untersuchung von zusammenhängen zwischen pflanzlichen...
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Untersuchung von Zusammenhängen zwischen
pflanzlichen Emissionen und pflanzeninternen
Signalmolekülen und Enzymaktivitäten
Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften
der RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Diplom-Chemiker (FH) Marco Miebach
aus Wipperfürth
Berichter:
Universitätsprofessor Dr. A.J. Slusarenko
Privatdozent Dr. J. Wildt
Tag der mündlichen Prüfung: 28.11.2008
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Inhaltsverzeichnis ................................................................................................................. Seite
I. Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................
II. Abbildungsverzeichnis .............................................................................................
III. Tabellenverzeichnis ..................................................................................................
1. Einleitung .............................................................................................................................. 1
2. Stand der Forschung ............................................................................................................ 4
2.1 Begriffssystematik und Definitionen................................................................................ 4
2.1.1 Austausch gasförmiger Substanzen über die Stomata............................................... 4
2.2 Ozon ............................................................................................................... 5
2.2.1 Schädigung von Pflanzen durch Ozon ...................................................................... 6
2.3 Biosynthese von VOCs und weiteren sekundären Pflanzeninhaltsstoffen ....................... 8
2.3.1.1 Biosynthese der Terpene über den Acetat / Mevalonat-Weg ................................. 9
2.3.1.2 Der 1-Deoxy-D-xylulose-Biosyntheseweg von Isoprenoiden ............................. 12
2.4 Bedeutung der VOCs für die Pflanze ............................................................................. 16
2.5 Enzyme ............................................................................................................. 17
2.5.1 Lipase (LIP) ......................................................................................................... 21
2.5.2 Lipoxygenase (LOX) ........................................................................................... 23
2.5.2.1 Der Lipoxygenase-Stoffwechselweg.................................................................... 24
2.5.3 Hydroperoxidlyase (HPL) .................................................................................... 27
3. Ziel der Arbeit und prinzipielle Vorgehensweise ............................................................ 30
4. Material und Methoden ..................................................................................................... 32
4.1 Das GC/MS-System ....................................................................................................... 34
4.1.1. Anreicherung ........................................................................................................ 34
4.1.2. Analyse ................................................................................................................. 35
4.2 Aufbau der Kalibrationsquellen ..................................................................................... 37
4.3 Kalibration des GC/MS-Systems ................................................................................... 38
4.4 Reproduzierbarkeit und Nachweisgrenze ....................................................................... 39
4.5 Fehlerrechnung ............................................................................................................. 40
4.5.1 Fehler bei der Kalibration .................................................................................... 40
4.5.2 Fehler bei der Bestimmung der Mischungsverhältnisse der VOCs in der
Pflanzenkammer ............................................................................................................... 41
4.6 Bestimmung der Blattfläche ........................................................................................... 42
4.7 Durchführung der Experimente ...................................................................................... 44
4.7.1 Tomate als Modellpflanze .................................................................................... 44
4.7.2 Ozonexpositionen ................................................................................................. 44
4.7.3 Versuche mit Botrytis cinerea .............................................................................. 45
4.8 Messung der freien Fettsäuren im Pflanzenmaterial ...................................................... 46
4.9 Messung der Enzymaktivitäten ...................................................................................... 49
4.9.1 Messung der Lipaseaktivität ................................................................................. 50
4.9.2 Messung der Lipoxygenaseaktivität ..................................................................... 51
4.9.3 Messung der Hydroperoxidlyaseaktivität.............................................................. 52
4.10 Messung der Gehalte an Phenylpropanoidweg-Produkten in Pflanzenproben ............ 53
4.11 Markierungsversuch mit 13CO2 .................................................................................... 55
4.12 Vergleich der Messgrößen ............................................................................................ 56
5. Ergebnisse ....................................................................................................................... 58
6. Diskussion ....................................................................................................................... 80
6.1 Pflanzliche Reaktionen auf Ozonstress .......................................................................... 80
6.2 Vergleich der Prozesse im Octadecanoidweg mit den Emissionsraten der GLAs ......... 83
6.3 Korrelationen zwischen MeSA – Emissionen und dem Gehalt an freier Salicylsäure in
den Tomatenpflanzen ........................................................................................................... 96
6.4 Markierungsversuch ....................................................................................................... 97
7. Zusammenfassung ........................................................................................................ 104
8. Summary ....................................................................................................................... 106
IV. Literaturverzeichnis ............................................................................................ 108
Lebenslauf ...................................................................................................................... 122
Danksagung........................................................................................................................... 123
I. Abkürzungsverzeichnis AOS Allenoxid-Synthase ATP Adenosin-Triphosphat BAH2 Benzoesäure-2-Hydroxylase BOVOCs Biogenic oxygenated volatile organic compounds/biogen (teil-)oxidierte
flüchtige Kohlenwasserstoffe CoA Coenzym A DES Divinylether-Synthase DMAPP Dimethylallyl pyrophosphat EAS Epoxyalkohol-Synthase EPC Electronic pressure control/elektronische Säulenvordruckregelung FG Frischgewicht FPP Farnesylpyrophosphat GC Gaschromatograph Gl Gleichung GPP Geranylpyrophosphat HPL Hydroperoxidlyase H(P)ODE Hydro(per)oxy-octdecadiensäure H(P)OTE Hydro(per)oxy-octadecatriensäure ICS Isochorismat-Synthase IPP Isopentylpyrophosphat KAS Kaltaufgabesystem KM Mechaelis-Menten-Konstante KODE Ketooctadecadiensäure KOTE Ketooctadecatriensäure LA L inoleic Acid, Linolsäure LeA L inolenic Acid, Linolensäure LOX L ipoxygenase MeSA Salicylsäuremethylester MS Massenspektrometer MSD massenspektrometrischer Detektor Mt Megatonnen MT Monoterpene NADPH reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotidphosphat NMHC non methan hydrocarbons/Nicht-Methan-Kohlenwasserstoffe OPDA Oxo-Phytodienicacid, Oxophytodienonsäure PAR Photosynthetic active radiation/photosynthetisch aktive
Strahlung/Lichtintensität ppb parts per billion ppm parts per million ppt parts per trillion PAL Phenylalaninlyase PL Pyruvatlyase POX Peroxygenase PTFE Poly-Tetra-Fluor-Ethylen PUFA Polyunsaturated fatty acid, mehrfach ungesättigte Fettsäuren RED Reduktase ROS Reactive oxygen species, reaktive Sauerstoffspecies [S] Substratkonzentration SA Salicylic Acid; Salicylsäure SAG Salicylic Acid Glycoside, Salicylsäureglycosid
SAR/SER Systemic aquired resistance, systemisch erworbene Resistenz SOVOCs Short chained oxygenated volatile organic compounds SQT Sesquiterpene TDS Thermodesorptionssystem TG Trockengewicht TIC Total Ion Current/Totalionenstrom TMTT 4,8,12-Trimethyltrideca-1,3,7,11-tetraen VOCs Volatile organic carbons/flüchtige organische Kohlenwasserstoffe
II. Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Schematische Darstellung der für diese Arbeit relevanten Themengebiete ........ 3
Abbildung 2: Aufbau des Kohlenstoffskelettes terpenoider Verbindungen aus
Isopentyleneinheiten ................................................................................................................... 9
Abbildung 3: Dimerisierung und Kondensation von Acetyl-CoA (Acetyl-Coenzym A) .......... 9
Abbildung 4: Reduktive Abspaltung von CoA und Phosphorylierung der (R)-Mevalonsäure 10
Abbildung 5: Zweifache Phosphorylierung der 5-Phosphomevalonsäure ............................... 10
Abbildung 6: Decarboxylierung und Wasserabspaltung führt zu DMAPP und IPP ................ 10
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Biosynthese von Terpenoiden über den Acetat /
Mevalonat- Weg ....................................................................................................................... 11
Abbildung 8: Schema des 1-Deoxy-D-xylulose-Biosyntheseweges pflanzlicher Isoprenoide 12
Abbildung 9: Schematische Darstellung der Produktion flüchtiger organischer Verbindungen
aus dem Octadecanoidweg ....................................................................................................... 14
Abbildung 10: Schema der Biosynthese von Salicylsäure über die zwei bisher bekannten
Biosynthesewege Phenylpropanoidweg und Isochorismatweg ............................................... 15
Abbildung 11: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion
von der Substratkonzentration nach Michaelis und Menten .................................................... 19
Abbildung 12: Schematische Darstellung der primären Lipasereaktion .................................. 21
Abbildung 13: Katalytische Triade aus Asparaginsäure, Histidin und Serin im aktiven
Zentrum von Lipasen (und Serinproteasen) ............................................................................ 22
Abbildung 14: Reaktionsmechanismus der lipasekatalysierten Hydrolyse eines Fettsäureesters
.................................................................................................................................................. 22
Abbildung 15: Reaktionsverlauf der lipasekatalysierten Hydrolyse eines Fettsäureesters ...... 23
Abbildung 16: Schema des Abbaus von Linol(en)säure im Lipoxygenase-Reaktionsweg ..... 26
Abbildung 17: Postulierter radikalischer Reaktionsmechanismus der CYP74-Enzyme .......... 28
Abbildung 18: Beispiel zeitlicher Verlauf der LOX-Emissionen nach Stresseinwirkung auf
eine Tomatenpflanze ................................................................................................................ 30
Abbildung 19: Schematische Darstellung der Pflanzenkammer und der an der Kammer
vorhandenen Analytik, ............................................................................................................. 32
Abbildung 20: Strömungsschema für die Anreicherung der Probe im GC/MS-System .......... 36
Abbildung 21: Schematische Darstellung der Kalibrationsquellen ......................................... 37
Abbildung 22: Auftragung des Trockengewicht gegen das Frischgewicht von Tomatenblättern
.................................................................................................................................................. 43
Abbildung 23: Auftragung der Blättfläche gegen das Frischgewicht von Tomatenblättern .... 43
Abbildung 24: Kalibration der HPLC-Anlage mit Linolensäure ............................................. 47
Abbildung 25: Kalibration der HPLC-Anlage mit Linolsäure ................................................. 47
Abbildung 26: Beispiel für den zeitlichen Verlauf der Änderung der Absorption durch die
Freisetzung von para-Nitrophenol bei der Bestimmung der Lipaseaktivität ........................... 50
Abbildung 27: Beispiel für den zeitlichen Verlauf der Änderung der Absorption durch die
Bildung von Hydroperoxiden der Linolensäure bei der Bestimmung der
Lipoxygenaseaktivität .............................................................................................................. 51
Abbildung 28: Beispiel für den zeitlichen Verlauf der Änderung der Absorption durch den
Verbrauch von NADH bei der Bestimmung der Hydroperoxidlyaseaktivität ......................... 52
Abbildung 29: Kalibration Salicylsäure ................................................................................... 54
Abbildung 30: Chromatogrammm (TIC) der VOC-Emissionen einer Tomatenpflanzen vor
Ozonexposition ......................................................................................................................... 58
Abbildung 31: Chromatogramm (TIC) der VOC-Emissionen einer Tomatenpflanzen kurz
nach Ozonexposition. Hauptemission kurz nach der Ozonexposition ist die der GLAs ......... 59
Abbildung 32: Chromatogramm (TIC) der VOC-Emissionen einer Tomatenpflanzen einen
Tag nach Ozonexposition ......................................................................................................... 59
Abbildung 33: Korrelation der Flussdichten von α-Pinen mit denen dreier anderer,
willkürlich ausgewählter Monoterpene eines Ozonexperimentes vor und nach
Ozonexposition. ........................................................................................................................ 60
Abbildung 34: Verteilung dreier ausgewählter Monoterpene an ihrer Gesamtemissionsstärke
ohne Stress ................................................................................................................................ 61
Abbildung 35: Verteilung dreier ausgewählter Monoterpene an ihrer Gesamtemissionsstärke
nach Ozonstress ........................................................................................................................ 61
Abbildung 36: Schematische Darstellung der Bildung einiger wichtiger VOCs aus dem
Octadecanoidweg ausgehend von α-Linolensäure ................................................................... 64
Abbildung 37: Auftragung der Gesamtemissionsstärke der GLAs gegen die Lipaseaktivität 65
Abbildung 38: Auftragung der Gesamtemissionsstärke der GLAs gegen die
Hydroperoxidlyaseaktivität ...................................................................................................... 66
Abbildung 39: Auftragung der Gesamtemissionsstärke der GLAs gegen die
Lipoxygenaseaktivität .............................................................................................................. 66
Abbildung 40: Summe der gemessenen GLA Emissionen in Abhängigkeit von der
Lipoxygenaseaktivität .............................................................................................................. 67
Abbildung 41: Auftragung der Salicylsäuremethylesteremissionen gegen den Gehalt an freier
Salicylsäure in den Pflanzen .................................................................................................... 70
Abbildung 42: Scan von Tomatenblättern 20h nach Ozonexposition ...................................... 71
Abbildung 43: Zeitlicher Verlauf der Emissionen von TMTT, β-Phellandren und MeSA in
einem Kontrollexperiment ohne Behandlung mit einem Stressor ........................................... 72
Abbildung 44: Zeitverlauf der Emissionen von (Z)-3-Hexenol, MeSA, TMTT und der
Monoterpene am Beispiel des β-Phellandrens nach Ozonexposition (13CO2-Experiment) ..... 73
Abbildung 45: Relative Zählraten im Massenspektrum Molmassen von (Z)-3-Hexenol 4,5
Stunden nach Beginn der 13CO2 Exposition ............................................................................. 74
Abbildung 46: Relative Zählraten im Massenspektrum Molmassen von β-Phellandren 4,5
Stunden nach Beginn der 13CO2 Exposition ............................................................................. 74
Abbildung 47: Relative Zählraten im Massenspektrum Molmassen von
Salicylsäuremethylester 4,5 Stunden nach Beginn der 13CO2 Exposition ............................... 75
Abbildung 48: Zeitverlauf des Verhältnisses von mit 13C angereicherten zu nicht
angereicherten β-Phellandren Molekülen ................................................................................ 76
Abbildung 49: Zeitverlauf der Emissionsraten von β-Phellandren .......................................... 77
Abbildung 50: Zeitverlauf der MeSA-Emissionen und Zeitverlauf des Verhältnisses M/U im
C7 Fragment der MeSA ........................................................................................................... 78
Abbildung 51: Relative Zählraten der Massenspektren der C7 -Fragmente von MeSA und
Benzoesäuremethylester sieben Stunden nach Beginn der 13CO2 -Exposition ....................... 79
Abbildung 52: Relative Zählraten der Massenspektren der C6 -Fragmente von MeSA und
Indol sieben Stunden nach Beginn der 13CO2 -Exposition ...................................................... 79
Abbildung 53: Schema des Octadecanoidwegs mit Schwerpunkt auf dem Abbau der
Hydroxyperoxifettsäuren .......................................................................................................... 83
Abbildung 54: Schema des enzymatischen Abbaus von Hydroperoxifettsäuren durch die
bisher bekannten Enzyme ......................................................................................................... 88
Abbildung 55: Lipaseaktivität in Abhängigkeit von der Lipoxygenaseaktivität ..................... 90
Abbildung 56: Hydroperoxidlyaseaktivität in Abhängigkeit von der Lipoxygenaseaktivität 91
Abbildung 57: Auftragung des Verhältnisses der Aktivitäten der HPL zur LOX gegen den
Ausbauzeitpunktes nach Beginn der Ozonexposition .............................................................. 92
Abbildung 58: Veränderung der prozentualen Ausbeute von Enzymsystemen bei Variation
eines Enzyms nach Kacser und Burns ...................................................................................... 93
Abbildung 59: Veränderung der Flussausbeute, Lipoxygenaseaktivität variiert von 0,01 – 1 94
Abbildung 60: Schematische Darstellung der Biosynthese von MeSA ................................... 99
III. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Nomenklatur einiger natürlich vorkommender Fettsäuren ..................................... 13
Tabelle 2: Nomenklatursytem für Enzyme nach der IUB ........................................................ 20
Tabelle 3: An der Pflanzenkammer quantifizierte Messgrößen ............................................... 33
Tabelle 4: Parameter des verwendeten GC/MS-Systems für die Bestimmung der
Konzentration der analysierten VOCs ...................................................................................... 35
Tabelle 5: Einzelfehler der Größen, die bei der Berechnung des Fehlers des
Mischungsverhältnisse des Kalibrationsstandards berücksichtigt wurden. ............................. 40
Tabelle 6: Fehler der einzelnen Größen, die bei der Berechnung des Mischungsverhältnisses
der Substanz x in der Probe angenommen wurden. ................................................................. 41
Tabelle 7: Gradient zur Bestimmung der freien Fettsäuren mittels HPLC .............................. 46
Tabelle 8: Gradient zur Messung der phenolischen Inhaltsstoffe ............................................ 53
Tabelle 9: Quantifizierbare Substanzen aus dem Shikimatweg ............................................... 54
Tabelle 10: Übersicht über die Ozonflussdichten, die Dauer der Ozonexposition sowie des
Ausbauzeitpunktes nach Beginn der Ozonexposition .............................................................. 62
Tabelle 11: Flussdichten der von Tomatenpflanzen hautsächlich emittierten GLAs nach
Ozonexposition bzw. Behandlung mit Botrytis cinerea zum Zeitpunkt des Ausbaus der
Pflanzen aus der Pflanzenkammer ........................................................................................... 63
Tabelle 12: Vergleich der Lipase-, Lipoxygenase- und Hydroperoxidlyase-Aktivitäten mit der
Summe der Flussdichten an GLAs nach Ozonexposition bzw. Infektion mit Botrytis cinerea
.................................................................................................................................................. 65
Tabelle 13: Gehalte an freier Linolen- bzw. Linolsäure in Kontroll- und Versuchspflanzen .. 68
Tabelle 14: Gemessene MeSA-Flüsse in der Expositionskammer und Gehalte an freier SA in
den Pflanzen nach Ozonexposition .......................................................................................... 69
Tabelle 15: Potential der gemessenen Enzymaktivitäten ......................................................... 88
1
1. Einleitung
Pflanzen stehen mit der sie umgebenden Umwelt in ständigem Kontakt. Der Stoffaustausch
zwischen den Pflanzen und der Atmosphäre erfolgt dabei hauptsächlich über die
Spaltöffungen (Stomata) der Blätter. Kohlendioxid (CO2) wird aus der Atmosphäre
aufgenommen und mit Hilfe der Sonnenenergie zu Kohlenhydraten umgewandelt
(Photosynthese). Im Gegenzug geben die Pflanzen Sauerstoff (O2) ab [Jacob et al., 1994].
Pflanzen spielen auch eine wichtige Rolle im Bezug auf die Chemie der Atmosphäre. Ein
Beispiel dafür ist die Ozonbilanz in der planetaren Grenzschicht. In Gebieten mit hohen
Stickstoffoxid – Konzentrationen (NOx) wird durch die pflanzliche Aufnahme von NOx deren
atmosphärische Konzentration gesenkt. Da NOx bei der photochemischen Ozonbildung die
Rolle des Katalysators spielt, senkt die Aufnahme von NOx indirekt die Ozonkonzentration.
Hinzu kommt, dass das Ozon (O3) selbst von Pflanzen aufgenommen wird [z.B. Neubert et
al., 1993]. Schätzungen von Galbally und Roy (1980) und Chameides (1989) ergaben, dass
jährlich zwischen 500 und 1500 Megatonnen (Mt) Ozon durch Pflanzen aus der Troposphäre
entfernt werden.
Andererseits sind Pflanzen eine Quelle für eine Vielzahl flüchtiger organischer Verbindungen
(volatile organic compounds, VOCs), die als „Brennstoff“ bei der troposphärischen
Ozonbildung wirken und daher die Ozonkonzentrationen erhöhen. Zu den von Pflanzen
emittierten VOCs gehören reaktive Kohlenwasserstoffe wie Isopren (C5H8), Monoterpene
(C10H16) und Sesquiterpene (C15H24), die den Hauptanteil der emittierten VOCs ausmachen.
Guenther et al. (1995) schätzen den weltweiten Gesamteintrag biogener VOCs in die
Atmosphäre auf ca. 1150 Mt (C) pro Jahr womit dieser Eintrag etwa eine Größenordnung
höher wäre als der Eintrag von VOCs durch anthropogene Quellen [Fehsenfeld et al., 1992;
Müller, 1992].
Neben diesen analytisch leicht messbaren VOCs geben Pflanzen auch kurzkettige
sauerstoffhaltige flüchtige organische Verbindungen (SOVOCs, short chain oxygenated
volatile organic compounds) ab. Zu diesen gehören Alkohole, Aldehyde, Ketone und Säuren.
Schätzungen von Guenther et al. (1995) ergaben für die SOVOCs eine weltweite
Gesamtemissionsstärke von ca. 520 Mt (C) pro Jahr.
Um die Quellstärke der Emissionen realistisch abschätzen zu können, müssen die Größen
bekannt sein, die einen Einfluss auf diese Emissionen haben. Allgemein bekannt ist, dass die
Emissionsstärken von VOCs aus Pflanzen von der Temperatur sowie von der Lichtintensität
abhängig sind [Sharkey und Loreto, 1993]. Es wurden z. B. für Isopren- und Monoterpen-
2
Emissionen bereits Algorithmen entwickelt, die diese Abhängigkeiten beschreiben [Guenther
et al., 1993; Harley et al., 1997; Schuh et al., 1997].
Die Emissionsstärke pflanzlicher VOCs wird auch durch Stressfaktoren beeinflusst. Nach
Stressapplikation können sich die Emissionsraten isoprenoider VOCs um bis zu 3
Größenordnungen erhöhen [Schuh et al., 1996]. Ebenfalls kann es zu einer Induktion der
Emissionen anderer VOCs kommen, die in unterschiedlichen Biosynthesewegen synthetisiert
werden. Dazu gehören VOCs, die über den Octadecanoidweg produziert werden [Croft et al.,
1993; Hatanaka, 1993; Gardner, 1995; Rosahl, 1996].
Pflanzen reagieren auf Stressoren wie Wasser- oder Nährstoffmangel, Pathogen- oder
Herbivorenbefall oder die Aufnahme von Schadgasen (O3, SO2) unter Anderem mit der
Erhöhung ihrer VOC Emissionen. Um die Änderungen der Emissionen einer Pflanze auf
einen bestimmten Stressor messen zu können, werden Pflanzen unter möglichst stressfreien
Bedingungen angezogen und dann dem zu untersuchenden Stress ausgesetzt. Hierbei stellt die
Dosierung des Stresses ein Problem dar, da sich viele Stressoren nur schwierig quantitativ
bestimmen lassen (z. B. Pathogen- oder Herbivorenbefall).
Wird Ozonexposition als Stressor genutzt, kann dessen Flussdichte in die Pflanze als
quantitatives Maß für die Stressdosis genutzt werden [Filella und Penuelas, 2005; Beauchamp
et al., 2005]. Als akute Reaktion auf Stress (wie z. B. stark erhöhte Ozonaufnahme) kommt es
bei Pflanzen zu der Emission von Blattalkoholen und –aldehyden (GLAs, green leave
alcohols/aldehydes) [Hatanaka und Harada, 1973; Croft et al., 1993; Beauchamp et al., 2005]
aus dem Octadecanoidweg. Diese Substanzen werden auch nach Pilzbefall [Hora und Baker,
1970; Vaughn und Gardner, 1993; Jansen et al., im Druck] oder Pathogenbefall [Leammli
1970; Baldwin et al., 2001] abgegeben, scheinen also eine wichtige Rolle bei der pflanzlichen
Abwehr zu spielen. Um diese stressinduzierten Emissionen näher untersuchen zu können,
wurde aufgrund der oben schon erwähnten Vorteile Ozon als Stressor gewählt. An der
Modellpflanze Tomate (Lycopersicon esculentum Mill. cv Moneymaker) wurden sowohl die
zeitliche Änderungen der VOC Emissionen, der Aktivitäten der zu diesen Emissionen
führenden Enzyme, sowie die Veränderung der Konzentrationen pflanzeninterner
Signalmoleküle bzw. deren Vorstufen im Pflanzenmaterial untersucht (Abbildung 1).
Die Messungen zur Untersuchung der Emissionen bzw. der Aufnahme von VOCs erfolgten in
den Pflanzenkammern des Institutes für Chemie und Dynamik der Geosphäre (ICG-3) des
Forschungszentrums Jülich. Sie ermöglichten, die Pflanzen unter kontrollierten Bedingungen
zu untersuchen. Eine genauere Beschreibung dieser Kammer erfolgt in Kapitel 4.
3
Abbildung 1: Schematische Darstellung der für diese Arbeit relevanten Themengebiete, schwarz = konstitutive Emissionen, rot = Stressoren und erste Reaktionen der Pflanze, blau = pflanzeninterne Signalmoleküle, grün = induzierte Abwehrreaktionen
Stressoren wie: Ozon, Bakterien, Pilze, Fraßfeinde
Konstitutive Emissionen: Mono- und Sesquiterpene, Niedrige Emissionsstärke
Induzierte Emissionen: C6-Aldehyde und -Alkohole,
Ethylen, Salicylsäuremethylester
Induktion von Abwehrreaktionen: Octadecanoid- and Shikimat-
Biosynthesewege
Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
(ROS)
Bildung und Transport von Signalmolekülen wie z.B.Salicylsäure
(SA/MeSA)
SER Systemisch Erworbene Resistenz
4
2. Stand der Forschung
2.1 Begriffssystematik und Definitionen Zu den flüchtigen organischen Verbindungen zählen alle atmosphärischen Spurengase, die
Kohlenstoff enthalten, Kohlendioxid (CO2) und Kohlenmonoxid (CO) ausgenommen. Sie
können bis zu 20 Kohlestoffatome beinhalten, werden in der Regel allerdings mit steigender
Kettenlänge immer weniger flüchtig. VOCs können in gesättigter, ungesättigter oder teilweise
oxidierter Form vorliegen. Als BVOCs (biogenic volatile organic compounds) beschreibt man
VOCs biologischer Herkunft [Kesselmeier und Staudt, 2000]. BVOCs können Alkane,
Alkene, Aromate, oxygenierte Verbindungen (Aldehyde, Ketone, Alkohole, Karbonsäuren,
Ester und Ether), schwefelhaltige, stickstoffhaltige und halogenierte Substanzen sein.
2.1.1 Austausch gasförmiger Substanzen über die Stomata Der Austausch gasförmiger Substanzen zwischen Pflanzen und der sie umgebenden
Atmosphäre findet hauptsächlich über die Blattöffnungen (Stomata) statt. Die Stomata
werden je nach Wasserverfügbarkeit geöffnet oder geschlossen, womit auch der Gasaustausch
reguliert wird. Neben dem zur Photosynthese benötigten CO2 werden auch Gase wie Ozon
oder NO2 fast ausschließlich über die Stomata aufgenommen [Neubert et al., 1993]. Auch die
Emission von z. B. Isoprenoiden erfolgt über die Stomata.
Die Flussdichte Φ ist die Größe, die die Aufnahme bzw. Abgabe von Gasen durch Pflanzen
beschreibt. Die Flussdichte ist hier die auf die Blattfläche bezogene Menge an Substanz, die
pro Zeiteinheit aufgenommen oder abgegeben wird. Beispiele hierfür sind Transpirations-
oder Nettophotosyntheseraten aber auch Emissionsraten von VOCs oder Aufnahmeraten von
Ozon. Diese Flussdichten sind die Grundgrößen, auf die im Rahmen dieser Arbeit Bezug
genommen wird.
Unter Vernachlässigung von Wandeffekten in den Kammern oder deren Leitungen und
anderen Prozessen, die zur Produktion oder Destruktion von Verbindungen in der
Pflanzenkammer führen könnten, berechnet sich diese Flussdichte wie folgt:
)][]([ EAB
K XXA
F−=Φ
FK = Luftfluss durch die Kammer [m3 s-1] AB = Blattfläche [m2] [X] A = Konzentration der Komponente X im Luftstrom am Kammerausgang [mol m-3] [X] E = Konzentration der Komponente X im Luftstrom am Kammereingang [mol m-3]
5
In SI Einheiten ergibt sich für die Flussdichte die Einheit: [mol m-2 s-1]. Ist [X]A > [X] E
handelt es sich um Emission der Komponente X durch die Pflanze, ist [X]A < [X] E handelt es
sich um eine Aufnahme.
Oft werden anstelle von Konzentrationen Mischungsverhältnisse benutzt. Werden für [X]A
und [X]E Mischungsverhältnisse (dimensionslos) genutzt, muss der Luftfluss in den Einheiten
[mol s-1] eingesetzt werden, um die Flussdichte in SI Einheiten zu erhalten.
Die Charakterisierung der Kammer erfolgte bereits in früheren Arbeiten [z. B. Heiden, 1995;
Miebach, 2003]. Dabei zeigte sich, dass Wandeffekte oder Photolyse von VOCs (MT und
GLAs) bei der Berechnung der Flussdichten vernachlässigt werden können. Dazu wurden
einige der zur analysierenden VOCs der Luft am Kammereingang beigegeben. Die
Konzentrationen dieser Substanzen in der Zu- und Abluft der keine Pflanzen beinhaltenden
Kammer wurden gemessen, um Verluste quantitativ zu bestimmen. Dabei wurden auch
Parameter wie Feuchte, Temperatur und Licht variiert. Für keine der herangezogenen VOCs
konnten Verluste gemessen werden. Damit ist eine Vernachlässigung von Wandeffekten oder
Photolyse der untersuchten Substanzen bei der Berechnung der Flussdichten gerechtfertigt.
2.2 Ozon Troposphärisches Ozon entsteht durch photochemische Reaktionen aus Stickoxiden und
flüchtigen organische Verbindungen [Leighton, 1961; Crutzen und Graedel, 1994; Alexander,
2000]. Es ist ein Gas, welches in höheren Konzentrationen beim Menschen hauptsächlich auf
die Schleimhäute reizend wirkt. Das Gas wurde 1839 durch Christian F. Schönbein bei der
Elektrolyse von Wasser entdeckt und nach dem griechischen Wort „riechen“ benannt. Ozon
ist eins der stärksten Oxidationsmittel und reagiert schnell mit ungesättigten, organischen
Verbindungen [Hoigné und Bader, 1983; Kley et al., 1999].
Es kommt natürlicherweise in der Atmosphäre vor, in der Stratosphäre spielt es eine wichtige
Rolle als „Schutzschild“ vor schädlicher UV-Strahlung, da es eine starke Absorptionbande in
diesem Spektralbereich (Hartleybande) aufweist. Ozon wird durch Transport aus der
Stratosphäre in die Troposphäre eingetragen. Dieses eintransportierte Ozon bildet eine
natürliche Hintergrundkonzentration, die auf etwa 10 – 20 ppb geschätzt wird [Volz und
Kley, 1988]. Erhöhte Ozonkonzentrationen (Sommersmog) werden durch die photochemische
Ozonbildung hervorgerufen [Kley et al., 1999].
Seit dem Beginn der Industrialisierung stieg die Ozonkonzentration von ca. 30 – 40 µg m-3
(15 – 20 ppb) [Dollard et. al., 1995] auf 80 – 120 µg m-3 (40 – 60 ppb) an. Spitzenwerte über
200 µg m-3 (100 ppb) treten in ländlichen Gebieten in den Mittagsstunden im Sommer auf
6
[Guderian, 1985; Sandermann et al., 1997]. Dort können die Emissionen pflanzlicher VOCs
zur troposphärischen Ozonproduktion beitragen [Hewitt et al., 1995; Gomiscek et al., 1995].
