstrakt

L.volemus i metanolni ekstrakt L.volemus. Metanolni ekstrakt L. piperatus i acetonski ekstrakt L.

piperatus čine drugi podklaster klastera B.

Ward`s method

Euclidean distances

0 20 40 60 80 100 120

(Dlink/Dmax)*100

Lactarius sanguifluus Ac

Lactarius sanguifluus EtAc

Lactarius sanguifluus MeOH

Lactarius semisanguifluus EtAc

Lactarius semisanguifluus Ac

Lactarius semisanguifluus MeOH

Lactarius piperatus Ac

Lactarius piperatus MeOH

Lactarius volemus EtAc

Lactarius piperatus EtAc

Lactarius volemus Ac

Lactarius volemus MeOH

Klaster A

Klaster B

Slika 49. Dendrogram ekstrakata različite polarnosti analiziranih vrsta

66

Zaključak

67

12. Zaključak

U ovom radu prikazani su rezultati ispitivanja antioksidativne aktivnosti ekstrakta gljiva

Lactarius volemus, Lactarius piperatus, Lactarius sanguifluus i Lactarius semisanguifluus u

cilju analize antioksidativne aktivnosti ekstrakata različite polarnosti.

Antioksidativna aktivnost metanolnog, acetonskog i etil-acetatnog ekstrakta gljiva L.

volemus, L. piperatus, Lactarius sanguifluus i Lactarius semisanguifluus određivana je

primenom pet različitih metoda (Određivanje ukupnog sadrţaja fenolnih jedinjenja (Total

Phenolic Content-TPC), određivanje antioksidativne aktivnosti korišćenjem Cu(II) kao oksidansa

(CUPRAC metoda), određivanje antioksidativne aktivnosti ispitivanih uzoraka merenjem

njihove efikasnosti redukcije ABTS˙+ radikala (ABTS metoda), određivanje „scavenging“

antioksidansnog slobodno-radikalskog kapaciteta prema 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH)

radikalu (DPPH metoda), određivanje antioksidativne aktivnosti merenjem ukupne redukcione

moći (TRP metoda).

Na osnovu rezultata dobijenih različitim metodama moţe su videti da antioksidativna

aktivnost u mnogome zavisi od odabira rastvarača za pripremu ekstakata, jer rastvarači različite

polarnosti ekstrahuju različite komponente u skladu sa njihovom rastvorljivošću u istim.

Određivanjem ukupnog sadrţaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content-TPC)

utvrđeno je da je najveći sadrţaj polifenola u ekstraktu gljive L. sanguifluus, a najmanji u

ekstraktu gljive L.volemus. Ovi rezultati su u skladu sa primenjenim metodama za određivanje

antioksidativne aktivnosti.

Ukoliko se uporede vrednosti za CUPRAC metodu za sve ekstrakte analiziranih vrsta

gljiva utvrđeno je da je največu antioksidativnu aktivnost pokazuju acetonski ekstrakti i to

ekstrakt gljive L. sanguifluus, a najmanju etil-acetatni ekstrakti i to ekstrakt gljive L. volemus.

Određivanjem antioksidativne aktivnosti ispitivanih uzoraka merenjem njihove

efikasnosti redukcije ABTS radikala, dolazi se do saznanja da metanolni ekstrakti svih vrsta

analiziranih gljiva ispoljavaju najvećuj antioksidativnu aktivnosti, dok je ona najmanja u etil-

acetatnim ekstraktima. To se objašnjava činjenicom da je metanol najpolarniji rastvarač, pa je

kao takav više od ostalih primenjivanih rastvarača mogao da ekstrahuje antioksidanse.

Određivanjem "scavening" antioksidativnog slobodno-radikalskog kapaciteta prema 2,2-

difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikalu, najveći slobodno-radikalski antioksidativni kapacitet,

pokazuje acetonski ekstrakt L. sanguifluus, a najmanji antioksidativni kapacitet pokazuje etil-

acetatni ekstrakt L. volemus.

68

Određivanje antioksidativne aktivnosti merenjem ukupne redukcione moći ukazuje da svi

acetonski ekstrakti gljiva ispoljavaju najveću ukupnu redukcionu moć, dok etil-acetatni ekstrakti

pokazuje najmanju ukupnu redukcionu moć.

