univerzitet u tuzli farmaceutski fakultet dr.sc.adaleta softić izolacija cd14+ ćelija 1. izolacija...

Imunohemijske metode u istraživanjima uloge

lizosomskih cisteinskih proteaza i njihovih inhibitora u ćelijama imunog sistema

Univerzitet u Tuzli Farmaceutski fakultet Dr.sc.Adaleta Softić

• Stepen maturacije dendritičnih ćelija (DC) je krucijalan za efektivnu antigenu prezentaciju i inicijaciju primarnog imunog odgovora.

• Maturacijski stimulusi izazivaju adheziju nezrelih DC za ekstracelularni matriks, što je praćeno angažovanjem integrinskog receptora CD11b/CD18 [macrophage antigen-1 (Mac-1)], reorganizacijom citoskeleta i formiranjem podosoma.

Uvod

Hvatanje i prezentacija proteinskih

antigena putem dendritičnih

ćelija

• Katepsin X je eksprimiran u DC i drugim APC i uključen u aktivaciju Mac-1.

• Tokom maturacije, katepsin X se translocira prema plazma membrani maturirajućih DC, aktivira Mac-1 a time i ćelijsku adheziju.

• U zrelim DC, katepsin X redistribuira iz područja ćelijske membrane u perinuklearno područje, što koincidira sa de-adhezijom DC, formiranjem nakupina ćelija i formiranja zrelog fenotipa.

Uvod

• Prema rezultatima Jevnikarove i saradnika (2009) prokatepsin X bi se mogao aktivirati djelovanjem katepsina L; autori su utvrdili da obe proteaze snažno kolokaliziraju sa β2 lancem integrina uz plazma membranu aktiviranih monocita /makrofaga i uz uropode T limfocita.

• Cistatin C je kandidat za regulaciju aktivnosti katepsina L a time i aktivacije prokatepsin X.

Uvod

Cilj istraživanja

Analizirati kolokalizaciju cistatina C sa ciljnim enzimima, katepsinom L i katepsinom X, tokom diferencijacije DC u kulturi

Tokom diferencijacije DC u kulturi dolazi do kolokalizacije cistatina C sa ciljnim enzimima, katepsinom L i katepsinom X, kao i katepsina L i katepsina X.

Hipoteza

Postupak pripreme kulture DC

4. Imunofluo- rescentna

kolokalizacija

3. Uzgoj u kulturi uz

faktore rasta i LPS;

skrining

2. Izolacija CD14+ ćelija

1. Izolacija PBMC iz krvi

PBMC se izdvajaju iz pune krvi centrifugiranjem u gradijentu

gustoće uspostavljenom uz pomoć Ficoll histopaque.

1.Izolacija PBMC iz krvi

Centrifugiranje na 300xg 30 min na 4°C u swing-

out bucket rotoru, bez

kočnice

Materijal i reagensi • Svježa heparinizirana krv • Ficoll Histopaque (Sigma- Aldrich) – neutralni, jako

razgranati hidofilni polisaharid velike molekulske mase • Dulbecco's modified eagle medium uz dodatak 1%

penicilin-streptomicin otopine

1.Izolacija PBMC iz krvi

2.Imunomagnetna izolacija CD14+ ćelija

imunomagnetna izolacija

CD14+ ćelija


• Sterilnom Pasterovom pipetom se otpipretira sloj mononuklearnih ćelija, a zatim se vrši ispiranje sa DPBS (bez Ca i Mg) 1500xg/8min nekoliko puta, da bi se isprali trombociti koji mogu začepiti magnetnu kolonu.

• Talog se resuspendira u 0,5%FBS/DPBS (bez Ca i Mg), otprilike 80 uL. Potom se ostavi na 4 C a onda se 100uL suspenzije miješa sa 100 uL magnetic beads CD14+, te se inkubira 15 min u frižideru.

• Na držač magneta postavi se magnet a na njega kolona. Kolona se spere sa 0,5% FBS/DPBS (bez Ca i Mg). Zatim se otpipetira suspenzija. Suspenzija kroz kolonu teče polako, oko 30 min.


• Zatim se kolona ispira da bi se odstranile ostale ćelije. Prvo ispiranje je sa 1 mL 0,5%FBS/DPBS (bez Ca i Mg), a drugo i treće sa 3 mL.

