untersuchungen zum nachweis von listeria monocytogenes in ... · aus der zentrumsabteilung für...
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Aus der Zentrumsabteilung für Lebensmittelkunde, Fleischhygiene und -technologie
des Zentrums für Lebensmittelwissenschaften
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Nachweis von Listeria monocytogenes
in Schweinehackfleisch:
Kulturelle Referenzmethode, ELISA, PCR und Microarray
I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Melanie Tina Leidreiter
aus Bochum
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Priv.-Doz. Dr. M. Kühne
1. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. M. Kühne
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung: 17. November 2003
Die Arbeit wurde aus Mitteln der Dr. Eberhard Lienhop Stiftung gefördert.
Gewidmet
meinen Eltern, meinem Opa
und in Gedenken Frau Helene Schröder
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung..........................................................................................................................................................................13
2. Schrifttum.........................................................................................................................................................................15
2.1 Genus Listeria ....................................................................................................................................................................15
2.1.1 Geschichte .............................................................................................................................................................15
2.1.2 Taxonomie und mikrobiologische Eigenschaften ...................................................................15
2.1.3 Differenzierung der Spezies von Listerien.................................................................................... 16
2.1.4 Epidemiologie der humanen Listeriose .......................................................................................... 17
2.1.5 Listeriose: Klinische Symptomatik des Menschen................................................................. 19
2.1.6 Prophylaxe ............................................................................................................................................................ 19
2.2 Hackfleisch ...........................................................................................................................................................................20
2.2.1 Allgemeines.......................................................................................................................................................... 20
2.2.2 Kontaminationen von Fleisch und Fleischerzeugnissen mit Listeria spp..............20
2.3 Methoden zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln.......................23
2.3.1 Kulturelle Nachweismethoden................................................................................................................ 23
2.3.1.1 Erfahrungen mit den Medien der Amtlichen Methode nach § 35 LMBG
(DIN EN ISO-Methode 11290-1 von 1996 – qualitativer Nachweis)..................... . 23
2.3.2 Immunologische Nachweismethoden................................................................................................ 27
2.3.2.1 Allgemeines.......................................................................................................................................................... 27
2.3.2.2 Immunologische Verfahren zum Nachweis von Listeria (monocytogenes).........27
2.3.2.3 Anwendung Listeria spp.-spezifischer Enzymimmunoassays........................................29
2.3.2.4 Anwendung Listeria monocytogenes-spezifischer Enzymimmunoassays............ 33
2.3.3 Molekularbiologische Methoden.......................................................................................................... 35
2.3.3.1 PCR als integrales System ........................................................................................................................ 6336
2.3.3.2 Anreicherung der Zielkeime im Vorfeld der PCR...................................................................36
2.3.3.3 Listeria monocytogenes-spezifische Zielsequenzen.............................................................. 38
2.3.3.4 Multiplex-PCR................................................................................................................................................... 39 39
2.3.3.5 Detektion der PCR-Produkte....................................................................................................................40
2.3.3.6.1 Nachweisgrenzen und Spezifität von PCR-Systemen bei Untersuchungen
von Listeria monocytogenes-Reinkulturen.................................................................................... 42
2.3.3.6.2 Nachweisgrenzen von PCR-Systemen bei Untersuchung von Listeria mono-
cytogenes-dotierten Lebensmitteln (mit oder ohne Anreicherung). ........................... 4 44
2.3.3.6.3 Sensitivität und Spezifität verschiedener PCR-Systeme nach Untersuchungen
von Feldproben................................................................................................................................................... 48
2.3.4 Methodenvergleich.......................................................................................................................................... 51
2.4 Schlussfolgerungen aus dem wissenschaftlichen Schrifttum.................................................... 55
3. Eigene Untersuchungen ................................................................................................................................ 57
3.1 Material ................................................................................................................................................................................... 57
3.1.1 Hackfleisch............................................................................................................................................................ 57
3.1.2 Mikroorganismen.............................................................................................................................................. 57
3.2 Methoden.................................................................................................................................................................................58
3.2.1 Kulturelle Nachweismethode................................................................................................................... 59
3.2.2 Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA …...................................................…............ 62
3.2.3 PCR...............................................................................................................................................................…...........64
3.2.4 NUTRI®-Chip...…............................................................................................................................................... 69
3.3 Versuche ..................................................................................................................................................................................74
3.3.1 Dotieren von Schweinehackfleisch mit Listeria monocytogenes sowie mit
Listeria innocua................................................................................................................................................. 74
3.3.1.1 Prüfung der Anreicherungsbedingungen zur Erzielung bestimmter Listeria
monocytogenes-Konzentrationen .........................................................................................................74
3.3.1.2 Herstellen einer TK-Keimbank mit einem Freezing Medium........................................ 75
3.3.1.3 Dotieren (künstliche Kontamination)................................................................................................ 76
3.3.1.4 Überprüfung des Einflusses von Brillantschwarz auf das Wachstum von
Listerien................................................................................................................................................................... 78
3.3.2 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode.................................................................78
3.3.2.1 Ermittlung des Zeitaufwandes.................................................................................................................78
3.3.2.2 Spezifität der mikrobiologischen Referenzmethode für Mischkulturen mit
Listeria innocua in Schweinehackfleisch....................................................................................... 80
3.3.3 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels PCR........................................................................................................82
3.3.3.1 Versuche zur Sensitivität und Spezifität der PCR....................................................................82
3.3.3.1.1 Sensitivität der PCR nach Anreicherung von Listeria monocytogenes
in TSYE- und Halbfraser-Bouillon......................................................................................................82
3.3.3.1.2 Prüfung der Spezifität der PCR mit DNA von Listeria innocua.................................. 82
3.3.3.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis
von Listeria monocytogenes in Schweinefleisch mittels PCR...................................... 83
3.3.4 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels Microarray........................................................................................85
3.3.4.1 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis
von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels Microarray............85
3.3.4.2 Spezifität des Microarray-Nachweises für Mischkulturen mit Listeria
innocua in Schweinehackfleisch...........................................................................................................85
3.3.5 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels ELISA.................................................................................................. 86
3.3.5.1 Überprüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Einflüsse auf
die ELISA-Methode (Tranisa plate® Listeria moncytogenes-ELISA) sowie
der vom Hersteller angegebenen Sensitivität für das Testkit.......................................... 86
3.3.5.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis von
Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels ELISA................................. 87
3.3.6 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Feldproben mittels molekularbiologischen Verfahren......................................................... 89
3.3.6.1 Untersuchung von Listerien-positiven Feldproben mittels
Agargel-Elektrophorese und Microarray........................................................................................ 89
4. Ergebnisse........................................................................................................................................................................ 90
4.1 Dotieren von Schweinehackfleisch mit Listeria monocytogenes sowie mit
Listeria innocua................................................................................................................................................................ . 90
4.1.1 Prüfung der Anreicherungsbedingungen zur Erzielung bestimmter Listeria
monocytogenes-Konzentrationen.......................................................................................................... 90
4.1.2 Herstellen einer TK-Keimbank mit einem Freezing Medium........................................ 91
4.1.3 Dotieren (künstliche Kontamination) des Hackfleisches....................................................92
4.1.4 Prüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Wirkungen auf das
kulturelle Wachstum von Listerien..................................................................................................... 92
4.2 Nachweis von Listerien in Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode........ 93
4.2.1 Ermittlung des Zeitaufwandes für den qualitativen Nachweis von Listeria
monocytogenes in Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode.....................93
4.2.2 Spezifität der mikrobiologischen Referenzmethode für Mischkulturen mit
Listeria innocua in Schweinehackfleisch....................................................................................... 95
4.3 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels PCR..................................................................................................................... 97
4.3.1 Versuche zur Sensitivität und Spezifität der PCR................................................................... 97
4.3.1.1 Sensitivität der PCR nach Anreicherung von Listeria monocytogenes in
TSYE-respektive Halbfraser-Bouillon............................................................................................. 97
4.3.1.2 Prüfung der Spezifität der PCR mit DNA von Listeria innocua.................................. 97
4.3.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis
von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels PCR............................ 99
4.4 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels Microarray.................................................................................................100
4.4.1 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis von
Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels Microarray.................... 100
4.4.2 Molekularbiologischer Nachweis von Listeria monocytogenes mittels
Microarray in Anwesenheit von Listeria innocua................................................................ 105
4.5 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels ELISA.............................................................................................................107
4.5.1 Überprüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Einflüsse auf
die ELISA-Methode (Tranisa plate® Listeria moncytogenes-ELISA) sowie
der vom Hersteller angegebenen Sensitivität für das Testkit....................................... 107
4.5.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis von
Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels ELISA.............................. 108
4.6 Qualitativer Nachweis von Listeria monocytogenes in Feldproben mittels
Agargel-Elektrophorese und Microarray............................................................................................... 110
5. Diskussion....................................................................................................................................................................... 115
5.1 Diskussion des Dotierens von Schweinehackfleisch ..................................................................... 115
5.2 Diskussion zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode........................................................................ 116
5.3 Diskussion zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels PCR.................................................................................................................. 122
5.4 Diskussion zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels ELISA............................................................................................................. 132
5.5 Bedeutung der Halbfraser-Anreicherungskultur in Verbindung mit
Schnellmethoden............................................................................................................................................................ 136
5.6 Vergleich der Schnellmethoden....................................................................................................................... 136
6. Zusammenfassung................................................................................................................................................140
7. Summary.......................................................................................................................................................................... 142
8. Schrifttumsverzeichnis................................................................................................................................... 144
9. Anhang .............................................................................................................................................................................. 169
9.1 Nähr- und Differenzierungsmedien ............................................................................................................ 169
9.2 ELISA-Materialien .................................................................................................................................................... 172
9.3 Materialien für molekularbiologische Untersuchungen ........................................................... 172
9.3.1 Reagenzien ........................................................................................................................................................ 172
9.3.2 Rezepturen ......................................................................................................................................................... 173
9.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien ............................................................................................................ 175
9.5 Tabellenverzeichnis ................................................................................................................................................... 177
9.6 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................................................ 178
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
aqua dest. Aqua destillata
bp Basenpaar
bzw. beziehungsweise
ca. circa
d. h. das heißt
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
et al. et alii
evtl. eventuell
°C Grad Celsius
FDA United States Food and Drug Administration
g Gramm
ggf. gegebenenfalls
GKZ Gesamtkeimzahl
h Stunde
i. d. R. in der Regel
inkl. inklusive
ITS Interner Standard
i. w. im wesentlichen
KbE Kolonie-bildende Einheit
kDA Kilodalton
L. Listeria
µl Mikroliter
mAK monoklonale Antikörper
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
o. A. ohne Angabe
n Anzahl der Proben
pAK polyklonale Antikörper
PALCAM (Polymyxin B, Akriflavin, Lithiumchlorid, Ceftazidim,
Moxalactam)
PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
pH pondus hydrogenii
RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)
s. siehe
spp. Spezies
Tab. Tabelle
TSYEB Tryptone Soya Yeast Enrichment Broth
USDA United States Department of Agriculture
u. und
UV Ultraviolett
v. a. vor allem
z. B. zum Beispiel
z. Z. zur Zeit
Einleitung
13
1. Einleitung
Im Sinne eines vorbeugenden Gesundheitsschutzes ist der Nachweis von Listeria
monocytogenes (L. m.) in Lebensmitteln Gegenstand vieler Studien. Innerhalb der Gattung
Listeria ist Listeria monocytogenes die weitaus bedeutendste humanpathogene Spezies
(FARBER u. PETERKIN 1991).
Die Listeriose tritt relativ selten manifest in Erscheinung, wenn sie es aber tut, dann handelt es
sich - mit einer durchschnittlichen Mortalitätsrate von 30 bis 40 % - um eine äußerst ernst zu
nehmende Infektion (McLAUCHLIN 1987; 1990a).
Listerien werden regelmäßig in Lebensmitteln, besonders auch in rohem Fleisch, nach-
gewiesen (Tab. 3). Der herkömmliche qualitative und quantitative Listerien-Nachweis
benötigt für ein Ergebnis mehrere Tage. Die Laborpraxis braucht für einen ausreichend
empfindlichen, spezifischen und zuverlässigen Nachweis von Listerien Schnellmethoden,
deren Entwicklung auch im Hinblick auf die begrenzte Haltbarkeitsdauer bestimmter
Lebensmittel und die hohen Kosten der Lagerung erforderlich ist (NIEDERHAUSER et al.
1992).
Schnelle spezifische und sensitive Methoden sollen in Zukunft Zeit- und Arbeitsaufwand im
Labor minimieren. In jüngster Zeit sind insbesondere auch Microarrays, die auf molekular-
biologischen Methoden basieren, ins Zentrum des Interesses gerückt.
Verzehrsfertige Lebensmittel wie Hackfleisch, die mit L. monocytogenes kontaminiert sein
können und auch eine Vermehrung ermöglichen (gemäß der Empfehlung des BgVV folgt
daraus eine Zuordnung in die Kategorie II), sollen nach der Empfehlung des BgVV anhand
des quantitativen Listerien-Nachweises beurteilt werden: Als verkehrsfähig wäre beispiels-
weise Hackfleisch nur anzusehen, wenn in 1 g höchstens 100 KbE Listeria monocytogenes
gefunden werden könnten (WEISE et al. 1999).
Aus diesem Kontext heraus ergeben sich die Fragen nach den für den Listerien-Nachweis
geeigneten Methoden. Neben der Zuverlässigkeit sowie Schnelligkeit ist die praktikable
Einsetzbarkeit im Labor der entscheidende Parameter in der Wahl der Methode.
Einleitung
14
Bisher gibt es keine Veröffentlichungen über vergleichende Untersuchungen zum Nachweis
von Listerien mittels bakteriologischer Untersuchung gemäß § 35 LMBG, ELISA und PCR
mittels Detektion der PCR-Produkte anhand Agargel-Elektrophorese und Microarray-
Analyse.
Ziel dieser Arbeit ist es, kulturelle, serologische und molekularbiologische Methoden für den
spezifischen Listeria monocytogenes-Nachweis (besonders hinsichtlich Zeitaufwand) zu
vergleichen. Diese Arbeit soll einen Beitrag leisten zu den Erkenntnissen hinsichtlich der
Praktikabilität von Schnellmethoden für den Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch.
Schrifttum
15
2. Schrifttum
2.1 Genus Listeria
Listeria-Arten sind weltweit verbreitet. Sie sind relativ anspruchslose Bakterien und werden
z. B. in Wasser, Abwasser, Erdboden, Pflanzen, Silage, Schlachthofabfällen oder Gullies von
LM-verarbeitenden Betrieben gefunden (GRAY u. KILLINGER 1966; BAUMGART et al.
1997, III.3, S. 61).
2.1.1 Geschichte
1893 berichtete Henle nach Sektionen von Patienten in Deutschland von gram-positiven
Stäbchenbakterien, bei denen es sich aus heutiger Sicht um pathogene Listerien gehandelt hat
(GRAY u. KILLINGER 1966). Als Auslöser einer Erkrankung bei Laborkaninchen, die mit
einer charakteristischen Vermehrung der Monozyten im Blut einherging, wurde der Keim
1926 von Murray erstmals beschrieben und als Bacterium monocytogenes bezeichnet. Den
gleichen Keim isolierte Pirie 1927 bei einer seuchenartigen Erkrankung von Wüstenspring-
mäusen und nannte ihn Listerella hepatolytica. Seit 1940 trägt der Keim die bis heute gültige
Bezeichnung Listeria monocytogenes (s. Review FARBER u. PETERKIN 1991).
Erst seit den 1980er Jahren wird L. monocytogenes (Erreger der Listeriose) als ein wichtiger
Faktor der öffentlichen Gesundheit wahrgenommen, nachdem der Verzehr kontaminierter LM
mit Listeriose-Epidemien in Verbindung gebracht wurde (SCHLECH et al. 1983).
Im (human-)medizinischen Sinne galten die Listerien bis dahin als relativ unbedeutend, und
es gab weder offizielle noch zufriedenstellende Nachweismethoden für die Isolation und
Identifizierung von pathogenen Listerien (McLAUCHLIN 1987).
2.1.2 Taxonomie und mikrobiologische Eigenschaften
Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology (SEELIGER u. JONES 1986) führt die Gattung
Listeria unter der Gruppe der regelmäßigen, nicht sporenbildenden, gram-positiven Stäbchen-
bakterien. Bergey`s Manual of Determinative Bacteriology (HOLT et al. 1994) unterscheidet
sieben Arten: L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. monocytogenes, L. murrayi, L. seeligeri und
L. welshimeri.
Schrifttum
16
Nach phylogenetischen, molekularbiologischen Studien wird jedoch davon ausgegangen, dass
L. grayi und L. murrayi eine einzige Spezies (Grayi) darstellen (BOERLIN et al. 1992).
Die an den Enden abgerundeten, zumeist kurzen Stäbchenbakterien (Länge 0,5 bis 2,0 µm
und Durchmesser 0,4 bis 0,5 µm) kommen einzeln und in kurzen Ketten, V-förmig oder
palisadenförmig aneinandergereiht vor. Listerien bewegen sich charakteristisch taumelnd, was
sie bei Temperaturen von 20 - 25°C am besten ausprägen. Das Wachstum ist fakultativ an-
aerob und optimal bei Temperaturen zwischen 30 und 37°C. Temperaturen von unter 1°C und
über 45°C verhindern eine Vermehrung (HOLT et al. 1994). Der Mindest-pH-Wert ist tem-
peraturabhängig (FARBER u. PETERKIN 1991). Kolonien sind katalase-positiv, hydro-
lysieren Äskulin und können Hämolysin (Listeriolysin O) sowie Cytochrome produzieren
(SEELIGER u. JONES 1986). Generationszeiten verschiedener Stämme waren annähernd
vergleichbar (BESSER 2000). Weitere mikrobiologische Eigenschaften s. unter 2.1.3.
2.1.3 Differenzierung der Spezies von Listerien
Die Spezies der Listerien werden im Allgemeinen mit Hilfe von kulturellen, biochemischen
und mikroskopischen Methoden differenziert (SEELIGER u. JONES 1986).
Für die Unterscheidung β-hämolysierender Kulturen (L. ivanovii, L. monocytogenes und
L. seeligeri) muß der CAMP-Test durchführt werden (Tab. 1).
Tab. 1: Charakteristika zur Differenzierung der Listerien (nach HOLT et al. 1994).
+ = 90 % der Stämme oder mehr sind positiv; - = 90 % der Stämme oder mehr sind negativ. V = 11 - 89 % der Stämme sind positiv.
(1) im Allgemeinen breite Zonen oder multiple Zonen(2) wenige Stämme sind nicht-hämolytisch
Merkmal L.grayi
L.innocua
L.ivanovii
L.monocytogenes
L.murrayi
L.seeligeri
L.welshimeri
β-Hämolyse – – +(1) +(2) – + –CAMP-Testmit S. aureus – – – + – + –CAMP-Testmit R. equi – – + – – – –Säurebildungaus:
Rhamnose – V – + V – V
Xylose – – + – – + +
Schrifttum
17
Nach der Beurteilung des Hämolyseverhaltens eines Stammes wird das Fermentations-
verhalten geprüft (Tab. 1). L. monocytogenes ist der einzige hämolytische Stamm, der
Rhamnose – unter Säurebildung – fermentiert.
Die serologischen Methoden zur Differenzierung von L. monocytogenes in 13 Serotypen
sollen hier nicht weiter erläutert werden.
2.1.4 Epidemiologie der humanen Listeriose
Die humane Listeriose tritt sowohl epidemisch als auch sporadisch in Erscheinung. Die Er-
krankungsrate beträgt durchschnittlich 6,2 bzw. 8 Erkrankte pro eine Million Einwohner und
Jahr. Die Erkrankungsrate wird sehr wahrscheinlich unterschätzt, weil in vielen Fällen der
Erreger entweder nicht vermutet (z. B. bei Aborten) oder auch nicht nachgewiesen wird
(FARBER u. PETERKIN 1991; ANON. 1991). Die klinische Listeriose geht mit einer
durchschnittlichen Mortalitätsrate von 30 bis 40 % einher. Bei den nicht mit perinataler
Listeriose assoziierten Fällen steigen das Risiko einer manifesten Erkrankung und die
Mortalitätsrate mit dem Alter (McLAUCHLIN 1987; 1990b). Bundesländer mit einer Melde-
pflicht für listerielle Meningitiden verzeichneten für diese einen Anteil an den bakteriellen
Meningitiden zwischen 4 und 6 %. Klinische Listeriosen treten am häufigsten bei
Neugeborenen und Menschen über 60 Jahren auf (McLAUCHLIN 1990a; ANON. 1991).
Nach dem deutschen Infektionsschutzgesetz unterliegt lediglich die Neugeborenen-Listeriose
(Erkrankung und Tod) der Meldepflicht. Pro Jahr werden zwischen 30 und 40 Fälle amtlich
erfasst (ANON. 1999).
Lebensmittel (LM) gelten als wichtigste Infektionsquellen für den Menschen (BAUMGART
2000). Risikoreich ist u. a. der Verzehr von roher Milch und Rohmilchprodukten sowie von
rohem Fleisch und nur unzureichend durchgegartem Fleisch und Fleischerzeugnissen. Die
Serotypen 1/2a und 1/2b sowie 4b verursachen über 90 % der menschlichen Listeriosen
(FARBER u. PETERKIN 1991). Weltweit dominiert beim Fleisch der Serotyp 1 (ANON.
1991; FARBER u. PETERKIN 1991; VINES u. SWAMINATHAN 1997; PERLBERG et al.
2000). Die orale Aufnahme der Listerien führt u. U. zu einer lokal begrenzten Besiedlung des
Intestinaltraktes. Symptomfreie Dauerausscheider innerhalb der Bevölkerung (FARBER u.
PETERKIN 1991; SLUTSKER u. SCHUCHAT 1999) spielen wahrscheinlich eine Rolle in
der Epidemiologie der Listeriose (ANON. 1991).
