untersuchung schwacher wechselwirkungen innerhalb von biofilmen … · 2003. 7. 1. · untersuchung...
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Untersuchung schwacher Wechselwirkungen
innerhalb von Biofilmen
mittels 13C- NMR - Spektroskopie
Von der Fakultät für Naturwissenschaften
der Universität Duisburg-Essen
(Standort Duisburg)
zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
genehmigte Dissertation
von
Daniel Lattner
aus Dinslaken
Referent: Prof. Dr. Christian Mayer
Korreferent: Prof. Dr. Werner Borchard
Datum der Einreichung: 2. April 2003
Tag der mündlichen Prüfung: 2. Juli 2003
"Denn das ist das Ziel:
Dem Leben jeden Platz zu erobern, auf dem es bestehen und weiter wachsen kann, jede
unbelebte Welt zu beleben und jede lebende sinnvoll zu machen."
Hermann Oberth
DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt Herrn. Prof. Dr. C. Mayer für die Überlassung dieses inter-
disziplinären Themas und die fortwährende Unterstützung im Verlaufe der Arbeit. Die
Diskussionen mit Ihnen haben mir geholfen über die holprigen Zeiten der Anfangsphase
hinwegzukommen und viele Dinge in einem positiveren Licht zu sehen, als sie sich zunächst
präsentierten.
Herrn Prof. Dr. W. Borchard danke ich für die Übernahme des Korreferats und für seine
Ratschläge bezüglich der Gelierung von Alginaten.
Bei Herrn Prof. Dr. H.-C. Flemming möchte ich mich für die Einführung in die Biofilm-
forschung bedanken. Die AFM- Untersuchungen an EPS Lösungen, die ich an der University
of Portsmouth durchführen konnte, wären ohne Ihre vermittelnde Tätigkeit wohl nicht
zustande gekommen.
Herrn Dr. J. Wingender gilt mein Dank für die Vermittlung von fundiertem mikrobio-
logischen Wissen und die stete Bereitschaft zur Diskussion.
Für die tatkräftige Hilfe mit den NMR- Spektrometern, insbesondere aber auch der Wartung
unseres "Sorgenkindes", dem 10 mm Probenkopf, möchte ich mich bei Herrn M. Zähres
(Zorro) und Herrn U. Bachorski bedanken.
Mein ganz besonderer Dank gilt Dir, Natascha, für die Bereitstellung von EPS- Proben, aber
auch den moralischen und praktischen Beistand in mancherlei "kleinen Problemchen".
Christian und Elena, ich möchte euch beiden für die gemeinsame Zeit im Büro danken.
Haben wir doch bewiesen, dass selbst bei dieser unterschiedlichen Zusammensetzung an
Temperamenten eine harmonische Mischung zustande kommen kann. Ich habe die Zeit mit
euch sehr genossen und viel (auf unser aller Kosten) gelacht. Wenn ich so zurückblicke
schießen mir viele Begebenheiten durch den Kopf, Momente, an die ich mich gerne
zurückerinnere. „Daniel,...?“, „Ja, euch beide.“
Ferner möchte ich mich bei allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Fachgebietes der
Physikalischen Chemie, der Angewandten Physikalischen Chemie, der Mikrobiologie und der
Forschergruppe "Biofilme" für die freundschaftliche und offene Atmosphäre bedanken.
Für die finanzielle Unterstützung während der Erstellung dieser Arbeit danke ich der
Deutschen Forschungsgemeinschaft.
Schließlich möchte ich allen anderen, die mich bei der Erstellung dieser Dissertation auf
unterschiedlichste Weise unterstützt haben und die hier ungenannt bleiben, für die erwiesene
Hilfe danken.
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung...................................................................................................................... 1
2. Überblick....................................................................................................................... 3
2.1 Biofilme................................................................................................................... 3
2.1.1 Definition....................................................................................................... 3
2.1.2 Vorkommen................................................................................................... 3
2.1.3 Bedeutung von Biofilmen.............................................................................. 5
2.1.3.1 Biofilme aus ökologischer Sicht....................................................... 5
2.1.3.2 Biofilme in Industrie und Technik.................................................... 5
2.1.3.3 Biofilme in der Medizin.................................................................... 7
2.1.4 Aufbau und Entstehung von Biofilmen......................................................... 8
2.2 Extrazelluläre polymere Substanzen (EPS)............................................................. 12
2.2.1 Definition....................................................................................................... 12
2.2.2 Zusammensetzung der EPS........................................................................... 13
2.2.3 Wechselwirkungen innerhalb der EPS.......................................................... 15
2.3 Polysaccharide......................................................................................................... 18
2.3.1 Allgemein...................................................................................................... 18
2.3.2 Alginate......................................................................................................... 21
2.3.3 Wechselwirkungen bivalenter Kationen mit Alginat:
das „Egg-box“ Modell................................................................................... 24
3. Theoretische Grundlagen............................................................................................ 26
3.1 Spin - Gitter Relaxation........................................................................................... 26
3.1.1 Die Spin - Gitter Relaxation aus phänomenologischer Sicht........................ 26
3.1.2 Methoden zur Bestimmung der T1- Zeit........................................................ 29
3.2 Spin - Spin Relaxation............................................................................................. 30
3.2.1 Die Spin - Spin Relaxation aus phänomenologischer Sicht.......................... 30
3.2.2 Methoden zur Bestimmung der T2- Zeit........................................................ 33
3.3 Linienbreiten und Relaxation.................................................................................. 34
3.4 Dipolare Kopplung und Relaxation......................................................................... 36
i
Inhaltsverzeichnis
4. Methoden....................................................................................................................... 40
4.1 Anzucht von Biofilmen............................................................................................ 40
4.2 Isolierung der EPS................................................................................................... 40
4.3 Isolierung von bakteriellem Alginat........................................................................ 41
4.4 Isolierung der Alginat- Lyase.................................................................................. 41
4.5 Bestimmung des Einflusses von pH- Wert und Temperatur................................... 42
4.5.1 Einfluss des pH-Wertes................................................................................. 42
4.5.2 Einfluss der Temperatur................................................................................ 43
4.6 Bestimmung des Einflusses mono- und bivalenter Ionen........................................ 43
4.7 Bestimmung des Einflusses trivalenter Ionen.......................................................... 43
4.8 Stressreaktionen von Biofilmen............................................................................... 44
5. Ergebnisse..................................................................................................................... 45
5.1 Messungen am unmarkierten Biofilm und seinen Komponenten............................ 45
5.1.1 Nativer Biofilm von Pseudomonas aeruginosa SG81.................................. 45
5.1.2 Bakterielles Alginat....................................................................................... 47
5.2 Messungen an 13C- angereichertem Biofilm und seinen Komponenten.................. 52
5.2.1 Natürlicher Biofilm von Pseudomonas aeruginosa SG81............................ 52
5.2.2 Extrazelluläre polymere Substanzen (EPS)................................................... 54
5.2.3 Bakterielles Alginat....................................................................................... 55
5.3 Einfluss von pH- Wert und Temperatur.................................................................. 57
5.3.1 Einfluss des pH- Wertes................................................................................ 57
5.3.2 Einfluss der Temperatur................................................................................ 60
5.4 Einfluss monovalenter Kationen.............................................................................. 63
5.4.1 Extrazelluläre polymere Substanzen (EPS)................................................... 63
5.4.2 Bakterielles Alginat....................................................................................... 67
5.5 Einfluss bi- und trivalenter Ionen............................................................................ 70
5.5.1 Einfluss von Magnesiumionen...................................................................... 70
5.5.2 Einfluss von Calciumionen............................................................................ 74
5.5.3 Einfluss von Aluminiumionen....................................................................... 79
5.6 Effekte paramagnetischer Ionen.............................................................................. 82
5.7 Stressreaktionen von Biofilmen............................................................................... 84
ii
Inhaltsverzeichnis
6. Diskussion...................................................................................................................... 89
6.1 Charakerisierung des Biofilms................................................................................ 89
6.2 Effektivität und Spezifität der 13C- Anreicherung.................................................. 92
6.3 Spektroskopische Charakteristika von Biofilmspektren.......................................... 96
6.4 Einfluss von pH- Wert und Temperatur.................................................................. 99
6.4.1. Einfluss des pH- Wertes............................................................................... 99
6.4.2 Einfluss der Temperatur................................................................................ 100
6.5 Einfluss monovalenter Ionen................................................................................... 101
6.5.1 Extrazelluläre polymere Substanzen (EPS)................................................... 101
6.5.2 Bakterielles Alginat....................................................................................... 102
6.6 Einfluss bi- und trivalenter Ionen............................................................................ 106
6.6.1 Einfluss von Magnesiumionen...................................................................... 106
6.6.2 Einfluss von Calciumionen............................................................................ 108
6.6.3 Einfluss von Aluminiumionen....................................................................... 112
6.7 Effekt paramagnetischer Ionen................................................................................ 114
6.8 Stressreaktionen in Biofilmen.................................................................................. 116
7. Zusammenfassung........................................................................................................ 120
8. Literaturverzeichnis..................................................................................................... 122
9. Anhang........................................................................................................................... 131
Anhang A – Tabellenanhang....................................................................................... 131
Anhang B – Abbildungsanhang................................................................................... 136
Anhang C – Tabellenverzeichnis................................................................................. 137
Anhang D – Abbildungsverzeichnis............................................................................. 139
Anhang E – Abkürzungsverzeichnis............................................................................ 144
iii
Einleitung
1. Einleitung
Obwohl Bakterien in der Lage sind frei, also in einem "planktonischen Zustand", zu
existieren, liegt die überwiegende Mehrheit aller Mikroorganismen auf der Erde in Form von
mikrobiellen Konsortien als Biofilme oder Flocken vor [1]. Als solche sind sie häufig auf
Oberflächen vorzufinden, die im regelmäßigen Kontakt mit einem wässrigen Medium stehen.
Aufgrund dieses Umstandes ist es ersichtlich, dass Biofilme einen gravierenden Einfluss auf
viele natürliche und technische Prozesse nehmen. Aus der Perspektive des Menschen betrach-
tet können sie sowohl nützliche als auch schädigende Auswirkungen haben.
Eine Grundvoraussetzung für alle biotechnologischen Anwendungen von Biofilmen ist die
mechanische Stabilität der Biomasse innerhalb von Bioreaktoren. Gleich welcher Reaktortyp
in der Technik Einsatz findet, die Grundlage für eine effektive Prozessführung ist, dass der
Biofilm im Reaktor zurückgehalten und nicht mit der Wasserphase ausgeschwemmt wird.
Umgekehrt verhält es sich bei unerwünschten Biofilmen, wie sie z.B. in Wärmetauschern
oder auf Umkehrosmosemembranen auftreten können. Zwar lassen sich die Mikroorganismen
durch den Einsatz von Bioziden abtöten, die Biofilmmatrix selbst verbleibt jedoch in den
technischen Anlagen. Dort ist sie oftmals nur schwer zu entfernen, zumal sie einen idealen
Nährboden für eine Neubesiedlung darstellt [2].
In beiden Fällen liegt der Schlüssel zur Problemlösung in den extrazellulären polymeren Sub-
stanzen (EPS). Die EPS bilden die schützende Polymermatrix des Biofilms und sind sowohl
für den Zusammenhalt der Zellen als auch für die Adhäsion an ein Substrat verantwortlich
[3]. Die physikalischen Eigenschaften der EPS werden dabei maßgeblich durch die Art sowie
den relativen Anteilen der verschiedenen Matrixpolymere an den EPS bestimmt.
Die Zusammensetzung der EPS ist von mehreren Faktoren (Bakterienspezies, Wachstums-
phase, Nährstoffangebot, etc.) abhängig. Im Falle der EPS von Pseudomonas aeruginosa
SG81 stellen Polysaccharide und Proteine die Hauptkomponenten dar. Zu geringeren Anteilen
sind neben diesen auch noch Nukleinsäuren, Lipide und Lipopolysaccharide als weitere Be-
standteile in den EPS vorzufinden.
1
Einleitung
Die dieser Arbeit zugrunde liegende Fragestellung besteht darin, mittels kernmagnetresonanz-
spektroskopischer Methoden die Natur der Wechselwirkungskräfte, welche in den EPS auftre-
ten, auf molekularer Ebene zu untersuchen. Im Vordergrund der Untersuchungen stehen dabei
die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem bakteriellen Alginat und seinen
Gegenionen.
In der Literatur werden Stärke und Selektivität der Bindungen zwischen unterschiedlichen
mono- oder bivalenten Ionen mit Alginaten diskutiert . Eines der fundamentalen Modelle zur
Beschreibung der Wechselwirkungen zwischen Calciumionen und Alginaten stellt das "Egg-
box" Modell von Grant et al [4] dar. Entsprechend dieses Modells beruht die Bildung des
Gelnetzwerkes in Algenalginaten auf der Entstehung Ca2+- verbrückter, chelat-ähnlicher
Komplexe zwischen den Guluronatblöcken benachbarter Polysaccharidketten.
In der Praxis zeigt sich, dass Alginate bakteriellen Ursprungs in Gegenwart von Ca2+- Ionen
ebenfalls eine starke Tendenz zur Gelbildung besitzen, gleichwohl sie im Gegensatz zu den
Algenalginaten nicht über Guluronatblöcke verfügen. NMR- Untersuchungen an 13C-
markierter EPS sollen Aufschluss über die direkte lokale Umgebung an den Vernetzungs-
punkten geben und aufzeigen, inwieweit Analogien zum "Egg-box" Modell vorliegen.
2
Überblick
2. Überblick
2.1 Biofilme
2.1.1 Definition
Der Terminus „Biofilm“ stellt einen nicht scharf definierten Oberbegriff dar. Im Allgemeinen
versteht man unter Biofilmen Konsortien von Mikroorganismen (Bakterien, Pilze, Hefen, Pro-
tozoen etc.), welche in einer Matrix aus extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) eingela-
gert sind und miteinander und/oder an Grenzflächen verhaftet sind [5]. In die organische Po-
lymermatrix können gleichermaßen weitere gelöste oder partikuläre Stoffe eingelagert sein.
Im Rahmen dieser Definition können somit auch mikrobielle Aggregate wie Flocken (soge-
nannte "planktonische Biofilme") oder Mikrokolonien innerhalb von Porenräumen poröser
Materialien [6] als Biofilme angesehen werden.
2.1.2 Vorkommen
Biofilme stellen eine ubiquitäre Lebensform dar. Es existiert keine Oberfläche, welche nicht
von Mikroorganismen besiedelt wird. Trotz intensiver Bemühungen im Bereich der Material-
und Grenzflächenforschung ist derzeit kein Werkstoff bekannt, der dauerhaft einer Besiedlung
widersteht [7, 8]. Dies beruht unter anderem darauf, dass die Grundvorraussetzungen für Bio-
filmwachstum sehr gering sind: Mikroorganismen, Grenz- bzw. Oberflächen, Feuchtigkeit
und Nährstoffe. Dementsprechend ist die Spannweite der Lebensbedingungen unter denen
Biofilme existieren können, weit gefasst (Tabelle 2.1).
Aufgrund dieser außerordentlichen Anpassungsfähigkeit stellen Biofilme in natürlichen Öko-
systemen die dominante Daseinsform mikrobiellen Lebens dar [5]. Offensichtlich bietet das
Leben im Biofilm als Mikrokonsortien den Bakterien entscheidende Vorteile gegenüber der
Existenz als suspendierte Einzelorganismen. Der Biofilm gewährleistet in erster Hinsicht
einen Schutz vor pH- Schwankungen, osmotischem oder hydraulischem Stress und Bioziden.
Gleichzeitig können durch Sorption in der Biofilmmatrix Nährstoffe angereichert werden. Die
3
Überblick
Matrix reduziert aufgrund der gehinderten Diffusion den Verlust extrazellulärer Enzyme an
die Wasserphase und unterstützt somit zusätzlich die Effektivität der Nährstoffverwertung. In
einigen Fällen wurde sogar eine Fixierung und Stabilisierung extrazellulärer Enzyme durch
die EPS- Matrix festgestellt [9].
Tab. 2.1: Spannweite mikrobieller Existenz in Biofilmen nach Flemming [2]
Milieufaktor Spannweite Temperatur von – 12°C (kalte salzhaltige Lösungen)
bis > 110°C (heiße maritime Schwefelquellen) pH- Bereich von 0 (Thiobacillus ferrooxidans)
bis > 13 (Plectonema nostrocoum) hydrostatischer Druck von 0
bis > 140 bar ("barophile Bakterien") Redoxpotential von – 450 mV (methanogene Bakterien)
bis + 850 mV (Eisenbakterien) Salinität von 0 (aqua bidest.)
bis zu gesättigten Salzlösungen (obligat halophile Bak-terien in Salzseen)
Nährstoffangebot von < 10 µg ⋅ L-1 Corg. (Systeme mit hochreinem Wasser)
bis Leben direkt auf Nährstoffquellen Oberflächenmaterialien Metalle, Beton, Kunststoffe, Glas, Mineralien, Öle,
pflanzliche und tierische Gewebe Strahlenbelastung Biofilme auf Quarzhüllen von UV-Lampen
Biofilme auf radioaktivem Material (> 500 krad) Biozidkonzentration > 2 mg ⋅ L-1 freies Chlor
Biofilme in Desinfektionsmittelleitungen
Neuere Erkenntnisse deuten ferner darauf hin, dass sich die Mikroorganismen im Biofilm
über Autoinduktoren, wie Homoserin-Lactone, verständigen und dadurch das An- bzw. Ab-
schalten bestimmter Gene bewirken [10].
4
Überblick
2.1.3 Bedeutung von Biofilmen
2.1.3.1 Biofilme aus ökologischer Sicht
Die frühesten morphologischen Beweise für Leben auf der Erde weisen einen engen Zusam-
menhang zwischen hydrothermalen Aktivitäten und dem Auftreten von mikrobiellen Rasen
(engl.: microbial mats) bzw. Biofilmen
auf. Die ältesten bekannten Funde da-
tieren zw. 3,3 - 3,5 Mrd. Jahre zurück
und zeigen versteinerte Biofilme in stro-
matolitischen Gesteinsformationen [11,
12, 13]. Im Verlauf der Erdgeschichte
konnten sich innerhalb dieses mikro-
biellen Bewuchses einfache Mikroorga-
nismen entwickeln, welche dazu in der
Lage waren, Photosynthese zu betreiben. Dadurch sind sie maßgeblich an der Umstellung der
Erdatmosphäre von anaeroben zu aeroben Bedingungen beteiligt [14]. Als bakterieller
Bewuchs auf zerfallendem organischem Material und durch dessen partiellen Abbau haben
Biofilme einen wesentlichen Beitrag zur Bildung fossiler Brennstoffe geleistet [15]. Heutzu-
tage spielen die sogenannten "microbial mats" eine wesentliche Rolle bei der Fixierung von
atmosphärischem CO2 [16], aber auch bei der Verwitterung von Gesteinen [17, 18].
Abb. 2.1: „Microbial mats“ im Yellowstone Nationalpark (USA)
2.1.3.2 Biofilme in Industrie und Technik
Im Bereich von Industrie und Technik muss zwischen den positiven Nutzungsmöglichkeiten
der Biofilme und ihrem unerwünschten Auftreten als Störfaktor in industriellen Prozessen
unterschieden werden. Der größte Anwendungsbereich von Biofilmen liegt in der Abwasser-
reinigung. Die Immobilisation der Mikroorganismen als Biofilm innerhalb eines Reaktors
birgt entscheidende Vorteile für die biologische Reinigung von Abwässern. So ist der Umsatz
von Substrat aufgrund der höheren Zelldichten wesentlich größer und die Reaktorführung ist
vergleichsweise unkompliziert, da physiologische Beschränkungen hinsichtlich der Wachs-
5
Überblick
tumsrate der Mikroorganismen (Auswaschen) nicht gegeben sind. Darüber hinaus bietet die
EPS- Matrix des Biofilms den Bakterien einen effektiveren Schutz gegenüber plötzlichen
Stoßbelastungen, wie pH- Schwankungen oder erhöhten Salzkonzentrationen.
In der biologischen Abluftreinigung finden Biofilme unterschiedlichster Form ihren Einsatz.
Man unterscheidet dabei drei Hauptverfahren: Biofilter [19], Biowäscher und Biotricklingfil-
ter. Biofilter sind Festbettfilter, die mit organischen Trägermaterialien (z.B. Reisig, Fasern,
Rindenmulch) gefüllt sind. Biowäscher sind Wäschersysteme, welche mit einer hohen Kreis-
laufwassermenge und einem separaten Reaktionsbehälter arbeiten. Der Nachteil dieses
Systems ist, dass es nur für wasserlösliche Schadstoffe geeignet ist. Der Biotricklingfilter [20,
21, 22] macht sich die positiven Eigenschaften beider Reinigungssysteme zu eigen.
Häufig stellen Biofilme aber auch erhebliche Störfaktoren dar. In der Wasseraufbereitung
kommt es durch mikrobiellen Aufwuchs auf Umkehrosmosemembranen, Aktivkohle-
adsorbern o.ä. zur Kontamination des Wassers. Man spricht in diesem Falle auch von einem
sogenannten "Biofouling".
In der Schiffahrt führt die Biofilmbildung an Schiffsrümpfen zur Verschlechterung der
hydrodynamischen Eigenschaften des Schiffskörpers und somit zu einem erhöhten Treibstoff-
verbrauch. In Verbindung mit den resultierenden Folgekosten (Rumpfreinigung, Neuanstrich
etc.) entsteht ein erheblicher wirtschaftlicher Schaden aufgrund von marinem Biofouling, der
sich allein für die US Navy auf ca. 1 Mrd. Dollar pro Jahr beziffert [23].
Andere Formen der mikrobiellen Schädigung von Materialien werden unter dem Oberbegriff
"Biodetoriation" zusammengefasst. Je nach betroffenen Materialien unterscheidet man
zwischen mikrobiell induzierter Korrosion im Falle von Metallen oder Legierungen und
mikrobieller Verwitterung [2, 24] bei mineralischen Werkstoffen.
Ein Beispiel für mikrobiell induzierte Korrosion ist der Lochfraß in Flugzeugtreibstofftanks
aus Aluminium. Pilze wie H. resinae, welche über den Treibstoff mit eingebracht werden,
kolonisieren die dünne Wasserschicht am Tankboden und setzen organische Säuren als
Stoffwechselprodukte frei. Durch die Erniedrigung des pH- Wertes wird die Passivierung des
Aluminiums aufgehoben und das Metall angegriffen [25].
6
Überblick
2.1.3.3 Biofilme in der Medizin
Biofilme sind aus medizinischer Sicht unerwünscht und stellen eine ernste Problematik dar,
da sie potentiell pathogene Keime beheimaten können. So werden nach neuesten Erkenntnis-
sen wenigstens 60% aller nosokomialen Infektionen in der Implantationschirurgie auf bak-
terielle Biofilme zurückgeführt [26]. Als besonders ernst werden dabei Biofilminfektionen
von Fremdkörperimplantaten wie z.B. Herzklappen- oder Gelenkprothesen [27] eingestuft,
welche eine erhöhte Sterblichkeit bei den betroffenen Patienten zur Folge haben.
Die Problematik der Biofilme erstreckt sich aber auch auf eine Vielzahl anderer klinischer
Bereiche. Im Rahmen des stationären Intensivpflegebetriebes treten häufig sogenannte
Katheter-assoziierte Infektionen [28] auf. Dabei können entweder physiologische Hautkeime
von der Katheteraustrittsstelle über die Katheteraußenfläche in das subcutane Gewebe ein-
dringen und von dort in die Blutbahn gelangen oder aber Bakterien, welche anderen Infek-
tionsherden innerhalb des Körpers entstammen, siedeln sich aufgrund der lokalen hämo-
dynamischen Verhältnisse am Katheter an und führen hier zu einer Infektion.
Tab. 2.2: Beispiele für bakterielle Infektionen, die in Zusammenhang mit Biofilmen stehen [29]
Infektionskrankheit Bakterienspezies
Karies Acidogene Gram-positive Kokken (z.B. Streptococci) Parodontitis Gram-negative, anaerobe Bakterien Otitis media Haemophilus influenzae Musculoskeletale Infektionen Gram-positive Kokken (z.B. Staphylococci) nekrotische Fasciitis Gruppe A Streptococci bakterielle Prostatitis E. coli und andere Gram-negative Bakterien zystische Fibrose P. aeruginosa und Burkholderia cepacia Melioidose Pseudomonas pseudomallei Endokarditis Viridans Gruppe Streptococci
7
Überblick
In der Zahnmedizin wurde recht früh die Bedeutung von Biofilmen in Zusammenhang mit
dem Auftreten dentaler Plaque erkannt, wo sie zu Parodontitis und Gingivitis führen können.
In diesem Bereich der Medizin existiert daher eine Reihe von Forschungsarbeiten [30, 31, 32,
33] zur Besiedlung von Zahnoberflächen, welche maßgeblich zum allgemeinen Verständnis
der Biofilmentstehung beigetragen haben.
Im Rahmen dieser Forschungsarbeit wurden Biofilme eines Stammes von Pseudomonas
aeruginosa untersucht, welcher aufgrund seiner potentiell pathogenen Eigenschaften eine
medizinische Relevanz besitzt und eine Schlüsselfunktion in der Bekämpfung der Mukoviszi-
dose einnimmt [34, 35]. Bei Mukoviszidose (engl.: cystic fibrosis) handelt es sich um eine
erbliche, chronische Stoffwechselerkrankung [36], die vorwiegend innerhalb der kaukasi-
schen Bevölkerung auftritt. Erhebungen der Cystic Fibrosis Foundation zufolge sind weltweit
ca. 53.000 Fälle registriert, wobei jeder zwanzigste Amerikaner Träger des defekten „CF
Gens“ ist. Bei Mukoviszidose- Patienten kommt es zu einer verstärkten Schleimbildung ins-
besondere innerhalb der Atemwege, die somit ein ideales Habitat für pathogene Bakterien wie
P. aeruginosa darstellen. Infolge der Besiedlung durch pathogene Keime treten Entzündungen
der Bronchien auf, die im weiteren Verlauf chronische Atemwegserkrankungen zur Folge
haben.
2.1.4 Aufbau und Entstehung von Biofilmen
Obwohl Biofilme sehr heterogene Systeme darstellen [37] und die Variationsbreite hinsicht-
lich ihrer Zusammensetzung und Struktur groß ist, verläuft die Entwicklung eines Biofilms
nach einem charakteristischen Schema. Flemming [2] unterscheidet bei der Besiedlung einer
Oberfläche sechs typische Stadien (siehe Abb. 2.2).
Die Voraussetzung für eine mikrobielle Besiedlung ist der Transport der Organismen zur O-
berfläche hin. Durch Konvektion gelangen die Bakterien bis zu einer hydrodynamischen
Grenzschicht, bei der die laminare Fließgeschwindigkeit des wässrigen Mediums vollständig
zum Erliegen kommt. Innerhalb der diffusiven Grenzschicht, welche zwischen 10 - 100 µm
groß ist und somit deutlich die Größenordnung der Bakterien überschreitet, erfolgt der Trans-
port über Diffusion oder aktive Fortbewegung mittels Flagellen oder Fimbrien.
8
Überblick
Substratum
conditioning film
planktonische Zellen
twitching motility
Flagellum
Pili
EPSMikrokolonie
Zell - Zell Kommunikation
EPS- Matrix
Schwärmer- ZellenErosion Sloughing
Neubesiedlung
a) b)
c) d)
e) f)Abb. 2.2: Entstehung und Evolution eines Biofilms in einem Wassersystem; a) conditioning film,
b) reversible und irreversible Adhäsion, c) EPS- Produktion und Bildung von Mikrokolonien,
d) reifer, konfluenter Biofilm, e) Ablösung einzelner Bestandteile durch "sloughing" oder
aktive Ablösung von Einzelorganismen ("Schwärmer- Zellen") durch Abbau von Matrixpoly-
meren, f) Neubesiedlung; Abbildungen nach Flemming [2]
9
Überblick
Dem Transport der Mikroorganismen zur Oberfläche des Substrats hin folgt die initiale Adhä-
sion. Selten erfolgt diese direkt auf dem "inerten" Substrat, sondern auf einem sogenannten
"conditioning film", einer unregelmäßigen Belegung aus organischen Makromolekülen. Die
Adhäsion ist zunächst reversibler Natur, kann aber durch zunehmende physikochemische
Wechselwirkungen zwischen Substrat und Mikroorganismen bzw. deren EPS irreversibel
werden [38].
Die Wachstumsphase des Biofilms ist gekennzeichnet durch die Bildung von Mikrokolonien
und der verstärkten Produktion von EPS. Die Entstehung der Mikrokolonien erfolgt sowohl
durch Vermehrung der Bakterien, als auch durch aktive Bewegung der Zellen ("twitching
motility") [39] auf der Oberfläche des Substrats. Gleichzeitig ist ein Anstieg der EPS-
Produktion während dieser Phase zu beobachten; ein "reifer Biofilm" wird ausgebildet.
Das Biofilmwachstum erreicht einen stationären Zustand, die sogenannte Plateauphase, so-
bald das Biofilmwachstum und die Abtrennung von Biofilmbestandteilen einander die Waage
halten.Von der Ablösung können sowohl einzelne Bakterienzellen (Erosion) oder periphere
Teile des Biofilms ("Sloughing") betroffen sein. Zusätzlich zu diesen beiden Mechanismen
wird auch ein aktives Absetzen von Bakterien in Form von sogenannten “Schwärmerzellen“
erwogen [2].
Hat sich ein Biofilm auf einer Oberfläche etabliert, so wird seine Morphologie im Wesentli-
chen durch sein Wachstum, sowie durch eine Vielzahl von äußeren Faktoren (Scherkräfte [40,
41], Nährstoffangebot, Zelldichte etc.) bestimmt. Ein weitläufig anerkanntes Biofilm- Modell
ist unten (Abb. 2.3) dargestellt.