2.2.1 Schädigung von Pflanzen durch Ozon Bereits 1944 wurde das Schädigungspotential von photochemischem „Smog“ erkannt.
Untersuchungen in den 50er Jahren zeigten, dass Ozon einer der pflanzenschädigenden
Luftschadstoffe war [Richards et al., 1958; Heggestad und Middleton, 1959; Miller et al.,
1963]. Ozon löste bei Pflanzen ein als „Wetterflecken“ bekanntes Symptombild aus, welches
den Tabakzüchtern schon seit Beginn der 20er Jahre bekannt war [Langebartels und
Sandermann, 1999]. Diese Schädigung der Pflanzen durch Ozon führte zu starken
Ernteverlusten und wurde ab 1951 für den Tabakanbau zum Problem. Bereits 1955 wurden
die „Wetterflecken“ zum größten Krankheitsproblem bei Tabakpflanzen im Osten der USA
und es wurden verschiedene Forschungsprojekte zur Bestimmung der Ursachen der
„Wetterflecken“ sowie zur Zucht ozontoleranterer Tabaksorten initiiert [Heggestad und
Middleton, 1959]. Durch die Züchtungsstudien wurde unter anderem festgestellt, dass Ozon-
Sensitivität ein erbliches Pflanzenmerkmal darstellt [Heggestad, 1991]. Dabei wurden auch
sehr Ozon empfindliche Tabaksorten entdeckt, welche die Ausgangspflanzen der Varietät Bel
W3 darstellen. Bel W3 ist eine extrem Ozon sensitive Tabaksorte und findet daher heute als
Bioindikator für phytotoxische Ozonkonzentrationen Verwendung [Heggestad, 1991]. Es
wird geschätzt, dass die durch Ozon verursachten Ernteverluste in Europa und den USA etwa
5 – 15% ausmachen [OTC Studie USA 1980-1988, Open-Top Chamber Program Europa,
1984 – 1991; Heck et al., 1988; Skarby et al., 1992], bei empfindlichen Sorten sogar mehr
[Dierkesmann und Sandermann, 2000].
2.2.2 Ozonaufnahme durch Pflanzen
Wie viele der anderen Gastauschprozesse zwischen Pflanzen und Atmosphäre auch, verläuft
die Aufnahme von Ozon hauptsächlich über die Stomata. Die Kutikula ist nahezu Ozon-
undurchlässig. Eine verstärkte Aufnahme von Ozon führt häufig zum Schließen der Stomata,
was zum Einen den weiteren Ozonfluss in die Pflanze erniedrigt, zum Anderen durch die
dadurch verminderte CO2 - Aufnahme zu einer geringen Photosyntheserate führt [Lyons et al.,
1999].
Nach der Aufnahme des Ozons in den Apoplasten reagiert es dort bereits zu über 95% ab
[Chameides 1989; Dierkesmann und Sandermann, 2000]. Dabei entstehen u.a. Verbindungen
wie H2O2, O2-, OH· und Singulett - Sauerstoff (O2 a1∆g), die unter dem Begriff reaktive
7
Sauerstoffspezies (ROS) zusammengefasst werden. Es kommt zur Schädigung von
Zellmembranen und im Extremfall z. B. bei Bel W3 zur Entwicklung sichtbarer Blattschäden.
Es bilden sich weiße, pergamentartige Stellen (Nekrosen), die in ihrem Erscheinungsbild stark
einer inkompatiblen Interaktion zwischen Pflanzen und Pathogenen ähneln. Bei der
inkompatiblen Interaktion werden Pathogene abgewehrt, indem die Pflanzen infizierte
Pflanzenzellen sowie ihre benachbarten Zellen durch ein spezifisch aktiviertes Zellprogramm
absterben lassen [Beers und McDowell, 2001; Shirasu und Schulze-Lefert, 2000].
Ozonschäden treten bei einer Vielzahl von Spezies wie z. B. den Kultur-Pflanzen Kartoffel,
Luzerne, Klee, Soja und Tomate auf [Fuhrer und Achtermann, 1994], auch viele Baumarten
zeigen starke Ozonschädigungen [Karnosky et al., 2005]. Lange Zeit wurden diese Schäden
auf die direkte toxische Wirkung von Ozon und der aus den Reaktionen des Schadgases im
Apoplasten entstehenden ROS zurückgeführt [Foyer et al., 1994; Heath und Taylor, 1997].
Neuere Arbeiten zeigen allerdings, dass bei ozonempfindlichen Pflanzen auch eine aktive
ROS Bildung als Reaktion der Pflanze auf das aufgenommene Ozon auftritt [Pellinen et al.,
1999; Schraudner et al., 1998; Runeckles und Vaartnou, 1997].
Seit 1988 versucht man kritische Level für Ozon zu definieren, oberhalb derer nachteilige
Effekte auf Kultur- und Wildpflanzen beobachtet werden [Kärenlampi und Skärby, 1996].
Lange Zeit wurde diese Abhängigkeit über AOT40 (accumulated dose over a threshold of
40 nl L-1) bestimmt, sie gibt die kumulative Ozondosis oberhalb des Schwellenwertes von
40 nl L-1 an [Kärenlampi und Skärby, 1996]. Neuere Studien zeigen allerdings, dass nicht die
Ozonkonzentration sondern der Ozonfluss in die Pflanzen ein Maß für die Stärke des
verursachten Stresses sind und somit die Reaktion der Pflanzen bestimmen [Beauchamp et al.,
2005, Filella und Penuelas, 2005].
Eine schon lange bekannte Reaktion von Pflanzen auf erhöhte Ozonkonzentrationen ist die
Veränderung der Emissionsstärke bzw. des Emissionsmuster verschiedener VOCs [Heiden et
al., 1999; Folkers, 2002]. Im Weitern soll daher näher auf ihre Biosynthese eingegangen
werden.
8
2.3 Biosynthese von VOCs und weiteren sekundären Pflanzeninhalts-stoffen
Während alle für eine lebende Zelle essentiellen Zellbestandteile über den sogenannten
Primär- oder Grundstoffwechsel biosynthetisiert werden, gibt es eine Vielzahl von Stoffen,
die nicht essentiell für einen Organismus sind und über den Sekundärstoffwechsel erzeugt
werden.
Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe können in drei chemisch unterschiedliche Gruppen eingeteilt
werden: isoprenoide, phenolische und stickstoffhaltige Verbindungen. Im Folgenden soll die
Biosynthese der für diese Arbeit relevanten Substanzgruppen kurz beschrieben werden.
Zu den in dieser Arbeit gemessenen isoprenoiden Verbindungen gehören die Mono- und
Sesquiterpene. Die Biosynthese der Terpene wird näher im Kapitel 2.3.1 beschrieben.
Des Weiteren wurden die aus dem Octadecanoidweg stammenden GLAs gemessen. Die
GLAs werden von allen bisher gemessenen Pflanzen als Stressantwort emittiert. Zu ihnen
gehören kurzkettige Aldehyde, Alkohole und deren Ester. Sie werden aus freien Fettsäuren
gebildet (Kapitel 2.3.2), eine nähere Beschreibung der Biosynthese dieser VOCs aus den
freien Fettsäuren erfolgt in Kapitel 2.3.3.
Neben den schon erwähnten Substanzen werden auch phenolische VOCs emittiert. Phenole
sind aromatische Substanzen, die über den Shikimisäure- oder den Acetat-Mevalonat-Weg
gebildet werden. In Kapitel 2.3.4 wird näher auf die Bildung der Salicylsäure eingegangen, da
sie bei der pflanzlichen Abwehr eine wichtige Rolle spielt.
Die Biosynthesewege vieler anderer von Pflanzen emittierten VOCs wie z.B. bei Aceton,
Ethanol oder Acetaldehyd sind aber noch unklar, siehe auch Folkers (2002).
2.3.1 Terpene
Viele Pflanzenarten enthalten in ihren Blüten, Blättern, Nadeln und Früchten oder in ihren
Harzen etherische Öle, die oft in Ölzellen angereichert werden [Lehmann, 1925]. Diese
enthalten flüchtige organische Verbindungen mit ausgeprägtem Geruch. Die
Hauptkomponenten der meist komplexen Gemische etherischer Öle sind terpenoide
Verbindungen [Tingey et al., 1980].
Die Terpene lassen sich formal als Oligomere des Kohlenwasserstoffs Isopren (2-Methyl- 1,3-
butadien) auffassen und aus C5-Einheiten, Isopentylen- oder Isopreneinheiten (Isoprenoide)
zusammensetzen. Je nach Zahl dieser Basiseinheiten teilt man sie in Monoterpene (C10, 2
Isopreneinheiten), Sesquiterpene (C15, 3 Isopreneinheiten), Diterpene (C20, 4 Isopreneinhei-
9
ten), Sesterpene (C25), Triterpene (C30) und Tetraterpene (C40) ein. Die Isopentyleneinheiten
können entweder Kopf-Schwanz- oder Kopf-Kopf-verknüft sein (Abbildung 2).
C C C C C C C
C
C
C
C C C C C C C
C
C
C
(a) Kopf-Kopf-Anordnung (b) Kopf-Schwanz-Anordnung
Abbildung 2: Aufbau des Kohlenstoffskelettes terpenoider Verbindungen aus Isopentyleneinheiten
Dieses Kriterium des Aufbaus des Kohlenstoffskelettes der Isoprenoide wurde ursprünglich
von O. Wallach (1909, Chemienobelpreis 1910) aufgestellt und später von L. Ruzicka (1922,
Chemienobelpreis 1939) als biogenetische Isoprenregel formuliert und stellt eine wertvolle
Hilfe zur Konstitutionsermittlung komplexer Terpene dar.
2.3.1.1 Biosynthese der Terpene über den Acetat / Mevalonat-Weg Das Bauprinzip der Terpenoide wird am besten durch ihre Biosynthese [Lynen, 1965]
verstanden. Zwei Moleküle Acetyl-CoA bilden zusammen das Acetoacetyl-CoA welches
dann durch eine Kondensationsreaktion mit einem dritten Acetyl-CoA das
(S)-3-Hydroxy-3-methylglutarsäurederivat bildet (Abbildung 3).
C SCoACH3
O
SCoA
O OA cCoA A cCoA
H2O
SCoAO
HO
HOOC
AcetylCoA AcetoacetylCoA (S)-3-Hydroxy-methyl- glutaryl-CoA
Abbildung 3: Dimerisierung und Kondensation von Acetyl-CoA (Acetyl-Coenzym A)
Die reduktive Abspaltung von CoA liefert die (R)-Mevalonsäure, welche durch
Phosphorylierung in die 5-Phosphomevalonsäure überführt wird (Abbildung 4).
10
SCoAO
HO
HOOC
NA DH
-CoA SH H C CH 2OH
HO
OO
A TP
CH2
CH2
O
CH2
CH3 OH
P
COOH
(S)-3-Hydroxy-methyl- glutaryl-CoA
(R)-Mevalonsäure 5-Phosphomevalonsäure
Abbildung 4: Reduktive Abspaltung von CoA und Phosphorylierung der (R)-Mevalonsäure
Zwei weitere Phosphorylierungsschritte ergeben dann die 3-Phospho-5-pyrophospho-
mevalonsäure (Abbildung 5).
A TP
CH2
CH2
O
CH2
CH3 OH
P
COOH
CH2
CH2
O
CH2
CH3 OH
COOH
PP
A TP
O O O P
O
O P
O-
O
O-
O -H
OPO
O
O-
3-Phospho-5-pyrophosphomevalonsäure5-Pyrophosphomevalonsäure5-Phosphomevalonsäure Abbildung 5: Zweifache Phosphorylierung der 5-Phosphomevalonsäure
Durch Decarboxylierung und Wasserabspaltung entsteht das Isopent-3-enylpyrophosphat
(IPP/aktives Isopren), das durch eine Isomerase in das stabilere 3,3-Dimethylallyl-
pyrophosphat (DMAPP/Prenol) umgelagert wird (Abbildung 6). Durch Kopf-Schwanz-
Kondensation entsteht aus DMAPP und IPP (E)-2-Geranylpyrophosphat (GPP) oder (Z)-2-
Nerylpyrophosphat welche durch Hydrolyse zu den acyclischen Monoterpenalkoholen
Geraniol bzw. Nerol umgesetzt wird.
O O O P
O
O P
O-
O
O-
O-
H
OPO
O
O-
-H3PO4
-CO2C C
H3C
H3C
H
C
H
H
O PPIsomerase
CH2
CH2
OPP
CCH3H2C
3-Phospho-5-pyrophosphomevalonsäure Isopentenylpyrophosphat IPP (aktives Isopren)
3,3-Dimethylallylpyrophosphat
Abbildung 6: Decarboxylierung und Wasserabspaltung führt zu DMAPP und IPP
11
Eine weitere Verknüpfung mit einer IPP-Einheit führt zu den isomeren Farnesylpyro-
phosphaten, die Vorstufen zu den Sesquiterpenen und anderen Terpenen und Steroiden
darstellen. Abbildung 7 gibt eine Gesamtübersicht über die Biosynthesewege der Terpenoide.
Geranylpyrophosphat (C10)
Farnesylpyrophosphat
(C20)
Squalen
Steroide
PlastochinoneUbichinone
KautschukGuttapercha
Acetyl-CoA Mevalonat Isopentenylpyrophosphat
Tetraterpene(Carotinoide)
Triterpene
Monoterpene
Diterpene
Sesquiterpene
DMAPP
Geranylgeranylpyrophoshat
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Biosynthese von Terpenoiden über den Acetat / Mevalonat- Weg Cyclische bzw. polyzyklische Terpene entstehen über in der Biosynthese intermediär
vorkommende Carbeniumionen (z.B. Ausbildung eines Allyl-Kations nach Abspalten des
Pyrophosphatanions). Teilweise sind exzessive Umlagerungen der Kohlenstoffgerüste zu
beobachten.
Die Bildung der Monoterpene erfolgt in den Plastiden. Im Cytosol bilden sich dagegen die
Sesquiterpene [Kesselmeier und Staudt, 1999]. Der Synthese- und Speicherungsort der Mono-
und Sesquiterpene ist sehr stark von der Pflanzenspezies abhängig. Bei Lippenblütlern, z. B.
bei Salbei oder Thymian, sind es die Drüsenhaare auf den Blatt- und Stengeloberflächen und
bei Koniferennadeln sind es Harzkanäle oder Ölkörper [Tingey et al., 1980].
12
2.3.1.2 Der 1-Deoxy-D-xylulose-Biosyntheseweg von Isoprenoiden Da einige Beobachtungen mit dem Acetat / Mevalonat-Biosyntheseweg nicht in Einklang
gebracht werden konnten, wird in neueren Arbeiten als alternativer Syntheseweg der 1-
Deoxy-D-xylulose-Biosyntheseweg diskutiert [Lichtenthaler et al., 1997, Abbildung 8].
OPP
OHOH
OPPO
OP
HO
OHOH
O
OHOH
HO
CDP
OP
OH
OHO
O
OHOH
PO
CDP
Pyruvat + Glycerinaldehyd-3-P
CO2
DOXP-Synthase
1-Deoxy-D-xylulose-5-P
DOXP-Redukto-Isomerase
2-C-Methyl-D-erythritol-4-P (MEP)
CDP-methyl-D-erythritol (CDP-ME)
CDP-ME-Synthase+ CDP
CDP-ME-Kinase+ ATP
CDP-methyl-D-erythritol-2-phosphat
ME-Cyclodiphosphat-Synthase
2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat
- Reduktasen- Dehydratasen
Isopentenyldiphosphat (IPP) Abbildung 8: Schema des 1-Deoxy-D-xylulose-Biosyntheseweges pflanzlicher Isoprenoide
Die Ausgangssubstrate sind Glycerinaldehyd-3-phosphat (GA-3-P) und Pyrovat. In einem
Thiamin-abhängigen, Transketolase-ähnlichen Schritt wird die C2-Einheit vom Pyrovat
(aktiver Acetaldehyd) auf Glycerinaldehyd-3-phosphat übertragen, wobei ein C5-
Zuckerphosphat entsteht, das 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat (DOX-P). In weiteren, bisher
noch nicht geklärten enzymatischen Schritten wird 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat,
möglicherweise über 2-C-Methyl-D-erythrose-4-phosphat und 2-C-Methyl-D-erythritol-4-
phosphat, in Isopentenyldiphosphat umgewandelt. Die Biosynthese von Isopren und der
Monoterpene ist gut untersucht und wird ausführlich z. B. von Zimmer et al. (2000),
Kesselmeier (2001), Kreuzwieser et al. (1999) und Fall (1999) diskutiert.
13
2.3.2 Fettsäuren
Fettsäuren sind langkettige, gesättigte oder ungesättigte aliphatische Monocarbonsäuren. Die
natürlich vorkommenden sind meist unverzweigt und besitzen eine gerade Anzahl von
Kohlenstoffatomen. Bis heute sind weit über 100 verschiedene Fettsäuren, vor allem als
Bausteine von Lipiden von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen identifiziert worden. In
unveresterter, freier Form kommen sie jedoch nur in sehr geringen Konzentrationen im
Gewebe und in der Zelle vor.
Tabelle 1: Nomenklatur einiger natürlich vorkommender Fettsäuren Kürzel Nomenklatur Trivialnamen gesättigte 4:0 Butansäure Buttersäure 6:0 Hexansäure Capronsäure 8:0 Octansäure Caprylsäure 10:0 Decansäure Caprinsäure 12:0 Dodecansäure Laurinsäure 14:0 Tetradecansäure Myristinsäure 16:0 Hexadecansäure Palmitinsäure 18:0 Octadecansäure Stearinsäure 20:0 Eicosansäure Arachinsäure 22:0 Docosansäure Behensäure 24:0 Tetracosansäure Lignocerinsäure ungesättigte
16:1∆9 (Z)-9-Hexadecensäure Palmitoleinsäure
18:1∆9 (Z)-9-Octadecensäure Ölsäure
18:1∆9trans (E)-9-Octadecensäure Elaidinsäure
18:1∆11 (Z)-11-Octadecensäure cis-Vaccensäure
18:2∆9,12 (9Z,12Z)-9,12-Octadecadiensäure Linolsäure
18:3∆9,12,15 (9Z,12Z,15Z)-9,12,15-Octadecatriensäure α-Linolensäure 18:3∆6,9,12 (6Z,9Z,12Z)-6,9,12-Octadecatriensäure γ-Linolensäure 20:3∆8,11,14 (8Z,11Z,14Z)-8,11,14-Eicosatriensäure Di-homo-γ-Linolensäure
20:4∆5,8,11,14 (5Z,8Z,11Z,14Z)-5,8,11,14-Eicosatetraensäure Arachidonsäure
22:1∆13 (Z)-13-Docosensäure Erucasäure
24:1∆15 (Z)-15-Tetracosensäure Nervonsäure
Kurzkettige Fettsäuren sind u. a. im Palmöl, im Kokosfett und in Milchfetten enthalten,
langkettige mit mehr als 24 C-Atomen kommen vor allem in Wachsen vor. Die meisten
ungesättigten Fettsäuren sind einfach ungesättigt, die häufigste ist (Z)-9-Octadecensäure, die
besonders häufig in höheren Pflanzen und in Tieren, die bei niedrigen Temperaturen leben,
gefunden wird.
In der Fettsäurechemie hat sich eine Kurzschreibweise eingebürgert, die die Kohlenstoffzahl
sowie die Anzahl, Position und Konfiguration der Doppelbindungen symbolisiert. 16:0 steht
14
z.B. für die gesättigte Palmitinsäure, 18:1∆9 für (Z)-9-Octadecensäure usw. (Die trans-
Geometrie muss gesondert angegeben werden, vergl. Tabelle 1).
Für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen spielen die Fettsäuren Linolsäure und
Linolensäure eine wesentliche Rolle.
2.3.3 Biosynthese von C6-Alkoholen und -Aldehyden (GLAs)
Der erste Schritt bei der Produktion dieser VOCs ist die Bildung freier Fettsäuren aus
Bestandteilen von Zellmembranen mittels Lipasen. Die Fettsäuren werden durch
Lipoxygenaseenzyme zu Hydroperoxiden oxidiert. Diese Hydroperoxide werden unter
anderem durch Lyaseenzyme umgewandelt, wobei flüchtige Verbindungen gebildet werden,
die hauptsächlich aus sechs Kohlenstoffatomen bestehen (C6-Verbindungen, Abbildung 9).
Abbildung 9: Schematische Darstellung der Produktion flüchtiger organischer Verbindungen aus dem Octadecanoidweg nach Croft et al. (1993), Hatanaka (1993), Gardner (1995). Ausgehend von Lipiden werden die GLAs über drei enzymatische Schritte (rot) gebildet.
15
2.3.4 Biosynthese von Salicylsäure (SA)/ Salicylsäuremethylester (MeSA)
Aus dem im Shikimatweg gebildeten Chorismat wird über Zwischenstufen Phenylalanin
synthetisiert. Dieses gilt aus Ausgangsverbindung für die Salicylsäurebildung [Mauch-Mani
und Slusarenko, 1996; Ribnicky et al., 1998]. Die Reaktion von Phenylalanin zur Zimtsäure
ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt zur Salicylsäurebildung. Dieser wird von dem
Enzym Phenylalaninlyase (PAL) katalysiert. Das Enzym Benzoesäure-2-Hydroxylase
(BA2H) setzt nach weiteren Zwischenschritten Benzoesäure zu Salicylsäure um [Ribnicky et
al., 1998]. Auch eine Bildung von SA über ortho-Coumarinsäure wird diskutiert [Yalpani et
al., 1993].
Neuere Untersuchungen zeigten für Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa einen weiteren
Weg zur Salicylsäure-Bildung. Die Bildung erfolgte aus Chorismat über die Isochorismat-
Synthase (ICS) und Pyruvat-Lyase (PL). Auch für einige Pflanzen wurde dieser zweite
mögliche Biosyntheseweg vorgeschlagen [Wildermuth et al., 2001].
Abbildung 10: Schema der Biosynthese von Salicylsäure über die zwei bisher bekannten Biosynthesewege Phenylpropanoidweg und Isochorismatweg (PAL = Phenylalaninlyase, BAH2 = Benzoesäure-2-Hydroxylase, ICS = Isochorismat-Synthase, PL = Pyruvat-Lyase)
16
Die Methylierung der Salicylsäure erfolgt durch das Enzym Salicylsäuremethyltransferase. Es
katalysiert den Transfer einer Methylgruppe von S-Adenosyl-L-methionin zur Carboxyl-
gruppe der Salicylsäure.
2.4 Bedeutung der VOCs für die Pflanze Da Pflanzen zahlreichen biotischen und abiotischen Stressfaktoren in ihrem Lebensraum
ausgesetzt sind, ihnen aber nicht ausweichen können, haben sie in Laufe der Evolution andere
Strategien entwickelt, sich gegen Schädigungen zu wehren. Zu diesen Strategien gehört die
Ausbildung mechanischer Barrieren (Stachel, Dornen, Wachsschichten, Drüsenhaare und
Trichome) [Eisner et al., 1998]. Die Trichome und Drüsenhaare stellen dabei eine Mischung
aus mechanischer und chemischer Abwehr dar. Sie enthalten unter anderem Monoterpene, die
bei Berührung abgegeben werden.
Neben diesen Emissionen gibt es auch andere induzierbare Emissionen. Diesen induzierbaren
Emissionen wird eine Rolle bei der Abwehr von Pflanzenschädlingen zugeschrieben. Der
Auslöser induzierter Emissionen kann sowohl ein pflanzeninternes Signal (z. B. bei der
Blütenduftbildung) oder aber ein Stressor sein.
So werden Mono- und Sesquiterpene als Lockstoffe gebildet, um die Bestäubung zu fördern
[Heß, 1988], bestimmte Monoterpene können aber auch die Samenkeimung oder das
Wachstum benachbarter Pflanzen behindern [Fischer, 1991].
Gershenzon und Croteau (1991) erkannten in den Monoterpenen einen Abwehrstoff gegen
Pathogene und Herbivore, ebenso ergaben Untersuchungen von Farentinos et al. (1981) und
Elliot und Loudon (1987), dass Herbivore durch den Geruch oder den Geschmack von
Monoterpenen bei ihrer Ausbreitung behindert werden. Weaver et al. (1994) untersuchten die
Monoterpenbildung hinsichtlich des Fraß-, Besiedlungs- und Eiablageschutzes und stellten
einen für die Pflanze positiven Zusammenhang fest. Je höher die Emission der Monoterpene
war, desto geringer war die Eiablage und die Besiedlungsanzahl und somit auch der
Fraßschaden. Turlings et al. (1990) untersuchten die Wirkung von Terpenoidemissionen aus
Maispflanzen auf Raupen. Bei Fraß der Raupe induziert ihr Speichel die Terpenoid-
emissionen, diese wiederum locken dann Raubwespen an, die ihre Eier in die Raupe legen.
Monoterpenen wird ebenfalls eine antimikrobielle Wirkung zugeschrieben [Cheniclet, 1987;
Lewinsohn et al., 1991; Himejima et al., 1992 und Funk et al., 1994].
Auf biotische und abiotische Stressoren wie z. B. Ozon reagieren Pflanzen auch mit der
Abgabe von Substanzen aus dem Octadecanoidweg. Hierzu gehören Aldehyde, Alkohole,
17
Ketone und Ester mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen. Sie werden oft unter dem Namen
Blattalkohole oder –aldehyde zusammengefasst. Auch ihre Funktion ist nicht vollständig
geklärt. Einige dieser Substanzen sind Bitterstoffe, die Fraßfeinde abschrecken sollen
[Schaller, 2001], sie können antibakterielle Wirkung zeigen [Croft et al., 1990, 1993] oder sie
haben sogar toxische Wirkung [Matile, 1984].
Neben diesen aus dem Octadecanoidweg stammenden Kohlenwasserstoffen werden nach
Stress auch Substanzen über den Shikimatweg gebildet. Eine wichtige Rolle spielt hier die
Salicylsäure. Salicylsäure ist ein wichtiges Pflanzenhormon, da sie in Pflanzen für die
systemisch erworbene Resistenz (SER) verantwortlich ist [Ryals et al., 1996]. Shulaev et al.
(1997) beschreiben zudem ihren Methylester als Botenstoff, der auch in benachbarten
Pflanzen die SER auslösen kann.
2.5 Enzyme Enzyme (griech.: en zyme = in der Hefe, im Sauerteig), früher auch Fermente (lat.:
fermentum = Sauerteig) genannt, sind hochmolekulare Proteine (Eiweißstoffe), welche
chemischen Reaktionen im Organismus katalysieren [Dellweg et al., 1992; Theil, 1997].
Enzyme sind natürlich vorkommende Copolymere, die aus Polypeptidketten aufgebaut sind.
Sie setzen sich aus den 20 verschiedenen α-Aminosäuremonomeren zusammen.
Man unterscheidet zwischen vier unterschiedlichen Strukturen, der Primär-, Sekundär-,
Tertiär- und der Quartärstruktur. Als Primärstruktur wird die Reihenfolge der über Peptid-
Bindungen miteinander verknüpften Aminosäuren (Aminosäuresequenz) bezeichnet. Diese
Primärstruktur ist verantwortlich für die Faltung der Polypeptidketten unter Ausbildung der
Sekundärstruktur. Typische Formen sind die α-Helix und das β-Faltblatt. Die Verknäuelung
der einzelnen Proteinmoleküle führt zu seiner dreidimensionalen Struktur, der Tertiärstruktur.
Bei Enzymen, die aus mehreren Polypeptidketten bestehen, kann es zu intermolekularen
Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Untereinheiten kommen, diese Anordnung
bezeichnet man als Quartärstruktur.
Die katalytische Aktivität des Enzyms hängt vor Allem von seiner dreidimensionalen
Struktur, also von der räumlichen Anordnung der Polypeptidkette und den Aminosäureresten
ab. Die räumliche Struktur eines Enzyms ergibt sich intramolekular durch hydrophobe und
ionische Wechselwirkungen und wird durch Disulfid-Brücken und durch Wasserstoff-
Brückenbindungen stabilisiert.
18
Durch äußere Einflüsse wie Druck, organische Lösemittel, Temperatur oder Wasserentzug
kann es zur Änderung der Tertiärstruktur (Denaturierung) kommen. Diese Änderung führt
meistens zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der katalytischen Aktivität.
Allerdings können Enzyme durch Cofaktoren wie zum Beispiel Metallionen oder organische
Moleküle (Coenzyme) gegen eine Denaturierung stabilisiert werden.
Enzyme setzten die Aktivierungsenergie chemischer Reaktionen um das bis zu 106-fache
herab und erhöhen daher die Reaktionsgeschwindigkeit. Aufgrund dieser katalytischen
Eigenschaften werden Enzyme oft als Biokatalysatoren bezeichnet. Viele Enzyme können
sowohl die Hin- als auch die Rückreaktion beschleunigen (siehe auch Abbildung 9) und
werden dabei selbst nicht verändert. Die Katalyse findet in einer speziellen Region des
Enzyms statt, welches als aktives Zentrum bezeichnet wird. Es kommt dort zu
Wechselwirkungen zwischen räumlich benachbarten (funktionellen) Aminosäureresten mit
dem Substrat. Zudem besitzen Enzyme spezifische Bindungstaschen, welche das Substrat
durch nicht-kovalente Wechselwirkungen binden.
Eine wichtige Eigenschaft der Enzyme ist ihre Spezifität. Bei Enzymen, welche nur eine
einzige Reaktion für ein Substrat katalysieren, spricht man von absoluter Spezifität. Andere
Enzyme katalysieren bestimmte Reaktionen für eine Reihe von Substraten mit ähnlichen
chemischen Eigenschaften, diese Enzyme sind gruppenspezifisch.
Auch heute werden die molekularen Wirkungsmechanismen von Enzymen noch untersucht
und diskutiert. Die allgemein gültige Reaktionsgleichung für enzymatisch katalysierte
Reaktionen wurde allerdings bereits 1913 von Michaelis und Menten [Michaelis und Menten,
1913] als „Enzym-Substrat-Theorie“ formuliert:
Der erste Schritt ist die Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes (ES) aus dem Enzym (E)
und dem Substrat (S). Dieser Komplex steht in Abhängigkeit von äußeren Größen (z.B. pH-
Wert, Temperatur) in einem Gleichgewicht mit dem freien Enzym und Substrat. Die vom
Enzym katalysierte Reaktion führt im zweiten Schritt unter Freisetzung des Enzyms und des
Produktes (P) zur Spaltung des Enzym-Substrat-Komplexes. Der Katalysezyklus aus
Kombination (Schritt 1) und Spaltung (Schritt 2) kann nun erneut ablaufen.
Michaelis und Menten entwickelten basierend auf ihrer „Enzym-Substrat-Theorie“ eine nach
ihnen benannte Gleichung, die den Zusammenhang zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit
19
[v] einer Enzymreaktion und der Substratkonzentration [S] beschreibt und als Grundgleichung
der Enzymkinetik gilt [Hübner, 1989]:
Vmax stellt in dieser Gleichung die Maximalgeschwindigkeit bei Sättigung des Enzyms mit
dem Substrat dar. KM ist die Michaelis-Menten-Konstante, die sich aus den
Geschwindigkeitskonstanten k1, k-1 und k2 wie folgt zusammensetzt:
In der Literatur findet man Michaelis-Menten-Konstanten, die in der Regel zwischen 10-2 bis
10-5 mol L-1 liegen. Die Auftragung der Reaktionsgeschwindigkeit v gegen die Substrat-
konzentration [S] ergibt einen wie in Abbildung 11 dargestellten hyperbelförmigen Verlauf.