69

Literatura

70

13. Literatura

Abollimo, O., Malandrino, M., Giacomino, A., Mentasti, E. The role of

chemometrics in single and sequential extraction assays: A review Part I. Extraction

procedures, uni- and bivariate techniques and multivariate variable reduction

techniques for pattern recognition. Analytica Chimica Acta, 2011, 688, 104-121.

Ak T, Gulcin I. Antioxidant and radical scavenging properties of curcumin. Chem Biol

Int 2008; 174: 27-37.

Arai S., Mori T., Miki W., Yamaguchi K., Konosu S., Satake M., Fujita T., Pigmentation

of juvenile coho salmon with carotenoid oil extracted from Antarctic krill, Aquaculture, 66,

1987, 255-264.

Arts M.J.T.J., Haenen G.R.M.M., Voss H.P., Bast A., Antioxidant capacity of reaction

products limits the applicability of the trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay.

Food Chem Toxicol., 42 (1) (2004) 45–49.

Aruoma OI, Assessment of potencial prooxidant and antioxidant actions, Journal of the

American Oil Chemists' Society, 1996, 1617-1625.

Aruoma OI, Methodological considerations for characterizing potential antioxidant

actions of bioactive components in plant foods, Mutation Research, 2003, 9-20, 523–524.

Barros L, Dueñas M, Dias MI, Sousa MJ, Santos-Buelga C, Ferreira I, Phenolic profiles

of cultivated, in vitro cultured and commercial samples of Melissa officinalis L. infusions, Food

Chemistry, 136, 2013, 1-8.

Barros, L., Baptista, P., Correia, D. M., Sá Morais, J., Ferreira, I. C. (2007a). Effects of

conservation treatment and cooking on the chemical composition and antioxidant activity of

Portuguese wild edible mushrooms. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55(12),

4781‐4788.

Barros, L., Correia, D. M., Ferreira, I. C., Baptista, P., Santos‐Buelga, C. (2008a).

Optimization of the determination of tocopherols in Agaricus sp. edible mushrooms by a normal

phase liquid chromatographic method. Food Chemistry, 110(4), 1046‐1050.

Barros, L., Venturini, B. A., Baptista, P., Estevinho, L. M., Ferreira, I. C. (2008b).

Chemical composition and biological properties of Portuguese wild mushrooms: a

comprehensive study. Journal of agricultural and food chemistry, 56(10), 3856‐3862.

71

Boros B, Jakabová S, Dörnyei A, Horváth G, Pluhár Z, Kilára F, Felinger A,

Determination of polyphenolic compounds by liquid chromatography–mass spectrometry in

Thymus species, Journal of Chromatography A, 51, 2010, 7972-7980.

Boţin, B. Biohemijska i farmakološka ispitivanja vrsta roda Allium L. (Sect. Allium).

Doktorska disertacija. Univerzitet u Novom Sadu, Prirodno-matematički fakultet, Novi Sad.

2009.

Britton G., The biochemistry of natural pigments, Cambridge University Press, Cam-

bridge, UK, 1983.

Cadenas E., Davies, J. A. K., Mitochondrial free radical generation, oxidative stress and

aging, Free Rad. Biol. Med., 29, 2000, 222-230.

Cook NC, Samman S, Flavonoids-Chemistry, metabolism, cardioprotective effects, and

dietary sources, Nutritional Biochemistry, 1996, 7, 66-76.

Cvetković J., Antioksidacione osobine vrste Allium scorodoprasum, Prirodno-

matematički fakultet, Niš, 2012.

Denisov ET, Afanasev IB, Oxidation and Antioxidants in Organic Chemistry and

Biology, CRC Press Taylor & Francis Group, USA, 2005.

Dewick PM, Medicinal Natural Products-A Biosynthetic Approach, Second Edition, John

Wiley & Sons, 2002, England.

Dimitrijević M., Uticaj poţara na antioksidativne karakteristike ekstrakta biljke Seseli

rigidum Waldst&Kit, Prirodno-matematički fakultet, Niš, 2012.

Dixon R. A., Paiva N. L., Stress- induced phenylpropanoid metabolism, Plant. Cell., 7,

1995, 1085-1097.