Abb. 2.3: Darstellung der Biofilmstruktur in einem Fließwassersystem; blaue Pfeile symbolisieren den
konvektiven Stofftransport durch Poren bzw. Kanäle; nach Costerton et al. [42]
10
Überblick
Wie der Abbildung zu entnehmen ist, besitzt der Biofilm eine pilzartige Morphologie, in der
die Bakterien als Mikrokolonien eingebettet sind. Ein System von Kanälen und Poren durch-
zieht die Biofilmatrix und gewährleistet den konvektiven Transport [43, 44, 45] von Nähr-
stoffen und Sauerstoff bis hin zu den tiefergelegenen, älteren Schichten des Biofilms. Unter-
suchungen von Bishop [46] zeigen, dass die Porengrößenverteilung über den gesamten Bio-
film betrachtet nicht einheitlich ist, sondern eine lokale Gewichtung vorliegt. So nimmt der
mittlere Durchmesser der Poren von der äußeren Grenzschicht (Biofilm / wässriges Medium)
zum Substrat hin ab. Innerhalb der EPS- Matrix selbst hingegen erfolgt der Stofftransport
ausschließlich durch Diffusion.[43, 47]
Die Struktur des Biofilms kann jedoch darüber hinaus von den Mikroorganismen selbst
beeinflußt werden. Gram-negative Bakterien sind in der Lage über Signalmoleküle, sogenann-
te Autoinduktoren, Informationen hinsichtlich der Zelldichte in ihrer Umgebung ("Quorum
Sensing") auszutauschen.
Für Pseudomonas aeruginosa sind bislang zwei Wege des "Quorum Sensing" bekannt. Das
System lasR-lasI reguliert die Virulenz sowie die Expression von rhlR-rhlI, welches an der
Produktion einiger sekundärer Katabolite beteiligt ist. Beide Systeme regulieren die Aus-
schüttung bestimmter Autoinduktoren: rhlI die von Butyrylhomoserinlacton und lasI die von
3-Oxododecanoylhomoserinlacton [48].
X
O
NH
OO
HSLAcylketteAbb. 2.4: Aufbau eines N-acyl- L-Homoserinlacton Autoinduktors. Das Molekül besteht aus einem
L-Homoserinlacton Grundgerüst (HSL) und einer Acylkette, welche in Länge und Struktur
variabel sein kann; X = O, S, N.
Weiterhin konnten O'Toole et al. [49] nachweisen, dass crc Mutanten von P. aeruginosa
lediglich eine Monolayerschicht auf Oberflächen ausbilden und keinen dichten, mucoiden
Biofilm, wie es beim Wildtyp der Fall ist. Da crc mit der Unterdrückung von Kataboliten
assoziiert ist, müssen diese an der Biofilmentstehung beteiligt sein.
11
Überblick
2.2 Extrazelluläre polymere Substanzen (EPS)
2.2.1 Definition
Unter extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) versteht man im Allgemeinen Biopoly-
mere mikrobieller Herkunft. Sie sind maßgeblich beteiligt am Aufbau der polymeren Gel-
matrix, welche das „Grundgerüst“ des Biofilms darstellt. So definieren Characklis und
Wilderer [3] EPS als „... organische Polymere mikrobiellen Ursprungs. In Biofilmsystemen
sind sie oft verantwortlich für den Zusammenhalt von Zellen (Kohäsion) [...] und die
Anhaftung an ein Substrat (Adhäsion).“, d.h. der Funktionalität der Polymere fällt somit eine
entscheidende Rolle zu.
Tab. 2.3: Übersicht über die Funktionalität der EPS innerhalb von Biofilmen (Teil I) [1]
Funktion Bedeutung
Adhäsion an Oberflächen Erster Schritt bei der Kolonisierung inerter Ober-flächen und Gewebe, Akkumulation von Bakterien auf nährstoffreichen Oberflächen in oligotropher Umgebung
Aggregation von Bakterienzellen, Bildung von Flocken und Biofilmen
Verbindung zwischen Zellen und anorganischen Trägermaterialen, Immobilisierung heterogener Bakterienpopulationen, Grundlage für die Ausbil-dung hoher Zelldichten, Medium für quorum sen-sing, Ursache für Biofouling und Biokorrosion
Zell – Zell Erkennung Symbiose mit Pflanzen oder Tieren, Iniziierung
pathogener Prozesse Strukturelle Elemente des Biofilms Mechanische Stabilität von Biofilmen (oft in Zu-
sammenhang mit bivalenten Kationen), bestimmt die Form der EPS (kapsuläres Material, Schleim, Hülsen)
Schutzfunktionen Resistenz gegenüber spezifischen oder unspezifi-
schen Abwehrmechanismen des Wirts (Phagocy-tose, Antikörperausschüttung, Bildung freier Ra-dikale), Resistenz gegenüber Bioziden wie Desin-fektionsmitteln und Antibiotika
Wasserrückhaltung Verhindert die Austrocknung unter wasserarmen
Bedingungen
12
Überblick
Tab. 2.3: Übersicht über die Funktionalität der EPS innerhalb von Biofilmen (Teil II) [1]
Funktion Bedeutung
Sorption exogener organischer Verbin-dungen
Akkumulation von Nährstoffen aus der Umge-bung, Sorption von Xenobiotika (Detoxifikation)
Sorption anorganischer Ionen Akkumulation toxischer Metallionen (Detoxifika-
tion), Ausbildung von Polysaccharidgelen Enzymatische Aktivität Verwertung exogener Makromoleküle als Nähr-
stoffquelle, Freisetzung von Biofilmzellen durch den Abbau strukturbildender EPS des Biofilms
Wechselwirkungen zwischen den Poly-sacchariden und Enzymen
Akkumulation/Retention und Stabilisierung von Enzymen
2.2.2 Zusammensetzung der EPS
Biofilme setzen sich aus einer Vielzahl von Komponenten zusammen: Bakterienzellen, extra-
zelluläre Polymere mikrobiellen Ursprungs, diverse Lyse- und Hydrolyseprodukte [50] sowie
gebundene organische und anorganische Substanzen. Die makroskopisch beobachteten physi-
kalischen Eigenschaften (viscoelastisches Verhalten, Adhäsions- und Kohäsionsvermögen,
Komplexbildungsverhalten gegenüber Ionen etc.) der Biofilmmatrix sind durch das
Mischungsverhalten aller makro- und niedermolekularen Komponenten im wässrigen Löse-
mittel, sowie bestimmten Sekundärfaktoren (pH, Ionenstärke der Lösung, etc.) gegeben.
Sollen qualitative Aussagen über das Verhalten eines solch komplexen Systems gemacht
werden, so ist eine Charakterisierung der Hauptkomponenten der EPS unerlässlich.
Aus chemischer Sicht stellen bakterielle EPS eine hochgradig heterogene Mischung unter-
schiedlichster Matrixpolymere dar. Die Polymere können durch verschiedenartige Mechanis-
men in die Biofilmmatrix gelangen. Mögliche Wege hierfür sind aktive Sekretion, Ablösen
von Bestandteilen der äußeren Zellmembran, Lysis oder Sorption aus der wässrigen Phase
[51]. Ein schematisches Modell, welches all diese Prozesse berücksichtigt, wurde von Nielsen
et al. [52] vorgestellt (Abb. 2.5). Mit ihm lässt sich nicht nur der Nährstoffkreislauf und die
13
Überblick
Zusammensetzung beschreiben, sondern es erlaubt darüber hinaus eine Korrelation zwischen
Komposition, Aktivität und den physikochemischen Eigenschaften des Biofilms.
löslicheSubstrate
löslichePolymere
KohlenhydrateProteine
löslicheLyse- undHydrolyse-Produkte
KohlenhydrateProteine
partikuläresMaterial
Zellenorganische Materie
ZelleBiomasse
KohlenhydrateProteine
ISP
gebundeneBiomasse
KohlenhydrateProteine
Hydrolyse-produkte
KohlenhydrateProteine
Lyse-produkte
KohlenhydrateProteine
Wachstum
Aufnahme vonSubstraten
Lyse
Hydrolyse
Hydrolyse
Produk-tion
gebundenesorganischesMaterial
KohlenhydrateProteine
Diffusion DetachmentAttachment
Abb. 2.5: Schematische Darstellung der physikalischen und chemischen Prozesse innerhalb eines Bio-
films [52]; ISP = intracellular storage products
Die größte Fraktion der polymeren Komponenten der EPS stellen Polysaccharide und Protei-
ne dar. In geringeren Konzentrationen liegen daneben auch noch Nukleinsäuren, Lipide und
Lipopolysaccharide vor. Manche Autoren zählen auch Huminstoffe zu den EPS [52, 53, 54],
diese gelangen jedoch ausschließlich durch Sorption aus der Umgebung in die Biofilmmatrix
und können daher nicht als EPS im engeren Sinne angesehen werden.
Die relativen Anteile aller Komponenten an den EPS sowie die Zusammensetzung und Mol-
massenverteilung der bakteriellen Polysaccharide [55] können stark in Abhängigkeit von den
Anzuchtbedingungen des Biofilms variieren. Eingehendere Untersuchungen an Laborkulturen
von P. aeruginosa SG81 durch Rhode zeigen, dass das Nährstoffangebot eine entscheidende
Rolle in der Alginatsynthese spielt [56]. Bei Bakterien der Spezies Pseudomonas sp. konnte
sogar die Biosynthese zweier gänzlich verschiedener Polysaccharide [57] in Abhängigkeit
von dem Wachstumsstadium der Mikrokolonien nachgewiesen werden.
14
Überblick
Tab. 2.4: Zusammensetzung der EPS einer Laborkultur von Pseudomonas aeruginosa SG81 bezogen auf
109 Zellen, Anzucht auf PIA- Platten [58]
Komponente Biofilm
(µg ⋅ 109 Zellen)
EPS
(µg ⋅ 109 Zellen)
Anteil in den
EPS
Polysaccharide 1005,8 766,6 76,2 %
Uronsäuren 473,8 402,8 85,0 %
Proteine 585,0 226,4 45,5 %
2.2.3 Wechselwirkungen innerhalb der EPS
Die Bedeutung der EPS als strukturgebendes Element der Biofilmmatrix wurde bereits an
anderer Stelle (Kapitel 2.1.4) erwähnt. Die Kräfte, welche für die kohäsiven und adhäsiven
Eigenschaften des EPS- Netzwerks verantwortlich sind, sind nicht von der Natur kovalenter
Bindungen. Es handelt sich vielmehr um die Summe unterschiedlicher schwacher Wechsel-
wirkungskräfte, wobei man im Wesentlichen zwischen drei Typen von Wechselwirkungen
unterscheidet [59]:
CH2
OH
CH2
OH
COO-
-OOC
COO-
-OOC
Ca2+
CH2
OH
CH2
HO
ionischeAbstoßungs-kräfte
Wasserstoff-brückenbindungen
+ + + +
- - - -
+ + + + +
- - - --
London‘scheWechselwirkungen
ionischeAnziehungs-kräfte
elektrostatischeAnziehungskräfte
Abb. 2.6: Schematische Darstellung der unterschiedlichen Wechselwirkungskräfte innerhalb der EPS-
Matrix
15
Überblick
London’sche Wechselwirkungskräfte:
Hierunter versteht man im Allgemeinen anziehende Kräfte zwischen Molekülen
bzw. Molekülgruppen. Sie können leicht durch oberflächenaktive Substanzen wie
Detergenzien aufgehoben werden und besitzen eine Bindungsenergie von ca. 2,5
kJ/mol.
Elektrostatische Wechselwirkungen:
Diese Form der Wechselwirkung tritt zwischen Ionen und permanenten sowie in-
duzierten Dipolen auf. Die Wechselwirkungen zwischen ionischen funktionellen
Gruppen und bivalenten Ionen sind sehr stark. Eine besondere Rolle fällt den
Wechselwirkungen zwischen den Carboxylatgruppen extrazellulärer Poly-
saccharide mit Ca2+- Ionen zu.
Elektrostatische Wechselwirkungen können ebenfalls als Abstoßungskräfte auftre-
ten und somit die makromolekulare Struktur beeinflussen, wie z.B. zwischen be-
nachbarten Carboxylatgruppen der Polyuronsäuren. Die Bindungsenergie nicht-
ionischer elektrostatischer Bindungen beträgt zwischen 12 und 29 kJ/mol. Die
Stärke elektrostatischer Wechselwirkungen innerhalb einer Lösung ist abhängig
vom pH- Wert, der Ionenstärke und der Anwesenheit von Komplexbildnern.
Wasserstoffbrückenbindungen:
Wasserstoffbrückenbindungen treten hauptsächlich zwischen Hydroxylgruppen
auf. Bei Proteinen sind Wasserstoffbrückenbindungen maßgeblich an deren
Tertiärstruktur beteiligt. "Chaotrope" Reagenzien wie Harnstoff, Trimethyl-
harnstoff o.ä. verändern die Wasserstruktur. Die freiwerdende Bindungsenergie
von Wasserstoffbrückenbindungen liegt bei 10 - 30 kJ/mol.
Neben diesen Wechselwirkungskräften findet man bei Makromolekülen auch das sogenannte
"Entanglement" vor, d.h. die Verschlaufung und Verknotung fadenförmiger Polymere [60].
Damit "Entanglements" auftreten können, muss die Molekülmasse der Matrixpolymere höher
sein als 2 ⋅ 105 g ⋅ mol-1 und in einer kritischen Konzentration zwischen 3 - 5% im Lösungs-
mittel vorliegen. Die mittlere Molmasse des im Rahmen der Forschungsarbeit untersuchten
Alginats von P. aeruginosa SG81, liegt zwischen 1,2 – 0,9 ⋅ 106 g/mol [61, 62], wobei die
Konzentration des Polymeren in wässriger Lösung 1% nicht übersteigt. Aufgrund dieser
16
Überblick
Rahmenbedingungen muss man davon ausgehen, dass "Entanglements" in Form von Agglo-
meraten vorliegen, jedoch kommt es ohne Zusatz bivalenter Ionen nicht zur Ausbildung eines
unendlich ausgedehnten Gelnetzwerkes.
17
Überblick
2.3 Polysaccharide
2.3.1 Allgemein
Polysaccharide sind hochmolekulare Kohlenhydrate natürlichen Ursprungs, welche sich aus
einfachen Monosaccharideinheiten zusammensetzen. Ihre Monomereinheiten bestehen über-
wiegend aus Pentosen oder Hexosen und deren Derivaten. Eine Darstellung der häufigsten
Zucker, welche zum Aufbau der Polysaccharide beitragen, sind in Abb. 2.7 und Abb. 2.8 fest-
gehalten.
O
OHOH
OH
OH
OOH
OH
OH
OH
OCH3
OH
OH OH
OH
OCH3
OH
OHOHOH
Aldopentosen 6- Deoxyhexosen
D- Xylose L- Arabinose 6- Deoxy-L-galactose6- Deoxy-L-mannose
Aldohexosen
OCH2OH
OHOH
OH
OH
OCH2OH
OH
OH
OH
OH
OCH2OH
OHOH OH
OH
OCH2OH
OHOH
OH
OH
D- Glucose D- Galactose D- Mannose L- Galactose
Ketohexose Hexosamine
O
OHOH
OH
CH2OH
O
OH OH
NH2
OH
CH2OHOOH
OH
NH2
OH
CH2OH
D- Fructose D- Glucosamin D- Galactosamin
Abb. 2.7: Häufige Monomerbausteine in Polysacchariden (Teil I) [63]
18
Überblick
Uronsäuren
O
OH OH
OH
OHCO2H
O
OH OH
OH
OH
CO2HOOH
OH
OH
OH
CO2H
O
OHOH
OHOH
CO2HO
OHOH
OHOHCO2H
O
O OH
OH
OH
CO2H
CH3
D- Glucuronsäure D- Galacturonsäure
D- Mannuronsäure L- Guluronsäure 4-O-Methyl-D- Glucuronsäure
D- Iduronsäure
Abb. 2.8: Häufige Monomerbausteine in Polysacchariden, Uronsäuren (Teil II) [63]
Die Erscheinungsformen der Polysaccharide sind trotz ihrer einfachen Grundstruktur sehr
vielschichtig. Die Spanne der Molekulargewewichte variiert von einigen Oligomeren bis zu
Molekülen mit Molmassen von mehreren Millionen g/mol und die Makromoleküle können
linear, verzweigt oder als Netzwerkstrukturen vorliegen. Man unterscheidet ferner zwischen
homopolymeren und heteropolymeren Polysacchariden. Letztere treten als regelmäßige Copo-
lymere, bestehend aus zwei bis acht unterschiedlichen Saccharidmonomeren, auf [63].
Polysaccharide sind vorwiegend polymolekular, d.h. sie setzen sich aus einer Vielzahl von
Molekülen mit einer breiten Molmassenverteilung, aber identischem Grundgerüst zusammen.
Darüber hinaus weisen sie in vielen Fällen auch einen hohen Grad an Polydispersität auf.
Die physikalischen Eigenschaften der Polysaccharide werden zudem durch die Natur der gly-
kosidischen Bindung mitbestimmt. Die Nomenklatur der Bindung erfolgt gemäß der be-
teiligten monomeren Zuckermoleküle. So liegt, wie in den Beispielen von Amylose und
Cellulose, eine 1,4- glykosidische Bindung vor, wohingegen bei Dextran eine 1,6- glykosi-
dische Bindung vorgefunden wird. Die Konformation der 1,4- glykosidischen Bindung lässt
sich durch zwei Winkel Φ und Ψ beschreiben. Die 1,6- glykosidische Bindung hingegen ist
komplexer und man benötigt einen weiteren Winkel ω um die lokale Struktur exakt wieder-
19
Überblick
O
OHOH
OCH2 OH
OOC
H2
OHO
OH
OH
Φ Ψ
OO
CH2
O OH
O
OH
HO
CH2
O
OHO
H
OH
Φ Ψ
O
O
OHOH
OHO
CH
OOH
OHOH
OHO
I
II
III
Φ Ψω
Abb. 2.9: Darstellung der Beweglichkeit der glykosidischen Bindung anhand dreier Beispiele: I) Cellulo-
se, II) Amylose, III) Dextran; gepunktete Linien symbolisieren die intramolekularen Wasser-
stoffbrückenbindungen; nach [64]
zugeben. Wie bereits aus der graphischen Darstellung (Abb. 2.9) ersichtlich ist, verfügt die
1,6- glykosidsche Bindung eine wesentlich höhere Flexibilität als die vergleichsweise rigidere
1,4- glykosidische Bindung. Dies beruht sowohl auf der Abwesenheit des zusätzlichen Tor-
sionswinkels, als auch auf den Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Ringsauerstoff-
atom und der Hydroxylgruppe am C-3 Atom (I) bzw. zwischen den Hydroxylgruppen an den
C-2 und C-3 Kohlenstoffatomen (II), welche die Rotationsfreiheit stark einschränken.
20
Überblick
2.3.2 Alginate
Algenalginate sind unverzweigte Copolymere, die sich aus dem Monomerbaustein β-D- Man-
nuronat und dessen C5- Epimer α-L- Guluronat zusammensetzen. Obwohl beide Uronsäuren
sich nur geringfügig hinsichtlich ihrer Struktur unterscheiden, nehmen sie unterschiedliche
Sesselkonformationen an, wodurch die Carboxylgruppe in der energetisch günstigen äquatori-
alen Orientierung vorliegt.
OOH OH
OHOH
COO-
O
OH
OH
OH
OH-OOC
Abb. 2.10: Monosaccharidische Grundbausteine des Alginats: D- Mannuronat (links) und L- Guluronat
(rechts)
Hieraus ergibt sich, dass die resultierenden glykosidischen Bindungen im Polysaccharid an
den C1- und C4- Positionen im Falle des β-D- Mannuronats äquatoriale und für α-L- Guluro-
nat axiale Orientierung aufweisen. Innerhalb eines Alginatmoleküls sind die Monomere in
einer Reihe von Blockstrukturen angeordnet, wobei sowohl homopolymere Blöcke [Poly- β-
D- Mannuronat (M- Block) und Poly- α-L- Guluronat (G- Block)], als auch alternierende
Sequenzen (MG- Blöcke) nebeneinander vorliegen [65]. Die Sequenzverteilung der struktur-
gebenden Monomereinheiten folgt bei Algenalginaten rein statistischen Gesetzmäßigkeiten.
Die physikalischen Eigenschaften des Makromoleküls werden maßgeblich durch die anteilige
Zusammensetzung der Monomeren, dem sogenannten M/G- Verhältnis, bestimmt. Aufgrund
der Natur der glycosidischen Bindung weisen mannuronatreichere Bereiche der Alginate eine
flexible Bänderstruktur auf, wohingegen guluronatreiche Bereiche starre Kettensegmente aus-
bilden.
Bakterienalginate sind im Allgemeinen spezifisch für die jeweilige Bakterienspezies [66] und
besitzen eine ähnliche Grundstruktur wie die Algenalginate, unterscheiden sich jedoch in
einigen Merkmalen. Hinsichtlich der Sequenz und der Häufigkeit bestimmter Blockstrukturen
im Polymeren weisen Alginate von Azotobacter vinelandii die größte Ähnlichkeit zu
Algenalginaten auf. Anders verhält es sich mit Alginaten unterschiedlicher Pseudomonas
21
Überblick
Spezies. Die von den Pseudomonaden isolierten Polyuronsäuren besitzen im Gegensatz zu
den Algenalginaten keine Polyguluronatblöcke. Eingehendere Strukturanalysen von
Abb. 2.11: Ausschnitt aus einem Alginatmolekül bakterieller Herkunft; R= -H, -COCH3
O
O
ROOR
OO
O
ROOR
O
OH
OH
ORO
RO
COO-
COO-
COO-COO-
M MMG
Alginatisolaten verschiedener Pseudomonas aeruginosa Stämme wiesen ferner darauf hin,
dass die Sequenzverteilung im Polymeren nicht statistischer Natur sind [67].
Weiterhin verfügen Alginate bakterieller Herkunft über Acetylgruppen, welche ausschließlich
an den O-2 oder O-3 Sauerstoffen der D-Mannuronatreste lokalisiert sind. Durch 1H- NMR
Messungen konnte nachgewiesen werden, dass partiell auch eine gleichzeitige Acetylierung
an beiden Positionen auftreten kann [68]. Die Acetylierung der Mannuronatreste führt zu
einer Erhöhung der Hydrophobizität dieser Monomerbausteine. Übertragen auf das gesamte
Makromolekül verringern sich die Wechselwirkungen zwischen Polymer und Wasser und die
Polymer - Polymer Wechselwirkungen nehmen zu. Dies hat zur Folge, dass ein vermindertes
Quellungsvermögen der acetylierten Alginate zu beobachten ist [69]. Eine weitere Konse-
quenz der Acetylierung stellt die gehemmte Tendenz zur Gelierung in Anwesenheit bivalenter
Kationen dar [70, 71].
Die Existenz bakterieller Alginate konnte erstmals durch Linker und Jones Mitte der 60er
Jahre an Pseudomonaden nachgewiesen werden [72, 73]. Die Biosynthese von Alginat (siehe
Abb. 2.11) in P. aeruginosa erfolgt ausgehend von Fructose-6- phosphat über den Entner-
Doudoroff Zyklus [74]. Fructose-6- phosphat wird enzymatisch über Mannose-6- phosphat,
Mannose-1- phosphat und GDP- Mannose in GDP- Mannuronsäure umgewandelt. Es folgt
die Polymerisation des monomeren Materials zu GDP- Polymannuronsäure, welche bei
P. aeruginosa durch die Gene alg8, alg44 und alg60 reguliert wird [75, 76]. Das Polymer
22
Überblick
O
COO
OH OHOO
COO
OH OHO
COO
OH OH O O
O
COO
OHOO
COO
OH OHO
COO
OH OH O OO
OCH3
O
COO
OHOOOH
O
COO
OH OH O OO
OCH3
COOOH
D-Fructose-6-phosphat
GDP-D-Mannuronsäure
(Polymerisation)
Mannuronan (β-1,4- Polymannuronsäure) (--M-M-M-M-M--)
M M M
Acetylierung an O-2 und/oder O-3
C-5 Epimerisierung
M M
G
weitere Epimerisierung (nichtacetylierter M- Reste) führt zu unterschiedlichen
Monomersequenzen:
...-M-M-M-M-M-G-M-M-M-... → ...-M-G-M-G-M-G-M-G-M-...
↓
...-M-G-G-G-G-G-G-G-G-M-...
Abb. 2.12: Grundzüge der Biosynthese bakterieller Alginate nach Christensen [77]
wird im nächsten Schritt partiell an der O-2 bzw. O-3 Position acetyliert [78, 79]. Gegen-
wärtigen Erkenntnissen zufolge wird angenommen, dass die Acetylierung des Polymannuro-
23
Überblick
nats den Grad der Epimerisierung [80] reguliert, bei der D-Mannuronsäure in L-Guluron-
säure umgewandelt wird. Die naszierenden Alginatmoleküle werden mit Hilfe des algE
Porenproteins über die äußere Zellmembran an die Umgebung abgegeben [81].
2.3.3 Wechselwirkungen bivalenter Kationen mit Alginat: Das "Egg-box" Modell
Alginate besitzen ein ausgezeichnetes Bindungsvermögen gegenüber Kationen und sind in der
Lage, in Gegenwart bivalenter Kationen, insbesondere dem Calciumion, feste Gele zu bilden.
Die Geleigenschaften der Alginate werden dabei maßgeblich von ihrer Molmasse, ihrer Kon-
zentration und dem M/G- Anteil innerhalb der Polysaccharidkette geprägt: guluronatreiche
Alginate bilden feste, aber brüchige Gele; mannuronatreiche Gele hingegen besitzen eine
geringere Gelstärke, sind aber wesentlich flexibler.
Grant et al. [4] zeigten anhand von CD- spektroskopischen Untersuchungen zur Wechsel-
wirkung von Alginaten mit Ca2+- Ionen, dass in Alginatgelen eine Bindung chelat-ähnlicher
Natur vorliegt, welche nahezu ausschließlich über die Guluronatblöcke des Alginats erfolgt.
Aufgrund der axial - axialen Anordnung der glykosidischen Bindung im Polyguluronat besitzt
die helicale Kettenstruktur eine günstige Zweifach- Symmetrie. Die so gefaltete Kettenstruk-
tur bildet die sogenannte "Egg-box", in welcher das bivalente Kation gebunden ist. Diese
Konformation (siehe Detailvergrößerung in Abb. 2.13) ermöglicht Wechselwirkungen zwi-
schen dem Kation und dem Carboxylat- Sauerstoff und dem O-5 eines Monomers sowie dem
glykosidischen Sauerstoff, dem O-2 und dem O-3 von dessen Nachbarn. Es besteht somit für
jedes Calciumion eine fünffache, chelat-ähnliche Koordination durch die Sauerstoffatome des
Polyguluronatblocks, wodurch eine stabile Komplexierung des Kations ermöglicht wird.
Die Ausbildung eines Gels ist ein vielschrittiger Prozess. In einer wässrigen Lösung von Al-
ginat liegen die Polymerketten als ungeordnete Knäuel nebeneinander vor. Bei Dotierung der
Lösung mit Ca2+- Ionen bilden sich zunächst "Egg-box"- Dimere, d.h. Calciumionen werden
zwischen zwei benachbarten Guluronatblöcken eingelagert. Mit zunehmender Ca2+- Dotie-
rung werden zunächst die Außenseiten der Dimere mit Kationen abgesättigt ("half egg-box"
24
Überblick
binding [82]). Erst im nächsten Schritt erfolgt die Assoziation weiterer Polyguluronatblöcke
an bereits vorhandene Dimere zu mehrschichtigen Netzwerkpunkten.
O
O
OH
OHO
O OO
O O
COO
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Abb. 2.13: Das "Egg-box" Modell für Calcium- Alginatgele nach Yalpani [83]; hellblaue Kettensegmente: Polyman-
nuronatblöcke; dunkelblaue Kettensegmente: Polyguluronatblöcke, rechts: Detailansicht der Koordination
eines Calciumions innerhalb einer "Egg-box"
Austauschexperimente mit monovalenten Kationen an Calciumalginatgelen bestätigen die
hohe Stabilität der kooperativen Bindung: ist die für die Dimerbildung notwendige Äquiva-
lentkonzentration zwischen Calciumionen und Guluronatblöcken erreicht, so findet kaum
noch ein Austausch statt.
25
Theoretische Grundlagen
3. Theoretische Grundlagen
3.1 Spin - Gitter Relaxation
3.1.1 Die Spin - Gitter Relaxation aus phänomenologischer Sicht
Betrachtet man ein einfaches Einspinsystem wie z.B. das Proton in Chloroform (CHCl3), und
legt ein äußeres Magnetfeld B0 an, so nimmt das magnetische Moment µ des Kerns (mit
I = ½) zwei Orientierungen an: parallel oder antiparallel zum äußeren Feld (Abb. 3.1).
0BzM
µ
x
y
z
Abb. 3.1: Darstellung der Spinverteilung im thermischen Gleichgewicht im Laborkoordinatensystem;
Die Summe der Kernspins µ ergibt den makroskopischen Magnetisierungsvektor zM , wel-
cher parallel zu 0B orientiert ist; Darstellung nach [84]
Der Energieinhalt und die Besetzung der jeweiligen Zustände sind dabei direkt proportional
zum äußeren Magnetfeld B0 und dem magnetischen Moment µ der Kerne. Es ergibt sich
daher für die Spinverteilung im thermischen Gleichgewicht:
26
Theoretische Grundlagen
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛−=⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛ ∆−=
TkB
TkE
NN
BB
02expexp µα
β (3.1)
kB = Boltzmann-Konstante = 1,3805 ⋅ 10-23 J K-1
T = absolute Temperatur [K]
Die Summe der magnetischen Momente wird dabei als makroskopische Magnetisierung M
bezeichnet, welche im Gleichgewicht parallel zur z- Achse des Laborkoordinatensystems ge-
richtet ist, da die Population des α- Niveaus gemäß der Boltzmann- Verteilung stärker besetzt
ist als die des β- Niveaus.
Bringt man das Spinsystem aus dem Gleichgewichtszustand (z.B. durch eine Sättigungspuls-
sequenz), dann gilt für den zeitlichen Verlauf der Magnetisierung in der z- Achse, Mz [85]:
zz MM
tM
−∝ 0d
d (3.2)
dMz/dt beschreibt die zeitliche Änderung von Mz und M0 - Mz stellt die Auslenkung aus der
Gleichgewichtslage dar. Durch Einführung einer Proportionalitätskonstante k lässt sich
(Gl. 3.2) umformen zu:
( zz MMk
tM
−= 0d
d ) (3.3)
und ∫ =−
tk∫MMM
z
z dd0
(3.4)
Zum Zeitpunkt t = 0, wenn die Probe im Zustand der Sättigung ist, ist ∆N = 0 und Mz = 0.
