Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Hemijska analiza i određivanje antimikrobne aktivnosti etarskog

ulja biljne vrste Artemisia scoparia Waldst. & Kit.

-Master rad-

Kandidat Mentor

Marija Ivanović prof. dr Ivan Palić

Niš, 2018.

Прилог5/1

ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редниброј, РБР:

Идентификациониброј, ИБР:

Типдокументације, ТД: монографска

Типзаписа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Марија Ивановић

Ментор, МН: Иван Палић

Насловрада, НР: Хемијска анализа и одређивање антимикробне

активности етарског уља биљне врсте Аrtemisia

scoparia Waldst. & Kit.

Језикпубликације, ЈП: српски

Језикизвода, ЈИ: српски

Земљапубликовања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2018

Издавач, ИЗ: ауторскирепринт

Местоиадреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога) 5 поглавља, 38 стране, 4 табела, 7 графичких приказа

Научнаобласт, НО: Хемија

Научнадисциплина, НД: Органска хемија и биохемија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: хемијски састав, етарско уље, антимикробна

активност, GC/MS, Artemisia scoparia

ОбразацQ4.09.13- Издање 1

УДК 581.192 : 582.998.16

579.6 : 582.998.16

Чувасе, ЧУ: Библиотека

Важнанапомена, ВН: Експериментални део рада рађен је у лабораторијама

за органску хемију и биохемију ПМФ-а у Нишу у оквиру

пројекта ОИ 172047

Извод, ИЗ: Надземни делови биљне врсте Аrtemisia scoparia

Waldst. et Kit. прикупљена су у Нишкој Бањи, у близини

Ниша, у фази пуног цветања. Из сувог узорка је

добијено етарско уље хидродестилацијом по Clevenger

–у. Хемијски састав је одређен анализом GC i GC/MS.

Идентификовано је 65 једињења што чини 98,6%.

Најзаступљенија класа једињења етарског уља су

фенилдиацетилени, са уделом од 46,3%. Једињење

које је доминатно у етарском уљу је капилен са уделом

од 35,2%, што чини приближно 1/3 етарског уља.

Резултати антимикробне активности етарског уља на

четири врсте бактерија и једну врсту гљивица су

испитивани диск – дифузионом методом. Етарско уље

је било неактивно на грам-негативне бактерије, али је

показало одређену активност према грам-позитивним

бактеријама. Испитивани узорак је имао висок

антифунгални потенцијал и показао је веома високу

активност у односу на Нистатин (29 мм), који је

коришћен као позитивна контрола.

Датумприхватањатеме, ДП: 17.1.2018.

Датумодбране, ДО:

30.10.2018.

Члановикомисије, КО: Председник: др Горан Петровић

Члан: др Александра Ђорђевић

Члан, ментор: др Иван Палић

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monographic

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master work

Author, AU: Marija Ivanović

Mentor, MN: Ivan Palić

Title, TI: Chemical analysis and determination of antimicrobial

activity of essential oil of plant species Artemisia scoparia

Waldst. & Kit.

Language of text, LT: serbian

Language of abstract, LA: english

Country of publication, CP: Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2018

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) 5 chapters, 38 pages, 4 tables, 7 graphic representations

Scientific field, SF: Chemistry

Scientific discipline, SD: Organic chemistry and biochemistry

Subject/Key words, S/KW: chemical composition, antimicrobial activity,

GC/MS,Artemisia scoparia

UC 581.192 : 582.998.16

579.6 : 582.998.16

Holding data, HD: library

Note, N: The experimental part of this master work was performed in laboratories for organic chemistry and biochemistry of Faculty of Sciences and Mathematics as a part of the grant 172047

Abstract, AB: Aerial parts of plant species Artemisia scoparia Waldst. et

Kit. were collected in Niška Banja, near Niš, in the stage

of full flowering. From the dry sample, essential oil was

isolated by Clevenger type hydrodistillation. The chemical

composition was determined by analysis using GC/MS.

65 compounds were identified, which makes 98.6%. The

major class of compounds in the essential oil is

phenyldiacetilene, with percentage of 46.3%. The major

component of oil was capillene, with percentage of

35.2%, which makes nearly 1/3 oil mass. The results of

antimicrobial activity of the essential oil against four

bacteria and one fungus species were determined using

disc-diffusion method. Essential oil was inactive against

gram-negative bacteria, but it showed some activity

against gram-positive bacteria. The studied sample had

high antifungal potential and showed very high activity in

comparison of Nystatin (29 mm), which was used as

positive control.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 17.01.2018.

Defended on, DE: 30.10.2018.

Defended Board, DB: President: dr Goran Petrović

Member: dr Aleksandra Djordjević

Member, Mentor: dr Ivan Palić

ОбразацQ4.09.13- Издање 1

Eksperimentalni deo ovog master rada odrađen je u laboratoriji za organsku hemiju i biohemiju

(Departman za hemiju, Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Nišu) i predstavlja deo

istraživanja u okviru projekta 172047.

Posebnu zahvalnost dugujem svom mentoru, dr Ivanu Paliću, vanrednom profesoru Prirodno-

matematičkog fakulteta, Univerziteta u Nišu, na ukazanom poverenju, korisnim savetima i

sugestijama tokom izrade master rada.

Veliku zahvalnost dugujem doktorantkinjama Jovani Ickovskii Katarini Stepić na izdvojenom

vremenu i stručnoj pomoći tokom izrade ovog master rada.

Zahvaljujem se svim prijateljima i kolegama na pruženoj podršci tokom studiranja.

Na kraju, neizmernu zahvalnost dugujem svojoj porodici na pruženoj podršci i motivaciji tokom

studiranja da istrajem do kraja.

HVALA VAM!

SADRŽAJ

1. UVOD I CILJEVI RADA.............................................................................................1

2. TEORIJSKI DEO .........................................................................................................4

2.1. SISTEMATIKA BILJAKA ........................................................................................................... 5

2.1.1. Uvod u sistematiku biljaka ..................................................................................................... 5

2.1.2. Familija Asteraceae ................................................................................................................ 6

2.1.3. Artemisia scoparia ................................................................................................................. 7

2.2. ETARSKA ULJA ......................................................................................................................... 8

2.2.1. Opšte karakteristike etarskih ulja ............................................................................................ 8

2.2.2. Fizičke osobine etarskih ulja................................................................................................... 9

2.2.3. Hemijski sastav etarskih ulja .................................................................................................. 9

2.2.4. Biološka aktivnost i primena etarskih ulja ............................................................................... 9

2.2.5. Postupci dobijanja etarskog ulja ........................................................................................... 10

2.3.DOSADAŠNJA ISPITIVANJA ETARSKOG ULJA BILJKE ARTEMISIA SCOPARIA ............... 12

2.4. GASNA HROMATOGRAFIJA .................................................................................................. 13

2.4.1. Parametri identifikacije ........................................................................................................ 14

2.5. GASNA HROMATOGRAFIJA / MASENA SPEKTROMETRIJA ............................................. 16

2.5.1. Kvantitativna GC/MS analiza ............................................................................................... 17

2.6. ANTIMIKROBNA AKTIVNOST .............................................................................................. 18

3. EKSPERIMENTALNI DEO ...................................................................................... 22

3.1. POREKLOI PRIPREMA BILJNOG MATERIJALA .................................................................. 23

3.2. IZOLOVANJE ETARSKOG ULJA ............................................................................................ 23

3.3. PARAMETRI I IDENTIFIKACIJE KOMPONENATA ETARSKOG ULJA GC/MS

ANALIZOM ..................................................................................................................................... 25

3.4. PARAMETRI DISK-DIFUZIONE METODE I BAKTERIJSKE KULTURE ZA TESTIRANJE

ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI ETARSKOG ULJA BILJNE VRSTE A. SCOPARIA ................... 26

4.REZULTATI I DISKUSIJA ....................................................................................... 27

4.1. HEMIJSKA ANALIZA ISPITIVANIH UZORAKA ................................................................... 28

4.1.1. Sadržaj i hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia .................................. 28

4.1.2. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia ................................... 33

5.ZAKLJUČAK .............................................................................................................. 34

LITERATURA ............................................................................................................... 36

1. UVOD I CILJEVI RADA

2

Upotreba bilja u lečenju vodi poreklo iz daleke prošlosti. Veština lečenja biljem razvijala

se kod svih naroda i sačuvala se, negde više, negde manje, kao tradicionalna ili narodna terapija,

popularno nazvana narodna medicina, sve do danas. Mnoge biljke su se uspešno vekovima

upotrebljavale u tradicionalnoj terapiji, a prihvaćene su i u medicini i predstavljaju važne

lekovite sirovine u savremenoj medicini [1].

Veština lečenja je kod „primitivnih naroda” bila povezana sa religijskim i ritualnim

obredima, što se i danas sreće tamo gde su očuvani tradicionalni oblici ljudske zajednice. Istorija

počinje pisanim spomenicima; prvi zapisi o korišćenju biljaka za lečenje sreću se kod Kineza

(Šen-Nung,2737-2698 god. p.n.e), Indusa (Vede, 2000-1000 god. p.n.e), Egipćana (Papirus

Ebers, 1500 god. p.n.e) i kasnije kod Grka i Rimljana[2].