Gut zu erkennen ist das für Enzymreaktionen charakteristische Phänomen der Substrat-
sättigung.
Abbildung 11: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion von der Substratkonzentration [S] nach Michaelis und Menten, KM = Michaelis-Menten-Konstante
Im niedrigen Substratkonzentrationsbereich ist die Reaktionsgeschwindigkeit nahezu
proportional zur Konzentration des Substrats. Steigt die Substratkonzentration hingegen
weiter an, so ist die Reaktionsgeschwindigkeit nicht mehr linear von der
Substratkonzentration abhängig, sondern strebt asymptotisch einem Grenzwert, der
20
maximalen Reaktionsgeschwindigkeit Vmax, entgegen. Theoretisch wird die maximale
Reaktionsgeschwindigkeit genau dann erreicht, wenn das Enzym mit Substrat gesättigt ist,
d.h. die gesamte Enzymmenge als Enzym-Substrat-Komplex vorliegt. In Abbildung 11
entspricht die Michaelis-Menten-Konstante KM genau der Substratkonzentration, bei der die
Geschwindigkeit der Enzymreaktion 50% der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit beträgt.
Zur Benennung von Enzymen hat die IUB (International Union of Biochemistry) einen
einfaches System entwickelt (Tabelle 2). Der Name eines Enzyms setzt sich zusammen aus
einem empfohlenen Trivialnamen, einem systematischen Namen und einer vierstelligen
Schlüsselnummer. Der systematische Name eines Enzyms lässt dabei Rückschlüsse auf das
Substrat und den Reaktionstyp zu, während die durch Punkte getrennten vier Ziffern die
Enzymklasse, die 1. und 2. Unterklasse sowie eine laufende Seriennummer darstellen.
Tabelle 2: Nomenklatursytem für Enzyme nach der IUB (International Union of Biochemistry):
EC-Nr.a) Klasse Funktion
1 Oxidoreduktasen Katalyse von Redoxreaktionen innerhalb eines Substrat- paares durch Wasserstoff- bzw. Elektronenübertragung 2 Transferasen Katalyse von intermolekularen Übertragungen funktioneller Gruppen 3 Hydrolasen Katalyse von hydrolytischen Spaltungen
4 Lyasen Katalyse von Eliminierungen unter Bildung von Doppelbindungen
Katalyse von Additionen an Doppelbindungen 5 Isomerasen Katalyse von Isomerisierungen
6 Ligasen (Synthetasen) Katalyse von Verknüpfungen zweier Moleküle unter ATP-
Verbrauch a) EC: Enzyme Commission der IUB
Die Wirkungsweise der für diese Arbeit relevanten Enzyme Lipase, Lipoxygenase und
Hydroperoxidlyase wird im Folgenden kurz erläutert.
21
2.5.1 Lipase (LIP) Lipasen (EC 3.1.1.3: Triacylglycerinacylhydrolasen) gehören zur Klasse der Hydrolasen (EC
3), spezieller der Esterasen (EC 3.1). Sie sind in der Lage, spezifisch Fette (Triglyceride) in
Glycerin und Fettsäuren zu spalten (Abbildung 12) [Borgstörm und Brockman, 1984;
Dellweg et al., 1992; Theil, 1997]. Ihre Funktionsweise ist bereits sehr gut in Arbeiten wie
z. B.: Schmid (2000) oder Borgdorf (2005) beschrieben.
Abbildung 12: Schematische Darstellung der primären Lipasereaktion [Borgdorf, 2005]
Die Lipolyse, also die lipasekatalysierte Hydrolyse von Triglyceriden, ist eine Gleich-
gewichtsreaktion, die teilweise oder vollständig verlaufen kann (partielle bzw. totale
Fettspaltung). Bei der partiellen Fettspaltung entstehen dabei Di- und Monoglyceride. Das
Vorkommen von Lipasen wurde bisher in Mikroorganismen wie Bakterien, Pilzen, in
Organen von Säugetieren (z.B. Pankreas) und in Pflanzen nachgewiesen.
Das pH-Optimum von Lipasen in wässrigem Medium schwankt je nach deren Herkunft.
Lipasen aus Säugetieren haben ein pH-Optimum im schwach alkalischen Bereich, Lipasen
aus Bakterien eher im neutralen bis schwach alkalischen Bereich. Lipasen aus Pflanzen oder
Schimmelpilzen haben ein Optimum im neutralen bis schwach saueren Bereich.
Das Temperatur-Optimum der meisten Lipasen liegt zwischen 30°C und 40°C und sie
benötigen wie alle Hydrolasen keine Coenzyme. Ihre Hydrolyseaktivität gegenüber den
wasserunlöslichen Fetten entfalten die Lipasen an der Grenzfläche Wasser/Öl. Der Grund
hierfür ist einerseits der enge Kontakt zwischen Enzym und hydrophobem Substrat,
andererseits eine erhöhte Aktivität durch das Phänomen der „Grenzflächenaktivierung“
(interfacial activation). Dieses Phänomen zeigte sich schon früh durch Messungen der
Lipaseaktivität in Abhängigkeit von der Substratkonzentration. Die Grenzflächenaktivierung
von Lipasen konnte allerdings erstmals 1990 anhand von Röntgenstrukturdaten kristallisierter
Lipasen erklärt werden [Brady et al., 1990; Winkler et al., 1990].
Lipasen besitzen einen „Deckel“ (lid oder flap) in Form einer beweglichen
Oligopeptideinheit, der den Zugang zum aktiven Zentrum blockiert. Erst wenn sich eine
hydrophobe Grenzfläche dieser Einheit annähert, wie z.B. ein Fetttröpfchen, öffnet sich der
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Deckel im Zuge einer Konformationsänderung und ermöglicht dem Substrat den Zugang zum
aktiven Zentrum. Alle räumlichen Strukturen, die bisher aufgeklärt wurden, weisen eine
spezifische Sequenzfolge von α-Helices und β-Faltblättern, die so genannte „α/β-
Hydrolasefaltung“ auf. Lipasen wirken ähnlich wie Serinproteasen, ihre Wirkung beruht auf
der „katalytischen Triade“ aus den Aminosäuren Asparaginsäure (oder Glutaminsäure),
Histidin und Serin, welche über Wasserstoffbrückenbindungen miteinander verknüpft sind
(Abbildung 13).
Abbildung 13: Katalytische Triade aus Asparaginsäure, Histidin und Serin im aktiven Zentrum von Lipasen (und Serinproteasen) [Borgdorf, 2005]
Der Mechanismus der lipasekatalysierten Hydrolyse eines Fettsäureesters kann in mehrere
Reaktionsschritte unterteilt werden (Abbildung 14). Der erste Schritt ist eine nukleophile
Reaktion des Serins mit dem Ester unter Bildung eines tetraedrischen Intermediates (1).
Abbildung 14: Reaktionsmechanismus der lipasekatalysierten Hydrolyse eines Fettsäureesters [verändert Schmid, 2000]
23
Der Imidazolrest des Histidins bindet das freigewordene Proton; diese Reaktion wird durch
das Carboxylatanion der Asparaginsäure stabilisiert. Mehrere Aminosäurereste in einer
Region des aktiven Zentrums stabilisieren das negativ geladene Zwischenprodukt der
Protonenabspaltung. Diese Region wird als Oxyanionen-Loch bezeichnet. Durch die
Abspaltung eines Alkohols aus dem Enzym-Substrat-Komplex bildet sich Acylenzym (2).
Der nukleophile Angriff von Wasser auf das Acylenzym im nächsten Schritt der Reaktion
führt erneut zu einem tetraedrischen Intermediat (3), das schließlich in das freie Enzym und
die Fettsäure zerfällt (4).
Die Bildung des Acylenzyms ist streng genommen eine Umesterung des Fettsäureesters mit
dem freien Enzym (Abbildung 15). Dabei konkurriert der freigesetzte Alkohol als Nukleophil
im anschließenden Katalyseschritt mit Wasser um das Acylenzym. Da Wasser generell
gegenüber dem Alkohol im großen Überschuss vorhanden ist, liegt das Gleichgewicht der
Gesamtreaktion eindeutig auf der Seite der Hydrolyseprodukte.
Abbildung 15: Reaktionsverlauf der lipasekatalysierten Hydrolyse eines Fettsäureesters [Borgdorf, 2005]
Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der lipasekatalysierten Hydrolyse eines
Fettsäureesters ist die Freisetzung von Enzym und Fettsäure, da die Bildung des Acylenzyms
sehr schnell verläuft.
2.5.2 Lipoxygenase (LOX) Lipoxygenasen (Linoleat: Sauerstoff Oxidoreduktase, EC 1.13.11.12; LOXs) kommen in
Wirbeltieren, Pilzen, Algen und höheren Pflanzen vor. Sie sind nicht-Häm-Eisen-haltige
Dioxygenasen [Siedow, 1991]. Sie katalysieren regiospezifische Umsetzung von Fettsäuren
mit einem (1Z, 4Z)-Pentadiensystem und molekularem Sauerstoff unter Bildung von (1Z, 3E)-
Hydroperoxyfettsäuren [Gardner, 1991].
Die LOX in Pflanzen können nach ihrer Regiospezifität eingeteilt werden. Da hier Linolsäure
und α-Linolensäure die häufigsten Substrate darstellen, werden sie nach den aus ihnen durch
24
die LOX-Reaktion entstehenden Regioisomeren der Positionen 9 und 13 eingeteilt [Vick,
1993]. Diese Regiospezifität ist von verschiedenen Reaktionsbedingungen wie z. B. dem pH-
Wert abhängig [Gardner, 1989; Kühn et al., 1985].
Neuere Arbeiten teilen pflanzliche LOX aufgrund von Homologien in ihrer cDNA-Sequenz
ein. Allerdings haben auch diese beiden Familien untereinander hohe Sequenzhomologien
[Shibata et al., 1995a]. Man unterscheidet Enzyme ohne (LOX1-Typ) und mit
chloroplastidärem Transitpeptid (LOX2-Typ) [Feussner und Wasternack, 2002].
Da LOXs hohe Homologien in ihrer Aminosäuresequenz aufweisen, sind sie nur sehr schwer
zu unterscheiden. Ein weiteres Problem zur Unterscheidung stellt ihr Vorkommen als
Multigenfamilie in Pflanzen dar, so wurden z. B. aus Sojabohne bisher 12 verschiedene
cDNAs bzw. Gene isoliert, die für LOX kodieren [Shibata, 1996]. In Kartoffel sollen sogar 30
– 40 LOX-Gene vorhanden sein [Bachem et al., 1996].
Darüber hinaus hängt die Regulation und Expression von LOX-Genen in der Zelle von ihrem
Entwicklungsstadium ab und kann durch biotischen und abiotischen Stress beeinflusst werden
[Saravitz und Siedow, 1995 und 1996]. Ein weiteres Problem bei der Zuordnung
verschiedener LOX Formen zu ihrer physiologischen Funktion stellen unterschiedliche
enzymatische Aktivitäten in verschiedenen Geweben und das Vorkommen mehrer LOX in
einer Zelle dar [Feussner und Kindl, 1994; Grayburn et al., 1991].
Intrazelluläre LOX unterscheidet man als gelöst vorliegende oder an Membranen gebundene
LOX. Lösliche LOX kommen in hohen Mengen im Cytosol von Samen und Keimlingen vor
[Rosahl, 1996]; ihre physiologische Funktion ist allerdings bis heute nicht sicher. Auch in
Blättern wurden in der Vakuole [Tranbarger et al., 1991], im Zellkern [Feussner et al., 1995]
und im Chloroplasten [Bell et al., 1995; Feussner et al., 1995; Heitz et al., 1997; Peng et al.,
1994; Royo et al., 1996] lösliche LOX gefunden.
2.5.2.1 Der Lipoxygenase-Stoffwechselweg In Pflanzen werden die durch LOXs gebildeten Fettsäurehydroperoxide sehr schnell durch
eine Vielzahl von Enzymreaktionen weiter umgesetzt (Abbildung 16) [Feussner und
Wasternack, 1998; Rosahl, 1996]. Bis jetzt sind sieben Enzyme beschrieben, die
Fettsäurehydroperoxide umsetzen und damit um diese Hydroperoxide konkurrieren. Daher
sind Kenntnisse zur Verzweigung des Stoffwechsels nach der LOX-Reaktion wichtig für das
Verständnis des Metabolismus der mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs, Poly
Unsaturated Fatty Acids).
25
AOS: Als erstes Enzym wurde die Allenoxid-Synthase (AOS) oder Hydroperoxid-Dehydrase
isoliert und charakterisiert [Song und Brash, 1991]. Es ist das bisher am Besten untersuchte
Enzym und gehört zur Familie der Cytochrom-P450-Enzyme der Unterfamilie CYP74A. Sein
Reaktionsprodukt ist ein Allenoxid, das spontan in Ketole zerfallen oder im Falle von (13S)-
Hydroperoxylinolensäure durch die Allenoxid-Cyclase (AOC) zur 12-Oxophytodienonsäure
(OPDA) zyklisiert werden kann [Song und Brash, 1991]. Diese ist die Vorstufe der
Jasmonsäure, die den Pflanzenhormonen zugerechnet wird.
POX: Ein weiteres gut charakterisiertes Enzym ist die Peroxygenase [Blee und Schuber,
1990]. Sie katalysiert Umsetzungen zu Hydroxy-, Epoxy- und β-Hydroxyepoxyfettsäuren.
Die Epoxygruppen können anschließend zu Dihydroxygruppen hydrolysiert werden, so dass
Di- und Trihydroxyfettsäuren entstehen [Hamberg, 1993]. Dieses Enzym wurde besonders in
Keimlingen der Sojabohne charakterisiert. Seine Reaktionsprodukte wurden aber auch in
einer Vielzahl anderer Pflanzen gefunden.
EAS: Die Epoxyalkoholsynthase katalysiert intramolekulare Konformationsveränderungen
der Hydro(per)oxyfettsäuren was ebenfalls zur Bildung von Epoxyhydroxyfettsäuren führt
[Hamberg, 1999]. Dieser Weg konnte bisher nur in Solanaceen nachgewiesen werden
[Feussner und Wasternack, 2002].
Reduktase: Im Reduktaseweg werden Hydro(per)oxyfettsäuren zu Hydroxyderivaten
reduziert. Der Mechanismus ist allerdings noch nicht geklärt [Feussner und Wasternack,
2002].
DES: Die Divinylether-Synthase bildet aus den Hydroperoxyfettsäuren Divinylether sowie
Colnel- und Colnelensäuren [Feussner et al., 1998, Grechkin, 1998].
LOX: Weiterhin können LOXs selbst ihre Produkte weiter umsetzen. Diese oxidieren bei
Sauerstoffmangel die Fettsäurehydroperoxide zu den entsprechenden Ketoderivaten
(Abbildung 16, z. B. Ketolinolsäure, KODE) [Kühn et al., 1991].
HPL: Ein weiteres Enzym ist Hydroperoxidlyase (HPL). Es spaltet die
Fettsäurehydroperoxide in Aldehyde und ω- Ketofettsäuren [Matsui, 1998]. HPL-cDNAs
wurden kürzlich aus Arabidopsis und Pfeffer isoliert. Ihre Analyse erbrachte ebenfalls die
Zuordnung dieses Enzyms zu den Cytochrom-P450-Enzymen. Darüber hinaus bilden sie mit
den AOS eine gemeinsame Unterfamilie, CYP74A bzw. CYP74B. Eine nähere Beschreibung
der HPL erfolgt in Kapitel 2.5.3.
26
Abbildung 16: Schema des Abbaus von Linol(en)säure im Lipoxygenase-Reaktionsweg, AOC = Allenoxid-Cyclase, AOS = Allenoxid-Synthase, DES = Divinylether-Synthase, EAS = Epoxyalkohol-Synthase, RED = Reduktase, OPDA = Oxophytodienonsäure, HPO(D/T)E = Fettsäurehydroperoxide, KO(D/T)E = Ketofettsäuren, HO(D/T)E = Hydroxifettsäuren [Stumpe et al., 2005]
Über die Regulation des LOX-Reaktionsweges, insbesondere unter Berücksichtigung der
genannten Verzweigungen, gibt es noch keine Befunde. Wenige Daten existieren über das
organspezifische Vorkommen in Pflanzen [Blee und Joyard, 1996]. Anhaltspunkte zur
Funktion der Produkte des LOX-Reaktionsweges, die man unter dem Oberbegriff
„Oxylipine“ zusammenfasst, sind bisher auf wenige Verbindungen begrenzt. Am besten
untersucht ist bisher die Entstehung und Rolle von Jasmonaten [Creelman und Mullet, 1997;
Wasternack und Parthier, 1997].
27
2.5.3 Hydroperoxidlyase (HPL) Die Produkte der LOX-Reaktion, die Fettsäure-Hydroperoxide, werden in der Pflanze auch
durch die HPL weiterverarbeitet. Ihre chemische Spaltung führt im Falle von z. B.
13-HPOTE zur Bildung von (Z)-3-Hexenal und (Z,Z)-9,12-Oxo-9-dodecensäure [Gardner und
Plattner, 1984; Grechkin, 1998].
Im LOX-Reaktionsweg katalysiert die HPL die Spaltung des Kohlenstoffgerüstes zwischen
dem Hydroperoxid-tragendendem Kohlenstoff und der Methingruppe der Doppelbindung in
Nachbarstellung [Noordermeer et al., 2001a]. Die dabei entstehenden Reaktionsprodukte sind
denen der säurekatalysierten Spaltung sehr ähnlich. Daher nimmt man an, dass die
Enzymkatalyse mit einer heterolytischen Spaltung des Hydroperoxides beginnt. Aus diesem
Grund werden die HPL des LOX-Reaktionsweges als „heterolytische“ HPL bezeichnet
[Gardner und Plattner, 1984].
Andererseits identifizierten Shibata et al. (1995b) durch spektroskopische Untersuchung
dieser HPL das Protein als P-450-Enzym. Dieses und die Tatsache, dass Radikalfänger, wie z.
B. Gallensäurederivate oder α-Tocopherol die Katalyse hemmen, führten zu der Hypothese
einer homolytischen Spaltung des Hydroperoxides unter Ausbildung eines Epoxyallylradikals
[Hatanaka et al., 1986; Shibata et al., 1995b]. Der Reaktionsmechanismus der Oxidation zu
einem Kation ist noch nicht geklärt. Das Epoxyallylradikal bzw. -kation ist vermutlich ein
gemeinsames Intermediat im Reaktionsmechanismus aller CYP74-Enzyme. Sie unterscheiden
sich wahrscheinlich nur in den Folgereaktionen [Feussner und Wasternack, 2002].
Bei der HPL kommt es zur Spaltung der C-C-Bindung des Oxirans, gefolgt von der
Anlagerung des Hydroxylradikals an den Oxiranrest unter Bildung eines Halbacetals
(Abbildung 17). Grechkin und Hamberg konnten 2004 zeigen, dass dieses Halbacetal das
tatsächliche HPL-Reaktionsprodukt ist [Grechkin und Hamberg, 2004]. Aufgrund der
chemischen Instabilität (Halbwertzeit 20 s bei 0 °C) kommt es zur spontanen Dissoziation und
damit zur Bildung eines Aldehyds und eines Enols, welches zu einem zweiten Aldehyd
isomerisiert. Dieser Mechanismus wird unterstützt durch Untersuchungen mit [18O2]-13-
HPOTE bzw. [18O]-Wasser. Dabei wurde für die CYP74-Familie der Cytochrom P-450-
Enzyme gezeigt, dass der Sauerstoff beider Aldehydgruppen vom Hydroperoxid stammt und
nicht vom Wasser [Grechkin und Hamberg, 2004].
28
Abbildung 17: Postulierter radikalischer Reaktionsmechanismus der CYP74-Enzyme nach Song et al., (1993); Grechkin, (2002); Grechkin und Hamberg, (2004).
Da CYP74-Enzyme die Reaktionsprodukte der LOX als Substrate nutzen, kann man die
Theorien zur LOX-Regiospezifität vermutlich auf CYP74-Enzyme übertragen. Basierend auf
der aufgelösten Struktur verschiedener LOX und gerichteten Mutagenesen nimmt man an,
dass die Größe der Bindungstasche die Regiospezifität beeinflusst und die Fettsäure mit dem
Methyl-Ende in diese eintaucht [Browner et al., 1998; Gillmor et al., 1998]. Das Carboxyl-
Ende wird durch positive Aminosäuren am Rand der Tasche erkannt. Kann das Substrat tief
in das Protein vordringen, erfolgt die Oxidation weiter entfernt vom Methyl-Ende; ist die
Bindungstasche klein kommt es zur Einführung des Sauerstoffs näher am Methyl-Ende.
Alternativ wäre eine inverse Orientierung der Fettsäure in der Bindungstasche für die
Spezifität verantwortlich [Prigge et al., 1998; Hornung et al., 1999; Coffa und Brash, 2004].
Bei 13-LOX befindet sich das Methyl-Ende in der hydrophoben Bindungstasche; bei 9-LOX
dringt das Carboxyl-Ende der Fettsäure zuerst in die Bindungstasche ein.
In dieser Arbeit sollten die oben näher beschriebenen Enzyme und ihre Bedeutung für die
Menge an stressinduzierten Emissionen näher untersucht werden. In der in Abbildung 9
gezeigten Kaskade sollte der langsamste und somit geschwindigkeitsbestimmende Schritt
29
bestimmt werden. Da es sich dabei um ein Mehr-Enzymsystem handelt muss diese
Vorgehensweise hinterfragt werden. Kacser und Burns (1981) erläutern in ihrer Arbeit den
prinzipiellen Zusammenhang zwischen Enzymen und ihrem Produkt/en. Betrachtet man ein
Ein-Enzymsystem erhält man einen linearen Zusammenhang zwischen der Enzymaktivität
und der Konzentration des gebildeten Produktes (hier GLA Emissionen). In einem Mehr-
Enzymsystem hängt das Ergebnis allerdings nicht alleine von einer der Enzymaktivitäten ab.
Die Variation der Aktivität nur eines der Enzyme führt nach Kacser und Burns (1981) zu
einem nicht linearen Verhalten bei dem es zu einer Sättigung kommt, wenn alle Enzyme
einen ähnlichen Umsatz zeigen. Daher ist der Zusammenhang zwischen den gemessenen
Enzymaktivitäten und der Emissionsstärke an GLAs nicht zwingend als linear anzunehmen.
30
3. Ziel der Arbeit und prinzipielle Vorgehensweise
Im Rahmen dieser Arbeit sollten Untersuchungen zum Zusammenhang zwischen den
Emissionen von VOCs aus dem Octadecanoidweg und den Aktivitäten der beteiligten
Enzyme (Abbildung 9, rot markiert) durchgeführt werden. Ziel dieser Arbeit war die
Entwicklung eines Assays zur online und nicht invasiven Bestimmung der Auswirkungen von
Stress auf die Aktivierung und der Dynamik der Enzymaktivitäten im Octadecanoidweg.
Vorgehensweise:
Tomatenpflanzen cv. Moneymaker wurden in den Pflanzenkammern des ICG-3 (Institut für
Chemie und Dynamik der Geosphäre) unter definierten Bedingungen gehalten und zu
definierten Zeitpunkten mit unterschiedlichen Stressdosierungen exponiert. Als Stressor
wurde Ozonexposition gewählt, da Ozon einfach dossierbar ist und daher der Stressor
reproduzierbar eingesetzt werden kann. Hierbei ist die Stressstärke quantitativ durch die pro
Zeit und pro Blattfläche aufgenommene Ozonmenge bestimmt (Ozonflussdichte, Φ(O3))
[Beauchamp et al., 2005]. Die Bestimmung der Emissionsstärken erfolgte online mittels
GC/MS.
Abbildung 18: Beispiel zeitlicher Verlauf der LOX-Emissionen nach Stresseinwirkung auf eine Tomatenpflanze Mit den zwei vorhandenen speziellen Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Systemen
war die qualitative und quantitative Bestimmung der Konzentrationen von VOCs ab
Methanol, über die GLAs, die Mono- und Sesquiterpene, MeSA, bis hin zu C16-VOCs
31
(TMTT) möglich [Heiden et al., 1999; Folkers, 2002]. Abbildung 18 zeigt beispielhaft den
Verlauf der Summe der LOX Emissionen einer Tomatenpflanze nach Ozonexposition. Bei
den Experimenten zur Bestimmung der Enzymaktivitäten wurden die Pflanzen während der
Stressantwort ausgebaut, schockgefroren und zur Bestimmung der Enzymaktivitäten des
Octadecanoidwegs bis zur Messung bei -80°C eingefroren. Die roten senkrechten Linien
stehen hier beispielhaft für den Zeitpunkt der Beprobung bei den unterschiedlichen
Versuchen. Bei einem Vergleich von Enzymaktivitäten mit Emissionen stellte die lange
Anreicherungszeit des GCs ein Problem dar, da die Chromatogrammme immer
Emissionsmittelwerte über die Anreicherungsdauer darstellen. Die Emissionen von GLAs
treten nach pulsförmiger Stressapplikation in Pulsen auf. Die Mittelwertnahme führt daher zu
einem Fehler bei einem Vergleich der Emissionsraten mit den Enzymaktivitäten, da letztere
die Aktivität zum Zeitpunkt des Schockgefrierens der Probe darstellen. Um dieses Problem zu
minimieren, wurde die Anreicherungszeit der GC/MS-Systeme auf 10 Minuten herabgesetzt.
Das dann erhaltene Chromatorgram spiegelt dann einen Mittelwert über die letzten 10 min.
vor der Probennahme wieder. Für diese kürzere Zeitspanne sollte sich dann ein kleinerer
systematischer Fehler ergeben als bei einer längeren Anreicherungszeit. Um diese Verkürzung
zu erreichen, wurden die VOCs aus den Pflanzen in den meisten Versuchen nur für 10 min
angereichert und die restlichen 40 Minuten aufgereinigte Luft (Kammereingang) über das
Absorptionsröhrchen geleitet. Nach der 10 minütigen Anreicherungszeit wurden die Pflanzen
aus der Kammer ausgebaut, die Blätter mittels Flüssigstickstoff schockgefroren und unter
Flüssigstickstoff in einem Möser pulverisiert und homogenisiert.
Das Pflanzenmaterial wurde auch auf den Gehalt an freien Fettsäuren (Linol- und
Linolensäure), Hydroperoxisäuren, sowie die Gehalte an phenolischen Inhaltsstoffe (SA) aus
dem Shikimatweg untersucht. Die so ermittelten Gehalte an freier Salicylsäure wurden dann
mit den gemessenen Emissionen an Salicylsäuremethylester verglichen, um auch hier
eventuelle Zusammenhänge näher zu untersuchen.
32
4. Material und Methoden
Um die Emissionen von VOC aus Pflanzen unter kontrollierten Bedingungen (T, PAR, Stress)
bestimmen zu können, müssen die Pflanzen in abgeschlossenen Behältern eingesetzt werden.
Hierfür stehen drei Pflanzenkammern (schematische Darstellung einer Kammer siehe
Abbildung 19) mit unterschiedlichen Volumina zur Verfügung (164 L, 1150 L und 1450 L),
in denen die Emissionen aus Pflanzen unterschiedlicher Größe oder aus einem Set aus bis zu
sieben Pflanzen gemessen werden können. Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten
Versuche mit Ozon wurde die kleinste Kammer benutzt. Die Versuche mit Botrytis Cinerea
erfolgten in der Kammer mit 1055L Volumen.
Abbildung 19: Schematische Darstellung der Pflanzenkammer und der an der Kammer vorhandenen Analytik,
Alle Kammern bestehen aus inertem, lichtdurchlässigem Glas (Duran, Borosilikat-Glas,
Schott Engineering). Da nur der oberirdische Teil der Pflanzen untersucht werden soll,
werden die Pflanzen von unten vorsichtig in die Kammer eingeführt (Durchlass ca. 30 cm und
der Stängel der Pflanzen zwischen einer zweigeteilten Teflonplatte (Durchmesser 2 cm)
fixiert. Die Abdichtung der verbliebenen Öffnungen erfolgt mittels Schaumstoff und Optosil®
33
(Heraeus Kultzer). Abweichend von Abbildung 19 wurden die Versuche meistens nicht in
Nährlösung sondern mit in Boden gewachsenen Pflanzen durchgeführt.
Der Tagesgang der PAR wird in der Kammer durch eine zeitprogrammierte Steuerung der
Halogenmetalldampf-Lampen (Osram HQI-BT 400 W/D) simuliert (in der benutzten
Kammer am Tag 800 µmol m-2 s-1). Die Temperatur in der Kammer war in den Versuchen
25°C. Alle Leitungen für Zu- und Abluft bestehen aus Glas oder Poly-Tetra-Fluor-Ethylen
(PTFE, Teflon), um unerwünschte Memory- und Wandeffekte für die VOC-Messung zu
minimieren. Die am Kammereingang zugeführte Luft wird gereinigt um Wasser, VOCs und
Ozon zu entfernen. Hierzu wird komprimierte Außenluft zuerst mit einem Druck von 8 bar
über Adsorptionsmaterial (KEA 70, Ecosorb, Zander) geleitet und getrocknet (Abbildung 19,
1). Die Entfernung von VOCs erfolgt durch einen Katalysator (Al2O3 0,5% Pd, Hüls) bei
450°C. Hierbei werden vorhandene Kohlenwasserstoffe zu CO2 und H2O oxidiert. Die so
gereinigte Luft wird mit einem Massenflussregler (MFC, Brooks Instruments) geregelten
konstanten Volumenstrom direkt durch die Kammer geleitet (Abbildung 19, 2). Am Eingang
der Kammer können definierte Mengen verschiedener Spurengase zudosiert werden, z.B.
Ozon (erzeugt mittels einer Quecksilberdampflampe, λ = 189nm), VOCs, Wasser oder CO2
(Abbildung 19, 3). Der Taupunkt am Eingang der Kammer beträgt ohne zusätzliche
Befeuchtung ca. -18°C, und die Konzentrationen der VOCs, des Ozons und der Stickoxide
liegen unterhalb der Nachweisgrenzen der analytischen Geräte. Für die gemessenen VOCs
liegt diese bei ca. 1 ppt, für Ozon bei ca. 1 ppb und für die Stickoxide bei 0,05 (NO) und 0,1
(NO2) ppb. Tabelle 3 fasst die im Rahmen dieser Arbeit genutzten an der Kammer
quantifizierbaren Messgrößen zusammen. Die Messungen für z. B. die Temperatur oder Ozon
werden hier auf 10 min gemittelt.
Tabelle 3: An der Pflanzenkammer quantifizierte Messgrößen
Größe Messprinzip Zeitauflösung Messgerät Gasphasenanalytik
[O3] UV-Absorption 10 min TE 49 (Thermo Env. Inst,)
[VOCTerpene] GC/MS 75 min (Agilent/Gerstel)
[VOCSOVOC] GC/MS 55 min (Agilent/Gerstel) Temperatur und PAR
TKammer Thermoelement 10 min NiCrNi Thermoelement (Philips)
34
4.1 Das GC/MS-System Die Emissionsflussdichten der von Pflanzen abgegebenen VOCs sind im Allgemeinen sehr
gering. Die Mischungsverhältnisse in Luft liegen im unteren ppb Bereich. Damit werden sehr
hohe Anforderungen an das analytische System gestellt. Zum Einsatz kommt ein
Gaschromatograph (HP 5890 Serie II, Agilent), zusammen mit einem Massenselektiven
Detektor (HP 5972, Agilent), um die von Pflanzen emittierten Verbindungen aufzutrennen
und identifizieren zu können.