Nach dem Zeitintervall t wächst die Magnetisierung auf einen neuen Wert Mz an. Dadurch
ergeben sich folgende Integrationsgrenzen:
∫ =−
Mz t
z
z tkMM
M
0 00dd∫ (3.5)
27
Theoretische Grundlagen
Als Lösung dieser Gleichung erhält man:
10
0lnTt
MMM z
−=−
(3.6)
Durch Substitution von k durch T1-1, wobei T1 durch eine Dimension der Zeit ausgedrückt
wird, lässt sich obige Gleichung (Gl. 3.6) umformen zu:
( )e Ttz MM 1/
0 1 −−= (3.7)
Die Spin - Gitter Relaxationszeit T1 ist dabei ein Maß für die Geschwindigkeit, mit der die
Magnetisierung in der z- Achse wieder aufgebaut wird. Sie entspricht der Zeit, die das Spin-
system nach einem 90°- Puls benötigt, um (1-e-1) der ursprünglichen Magnetisierung Mz vor
dem Puls zu erreichen (s. Abb. 3.2). Da Mz sich asymptotisch dem Wert von M0 annähert,
betrachtet man die longitudinale Relaxation innerhalb der gegebenen Messgenauigkeit als
abgeschlossen, wenn sie auf 99% des Maximalwertes angewachsen ist. In den allgemein
üblichen Pulssequenzen wird daher 5 T1 als Relaxationsperiode eingehalten.
0 20 40 60 80 1000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Mz /
M0
t [s]
Abb. 3.2: Darstellung des Wachstums des makroskopischen Magnetisierungsvektors zM für ein Spin-
system mit T1 = 20 s. Die gestrichelte Linie entspricht der Anfangssteigung der Kurve und er-
reicht den Wert M0 zu einem Zeitpunkt der T1 entspricht. Zu diesem Zeitpunkt hat zM 63,2 %
des Maximalwertes erreicht.
28
Theoretische Grundlagen
3.1.2 Methoden zur Bestimmung der T1- Zeit
Eine der frühsten Methoden zur Bestimmung der Spin - Gitter Relaxationszeit T1 stellt das
sogenannte Inversion Recovery- Experiment dar. Nach dem πx'- Puls wird der Magnetisie-
rungsvektor M0 invertiert und weist somit in Richtung der (-z)- Achse (Abb.3.3). Nach dem
Zeitintervall τ wird ein x′2π - Puls auf das Spinsystem gegeben. Ist M0 zu diesem Zeitpunkt
z
y‘
x‘
180°
z
y‘
x‘
z
y‘
x‘
z
y‘
x‘
90°
90°
z
y‘
x‘
z
y‘
x‘
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
0,3 T1
1,0 T1
Abb. 3.3: Schema eines Inversion Recovery- Experiments: Zunächst wird der Magnetisierungsvektor (a)
durch einen 180°- Puls invertiert (b). Dann, nach einer Wartezeit (c) und (e), erfolgt ein 90°-
Puls und ein Signal wird empfangen. Ist der Vektor noch nicht bis zum Ursprung des Koordi-
natensystems relaxiert, so ist das Signal negativ (d); ist er hingegen über den Koordinatenur-
sprung hinausgewachsen, so erhält man ein positives Signal (f), nach Traficante [85]
immer noch negativ, dann ergibt sich für Mz nach Rotation in die (x,y)- Ebene und nach
Fouriertransformation ein negatives Signal. Ist andererseits die Wartezeit lang genug, dass Mz
über den Koordinatenursprung hinauswachsen konnte, so erhält man ein positives Signal. Ein
Sonderfall tritt dann ein, wenn τ = (ln2) T1 ist, denn zu diesem Zeitpunkt ist M0 gerade bis
zum Koordinatenrsprung relaxiert und es wird kein Signal detektiert.
29
Theoretische Grundlagen
In der Praxis der 13C- NMR- Spektroskopie entspricht die Pulsfolge eines Inversion Recovery-
Experiments der unten dargestellten Blockgrafik (Abb. 3.4). Auf dem X- Kanal (13C- Kanal)
wird zunächst ein 180°- Puls gegeben, der den Magnetisierungsvektor der 13C- Spins inver-
tiert. Nach einer variablen Wartezeit τ erfolgt der 90°x Detektionspuls und der FID wird auf-
gezeichnet. Während der Akquisition des FIDs wird auf dem 1H- Kanal gleichzeitig ein Ent-
kopplerpuls eingestrahlt, welcher die Kopplung zwischen Protonen und 13C-Kernen aufhebt.
90°180°
ττp
1H- Kanal
13C- Kanal
Abb. 3.4: Impulsfolge zur Bestimmung der Spin - Gitter Relaxationszeit T1 von 13C- Kernen nach der
Inversion - Recovery Methode mit Protonenentkopplung während der Akquisition: 180°x‘ - τ -
90°x‘ - FID (die Breite der Impulse ist nicht maßstabsgetreu auf der Zeitachse wiedergegeben);
τp = Pulslänge
3.2 Spin - Spin Relaxation
3.2.1 Die Spin - Spin Relaxation aus phänomenologischer Sicht
Die Spin - Spin oder auch transversale Relaxation lässt sich anschaulich über den Verlauf
eines 2π - Pulsexperimentes verdeutlichen, bei dem unmittelbar nach dem Puls nur die trans-
versale Magnetisierung My vorhanden ist (Abb. 3.5 a)), wobei alle Einzelspins in Phase mit
der Larmor- Frequenz in der x,y- Ebene rotieren, d.h. es herrscht Phasenkohärenz [85]. Nach
einem fortschreitenden Zeitintervall t (Abb. 3.5 b), c)) geht die Phasenbeziehung der einzel-
30
Theoretische Grundlagen
nen Spins verloren und das System dephasiert, wodurch My‘ kleiner und das in der Empfän-
gerspule induzierte Signal schwächer wird.
Die Ursache hierfür liegt zum einen an dem Einfluss von Feldinhomogenitäten, als auch zum
anderen an der Spin - Spin Relaxation. Feldinhomogenitäten stellen keinen Relaxationspro-
zess im engeren Sinne dar, da der Kohärenzverlust refokussierbar ist. Dennoch rufen Inhomo-
genitäten eine Abnahme des Magnetisierungsvektors in der x,y- Ebene hervor.
Wird der Magnetisierungsvektor zM in die x,y- Ebene gekippt, so erfahren die einzelnen
Vektorkomponenten µz aufgrund ihrer unterschiedlichen Positionen im inhomogenen Magnet-
feld verschiedene Feldstärken. Dadurch kommt es trotz gleicher Abschirmungskonstanten σ
aller Kerne zu einer Verteilung von Larmorfrequenzen, und das Spinsystem dephasiert.
x′
y′
z
0MMz =
yM ′
x′
y′
z
yM ′
x′
y′
z
yM ′
c) b)a)
t
Abb. 3.5: Darstellung der zeitlichen Abnahme der Quermagnetisierung My'; a) unmittelbar nach dem
2π
x'- Impuls liegt der maximale Wert der Quermagnetisierung vor; b) die Quermagnetisierung
My' nimmt bereits nach kurzer Zeit durch das Auffächern der gebündelt präzidierenden Spins
ab c) fortschreitende Dephasierung der Spins, nach [84]
Bei der Spin - Spin Relaxation T2 hingegen handelt es sich um einen Entropieprozess, bei dem
das Besetzungsverhältnis (Gl. 3.1) zwischen den Spinzuständen konstant bleibt. Kerne,
welche sich im angeregten Zustand befinden, relaxieren und geben ihre Energie an benachbar-
31
Theoretische Grundlagen
te, energieärmere Kerne ab, so dass ein Austausch von α- und β- Zuständen stattfindet. Der
relaxierte Kern kann wiederum Energie aufnehmen und in den β- Zustand zurückkehren. Da
dies einen spontanen Vorgang darstellt, ist es unwahrscheinlich, dass er mit derselben Phase
in den β- Zustand zurückkehrt. Die Isochromaten, welche ursprünglich phasenkohärent präzi-
dierten, verlieren aufgrund der statistischen Phasenübergänge ihre Phasenbeziehung und
fächern in der x,y- Ebene auf.
Die Quermagnetisierung Mxy nimmt dabei mit einer Rate ab, welche der Summe beider Ein-
zelprozesse entspricht [85]:
222
1'
11* TTT
+= (3.8)
mit: *
2
1T
= Gesamtrate des Kohärenzverlusts
'
12T
= Kohärenzverlust bedingt durch Feldinhomogenitäten
2
1T
= natürliche Relaxationsrate T2-1
Somit ist T2*, wie in Abb. 3.6 dargestellt, maßgebend für die exponentielle Abnahme des
FIDs.
0 2 4 6 8 10 12 140,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Mxy
/ M
0
t [s]
Abb. 3.6: Darstellung der Abnahme des Magnetisierungsvektors Mxy in der x,y- Ebene für ein Spin-
system mit T2 = 3 s. Die gestrichelte Linie entspricht der Anfangssteigung der Kurve und
schneidet die Zeitachse bei T2.
32
Theoretische Grundlagen
3.2.2 Methoden zur Bestimmung der T2- Zeit
Die gängigste Methode zur Bestimmung der Spin - Spin Relaxationszeit T2 ist die Carr-
Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) Modifikation [86] des klassischen Hahn-Echo- Experiments
[87]. Die Impulsfolge des CPMG - Experiments lautet:
90°x‘ - τ - 180°y‘ - τ (1. Echo) - τ - 180°y‘ - τ (2. Echo)...
Nachdem der 90°x‘- Puls gegeben wurde, nimmt die Mxy Magnetisierung aufgrund der T2*
Relaxation ab. Die Isochromaten dephasieren, da einige mit einer höheren Larmorfrequenz als
das rotierende Koordinatensystem um die z- Achse präzidieren, andere wiederum mit einer
niedrigeren Larmorfrequenz (Abb. 3.7 a)). Nach einer Wartezeit τ wird ein 180°- Puls in der
-y- Achse eingestrahlt und die Kernspins werden invertiert. Die Isochromaten behalten ihre
A
(b) (c) (a)
z z z
180°
x´x´x´
y´y´y´ - ∆ω
- ∆ω
+ ∆ω
+ ∆ω
bb. 3.7: Schema der Auswirkungen einer Carr-Purcell-Maiboom-Gill- Sequenz zur Bestimmung der
weiligen individuellen Larmorfrequenzen (± ∆ω) bei, jedoch laufen sie aufgrund der Inver-
Spin - Spin- Relaxationszeit T2; (a) unmittelbar nach dem 90°x` Puls beginnen die Isochroma-
ten zu dephasieren; (b) durch einen 180°y´ Puls werden die Isochromaten invertiert und begin-
nen zu refokussieren; (c) hat keine merkliche Diffusion der Kerne stattgefunden, so refokus-
sieren die Isochromaten vollständig zu einem Spinecho, Darstellung nach [84]
je
sion aufeinander zu statt voneinander weg (Abb. 3.7 b)), sie refokussieren. Bei der Refokus-
sierung nimmt die Magnetisierung Mxy stetig zu, bis zu einem Maximum, dem Spinecho,
welches in Form eines FID wieder abklingt. Eine Reihe von 180°y´- Pulsen liefert demzufolge
33
Theoretische Grundlagen
eine Reihe von Echos nach 2τ, 4τ, 6τ etc., welche zueinander um 180° phasenverschoben
sind. Die Echointensität nimmt mit jedem neuen Puls stetig ab, da die Isochromaten aufgrund
der natürlichen Relaxationszeit T2 dephasieren.
Abfall nach T2*
Abfall nach T2
1. Spinecho 2. Spinecho 3. Spinecho
Abb. 3.8: Schematische Darstellung eines CPMG- Spektrums in der Zeitdomäne: FID und drei Echos
Werden die aufgezeichneten FIDs eines jeden Echos fouriertransformiert, so ist die Intensität
I des Linienspektrums direkt proportional zur Größe von Mxy zum Zeitpunkt des Echos:
20ln)(ln
TtItI −= (3.9)
Trägt man ln I(t) gegen t auf, wobei I(t) die Echointensität zu den Zeiten t = 2τ, 4τ,... darstellt,
so ergibt sich hieraus eine Gerade mit der Steigung -1/T2.
3.3 Linienbreiten und Relaxation
Im Allgemeinen betrachtet man zwei benachbarte Signale als aufgelöst, wenn beide Reso-
nanzlinien deutlich voneinander separiert sind. In der NMR- Spektroskopie wird die Auf-
lösung eines Resonanzsignals durch die Linienbreite bei halber Signalamplitude, die soge-
nannte Halbwertsbreite b1/2 charakterisiert.
34
Theoretische Grundlagen
b1/2
Frequenz [Hz]
Abb. 3.9: gnal (Lorentzkurve)
lge ist die Linienverbreiterung der Resonanzlinien umso
rößer, je kürzer T1 und T2 sind [84]:
Darstellung der Halbwertsbreite an einem simulierten Resonanzsi
Die Halbwertsbreite einer Resonanzlinie wird maßgeblich durch die Spin - Gitter- sowie die
Spin - Spin- Relaxation bestimmt [84, 88]. Gemäß der Heisenbergschen Unschärferelation ist
die Energie eines Zustandes umso „schärfer“ definiert, je länger die Lebensdauer τ1 eines
Teilchens in diesem Energiezustand ist. Im Falle der NMR- Spektroskopie entspricht diese
Energiedifferenz δE dem Energieunterschied zwischen zwei benachbarten Energieniveaus
(bei Spinsystemen mit I = ½ ). Als Fo
g
πτδ
21
hE ≥⋅ (3.10)
urz (~ 10-5 µs) und somit allein ausschlaggebend für
ie Linienbreite der Resonanzsignale.
In Flüssigkeiten niedriger Viskosität sind die Relaxationszeiten T1 und T2 für Spinsysteme mit
I = ½ in derselben Größenordnung und recht lang. Demzufolge ergeben sich für Flüssig-
spektren sehr kleine Linienbreiten. In Festkörpern oder hochviskosen Flüssigkeiten hingegen
differieren Spin - Gitter- und Spin - Spin- Relaxationszeit stark voneinander. Die T1- Zeiten
solcher Systeme sind sehr lang und liegen im Bereich von einigen Minuten oder gar Stunden.
Im Gegensatz dazu sind die T2- Zeiten aufgrund der starken magnetischen Kopplungen be-
nachbarter Spins im Festkörper recht k
d
35
Theoretische Grundlagen
Die Linienform der Resonanzlinien lässt sich durch eine Lorentz-Funktion beschreiben. Die
Linienbreite b1/2 ergibt sich somit aus:
*2
2/11T
b⋅
=π
(3.11)
Über diese Beziehung lässt sich aus der experimentell ermittelten Halbwertsbreite eines
Signales die Spin - Spin Relaxation T2* bestimmen, welche weitgehend von dem Anteil der
Feldinhomogenitäten bestimmt wird.
Neben den Feldinhomogenitäten kann auch die Wechselwirkung mit Nachbarkernen zu einer
Linienverbreiterung führen. Darüber hinaus tragen paramagnetische Verunreinigungen wie
z.B. gelöster Sauerstoff, aufgrund der Verkürzung der Relaxationszeiten zu einer Ver-
breiterung der Resonanzlinien bei.
3.4 Dipolare Kopplung und Relaxation
Die dipolare Kopplung zwischen ungepaaren Elektronen und Kernspins erfolgt als eine
direkte Kopplung durch den Raum. In einem äußeren Magnetfeld, welches parallel zur z-
Achse verläuft, ist die Wechselwirkungsenergie E zwischen Elektron- und Kernspin gegeben
durch die McConnell-Robertson- Gleichung [89]:
( 1cos3 23 −Θ⋅⋅
= )r
E SzIz µµ (3.12)
wobei µIz und µSz die z- Komponenten der magnetischen Momente des Kerns bzw. Elektrons
sind. Der Winkel Θ ist gegeben durch den Vektor zwischen Kern und Elektron und dem
äußeren Magnetfeld B0 (Abb. 3.10). Die Wechselwirkungsenergie ist, wie aus (3.12) ersicht-
lich, stark abhängig von der Kern - Elektron Distanz r und nimmt mit der dritten Potenz ab.
Über chemische Verschiebung und der damit verbundenen Abstandsabhängigkeit der Funk-
tion kann somit die Koordination von paramagnetischen Ionen innerhalb von Komplexen be-
stimmt werden.
36
Theoretische Grundlagen
B0
Θ r
N
e
µSz
µIz
Abb. 3.10: Direkte Kopplung von Elektronen- und Kernspin; r repräsentiert den Spin – Spin Abstand und
Θ den Kontaktwinkel zwischen beiden Spins, nach [90]
Wie in den vorangegangenen Kapiteln dargestellt wurde, beruht die Relaxation von Kernen
mit einem magnetischen Moment (I ≠ 0) in einem Magnetfeld auf den Kopplungen mit dem
umgebenden Gitter, dessen magnetisches Feld aufgrund von Gitterbewegungen fluktuiert. Im
Allgemeinen ist die longitudinale Relaxation T1 abhängig von der Spindichtefunktion des
Kernspinübergangs bei der Frequenz ωI, und als solche proportional zu einer Funktion der
Gestalt τc / (1 + ωI2τc
2).
Betrachtet man ein I - S gekoppeltes Spinsystem so zeigt sich, dass in diesem Fall Kernspin-
übergänge nicht nur bei der Kernspin - Larmorfrequenz ωI stattfinden, sondern zusätzlich
auch noch Übergänge bei ωS + ωI und ωS - ωI, also denjenigen Frequenzen die aus der Wech-
selwirkung von Kern- und Elektronenspinniveaus resultieren. Somit setzt sich die Gesamt-
relaxationsrate T1-1 der Kernspins aus drei verschiedenen Termen zusammen: τc / (1 + ωI
2τc2),
τc / (1 + (ωS + ωI)2τc2) und τc / (1 + (ωS - ωI)2τc
2).
Wird die Relaxation eines Kernspins durch die Kopplung mit einem ungepaarten Elektron
moduliert, so ist zu unterscheiden, ob diese durch eine Wechselwirkung mit der longitudina-
len (T1e) oder der transversalen (T2e) Elektronenspinrelaxation hervorgerufen wird [90].
37
Theoretische Grundlagen
Die Zeitkonstante der Fluktuation des Magnetfeldes eines Elektrons in der z- Achse ist unab-
hängig von der Fluktuation in der x,y- Ebene. Solange diese jedoch Magnetfelder in der x,y-
Ebene des Kerns erzeugen, beeinflussen beide Fluktuationen die longitudinale Relaxation.
B0
e
N
Θ
B0 N
Θe
T1e-1
B0 B0
T2e-1
N Ne e
B0 B0
T2e-1
N N
e e
Mz Mz
Mx Mx
Mx Mx
A
B
C
Abb. 3.11: Kerne in der näheren Umgebung eines ungepaarten Elektrons erfahren fluktuierende Magnet-
felder in der x,y- Ebene; A: das elektronische Zusatzfeld Mz fluktuiert mit der Zeitkonstante
T1e, B u. C: Mx fluktuiert mit der Zeitkonstante T2e, Grafik nach Banci [90]
38
Theoretische Grundlagen
Fluktuationen in der z- Achse mit der Zeitkonstante T1e entfalten ihre stärkste Wirkung, wenn
der Vektor aus dem Metallion und dem Kern in einem Winkel Θ = 54°44‘ zum äußeren
Magnetfeld B0 steht (Abb. 3.11 A). Dadurch werden Übergänge mit der Frequenz ωI initiiert
und der entsprechende Kontaktterm erhält die Korrelationszeit T1e. Fluktuationen des Magnet-
felds des Elektrons in der xy- Ebene hingegen erfolgen mit T2e. Derartige Fluktuationen (s.
Abb. 3.11 B u. C) haben ihr Maximum in der x,y- Ebene bei Θ- Winkeln 0° und 90° und
rufen Übergänge bei ωI ± ωS hervor. Dementsprechend haben Terme mit ωS + ωI oder ωS - ωI
eine Korrelationszeit von T2e. Da ωS >> ωI, können diese Terme vereinfacht und zu einem
Ausdruck mit ωS als Übergangsfrequenz zusammengefasst werden.
39
Methoden
4. Methoden
4.1 Anzucht von Biofilmen
Ausgehend von einer Stammplatte mit Zellkulturen von Pseudomonas aeruginosa SG81
wurden Einzelkolonieausstriche auf Pseudomonas Isolierungs Agar (PIA) angelegt und 24 h
bei 36°C bebrütet.
Mit der Bakterienmasse der Einzelkolonien wurden 10 mL einer sterilen 0,14 mol ⋅ L-1 NaCl-
Lösung angeimpft so, dass eine schwach getrübte Suspension entsteht. Die Trübung der
Suspensionen entsprach dabei McFarland- Standard 2 ( ≈ 6 ⋅ 108 Zellen pro mL). Je 100 µL
der Suspension wurde auf PIA- Platten ausplattiert und anschließend im Brutschrank über 24
h bei 36°C bebrütet.
Die Anzucht von selektiv markierten Biofilmen erfolgte auf speziellen PIA- Platten, wobei
der PIA mit an der C-2 Position isotopenmarkiertem 13C- Glycerin (2 g ⋅ L-1) angesetzt wurde.
4.2 Isolierung der EPS
Mit Hilfe eines Metallspatels wurde der konfluente Bakterienrasen von ca. 20 Platten vorsich-
tig abgeerntet und in einem Gewichtsverhältnis von 1:16 in deionisiertem Wasser
resuspendiert. Die Suspension wurde daraufhin 30 min bei Raumtemperatur auf einem
Magnetrührer homogenisiert. Die Bakteriensuspensionen wurden im Anschluss 2h bei 10°C
und 40000 gn zentrifugiert, der Überstand dekantiert und durch einen Membranfilter aus
Celluloseacetat (0,2 µm Porenweite, Fa. Sartorius, Minisart) steril filtriert.
Zur Abtrennung niedermolekularer Verbindungen wurde die EPS- Lösung über Nacht bei 4°C
zweimal gegen 5 L entionisiertes Wasser dialysiert (Dialyseschlauch: regenerierte Cellulose,
Porenweite: 25 Å, Ausschlussvolumen: 12000 - 14000 g ⋅ mol-1, Fa. Serva, Visking dialysis
40
Methoden
tubing 20/32, Art.Nr. 44110.02). Die dialysierte EPS wurde im Anschluss daran für den späte-
ren Gebrauch lyophilisert.
4.3 Isolierung von bakteriellem Alginat
Der bakterielle Bewuchs von ca. 20 Agarplatten wurde vorsichtig geerntet und in 100 mL
einer sterilen 0,14 mol ⋅ L-1 Kochsalzlösung suspendiert [91]. Die homogenisierte Suspension
wurde anschließend in 2 Stufen zentrifugiert: zunächst für 1h bei 10°C und 20000 gn, dann
wurde der Überstand erneut für 2h bei 40000 gn zentrifugiert. Die resultierenden Überstände
wurden unter rühren langsam mit der dreifachen Menge eiskaltem, vergällten Ethanols (Roti-
sol, Fa. Roth) versetzt und 30 min in einem Eisbad gerührt. Der Niederschlag wurde über eine
Nutsche (Nutsche Nr. 3, Fa. Schott) filtriert und auf der Nutsche je zweimal mit kaltem
Rotisol und eiskaltem absoluten Ethanol (Fa. Merck) gewaschen. Die Trocknung der Präzipi-
tate erfolgte in einem Vakuum- Exsikkator über P2O5. Das getrocknete Rohpräzipitat wurde
in sterilem 50 mmol ⋅ L-1 Tris-HCl- Puffer, pH 7,2 in einer Konzentration von 5 mg ⋅ mL-1 re-
solvatisiert. Nach Zusatz von MgCl2 (Endkonzentration: 10 mmol ⋅ L-1), Desoxyribonuklease
I (Endkonzentration: 10 µg ⋅ mL-1) und Ribonuklease A (Endkonzentration: 10 µg ⋅ mL-1)
wurden die Ansätze 4h bei 36°C auf einem Rundschüttler inkubiert. Anschließend wurde der
Lösung Pronase E (Endkonzentration: 12 µg ⋅ mL-1) zugegeben und über Nacht bei 36°C
inkubiert. Danach wurden die Ansätze 30 min bei 40000 gn (4°C) zentrifugiert und die Über-
stände über Nacht zweimal gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Das Dialysat wurde wie
zuvor beschrieben mit eiskaltem Ethanol gefällt, das resultierende Präzipitat in wenig deioni-
siertem Wasser gelöst und lyophilisiert.
4.4 Isolierung der Alginat- Lyase
Als Vorkultur wurden 50 mL NBA- Medium in einem 250 mL Erlenmeyerkolben mit Kleb-
siella aerogenes type 25 angeimpft und für 22h bei 37°C auf dem Rundschüttler bei 180 Upm
41
Methoden
bebrütet [92]. Anschließend wurde die Zellzahl in der Neubauer- Zählkammer bestimmt. Die
Hauptkultur, bestehend aus 5 1 L Erlenmeyerkolben mit jeweils 400 mL NBA, wurde mit je
0,2 mL der Vorkultur angeimpft und gleichermaßen für 22h bei 37°C und 180 Upm kultiviert.
Zur Kontrolle wurde die Zellzahl bestimmt und per Einzelkolonieausstrich auf Kontami-
nationen überprüft.
Die Bakterien wurden durch Zentrifugation für 20 min bei 16000 gn sedimentiert und in 1/8
Volumen 50 mmol Phosphatpuffer, pH 7,0, mit 1 mmol EDTA resuspendiert. Nach Bestim-
mung des Basiswertes der Extinktion bei 580 nm wurden die Zellen per Ultraschall aufge-
schlossen. Die Beschallungsdauer betrug 6 ⋅ 30 sec bei 90 W, wobei der Extinktionswert auf
weniger als 10% des Ursprungswertes abgesunken war. Verbliebene intakte Zellen wurden
durch 10 min Zentrifugation bei 6000 gn entfernt. Schließlich wurde der Überstand 1h bei
40000 gn zentrifugiert, um die Zellhüllen zu entfernen.
Der erhaltene Zellextrakt wurde einer zweistufigen Ammoniumsulfatfällung unterzogen.
Zunächst wurde eine Fällung mit 50% Ammoniumsulfat (29,5 g Ammoniumsulfat auf 100
mL Zellextrakt) durchgeführt. Nach Aufbewahrung des Zellextrakts für 3h bei 4°C wurden
die mit dem Ammoniumsulfat gefällten Proteine durch 20 min Zentrifugation bei 15000 gn
entfernt. Im Überstand wurde die Ammoniumsulfat- Konzentration auf 90% erhöht (29,5 g /
100 mL hinzufügen) und der Ansatz wurde wiederum bei 4°C über Nacht gelagert. Das resul-
tierende Präzipitat wurde für 20 min bei 15000 gn abzentrifugiert. Der Überstand wurde ver-
worfen und das Sediment in 1/10 Volumen (ca. 25 mL) 50 mmol Phosphatpuffer (pH = 7,0)
aufgenommen. Die Lösung wurde über Nacht bei 4°C gegen Deionat dialysiert und bis zur
späteren Verwendung in Eppendorf- Tubes eingefroren.
4.5 Bestimmung des Einflusses von pH- Wert und Temperatur
4.5.1 Einfluss des pH- Wertes
Es wurden jeweils 30 mg lyophilisierter EPS in je 4 mL deionisierten Wassers resuspendiert,
so dass die Endkonzentration der Lösung 7,5 g ⋅ L-1 betrug. Im Falle der Messung im sauren
42
Methoden
Milieu wurde der pH- Wert des wässrigen Lösemittels zuvor durch Zugabe von 0,1 mol ⋅ L-1
HCl auf einen pH- Wert von 4,0 eingestellt. Bei den Messungen im alkalischen Bereich
wurde analog verfahren. Durch tropfenweisen Zusatz von 0,1 mol ⋅ L-1 NH3- Lösung konnte
der pH- Wert auf 11,0 reguliert werden.
4.5.2 Einfluss der Temperatur
Die temperaturabhängigen NMR- Messungen wurden an einer EPS- Lösung der Konzentrati-
on 7,5 g ⋅ L-1 durchgeführt. Die Temperatur der Probe wurde mittels direkt im Messkopf regu-
liert. Die Kalibration der Temperatur erfolgte nach Amman et al. [93] über die Bestimmung
der Frequenzverschiebung zwischen dem –CH3 und dem –OH 1H- Signal von Methanol.
4.6 Bestimmung des Einflusses mono- und bivalenter Ionen
Zur Bestimmung der Alginat-Gegenion Wechselwirkungen mit mono- und bivalenten Ionen
wurde eine EPS- Konzentration 7,5 g ⋅ L-1 zugrundegelegt. Die gefriergetrocknete EPS wurde
dabei vorgelegt und in den Lösungen der jeweiligen Chloride (NaCl, MgCl2, CaCl2, MnCl2)
resuspendiert. Um insbesondere bei den bivalenten Ionen die Homogenität der Sol/Gel-
Systeme zu gewährleisten, wurden die EPS-Me+- bzw. EPS-Me2+- Lösungen 24h auf einem
Magnetrührer gerührt.
4.7 Bestimmung des Einflusses trivalenter Ionen
Der Einfluss von Aluminiumionen wurde bei zwei unterschiedlichen pH- Werten bestimmt.
Hierzu wurde Al(NO3)3 Salz der jeweiligen Konzentration entsprechend in einem Volumen
von 500 mL gelöst, der pH-Wert mittels 0,1 molarer HCl bzw. NaOH eingestellt und mit
43
Methoden
einem pH- Meter kontrolliert. Anschließend wurde die EPS in 4 mL der entsprechenden Al3+-
Lösungen gelöst.
4.8 Stressreaktionen von Biofilmen 13C- markierter Biofilm wurde in ein 10mm- Probenröhrchen überführt und hermetisch
verlossen. Der so von Nährstoffen und Sauerstoff abgeschlossene Biofilm wurde bei Raum-
temperatur aufbewahrt und nach 1, 2, 14, 20, 25, 27, 30 und 150 Tagen spektroskopisch ver-
messen. Nach der letzten Messung wurde zur Kontrolle ein Einzelkolonieausstrich vorge-
nommen, um den Zustand der Bakterien zu verifizieren. Anschließend wurde die Biofilm-
probe mit 100 µL Alginatlyase von Klebsiella aerogenes versetzt und 2h bei 36°C gelagert
und vermessen.
44
Ergebnisse
5. Ergebnisse
5.1 Messungen am unmarkierten Biofilm und seinen Komponenten
Die organische Matrix von Biofilmen stellt ein komplexes Gemisch unterschiedlichster
Komponenten dar, zu deren makromolekularen Bestandteilen man im Allgemeinen Poly-
saccharide, Lipopolysaccharide, Proteine und Nukleinsäuren zählt. Von der vorliegenden
Bakterienspezies Pseudomonas aeruginosa SG81 ist bekannt, dass sie unter den vorge-
gebenen Anzuchtbedingungen Alginat, Proteine und andere extrazelluläre Polymere an ihre
Umgebung - die resultierende Biofilmmatrix - abgibt.