Mogu se naći u svim raznovrsnim delovima biljke, uključujući seme, koren, list, cvet,

stablo, balzam, koru, smolu. Širok spektar aromatičnih materija dobijenih iz prirodnih izvora i

umetnostnjihove ekstrakcije i upotrebe vremenom se sporo razvijala, ali njihovo poreklo datira

čakod početka najstarijih civilizacija. U poslednje dve decenije primećuje se porast interesovanja

za komplementarnim metodama lečenja i upotrebom prirodno dobijenih produkata kao što su

etarska ulja. Aromaterapija se nekada smatrala primarnom praksom, postala je široko prihvaćena

i poštovana i sve više se nudi bolničkim pacijentima kao deo njihove terapije. Proizvođači

mediciskih proizvoda, kozmetike i parfema sve više prepoznaju vrednost etarskih ulja u

poboljšanju kvaliteta i privlačnosti svojih proizvoda. Istovremeno, kućna upotreba etarskih ulja

je u porastu, jer ljudi otkrivaju terapeutske prednosti i jedinstveno estetsko uživanje u uljima.

Trenutna naučna istraživanja u vezi sa hemijskim i medicinskim upotrebama određenih etarskih

ulja su pomogla da se potvrdi i objasninjihov lekoviti potencijal [3].

Aktivnost etarskih ulja predstavlja mešavinu aktivnosti njegovih sastojaka. Međutim,

teško je ispitivati aktivnost određenih, pojedinačnih komponenti ulja i većinom se definiše

farmakološka aktivnost ukupnog ulja. Pored velike raznovrsnosti, moguće je izdvojiti nekoliko

dejstava koje poseduje veći broj etarskih ulja, od kojih je značajno antimikrobno delovanje

etarskih ulja, pa se koriste kao dezinficijensi i antiseptici [2].

Familiji Asteraceae pripada rod Artemisia,koji obuhvata preko 800 vrsta. Najveći broj

vrsta se javlja u stepama Evrope, Azije, kao i u stepskim oblastima Severne i Srednje Amerike.

U Srbiji je pronađeno 9 vrsta.

3

Predstavnici ovog roda su zeljaste ili polužbunaste biljke. Listovi su naizmenično

raspoređeni, retko celi, najčešće su jednostavno ili više puta perasto deljeni.

Glavice su često viseće, cilindrične ili loptaste, grupisane u metličaste ili grozdaste cvasti.

Plod je ahenija po obliku cilindrična ili spljoštena [4].

Najznačajnije vrste roda Artemisia su: Artemisiapetrosa, Artemisiavulgaris,

Artemisiaabsinthium, Artemisia maritima, Artemisia pontica, Artemisia lobelii, Artemisiaannua,

Artemisiacampestris i Artemisia scoparia.

Rod Artemisia, poznat kao rod pelina, je jedan od najvecih u porodici Asteraceae, koji se

sastoji od više od 800 vrsta koje se mogu naći širom sveta, naročito na jugozapadu Azije i

centralne Evrope. Značaj ove vrste se može pripisati prisustvu fitotoksina i etarskih ulja, pored

ostalih neisparljivih sekundarnih metabolita. Utvrđeno je da etarsko ulje dobijeno iz delova

Artemisia scoparia ima medicinsku vrednost [5]. Biljka ima antiholesterolemično, antipiretičko,

antiseptično, holagogno, diuretičko i vazodilatatorno dejstvo.Ima antibakterijsku aktivnost koja

sprečava rastStaphylococcus aureus, Streptococci, Bacillusdysenteriae, Salmonella Typhi,

Bacillus subtilis, Pneumococci, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium.Koristi se u

lečenju žutice, hepatitisa i upale bešike. Biljka se takođe koristi u mešavini sa drugim lekovima

kao holagog [6].

Istraživanja su vršena korišćenjem sledećih metoda:

•za izolovanje etarskog ulja koristila se hidrodestilacija po Clevenger-u,

•za razdvajanje i analizu etarskog ulja gasna hromatografija (GC) i gasna hromatografija/masena

spektrometrija (GC/MS).

2. TEORIJSKI DEO

5

2.1. SISTEMATIKA BILJAKA

2.1.1. Uvod u sistematiku biljaka

Sistematika biljaka je botanička disciplina koja proučava raznovrsnost biljnog sveta i

traži puteve da se ta raznovrsnost svede u logički uređen sistem. Zajedno sa tim, savremena

sistematika kao biološka disciplina izučava ne samo raznovrsnost (i podjedinice unutar vrsta),

već i uzroke njihovog nastanka. Krajnji cilj sistematike biljaka sastoji se u raspoređivanju u

sistematske kategorije, na osnovu stvarnog srodstva svih sadašnjih i ranije živelih biljaka

(fosilnih), kao i u raspoređivanju tih grupa u takav logički sistem, koji bi odražavao tok

istorijskog razvoja biljnog sveta, njegovu evoluciju [7].

Sistematika biljaka pruža potporu i važan konceptualni doprinos drugim biološkim

disciplinama koji inače eksperimentalnim biolozima ne bi bio na raspolaganju. Ona predstavlja

fundamentalnu botaničku disciplinu od koje u velikoj meri zavisi rad drugih bioloških disciplina

kao što su: fiziologija, ekologija, geografija biljaka, populaciona biologija, biohemija, genet ika,

molekularna biologija i drugo, koje često kao predmet svojih istraživanja biraju biljke. Za sve

navedene oblasti nauke, veoma su značajne informacije o preciznoj identifikaciji i poznavanju

sistematskog položaja biljnih vrsta.

Svojim velikim delom ona se podudara sa taksonomijom, granom biologije koja

podrazumeva identifikaciju, deskripciju, nomenklaturu i klasifikaciju recentnih i fosilnih

organizama. U skladu sa taksonomskim pravilima, srodni organizmi se svrstavaju u formalne

sistematske, odnosno taksonomske jedinice, taksone, koji su organizovani po hijerarhijskom

principu. U skladu sa tradicionalnim konceptom, vrsta (Species) predstavlja osnovnu

taksonomsku jedinicu koja obuhvata sve jedinke istoga porekla, sličnog izgleda i anatomske

građe, koje međusobnim ukrštanjem daju plodno potomstvo. Nadalje, vrste klasifikujemo u više

taksonomske jedinice, od kojih su glavne: rod (Genus), porodica (Familia), red (Ordo), klasa

(Classis), razdeo (Phylum, Divisio) i na kraju carstvo (Regnum). Često se koriste i pomoćne

taksonomske kategorije, kod kojih se dodaje prefiks pod- odnosno sub-, nad- ili super- odnosno

supra-. Taksonomske jedinice niže od vrste su: podvrsta (Subspecies), varijetet (Varietas) i oblik

(Forma), a predstavljaju skup pripadnika jedne vrste koje se razlikuju od ostalih [8].

6

Idući od roda ka carstvu sve je manji broj zajedničkih osobina koje karakterišu određene

taksonomske jedinice. Taksonomske jedinice se označavaju latinskim nazivom, pri čemu se

koriste ustaljeni nastavci pri imenovanju.

Tabela 1.Taksonomija vrste Artemisia scoparia

Taksonomske kategorije Taksoni

Carstvo (regnum) Plantae

Podcarstvo (subregnum) Tracheobionta

Odeljak (phylum) Magnoliophita

Klasa (classis) Magnoliopsida

Podklasa (subclassis) Asteridae

Red (ordo) Asterales

Familija (familia) Asteraceae

Podfamilija (subfamilia) Asteroideae

Pleme (tribus) Anthemideae

Rod (genus) Artemisia

Epitet Scoparia

Vrsta Artemisia scoparia

2.1.2. Familija Asteraceae

Najbrojnija familija u okviru klase Magnoliopsida je porodica Asteraceae kojoj pripada

oko 1/3 vrsta.U okviru klase dikotiledonih skrivenosemenica najobimnija je familija glavočika

(Asteraceae, Compositae), a ujedno i jedina familija reda Asterales. Asteraceae su ogromna

kosmopolitska familija od 920 rodova i 19 000 vrsta. Asteraceae su većinom zeljaste

jednogodišnje ili višegodišnje biljke, ređe šiblje i drveće, jastučaste forme.Najstariji fosilni ostaci

datiraju iz doba oligocena [9].Predstavnici ove familije najčešće naseljavaju umerene oblasti i

planinske regione, a nalaze se i na otvorenim i često suvim staništima. Na prostoru Srbije i Crne

Gore nalazi se više od 80 rodova sa preko 800 vrsta [10]. Familija Asteraceae čini posebnu

prirodnu celinu i nemoguće ih je podeliti u posebne familije, pa čak ni u podfamilije [7].

7

2.1.3. Artemisia scoparia

Rod Artemisia, poznat pod nazivom rod-pelina, je rod gorkih aromata. Artemisia

obuhvata oko 800 vrsta koje su široko rasprostranjene u Južnoj Africi i Južnoj Americi, a 34

vrste su pronađene u Indiji. Ovaj rod je naziv dobio po grčkoj boginji čednosti (Artemis) [11].