Schrifttum
18
BOJSEN-MØLLER (1964) berichtete über die Isolation des Erregers aus menschlichen Fäzes
bei listeriosekranken Kindern, bei Personen mit Kontakt zu Listeriosekranken, bei stationären
Patienten sowie bei symptomfreien Schlachthofarbeitern. Bei immunkompetenten Menschen
verläuft eine L. monocytogenes-Infektion i. d. R. subklinisch bzw. nicht-invasiv mit einem
leichten Verlauf und leichtem Fieber, wobei über das Ausmaß der Verbreitung subklinischer
Infektionen kaum etwas Konkretes bekannt ist (ANON. 2000; McLAUCHLIN 1987). Bei
Ausbruch einer fieberhaften Gastroenteritis in Schweden deuteten alle mikrobiologischen und
epidemiologischen Analysen darauf hin, dass es sich dabei um einen Ausbruch von Listeriose
handelte (CARRIQUE-MAS et al. 2003).
Zu den Risikogruppen für eine klinische Manifestation zählen Schwangere und deren un- oder
neugeborene Kinder, ältere Menschen und immungeschwächte Personen. Zu letzteren
gehören u. a. Patienten mit Krebs, AIDS oder Diabetes mellitus (ANON. 1991; ANON. 1999;
ANON. 2000; BECKER u. HOLZAPFEL 2000; SLUTSKER u. SCHUCHAT 1999). Das
Listeriose-Risiko für die Bevölkerung nimmt in dem Maße zu, in dem das Durchschnittsalter
der Bevölkerung steigt (ANON. 1991).
Die infektiöse Dosis ist stark von dem Gesundheitszustand der einzelnen Person abhängig.
Bedingt durch die lange Inkubationszeit sind Daten über die aktuelle Erregerexposition resp.
die minimale infektiöse Dosis bei invasiven Listeriosen spärlich gesät. Infektiöse Dosen bei
gesunden Erwachsenen in dokumentierten Listeriose-Fällen rangierten zwischen 109 und 105
KbE pro ml bzw. g LM. Für gefährdete Personen betrug die infektiöse Dosis 104, 102 – 104
bzw. weniger als 10 KbE pro g LM. Weit unter 102 KbE L. moncytogenes können wahr-
scheinlich eine Listeriose auslösen, wenn diese Erregermengen über einen längeren Zeitraum
täglich aufgenommen werden. Auch der Verzehr von überdurchschnittlichen Mengen eines
kontaminierten Lebensmittels ist bei der Entstehung einer LM-Infektion evtl. von Bedeutung
(MAIJALA et al. 2001). Kontaminationsraten von weniger als 1 KbE pro g liegen zu häufig
in LM vor, als dass sie für Erkrankungsfälle verantwortlich gemacht werden könnten. Die in
den USA festgestellte Listerioserate ging allerdings mit der Wahrscheinlichkeit einher, eine
Dosis von ≥ 103 KbE pro g Lebensmittel zu sich zu nehmen (HITCHINS 1996).
Die Zeit von der Aufnahme des Erregers bis zur Erkrankung (Inkubationszeit) ist nicht
eindeutig zu definieren (1 Tag bis 90 Tage). Symptome können bei Aufnahme großer Mengen
des Erregers bereits nach 1 bis 7 Tagen auftreten (McLAUCHLIN 1990b; ANON. 1999).
Schrifttum
19
2.1.5 Listeriose: Klinische Symptomatik des Menschen
Die Listeriose manifestiert sich in schweren, invasiven Fällen mit Blutvergiftungen (Septi-
tiden) und Hirnhautentzündungen (v. a. eitrige Meningitiden). Alle Organe können im Krank-
heitsverlauf angegriffen werden. Bei schwangeren Frauen nimmt die Listeriose i. d. R. einen
milden grippeähnlichen Verlauf (McLAUCHLIN 1987). Schon vor bzw. während der Geburt
kann der Erreger auf das Kind übergehen. Spontane Aborte, Früh- und Totgeburten sowie
verschiedene Formen der neonatalen Listeriose (Granulomatosis infantiseptica, Meningitis)
sind charakteristisch (ANON. 1999; ANON. 1991). Selbst bei einer baldmöglichst einge-
leiteten Therapie ist die Letalität kaum zu beeinflussen (ANON. 1999; ANON. 2000).
2.1.6 Prophylaxe
Für die Bekämpfung der Listeriose haben präventive Maßnahmen, die eine Vermehrung von
L. monocytogenes in LM verhindern oder eine wirkungsvolle Keimabtötung sicherstellen,
sowie umfassende Produktkontrollen auf L. monocytogenes, die sich am Risikopotential des
Lebensmittels orientieren, eine besondere Bedeutung. Die Etablierung des Hazard Analysis
and Critical Control Point-Konzeptes (HACCP) ist wichtig für die Kontrolle von L. mono-
cytogenes-Kontaminationen von Lebensmitteln. Als CCP (critical control point) ist die Ein-
haltung der Lagerungstemperatur gekühlter verzehrsfertiger LM anzusehen. Die Anwendung
hygienischer Maßnahmen trägt wesentlich zur Minimierung von Listerien-Kontaminationen
in Lebensmitteln bei (ANON. 1991). Insbesondere bei der Herstellung von LM, die für
Risikogruppen bestimmt sind, sind Kontrollen im Rahmen des HACCP-Konzepts von Be-
deutung (MAIJALA et al. 2001). Herkömmliche mikrobiologische Nachweismethoden sind
ungeeignet für den Gebrauch innerhalb von HACCP-Systemen, weil die Ergebnisse erst mit
zeitlicher Verzögerung zu erhalten sind und sich z. T. als unzuverlässig erwiesen
(SHERIDAN et al. 1997; PENG u. SHELEF 2001). Solange keine kosteneffektiven Schnell-
methoden in HACCP-Konzepten angewendet werden, bereiten die Kontrollen von L. mono-
cytogenes-Kontaminationen Schwierigkeiten. Schnellmethoden ermöglichen ein Online-
Monitoring im Rahmen von HACCP-Konzepten der LM-Industrie (SHERIDAN et al. 1997).
Bewertungskriterien für Schnellmethoden sind Sensitivität, Arbeitsaufwand, (Anschaffungs-)
Kosten und erforderliche Fachkenntnis (FARBER u. PETERKIN 1991).
Schrifttum
20
2.2 Hackfleisch
2.2.1 Allgemeines
Hackfleisch ist ein Gemenge aus stark zerkleinerter roher Muskulatur, das außer Kühlung
keine weitere Zubereitung oder Behandlung erfährt. Gegenüber dem Rohstoff Fleisch besitzt
Hackfleisch eine enorm vergrößerte Oberfläche. Dadurch bietet es ideale Vermehrungs-
bedingungen für Mikroorganismen und stellt im Hinblick auf einen möglichen Rohverzehr
ein besonders hohes hygienisches Risiko dar (SCHALCH et al. 1996).
Die GKZ handelsüblichen Hackfleisches beträgt innerhalb von 48 h ab Herstellung bei einer
konstanten Lagerungstemperatur von 2 - 7°C i. d. R. etwa 105 KbE pro Gramm (LOUWERS
et al. 1999). Die Fleischhygiene-Verordnung (FlHV vom 21.5.1997) gibt einen Grenzwert für
die aerobe mesophile GKZ von log 6,7 KbE pro Gramm vor, der allerdings in praxi immer
wieder überschritten wird (HILDEBRAND et al. 2001; SCHALCH et al. 1996).
Verzehrsfertige Lebensmittel wie Hackfleisch, die mit L. monocytogenes kontaminiert sein
können und auch eine Vermehrung ermöglichen (gemäß der Empfehlung des ehemaligen
BgVV folgt daraus eine Zuordnung in die Kategorie II), sollen nach der Empfehlung des
BgVV anhand des quantitativen Nachweises beurteilt werden: Im Sinne des vorbeugenden
Gesundheitsschutzes soll ein Inverkehrbringen nur bei Keimgehalten < 102 KbE pro g bzw.
ml möglich sein (WEISE et al. 1999).
Gemäß der Lebenmittelhygiene-Verordnung (LMHV) sind die Betriebe zur Durchführung
von Eigenkontrollsystemen im Rahmen eines HACCP-Konzepts verpflichtet. Die Über-
wachung des Vorkommens sowohl pathogener als auch apathogener Listerien unterliegt
dieser Vorschrift, deren Anwendung die hygienische Unbedenklichkeit sicherstellen soll.
2.2.2 Kontaminationen von Fleisch und Fleischerzeugnissen mit Listeria spp.
Ein nicht unerheblicher Anteil von frischem Fleisch (19 % bis 100 %) und Fleisch-
erzeugnissen ist mit Listeria monocytogenes und Listeria innocua kontaminiert. In Hack-
fleischprodukten und Produkten, die vor dem Verzehr gegart werden müssen, rangierte die
Häufigkeit der Listerien nach JOHNSON et al. (1990) zwischen 8 % und 92 %.
Schrifttum
21
Gelegentlich werden L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi, L. murrayi und L. ivanovii als
Kontaminanten in Fleisch nachgewiesen. Mischkulturen aus L. monocytogenes und anderen
Listeria spp., insbesondere mit L. innocua, kommen regelmäßig vor (BREUER u. PRÄNDL
1988; BUNČIĆ 1991; COMI et al. 1992; NICOLAS et al. 1989; OZARI u. STOLLE 1990;
RYSER et al. 1996; SCHMIDT et al. 1988; SKOVGARD u. MORGEN 1988; SKOVGARD
u. N∅ RRUNG 1989; TENGEL et al. 2001). Der Nachweis von Listeria spp. ist auch als
Indikator für das Vorhandensein von Listeria monocytogenes anzusehen. Keimgehalte reichen
von über 0 bis 2000 KbE L. monocytogenes pro Gramm (Tab. 2).
Tab. 2: Konzentrationen von L. monocytogenes (L. m.) oder Listeria spp. in Fleisch.
Art der Proben Range KbE g-1 Anteil positiver Proben Referenz
gemischtesHackfleisch (je 50 %Rind und Schwein)
> 0 - ≤ 1,1> 1,1 - ≤ 12> 12 - ≤ 110Listeria spp.
13 %17 %23 %
BREUER u. PRÄNDL(1988)
Hackfleisch(Schwein)
< 10 L. m. 8 (50%) SCHMIDTet al. (1988)
Hackfleisch (Rind)
Schweinefleisch
< 100 L. m.
< 100 L. m.
91,6 %
92,6 %
COMIet al. (1992)
Hackfleisch(Schwein)
< 0,30,3 - < 1,11,1 - < 1010 - < 100 L. m.
28,6 %14,3 %28,6 %28,6 %
INOUEet al. (2000)
Die L. monocytogenes-Serotypen 1/2a, 1/2b, 1/2c und 4b wurden am häufigsten isoliert,
seltener wurden die Serotypen 3c, 4c und 4e gefunden (COMI et al. 1992; CORDANO u.
ROCOURT 2001; FANTELLI u. STEPHAN 2001; INOUE et al. 2000; NICOLAS et al.
1989 ; NOACK u. JÖCKEL 1993; OZARI u. STOLLE 1990; SCHMIDT et al. 1988; WANG
et al. 1990).
Mit dem Grad der Bearbeitung nimmt die Häufigkeit von Listeria spp. zu (BREUER u.
PRÄNDL 1988; JOHNSON et al. 1990; NOACK u. JÖCKEL 1993; OZARI u. STOLLE
1990; SKOVGARD u. N∅ RRUNG 1989; VAN DEN ELZEN u. SNIJDERS 1993). Auf den
Oberflächen von Schlachttierkörpern von Schweinen und Rindern wurde L. monocytogenes in
2 % und 22 % der Fälle bzw. Listeria spp. in 10 % und 54 % der Fälle nachgewiesen
(KORSAK et al. 1998).
Schrifttum
22
Die Inzidenz in Muskulatur und Milz von Schlachttieren war hingegen mit unter 1 % gering
(AMTSBERG et al. 1969). Im Zerlegeraum wurde eine mindestens siebenfache Konzen-
trierung gegenüber der reinen Seite der Schweineschlachtlinie festgestellt (VAN DEN
ELZEN u. SNIJDERS 1993). In Feldproben von Fleisch und Fleischerzeugnissen wurden
Mischkulturen aus unterschiedlichen Spezies und / oder Stämmen einer Spezies festgestellt
(RYSER et al. 1996).
Als Kontaminationsquellen sind dabei vor allem die Fäzes der Schlachttiere und das Personal
anzusehen (WEISS u. AMTSBERG 1995). Lokalisationen, an denen Sekundärkontaminatio-
nen auftreten, müssen an jedem einzelnen Punkt der Herstellung vermutet werden und ent-
stehen vermutlich über den Kontakt des Fleisches mit Schneidebrettern, Messern, anderen
Oberflächen und über den Kontakt mit Menschen (JOHNSON et al. 1990).
Tab. 3: Inzidenz von L. monocytogenes sowie Listeria spp. bzw. L. innocua in Fleisch undFleischerzeugnissen.
Probe Anteil der Probenmit positivem Nachweis von
L. mono Listeria spp. L. innocua
Referenz
rohes Fleisch (Schwein)Hackfleisch (Rind)Wurstwaren
15,9 %9,5 %14,3 %
19,0 %43,2 %43,9 %
(ja) COMIet al. (1992)
rohes Fleisch (Schwein) 35,7 % 60,0 %nicht L. m
k. A. WANGet al. (1992)
rohes Fleisch, stückigrohes Fleisch, zerkleinert(v. a. Hack- undSchabefleisch)
8,6 %23,6 %
32,9 %29,8 %
k. A. NOACK u.JÖCKEL (1993)
Hackfleisch (Rind)Wurst (Schwein)Hackfleisch (Pute)Geflügelfleisch
40 %*100 %*40 %*60 %*
89 %96 %76 %75 %
60 %*40 %*
100 %*80 %*
RYSERet al. (1996)
Hackfleisch (Schwein) 13,5 % k. A. k. A. HILDEBRAND etal. (2001)
Hackfleisch (Schwein)gemischtes Hackfleisch(50 % Schwein, 50 %Rind)
20,6 %25,0 %
k. A. k. A. INOUEet al. (2000)
400 Hackfleischproben(Schwein bzw. Rind)
10,8 % 17,5 % k. A. FANTELLI u.STEPHAN (2001)
* von 15 Listeria spp.-positiven Proben
Schrifttum
23
2.3 Methoden zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln
2.3.1 Kulturelle Nachweismethoden
Ältere Studien demonstrierten das Auftreten von falsch-negativen Ergebnissen nach Durch-
führung verschiedener kultureller Nachweis- und Referenzmethoden (HEISICK et al. 1989;
KING et al. 1989; NIEDERHAUSER et al. 1992; RYSER et al. 1996; WALKER et al. 1990).
HAYES et al. ermittelten 1992, dass in 25 % aller L. monocytogenes-positiven Lebensmittel
der Zoonoseerreger kulturell nicht nachweisbar war. Falsch-negative Resultate gängiger
mikrobiologischer Referenzmethoden, die noch immer als golden standard für den Nachweis
von Listeria monocytogenes herangezogen werden, hatten zur Ursache, dass entweder die
L. monocytogenes-Kontamination aus einer sehr geringen Anzahl Bakterien bestand oder die
Zielkeime sich nicht homogen über die Untersuchungsmatrix verteilten.
Die Identifikation von L. monocytogenes gelang generell häufiger, sobald die Lebensmittel-
proben in mehr als einem Anreicherungsmedium angereichert wurden (SCHMIDT et al.
1988; HAYES et al. 1992; RYSER et al. 1996; SCOTTER et al. 2001).
2.3.1.1 Erfahrungen mit den Medien der Amtlichen Methode nach § 35 LMBG
(DIN EN ISO-Methode 11290-1 von 1996 – qualitativer Nachweis)
Studien mit dem Referenzverfahren DIN EN ISO-Methode 11290-1 (1996) belegten, dass
L. monocytogenes-positive aber auch L. innocua-positive Proben mit dem kulturellen
Verfahren nicht in jedem Fall identifizierbar sind (Tab. 4).
Die Arbeitsgruppe nach § 35 LMBG „Molekularbiologische Methoden – Mikrobiologie“ des
damaligen BgVV (ANON. 2002) stellte zwei kritische Punkte in der praktischen Durch-
führung heraus:
Erstens waren Proben, die auch L. innocua enthielten, anfällig für falsche Diagnosen. Dafür
wurden sowohl das kompetitive Wachstum als auch fehlerhafte Interpretation von L. innocua
als L. monocytogenes verantwortlich gemacht. Zweitens konnte L. monocytogenes aus LM
mit viel Begleitflora nicht isoliert werden.
Schrifttum
24
Tab. 4: Leistungsfähigkeit des kulturellen Referenzverfahrens nach § 35 LMBG (DIN ENISO 11290-1 (1996).
Spezifität Sensitivität Referenz
100 % 93,6 % BECKER et al. (1998)
97,4 % 85,6 % SCOTTER et al. (2001)
95,0 % 88,3 % ANON. (2002)
Erfahrungen mit den selektiven Anreicherungsmedien und Nährböden gemäß DIN EN ISO
11290-1 von 1996 (§ 35 LMBG) wurden seit deren Entwicklung gegen Ende der 1980er Jahre
gewonnen.
FRASER und SPERBER (1988) entwickelten die Fraser-Bouillon (Fraser) mit der Ziel-
setzung, die präsumtive Anwesenheit von Listerien in Proben anhand des Anreicherungsme-
diums ablesen zu können. Alle Listeria spp. hydrolysieren Äskulin. In Fraser reagieren Eisen-
ionen mit den Produkten der Äskulinhydrolyse zu stabilen Komplexen, erkennbar an einem
schwarzen Präzipitat. Nach dem Bebrüten wurden Anreicherungskulturen, die sich schwärz-
ten, als listerienverdächtig bezeichnet. Die Schwärzung vollzog sich besser bei 35°C als bei
30°C und war nach 24 h komplett abgeschlossen.
In anderen Versuchen trat die Schwarzfärbung erst nach 48 h bei allen Proben ein (WALKER
et al. 1990). Schließlich färbten sich auch Anreicherungskulturen, die keine Listerien enthiel-
ten, schwarz (WALKER et al. 1990).
Das selektive Agens Akriflavin beeinträchtigt das Wachstum von Listeria monocytogenes
nicht aber von Listeria innocua, wodurch letzterer insbesondere in Fraser (höher konzentriert
als Halbfraser) einen Selektionsvorteil hat (BEUMER u. HAZELEGER 2003).
Auf dem nach DIN EN ISO 11290 vorgeschriebenen Oxford-Agar (CURTIS et al. 1989)
bilden sich i. d. R. nach 24 h Inkubation präsumtive Listerienkolonien, die makroskopisch zu
erkennen sind – zum einen an der Färbung, zum anderen an den schwarzen Höfen, die sich
aufgrund der Reaktion zwischen Produkt der Äskulinhydrolyse und Eisen-Ammonium-Citrat
bilden. Nach 48 h weisen typische Kolonien eingesunkene Zentren auf. Die Produktivität von
L. monocytogenes als auch L. innocua erschien annähernd gleich zu sein.
Bei erheblichem Wachstum der Begleitflora wurde die Isolation von Listeria spp. teilweise
unmöglich (BUNČIĆ 1991; KORSAK et al. 1998).
Schrifttum
25
Der zweite feste Nährboden, den die DIN EN ISO 11290 vorschreibt, ist der PALCAM-Agar
(VAN NETTEN et al. 1989). Auch im PALCAM-Agar sind Äskulin und Eisen enthalten, so
dass nach 24 h Inkubation ca. 1 mm große, graugrüne Kolonien entstehen, die regelmäßig
nach 48 h in den Zentren eingesunken und von schwarzen Höfen umgeben sind.
SCOTTER et al. (2001) demonstrierten eine höhere Sensitivität des PALCAM-Agars, die
allerdings nicht signifikant war. In Fleischerzeugnissen wurde mit Oxford-Agar, PALCAM-
Agar und LPM je eine vergleichbare Anzahl positiver Nachweise ermittelt (CORDANO u.
ROCOURT 2001). Weitere Studien bestätigen PALCAM gegenüber Oxford als sensitiveren
und selektiveren Nährboden für die Isolation von Listerien (JOHANSSON 1998; WANG et
al. 1992). Bei Untersuchungen von Fleisch bzw. Fleischerzeugnissen verhinderte PALCAM-
Agar das Wachstum der Begleitflora effektiver als Oxford-Agar (WANG et al. 1992;
GUNASINGHE et al. 1994).
Die Ergebnisse verdeutlichen die Abhängigkeit der tatsächlichen Sensitivität der festen
selektiven Nährmedien von der Art der untersuchten Lebensmittelprobe. In vergleichenden
Studien konnte kein Nährbodentyp in jedem Fall Listerien aus den Proben isolieren. Die
Verwendung zweier Nährmedientypen zur Differenzierung wurde als positiv bewertet,
wenn nicht gar als notwendig angesehen (BRUNNER u. BÜLTE 2001; CORDANO u.
ROCOURT 2001; JINNEMAN et al. 2003; SCHMIDT et al. 1988).
Lebensmittel enthalten häufig Mischkontaminationen, in denen L. innocua aufgrund einer
kürzeren Generationszeit den eigentlichen Zielkeim in der Anreicherungskultur überwachsen
kann, was dann zu falsch-negativen Ergebnisse führt (BECKER et al. 1998; BRUNNER u.
BÜLTE 2001; CURIALE u. LEWUS 1994; JOHANSSON 1998). In Abwesenheit von
Listeria innocua wurde Listeria monocytogenes immer nachgewiesen. Je größer ein gegebe-
nes Verhältnis von Listeria monocytogenes zu Listeria innocua ist, desto wahrscheinlicher ist
der Nachweis des Erregers (CURIALE u. LEWUS 1994). Obwohl das Verhältnis 1:2 betrug,
wurden nur 5,4 % der Erreger-enthaltenden Proben als solche identifiziert. Damit wird die
entscheidende Bedeutung des Verhältnisses von L. monocytogenes zu L. innocua deutlich.
Die bevorzugte Wiederfindung von Innocua ist vereinbar mit den Unterschieden in der
Wachstumsrate.