5.1.1 Nativer Biofilm von Pseudomonas aeruginosa SG81
Charakteristisch für die 13C-NMR Spektren des unter den gegebenen Bedingungen erhaltenen
nativen Biofilms sind die scharfen Resonanzlinien von Glycerin (C1, C3: 64,2 ppm; C2: 73,6
ppm), welches als Kohlenstoffquelle für die Alginatsynthese dient und durch Diffusion aus
dem Nähragar in den Biofilmrasen gelangt. Die Abb. 5.1 zeigt das statische 13C- Linien-
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
(ppm)
Abb. 5.1: 13C {1H}-NMR Spektrum (statisch) eines nativen Biofilms von P. aeruginosa SG81
45
Ergebnisse
spektrum, welches bei Direktanregung unter Protonenentkopplung aufgezeichnet wurde. Ab-
gesehen von den Resonanzen des Glycerins weisen alle übrigen Signale ein ausgesprochen
schlechtes Signal/Rausch- Verhältnis auf. Das breite Signal bei 175,4 ppm deutet auf die
Gegenwart von Carbonylkohlenstoffen hin und wurde den C6- Carboxylkohlenstoffen der
Polyuronate zugeordnet. Darüber hinaus erscheinen im Frequenzbereich von 15 - 50 ppm
einige schwache Resonanzlinien, die von Methylen- (-CH2-) und Methin- (-CH-) Kohlen-
stoffen herrühren. Eine nähere Zuordnung dieser Resonanzlinien ist jedoch aufgrund der ge-
ringen Signalintensitäten nicht möglich.
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
(ppm)
Abb. 5.2: 13C- CP - NMR Spektrum (statisch) eines nativen Biofilms von P. aeruginosa SG81
Unter Kreuzpolarisation (Abb. 5.2) erhält man ein Resonanzspektrum, bei dem ein Ensemble
von Hydroxylkohlenstoffresonanzen (-HCOH-) im Bereich zwischen 60 - 80 ppm neben dem
Glycerinsignal zu beobachten ist. Die Resonanzen in diesem Spektralbereich unterscheiden
sich z.T. signifikant in ihrer spektralen Breite: überwiegend beträgt die Halbwertsbreite
zwischen 45 und 60 Hz, bei dem einzelnen Signal bei 77,3 ppm hingegen sind es 200 Hz.
46
Ergebnisse
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
Abb. 5.3: 13C- CP- NMR Spektrum eines nativen Biofilms von P. aeruginosa SG81; Ausschnittsver-
größerung der Hydroxylkohlenstoffresonanzen; "wiggles" im Spektrum deuten darauf hin, dass
die Akquisitionszeit zu kurz gewählt worden ist, um den freien Induktionszerfall des Gly-
cerinanteils vollständig aufzuzeichnen.
In der Ausschnittsvergrößerung des Hydroxylgruppenbereichs (Abb. 5.3) wird deutlich, dass
sich die Signale stark von dem Flüssigkeitsspektrum des Glycerins unterscheiden, jedoch
wiederum nicht die typischen Charakteristika eines Festkörperspektrums aufweisen. Die
Linienbreiten erscheinen wesentlich geringer, als man es von statischen NMR- Messungen
eines Festkörpers erwarten würde.
5.1.2 Bakterielles Alginat
Die Charakterisierung des Alginats als eine der Hauptkomponenten des Biofilms, ist von
essenzieller Bedeutung für das Verständnis des Aufbaus der Biofilmmatrix. Die Isolierung
bakteriellen Alginats aus der EPS von Laborkulturen ist bereits in Kapitel 4 (s. 4.3) beschrie-
ben worden. Das so gewonnene Polysaccharid weist eine relativ geringe Löslichkeit (ca. 1,5
Gew.-%) im wässrigen Lösemittel bei Raumtemperatur auf, so dass eine NMR- spektro-
skopische Untersuchung direkt am unmarkierten Isolat aufgrund experimenteller Rahmen-
bedingungen nicht durchführbar ist.
47
Ergebnisse
Dennoch ist es möglich, eine eingehende Struktur- und Sequenzbestimmung am Alginat vor-
zunehmen. Anfang der 80er Jahre wurde von Grasdalen et al. [94] ein Verfahren vorgestellt,
bei dem die Löslichkeit von Alginaten durch partielle saure Hydrolyse [95, 96, 97] zu Poly-
merketten niedrigen Polymerisationsgrades erhöht wird. Die so abgebauten Kettenfragmente
können leicht spektroskopisch untersucht werden und erlauben nicht nur eine Zuordnung der
Resonanzen zu einzelnen Ringkohlenstoffen, sondern sogar eine Sequenzierung aufgrund der
unterschiedlichen chemischen Verschiebung durch Nachbargruppeneffekte. Diese Methodik
wurde von Schürks [67] aufgegriffen und für die bakteriellen Alginate entsprechend modifi-
ziert.
Das Flüssigkeits- NMR Spektrum des hydrolysierten Alginats (Abb. 5.4) weist erwartungs-
gemäß dieselben typischen Resonanzlinien auf, wie sie zuvor in den Biofilmspektren beob-
achtet werden konnten. Die hohe Auflösung der einzelnen Resonanzlinien erlaubt jedoch in
diesem Falle nicht nur die Zuordung der C6- Ringkohlenstoffatome zu den jeweiligen Mannu-
ronat- (M bzw. Man) oder Guluronatmonomerbausteinen (G bzw. Gul), sondern darüber
200 150 100 50 0
(ppm)
Abb. 5.4: 13C {1H}-NMR Spektrum von partiell abgebautem und deacetyliertem Alginat von P. aerugi-
nosa SG81 bei T = 333 K; Carbonylkohlenstoffe: 178,1 ppm; anomerer Kohlenstoff: 104,3 -
102,6 ppm; Hydroxylgruppenkohlenstoffe: 83,0 - 67,9 ppm; THF (interner Standard): 27,9
ppm
48
Ergebnisse
hinaus auch aufgrund der von Nachbargruppeneffekten leicht unterschiedlichen chemischen
Verschiebungen eine eingehende Sequenzierung (Abb. 5.6). Einzelne Resonanzlinien können
bestimmten Triadensequenzen zugewiesen und somit Aussagen über den statistischen Aufbau
des Alginats getroffen werden.
106 104 102 100 98 96
(ppm)
C1 (red.Endgr.)
C1-ManC1-Gul
Abb. 5.5: Ausschnittsvergrößerung des Bereichs der anomeren Kohlenstoffatome
84 82 80 78 76 74 72 70 68 66
(ppm)
G-5
G-4 G-3
M-4
M-5
G-2
M-2 M-
3
Abb. 5.6: Ausschnittsvergrößerung des Resonanzbereichs der Hydroxylgruppenkohlenstoffe
49
Ergebnisse
Die Abbildung 5.5 zeigt den Verschiebungsbereich der anomeren Kohlenstoffe. In dem
Spektrum lassen sich deutlich die Resonanzlinien der C1- Kohlenstoffe der Mannuronat-
bausteine (103,1 ppm u. 104,1 ppm) von denen der Guluronatreste (103,2 ppm u. 104,3 ppm)
unterscheiden. Aus den Signalintensitäten beider Resonanzen lässt sich die relative Häufigkeit
der Monomerbausteine im Polysaccharid (M/G- Verhältnis) bestimmen. Das M/G- Verhält-
nis, welches anhand des vorliegenden Spektrums bestimmt wurde, beläuft sich auf einen
Mannuronatanteil von 76% bzw. einem Guluronatanteil von 24%. Weiterhin geben die Reso-
nanzlinien der reduzierten Endgruppen bei 67,5 ppm Aufschluss über den Grad des Abbaus,
wobei angemerkt werden muss, dass diesbezüglich nur grobe Abschätzungen möglich sind.
Bei der von Schürks [67] durchgeführten milden, sauren Hydrolyse weisen die resultierenden
Alginatfragmente einen Polymerisationsgrad von 30 - 40 auf.
75.0 74.5 74.0 73.5 73.0 72.5 72.0 71.5 71.0
(ppm)
MMM-3
GMG
M-3
GMG
M-2
GMMM-2
MGM
MMMM-2
G-3
Abb. 5.7: Zuordnung der 13C- Signale der M-2, M-3 und G-3 Ringkohlenstoffe zu einzelnen
Triadensequenzen
Wie dem obigen Spektrenausschnitt (Abb. 5.6) zu entnehmen ist, stellt der Resonanzbereich
der Hydroxylgruppenkohlenstoffe den linienreichsten Teil des NMR- Spektrums eines Algi-
nats dar. Im Spektrum des intakten Biofilms (Abb. 5.3) können diese Signale nicht aufgelöst
werden und lediglich die intensivsten Resonanzlinien (M-5 u. G-5) lassen sich mit Gewissheit
zuordnen. Im Falle des hydrolysierten Alginats hingegen ist eine detaillierte Charakterisie-
rung der Signale möglich (Abb. 5.7). Die Mehrzahl der Resonanzen in dem Spektrum ist stark
50
Ergebnisse
aufgespalten, insbesondere tritt dies im spektralen Bereich der M-2, M-3 und G-3 Signale
(75 - 71 ppm) auf, was darauf hindeutet, dass sich Nachbargruppeneffekte am stärksten auf
die C-2 und C-3 Ringkohlenstoffe (Abb. 5.7) auswirken. Die Zuweisung bestimmter Triaden-
sequenzen zu den jeweiligen Resonanzsignalen erfolgte entsprechend der von Grasdalen et
al. [94] vorgenommenen Einteilung.
In Analogie zu dem zuvor untersuchten Biofilmspektrum weist auch im Flüssigspektrum das
Signal des C-5 Kohlenstoffs der Mannuronatbausteine im partiell abgebauten Alginat eine
ungewöhnlich hohe Halbwertsbreite von 21 Hz auf, wodurch es sich grundsätzlich von den
anderen Resonanzsignalen (5 - 8 Hz) des Spektrums unterscheidet.
51
Ergebnisse
5.2 Messungen an 13C- angereichertem Biofilm und seinen Komponenten
5.2.1 Natürlicher Biofilm von Pseudomonas aeruginosa SG81
Die 13C- Anreicherung nativen Biofilms mittels Zusatz von an der C2- Position markierten
200 150 100 50 0
(ppm)
c
d
ba
Abb. 5.8: 13C {1H}- NMR Spektrum (statisch) eines 13C- angereicherten Biofilms von P. aeruginosa
SG81; a) Carbonylkohlenstoffe b) anomere Kohlenstoffe c) Hydroxylgruppenkohlenstoffe d)
Methylen- u. Methinkohlenstoffresonanzen
Glycerins führt zu einer deutlichen Verbesserung des S/N- Verhältnisses des Spektrums. Wie
in Abb. 5.8 zu sehen ist, wirkt sich die Markierung ausschließlich auf die Signalamplituden
der Hydroxylkohlenstoffresonanzen (c) aus, die Resonanzlinien der übrigen Kohlenstoffe
(a, b, d) weisen hingegen vergleichbare Signalintensitäten auf, wie im unmarkierten Biofilm
(Abb. 5.1).
52
Ergebnisse
In der Ausschnittsvergrößerung des Spektralbereichs zeigt sich die hohe Linienbreite der
Resonanzsignale im Festkörperspektrum des Biofilms. So lässt sich der spektrale Bereich der
Hydroxylgruppenresonanzen grob in drei Teilabschnitte unterteilen: das verbreiterte, isolierte
Signal des C-5 Ringkohlenstoffs der Mannuronatbausteine bei 77,3 ppm (M-5), einen
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
G-5
G-2
M-3, M-2M-5
Abb. 5.9: Ausschnittsvergrößerung des Resonanzbereichs der Hydroxylgruppenkohlenstoffe eines 13C-
angereicherten Biofilms von P. aeruginosa
Bereich von sich eng überschneidenden Resonanzlinien zwischen 73,5 - 69,0 ppm (M-3, M-2,
G-5) und zwei isolierte, aber einander überlappende Signale (G-2) bei 66,3 bzw. 65,3 ppm.
Die Übereinstimmungen zu dem Kreuzpolarisationsspektrum des natürlichen Biofilms (Abb.
5.3) sind am deutlichsten bei den separierten Resonanzlinien (77,3 ppm, 66,3 ppm) zu
erkennen (Abb. 5.9). Bei den anderen Kohlenstoffresonanzen im Frequenzbereich von 73,5 -
69,0 ppm hingegen kommt es zu einer Verlagerung der Intensitätsverhältnisse aufgrund der
spezifischen 13C- Markierung. Darüber hinaus erweist sich hier die Auflösung einzelner
Resonanzsignale als unzureichend, was eine zufriedenstellende Dekonvolution dieses
Spektralbereichs erschwert.
Untersuchungen zur Spin - Gitter Relaxation des Alginats im Biofilm können aufgrund der
oben beschriebenen Probleme bei der Dekonvolution lediglich an den C-5 Resonanzlinien
beider Monomerbausteine durchgeführt werden. Die T1- Zeiten beider Monomere unter-
53
Ergebnisse
scheiden sich merklich voneinander und liegen bei 0,313 s für die Mannuronat- und bei
0,262 s für die Guluronatreste.
5.2.2 Extrazelluläre polymere Substanzen (EPS)
Wenn man sich ausgehend von den naturbelassen Biofilmen den Isolaten zuwendet, dann
stellt die bakterienfreie, dialysierte EPS die erste Aufarbeitungsstufe dar (s. Kapitel 4.2). Die
aus dem Überstand gewonnenen extrazellulären polymeren Substanzen beinhalten sämtliche
makromolekularen Bestandteile der Biofilmmatrix bis zu einer Ausschlussgröße von 12 kDa.
Um die Langzeitbeständigkeit des Probenmaterials zu gewährleisten, wird die EPS
lyophilisiert und trocken gelagert. Für die jeweiligen Messungen wird das gefriergetrocknete
Material in deionisiertem Wasser resuspendiert und auf eine EPS - Konzentration von 7,5 g/L
eingestellt.
200 150 100 50 0
(ppm)
Abb. 5.10: 13C {1H}-NMR Spektrum (statisch) einer wässrigen, 13C- angereicherten Lösung (7,5 g/L) von
EPS
54
Ergebnisse
Das Linienspektrum der EPS- Lösung (Abb. 5.10) gleicht im Wesentlichen dem des markier-
ten Biofilms. Dennoch lassen sich einige markante Unterschiede zum vorangegangenen
Spektrum feststellen. Insbesondere im Bereich der Methylen- und Methinresonanzen (15 - 25
ppm) zeigt das 13C- Spektrum der EPS lediglich ein einziges, schwaches Resonanzsignal bei
22,1 ppm, welches dem CH3- Kohlenstoff der Acetylgruppen des Alginats zugeordnet wurde.
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
Abb. 5.11: Resonanzbereich der Hydroxylgruppenkohlenstoffe einer wässrigen EPS - Lösung (7,5 g/L)
Die Resonanzsignale der Hydroxylgruppen sind in den Spektren von Biofilm und EPS nahezu
identisch. Sie differieren lediglich geringfügig in ihrer Auflösung bzw. in der Halbwertsbreite
der Signale. So beträgt die Halbwertsbreite der C-5 Man Resonanz in der EPS- Lösung ledig-
lich 164,5 Hz gegenüber 191,9 Hz im nativen Biofilm. Es ist hierbei anzumerken, dass der
Biofilmrasen von Natur aus eine höhere Viskosität aufweist als die EPS- Lösung und Viskosi-
tätsunterschiede der Proben merklich die spektrale Linienbreite beeinflussen.
5.2.3 Bakterielles Alginat
Die letzte Aufarbeitungsstufe des Biofilms stellt die Separation des Alginats von Proteinen
und Nukleinsäuren dar. Um eine Vergleichbarkeit der Proben zu gewährleisten, wird die
Alginatkonzentration der zu untersuchenden Lösungen so eingestellt, dass sie in etwa der
Viskosität der EPS- Lösung entspricht (10 g/L).
55
Ergebnisse
Differenzen zwischen dem NMR- Spektrum des Alginats (Abb. 5.12) und den Spektren des
Biofilms bzw. der EPS zeigen sich lediglich im Bereich der Hydroxylgruppenresonanzen. In
der Auschnittsvergrößerung sind zwei schwache Resonanzsignale bei 63,2 und 61,3 ppm er-
kennbar, welche zuvor nicht beobachtet wurden. Eine Charakterisierung dieser neuen Reso-
nanzlinien war nicht möglich. Es ist unklar, ob die Signale allein ein Phänomen der Aufkon-
zentration der Probe sind oder auf sekundäre Reaktionen während des Proteinabbaus zurück-
geführt werden können. Wie sich im Verlauf der Arbeit herausgestellt hat, ist bei der Isolie-
rung des Alginats z.T. eine Kontamination durch Fungi- Sporen aufgetreten, welche über die
Pronase E in die Probe gelangen konnten. In der weiteren Probenaufarbeitung kann dies zu
einem partiellen Abbau des Alginats und zur Bildung von Sekundärprodukten seitens der
Pilzkulturen geführt haben.
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
**
Abb. 5.12: Resonanzbereich der Hydroxylgruppenkohlenstoffe einer wässrigen Alginat- Lösung (10,0
g/L); *: nicht identifizierte Kohlenstoffresonanzen
In den weiterführenden Untersuchungen wurde weitestgehend auf die Verwendung von
isoliertem Bakterienalginat verzichtet, da der präparative Aufwand zur Gewinnung dieses
Isolats groß ist und es nur bedingt die Wechselwirkungen innerhalb eines realen Biofilms
widerzuspiegeln vermag.
56
Ergebnisse
5.3 Einfluss von pH- Wert und Temperatur
5.3.1 Einfluss des pH- Wertes
Das Milieu der wässrigen Umgebung hat einen entscheidenden Einfluss auf die Struktur der
Makromoleküle. Bei Polyelektrolyten wie dem Alginat wird die räumliche Struktur der
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
155,9 Hz
146,3 Hz
142,2 Hz
c)
b)
a)
Abb. 5.13: 13C {1H}-NMR Spektren (statisch) einer EPS- Lösung bei unterschiedlichen pH- Werten:
a) pH = 4,0; b) pH = 7,0; c) pH = 11,0
57
Ergebnisse
Moleküle u.a. von den elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den geladenen funktio-
nellen Gruppen bestimmt. Der Dissoziationsgrad der Carboxylgruppen nimmt damit einen
wesentlichen Einfluss darauf, inwieweit die elektrostatischen Abstoßungskräfte der Ver-
knäuelung des Makromoleküls entgegenwirken oder sie begünstigen.
Die NMR- Spektren der EPS- Lösungen (Abb. 5.13) spiegeln den Einfluss des pH- Wertes
wider. Differieren die ersten beiden Spektren (a, b) nur unmerklich in der Linienbreite des
C-5 Mannuronatsignals, so wird der Unterschied zu dem Spektrum bei hohem pH- Wert deut-
licher. Die Halbwertsbreite nimmt dabei von 146,2 Hz im Neutralbereich auf 155,9 Hz im
basischen Milieu zu.
b) a)
Abb. 5.14: 5×5 µm Ausschnitte einer AFM- Aufnahme von einer getrockneten EPS- Lösung auf Mica (Auf-
sicht); a) pH = 4,0;b) pH = 11,0; University of Portsmouth
Noch eindrucksvoller lässt sich der Effekt des pH- Wertes anhand von AFM- Messungen
veranschaulichen. Bei den obigen Aufnahmen handelt es sich jeweils um stark verdünnte
EPS- Lösungen, deren pH- Wert vor der Trocknung mit HCl bzw. NH3 eingestellt wurde.
Wie leicht zu erkennen ist, weisen die EPS - Proben vollkommen unterschiedliche Charakte-
ristika in den AFM- Aufnahmen auf. Probe a), welche bei niedrigem pH eingedampft wurde,
zeigt flache, in erster Näherung kreisförmige Strukturen. Die Größenordnung dieser Objekte
58
Ergebnisse
(∅: 0,58 µm Höhe: 50 nm) legt nahe, dass es sich hierbei z.T. um Aggregate zweier oder
dreier Alginatmoleküle handeln könnte.
Erhöht man den pH- Wert der EPS- Lösung, so ändert sich das Erscheinungsbild der Probe
merklich. Anstelle der scheibenförmigen Aggregate sind verknäuelte Kettenstrukturen getre-
ten (Höhe: 13 nm), bei denen deutlich einzelne Molekülstränge erkennbar sind. Dies entsprä-
che somit einer Abnahme der Dichte der Alginatknäuel in Abhängigkeit von der Anzahl der
deprotonierten Carboxylatgruppen.
59
Ergebnisse
5.3.2 Einfluss der Temperatur
Der Temperaturbereich, welcher im Rahmen der Messungen zur Verfügung stand, ist sowohl
durch die physikalischen Eigenschaften des Lösemittels als auch durch die Temperatur-
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
f)
e)
d)
c)
b)
a)
Abb. 5.15: 13C {1H}- NMR Spektren einer wässrigen EPS - Lösung (7,5 g/L) in Abhängigkeit von der Tem-
peratur: a) 280 K b) 290 K c) 300 K d) 310 K e) 320 K f) 330 K
beständigkeit einzelner Komponenten der EPS begrenzt. Die untersuchte Maximaltemperatur
beträgt daher 330 K. Von einer weiteren Temperaturerhöhung über diesen Wert hinaus wurde
abgesehen, da oberhalb von 330 K eine Denaturierung der in der Probe enthaltenen Proteine
nicht ausgeschlossen werden kann.
60
Ergebnisse
Tab. 5.1: Temperaturabhängige Änderung der Halbwertsbreite [Hz] der C-5 Man u. Gul Resonanzlinien
T [K] 280 290 300 310 320 330 C-5 Man 189,6 164,8 155,1 144,6 131,2 125,3
C-5 Gul 90,0 80,4 75,5 74,7 72,5 67,0
Die 13C- NMR Spektren der EPS- Temperaturreihe weisen deutlich erkennbar eine Verringe-
rung der Halbwertsbreite aller Resonanzsignale mit steigender Temperatur (s. Tab.5.1) auf.
Um diesen Effekt quantitativ erfassen zu können, wurden die C-5 Kohlenstoffsignale der
280 290 300 310 320 330120
130
140
150
160
170
180
190 C-5 Man
Lini
enbr
eite
hH [H
z]
T [K]
Abb. 5.16: Darstellung der Veränderung der Linienbreite des C-5 Man Resonanzsignals in Abhängigkeit
von der Temperatur
Mannuronat- bzw. Guluronateinheiten als Bezugspunkte gewählt. Die Abnahme der Linien-
breite folgt in erster Näherung einer Exponentialfunktion der allgemeinen Form L = A ⋅ e-b(T)
(s. Abb. 5.16 u. Abb. 5.17) und steht somit in direktem Zusammenhang mit der Viskositäts-
abnahme, welche ebenfalls einer Exponentialfunktion folgt [98].
61
Ergebnisse
280 290 300 310 320 33065
70
75
80
85
90 C-5 Gul
Lini
enbr
eite
hH [H
z]
T [K]
Abb. 5.17: Darstellung der Veränderung der Linienbreite des C-5 Gul Resonanzsignals in Abhängigkeit
von der Temperatur
Die Untersuchungen zur Temperaturabhängigkeit der longitudinalen Relaxation T1 zeigen
lediglich schwache Tendenzen auf.
62
Ergebnisse
5.4 Einfluss monovalenter Kationen
5.4.1 Extrazelluläre polymere Substanzen (EPS)
Variiert man die Ionenstärke einer EPS - Lösung durch Zugabe monovalenter Ionen wie Li+,
so hat dies erkennbare Auswirkungen auf die Probeneigenschaften. Bereits geringfügige Zu-
gaben von LiCl führen zu einer erheblichen Reduzierung der apparenten Viskosität der jewei-
ligen Lösung, was in Einklang mit den von Moritz [99] durchgeführten Messungen an EPS
und Modellsystemen (PVA, PAS) steht. Anhand der Grafik (Abb. 5.4.1) wird deutlich,
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 225
15
I [ mol · kg-1Lsg. ]
25
35
45
55
65
75
85 PVAPASEPS
ηapp. [ m
Pa · s ]
Abb. 5.18: Abhängigkeit der apparenten Viskosität ηapp einer 3,6%igen PVA, einer 20,2%igen PAS und
einer EPS- Lösung von der LiCl- Ionenstärke [99]
dass der wesentliche Abfall der Viskosität im Konzentrationsbereich zwischen 0,01 und 0,1
mol ⋅ L-1 LiCl auftritt. Eine weitere Erhöhung der Ionenstärke über diese Konzentration
hinaus hat bis 6,0 mol ⋅ kg-1 keine merklichen Auswirkungen auf die apparente Viskosität der
EPS- Lösung.
Spektroskopische Untersuchungen der Linienbreite (Abb. 5.19) weisen Parallelen zu den von
Moritz [99] gemachten Beobachtungen auf. Die hier angegebenen Halbwertsbreiten beziehen
sich auf die C-5 Mannuronatresonanzlinie, deren Linienbreite als Referenz dient. Es ist eine
deutliche Tendenz bei den Ionenkonzentrationen zwischen 0 und 1,0 mol ⋅ L-1 zu verzeichnen.
63
Ergebnisse
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
i)
h)
g)
f)
e) j)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
d)
c)
b)
a)
Abb. 5.19: 13C {1H}-NMR Spektren der Hydroxylgruppen in einer wässrigen EPS - Lösung(7,5 g/L) in
Abhängigkeit von der Li+- Konzentration: a) ohne Zusatz von Li+- Ionen b) 0,01 mol/L Li+
c) 0,02 mol/L Li+ d) 0,05 mol/L Li+ e) 0,1 mol/L Li+ f) 0,5 mol/L Li+ g) 1,0 mol/L Li+ h) 1,5
mol/L Li+ i) 2,0 mol/L Li+ j) 2,5 mol/L Li+
64
Ergebnisse
Die normalisierte Linienbreite, d.h. der Quotient aus beobachteter Linienbreite und der
Linienbreite der EPS- Lösung ohne Zusatz von ionischen Additiven, fällt mit zunehmender
Ionenstärke der Lösung bis auf ein Minimum von 0,94 ab (s. Abb. 5.20). Bei Li+ - Konzentra-
tionen jenseits von 1,0 mol ⋅ L-1 ist ein Anstieg der Halbwertsbreite des C-5 Mannuronat
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,50,90
0,95
1,00
1,05
1,10
rela
tive
spek
tral
e Li
nien
brei
te
c (LiCl) [mol/L]
Abb. 5.20: Einfluss der Li+ - Ionenkonzentration auf die relative spektrale Linienbreite des C-5 Man
Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,50,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
T 1 [s]
c (LiCl) [mol/L]
Abb. 5.21: Einfluss der Li+ - Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit T1 des C-5 Man
Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)
65
Ergebnisse
signals bis auf 0,99 zu verzeichnen. Es ist anzumerken, dass die Variation der Linienbreite im
Falle der EPS- Lösungen weitaus schwächer ausgeprägt ist, als es bei reinen Alginatlösungen
der Fall ist. Dennoch werden leichte Trends, d.h. das Durchlaufen eines Minimums und der
graduelle Anstieg der relativen Linienbreite des Referenzsignals bei höheren LiCl- Konzent-
rationen (1,5 - 2,5 mol ⋅ L-1), erkennbar.
Im Gegensatz hierzu ist bzgl. der Spin - Gitter Relaxation T1 keine konkrete Tendenz der
Messwerte mit zunehmender Konzentration an Lithiumionen feststellbar (Abb. 5.21). Die
Schwankungen der einzelnen Messpunkte liegen im Rahmen der experimentellen Streuung.
66
Ergebnisse
5.4.2. Bakterielles Alginat
Bakterielles Alginat zeigt in NMR- Messungen unter dem Einfluss von LiCl ein ähnliches
Abb. 5.22: 13C {1H}- NMR Spektren der Hydroxylgruppen in einer wässrigen Alginatlösung (10 g/L) in
Abhängigkeit von der Li+- Konzentration: a) ohne Zusatz von Li+- Ionen b) 0,01 mol/L Li+ c)
0,02 mol/L Li+ d) 0,05 mol/L Li+ e) 0,1 mol/L Li+ f) 0,5 mol/L Li+ g) 1,0 mol/L Li+
h) 1,5 mol/L Li+ i) 2,0 mol/L Li+ j) 2,5 mol/L Li+
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
j)
i)
h)
g)
e)
f)
d)
c)
b)
a)
67
Ergebnisse
Verhalten wie zuvor die EPS- Proben. Allerdings ist im Falle der Alginat- Lösungen der Ein-
fluss der Lithiumionenkonzentration auf die spektroskopischen Eigenschaften wesentlich aus-
geprägter. Die relative Halbwertsbreite der Referenzresonanzlinie nimmt im unteren Konzent-
rationsbereich bis 1,0 mol/L LiCl rapide bis auf einen Wert von 0,81 ab. Wird die
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,50,75
0,80
0,85
0,90
0,95
1,00
1,05
1,10
rela
tive
spek
tral
e Li
nien
brei
te
c (LiCl) [mol/L]
Abb. 5.23: Einfluss der Li+- Ionenkonzentration auf die relative spektrale Linienbreite des C-5 Man
Signals einer Alginatlösung (10 g/L)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,50,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
T 1 [s]
c (LiCl) [mol/L]
Abb. 5.24: Einfluss der Li+- Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit T1 des C-5 Man
Signals einer Alginatlösung (10 g/L)
68
Ergebnisse
Ionenstärke weiter erhöht, so tritt eine Art Sättigungseffekt ein und die relative Linienbreite
bleibt auf einem annähernd konstanten Niveau von 0,83 (s. Abb. 5.23).
Die T1 - Zeiten der vermessenen Alginatlösungen (Abb. 5.24) streuen im Rahmen des experi-
mentellen Fehlers, sind aber ansonsten konstant. Dies weist darauf hin, dass keine signifikante
Tendenz innerhalb der Konzentrationsreihe auftritt. Die Spin - Gitter Relaxation der Poly-
saccharidkohlenstoffe ist somit unabhängig von der Ionenstärke des umgebenden Lösemittels
ist.