Artemisia scopariaWaldst. & Kit., poznatija pod nazivom bezlisni pelin ili žuta metla, je

visoka, razgranata biljna vrsta blagog mirisa. Sama biljka popularna je među baštovanima kao

kultivisani ukras. U iranskoj tradicionalnoj medicini neki delovi biljke koristili su se za

hiperlipemiju, hipoglikemiju, a utvrđena je i njena antibakterijska, anti-inflamatorna aktivnost i

diuretičkodejstvo. Takođe, sveže listove stanovnici Irana upotrebljavali su i kao začine. Ekstrakt

biljke koristi se kao purgativ, za lečenje ušiju i groznice. Poznato je da je jedinjenje

„skoparon“,koje je pronađeno u A.scoparia, veoma značajno za razvoj boljih imunosupresivnih

agenasa.Etarska ulja pokazuju snažnu insekticidnu aktivnost [12].

Biljka je poznata po svojoj upotrebi u domacem sistemu medicine kao diuretik i

spazmolitik i kao lek za snižavanje temperature. Štaviše, infuzije napravljene od cele biljke se

tradicionalno koriste za lečenje žutice i drugih poremećaja jetre.

Fitohemijskim ispitivanjima biljnog materijala utvrđeno je prisustvo brojnih jedinjenja

uključujuci flavonoide (kvercetin, rutin i kempferol), fenolna jedinjenja (hlorogenična kiselina,

kofeinska kiselina, pirogalol i vanilin), karotenoide, L-askorbinska kiselinu i holin. Međutim,

biljni ekstrakt ili njegovi sastojci nisu široko proučavani farmakološki [13].

A.scoparia je jednogodišnja do dvogodišnja termofilna biljka, visoka 30-100 cm.

Stabljika ove biljke je gusto razgranata, crvenkasta. Listovi su sivkastozeleni, goli ili svilasto

dlakavi. Listovi rozete su dvostruko, perasto deljeni a režnjevi lancetasti, u vreme cvetanja

odsutni. Cvetovi su u crvenkastim piramidalnim cvastima. Glavice su okrugle, veličine 1,5-2 mm

i vise na kratkim drškama. Biljka raste mestimično pored puteva, na strnjini, na rudinama, od

nizija pa sve do planinskih oblasti. To je lekovita, ali alergena biljka. U nekim Evropskim

zemljama je zakonom zaštićena kao retkost [14].

8

Slika 1.Artemisia scopariaWaldst.& Kit.

2.2. ETARSKA ULJA

2.2.1. Opšte karakteristike etarskih ulja

Etarska ulja predstavljaju specifične, najčešće tečne produkte biljnog tkiva. To su više ili

manje složene smeše različitih isparljivih mono-, seskviterpena i fenilpropanskih jedinjenja.

Najjednostavniji način da se ove tečnosti izoluju iz biljne sirovine je destilacija vodenom parom,

postupak koji se koristi već hiljadama godina. Pored destilacije, vekovima se etarsko ulje agruma

dobija presovanjem, ceđenjem svežeg tkiva.

Etarska ulja su uglavnom produkti viših biljaka. Ove biljke su raspoređene u preko

pedeset familija, a najpoznatije su aromatične biljke familija Asteraceae, Lamiaceae, Apiaceae,

Rutaceae, Myrtaceae i Lauraceae.Etarska ulja su lokalizovana u različitim delovima biljaka, tako

da se kao droga koristi cvast kamilice i pupoljak cveta karanfilića, list nane i matičnjaka, kora

cimetovog drveta, sandalovo i klekovo drvo. Etarska ulja lokalizovana u različitim delovima iste

biljke, mogu biti sličnog sastava, ali se mogu i značajno razlikovati.

9

2.2.2. Fizičke osobine etarskih ulja

Na sobnoj temperaturi, etarska ulja su najčešće tečnosti, ređe imaju viskoznu ili

polučvrstu konzistenciju. Lako su pokretljiva, bezbojna ili slabo obojena, bistra. Već na nižim

temperaturama, pojedini sastojci etarskih ulja isparavaju i zato ulja imaju specifičan, prijatan ili

neprijatan miris.

Etarska ulja su lipofilna, rastvaraju se u nepolarnim organskim rastvaračima, etanolu,

mastima i masnim uljima. Generalno, etarska ulja se ne rastvaraju u vodi. U stvari, samo mali

broj sastojaka ulja je rastvorljiv i ovakvi proizvodi se nazivaju aromatične vode.

2.2.3. Hemijski sastav etarskih ulja

Etarska ulja su složene mešavine dve različite klase jedinjenja: terpena i fenilpropanskih

derivata. U okviru terpenske frakcije, zastupljeni su isparljivi mono- i seskviterpeni.

Monoterpeni se javljaju u obliku acikličnih (linearnih), mono- i bicikličnih, alifatičnih i

aromatičnih struktura. Na osnovu uvedenih funkcionalnih grupa, sastojci ulja mogu biti

ugljovodonici, alkoholi, aldehidi, ketoni, kiseline, estri, fenoli, etri, oksidi, peroksidi, epoksidi.

U okviru frakcije seskviterpena, formirane su još raznovrsnije strukture osnovnog

skeleta: zbog dužine ugljovodoničnog lanca veća je mogućnost različitih ciklizacija. I ova grupa

terpena javlja se u obliku ugljovodonika, oksida, alkohola, ketona i estara.

U etarskim uljima su aromatični, fenilpropanski sastojci zastupljeni u znatno manjim

količinama [2].

2.2.4. Biološka aktivnost i primena etarskih ulja

Biološka uloga etarskih ulja jeste da privlače insekte i pomažu u oprašivanju, mogu da

inhibiraju klijanje semena, kako drugih, tako i sopstvenih biljaka, štite biljku od napada insekata

i drugih životinja, stvaraju specifičnu mikroklimu koja ih štiti od prekomerne transpiracije,

sprečavaju razvoj mikroorganizama (štite biljku od infekcije) [15].

10

Etarska ulja se primenjuju u medicini, farmaciji, prehrambenoj, kozmetičkoj industriji,

zatim industriji alkoholnih i bezalkoholnih pića, kao i u industriji boja i lakova. Mikrobiološka

ispravnost, poboljšane fizičko-hemijske i organoleptičke osobine proizvoda od etarskih ulja čine

ih prihvatljivim, organizam ih usvaja, bez neželjenih posledica, što nije slučaj sa nekim

prehrambenim proizvodima koji često u sebi sadrže sintetičkim putem proizvedena mirisna i

antioksidativna jedinjenja. Zbog toga se etarska ulja najviše koriste u proizvodnji izuzetno

cenjenih i vrednih biološki zdravih proizvoda.

Aromaterapija je jedan kompleksan tretman koji izaziva duboki efekat na um, telo i

emocije. U aromaterapiji kombinuju se efekti vezani za pokrete prisutne u masaži sa

terapeutskim osobinama etarskih ulja koja se koriste pri masaži. Mnoga ulja se jako dugo koriste

u ove svrhe, kao što su ulja iz limuna, kedra, eukaliptusa, lavande, majčine dušice, i druga.

U farmakologiji, etarska ulja se koriste kao antispazmolitici, za jačanje organizma, protiv

katara želuca, za poboljšanje apetita, antiflogistici, za opekotine i rane, za smirenje upala kože i

sluzokože, za lokalnu anesteziju, za umirenje, protiv nazeba.

U kozmetičkoj industriji etarska ulja su značajne komponente koje ulaze u sastav

parfema, mirisnih ulja, kolonjskih voda, balsama, pomada i pasti za zube.

U prehrambenoj industriji etarska ulja se koriste kao aromatični začini, u industriji likera,

u industriji peciva i slatkiša, kao konzervansi, kao i aditivi u industriji mesa.

2.2.5. Postupci dobijanja etarskog ulja

Uobičajena su četiri postupka dobijanja etarskih ulja:

Hidrodestilacija

Hladno presovanje

Ekstrakcija pomoću organskih rastvarača

Nadkritična ekstrakcija

Destilacija je opšti pojam postupka za dobijanje etarskih ulja iz biljnog materijala mada

se ona izvodi na tri posebna načina: destilacija vodom, destilacija vodom i vodenom parom,

destilacija vodenom parom.

11

Kod postupka destilacije vodom, biljni materijal je potopljen sve vreme u ključalu vodu.

Grejanje suda sa biljnim materijalom ostvaruje se direktno ispod dna suda (čvrsto gorivo, gas) ili

indirektno kroz duplikator, grejan dodatnim grejnim medijumom. Formirana vodena para odnosi

lako isparljive aromatične komponente iz materijala. Ovaj postupak ne daje etarsko ulje dobrog

kvaliteta, pošto tokom kuvanja često dolazi do dogradacije estara iz biljnog materijala.

Destilacija vodom i vodenom parom je prikladna za sudove zapremine do 300L. U ovom

slučaju znatno je manji kontakt biljnog materijala i vode nego u prothodnom primeru. Vreme

destilacije za jednu šaržu je kraće nego kod destilacije vodom. Potrošnja energije za izdvajanje

etarskih ulja je najmanja u poređenju sa ostalim postupcima.

Destilacijavodenom parom je jedan odnajčešće korišćenih postupaka za dobijanje

etarskih ulja iz biljnog materijala. Preporučuje se u slučajevima da polazna sirovina sadrži

relativno visok procenat etarskog ulja i kada su komponente ulja stabilne na povišenim

temperaturama. Ako je sadržaj ulja ispod 0,1%ili je neka komponenta ulja rastvorljiva u vodi,

postupak se ne preporučuje.