Schrifttum
26
Falsch-negative Ergebnisse konnten dadurch erklärt werden, dass v. a. L. innocua aufgrund
einer schnelleren Generationszeit L. monocytogenes überwuchs und interferierte bzw. dass die
Medien nicht das Potential hatten, zwischen L. monocytogenes und L. innocua zu unterschei-
den (JOHANSSON 1998). Daraus folgt, dass der Nachweis von nicht-pathogenen Listerien in
Lebensmitteln nicht die Möglichkeit ausschließt, dass L. monocytogenes enthalten sein
könnte, jedoch nicht isoliert wurde. Bei JOHANSSON (1998) belief sich die Übereinstim-
mung bezüglich positiver Proben, die mit unterschiedlicher Sensitivität mittels verschiedener
Nährböden erkannt wurden, auf 77 % (Übereinstimmung für alle Proben und alle Nährböden).
Es wurde vorgeschlagen, neue Differenzierungsnährböden in das Protokoll der ISO 11290-
1 zu integrieren, damit die Identifizierung von L. monocytogenes in zusätzlichen positiven
Proben ermöglicht wird, die evtl. nicht mit der bisherigen Vorgehensweise erkannt würden
(BEUMER u. HAZELEGER 2003). Die Häufigkeiten von L. monocytogenes in Lebens-
mitteln würden dann mit großer Wahrscheinlichkeit höhere Werte erreichen.
Arbeiten liegen vor zum Rapid’ L. mono-Agar (BECKER u. MURPHY 2001; POLIVKA
2001; GRACIEUX et al. 2002), zum Agar Listeria nach Ottaviani und Agosti (ALOA)
(VLAEMYNCK et al. 2000; BAUWENS et al. 2003; BÜLTE et al. 2003; GRACIEUX et al.
2003), zum BCM L. monocytogenes-Agar (BCM-Agar) (JINNEMAN et al. 2003) und zum
Listeria monocytogenes-Blutagar (LMBA) (JOHANSSON 1998; BRUNNER u. BÜLTE
2001).
Schrifttum
27
2.3.2 Immunologische Methoden
2.3.2.1 Allgemeines
Als immunologische Methoden werden alle Analyseverfahren bezeichnet, die auf der
Immunoreaktion zwischen Antigen und Antikörper unter Bildung eines Antigen-Antikörper-
Komplexes basieren. Die Immunoreaktion verläuft nach dem Massenwirkungsgesetz
(OELLERICH 1983, S. 239f; NELSON u. COX 2001, S. 242 f).
Markersubstanzen für die Reagenzien eines Immunoassays können radioaktive Isotope oder
Enzyme, Hemmstoffe von Enzymen, fluorogene Substrate, Fluoreszenzfarbstoffe und
metallische Atome sein (OELLERICH 1983, S. 236 – 237, S. 233).
Antigen-Antikörper-Reaktionen mit enzymmarkierten Reagenzien (Enzymimmunoassay,
EIA, und Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) verfügen im Vergleich zu anderen
immunologischen Methoden über eine um 2 bis 3 Zehnerpotenzen gesteigerte Nachweis-
empfindlichkeit (BAUMGART et al. 1997, III.4, S. 2).
Für den Nachweis von Antigenen in der Lebensmitteldiagnostik kommt hauptsächlich der
ELISA zum Einsatz. Verwendete Systeme sind der Sandwich-ELISA (nicht-kompetitiver
ELISA) und der kompetitive ELISA, die sich in ihrem Testprinzip unterscheiden
(BAUMGART et al. 1997, III, S. 2 – 4; GOTTSTEIN 1991).
2.3.2.2 Immunologische Verfahren zum Nachweis von Listeria (monocytogenes)
Innerhalb der Gattung Listeria gibt es eine beträchtliche Anzahl gemeinsamer Antigene
(SEELIGER u. JONES 1986), weshalb Listeria monocytogenes nicht auf Basis konventio-
neller serologischer Reaktionen identifiziert werden kann.
Polyklonale Antikörper gegen Listeria spp. erwiesen sich als nicht gattungsspezifisch (GRAY
u. KILLINGER 1966). Um L. monocytogenes z. B. in LM nachzuweisen, wurden auf
monoklonalen Antikörpern (mAK) basierende Enzymimmunoassays entwickelt (FARBER u.
SPEIRS 1987; FARBER et al. 1988; McLAUCHLIN et al. 1988; McLAUCHLIN u. PINI
1989). Diese mAK richteten sich gegen Proteine (BUTMAN et al. 1988), Zell-
oberflächenproteine (FARBER u. SPEIRS 1987; BHUNIA et al. 1991), Stoffwechselprodukte
und Virulenzfaktoren wie Listeriolysin O (NATO et al. 1991).
Schrifttum
28
Listeriolysin O zeigte strukturell strenge Homologien zu Cytolysinen von Streptococcus
pyogenes und von Streptococcus pneumoniae (KEHOE et al. 1987; MENGAUD et al. 1987,
1988), die sich immer wieder in Kreuzreaktionen niederschlugen (NATO et al. 1991).
Frühe mAK reagierten entweder gattungsspezifisch mit Listerien (BUTMAN et al. 1988;
FARBER u. SPEIRS 1987; MATTINGLY et al. 1988; McLAUCHLIN et al. 1988) oder mit
L. monocytogenes, wobei Kreuzreaktionen mit L. welshimeri und / oder L. innocua
(SIRAGUSA u. JOHNSON 1990; BHUNIA et al. 1991) auftraten.
Der Schwerpunkt der Entwicklung von Listeria spp.-spezifischen Antikörpern verlagerte sich
auf das Protein p60 (s. Tab. 5).
Für einen indirekten Fluoreszenz-Immunoassay wurden polyklonale Antikörper (pAK)
hergestellt, die sich gegen ein extrazelluläres 60 kDA Protein (p60; Tab. 5) von L. mono-
cytogenes richteten. Das Anti-p60-Antiserum reagierte mit verschiedenen Listerien-Stämmen
(RUHLAND et al. 1993). Alle Spezies der Gattung Listeria sekretieren p60 als extrazelluläres
Protein (BUBERT et al. 1992a), wobei das p60 von Listeria monocytogenes charakteristische
Unterschiede in der Aminosäuren-Sequenz gegenüber anderen Listerien-Arten aufweist.
Bei invasiven Stämmen ist die Aktivität der Sekretion sehr hoch (KUHN u. GOEBEL 1989;
BUBERT et al. 1992b). Das p60 kommt an der Zelloberfläche gleichmäßig verteilt vor
(RUHLAND et al. 1993).
Aufgrund dieser Charakteristika ist das p60 prädestiniert, in der Lebensmitteldiagnostik als
Ziel-Antigen für Listeria monocytogenes zu fungieren.
Tab. 5: Charakterisierung des Antigens p60 (sowie des p60-kodierenden Gens iap).
Eigenschaften Referenz
Protein in Überständen von Anreicherungskulturen jede Listeria-Spezies besitzt spezifisches Molekulargewicht
KUHN u. GOEBEL 1989
Mureinhydrolase: essentiell für die Vermehrungsfähigkeit der Zelle WUENSCHER et al. 1993
thermoregulierte Genexpression RUHLAND et al. 1993
kodiert durch das iap-Gen („invasion associated protein“) KÖHLER et al. 1990
interne iap-Sequenzen für die spezies-spezifische Differenzierung von Listeria monocytogenes oder von Listeria innocua geeignet
BUBERT et al. 1992a, 1992b, 1999; FURRER et al. 1991; NIEDERHAUSER et al. 1992
Schrifttum
29
Mit g a n z e n Zellen von L. monocytogenes reagierte das Anti-p60-Antiserum in jedem Fall
und unabhängig von der Wachstumsphase der Kultur und von der Inkubationstemperatur
(RUHLAND et al. 1993). In Ü b e r s t ä n d e n von Kulturen, die sich in einer frühen oder
mittleren Wachstumsphase befanden, war das p60 hingegen n i c h t nachweisbar.
Inkubationstemperaturen von 37°C begünstigten die Antigen-Antikörper-Reaktion: bei
geringeren Temperaturen (26°C) war eine weniger intensive Reaktion zu beobachten. Bei
apathogenen L. monocytogenes-Stämmen stagnierte die Sekretion des p60, nicht aber die
Genexpression des p60 als Zelloberflächenantigen.
Antiserum gegen ein synthetisches Peptid reagierte mit p60 aller L. monocytogenes-
Serotypen, ohne mit anderen Listeria spp. kreuzzureagieren (BUBERT et al. 1994). Die pAK
reagierten im ELISA mit sekretiertem p60, was anzeigte, dass zusätzlich zur denaturierten
Form des p60 auch das native Antigen erkannt wurde. Zusätzlich wurde das Vorhandensein
von p60 in Listeria monocytogenes-Feldstämmen nachgewiesen.
2.3.2.3 Anwendung Listeria spp.-spezifischer Enzymimmunoassays
Allgemeine Mängel der kulturellen wie auch immunologischen Nachweissysteme offenbarten
sich ebenso wie die Inkompatibilität von Bestandteilen des Analysensystems wie
Anreicherung und Differenzierung (FELDSINE et al. 1997).
Die Sensitivität eines immunologischen Testsystems scheint von der Art des untersuchten
Lebensmittels wie auch von der für ein LM typischen bakteriellen Flora abhängig zu sein
(BEUMER u. BRINKMAN 1989; HEISICK et al. 1989; BARBUTI et al. 1995), und die
Notwendigkeit, Inkubationszeiten an die Nachweismethoden anzupassen, wurde deutlich. Die
Nachweisbarkeit scheint sowohl von der initialen Listerienanzahl als auch von der Vitalität
der Zielkeime und von der Konzentration der lebensmitteltypischen Mikroflora abzuhängen
(HEISICK et al. 1989). Diese Tatsache erlaubt den Schluß, dass bei einem Methodenvergleich
zwischen einem neuen Test und einer Standardmethode die ermittelte Leistungsfähigkeit
eines Tests von Sensitivität und Selektivität der verwendeten Medien abhängig ist. Dieser
Zusammenhang wird durch die Aussagen einer Studie bekräftigt, bei der kulturelle Ergebnisse
getrennt nach Typ des Nährbodens dokumentiert wurden (CAPITA et al. 2001). Sensitivitäts-
und Spezifitätsgrade sowie die Übereinstimmungsgrade zwischen der kulturellen Methode
und Immunoassay wurden nachfolgend in Abhängigkeit vom Agartyp ermittelt.
Schrifttum
30
Ein Ansatz, den Anteil (falsch-)positiver Diagnosen eines getesteten immunologischen
Systems gegenüber der kulturellen Methode zu verringern, war es, jede Probe, sobald sie als
Listeria-positiv identifiziert war, als (richtig-)positiv anzusehen (HEISICK et al. 1989;
BECKER et al. 1998).
Zur Verkürzung des Untersuchungszeitraums wurden Methoden erprobt, den Zielkeim aus
dem LM zu konzentrieren und zu extrahieren. Die Konzentrierungsmethoden wurden
teilweise mit einem, selektiven oder nicht-selektiven, Anreicherungsschritt kombiniert
(SHERIDAN et al. 1991, 1997; CLOAK et al. 1999).
Verschiedene Kombinationen aus mehreren Anreicherungsmedien wurden durchführt, um die
vergleichsweise erfolgversprechendste zu ermitteln (ROBERTS 1994). Kombinationen mit
Halbfraser-Bouillon stellten sich als die effektivsten heraus. Bei 30°C wurden noch Antigene
(Flagellen) ausgebildet, während die Wachstumsrate der Keime suboptimal war.
Die Nachweisgrenze eines Sandwich-ELISA lag bei über 106 KbE pro ml (KERR et al. 1990).
Die Resultate ließen vermuten, dass der ELISA in Proben mit geringen Konzentrationen von
Listerien falsch-negative Ergebnisse erzielte; nach Reinkubation über 24 Stunden lieferte der
Test positive Listerien-Nachweise.
Vergleichende Untersuchungen mit immunologischen Testsystemen (z. T. automatisiert wie
EiaFoss oder VIDAS LIS, Vitek Immunodiagnostic Assay System) und herkömmlichen
Methoden wurden durchgeführt (HEISICK et al. 1989; WALKER et al. 1990; ROBERTS
1994; FELDSINE et al. 1997; KERDAHI u. ISTAFANOS 1997; PETERSEN u. MADSEN
2000).
Nachdem früher mit Hilfe der entwickelten Enzymimmunoassays und Koloniematerial der
Nachweis von Listerien in LM geführt wurde (FARBER u. SPEIRS 1987; McLAUCHLIN u.
PINI 1989), gelangen immunologische Systeme heute typischerweise nach selektiven
Anreicherungsschritten zur Anwendung (MATTINGLY et al. 1988; S∅ LVE et al. 2000; s.
auch Tab. 6).
Die Tabellen 6 und 7 enthalten Ergebnisse verschiedener Studien, die Untersuchungen von
dotiertem Fleisch bzw. Feldproben mit Hilfe von genus-spezifischen immunologischen Test-
systemen durchführten.
Schrifttum
31
Tab. 6: Nachweisgrenzen verschiedener Listeria spp.-spezifischer immunologischer Nach-weissysteme nach Untersuchungen von dotiertem Fleisch.
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Schrifttum
32
Tab. 7: Sensitivität und Spezifität verschiedener Listeria spp.-spezifischer immunologischer Nachweissysteme nach Untersuchungen von Feldproben.
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Sensitivität (Immunologisches System) 25
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Immunologisches System –, Kultur + 3 2 5 1
Immunologisches System +, Kultur – 0 0 0 0
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Schrifttum
33
2.3.2.4 Anwendung Listeria monocytogenes-spezifischer Enzymimmunoassays
Der Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA (Zielantigen p60) wurde auf künstlich
kontaminierte Hackfleisch- und Brühwurstproben (rohe und hitzebehandelte Fleisch-
erzeugnisse) sowie auf Feldproben von rohen Lebensmitteln angewendet, die nach
zwei Anreicherungsschritten untersucht wurden (KLEINER u. SCHINKEL 2002). Die
Ergebnisse (s. Tab. 8) wurden mit den kulturellen Nachweisergebnissen gemäß § 35 LMBG
in Beziehung gesetzt. Dieses ELISA-System bewies dieselbe Sensitivität wie die amtliche
Methode nach § 35 LMBG, wobei die Nachweisrate in deutlicher Abhängigkeit zur
anfänglichen Kontaminationsrate zu sehen war. Innerhalb von 2 Tagen lag der Anwesenheits-
bzw. Abwesenheitsnachweis von L. monocytogenes vor. Weil mit dem Überstand einer
Listerien-Anreicherung gearbeitet wird, sind weniger Komponenten der Lebensmittelprobe in
dem zu untersuchenden Aliquot (0,1 ml) vorhanden. Ein negativer Einfluß auf die
Nachweisgrenze des ELISA-Systems wird dadurch unwahrscheinlicher. Der p60-Nachweis
wird anhand von denaturierten Zellen geführt, was für das Laborpersonal den Vorteil bietet,
im geringeren Umfang mit infektiösem Material arbeiten zu müssen.
Eine vergleichende Studie unternahmen KERDAHI und ISTAFANOS (2000). Sie unter-
suchten künstlich kontaminierte Lebensmittel mit dem VIDAS LMO (Vitek Immuno
Diagnostic Assay System Listeria monocytogenes) (s. Tab. 8).
In Abhängigkeit vom Inokulationsniveau wurden 100 % und 89 % der positiven Proben
bestätigt. Die positive Bestätigung gelang mit einer DNA-Gensonde bei 96 % und 87 % der-
selben Proben. Der VIDAS LMO kombiniert mit der DNA-Gensonde erwies sich in einem
Vergleich mit dem kulturellen Nachweis als sehr spezifisches System, das nach Anreicherung
zwischen L. monocytogenes und anderen Listeria spp. unterscheiden kann.
Tab. 8: Nachweisgrenzen verschiedener L. monocytogenes-spezifischer immunologischer Nachweissysteme nach Untersuchungen von dotierten Lebensmitteln.
Probenmaterial Dotiert: Immunologisches System
Nachweisgrenze Referenz
Gemüse, Räucherlachs
1 – 10 und 10 – 100 KbE/25 g
VIDAS LMO 1 – 10 bis 10 – 100 KbE/25 g
KERDAHI u. ISTAFANOS (2000)
Hackfleisch, Brühwurst
1 und 10 KbE/10 g
Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA
1 KbE/10 g
KLEINER u. SCHINKEL (2002)
Schrifttum
34
BECKER et al. (1998) führten auch Untersuchungen mit den ELISA-Testkits von Merck
(Pathalert Listeria monocytogenes) und bioMerieux (VIDAS LMO) durch.
Die untersuchten Proben und prinzipiell die Vorgehensweise waren dieselben wie bei dem
gattungs-spezifischen Nachweis (2.3.2.3). Die Testsysteme zeigten eine Anfälligkeit für
falsch-negative Ergebnisse. Sie erwiesen sich aber als geeignet, in einer Mischkultur aus
L. monocytogenes und L. innocua den Erreger nachzuweisen. In einer anderen Probe
korrespondierten die immunologischen Tests bezüglich des positiven Ergebnisses, obwohl aus
keiner Anreicherung kulturell L. monocytogenes isoliert wurde. Allerdings wurde kulturell
mehrfach L. innocua differenziert.
Prinzipiell ist der Nachweis nur schwach hämolytischer Monocytogenes-Stämme möglich,
wie anhand des Pathalert Listeria monocytogenes gezeigt wurde (FRIEDRICH u.
SCHUBERT 1995).
Mittlerweile stehen mAK zur Verfügung, die ausschließlich l e b e n d e Listerien – auch
L. monocytogenes-spezifisch – detektieren (TORENSMA et al. 1993; KATHARIOU et al.
1994). Diese mAK könnten bei immunologischen Separationen nützlich sein, die im Vorfeld
einer PCR durchgeführt werden könnten (S∅ LVE et al. 2000). Dadurch könnten falsch-
positive PCR-Ergebnisse ausgeschlossen bzw. könnten Anreicherungszeiten reduziert
werden.
Schrifttum
35
2.3.3 Molekularbiologische Methoden
Bei den molekularbiologischen Methoden gibt es zum einen die Möglichkeit der direkten
DNA-Hybridisierung mit molekularen Gensonden. Zum anderen ist im Rahmen der
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach der Vervielfältigung (Amplifikation) von DNA-
Abschnitten die Darstellung spezifischer PCR-Produkte (Amplifikate) möglich. Eine Anzahl
von Gensonden (Segmente einzelsträngiger Nukleinsäuren) wurden für den Nachweis von
L. monocytogenes konstruiert und radioisotopisch (KLINGER et al. 1988), enzymatisch
(KING et al. 1989) oder chemolumineszent (BOBBITT u. BETTS 1992; NINET et al. 1992;
BECKER u. MURPHY 2001) markiert. Die Sonden basierten entweder auf dem Listeriolyin
O-(β-Hämolysin-) Gen (CHENEVERT et al. 1989; DATTA et al. 1987, 1988a, 1988b, 1990;
KIM et al. 1991) oder auf einer 16s rRNA-Sequenz (KLINGER et al. 1988; KING et al. 1989;
BOBBIT u. BETTS 1992; NINET et al. 1992; BECKER u. MURPHY 2001).
NASBA®, eine alternative, isothermal ablaufende Amplifikationstechnik, wurde ebenfalls
erprobt (UYTTENDAELE et al. 1995). Die Amplifikationsprodukte wurden per Agarosegel-
Elektrophorese oder Enzyme Linked Gel Assay (ELGA) nachgewiesen. Die enzymmarkierte
ELGA-Sonde war spezifisch für 16s rRNA und hybridisierte mit den NASBA®-Produkten.
Nicht-hybidisierte ELGA-Sonden und Hybride wurden mittels vertikaler Polyamidgel-
Elektrophorese getrennt.
Die Nachweisgrenze betrug 2 x 106 KbE Listeria monocytogenes pro ml.
Die PCR ist ein Instrument für die exponentielle Vervielfältigung gesuchter Nukleotid-
sequenzen von Genombereichen, die z. B. für den spezifischen Nachweis von Listeria
monocytogenes geeignet sind. Die PCR steigert die Sensitivität des Nachweises, der
theoretisch mit einem einzigen Molekül der Ziel-DNA geführt werden kann (BEJ et al. 1990).
Die DNA-Sequenz erreicht nachweisbare Konzentrationen, die z. B. durch Agargel-
Elektrophorese oder DNA-Hybridisierung dargestellt werden können.
In Schritt 1 (Denaturierung der DNA-Doppelstränge) des ersten Amplifikationszyklus einer
PCR wird die DNA durch Erhitzen auf 95°C in ihre Einzelstränge überführt.
In Schritt 2 (Annealing) erfolgt eine Abkühlung auf ca. 55°C. Die Primer können mit den
3‘-Enden der komplementären Abschnitte der Einzelstränge hybridisieren.
Schrifttum
36
Für Schritt 3 (DNA-Synthese bzw. Elongation) wird die Temperatur auf die optimale
Reaktionstemperatur der hitzestabilen DNA-Polymerase (72°C) erhöht. Die DNA-Polymerase
kopiert von 3‘ nach 5‘ einen neuen komplementären Strang unter Verwendung der vier
Nukleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Der neue Strang ist einseitig begrenzt durch die
Sequenz des Primers und enthält die Sequenz, die komplementär zum zweiten Primer ist.
Im zweiten Zyklus dient der neu synthetisierte Strang neben dem ursprünglichen als Matrize.
Weil der Strang mit der Sequenz des ersten Primers endet, kommt es bei der DNA-Synthese
an dieser Stelle zum Kettenabbruch. Durch Wiederholung der Zyklen kommt es zu einer
exponentiellen Vervielfältigung des zwischen den beiden Primern gelegenen DNA-
Abschnittes (CANDRIAN et al. 1991).
2.3.3.1 PCR als integrales System
Die Definition integraler Systeme ist, dass alle Prozessschritte einer Analyse, bei der als
letzter Schritt eine PCR durchgeführt wird, aufeinander abgestimmt sind (KRISMER et al.
2002). Dabei sind die Prozessschritte (Probenaufbereitung, Anreicherung, Extraktion der
DNA) geprüft worden, ob sie für die PCR in einem speziellen Fall kompatibel sind.
Die dringende Notwendigkeit, integrale Systeme zu etablieren, ergibt sich sowohl aus der
Komplexität als auch aus der Verschiedenheit der Lebensmittelmatrizes hinsichtlich ihrer
mikrobiologischen und chemischen Bestandteile.