69
Ergebnisse
5.5 Einfluss bi- und trivalenter Kationen
Rheologische Untersuchungen haben gezeigt, dass bivalente Gegenionen eine entscheidende
Rolle bezüglich der mechanischen Festigkeit von Biofilmen spielen [100]. Sie sind wesentlich
beteiligt an der Ausbildung von Netzwerkstrukturen innerhalb polyanionischer Gele.
Im Vordergrund dieser Untersuchungen stehen daher die Rahmenbedingungen, unter denen
Polysaccharide in den EPS Gele bilden [101, 102, 103, 104] und inwieweit potentielle Ver-
netzungspunkte innerhalb des Makromoleküls lokalisiert werden können.
5.5.1 Einfluss von Magnesiumionen
Es gilt als erwiesen, dass Magnesiumionen von allen Erdalkalimetallionen die geringste Ten-
denz zur Gelbildung mit Alginaten haben. Innerhalb des in diesem Rahmen untersuchten
Konzentrationsbereichs tritt eine Gelierung der EPS- Lösung erst bei der Maximalkonzentra-
tion von 3,6 mmol ⋅ L-1 Mg2+ ein, womit dieses Ergebnis auch für Alginate bakterieller Her-
kunft bestätigt wird.
Im Allgemeinen kann festgestellt werden, dass die geringe Gelierungstendenz bei der Dotie-
rung mit Mg2+ sich auch in den Ergebnissen der kernmagnetischen Resonanz widerspiegelt.
Dies zeigt sich u.a. sehr eindrucksvoll, wenn man die vorherrschende Einheitlichkeit der
Spektren der Hydroxylkohlenstoffresonanzen (Abb. 5.25) berücksichtigt. Merkliche Ände-
rungen der Linienformen sind erst bei höheren Ionenkonzentrationen zwischen 2,0 - 2,7 mmol
⋅ L-1 zu beobachten. Die Dotierung mit Mg2+- Ionen über diese Schwellenkonzentration
hinaus ruft eine Linienverbreiterung des gesamten Spektrums hervor, von der sämtliche
Resonanzsignale gleichermaßen betroffen sind. Aufgrund ihrer besonderen und vergleichs-
weise isolierten Lage innerhalb der Hydroxylgruppenkohlenstoffresonanzen wird die Verbrei-
terung vorwiegend anhand der Linienformen des C-5 Man Referenzsignals als auch der G-2
Resonanzlinien (66,3 und 65,3 ppm) wahrgenommen. Dennoch ist der durch die Dotierung
hervorgerufene Effekt vergleichsweise schwach ausgeprägt: so beträgt die Linienverbreite-
rung der C-5 Mannuronatresonanzlinie selbst bei den Lösungen im mittleren Konzentrations-
70
Ergebnisse
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
Abb. 5.25: 13C {1H}-NMR Spektren der Hydroxylgruppenresonanzlinien in einer wässrigen EPS- Lösung
(7,5 g/L) in Abhängigkeit von der Mg2+- Konzentration: a) ohne Zusatz von Mg2+- Ionen
b) 0,7 mmol/L Mg2+ c) 1,2 mmol/L Mg2+ d) 1,6 mmol/L Mg2+ e) 2,0 mmol/L Mg2+
f) 2,7 mmol/L Mg2+ g) 3,6 mmol/L Mg2+
71
Ergebnisse
bereich (≤ 2,0 mmol ⋅ L-1) nur bis zu 6,5 % in Relation zur undotierten EPS- Probe. Ab einer
Ionenkonzentration von 2,7 mmol ⋅ L-1 steigt die Linienbreite sprunghaft um 31,6 % des Aus-
gangswertes an.
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0130
140
150
160
170
180
190 C-5 Man
Lini
enbr
eite
hH [H
z]
c (MgCl2) [mol/L]
Abb. 5.26: Darstellung der Veränderung der Linienbreite des C-5 Man Resonanzsignals in Abhängigkeit
von der Mg2+- Konzentration in einer EPS- Lösung (7,5 g/L)
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.00.20
0.25
0.30
0.35
0.40 C-5 Man
T 1 [s]
c (MgCl2) [mol/L]
Abb. 5.27: Einfluss der Mg2+ - Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit T1 des C-5 Man
Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)
72
Ergebnisse
In Abbildung 5.27 werden die Spin - Gitter Relaxationszeiten T1 der Referenzresonanzlinie
(C-5 Man) gegen die Ionenkonzentrationen der jeweiligen MgCl2- Lösungen aufgetragen.
Hieraus wird ersichtlich, dass T1 im Rahmen der Fehlerschwankungen über den untersuchten
Konzentrationsbereich hinweg konstant bei einen Wert von ca. 0,3 s bleibt.
73
Ergebnisse
5.5.2 Einfluss von Calciumionen
Versetzt man eine EPS- Lösung mit Calciumionen, so beobachtet man schon bei relativ nie-
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
Abb. 5.28: 13C {1H}- NMR Spektren der Hydroxylgruppen in einer wässrigen EPS- Lösung (7,5 g/L) in
Abhängigkeit von der Ca2+- Konzentration: a) ohne Zusatz von Ca2+- Ionen b) 0,7 mmol/L Ca2+
c) 1,2 mmol/L Ca2+ d) 1,6 mmol/L Ca2+ e) 2,0 mmol/L Ca2+ f) 2,7 mmol/L Ca2+ g) 3,6 mmol/L
Ca2+
74
Ergebnisse
drigen Konzentrationen eine rapide Änderung der physikalischen Eigenschaften der Probe.
Makroskopisch betrachtet äußert sich dies in einem abrupten Anstieg der Viskosität bis hin
zur Gelbildung bei Ionenkonzentrationen zwischen 2,7 - 3,6 mmol ⋅ L-1. Untersuchungen bei
höheren Calciumkonzentrationen konnten nicht durchgeführt werden, da aufgrund der Gelbil-
dung keine gleichmäßige Ionenverteilung gewährleistet werden konnte.
Die Dotierung von EPS- Lösungen mit Ca2+- Ionen hat signifikante Auswirkungen auf das
gesamte Spektrum des Alginats. So kann man einhergehend mit dem Viskositätsanstieg eine
grundsätzliche Linienverbreiterung im NMR- Spektrum beobachten (s. Abb. 5.29).
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0130
140
150
160
170
180
190 C-5 Man
Lini
enbr
eite
hH [H
z]
c (CaCl2) [mmol/L]
Abb. 5.29: Darstellung der Veränderung der Linienbreite des C-5 Man Resonanzsignals in Abhängigkeit
von der Ca2+- Konzentration in einer EPS- Lösung (7,5 g/L)
Trägt man nun die Linienbreite dieses Signals gegen die Ca2+- Ionenkonzentration der EPS-
Lösungen auf, so ergibt sich ein charakteristischer Verlauf, welcher gut mit den makroskopi-
schen Beobachtungen zum Sol-Gel Übergang korreliert (Abb. 5.29). So ist im Konzen-
trationsbereich von 0 - 2,0 mmol ⋅ L-1 Ca2+ ein nahezu linearer Anstieg der Halbwertsbreite
der C-5 Man Resonanzlinie zu beobachten. Die Zunahme in dem linearen Bereich erscheint
wesentlich stärker als die Verbreiterung bei Dotierung mit Magnesiumionen. Bei höheren
Ionenkonzentrationen steigt die Linienbreite sprunghaft von 160,5 Hz (2,0 mmol ⋅ L-1 Ca2+)
auf 183,9 Hz (2,7 mmol ⋅ L-1 Ca2+) an, um dann auf 173,3 Hz abzufallen. Die scheinbar ge-
genläufige Tendenz des letzten Messpunktes beruht auf der Dekonvolution des C-5 Mannuro-
75
Ergebnisse
natsignals. Dieses setzt sich aus zwei Komponenten zusammen: Den Resonanzlinien der MM-
und der MG- Diade, welche nicht separiert werden können. Ist nun eines der beiden Diaden-
signale (in diesem Fall das der MG- Diade) stärker von der Linienverbreiterung betroffen als
das andere, so bleibt die Amplitude des einen Signals nahezu unverändert, während die des
anderen rapide abnimmt. Dies kann dazu führen, dass die Amplitude der verbreiterten Reso-
nanzlinie unter die halbe Amplitude des unbeeinfussten Resonanzsignals absinkt und somit
bei der Dekonvolution nicht mehr berücksichtigt wird.
Neben der allgemeinen Linienverbreiterung ist zusätzlich eine charakteristische Verbreiterung
einzelner Resonanzlinien zu beobachten, wie in Abb. 5.28 anhand von Pfeilen dargestellt ist.
Hiervon sind sowohl alle Guluronatresonanzen (G-5, G-2, G-3, durchgezogene Pfeile) als
auch diejenigen Mannuronatsignale betroffen, welche der GMG- und MMG- Triadensequenz
(M-2, gestrichelter Pfeil) zugeordnet werden konnten. Die Spezifität der Wechselwirkungen
zwischen Guluronatbausteinen (sowie deren unmittelbare Nachbarn) und Ca2+- Ionen wird
insbesondere dadurch hervorgehoben, dass sie schon bei niedrigen Ionenkonzentrationen zum
Tragen kommen. So ist bereits bei einer Ca2+- Konzentration von 0,7 mmol ⋅ L-1 ein deutli-
cher Verlust an Signalintensität bei den M-2 (GMG/MMG- Triaden) und Guluronatresonanz-
linien zu erkennen.
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.00.20
0.25
0.30
0.35
0.40 C-5 Man
T 1 [s]
c (CaCl2) [mmol/L]
Abb. 5.30: Einfluss der Ca2+ - Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit T1 des C-5 Man
Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)
76
Ergebnisse
Innerhalb der Konzentrationsreihe bleiben die Spin - Gitter Relaxationszeiten T1 innerhalb des
experimentellen Fehlers (s. Abb. 5.30) konstant bei einem Mittel von 0,33 s. Das deutet dar-
auf hin, dass schnelle lokale Bewegungen im MHz Regime (z.B. Librationen einen CHOH-
Gruppe) nicht durch die Anbindung der Ca2+- Ionen oder die Gelierung eingeschränkt werden.
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
a)
b)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
c)
141,0 Hz
183,9 Hz
162,8 Hz
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
a)
b)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
c)
141,0 Hz
183,9 Hz
162,8 Hz
Abb. 5.31: Änderung der Linienbreite auf halber Signalhöhe (Hz) nach Regenerierung der EPS mittels
Kationenaustauscher DOWEX; a) EPS- Lösung (7,5 g/L); b) EPS- Lösung (7,5 g/L) dotiert mit
2,7 mmol/L Ca2+, c) regenerierte EPS- Lösung (7,5 g/L)
77
Ergebnisse
Des weiteren wurde die Gelierung von bakteriellem Alginat durch Calciumionen hinsichtlich
ihrer Reversibilität untersucht. Der Solzustand ist dabei leicht durch Verdünnen der Probe
wiederherzustellen. Darüber hinaus wurde ein EPS- Gel mit einer Calciumkonzentration von
2,7 mmol/L über einen Zeitraum von 24 h mit einem Kationenaustauscher behandelt.
Während der Behandlungsdauer war das Gel durch eine semipermeable Membran vom Aus-
tauscherharz räumlich separiert, so dass das Gel keinen mechanischen Scherkräften ausgesetzt
war. Nach anschließender Dialyse gegen deionisiertes Wasser wurde die Probe lyophilisiert
und resuspendiert. Das 13C- NMR Spektrum der so wiederaufbereiteten EPS- Lösung unter-
scheidet sich in ihrer Linienform nicht merklich von dem Kontrollspektrum, welches vor der
Dotierung mit Ca2+ aufgezeichnet wurde. So sind die Linien der Guluronatresonanzen (G-2,
G-5) im direkten Vergleich mit der Kontrollprobe hinsichtlich ihrer Amplitude nahezu iden-
tisch. Allerdings konnte festgestellt werden, dass Spektren a) und c) trotz scheinbar gleicher
Linienform der Hydroxylgruppenresonanzen in der Linienbreite differieren. Demzufolge ist
die Halbwertsbreite der Referenzresonanzlinie (M-5) der regenerierten EPS gegenüber der
reinen EPS- Lösung um 15 % verbreitert. Eine Linienverbreiterung ohne gleichzeitige Beein-
flussung der Linienform deutet darauf hin, dass es bei wiederholter Dialyse zu einer Aufkon-
zentration des makromolekularen Bestandteils der EPS und einer Ausschwemmung nieder-
molekularer (Spalt-) Produkte gekommen sein könnte.
78
Ergebnisse
5.5.3 Einfluss von Aluminiumionen
Neben den bivalenten Erdalkalimetallkationen wurden darüber hinaus die Wechselwirkungen
zwischen bakteriellem Alginat und trivalenten Aluminiumionen untersucht. Um das ampho-
tere Verhalten des Aluminiumions zu berücksichtigen wurden zwei Untersuchungsreihen bei
unterschiedlichen pH- Werten (pH = 4 u. pH = 7) durchgeführt.
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
b)
a)
c)
d)
e)
Abb. 5.32: 13C {1H}- NMR Spektren der Hydroxylgruppenresonanzlinien in einer wässrigen EPS- Lösung
(7,5 g/L) in Abhängigkeit von der Al3+- Konzentration: a) ohne Zusatz von Al3+- Ionen b) 0,1
mmol/L Al3+ c) 0,5 mmol/L Al3+ d) 1,0 mmol/L Al3+ e) 2,0 mmol/L Al3+, pH = 4,0
79
Ergebnisse
Die Kernresonanzspektren, welche im sauren Milieu (pH = 4) durchgeführt wurden, weisen
im untersuchten Konzentrationsbereich von 0,1 – 2,0 mmol ⋅ L-1 eine völlige Übereinstim-
mung der Resonanzlinien der Hydroxylgruppen auf. Sowohl die Linienform im Allgemeinen
als auch insbesondere die Halbwertsbreite der C-5 Mannuronat Referenzlinie ist im Rahmen
Abb. 5.33: 13C {1H}- NMR Spektren der Hydroxylgruppenresonanzlinien in einer wässrigen EPS- Lösung
(7,5 g/L) in Abhängigkeit von der Al3+- Konzentration: a) ohne Zusatz von Al3+- Ionen b) 0,1
mmol/L Al3+ c) 0,5 mmol/L Al3+ d) 1,0 mmol/L Al3+ e) 2,0 mmol/L Al3+ , pH = 7,0
b)
a)
c)
d)
e)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
80
Ergebnisse
der Messtoleranzen als konstant und somit unabhängig von der Aluminiumionenkonzentra-
tion in der EPS- Lösung anzusehen.
Im Neutralbereich (pH = 7) beobachtet man ähnliche Tendenzen wie zuvor bei den Mes-
sungen bei niedrigen pH- Werten (Abb. 5.33). So sind auch hier keinerlei Veränderungen in
Abhängigkeit von der Aluminiumionenkonzentration zu erkennen. Die relativen Linienbreiten
der Hydroxylgruppenresonanzen sind innerhalb des Messfehlers als konstant zu erachten.
81
Ergebnisse
5.6 Effekte paramagnetischer Ionen
Für diese Messreihe wurde das paramagnetische Mangan-II-Ion (Elektronenkonfig.: [Ar] 3d5)
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
Abb. 5.34: 13C {1H}- NMR Spektren der Hydroxylgruppenresonanzlinien in einer wässrigen EPS- Lösung
(7,5 g/L) in Abhängigkeit von der Mn2+- Konzentration: a) ohne Zusatz von Mn2+- Ionen b)
0,05 mmol/L Mn2+ c) 0,10 mmol/L Mn2+ d) 0,25 mmol/L Mn2+ e) 0,50 mmol/L Mn2+ f) 0,75
mmol/L Mn2+ e) 1,00 mmol/L Mn2+
82
Ergebnisse
zur Dotierung der EPS- Proben (7,5 g/L) aufgrund seines hydrodynamischen Radius ausge-
wählt, welche dem des Ca2+- Ions sehr ähnlich ist. Hierbei wurde ein Konzentrationsbereich
von 0,05 – 1,00 mmol ⋅ L-1 untersucht, in dem der paramagnetische Effekt insbesondere hin-
sichtlich der Linienform der Hydroxylgruppenresonanzen beobachtet wird. Wie erwartet
kommt es schon bei geringfügiger Dotierung mit Mn2+ zu einer starken Verbreiterung der
Resonanzlinien des gesamten Spektrums. Ähnlich wie bei den Festkörperspektren der Ca2+-
Konzentrationsreihe (5.28) zeigen sich im unteren Konzentrationsbereich bis zu 0,25 mmol ⋅
L-1 spezifische Linienverbreiterungen der Guluronatlinien (G-2, G-3 und G-5) sowie der
GMG/MMG- Triadensequenzen des C-2 Kohlenstoffs der Mannuronatreste. Erhöht man die
Konzentration an paramagnetischen Ionen in der EPS- Lösung über diesen Schwellenwert
hinaus, so wird auch das C-5 Mannuronatsignal merklich verbreitert.
Die einzigen Resonanzlinien, welche kaum von dem paramagnetischen Effekt betroffen sind,
sind die C-2 und C-3 Kohlenstoffatome derjenigen Mannuronatreste, die an der C-1 Position
nicht mit Guluronatresten glykosidisch verbrückt sind. Es kann davon ausgegangen werden,
dass sie sich sterisch außerhalb des Wirkungsbereichs der paramagnetischen Mn2+- Ionen be-
finden. Nur die Kohlenstoffresonanzen (G-5,G-2, M-2 GMG/MMG), welche in direkter
Nachbarschaft zum gebundenen Mn2+- Ion stehen, werden durch den Feldeffekt des assoziier-
ten Mn2+- Ions verbreitert.
Auf die Untersuchung der segmentellen Molekülbeweglichkeit wurde verzichtet, da die T1-
Zeiten durch den Zusatz von paramagnetischen Ionen stark verkürzt werden und somit rele-
vante Informationen verloren gehen.
83
Ergebnisse
5.7 Stressreaktionen von Biofilmen
Biofilme als mikrobielle Lebensform durchlaufen wie in Kapitel 2 vorgestellt unterschied-
liche Entwicklungsstadien. Insbesondere bei den späteren Stadien oder unter Stressbeding-
ungen beobachtet man makroskopisch deutliche Veränderungen der organischen Matrix
(Pigmentierung, Dichte, Porosität). Im Rahmen der Versuchsreihe sollen die Prozesse inner-
halb eines intakten Biofilms auf molekularer Ebene näher beleuchtet werden, welche unter
Stressbedingungen [105] (Nährstoff-/Sauerstoffarmut) (s. Kapitel 4.6) ausgelöst werden.
Ein 13C- angereicherter Biofilm wird dazu hermetisch abgeschlossen und in größer werdenden
Abständen über einen Zeitraum von 30 Tagen untersucht (Abb. 5.36), zusätzlich erfolgt eine
Abschlussuntersuchung nach 150 Tagen. Unmittelbar nach der Entnahme des mikrobiellen
Rasens von der PIA- Platte ist eine starke Veränderung in der Pigmentierung des Biofilms zu
beobachten. Sie wechselt innerhalb von wenigen Minuten von einem Dunkelgrün zu einer
gelbgrünlichen Färbung. In dem untersuchten Zeitrahmen sind keine weiteren makroskopi-
schen Veränderungen des Biofilms hinsichtlich Färbung und chemischer Struktur eingetreten.
-5 0 5 10 15 20 25 30 140 160145
150
155
160
165
170
175
180
185
190
195
200 C-5 Man
Lini
enbr
eite
hH [H
z]
Zeit [d]
Abb. 5.35: Zeitabhängige Änderung der Linienbreite der C-5 Mannuronatlinie im Spektrum eines nativen
Biofilms von P. aeruginosa SG81 unter Einfluss von Stressfaktoren (Nährstoff- und Sauer-
stoffknappheit)
84
Ergebnisse
Die NMR- Spektren des Biofilms weisen im zeitlichen Verlauf mehrere Veränderungen hin-
sichtlich ihrer Linienform auf. Eine der vordergründigen Veränderungen stellt die fort-
Abb. 5.36: 13C {1H}- NMR Spektren eines 13C- angereicherten nativen Biofilms von P. aeruginosa SG81;
a) t = 0 d; b) t =1 d; c) t = 2 d, d) t = 14 d, e) t = 20 d, f) t = 25 d, g) t = 27 d, h) t = 30 d
200 175 150 125 100 75 50 25 0
(ppm)
200 175 150 125 100 75 50 25 0
(ppm)
200 175 150 125 100 75 50 25 0
(ppm)
200 175 150 125 100 75 50 25 0
(ppm)
200 175 150 125 100 75 50 25 0
(ppm)
200 175 150 125 100 75 50 25 0
(ppm)
200 175 150 125 100 75 50 25 0
(ppm)
200 175 150 125 100 75 50 25 0
(ppm)
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
85
Ergebnisse
schreitende Abnahme der Linienbreite mit der Zeit dar, wodurch es zu einer Verbesserung der
Auflösung des gesamten Biofilmspektrums kommt. Trägt man die Linienbreite auf halber
Peakhöhe der C-5 Mannuronatreferenzlinie gegen die Zeit auf, so ergibt sich näherungsweise
ein exponentieller Verlauf, welcher einem unteren Grenzwert entgegenstrebt (Abb. 5.35). Der
Endwert, welcher nach einer Versuchsdauer von 150 Tagen bestimmt wurde betrug dabei 157
Hz, zum Zeitpunkt unmittelbar nach der Probenahme wurde hingegen eine Halbwertsbreite
von 191 Hz gemessen.
Neben der deutlichen Verbesserung der Auflösung innerhalb der Spektrenreihe konnte beo-
bachtet werden, dass neue Resonanzlinien im Biofilmspektrum erscheinen. Erste Verände-
rungen im 13C- NMR Spektrum des nativen Biofilms sind bereits nach 24 h zu erkennen. Im
Verschiebungsbereich der Methylen- und Methinkohlenstoffe erscheinen schwache Banden
bei 35,4 ppm, 41,0 ppm, 52,5 ppm und 56,6 ppm, welche zuvor nicht bzw. nicht so ausge-
200 175 150 125 100 75 50 25 0
(ppm)
Abb. 5.37: 13C {1H}- NMR Spektren eines Biofilms von P. aeruginosa 48 h nach der Entnahme, Pfeile kennzeichnen
die Resonanzlinien, die im Zuge der Stressreaktionen erscheinen
Prägt vorhanden waren. Leicht tieffeldverschoben zu den Hydroxylgruppenresonanzen tau-
chen bei 84,2 und 88,4 ppm zwei weitere Resonanzlinien auf. Im Verlauf der nächsten 24 h
nehmen diese Resonanzsignale an Intensität zu und im Verschiebungsbereich der -C=C-
Doppel-bindungen zwischen 115 - 135 ppm erscheinen vier neue Linien im 13C- Spektrum
86
Ergebnisse
200 175 150 125 100 75 50 25 0
(ppm)
Abb. 5.38: 13C {1H}- NMR Spektren eines Biofilms von P. aeruginosa nach 150 Tagen Lagerung unter
Sauerstoff- und Nährstoffarmut
(Abb. 5.37). Über die gesamte Versuchsdauer von 30 Tagen betrachtet ändern sich die
Signalamplituden der Abbauprodukte nach den ersten 14 Tagen nur unwesentlich, d.h. der
native Biofilm hat schnell sein statisches Gleichgewicht hinsichtlich der Ausschüttung von
Lyse- und Hydrolyseprodukten erreicht. Eine weitere Kontrollmessung nach 150 Tagen (Abb.
5.38) zeigt, dass auch über diesen ausgedehnten Zeitraum eine fortschreitende Metaboli-
sierung von Alginat stattgefunden hat. Im Resonanzbereich der Methingruppen treten einige
Linien deutlich hervor. Andere Signale, welche bereits Metaboliten zugeordnet worden wa-
ren, erscheinen noch deutlicher im Spektrum des Biofilms, als dies zuvor der Fall war.
Abb. 5.39: Einzelkolonieausstrich des Biofilms nach Abschluss des Dauerversuchs; Färbung und Wachs-
tum des Biofilms entsprechen dem üblichen Phänotyp
87
Ergebnisse
Darüber hinaus wurde ein Teil der Bakterien hinsichtlich seines biologischen Zustands unter-
sucht. Eine Probe des Biofilms wurde entnommen und ein Einzelkolonieausstrich auf einer
PIA- Platte angelegt. Die Platte wurde 24 h bei 36°C bebrütet. Der Ausstrich der Probe (Abb.
5.39) zeigte ein Wachstumsverhalten entsprechend des üblichen Phänotyps von P. aerugi-
nonsa.
Der verbliebene Rest der Probe wurde zur Kontrolle mit Alginatlyase, welche zuvor von
Klebsiella aerogenes isoliert worden war [92], versetzt, und für 2 h bei 36°C bebrütet. Nach
Ablauf dieses Zeitraums ist der Biofilm komplett abgebaut. Statt einer Gelmatrix liegt nun
eine klare, dünnflüssige Lösung vor, in welcher die Bakterien als Bodensatz sedimentiert
sind. Das NMR- Spektrum des gelösten Überstandes wurde aufgenommen und mit dem
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
(ppm)
*
Abb. 5.40: 13C {1H}- NMR Spektren abgebauter Biofilme; schwarz: ein hermetisch abgeschlossener Bio-
film nach 150 Tagen, Abbau erfolgte vermutlich durch Pseudomonas - Alginatlyase; blau: der-
selbe Biofilm nach Zusatz von Klebsiella- Alginatlyase; *: Resonanzsignal des Tris-Puffers
Spektrum des 150 Tage hermetisch abgeschlossenen Biofilms verglichen. Beide Spektren
hinsichtlich der Lagen ihrer Resonanzsignale identisch, wobei jedoch die Resonanzsignale
des vollständig abgebauten Biofilms wesentlich besser aufgelöst sind und wegen ihrer grös-
seren Signalamplitude scheinbar an Intensität zugenommen haben. Die Linienbreite des C-5
Mannuronat- Referenzsignals beträgt im abgebauten Biofilm lediglich 92 Hz.
88
Diskussion
6. Diskussion
6.1 Charakterisierung des Biofilms
Die Charakterisierung der Biofilmmatrix, d.h. ihrer EPS und insbesondere ihres Alginats,
stellt die grundlegende Voraussetzung zur eingehenderen Erforschung intra- bzw. intermole-
kularer Wechselwirkungen im Biofilm dar. Die Grundlagen hierfür basieren im Wesentlichen
auf den intensiven Vorarbeiten zur Bestimmung der Zusammensetzung von Algenalginaten
[94, 95, 96], sowie der Adaption bestehender nasschemischer Verfahren in der Kernresonanz-
spektroskopie durch Grasdalen et al. [94]. Die Einführung dieser spektroskopischen Methode
eröffnete den Weg zur detaillierten Erfassung der Monomerzusammensetzung und Sequen-
zierung von Alginaten.
Die Untersuchungen zeigen, dass die Hochauflösungsspektren des partiell hydrolysierten,
bakteriellen Alginats (Abb. 5.4) eine gute Korrelation mit den Verschiebungswerten, welche
für die Resonanzsignale der Algenalginate gefunden wurden (s. Tab. 6.1), aufweisen. Im
Bereich der Hydroxylgruppenresonanzen (68 – 83 ppm) (Abb. 5.1.6) ließ sich eine eindeutige
Zuweisung der Resonanzlinien zu den jeweiligen Ringkohlenstoffatomen der Mannuronat-
bzw. Guluronatmonomerbausteine treffen. Die Abweichung der chemischen Verschiebung
einzelner Linien zu den von Grasdalen tabellierten Verschiebungswerten ist über den
gesamten Frequenzbereich konstant (ca. 1,5 ppm), so dass davon ausgegangen werden kann,
dass sie auf die Referenzierung mit unterschiedlichen internen Standards (THF / Natrium-3-
trimethylsilylpropionat-d4) bzw. des unterschiedlichen Dielektrikums des wässrigen Solvens
(Addition von EDTA [94]) zurückzuführen ist. Darüber hinaus sollten die Signallagen wegen
des weitgehend analogen Aufbaus von Alginaten mariner und bakterieller Herkunft nur
minimal divergieren. Lediglich die Signalintensitäten einzelner Resonanzen differieren
erwartungsgemäß mitunter stark, aufgrund der unterschiedlichen relativen Häufigkeit der
Monomerbausteine im Polysaccharid (s. Tab. 6.2).
Die Sequenzierung der Alginatmatrix von Pseudomonas aeruginosa SG81 sowie dreier
weiterer Pseudomonas Stämme wurde eingehend von Schürks [67] beschrieben und erfolgte
vorwiegend über die Zuordnung der Resonanzlinien der C-1 Kohlenstoffe. Im Rahmen dieser
89
Diskussion
Arbeit stehen hingegen nicht die Kohlenstoffe der glykosidischen Bindung, sondern vielmehr
die Ringkohlenstoffe im Vordergrund. Aufgrund der hohen Anzahl von sich teilweise über-
lappenden Signalen innerhalb dieses Resonanzbereichs (70 - 83 ppm), ist eine vollständige
Charakterisierung aller Triadensignale nicht möglich. Dennoch ließen sich durch Korrelation
mit den Verschiebungswerten aus der Literatur und den aus der C-1 Sequenzierung bekannten
Intensitätsverhältnissen einige Triadensequenzen der M-3, M-2 und G-3 Kohlenstoffe eindeu-
tig zuordnen (s. Abb. 5.7).
Tab. 6.1: Verschiebungswerte der Resonanzsignale [ppm] für P. aeruginosa SG81 (Referenz: THF) und
L. digitata (Referenz: Natrium-3-trimethylsilylpropionat-d4) in der Gegenüberstellung
Resonanzsignale Pseudomonas aeruginosa SG81
Laminaria Digitata
C – 1 (M & G)
MMG 104,62 103,9
GMG 104,49 103,8
MGG - 103,4
MMM 103,55 102,8
GMM 103,42 102,7
GGM 103,22 102,3
MGM 103,13 102,2
C – 1 (red. Endgr.)1 96,93 96,2 (M), 95,5 (G)
G – 4 83,33 82,6
M – 4 81,42 80,7
80,73 80,3
M – 5 79,67 79,2
M – nichtred. Endgr.2 76,06 -
M – 3 74,95 74,3
74,76 74,1
M – 2 74,10 73,3
73,33 72,7
G – 3 72,75 72,1
G – 5 71,09 70,2
G – 2 68,28 67,8
1 red. Endgr.: reduzierte Endgruppen 2 nichtred. Endgr: nicht reduzierte Endgruppen
90
Diskussion
Der direkte Vergleich der Spektren des abgebauten Bakterienalginats (Abb. 5.4) mit dem
Kreuzpolarisationsspektrum des nativen Biofilms (Abb. 5.2), zeigt in weiten Bereichen
große Übereinstimmungen. Insbesondere im Bereich der Hydroxylgruppenresonanzen werden
die Parallelen deutlich. Dies bedeutet, dass das Festkörperspektrum eines natürlichen Biofilms
vom Alginat als makromolekularem Bestandteil dominiert wird. Andere Makromoleküle wie
Nukleinsäuren und Proteine erscheinen nicht im NMR- Spektrum oder werden von den inten-
siveren Resonanzsignalen des Heteropolysaccharids überlagert.