Postupak hladnog presovanja koristi se kod proizvodnje ulja iz kore ploda limuna,

pomorandže, grejpfruta i mandarina. Presovanje se vrši pomoću mašina koje ljušte koru sa ovih

plodova, iz koje se zatim pod pritiskorn izdvaja ulje. Hladno presovani tečni proizvod predstavlja

zapravo smešu vode i etarskog ulja.

Ekstrakcija ulja pomoću organskih rastvarača (petroletar, benzen, heksan ili aceton)

primenjuje se za biljni materijal koji sadrži termodegradabilna jedinjenja (jasmin, cvet lipe i

drugo). Proces ekstrakcije se odvija u kolonskom uređaju, pri čemu se biljni materijal nalazi na

perforiranoj pregradi. Naime, materijal se višestruko ispira organskim rastvaračem. Na ovaj

način u rastvaraču se iz biljnog materijala rastvaraju ekstraktivne materije, kao sto su:

nearomatični voskovi, pigmenti i visoko isparljive aromatične komponente.

Ekstrakcija pomoću tečnog gasa (najčešće CO2) ili nadkritičnog fluida, poznata je pod

nazivom nadkritična ekstrakcija, pošto se koriste fluidi koji se nalaze na temperaturi i pritisku

iznad njihovih kritičnih vrednosti. Tečni CO2 se može koristiti kao vrlo inertan, bezbedan „tečni

rastvarač”, koji vrlo efikasno ekstrahuje aromatične komponente iz biljnog materijala. Prednost

ovog postupka u odnosu na klasičnu ekstrakciju organskim rastvaračima je u tome što se

CO2nakon kontakta sa materijalom ne zadržava u produktu, pošto se on na normalnoj

temperaturi i pritisku ekspanzijom pretvara u gas i odvodi u atmosferu [15].

12

2.3.DOSADAŠNJA ISPITIVANJA ETARSKOG ULJA BILJKE ARTEMISIA

SCOPARIA

Prinos i sastav etarskog ulja variraju u zavisnosti od vrste zemljišta, starosti biljke,

klimatskih faktora i teritorije sa koje je biljka sakupljena. To se može potvrditi na osnovu

navedenih dosadašnjih ispitivanja etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia.

Autor Singh sa saradnicima [16,5,17] je sproveo više ispitivanja etarskog ulja biljne vrste

Artemisia scopariaWaldst. & Kit. sa teritorije Indije. Prvim ispitivanjem etarskog ulja dobijenog

hidrodestilacijom biljnog materijala A.scoparia(prinos 0,2%, m/v) identifikovanoje 48

komponenata, što čini 99,3% ukupne mase ulja. Najzastupljenija klasa jedinjenja bili su

monoterpeni (56,7%). Citronelal (15,2%) i β-citronelol (11,0%) bilisu glavni monoterpenski

sastojci ulja [16]. Drugo ispitivanje sprovedeno od strane ove grupe istraživača sastojalo se iz

određivanja hemijskog sastava i antioksidativne aktivnosti etarskih uljadobijenih

hidrodestilacijom mladog i zrelog lišća biljne vrste Artemisia scoparia. GC/MS analizaje

pokazala veliki procenat monoterpena (64,0-67,0%) i identifikovana je 31 komponenta u

etarskom ulju dobijenom iz zrelog lišća i 44 komponente u ulju dobijenom iz mladog lišca.

Dominantna jedinjenja etarskog ulja bili su β-mircen (24,1%) i p-cimen (27,1%) [5]. Treće

ispitivanje ovih istraživača zasnivalo se na analizi hemijskog sastava i fitotoksičnosti etarskog

ulja Artemisia scoparia. GC i GC/MS analizom su identifikovana 33 jedinjenja koja

predstavljaju 99,8% ulja. Etarsko ulje bilo je bogato monoterpenima (71,6%), a najzastupljeniji

su bili β-mircen (29,3%), limonen (13,3%), (Z)-β-ocimen (13,4%) i γ-terpinen (9,5%) [17].Sva

tri istraživanja okarakterisala su monoterpenekao dominantnu klasu jedinjenja.

Analizom hemijskog sastava etarskog ulja Artemisia scopariasa područja Irana,

sprovedenom od strane Negahbana i saradnika [18], ispitana je fumigantna i repelentna aktivnost

na tri vrste insekata koji se pojavljuju tokom skladištenja: Callosobruchusmaculatus (Fab.),

Sitophilus orizae (L.) i Triboliumcastaneum (Herbst). GC/MS analizom identifikovano je 12

komponenata, što čini 99,5% ukupnog etarskog ulja. Jedinjenja koja su zastupljena u najvećem

procentu bila su β-pinen (19,0%), kapilin (17,5%), limonen (15,1%) i mircen (11,0%).

13

Morteza-Semnani i saradnici [19]izolovali su hidrodestilacijom etarsko ulje A. scopariaiz

Irana i analizirali ga pomoću GC i GC/MS. Glavna jedinjenja etarskog uljabila sukamfor

(37,9%), 1,8-cineol (27,8%) i borneol (21,1%).

Mirjalili i saradnici [20]su vršili ispitivanja količine i sastava etarskog ulja biljne vrste

Artemisia scoparia Waldst.& Kit. sa područja Irana, u različitim fazama razvića biljke,

uključujući vegetativnu fazu, fazu formiranja pupoljakai fazu cvetanja. Prinosi dobijenih etarskih

ulja iznosili su: faza cvetanja(0,9%) > faza formiranja pupoljaka (0,7%) > vegetativna faza

(0,4%). GC i GC/MS analizom identifikovano je 25 komponenata iz etarskog ulja biljke u

vegetativnoj fazi, 23 jedinjenja iz ulja u fazu formiranja pupoljakai 18 jedinjenja iz ulja u fazi

cvetanja, što predstavlja 98,4%, 98,5% i 98,7% ulja. Kao dominantna jedinjenja etarskog ulja

identifikovani suα-tujon,β-tujon i 1,8-cineol.

Ispitivanjebioherbicidne aktivnosti etarskih ulja biljne vrsteArtemisia scopariasa teritorije

Indijena pet različitih vrsta korova (viz. Achyranthes aspera, Cassia occidentalis, Parthenium

hysterophorus, Echinochloa crus-galli iAgeratum conyzoides)Kaur-a i saradnika [21], pokazalo

je da je etarsko ulje ispitivane biljne vrste imalo najveći inhibitorni efekat na rast P.

hysterophorus, a najmanji na rast C. Occidentalis.

Cha i saradnici iz Južne Koreje[22] analizirali su etarsko ulje A. scoparia pomoću

GC/MS.Najzastupljenija jedinjenja bila su: kamfor (11,0%), 1,8-cineol (21,5%) i β-kariofilen

(6,8%). Istraživanje pokazuje dosta sličnosti sa istraživanjima Morteza-Semnani-a i saradnikau

pogledu hemijskog sastava ulja i dobijenih najzastupljenijih jedinjenja (kamfor i 1,8-cineol), ali

se ta jedinjenja javljaju u različitim procentima u datim uljima.

2.4. GASNA HROMATOGRAFIJA

Gasna hromatografija (GC) predstavlja hromatografsku metodu razdvajanja i detekcije

hemijskih jedinjenja na osnovu različitih raspodela između dve faze-pokretne i nepokretne.

Nepokretna faza je tečna ili čvrsta, a pokretna je gasovita i nju čine inertan noseći gas i pare

jedinjenja koja se razdvajaju. U gasnohromatografskoj koloni dolazi do dodira između ove dve

faze.

14

Kod najvećeg broja gasnohromatografskih analiza primenjuje se takozvana tehnika

eluiranja koja se sastoji u neprekidnom proticanju nosećeg gasa konstantnom brzinom kroz

gasnohromatografski sistem: isparivač-kolona-detektor.

Kriva zavisnosti jačine signala od vremena naziva se gasni hromatogram. U uslovima

kada je postignuto dobro razdvajanje, svaki signal (maksimum) odgovara jednom hemijskom

jedinjenju i okarakterisan je vremenom zadržavanja (retencionim vremenom) i površinom.

Kao noseći gas najčešće se koriste H2, He, N2 i Ar. Neophodno je da on bude visoke

čistoće i da je hemijski inertan u odnosu na uzorak i tečnu fazu. Upravo od osobina nosećeg gasa

u velikoj meri zavisi osetljivost detekcije i u manjoj meri efikasnost GC kolona je cev u kojoj se

nalazi nepokretna faza. Izrađuje se od metala (nerđajućeg čelika, bakra ili aluminijuma) ili stakla.

Metali (naročito bakar) nisu pogodni zato što katalizuju hemijske reakcije na jedinjenjima koje

sadrže osetljive funkcionalne grupe.

Uobičajene dužine pakovanih analitičkih kolona su 0,5-4 m, a unutrašnji prečnici su 1-4

mm. Sa dužim kolonama postižu se bolja razdvajanja, ali se produžava vreme trajanja analize. U

poređenju sa pakovanim kolonama, znatno efikasnije kapilarne kolone imaju višestruko veće

dužine (30-150 m) i znatno manje unutrašnje prečnike (0,25-0,75 mm).