Dorman HJD, Kosar M, Kahlos K, Holm Y, Hiltunen R, Antioxidant Properties and

Composition of Aqueous Extracts from Mentha Species, Hybrids, Varieties, and Cultivars,

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 15, 4563-4569.

Dragovic-Uzelac V, Pospišil J, Levaj B, Delonga K, The study of phenolic profiles of

raw apricots and apples and their purees by HPLC for the evaluation of apricot nectars and jams

authenticity, Food Chemistry, 2005, 91, 373-383.

Escarpa A, González MC, Fast separation of (poly)phenolic compounds from apples and

pears by high-performance liquid chromatography with diode-array detection, Journal of

Chromatography A, 1999, 2, 301-309.

72

Ferreira, I. C., Barros, L., Abreu, R. (2009). Antioxidants in wild mushrooms. Current

Medicinal Chemistry, 16(12), 1543‐1560.

Gómez-Alonso S, García-Romeroa E, Hermosín-Gutiérrez I, HPLC analysis of diverse

grape and wine phenolics using direct injection and multidetection by DAD and fluorescence,

Journal of Food Composition and Analysis, 2007, 7, 618-626.

Guern J., Renaudin J.P., Brown S.C., The compartmentation of secondary metabolites in

plant cell cultures, in: Cell culture in phytochemistry, Constabel, F., Vasil, I. K., (Eds.),

Academic Press, London, UK, 1987, 43-76.

Häkkinen S, Heinonen M, Kärenlampi S, Mykkänen H, Ruuskanen J, Törrönen R,

Screening of selected flavonoids and phenolic acids in 19 berries, Food Research International,

June 1999, 5, 345-353.

Halliwel B., Whiteman, M., Measuring reactive species and oxidative damage invivo in

cell culture: how should you do it and what do the results mean?, Br. J. Pharmacol.142, 231-255,

2004

Halliwell B., Gutteridge J. M. C., Free radicals in biology and medicine, Clarendon,

Press, Oxford, 1985.

Harborne J. B., Baxter H., eds., Handbook of natural flavonoids, Wiley & Sons,

Chichester, UK, 2, 1999.

Harborne J. B., The Flavonoids: advances in research since 1986. Chapman & Hall,

Cambridge, UK, 1994.

Harborne J. B., Williams C. A., Advances in flavonoid research since 1992,

Phytochemistry, 55, 2000, 481–504.

Havsteen BH, The biochemistry and medical significance of the flavonoids,

Pharmacology & Therapeutics, 2002, 96, 67-202.

Heilman-Clausen, J., Verbeken, A., Vesterholt,J.: The genus Lactarius, Fungi of Northern

Europe vol. 2. Svampetryk, 1998..

http://bioras.petnica.rs/vrsta.php?id=45199

http://www.boletus.hr/prikaz.asp?slovo=Lactarius+piperatus+(Scop%3AFr)+Pers

http://www.boletus.hr/prikaz.asp?slovo=Lactarius+volemus+(Fr%3AFr)+Fr

http://www.gljivari.org.rs/Prirucnik_za_sakupljace.pdf

73

https://en.wikipedia.org/wiki/Lactifluus_piperatus

https://en.wikipedia.org/wiki/Lactifluus_volemus

Huang D., Ou B., Prior R. L. (2005) The chemistry behind antioxidant assays. J. Agric.

Food Chem. 53, 1841-56

Hurtado-Fernández E, Gómez-Romero M, Carrasco-Pancorbo A, Fernández-Gutiérrez A,

Application and potential of capillary electroseparation methods to determine antioxidant

phenolic compounds from plant food material, Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, 2010, 53, 1130-1160.

Irakli MN, Samanidou VF, Biliaderis CG, Papadoyannis IN, Development and validation

of an HPLC-method for determination of free and bound phenolic acids in cereals after solid-

phase extraction, Food Chemistry, 2012, 134, 1624–1632.

Kaiser A, Carle R, Kammerer DR, Effects of blanching on polyphenol stability of

innovative paste-like parsley (Petroselinum crispum (Mill.) Nym ex A. W. Hill) and marjoram

(Origanum majorana L.) products, Food Chemistry, 2013, 2-3, 1648-1656.