2.3.3.2 Anreicherung der Zielkeime im Vorfeld der PCR
Die Keimzahlen der Ziel-Organismen liegen nach Anreicherung mit höherer Wahrschein-
lichkeit oberhalb der Nachweisgrenze eines PCR-Systems (CANDRIAN et al. 1991). Vor der
Durchführung des eigentlichen Schnelltests erfolgen oft zweistufige Inkubationsschritte,
damit geringe Mengen von Pathogenen in Lebensmitteln höhere Zielkeim-Konzentrationen
erreichen, die genügen, um detektiert werden zu können.
Gegenstand heutiger Studien ist das Interesse, mit Hilfe von Schnellmethoden innerhalb eines
Tages zu einer Diagnose über die Präsenz von L. monocytogenes zu gelangen (DEVER et al.
1993).
Die PCR ist eine hochsensitive Methode (s. 2.3.3). Sie ist in der Lage, DNA von toten
respektive nicht vermehrungsfähigen Mikroorganismen nachzuweisen.
Schrifttum
37
Durch die Verdünnung mit einem Anreicherungsmedium reduziert sich das Risiko falsch-
positiver Ergebnisse durch nicht kultivierbare Mikroorganismen (CANDRIAN et al. 1991;
WERNARS et al. 1992; NIEDERHAUSER et al. 1992; SCHEU et al. 1998).
Verglichen mit der Nachweisgrenze für Reinkulturen oder reiner DNA liegt die Nachweis-
grenze für natürliche Proben oft deutlich höher (WERNARS et al. 1992; ROSSEN et al. 1991,
1992; DICKINSON et al. 1995). Das Erreichen einer höheren Zielkeim-Konzentration mit
Hilfe einer Anreicherung ist gerade bei der Diagnostik aus Lebensmittelmatrizes von Be-
deutung, weil bei der Durchführung der PCR technische Probleme durch Inhibitions-
phänomene auftreten können (ROSSEN et al. 1992). In einer Studie zum PCR-Nachweis von
Yersinia enterocolitica inhibierte ein Zusatz von Schweinefleischhomogenat die PCR-
Reaktion vollständig (LANTZ et al. 1998). Anreicherungsmedien (z. B. Fraser) können
inhibierend auf eine PCR-Reaktion wirken (ROSSEN et al. 1991, 1992). Die PCR toleriert
lediglich 0,0001 % der gebräuchlichen Eisen-Ammoniumcitrat-Konzentration, was einer 50-
fachen Verdünnung der Fraser-Bouillon entspricht (ROSSEN et al. 1992). PCR-Inhibitoren
werden durch eine Anreicherung vor der PCR-Amplifikation ebenfalls verdünnt.
Die Anreicherung von Lebensmittelproben vor der PCR-Analyse wurde in vielen Studien
angewendet (Tab. 10) und ist i. d. R. angezeigt.
Die direkte PCR (Verzicht auf Anreicherung) bietet die Möglichkeit, schwer kultivierbare
Mikroorganismen nachzuweisen oder Proben zu analysieren, die ohnehin mit einer hohen
Konzentration des Zielkeimes belastet sind (BECKER u. HOLZAPFEL 2002). Die direkte
PCR zum Nachweis von L. monocytogenes aus Lebensmitteln (z. B. WERNARS et al. 1992;
MAKINO et al. 1995; SIMON et al. 1996) wird als eine nicht praktikable Methode für die
Routine-Detektion angesehen. Gerade dem Nachweis dieses Erregers aus Fleisch sind enge
Grenzen gesetzt (ROSSEN et al. 1992; LANTZ et al. 1998; DICKINSON et al. 1995).
Nur geringe Volumina einer Anreicherungskultur resp. einer Lebensmittelprobe können je
PCR-Reaktion analysiert werden, was ein zusätzliches Problem bei der direkten Anwendung
einer PCR darstellt (CANDRIAN 1994).
Das limitierte Volumen der Aliquote in Verbindung mit einer nicht-homogenen Verteilung
der Zielkeime in der Lebensmittelmatrix kann zu falsch-negativen Resultaten in der Analyse
führen (z. B. GOLSTEYN THOMAS et al. 1991).
Schrifttum
38
Idealerweise wird während der Anreicherung das Wachstum einer Auswahl bestimmter
Keime unterstützt; und zwar am besten mehr als eine Spezies und / oder mehr als eine Art von
Interesse (CLOAK et al. 1999). BAILEY und COX (1992) beschrieben die Anwendung eines
simultanen Anreicherungsschrittes für Listeria und Salmonella in Lebensmitteln.
Ein simultaner Anreicherungsschritt wäre insofern vorzuziehen, als dass die Durchführung
billiger und weniger arbeitsintensiv wäre. Ein Nachteil ist die Selektivität einer einzigen
Anreicherungs-Bouillon für die verschiedenen Organismen und die Effektivität der Bouillon
bei der simultanen Isolation von gram-positiven und gram-negativen Mikroorganismen
(BEUMER u. HAZELEGER 2003).
Frische Anreicherungskulturen sollten bevorzugt eingesetzt werden, weil eine Lagerung zum
Abbau der DNA führen könnte (NIEDERHAUSER et al. 1992).
Zur Verkürzung der Nachweiszeit gibt es weitere Methoden, die die Konzentration und
Extraktion der Ziel-Spezies aus dem Lebensmittel ermöglichen (SCHEU et al. 1998).
2.3.3.3 Listeria monocytogenes-spezifische Zielsequenzen
Verschiedene Proteine wurden charakterisiert, die für die Pathogenität von L. monocytogenes
von Bedeutung sind. Dazu gehören das Listeriolysin O und die Zink-Metalloprotease.
Die Eigenschaften (letale Toxizität im Mausversuch, entzündungsauslösend) des Hämolysins,
als Listeriolysin O bezeichnet, führten zu der Annahme, dass es sich dabei um einen
wichtigen Pathogenitätsfaktor von L. monocytogenes handelt (GEOFFROY et al.1987). Es
wird kodiert durch das L. monocytogenes-spezifische hlyA-Gen (MENGAUD et al. 1988).
Das Listeriolysin O (Molekulargewicht 58 kDa), nicht zell-assoziiert, liegt in relativ großen
Mengen – verglichen mit sekretierten Mengen an Protein p60 – in den Überständen von
Anreicherungskulturen vor (KUHN u. GOEBEL 1989; RUHLAND et al. 1993). Es ist hämo-
lytisch aktiv und essentiell für die Virulenz bzw. das intrazelluläre Vorkommen von L. mono-
cytogenes (COSSART et al. 1989; PORTNOY et al. 1988). Die Serotypen 1/2b und 4b
verfügen über eine identisches Listeriolysin O (VINES u. SWAMINATHAN 1997). Trotz
zahlreicher Homologien mit anderen Cytolysinen in Sequenzen der Aminosäuren
(MENGAUD et al. 1987, 1988; KEHOE et al. 1987) besteht hinsichtlich der DNA-Sequenzen
keine substantielle Homologie (MENGAUD et al. 1988).
Schrifttum
39
Das hlyA-Gen steht im Mittelpunkt verschiedener PCR-Systeme (z. B. BESSESEN et al.
1990; BORDER et al. 1990; GOLSTEYN THOMAS et al. 1991; DENEER u. BOYCHUK
1991; FURRER et al. 1991; ROSSEN et al. 1991; FITTER et al. 1992; NIEDERHAUSER et
al. 1992; BASSLER et al. 1995).
Die Transkription von hlyA wird an die Milieubedingungen des Erregers angepasst und ist
dabei der Temperatur und der Wachstumsphase unterworfen: unter 30°C ist die Transkription
des hlyA-Gens gehemmt, bei 37°C hingegen beträgt die hämolytische Aktivität das 8- bis 16-
fache (LEIMEISTER-WÄCHTER et al. 1992). Die Transkription von hlyA zeigt zwei deut-
liche Peaks entlang der Wachstumskurve. Der erste Peak während des frühen exponentiellen
Wachstums erstreckt sich über einen kürzeren Zeitraum und ist schwächer ausgeprägt als der
zweite in der frühen stationären Phase (ab Stunde 10 der Inkubation) (MENGAUD et al.
1991b). Gegen Ende der exponentiellen Wachstumsphase und Beginn der stationären Phase
besteht in Überständen von Anreicherungskulturen eine maximale hämolytische Aktivität
(GEOFFROY et al. 1989). Bei GEOFFROY et al. (1989) erreichte die hämolytische Aktivität
ihren Höhepunkt nach 8 bis 10 h Inkubation, um danach sofort stark abzufallen. Nach 48 h
war das Listeriolysin O nicht mehr nachweisbar (MENGAUD et al. 1991b).
L. monocytogenes sekretiert eine Proteinase, die einen Pathogenitätsfaktor darstellt, zur
Gruppe der Zink-Metalloproteasen zählt und durch das mpl-Gen kodiert wird (DOMANN et
al. 1991; MENGAUD et al. 1991a). Das mpl-Gen ist stromabwärts des hlyA-Gens lokalisiert
und existiert ausschließlich bei pathogenen L. monocytogenes-Stämmen (LEIMEISTER-
WÄCHTER u. CHAKRABORTY 1989; DOMANN et al. 1991; MENGAUD et al. 1991a).
Das prfA-Gen kodiert ein DNA-bindendes Protein (FREITAG et al. 1993), prfA (positive
regulatory factor of listeriolysin A), das die Expression vieler L. monocytogenes-Virulenz-
gene, einschließlich hlyA-, mpl- und prfA-Gen, aktiviert (CHAKRABORTY et al. 1992;
LEIMEISTER-WÄCHTER et al. 1990; MENGAUD et al. 1991b).
2.3.3.4 Multiplex-PCR
Ziel der Multiplex-PCR ist es, verschiedene Amplifikate von Abschnitten der Ziel-DNA zu
erhalten. Dazu wird mehr als ein Primerpaar verwendet. Die Primerpaare sollen keine
homologen Sequenzen amplifizieren, ansonsten kann es leicht zu einem Fehlannealing der
Primer oder auch der Produkte kommen.
Schrifttum
40
Je unterschiedlicher die Amplifikate in ihrer Länge sind, desto leichter und eindeutiger
gestaltet sich der Nachweis (MÜLHARDT 1999).
Darüber hinaus erübrigt sich die weitere Identifizierung der Fragmente durch Methoden wie
Restriktionsenzymanalyse oder Hybridisierung mit Oligonukleotiden, weil sich der ver-
gleichsweise einfache Größenvergleich der PCR-Produkte für eine sichere Aussage als
ausreichend erwiesen hat (FURRER et al. 1991; NIEDERHAUSER et al. 1992).
Mit den ersten PCR-Systemen konnte entweder die Gattung Listeria oder die Art Listeria
monocytogenes detektiert werden (BUBERT et al. 1992a; DENEER u. BOYCHUK 1991;
FURRER et al. 1991).
BORDER et al. (1990) erzielte in einer einzigen PCR-Amplifikation 3 PCR-Amplifikate von
unterschiedlicher Größe, wovon eines als Listerien-spezifisch und ein anderes als
L. monocytogenes-spezifisch beschrieben wurde. 1991 erschien die erste Studie über die
Anwendung einer Multiplex-PCR für den Nachweis von Listerien in Lebensmitteln
(FURRER et al. 1991).
Neben dem Nachweis von Listeria monocytogenes geriet vor allem Listeria innocua in das
Zentrum des Interesses.
BUBERT et al. (1999) gelang es, eine Multiplex-PCR zu entwickeln, die parallel den
Nachweis von Listeria spp. und die Differenzierung zwischen Listeria monocytogenes,
Listeria innocua und zwei weiteren Gruppen (erste Gruppe: L. seeligeri, L. welshimeri,
L. ivanovii; zweite Gruppe: L. grayi, L. murrayi) zuließ.
Eine Weiterführung des Prinzips der Multiplex-PCR stellt die sogenannte MAMA-PCR
(Mismatch Amplification Mutation Assay-PCR) dar. Mit MAMA-Primern können Listeria
monocytogenes-Isolate identifiziert und nach den drei evolutionären Abstammungsgenotypen
von Listeria monocytogenes unterschieden werden, was den Zusammenhang zwischen LM-
Probe und einer Listeriose-Erkrankung herstellen kann (JINNEMANN u. HILL 2001).
2.3.3.5 Detektion der PCR-Produkte
Erste Studien über den Listeria monocytogenes-Nachweis nach der Durchführung einer PCR
stammen von dem Beginn der 1990er Jahre (BESSESEN et al. 1990; BORDER et al. 1990).
PCR-Produkte wurden seitdem i. d. R. mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese detektiert
oder mit Slot-Blot-Hybridisation bestätigt.
Schrifttum
41
Die Analyse mit Microarrays (Synonyme: Biochips, Microchips, DNA-Arrays, DNA-Chips
etc.) stellt eine Weiterentwicklung in der Hybridisierungstechnologie dar. Ein Microarray ist
ein stabiler Träger, auf dem DNA-Sonden in hoher Anzahl und Dichte in definierter Anord-
nung gebunden vorliegen. Es gibt grundsätzlich 2 Typen von Microarrays (HARRINGTON et
al. 2000): spotted DNA array und high density oligonucleotide array (Tab.9).
Tab. 9: Typen von Microarrays und deren Charakteristika.
• DNA-Amplifikate werden auf einen festen Träger (i. d. R. aus Glas) gedruckt („Spot“ = Punkt = kreisförmig bedruckte Fläche)
• entweder im hauseigenen Labor oder durch entsprechende Anbieter nach individuellen Wünschen produzierbar
Dieser Microarray-Typ kann mit verschiedenen Eigenschaften, die von den verwendeten Gensonden bestimmt sind, hergestellt werden (ZHOU 2003):
Spotted DNA array Quantifizierung möglich
• CGA (community genome array): Sonde besteht aus Genom in toto; Anwendung bei phylogenetischen Studien; (relativ) höchste Sensitivität und geringste Spezifität
• FGA (functional gene array): - Gensonden i. d. R. 200 – 1000 bp - differenziert DNA-Fragmente, die zu bis 80 – 85 % homolog sind • Oligonukleotid-FGA: - Gensonden i. d. R. 50 – 70 bp
(weiterentwickelter FGA) - differenziert DNA-Fragmente, die bis zu 86 – 90 % homolog sind
- Herstellung und Handhabung einfacher (im Vergleich zu FGA)
High density oligonucleotide array Quantifizierung möglich
Auf einem kleinen Glasträger entstehen in einer Abfolge chemischer Synthesen Tausende verschiedene Oligomer-Sonden (15 - 20 bp) an genau festgelegten Positionen. Anwendung: - qualitative Erfassung von Keimgehalten, Vergleich der Keimgehalte verschiedener Proben
- Erstellung mikrobieller Transkriptionsprofile (z. B. bei unterschiedlichen Milieubedingungen)
- kommerziell erhältlich
Die Microarray-Analyse hat das Potential, mikrobielle Kontaminationen hoch-spezifisch,
hoch-sensitiv und dabei quantitativ nachzuweisen (HOHEISEL u. VINGRON 1998; ZHOU
2003); dabei ist gleichzeitig ein hoher Probendurchsatz möglich (Automatisierbarkeit).
Kommerziell erhältlich sind Microarray-Testkits für den Nachweis von Bakterien wie z. B.
Escherichia coli und Bacillus subtilis (LUCCHINI et al. 2001). Der Nachweis von Listeria
monocytogenes mit Microarray-Technologie wurde von BUSCH et al. (2002) und HUBER et.
al. (2002) beschrieben.
Schrifttum
42
Der NUTRI®-Chip (= spotted DNA array) bestätigte erfolgreich die kulturell erhobenen
Diagnosen für verschiedene Feldproben (BUSCH et al. 2002; HUBER et al. 2002). Der
parallele Nachweis von Listeria monocytogenes, Campylobacter coli respektive jejuni und
Salmonella spp. konnte mit dem NUTRI®-Chip-Analysekit in einer einzigen Untersuchung
erzielt werden.
Die technische Umsetzung eines quantitativen Nachweises von mikrobiellen Genen wurde
besonders ausführlich bei CHO und TIEDJE (2002) beschrieben. Sie stellten die lineare Ab-
hängigkeit von (Hybridisierungs-)Signalstärke und DNA-Konzentration dar. Die Nachweis-
grenze ist abhängig und proportional zu der Menge an DNA, die auf dem Träger (Membran)
immobilisiert vorliegt. Die Nachweisgrenze für bakterielle Mischkulturen (Umgebungs-
proben) mittels Microarray-Analyse wurde mit 105 Zielzellen bzw. Zielsequenzen kalkuliert.
Dies war eine verhältnismäßig hohe Anzahl erforderlicher Zielkeime unter Berücksichtigung
herkömmlicher Hybridisierungsmethoden, die mit Hilfe einer Membran durchgeführt werden
und dabei i. d. R. Nachweisgrenzen im Femtogramm-Bereich erzielen. Grund dafür war, dass
jeder Bestimmungspunkt auf einer Membran (dot) mehr als 1 µg Sonden-DNA enthält,
wohingegen pro Bestimmungspunkt (spot) eines Glasträgers bzw. Microarrays maximal 20 pg
Sonden-DNA aufgetragen waren. Um das Problem der relativ hohen Nachweisgrenze zu
lösen, wurden Maßnahmen wie das Aufbringen von Sonden in größerer Dichte bzw. Menge,
eine Verbesserung des Systems zur Detektion der Microarray-Hybridisierungs-Signale und
die Anreicherung von Ziel-DNA bzw. von Zielkeimen vorgeschlagen.
2.3.3.6.1 Nachweisgrenzen und Spezifität von PCR-Systemen bei Untersuchungen
von Listeria monocytogenes-Reinkulturen
Seit 1990 wurden für den spezifischen Nachweis von Listeria monocytogenes mittels PCR
zahlreiche Primer entwickelt. Die Ziel-DNA-Sequenzen waren hauptsächlich Listeria
monocytogenes-spezifische, Virulenz-kodierende Gene (Tab. 10). Daneben wurden auch
rRNA-kodierende Gene für einen Nachweis identifiziert. Bei den meisten in der Tabelle 10
aufgeführten Studien waren nicht humanpathogene Listerien-Stämme, insbesondere Listeria
innocua, in den Versuchen berücksichtigt. Die Spezifität der Monocytogenes-spezifischen
Primerpaare und der Pathogenitätsfaktoren konnte in jedem Fall bestätigt werden.
Schrifttum
43
Gerade in älteren Studien wurden Nicht-Listerien-Stämme in die Experimente integriert
(BESSESEN et al. 1990; BORDER et al. 1990; DENEER u. BOYCHUK 1991; FITTER et al.
1992).
Die methodische Sensitivität (Nachweisgrenze) der PCR für den Nachweis aus Reinkulturen
betrug zwischen 5 KbE im günstigsten und 3 x 106 KbE im ungünstigsten Fall (Tab. 10).
Höhere Nachweisgrenzen (log 3 – 6 KbE Listeria monocytogenes) wurden v. a. nach dem
Jahr 1995 festgestellt. In manchen Fällen könnten für die Berechnung von Nachweisgrenzen
falsch-positive Ergebnisse zugrundegelegen haben, die auf PCR-Kontaminationen mit Ziel-
DNA basierten. Hätten diese tatsächlich vorgelegen, wären höhere Nachweisgrenzen ab log 3
eine realistische Größe, an der sich ein PCR-System zu messen hätte.
Wenige Studien legten die methodische Sensitivität von kommerziell erhältlichen PCR-
Systemen dar. Das BAXTM for Screening / Listeria monocytogenes-System war in der Lage,
log 4 KbE ml-1 Anreicherungskultur zu detektieren. Andere Arbeitsgruppen ermittelten für
dieses PCR-System Nachweisgrenzen zwischen log 5 und log 6 KbE ml-1 (STEWART u.
GENDEL 1998; BESSER 2000). Die Sensitivität wurde in Gegenwart hoher Konzentrationen
anderer Listeria spp. (u. a. Listeria innocua) sowie von Nicht-Listerien nicht negativ beein-
flusst. SCHEU et al. (1999) drückten die Nachweisgrenze mit der Anzahl der detektierbaren
Kopien einer Standard-DNA – in dem Fall 300 – aus.
Die Detektion der Amplifikate erfolgte meist mit Hilfe der Agargel-Elektrophorese und
Färbung der Amplifikate mit Ethidiumbromid. In einigen Fällen wurde zusätzlich ein
Southern Blot bestätigend durchgeführt (KLEIN u. JUNEJA 1997).
Die Sensitivität für das iap-spezifische Produkt unterschied sich je nachdem, welches
Detektionsverfahren verwendet wurde: die Agargel-Elektrophorese war sensitiv genug, eine
initiale Kontamination von etwa 3000 KbE ml-1 nachzuweisen; hingegen erwies sich die
Hybridisierung als annähernd 1000-fach sensitiver mit einer Nachweisgrenze von ca. 3 KbE
ml-1 (KLEIN u. JUNEJA 1997).
Kommerziell erhältliche PCR-Testkits für den Nachweis von L. monocytogenes sind z. B. das
BAXTM-System, die Listeria test-PCR und das PROBELIATM-PCR-Hybridisierungssystem.
Nähere Einzelheiten sind aus verschiedenen Veröffentlichungen zu entnehmen (CANDRIAN
et al. 1991; STEWART u. GENDEL 1998; BESSER 2000).
Schrifttum
44
Tab. 10: Nachweisgrenzen und Spezifität von PCR-Systemen bei Untersuchungen von Listeria monocytogenes-Reinkulturen. Referenz DUFFY
et al. (1999)
SCHEU et al. (1999)
BESSER (2000)
HOCHBERG et al. (2001)
BECKER u. HOLZAPFEL (2002)
Nicht-Listerien-Stämme
6
40 -
9
3 41 -
Andere Listerien-Stämme
6
33
- 13
5
15
-
L. monocyto-genes-Stämme
1 103 1
17
11 97 1
Nachweis-grenze
log10 4 KbE
(s. Text) 1,6 x 106 KbE ml-1
1,4 x 102 KbE ml-1
3,4 x 103 KbE ml-1
k. A. log10 4 KbE ml-1
Ziel-DNA-Sequenz
hlyA mpl unbe-kannt;
BAXTM-PCR
hlyA
hlyA
unbekannt; BAXTM-PCR
unbekannt; BAXTM-PCR
2.3.3.6.2 Nachweisgrenzen von PCR-Systemen bei Untersuchung von Listeria
monocytogenes-dotierten Lebensmitteln (mit oder ohne Anreicherung)
Mit Dotierungsversuchen wurde die Anzahl von L. monocytogenes in Lebensmitteln ermit-
telt, die einen positiven Nachweis ermöglichte. Tabelle 11 zeigt eine Auswahl von Unter-
suchungen.