Die direkte Zuordnung der Resonanzlinien im Festkörperspektrum (s. Abb. 5.3) der Biofilm-
matrix ist durch die starke Linienverbreiterung im Festkörper, sowie wegen der starken Über-
lappung benachbarter Resonanzlinien erschwert. Außer der intensiven C-2 Resonanzlinie des
Glycerins (73,0 ppm) können lediglich das G-2 (65,6 und 64,6 ppm), das M-5 (77,3 ppm)
sowie das G-5 Signal (68,1 ppm) mit hinreichender Gewissheit zugewiesen werden.
Tab. 6.2: Sequenzanalyse und Bestimmung des M/G - Verhältnisses für P. aeruginosa SG81 und L. digitata [94]
Probe FM FG FMMM FMMG FMGM FGGM FGMG FM/FG
P.a. SG81 0,76 0,24 0,11 0,51 0,09 0,09 0,16 3,17
L. digitata 0,60 0,40 0,38 0,08 0,10 0,04 0,06 1,50
91
Diskussion
6.2 Effektivität und Spezifität der 13C- Anreicherung
Die Untersuchungen von Wechselwirkungskräften innerhalb der EPS eines Biofilms stellen
Anforderungen an das Probenmaterial, welche von einem natürlichen Biofilm nicht erfüllt
werden können. Wie aus dem vorangegangenen Kapitel 6.1 ersichtlich wurde, sind die
Signalintensitäten im 13C- Spektrum sehr schwach, so dass z.B. Einflüsse ionischer Additive
nicht mit zufriedenstellender Sicherheit untersucht werden können. Darüber hinaus stellt die
Biofilmmatrix selbst ein sehr komplexes und ein vergleichsweise schwer reproduzierbares
Modellsystem dar. Daraus erwächst die Problemstellung, ein Probensystem zu finden, wel-
ches folgende Kriterien erfüllt:
• Vergleichbarkeit zu den Eigenschaften im nativen Biofilm
• Reduktion auf wesentliche Komponenten
- ermöglicht die eindeutige Zuordnung von Effekten
• Homogenität
• Langzeitstabilität des Probenmaterials
• einfache Isolierung in quantitativen Mengen
Der erste Schritt zur Lösung des Problems stellt eine Anreicherung des Probenmaterials durch
Isotopenmarkierung - in diesem Falle mit 2-13C-Glycerin - dar. In Vorversuchen wurde die
optimale Glycerinkonzentration bestimmt, bei der ein vollständiger Bakterienrasen unter
minimalem Einsatz an isotopenmarkiertem Glycerin ausgebildet wird. Dadurch konnte zum
einen sichergestellt werden, dass keine Revertierung der Bakterienkulturen zu nicht bzw.
schwach mucoiden Stämmen auftritt, zum anderen sollte der störende Einfluss des Glycerins
im Festkörperspektrum reduziert werden. Das Ergebnis ist äußerst zufriedenstellend und weist
eine deutliche Verbesserung der Spektrenqualität auf (Abb. 5.8). Ein besonders augenfälliger
Punkt ist die Abwesenheit des Glycerinsignals im Spektrum des isotopenmarkierten Biofilms.
Dies kann als sicheres Anzeichen dafür gewertet werden, dass das 2-13C-Glycerin im Nähr-
medium nahezu vollständig vom Bakterium verstoffwechselt wurde und lediglich nicht-
detektierbare Spuren davon in die EPS diffundiert sind.
92
Diskussion
Weitere Aussagen über die Effizienz und Spezifität der Anreicherung liefert insbesondere der
direkte Vergleich zwischen den Spektren des markierten und nichtisotopenmarkierten Bio-
films (Abb. 6.1). In beiden Spektren weisen die Resonanzbereiche der Carboxyl-, der
Methylen-, der Methin- sowie der anomeren Kohlenstoffe nahezu identische Intensitäts-
verhältnisse auf, wohingegen die Resonanzlinien der Hydroxylkohlenstoffe deutlich an Inten-
sität gewonnen haben. Dies bedeutet, dass das Glycerin in Analogie zur Fructose ausschließ-
lich über den Entner-Doudoroff-Zyklus [75] zu Alginat verstoffwechselt wird. Die Signalla-
gen der Resonanzlinien geben weiterhin Aufschluss darüber, wie das Glycerin zum Aufbau
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
(ppm)200 150 100 50 0
(ppm)
a b
c
d
2) 1)
Abb. 6.1: 13C{1H}- NMR Spektren eines unmarkierten (1) und eines 13C- markierten Biofilms (2);
a) Carboxylkohlenstoffe, b) anomerer Kohlenstoff, c) Hydroxylgruppenkohlenstoffe,
d) Methin- und Methylenkohlenstoffe
des Polysaccharids genutzt wird. Die intensivsten Resonanzlinien des Spektrums stellen die
des M-5 (77,3 ppm) und des G-5 Kohlenstoffatoms (69,0 ppm) dar. Darüber hinaus sind zu-
sätzlich noch die Resonanzen der C-2 bzw. C-3 Kohlenstoffatome der jeweiligen Monomer-
bausteine im Spektrum vertreten. Das bedeutet, dass der C6- Ringkörper sowohl aus C3- als
auch C2- Einheiten zusammengesetzt wird. Der C-5 Kohlenstoff ist somit in beiden Mono-
meren zu je 100 % isotopenmarkiert, die C-2 bzw. C-3 Kohlenstoffe hingegen nur zu jeweils
50 % (Abb. 6.2).
93
Diskussion
1)
O
O O
OH
O
OH
O
COO-6
5
4
3
216
5
4
32
1
a) b)COO- O
OR
RO
Abb. 6.2: Darstellung der Monomereinheiten innerhalb bakteriellen Alginats und ihrer Isotopenmarkie-
rung (volle Kreise: 100% markiert; schraffierte Kreise 50% markiert); a) Mannuronatrest; R =
H, COCH3 ; b) Guluronatrest
Die verschiedenen Spin - Gitter Relaxationszeiten T1, welche für die C5- Kohlenstoffe der
Mannuronat- bzw. Guluronatreste gefunden wurden, deuten weiterhin auf Differenzen hin-
sichtlich der chemischen Verschiebungsanisotropie und der lokalen Beweglichkeit wie z.B.
Librationen einzelner HCOH- Gruppen hin. Eine Ursache hierfür kann in der partiellen
Acetylierung der C-2 und C-3 Kohlenstoffe der Mannuronatbausteine gesehen werden, da
diese sowohl die Acidität der Carboxylgruppe als auch die allgemeine Hydrophobizität, also
die Stärke der Wasserstoffbrückenbindungen mit dem wässrigen Milieu, mit beeinflussen. Es
ist daher zu erwarten, dass die Wechselwirkungen der Hydroxylgruppen der Guluronat-
bausteine mit dem Wasserkörper (engl.: bulk water) ausgeprägter sind.
Die 13C-NMR Spektren einer wässrigen EPS- Lösung (Abb. 5.10) zeigen naturgemäß starke
Parallelen zu dem Spektrum des Biofilmrasens. Linienformen und -intensitäten sind ver-
gleichbar, wenn auch die Linienbreiten aufgrund der geringeren Viskosität des Mediums im
Allgemeinen wesentlich schmaler sind (164,5 Hz gegenüber 191,9 Hz bzgl. der C-5 Man Re-
sonanz). Ein weiteres Unterscheidungsmerkmal ist der linienarme Resonanzbereich der
Methylen- und Methinresonanzen, mit nur einem einzigen Resonanzsignal der Acetylgruppen
des Alginats (22,1 ppm). Es wird angenommen, dass dies auf die Abwesenheit von Bakterien
sowie auf den Verlust vergleichsweise niedermokularen Materials (< 12 kDa) im Zuge der
Probenaufarbeitung zurückzuführen ist.
94
Diskussion
Ähnliche Aussagen lassen sich auch zum Spektrum der reinen Alginatlösung (Abb. 5.12)
treffen. Als Besonderheit der Alginatspektren ist hier auf die Anwesenheit zweier nicht näher
zugeordneter Resonanzsignale bei 63,2 und 61,3 ppm hinzuweisen. Da es sich hierbei um
Linien vergleichsweise schwacher Intensität handelt, wird davon ausgegangen, dass es sich
um Abbauprodukte durch Pilzbefall während der Aufarbeitung des Probenmaterials handelt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch die schrittweise spektroskopische Unter-
suchung des Biofilms und seiner Komponenten (EPS, Alginat) die Metabolisierung von
2-13C-Glycerin zu Alginat nachvollzogen werden konnte. Die Effektivität der Umsetzung
isotopenmarkierten Materials zum Polysaccharid beträgt annähernd 100 % und erfolgt
selektiv an den C-2, C-3 und C-5 Kohlenstoffen der Mannuronat- bzw. Guluronatbausteine.
Hinsichtlich der Handhabbarkeit des Probenmaterials erweist sich die EPS- Lösung als das
geeignete Probensystem für nachfolgende Messreihen. Die EPS als solche ist leicht in
verhältnismäßig großen Mengen zu isolieren und zeigt sowohl als Lyophilisat als auch in
wässriger Lösung eine gute Langzeitbeständigkeit. Da die EPS sämtliche makromolekularen
Komponenten des Biofilms beinhaltet, bietet sie eine bessere Ausgangsbasis für Rückschlüsse
auf Wechselwirkungen innerhalb von Biofilmen als dies bei reinem Bakterienalginat der Fall
wäre.
95
Diskussion
6.3 Spektroskopische Charakteristika von Biofilmspektren
Die NMR - Spektren von Laborkulturen von Pseudomonas aeruginosa besitzen einige
Charakteristika, die sie von herkömmlichen Festkörperspektren unterscheiden. Dies ist an
vorderster Stelle die ungewöhnlich niedrige Halbwertsbreite der Resonanzsignale im Spekt-
rum. Stellt man das Resonanzspektrum eines Bakterienrasens dem einer Lösung resuspen-
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
b)
a)
Abb. 6.3: Gegenüberstellung der Hydroxylkohlenstoffresonanzlinien von a) nativem Biofilm und b) einer
EPS- Lösung (7,5 g ⋅ L-1)
dierter EPS gegenüber, so zeigt sich, dass die Auflösung im gelartigen Festkörper nur gering-
fügig von der der EPS- Lösung differiert. Die allgemeine Linienverbreiterung im Biofilm be-
trägt gemessen an der C-5 Mannuronatresonanzlinie 16,7 %, was angesichts des unterschied-
lichen viskoelastischen Verhaltens beider Proben zunächst als ungewöhnlich erscheinen mag.
Ein weiteres Unterscheidungsmerkmal zwischen den Spektren ist die Verlagerung von Inten-
sitätsverhältnissen einzelner Resonanzlinien. So hat die C-5 Guluronatlinie (69,0 ppm) im
Biofilm gegenüber der EPS deutlich an Intensität verloren. Die Ursache für die Verlagerung
von Signalintensitäten ist im Wesentlichen in der Gegenwart von bivalenten Kationen, insbe-
96
Diskussion
sondere dem Calciumion im Agarnährmedium zu suchen, welche eine selektive Linienver-
breiterung hervorruft (vergl. Kapitel 6.6.2).
Die ungewöhnlich geringe Linienbreite in den Biofilmen beruht in erster Linie auf der hohen
molekularen Beweglichkeit des Alginats innerhalb der Probe. Dies deutet darauf hin, dass die
Vernetzungsdichte innerhalb des Gelnetzwerkes niedrig ist bzw. die Vernetzungspunkte stark
fluktuieren und somit in weiten Bereichen des Polysaccharidmoleküls eine nahezu
COO-
RO
RO
RO
OR
COO-
COO-
OH
OH
OO
OO O
O
O
COO-
RO
OR
Gul Man Man Man
Abb. 6.4: Schematische Darstellung der „crankshaft motion“ anhand eines Ausschnitts aus einem Algi-
natmolekül
ungehinderte Reorientierung der Monomerbausteine zulassen. Eine besondere Form der
Moleküldynamik stellt die sogenannte „crankshaft motion“ dar. Wie in Abb. 6.4 dargestellt
handelt es sich dabei um eine kreisförmige Translationsbewegung zweier Nachbargruppen (in
diesem Falle seien es Mannuronatgruppen) um den zentralen Monomerbaustein (hier: die Gu-
luronatgruppe), welcher dadurch eine Drehbewegung ausführt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt
ist mangels moleküldynamischer Simulationen unklar, ob im Falle des Alginats im Gel-
netzwerk eine komplette Drehbewegung um 360° vorliegt. Es wird allerdings davon ausge-
gangen, dass bereits eingeschränkte Rotationsbewegungen (kleine Rotationswinkel) ausrei-
chen, um eine effektive Mittelung der chemischen Anisotropie der Uronsäurekohlenstoffe zu
bewirken.
In Zusammenhang mit den Untersuchungen zum Einfluss mono-, bi- und trivalenter auf intra-
und intermolekulare Wechselwirkungen innerhalb von Biofilmen kommt der Änderung der
97
Diskussion
molekularen Beweglichkeit eine besondere Bedeutung zu. Dies ist insbesondere bei der Inter-
pretation der Wechselwirkungen zwischen bakteriellem Alginat und bivalenten Ionen der
Fall. Es muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass die spektroskopischen Befunde in ers-
ter Linie Aufschluss darüber geben, ob und inwieweit das jeweilige Ion an bestimmten
a) b)
Abb. 6.5: Gegenüberstellung intra- und intermolekularer Wechselwirkungen in Polymeren; a) intra-
molekulare Verknüpfungen in einem Polymer ("Hairpin" – Modell) b) intermolekulare Ver-
knüpfungen, Ausbildung eines Netzwerkes; blau: Polymer ; orange: Verknüpfungsstellen
Sequenzen des Polysaccharidmoleküls assoziiert ist und somit deren Beweglichkeit beein-
flusst. Die experimentellen NMR- Daten allein lassen keine direkte Aussagen hinsichtlich der
intra- oder intermolekularen Natur der Wechselwirkungen zu (s. Abb. 6.5). Erst in der Zu-
sammenschau mit makroskopischen Beobachtungen (wie z.B. der Rheologie der Probe)
lassen sich solche Zusammenhänge verlässlich zuordnen.
98
Diskussion
6.4 Einfluss von pH- Wert und Temperatur
6.4.1 Einfluss des pH- Wertes
Die Struktur von Alginatmolekülen wird wesentlich durch inter- und intramolekulare
Wechselwirkungen bestimmt. Hierbei fällt dem Milieu des Lösemittels eine besondere Rolle
zu, da es die Protonierung- bzw. Deprotonierung der funktionellen Gruppen bei Poly-
elektrolyten, wie dem Alginat beeinflusst.
Der Einfluss des pH- Wertes auf die räumliche Struktur von bakteriellem Alginat wurde so-
wohl mit kernresonanzspektroskopischen, als auch mit rasterkraftmikroskopischen Methoden
untersucht. Die NMR Untersuchungen an EPS- Lösungen (Abb. 5.13) unterschiedlichen pH-
Wertes (pH = 4 – 11) zeigen einen deutlichen Trend hinsichtlich der Änderung der molekula-
ren Beweglichkeit im Polysaccharid. Im sauren und neutralen Milieu weisen die Spektren nur
minimale Unterschiede (4,1 Hz) hinsichtlich der Linienbreite der C-5 Mannuronat-
Referenzlinie auf. In diesem pH- Bereich ändert sich der Dissoziationsgrad α nur geringfügig.
Wird jedoch die Hydroniumionenkonzentration verringert, so steigt der Dissoziationsgrad
stark an und ionische Abstoßungskräfte zwischen benachbarten Carboxylgruppen nehmen zu.
Die Wirkungsweise dieser Kräfte ist vorwiegend intramolekular und wirkt einer Ver-
knäuelung des Makromoleküls entgegen, d.h. jedes Alginatmolekül nimmt eine vergleichs-
weise „gestreckte“ Konformation ein und ist somit in seiner allgemeinen Beweglichkeit ge-
hindert. Im 13C{1H}- Spektrum drückt sich dieses durch einen starken Anstieg der Linienbrei-
te der Referenzlinie auf 155,9 Hz aus.
Die Ergebnisse der NMR- Spektroskopie erhalten zusätzliche Bestätigung durch die AFM-
Messungen an EPS- Proben. Wie die AFM- Ausschnitte wässriger EPS- Lösungen (Abb.
5.14), jeweils aufgenommen bei einem pH- Wert von 4,0 bzw. 11,0 , zeigen, findet man in
Abhängigkeit vom Milieu des Lösungsmittels unterschiedliche Kettenstrukturen vor. Unter
sauren Bedingungen sind flache, scheibenförmige Gebilde zu erkennen. Es wird davon aus-
gegangen, dass es sich hierbei um dichte Knäuel von Alginatmolekülen handelt, welche im
Verlauf des Trocknungsprozesses auf dem Mica- Objektträger kollabieren und abflachen. Im
Gegensatz dazu liegen im basischen Milieu deutlich entknäuelte Kettenstrukturen vor. Die
genaue Natur dieser Knäuel konnte leider nicht eindeutig aufgeklärt werden, es wird aller-
99
Diskussion
dings aufgrund der Dimensionen der abgebildeten Objekte davon ausgegangen, dass es sich
hierbei um Aggregate zweier oder dreier Alginatmoleküle handelt [106]. Die „Auflockerung“
der Polysaccharidknäuel steht also im Einklang mit der Theorie der verstärkten intramoleku-
laren Abstoßung zwischen den benachbarten Carboxylgruppen im Polymeren, welche zu
einer „Streckung“ des Makromoleküls führt.
6.4.2 Einfluss der Temperatur
Der Einfluss der Probentemperatur auf das Kernresonanzspektrum von EPS- Lösungen (Abb.
5.15) beruht im Wesentlichen auf der Temperaturabhängigkeit der Korrelationszeit τc des
Moleküls. Ist die Korrelationszeit τc lang, wie es in Festkörpern, hochviskosen Lösungen oder
aber auch bei niedrigen Temperaturen der Fall ist, so ist die Verweilzeit der Kerne in ihrer
jeweiligen relativen Orientierung zu ihrer Umgebung lang. Aufgrund der Wechselwirkungen
mit lokalen Magnetfeldern benachbarter Dipole kommt es somit zu einer breiteren Verteilung
von Larmorfrequenzen und einem schnelleren Verlust der Phasenkohärenz. Dies ist gleichbe-
deutend mit einer kürzeren T2 Relaxationszeit und einer damit einhergehenden Linienver-
breiterung [85].
Umgekehrt verkürzt sich die Korrelationszeit τc, wenn die Viskosität des Lösemittels ernied-
rigt oder die Temperatur der Probe erhöht wird: Die Viskositätserniedrigung reduziert Re-
striktionen hinsichtlich der Reorientierung des Moleküls, eine höhere Temperatur führt zu
einer höheren kinetischen Energie der Moleküle; die Besetzungsverteilung der translatori-
schen und rotatorischen Energieniveaus ändert sich.
Dementsprechend zeigen die temperaturabhängigen Messungen an einer EPS- Lösung deut-
lich eine Abnahme der Linienbreite aller Resonanzlinien mit zunehmender Probentemperatur.
Referenziert man die Änderung der Linienbreite hinsichtlich des C-5 Mannuronat- bzw. C-5
Guluronatsignals, so ist bei beiden Resonanzen eine exponentielle Abnahme der Linienbreite
auf halber Höhe zu beobachten (s. Abb. 5.16 u. Abb. 5.17).
Die Spin - Gitter Relaxationszeiten T1 zeigen hingegen keinerlei Temperaturabhängigkeit im
untersuchten Temperaturbereich. Die T1 - Zeit ist gegenüber Molekülbewegungen im Mega-
100
Diskussion
hertzbereich wie z.B. Librationen der HCOH- Gruppen empfindlich. Die Aktivierungsenergie
derartiger Bewegungsabläufe ist sehr niedrig. Daraus resultiert, dass die relative Änderung
dieser Bewegungen bei höheren Temperaturen ( > 273 K) gering ist und somit die longitudi-
nale Relaxationszeit nur insignifikant beeinflusst wird.
6.5 Einfluss monovalenter Kationen
Die Wechselwirkungen monovalenter Kationen mit Alginaten oder EPS sind vergleichsweise
schwach untersucht. Frühe Studien von Podlas und Ander [107] deuteten darauf hin, dass die
Bindung von Na+- und K+- Ionen rein statistischer Natur ist. Umfassendere Untersuchungen,
durch Seale et al. [108] mittels CD- Spektroskopie an kommerziellen Algenalginaten durch-
geführt, ergaben, dass die Bindungskapazität innerhalb der homologen Reihe ansteigt.
Darüber hinaus wurden für die Wechselwirkungen monovalenter Ionen unterschiedliche
Bindungsarten postuliert: Li+ bindet rein statistisch an Alginate , Na+ ist in begrenztem Um-
fang zu kooperativen Bindungen fähig und K+ geht in Gegenwart von Polyguluronatblöcken
spezifische Bindungen zu benachbarten Guluronatresten ein. Die Wechselwirkungen mit bak-
teriellen Alginaten von Acetobacter vinelandii und Pseudomonas aeruginosa wurden insbe-
sondere in Hinblick auf den Einfluss der Acetylgruppen erforscht [69]. Dabei wurden die
Ergebnisse von Seale et al. weitgehend bestätigt und es zeigte sich, dass acetylierte Alginate
geringere Bindungskapazitäten haben, als ihre deacetylierten Gegenstücke.
6.5.1 Extrazelluläre polymere Substanzen (EPS)
Monovalente ionische Additive wie Li+ haben einen merklichen Einfluss auf die makroskopi-
schen Probeneigenschaften wässriger EPS- Lösungen (Abb. 5.18). Schon geringe Mengen
von LiCl (> 0,01 mol⋅ L-1) rufen eine starke Verringerung der apparenten Viskosität ηapp. her-
vor bis zu einem Punkt, an dem ein Sättigungsniveau erreicht ist und eine weitere Addition
101
Diskussion
von Elektrolyt keine weiteren Auswirkungen zeigt. In den von Moritz [99] durchgeführten
Messungen liegt dieser Grenzwert bereits bei einer Ionenkonzentration von 0,75 mol ⋅ L-1.
Kernresonanzspektroskopische Methoden bieten den Vorteil direkte Einblicke in Bewegungs-
abläufe auf der molekularen Ebene zu gewähren. Somit stellen die 13C-NMR Untersuchungen
einen praktikablen Indikator hinsichtlich inter- bzw. intramolekularer Wechselwirkungen
zwischen Polysaccharidketten in der EPS dar.
Betrachtet man die Resonanzsignale der Hydroxylkohlenstoffe (Abb. 5.18), so ist mit zu-
nehmender Ionenstärke eine Verringerung der Halbwertsbreite und einhergehend eine
Verbesserung der Auflösung des Spektrums zu beobachten. Durch die Referenzierung über
das C-5 Mannuronatsignal lässt sich dieser Effekt quantitativ erfassen (Abb. 5.20). Im unteren
Konzentrationsbereich (0,01 – 1,0 mol ⋅ L-1) fällt die relative Halbwertsbreite rapide ab und
nimmt im oberen Bereich (1,5 – 2,5 mol ⋅ L-1) wieder zu. Das deutet darauf hin, dass der
Mechanismus, welcher für die Änderung der Linienbreite verantwortlich ist, auf isotroper
Rotationsdiffusion der Alginatknäuel beruht. Zur eingehenderen Diskussion der Simulation
der isotropen Rotationsdiffusion von Alginatmolekülen wird auf das nächste Unterkapitel
(Kapitel 6.5.2) verwiesen.
Ferner zeigen die Messungen keine signifikante Abhängigkeit der Spin - Gitter Relaxations-
zeit T1 von der Ionenstärke der Lösung. Die longitudinale Relaxation wird maßgeblich be-
stimmt durch Molekülbewegungen im MHz - Regime, wie z.B. Librationen einzelner Hydro-
xylgruppen. Diese werden im Allgemeinen nicht bzw. nur unwesentlich durch die Anwesen-
heit von Anionen oder Kationen beeinflusst. Dies deckt sich mit den Beobachtungen von
Kirschner [99] an Modellsystemen wie Polyacrylsäure (PAS).
6.5.2. Bakterielles Alginat
Die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen bakteriellem Alginat und dem 1,1- Elekt-
rolyten LiCl weisen deutliche Analogien zu den Ergebnissen bezüglich der extrazellulären
polymeren Substanzen (EPS) auf. Nichts desto trotz erscheint der Grad der Wechselwir-
102
Diskussion
kungen bei dem reinen Isolat wesentlich ausgeprägter zu sein als es bei dem Mehrkomponen-
tensystem, wie es die EPS darstellen, der Fall ist. Dies wird zum einem auf die wesentlich
höhere Alginatkonzentration der Probelösungen, zum anderen auf Störeinflüsse durch
Sekundärkomponenten (Proteine, LPS) zurückgeführt, wobei dem letzteren Faktor lediglich
eine untergeordnete Rolle eingeräumt wird.
In Übereinstimmung mit den EPS- Proben ist auch bei den Alginatlösungen eine rasche Ab-
nahme der Halbwertsbreite der Referenzresonanzlinie (Abb. 5.23) bei niedrigen Ionenstärken
( c(LiCl) ≤ 1,0 mol ⋅ L-1) zu verzeichnen. Beim Alginat ist der Effekt hingegen erheblich mar-
kanter: Die Linienbreite des C-5 Man Referenzsignals reduziert sich auf 81% (im Gegensatz
zu 94% bei der EPS) der Breite der Lösung ohne Elektrolytzusatz. Bei weiterer Erhöhung der
Ionenkonzentration nimmt dieser Wert leicht zu.
Um den oben beschriebenen Effekt näher zu charakterisieren wurde eine Linienformanalyse,
unter Zuhilfenahme numerischer Simulationsmethoden [109, 110], vorgenommen. Es wurde
dabei zugrunde gelegt, dass die Linienverbreiterung in protonenentkoppelten 13C-Spektren
ausschließlich auf der Anisotropie der chemischen Verschiebung beruht [111]. Aus den
Hochauflösungsspektren partiell abgebauten Alginats ist bekannt, dass sich das C-5
Mannuronatsignal aus zwei Resonanzlinien (σiso(1) = 79,1 ppm; σiso(2) = 79,8 ppm) zusammen-
setzt, welche entsprechend dem Verhältnis ihrer Flächenintegrale mit 70% und 30% gewichtet
werden. Die Anisotropie des Tensors der chemischen Verschiebung wird durch die charak-
teristischen Verschiebungsparameter σ11, σ22 und σ33 beschrieben. Da die Parameter für Man-
nuronat bzw. Guluronat nicht bestimmt sind, wurde für die Simulation auf die bekannten
Literaturwerte für die inneren Kohlenstoffatome von Diammoniumtartrat (NH4)2C4H4O6 (σ11
= σiso + 13ppm, σ22 = σiso + 7ppm, σ33 = σiso - 20ppm) [112] zurückgegriffen, welches von
der Struktur und seinen funktionellen Gruppen dem C-5 Kohlenstoff des Mannuronats im
Alginat gleicht. Der Gesamtwechselwirkungstensor σ(total) ergibt sich in Übereinstimmung mit
den Festkörperspektren aus der gewichteten Summe der einzelnen Tensoren: σ(total) = 0,7 σ(1)
+ 0,3 σ(2).
Aufgrund der symmetrischen Signalformen der experimentellen Spektren wird davon ausge-
gangen, dass innerhalb des Moleküls eine Bewegung vorliegt, die zu einer effizienten Mitte-
lung des Anisotropietensors am C-5 Man Kohlenstoff führt. Folglich kann man in einfacher
103
Diskussion
Näherung davon ausgehen, dass die isotrope Rotationsdiffusion ein geeignetes Modell zur
Beschreibung der Moleküldynamik darstellt. Im Rahmen der Untersuchungen wurden die
τc= 3250 ns
τc = 4500 ns
τc= 3750 ns
τc= 3250 ns
0,01 M
0,05 M
1,00 M
Abb. 6.6: Gegenüberstellung experimenteller Alginatspektren (Li+ - Konzentrationsreihe, links) mit
simulierten Spektren (isotrope Rotationsdiffusion, rechts) der C-5 Mannuronatresonanzlinie;
Anisotropietensor der inneren Kohlenstoffe von Ammoniumtartrat: (NH4)2C4H4O6 (σ11 = σiso
+ 13ppm, σ22 = σiso + 7ppm, σ33 = σiso – 20ppm); komplette Konzentrationsreihe ist dem An-
hang zu entnehmen
Korrelationszeiten τC in einem Zeitintervall von 4,5 - 3,25 µs variiert und mit den ent-
sprechenden experimentellen Spektren der Elektrolytkonzentrationsreihe verglichen. Wie aus
der Gegenüberstellung der Spektren deutlich hervorgeht, steht die konzentrationsabhängige
Änderung der Linienform im Zusammenhang mit der Modulation der rotativen Korrelation
unter gleichzeitiger Abnahme der apparenten Viskosität. Die Erhöhung der rotativen Beweg-
lichkeit des Alginatmoleküls in Abhängigkeit von der Ionenstärke der Lösung kann nur durch
eine strukturelle Konformationsänderung aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen
erklärt werden. Wie in der Abbildung 6.7 dargestellt ist, überwiegen bei Lösungen mit nie-
drigen Elektrolytkonzentrationen die intramolekularen, elektrostatischen Abstoßungskräfte
benachbarter Carboxylgruppen der Mannuronat- bzw. Guluronatreste. Die Wechselwirkungs-
kräfte zwischen diesen negativ geladenen funktionellen Gruppen bewirken eine Streckung des
104
Diskussion
Makromoleküls und dadurch eine Erhöhung der apparenten Viskosität sowie eine Linienver-
breiterung im NMR- Spektrum. Durch Addition eines Überschusses an Elektrolyt werden die
wechselwirkenden Kräfte der negativ geladenen Carboxylgruppen partiell abgeschirmt, so
dass die Alginatkette in zunehmendem Maße eine verknäuelte Struktur annehmen kann, was
zur Folge hat, dass Viskosität und Linienbreite abnehmen. Weitere Elektrolytaddition kann
zudem zu einer Agglomeration solcher Alginatknäuel und somit zu einem Viskositätsanstieg
der gelösten Probe führen. Dieser Effekt konnte allerdings nur bei den EPS- Lösungen
beobachtet werden.