Vor der Analyse findet eine Anreicherung statt. Dies geschieht mit einer
Thermodesorptionseinheit (TDS-G 2, Gerstel). Als Zwischenfokussierung dient ein
temperaturprogrammierbarer Split-Splitlos-Injektor (KAS 3, Gerstel). Eine schematische
Darstellung des Systems findet sich in Abbildung 20. Wichtige Parameter des GC/MS-
Systems, wie sie zur Analyse der Proben verwendet werden, sind in Tabelle 4
zusammengefasst. Die Analyse der zu messenden Verbindungen gliedert sich also in drei
Schritte:
- Anreicherung
- Desorption und Kryofokussierung
- und Analyse
Mit Hilfe eines 6-Wegeventils (Rheodyne, Valco Europe) und eines Massenflussreglers
(MFC 1, Gerstel) können automatisch Luftproben im TDS adsorbiert und anschließend
wieder desorbiert werden.
4.1.1. Anreicherung Bei der Anreicherung wird die Luftprobe (4L) mit Hilfe einer Vakuumpumpe (MZ 2,
Vakubrand) über ein auf 250 °C geheiztes 6-Wegeventil im TDS-G auf ein
Adsorptionsröhrchen (T = 30°C) gezogen. (vgl. Abbildung 20, gezeigter Schaltzustand). Als
Adsorbentien dienen das poröse Polymer Tenax TA (60/80 mesh, Supelco) sowie Carbotrap
(20/40 mesh, Supelco), ein graphitisiertes Kohlenstoff-Adsorbens. Bei der Adsorption gelangt
die Probe zuerst auf das Tenax TA. VOCs, die dort nicht vollständig adsorbiert werden,
brechen durch und werden im Carbotrap zurückgehalten. Beide Adsorbentien sind durch
silanisierte Glaswolle (Alltech) voneinander getrennt. Auf der Seite des Tenax TA wurde in
das Glasröhrchen anstatt silanisierter Glaswolle eine Glasfritte (Porosität G1)
35
eingeschmolzen, da an den Bruchstellen der Glaswolle hochreaktive VOCs zerstört werden
können.
Tabelle 4: Parameter des verwendeten GC/MS-Systems für die Bestimmung der Konzentration der analysierten VOCs
Anreicherung Adsorptionsfluss 80 mL min-1 Adsorptionsvolumen 4 L TDS Temperatur 30 °C
Desorption und Kyrofokussierung Desorptionsfluss 25 mL min-1 TDS Temperatur 30 °C - (60 °C min -1) - 250 °C (5 min) TDS Ventil und Leitungen 250 °C KAS Temperatur - 100 °C Transferheizung zum KAS 200 °C
Analyse KAS Temperatur - 100 °C - (12 °C s -1) - 250 °C (3 min) Splitschaltung 1,5 min splitlos, Splitverhältnis 50:1 Trennsäule BPX-5 (50 m x 0,22 mm x 1µm SGE) 40 °C (1 min) - (5 °C min -1) - 110 °C (3 min) GC-Ofentemperatur 110 °C (1 min) - (5 °C min -1) - 200 °C (7 min) 200 °C (1 min) - (5 °C min -1) - 220 °C MSD GC-Interface 250 °C MSD Ionenquelle ca. 160 °C MSD Scanbereich m/z 35 – 260 amu
Vor der Verwendung muss das Polymer Tenax TA durch Soxhlet-Extraktion mit Toluol
gereinigt werden [Hoffmann, 1992)]. Das Adsorptionsröhrchen wird während der
Anreicherung auf 30°C geheizt, um ein Auskondensieren von Wasser zu vermeiden. Für eine
Messung werden die adsorbierbaren Substanzen aus einer 4 L Probe bei einem
Adsorptionsfluss von 80 mL min-1 angereichert. Daraus ergibt sich eine Anreicherungszeit
von 50 min. Die aus der Messung gewonnenen Daten spiegeln den Durchschnittswert dieser
50 min wieder. Bei den hier durchgeführten Experimenten wurde allerdings nur für 10 min
die Luft aus der Kammer angereichert und die restlichen 40 min aufgereinigte Luft.
4.1.2. Analyse Vor dem Ausheizen des TDS wird die darin verbliebene Luft mit Helium ausgetrieben, um
Oxidation der adsorbierten VOCs bei hohen Temperaturen zu vermeiden. Die ausgetriebenen
VOCs werden im KAS bei -100 °C kryogen zwischenfokusiert. Zur Oberflächenvergrößerung
und zur Verringerung des Totvolumens ist das Glasverdampferrohr im KAS (Abbildung 20,
Nr. 3) mit Tenax TA gefüllt. Die fokussierten Verbindungen werden anschließend direkt auf
die Trennsäule (Abbildung 20, Nr. 11) injiziert. Zum Trennen der komplexen Mischung
36
emittierter VOCs, die aus unpolaren Terpenen, sowie Alkoholen, Aldehyden und Ketonen
besteht, hat sich eine weitgehend unpolare Säule bewährt (BPX-5 Trennsäule, 50m x 0,22mm
x 1 µm, SGE) [Heiden et al., 1999].
Die Zeitauflösung dieser Methode liegt bei ca. 75 min. Davon entfallen ca. 8 min auf die
Thermodesorption und 66 min auf den chromatographischen Lauf. Während der
Chromatographie wird 50 min lang die nächste Probe im TDS angereichert. Für die
detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte soll hier auf die Arbeiten von Folkers (2002)
und Heiden (1995) verwiesen werden.
Abbildung 20: Strömungsschema für die Anreicherung der Probe im GC/MS-System [Heiden, 1995]
37
4.2 Aufbau der Kalibrationsquellen Zur Kalibration des verwendeten GC/MS-Systems und damit zur quantitativen Bestimmung
der Konzentrationen emittierter Substanzen wurden Permeationsquellen benutzt [Folkers,
2002; Heiden, 1995; Schuh et al., 1996]. Die Quellen wurden ausschließlich aus Glas und
Teflonbauteilen gefertigt, da z.B. einige Terpene an Metalloberflächen zersetzt werden. Die
Permenationsquellen bestehen aus doppelwandigem Glas und werden durch einen
Thermostaten auf 30°C temperiert.
Abbildung 21: Schematische Darstellung der Kalibrationsquellen
Die zur Kalibration eingesetzten, reinen Verbindungen (Aldrich, Merck, Fluka, Reinheit min.
95%) werden in braune Glasgewindeflaschen (Volumen = 4 mL) eingefüllt und durch einen
Deckel mit Teflonscheiben verschlossen. Je nach Dampfdruck der Verbindungen werden
Löcher in diese Teflonscheiben gebohrt, mit deren Größe und Anzahl die Abdampfrate der
eingefüllten Stoffe beeinflusst wird. Nach Einsetzen der Gewindeflaschen in die
Permeationsquellen werden diese durch einen Deckel luftdicht verschlossen und mit
Stickstoff (5.0, Nitrogenerator PtL) durchströmt. Am Deckel der Quellen sind T-Stücke aus
Glas angebracht. Ein Teilstrom aus diesem T-Stück wird verworfen (ca. 95% des
38
Gesamtstromes durch die Quelle), der andere Teil (ca. 50 ml min-1) wird in einen Mischer
geleitet und weiter verdünnt um VOC Konzentrationen im unteren ppb Bereich am Ausgang
des Mischers zu erreichen. Der Verdünnungsstrom im Mischer beträgt ca.11 L min-1.
Durch Messung aller Flüsse und Wägungen der Gefäße in regelmäßigen Zeitabständen kann
die Abdampfrate der VOCs und damit die Konzentration der Verbindungen im Luftstrom am
Ausgang des Mischers berechnet werden.
4.3 Kalibration des GC/MS-Systems
Zur Bestimmung der Emissionsraten bzw. Flussdichten müssen die Konzentrationen der
Spurengase am Ein- und Ausgang der Pflanzenkammer bestimmt werden. Das
Mischungsverhältnis der zu messenden Verbindungen berechnet sich bei der Kalibrierung des
GC/MS-Systems für Standardbedingungen aus den Wägedifferenzen und Flussmessungen für
eine Substanz x entsprechend Gleichung 1:
TR
pMrFFF
FF
F
t
m
x
xGesZM
VM
Mx
Kal
***)(
*
][++
+∆∆
= Gleichung 1
[x] Kal = Mischungsverhältnis der Substanz x im Kalibrationsstandard [dimensionslos]
∆ mx = Massendifferenz der Substanz x zwischen zwei Wägungen [g]
∆ t = Zeitdifferenz zwischen den Wägungen [s]
FM = Fluss aus der Quelle in den Mischer [L s -1]
FV = Verworfener Fluss aus der Quelle [L s -1]
FZ = Verdünnungsfluss durch den Mischer [L s -1]
FGes = Gesamtfluss aus den allen anderen Quellen in den Mischer [L s -1]
Mrx = Molmasse der Substanz x [g mol-1]
R = Gaskonstante [J mol-1 K-1]
T = Standardtemperatur (298 K)
p = Standarddruck (1013 hPa)
39
Das Mischungsverhältnis der Substanz X in der jeweiligen Probe berechnet sich entsprechend
der Gleichung:
Kalobe
Kal
Kalx
obeXobe x
V
V
A
AX ][**][
Pr
PrPr = Gleichung 2
obeX Pr][ = Mischungsverhältnis der Substanz x in der analysierten Probe obe
XAPr = Peakfläche der Substanz x bei der Analyse der Probe KalXA = Peakfläche der Substanz x bei der Kalibration
Kalx][ = Mischungsverhältnis der Substanz x bei der Kalibration KalV = Angereichertes Volumen bei der Kalibration
obeV Pr = Angereichertes Volumen bei der Analyse der Probe Die Bestimmung der Mischungsverhältnisse von Substanzen für die keine Referenzproben zur
Verfügung stehen werden über den Pseudotic [Heiden, 1995; Folkers, 2002] und mittels einer
Substanz mit einer ähnlichen Ionisationseffizienz ermittelt (z. B. für Monoterpene überprüft,
Heiden et al., 1998].
4.4 Reproduzierbarkeit und Nachweisgrenze Die Reproduzierbarkeit von Messungen mit den genutzten GC/MS-Systemen wurde bereits
durch Heiden (1998) und Folkers (2002) bestimmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden hierzu
keine gesonderten Experimente durchgeführt. Zur Abschätzung der Reproduzierbarkeit wurde
hier die Reproduzierbarkeit der Messungen der Kalibrationen genutzt. Wie in vorhergehenden
Messungen auch [Folkers, 2002; Heiden, 1995 und 1998] ergab sich eine Reproduzierbarkeit
von besser 5% im unteren ppb Bereich. Auch die Nachweisgrenze für einige Verbindungen
wurde bereits in den Arbeiten von Heiden (1995), Heiden (1999) und Folkers (2002)
bestimmt. Als Nachweisgrenze wird die 3-fache Standardabweichung des Detektorrauschens
auf der für die jeweilige Substanz charakteristischen Ionenspur benutzt. Es ergab sich für die
meisten Verbindungen eine Nachweisgrenze im Bereich von wenigen ppt. Diese
Nachweisgrenzen sind deutlich geringer als die Mischungsverhältnisse der gemessenen VOCs
aus dem Octadecanoidweg nach der Exposition der Tomatenpflanzen mit Ozon.
40
4.5 Fehlerrechnung
4.5.1 Fehler bei der Kalibration Das Mischungsverhältnis der Substanz x im Kalibrationsstandard [x]Kal wird entsprechend
Gleichung 1 berechnet. Da es sich bei den Fehlern der zur Berechnung des
Mischungsverhältnis benutzten Größen um statistische Fehler handelt, berechnet sich der
Gesamtfehler nach der Gauß’schen Fehlerfortpflanzung (Gleichung 3) aus den einzelnen
Fehlern, die entweder bestimmt oder abgeschätzt werden können.
∑=
∂∂=
k
jjx
jf x
f
1
2
* σσ Gleichung 3
In die Fehlerrechnung gehen die Größen ∆ mx, ∆ t, FM, FV, FZ, FGes, Mrx, p, T und R ein. Die
Molmassen (Mrx), Druck (p) und Temperatur (T) sowie R besitzen vernachlässigbar kleine
Fehler. In Tabelle 5 sind die Einzelfehler aufgeführt, die bei der Berechnung berücksichtigt
werden. Für die Messung der Gasflüsse ist die Standardabweichung kleiner 3%, daher wird
für die Berechnung wird ein Fehler von drei Prozent angenommen. Der Gesamtfehler des
Mischungsverhältnis der Substanz x im Kalibrationsstandard ergibt sich zu 7,2%.
Tabelle 5: Einzelfehler der Größen, die bei der Berechnung des Fehlers des Mischungsverhältnisse des Kalibrationsstandards berücksichtigt wurden.
Größe Typischer Wert Typischer Fehler Typischer Fehler/%
∆ mx+ 65 mg 50 µg 0,08
∆ t+ 6*105 s 300 s 0,05
FV++ 400 mL min-1 12 mL min-1 3,0
FM++ 50 mL min-1 1,5 mL min-1 3,0
VM
M
FF
F
+
5,0
FZ++ 11 L min-1 0,33 L min-1 3,0
+ Fehler kann vernachlässigt werden ++ Fehler entsprechend der Spezifikation der Massenflussregler
41
4.5.2 Fehler bei der Bestimmung der Mischungsverhältnisse der VOCs in der Pflanzenkammer Die Mischungsverhältnisse der gemessenen Verbindungen berechnen sich entsprechend
Gleichung 2. Der Fehler der Mischungsverhältnisse berechnet sich entsprechend der
Gauß’schen Fehlerfortpflanzung (Gleichung 3) aus den Fehlern der einzelnen Größen. Für die
Fehler der einzelnen Größen sind typische Werte in Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6: Fehler der einzelnen Größen, die bei der Berechnung des Mischungsverhältnisses der Substanz x in der Probe angenommen wurden.
Größe Fehler / % obe
XAPr + 5,0
Kalx][ ++ 7,2
KalV 3,0
obeV Pr 3,0
+ Die Fehler des Systems werden aus der Reproduzierbarkeit abgeschätzt. Die Reproduzierbarkeit bei hohen Konzentrationen ist besser als 5%, daher wurde als maximaler Fehler des Systems ein Wert von 5% angenommen.
++ Der Fehler wurde über Gleichung 3 berechnet
Das Adsorptionsvolumen VProbe und VKal wird durch den Probennahmefluss und das
Zeitintervall der Probennahme bestimmt. Der Probennahmefluss wird mit einem
Massenflussregler gesteuert und besitzt einen Fehler von 3%. Der Fehler bei der Bestimmung
des Probenahmeflusses ist deutlich größer als der Fehler der Zeitmessung. Der Fehler der
Zeitmessung kann daher vernachlässigt werden. Da während der Messungen zeitnah kalibriert
wurde und daher VProbe und VKal gleich waren, ist der Fehler des Probennahmevolumens
ebenfalls vernachlässigbar klein. Nach Gleichung 3 ergibt sich ein Gesamtfehler des
Mischungsverhältnisses von 13,4%.
42
4.6 Bestimmung der Blattfläche Die Blattfläche wurde bei den Versuchen vor oder nach dem Experiment bestimmt. Hierzu
wurden die Blattumrisse auf Transparentpapier mit bekanntem Papiergewicht übertragen,
ausgeschnitten und gewogen. Durch Umrechnung mit dem Flächen-Gewichtsverhältnis des
Transparentpapiers erhält man die Blattfläche.
Viele Pflanzen zeigen im Wachstumsstadium der benutzten Pflanzen ein lineares
Blattwachstum [Bünning und Konder, 1954]. Bei längeren Experimenten (Infektion mit
Botrytis cinerea) wurde daher die aktuelle Blattfläche zum Zeitpunkt der Messung durch
lineare Interpolation abgeschätzt. Experimente mit Sonnenblumen (Helianthus annuus var.
Gigantheus) haben gezeigt, dass diese lineare Interpolation bei einer Versuchsdauer von zwei
Wochen einen Fehler von maximal 7% verursachen kann [Rockel, 1997].
Für die in den länger andauernden Versuchen genutzten Tomatenpflanzen wird dieser Fehler
auf maximal 5% geschätzt, da die Pflanzen maximal fünf Tage in der Kammer verblieben.
Der Fehler der Blattfläche geht direkt in den Gesamtfehler der Flussdichte ein, da sowohl für
die Aufnahme- als auch für die Emissionsraten die Blattfläche als Normierungsgröße
herangezogen wird.
Eine weitere Möglichkeit der Flächenbestimmung ist die Bestimmung des Frisch- oder
Trockengewichtes. Sowohl diese beiden Gewichte korrelieren recht gut miteinander
(Abbildung 22), als auch die Blattflächen mit den jeweiligen Gewichten (Abbildung 23). Dies
gilt allerdings nur für Blätter ohne Nekrosen oder Wassermangel. Die Bestimmung des
Frisch- oder Trockengewichtes ist auch nur zum Ende eines Versuches möglich.
Bei den im Rahmen dieser Arbeiten durchgeführten Vergleichen zwischen Emissionsstärken
und Enzymaktivitäten spielen Fehler in der Blattflächenbestimmung keine Rolle. Die
gemessenen Größen wurden immer für die Gesamtblattfläche der Pflanze betrachtet und bei
einem Vergleich kürzt sich die Blattfläche bzw. betrachtete Biomasse heraus. Bei dem
Vergleich der Blattflächen zwischen verschiedenen Pflanzen in den Versuchen wird der
Fehler auf ca. 5% abgeschätzt.
43
Abbildung 22: Auftragung des Trockengewicht gegen das Frischgewicht von Tomatenblättern, 15 Pflanzen, Alter 2 -14 Wochen, Fehlerbalken 5%, (durch Null gezwungen, Korrelationkoeffizient R2 = 0,96)
Abbildung 23: Auftragung der Blättfläche gegen das Frischgewicht von Tomatenblättern, 15 Pflanzen, Alter 2 -14 Wochen, Fehlerbalken 5%, (durch Null gezwungen, Korrelationkoeffizient R2 = 0,97)
44
4.7 Durchführung der Experimente
4.7.1 Tomate als Modellpflanze Die Wahl der Tomate cv. Moneymaker als Modellpflanze hatte mehrere Gründe. Es bestanden
bereits Vorkenntnisse bezüglich der Induzierbarkeit der Lipoxygenaseaktivität bei dieser
Pflanze seitens der RWTH Aachen (Labor für Pflanzenphysiologie) und die Grundaktivität
der Lipoxygenase ist sehr gering, wenn überhaupt messbar. Tomatenpflanzen haben zudem
nur eine Lipoxygenase in ihren Blättern [Porta und Rocha-Sosa, 2002]. Auch zeigte eine
Reihe von Vorversuchen eine einfache Induzierbarkeit der VOC Emissionen aus dem
Octadecanoidweg mittels Ozon. Das schnelle Wachstum und die einfache Handhabung bei
der Pflanzenanzucht machte die Tomate als Versuchspflanze gut einsetzbar.
Die Anzucht der Versuchspflanzen, Tomate (Lycopersicon esculentum Mill. cv Moneymaker),
erfolgte im Anzuchtkeller des ICG-3. Wöchentlich wurden ca. 12 Samen in einer Mixtur aus
Erde, Torf und Kompost (Pikiererde, Plantaflor, Vechta, Deutschland) ausgesät. Nach der
Bildung der ersten Sekundärblätter wurden die Pflanzen einzeln in Standardsubstrat
(Einheitserde, Type ED 73) pikiert. Während der gesamten Wachstumsphase wurden die
Bedingungen konstant gehalten, 12h/12h Licht/Dunkelheit, Luftfeuchte ca. 60%, 20°C und
einer Lichtintensität von ca. 300 – 400 µmol m-2 s-1. In regelmäßigen Abständen wurden die
Pflanzen mit Nährstofflösung nach Epstein gedüngt, um eine ausreichende
Nährstoffversorgung zu gewährleisten. Die eingesetzten Versuchspflanzen waren zwischen
acht und zwölf Wochen alt und hatten Gesamtblattflächen zwischen ca. 450 und 1200 cm2.
4.7.2 Ozonexpositionen Für die Ozonexpositionen wurde jeweils eine Pflanze in die kleinste Pflanzenkammer
(Volumen = 164 L) eingesetzt. Der Luftfluss durch die Kammer wurde je nach
Transpirationsrate der Pflanze auf Werte zwischen 12 und 30 L min-1 gesetzt. Dadurch wurde
erreicht, dass die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer von Versuch zu Versuch recht
konstant war. Die Temperatur in der Kammer betrug in allen Versuchen 25°C, der Taupunkt
lag tagsüber bei etwa 15°C. Die Emissionen der Pflanzen wurden zuerst 1 – 3 Tage lang
gemessen ohne bewusst Stress auf die Pflanzen auszuüben (Kontrolle). Nach dieser Zeit
wurden die Pflanzen durch die Zugabe von Ozon zur Luft am Kammereingang gestresst, um
die pflanzliche Abwehr zu induzieren. Bei den hier verwendeten kurzen Austauschzeiten für
die Luft in der Kammer (≈ 5 – 14 min.) stellte sich recht schnell die gewünschte
45
Ozonkonzentration ein. Die Ozonmischungsverhältnisse wurden in Vorversuchen zwischen
ca. 100 ppb und 2000 ppb variiert. Bei Ozonmischungsverhältnissen unterhalb von 200 ppb
und bei Expositionsdauern unterhalb von 1,5 h zeigten die Tomaten keine Reaktion im Bezug
auf ihr Emissionsmuster, sie schlossen lediglich die Stomata. Ozonmischungsverhältnisse
über 1000 ppb bei Expositionsdauern von 30 bis 60 min. führten zu einer sehr schnellen und
starken Reaktion der Pflanzen, wobei allerdings das Auftreten von Autoxidationsprodukten
nicht ausgeschlossen werden konnte.
Experimentell gut zu handhaben waren Ozonmischungsverhältnise zwischen 600 und 700 ppb
bei einer Expositionsdauer von 30 min. Die Pflanzen reagierten dann in einen Zeitfenster
zwischen 90 und 365 min nach Beginn der Ozonexposition durch die Abgabe von GLAs.
Damit war es möglich, die GC/MS-Messungen erst dann zu starten, wenn die
Ozonmischungsverhältnisse in der Kammer unter 20 ppb abgesunken waren und somit die
Oxidation der emittierten VOCs in der Kammerluft vernachlässigbar war.
4.7.3 Versuche mit Botrytis cinerea Um die Autoxidation als Grund für die Änderung der Emissionen der Tomaten nach Ozon-
exposition ausschließen zu können, wurden in Kooperation mit der Universität Wageningen
Versuche mit dem Pilz Botrytis cinerea durchgeführt. Bei diesen beiden Versuchen wurden
einmal drei, das andere Mal vier Pflanzen in die Pflanzenkammer mit einem Volumen von
1150 L eingesetzt. Zuerst erfolgte die Adaption der Pflanzen an die Verhältnisse in der
Kammer. Nach zwei Tagen wurden die Pflanzen dann mit einer Botrytis-Sporen-Suspension
besprüht und für 16h bei 100%iger Luftfeuchtigkeit und Dunkelheit belassen, um die
Infiltration des Pilzes zu begünstigen. Die Änderung der VOC Emissionen wurde danach für
weitere drei Tage verfolgt. Die Präpäration der Sporensuspension und weitere Details sind bei
Jansen et al. (Plant Biology im Druck) detailliert beschrieben. Zur Kontrolle wurden in dieser
Kammer Tomatenpflanzen mit einer Lösung ohne Sporen gesprüht und unter gleichen
Bedingungen für 3 -5 Tage gemessen.
46
4.8 Messung der freien Fettsäuren im Pflanzenmaterial Zur Extraktion der freien Fettsäuren wurden ca. 1 g gefrorenes, pulverisiertes Blattmaterial in
einem 50 mL Falcon eingewogen. Nach der Zugabe von 20 mL Extraktionsmedium (n-
Hexan/Isopropanol, 3:2, 0,0025% w/v 2,6-Di-tert-butyl-4-methyl-phenol) wurde die
Suspension zum Aufschluss der Zellen 30 s im Ultraschallbad behandelt. Nach 15 minütiger
Zentrifugation bei 6000g und 4 °C wurde die klare, obere Phase abpipettiert und in einem
neuen Falcon auf Eis aufbewahrt. Das Pellet wurde dreimal mit je 3 mL Extraktionsmedium
extrahiert und der jeweilige Überstand mit dem Rest vereint. Im nächsten Schritt wurde das
Falcon bis auf ca. 48 mL mit 6,7%iger Kaliumsulfat-Lösung aufgefüllt und kräftig
geschüttelt. Nach der Trennung der wässrigen und organischen Phasen auf Eis wurde die
obere Phase (n-Hexan) abpipettiert und unter einem Argonstrom eingeengt. Der Rest wurde in
1 mL Chloroform aufgenommen und unter Argon-Schutzgas bei -80 °C bis zur Messung
gelagert. In den meisten Fällen erfolgte die Messung jedoch direkt nach der Aufarbeitung.
Die zur Messung verwendete HPLC Anlage ist ein VWR Merck-Hitachi System:
- D-6000 Interface Modul
- L-4500 DAD-Detektor
- L-6200 Pumpe
- L-5025 Säulenofen (30°C)
- AS-2000A Autosampler
- D 7000 HPLC-System-Manager
Zur Trennung der Substanzen wurde eine Nucleosil C-18-Säule (250mm * 4,6 mm, 5 µm
Korngröße) verwendet, Probevolumen 100 µL. Eluent A war angesäuertes Methanol (0,1%
Essigsäure) und Eluent B Methanol/Wasser/Essigsäure (75:25:0,1). Der verwendete Gradient
ist in Tabelle 7 zu sehen. Mit der vorgegebenen Methode können die relevanten freien
Fettsäuren Linolsäure (RT = 31 min) und Linolensäure (RT = 29 min) auf der Wellenlänge
210 nm gut detektiert werden.
Tabelle 7: Gradient zur Bestimmung der freien Fettsäuren mittels HPLC Zeit [min] Fluss [mL min-1] % Eluent A % Eluent B
0 0,180 80 20 10 0,180 80 20 15 0,180 0 100 17 0,360 0 100 25 0,360 0 100 27 0,360 80 20 30 0,360 80 20 31 0,180 80 20 45 0,180 80 20
47
Abbildung 24: Kalibration der HPLC-Anlage mit Linol ensäure, x-Achse = auf die Säule aufgegebene Menge an Linolensäure in µg, y-Achse = gemessene Peakfläche bei 210 nm, rot = zweite unabhängige Einwaage, Fehlerbalken = 5%.
Abbildung 25: Kalibration der HPLC-Anlage mit Linol säure, x-Achse = auf die Säule aufgegebene Menge an Linolsäure in µg, y-Achse = gemessene Peakfläche bei 210 nm, rot = zweite unabhängige Einwaage, Fehlerbalken = 5%.
48
Ebenfalls können mit dieser Methode die Oxydationsprodukte (Hydroperoxy-PUFAs und
Hydroxy-PUFAs) auf der Wellenlänge 234 nm erfasst werden. Bei den Messungen frisch
aufgearbeiteter Proben waren diese aber nicht messbar obwohl sie einen ähnlichen molaren
Absorptionskoeffiezienten (2,5*104 M-1cm-1; Grosch et al., 1977) besitzen wie die
Linolensäure (2,5*104 M-1cm-1) und Linolsäure (2,9*104 M-1cm-1).
Die Messung der Proben erfolgte zeitnah zu ihrer Aufarbeitung um die Bildung von
Hydroperoxiden durch Autoxidation der Fettsäuren zu vermeiden. Denn bereits nach 12 h bei
Raumtemperatur im Autosampler waren 50% der beiden erfassten Fettsäuren durch
Autoxidation abgebaut (Messwerte nicht in der Arbeit) und die Hydroperoxy-PUFAs und
Hydroxy-PUFAs sehr gut messbar. Daher war die Messung einer größeren Probenanzahl
mittels Autosampler nicht möglich.
49
4.9 Messung der Enzymaktivitäten Die Extraktion der Enzyme aus dem Pflanzenmaterial wurde immer bei möglichst tiefen
Temperaturen (knapp über 0 °C) und schnell durchgeführt, um termische Abbauprozesse zu
minimieren. In einen vorgekühlten Mörser wurden dazu 0,25 g Seesand und ca. 1 g
pulverisiertes Pflanzenmaterial (bei -80°C gelagert, homogenisiert) gegeben und mit 2 mL
Extraktionspuffer (50 mM Kaliumdihydrogenphosphat, pH 7,0, 1% Polyvinylpolypyrrolidon,
0,1% Triton X-100, 0,04% Natriummetabisulfit) ca. 1 Minute lang gemörsert. Das
Homogenat wurde in 2,5 mL Eppendorf Cabs gefüllt und 5 Minuten bei 16000g und bei 4 °C
zentrifugiert. Der Überstand wurde in Eppendorf Cabs pipettiert und bis zur Messung auf Eis
gelagert. Die Messung der Enzymaktivitäten erfolgte photospektrometrisch bei 25 °C mit
einem 2-Kanal-UV/VIS-Spektrometer (Perkin Elmer, Lambda 15). Zuerst wurden alle
Substrate bezüglich ihrer Stabilität überprüft. Dazu wurde das jeweilige Substrat über zwei
Stunden gegen die Pufferlösung gemessen. Alle Substrate verhielten sich in diesem
Zeitfenster stabil.
Bei der Aktivitätsbestimmung befand sich in der Referenzküvette der verwendete Puffer
zusammen mit dem Substrat in der gleichen Konzentration wie in der Messküvette. Die
Messküvette enthielt diese Lösung zusammen mit dem Proteinextrakt. Die Aktivität der
Enzyme wurde über die Zu- bzw. Abnahme der jeweiligen Reaktionsprodukte bzw. -edukte
bestimmt. Alle Enzymaktivitätsbestimmungen wurden mindestens als Doppelbestimmung
durchgeführt. Wichen zwei Messungen des gleichen Probenmaterials um mehr als 5%
voneinander ab, wurde eine dritte Messung/Aufarbeitung durchgeführt und der Mittelwert aus
den beiden zueinander passenden Werten gebildet. Die Messungen des Proteingehaltes
erfolgten ebenfalls photospektrometrisch nach Bradfort mit BSA als Kalibrierungsreagenz
[Bradford, 1976]. Auch diese wurden als Doppelbestimmung gemessen.