Die Mehrzahl der PCR-Analysen wurde nach einem oder auch zwei Anreicherungsschritten
durchgeführt. Dabei wurden Nachweisgrenzen zwischen 0,1 und 100 KbE L. monocytogenes
pro g LM ermittelt. Die Nachweisgrenze für ein PCR-System ist hier in Abhängigkeit von
Nachweissystem u n d Anreicherung zu sehen.
Im Vergleich dazu führte der d i r e k t e PCR-Nachweis erst bei erheblich größeren
Inokulationsmengen (103 – 108 KbE g-1) zu einem positiven Ergebnis. Daher ist die direkte
PCR für den Nachweis eines Zielkeimes wie L. monocytogenes, der gewöhnlich in weit
geringeren Konzentrationen in Fleisch und Fleischerzeugnissen vorkommt, ungeeignet.
Schrifttum
45
NIEDERHAUSER et al. (1992) und BANSAL et al. (1996) führten parallel zur PCR-Analyse
mikrobiologische Untersuchungen zum Nachweis von L. monocytogenes durch, und die Er-
gebnisse beider Methoden stimmten vollständig überein. Wurden keine Listerien wiederge-
funden, wurde dies mit sehr niedrigen Inokulationsmengen begründet (BANSAL et al. 1996).
In einer Veröffentlichung des BgVV (ANON. 2002) wird ein Ringversuch (s. 2.3.4)
beschrieben. Nach Analyse mittels PCR-ELISA und dem kulturellen Referenzverfahren nach
DIN EN ISO 11290-1 wurden die beiden Verfahren anhand ihrer Ergebnisse verglichen. Das
kulturelle Verfahren hatte immerhin für mehr als jede zehnte Probe ein falsch-negatives
Ergebnis produziert. Als problematisch wurden die DNA-Präparation und die anschließenden
Arbeitsschritte bewertet, die die Gefahr der Kreuzkontamination in sich bergen, wenn
verschiedene Proben gleichzeitig zu bearbeiten sind.
Schweinehackfleisch wurde mit dem BAXTM for Screening/Listeria monocytogenes-System
nach einer zweistufigen Anreicherung untersucht (BECKER u. HOLZAPFEL 2002; Tab. 10).
Die Primäranreicherung wurde einerseits 24 Stunden und andererseits 48 Stunden inkubiert.
Nach 48 Stunden Inkubation waren die Signale deutlicher zu erkennen, insbesondere nach
Primäranreicherung in PALCAM-Bouillon, die das Wachstum von L. monocytogenes etwas
besser förderte als Fraser (log 9 KbE ml-1 gegenüber log 8 KbE ml-1).
Bei HOCHBERG et al. (2001) wurden mit dem BAX-System besonders geringe Konzen-
trationen von Listeria monocytogenes nachgewiesen (Tab. 10). Eine Probe, die zu den nicht
inokulierten Untersuchungsmaterialien zählte, wurde mit dem BAX-System positiv getestet;
gleichzeitig gelang mit der ISO-Methode der kulturelle Nachweis des Erregers nicht.
Primäre und sekundäre selektive Anreicherungen gemäß DIN EN ISO-Standard wurden
(anhand von Milch und Käsearten) im Vorfeld verschiedener PCR-Systeme eingesetzt, um die
Mindestanreicherungszeit zu ermitteln (BESSER 2000). Nach einer Mindestanreicherungszeit
von 22 Stunden betrug die detektierbare Keimzahl wenigstens 2 x 103 KbE ml-1.
Schrifttum
46
Tab. 11: Untersuchungen zur Nachweisgrenze von PCR-Systemen zum Nachweis von L. monocytogenes aus dotierten Lebensmitteln (mit oder ohne Anreicherung).
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Schrifttum
47
Tab. 11: Untersuchungen zur Nachweisgrenze von PCR-Systemen zum Nachweis von L. monocytogenes aus dotierten Lebensmitteln (mit oder ohne Anreicherung).
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Schrifttum
48
2.3.3.6.3 Sensitivität und Spezifität verschiedener PCR-Systeme nach
Untersuchungen von Feldproben
Feldproben wurden parallel mit kulturellen Verfahren und PCR-Systemen auf die Anwesen-
heit von Listeria monocytogenes untersucht. Anhand der Ergebnisse wurden Erkennnisse über
Sensitivität und Spezifität eines PCR-Systems sowie den Übereinstimmungsgrad der
Methoden als Parameter für die Qualität eines Nachweisverfahrens gewonnen. Als Referenz
werden i. A. Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung zugrunde gelegt. Eine
Zusammenfassung von Vergleichsuntersuchungen ist der Tabelle 12 zu entnehmen.
Als Grundlage für die Berechnung der Parameter sind ebenfalls jeweils die Anzahl der unter-
suchten Feldproben, richtig-positive und richtig-negative Ergebnisse sowie falsch-positive
und falsch-negative Ergebnisse aufgeführt. Gut die Hälfte der genannten PCR-Systeme
erreichte eine Sensitivität von 100 %.
Nach allgemeiner Ansicht ist ein falsch-positives Ergebnis nach einer Multiplex-PCR
unwahrscheinlich, solange beide bzw. mehrere spezifische Banden visualisiert werden
(BANSAL et al. 1996; NIEDERHAUSER et al. 1992). Schwach ausgeprägte Banden im Gel
wurden als Hinweis auf eine geringe Kontamination gewertet (BANSAL et al. 1996).
Mit einem Multiplex-PCR-System erzielten NIEDERHAUSER et al. (1992) korrespon-
dierende Ergebnisse mit Kultur und PCR. Allerdings musste das Analysenprotokoll für
Feldproben um eine sekundäre selektive Anreicherung ergänzt werden, auf die bei künstlich
kontaminierten Proben verzichtet werden konnte.
Auch kommerziell erhältliche, Listeria monocytogenes-spezifische PCR-Systeme wurden mit
Feldproben getestet (BRUNNER u. BÜLTE 2000; PENG u. SHELEF 2001; SIMON et al.
1999). Dabei erreichte kein PCR-Testsystem eine vollständige Übereinstimmung mit den
kulturellen Ergebnissen, wobei in zwei von drei Untersuchungen mehr falsch-negative als
falsch-positive Nachweise erbracht wurden. In Verbindung mit Käsereiprodukten hatten die
von BRUNNER und BÜLTE (2000) getesteten Systeme BAXTM und PROBELIATM die
relativ geringste Übereinstimmung (85,8 %); bei beiden kam es zu etwas mehr positiven
Ergebnissen. Das BAXTM-System, auf fleischhaltige Proben angewendet, erzielte in allen drei
Parametern die höchsten Werte (PENG u. SHELEF 2001).
Schrifttum
49
Umgebungsproben wurden kulturell und mit dem BAXTM-System übereinstimmend negativ
auf L. monocytogenes getestet (TENGEL et al. 2001). Ebenfalls mit dem BAX-PCR-System
wurden 16 verschiedene Lebensmittel untersucht (HOCHBERG et al. 2001). Insgesamt
ergaben sich 2,4 % falsch-negative und 1,8 % falsch-positive Ergebnisse.
Unter Verwendung der Listeria test-PCR (BESSER 2000) wurde die Abhängigkeit der PCR-
Sensitivität von der Dauer einer bestimmten Anreicherung deutlich. Nachdem die Bebrü-
tungszeit verlängert worden war, wurden keine falsch-positiven Diagnosen mehr beobachtet.
BUSCH et al. (2002) nutzten die Microarray-Analyse für den parallelen Nachweis von
3 pathogenen Arten. Neben Voranreicherungen, die untersucht wurden, wurden Bakterien-
Isolate (identifiziert als Listeria monocytogenes, Campylobacter und Salmonella spp.) nach
separater Kultivierung vereinigt und simultan mit dem NUTRI®-Chip analysiert. Die isolier-
ten Bakterien wurden alle mit dieser Methode bestätigt. Der Vergleich von PCR-Systemen
mit der Kulturmethode nach DIN EN ISO 11290-1 (1996) ist bisher in wenigen Studien
gezogen worden (Tab. 12).
Die Anwesenheit der kulturell nachgewiesenen Spezies Innocua führte mit keinem PCR-
System zu falsch-positiven Ergebnissen (BRUNNER u. BÜLTE 2000; DUFFY et al. 1999).
Eine Häufung der falsch-negativen PCR-Ergebnisse wurde mit einer geringen Ausgangs-
konzentration von L. monocytogenes bzw. Anwesenheit von L. innocua in Verbindung
gebracht (SIMON et al. 1999).
Schrifttum
50
Tab. 12: Sensitivität und Spezifität verschiedener PCR-Systeme nach Untersuchungen von Feldproben.
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Schrifttum
51
2.3.4 Methodenvergleich
Parameter zur Charakterisierung einer Methode sind insbesondere Sensitivität (Wahrschein-
lichkeit, dass eine Methode eine positive Probe als positiv erkennt) und Spezifität (Wahr-
scheinlichkeit, dass ein Methode eine negative Probe als negativ erkennt) (BECKER et al.
1998). Beide Werte ergeben sich aus qualitativen Untersuchungsergebnissen.
Die Übereinstimmung zweier Methoden entspricht der Wahrscheinlichkeit einer richtigen
Diagnose (CAPITA et al. 2001).
Sensitivität = a / (a + c) Spezifität = b / (b + d)
a = richtig-positiv; positiver Test
& L. monocytogenes bestätigt
b = richtig-negativ; negativer Test ohne
Bestätigung von L. monocytogenes
c = falsch-negativ; negativer Test
& L. monocytogenes bestätigt
d = falsch-positiv; positiver Test ohne
Bestätigung von L. monocytogenes
Übereinstimmung = (a + d) / (a + b + c + d)
Ein „golden standard“ im eigentlichen Sinne steht als Referenz für einen Methodenvergleich
nicht zur Verfügung. Der Vergleich neuer Schnellmethoden ist daher mit der herkömmlichen
Referenzmethode nicht ohne weiteres durchführbar (BAILEY 1998). Dies gilt insbesondere
für die hochspezifische und hochsensitive PCR.
Wird aber trotzdem bei einem kulturell falsch-negativen / falsch-positiven Ergebnis dieses mit
dem positiven / negativen, mit Hilfe einer neuen Methode erzielten Ergebnis direkt
verglichen, dann wird fälschlicherweise davon ausgegangen, dass die neue Methode („falsch-
posititv“ / „falsch-negativ“) eine geringere Spezifität / Sensitivität aufweist als die Referenz-
methode.
Dass die ermittelte Leistungsfähigkeit neuer Tests abhängig ist von Sensitivität und
Selektivität der festen oder flüssigen selektiven Medien der Standardmethode, wurde z. B. für
Immunoassays gezeigt (BECKER et al. 1998; CAPITA et al. 2001; GUNASINGHE et al.
1994; JOHANSSON 1998; WANG et al. 1992).
Schrifttum
52
Der Gebrauch i d e n t i s c h e r Anreicherungsprotokolle bzw. Nährböden wird angeraten
(BEUMER et al. 1996). HITCHINS und DUVALL (2000) sprachen sich ausdrücklich dafür
aus, v e r s c h i e d e n e Methoden p a r a l l e l anzuwenden, wobei alle anderen
Bedingungen soweit wie möglich standardisiert werden sollten.
Die Konzentration von Listeria monocytogenes ist bei Inokulationsversuchen bereits auf das
geringste Maß reduziert worden, um erfolgreich spezifische DNA oder spezifische Antigene
in Lebensmitteln nachzuweisen.
Wenn das Inokulationsniveau relativ niedrig ist, können schon geringe Unterschiede in der
Kontaminationsdosis großen Einfluß auf das Resultat haben. Das gilt insbesondere für
Inokulationsversuche mit Listerien, die relativ langsam wachsen (FELDSINE et al. 1997).
Ansonsten sind Inokulationsversuche, die sich dadurch auszeichnen, dass die Zielkeim-
konzentration im Lebensmittel bekannt ist, ein geeignetes Mittel, um aussagekräftige
Informationen über die Sensitivität bzw. Spezifität einer Methode zu erhalten. Darin unter-
scheiden sich diese Versuche von Feldstudien, bei denen die Kontamination nachzuweisender
Pathogene als Häufigkeit des Vorkommens allgemein vorausgesetzt werden kann.
Eine weitere Möglichkeit, die indirekt etwas über die Höhe der Sensitivität aussagt, ist die
genaue Erfassung der Inkubationsdauer, die mindestens notwendig ist, damit in allen
gleichartigen Proben - gleiche Art des Lebensmittels und gleiches Kontaminationsniveau
vorausgesetzt - der positive Nachweis des Erregers erfolgt (Mindestanreicherungszeit).
Die Mindestanreicherungszeit ist auch insofern von Interesse, als dass eine s c h n e l l e
Nachweisfindung Gegenstand der heutigen Forschung in der Diagnostik von Lebensmittel-
infektionserregern ist.
Als Methodenvergleich wurden auch immer wieder Ringversuche (z. B. KNIGHT et al. 1996;
GANGAR et al. 2000) angesehen. Ringversuche sind an sich ein Instrument der
Qualitätssicherung, wobei die Leistungsfähigkeit eines Labors, die wesentlich von der
Arbeitsleistung des Personals abhängig ist, bewertet wird. Nach Ansicht von BEUMER et al.
(1996) sind Ringversuche daher nicht geeignet, Methoden zu evaluieren.
Untersuchungen von Feldproben gelten als unerlässlich, weil die Bedingungen in Feldproben
durch dotierte Proben nicht vollständig simuliert werden. Bedingungen in Feldproben sind
allerdings variabel bzw. nicht standardisiert (HITCHINS u. DUVALL 2000), was den Wert
einer Feldprobenstudie relativiert.
Schrifttum
53
Vergleicht man den Aufbau der Studien verschiedener Arbeitsgruppen, finden sich in den
meisten Fällen erhebliche Unterschiede. Angefangen bei den Testsystemen beziehen sich
diese v. a. auf das Kontaminationsniveau (sowohl natürlich als auch künstlich kontaminierter
Lebensmittel), die Lebensmittelmatrix und die Art der Anreicherung sowie die originäre
Mikroflora im Lebensmittel, die (HITCHINS u. DUVALL 2000) die mit am wenigsten
kontrollierbare Variable darstellt, und die quantitativ und qualitativ mit dem Lebensmitteltyp
und innerhalb eines Probenvolumens variiert.
Allgemein besteht die Auffassung, dass für die Isolation von Listerien insbesondere die 2-
stufige Anreicherung, und zwar i. w. bei geringgradigen Kontaminationen, eine wichtige
Bedeutung hat. Nach Meinung von HITCHINS und DUVALL (2000) basiert diese
Auffassung auf Unterschieden, die lediglich in dem Ausmaß bestanden, dass sie sich als
statistisch nicht signifikant erwiesen; in Untersuchungen konnte kein Unterschied bei dem
Nachweis nach Anwendung von 1-stufiger bzw. 2-stufiger Anreicherung festgestellt werden.
Methodenvergleich zwischen verschiedenen veröffentlichten Studien
Die Anwendung der PCR (wie auch des ELISA) in der Lebensmitteldiagnostik sollte als ein
integrales System angesehen werden (2.3.3.3). Die Faktoren eines integralen Systems beein-
flussen sich gegenseitig und müssen aufeinander abgestimmt (kompatibel) sein. Die Er-
fahrungen mit Systemen zum Nachweis von L. monoctogenes lehrten, dass die Leistungs-
fähigkeit eines Tests abhängig ist von
- Sensitivität und Selektivität der verwendeten Medien (2.3),
- Zielkeimkonzentration,
- Inkubationsdauer (2.3.2.2.2),
- der untersuchten Lebensmittelmatrix.
Diese Abhängigkeitsfaktoren sind in den bekannten Studien meist sehr unterschiedlich ge-
wählt, was die Möglichkeit, einen Methodenvergleich zwischen den Ergebnissen der Arbeits-
gruppen zu ziehen, stark einschränkt (BECKER et al. 1998).
Mit der kulturellen ISO-Methode 11290-1 sind, wie bereits für eine Auswahl von Lebens-
mitteln gezeigt (SCOTTER et al. 2001; ANON. 2002), zwischen 5 und 10 KbE in 25
Gramm Lebensmittel (Inokulation mit L. monocytogenes) bzw. zwischen 50 und 100 KbE
in 25 g (Inokulation zusätzlich mit L. innocua) nachweisbar.
Schrifttum
54
Immunologisch ist mittels Sandwich-ELISA (Transia plate Listeria monocytogenes) bereits
1 KbE, mit der 10 g Hackfleisch beimpft wurde, nach primärer und sekundärer Anreicherung
(L-PALCAM-Bouillon plus Fraser-Bouillon) nachgewiesen worden (KLEINER u.
SCHINKEL 2003). KERDAHI und ISTAFANOS (2000) berichteten sogar von 1 – 10 KbE
des Erregers, die in 25 g Lebensmittel nachgewiesen werden konnten.
Auf Genus-Ebene ist der immunologische Nachweis von 1 KbE in 25 g Hackfleisch
(Schwein und Rind gemischt) beschrieben (UYTTENDAELE et al. 1995).
Dotierungsversuche zum molekularbiologischen Nachweis (PCR) von Listeria monocyto-
genes führten bei Proben tierischen Ursprungs bei 10 – 100 KbE pro Gramm (Geflügelhaut;
18 h selektive Anreicherung), 100 KbE pro Gramm (Schweinehackfleisch, 24 h selektive
Anreicherung plus 3 h selektive Anreicherung) oder 40 KbE pro 10 g (n i c h t bei 4 KbE in
10 g Hackfleisch; 20 – 24 h selektive Anreicherung) zur Identifizierung der gesuchten DNA
(Tab. 6). Für Proben tierischen Ursprungs wurde im Fall der PCR gezeigt, dass 4 KbE in 10 g
n i c h t nachweisbar waren; zu bemerken ist, dass die Inkubation im selektiven Medium
nicht länger als 24 Stunden erfolgte.
Zwar wurde auch über den Nachweis von ca. 1 KbE pro Gramm Rinderhackfleisch berichtet,
allerdings wurde dabei verdächtiges Koloniematerial für die PCR eingesetzt (Tab. 6). Durch
diesen Zwischenschritt wird eher eine Aussage über die methodische Sensitivität des
mikrobiologischen Nachweises getroffen.
In Rinderhackfleisch konnten schließlich – im Gegensatz zu Schweinefleisch (s. o.) – 3 KbE
in 25 g nachgewiesen werden; dabei folgte die zweistufige Anreicherung dem Protokoll der
kulturellen ISO-Methode (Tab. 6).
Insofern gilt, dass mit Hilfe von zweistufigen Anreicherungen die heutigen Schnellmethoden
erwiesenermaßen geeignet sind, selbst geringste Konzentrationen von Listeria monocytogenes
in Lebensmitteln zu detektieren.
Das Potential der Schnellmethoden, Untersuchungszeit einzusparen, wird derzeit aufgrund
mangelnder Erfahrung mit den Nachweissystemen in der Praxis noch nicht ausgeschöpft. Es
gilt, die Frage nach dem kürzesten Untersuchungszeitraum, der für eine sichere Diagnose
ausreichend ist, zu beantworten.
Schrifttum
55
2.4 Schlußfolgerungen aus dem wissenschaftlichen Schrifttum
Die kulturelle Referenzmethode nach § 35 LMBG weist den Zoonoseerreger Listeria
monocytogenes nicht zuverlässig nach.
Die an sich sehr hohe Sensitivität der Methode leidet in einem mehr oder weniger
unbestimmten Ausmaß unter dem Einfluß der Listeria-Spezies Innocua, die häufig aus
Fleisch und Fleischerzeugnissen, auch in Mischkulturen mit L. monocytogenes, isoliert wird,
weshalb das Ausmaß dieses Einflusses hier miteinbezogen werden soll.
Das Lebensmittel Fleisch bzw. Hackfleisch ist insbesondere für Risikogruppen als Vektor von
Listeriose-Erregern anzusehen. Die hohe Dichte der kompetitiven Flora in diesem LM kann
den Nachweis von L. monocytogenes, einem Mikroorganismus mit einer relativ langen
Generationszeit, erschweren.
Es stellt sich die Frage nach der Leistungsfähigkeit – Spezifität und Sensitivität innerhalb
einer bestimmten Zeit – von sogenannnten Schnellmethoden (ELISA und PCR; letztere auch
in Verbindung mit Microarray-Technologie) in Bezug auf dieses Lebensmittel.
Sensitivität und Spezifität von Listeria monocytogenes-spezifischen immunologischen Nach-
weissystemen wurden mit inokulierten Lebensmitteln, auch bei niedrigsten Erregerkonta-
minationen, untersucht; insbesondere mit dem Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA
wurde der Zielkeim hochspezifisch und hochsensitiv in Hackfleisch mit dem Nachweis von
p60 identifiziert. Die Sensitivität dieses Testkits in Anwendung auf Schweinehackfleisch soll
hier weiter definiert werden, indem die Mindestanreicherungszeit (= Reduzierung des / der
vorgeschalteten Anreicherungsschritte) festgestellt werden soll.
Für PCR-Systeme konnte gezeigt werden, dass selbst geringste Listeria monocytogenes-
Konzentrationen in Lebensmitteln nachweisbar sind. Der nächste Schritt ist zu ermitteln,
inwieweit das diagnostische Potential der PCR-Methode ausgeschöpft werden kann, indem
der Zeitaufwand für die Inkubationsschritte reduziert wird.
Für den Nachweis von Listeria monocytogenes mittels PCR/Microarray-Technologie liegen
bislang nur wenige Erfahrungsberichte vor.