+
+
+
+
+
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
--
-
-
--
-
-
-
-
--
+
+
+ -
- -
-
-
-
+
+
++
+- -
-
--
-
+
+
++ +
-
-
- -
zunehmende Ionenstärkeabnehmender hydrodynamischer Radius, verkleinerte Partikelvoluminaabnehmende apparente Viskosität, abnehmende rotative Korrelationszeit
Abb. 6.7: Schematische Darstellung der Konformationsänderung eines Alginatmoleküls in Abhängigkeit
von der Li+ - Ionenstärke; blau: Carboxylgruppen, rot: Li+ - Ionen
In Analogie zu den Beobachtungen bezüglich der T1- Relaxation von EPS- Lösungen konnte
auch für bakterielles Alginat keine Auswirkungen der Kation - Polyanion Wechselwirkungen
auf die Librationen von Hydroxylkohlenstoffen des Polysaccharidgerüsts festgestellt werden.
105
Diskussion
6.6 Einfluss bi- und trivalenter Kationen
6.6.1 Einfluss von Magnesiumionen
Der Vergleich der Linienformen der Hydroxylgruppenresonanzen innerhalb der Mg2+-
Konzentrationsreihe korrespondiert weitgehend mit den rheologischen Befunden. Bei niedri-
gen Ionenstärken bis zu 2,0 mmol ⋅ L-1 sind keine wesentlichen Veränderungen im Verschie-
bungsbereich zwischen 85 - 65 ppm festzustellen (Abb. 5.25). Die relativen Signal-
intensitäten der Hydroxylkohlenstoffe werden als konstant angesehen, die Linienver-
breiterung bezogen auf die C-5 Man Referenzresonanzlinie ist minimal (< 10 Hz).
Wird die Elektrolytkonzentration hingegen weiter erhöht, so lässt sich hinsichtlich der makro-
skopischen Probeneigenschaften eine leichte Zunahme der Viskosität feststellen. Dies führt
im 13C-NMR- Spektrum zu einer drastischen Linienverbreiterung der Referenzlinie um 36,2
Hz im Konzentrationsbereich zwischen 2,0 - 3,6 mmol ⋅ L-1 (Abb. 5.26). Bezogen auf die Al-
ginatkonzentration der EPS- Lösung entspricht diese Ionenkonzentration nominell einem
Verhältnis von 7 - 12 Monomereinheiten pro Mg2+- Ion. Dieser Wert relativiert sich, wenn
man berücksichtigt, dass sich hiervon nur eine bestimmte Anzahl in der unmittelbaren Nach-
barschaft von den Carboxylgruppen der Mannuronat- bzw. Guluronatresten aufhalten und der
übrige Anteil hydratisiert im Wasserkörper vorliegt. Eine exakte Beschreibung der Konzent-
rationsverhältnisse zwischen den Reaktanden und dem Komplex in Lösung kann nur auf der
Basis des Massenwirkungsgesetzes erfolgen. Für ein Komplexgleichgewicht zwischen bakte-
riellem Alginat, bivalenten Metallionen und dem Alginatkomplex gilt allgemein:
( )( ) ( )AlginatMe
AlginatMe2
2
cccK
⋅−
= +
+
(6.1)
In Übereinstimmung mit literaturbekannten Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen
Alginat und Mg2+- Ionen [103, 103, 113] wurde für die bakteriellen Alginate eine geringe
Bindungstendenz festgestellt. Desweiteren ermöglichten kernresonanzspektroskopische Mes-
sungen Aussagen hinsichtlich der Selektivität bezüglich bestimmter Monomerbausteine. Im
Falle des Magnesiumions gilt aufgrund der vorliegenden Ergebnisse als gesichert, dass dieses
Ion keinerlei Präferenz hinsichtlich der Anbindung an bestimmte Monomerbausteine hat, d.h.
106
Diskussion
Magnesium bindet nicht-selektiv an die Carboxylatgruppen von Mannuronat- und Guluro-
natresten (s.Abb. 6.8).
Das bivalente Ion kann dabei als potentieller Verknüpfungspunkt zwischen benachbarten
Polymerketten dienen, so dass die Polymerlösung bei Erreichen einer kritischen Ionenkon-
zentration in die Gelphase übergeht. Innerhalb dieses Gelnetzwerkes ist die Mobilität der
Polysaccharidketten in der unmittelbaren Umgebung der Netzwerkpunkte stark eingeschränkt.
Dies führt zur Abnahme der rotativen Korrelationszeit τC und zu einer maßgeblichen Linien-
verbreiterung im Kohlenstoffspektrum.
Mg2+
a)
b)
Abb. 6.8: Schematische Darstellung der Wechselwirkungen zwischen Mg2+- Ionen und bakteriellem
Alginat: a) Mg2+ assoziiert nicht-selektiv mit den Carboxylgruppen der Mannuronat- (gelb) und Guluronatbausteine (blau) b) Mg2+- Ionen bewirken eine schwache Hemmung der mole-
kularen Beweglichkeit des gesamten Alginatmoleküls
Die T1- Relaxation des C-5 Ringkohlenstoffs (Abb. 5.27) zeigt keinerlei Abhängigkeit von der
Mg2+- Konzentration der Lösung und kann im Rahmen des experimentellen Fehlers als
konstant angesehen werden. Schnelle dynamische Prozesse (im MHz- Bereich) innerhalb des
Polysaccharids sind folglich nicht von der Wechselwirkung mit Mg2+- Ionen betroffen.
107
Diskussion
6.6.2 Einfluss von Calciumionen
Im Rahmen der Polysaccharidchemie stellen die Wechselwirkungen zwischen Calciumionen
und Alginatmolekülen einen intensiv untersuchten Bereich der Forschung dar. Eine Vielzahl
von Publikationen befasst sich mit der Bindungskapazität und der Rheologie von Alginaten
[113 - 118] gegenüber Ca2+- Ionen.
Kernresonanzspektroskopische Messungen und moleküldynamische Simulationen [119, 120]
bestätigen die Präferenz von Calciumionen gegenüber GG- Monomerblöcken im Vergleich zu
MM- Blöcken, wie es im Falle der Dimer- Komplexe nachgewiesen werden konnte.
Die Addition von CaCl2 führt bereits in Spurenkonzentrationen (≤ 0,7 mmol ⋅ L-1) zu einem
raschen Anstieg der Viskosität ηapp. der resuspendierten EPS- Proben. Bei weiterer Erhöhung
der Calciumionenkonzentration kommt es schließlich zum Phasenübergang in den Gel-
zustand, d.h. es liegen genügend Ca2+- Ionen in der Lösung vor, um in Verbindung mit dem
bakteriellen Alginat ein Gelnetzwerk auszubilden. Diese Schwellenkonzentration ist bei einer
Ionenkonzentration von 2,7 mmol ⋅ L-1 erreicht.
Der Anstieg und die Gelierung der Probe spiegeln sich in den Linienbreiten der C-5 Man
Referenzlinie (s. Abb. 5.28) wider. Im Gegensatz zur Mg2+- Konzentrationsreihe ist die
Zunahme der Halbwertsbreite im Bereich bis 2,0 mmol ⋅ L-1 wesentlich stärker ausgeprägt
und beträgt 13,9 % bezogen auf die undotierte EPS- Probe gegenüber nur 6,6% bei Magnesi-
um. Dies verdeutlicht, dass Ca2+ als Gegenion zu den Carboxylatgruppen des Alginats stärke-
re ionische Wechselwirkungen eingeht und daraus resultierend die Moleküldynamik merklich
herabsetzt.
Im Bereich des Phasenübergangs zur Gelphase (≈ 2,7 mmol ⋅ L-1 Ca2+) tritt ein abrupter An-
stieg der Halbwertsbreite der C-5 Mannuronatlinie auf. Die Ausbildung eines Gelnetzwerkes
stellt somit eine besonders starke Restriktion in der Beweglichkeit des Polysaccharids dar.
Die Ursachen hierfür liegen sowohl in einer direkten Hinderung der Reorientierung von
Monomerbausteinen durch die Bildung eines dreidimensionalen Netzwerkes in der unmittel-
baren Nachbarschaft zu Verknüpfungsstellen, als auch in der selektiven Anbindung von Ca2+
an MG- Sequenzen des Makromoleküls.
Die scheinbare Abnahme der C-5 Man Halbwertsbreite bei einer Ca2+- Konzentration von 3,6
mmol ⋅ L-1 beruht auf einem Artefakt der Dekonvolution des C-5 Mannuronatsignals. Letz-
108
Diskussion
teres setzt sich wie in 6.5.1 besprochen aus zwei Resonanzlinien (79,1 u. 79,8 ppm) der MM-
und MG- Diadensequenzen zusammen, welche nicht voneinander separiert werden können.
Bei der Dotierung mit Calciumionen erfährt dabei das Signal der MG- Diade eine stärkere
Linienverbreiterung als das der MM- Diade, was zur Folge hat, dass die Amplitude der MG-
Resonanzlinie stark abnimmt, wohingegen die MM- Signalamplitude nahezu unverändert
bleibt. Mit zunehmender Linienverbreiterung wird ein Punkt erreicht, bei dem sich nun die
MG- Signalamplitude so weit verringert hat, dass sie nunmehr unterhalb der halben Signalhö-
he der MM- Resonanzlinie liegt. Somit leistet das C-5 MG- Signal keinen Beitrag mehr zur
experimentell bestimmten Halbwertsbreite.
Desweiteren erlauben die 13C-NMR Spektren der EPS- Lösungen Rückschlüsse hinsichtlich
der Selektivität der Wechselwirkung zwischen den Carboxylgruppen des Alginats und Calci-
um als bivalentes Gegenion. Zum besseren Verständnis wurden die NMR- Spektren einer
undotierten EPS- Lösung und einer Ca2+- dotierten Probe gegenübergestellt (Abb. 6.9). Ginge
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
GMG/MMG C-2 Mana) b)
100 90 80 70 60 50 40
(ppm)100 90 80 70 60 50 40
(ppm)
GMG/MMG C-2 Mana) b)
Abb. 6.9: Vergleich der Hydroxylgruppenresonanzen einer a) undotierten EPS- Lösung (7,5 g ⋅ L-1) und
b) EPS- Lösung mit 1,6 mmol ⋅ L-1 Ca2+; rote Pfeile: verbreiterte Guluronatlinien; grüner Pfeil:
verbreiterte Resonanzlinie des C-2 Man Kohlenstoffs der GMG/MMG- Triade
man, wie im Falle des Magnesiumions, davon aus, dass eine rein statistische Anbindung des
Gegenions an das Polyanion vorläge, so sollten alle Resonanzlinien gleichermaßen von der
Linienverbreiterung betroffen sein und das Verhältnis der Signalintensitäten zueinander
bliebe konstant. Dies ist jedoch, wie der Gegenüberstellung der Spektren zu entnehmen ist,
109
Diskussion
nicht der Fall. Die Addition von Ca2+- Ionen bewirkt eine verstärkte Verbreiterung der
Guluronatresonanzlinien. So erscheinen die Signalintensitäten der Linien der C-5, C-3 und C-
2 Guluronatkohlenstoffe gegenüber denen der anderen Resonanzlinien stark herabgesetzt. Ein
ähnlich starker Abfall der Intensität ist auch bei der C-2 Resonanzlinie der GMG/MMG- Tri-
adensequenz zu beobachten. Andere Mannuronatsignale hingegen werden in einem
wesentlich geringeren Maße verbreitert und deren Intensitätsverhältnisse bleiben innerhalb
der Konzentrationsreihe konstant. Diese Indizien legen den Schluss nahe, dass Calciumionen
Ca2+
a)
b)
Abb. 6.10: Schematische Darstellung der Wechselwirkungen zwischen Ca2+- Ionen und bakteriellem Al-
ginat: a) Ca2+ assoziiert bevorzugt mit den Carboxylgruppen der Guluronatbausteine (blau) b)
Ca2+- Ionen bewirken eine starke Hemmung der molekularen Beweglichkeit des gesamten
Alginatmoleküls, insbesondere aber in der direkten Nachbarschaft von Guluronatmonomer-
bausteinen (breite Schraffur)
eine selektive Präferenz gegenüber der Anbindung an alternierende GMG- Kettensegmente
haben. Die experimentellen Befunde deuten darauf hin, dass es in diesen Abschnitten inner-
halb der Alginatkette zu einer verstärkten Hinderung der Molekülbewegung kommt, was zu
einer erheblichen Verbreiterung der betroffenen Resonanzlinien führt (s. Abb. 6.10). Die
Auswirkungen der Ca2+- Dotierung sind bereits bei geringfügigen Ionenstärken (≤ 0,7 mmol ⋅
L-1) weit unterhalb des Gelierungspunktes sichtbar. Die Moleküldynamik wird demzufolge in
zwei Stufen gehindert: Unterhalb des Gelpunktes sind im Polysaccharid die MG- Gruppen mit
gebundenen Calciumionen in ihrer die Konformation "eingefroren", d.h. die "crankshaft
motion" ist stark gehindert. Oberhalb dieses Punktes wird die molekulare Beweglichkeit zu-
sätzlich durch die dynamischen Restriktionen eines Gelnetzwerks gehemmt.
110
Diskussion
Auf Basis dieser Ergebnisse sowie der Erkenntnisse aus den Untersuchung zu den Effekten
paramagnetischer Ionen wurden ab initio Rechnungen an einem Ca2+- Man - Gul - Dimer-
komplex durchgeführt [121]. Die Berechnungen liefern ein Abbild einer der möglichen Kon-
formationen eines solchen Komplexes, wie er auch lokal innerhalb des Makromoleküls auf-
Abb. 6.11: Darstellung einer möglichen Konformation eines Ca - Man - Gul Dimerkomplexes (nach
Kolster [118]); das Ca2+- Ion ist fünffach koordiniert
tritt. In der Simulation ist das Ca2+- Ion fünffach von Sauerstoffatomen des Man - Gul-
Dimers koordiniert, d.h. man kann von einer chelat-ähnlichen Komplexierung des Kations
ausgehen. Überträgt man dies auf die Gesamtheit des Alginatmoleküls so bedeutet das, dass
sich die alternierenden MG- Sequenzen innerhalb des Makromoleküls besonders für eine
koordinative Bindung mit bivalenten Ionen eignen. In Analogie zu den GG- "Taschen" beim
"Egg-box"- Modell könnte man demzufolge von MG- "Taschen" sprechen, in die Kationen
eingelagert werden. Ist ein Calciumion in einer dieser "Taschen" koordinativ gebunden, so
kann diese als ein potentieller Verknüpfungspunkt für intra- oder intermolekulare Ver-
brückungen mit anderen MG- Sequenzen in ihrer unmittelbaren Umgebung fungieren.
Für ein besseres Verständnis der exakten Konformation des Komplexes wären moleküldyna-
mische Berechnungen der Komplexstruktur des Dimerkomplexes oder größerer Oligomere in
111
Diskussion
wässrigem Medium erforderlich. Diese liegen jedoch zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch
nicht vor.
Das gelierte Bakterienalginat unterscheidet sich hinsichtlich seiner Stabilität wesentlich von
den kommerziellen Algenalginaten. Im Gegensatz zu Manugel ist das Gel aus dem Isolat von
P. aeruginosa nicht stabil hinsichtlich der Verdünnung mit Wasser; das Gel löst sich nach
kurzer Zeit wieder auf, auch ohne äußere mechanische Einflüsse (z.B. Scherkräfte durch das
Rühren).
Eine vollständige Regenerierung der EPS- Lösungen von Ca2+- Ionen wurde mit Hilfe eines
Kationenaustauschers (DOWEX) durchgeführt. Den korrespondierenden 13C-NMR Spektren
kann man entnehmen, dass das in GMG/MMG- Sequenzen gebundene Calciumion nahezu
vollständig vom Austauscherharz komplexiert wird. Die Intensitätsverhältnisse der Resonanz-
signale von undotierter und regenerierter EPS sind identisch, d.h. Calcium liegt lediglich in
nicht nachweisbaren Konzentrationen im Alginat vor. Dennoch ist eine leichte Verbreiterung
der Resonanzlinien der zurückgewonnenen EPS zu beobachten. Es wird angenommen, dass
die Linienverbreiterung auf einer Aufkonzentration während der Dialyse beruht. Nieder-
molekulare Bestandteile der EPS passieren die Dialysemembran, so dass der Massenanteil an
hochmolekularen Polymeren im Dialysat steigt. Demzufolge ist bei der Resolvatisierung der
regenerierten EPS der Anteil hochmolekularer Matrix- Komponenten größer als bei der ur-
sprünglichen EPS.
Die Reversibilität der Gelbildung durch Verdünnung oder konkurrierende Komplexierung
von Calciumionen mittels eines Kationenaustauschers belegt ferner, dass es sich bei den
Alginatgelen um Gelnetzwerke mit fluktuierenden Netzwerkpunkten handelt.
6.6.3 Einfluss von Aluminiumionen
Die Wechselwirkungen zwischen Alginat und Aluminiumionen wurden aufgrund der
amphoteren Eigenschaften dieses Ions bei unterschiedlichen pH- Werten untersucht. Dabei
wurden zwei Messreihen im schwach sauren (pH = 4,0) und im Neutralbereich (pH = 7,0)
durchgeführt. Von Messungen unter alkalischen Bedingungen wurde abgesehen, da Alu-
112
Diskussion
minium hier als [Al(OH)4]- vorliegt und somit als Gegenion zu den Carboxylatgruppen aus-
scheidet.
Die 13C- NMR Spektren beider Messreihen weisen im untersuchten Konzentrationsbereich
keine Anhaltspunkte für Wechselwirkungen zwischen Aluminiumionen und bakteriellem
Alginat auf. Die Linienformen der Hydroxylgruppenresonanzen sind sowohl bei pH 4,0 als
auch bei pH 7,0 unverändert und die Halbwertsbreiten des C-5 Man Referenzresonanzsignals
sind im Rahmen der Messtoleranzen ebenfalls als identisch zu betrachten.
Aufgrund der experimentellen Befunde ist davon auszugehen, dass Aluminiumionen keinerlei
Einfluss auf die Struktur des Alginats ausüben. Es wurden weder Hinweise hinsichtlich einer
koordinativen Bindung an Carboxylat- und Hydroxylgruppen der MG- Sequenzen ähnlich der
von bivalenten Ionen (insbesondere Ca2+- Ionen) an Alginat gefunden, noch konnte eine
Reduktion intramolekularer ionischer Abstoßungskräfte wie im Falle der monovalenten Ionen
beobachtet werden.
Eine mögliche Ursache für das Fehlen von Wechselwirkungen zwischen bakteriellem Alginat
und Aluminiumionen in dem untersuchten Konzentrations- und pH- Bereich ist in deren
spezifischen Eigenschaften zu suchen. Aufgrund seiner hohen Ladungsdichte muss das
Aluminiumion als ein "hartes" Ion, eingestuft werden. Als solches besitzt es eine wesentlich
größere Hydrathülle als die Alkali- bzw. Erdalkalimetallionen der 3. Periode. Es liegt daher
nahe, dass aufgrund der Abschirmung durch die Hydrathülle, welche elektostatischer und
sterischer Natur ist, eine direkte Wechselwirkung mit den Carboxylatgruppen verhindert wird.
Es ist ferner anzumerken, dass bei niedrigen pH- Werten, bei denen eine Wechselwirkung aus
Sicht des Kations günstig wäre, der geringere Deprotonierungsgrad des Alginats dieser positi-
ven Tendenz entgegensteht.
Dieses Ergebnis steht scheinbar im Gegensatz zu den experimentellen Befunden von Gregor
et al. [115], welche für Aluminiumionen ähnlich starke Wechselwirkungen mit Alginat fest-
stellten wie bei Calciumionen. Die Untersuchungen von Gregor et al. beziehen sich auf die
Interaktion der Ionen mit Algenalginat. Bakterielles Alginat von Pseudomonas aeruginosa
hingegen unterscheidet sich sowohl in der Sequenz der Monomerbausteine, als auch durch die
Acetylierung der C-2 bzw. C-3 Kohlenstoffe der Mannuronatgruppen. Es kann daher davon
113
Diskussion
ausgegangen werden, dass die strukturellen Besonderheiten des Bakterienalginats das
Bindungsverhalten von Aluminiumionen negativ beeinflusst.
6.7 Effekt paramagnetischer Ionen
In den vorangegangenen Kapiteln wurde der Einfluss von ionischen Additiven hinsichtlich
inter- bzw. intramolekularen Wechselwirkungen mit bakteriellem Alginat und deren Aus-
wirkungen auf dessen molekulare Beweglichkeit diskutiert. Die lokale Konformation der
MG- Verknüpfungstellen hingegen ist bisher noch nicht näher untersucht worden. Mit Hilfe
des paramagnetischen Mangan-II-Ions soll die unmittelbare lokale Geometrie der Wechsel-
wirkungen zwischen Gegenion und Polysaccharid aufgeklärt werden.
Der Zusatz von paramagnetischen Mn2+- Ionen zeigt bereits bei sehr geringen Konzentra-
tionen (≤ 0,05 mmol ⋅ L-1) einen sichtlichen Einfluss auf die Linienform der Hydroxyl-
gruppenresonanzen der 13C- NMR Spektren. Von der Verbreiterung ist, analog zu den Ergeb-
nissen der Ca2+- Konzentrationsreihe, die Linie der C-5 Guluronatkohlenstoffe am stärksten
betroffen. Ebenso weist der C-5 Kohlenstoff des Mannuronatmonomerbausteins eine rapide
Linienverbreiterung mit zunehmender Mn2+- Konzentration auf. Dies spricht dafür, dass die
Kation - Polyanion Wechselwirkungen primär mit den Sauerstoffatomen der C-6 Carboxylat-
kohlenstoffe auftreten. Dadurch stehen die isotopenmarkierten C-5 Kohlenstoffe in nächster
Nachbarschaft zum Manganion und sind vom paramagnetischen Effekt am stärksten betrof-
fen. Des weiteren weisen die C-2 und C-3 Guluronatlinien ebenfalls eine Linienverbreiterung
Abb. 6.12: Schematische Darstellung der Lokalisierung des Mn2+- Ions innerhalb der Alginatkette
O
O
ROOR
OO
O
ROOR
O
OH
OH
ORO
RO
COO-
COO-
COO-COO-
Mn2+
114
Diskussion
mit steigender Mn2+- Konzentration auf, wobei der Effekt nicht so stark ausgeprägt ist, wie
bei den C-5 Kohlenstoffen. Dies lässt den Schluss zu, dass die Hydroxylsauerstoffe an der
C-2 bzw. C-3 Position zumindest partiell über elektrostatische Anziehungskräfte mit dem
Mn2+- Ion in Wechselwirkung treten.
Im Gegensatz dazu kann festgestellt werden, dass die experimentellen Ergebnisse der NMR-
Spektroskopie keinerlei Anzeichen für elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Mn2+
und den Hydroxylgruppen der C-2 und C-3 Kohlenstoffe der Mannuronatbausteine aufwei-
sen. Dieser Umstand wird auf die Anwesenheit von Acetylgruppen an den O-2 und/oder O-3
Sauerstoffen der Mannuronatreste zurückgeführt.
Es ist bekannt, dass der Acetylierungsgrad der Polyuronsäuren einen entscheidenden Parame-
ter für die Bindungskapazität und -selektivität gegenüber mono- und bivalenten Kationen dar-
stellt [69 - 71, 122, 123]. Darüber hinaus führt die Acetylierung zu einer Erhöhung der
Hydrophobizität der Alginate, was sich in einem reduzierten Quellungsverhalten der Poly-
mere äußert [69]. In Bezug auf die Assoziation von Mn2+- Ionen bedeutet dies, dass aufgrund
der sterischen Hinderung durch die Acetylgruppen der paramagnetische Effekt sich nicht oder
nur in geringem Maße auf die C-2 und C-3 Mannuronatkohlenstoffe auswirkt und diese kaum
von der Linienverbreiterung betroffen sind.
Zusammenfassend kann man sagen, dass die Dotierung mit paramagnetischen Mn2+- Ionen
einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis und zur Lokalisierung von Me2+- Alginat
Wechselwirkungen geleistet hat. Inwieweit diese Erkenntnisse auch auf die Wechselwirkun-
gen mit Ca2+- Ionen übertragbar sind ist noch unklar, allerdings lassen die Ergebnisse hin-
sichtlich der Änderung der molekularen Beweglichkeit bei Ca2+- Dotierung deutliche
Parallelen erkennen.
115
Diskussion
6.8 Stressreaktionen in Biofilmen
Die physikalischen Eigenschaften von Biofilmen werden, wie in den vorangegangenen
Kapiteln gezeigt wurde, maßgeblich von den Wechselwirkungen der organischen Polymer-
matrix des Biofilms mit ionischen Additiven beeinflusst. Diese Einflüsse können in der Regel
als externe Einflüsse betrachtet werden (Wasserhärte, Salzgehalt von Gewässern etc.).
Beschäftigt man sich jedoch näher mit der Rheologie von Biofilmen, so dürfen auch die
internen Faktoren nicht vernachlässigt werden (z.B. enzymatischer Abbau durch Alginat-
lyase). Dies e Effekte, die hier unter dem Stichwort "Stressphänomene" zusammengefasst
werdenso sollen, spielen gerade in den unterschiedlichen Wachstumsphasen des Biofilms eine
be-deutende Rolle.
Im Rahmen der Messungen an hermetisch eingeschlossenen Proben (Nährstoff- und Sauer-
stoffarmut) konnte die Änderung zweier wesentlicher Merkmale innerhalb der NMR- Spekt-
ren des Biofilms festgestellt werden: Zum Einen eine deutliche Abnahme der Linienbreiten
der Resonanzsignale über den Verlauf der Messungen, zum Anderen das Auftreten neuer Re-
sonanzlinien im Spektrum.
Die verbesserte Auflösung des Spektrums aufgrund der allgemeinen Abnahme der Linienbrei-
te deutet auf eine Herabsetzung der Probenviskosität hin. Wie aus der Abbildung 5.35 deut-
lich hervorgeht, nimmt die Linienbreite der C-5 Referenzresonanzlinie des Biofilms
innerhalb der ersten 30 Tage stetig ab. Bezogen auf die Halbwertsbreite zu Versuchsbeginn
beträgt die Linienbreitenabnahme nach 48 h bereits 5,3% und bei Versuchsende sogar 17,8%.
Der Abfall scheint in erster Näherung exponentieller Natur zu sein und einem Grenzwert zu-
zustreben. Dies kann als Anzeichen dafür gewertet werden, dass es innerhalb des Biofilms
vermehrt zu einem partiellen Abbau des polymeren Materials, d.h. vorwiegend des Alginats,
durch Lyase-induzierte Abbaureaktionen (s. Abb. 6.13) kommt. Derartige Zersetzungsreakti-
onen treten anscheinend verstärkt direkt nach der Umstellung von nähr- bzw. sauerstoff-
reichen zu entsprechend „ungünstigen“ Lebensbedingungen auf und können daher als „Stress-
reaktion“ des Bakteriums auf die veränderten äußeren Bedingungen gewertet werden [105].
116
Diskussion
I O
COO
H
OR
OH
OR
OO
O
OR
OO
OOOC
H
AS 1
AS 2
AS 1
R OH
II
III
Abb. 6.13: Enzymatischer Abbau von Alginat nach Gacesa [124]; I: Kompensation der negativen Ladung
des Carboxylatanions, II: basen-katalysierte Abstraktion des Protons am C-5 Kohlenstoffatom,
III: β- Eliminierung der 4-O- glycosidischen Bindung; AS 1 bzw. AS 2 = Aminosäuregruppen
der Lyase, R = Uronsäurerest, aus Gründen der besseren Übersicht wurden die Hydroxylgrup-
pen an C-2 und C-3 sowie die glycosidische Bindung an C-1 nicht mit abgebildet
Wie den Übersichtsspektren (Abb. 5.36) zu entnehmen ist, finden die markantesten Verände-
rungen der EPS- Matrix innerhalb der ersten 48 h nach der Probenahme statt. Man erkennt
deutlich die neu hinzugekommenen Resonanzlinien im Bereich der Methylen- und Methin-
gruppen sowie die Resonanzlinien bei 84,2 und 88,4 ppm. Vergleichweise schwach in ihrer
Signalintensität sind die Linien der C=C – Resonanzen im Bereich zwischen 115 - 135 ppm.
Letztere erfahren auch in den späteren Phasen des Versuchs keinen merklichen Zuwachs. Im
Resonanzbereich zwischen 35 - 57 ppm hingegen ist sogar 25 Tage nach der Entnahme des
Biofilms noch eine geringe Signalzunahme zu beobachten (s. Abb. 6.14).
117
Diskussion
60 50 40 30 20
(ppm)
56,6
ppm
52,5
ppm
Abb. 6.14: Ausschnitt der Methin- u. Methylenkohlenstoffresonanzen eines 25 d alten Biofilms
Eine Charakterisierung dieser Signale konnte aufgrund der geringen Signalintensitäten und
der schlechten Auflösung der Signale im Methylengruppenbereich (Abb. 6.14) nicht vorge-
nommen werden. Es wird jedoch angenommen, dass es sich hierbei um Spaltprodukte aus
dem Alginatabbau oder um andere Metaboliten von P. aeruginosa handelt. Der Vergleich mit
dem mit Klebsiella aerogenes Lyase vollständig abgebauten Biofilm (Abb. 5.40) unterstreicht
diese These, da es sich bei beiden Lyasen um nichtselektive Alginatlyasen handelt und keine
neuen Abbauprodukte neben den bereits vorhandenen Resonanzsignalen nachgewiesen
werden konnten.
Der Einzelkolonieausstrich des 13C- markierten Biofilms nach Abschluss der Versuchsreihe
hat das selbe Wachstum und Färbung wie der Phänotyp. Dies kann als ein Anzeichen gewer-
tet werden, dass keine Revertierung der Bakterien in größerem Maßstab stattgefunden hat. Es
ist anzumerken, dass der Einzelkolonieausstrich lediglich qualitative Informationen wider-
spiegelt, da keine vergleichende Zelldichtezählung vor und nach dem Dauerversuch vorliegt.