Bespielrechnung zur Enzymaktivitätsbestimmung:
molPr
Pr
Pr
*** εdG
V
G
kat
otein
obe
t
Abs
otein ∆∆=
kat = umgesetztes Substrat [mol s-1] ∆Abs = Absorptionsänderung ∆t = Zeit [s] εmol = molarer Extinktionskoeffizient [mol L-1 cm-1] VProbe = Probenvolumen des Homogenats [L] GProtein = Gewicht des extrahierten Gesamtproteins [g]
d = Schichtdicke der Küvette [cm]
50
4.9.1 Messung der Lipaseaktivität Lipasen katalysieren den Abbau von Estern, daher wurde für den Lipaseassay para-
Nitrophenylpalmiat (pNPP) als Substrat eingesetzt. 30 mg pNPP wurden in 10 mL
Isopropanol gelöst und mit Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) auf 100 mL aufgefüllt. Der Puffer
enthielt zusätzlich 2 mM Natriumdeoxycholat und 2 mM Arabic gum. Das Volumen in beiden
Quartz-Küvetten (1 cm Schichtdicke) war 1,2 mL (50 mM Kaliumdihydrogenphosphatpuffer,
pH 7,0), beinhaltete 10 µL der Substratlösung, die Messküvette zusätzlich 100 µL des
Proteinextraktes. Nach einer guten Homogenisierung der Lösungen in den jeweiligen
Küvetten konnte die Zunahme der Absorption bei λ = 410 nm (Abbildung 26) infolge der
Freisetzung von para-Nitrophenol (pNP) gemessen werden.
Nach der Bestimmung des Proteingehaltes konnte über den molaren Extinktionskoeffizienten
von pNP (2,71*103 M-1cm-1, Gilham und Lehner, 2005) die Enzymaktivität berechnet werden.
y = 5,36E-04x + 3,63E-04R² = 0,99
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0 5 10 15 20 25 30
∆∆ ∆∆abs
λλ λλ=
410n
m
Zeit [min] Abbildung 26: Beispiel für den zeitlichen Verlauf der Änderung der Absorption durch die Freisetzung von para-Nitrophenol bei der Bestimmung der Lipaseaktivität
51
4.9.2 Messung der Lipoxygenaseaktivität Lipoxygenasen katalysieren die Hydroperoxidation von Fettsäuren mit einer cis, cis-1,4-
Pentadien-Struktur. Als Substrat für die Enzymaktivitätsmessungen wurde daher Linolensäure
(18:3) eingesetzt. 70 mg Linolensäure wurden zusammen mit 70 mg Tween-20 in 4 mL
sauerstofffreiem Wasser (erhalten durch Argonentgasung) und Schutzgas (Argon)
homogenisiert. Um die Trübung der Lösung zu entfernen wurden 0,55 mL einer 0,5 molaren
Natriumhydroxid-Lösung zugegeben und die Lösung mit sauerstofffreiem Wasser auf
25 mL aufgefüllt. Danach wurden Aliquote der Substratlösung in 2 mL HPLC Schraub-
fläschchen unter Argonschutzatmosphäre abgefüllt und bis zur Messung bei -80°C gelagert.
Das Volumen in beiden Quartz-Küvetten (1 cm Schichtdicke) war 1,2 mL (50 mM
Kaliumdihydrogenphosphatpuffer, pH 7,0), beinhaltete 10 µL der Substratlösung, die zweite
Küvette zusätzlich 100 µL des Enzymextraktes. Nach einer guten Durchmischung der
Lösungen in den jeweiligen Küvetten konnte die Zunahme der Absorption bei λ = 234 nm
(Abbildung 27) infolge der Bildung der Hydroperoxide gemessen werden. Nach der
Bestimmung des Proteingehaltes konnte über den molaren Extinktionskoeffizienten der
Hydroperoxide der Linolensäure (2,5*104 M-1cm-1, Koch et al, 1992) die Enzymaktivität
berechnet werden.
Abbildung 27: Beispiel für den zeitlichen Verlauf der Änderung der Absorption durch die Bildung von Hydroperoxiden der Linolensäure bei der Bestimmung der Lipoxygenaseaktivität
52
4.9.3 Messung der Hydroperoxidlyaseaktivität Hydroperoxidlyasen setzten Hydroperoxide ungesättigter Fettsäuren zu Aldehyden um. Als
Reaktionspartner dient die reduzierte Form des Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH),
das der 1,2 mL Phosphatpufferlösung (50 mM Kaliumdihydrogenphosphatpuffer, pH 7,0) 0,1
mM in den Quartz-Küvetten (1 cm Schichtdicke) zugesetzt wurde. Gemessen wurde die
erfolgende Abnahme der Absorption bei λ = 340 nm (Abbildung 28) durch den Verbrauch an
NADH. Nach der Bestimmung des Proteingehaltes konnte über den molaren
Extinktionskoeffizienten der NADH (6,2*103 M-1cm-1, Vick, 1991) die Enzymaktivität
berechnet werden.
Abbildung 28: Beispiel für den zeitlichen Verlauf der Änderung der Absorption durch den Verbrauch von NADH bei der Bestimmung der Hydroperoxidlyaseaktivität
53
4.10 Messung der Gehalte an Shikimat-/Phenylpropanoidweg-Produkten in Pflanzenproben Ca. 1 g bei -80°C gelagertes, homogenisiertes pulverisiertes Pflanzenmaterial wurde genau
eingewogen, quantitativ in einen vorgekühlten Mörser überführt, mit 2 ml angesäuertem
Methanol (0,1% H3PO4 + 10 µM 3-Methyl-SA als internen Standard) versetzt und eine
Minute lang gemörsert. Das Homogenisat wurde in ein Eppendorf-Cap überführt und fünf
Minuten bei 16000g und 4 °C zentrifugiert. Die Messung der phenolischen Inhaltsstoffe
konnte direkt aus dem Überstand durchgeführt werden. Zur Messung wurde ein HPLC HTA-
System von VWR-Hitachi verwendet:
- L2130 Gradienten Pumpe
- L2200 Autosampler
- L2450 DAD Detektor
- L2300 Säulenofen (30°C)
- EZChrom Elite Software
Die Trennung der Substanzen erfolgte auf einer CS Multisphere 120 RP18 HP Säule (250 mm
* 4 mm, 3µm Korngröße). Eluent A war angesäuertes Wasser (0,1% H3PO4) und Eluent B
Acetonitril. Gesamtfluss der Eluenten 0,5 mL min-1. Der verwendete Gradient ist in Tabelle 8
zu sehen.
Tabelle 8: Gradient zur Messung der phenolischen Inhaltsstoffe
Zeit [min] % Eluent A % Eluent B
0 95 5
28 70 30
38 70 30
45 60 40
50 40 60
60 20 80
70 20 80
75 95 5
90 95 5
Die qualitative und quantitative Analyse der Substanzen erfolgte über Kalibrierungen mit
Referenzsubstanzen. Alle Messungen wurden als Dreifachbestimmungen durchgeführt, es
wurden zwei Aufarbeitungen gemacht, wobei das Extrakt der zweiten Aufarbeitung gesplittet
wurde und mit einer bekannten Menge der zu messenden Substanzen versehen wurde
(Standardadditionsverfahren). Tabelle 9 zeigt die mit dieser Methode messbaren Substanzen.
54
Tabelle 9: Quantifizierbare Substanzen aus dem Shikimatweg
Nr. RT [min] Substanz Wellenlängen [nm]
1 13,5 Phenylalanin 259 311 352
2 17,3 d-Salicin 267 310 353
3 18,3 Tryptophan 218 277 352
4 21,8 Chlorogensäure 218 238 326
5 22,4 Salicylsäureglycosid 205 231 299
6 23,7 p-Hydroxyphenylessigsäure 223 275 311
7 30,2 trans-4-Hydroxyzimtsäure 211 226 309
8 31,6 Sinapinsäure 237 324 -
9 32,0 Ferulasäure 218 236 323
10 36,6 trans-2-Hydroxyzimtsäure 213 276 325
11 40,1 Salicylsäure 204 235 303
12 45,4 Zimtsäure 204 216 276
13 47,8 3-Salicylsäuremethylester 207 241 305
Die Identifikation der Substanzen erfolgte über den Vergleich mit den DAD-Spektren und
Retentionszeiten der Standards. Die Auswertung der Pflanzenproben erfolgte manuell und die
Gehaltsbestimmung über die Kalibrationsgerade (z.B. siehe Abbildung 29).
Abbildung 29: Kalibration Salicylsäure, Auftragung der Peakfläche gegen die auf die Säule aufgegebene Menge an Salicylsäure, rote Punkte: zweite unabhängige Einwaage/Messung, Fehlerbalken 5%, (Korrelationskoeffizient R2 = 0,99)
55
4.11 Markierungsversuch mit 13CO2 Zur näheren Untersuchung der Mechanismen, die zur Änderung der VOC Emissionen aus
Tomaten nach Ozonexposition führen, wurde ein Markierungexperiment durchgeführt. Dazu
wurde die normalerweise verwendete Luftversorgung, die CO2 mit natürlicher Isotopen-
verteilung (ca. 1% 13C) enthält, gegen synthetische Luft (N2/O2) ausgetauscht. Zu dieser
synthetischen Luft wurde so viel 13CO2 (99 atom % 13C) zugemischt, dass sich ein
Mischungsverhältnis von 350 ppm am Kammereingang einstellte. Zwei Stunden nach dem
Beginn der Zugabe des 13CO2 wurde die Pflanze ebenfalls mit Ozon exponiert (800 ppb, 60
Min.). Die 13CO2 Exposition wurde auch nach der Ozonexposition für vier Stunden weiter
fortgesetzt. Danach wurde von der mit 13CO2 angereicherten synthetischen Luft wieder auf die
normale Luftversorgung mit CO2 mit natürlicher Isotopenverteilung gewechselt. Dieser
Versuch wurde unter den gleichen Versuchbedingungen wie die anderen Ozonexpositions-
versuche durchgeführt (Licht: 800 µmol m-2 s-1, Kammertemperatur: 25 °C). Um die
Emissionen über einen längeren Zeitraum verfolgen zu können, wurde diese Pflanze
abweichend von den anderen Versuchen nach der Ozonexposition unter Dauerlicht gehalten.
Eine der zu beantwortenden Fragen war, ob die Synthese der emittierten, stressinduzierten
pflanzlichen VOCs oder deren Vorläufersubstanzen parallel zur Photosynthese in der Pflanze
erfolgt. Dafür wurde nicht der Markierungsgrad in Form des Verhältnisses 13C/12C bestimmt,
sondern der Anteil der Substanzen bzw. Vorläufer, die während der Exposition mit 13CO2
synthetisiert wurden. Annahme dabei war, dass alle VOCs, die 13C enthielten während der
Zeit der Exposition synthetisiert wurden unabhängig davon, ob sie einfach oder mehrfach
markiert waren. Wenn möglich wurde das Molekülion zu dieser Bestimmung genutzt und das
Verhältnis markierte (M) zu unmarkierten (U) VOCs wurde entsprechend der Gleichung 4
bestimmt:
( ) ( ) ( )( ) ( )nmiz
nmizmiznmizmiz
U
M
⋅+⋅++++⋅⋅−+=
01,01
...2)01,0)1(( Gleichung 4
Dabei ist mi die Masse des Molekülions, z(mi+x) die Zählrate des MS für den Peak mit der
Masse mi+x wobei x von 1 (Markierung mit einem 13C Atom) bis n läuft. Die Summanden
z(mi)⋅0,01⋅n im Zähler bzw. (0,01⋅n) im Nenner berücksichtigen die natürliche Anreicherung
einer Kohlenstoffverbindung mit 13C (natürliche Häufigkeit von 13C ≈ 1%).
56
Um einige Antworten zum Biosyntheseweg von MeSA zu erhalten, wurde der Markierungs-
grad einiger anderer VOCs in Form des Verhältnisses 13C/12C bestimmt. Im Falle von Indol
wurde der Markierung des C6-Ringes verglichen; bei Benzoesäuremethylester wurde das C7 –
Fragment ausgewählt, da hier die Signalintensität im Massenspektrum wesentlich höher und
damit besser und genauer quantifizierbar war.
Der Markierungsgrad wurde entsprechend der Gleichung 5 berechnet:
( ) ( ) ( )( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 11)...2(2)1()01,0)1((01,01
.......221)01,0)1((12
13
⋅−++−⋅++−⋅⋅⋅−++⋅⋅+⋅⋅++⋅++⋅⋅⋅−+=
nmiznmiznnmizmiznnmiz
nnmizmiznmizmiz
C
C
Gleichung 5
Mit Hilfe der Gleichung 4 lässt sich der Anteil der VOCs bestimmen, die selbst oder deren
Vorläufer während der 13CO2 Exposition synthetisiert wurden, Gleichung 4 wichtet aber nicht
mit der Anzahl der in das Molekül eingebauten 13C Atome. Dies wird durch Gleichung 5
berücksichtigt. Sie ermöglicht die Bestimmung des Markierungsgrades, also des Verhältnisses
der in einer Substanz enthaltenen 13C – Atome bezogen auf die 12C Atome. Durch die
Fragmentierung der Substanzen im Massenspektrometer lassen sich bei den relevanten
Substanzen die Markierungen im C6 – Ring und die Markierung der Seitenketten klar
unterscheiden.
4.12 Vergleich der Messgrößen Zur Bestimmung von Zusammenhängen zwischen pflanzlichen Emissionen und
pflanzeninternen Signalmolekülen sowie Enzymaktivitäten werden verschiedene Messgrößen
genutzt. Diese sind Flussdichten der VOCs und die Flussdichte von Ozon (Einheiten: mol m-2
s-1, siehe Kapitel 2.1.1), Enzymaktivitäten (nmol s-1 mg-1 Gesamtprotein) und pflanzeninterne
Konzentrationen (µg g-1 Frischgewicht)
Die erste erfasste Messgröße ist die Emissionsrate der von den Pflanzen abgegebenen VOCs.
Diese wird als Flussdichte angegebenen (s. Seite 4). Gleiches gilt für die Aufnahme von Ozon
durch die Pflanzen. Referenz hierfür ist die Flussdichte von Ozon, die die Menge an Ozon
angibt, die pro Zeiteinheit und bezogen auf 1 m2 Blattfläche von den Pflanzen aufgenommen
wird. In allen Graphen, in denen die Emissionsraten oder Aufnahmeraten von Ozon gezeigt
werden, sind diese als Flussdichten angegeben. Treten kurzzeitige Änderungen dieser Größen
auf, werden auch Mittelwerte angegeben.
57
Diese Flussdichten der GLAs errechnen sich durch die Konzentrationsdiffernz zwischen
Kammereingang und Ausgang der jeweiligen Substanz, dem Luftfluss durch die Kammer und
der Blattfläche. Durch die Multiplikation der Flussdichten mit der Blattfläche erhält man
Gesamtflüsse pro Pflanze. Diese können durch die Homogenisierung des Blattmaterials direkt
mit den gemessenen Enzymaktivitäten bzw. Konzentration an endogenen Inhaltsstoffen
verglichen werden.
Die Enzymaktivitäten beziehen sich auf die aus jeweils 1 g Blattmaterial extrahierte
Gesamtproteinmenge. Diese stellt durch die Homogenisierung des Blattmaterials ebenfalls ein
Aliquot der gesamten Proteinmenge dar und ist daher direkt mit dem Gesamtfluss an VOCs
aus den Pflanzen vergleichbar.
Auch die Messung der freien Fettsäuren und der phenolischen Inhaltsstoffe wie der
Salicylsäure erfolgte aus jeweils 1 g homogenisiertem Pflanzenmaterial. Die Angabe erfolgt
hier als Konzentrationen (µg g-1 Frischgewicht für die Fettsäuren und die phenolischen
Inhaltsstoffe).
Wichtig ist dabei eine direkte Vergleichbarkeit der unterschiedlichen Größen. Da die Blätter
der Versuchspflanzen nach dem Ausbau aus der Kammer unter Flüssigstickstoff
homogenisiert wurden, entsprechen alle Bestimmungen aus diesem Material einem Aliquot
und können direkt mit den Flüssen aus den Pflanzen verglichen werden.
Alle angegebenen Größen lassen sich daher auf die gesamte Pflanze hochrechnen, anstatt
Flussdichten kann auch der Gesamtfluss aus der Pflanze angeben werden, die
Enzymaktivitäten hätten dann die Einheit nmol s-1 Pflanze-1 und die Konzentrationen wären in
den Größen µg Fettsäure/Salicylsäure pro Pflanze angegeben. In dieser Arbeit wurden
trotzdem die üblichen Einheiten in Form von Flussdichten, Enzymaktivitäten und
Konzentrationen angegeben.
Für den Vergleich der Enzymaktivitäten und den VOCs aus dem Octadecanoidweg wurden
alle Emissionen der Substanzen aus dem Octadecanoidweg addiert. Durch dieses Verfahren
werden Verfälschungen durch nachfolgende Prozesse wie Acetylierung oder Hydrierung
ausgeschlossen (Abbildung 36).
58
5. Ergebnisse
Tomatenpflanzen cv. Moneymaker emittieren konstitutiv acht Monoterpene (α-Pinen,
β-Myrcen, α-Terpinen, α-Phellandren, 3-Caren, Limonen, β-Phellandren und γ-Terpinen)
und mit trans-Caryophyllen ein Sesquiterpen sowie Spuren von Isopren. Neben diesen
Emissionen gaben nahezu alle Versuchspflanzen 4,8,12-Trimethyltrideca-1,3,7,11-tetraen
(TMTT) und Salicylsäuremethylester (MeSA) in unterschiedlichen Mengen ab (Beispiel-
Chromatogrammm: Abbildung 30, n-Dekan = interner Standard).
Abbildung 30: Chromatogrammm (TIC) der VOC-Emissionen einer Tomatenpflanzen vor Ozonexposition
Nach der Ozonexposition reagierten die Pflanzen in einem Zeitfenster zwischen eineinhalb
und sieben Stunden. Die erste messbare Änderung der VOC Emissionen der Tomaten war
immer die von Methanol, gefolgt von der Emission von 1-Penten-3-ol. Danach folgt die
Abgabe der C6 Blattalkohole und -Aldehyde sowie deren Esterverbindungen (Abbildung 31).
Zu beachten ist die unterschiedliche Skalierung in Abbildung 30 und Abbildung 31.
59
Abbildung 31: Chromatogramm (TIC) der VOC-Emissionen einer Tomatenpflanzen kurz nach Ozonexposition. Hauptemission kurz nach der Ozonexposition ist die der GLAs (hier (Z)-3-Hexenol)
Abbildung 32: Chromatogramm (TIC) der VOC-Emissionen einer Tomatenpflanzen einen Tag nach Ozon-exposition. Die Emission der GLAs sind abgeklungen und Hauptemissionen sind die von MeSA und TMTT
60
Bei allen Experimenten zeigte sich ein festes Emissions-Pattern der Monoterpene.
Abbildung 33 zeigt die Korrelation der Flussdichten von α-Pinen mit denen von Limonen,
β-Phellandren und α-Terpinen für eine Pflanze vor und nach einer Ozonexposition. Die gute
Korrelation besteht unabhängig davon ob die Stärke der Emissionen unter dem Einfluss des
Stresses geändert war oder nicht.
Abbildung 33: Korrelation der Flussdichten von αααα-Pinen mit denen dreier anderer, willkürlich ausgewählter Monoterpene eines Ozonexperimentes vor und nach Ozonexposition.
Auch bei einem Vergleich der Emissionen aus verschiedenen Individuen zeigte sich eine recht
konstante Verteilung der Monoterpenemissionen. Zur Demonstration dieser Konstanz wurden
die Emissionen der Monoterpene α-Pinen, α-Terpinen und Limonen hier willkürlich als
Beispiel herangezogen. Die Gesamtmenge an emittiertem α-Pinen, α-Terpinen und Limonen
wurde zu 100 Prozent gesetzt. Die prozentualen Anteile der einzelnen Monoterpene wurden in
5% Klassen eingeteilt. Wird beispielsweise α-Pinen zu 23% von der Summe von α-Pinen,
α-Terpinen und Limonen emittiert kommt dieses Monoterpen in die Klasse 20-25%.
Diese Einteilung wurde für 39 Pflanzen ohne und 42 Pflanzen mit Ozonstress berechnet. Sie
ist den folgenden Abbildungen gezeigt, wobei Abbildung 34 die Verteilung vor und
Abbildung 35 die Verteilung nach Ozonstress zeigt.
61
Die Anteile der drei Monoterpene betragen unter beiden Versuchsbedingungen ca. 10 - 25%
α-Pinen, 25 - 40% Limonen und 45 - 60% α-Terpinen.
0-0,04 0,05-0,09
0,1-0,14
0,15-0,19
0,2-0,24
0,25-0,29
0,3-0,34
0,35-0,39
0,4-0,44
0,45-0,49
0,5-0,54
0,55-0,59
0,6-0,64
0,65-0,69
0
5
10
15
20
25
Anz
ahl
5% Klassen
Verteilung mit Stress
Anteil a-PinenAnteil a-TerpinenAnteil Limonen
Abbildung 34: Verteilung dreier ausgewählter Monoterpene an ihrer Gesamtemissionsstärke ohne Stress
0-0,04
0,05-0,09
0,1-0,14
0,15-0,19
0,2-0,24
0,25-0,29
0,3-0,34
0,35-0,39
0,4-0,44
0,45-0,49
0,5-0,54
0,55-0,59
0,6-0,64
0,65-0,69
0
5
10
15
20
Anz
ahl
5% Klassen
Verteilung ohne Stress
Anteil a-PinenAnteil a-TerpinenAnteil Limonen
Abbildung 35: Verteilung dreier ausgewählter Monoterpene an ihrer Gesamtemissionsstärke nach Ozonstress
62
GLAs:
Nach der Ozonexposition kam es bei den untersuchten Pflanzen zur Emission von GLAs,
Tabelle 10 gibt eine Übersicht über die Ozonflussdichten, die Dauer der Ozonexposition
sowie des Zeitpunktes des Ausbaus der Pflanzen nach Beginn der Ozonexposition. Die
Analyse der Enzymaktivitäten erfolgte immer möglichst zeitnah zum Ausbauzeitpunkt.
Tabelle 10: Übersicht über die Ozonflussdichten, die Dauer der Ozonexposition sowie des Ausbauzeitpunktes nach Beginn der Ozonexposition
Versuchsnummer mittlere Ozonflussdichte Dauer der Exp. Ausbau ∆t nach
mol m-2 s-1 [min] Beginn Ozon [min] 2005_06_20 1,02E-07 30 245 2005_06_21 4,72E-08 53 177 2005_06_28 1,53E-07 60 130 2005_08_10 5,27E-08 32 190 2005_08_12 1,06E-07 32 205 2005_08_15 6,37E-08 30 110 2005_08_17 7,05E-08 30 160 2005_08_19 6,40E-08 30 115 2005_08_28 7,78E-08 32 98 2005_09_19 7,11E-08 30 130 2005_09_21 9,36E-08 30 126 2005_09_22 9,77E-08 30 161 2005_10_03 8,03E-08 30 138 2005_10_04 8,47E-08 30 145 2005_10_05 9,38E-08 60 130 2005_10_06 1,34E-07 45 107 2005_10_09 7,46E-08 30 365
Das Emissionsmuster der GLAs zeigte eine höhere Variabilität als das der Monoterpene,
allerdings war (Z)-3-Hexenol in allen Versuchen das dominierende GLA. Der prozentuale
Anteil der (Z)-3-Hexenol-Emission an der Gesamtemission der GLAs variierte zwischen 52
und 98% und betrug im Mittel etwas mehr als 60%. Auch die Anteile anderer GLAs variierten
stark. Tabelle 11 zeigt die Emissionen der wichtigsten GLAs für die Experimente, die für den
Vergleich mit den Enzymaktivitäten herangezogen wurden.
Neben den in der Tabelle aufgeführten Emissionen traten auch weitere Emissionen von VOCs
aus dem Octadecanoidweg auf. Beispiele dafür sind die Emissionen von Hexanal, (Z)-3-
Hexenal, (E)-2-Hexenol oder 2,4-Hexadienal. Der Anteil dieser Emissionen an der
Gesamtemission von VOCs aus dem Octadecanoidweg betrug zusammen allerdings weniger
als 5% und wurde bei den weiteren Betrachtungen nicht berücksichtigt.
63
Tabelle 11: Flussdichten der von Tomatenpflanzen hautsächlich emittierten GLAs nach Ozonexposition bzw. Behandlung mit Botrytis cinerea (kursiv) zum Zeitpunkt des Ausbaus der Pflanzen aus der Pflanzenkammer
Flussdichten in mol m-2 s-1
Versuchsnummer (Z)-3-Hexenol (Z)-3-
Hexenylacetat Buttersäure
-3-hexenylester 1-Penten-3-ol Summe 2005_06_20 2,2E-10 9,9E-12 4,7E-11 5,4E-12 2,8E-10 2005_06_21 4,8E-10 8,8E-11 2,4E-10 2,6E-11 8,3E-10 2005_06_28 2,6E-08 1,7E-09 4,2E-09 8,9E-10 3,3E-08 2005_08_10 2,9E-09 2,8E-10 5,7E-10 1,4E-10 3,9E-09 2005_08_12 1,7E-10 6,0E-11 2,2E-10 3,7E-11 4,9E-10 2005_08_15 8,8E-11 1,2E-11 9,0E-11 3,2E-11 2,2E-10 2005_08_17 2,2E-10 1,9E-11 5,4E-11 3,2E-11 3,3E-10 2005_08_19 2,7E-10 9,4E-11 3,3E-10 3,3E-11 7,3E-10 2005_08_28 2,4E-11 2,9E-12 1,4E-11 5,3E-12 4,6E-11 2005_09_19 3,5E-10 3,6E-12 1,7E-11 4,4E-11 4,2E-10 2005_09_21 8,5E-10 1,9E-11 5,1E-11 9,0E-12 9,3E-10 2005_09_22 5,7E-10 2,7E-11 9,8E-11 7,6E-11 7,7E-10 2005_10_03 1,2E-10 1,3E-11 7,0E-11 2,0E-11 2,3E-10 2005_10_04 1,7E-11 2,8E-12 1,2E-11 1,8E-11 5,0E-11 2005_10_05 1,8E-09 1,7E-10 5,9E-10 1,4E-10 2,7E-09 2005_10_06 1,2E-08 9,5E-10 1,6E-09 5,2E-10 1,5E-08 2005_10_09 8,3E-12 1,4E-12 3,7E-12 1,1E-11 2,4E-11
2006_03_28_K3 2,12E-11 9,55E-13 2,64E-12 3,99E-13 2,5E-11 2006_03_29_K3 4,24E-10 1,64E-11 2,87E-11 1,21E-11 4,8E-10
Das von der HPL primär gebildete Produkt ist (Z)-3-Hexenal. Aus diesem entstehen durch
nachfolgende Umwandlungsschritte weitere Produkte.
64
Abbildung 36: Schematische Darstellung der Bildung einiger wichtiger VOCs aus dem Octadecanoidweg ausgehend von αααα-Linolensäure
Hauptgegenstand der hier durchgeführten Untersuchungen war der Zusammenhang zwischen
den Emissionen aus dem Octadecanoidweg und den Enzymaktivitäten innerhalb dieses
Weges. Betrachtet wurden dabei nur die Enzymaktivitäten der Lipase, Lipoxygenase und
Hydroperoxidlyase, da sie in einer Kaskade hintereinander geschaltet sind und zu den
erwähnten Emissionen führen. Die emittierten GLAs (Abbildung 36, rotes Rechteck)
stammen aus dem Substrat Linolensäure (18:3). Je nach Effizienz der Umwandlungsprozesse
werden unterschiedliche Emissionsmuster gefunden. Durch die Aufsummierung der
Flussdichten aller GLAs wird der Einfluss der Isomerisierung oder nachgelagerter
Umwandlungen (durch Alkoholdehydrogenase / Acetyltransferase) auf den Vergleich
aufgehoben. Tabelle 12 zeigt die gemessenen Enzymaktivitäten aus dem Octadecanoidweg.
65
Tabelle 12: Vergleich der Lipase-, Lipoxygenase- und Hydroperoxidlyase-Aktivitäten mit der Summe der Flussdichten an GLAs nach Ozonexposition bzw. Infektion mit Botrytis cinerea (kursiv) Versuchsnummer Lipase Lipoxygenase Hydroperoxidlyase Flussdichte Summe
nmol s-1 mg-1 Gesamtprotein GLAs [mol m-2 s-1] 2005_06_20 ng 2375 2068 2,81E-10 2005_06_21 ng 3988 3948 8,33E-10
#2005_06_28 206 464 2538 3,31E-08 #2005_08_10 ng 1577 2538 3,93E-09 2005_08_12 332 2197 1786 4,89E-10 2005_08_15 357 963 2726 2,21E-10 2005_08_17 434 2871 3760 3,27E-10 2005_08_19 344 3580 3387 7,34E-10 2005_08_28 281 1303 2626 4,57E-11 2005_09_19 315 2320 3854 4,19E-10
#2005_09_21 ng 1129 ng 9,32E-10 #2005_09_22 ng 1347 3512 7,68E-10 2005_10_03 405 2231 2340 2,27E-10 2005_10_04 ng 749 1972 4,95E-11
#2005_10_05 ng 1728 2212 2,66E-09 #2005_10_06 ng 3302 4744 1,55E-08 2005_10_09 148 923 1222 2,42E-11
2006_03_28_K3 ng 859 ng 2,52E-11 2006_03_29_K3 ng 2693 ng 4,81E-10
3
ng = nicht gemessen, # = Messwerte sind nicht in den nachfolgenden Grafiken enthalten da die Emissionsstärke an GLAs bei diesen Versuchen sehr hoch war
Die folgenden Grafiken geben die Korrelationen zwischen den Gesamtemissionsstärken
[mol m-2 s-1] an GLAs und der Lipase-, Hydroperoxidlyase- bzw. Lipoxygenase-Aktivitäten
wieder.
Abbildung 37: Auftragung der Gesamtemissionsstärke der GLAs gegen die Lipaseaktivität (Korrelationskoeffizient R2 = 0,19)
66
Abbildung 38: Auftragung der Gesamtemissionsstärke der GLAs gegen die Hydroperoxidlyaseaktivität (Korrelationkoeffizient R 2 = 0,41)
Abbildung 39: Auftragung der Gesamtemissionsstärke der GLAs gegen die Lipoxygenaseaktivität (Korrelationkoeffizient R 2 = 0,82) Nur die Lipoxygenaseaktivität zeigt eine gute Korrelation mit der Emissionsstärke der
Summe der VOCs aus dem Octadecanoidweg (Korrelationskoeffizient = 0,82). Zusätzlich zu
den durch Ozon induzierten GLA-Emissionen sind in Abbildung 39 auch die gemessenen
67
Werte für zwei Messungen nach Infektion von Tomaten cv. Moneymaker mit Botrytis cinerea
enthalten.
Die in Abbildung 39 gezeigte Korrelation zwischen der Lipoxygenaseaktivität und der
Gesamtemissionsstärke der GLAs galt nur für Ozonflussdichten zwischen 3*10-8 mol m-2 s-1
bis ca. 8*10-8 mol m-2 s-1 oder für die hier untersuchte milde Infektion mit Botrytis cinerea.
War die Ozonflussdichte höher, waren bei annährend gleicher Enzymaktivität die Emissionen
um bis zu 100fach verstärkt (Abbildung 40). Die rot markierten Punkte sind Werte, die bei
den Versuchen mit den höchsten Ozonflussdichten in die Pflanze erhalten wurden (> 9*10-8
mol m-2 s-1).
0,0E+00
5,0E-09
1,0E-08
1,5E-08
2,0E-08
2,5E-08
3,0E-08
3,5E-08
4,0E-08
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
LOX Aktivität [nmol s -1 mg -1 Gesamtprotein]
Ges
amte
mis
sion
alle
r G
LAs
[mol
m-2
s-1
]
Fehlerbalken x = 10% = maximaler FehlerFehlerbalken y = 15% = maximaler Fehler
Abbildung 40: Summe der gemessenen GLA Emissionen in Abhängigkeit von der Lipoxygenaseaktivität. Die rot gekennzeichneten Punkte stellen die Messwerte bei den höchsten Ozonflussdichten dar.