Detektor je direktno povezan sa izlazom iz kolone, tako da sve što je sa njega eluirano (i

noseći gas i pare ispitivanih jedinjenja) prolazi kroz njega. Uglavnom se primenjuju

diferencijalni detektori čiji se princip rada zasniva na neprekidnom merenju nekog fizičkog

svojstva nosećeg gasa, koje je u direktnoj vezi sa koncentracijom pare u njemu. Najviše se

primenjuju termoprovodljivi i jonizacioni detektori.

Metode identifikacije jedinjenja pomoću gasne hromatografije se mogu podeliti na: GC

metode bez primene drugih metoda i GC metode u kombinaciji sa drugim metodama

(instrumentalnim ili hemijskim).

2.4.1. Parametri identifikacije

Retenciono vreme predstavlja vreme koje protekne od ubrizgavanja smeše do pojave

maksimuma njegovog signala. Preko njega se najčešće izražava dužina boravka nekog jedinjenja

u GC koloni.

15

Retencioni indeksi se primenjuju kod identifikacije organskih jedinjenja. Nazivaju se još i

Kovats-evi indeksi. Te veličine su izvedene u cilju standardizacije GC podataka i one povezuju

retenciona vremena organskih jedinjenja sa odgovarajućim vrednostima za n-parafine koji se

uzimaju kao standardi.

Za izotermalne uslove analize koristi se jednačina Kováts-a, a za linearno programirane

temperaturne uslove analize Van den Dool i Kratz-a jednačina gasnohromatografske kolone.

Kováts-eva jednačina za izračunavanje retencionih indeksa:

RIx = 100n +100(log tR(x) − log tR(n))

log tR(n+1) − log tR(n)

RIx- retencioni indeks ispitivane supstance,

n - broj C-atoma alkana koji se eluira neposredno pre ispitivane supstance,

tR(x)- retenciono vreme ispitivane supstance,

tR(n)- retenciono vreme alkana koji se eluira neposredno pre ispitivane supstance,

tR(n+1)- retenciono vreme alkana koji se eluira neposredno posle ispitivane supstance.

Van den Dool i Kratz-ova jednačina za izračunavanje retencionih indeksa:

RIx = 100n +100(tR(x) − tR(n))

tR(n+1) − tR(n)

RIx- retencioni indeks ispitivane supstance,

n - broj C-atoma alkana koji se eluira neposredno pre ispitivane supstance,

tR(x)- retenciono vreme ispitivane supstance,

tR(n)- retenciono vreme alkana koji se eluira neposredno pre ispitivane supstance,

tR(n+1) - retenciono vreme alkana koji se eluira neposredno posle ispitivane supstance.

16

2.5. GASNA HROMATOGRAFIJA / MASENA SPEKTROMETRIJA

Kombinacija GC/MS postala je u zadnje vreme jedna od najmoćnijih metoda

identifikacije sastojaka složenih smeša organskih jedinjenja. Velika osetljivost masenog

spektrometra (potrebna količina uzorka je reda veličine 10-10g), kao i mogućnost brzog

snimanja masenog spektra (za manje od 1s) omogućavaju povezivanje GC kolone sa masenim

spektrometrom i direktno snimanje masenih spektara svih eluiranih jedinjenja.

Uloga gasne hromatografije se svodi na razdvajanje, a uloga masene spektrometrije na

identifikaciju komponenti smeše.

U ovom GC/MS sistemu maseni spektrometar ima i ulogu detektora. Neprekidnim

merenjem ukupne jonske struje dobija se gasni hromatogram. Maseni spektar se dobija

merenjem struja koje potiču od jona razdvojenih prema m/z (masa/naelektrisanje) vrednostima.

Do razdvajanja jona dolazi u analizatorskoj cevi koja se nalazi između polova magneta. Maseni

spektar se predstavlja kao zavisnost jonske struje od m/z vrednosti.

Slika 2.Šema GC/MS aparata

17

Pre početka analize podešavaju se osnovni GC i MS radni uslovi (temperaturni program,

brzina snimanja masenih spektara, opseg m/z vrednosti u kojima se snimaju maseni spektri itd.).

Tokom hromatografisanja se neprekidno snimaju maseni spektri, a podaci iz njih se akumuliraju

u digitalnom obliku u memoriji računara.

Nakon završenog snimanja, moguće je prikazivanje svih izmerenih GC/MS podataka i to

u različitim oblicima. Najčešće se rezultati prikazuju kao promena ukupne jonske struje (tj. sume

svih maksimuma u snimljenim masenim spektrima) u zavisnosti od vremena i rednog broja

spektra. Odabrani maseni spektri se dobijaju direktno (uz pomoć računara) u standardnom obliku

u kome su obilnosti jona izražene u procentima u odnosu na najobilniji jon-osnovni jon (100%).

2.5.1. Kvantitativna GC/MS analiza

Kod kvantitativne GC/MS analize maseni spektrometar se koristi isključivo kao GC

detektor. Njegove prednosti nad konvencionalnim GC detektorom su u većoj univerzalnosti, kao

i mogućnosti selektivne detekcije pojedinih jedinjenja. Upravo zbog toga se ova analitička

metoda koristi za određivanje mikrokoličina organskih jedinjenja u složenim smešama.

Mnogobrojni primeri primene ove metode jesu kvantitativna određivanja biološki aktivnih

jedinjenja kao što su steroidi, prostaglandini, alkaloidi i mnoga druga.

Kako bi se postigla selektivna detekcija pojedinih jedinjenja, što je od naročitog interesa

kod kvantitativnog određivanja mikrokoličina, koje vrlo često ne mogu da

segasnohromatografski odvoje od pratećih jedinjenja, neophodno je merenje promene jonske

struje koja potiče samo od jednog jona, karakterističnog za jedinjenje koje se kvantitativno

određuje.

Postoje tri načina merenja intenziteta izabranih jonskih struja:

1. Masena hromatografija

2. Detekcija jednog jona

3. Masena fragmentografija ili detekcija više jona [23].

18

2.6. ANTIMIKROBNA AKTIVNOST

Testiranje antimikrobne osetljivosti može se koristiti za otkrivanje lekova, epidemiologiju

i predviđanje terapijskog ishoda. Nakon revolucije u "zlatnom dobu", kada su otkrivene gotovo

sve grupe važnih antibiotika (tetraciklini, cefalosporini, aminoglikozidi i makrolidi), a glavni

problemi hemoterapije su rešeni u 1960-im, istorija se danas ponavlja i ova uzbudljiva jedinjenja

su u opasnosti od gubitka njihove efikasnosti zbog povecanja otpornosti mikroba. Trenutno,

njegov uticaj je značajan kod neuspeha lečenja koji su povezani sa bakterijama otpornim na

višestruku grupu lekova, i postala je globalna briga za javno zdravlje.

Zbog toga je otkrivanje novih antibiotika isključivo važan cilj. Prirodni proizvodi su i

danas jedan od glavnih izvora novih molekula lekova. Izvode se iz prokariotskih bakterija,

eukariotskih mikroorganizama, biljaka i raznih životinjskih organizama. Mikrobni i biljni

proizvodi zauzimaju najveci deo antimikrobnih jedinjenja otkrivenih do sada.

Biljke i drugi prirodni izvori mogu pružiti veliki broj kompleksnih i strukturno različitih

jedinjenja. Nedavno su se mnogi istraživači fokusirali na istraživanje biljnih i mikrobioloških

ekstrakata, etarskih ulja, čistih sekundarnih metabolita i novih sintetizovanih molekula kao

potencijalnih antimikrobnih agenasa. Međutim, poređenje rezultata iz objavljenih članaka o

antimikrobnom efektu ovih prirodnih proizvoda je često teško, zbog korišćenja različitih

nestandardizovanih pristupa tehnike pripreme inokuluma, veličine inokuluma, medijuma za rast,

uslova inkubacije i određivanja krajnjih tačaka.

Različite laboratorijske metode mogu se koristiti za procenu ili ekranizaciju in vitro

antimikrobne aktivnosti ekstrakta ili čistog jedinjenja. Najpoznatije i osnovne metode su disk-

difuzione i dilucione. Ostale metode se koriste posebno za antifungalne testove, kao što je

tehnika trovanja hrane. Da bi se dalje proučavala antimikrobna aktivnost agensa u dubinu,

preporučuje se testiranje vremenskih uboda i citofluorimetrijska metoda protoka koji pružaju

informacije o prirodi inhibitornog efekta (baktericidnog ili bakteriostatičkog) (zavisno od

vremena ili zavisnosno od koncentracije) i šteta nanetih ćelijama testiranog mikroorganizma.

Zahvaljujuci novim privlačnim svojstvima novih antimikrobnih proizvoda kao što je

borba protiv bakterija rezistentnih na više lekova, važno je razviti bolje razumevanje trenutnih

metoda dostupnih za skrining i/ili kvantifikaciju antimikrobnog efekta ekstrakta ili čistog

19

jedinjenja za upotrebu u zdravlju ljudi, poljoprivredi i životnoj sredini. Prema tome, u ovom

pregledu detaljno su razmatrane tehnike za procenu in vitro antimikrobne aktivnosti.