• Eluiranje sa kolone: kolona se ukloni sa magnetnog nosača a zatim ispere sa oko 3 mL medija RPMI 1640. Pod pritiskom, sa kolone se ispiru monociti, hvataju se u falkonku, u koju se na kraju dospe do 50mL medija.

• Centrifugiranje 1400xg 7 min. otprilike, a potom inkubacija 2h u frižideru (da se ćelije smire) i dodatak faktora rasta. (GM-CSF i IL-4).

• Ćelije se dohrane slijedećeg dana a dan kasnije se promijeni kompletan medij.

• 5. dana su to imDC.


3. Uzgoj u kulturi uz faktore rasta

Kultura CD14+ ćelija

RPMI-1640 medij+

10% FBS

gentamicin

(50 μg/mL)

rhGM-CSF

(500 U/mL)

rhIL-4

(400 U/mL)

2. dana,

½ medija zamijenjena uz

dodatak početne količine

rhGM-CSF

(500 U/mL)

rhIL-4

(400 U/mL)

5. dana,

nezrelim DC mjeren nivo

ekspresije CD1a, CD14, CD80,

CD83, CD86, i HLA-DR.

Ćelije resuspendirane

u mediju sa rhGM-CSF (500

U/mL) i LPS (20

ng/mL) i uzgajane u kulturi još dva

dana.

7. dana, zrelim DC,

mjeren nivo ekspresije

CD1a, CD14, CD80, CD83, CD86 i HLA-

DR.

3. Uzgoj u kulturi uz faktore rasta

Protočna citometrija

(engl. flow cytometry) ili FACS (engl. fluorescence-activated cell sorting) Za analizu sa protočnim citometrom potrebna je suspenzija ćelija. Prilikom prolaska kroz izvor svjetlosti, svaka pojedinačna ćelija odaje svjetlosne signale, koji ovise od njenih osobina. Izvor svjetlosti je laserska zraka (najpogodnija je argonska) koja je usmjerena na tok ćelija, koje kroz mjesto interakcije sa laserskom zrakom prolaze pojedinačno (hidrodinamsko fokusiranje).

U protočnoj ćeliji dolazi do injektiranja uzorka, koji ima spor tok, u bržu noseću tekućinu (engl. sheath fluid). Zbog površinske napetosti i laminarnog toka dolazi do odvajanja kapljice uzorka iz injektora u uski brzi tok tekućine nosioca. Tačan nadzor brzine oba protoka omogućuje kontrolu širine srednjeg toka i posljedično smještaja ćelija u njemu.

Protočna citometrija Princip

Protočna citometrija Princip

FL2 PE

SSC

FSC

Fluidi

Elektronika

Računar

FL3 P Cy5

FL1 FITC

Detektori svjetla

Protočna citometrija Raspršena svjetlost

Pri interakciji laserskog zraka sa uzorkom, većina fotona neometano prolazi kroz tok. Međutim, neki fotoni, zbog ometanog puta kroz uzorak, mijenjaju svoje karakteristike, što opažamo kao odbijanje ili raspršivanje svjetlosti. Dva detektora mjere količinu raspršene svjetlosti koju odaje obasjana ćelija (emitovana svjetlost je jednake talasne dužine kao obasjavajuća svjetlost). Prvi detektor je FALS (engl. forward angle light scatter) koji se nalazi u ravnini puta laserskog zraka (tj. na suprotnoj strani toka) i omogućuje detekciju odbijene svjetlosti.

Parametar „prednje rasipanje“ (engl. forward scatter“, FSC), nastaje zbog kontakta sa ćelijskom membranom i srazmjeran je veličini ćelije; što je veća ćelija, veće je rasipanje svjetlosti te tako i signal koji se detektira na detektoru, koji prima raspršenu svjetlost iz smjera laserkog zraka (kut odbijanja zrake je malen). Kad su ćelije prozirne, dolazi do prolaska velike količine fotona kroz citoplazmu. Ukoliko dođe do interakcije sa organelama (endoplazmatski retikulum, jedro...) dolazi do odbijanja fotona pod različitim uglovima od smjera laserske zrake. Fotodetektor RALS (engl. right angle scatter) nalazi se pod pravim uglom u odnosu na lasersku zraku i omogućuje zapis drugog parametra – „bočno rasipanje“ (engl. side scatter) koji je razmjeran kompleksnosti (zrnatosti ili granuliranosti) pojedinačne ćelije; što je više organela odnosno membranskih struktura, veće je bočno rasipanje i viši je signal.