Zusätzlich wurden Enzymaktivitätsmessungen bei Kontrollpflanzen durchgeführt. Die
Kontrollpflanzen wurden keinem Ozonstress ausgesetzt und emittierten keine GLAs. Die
Messung der Emissionen und die Aufarbeitung der Pflanzen erfolgte genau so wie bei den
Pflanzen, die mit Ozon gestresst wurden. Bei diesen Kontrollpflanzen konnten weder für die
Lipoxygenase noch für die Hydroperoxidlyase Aktivitäten gemessen werden. Nimmt man das
Grundrauschen des Photometers als Maß, so betrug die Aktivität dieser Enzyme weniger als 5
nmol s-1 mg-1 Gesamtprotein und ist im Vergleich zu den nach Stresseinwirkung (Ozon,
Botrytis Cinerea) gemessenen Werten vernachlässigbar klein.
68
Die Lipase hingegen zeigte in allen gemessenen Kontrollpflanzen eine Aktivität von < 30
nmol s-1 mg-1 Gesamtprotein (Daten nicht in Arbeit).
Bestimmung der Gehalte an freier Linol- bzw. Linolensäure im Pflanzenmaterial
Aus dem Pflanzenmaterial wurde auch der Gehalt an freier Linol- und Linolensäure bestimmt.
Diese beiden Fettsäuren sind die Hauptsubstrate für das Lipoxygenaseenzym. Zur
Bestimmung wurden fünf Versuche herangezogen bei denen Extremwerte der
Emissionsstärken der GLAs auftraten (z.B. 2005_08_12 hoch, 2005_09_22 niedrig), sowie
sieben Kontrollpflanzen und zwei Pflanzen aus Messungen nach Infiltration mit Botrytis
Cinerea. Tabelle 13 zeigt die gefunden Fettsäurekonzentrationen unterteilt nach den
unterschiedlichen Versuchbedingungen.
Tabelle 13: Gehalte an freier Linolen- bzw. Linolsäure in Kontroll- und Versuchspflanzen Versuchsnummer LeA LA Behandlung Mittelwerte [mg g-1 FG] ± std 1σ
[mg g-1 FG] Ozonflussdichte* LeA (18:3) LA (18:2) 2005_08_12 18 7 1,06E-07 2005_08_19 23 14 6,40E-08 2005_09_19 28 10 7,11E-08 2005_09_22 20 12 9,77E-08 2005_10_04 27 15 8,47E-08 23,2 ± 4,3 11,6 ± 3,2
2006_03_29_K3 35 20 Botrytis Cinerea 2006_03_28_K3 24 11 Botrytis Cinerea 29,5 ± 7,8 15,5 ± 6,4
2006_07_07 22 9 Kontrolle 2006_12_18 17 12 Kontrolle
2006_12_18_2 18 12 Kontrolle 2006_12_19 15 7 Kontrolle 2006_12_20 18 13 Kontrolle 2006_12_21 20 11 Kontrolle 2006_12_22 20 13 Kontrolle 18,6 ± 2,3 11,0 ± 2,2
* Ozonflussdichte [mol m-2 s-1]
Mit der verwendeten Methode zur Bestimmung der freien Fettsäuren konnte auch der Gehalt
an Fettsäurehydroperoxiden simultan ermittelt werden. Allerdings lag deren Konzentration in
allen frisch gemessenen Proben unterhalb der Bestimmungsgrenze (<50 µg g-1 FG). Erst nach
mehreren Stunden im Autosampler nahm ihr Gehalt durch Autoxidation der freien Fettsäuren
zu und war gut messbar.
69
Emissionen von Salicylsäuremethylester
Die Emissionen von Salicylsäuremethylester (MeSA) variierten sehr stark von Pflanze zu
Pflanze. Einige Pflanzen emittierten MeSA bereits vor der Stressapplikation durch Ozon, was
möglicherweise auf Stress zurückzuführen ist, der vor Einbau der Pflanzen in die Kammern
aufgetreten war (z. B. Boden zwischendurch in der Anzucht ausgetrocknet, Pathogenbefall).
Auch diese Pflanzen reagierten nach erneuter Stresseinwirkung mit der Erhöhung der MeSA-
Emission. Aufgrund des begrenzten Pflanzenmaterials konnte der Gehalt an freier
Salicylsäure nur für fünf der 17 vorher bezüglich der Enzymaktivitäten im Octadecanoidweg
(Tabelle 12) untersuchten Pflanzen gemessen werden. Daher wurden für andere Pflanzen die
MeSA-Emissionen und der Gehalt an freier SA gemessen. Tabelle 14 stellt die gemessenen
Emissionsflüsse von MeSA (bezogen auf die Gesamtpflanze) und die Gehalte an freier SA in
den Pflanzen zusammen.
Tabelle 14: Gemessene MeSA-Flüsse in der Expositionskammer und Gehalte an freier SA in den Pflanzen nach Ozonexposition
Versuchsnummer Freie SA Fluss MeSA Fluss MeSA
µg Pflanze-1 [mol s-1 Pflanze-1] [µg s-1 Pflanze-1] 2005_08_10 57,1 9,05E-11 0,0137 2005_08_12 31,8 5,11E-11 0,0078 2005_08_15 27,5 1,32E-11 0,0020 2005_08_17 30,6 3,25E-11 0,0049 2005_10_03 140,2 9,90E-10 0,1504 2006_05_31 33,4 1,45E-10 0,0221 2006_07_07 9,9 2,71E-11 0,0041 2006_07_09 20,8 5,56E-11 0,0084 2006_07_13 168,7 1,10E-09 0,1676 2006_07_17 126,7 8,71E-10 0,1324 2006_07_19 19,1 3,28E-10 0,0499 2006_08_03 32,8 5,69E-11 0,0086
Diese Emissionen wurden dann mit den aus den Blättern extrahierten Gehalten an freier
Salicylsäure verglichen. Abbildung 41 zeigt die Korrelation der MeSA-Emissionen der
Gesamtpflanze [µg s-1] und den Gehalten an freier SA in diesen Pflanzen. Für die meisten
Pflanzen lagen die Gehalte an freier SA unter 40 µg Pflanze-1. In diesem niedrigen
Konzentrationsbereich war die Messung der SA mit dem in der HPLC-Anlage eingesetzten
DAD Detektor sehr schwierig (Rauschen, Untergrund, andere Peaks). Daher sind Werte
unterhalb von ca. 30 µg Pflanze-1 mit Vorsicht zu betrachten. Zur genaueren Bestimmung
dieser Gehalte sollte die Messung mit einem empfindlicheren Detektor (z. B. Fluoreszenz-
Detektor) oder nach Veresterung mittels GC/MS erfolgen. Diese Messungen waren im
70
Rahmen dieser Arbeit nicht möglich, daher soll hier nur auf den deutlich zu erkennenden
Trend hingewiesen werden.
y = 0,0011x - 0,0177R2 = 0,91
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
µg freie SA Pflanze -1
Flu
ss µ
g s
-1 P
flanz
e-1
Abbildung 41: Auftragung der Salicylsäuremethylesteremissionen [µg s-1] gegen den Gehalt an freier Salicylsäure in den Pflanzen (Korrelationskoeffizient R2 = 0,91); alle Daten für T = 25°C, PAR = 800 µmol m-2 s-1.
71
Visuelle Auswirkungen der Ozonexposition:
Die Blätter der mit Ozon exponierten Pflanzen zeigten bereits einige Stunden nach der
Behandlung sehr viele Nekrosen, die am nächsten Tag bei den älteren Blättern den größten
Teil der Blattfläche ausmachten (Abbildung 42).
Abbildung 42: Scan von Tomatenblättern 20h nach Ozonexposition (700ppb, 30 min) Durch diesen großen Anteil an abgestorbenem Blattmaterial geht die Photosynthese der
Pflanzen stark zurück. Die Nekrotisierung der Blätter war immer zuerst bei den unteren
älteren Blättern zu beobachten und erfolgte bei hohen Ozonflussdichten im Verlauf des
nächsten Tages nach der Ozonexposition auch bei den jüngeren Blättern.
72
Messungen der Kontrollpflanzen:
Die Messung der Kontrollpflanzen erfolgte immer unter den gleichen Bedingungen wie die
Versuche mit Ozon oder Infiltration mit Botrytis cinerea. Ohne Einwirkung eines Stressors
emittierten die Tomatenpflanzen nur die bereits oben erwähnten Substanzen. Ein Zeitverlauf
ausgewählter Substanzen eines länger andauerenden ist in Abbildung 43 dargestellt. Deutlich
zu erkennen ist hier die Abnahme der Emissonen. Die erhöhten Emissonen am Anfang der
Experiments sind durch den "Einbaustress" (Berühren der Blätter usw.) bedingt.
0,00E+00
1,00E-11
2,00E-11
3,00E-11
4,00E-11
5,00E-11
6,00E-11
7,00E-11
1.9.06 12:00 2.9.06 0:00 2.9.06 12:00 3.9.06 0:00 3.9.06 12:00 4.9.06 0:00 4.9.06 12:00
Datum/Zeit
Flu
ssdi
chte
And
ere
[mol
m-2
s-1
]
0,00E+00
5,00E-10
1,00E-09
1,50E-09
2,00E-09
2,50E-09
3,00E-09
3,50E-09
Flu
ssdi
chte
TM
TT
[mol
m-2
s-1
]
b-PhellandrenMeSA
TMTT
Abbildung 43: Zeitlicher Verlauf der Emissionen von TMTT (rechte y-Achse), ββββ-Phellandren und MeSA (linke y-Achse) in einem Kontrollexperiment ohne Behandlung mit einem Stressor
Die Kontrollpflanzen emittierten keine GLAs und zeigten weder eine messbare Lipoxygenase
noch Hydroperoxidlyaseaktivität. Die Lipase hingegen zeigte eine geringe Aktivität (< 30
nmol s-1 mg-1 Gesamtprotein). Dies könnte ein Grund für die auch in den Kontrollpflanzen
gefundenen Konzentration an freien Fettsäuren sein (Tabelle 13).
73
Markierungsversuch mit 13CO2
Vor der Beginn der Ozonexposition emittierten Tomatenpflanzen cv. Moneymaker konstitutiv
die schon weiter oben beschriebenen acht Monoterpene (α-Pinen, β-Myrcen, α-Terpinen,
α-Phellandren, 3-Caren, Limonen, β-Phellandren und γ-Terpinen), geringe Mengen an TMTT
und Spuren von MeSA und Isopren. Schon zwei Stunden nach Beginn der 13CO2 Exposition
waren Isopren und TMTT stark, die Monoterpene deutlich mit 13C markiert. Aufgrund der
hohen Ozonflussdichte waren bereits eine Stunde nach der Ozonexposition (erstes
Chromatogramm nach der Ozonexposition) die Emissionen von GLAs, MeSA sowie der
Monoterpene stark erhöht. Der Verlauf dieser Emissionen war dabei ähnlich zu denen, die
während der anderen Ozonexpositionen beobachtet wurden. Wie in allen anderen Fällen auch
waren und blieben die Monoterpenemissionsraten untereinander hoch korreliert.
Abbildung 44 zeigt den Zeitverlauf der Emissionen von (Z)-3-Hexenol, MeSA, TMTT und
der Monoterpene am Beispiel des β-Phellandrens.
0,0E+00
1,0E-10
2,0E-10
3,0E-10
4,0E-10
5,0E-10
6,0E-10
7,0E-10
8,0E-10
9,0E-10
4.1.07 6:00 4.1.07 10:48 4.1.07 15:36 4.1.07 20:24 5.1.07 1:12 5.1.07 6:00
Datum/Uhrzeit
Flu
ssdi
chte
and
ere
[mol
m-2
s-1]
0,0E+00
1,0E-09
2,0E-09
3,0E-09
4,0E-09
5,0E-09
6,0E-09
7,0E-09
8,0E-09
9,0E-09
Flu
ssdi
chte
(Z
)-3-
Hex
enol
[m
ol m
-2 s-1
]
MeSAb-PhellandrenTMTTOzon13CO2(Z)-3-Hexenol
13CO2
Abbildung 44: Zeitverlauf der Emissionen von (Z)-3-Hexenol, MeSA, TMTT und der Monoterpene am Beispiel des ββββ-Phellandrens nach Ozonexposition (13CO2-Experiment)
74
100 101 102 103 104 105 1060,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Rel
ativ
e Z
ählra
te z
(100
+n)
/z(1
00)
Masse [amu]
(Z)-3-Hexenol gemessen 4,5 h nach 13CO2
(Z)-3-Hexenol ohne 13CO2
Abbildung 45: Relative Zählraten im Massenspektrum Molmassen von (Z)-3-Hexenol 4,5 Stunden nach Beginn der 13CO2 Exposition
136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 1460,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Rel
ativ
e Z
ählra
te z
(136
+n)
/z(1
36)
Masse [amu]
β-Phellandren gemessen 4,5 h nach 13CO2
β-Phellandren ohne 13CO2
Abbildung 46: Relative Zählraten im Massenspektrum Molmassen von β β β β-Phellandren 4,5 Stunden nach Beginn der 13CO2 Exposition
75
152 153 154 155 156 157 158 159 1600,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0R
elat
ive
Zäh
lrate
z(1
52+
n)/z
(152
)
Masse [amu]
MeSA gemessen 4,5 h nach 13CO2
MeSA ohne 13CO2
Abbildung 47: Relative Zählraten im Massenspektrum Molmassen von Salicylsäuremethylester 4,5 Stunden nach Beginn der 13CO2 Exposition
Abbildung 45 bis Abbildung 47 zeigen Beispiele für Massenspektren, die nach 4,5 Stunden
unter 13CO2 Exposition (etwa 2 ½ Stunden nach Beginn der 60 minütigen Ozonexposition)
gemessen wurden. Aufgetragen sind die relativen Zählraten im Bereich von den jeweiligen
Molekülionen (mi) bis mi+n, wobei n die Anzahl der Kohlenstoffatome des VOCs ist. Zum
besseren Vergleich wurden die jeweiligen Zählraten der mit 1 bis n 13C-Atomen markierten
Molekülionen auf die des unmarkierten Molekülions normiert (z(mi+n) / z(mi) = 1).
Während für (Z)-3-Hexenol (Abbildung 45) keine signifikante Anreicherung mit 13C messbar
ist, ist sowohl für β-Phellandren (und alle anderen emittierten Monoterpene) und auch für
MeSA eine bimodale Verteilung zu erkennen.
Ein Maximum der Verteilung ist für MeSA beim unmarkierten Molekülion zu finden (nur 12C-Atome), bei höheren Markierungsgraden ist ein zweites Maximum zu erkennen. Zu dem
in den Abbildung 45 - Abbildung 47 gezeigtem Zeitpunkt lagen diese Maxima bei n = 5 für
die Monoterpene und bei n = 7 für MeSA.
Abbildung 48 zeigt die Auftragung des Verhältnisses markierter (M) zu unmarkierten (U) β-
Phellandren-Molekülen entsprechend der Gleichung 4 sowie den Verlauf der Gesamtfluss-
dichte an β-Phellandren.
76
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
-10,0 -5,0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0
Zeit nach Beginn der 13CO2 Exposition [h]
M/U
0,0E+00
1,0E-10
2,0E-10
3,0E-10
4,0E-10
5,0E-10
6,0E-10
7,0E-10
8,0E-10
9,0E-10
[mol
m-2
s-1
]
M/U b-Phellandren Ozonexposition 13CO2 Exposition Flussdichte b-Phellandren
Abbildung 48: Zeitverlauf des Verhältnisses von mit 13C angereicherten zu nicht angereicherten ββββ-Phellandren Molekülen (linke Achse). Aufgetragen ist das Verhältnis M/U entsprechend der Gleichung 4. Flussdichte ββββ-Phellandren (rechte Achse).
Schon eine Stunde nach Beginn der 13CO2 Exposition zeigt das emittierte β-Phellandren ein
M/U von 0,8. M/U zeigt das Verhältnis der Moleküle deren Vorläufer oder die selbst während
der 13CO2 Exposition de novo synthetisiert wurden zu den Molekülen welche aus Pools
stammen. Kurz nach der Ozonexposition sinkt dieser Anteil und steigt etwa 3 - 4 Stunden
nach Beendigung der Ozonexposition wieder an.
Der durch die Ozonexposition hervorgerufene Emissionspuls von Monoterpenen wird zum
Großteil durch die Emission nicht mit 13CO2 angereicherter Monoterpene verursacht (rote
Punkte). Daher kommt es zu einer Erniedrigung des in Abbildung 48 zu gezeigten
Verhältnisses M/U auf ca. 15%. Analoges gilt für die Erhöhung von M/U auf ca. 70% nach
Abklingen des Emissionspulses der Monoterpene (≈ 15h nach Ozon). Hier sinkt vor allem die
Emission der nicht mit 13C angereicherten Monoterpene stärker als die der markierten
Momoterpene (Abbildung 49).
77
0,0E+00
1,0E-10
2,0E-10
3,0E-10
4,0E-10
5,0E-10
6,0E-10
7,0E-10
8,0E-10
9,0E-10
-10,0 -5,0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0
Zeit rel. zur 13CO2 Exposition
Flu
ssdi
chte
[mol
m-2
s-1
]
Flussdichte b-Phellandren b-Phellandren markiert 13CO2 O3
Abbildung 49: Zeitverlauf der Emissionsraten von ββββ-Phellandren. Die Quadrate zeigen die Emissionsraten von ββββ-Phellandren-Molekülen, die mindestens 1 13C Atom enthielten, die blauen Rauten zeigen die Emissionsraten von ββββ-Phellandren-Molekülen, die nicht mit 13C angereichert waren. Für MeSA ist die Interpretation des zeitlichen Verlaufs der Markierung etwas komplizierter
als für die Monoterpene. Der Vorläufer der Monoterpene GPP ist aus 10 Kohlenstoffatomen
aufgebaut, die daraus gebildeten und emittierten Monoterpene haben ebenfalls 10
Kohlenstoffatome. Wird also markierter Kohlenstoff bei der Biosynthese von GPP eingebaut
ergibt sich dasselbe Verhältnis markiert/unmarkiert für alle Monoterpene.
Die emittierte MeSA besitzt durch die Methylierung der Salicylsäure ein Kohlenstoffatom
mehr als die freie Salicylsäure. Diese Methylgruppe kann aus einem anderen Substrat
synthetisiert werden als Salicylsäure. Daher kann das Verhältnis markiert/unmarkiert für das
Kohlenstoffatom der Methylgruppe ein anderes sein als bei der Salicylsäure selbst. Bei der
Interpretation des Zeitverlaufs der Markierung von MeSA sollte daher zwischen der
Markierung der Salicylsäure und des Kohlenstoffatoms der Estergruppe unterschieden
werden.
Die Fragmentierung von MeSA im Massenspektrometer führt zur Bildung zweier
Hauptfragmente. Neben dem unfragmentierten Molekülion mit der Masse 152 amu (C8 H8O3)
entsteht durch die Abspaltung von Methanol (CH3OH) ein Fragment mit der Masse 120 amu
(C7H4O2). Dieses abgespaltene Methanol beinhaltet das Kohlenstoffatom aus der
Methylierung. Ein Vergleich der Markierungen in den einzelnen Fragmenten mit den Massen
78
152 bis 160 mit dem in den Fragmenten 120 bis 127 zeigt daher wie viel der Markierung aus
dem Methylierungsschritt stammt. Abbildung 50 zeigt den Verlauf der Markierung im
Molekülion und im C7 Fragment des emittierten MeSAs sowie die Flussdichte der MeSA-
Emissionen. Der Messpunkt während der Ozonexposition fehlt, da es durch die hohen
Ozonkonzentrationen in der Kammer zu Oxidationsprozessen der MeSA kommt und dieser
Messwert daher nicht zuverlässig ausgewertet werden kann.
0,0E+00
2,0E-11
4,0E-11
6,0E-11
8,0E-11
1,0E-10
1,2E-10
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
MeS
A-F
luss
dich
te [
mol
m-2
s-1]
Zäh
lrate
M/U
Zeit relativ zum Begin der 13CO2 Exposition [h]
Markiert/Unmarkiert im C7-Fragment13 CO2 ExpositionOzonexpositionMarkiert/Unmarkiert MeSA-MolekülFlussdichte MeSA
Abbildung 50: Zeitverlauf der MeSA-Emissionen (blaue Quadrate, rechte Achse) und Zeitverlauf des Verhältnisses M/U im C7 Fragment der MeSA (rote Dreiecke, linke Achse) Die Zeitverläufe der Verhältnisse M/U unterscheiden sich für das Molekülion und das C7 -
Fragment. Wie zu erkennen ist, zeigt das Molekülion direkt zu Beginn der 13CO2 Exposition
eine hohe Markierung die danach sehr schnell abklingt. Das C7 –Fragment hingegen erreicht
sein M/U-Maximum erst später. Das weist darauf hin, dass das Kohlenstoffatom, das bei der
Methylierung in das MeSA eingebaut wird, sehr schnell aus dem aufgenommenen CO2
synthetisiert wird. Die Markierung des C7 Fragmentes selber ändert sich während des
Emissionspulses nicht stark.
Nach der Ozonexposition emittierte die Tomate auch andere Substanzen, die wie SA
Chorismat als Vorläufer haben. Dazu gehören Benzoesäuremethylester und Indol. Der
Vergleich der Markierung dieser Substanzen mit der des C7-Fragments des MeSA ließ weitere
Schlüsse zu.
79
0 1 2 3 4 5 6 7 80,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0R
elat
ive
Zäh
lrate
z(C
7+n)
/z(C
7)
Anzahl von 13C Atomen im C7-Fragment
Benzoesäuremethylester C7-Fragment
MeSA C7-Fragment
Abbildung 51: Relative Zählraten der Massenspektren der C7 -Fragmente von MeSA (Massen 105 -112) und Benzoesäuremethylester (Massen 120 – 127) sieben Stunden nach Beginn der 13CO2 -Exposition
0 1 2 3 4 5 60,0
0,4
0,8
1,2
1,6
Rel
ativ
e Z
ählra
te z
(C6+
n)/z
(C6)
Anzahl von 13C Atomen im C6-Fragment
Indol C6-Fragment
MeSA C6-Fragment
Abbildung 52: Relative Zählraten der Massenspektren der C6 -Fragmente von MeSA (Massen 92 – 98) und Indol (Massen 90 -96) sieben Stunden nach Beginn der 13CO2 -Exposition Abbildung 52 zeigt einen Vergleich der Markierungsmuster von MeSA und Indol. Indol ist
hier deutlich stärker markiert als MeSA.
80
6. Diskussion
6.1 Pflanzliche Reaktionen auf Ozonstress Bereits in den 50er Jahren wurde Ozon als Schadgas erkannt. In Pflanzenarten wie Nicotiana
tabacum L. führten erhöhte Ozonkonzentrationen zu nekrotischen Blattschäden, welche
Wetterflecken genannt wurden [Heggestad und Middleton, 1959]. In Versuchen im Jahr 2003
[Beauchamp et al., 2005] wurde die besonders sensitive Tabaksorte Bel W3 eingesetzt und
die Reaktion der Pflanzen auf erhöhte Ozonkonzentrationen und die zeitliche Dynamik dieser
Reaktionen untersucht. Eines der wichtigsten Ergebnisse zeigte, dass nicht die
Ozonkonzentration, sondern die Ozonflussdichte in die Pflanzen als Referenz für die Reaktion
der Pflanze auf diesen Stress herangezogen werden muss [Beauchamp et al., 2005; Filella und
Penuelas, 2005]. Die Antwort der Pflanze (also hier die Bildung der GLAs) hängt in ihrer
Stärke (hier Flussdichte der GLAs) direkt von dem Ozonfluss in die Pflanze ab. Das bedeutet,
über die Ozonflussdichte hat man die Möglichkeit, eine Stressapplikation quantitativ
durchzuführen. Das ist bei den meisten anderen Stressoren (Herbivorie, Pilzbefall, Pathogene)
nicht so einfach möglich.
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob ein Zusammenhang zwischen den
Emissionsstärken der stressinduzierten GLAs und den Enzymen des Octadecanoidwegs
besteht. Dafür war Tabak als Modelpflanze nicht gut geeignet, da in Tabak drei
unterschiedliche LOX-Isoenzyme vorhanden sind [Halitschke und Baldwin, 2003]. Eine
unterschiedlich starke Aktivierung dieser Isoenzyme nach Stress hätte die Interpretation der
Daten im Hinblick auf die Aufgabenstellung dieser Arbeit erschwert. Bei den zur gleichen
Familie wie Tabak gehörenden Tomaten (Lycopersicon esculentum Mill.) wurde bisher
dagegen nur ein Lipoxygenaseenzym in den Blättern nachgewiesen [Porta und Rocha-Sosa,
2002]. Hauptsächlich aus diesem Grund wurden für diese Arbeit Tomaten als Modellsystem
ausgewählt.
Auch Tomaten reagieren auf erhöhte Ozonflussdichten mit einer Veränderung ihrer VOC-
Emissionen. Es kommt zu einer Verstärkung der konstitutiven Emissionen von Monoterpenen
und es werden neue Substanzen, die zur Gruppe der GLAs gehören wie z.B. (Z)-3-Hexenol,
synthetisiert und emittiert. Hinzu kommt die Erhöhung der Emissionen von MeSA. Genau
wie bei der Tabaksorte Bel W3 bilden sich bei den Tomatenpflanzen nach einiger Zeit
nekrotische Flecken aus, die Anzeichen für programmierten Zelltod sind. Nach Augenschein
war die Anzahl und Größe der nekrotischen Flecken wie bei den Tabakpflanzen von der
81
Ozonflussdichte in die Pflanzen abhängig. Dieser Zusammenhang wurde allerdings in dieser
Arbeit nicht quantitativ untersucht.
Die Reaktion der Pflanzen hängt von verschiedenen Faktoren ab. Je nach z.B. Ernährungs-
oder Entwicklungszustand oder Bewässerung können einzelne Individuen unterschiedliche
Mengen an Antioxidantien (z.B. phenolische Inhaltsstoffe) bilden, welche wiederum für ihre
Ozonresistenz von entscheidender Bedeutung sind. Die erste messbare Reaktion der Pflanzen
auf erhöhte Ozonflussdichten ist das Schließen der Stomata [Lyons et al., 1999]. Diese
Reaktion ist bei hohen Ozonflussdichten bereits nach ca. 30 min zu beobachten. Die in den
Versuchen genutzten Ozonflussdichten wurden durch Ozonpulse mit einer Länge vom
maximal 60 min erreicht, wobei für Ozonflussdichten zwischen 3*10-8 bis 8*10-8 mol m-2 s-1
eine Pulsdauer von 30 min für das Auslösen einer Stressantwort ausreichend waren.
Allerdings ergab sich eine Schwelle für die Ozonflussdichte unterhalb derer es nie zu einer
messbaren Reaktion der Pflanzen auf Ozonstress kam (<1*10-8 mol m-2 s-1). Wahrscheinlich
reichen bei kleinen Ozonflussdichten die im Blatt vorhandenen bzw. neu synthetisierten
Antioxidatien aus, um eine Schädigung der Pflanze durch das Ozon zu verhindern.
Die Reaktionen der Tomatenpflanzen konnte in drei Gruppen eingeteilt werden:
Erstens: Die Reaktion auf kleine Ozonflussdichten in die Pflanze
Bei Ozonflussdichten unter 1*10-8 mol m-2 s-1 waren keine Änderungen der Emissionen der
Pflanzen messbar. Die Pflanzen tolerieren diese Stresseinwirkung, wahrscheinlich durch das
Abfangen des Ozons oder der neu gebildeten ROS durch Scavenger wie Antioxidantien. Es
kam nicht zur Induktion des Lipoxygenase-Weges und somit auch zu keiner Veränderung des
Emissionsmusters. Diese Pflanzen wiesen auch nach den Ozonexpositionen keine visuellen
Veränderungen auf. In diesen Versuchen kam es zu keiner Änderung der stomatären
Öffnungsweite und auch zu keiner Veränderung der Photosyntheseaktivität.
Zweitens: Die Reaktion auf Ozonflussdichten von 3*10-8 bis 8*10-8 mol m-2 s-1
Die Pflanzen reagieren auf die Ozonexposition in einem Zeitfenster von eineinhalb bis sieben
Stunden mit der Emission von GLAs. Die Reaktionszeit ist dabei von Faktoren wie der
Ozonflussdichte in die Pflanze abhängig. Die Gesamtemission der GLAs ergibt sich zu mehr
als 95% aus der Summe der Emissionen von (Z)-3-Hexenol, 1-Penten-3-ol, (Z)-3-
Hexenylacetat und Buttersäurehexenylester, wobei (Z)-3-Hexenol immer den größten Anteil
ausmachte. In Langzeitexperimenten zeigten die Versuchspflanzen je nach Ozonflussdichte
82
eine unterschiedliche Anzahl/Größe von nekrotischen Läsionen. Diese Ergebnisse lassen sich
gut mit den Ergebnissen bei milder Botrytis cinerea -Infiltration vergleichen.
Drittens: Die Reaktion auf Ozonflussdichten > 8*10-8 mol m-2 s-1
In diesen Versuchen kam es zu einer sehr schnellen und starken Reaktion der Pflanzen auf
den Stressor. Die Emissionen der GLAs waren im Vergleich zu den mild gestressten Pflanzen
bis zu 100fach erhöht.
Zwischen diesen drei Gruppen gibt es fließende Übergänge. Liegt die Ozonflussdichte im
Bereich von 8*10-8 mol m-2 s-1 kann die Emissionsstärke der GLAs sehr stark variieren. Hier
kann man über die Emissionsstärke keine sicheren Rückschlüsse auf die
Lipoxygenaseaktivität machen. In diesen Bereich der Stressdosierung scheint es einen
Übergang zwischen unterschiedlichen Reaktionen der Pflanzen zu geben.
Allerdings kann man aufgrund der gewonnenen Daten eindeutig sagen, dass ab einer
Emissionsstärke mit Flussdichten oberhalb von 1*10-7 mol m-2 s-1 für die Summe der GLAs
keine Korrelationen zwischen den GLA-Emissionen und der Lipoxygenaseaktivität
vorhanden ist.
83
6.2 Vergleich der Prozesse im Octadecanoidweg mit den Emissionsraten der GLAs
Ziel der Arbeit war die Bestimmung von Zusammenhängen zwischen pflanzeninternen
Prozessen und den daraus resultierenden Emissionen nach Stresseinwirkung. Als
Untersuchungsschwerpunkt wurde der Octadecanoidweg gewählt, da die daraus stammenden
Emissionen gut quantitativ erfassbar sind und bei allen bisher untersuchten Pflanzen nach
Stress zu beobachten waren. Abbildung 53 gibt einen Überblick über die dabei gemessenen
Größen (in gelb 1-6). Ausgehend von den Lipiden aus den Zellwänden führt deren Abbau
über drei Enzyme (Schritte 1, 3, 5) und die Zwischenstufen Freie Fettsäuren (Schritt 2) und
Hydroperoxifettsäuren (Schritt 4) zur Bildung und Emission von Blattaldehyden und
-alkoholen (Schritt 6).