Mit der Microarray-Analytik steht der Diagnostik von pathogenen Mikroorganismen in
Lebensmitteln prinzipiell eine leistungsstarke Methode (spezifisch, sensitiv, quantitativ,
automatisierbar) zur Verfügung.
Schrifttum
56
Neben der Prüfung der Kompatibilität der einzelnen Bestandteile in einem System (Halb-
fraser-Anreicherungsbouillon, Schweinehackfleisch (dotiert), DNA-Extraktion, Multiplex-
PCR-System und Microarray-Analyse) soll festgestellt werden, ob der Nachweis von
L. monocytogenes bei Mischkulturen aus L. monocytogenes und L. innocua beeinträchtigt
wird.
Eine Multiplex-PCR, die Fragmente von zwei Virulenzgenen vervielfältigt, soll weitere
Bestätigungsreaktionen im Rahmen der Routinediagnostik entbehrlich machen, weil anhand
der relativ einfachen Größenbestimmung von zwei spezifischen Amplifikaten der Nachweis
ausreichend verifiziert ist. Zu klären ist, ob die Detektion der PCR-Produkte ohne weiteres in
positiven Proben möglich ist.
Zum Erreichen der Nachweisgrenze der PCR-Systeme wie auch des ELISA-Systems muss
eine Anreicherung der Keime vorgenommen werden, da die Nachweisgrenzen die vor-
liegenden Konzentrationen des Erregers in Lebensmitteln in praxi oft weit übersteigen.
Das gemäß DIN EN ISO 11290-1 (1996) einzusetzende primäre Selektivmedium soll auf
Kompatibilität mit den Schnellmethoden u n d Schweinehackfleisch getestet werden.
Zum Nachweis von Monocytogenes-spezifischer DNA sowie des Monocytogenes-
spezifischen p60 soll die (Primär-) Anreicherungkultur bei 37°C (anstelle von 30°C) inkubiert
werden.
Die Hackfleischproben sollen alle mit annähernd gleichen Keimkonzentrationen dotiert
werden, um das Probenvolumen als feste Größe in einen Methodenvergleich einbringen zu
können. Damit Schwierigkeiten bei der Beimpfung mit sehr kleinen Keimzahlen vermieden
werden, ist je eine größere Menge Hackfleisch mit einer Inokulationsmenge von 10 bis zu 40
KbE pro Gramm zu dotieren. Die Gleichmäßigkeit der Inokulation soll kontrolliert werden.
Als Parameter zur Charakterisierung kann die Mindestanreicherungszeit im Rahmen von
Inokulationsversuchen herangezogen werden.
Eigene Untersuchungen
57
3. Eigene Untersuchungen
3.1 Material Für die im folgenden dargestellten Versuche wurden Hackfleisch vom Schwein und
Referenzstämme verschiedener Mikroorganismen verwendet.
3.1.1 Hackfleisch Das Hackfleisch wurde in der Zentrumsabteilung für Lebensmittelkunde, Fleischhygiene
und -technologie durch Wolfen mit der 2 mm-Scheibe (einfacher Satz) hergestellt. Als
Ausgangsmaterial diente Schinkenmuskulatur vom Schwein (Kaltfleisch, 0 – 4°C, 2 Tage
post mortem, von sichtbaren Fett- und Bindegewebsanteilen befreit). Direkt im Anschluß an
die Herstellung wurden Portionen von je 80 g in Kunststoffbeutel verpackt und bei –20°C
tiefgefroren.
Das Auftauen erfolgte langsam bei Kühlschranktemperaturen (6 – 8°C) über 8 bis 15
Stunden. Jede Charge wurde auf eine natürliche Kontamination mit Listeria monocytogenes
untersucht, damit in den Versuchen ausschließlich Monocytogenes-freies Hackfleisch
eingesetzt wurde.
3.1.2 Mikroorganismen Für die künstliche Kontamination des Hackfleischs wurden die Stämme Listeria
monocytogenes SLCC* 9091 Serotyp 1/2a und Listeria innocua SLCC* 9053 eingesetzt.
Die Keime wurden freundlicherweise von Herrn Prof. Amtsberg, Institut für Mikrobiologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover, zur Verfügung gestellt.
Zur Herstellung einer Stammkultur wurde Listeria monocytogenes in 10 ml TSYE-Bouillon
bei 37°C für 20 Stunden angereichert. Nachfolgend wurde 1 ml Anreicherungskultur in ein
MicrobankTM-Kryogefäß überführt. Dieses wurde geschüttelt, wobei sich die Keime an die in
dem Kryogefäß enthaltenen Kügelchen binden. Überstände wurden verworfen. Mit dem
Listeria innocua-Stamm wurde analog verfahren.
* SLCC: Special Listeria Culture Collection, Würzburg
Eigene Untersuchungen
58
Die Listerien-Stämme wurden als Dauerkulturen, die mit dem MicrobankTMSystem
tiefgefroren bei –20°C gelagert wurden, vorrätig gehalten.
Aus der Stammkultur wurde bei Bedarf ein Kügelchen steril entnommen, in 10 ml TSYE-
Bouillon verbracht und bei 37°C für 18 – 24 Stunden inkubiert. Nach Ausstrich auf TSYE-
Agar und Bebrütung konnte über eine Gebrauchskultur für den Einsatz in praktischen
Untersuchungen verfügt werden.
Staphylococcus aureus- und Rhodococcus equi-Kulturen (beide aus dem Institut für Mikro-
biologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover) wurden ebenfalls mit Hilfe des
MicrobankTMSystems als Stammkultur aufbewahrt. Gebrauchskulturen wurden auf Blutagar
angezüchtet.
3.2 Methoden
In dem Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden mikrobiologische, immunologische und
molekularbiologische Verfahren zum Nachweis von Listeria monocytogenes verwendet:
a) Kulturelle Nachweismethode entsprechend DIN EN ISO 11290 : Teil 1 (1996),
b) Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA (Transia GmbH),
c) PCR (GeneScan Analytics GmbH),
d) NUTRI®-Chip (GeneScan Analytics GmbH).
Eigene Untersuchungen
59
3.2.1 Kulturelle Nachweismethode
Das kulturelle Nachweisverfahren wurde nach der vorgeschriebenen Methode der Amtlichen
Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG (L 00.00-32), mit der die DIN EN
ISO 11290-1 (1996) umgesetzt ist (ANON. 1998), durchgeführt.
Dieses qualitative Verfahren zum Nachweis von Listeria monocytogenes erforderte vier
aufeinanderfolgende Stufen:
1. Erste Anreicherung in einem selektiven flüssigen Anreicherungsmedium mit verminderten
Konzentrationen an selektiven Agentien (Halbfraser-Bouillon).
2. Zweite Anreicherung in einem selektiven flüssigen Anreicherungsmedium mit voll-
ständigen Konzentrationen an selektiven Agentien (Fraser-Bouillon).
3. Ausstreichen und Identifizieren.
4. Bestätigung.
Von dem Untersuchungsmaterial wurden 25 g in einen Stomacherbeutel eingewogen. Zur
Herstellung der ersten Anreicherungssuspension wurden 225 ml Halbfraser-Bouillon hinzu-
gefügt (1:10-Verhältnis von Untersuchungsmenge zum ersten selektiven Anreicherungs-
medium, Masse zu Volumen), und Untersuchungsgut und Verdünnungsflüssigkeit wurden mit
einem Beutel-Walk-Gerät (Stomacher) durchmischt.
50 g der ersten Anreicherungssuspension wurden anschließend bei 30°C für 24 Stunden
inkubiert (Erst- / Primäranreicherung = PA).
Nach dem Bebrüten wurde 0,1 ml der Erstanreicherungskultur in ein Kulturröhrchen mit
10 ml des zweiten selektiven Anreicherungsmediums (Fraser-Bouillon) überführt.
Die beimpfte Fraser-Bouillon wurde 48 Stunden bei 37°C bebrütet (Zweit- / Sekundäran-
reicherung = SA).
Von der Erstanreicherungskultur, die 24 Stunden bei 30°C bebrütet wurde, und von der
Zweitanreicherungskultur, die 48 Stunden bei 37°C bebrütet wurde, wurde mit einer Impföse
jeweils ein Tropfen entnommen, und die Oberflächen der ersten und zweiten festen Selektiv-
medien (je einmal PALCAM- und zweimal Oxford-Agar) wurden beimpft.
Eigene Untersuchungen
60
Die Bebrütung der Oxford-Agarplatten erfolgte zum einen bei 30°C und zum anderen bei
37°C, die aerobe Bebrütung des PALCAM-Agars bei 37°C. Nach 24 und 48 Stunden
Bebrütung wurden die Platten auf die Anwesenheit von Kolonien untersucht, die vermutlich
Listeria spp. sein konnten.
Typische, 24 Stunden auf Oxford-Agar gewachsene Kolonien von Listeria spp. sind klein
(1 mm), gräulich und von Schwärzungshöfen umgeben. Die nach 48 Stunden erhaltenen
Kolonien sind dunkler, möglicherweise mit einem grünlichen Schimmer, etwa 2 mm im
Durchmesser, mit Schwärzungshöfen und eingesunkenen Zentren.
Auf PALCAM-Agar wachsen Listeria spp. nach 24 Stunden Bebrütung in kleinen oder sehr
kleinen Kolonien, 1,5 bis 2,0 mm im Durchmesser, manchmal mit schwarzen Zentren, aber
immer mit Schwärzungshöfen. Nach 48 Stunden erscheinen Listeria spp. als grüne Kolonien,
1,5 bis 2,0 mm im Durchmesser, mit eingesunkenen Zentren und mit Schwärzungshöfen.
Nach der Identifizierung von Verdachtskolonien erfolgte die Bestätigung von Listeria spp.
sowie von Listeria monocytogenes. Dazu wurden von beiden festen Selektivmedien, auf
denen verdächtige Kolonien wuchsen, bis zu 5 verdächtige Kolonien genommen. Die ausge-
wählten Kolonien wurden auf Platten mit dem nicht-selektiven Nährmedium Trypton-Soja-
Hefe-Extrakt-Agar (TSYEA) ausgestrichen, um eine Reinkultur zu erhalten. Die beimpften
TSYEA-Platten wurden für 18 bis 24 Stunden bei 37°C bebrütet.
Auf TSYEA wachsen Listerienkolonien typischerweise mit einem Durchmesser von 1,0 bis
2,0 mm. Sie sind farblos, konvex, opak und haben einen vollständigen Rand. Wenn die
Kolonien nicht gut voneinander getrennt wachsen, wird eine für Listerien typische Kolonie
entnommen und davon eine Subkultur auf einer weiteren Platte mit TSYEA erstellt.
Die folgenden Untersuchungen zur Bestätigung von Listeria spp. wurden mit den
Reinkulturen durchgeführt. Und zwar wurden der Beleuchtungstest nach Henry, die Gram-
färbung und die Katalase-Reaktion angewendet. Verzichtet wurde auf die Prüfung zur
Feststellung der Listerien-charakteristischen torkelnden Bewegung, die nur dann unbedingt
erforderlich ist, wenn die Untersuchung von einer Person durchgeführt wird, die nicht
regelmäßig L. monocytogenes nachweist.
Eigene Untersuchungen
61
Für den Beleuchtungstest nach Henry wurden die Platten so mit gebündeltem weißen Licht
durchleuchtet, dass in einem schrägen Durchlicht (Henry-Beleuchtung) durch Prüfung direkt
oberhalb der Platte die typische bläuliche Tönung der Listerienkolonien deutlich wurde.
Eine Kolonie wurde auf einem Objektträger in einem Tropfen 3%iger Wasserstoffperoxid-
Lösung suspendiert. Sofortige Bildung von Gasblasen zeigte die positive Katalase-Reaktion
an.
Eine Kolonie wurde nach Gram gefärbt. Listerien waren gram-positive dünne kurze Stäbchen.
Die Bestätigung von Listeria monocytogenes erfolgte mit Prüfung der Hämolyse-Reaktion,
des Kohlenhydratabbaus und nach Durchführung des CAMP-Tests (s. Tab. 2).
Die Hämolyseeigenschaft wurde bestimmt, indem Columbia SchafblutPLUS Agar mit
verdächtigen Kolonien beimpft wurde. L. monocytogenes zeigte nach der Bebrütung enge,
klare und helle Hämolysezonen (β-Hämolyse).
Zur Durchführung des CAMP-Tests wurden verdächtige Kolonien jeweils rechtwinklig zu
einem Staphylococcus aureus (S. aureus)- und einem Rhodococcus equi (R. equi)-Impfstrich
auf Columbia SchafblutPLUSAgar ausgestrichen. Der Ausstrich erfolgte in der Weise, dass
sich die Impfstriche von Prüfstamm und S. aureus sowie R. equi nicht berührten und ein
Abstand von etwa 1 mm bis 2 mm bestand. War an der Schnittstelle zwischen der Verdachts-
kultur und S. aureus nach spätestens 18 Stunden Inkubation bei 37°C eine β-Hämolysezone
(CAMP-Phänomen) entstanden, wurde die Reaktion als L. monocytogenes-positiv beurteilt.
Diese kleine, abgerundete β-Hämolysezone dehnt sich vom Prüfstamm bis zu 2 mm in die nur
schwach hämolytische Zone der S. aureus-Kultur aus.
Die Kohlenhydrat-Bouillons wurden jeweils mit einer Öse mit TSYEA-Koloniematerial
(anstelle einer Öse mit TSYEB-Kultur) beimpft und bis zu 2 Tage bei 37°C bebrütet. Die
Bebrütungsdauer kann nach der amtlichen Vorschrift auf bis zu 5 Tage erhöht werden.
L. monocytogenes bildet als positive Reaktion Säure aus Rhamnose (Gelbfärbung der
Bouillon). Keine Säurebildung findet statt in der Xylose-Bouillon, die ihre ursprüngliche
violette Färbung behält.
Eigene Untersuchungen
62
3.2.2 Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA
Nach Angaben des Herstellers ist der Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA für alle
Lebensmittel wie Fleisch-, Fisch- und Milchprodukte und Gemüse geeignet. Für den
zeitlichen Aufwand werden 48 Stunden für die Inkubation der selektiven Anreicherung
angegeben. Bei 106 – 107 KbE ml-1 Anreicherungsbouillon ist dann der Nachweis innerhalb
von ca. 3 Stunden möglich. Insgesamt beträgt die vorgesehene Dauer für den Listeria
monocytogenes-Nachweis mittels Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA 51 Stunden.
Der ELISA wird in den mit Antikörpern beschichteten Kavitäten einer brechbaren Mikro-
titerplatte durchgeführt. Die monoklonalen Antikörper richten sich gegen das Protein p60 von
Listeria monocytogenes. Auch andere kommerzielle ELISA-Systeme im Mikrotiterplatten-
format integrieren p60-spezifische Antikörper (z. B. Pathalert L. m.). Systeme in diesem
Format können auch automatisiert bearbeitet werden.
Testprinzip
Bei dem Testkit handelt es sich um einen nicht-kompetiven Sandwich-ELISA. Nach
selektiver Anreicherung werden die Zellen hitzedenaturiert. Dabei wird das zellassoziierte
p60 freigesetzt. Diese werden zuerst mit den Proben und dann mit einem Antikörper-
Konjugat beschickt. Der Sandwich-Komplex bildet sich während der Inkubationsschritte aus.
Nicht gebundene Anteile werden in den Waschschritten entfernt.
Nach Zugabe von Substrat-Lösung und Chromogen entsteht eine blaue Reaktionsfarbe. Die
Blaufärbung ist direkt proportional zur p60-Konzentration. Je intensiver die Blaufärbung
desto größer war die Listeria monocytogenes-Konzentration in der selektiven Anreicherungs-
kultur. Die weitere Intensivierung einer Blaufärbung wird gestoppt und danach die Färbung
der Lösung, die nach Zugabe der Stopplösung gelb ist, gemessen.
Testdurchführung
Nach selektiver Anreicherung erfolgte die test-spezifische Probenaufbereitung. Aus der
Erstanreicherungs- oder Zweitanreicherungskultur wurde je Probe ein- bzw. zweimal 1 ml
(= Einfach- bzw. Doppelansatz) in ein hitzebeständiges Röhrchen (2 ml-Eppendorf-
Reaktionsgefäß) überführt. Die Proben wurden darin für genau 20 Minuten bei 100°C
(Wasserbad) denaturiert und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt.
Eigene Untersuchungen
63
Sowohl die Reagenzien als auch die Mikrotiterplatte wurden zunächst auf 18 - 25°C
temperiert (Raumtemperatur). Flascheninhalte wurden vor der Entnahme gemischt.
Für Schritt 1 wurden das Reagenz für die Negativkontrolle (bestehend aus Fraser-Bouillon)
zu je 100 µl in zwei Kavitäten und das Reagenz für die Positivkontrolle (bestehend aus
Listeria monocytogenes-Antigen) zu 100 µl in eine Kavität gegeben. Von den denaturierten
Proben wurden je 100 µl in eine Kavität des Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA
pipettiert. Die Abdeckplatte wurde auf die Mikrotiterplatte gelegt und der Inhalt in den
Kavitäten sorgfältig durch kreisende horizontale Bewegungen mit und gegen den Uhrzeiger-
sinn gemischt. Zur Inkubation wurde die Mikrotiterplatte für 1 Stunde in den 37°C-Brut-
schrank verbracht. Das Monocytogenes-spezifische Antigen p60 bindet an die Antikörper, mit
denen die Kavitäten beschichtet sind.
In Schritt 2 wurden als Konjugat Antikörper gegen das p60-Protein hinzugegeben. Dazu
wurden 100 µl des Reagenz in jede Kavität pipettiert. Wie im ersten Schritt erfolgte das
sorgfältige Mischen und die Bebrütung (37°C, 1 Stunde). Das Antikörperkonjugat bindet an
p60, das bereits über Antikörper an die Kavität gebunden wurde (= Bildung des Sandwich-
Komplexes).
Sowohl nach dem ersten als auch nach dem zweiten Schritt wurden die Kavitäten geleert und
nicht-gebundene Antigene bzw. Antikörper in Waschschritten entfernt. Bei jedem Waschen
wurden alle Kavitäten fünfmal bis zum Rand mit Waschpuffer gefüllt (kräftiger Strahl) und
wieder geleert, und schließlich auf saugfähigem Papier trockengeklopft.
Der dritte Schritt bestand aus der Zugabe von je 100 µl einer 1:1-Mischung aus Substrat
(Harnstoffperoxid-Lösung) und Chromogen (Tetramethylbenzidin-Lösung). Die 30-minütige
Inkubation erfolgte abgedunkelt bei Raumtemperatur (18 – 25 °C). Mit der Reaktion
zwischen Sandwich-Komplex und Substrat-Chromogen-Lösung entsteht eine blaue Färbung,
die der Listeria monocytogenes-Konzentration in der beprobten Anreicherungskultur direkt
proportional ist. Nach der Inkubation wurde die Reaktion inhibiert, indem 1 M Schwefelsäure
(je 100 µl „Stopp-Lösung“) zugegeben wurde. Dabei entsteht eine Gelbfärbung der
Testlösung, die zu der vorherigen Blaufärbung proportional ist.
Das Messen in dem gegen Luft eingestellten Mikrotiterplatten-Reader erfolgt bei 450 nm.
Eigene Untersuchungen
64
3.2.3 PCR
Im Rahmen der molekularbiologischen Methode wurde in Anlehnung an die Vorschriften der
Amtlichen Sammlung von Untersuchungsmethoden nach § 35 LMBG (L 00.00-52 und
L 00.00-45) und in Anlehnung an die Arbeitsvorschriften des Herstellers gearbeitet.
Zur Steigerung der Anzahl lebensfähiger Bakterien, Verdünnung nicht-lebensfähiger
Bakterien und potentieller PCR-Inhibitoren wurde initial eine selektive kulturelle
Anreicherung vorgenommen. Dafür wurde das Probenmaterial in einen Stomacherbeutel
eingewogen und im Verhältnis 1:10 (Masse zu Volumen) mit Halbfraser-Bouillon verdünnt.
Nach dem Mischen von Probenmaterial und Anreicherungsflüssigkeit mit Hilfe eines
Stomachers und nach dem Überführen von 50 g des verdünnten Probenmaterials in einen
weiteren Stomacherbeutel erfolgte die Inkubation bei 37°C.
DNA-Extraktion
Nachdem das Untersuchungsmaterial verdünnt und inkubiert worden war, folgte anschließend
die Extraktion der Desoxyribonukleinsäure (DNA) mit Hilfe der sog. CTAB-Methode.
Durchführung der DNA-Extraktion:
Für die DNA-Extraktion wurde jeweils ein Probenvolumen von 1 ml aus der
Erstanreicherungskultur entnommen und in ein 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt.
Damit Keime und Verdünnungsflüssigkeit getrennt werden konnten, wurde die Erst-
anreicherungskultur zunächst bei 10 000 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Nach dem
Zentrifugieren konnte der Überstand über dem Keimsediment verworfen werden.
In einigen Fällen, in denen das Keimsediment durch Rückstände aus der Erst-
anreicherungskultur stark verunreinigt erschien, folgte dann ein Waschschritt. Das Keim-
sediment wurde mit 1 ml physiologischer Kochsalzlösung in Suspension gebracht und der
erste Zentrifugationsschritt und das Verwerfen des Überstandes wiederholt.
Zur Freisetzung der DNA aus den Zellen wurden Enzyme zugesetzt. Dazu wurde das
Keimsediment in 1 ml CTAB-Puffer gründlich suspendiert. Es wurden 50 µl Lysozym sowie
50 µl RNAse hinzugegeben und kurz gevortext.
Eigene Untersuchungen
65
Bei 37°C wurde die Probe mindestens 1 Stunde bebrütet.
Nach Zugabe von 25 µl Proteinase K und kurzem Vortexen wurde die Probe im Heizblock bei
65°C für mindestens 1 Stunde bebrütet. Danach lag die DNA in freier Form in der Probe vor.
Zur Entfernung der Nicht-DNA-Bestandteile wurde die Probe auf dem Vortex gemischt
und dann kurzzeitig zentrifugiert. Als organisches Lösungsmittel wurde Chloroform (700 µl)
mit der Probe durch Vortexen bei mittlerer Intensität für einige Sekunden vermengt. Die
Phasentrennung wurde mit einer 15-minütigen Zentrifugation bei 10 000 x g beschleunigt.