Protočna citometrija Raspršena svjetlost

Detektor za unutrašnju

strukturu ćelije

Upadna laserska

svjetlost

Detektor za veličinu ćelije

Stepen raspršenja svjetlosti u

smjeru laserske zrake razmjeran

je veličini ćelije

Stepen raspršenja svjetlosti pod pravim uglom

od smjera laserske zrake razmjeran je zrnatosti

tj. unutrašnjoj strukturi ćelije.

Analiza lizirane pune krvi korištenjem dvoparametrijskog FSC/SSC dijagrama

Protočna citometrija Analiza rezultata – SSC/FSC grafik

Protočna citometrija Imunofluorescentno označavanje proteina

Pored morfoloških karakteristika protočnom citometrijom možemo analizirati funkcionalne karakteristike ćelija. Razvrstavanje ćelija prema veličini i zrnatosti omogućuje razdvajanje bijelih krvnih ćelija na pojedinačne populacije, pa ukoliko želimo razlikovati podvrste limfocita, potrebno ih je razvrstati u pogledu prisustva pojedinačnih označavajućih molekula (obično na površini ćelije), čije se prisustvo određuje sa specifičnim anititijelima. Protočni citometar ima dva do četiri fluorescentna detektora (PMT) koji mjere svjetlost većih talasnih dužina od pobuđujuće (laserske) svjetlosti.

Svaki detektor prima emitiranu fluorescentnu svjetlost određene talasne dužine i na taj način mjeri signal, koji daje određena fluorescentna boja. Fotodetektori pretvaraju svjetlosne signale u električne. Izmjerene vrijednosti električnih signala po kompjuterskoj obradi prikazuju se matematički i grafički. Na taj način o svakoj ćeliji, pored podataka o njenoj relativnoj veličini i zrnatosti (FSC i SSC) se dobija i informacija o vrsti i jačini emitiranih fluorescentnih signala.



Spektar vidljive svjetlosti 390-750 nm

Protočna citometrija Analiza rezultata – jednoparametarski histogrami

Ovo su grafici koji pokazuju rezultate mjerenja jednog parametra (relativnu fluorescencu ili intenzitet raspršenja svjetlosti) na X-osi i broj događaja (broj ćelija) na Y-osi.

Histogram izgleda jednostavno i koristan je za procjenu ukupnog broja ćelija u uzorku koji posjeduje odabrane fizičke karakteristike ili eksprimira određeni marker. Ćelije sa željenim karakteristikama su označene kao pozitivan odziv.

PBMC mogu diferencirati u dva seta DC (mDC1 i mDC2) koje se odlikuju produkcijom različitog seta citokina, što je povezano sa različitim kapacitetom za usmjeravanje diferencijacije T ćelija. Kao i mDC1 (CD1a+), mDC2 eksprimiraju visoke nivoe CD11c, CD40, CD80, CD86, i MHC molekule klase II. mDC2 (CD1a-) ne sintetiziraju IL-12, sintetiziraju visok nivo IL-10, i usmjeravaju diferencijaciju T ćelija periferne krvi u Th0/Th2. mDC2 mogu diferencirati u CD83+ DC ćelije u prisustvu anti-CD40 mAb, i LPS-a uz IFN-γ, ali ostaju CD1a- i ne stvaraju IL-12 nakon maturacije.

3. Uzgoj u kulturi uz faktore rasta membranski markeri

• CD80 (B7.1) i CD86 (B7.2) na DC predstavljaju najvažnije kostimulatorne molekule za aktivaciju T ćelija Obično se CD80 i CD86 koriste za dokazivanje zrelih DC (mDC).

• CD83 pripada imunoglobulinskoj (Ig) superfamiliji i predstavlja marker mDC. Među imunim ćelijama, stabilna ekspresija ovog markera utvrđena je jedino na DC, ali može biti prolazno eksprimiran na aktiviranim limfocitima. CD83 je uključen u regulaciju imunosti in vitro i in vivo.