Mikro- ili makro-dilucija je jedna od najosnovnijih metoda ispitivanja antimikrobne

aktivnosti. Postupak podrazumeva pripremu dvostrukih dilucija antimikrobnih sredstava (na

primer 1, 2, 4, 8, 16 i 32 mg/mL) u rastvaraču za rastuce tečnosti izdatih u cevima koji sadrže

minimalnu zapreminu od 2 mL (makrodiluciju) ili sa manjim zapreminama sa mikrotitracionom

pločom od 96 rupa (mikrodilucija). Zatim, svaka cev ili sud se inokulira mikrobnim inokulumom

pripremljenim u istom medijumu nakon razblaživanja standardizovane mikrobiološke suspenzije

podešene na 0,5 McFarland skale. Nakon dobrog mešanja, inokulirane cevi ili ploča za

mikrotitraciju sa 96 rupa inkubiraju (uglavnom bez mešanja) pod odgovarajucim uslovima u

zavisnosti od testiranog mikroorganizma.

MIC je najniža koncentracija antimikrobnog agensa koja potpuno inhibira rast

organizma u tubama ili bunarima za mikrodilaciju golim okom. Za razliku od metoda

mikrodilacije, glavni nedostaci metode makrodilacije su mukotrpno, manuelno preduzimanje,

rizik od grešaka u pripremi antimikrobnih rešenja za svaki test i relativno velika količina

potrebnih reagensa i prostora. Stoga, reproduktivnost i ekonomičnost reagensa i prostora koji se

javljaju usled miniaturizacije testa su glavne prednosti metode mikrodilacije. Ipak, na konačni

rezultat značajno utiče pristup, koji se mora pažljivo kontrolisati ako se postignu ponovljivi

rezultati (intralaboratorni i međulaboratorijski). Za određivanje krajnje tačke MIC-a, uređaji za

gledanje mogu olakšati testove mikrodilacije čitanja i rezultate snimanja sa visokom

sposobnošcu da prepoznaju rast u bunarima. Štaviše, razvijeno je nekoliko kolorimetrijskih

metoda zasnovanih na upotrebi reagensa za bojenje. Tetrazolijum soli, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-

2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) i 2,3-bis{2-metoksi-4-nitro-5-[(sulfenilamino)-karbonil]-

2H-tetrazolium-hidroksid} (KSTT), često se koriste u određivanju konačne tačke MIC za

antimikotične i antibakterijske mikrodilucione analize. U ovu svrhu se takođe može koristiti

Alamar plava boja (rezazurin), koja je efikasan pokazatelj rasta.

20

Slika 3. Mikrotitarska ploča sa inokulisanom hranljivom podlogom, tretirana serijom razblaženja

etarskih ulja

Testiranje diferencijalnog diska agara razvijeno je 1940. godine, službeni je metod koji

se koristi u mnogim kliničkim laboratorijama za mikrobiologiju za rutinsko testiranje

antimikrobne aktivnosti. Danas, mnoge prihvacene i odobrene standarde objavljuje Klinički i

laboratorijski institut za standarde (CLSI) za ispitivanje bakterija i gljivica. Iako se ovom

metodom ne mogu precizno testirati sve prekomerne bakterije, standardizacija je napravljena

kako bi se testirali određeni brzi bakterijski patogeni kao što su streptokoke, Haemophilus

influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis,

koristeci specifične medijume za kulturu, različite uslove inkubacije i kriterijume interpretacije

za zone inhibicije.

U ovoj dobro poznatoj proceduri, agar ploče se inokuliraju standardizovanim

inokulumom testnog mikroorganizma. Zatim se na površinu agara stavljaju diskovi od papira

(prečnika oko 6 mm), koji sadrže testirano jedinjenje u željenoj koncentraciji. Petrijeva šolja se

inkubira pod odgovarajucim uslovima. Generalno, antimikrobni agens difunduje u agar i inhibira

klijanje i rast testnog mikroorganizma, a zatim se mere prečnici zona rasta inhibicije.

Ipak, disk difuziona metoda nudi mnoge prednosti u odnosu na druge metode:

jednostavnost, niske troškove, sposobnost testiranja ogromnog broja mikroorganizama i

antimikrobnih sredstava i lakoca interpretiranja dobijenih rezultata. Pored toga, nekoliko studija

pokazalo je veliko interesovanje za pacijente koji pate od bakterijske infekcije antibiotske

terapije zasnovane na antibiogramu [24].

21

Slika 4. Disk-difuziona metoda

3. EKSPERIMENTALNI DEO

23

3.1. POREKLOI PRIPREMA BILJNOG MATERIJALA

U cilju ispitivanja sastava etarskog ulja biljnog materijala prikupljeni su nadzemni delovi

Artemisia scopariaWaldst. & Kit. u Niškoj Banji, u blizini Niša, Srbija, 2017. u fazi punog

cvetanja. Biljni materijal je identifikovao profesor dr Bojan Zlatković i vaučer primerak broj

13814 je deponovan u herbarijumu Prirodno-matematičkog fakulteta (Niš, Srbija).Za

hidrodestilaciju u laboratorijskim uslovima biljni materijal je seckan na sitne komade dužine oko

5 mm.

3.2. IZOLOVANJE ETARSKOG ULJA

Biljni materijal je uskladišten u zatvorenom kontejneru na sobnoj temperaturi (25°C ± 2),

bez izlaganja direktnoj Sunčevoj svetlosti, godinu dana pre izolovananja ulja. Iseckani biljni

materijal Artemisia scopariamase 164 g je kvantitativno prenet u balon zapremine 4000 mL i

dodato je 2000 mL destilovane vode. Aparatura po Clevenger-u je sklopljena, puštenaje voda za

hlađenje i uključeno grejanje. Proces hidrodestilacije je izvođen 3h, tokom kojih se etarsko ulje

sakupljalo u graduisanom delu separatora, a višak vode je recirkulisao preko povratne cevi. Na

kraju procesa hidrodestilacije očitavana je zapremina izdvojenog etarskog ulja.

Etarsko ulje je zatim ispušteno u odmerni erlenmajer i ekstrahovano dietil etrom, sa

ponavljanjem od tri puta. Dietil etarski ekstrakt ulja se potom sušio anhidrovanim MgSO4.

Erlenmajer sa etarskim uljem i MgSO4 je zatvoren zatvaračem ili folijom i ostavljen 24h da

odstoji. Posle 24h sredstvo za sušenje je odvojeno od etarskog ulja ceđenjem u balon koji je

osušen i prethodno izmeren. Na kraju se dietil etar uparavao na rotacionom vakuum uparivaču.

Dobijeno je 144,8 mg etarskog ulja koje je spremno za dalju analizu.

Prinos(%) =masa ulja

masa droge∙ 100

Masa ulja: 0,1448 g

Masa droge: 164g

24

Slika 5. Aparatura za hidrodestilaciju po Clevenger-u: 1 - balon za destilaciju sa nastavkom,

2 - slavina sa nastavkom, 3 - graduisana cev za merenje zapremine etarskog ulja,

4 - odvazdušenje sa zapušačem, 5 - kondenzator

25

3.3. PARAMETRI I IDENTIFIKACIJA KOMPONENATA ETARSKOG

ULJA GC/MS ANALIZOM

Hemijski sastav etarskog ulja analiziran je pomoću GC/MS. GC/MS analiza je

izvedenakorišćenjem Agilent Technologies 7890A gasnog hromatografa opremljenog

kapilarnom kolonom HP-5MS (5% fenilmetilsiloksan, 250 µm x25 m, debljina filma 0,25 µm,

Agilent Technologies, Santa Clara, USA) kuplovanog sa 7000 MS/MS

QQQmasenimspektrometrom u MS1 scan modu.

Režim rada GC/MS aparatabio je sledeći: temperature injektora i interfejsaodržavane su

na 250°C i 280°C; temperatura peći je programirana linearno, 50°C-290°C,sa brzinomzagrevanja

od 4°C/min, a zatim je izotermalno držana 10 minuta; kao noseći gas korišćen je helijum, pri

konstantnom protoku od 1,0 mL/min; 1 μl rastvora ulja u etru jeinjektovan bez splitovanja.

Uslovi rada elektron impakt (EI) detektora su sledeći: jonizacioni potencijal 70 eV, pun

maseni sken beležen je u intervalu m/z 35–500 (brzina skeniranja 5 skena/s), vreme skeniranja

0,32 s.Procentualni sastav komponenata je određen na osnovu površina pikova, bez korišćenja

korekcionih faktora.

Hemijski sastav ispitivanih uzoraka određen je upoređivanjem linearnih retencionih

indeksa pojedinih sastojaka, izračunatih u odnosu na retenciona vremena C8-C20 i C21-C40 n-

alkana [25], sa literaturnim vrednostima, poređenjem masenih spektara sa spektrima jedinjenja iz

bibliotekaWiley 6, NIST11, Agilent Mass Hunter Workstation B.06.00, Adams[26]. Podaci su

obrađeni pomoću AMDIS softvera (Ver. 2.1, DTRA/NIST, 2011) koji je korišćen za

dekonvoluciju masenog skena.