Wenn sich eine starke Interphase ausgebildet hatte, wurde die Aufreinigung der DNA mit
Chloroform wiederholt.
Die obere, wässrige, DNA-enthaltende Phase wurde in ein neues 2 ml-Eppendorf-Reaktions-
gefäß überführt.
Zur Konzentrierung der DNA wurden im Verhältnis 10:1 Isopropanol (750 µl) und
Natriumacetat (75 µl) zugesetzt. Nach kurzem Schütteln fiel die DNA für mindestens
30 Minuten bei Raumtemperatur aus. Durch Zentrifugieren (10 000 x g, 15 Minuten) wurde
die DNA pelletiert und anschließend der Überstand verworfen.
Um das relativ wenig flüchtige Isopropanol von der extrahierten Probe zu trennen, wurde das
besser flüchtige Ethanol (70 – 75 %ig, 500 µl) zugegeben, zentrifugiert (10 000 x g, 5 min)
und der Überstand möglichst vollständig entfernt. Das Reaktionsgefäß wurde mit offenem
Deckel in den Heizblock (60°C) gestellt, bis das DNA-Pellet trocken war.
Das DNA-Pellet wurde in 100 µl Pufferlösung (0,2x TE-Puffer) suspendiert. In dieser Form
konnte das DNA-Extrakt direkt verwendet oder bis zur weiteren Verwendung bei –18°C
tiefgefroren gelagert werden.
Fertigstellen des Reaktionsansatzes für die Multiplex-PCR (mit nachfolgender Agargel-
Elektrophorese)
Hier wurde der PREMaster LID-C/A (Listeria Duplex) der Firma Genescan Analytics
GmbH eingesetzt. Dieser PCR-Mastermix enthielt zwei Primerpaare, mit deren Hilfe zwei
verschiedene PCR-Produkte (148 bp und 234 bp) amplifiziert wurden.
Eigene Untersuchungen
66
Die Amplifikate stellten Fragmente der Monocytogenes-spezifischen Metalloprotease-Gene
und Hämolysin-Gene dar.
Der PCR-Reaktionsansatz wurde aus folgenden Komponenten fertiggestellt (pro PCR-
Reaktion):
19,7 µl PREMaster LID-C/A (Listeria Duplex)
0,3 µl Hot Star Taq Polymerase (5 U/µl)
5,0 µl DNA-Extrakt der Probe
Um sicherzustellen, dass es während der DNA-Extraktion und nachfolgend zu keiner
Kontamination mit Ziel-DNA gekommen und der PCR-Reaktionsansatz einwandfrei zusam-
mengesetzt worden war, wurden zusätzlich je eine Positiv- sowie eine Negativkontrolle
präpariert.
Zusammensetzung des PCR-Reaktionsansatzes für die Positivkontrolle:
19,7 µl PREMaster LID-C/A (Listeria Duplex)
0,3 µl Hot Star Taq Polymerase (5 U/µl)
5,0 µl aqua dest.
0,1 µl Kontroll-DNA
Zusammensetzung des PCR-Reaktionsansatzes für die Negativkontrolle:
19,7 µl PREMaster LID-C/A (Listeria Duplex)
0,3 µl Hot Star Taq Polymerase (5 U/µl)
5,0 µl aqua dest.
Amplifikationskontrollen im Sinne einer Prüfung auf Inhibition der Vervielfältigung der
DNA durch Bestandteile im PCR-Reaktionsansatz wurden durchgeführt.
Zusammensetzung des PCR-Reaktionsansatzes für die Amplifikationskontrolle:
19,7 µl PREMaster LID-C/A (Listeria Duplex)
0,3 µl Hot Star Taq Polymerase (5 U/µl)
5,0 µl DNA-Extrakt der Probe
0,1 µl Kontroll-DNA
Verwendete PCR-Reaktionsgefäße waren Achterstreifen oder Mµlti®-Ultra Tubes und fassten
ein Volumen von 0,2 ml.
Eigene Untersuchungen
67
Amplifikation (Vervielfältigung der DNA)
In jedem Fall wurde die PCR mit dem Thermocycler unter folgenden Bedingungen durch-
geführt (Tab. 13):
Tab. 13: Funktionen der einzelnen Zyklen und Temperatur-Zeit-Profil.
Zyklen Funktion Temperatur Zeit
Zyklus 1 Denaturieren der Ziel-DNA-Doppelstränge
Aktivieren der Taq Polymerase
94°C 15 min
Zyklus 2 - 41 DNA-Denaturierung
Annealing (Bindung der Primer) Elongation (Synthese durch Taq Polymerase)
94°C
60°C
72°C
30 sec 1 min 1 min 20 sec
Zyklus 42 Elongation unvollständiger PCR-Produkte 72°C 7 min
Nach Abschluß des zyklischen PCR-Vorgangs wurden die Amplifikate auf eine Temperatur
von 4°C abgekühlt.
Agargel-Elektrophorese
Zur Detektion der PCR-Produkte (Amplifikate) wurde eine Agargel-Elektrophorese
durchgeführt.
Mit dieser wurden die Amplifikate anhand ihrer Größe in einem 2%igen bzw. 2,5%igen
Agarosegel aufgetrennt. Durch Zusatz von Ethidiumbromid wurden die Amplifikate sichtbar.
Die Gele wurden hergestellt, indem Agarose (6,0 bzw. 7,5 g) in 300 ml 1x TBE-Puffer
suspendiert und in einem 500 ml-Becherglas auf einem Magnet-Heizrührer für 1 Stunde bei
200°C gelöst wurden. Der Magnet-Heizrührer war dabei auf 300 – 450 Umdrehungen pro
Minute eingestellt. Anschließend wurde das Agarose-1x TBE-Puffer-Sol zur Abkühlung auf
einen Magnetrührer gestellt, und es wurden 7,5 µl Ethidiumbromid zugesetzt.
Eigene Untersuchungen
68
Nach etwa 30 Minuten konnte das ausreichend abgekühlte Agarose-1x TBE-Puffer-Sol in
eine Gelgießkammer gegossen werden.
Dieses geschah vorsichtig, um zum einen eine Blasenbildung im Gel und zum anderen eine
Belastung der Gelgießkammer durch zu hohe Temperaturen zu vermeiden. In die Gel-
gießkammer waren vier Kunststoffkämme (mit 20, 30 oder 42 Zähnen) eingesetzt. Nachdem
das Agarose-1x TBE-Puffer-Sol abgekühlt und zu einem Gel erstarrt war, wurden die
Kunststoffkämme entfernt und das Gel geviertelt. Die einzelnen Gelviertel wurden für die
Agargel-Elektrophorese verwendet.
Die Gelviertel wurden so in die mit 1x TBE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer gelegt,
dass die Kavitäten des Gels alle mit 1x TBE-Puffer volliefen. Die PCR-Produkte wurden mit
einer Pipettenspitze Blaumarker durchmischt, und 7 µl bis 10 µl von den Amlifikat-
Blaumarker-Gemischen wurden in die Gelkavitäten pipettiert.
An die Elektrophoresekammer wurde eine elektrische Spannung von 200 Volt angelegt, die
für 30 Minuten gehalten wurde. Die amplifizierten DNA-Fragmente (und zusätzlich der
DNA-Längenstandard pUC 19/MSP I) wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen Länge und
der damit einhergehenden Unterschiede in der elektrischen Ladung aufgetrennt.
Nach der Elektrophorese folgte die Fluoreszenz-Detektion zur Darstellung der Amplifikate.
Dafür wurde das Gel auf den Transilluminator gelegt, und durch das Ethidiumbromid, das mit
der DNA interkaliert, konnten gesuchte Fragmente in Form von Banden visualisiert werden.
Die Dokumentation erfolgte mittels Polaroidfotografie.
Eine Probe, die eine Bande aus PCR-Produkten mit einer Länge von ca. 190 bp und außerdem
eine zweite Bande aus PCR-Produkten mit einer Länge von ca. 242 bp aufzuweisen hatte,
wurde unter Beachtung der Banden der Positivkontrolle als Listeria monocytogenes-positiv
beurteilt.
Eigene Untersuchungen
69
3.2.4 NUTRI®-Chip
Bei dem NUTRI®-Chip handelt es sich um einen Microarray, der für den parallelen Nachweis
von Listeria monocytogenes, Salmonella spp. und Campylobacter jejuni bzw. coli in
Lebensmitteln konzipiert wurde.
Im Vorfeld des Nachweises werden die spezies-spezifischen DNA-Abschnitte der nachzu-
weisenden Mikroorganismen simultan in einer einzigen PCR-Reaktion (Multiplex-PCR)
vervielfältigt. Dabei erkennen hochspezifische PCR-Primerpaare die für die einzelnen Ziel-
keime charakteristischen Gene, d. h. Gene, die nur in den gesuchten Mikroorganismen vor-
kommen. Die doppelsträngigen Amplifikate werden in Einzelstränge überführt (Einzelstrang-
verdau), wodurch die Hybridisierungsrate gesteigert wird. Die einzelsträngigen PCR-
Reaktionsprodukte werden direkt auf die Hybridisierungsregion des NUTRI®-Chip (Array)
gegeben, wo sie mit den Sonden hybridisieren können (Tab. 14). Nach Färben der
hybridisierten DNA, die Biotin-markierte dNTPs enthält, mit dem Fluoreszenzfarbstoff
Streptavidin-Cy5 wird der Farbstoff mit Laserstrahlen zur Fluoreszenz angeregt. Der
BioChip-Analysator (BioDetect 645TM) detektiert die Fluoreszenzsignale und visualisiert die
Hybridisierung. Die Auswertung erfolgt mit Hilfe einer Software oder visuell.
Verschiedene Kontrollsysteme (Kopplungskontrollen, Färbekontrollen und Hybridisierungs-
kontrollen), die zusätzlich in den Array integriert sind, ermöglichen die Prüfung hinsichtlich
der Drucktechnik, die Prüfung der Färbung im Verlauf des Nachweises und die Prüfung der
stattgehabten Hybridisierung.
Interne Positivkontrollen (oder auch „Inhibitionskontrollen“) verhindern, dass falsch-negative
Ergebnisse unerkannt bleiben, die z. B. durch Inhibition der Amplifikation entstehen können.
Für die internen Positivkontrollen enthält der PCR-Mastermix die sogenannten „Internen
Standards“. Dabei handelt es sich um DNA-Abschnitte der Zielkeime, die in einer nicht-
inhibierten PCR-Amplifikation immer (auch bei Nichtvorhandensein eines Zielkeims in einer
Probe) vervielfältigt und anschließend als Amplifikate visualisiert werden.
Eigene Untersuchungen
70
Tab. 14: Hybridisierungsregion des Microarrays: Anordnung der verschiedenen Sonden und ihre Funktionen.
KK KK KK KK
Salm spp.
Salm spp.
C. coliC. jej.
C. coliC. jej.
L. m. A
L. m. A
L. m. B
L. m. B
Salm PK
Salm PK
CampPK
CampPK
L. m. A PK
L. m. A PK
L. m. B PK
L. m. B PK
FK FK FK FK
Pos. HK
Pos. HK
Neg. HK
Neg. HK
KK KK KK KK
Salm spp.
Salm spp.
C. coliC. jej.
C. coliC. jej.
L. m. A
L. m. A
L. m. B
L. m. B
Salm PK
Salm PK
CampPK
CampPK
L. m. A PK
L. m. A PK
L. m. B PK
L. m. B PK
FK FK FK FK
Pos. HK
Pos. HK
Neg. HK
Neg. HK
Sonden: L. m. A = spezifisch für Listeria monocytogenes (Virulenzgen A) L. m. B = spezifisch für Listeria monocytogenes (Virulenzgen B) Salm spp. = spezifisch für Salmonella spp. C. coli / C. jej. = spezifisch für Campylobacter coli resp. jejuni PK = Positivkontrolle HK = Hybridisierungskontrolle FK = Färbekontrolle KK = Kopplungskontrolle
Eigene Untersuchungen
71
Kulturelle Anreicherung
s. 3.2.3
DNA-Extraktion
s. 3.2.3
Fertigstellen des Reaktionsansatzes für die Multiplex-PCR (nachfolgende Detektion mittels
Biochip-Technologie)
Hier wurde der PCR-Mastermix des NUTRI®-Chip-Testkits der Firma Genescan Analytics
GmbH eingesetzt. Dieser PCR-Mastermix enthält mehrere Primerpaare (= Multiplex-PCR),
mit deren Hilfe folgende PCR-Produkte amplifiziert wurden:
- Listeria monocytogenes-spezifische Amplifikate 1. 148 bp
2. 234 bp
- Salmonellen-spezifische Amplifikate 424 bp
- Campylobacter-spezifische Amplifikate 453 bp
- Interne Kontrollstandards: ITS (Listeria moncytogenes) 186 bp plus 252 bp
ITS (Salmonella) 493 bp
ITS (Campylobacter) 597 bp
Für eine PCR-Reaktion wurde der PCR-Reaktionsansatz aus folgenden Komponenten fertig-
gestellt:
19,0 µl PCR-Mastermix des NUTRI®-Chip-Testkits
1,0 µl Interne Kontrollstandards des NUTRI®-Chip-Testkits
5,0 µl DNA-Extrakt der Probe
Die Listeria monocytogenes-spezifischen Amplifikate spiegeln Sequenzen des Erreger-
Genoms, die jeweils Monocytogenes-spezifische Enzyme bzw. Proteine kodieren
(Metalloprotease-Gene und Hämolysin-Gene). Verwendete PCR-Reaktionsgefäße waren
Mµlti®-Ultra Tubes und fassten ein Volumen von 0,2 ml.
Amplifikation
s. 3.2.3
Eigene Untersuchungen
72
NUTRI®-Chip-Analyse
Zur Detektion der Amplifikate wurde eine NUTRI®-Chip-Analyse durchgeführt. Nachdem
die Amplifikate zu Einzelsträngen verdaut worden waren, wurden diese nach Hybridisierung
mit spezifischen Sonden gefärbt und visualisiert.
Einzelstrangverdau
1. 4,0 µl Exonukleasepuffer (5x) wurden in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß pipettiert und mit
16,0 µl des PCR-Produktes versetzt und sorgfältig gemischt.
2. Nach Zugabe von 1,0 µl Exonuklease war der Ansatz zum Einzelstrangverdau sorgfältig
zu mischen.
3. Durch direkt anschließendes Inkubieren im Heizofen bei 37°C für 15 Minuten wurde die
Effektivität des Exonuklease-Umsatzes optimiert.
4. Sofort danach wurde das Enzym im Heizblock Temperaturen von 80°C für 5 Minuten
ausgesetzt, um es zu deaktivieren.
5. Das Reaktionsgemisch mit den nun einzelsträngigen PCR-Produkten wurde kurz zentri-
fugiert.
Hybridisierung
1. Von der Hybridisierungslösung, die bis ca. 37°C erwärmt worden war, wurden 6,0 µl in
ein ebenfalls vorgewärmtes 1,5 ml-Eppendorfgefäß pipettiert.
2. Aus dem Reaktionsgemisch des Einzelstrangverdaus wurden 6,0 µl entnommen und in
die 6,0 µl Hybridisierungslösung überführt sowie mit dieser vermischt.
3. Dieser Hybridisierungsansatz mit einem Volumen von 12,0 µl wurde im Heizblock bei
80°C für 5 Minuten denaturiert.
4. Es folgte ein kurzes Zentrifugieren des Hybridisierungsansatzes.
5. Von dem Hybridisierungsansatz wurden 10,0 µl auf die Hybridisierungsregion (Array)
des NUTRI®-Chips gegeben, und zwar in der Weise, dass keine Bereiche, in denen
Sonden gekoppelt wurden, beschädigt werden konnten.
Eigene Untersuchungen
73
6. Mit einem Deckglas und einer Dichtung aus Fixogum®-Klebstoff wurde die Hybridi-
sierungsregion vom äußeren Milieu isoliert.
7. Hybridisierung: In einer feuchten Kammer wurden die NUTRI®-Chips bei 60°C im
Wasserbad für 15 Minuten inkubiert.
8. In Waschschritten wurde die Hybridisierungsregion von nicht-gebundenen bzw. nicht-
spezifischen Nukleinsäuren gereinigt: Nach dem Entfernen des Deckglases erfolgte in
einer Färbeküvette ein dreimaliges Waschen à 5 Minuten mit der Waschlösung I/A.
Färben
1. Mit Waschlösung II/B wurden die NUTRI®-Chips kurz gewaschen, anschließend wurde
die Hybridisierungsregion durch Klopfen der NUTRI®-Chips auf saugfähigem Papier
weitestgehend von Resten der Waschlösung befreit.
2. 15,0 µl Färbelösung wurden auf die Hybridisierungsregion aufgetragen. Mit einem Deck-
glas wurde die Hybridisierungsregion vorsichtig abgedeckt.
3. Nach dem Deponieren in einer feuchten Kammer wurden die NUTRI®-Chips für
30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert (Färbung).
4. In Waschschritten wurde die Hybridisierungsregion von überschüssiger Färbelösung
gereinigt: Nach dem Entfernen des Deckglases erfolgte in einer Färbeküvette ein
dreimaliges Waschen à 5 Minuten mit der Waschlösung II/B. Nachfolgend wurden die
NUTRI®-Chips kurz in destilliertem Wasser gewaschen.
5. Das Trocknen der NUTRI®-Chips wurde in einem Luftstrom aus synthetischer Luft vor-
genommen.
Messung, Visualisierung und Auswertung
Mit Hilfe des Biodetect 645TM wurden die Messwerte ermittelt. Die Belichtungszeit betrug
160 Sekunden. Messung, Visualisierung und Auswertung wurden mit den Software-
Programmen „BioChip Reader Control“ bzw. „Signalyse“ unterstützt.
Eigene Untersuchungen
74
3.3 Versuche
3.3.1 Dotieren von Schweinehackfleisch mit Listeria monocytogenes sowie mit Listeria
innocua
3.3.1.1 Prüfung der Anreicherungsbedingungen zur Erzielung bestimmter
Listeria monocytogenes-Konzentrationen
Für die künstliche Kontamination von Hackfleisch wurden bestimmte L. monocytogenes-
respektive L. innocua-Konzentrationen benötigt. Mit diesem Versuch sollte überprüft werden,
ob eine 20-stündige Inkubation des Erregers in TSYE-Bouillon (TSYEB) bei 37°C eine
Keimkonzentration zwischen 1,0 und 4,0 x 109 KbE ml-1 Anreicherungsbouillon ermöglicht.
In die raumtemperierte TSYEB wurde mit einer Impföse Koloniematerial des Teststammes
eingebracht, indem die Kultur zunächst mit etwas Flüssigkeit am Reagenzglasrand verrieben
und dann in die 10 ml abgeschwemmt wurde. Anschließend wurde die Suspension
homogenisiert und für 20 Stunden bei 37°C inkubiert.
Nach 20 Stunden Inkubation wurde von der Anreicherungskultur eine dezimale Verdünnungs-
reihe (bis zur 8. Verdünnungsstufe) hergestellt, damit die Gesamtkeimzahl ermittelt werden
konnte.
Dazu wurde die Anreicherungskultur durchmischt und mit einer Pipette 1 ml entnommen und
in ein Röhrchen mit 9 ml steriler physiologischer NaCl-Lösung gegeben
(1. Verdünnungsstufe). Aus diesem Röhrchen wurde wiederum nach Durchmischen 1 ml in
ein weiteres Röhrchen überführt (2. Verdünnungsstufe). Dieser Vorgang wurde wiederholt
(bis zur 8. Verdünnungsstufe).
Die Verdünnungsstufen 6 bis 8 (103 bis 101 KbE ml-1) wurden zur Bestimmung der
Keimkonzentration mittels Plattengussverfahren verwendet. Jeweils 1 ml einer Verdünnungs-
stufe wurde in eine Petrischale (92 mm x 16 mm) pipettiert und mit ca. 10 ml flüssigem
Standard-I-Agar vermischt (Doppelansatz).
Eigene Untersuchungen
75
Das erstarrte Nährmedium wurde bei 37°C eingestellt. Nach 18 bis 24 Stunden Inkubation
wurden die gewachsenen kolonienbildenden Einheiten ausgezählt und die Keimkonzentration
berechnet.
Die Gesamtkeimzahl der Anreicherungskultur (GKZ der Verdünnungsstufe 0; GKZ0) wurde
mit folgenden Formeln berechnet:
Σ a 1) ā = n1 · 1 + n2 · 0,1
ā gewogenes arithmetisches Mittel der Koloniezahlen
Σ a Summe der Kolonie-bildenden Einheiten aller ausgezählten Petrischalen
(niedrigste und nächst höhere Verdünnungsstufe)
n1 Anzahl von ausgezählten Petrischalen der niedrigsten Verdünnungsstufe
n2 Anzahl von ausgezählten Petrischalen der nächsthöheren Verdünnungsstufe
2) GKZ0 = ā · d
d Faktor der niedrigsten ausgezählten Verdünnungsstufe
3.3.1.2 Herstellen einer TK-Keimbank mit einem Freezing Medium
Mit Hilfe eines „Freezing Mediums“ (1x FM), einer Lösung, die Bakterienzellen während des
Tiefgefrierens schützt, wurden tiefgefrorene Keimsuspensionen (= halbe Stammkulturen) in
Aliquoten von 1 ml hergestellt. Jede halbe Stammkultur enthielt bekannte Anzahlen von
Keimen. Die Lagerung erfolgte bei –20°C. Nach Auftauen einer Portion konnte diese direkt
für das Dotieren benutzt werden.
Eigene Untersuchungen
76
Anreicherung
Ein Teststamm wurde in 10 ml TSYE-Bouillon bei 37°C für 20 Stunden angereichert. Danach
enthält die Anreicherungskultur regelmäßig log 9 KbE Listeria monocytogenes (etwa 1 – 3 x
109 KbE) pro ml.
Eine dezimale Verdünnungsreihe (bis zur 8. Verdünnungsstufe) wurde hergestellt, und zur
Bestimmung der Keimkonzentration wurde die Plattengusstechnik angewandt (s. o.).