Kojic D., Otpornost na niske temperature i dehidrataciju kukuruznog plamenca (Ostrinia

nubilalis Hb)- celijski i molekularni odgovor. Doktorska disertacija.Univerzitet u Novom Sadu,

Prirodno-matematicki fakultet, Novi Sad. 2009.

Koraćević i sar., 2003. Biohemija

Kranl K., Schlesier K., Bitsch R., Hermann H., Rohe M., Bohm V., Comparing

antioxidative food additives and secondary plant products – use of different assays, Food Chem.,

93 (2005) 171–175.

Krishnaiah D, Sarbatly S, Nithyanandam R, A review of the antioxidant potential of

medicinal plant species, Food and Bioproducts Processing, 2011, 3, 217–233.

Lampe J. W., Health effects of vegetables and fruit: assessing mechanisms of action in

human experimental studies, Am. J. Clin. Nutr., 70, 1999. 475-490.

Leucuta S, Vlase L, Gocan S, Radu L, Fodorea C, Determination of phenolic compounds

from Geranium sanguineum by HPLC, Journal of Liquid Chromatography and Related

Technologies, 2005, 28, 3109-3117.

Macheix J. J., Fleuriet A., Billot J., Fruit phenolics, CRC Press, Boca Raton, FL, 1990.

Manzi, P., Aguzzi, A., Pizzoferrato, L. (2001). Nutritional value of mushrooms widely

consumed in Italy. Food chemistry, 73(3), 321‐325.

74

Marjana Davidović (2006); Gljive - blago naših krajeva , Metaphysica. ISBN: 86-7884-

005-6.

Marques V, Farah A, Chlorogenic acids and related compounds in medicinal plants and

infusions, Food Chemistry, 113, 2009, 1370-1376.

Matija Josipović, (2012), Gljive - vodič za prepoznavanje, Rijeka: Leo- commerce, ISBN

: 978-953-218-340-5.

Mendil, D., Uluözlü, Ö. D., Tüzen, M., Hasdemir, E., Sarı, H. (2005). Trace metal levels

in mushroom samples from Ordu, Turkey. Food Chemistry, 91(3), 463‐467.

Miles, P. G., & Chang, S. T. (2004). Mushrooms: cultivation, nutritional value, medicinal

effect, and environmental impact. CRC press.

Mimica-Dukić, N. (1997) In vivo i in vitro ispitivanja antioksidantnih svojstava biljnih

ekstrakata, Arh. farm. 5: 475- 493.

Monties B., Lignins, in: Methods in plant biochemistry, Dey P. M., Harborne J. B., (Eds.)

Acad. Press, London, UK, 1989. 113-157.

Moure A, Cruz JM, Franco D, Domínguez JM, Sineiro J, Domínguez H, Núñez MJ,

Parajó JC, Natural antioxidants from residual sources, Food Chemistry, 2001, 72, 145-171.

Nováková L, Spáĉil Z, Seifrtová M, Opletal L, Solich P, Rapid qualitative and

quantitative ultra high performance liquid chromatography method for simultaneous analysis of

twenty nine common phenolic compounds of various structures, Talanta, 2010, 80, 1970-1979.

Ouzouni, P. K., Petridis, D., Koller, W. D., Riganakos, K. A. (2009). Nutritional value

and metal content of wild edible mushrooms collected from West Macedonia and Epirus,

Greece. Food Chemistry, 115(4), 1575‐1580.

Prakash D, Singh BN, Upadhyay G, Antioxidant and free radical scavenging activities of

phenols from onion (Allium cepa), Food Chemistry, 2007, 4, 1389-1393.

Re R., Pellegrin N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C., Antioxidant

activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay, Free Radical Bio. Med.,

26 (1999) 1231-1237.

Robards K, Prenzer PD, Tucker G, Swatsitang P, Glover W, Phenolic compounds and

their role in oxidative process in fruits, Food Chemistry, 1999, 66, 401-436.

Romani A, Pinelli P, Galardi C, Sani G, Cimato A, Heimler D, Polyphenols in

greenhouse and open-air-grown lettuce, Food Chemistry, 2002, 3, 337-342.

75

Romano Boţac., Gljive naših krajeva., Grafički zavod Hrvatksa, Zagreb, 1978.