Die eindeutige Differenzierung zwischen Stress-induzierten Reaktionen und normalen
Wachstums- oder Alterungsprozessen des Biofilms allein auf der Basis der vorliegenden
NMR- spektroskopischen Untersuchungen erweist sich als schwierig. Aufgrund des Ver-
suchsaufbaus kommt es zwangsläufig zu einer Überlagerung beider Effekte. Weiterführende
Messungen, bei denen Biofilme von P. aeruginosa SG81 über einen ausgedehnten Zeitraum
118
Diskussion
bebrütet und dann direkt nach Entnahme vermessen werden, könnten hier als Referenz
dienen.
119
Zusammenfassung
7. Zusammenfassung
Die Untersuchungen zu den schwachen Wechselwirkungen innerhalb von Biofilmen von
Pseudomonas aeruginosa SG81 und ihren Isolaten (EPS, Alginat) zeigen, dass die mechani-
schen Eigenschaften des Biofilms maßgeblich durch das Milieu des wässrigen Lösemittels
(pH - Wert, Ionenstärke, Art der mono- und bivalenten Gegenionen) bestimmt werden.
Die Linienformanalyse der Li+- Konzentrationsreihen bestätigen die Übertragbarkeit der rheo-
logischen und spektroskopischen Befunde von Kirschner und Moritz [97] an dem
Modellsystem Polyacrylsäure auf Isolate mikrobieller Herkunft. Ein Vergleich der C-5 Reso-
nanzlinien mit simulierten Spektren belegt eindeutig die starke Abnahme der Korrelationszeit
τc schon bei geringen Ionenstärken. Die Addition von monovalenten Gegenionen führt somit
zu einer Reduktion der intramolekularen, elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen be-
nachbarten Carboxylgruppen innerhalb des Polysaccharids und erlaubt eine stärkere Ver-
knäuelung der Makromoleküle.
Erwartungsgemäß weisen die NMR- spektroskopischen Messergebnisse zur Wechselwirkung
zwischen bakteriellem Alginat und bivalenten Ionen (Mg2+, Ca2+) große Differenzen hinsicht-
lich ihrer Natur und Ausprägung auf. So werden für Mg2+- Ionen lediglich unspezifische, e-
lektrostatische Wechselwirkungen beobachtet, wohingegen Ca2+- Ionen ein spezifisches Bin-
dungsverhalten gegenüber Bakterienalginat zeigen.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein neues Modell zur Beschreibung der Wechselwirkung
zwischen Ca2+- Ionen und bakteriellem Alginat vorgeschlagen werden, welches die spezifi-
schen Struktureigenschaften der Bakterienalginate, namentlich die Abwesenheit von Guluro-
natblöcken, berücksichtigt. Kernpunkt dieses Modells stellt die chelat-ähnliche Kom-
plexierung der Ca2+- Ionen in den Bereichen alternierender MG- Sequenzen dar. Die Calcium-
bindung in diesen MG- "Taschen" führt aufgrund ihrer kooperativen, elektostatischen
Wechselwirkung zu einer drastischen Herabsetzung der lokalen, molekularen Beweglichkeit
und zur Ausbildung eines potentiellen Netzwerkpunktes. Bei zunehmender Dotierung mit
Calciumionen erhöht sich die Anzahl dieser Netzwerkpunkte und es kommt zu Ca2+-
vermittelten intermolekularen Wechselwirkungen benachbarter Alginatketten - ein Gel-
netzwerk entsteht. Wie die beobachtete Reversibilität der Gelbildung von Bakterienalginaten
120
Zusammenfassung
mit Ca2+- Ionen zeigt, handelt es sich hierbei um ein Gelnetzwerk mit fluktuierenden Netz-
werkpunkten.
Die Dotierung von EPS- Lösung mit paramagnetischen Mn2+- Ionen lieferte grundlegende
Informationen zum Komplexbildungsverhalten von bakteriellem Alginat und der lokalen
Konformation der potentiellen Verknüpfungsstellen. Die Messungen zeigten, dass die para-
magnetische Linienverbreiterung bei den Resonanzsignalen der Guluronatresonanzen
wesentlich ausgeprägter ist als im Falle der Mannuronatlinien. Gleichzeitig unterstreichen die
experimentellen Befunde die Bedeutung der Acetylierung für das Komplexbildungsverhalten
von Alginaten gegenüber bivalenten Ionen. So konnte nachgewiesen werden, dass die Acety-
lierung des bakteriellen Alginats an den O-2 und O-3 Sauerstoffatomen der Mannuronat-
bausteine die Assoziation von Me2+- Ionen infolge der sterischen Hinderung durch die
Acetylgruppen stark beeinträchtigt.
Die Auswirkungen von Stressfaktoren (Nährstoff- und Sauerstoffarmut) auf Mikoorganismen
und ihre umgebende Biofilmmatrix konnten in vivo untersucht werden. Die Ergebnisse deuten
darauf hin, dass es unter Stress zu einer verstärkten Ausschüttung von Alginatlyase kommt,
welche einen enzymatischen Abbau des Alginats in Gang setzt. Eine exakte Charakte-
risierung der Spalt- und Sekundärprodukte konnte aufgrund der schwachen Signalintensitäten
und der unzureichenden Auflösung im Methylgruppenresonanzbereich nicht vorgenommen
werden. Dennoch stellen diese Untersuchungen eine Grundlage für weiterführende Forschun-
gen hinsichtlich der Korrelation von Lebensbedingungen und Strukturmerkmalen der Matrix-
polysaccharide dar.
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130
Anhang
9. Anhang Anhang A - Tabellenanhang
Tab. 9.1: Einfluss der Li+ - Ionenkonzentration auf die relative spektrale Linienbreite des C-5 Man
Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)
Ionenkonz. [mol ⋅ L-1]
rel. Linienbr.
0,00 1,000 0,01 0,965 0,02 0,973 0,05 0,977 0,10 0,983 0,50 0,949 1,00 0,947 1,50 0,969 2,00 0,965 2,50 0,992
Tab. 9.2: Einfluss der Li+ - Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit T1 des C-5 Man
Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)
Ionenkonz. [mol ⋅ L-1]
T1[s]
Std.abw. [s]
0,00 0,306 0,010 0,01 0,277 0,006 0,02 0,278 0,010 0,05 0,284 0,010 0,10 0,276 0,009 0,50 0,290 0,019 1,00 0,238 0,013 1,50 0,261 0,009 2,00 0,248 0,015 2,50 0,289 0,006
131
Anhang
Tab. 9.3: Einfluss der Li+- Ionenkonzentration auf die relative spektrale Linienbreite des C-5 Man
Signals einer Alginatlösung (10 g/L)
Ionenkonz. [mol ⋅ L-1]
rel. Linienbr.
0,00 1,000 0,01 0,921 0,02 0,912 0,05 0,910 0,10 0,876 0,50 0,821 1,00 0,817 1,50 0,851 2,00 0,825 2,50 0,828
Tab. 9.4: Einfluss der Li+- Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit T1 des C-5 Man
Signals einer Alginatlösung (10 g/L)
Ionenkonz. [mol ⋅ L-1]
T1[s]
Std.abw. [s]
0,00 0,297 0,006 0,01 0,273 0,012 0,02 0,294 0,013 0,05 0,303 0,004 0,10 0,294 0,007 0,50 0,267 0,013 1,00 0,235 0,014 1,50 0,240 0,013 2,00 0,315 0,010 2,50 0,245 0,012
Tab. 9.5: Einfluss der Mg2+ - Ionenkonzentration auf die Halbwertsbreite des C-5 Man Signals einer
EPS- Lösung (7,5 g/L)
Ionenkonz. [mmol ⋅ L-1]
Linienbr. hH[Hz]
Std.abw. [Hz]
0,0 140,3 2,1 0,7 138,3 2,1 1,2 144,1 2,2 1,6 146,3 2,2 2,0 149,5 2,2 2,7 179,2 2,7 3,6 184,7 2,8
132
Anhang
Tab. 9.6: Einfluss der Mg2+ - Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit T1 des C-5 Man
Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)
Ionenkonz. [mmol ⋅ L-1]
T1[s]
Std.abw. [s]
0,0 0,308 0,008 0,7 0,291 0,007 1,2 0,307 0,005 1,6 0,287 0,010 2,0 0,318 0,010 2,7 0,298 0,010 3,6 0,290 0,019
Tab. 9.7: Einfluss der Ca2+ - Ionenkonzentration auf die Halbwertsbreite des C-5 Man Signals einer EPS-
Lösung (7,5 g/L)
Ionenkonz. [mmol ⋅ L-1]
Linienbr. hH[Hz]
Std.abw. [Hz]
0,0 141,0 2,1 0,7 145,9 2,2 1,2 150,0 2,3 1,6 157,0 2,4 2,0 160,5 2,4 2,7 183,9 2,8 3,6 173,3 2,6
Tab. 9.8: Einfluss der Ca2+ - Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit T1 des C-5 Man
Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)
Ionenkonz. [mmol ⋅ L-1]
T1[s]
Std.abw. [s]
0,0 0,318 0,008 0,7 0,308 0,008 1,2 0,330 0,005 1,6 0,332 0,019 2,0 0,350 0,014 2,7 0,320 0,013 3,6 0,346 0,011
133
Anhang
Tab. 9.9: Einfluss der Al3+ - Ionenkonzentration auf die Halbwertsbreite des C-5 Man Signals einer EPS-
Lösung (7,5 g/L); (pH = 4)
Ionenkonz. [mmol ⋅ L-1]
Linienbr. hH[Hz]
Std.abw. [Hz]
0,0 152,3 2,3 0,1 153,8 2,3 0,5 152,7 2,3 1,0 150,6 2,2 1,5 153,2 2,3 2,0 154,1 2,3
Tab. 9.10: Einfluss der Al3+ - Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit T1 des C-5 Man
Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L); (pH = 4)
Ionenkonz. [mmol ⋅ L-1]
T1[s]
Std.abw. [s]
0,0 0,311 0,007 0,1 0,315 0,006 0,5 0,314 0,007 1,0 0,317 0,009 1,5 0,314 0,004 2,0 0,308 0,011
Tab. 9.11: Einfluss der Al3+ - Ionenkonzentration auf die Halbwertsbreite des C-5 Man Signals einer EPS-
Lösung (7,5 g/L); (pH = 7)
Ionenkonz. [mmol ⋅ L-1]
Linienbr. hH[Hz]
Std.abw. [Hz]
0,0 123,4 1,9 0,1 122,6 1,8 0,5 122,6 1,8 1,0 125,5 1,9 1,5 121,7 1,8 2,0 124,1 1,9
134
Anhang
Tab. 9.12: Einfluss der Al3+ - Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit T1 des C-5 Man
Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L); (pH = 7)
Ionenkonz. [mmol ⋅ L-1]
T1[s]
Std.abw. [s]
0,0 0,312 0,010 0,1 0,321 0,009 0,5 0,309 0,007 1,0 0,311 0,013 1,5 0,316 0,007 2,0 0,312 0,012
Tab. 9.13: Zeitabhängige Änderung der Linienbreite der C-5 Mannuronatlinie im Spektrum eines nativen
Biofilms von P. aeruginosa SG81 unter Einfluss von Stressfaktoren (Nährstoff- und Sauer-
stoffknappheit)
Zeit [d]
Linienbr. hH[Hz]
Std.abw. [Hz]
0 190,8 2,9 1 185,9 2,8 2 179,6 2,7
14 165,4 2,5 20 165,2 2,5 25 166,9 2,5 27 166,2 2,5 30 165,4 2,5
150 156,8 2,3
135
Anhang
Anhang B - Abbildungsanhang
0.01 M
0.02 M
0.05 M
0.1 M
1.0 M
2.0 M
τ = 4250 ns
τ = 3750 ns
τ = 3500 ns
τ = 3250 ns
τ = 4500 ns
τ = 3250 ns
80 75 ppm 80 75
Abb. 9.1: Gegenüberstellung experimenteller Alginatspektren (Li+ - Konzentrationsreihe, links) mit
simulierten Spektren (isotrope Rotationsdiffusion, rechts) der C-5 Mannuronatresonanzlinie;
Anisotropietensor der inneren Kohlenstoffe von Ammoniumtartrat: (NH4)2C4H4O6 (σ11 = σiso
+ 13ppm, σ22 = σiso + 7ppm, σ33 = σiso – 20ppm
136
Anhang
Anhang C - Tabellenverzeichnis
Tab. 2.1: Spannweite mikrobieller Existenz nach Flemming [2]................................... 4
Tab. 2.2: Beispiele für bakterielle Infektionen, die im Zusammenhang mit Biofilmen
stehen [29].......................................................................................................
7
Tab. 2.3: Übersicht über die Funktionalität der EPS innerhalb von Biofilmen.............. 12
Tab. 2.4: Zusammensetzung der EPS einer Laborkultur von Pseudomonas
aeruginosa SG81 bezogen auf 109 Zellen....................................................... 15
Tab. 5.1: Temperaturabhängige Änderung der Halbwertsbreite [Hz] der C-5 Man u.
Gul Resonanzlinien.......................................................................................... 61
Tab. 6.1: Verschiebungswerte der Resonanzsignale [ppm] für P. aeruginosa und L.
digitata in der Gegenüberstellung................................................................... 90
Tab. 6.2: Sequenzanalyse und Bestimmung des M/G- Verhältnisses für P.
aeruginosa SG81 und L. digitata.................................................................... 91
Tab. 9.1: Einfluss der Li+ - Ionenkonzentration auf die relative spektrale Linienbreite
des C-5 Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)......................................... 131
Tab. 9.2: Einfluss der Li+ - Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit
T1 des C-5 Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)..................................... 131
Tab. 9.3: Einfluss der Li+- Ionenkonzentration auf die relative spektrale Linienbreite
des C-5 Man Signals einer Alginatlösung (10 g/L)......................................... 132
Tab. 9.4: Einfluss der Li+- Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit
T1 des C-5 Man Signals einer Alginatlösung (10 g/L).................................... 132
Tab. 9.5: Einfluss der Mg2+ - Ionenkonzentration auf die Halbwertsbreite des C-5
Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)....................................................... 132
Tab. 9.6: Einfluss der Mg2+ - Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxations-
zeit T1 des C-5 Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L).............................. 133
Tab. 9.7: Einfluss der Ca2+ - Ionenkonzentration auf die Halbwertsbreite des C-5
Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)....................................................... 133
Tab. 9.8: Einfluss der Ca2+ - Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit
T1 des C-5 Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L)..................................... 133
Tab. 9.9: Einfluss der Al3+ - Ionenkonzentration auf die Halbwertsbreite des C-5
Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L); (pH = 4)....................................... 134
137
Anhang
Tab. 9.10: Einfluss der Al3+ - Ionenkonzentration auf die Spin – Gitter Relaxations-
zeit T1 des C-5 Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L); (pH = 4)............ 134
Tab. 9.11: Einfluss der Al3+ - Ionenkonzentration auf die Halbwertsbreite des C-5
Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L); (pH = 7).................................... 134
Tab. 9.12: Einfluss der Al3+ - Ionenkonzentration auf die Spin – Gitter Relaxations-
zeit T1 des C-5 Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L); (pH = 7)............ 135
Tab. 9.13: Zeitabhängige Änderung der Linienbreite der C-5 Mannuronatlinie im
Spektrum eines nativen Biofilms von P. aeruginosa SG81 unter Einfluss
von Stressfaktoren (Nährstoff- und Sauerstoffknappheit)............................ 135
138
Anhang
Anhang D - Abbildungsverzeichnis
Abb. 2.1: „Microbial mats“ im Yellowstone Nationalpark (USA).................................... 5
Abb. 2.2: Entstehung und Evolution eines Biofilms in einem Wassersystem................... 9
Abb. 2.3: Darstellung der Biofilmstruktur in einem Fließwassersystem........................... 10
Abb. 2.4: Aufbau eines N-acyl- L-Homoserinlacton Autoinduktors................................. 11
Abb. 2.5: Schematische Darstellung der physikalischen und chemischen Prozesse
innerhalb eines Biofilms [56].............................................................................
14
Abb. 2.6: Schematische Darstellung der unterschiedlichen Wechselwirkungskräfte
innerhalb der EPS- Matrix.................................................................................
15
Abb. 2.7: Häufige Monomerbausteine in Polysacchariden (Teil I)[60]............................ 18
Abb. 2.8: Häufige Monomerbausteine in Polysacchariden (Teil II)[60]........................... 19
Abb. 2.9: Darstellung der Beweglichkeit der glycosidischen Bindung anhand dreier
Beispiele.............................................................................................................
20
Abb. 2.10: Monosaccharidische Grundbausteine des Alginats: D- Mannuronat und L-
Guluronat.........................................................................................................
21
Abb. 2.11: Ausschnitt aus einem Alginatmolekül bakterieller Herkunft.......................... 22
Abb. 2.12: Grundzüge der Biosynthese bakterieller Alginate........................................... 23
Abb. 2.13: Das "Egg-box" Modell für Calcium- Alginatgele nach Yalpani [80].............. 25
Abb. 3.1: Darstellung der Spinverteilung im thermischen Gleichgewicht im
Laborkoordinatensystem....................................................................................
26
Abb. 3.2: Darstellung des Wachstums des makroskopischen Magnetisierungsvektors
für ein Spinsystem mit TzM 1 = 20 s................................................................
28
Abb. 3.3: Schema eines Inversion Recovery- Experiments............................................... 29
Abb. 3.4: Impulsfolge zur Bestimmung der Spin - Gitter Relaxationszeit T1 von 13C-
Kernen................................................................................................................
30
Abb. 3.5: Darstellung der zeitlichen Abnahme der Quermagnetisierung My‘................... 31
Abb. 3.6: Darstellung der Abnahme des Magnetisierungsvektors Mxy in der x,y- Ebene
für ein Spinsystem mit T2 = 3 s..........................................................................
32
Abb. 3.7: Schema der Auswirkungen einer Carr-Purcell-Maiboom-Gill- Sequenz zur
Bestimmung der Spin - Spin Relaxationszeit T2................................................
33
Abb. 3.8: Schematische Darstellung eines CPMG- Spektrums in der Zeitdomäne.......... 34
139
Anhang
Abb. 3.9: Darstellung der Halbwertsbreite an einem simulierten Resonanzsignal
(Lorentzkurve)...................................................................................................
35
Abb. 3.10: Direkte Kopplung von Elektronen- und Kernspin........................................... 37
Abb. 3.11: Kerne in der näheren Umgebung eines ungepaarten Elektrons erfahren
fluktuierende Magnetfelder in der x,y- Ebene.................................................
38
Abb. 5.1: 13C{1H}-NMR Spektrum (statisch) eines nativen Biofilms von P. aeruginosa
SG81..................................................................................................................
45
Abb. 5.2: 13C- CP-NMR Spektrum (statisch) eines nativen Biofilms von P. aeruginosa
SG81..................................................................................................................
46
Abb. 5.3: 13C- CP-NMR Spektrum eines nativen Biofilms von P. aeruginosa SG81,
Ausschnittsvergrößerung der Hydroxylkohlenstoffresonanzen.........................
47
Abb. 5.4: 13C{1H}-NMR Spektrum von partiell abgebautem und deacetyliertem
Alginat von P. aeruginosa SG81 bei T = 333 K................................................
48
Abb. 5.5: Ausschnittsvergrößerung des Bereichs der anomeren Kohlenstoffatome......... 49
Abb. 5.6: Ausschnittsvergrößerung des Resonanzbereichs der Hydroxylkohlenstoffe..... 49
Abb. 5.7: Zuordnung der 13C- Signale der M-2, M-3 und G-3 Ringkohlenstoffe zu
einzelnen Triadensequenzen..............................................................................
50
Abb. 5.8: 13C{1H}-NMR Spektrum (statisch) eines 13C- angereicherten Biofilms von
P. aeruginosa SG81...........................................................................................
52
Abb. 5.9: Ausschnittsvergrößerung des Resonanzbereichs der Hydroxylgruppen-
kohlenstoffe eines 13C- angereicherten Biofilms von P. aeruginosa.................
53
Abb. 5.10: 13C{1H}-NMR Spektrum (statisch) einer wässrigen, 13C- angereicherten
Lösung (7,5 g/L) von EPS...............................................................................
54
Abb 5.11: Resonanzbereich der Hydroxylgruppenkohlenstoffe einer wässrigen EPS -
Lösung (7,5 g/L)..............................................................................................
55
Abb 5.12: Resonanzbereich der Hydroxylgruppenkohlenstoffe einer wässrigen Alginat
- Lösung (10,0 g/L)..........................................................................................
56
Abb. 5.13: 13C{1H}-NMR Spektrum (statisch) einer EPS- Lösung bei unterschied-
lichen pH- Werten...........................................................................................
57
Abb. 5.14: 5×5 µm Ausschnitte einer AFM- Aufnahme von einer getrockneten EPS-
Lösung auf Mica..............................................................................................
58
140
Anhang
Abb. 5.15: 13C{1H}- NMR Spektren einer wässrigen EPS- Lösung (7,5 g/L) in
Abhängigkeit von der Temperatur..................................................................
60
Abb. 5.16: Darstellung der Veränderung der Linienbreite des C-5 Man Resonanz-
signals in Abhängigkeit von der Temperatur..................................................
61
Abb. 5.17: Darstellung der Veränderung der Linienbreite des C-5 Gul Resonanzsignals
in Abhängigkeit von der Temperatur...............................................................
62
Abb. 5.18: Abhängigkeit der apparenten Viskosität ηapp einer 3,6%igen PVA, einer
20,2%igen PAS und einer EPS- Lösung von der LiCl- Ionenstärke...............
63
Abb. 5.19: 13C{1H}- NMR Spektren einer wässrigen EPS – Lösung (7,5 g/L) in
Abhängigkeit von der LiCl- Ionenstärke.........................................................
64
Abb. 5.20: Einfluss der Li+- Ionenkonzentration auf die relative spektrale Linienbreite
des C-5 Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L).........................................
65
Abb. 5.21: Einfluss der Li+- Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit
T1 des C-5 Man Signals einer EPS- Lösung....................................................
65
Abb. 5.22: 13C{1H}- NMR Spektren der Hydroxylgruppen in einer wässrigen
Alginatlösung (10 g/L) in Abhängigkeit von der Li+- Konzentration.............
67
Abb. 5.23: Einfluss der Li+- Ionenkonzentration auf die relative spektrale Linienbreite
des C-5 Man Signals einer Alginatlösung (10 g/L).........................................
68
Abb. 5.24: Einfluss der Li+- Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit
T1 des C-5 Man Signals einer Alginatlösung (10 g/L)....................................
68
Abb. 5.25: 13C{1H}- NMR Spektren der Hydroxylgruppenresonanzlinien in einer
wässrigen EPS- Lösung (7,5 g/L) in Abhängigkeit von der Mg2+- Kon-
zentration.........................................................................................................
71
Abb. 5.26: Darstellung der Veränderung der Linienbreite des C-5 Man Resonanz-
signals in Abhängigkeit von der Mg2+- Konzentration in einer EPS- Lösung
(7,5 g/L)...........................................................................................................
72
Abb. 5.27: Einfluss der Mg2+- Ionenkonzentration auf die Spin – Gitter Relaxation T1
des C-5 Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L).........................................
72
Abb. 5.28: 13C{1H}- NMR Spektren der Hydroxylgruppenresonanzlinien in einer
wässrigen EPS- Lösung (7,5 g/L) in Abhängigkeit von der Ca2+- Kon-
zentration.........................................................................................................
74
141
Anhang
Abb. 5.29: Darstellung der Veränderung der Linienbreite des C-5 Man Resonanz-
signals in Abhängigkeit von der Ca2+- Konzentration in einer EPS- Lösung
(7,5 g/L)...........................................................................................................
75
Abb. 5.30: Einfluss der Ca2+- Ionenkonzentration auf die Spin - Gitter Relaxationszeit
T1 des C-5 Man Signals einer EPS- Lösung (7,5 g/L).....................................
76
Abb. 5.31: Änderung der Linienbreite auf halber Signalhöhe (Hz) nach Regenerierung
der EPS mittels Kationenaustauscher DOWEX..............................................
77
Abb. 5.32: 13C{1H}- NMR Spektren der Hydroxylgruppenresonanzlinien in einer
wässrigen EPS- Lösung (7,5 g/L) in Abhängigkeit von der Al3+- Kon-
zentration (pH = 4,0).......................................................................................
79
Abb. 5.33: 13C{1H}- NMR Spektren der Hydroxylgruppenresonanzlinien in einer
wässrigen EPS- Lösung (7,5 g/L) in Abhängigkeit von der Al3+- Kon-
zentration (pH = 7,0).......................................................................................
80
Abb. 5.34: 13C{1H}- NMR Spektren der Hydroxylgruppenresonanzlinien in einer
wässrigen EPS- Lösung (7,5 g/L) in Abhängigkeit von der Mn2+- Kon-
zentration.........................................................................................................
82
Abb. 5.35: Zeitabhängige Änderung der Linienbreite der C-5 Mannuronatlinie im
Spektrum eines nativen Biofilms von P. aeruginosa SG81 unter Einfluss
von Stressfaktoren (Nährstoff- und Sauerstoffknappheit)...............................
84
Abb. 5.36: 13C{1H}- NMR Spektren eines 13C- angereicherten nativen Biofilms von P.
aeruginosa SG81.............................................................................................
85
Abb. 5.37: 13C{1H}- NMR Spektren eines Biofilms von P. aeruginosa 48 h nach der
Entnahme.........................................................................................................
86
Abb. 5.38: 13C{1H}- NMR Spektren eines Biofilms von P. aeruginosa nach 150
Tagen Lagerung unter Sauerstoff- und Nährstoffarmut..................................
87
Abb. 5.39: Einzelkolonieausstrich des Biofilms nach Abschluß des Dauerversuchs........ 87
Abb. 5.40: 13C{1H}- NMR Spektren abgebauter Biofilme................................................ 88
Abb. 6.1: 13C{1H}- NMR Spektren eines unmarkierten und eines 13C- markierten
Biofilms..............................................................................................................
93
Abb. 6.2: Darstellung der Monomereinheiten innerhalb bakteriellen Alginats und ihrer
Isotopenmarkierung...........................................................................................
94
Abb. 6.3: Gegenüberstellung der Hydroxylkohlenstoffresonanzlinien von a) nativem
Biofilm und b) einer EPS- Lösung (7,5 g/L).....................................................
96
142
Anhang
Abb. 6.4: Schematische Darstellung der „crankshaft motion“ anhand eines Ausschnitts
aus einem Alginatmolekül.................................................................................
97
Abb. 6.5: Gegenüberstellung von intra- und intermolekularen Wechselwirkungen in
Polymeren..........................................................................................................
98
Abb. 6.6: Gegenüberstellung experimenteller Alginatspektren mit simulierten Spektren
der C-5 Mannuronatresonanzlinie......................................................................
104
Abb. 6.7: Schematische Darstellung der Konformationsänderung eines Alginat-
moleküls in Abhängigkeit von der Li+- Ionenstärke..........................................
105
Abb. 6.8: Schematische Darstellung zwischen Mg 2+- Ionen und bakteriellem Alginat... 107
Abb. 6.9: Vergleich der Hydroxylgruppenresonanzen einer a) undotierten EPS- Lösung
(7,5 g/L) und b) EPS- Lösung mit 1,6 mmol/L Ca2+.........................................
109
Abb. 6.10: Schematische Darstellung zwischen Ca2+- Ionen und bakteriellem Alginat... 110
Abb. 6.11: Darstellung einer möglichen Konformation eines Ca – Man – Gul
Dimerkomplexes..............................................................................................
111
Abb. 6.12: Schematische Darstellung der Lokalisierung des Mn2+- Ions innerhalb der
Alginatkette.....................................................................................................
114
Abb. 6.13: Enzymatischer Abbau von Alginat nach Gacesa [124]................................... 117
Abb. 6.14: Ausschnitt der Methin- und. Methylenkohlenstoffresonanzen eines 25 d
alten Biofilms..................................................................................................
118
Abb. 9.1: Gegenüberstellung experimenteller Alginatspektren (Li+ - Konzentrations-
reihe, links) mit simulierten Spektren (isotrope Rotationsdiffusion, rechts)
der C-5 Mannuronatresonanzlinie......................................................................
136
143
Anhang
Anhang E - Abkürzungsverzeichnis
9.1 NMR- Abkürzungen
α, β Energiezustände MF Molecular Frame
0Br
externes Magnetfeld Nα, Nβ Besetzungszahlen des
0B z- Komponente des
Magnetfeldvektors 0Br
NMR Nuclear Magnetic Resonance
1Br
Magnetfeld, erzeugt durch rf- Puls PAS Principal Axis System
1B Betrag des Magnetfeldvektors 1Br
ppm Einheit der chemischen
Verschiebung (parts per million)
b1/2 Halbwertsbreite rf- Puls Radiofrequenzimpuls
CP Cross Polarisation
(Kreuzpolarisation)
RF Rotor Frame
CPMG Carr-Purcell-Meiboom-Gill
Pulssequenz
isoσ isotroper Wert des
Abschirmungstensors
DF Director Frame iiσ Hauptachsenwerte des
Abschirmungstensors im PAS
∆E Energiedifferenz zwischen α- und
β- Niveau
τ Zeitabschnitt
FID Free Induction Decay τc Korrelationszeit
h Plank’sches Wirkungsquantum τP Pulslänge
I Kernspinquantenzahl t Zeit
I(t) Intensität zum Zeitpunkt t T Temperatur
I0 Intensität zum Zeitpunkt t = 0 T1 Spin-Gitter-Relaxationszeit
kB Boltzmann- Konstante T1e longitudinale
Elektronenspinrelaxationszeit
LF Laboratory Frame T2 Spin-Spin- Relaxationszeit
µr magnetisches Moment T2e transversale
Elektronenspinrelaxationszeit
Mr
Magnetisierung ω Kreisfrequenz [rad/s]
M0 Maximalwert der Magnetisierung x´,y´,z´ Koordinatenachsen des
rotierenden Koordinatensystems
144
Anhang
9.2 Andere Abkürzungen
AFM Atomic Force Microscopy HSL Homoserinlacton
CF Cystic Fibrosis ISP Intracellular Storage Products
Corg organisch gebundener Kohlenstoff Man Mannuronatmonomerbausteine
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure NBA Nutrient Broth Agar
EPS Extracellular Polymeric
Substances
PAS Polyacrylsäure
gn Erdbeschleunigung PIA Pseudomonas Isolation Agar
Gul Guluronatmonomerbausteine PVA Polyvinylalkohol
ηapp apparente Viskosität THF Tetrahydrofuran
145