26

3.4. PARAMETRI DISK-DIFUZIONE METODE I BAKTERIJSKE

KULTURE ZA TESTIRANJE ANTIMIKROBNE AKTIVNOSTI

ETARSKOG ULJA BILJNE VRSTE A. SCOPARIA

Antimikrobna aktivnost A. scoparia etarskih ulja procenjena je na dve Gram-pozitivne

bakterije: Bacillus subtilis(ATCC 6633) i Staphilococcus aureus (ATCC 6538) i dve Gram-

negativne bakterije: Escherichia coli (ATCC 8739) i Salmonella aboni (NCTC 6017).

Antifungalna aktivnost je testirana na Candida albicans (ATCC 10231). Mikrobiološki sojevi

pripadali su American Type Culture Collection (ATCC, Gaithersburg, Mariland, SAD), osim S.

aboni, koji pripada National Collection of Type Cultures(NCTC, Public Health England,

London, Velika Britanija).

Korišcena je metoda disk-difuzije za određivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja,

prema National Committee for Clinical Laboratory Standards [27]. Inokulati bakterijskih i

gljivičnih sojeva su pripremljeni iz kultura preko noći, a suspenzije su prilagođene na 0,5

McFarland standardne zamucenosti. Zapremina od 100 μl suspenzije sadrži 1.0 x 108 CFU/ml

bakterije ili 1.0 x 104 CFU/ml gljivičnih spora premazanih na Mueller-Hinton agaru (Torlak,

Srbija) ili sabouraud dextrose agaru (Torlak), u sterilisanoj Petrijevoj šolji (dijametar 90 mm),

čineći sloj debljine 4 mm.Diskovi (dijametar 9 mm, Antibiotica Test Blattchen"-Schleicher i

Schull, Dassel, Nemačka) su impregnirani sa 30 μl ulja (koncentracija 50 mg/ml) za bakterijske

sojeve i 20 µl (koncentracija 50 mg/ml) za gljivične sojeve, i postavljeni su na inokularni agar.

Negativne kontrole su pripremljene pomocu heksana. Hloramfenikol (30 µg, Torlak),

Streptomicin (10 µg, Torlak) i Nistatin (30 µg, Torlak) su korišceni kao pozitivni standardi.

Inokulisane ploče su držane na 4°C tokom 2 sata i inkubirane na 37°C (24 h) za bakterijske

sojeve i na 28°C (48 h) za gljivične sojeve. Antimikrobna aktivnost je procenjena merenjem zona

(u milimetrima) inhibicije protiv testnih mikroorganizama pomocu uređaja "Fisher-Lilli

Antibiotic Zone Reder" (Fisher Scientific Co. USA).Heksan nije pokazao nikakvu aktivnost na

testirane mikroorganizme kod diskova koji su služili kao negativna kontrola.Antimikrobna

analiza je izvršena u tri ponavljanja i prikazane su srednje vrednosti.

4.REZULTATI I DISKUSIJA

28

4.1. HEMIJSKA ANALIZA ISPITIVANIH UZORAKA

4.1.1. Sadržaj i hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia

Prinos etarskog ulja, dobijenoghidrodestilacijom nadzemnih delova biljne vrste Artemisia

scoparia, koja je bila skladištena u periodu od jedne godineiznosi 0,088%.

Prinos(%) =mu

md∙ 100 =

0,1448 g

164 g∙ 100 = 0,088

mu- masa ulja

md- masa droge

Procenat etarskog ulja je dobijen na osnovu upotrebljene količine ispitivanog biljnog

materijala (md=164 g), koji smo hidrodestilovali u aparaturi po Clevenger-u, i dobijene količine

etarskog ulja dobijenog nakon procesa hidrodestilacije (mu=0,1448 g).

Slika 6. Hromatogram etarskog ulja nadzemnih delova biljne vrste Artemisia scoparia

29

Tabela 2. Sastav (%) etarskog ulja nadzemnih delova biljne vrste Artemisia scoparia

Jedinjenja RT RI RIa % Klasa

1. (E)-2-Heksenal 7,44 850 846 0,2 O

2. α-Pinen 10,06 934 932 0,1 M

3. Benzaldehid 10,95 960 952 1,1 O

4. Sabinen 11,45 974 969 tr M

5. β-Pinen 11,57 977 974 1,4 M

6. Mircen 12,03 990 988 0,5 M

7. α-Terpinen 12,98 1017 1014 0,1 M

8. p-Cimen 13,26 1025 1020 2,4 M

9. Limonen 13,41 1029 1024 1,3 M

10. 1,8-Cineol 13,51 1032 1026 1,6 MO

11. (Z)-β-Ocimen 13,71 1037 1032 0,8 M

12. Benzen acetaldehid 13,94 1044 1036 tr O

13. (E)-β-Ocimen 14,09 1048 1044 0,1 M

14. γ-Terpinen 14,50 1059 1054 0,4 M

15. Acetofenon 14,76 1066 1059 0,3 O

16. Izoterpinolen 15,60 1090 1085 tr M

17. Linalol 15,94 1099 1095 tr MO

18. n-Nonanal 16,10 1104 1100 tr O

19. trans-Pinen hidrat 16,79 1123 1119 tr MO

20. α-Kamfolenal 16,94 1127 1122 tr MO

21. Nopinon 17,36 1139 1135 0,3 MO

22. trans-Pinokarveol 17,42 1141 1135 0,3 MO

23. trans-Verbenol 17,61 1146 1140 tr MO

24. Pinokarvon 18,26 1165 1160 0,1 MO

25. Lavandulol 18,36 1167 1165 0,8 MO

26. Terpinen-4-ol 18,78 1179 1174 0,3 MO

27. p-Cimen-8-ol 19,01 1185 1179 0,1 MO

30

28. α-Terpineol 19,23 1192 1186 0,4 MO

29. Mirtenal 19,46 1198 1195 0,2 MO

30. n-Dekanal 19,69 1204 1201 0,2 O

31. (Z)-3-Heksenil-3-metilbutanoat 20,72 1236 1232 tr O

32. Karvon 21,07 1246 1239 tr MO

33. 4-Menta-1,8-dien-7-al 22,12 1277 1269 tr MO

34. 2,4-Pentadiinil-benzen 22,44 1286 1298 4,0 P

35. Lavandulil acetat 22,57 1290 1288 0,1 MO

36. (Z)-3-Heksenil tiglat 23,69 1325 1319 tr O

37. Eugenol 24,82 1360 1356 5,1 O

38. Geranil-acetat 25,21 1372 1379 0,1 MO

39. α-Kopaen 25,48 1380 1374 tr S

40. 2,6-Dimetilnaftalen 25,77 1389 1408* 0,1 O

41. α-Izokomen 25,88 1393 1387 tr S

42. Metileugenol 26,24 1404 1403 tr MO

43. Lavandulilizobutanoat 26,82 1423 1421 0,1 MO

44. (E)-Kariofilen 26,89 1426 1417 0,4 S

45. α-Humulen 27,94 1460 1452 tr S

46. 9-epi-(E)-Kariofilen 28,18 1468 1464 tr S

47. α-Kurkumen 28,71 1485 1479 0,6 S

48. Kapilen 29,26 1504 1493 35,2 P

49. Lavandulil-izovalerijat 29,45 1510 1509 0,1 SO

50. cis-Kariofilen oksid 30,89 1560 1572* 0,2 SO

51. (E)-Nerolidol 31,07 1566 1561 0,3 SO

52. Citronelil-2-metilbutanoat 31,36 1576 1588* 0,1 O

53. Spatulenol 31,67 1587 1577 13,1 SO

54. Kariofilen oksid 31,82 1592 1582 6,9 SO

55. 9,11-epoksi-Guaja-3,10(14)-dien 32,09 1602 1601 0,4 SO

56. Ledol 32,35 1611 1602 0,5 SO

57. Humulen-epoksid II 32,52 1618 1608 1,7 SO

31

58. Hinezol 33,09 1638 1640 0,6 SO

59. Kapilin 33,33 1647 1637 7,1 P

60. β-Eudezmol 33,67 1659 1649 3,9 SO

61. Citronelil acetat 33,81 1664 1658 1,3 O

62. (E)-Seskvilavandulil acetat 35,80 1739 1739 0,4 SO

63. Farnezol 36,44 1763 1749* 1,5 SO

64. trans-Pinokarvil acetat 36,57 1768 1762 0,4 SO

65. Fiton 38,49 1844 1846* 0,2 O

Komponente koje su označene su prisutne u procentu > 5%

RT-retenciono vreme

RI - eksperimentalno određeni retencioni indeksi na koloni HP-5 MS

RIa- retencioni indeksi dobijeni iz Adamsove baze podataka

tr - tragovi (< 0,1 %)

* - indeksi određeni poređenjem masenih spektara u “search for species data by chemical

name-the NIST webBook”

Tabela 3.Procentualna zastupljenost klasa jedinjenja u analiziranom etarskom ulju

Ukupno identifikovano 98,6%

M-Ugljovodonični monoterpeni 7,3%

MO-Oksigenovani monoterpeni 7,5%

S-Ugljovodonični seskviterpeni 1,7%

SO-Oksigenovani seskviterpeni 28,3%

P-Fenildiacetileni 46,3%

O-Ostala jedinjenja 7,5%

32

Iz Tabele 2. se može videti da GC i GC/MS analiza dobijenog ulja pokazuje prisustvo 65

komponenti koje su identifikovane, što čini 98,6%, a najzastupljenije klase jedinjenja su

fenildiacetileni (46,3%) i oksigenovani seskviterpeni (28,3%). Najzastupljenija jedinjenja

analiziranog etarskog ulja biljne vrste Artemisia scopariasu kapilen (35,2% što čini približno 1/3

etarskog ulja), spatulenol (13,1%), kapilin (7,1%), kariofilen oksid (6,9%) i eugenol (5,1).