Rudawska, M., Leski, T. (2005). Macro‐and microelement contents in fruiting bodies of

wild mushrooms from the Notecka forest in west‐central Poland. Food chemistry, 92(3),

499‐506.

Sanchez-Moreno, C., Methods used to evaluate the free radical scavenging activity in

foods and biological systems, review: free radical scavenging activity in foods, Food Sci. Tech.

Int., 8, 121-137, 2002.

Sánchez-Rodríguez E, Ruiz JM, Ferreres F, Moreno DA, Phenolic profiles of cherry

tomatoes as influenced by hydric stress and rootstock technique, Food Chemistry, 2012, 2, 775-

782.

Santos-Gomes PC, Seabra RM, Andrade PB, Fernandes-Ferreira M, Phenolic antioxidant

compounds produced by in vitro shoots of sage (Salvia officinalis L.), Plant Science, 2002, 162,

981-987.

Sayre M. L., Perry G., Smith A. M., Redox metals and neurodegenerative disease, Curr.

Opin. Chem. Biol., 3, 1999, 220-225.

Simpson DP. (1979). Cassell's Latin Dictionary (5 izd.). London, UK: Cassell Ltd.

str. 883. ISBN 0-304-52257-0.

Singleton VL, Rossi J, Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-

Phosphotungstic Acid Reagents, American Journal of Enology and Viticulture, 1965, 16, 144-

158.

Skibola C. F., Smith M. T., Potential health impacts of excessive flavonoid intake, Free

Radic. Biol. Med., 29, 3-4, 2000, 375-383.

Soylak, M., Saraçoğlu, S., Tüzen, M., Mendil, D. (2005). Determination of trace metals

in mushroom samples from Kayseri, Turkey. Food Chemistry, 92(4), 649‐652.

Stojković M., Antioksidativna aktivnost, fenolni i mineralni sastav biljnih vrsta Geranium

macrorrhizum L., Allium ursinum L., Stachys germanica L. i Primula veris L., Prirodno-

matematički fakultet, Niš, 2014.

Strack D., Phenolic metabolism, in: Plant Biochemistry, Dey, P. M., Harborne, J. B.

(Eds.), Academic Press, New York, 1997, 387-437.

Tirzitis, G., Bartosz, G. (2010): Determination of antiradical and antioxidant activity:

basic principles and new insights. Acta Biochimica Polonica, 57(1), 139-142.

76

Todorović M., Đurđević P., Antonijević V., Optičke metode instrumentalne analize,

Hemijski fakultet, Beograd (1997) 232-233.

Tomas-Barberan F, Espin JC, Phenolic compounds and related enzymes as determinants

of quality of fruits and vegetables, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81,

853-876.

Usenik V, Fabĉiĉ J, Štampar F, Sugars, organic acids, phenolic composition and

antioxidant activity of sweet cherry (Prunus avium L.), Food Chemistry, 1, 2008, 185-192.

Uzelac, B.: Gljive Srbije i zapadnog Balkana, BGV Logik, Beograd, 2009.

Vaya J., Aviram, M., Nutritional Antioxidants: Mechanisms of Action, Analyses of

Activities and Medical Applications, Curr. Med. Chem. - Imm., Endoc. & Metab. Agents, 1, 99-

117, 2001.

Vertuani S., Angusti A., Manfredini S., The antioxidants and pro-antioxidants network:

anoverview, Curr. Pharm. Des., 10 (2004) 1677–94.

Wallace G., Fry S. C., Phenolic components of the plant cell wall, Int. Rev. Cytol., 151,

1994, 229-267.

Wani, B. A., Bodha, R. H., Wani, A. H. (2010). Nutritional and medicinal importance of

mushrooms. J Med Plants Res, 4(24), 2598‐2604.

Winkel–Shirley B., Flavonoid biosynthesis: a colorful model for genetics, biochemistry,

cell biology and biotechnology, Plant Physiol., 126, 2001, 485–493.

Wollenweber E. Flavones and flavonols, U: The Flavonoids: Advances in research since

1986, Harborne, J. B. (Ed.), Chapman & Hall, Cambridge, UK, pp. 1994, 259–336.

Zielinski H, Kozłowska H, Lewczuk B, Bioactive compounds in the cereal grains before

and after hydrothermal processing, Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2001, 2,

159–169.