3. Uzgoj u kulturi uz faktore rasta membranski markeri

Fenotip nezrelih i zrelih dendritičnih ćelija. Isprekidana linija-fluorescentni odziv izotipske kontrole; puna linija-fluorescentni odziv membranskog markera.

Fenotip nezrelih dendritičnih ćelija: CD1ahi, CD14-, CD80low, CD83-, CD86low, i HLA-DRlow.

Fenotip zrelih dendritičnih ćelija: CD1alow, CD14-, CD80hi, CD83low, CD86hi, HLA-DRhi

3. Uzgoj u kulturi uz faktore rasta skrining fenotipa protočnom citometrijom

razvija se početkom 20-tog vijeka, kada je primjećeno da neki biološki molekuli fluoresciraju pri osvjetljavanju intenzivnim svjetlosnim zrakom određene talasne dužine

- od 60-tih godina se intenzivno koristi u biologiji i medicini (npr. antitijela), posebno u ćelijskoj biologiji zbog visoke osjetljivosti i rezolucije uz neinvazivni način detekcije

-Mnoge komponente biljnih tkiva fluoresciraju kada se osvijetle svjetlošću malih talasnih dužina, apsorbiraju svjetlosnu energiju jedne talasne dužine i emituju je na talasnim dužinama pomjerenim ka crvenom dijelu spektra.

Fluorescencija se sastoji iz dvije forme: -Primarna – prirodna fluorescencija (autofluorescencija) tkivnih jedinjenja i u nekim slučajevima je izuzetno slaba -Sekundarna – postiže se bojenjem fluorescentnom bojom ili fluorohromom i obično je jača.

Fluorescentna mikroskopija

Principe konfokalne mikroskopije postavio je fizičar i konstruktor Marvin Minski 1957. godine. Pojam konfokalan (eng. Confocal) je složenica iz engleskog termina CONjugated FOCAL plane. Sredinom osamdesetih godina prošlog vijeka, kombinovanjem usavršenih računara, lasera i optike, dolazi do konstruisanja konfokalnih mikroskopskih sistema koji uprkos vrlo velikoj cijeni postaju šire primjenjivani zahvaljujući svojim izuzetnim karakteristikama.

Konfokalna mikroskopija

U biologiji i medicini od posebnog je značaja fluorescentna konfokalna mikroskopija u kojoj se detektira fluorescenca u fiksiranom i obojenom uzorku, te u živim tkivima i ćelijama.

Konfokalna laserska pretražna mikroskopija je metoda svjetlosne mikroskopije pomoću koje je moguće detektirati svjetlost emitiranu iz vrlo tankog sloja u uzorku.

Konfokalna laserska pretražna mikroskopija (confocal laser scanning microscopy, CLSM)

Što se tiče optičkih principa, razlike između klasične fluorescentne mikroskopije i konfokalne mikroskopije su minimalne. Međutim, tehnička izvedba modernih konfokalnih mikroskopa uvodi čitav niz značajnih novina u odnosu na metodu ekscitacije, detekcije i interpretacije mikroskopske slike. Dok se u klasičnoj fluorescentnoj mikroskopiji, poznatoj i pod nazivom mikroskopija širokog polja, izvor svjetlosti koristi za istovremeno osvjetljavanje čitavog vidnog polja, u pretražnoj mikroskopiji ono se osvjetljava tačku po tačku.


U tu se svrhu pretežno koriste laserski izvori svjetlosti, uglavnom plinski laseri, a u novije vrijeme i laserske diode. Fokusirana laserska zraka prelazi preko uzorka tačku po tačku i ondje pobuđuje fluorescentne molekule, fluorofore, odakle i potiče termin ″pretražni″ u nazivu metode. Kako je u svakom trenutku osvijetljena samo jedna tačka uzorka, nikada nije moguće vidjeti realnu sliku čitavog vidnog polja pomoću npr. okulara, kao u klasičnoj mikroskopiji. Slika se, bilježeći intenzitet emitirane svjetlosti tačku po tačku pomoću odgovarajućeg detektora, može formirati tek u memoriji kompjutera i biti prikazana na zaslonu.