Abbildung 53: Schema des Octadecanoidwegs mit Schwerpunkt auf dem Abbau der Hydroxyperoxifett-säuren, AOS = Allenoxid-Synthase, DES = Divinylether-Synthase, EAS = Epoxyalkohol-Synthase, POX = Peroxygenase, RED = Reduktase
84
Zur Bestimmung von Zusammenhängen zwischen Enzymaktivitäten/den Konzentrationen der
Zwischenprodukte im Octadecanoidweg in den Pflanzen und den Emissionsraten wurden die
Schritte 1-6 in dieser Arbeit gemessen. Hier sollte der langsamste und damit
geschwindigkeitsbestimmende Schritt in dieser Kaskade bestimmt werden. Ein linearer
Zusammenhang zwischen den gemessenen Emissionen und einer Enzymaktivität oder eines
Zwischenproduktes würde diesen Schritt erkennen lassen. Da es sich um drei hintereinander
geschaltet Enzyme handelt, muss diese Vorgehensweise nicht unbedingt zum erwünschten
Erfolg führen. In Arbeiten wie z.B. Kacser und Burns (1981) wird das auftretende Problem
näher erläutert. Die genauere Betrachtung erfolgt am Ende der Diskussion.
Die Lipaseaktivität zeigte nach der Einwirkung des Stressors (Ozon) eine Aktivität zwischen
ca. 150 und 450 nmol s-1 mg-1 Gesamtprotein (Tabelle 12). Damit ist die Lipaseaktivität die
kleinste der gemessenen Enzymaktivitäten. Der Vergleich der Lipaseaktivität mit der
Gesamtemissionsstärke an GLAs zeigte keine gute Korrelation (Abbildung 37).
Eine mögliche Erklärung dafür, dass keine Korrelation zwischen Lipaseaktivität und den
Emissionsraten an GLAs zu finden war, ist die wenn auch geringe Grundaktivität dieses
Enzyms (< 30 nmol s-1 mg Gesamtprotein-1). Diese Grundaktivität wurde auch in
Kontrollpflanzen gemessen, also Pflanzen, die zumindest nicht bewusst Stress ausgesetzt
waren. Das bedeutet, dass auch in den Kontrollpflanzen freie Fettsäuren als Substrat für die
Lipoxygenase vorliegen. Die gefundenen Mengen der freien Linol- und Linolensäure in den
nicht bewusst gestressten Kontrollpflanzen unterscheiden sich mit mittleren Gehalten von
18,6 ± 2,3 mg g-1 FG für Linolensäure und 11,0 ± 2,2 mg g-1 FG Linolsäure nicht signifikant
von dem Gehalten in den gestressten Pflanzen (25,2 ± 5,7 / 12,7 ± 4,2 mg g-1 FG; Tabelle
13). Zu Ergebnissen in ähnlicher Größenordnung kamen auch bereits Conconi et al. (1996)
bei Untersuchung der Reaktion von Tomatenpflanzen auf Verwundung (unverwundet LA und
LeA beide etwa 10 – 12 mg g-1 TG, 2h nach Verwundung ca. 20 - 25 mg g-1 TG). Allerdings
sahen sie signifikante Unterschiede zwischen unverwundeten und verwundeten
Tomatenpflanzen im Bezug auf den Gehalt an freier LA/LeA. Ob die Fettsäuren bei der
Aufarbeitung erst freigesetzt wurden oder durch die auch in Kontrollpflanzen gemessene
Lipaseaktivität entstehen kann hier nicht geklärt werden.
85
Obwohl in den Kontrollpflanzen nicht viel weniger Substrat für die Lipoxygenase vorhanden
war, konnte bei keiner der Kontrollpflanzen die Emission von GLAs sowie eine
Lipoxygenase- oder Lyaseaktivität gemessen werden. Mögliche Erklärungen zu diesem
Befund könnten sein:
dass die freien Fettsäuren nicht verfügbar sind weil sie entweder
1. räumlich getrennt von den Lipoxygenase vorliegen oder
2. mit ihrer hydrophoben Seite in der Membran gebunden sind.
oder das Lipoxygenaseenzym entweder:
3. neu gebildet werden muss
4. aktiviert werden muss
1. Im Entwicklungsstadium der hier gemessen Pflanzen können Lipoxygenasen in der
Vakuole [Tranbarger et al., 1991], im Zellkern [Feussner et al., 1995] oder im
Chloroplasten [Bell et al., 1995; Feussner et al., 1995; Heitz et al., 1997; Peng et al.,
1994; Royo et al., 1996] vorliegen. Die Linolensäure ist ein Hauptbestandteil von
Membranlipiden und wird vermutlich auch dort freigesetzt [Farmer und Ryan, 1992;
Narváez-Vásquez et al., 1999], daher könnte eine örtliche Trennung zwischen dem
Substrat (freie Fettsäuren) und dem Lipoxygenaseenzym eine Emission von GLAs
verhindern [Brinckmann et al., 1998]. In solch einem Fall sollte die
Lipoxygenaseaktivität immer groß genug sein, um das zur Verfügung stehende
Substrat zu oxidieren. Dann wäre es aber auch unwahrscheinlich, dass eine
Korrelation zwischen Lipoxygenaseaktivität und VOC Emissionen vorhanden ist
(Abbildung 39). Denn dann wäre der Transport limitierend für die Emissionsstärke
und nicht die Lipoxygenaseaktivität und die gefundene Korrelation wäre reiner Zufall.
2. Eine weitere mögliche Erklärung für die fehlende Emission von GLAs stellt die
Verhinderung einer Reaktion zwischen dem Substrat und dem Lipoxygenaseenzym
dar. Die Fettsäuren liegen oft mit ihrer hydrophoben Kohlenstoffkette in der Membran
fest und sind daher nicht für einen Abbau durch die Lipoxygenase frei verfügbar [Ek
et al., 1997]. Erst nach ihrer Freisetzung durch die Auflockerung der Membran durch
z. B. H2O2 ist das Substrat frei zugänglich [Farmer und Ryan, 1992; Narváez-Vásquez
et al., 1999].
Allerdings kann weder die räumliche Trennung zwischen Substrat und Enzym noch
die Verhinderung einer Reaktion der beiden die Ergebnisse der Messungen der
Kontrollpflanzen erklären. Dabei wurde für die Lipoxygenaseaktivitätsmessungen
86
Substrat im Überschuss vorgelegt und der Enzymextrakt hinzugegeben. Es war keine
Bildung der Hydroperoxifettsäuren messbar. Das bedeutet, die Lipoxygenase muss
entweder neu gebildet werden oder sie liegt in inaktivem Zustand in den Pflanzen vor.
3. Die Transkription des Lipoxygenaseenzyms ist recht schnell nach der Einwirkung
eines Stressors zu beobachten (3 Stunden), allerdings konnte zu diesem Zeitpunkt in
anderen Arbeit mit Moneymaker keine Lipoxygenaseaktivität gemessen werden [Koch
et al., 1992]. Da die Emissionen der GLAs oft schon 1-2 Stunden nach der
Ozonexposition zu beobachten sind [Beauchamp et al., 2005], kann die Neubildung
des Lipoxygenaseenzyms hier nicht ausschlaggebend sein. Das Lipoxygenaseenzym
muss daher schon vor Einwirkung des Stressors in den Pflanzen vorhanden sein und
aktiviert werden. Die Aktivierung muss sehr schnell erfolgen können.
Da die Möglichkeiten 1- 3 als Grund für das Ausbleiben der GLA – Emissionen
nahezu ausgeschlossen werden können, ist die Aktivierung des Lipoxygenaseenzyms
wahrscheinlich entscheidend für das zeitliche Verhalten der Induktion der GLA
Emissionen.
4. Schon früh wurde nach dem Aktivierungsschritt der Lipoxygenase gesucht [Restrepo
et al., 1973; Nelson et al., 1977]. In diesen Arbeiten ging man davon aus, dass
Calciumionen diese Aktivierung verursachen könnten. Doch diese bewirkten oftmals
ganz gegensätzliche Effekte. So wurden durch Ca2+ -Ionen sowohl aktivierende als
auch hemmende Effekte auf Lipoxygenasen beobachtet [Kuo et al., 1997; Axelrod et
al., 1981; Christopher et al., 1972; Dreesen et al., 1982]. In späteren Arbeiten wird die
Rolle der Oxidationszahl des Eisenions der Lipoxygenase für ihre Aktivierung
diskutiert. Nach Scarrow et al., (1994) wird die Lipoxygenase erst durch die Oxidation
des Fe2+ Ions zu Fe3+ aktiviert. Wodurch diese Aktivierung erfolgt wird bis heute
kontrovers diskutiert [Funk et al., 1981], sie könnte auch über H2O2 erfolgen
[Kulkarni et al., 1990]. Die eigentliche Fettsäureumsetzung verläuft nach heutigen
Kenntnissen über eine Radikalbildung durch Abspaltung eines Protons im Zentrum
des 1,4-Pentadiensystems. Dies hat die Reduktion des Eisenatoms im aktiven Zentrum
von der Oxidationsstufe Fe3+ Ions zu Fe2+ zur Folge. In einem zweiten Schritt erfolgen
die Reaktion des Pentadienylradikals mit molekularem Sauerstoff und die Anlagerung
eines Protons, durch das das Hydroperoxid-Derivat entsteht. Parallel dazu verläuft die
Reaktivierung des Eisenatoms in die Fe3+-Form durch stöchiometrische Mengen eines
beliebigen Peroxides [Feussner und Kühn, 2000].
87
Wie diese Aktivierung letztendlich erfolgt, wurde hier nicht untersucht. Allerdings
scheint die Aktivierung des Lipoxygenaseenzyms durch die Einwirkung eines
Stressors zur GLA Emission zu führen.
Erst nach der Einwirkung von Stress zeigten alle Pflanzen, die GLAs emittierten, eine gut
quantifizierbare Lipoxygenaseaktivität. Diese variierte zwischen ca. 450 und 4000 nmol s-1
mg-1 Gesamtprotein und lag damit bis zu einer Größenordnung über der der Lipaseaktivität.
Die gute Korrelation zwischen der Emissionsstärke der GLAs und der Lipoxygenaseaktivität
(Abbildung 39) deutet auf eine geschwindigkeitsbestimmende Regulierung der Emissionen
durch das Lipoxygenaseenzym hin. Eine solch gute Korrelation ist allerdings nur ein Hinweis
und kann nicht als Beweis angesehen werden.
Das nächste Produkt in der betrachteten Kaskade sind die Hydroperoxifettsäuren. Deren
Konzentrationen lagen in allen untersuchten Pflanzen unterhalb der Nachweisgrenze was
zeigte, dass die endogenen Konzentrationen der Hydroperoxifettsäuren sehr gering waren (<
50 µg g-1 FG). Geringe Konzentrationen eines solchen Zwischenproduktes wie es diese
Hydroperoxide sind, deuten stark darauf hin, dass die Bildung sehr viel langsamer erfolgt als
die Weiterverarbeitung.
Einer der Schritte, die zum Abbau der Hydroperoxifettsäuren führen, ist die Umsetzung durch
die HPL. Während die Kontrollpflanzen keine messbare HPL-Aktivität zeigten, lag sie bei
den gestressten Pflanzen zwischen ca. 1200 und 5000 nmol s-1 mg-1 Gesamtprotein. Die
HPL-Aktivität war in der Regel etwas höher als die LOX-Aktivität. Das ist ein Hinweis
darauf, dass die HPL-Aktivität nicht geschwindigkeitsbestimmend für die Bildung der GLAs
ist und ist konsistent dazu, dass keine gute Korrelation der HPL-Aktivität mit der
Emissionsstärke der GLAs gefunden wurde (Abbildung 38).
Die sehr geringen Konzentrationen der Hydroperoxifettsäuren lassen sich aber nicht alleine
mit der hohen HPL-Aktivität erklären, da diese nur um einen Faktor von maximal drei größer
war als die der Lipoxygenase. Hier spielen wahrscheinlich andere Abbauwege für die
Hydroperoxifettsäuren eine Rolle (Abbildung 54).
88
Abbildung 54: Schema des enzymatischen Abbaus von Hydroperoxifettsäuren durch die bisher bekannten Enzyme, AOS = Allenoxid-Synthase, DES = Divinylether-Synthase, HPL = Hydroperoxid-lyase, EAS = Epoxyalkohol-Synthase, POX = Peroxygenase, RED = Reduktase
Hydroperoxifettsäuren können neben der HPL von sechs weiteren unterschiedlichen
Enzymen als Substrat genutzt werden. Die geringen Konzentrationen der Hydroperoxi-
fettsäuren sind daher auch auf einen schnellen Abbau durch mehrere der sieben Enzyme
zurückzuführen, die alle um das Substrat konkurrieren. Unabhängig davon, mit welchen
jeweiligen Anteilen die von der Lipoxygenase gebildeten Hydroperoxide von den
unterschiedlichen nachfolgenden Enzymen verarbeitet werden, ist ihre Produktion
offensichtlich limitierend für die Emission der GLAs. Dies kann die gute Korrelation
zwischen der Lipoxygenaseaktivität und den Emissionen erklären.
Berechnung der theoretisch möglichen Emissionsstärken
Tabelle 15 zeigt anhand eines Beispiels die Berechnung des Potentials zur Bildung von
GLAs. Zur Berechnung wurden mittlere Werte der Blattfläche, des Gesamtproteingehaltes
und Enzymaktivität sowie eine mittlere gemessene GLA-Emission herangezogen.
Tabelle 15: Potential der gemessenen Enzymaktivitäten Akitvität 0,002 mol*s-1/g ProteinExtrahiertes Protein 5 mg/g FGGewicht Pflanze 15 gUmsatzkapazität pro Pflanze 0,00015 mol*s-1
Typische Flussdichte 3,50E-10 mol*m-2*s-1
Blattfläche 0,075 m2
Fluss aus Pflanze 2,63E-11 mol*s-1
Faktor 5,71E+06
89
Die in den Experimenten gemessene mittlere Emission der Summe der GLAs liegt um einen
Faktor von fast 6E+06 unter der theoretisch möglichen Emissionsstärke.
Abbildung 40 enthält alle gemessenen Lipoxygenaseaktivitäten und die Extremwerte zeigen,
dass bei einer Lipoxygenaseaktivität in derselben Größenordung die Emissionsstärke der
GLAs um mehr als eine Größenordnung ansteigen kann. Eine in sich konsistente Hypothese
zur Erklärung der stark erhöhten Emissionen, trotz etwa gleich bleibender Aktivität der
Lipoxygenase, ist ein bei sehr starker Stressapplikation verringerter Abbau der
Hydroperoxide in den zur HPL parallelen Abbauwegen.
Das Potential der LOX-Aktivität und das der HPL-Aktivität zur Produktion der GLAs war
sehr viel höher als die gemessenen Emissionen der aus diesen Hydroperoxiden gebildeten
VOCs (Tabelle 15). Damit muss es auch während der Versuche mit relativ milder
Stressapplikation Wege geben, auf denen die Hydroperoxide abgebaut werden ohne dass es
zur Emission der GLAs kommt. Der Abbau der Hydroperoxifettsäuren über die anderen sechs
zur HPL parallelen Kanäle spielt dabei wahrscheinlich die wichtigste Rolle. Eine durch den
erhöhten Stress verursachte Erniedrigung der Aktivität einer oder mehrerer der mit der HPL
um die Hydroperoxide als Substrat konkurrierenden Enzyme könnte die Erhöhung der
Emissionsstärke der GLAs ohne ähnlich starke Erhöhung der Lipoxygenaseaktivität erklären.
Würde die HPL- Aktivität durch die erhöhte Stressapplikation nicht reduziert oder zumindest
weniger als die Aktivitäten der Enzyme in den anderen sechs Wegen, wäre eine verstärkte
Emission bei ähnlicher Lipoxygenaseaktivität die Folge. Welcher der konkurrierenden Wege
herunterreguliert wird, kann hier nicht angeführt werden, da eine Messung aller um die
Hydroperoxide konkurrierenden Enzymaktivitäten im Zeitrahmen dieser Arbeit nicht möglich
war.
Obwohl die Aktivitäten dieser sechs Enzyme nicht bestimmt wurden, lassen sich aus der
Korrelation zwischen Lipoxygenaseaktivität und Emissionen für Bedingungen geringen
Stresses Schlüsse über diese Aktivitäten ziehen. Eine Korrelation der Lipoxygenaseaktivität
mit den Emissionen ist nur dann möglich, wenn immer der gleiche Anteil der aus der
Lipoxygenase gebildeten Hydroperoxifettsäuren von der HPL weiter verarbeitet wird. Als
Ursache dafür kommen zwei Möglichkeiten in Betracht. Entweder ändern sich alle
Enzymaktivitäten unabhängig voneinander und der Anteil der von der HPL weiter
verarbeiteten Hydroperoxifettsäuren bleibt rein zufällig konstant. Die andere Möglichkeit ist
die, dass alle sieben Enzymaktivitäten sich unter milder Stresseinwirkung ähnlich stark
ändern und damit die Kanalverhältnisse der einzelnen Wege konstant sind. Bei insgesamt
sieben möglichen Parallelwegen ist die erste Möglichkeit unwahrscheinlich. Eher
90
wahrscheinlich scheint ein gekoppeltes System, bei der sich die Aktivitäten der hier
beteiligten Enzyme ähnlich stark ändern.
Verhältnisse der Enzymaktivitäten untereinander: Da die Enzyme des Octadecanoidweges in einer Kaskade in Reihe geschaltet sind, könnte die
Induktion eines Enzyms auch die Aktivität des nachfolgenden Enzyms beeinflussen. Alle im
Octadecanoidweg gemessenen Enzymaktivitäten konnten durch Stress induziert werden. Die
Frage, ob dabei alle beteiligten Enzyme nach der Stresseinwirkung ähnlich stark induziert
werden, ist nur schwierig zu beantworten. Ein Problem stellen dabei die unterschiedlichen
Zeiten der Beprobung nach den Ozonexpositionen dar. Da die Emissionen der GLAs nach
plusförmiger Stressapplikation (Ozon) als Puls auftreten, ist mit der Auflösung des genutzten
GC/MS-Systems nicht bestimmbar, in welchen Bereich des Pulses die Pflanzen zur Messung
der Enzymaktivitäten ausgebaut wurden. Aufgrund der plusförmigen Emission der GLAs ist
auch für die Enzymaktivitäten eine plusförmige Induktion zu erwarten, daher spielt der
Zeitpunkt des Ausbaus für ihre jeweiligen Aktivitäten eine wichtige Rolle. Trotzdem wurde
versucht die Enzymaktivitäten untereinander zu korrelieren. Die Abbildungen 55 und 56
zeigen die Aktivitäten der Lipase als Funktion der Lipoxygenase bzw. die Aktivitäten der
Hydroperoxidlyase als Funktion der Lipoxygenase. Da nicht in allen Experimenten alle
Enzymaktivitäten gemessen werden konnten (wenig Probenmaterial), ist die Anzahl der
Datenpunkte in den Abbildungen 55 und 56 unterschiedlich.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
LOX Aktivität [nmol s-1 mg-1 Protein]
LIP
Akt
ivitä
t [nm
ol s
-1 m
g-1 P
rote
in]
Abbildung 55: Lipaseaktivität in Abhängigkeit von der Lipoxygenaseaktivität
91
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
LOX Aktivität [nmol s-1 mg-1 Protein]
HP
L A
ktiv
ität [
nmol
s-1
mg-1
Pro
tein
]
Abbildung 56: Hydroperoxidlyaseaktivität in Abhängigkeit von der Lipoxygenaseaktivität, rot markiert = Messungen bei denen die Emissionsstärke der GLAs stark erhöht war In beiden Abbildungen zeigt sich ein Trend. Je größer die Aktivität des in der Sequenz jeweils
vorhergehenden Enzyms ist, umso größer scheint auch die Aktivität des in der Sequenz
nachfolgenden Enzyms zu sein.
Da durch die Ozonexposition ein Stresspuls gesetzt wurde, kann nicht ausgeschlossen
werden, dass die Korrelationen der Enzymaktivitäten untereinander durch die zeitliche
Abfolge der Einzelprozesse bzw. unterschiedliche Induktionszeiten der einzelnen Enzyme
beeinflusst werden. Wird beispielsweise zuerst die Lipoxygenase und später die
Hydroperoxidlyase induziert, kann das Verhältnis der Aktivitäten der Enzyme untereinander
eine Funktion der Zeit sein. Zur Kontrolle wurde dieses Verhältnis berechnet und gegen die
Zeit der Probennahme nach Beginn der Ozonexposition aufgetragen. Dabei wurde aber kein
Trend ersichtlich (Abbildung 57). Daraus lässt sich schließen, dass der Ausbauzeitpunkt für
das Verhältnis der Enzymaktivitäten untereinander keine Rolle spielt, oder zumindest nicht
gezeigt werden kann, weil die Zeitauflösung des vorhandenen Systems nicht ausreicht.
92
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Ausbau nach Beginn der Ozonexposition [min]
Ver
hältn
is A
ktiv
ität H
PL/
LOX
Abbildung 57: Auftragung des Verhältnisses der Aktivitäten der HPL zur LOX gegen den Ausbauzeitpunktes nach Beginn der Ozonexposition
Insgesamt zeigt sich anhand der Abbildungen (55 und 56), dass die Induktion der Aktivitäten
nicht völlig unabhängig voneinander ist. Eine Kopplung der Enzymaktivitäten an die
Aktivitäten des jeweiligen Vorläuferenzyms könnte dabei durch die Verfügbarkeit der
Zwischenprodukte hervorgerufen werden. Diese Zwischenprodukte sind Produkte der
Vorläuferenzyme und gleichzeitig Substrate für die nachfolgenden Enzyme. Die
Substratverfügbarkeit ist wahrscheinlich bei der Lipoxygenase nicht ausschlaggebend für
deren Aktivierung, da in allen gemessenen Pflanzen große Mengen an freien Fettsäuren
gefunden wurden (siehe Seite 85). Es waren kaum Unterschiede zwischen den
Konzentrationen freier Fettsäuren in gestressten und ungestressten Pflanzen zu finden
(Tabelle 13). So könnte auch erklärt werden, dass die Emissionen der GLAs eher mit den
Aktivitäten der Lipoxygenase korreliert sind als mit denen der Lipase, obwohl die Aktivitäten
der Lipase geringer sind als die der Lipoxygenase. Wären die von der Lipase produzierten
freien Fettsäuren direkt für die Lipoxygenase verfügbar, sollte die Lipaseaktivität
geschwindigkeitsbestimmend für die Emissionen sein und es müsste hier eine Korrelation
gefunden werden. Das war nicht der Fall.
Auch die HPL-Aktivität könnte durch die Substratverfügbarkeit induziert werden [Vacanneyt
et al., 2001]. Dafür spricht auch der deutlich zu erkennende Trend in Abbildung 56. Je höher
die Lipoxygenaseaktivität ist, desto mehr Substrat sollte der HPL zur Verfügung stehen. Der
93
in Abbildung 52 zu erkennende Trend ist zwar kein Beweis dafür, dass die HPL über die
Substratverfügbarkeit induziert wird, die hier vorliegenden Daten sind aber konsistent mit
dieser Annahme.
Theoretische Betrachtung:
Die Frage nach dem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in einem Mehrenzymsystem
wurde bereits 1981 von Kacser und Burns theoretisch analysiert. Die in dieser Arbeit
beschriebene Sequenz folgt den Kirchhoff'schen Regeln für Serienleitwerte/-widerstände. Sie
beschreiben in ihrer Arbeit ein System, in dem nur eine Größe (hier Enzymaktivität) variiert
wird, während die anderen festgehalten werden (Abbildung 58). Vorausgesetzt wird in dieser
Arbeit, dass die Bildung des Produktes durch die Enzymaktivität gegeben ist und nicht durch
die Substratverfügbarkeit.
Betrachtet man ein Ein-Enzym-System erhält man einen linearen Zusammenhang zwischen
der Enzymaktivität und dem daraus entstehenden Produkt (hier GLA Emissionen). In dem in
dieser Arbeit untersuchten Drei-Enzym-System hängt das Ergebnis (hier die Emission an
GLAs) allerdings nicht alleine von einer der Enzymaktivitäten ab.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Aktivität Enzym x (hier Lipoxygenaseaktivität)
Aus
beut
e (h
ier
Sum
me
der
GLA
-Em
isio
nen)
3-Enzymsystem
1-Enzymsystem
Abbildung 58: Veränderung der prozentualen Ausbeute von Enzymsystemen bei Variation eines Enzyms nach Kacser und Burns Die Variation nur einer dieser Enzymaktivitäten führt nach Kacser und Burns ab einer
bestimmten Enzymaktivität zu keiner signifikanten Erhöhung des Produktes
(Emissionserhöhung). Die Aktivitäten von zwei Enzymen werden auf den Wert 1 gesetzt
94
(maximale Enzymaktivität) und festgehalten, während die dritte Enzymaktivität von 0 – 1
variiert wird. Würde also in der in Abbildung 53 gezeigten Kaskade nur eine der
Enzymaktivitäten variiert, sollte man nicht unbedingt einen linearen Zusammenhang
zwischen einer der Enzymaktivitäten und der GLA-Emission erwarten. Die Messungen in
dieser Arbeit haben allerdings gezeigt, dass die Enzymaktivitäten in dieser Sequenz nicht
vollkommen unabhängig voneinander sind. Auch wenn die Korrelationen der
Enzymaktivitäten untereinander nicht sehr gut sind (Abbildung 55 und 56), verhalten sie sich
in Abhängigkeit von der Stressdosis ähnlich. Ein strikt gekoppeltes Mehr-Enzymsystem
verhält sich wie ein Ein-Enzymsystem, d.h. die Durchsätze sind – wenn das System nicht
substratlimitiert ist - proportional zu den Enzymaktivitäten. Dann ergibt sich ein linearer
Zusammenhang zwischen der Summe der Enzymaktivitäten und dem Fluss an GLAs aus der
Pflanze.
Die Korrelationen der Enzymaktivitäten untereinander waren nicht so strikt, dass eine sehr
starke Kopplung vermutet werden konnte. Daher wurde versucht die Linearität des Systems
über die in den Experimenten erhaltenen Kopplungen der Enzymaktivitäten abzuschätzen. Die
Aktivitäten der Hydroperoxidlyase und Lipase wurden aus den jeweiligen
Geradengleichungen ihrer Auftragung gegen die Lipoxygenaseaktivität berechnet.
Abbildung 59 zeigt die Auftragung der GLA-Emissionen gegen die Aktivität des
Lipoxygenaseenzyms wie sie im untersuchten System zu erwarten wäre.
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Aus
beut
e (S
umm
e de
r G
LA E
mis
sion
en)
Lipoxygenaseaktivität
Abbildung 59: Veränderung der Flussausbeute, Lipoxygenaseaktivität variiert von 0,01 – 1
95
Es zeigt sich ein großer Bereich des linearen Zusammenhangs zwischen den
Enzymaktivitäten und der Emissionsausbeute, wie es nach der Reduktion zu erwarten ist. Es
ist aber auch ein positiver Achsenabschnitt zu erkennen. Dieser Achsenabschnitt ist dadurch
begründet, dass bei einer nach 0 extrapolierten Lipoxygenaseaktivität noch Lipaseaktivität
vorhanden ist (Achsenabschnitt der Auftragung LOX-Aktivität gegen LIP-Aktivität,
Abbildung 55). Daher ist die Steigung in dieser Berechnung auch nicht eins wie im
theoretischen Model von Kacser und Burns.
Die Berechnungen zeigen zwar, dass das System sich einer Einenzymsystem annähert; der
eigentliche Grund für die im Experiment gefundene Linearität ist aber die parallel zur Bildung
der GLAs erfolgende Abreaktion der Hydroperoxifettsäuren (Abbildung 53) zu anderen
Produkten.
Die Ausbeute an GLAs (Emissionsflussdichte) liegt in der Regel < 0,001 der potentiellen
Ausbeute (Tabelle 15). Unter der Annahme, dass die Lipoxygenaseaktivität nicht
substratlimitiert ist, sollten damit etwa 1000 mal mehr der Hydroperoxifettsäuren in einem
anderen Weg abgebaut werden, als über die Hydroperoxidlyase zu den GLAs. Das Drei-
Enzymsystem ist also in diesem Schritt substratlimitiert. Demnach kann die HPL-Aktivität
auch keine wesentliche Rolle spielen. Damit reduziert sich das System auf ein Zwei-
Enzymsystem, welches zudem noch gekoppelt ist. Viele ältere Arbeiten und auch die
Ergebnisse in dieser Arbeit (Tabelle 13) zeigen, dass immer genug Substrat (freie Fettsäuren)
für die Lipoxygenase vorhanden ist, somit erhält man ein Ein-Enzymsystem. Daher ist der
lineare Zusammenhang zwischen Lipoxygenaseaktivität und den GLAEmissionen zu
verstehen.
Die Bildung der GLAs durch die Hydroperoxidlyase ist substratlimitiert. Die als Substrat für
die Hydroperoxidlyase dienenden PUFAs werden in den zur Hydroperoxidlyase parallelen
Wegen sehr viel effizienter abgebaut als über die Hydroperoxidlyase selber. Damit ist die
Bildung der Hydroperoxide für die Emissionen der GLAs und somit die LOX-Aktivität
geschwindigkeitsbestimmend.
96
6.3 Korrelationen zwischen MeSA – Emissionen und dem Gehalt an freier Salicylsäure in den Tomatenpflanzen
Die Erhöhung der pflanzeninternen Salicylsäurekonzentration nach Stress ist seit langem
akzeptiert [Chen et al., 1993 und 1995; Conrath et al., 2001] und auch die Erhöhung der
MeSA-Emissionen nach Stress wurde in einigen Arbeiten beschrieben [Shulaev et al., 1997;
De Boer et al., 2004; Shimoda et al., 2002, Chen et al., 2003].
Die im Verlauf der Versuche gemessenen Tomatenpflanzen emittierten neben Monoterpenen
und Caryophyllen in vielen Fällen auch schon vor der Stressapplikation
Salicylsäuremethylester. Die Menge der gemessenen Emissionen variierte dabei um mehrere
Größenordnungen. Warum einige Tomatenpflanzen sehr viel MeSA emittiert haben und
andere Pflanzen kaum messbare Emissionen zeigten, ist nicht bekannt.
Unabhängig von der Ursache der MeSA-Emissionen sollte aber ein Zusammenhang zwischen
der MeSA-Emission und dem Gehalt an freier Salicylsäure in den Pflanzen vorhanden sein.
MeSA wird in einem Schritt durch eine Methylierungsreaktion aus Salicylsäure gebildet. Die
MeSA-Emission sollte daher sowohl proportional zur SA-Konzentration als auch proportional
zur Effektivität des Methylierungsschrittes sein. Wird die Effektivität des
Methylierungsschrittes nicht stark geändert (z. B. bei PAR und T = konstant), sollte die
MeSA-Emission proportional zur SA-Konzentration sein. Zur Überprüfung dieser Vermutung
wurde aus einigen Versuchspflanzen der Gehalt an freier SA mittels HPLC gemessen (Kapitel
4.9) und mit der Stärke der MeSA-Emission verglichen.