Kapilen Eugenol Kapilin

Kariofilen oksid Spatulenol

Slika 7. Strukturne formule najzastupljenijih komponenata ispitivanog etarskog ulja

33

4.1.2. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia

Ispitivana je antimikrobna aktivnost etarskog ulja na dve Gram-negativne, dve Gram-

pozitivne bakterije i na gljivicu i prikazani su rezultati u Tabeli 4.

Tabela 4.Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia(zone inhibicije

prikazane u milimetrima)

Gram-negativne bakterije Gram-pozitivne bakterije Gljivice

E. coli S. abony S. aureus B. subtilis C. albicans

Etarsko ulje / / 21 20 37

Heksan / / / / /

Hloramfenikol 28 27 30 30 nt

Streptomicin 14 15 18 20 nt

Nistatin nt nt nt nt 29

/ - nije aktivno;

nt-nije testirano

Etarsko ulje biljne vrste Artemisia scoparia, koje je skladišteno u periodu od godinu

dana, nije pokazalo je aktivnost prema Gram-negativnim bakterijama, ali je pokazalo određenu

aktivnost prema Gram-pozitivnim bakterijamaS. aureus i B. subtilis, gde su zone inhibicije bile

21 mm i 20 mm.

Etarsko ulje je pokazalo veoma veliku aktivnost prema C. albicans(37 mm) u odnosu na

Nistatin (29 mm), koji je korišćen kao pozitivna kontrola.

Za ovakvo dejstvo etarskog ulja na C. Albicans je zaslužna komponenta kapilin kojom je

etarsko ulje bogato. Dosadašnja istraživanja su pokazala da kapilin ima mocne fungicidne

aktivnosti, kao i da je koristan u borbi protiv larvikomaraca [28].

5.ZAKLJUČAK

35

U ovom radu ispitivan je hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia

dobijenog hidrodestilacijom nadzemnih delova biljke ubrane u blizini Niša.

Analizom su dobijeni sledeći rezultati:

Prinos etarskog ulja, dobijenog hidrodestilacijom biljne vrste Artemisia scoparia, koja je

prethodno sladištena u periodu od godinu dana, iznosi 0,088%, na osnovučega možemo

doći do zaključka da je biljna vrsta siromašna uljem.

U ispitivanom etarskom ulju identifikovano je 65 jedinjenja što čini 98,6% svih prisutnih

komponenti. Najzastupljeniju klasu jedinjenja predstavljaju fenildiacetileni, sa udelom od

46,3%. Oksigenovani seskviterpeni su prisutni u procentu od 28,3%, dok su oksigenovani

monoterpeni prisutni u procentu od 12,6%. Ugljovodonični monoterpeni i seskviterpeni,

kao i ostala jedinjenja su prisutna u dosta manjim procentima. Najzastupljenija

komponenta u etarskom ulju ove biljne vrste je kapilen (35,2%), koja čini približno 1/3

etarskog ulja. Po zastupljenosti u ulju, bitne komponente su: spatulenol (13,1%), kapilin

(7,1%) i kariofilen oksid (6,9%).

Ispitivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja biljne vrste Artemisia scoparia Waldst.

& Kit. nije pokazalo aktivnost prema Gram-negativnim bakterijama, ali je pokazalo

određenu aktivnost prema Gram-pozitivnim bakterijama S. aureus i B. subtilis. Etarsko

ulje je pokazalo veoma veliku aktivnost prema C. albicans (37 mm) u odnosu na Nistatin

(29 mm), koji je korišćen kao pozitivna kontrola. Za ovakvo dejstvo etarskog ulja na C.

albicans je zaslužna komponenta kapilin kojom je etarsko ulje bogato.

LITERATURA

37

[1] P. Lukić, Farmakognozija, Peto izdanje, Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu(1993).

[2] N. Kovačević, Osnovi farmakognozije, Treće izdanje, Srpska školska knjiga, Beograd(2004).

[3] J. Lawless, Essential oils, An Illustrated Guide (2001).

[4] M. Gajić, Artemisia L. In: M. Josifović (ed.), Flora SR Srbije, 7, 121-129, Srpska Akademija Nauka i

Umetnosti, Beograd (1975).

[5] H.P. Singh, S. Kaur, S. Mittal, D.R. Batish, R.K. Kohli, In vitro screening of essential oil from young

and mature leaves of Artemisia scoparia compared to its major constituents for free radical scavenging

activity,Food and Chemical Toxicology, 48, 1040-1044, (2010).

[6] http://www.naturalmedicinalherbs.net/herbs/a/artemisia-scoparia.php

[7] B. Tatić, V. Blečić, Sistematika i filogenija viših biljaka, ZZUNS, Beograd, (1988).

[8] B. Zlatković, Z. Šarac, Praktikum iz sistematike biljaka, Prirodno-matematički fakultet Niš, (2016).

[9] S. Luketa, Tekstovi iz botanike, http://stefann90.blogspot.rs/2008/12/tekstovi-izbotanike.html

[10] V.P. Rasal, A. Kshirsagar, R. Bagali, S.K. Rai, Influence of Artemisia pallensWall plant on

experimental wounds in albino rats,Recent advances in medicinal plant research, 393-401, (2005).

[11] A. Rustaiyan, A. Faridchehr, M. Bakhtiyari,The third review on the costituents and biological

activities of Iranian Artemisia species, European Journal of Pharmaceutical and Medical Research, 3,

20-30, (2016).

[12]A.H. Gilani, K.H. Janbaz, A. Lateef, M. Zaman, Channel blocking activity of Artemisia

scopariaextract,Phytotherapy Research, 8, 161-165, (1994).

[13] http://bioras.petnica.rs/vrsta.php?id=25114

[14] http://www.vladimirrandjelovic.com/pdf/Sist-ekol-leko-bilja/06-Etarska%20ulja.pdf

[15] M. Sovilj, M. Spasojević, Proizvodnja i primena etarskih ulja iz domaceg lekovitog bilja, Tehnološki

fakultet, Novi Sad, (2001).

[16] H.P. Singh, S. Kaur, S. Mittal, D.R. Batish, R.K. Kohli,Chemical composition and antioxidant

activity of essential oil from residues of Artemisia scoparia,Food Chemistry, 114,642-645, (2009).

[17]H.P. Singh, S. Kaur, S. Mittal, D.R. Batish, R.K. Kohli, Essential oil of Artemisia scoparia inhibits

plant growth by generating reactive oxygen species and causing oxidative damage, Journal of Chemical

Ecology, 35, 154-162, (2009).

[18] M. Negahban, S. Moharramipour, F. Sefidkon, Chemical composition and insecticidal activity of

Artemisia scoparia essential oil against three coleopteran stored-product insects,Journal of Asia-Pacific

Entomology, 9, 381-388, (2006).

38

[19] K. Morteza-Semnani, M. Akbarzadeh,Essential oils composition of Iranian Artemisia absinthium L.

and Artemisia scoparia Waldst. et Kit.,Journal of Essential Oil Research, 17,321-322, (2005).

[20] M.H. Mirjalili, S.M.F. Tabatabaei, J. Hadian, A. Sonboli,Phenological variation of the essential oil of

Artemisia scoparia Waldst. et Kit from Iran, Journal of Essential Oil Research, 19, 326-329, (2007).

[21] S. Kaur, H.P. Singh, S. Mittal, D.R. Batish, R.K. Kohli, Phytotoxic effects of volatile oil from

Artemisia scoparia against weeds and its possible use as a bioherbicide,Industrial Crops and Products,

32,54-61, (2009).

[22] J.D. Cha, M.R. Jeong, S.I. Jeong, S.E. Moon, J.Y.Kim, B.S. Kil, Y.H. Song, Chemical composition

and antimicrobial activity of the essential oil of Artemisia scoparia and A. capillaris,Planta Medica,

71,186-190, (2005).

[23] S. Milosavljević, Strukturne instrumentalne metode, Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu

(1997).

[24] M. Balouiri, M. Sadiki, S.K. Ibnsouda, Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A

review,Journalof Pharmaceutical Analysis, 6,71-79, (2015).

[25] H. Van den Dool and D.P. Kratz, A generalization of the retention index system including linear

temperature programmed gas-liquid partition chromatography, Journal of Chromatography, 11, 463-471,

(1963).

[26] R.P.Adams, Identification of essential oil components by gas chromatography/mass spectrometry,

Allured Publishing Corporation, Carol Stream, Illinois, USA, (2007).

[27] NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards), Performance standards for

antimicrobial disk susceptibility testing; 6th Internacional Supplement, Wayne, PA, M2-A6, (1997).

[28] A. Banerji,D.L. Luthria, S.D. Kokate, Toxicity of capillin, the insecticidal principle of Artemisia

nilagirica Clarke, Indian Journal of Experimental Biology, 28,588-589, (1990).