1. laserski zrak, kao tačkasti izvor kontrolisanog svjetlosnog intenziteta, se pomoću motorizovanih optičkih elemenata fokusira u bilo koju tačku vidnog polja 2. reflektovana svetlost ili emitovana fluorescencija sa uzorka usmjeravaju se ka detektoru kroz minijaturni otvor («pinhole») te se tako propušta samo svjetlost koja dolazi iz tačke fokusa («princip konfokalnosti») 3. svjetlosni detektor (fotomultiplikator) mjeri intenzitet pristigle svjetlosti

1

2

3

Konfokalna laserska pretražna mikroskopija

Dobijanje konfokalnih slika visoke rezolucije omogućeno je zahvaljujuci primjeni lasera i analogno-digitalne konverzije koju podržavaju savremeni računarski sistemi. Laserski blok uređaja čine Argonski laser (sa nekoliko spektralnih linija: 457nm, 478nm, 488nm i 514nm) i Helijum-Neonski laser (543nm). Tako je omogućena ekscitacija fluorohorma (fluorescentnih indikatora) koji apsorbuju svjetlost u plavom i zelenom dijelu vidljivog spektra. Dvokanalno registrovanje emitovanog svjetla je u opsegu od 475 nm preko zelenog i crvenog dijela vidljivog spektra do IC svetla. Takođe upotrebom živine HBO-lampe moguće je dobiti signal sa fluorohorma koji zahtijevaju UV ekscitaciju, kakav je DNK marker, DAPI.


GM 130 Cys C rezultat

Cys C GM 130 rezultat

Cys C GM 130 rezultat

Kolokalizacija cistatina C sa GM 130

u nezrelim, adherentnim i zrelim DC.

Uzorci su označeni različitim

primarnim Ab:

anti-cistatin C 1A2 mAb (svi uzorci),

anti- GM 130 pAb (svi uzorci).

Sekundarna antitijela su označena

fluorescentnom bojom Alexa Fluor.

Nezrele DC

Adherentne DC

Zrele DC

4. Imunofluorescentna kolokalizacija

Cys C LysoTracker rezultat

rezultat

Cys C LysoTracker rezultat Kolokalizacija cistatina C sa

LysoTracker-om (crvena boja) u

nezrelim, adherentnim i zrelim

DC. Cistatin C je označen sa anti-

cistatin C 1A2 mAb (svi uzorci).

Sekundarno antitijelo, usmjereno

prema anti-cistatin C primarnom

antitijelu je označeno sa Alexa

Fluor 488.

Nezrele DC

Adherentne DC

Zrele DC

Cys C LysoTracker


Cat X Cys C rezultat



Nezrele DC

Adherentne DC nakon 5h


Kolokalizacija cistatina C sa

katepsinom X u nezrelim i

adherentnim ćelijama nakon 2

sata i nakon 5 sati.


primarnim antitijelima:

anti-cistatin C 1A2 mAb (svi

uzorci)

anti-katepsin X 2F12 (svi uzorci).

Sekundarna antitijela su

označena fluorescentnom bojom

Alexa Fluor.









Zrele DC


katepsinom X u adherentnim

ćelijama nakon 12 , 18 i 24 sata

od stimulacije diferencijacije

LPS-om i zrelim DC. Uzorci su

označeni različitim primarnim

antitijelima:

anti-cistatin C 1A2 mAb (svi

uzorci)

anti-katepsin X 2F12 (svi uzorci)



Alexa Fluor.


Cat L Cys C

Cat L Cys C rezultat

Cys C Cat L

rezultat

Cys C Cat L rezultat


katepsinom L u nezrelim,

adherentnim i zrelim DC.


primarnim antitijelima:

anti-cistatin C 1A2 mAb

(svi uzorci)

anti-katepsin L pAb

(svi uzorci).


označena fluorescentnom

bojom Alexa Fluor.

Nezrele DC

Adherentne DC

Zrele DC


Cat X Cat L rezultat

Cat X Cat L

rezultat

Cat X Cat L

rezultat

Nezrele DC

Adherentne DC

Zrele DC

Kolokalizacija katepsina X sa

katepsinom L u nezrelim,

adherentnim i zrelim DC. Uzorci

su označeni različitim primarnim

antitijelima:

anti-katepsin X 2F12 (svi uzorci)

anti-katepsin L pAb (svi uzorci)



Alexa Fluor.


univerzitet u tuzli farmaceutski fakultet dr.sc.adaleta softić izolacija cd14+ ćelija 1. izolacija...

Documents