Wie schon im Ergebnisteil erwähnt, ist die Quantifizierung von SA aus dem Pflanzenmaterial
bei kleinen SA–Gehalten schwierig. Die benutze Methode dient zur Bestimmung von
phenolischen Inhaltstoffen des Shikimatweges und ist nicht spezifisch zur Bestimmung von
SA entwickelt worden. Daher war eine exakte Bestimmung der Gehalte an freier SA im
unteren Konzentrationsbereich schwierig. Um die erhalten Daten weiter zu festigen wurde
daher die Standardadditionsmethode verwendet; sie vereinfachte die qualitative und auch
quantitative Bestimmung der SA-Konzentrationen (Daten nicht in Arbeit). Abbildung 41 zeigt
die Korrelation zwischen den SA-Konzentrationen und den MeSA-Emissionen. Es lässt sich
ein deutlicher Trend erkennen – je mehr freie SA in der Pflanze vorhanden war, desto größer
waren die gemessenen MeSA – Emissionen. Dieser Befund ist noch kein Beweis für einen
direkten Zusammenhang, er stützt allerdings die oben beschriebe Hypothese. Auch in
früheren Arbeiten [Seskar, 1998] wurde bereits eine parallele Erhöhung der MeSA-Emission
und Gehalt an freier SA beschrieben. Allerdings wurde in dieser Arbeit die gesamte SA-
97
Menge im Blatt bestimmt (freie SA und SAglycosid). Zur genaueren Bestimmung dieses
hypothetischen Zusammenhangs müssen allerdings weitere Untersuchungen mit spezifisch
zur SA Bestimmung entwickelten Methoden durchgeführt werden [Wilbert el al., 1998;
Rasmussen et al., 1991; Martinez et al., 2000] oder stark gestresste Pflanzen zur Messung
herangezogen werden, um eine größere MeSA-Emission und somit größere SA-
Konzentration in den Pflanzen zu finden.
6.4 Markierungsversuch Neben der Neuemission der GLAs kam es zu einer Erhöhung der Monoterpenemissionen,
sowie zur Erhöhung, bzw. Neuemission von MeSA und TMTT.
Monoterpene
Der Markierungsversuch zeigte, dass der Einbau von 13C in die aus Tomate emittierten
Monoterpene recht schnell erfolgt. Das deutet darauf hin, dass zumindest ein Teil der
emittierten Monoterpene direkt an deren Biosynthese aus dem aufgenommenen CO2
gekoppelt ist. Wegen der Stressapplikation ca. 2h nach Begin der 13CO2 wurde der steady
state Zustand nicht erreicht (Abbildung 48). Da hier nur untersucht werden sollte, welche
Substanzen über direkte Biosynthese gebildet werden und welche nicht, spielt das allerdings
keine Rolle.
Stattdessen kam es während des stressinduzierten Pulses der Monoterpenemissionen zu einer
starken Verringerung der Markierung der Monoterpene. Diese Veringerung ist zu erwarten,
wenn die Emission der Monoterpene zu diesem Zeitpunkt entweder aus einem Speicher
stammt oder ihre Synthese aus einem Substrat erfolgt, für das eine recht lange Umsatzzeit für
Kohlenstoff vorliegt.
Starke Erhöhungen von Monoterpenemissionen wurden auch bei Versuchen gefunden, bei
denen Trichome an den Stängeln oder Blätter durch Berührung zerstört wurden (Jansen et al.,
im Druck). Auch hier wurden die Monoterpene in der gleichen Verteilung emittiert wie ohne
offensichtliche Stresseinwirkung. Die guten Korrelationen der Monoterpenemissionen
untereinander blieben immer erhalten. Das legt die Vermutung nahe, dass es sich bei den nach
Ozonexpositionen oft gesehenen Erhöhungen der Monoterpenemissionen um einen
sekundären Prozess handelt.
Wahrscheinlich werden durch die Bildung von Nekrosen als Folge der Reaktion der Pflanzen
auf die Ozonexposition auch die auf den Blättern befindlichen Trichome zerstört. Diese sind
ein Speicher für Monoterpene [Nicoletti et al., 1988; Chamy et al., 1989; Wollenweber et al.,
98
1989] und ihre bei der Nekrosenbildung erfolgende Zerstörung kann zu einer vermehrten
Abgabe der gespeicherten Monoterpene führen. Geschieht das während einer Exposition mit 13CO2 muss sich die Markierung der emittierten Monoterpene verringern. Ein Großteil der in
den Trichomen abgespeicherten Monoterpene wurde vor der 13CO2 Exposition gebildet und
ist daher nicht mit 13C angereichert. Eine vermehrte Freisetzung dieser gespeicherten
Monoterpene sollte zu der im Experiment beobachteten Verringerung des Verhältnisses M/U
(Abbildung 48) führen.
Wie in Abbildung 46 zu sehen, liegt eine bimodale Verteilung für die Verteilung der 13C-
Atome vor und anhand der Abbildung 48 ist die erwartete Verringerung des Verhältnisses
M/U zu erkennen. So lange wie sowohl neu aus dem aufgenommenen 13CO2 synthetisierte
Monoterpene und die aus zerstörten Trichomen verdampfenden Monoterpene gleichzeitig
emittiert werden, sollte sich auch eine bimodale Verteilung zeigen. Ein Maximum muss in
diesem Fall bei dem unmarkierten Molekülion liegen. Ein anderes Maximum bei größeren
Massen, wobei die genaue Lage dieses zweiten Maximums von der Expositionszeit abhängt.
Offensichtlich wird die Erhöhung der Monoterpenemissionen aus Tomate nach Exposition
mit Ozon oder Infektion mit Botrytis cinerea nicht durch einen Trigger der de novo Synthese
durch ein pflanzeninternes Signalmoleküle wie JA induziert. Hier handelt sich überwiegend
um einen rein mechanisch hervorgerufenen Effekt. Auch wenn die Ergebnisse des
Markierungsexperimentes kein eindeutiger Beweis für diese Hypothese sind, handelt es sich
um eine konsistente Hypothese.
Andere Arbeiten zeigten hingegen nur eine geringe [Connor et al., 2008] oder keine Erhöhung
der 13C-Markierung der emittierten Monoterpene [Farag und Paré, 2002]. In der Arbeit von
Connor et al. (2008) wird die Messung erst 10 Stunden nach Beendigung der 13CO2-
Exposition gestartet. 10h nach Beendigung der 13CO2 Exposition ist auch nur eine geringe
Markierung zu erwarten. Die Emissionen der Monoterpene deren Biosynthese eng mit der
CO2 -Aufnahme gekoppelt ist können in diesem Fall keine starke Markierung zeigen und die
Emissionen von Monoterpenen aus Trichomen sollten ohnehin nur eine geringe Markierung
aufweisen. Farag und Paré (2002) setzten in ihrer Arbeit nur kuze 13CO2-Pulse (3h, 360 ppm)
und sie vermuteten selber, das die Markierung aufgrund der großen Emissionen aus den Pools
(Trichome) evtl. nicht zu detektieren war.
99
MeSA
Auch die recht schnelle Markierung von MeSA zeigt, dass zumindest ein Teil der Salicylsäure
sehr schnell aus dem aufgenommenen CO2 gebildet wird. Die Differenz der Markierungen
des Molekülions und des C7-Fragments zeigen, dass zumindest während der ersten 2 Stunden
unter 13CO2-Exposition die Methylgruppe die stärkere Markierung aufwies. Das für die
Methylierung der SA genutzte Kohlenstoffatom kommt hauptsächlich direkt aus dem
aufgenommenen CO2.
Interessanter für Erkenntnisse bezüglich der Biosynthese von SA ist hier aber die
Isotopenverteilung im C7-Fragment von MeSA. Diese weist eine bimodale Verteilung auf.
Ein Maximum besteht dabei für das unmarkierte Fragment, das andere für das vollständig
markierte Fragment (Abbildung 51).
Benzoesäure*
PhenylalaninChorismat
Benzoesäure-methylester
Salicylsäure
Salicylsäuremethylester
Indol
Tryptophan
Salicylsäure
Zimtsäure
Cumarsäure
Isochorismat
Abbildung 60: Schematische Darstellung der Biosynthese von MeSA, *verschiedene Benzoesäurederivate
Da die Markierung im C7-Fragment von MeSA die Markierung der SA wiederspiegelt,
müssen auch für die Isotopenverteilung der Salicylsäure zwei Maxima vorliegen. Das ist zu
erklären wenn mehrere Wege zur Bildung der Salicylsäure oder deren Vorläufermolekülen
führen. (Abbildung 60).
Wird SA in der ozonexponierten Tomate über mehrere Wege gebildet, können
unterschiedliche Umsatzzeiten für den aus dem CO2 aufgenommenen Kohlenstoff in diesen
beiden Wegen die bimodale Verteilung erklären. Einer dieser Wege muss dann eine sehr
kurze Umsatzzeit von weniger als drei Stunden haben.
100
Die in Abbildung 51 gezeigte nahezu identische Verteilung der 13C-Atome in den C7-
Fragmenten von Benzoesäuremethylester und Salicylsäuremethylester spricht dafür, dass
MeSA hauptsächlich über Benzoesäure gebildet wird. Auch Yalpani et al. (1993) und Mewly
et al. (1995) stellten fest, dass SA in Tabak und Gurke über Benzoesäure gebildet wird.
Allerdings könnten auch Derivate der Benzoesäure Vorläufer der SA sein. Da hier nur die
Markierung des C7 – Fragmentes betrachtet wird, spielt es keine Rolle, ob der
Benzoesäuremethylester bzw. die Salicylsäure direkt aus Benzoesäure gebildet wird oder aus
einem Benzoesäurederivat.
Es ist nicht auszuschließen, dass SA auch über Cumarsäure gebildet werden kann [Yalpani et
al., 1993; Mewly et al., 1995]. Gemeinsamer Vorläufer von Cumar- und Benzoesäure ist aber
Phenylalanin und für Phenylalanin sind große Pools beschrieben [z. B. Holländer und
Amrhein, 1981]. Damit wäre bei einer Produktion über Phenylalanin eine geringe Markierung
von SA zu erwarten.
Anhand von Abbildung 51 ist auch zu erkennen, dass sich das Markierungsmuster im
Salicylsäuremethylester von dem des Benzoesäuremethylesters leicht unterscheidet. Bei
ansteigender Anzahl an C-Atomen ist die Markierung der MeSA etwas höher als die im
Benzoesäuremethylester. Da es sich bei den Messungen zur Isotopenverteilung um
Relativmessungen handelt, ist der Fehler, den diese Verteilungen beinhalten, gering. Eine
Bestimmung dieses Fehlers zeigt, dass der in Abbildung 51 gezeigte Unterschied signifikant
ist.
Eine Möglichkeit zur Erklärung dieses Unterschieds wäre ein wenn auch geringer Beitrag zur
Synthese des aromatischen Ringes von MeSA über einen weiteren Weg. Dieser Beitrag sollte
über einen Weg laufen, bei dem nur kleine Pools für die Vorläufer vorliegen und der
Kohlenstoff zur Synthese direkt aus dem aufgenommenen CO2 stammt. Eine
Erklärungshypothese ist hier eine gleichzeitige Produktion von SA sowohl über Isochorismat
als auch über Phenylalanin. Wird angenommen, dass der überwiegende Teil von SA zwar
über Phenylalanin gebildet wird, ein geringer Teil (wenige Prozent) aber über Isochorismat,
sollte sich ein Unterschied im Markierungsgrad zwischen dem C7-Fragment des
Benzoesäuremethylesters und der MeSA zeigen. Somit würde SA über einen stark markierten
und einen weniger stark markierten Vorläufer gebildet. Voraussetzung für die Gültigkeit
dieser Hypothese ist aber ein Weg zur Bildung der SA, bei dem ein schneller Austausch des
Kohlenstoffs stattfindet. Der Markierungsgrad dieses Vorläufers muss dann höher sein als
der des Benzoesäuremethylesters.
101
Abbildung 52 zeigt einen Vergleich der Markierungsmuster von MeSA und Indol. Indol ist
deutlich stärker markiert als die MeSA. Da Indol aus Chorismat gebildet wird und eine
Markierung in der Regel mit fortschreitender Synthese von Produkten nur geringer werden
kann, sollte Chorismat mindestens so stark markiert sein wie Indol.
Nach Wildermuth et al.( 2001) kann SA auch über Isochorismat aus Chorismat synthetisiert
werden. Die Bildung von SA über Isochorismat verläuft in 2 Schritten. Der erste Schritt ist
die Isomerisierung des Chorismats zum Isochorismat. Der zweite Schritt ist die Abspaltung
von Pyrovat von einer Seite des aromatischen Ringes im Isochorismat. Im ersten Schritt ist
keine Verminderung des Markierungsgrades zu erwarten, da hier nur eine Isomerisierung
stattfindet. Auch im zweiten Schritt ist keine starke Erniedrigung des Markierungsgrades zu
erwarten. Der Ring des Isochorismats bleibt erhalten und bildet den Ring der SA. Die über
Isochorismat gebildete SA muss also eine starke Markierung des Ringes aufweisen wenn SA
nur über diesen Weg gebildet würde. Im Vergleich zum Indol ist MeSA nur schwach
markiert. Würde im hier betrachteten Fall die SA hauptsächlich über Isochorismat gebildet,
wäre diese im Vergleich zum Indol geringe Markierung der SA nur dann zu verstehen, wenn
für SA selbst ein großer Pool vorhanden wäre, der nur langsam ausgetauscht wird. Die über
Isochorismat gebildete SA mit ihrer starken Markierung würde im großen Pool vorhandener,
nicht markierter SA verdünnt.
Dann wäre aber die Ähnlichkeit der Markierung im MeSA und im Benzoesäuremethylester
rein zufällig. Die Verringerung des Markierungsgrades im vorhandenen großen SA-Pool
müsste zufällig die gleiche Verteilung der 13C - Atome im Ring der SA ergeben wie die in der
Benzoesäure. Ein solcher Zufall ist unwahrscheinlich. Eher wahrscheinlich ist hier, dass nach
Ozonexposition von Tomate SA über zwei Wege gebildet wird. Die SA - Bildung erfolgt
überwiegend über das Phenylalanin. Auf dem Weg vom Chorismat über Phenylalanin zur SA
findet eine Verringerung des Markierungsgrades statt, wahrscheinlich durch einen großen
Pool schon vorliegenden Phenylalanins bzw. Benzoesäure oder Coumarinsäure. Große Pools
für Phenylalanin bzw. Benzoesäure selbst und eine hauptsächliche Produktion der SA über
Phenylalanin könnten sowohl die Ähnlichkeit in der Markierung von Benzoesäuremethylester
und MeSA als auch die bimodale Verteilung der Markierung im Ring von MeSA erklären.
Der leichte Unterschied zwischen der Verteilung im Ring der SA und in der Benzoesäure
kann durch einen geringen Anteil der SA-Bildung über Isochorismat erklärt werden. Dieser
Anteil an der SA-Bildung ist für Tomate nach Ozonexposition allerdings nur wenige %.
102
Ein fester Wert für diesen Anteil kann hier nicht gegeben werden. Der Zeitverlauf des
Markierungsgrades der MeSA (Abbildung 50) liefert einen Hinweis darauf, dass dieser Anteil
nicht konstant ist. Der Markierungsgrad des MeSA-Ringes steigt während der ersten Zeit
unter 13CO2-Exposition stark an, sinkt bei Einsetzen des MeSA-Emissionspulses leicht ab und
steigt mit Absinken des MeSA-Emissionspulses wieder leicht an.
Nach Abbildung 41 korrelieren SA - Konzentration und MeSA - Emission. Daher sollte der
Zeitverlauf der MeSA - Emission den Zeitverlauf der SA - Konzentration reflektieren. Zu
Beginn der 13CO2 Exposition war die Pflanze keinem starken Stress ausgesetzt. Daher ist
verständlich, dass die MeSA - Emission bzw. SA - Konzentration vor der Ozonexposition
sehr gering war. Parallel zum Anstieg der MeSA - Emission nach der Ozonexposition sollte
auch die SA - Konzentration steigen und etwa vier Stunden nach der Ozonexposition ihr
Maximum erreichen. Danach war die Senkenstärke für SA größer als die Quellstärke und die
SA - Konzentrationen bzw. MeSA - Emissionen sinken. Das würde bedeuten, dass die
Produktion der Salicylsäure hauptsächlich innerhalb der ersten Stunden nach der
Stressapplikation stattfindet.
Auffallend ist, dass das erste leichte Absinken des Markierungsgrades des C7-Fragments
parallel zum Anstieg der MeSA-Emission verläuft, der leichte Anstieg des Markierungsgrades
nach Beendigung der 13CO2-Exposition parallel zum Absinken der MeSA-Emission
(Abbildung 50). Dieses Verhalten deutet darauf hin, dass SA während seiner verstärkten
Bildung direkt nach der Ozonexposition stärker aus 12C synthetisiert wird als vorher oder
nachher. Eine Verschiebung der Anteile der SA, die über Phenylalanin und über Isochorismat
gebildet werden, wäre eine konsistente Erklärungshypothese. Wird bei der verstärkten
Bildung von SA primär der Weg über Phenylalanin zur Bildung der SA genutzt, der Weg über
Isochorismat nicht so stark, ist der gezeigte Zeitverlauf im 13C/12C Verhältnis zu erwarten und
zu erklären.
103
GLAs
In den hier beschriebenen Messungen zeigten die GLAs keine signifikante Markierung.
Allerdings fanden Connor et al. (2008) eine starke Markierung der GLAs. Dies könnte an den
unterschiedlichen Versuchsbedingungen liegen (Connor et al. (2008) benutzen sehr hohe 13CO2-Konzentrationen, 900 ppm für 32h).
Für die in dieser Arbeit gewählten Versuchsbedingungen ist eine Markierung der GLAs nicht
zu erwarten, da sie aus Membranlipiden gebildet werden für deren Neusynthese Zeit benötigt
wird. Der überwiegende Teil wurde schon lange vor der 13CO2-Exposition synthetisiert. Die
während der 13CO2-Exposition neu synthetisierten Membranen enthalten zwar 13C-Atome,
wird aber die gesamte Menge an Membranen betrachtet ist der Markierungsgrad gering.
104
7. Zusammenfassung
Pflanzen können Duftstoffe aus ihren Blüten, Blättern und Früchten emittieren, die den
Pflanzen als Lockstoffe, Abwehrstoffe oder Signalsubstanzen dienen können. Viele Pflanzen
emittieren konstitutiv eine Reihe verschiedener Mono- und Sesquiterpene. Drüber hinaus gibt
es aber auch induzierbare Emissionen. Die Einwirkung von Stressoren wie z. B. Fraßfeinden,
Bakterien, Pilzen oder Ozon führt in Pflanzen zur Neusynthese und Emission von
Abwehrstoffen und Signalmolekülen. Diese werden hauptsächlich über den Octadecanoid-
und Shikimatweg gebildet. Im Octadecanoidweg werden Alkohole und Aldehyde
(überwiegend C6-Verbindungen) ausgehend von freien Fettsäuren über eine Enzymkaskade
(Lipase, Lipoxygenase, Hydroperoxidlyase) gebildet und emittiert.
Der Shikimatweg ist wichtig für die Bildung des wichtigen Pflanzenhormons Salicylsäure
(SA). Nach anschließender Methylierung kann SA als das flüchtige Salicylsäuremethylester
(MeSA) in die Atmosphäre emittiert werden.
Ziel dieser Arbeit war, bei der Modellpflanze Tomate (cv. Moneymaker) zu prüfen, inwiefern
stressinduzierte Emissionen Rückschlüsse auf bestimmte stressinduzierte pflanzeninterne
Enzymaktivitäten oder Substratkonzentrationen zulassen. Das würde eine nicht invasive
Messung solcher pflanzeninterner Größen erlauben.
Zum einen sollte geprüft werden, ob sich die Emissionen von Blattalkoholen und –aldehyden
(GLA: green leaf alcohols/aldehydes) eignen, Aussagen über die Enzymaktivitäten der
Lipase, Lipoxygenase und Hydroperoxidlyase oder über Substratkonzentrationen im
Octadecanoidweges zu treffen. Die Messung der GLAs erfolgte online mittels GC/MS, die
Zwischenprodukte (freie Fettsäuren, Hydroperoxyfettsäuren) wurden mittels HPLC gemessen
und die Enzymaktivitäten mittels UV/VIS-Spektrometrie. Eine gute Korrelation zwischen den
Emissionen und einer bestimmten Enzymaktivität bzw. Substratkonzentration wäre dabei
einen Hinweis auf den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in dieser Kaskade.
Zum anderen sollte geprüft werden, ob sich die Emissionen von MeSA eignen, auf die
endogenen Konzentrationen von SA rückzuschließen. Auch hier wurde versucht, die
Emission von MeSA mit der endogenen SA-Konzentration zu korrelieren. Die Messung der
MeSA-Emission erfolgte dabei ebenfalls online mittels GC/MS, die der endogenen
Salicylsäurekonzentrationen mittels HPLC.
Ozonexposition und Pilzinfektion (Botrytis cinerea) wurden als abiotischen bzw. biotischen
Stressoren angewendet.
Die Stressantwort der Tomatenpflanzen auf die Ozonexposition erfolgte mit einer
Zeitverzögerung zwischen 1 und 3 Stunden nach Beendigung der Ozonzugabe. Die Pflanzen
105
reagierten mit der Emission von Methanol, GLAs und MeSA sowie mit der Erhöhung der
Emissionen von Mono- und Sesquiterpenen.
Pflanzen wurden aus der Kammer entnommen, unter Flüssigstickstoff in einem Möser
schockgefroren, homogenisiert und bis zur Extraktion und Messung der Enzymaktivitäten und
der Salicylsäurekonzentrationen bei -80°C gelagert.
Während die GLA-Emissionen keine guten Korrelation zu den Lipase- und
Hydroperoxidlyaseaktivitäten aufwiesen (0,19 bzw. 0,41), wurde eine gute Korrelation
zwischen der Lipoxygenaseaktivität und den stressinduzierten Emissionen gefunden (0,82).
Das deutet auf die Lipoxygenaseaktivität als geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der
GLA-Emission hin. Freie Fettsäuren waren sowohl in Kontroll- als auch in gestressten
Pflanzen in ähnlicher Größenordnung vorhanden. Eine Substratlimitierung durch geringe
Verfügbarkeit freier Fettsäuren als geschwindigkeitsbestimmender Schritt scheint damit
unwahrscheinlich. Die Konzentration an Hydroperoxyfettsäuren lag immer unterhalb der
Bestimmungsgrenze, womit auch eine Substratlimitierung der Hydroperoxidlyase auch als
„bottle neck“ bei der GLA Emission angesehen werden kann. Auch eine solche
Substratlimitierung sollte sich in der gefundenen guten Korrelation zwischen GLA-
Emissionen und Lipoxygenaseaktivität bemerkbar machen.
Aufgrund dieser guten Korrelation ist es bei Botrytisbefall und Ozonflussdichten zwischen
3*10-8 – 8*10-8 mol m-2 s-1 möglich, von der Emissionsstärke der GLAs direkte Rückschlüsse
auf die Lipoxygenaseaktivität machen. Dennoch sind die GLA-Emissionen nicht
uneingeschränkt zur Bestimmung der Lipoxygenaseaktivität geeignet. Insbesondere bei hohen
Ozonflussdichten zeigen sich durch eine starke Erhöhung der Emissionen starke
Abweichungen vom linearen Zusammenhang zwischen der Emissionsstärke und der
Lipoxygenaseaktivität.
Auch zwischen den MeSA-Emissionen und den Gehalten an freier Salicylsäure in den
Pflanzen wurde ein recht guter Zusammenhang gefunden, die es erlauben sollte von den
MeSA Emissionen auf SA Konzentrationen zu schließen.
Insgesamt zeigte sich , dass Rückschlüsse über bestimmte pflanzeninterne Enzymaktivitäten
und Stoffmengen über flüchtige Emissionen möglich sind. Diese Emissionen erlauben daher
eine nicht invasive Bestimmung dieser Größen mit recht guter Zeitauflösung.
106
8. Summary
Plants are able to emit flavours over their flowers, leaves and fruits. These flavours serve
them as attractants, repellents or signal molecules. Many plants show a constitutive emission
of a series of different mono- and sesquiterpenes. Futhermore plants have also inducible
emissions. The influence of stressors like e.g. predators, bacteria, fungi or ozone yield to
novel synthesis and emission of repellents and signal molecules. They originate mainly form
octadecanoid and sikimate pathway. The octadecanoid pathway yields in the formation of
alcohols and aldehyds (predominatly C6-compounds). Starting form free fatty acids they were
generated and emitted via an enzyme cascade (lipase, lipoxygenase, hydroperoxidelyase).
The Shikimat pathway is important for the formation of the important plant hormone salicylic
acid (SA). After methylation SA can be emitted as the volatile methylsalicylate MeSA) into
the atmosphere.
The main task of the work was to approve if it is possible to draw conclusions from stress
induced emissions to certain plant internal enzyme activities or substrate concentration in the
model plant tomato (cv. Moneymaker). The would allow a non invasive measurement of such
endogenous parameters.
On the one hand it should be proved if the emission of green leave aldehyds and alcohols
(GLAs) can be suitable for the prediction of the enzyme activities lipase, lipoxygenase and
hydroperoxidelyase or the substrate concentrations in the octadecanoid pathway. The GLAs
were measured by online GC/MS, the intermediates (free fatty acids, hydroperoxy fatty acids)
by HPLC and the enzyme activities by UV/VIS spectroscopy. A good correlation between a
certain enzyme activity/substrate concentration should then be a hint to the rate-determining
step in the cascade.
On the other hand it should be proved if emission of MeSA can be suitable for the prediction
of endogenous free SA concentration. Also in this case I looked for a correlation between the
MeSA emission and the plant internal SA concentration. The measurement of MeSA were
measured by online GC/MS as well and the endogenous SA concentrations by HPLC.
Ozone exposure and infection by fungi (Botrytis cinerea) were used as abiotic/biotic stressors
respectively.
The stress response on ozone exposure of the tomato plants started with varying lag times
between 1 and 3 hours. The plants reacted with the emission of methanol, GLAs and MeSA as
well as increasing of the emissions of mono- and sesquiterpenes.
107
The plants were removed from the chamber, snap frozen and homogenised with pistil and
mortar and stored at -80°C until the extraction and measurement of the enzyme activities/SA
concentrations respectively.
Whereas the GLA emissions showed no good correlations with lipase and hydroperoxidelyase
activities (0.19 and 0.41) the correlation with the lipoxygenase activity was quite good (0.82).
This points to the lipoxygenase to be the rate-determining step for the GLA emission.
Free fatty acids were found in similar concentrations both in control plants and stressed
plants. Substrate limitation by low availability of free fatty acids hence seems not to be rate-
determining. The concentration of hydroperoxy fatty acids were always beyond the detection
limit, therefore the lack of substrate for the hydroperoxidelyase may be the "bottle neck" for
the GLA emission strength. Also this substrate limitation should lead to a good correlation
between GLA emission and lipoxygenase activity.
Due to this good correlation it is in cases of Botrytis infection and ozone fluxes between 3·10-
8 and 8·10-8 possible to predict internal enzyme activities by measurement of the GLA
emissions. However the GLA emission are not in all cases sufficient to predict the
lipoxygenase activity without restrictions. In particular high ozone fluxes into the plant
yielded in very high GLA emissions and strong variances form the linear correlation between
emission and lipoxygenase activity occurred.
Also the emission of MeSA and the internal concentration of free SA showed a good
correlation (0.91). Though it should possible to estimate the endogenous free SA
concentration by measuring the MeSA emission.
All in all this work shows that it is possible to conclude different plant internal enzyme
activities and amounts of substances using the measurement of volatile compounds. Though
these emissions allow the not invasive determination of these parameters in a good demand
interval.
108
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Lebenslauf Persönliche Daten Marco Miebach
geboren am 21.07.1974 in Wipperfürth / NRW
ledig
Berufstätigkeit 02/03 – 09/03 Prüfleiter Pharmaanalytik, Analytik Consulting Institut GmbH, 41466 Neuss 10/03 – 12/03 Wissenschaftlicher Angestellter, Forschungszentrum Jülich,
Institut für Chemie und Dynamik der Geosphäre (ICG-3, Phytosphere)
seit 03/09 stellv. Laborleiter EUROFINS, Dr. Specht Express GmbH, Hamburg
Hochschulausbildung 09/98 – 01/03 Studium an der FH Aachen/ Abt. Jülich zum Dipl.-Ing. Chemie Fachrichtung Ökologische Chemie und Bodenschutz
09/02 – 01/03 Diplomarbeit am Forschungszentrum Jülich im Institut für Chemie und Dynamik der Geosphäre (ICG-3, Phytosphere)
Thema der Arbeit: „Aufnahme flüchtiger organischer Verbindungen durch Pflanzen“.
03/04 - 11/08 Dissertation am Forschungszentrum Jülich im Institut für Chemie und Dynamik der Geosphäre (ICG-3, Phytosphere)
Thema der Arbeit: „Untersuchung der Zusammenhänge zwischen pflanzlichen Emissionen und pflanzeninternen Signalmolekülen und Enzymaktivitäten“.
Berufsausbildung 08/94– 06/97 Ausbildungen zum Chemielaboranten bei der Bayer AG in Leverkusen Schulausbildung 08/81 – 06/85 Grundschule GGS Olpe
08/85 – 06/94 St. Angela Gymnasium in Wipperfürth allgemeine Hochschulreife Zivildienst
08/97– 08/98 Zivildienst beim Aggerverband in Gummersbach
Außerberufliche Weitbildung 010/00 – 02/02 Betreuung des Praktikums Umweltanalytik an der FH Jülich Praktika 04/02 – 08/02 Praxissemester am Forschungszentrum Jülich im Institut für
Chemie und Dynamik der Geosphäre (ICG)
Kenntnisse/ Fähigkeiten Sprachkenntnisse Englisch, Französisch (Grundkenntnisse)
ED//V- Kenntnisse Windows, Office, Latex, diverse Auswertesoftware
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Danksagung
Zum Abschluss dieser Arbeit möchte ich mich bedanken. Bei Prof. Dr. Alan J. Slusarenko, da er als mein Doktorvater meine Promotion überhaupt erst
ermöglicht hat und mir gerade zu Anfang meiner Arbeit durch sein fundiertes Fachwissen und
die Unterstüzung seines Labores an der RWTH den Einstieg erleichtert hat.
PD Dr. Jürgen Wildt danke ich für die Bereitstellung der Messmöglichkeiten im
Forschungszentrum Jülich, sowie für die Hilfe bei der Durchführung der Experimente. Ohne
seine intensive wissenschaftliche Betreuung und die daraus resultierenden Diskussionen wäre
ein Erfolg bei meinem Vorhaben nicht möglich gewesen.
Dr. Einhard Kleist danke ich vor Allem für die Unterstützung bei der Wartung der Anlage,
sowie für die praktische Hilfe bei der Wartung und Instandsetzung der GC/MS-Systeme.
Roel Jansen von der Universität in Wageningen für die Möglichkeit der Durchführung der
Experimente mit Botrytis cinerea
Außerdem möchte ich mich bedanken bei:
- PD Dr. Ulrich Schaffrath für seine Einführung in die Enzymaktivitätsmessungen.
- Prof. Dr. Uwe Conrath für die Übernahme des Coreferates
- Ricarda Uerlings für die Unterstützung bei der Anzucht der Pflanzen sowie der
Kalibration der GC/MS-Systeme
- Andreas Averesch für die Schnelle Hilfe bei Problemen mit Soft- und/oder Hardware
- Allen Mitarbeitern des ICG-3, für ihre Kritik und Anregungen