Herstellung einer halben Stammkultur
Aus der Verdünnungsstufe 10-6 (ca. 1.000 bis 3.000 KbE L. m.) wurde je 1 ml in 2,0 ml-
Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert.
Anschließend wurden die Reaktionsgefäße für 12 Minuten bei 5.000 x g zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen, wobei das Entnehmen des Überstandes vorsichtig zu erfolgen
hatte (nicht-erkennbares Pellet). Das Pellet wurde mit 250 µl des 1x FM in Suspension
gebracht. Die Keimsuspension wurde bei –20°C tiefgefroren.
Zur Überprüfung der Herstellung wurde jeweils eine kleine Anzahl der tiefgefrorenen
Keimsuspensionen aufgetaut, und die Keimkonzentrationen wurden mit dem Platten-
gussverfahren bestimmt.
3.3.1.3 Dotieren (künstliche Kontamination)
Präparation einer Listeria monocytogenes-Brillantschwarz-Suspension
Für das Beimpfen wurde eine halbe Stammkultur von Listeria monocytogenes mit einer
Anzahl von x mal 103 koloniebildenden Einheiten bei Kühlschranktemperatur aufgetaut. Die
halbe Stammkultur mit einem Volumen von 0,25 ml wurde in 9,0 ml physiologische
Kochsalzlösung, die mit 0,005 g Brillantschwarz (Lebensmittelfarbstoff, Zusatzstoff E 151)
versetzt war, überführt. Das Behältnis der halben Stammkultur wurde mit 0,75 ml
physiologischer Kochsalzlösung gespült, und die Waschlösung wurde ebenfalls überführt
(= Listeria monocytogenes-Brillantschwarz-Suspension). Die Keimsuspension wurde auf dem
Vortex homogenisiert.
Eigene Untersuchungen
77
Als Alternative zur halben Stammkultur wurde in einigen Versuchen eine frische Listerien-
Anreicherungskultur verwendet. Listeria monocytogenes respektive Listeria innocua wurden
dazu in 10 ml TSYEB für 20 Stunden bei 37°C bebrütet. Nachfolgend wurde eine dezimale
Verdünnungsreihe erstellt. Zur Kontrolle der Keimkonzentration in der Anreicherungskultur
wurde diese mittels Plattengusstechnik bestimmt. 1 ml der 6. Verdünnungsstufe (log 3 KbE)
wurde anstelle einer halben Stammkultur für die Herstellung der Listerien-Brillantschwarz-
Suspension benutzt.
Dotieren des Hackfleisches
Mit einer 10 ml-Pipette wurde die homogenisierte Listerien-Suspension möglichst
gleichmäßig über die 80 g Hackfleisch verteilt.
Vorversuche ergaben, dass das 2-minütige Walken im Beutel-Walk-Gerät (Stomacher 400)
bei normaler Intensität (für die Probenvorbereitung üblich) n i c h t zu einer gleichmäßigen
Blaufärbung (= Homogenität) des beimpften Hackfleisches führte. Deshalb wurde der
Mischvorgang wie folgt durchgeführt:
Die beimpfte Probe wurde zunächst manuell vorgemischt und dann 1 Minute mit normaler
Intensität maschinell gewalkt. Das Gemenge wurde visuell auf Homogenität überprüft, ggf.
manuell gemischt und nochmals maschinell 1 Minute mit normaler Intensität gewalkt.
Wenn das Brillantschwarz eine gleichmäßige Blaufärbung des Hackfleisches hervorrief, und
wenn außerdem keine freie Flüssigkeit mehr beobachtet wurde, dann konnte von einer
homogenen künstlichen Kontamination des Gemenges ausgegangen werden. Das beimpfte
Hackfleisch (80 g Hackfleisch plus 10 ml Listeria monocytogenes-Brillantschwarz-
Keimsuspension = 90 g beimpftes Hackfleisch) wurde in Portionen von 10 g bzw. 25 g
aufgeteilt.
Eigene Untersuchungen
78
3.3.1.4 Überprüfung des Einflusses von Brillantschwarz auf das Wachstum von
Listerien
Damit ausgeschlossen werden konnte, dass der Zusatzstoff Brillantschwarz hemmende
Wirkungen auf das Wachstumspotential von Listerien ausübt, wurde dessen Einfluß
überprüft. Dazu wurde Listeria monocytogenes mit physiologischer NaCl-Lösung in
Suspension gebracht und mit einem Spatel zweimal auf TSYE-Agar ausgestrichen.
Auf eine der beimpften Agarplatten wurde zusätzlich viermal 1 Tropfen einer 0,05 %igen
Brillantschwarzlösung (5,0 mg Brillantschwarz in 9,0 ml physiologischer NaCl-Lösung)
gegeben. Die beimpften Agarplatten wurden 24 respektive 48 Stunden bei 37°C bebrütet, und
anschließend wurde das Bakterienwachstum beurteilt.
3.3.2 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode
3.3.2.1 Ermittlung des Zeitaufwandes
Das kulturelle Referenzverfahren für den Nachweis von Listeria monocytogenes ist im
Allgemeinen dafür bekannt, dass es sowohl zeit- als auch arbeitsintensiv ist. Mit dem
folgenden Versuch wurde ermittelt, wie hoch der zeitliche Aufwand für den sicheren
Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch ist.
Zu diesem Zweck wurden Hackfleisch-Portionen von je 80 g mit einer bestimmten Anzahl
koloniebildender Einheiten von L. monocytogenes, suspendiert in einer Lösung aus
physiologischem Kochsalz und Brillantschwarz, beimpft. 10 ml einer L. monocytogenes-
Brillantschwarz-Keimsuspension setzten sich wie folgt zusammen:
9 ml physiologische Kochsalzlösung plus 5 mg Brillantschwarz plus 1 ml der 6.
Verdünnungsstufe aus einer Anreicherungskultur, die nach dem Beimpfen von 10 ml
TSYEB mit Listeria monocytogenes 20 Stunden bei 37°C bebrütet worden war*.
*In Versuch 1 wurden ausnahmsweise 2 ml einer Anreicherungskultur zu 8 ml physiologischer Kochsalzlösung gegeben.
Eigene Untersuchungen
79
Direkt im Anschluß an die Herstellung der L. monocytogenes-Brillantschwarz-Keim-
suspension erfolgte das Dotieren des Hackfleisches (siehe 3.3.1.3).
Von den 90 g des beimpften Hackfleisches wurden drei Portionen von 25 g (A, B, C) ent-
nommen. Reste des kontaminierten Hackfleisches wurden verworfen.
Die 25 g-Portionen A, B und C wurden jeweils mit dem ersten flüssigen Selektivmedium
(Halbfraser) im Verhältnis 1:10 (Masse des Untersuchungsmaterials zu Volumen des
Anreicherungsmediums) verdünnt. Kontaminiertes Hackfleisch und Verdünnungsflüssigkeit
wurden mit dem Stomacher bei normaler Intensität für 1 Minute (bis zur Homogenität)
durchmischt.
Aus diesen homogenen Schweinehackfleischverdünnungen A, B und C wurden jeweils
viermal 50 g entnommen und bei 30°C für 24 Stunden inkubiert und im Folgenden als
Teilmengen 1 bis 12 gemäß dem kulturellen Referenzverfahren untersucht.
Als Negativkontrolle wurde parallel eine Verdünnung von 25 g undotiertem Hackfleisch wie
die Prüfkulturen behandelt. Damit sollte eine mögliche natürliche Kontamination des
Hackfleisches mit Listerien ausgeschlossen werden.
Je 1 ml der Listeria monocytogenes-Brillantschwarz-Keimsuspension wurde in 225 ml Halb-
fraser gegeben und als Positivkontrolle mitgeführt. Auf diese Weise wurde überprüft, ob die
Medien zur Anreicherung und Identifizierung in ausreichendem Maße bzw. effektiv genug
das selektive Wachstum von L. monocytogenes ermöglichten.
Eigene Untersuchungen
80
3.3.2.2 Spezifität der mikrobiologischen Referenzmethode für Mischkulturen mit
Listeria innocua in Schweinehackfleisch
Weil L. innocua als häufiger Begleiter von L. monocytogenes in Fleisch und Fleischprodukten
identifiziert ist, galt es in diesem Versuch, die Spezifität der mikrobiologischen
Referenzmethode bei gleichzeitiger Kontamination eines Lebensmittels mit L. monocytogenes
und L. innocua am Beispiel von Schweinehackfleisch festzustellen.
Die Listerienkontamination in 90 g dotiertem Schweinehackfleisch sollte für jede Spezies
x log 3 KbE betragen. Dafür wurde von einer TSYEB-Anreicherungskultur, die 20 Stunden
bei 37°C bebrütet worden war, eine Verdünnungsreihe erstellt. Die 6. Verdünnungsstufe
wurde zur künstlichen Kontamination des Hackfleisches herangezogen. Gleichzeitig wurde
die Keimkonzentration in der TSYEB-Anreicherungskultur mit Hilfe der Plattengusstechnik
ermittelt. Die Anzahl der dotierten Keime pro Gramm dotiertes Schweinehackfleisch wurde
dann mit Hilfe der Gesamtkeimzahl berechnet.
Hier wurden Hackfleisch-Portionen von je 80 g mit einer bestimmten Anzahl kolonie-
bildender Einheiten von L. monocytogenes sowie von L. innocua beimpft. Beide Spezies
wurden in einer Lösung aus physiologischem Kochsalz und Brillantschwarz suspendiert.
Diese Listeria monocytogenes-Listeria innocua-Brillantschwarz-Keimsuspension setzte sich
wie folgt zusammen:
8 ml physiologische Kochsalzlösung plus 5 mg Brillantschwarz plus je 1 ml der 6.
Verdünnungsstufe aus Anreicherungskulturen, die jeweils nach dem Beimpfen von 10
ml TSYEB mit Listeria monocytogenes respektive Listeria innocua 20 Stunden bei
37°C bebrütet worden war.
Nach der Erstellung der Brillantschwarz-Keimsuspension erfolgte das Dotieren des Hack-
fleisches in gleicher Weise wie unter 3.3.2.1.
Eigene Untersuchungen
81
Von den 90 g des beimpften, auf homogene Verteilung der inokulierten Keime überprüften
Hackfleisches (80 g Hackfleisch plus 10 ml Listeria monocytogenes-Listeria innocua-
Brillantschwarz-Keimsuspension) wurden drei Portionen von 25 g (a, b, c) entnommen. Reste
des kontaminierten Hackfleisches wurden verworfen.
Die 25 g-Portionen a, b und c wurden jeweils verdünnt und homogenisiert (siehe 3.3.2.1).
Aus diesen homogenen Schweinehackfleischverdünnungen a, b und c wurden jeweils viermal
50 g entnommen und bei 30°C für 24 Stunden inkubiert. Die 12 Teilmengen I bis XII wurden
im Folgenden gemäß dem kulturellen Referenzverfahren untersucht.
Als Negativkontrolle, die zum Ausschluß einer etwaigen natürlichen Kontamination des
Hackfleisches mit Listerien nötig ist, konnte hier diejenige zu dem Versuch 3.3.2.1
herangezogen werden, da die Untersuchungen unter 3.3.2.1 und dieser Versuch erstens
zeitlich parallel durchgeführt wurden und zweitens jeweils dieselbe Hackfleischcharge
verwendet wurde.
Als Positivkontrolle diente ebenfalls die unter 3.3.2.1 Beschriebene.
Eigene Untersuchungen
82
3.3.3 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels PCR
3.3.3.1 Versuche zur Sensitivität und Spezifität der PCR
3.3.3.1.1 Sensitivität der PCR nach Anreicherung von Listeria monocytogenes in
TSYE- und Halbfraser–Bouillon
Koloniematerial des Teststammes wurde in 10 ml TSYE-Bouillon über 20 Stunden bei 37°C
angereichert, und im Anschluß wurde eine Verdünnungsreihe (bis zur Verdünnungsstufe 9)
erstellt und die Gesamtkeimzahl mit Hilfe des Plattengussverfahrens bestimmt.
Aus je 1 ml verschiedener Verdünnungsstufen wurde die DNA extrahiert (siehe 3.2.3), die
mittels L. monocytogenes-spezifischer Primer in einer Multiplex-PCR amplifiziert wurde
(siehe 3.2.3). Die Detektion der Amplifikate erfolgte in einer Agargel-Elektrophorese (siehe
3.2.3).
Analog zu dieser Vorgehensweise wurde eine weitere Untersuchung durchgeführt, bei der die
TSYE-Bouillon gegen Halbfraser -Bouillon ausgetauscht wurde.
3.3.3.1.2 Prüfung der Spezifität der PCR mit DNA von Listeria innocua
Von einer L. innocua-Reinkultur wurde 1 Öse Koloniematerial entnommen und für
20 Stunden bei 37°C in 10 ml TSYE-Bouillon bebrütet.
Die Keimzahl wurde mittels Plattengussverfahrens bestimmt. Die DNA wurde extrahiert,
amplifiziert, und die Amplifikate wurden mittels Agargel-Elektrophorese detektiert (siehe
3.2.3).
Eigene Untersuchungen
83
3.3.3.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis
von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels PCR
Besondere Beachtung galt in diesem Versuch dem Zeitraum der Inkubation, nach dem
erstmals jede Probe als Listeria monocytogenes-positiv bewertet werden konnte. Dieser
Zeitraum wird als Mindestanreicherungszeit definiert. Für die Untersuchungen wurde Listeria
monocytogenes-dotiertes Schweinehackfleisch verwendet.
Dotieren des Hackfleisches
Die Kontamination sollte eine Anzahl von 30 KbE L. monocytogenes pro Gramm Hackfleisch
nicht überschreiten. Für das Dotieren (siehe 3.3.1.3) wurde eine halbe Stammkultur von
L. monocytogenes SLCC 9091 1/2a mit einer Anzahl von 2,0 x 103 KbE bei
Kühlschranktemperatur aufgetaut. Das beimpfte Hackfleisch wurde in Portionen von 10 g und
25 g aufgeteilt.
Mit raumtemperierter Halbfraser-Bouillon (90 bzw. 225 ml) wurde jede Probe neunfach
verdünnt. Jeweils 50 g der Anreicherungssuspension wurden aus den Schweinehackfleisch-
verdünnungen entnommen und bei 37°C inkubiert.
Kulturelle Anreicherung
In Vorversuchen hatten sich Inkubationszeiten von 6 und 9 Stunden als nicht ausreichend für
einen positiven Monocytogenes-Nachweis erwiesen. Ein positiver Nachweis von Listeria
monocytogenes war nach 20- bzw. 24-stündiger Anreicherung im selektiven
Anreicherungsmedium (Halbfraser) möglich. Die Anzahl Kolonie-bildender Einheiten pro
Gramm Hackfleisch betrug dabei nach dem Dotieren 42,2 (in Vorversuch I: 24 h Inkubation)
und 30,0 (in Vorversuchen II – VI: 6, 9, 20 und 24 h Inkubation).
Zur Ermittlung der Mindestanreicherungszeit betrugen die Anreicherungszeiten bis zu
18 Stunden. Die Probenahme erfolgte nach 10, 12, 14, 16 und 18 Stunden.
Eigene Untersuchungen
84
Nachweis von Listeria monocytogenes-spezifischen DNA-Sequenzen
1 ml der Anreicherungskultur wurde jeweils für die DNA-Extraktion entnommen und in 2 ml-
Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt. Nach Extraktion und Amplifikation der DNA mit der
Multiplex-PCR erfolgte zunächst eine Detektion der PCR-Produkte mittels Agargel-
Elektrophorese (siehe 3.2.3).
Die Durchführung des Versuchs erfolgte in 9-facher Wiederholung. Jede Charge Hackfleisch
wurde analog auf die Anwesenheit von Listeria monocytogenes untersucht. Die DNA-
Extrakte wurden für die Nachweisführung mittels Microarray (siehe 3.3.4.1) bei –20°C
zurückgestellt.
Berechnung der Anzahl der dotierten Keime in den Vorversuchen
Die Anzahl der Keime pro Gramm Hackfleisch wurde wie folgt bestimmt:
10 ml Keimsuspension mit x KbE L. monocytogenes + 80 g Schweinehackfleisch
= 90 g dotiertes Schweinehackfleisch
Anzahl KbE L. monocytogenes pro 90 g Hackfleisch → x KbE 90 g-1
= (x / 90) KbE g-1
x = Anzahl koloniebildender Einheiten in 1 ml Anreicherungskultur
ad Vorversuch I:
10 ml Keimsuspension enthalten 3,8 x 103 KbE L. monocytogenes
� 42,2 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
ad Vorversuche II-VI:
10 ml Keimsuspension enthalten 2,7 x 103 KbE L. monocytogenes
� 30,0 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
Eigene Untersuchungen
85
3.3.4 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweine-
hackfleisch mittels Microarray
3.3.4.1 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis
von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels Microarray
Zur Ermittlung der Mindestanreicherungszeit (siehe 3.3.3.2) wurden die DNA-Extrakte aus
dem unter 3.3.3.2 beschriebenen Versuch herangezogen. Der Nachweis von Monocytogenes-
spezifischer DNA wurde mit der NUTRI®-Chip-Analyse (siehe 3.2.4) geführt.
3.3.4.2 Spezifität des Microarray-Nachweises für Mischkulturen mit Listeria
innocua in Schweinehackfleisch
Natürlich mit Listerien kontaminierte Lebensmittel enthalten häufig gleichzeitig Listeria
monocytogenes und Listeria innocua. Es ist daher immer wahrscheinlich, dass nach
Extraktion der DNA aus einer natürlich kontaminierten Probe neben der Monocytogenes-
DNA ebenfalls DNA von Listeria innocua in dem Extrakt vorliegt.
Zur Prüfung des Unterscheidungsvermögens der Methode wurde aus dem unter 3.3.2.2
beschriebenen Versuch von jeder der 56 Schweinehackfleischverdünnungen nach der selekti-
ven Anreicherung in Halbfraser-Bouillon eine Probe für den molekularbiologischen Nachweis
entnommen. Zusätzlich wurde von einer L. innocua-Reinkultur eine Probe entnommen, die
genauso wie die Schweinehackfleischverdünnungen behandelt wurde.
Die Probenahme erfolgte nach 24 Stunden Inkubation der Proben bei 30°C. Aus je 1 ml der
Halbfraser-Anreicherungskultur wurde die DNA extrahiert und amplifiziert (siehe 3.2.3).
Reste der Halbfraser-Anreicherungskulturen wurden in 50 ml-Sarstedt-Röhrchen überführt
und bei –20°C tiefgefroren.
Die Amplifikate wurden nach den Angaben des Herstellers mit Hilfe der NUTRI®-Chip-
Analyse auf Monocytogenes-spezifische DNA untersucht.
Es erfolgte zudem eine Prüfung der Extraktionskontrollen auf Kontamination mit Ziel-DNA.
Eigene Untersuchungen
86
3.3.5 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweine-
hackfleisch mittels ELISA
3.3.5.1 Überprüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Einflüsse auf
die ELISA-Methode (Tranisa plate® Listeria moncytogenes-ELISA) sowie
der vom Hersteller angegebenen Sensitivität für das Testkit
Damit ausgeschlossen werden konnte, dass der Zusatzstoff Brillantschwarz hemmende
Wirkungen auf die ELISA-Reaktionen ausübt, wurde dessen Einfluß überprüft.
Zu diesem Zweck wurde die Nachweisgrenze des ELISA mit und ohne Zusatz von
Brillantschwarz ermittelt.
Listeria monocytogenes wurde 20 Stunden in 10 ml TSYE-Bouillon bei 37°C angereichert.
Anschließend wurden von der Anreicherungskultur zwei Verdünnungsreihen bis zur
8. Verdünnungsstufe erstellt.
Während die Kulturröhrchen der Verdünnungsreihe 1 wie üblich physiologische NaCl-
Lösung enthielten, wurde jedem Kulturröhrchen der Verdünnungsreihe 2 zusätzlich 5 mg
Brillantschwarz beigefügt.
Die Verdünnungsreihen wurden erstellt, und aus den Verdünnungsstufen 1 bis 4 sowie aus der
unverdünnten Anreicherungskultur wurden Proben für den Nachweis mittels ELISA
entnommen. Die Durchführung des ELISA erfolgte nach den Empfehlungen des Herstellers.
Die Verdünnungsstufen 7 und 8 wurden zu einer Bestimmung der Gesamtkeimzahl mittels
Plattengussverfahren herangezogen.
Eigene Untersuchungen
87
3.3.5.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis
von Listeria monocytogenes mittels ELISA
Der kommerziell erhältliche Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA der Firma Transia
GmbH (Artikel-Nr. 74029) wurde hier für den Nachweis von Listeria monocytogenes aus
Hackfleisch vom Schwein eingesetzt. Das Testkit besteht aus den Reagenzien und einer
Mikrotiterplatte.
Dieser Sandwich-Enzymimmunoassay weist anhand eines Listeria monocytogenes-
spezifischen Antigens (p60) die Anwesenheit des Keims in Lebensmitteln wie z. B.
Fleischprodukten nach.
In den Kavitäten der brechbaren Kavitätenstreifen, die mit Antikörpern gegen das p60
beschichtet sind, wurde der ELISA durchgeführt (siehe 3.2.2).
Im Vorfeld des Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA erfolgte die künstliche
Kontamination des Hackfleisches (siehe 3.3.1.3), die selektive Anreicherung der gesuchten
Keime und die Probenaufbereitung.
Für das Dotieren wurden halbe Stammkulturen verwendet. Bei einer sogenannten „halben
Stammkultur“ handelt es sich um ein Bakterienpellet, das mit einem „Freezing Medium“ in
Suspension gebracht wurde und bis zum Auftauen bei –20°C tiefgefroren gelagert wurde
(siehe 3.3.1.2).
Jeweils eine Portion von 80 g Schweinehackfleisch sollte mit 2 – 3 x 103 KbE Listeria
monocytogenes dotiert werden. Damit wären in 1 g Hackfleisch zwischen 22,2 und 33,3 KbE
Listeria monocytogenes enthalten.
Zunächst wurde eine L. monocytogenes-Brillantschwarz-Keimsuspension (10 ml) hergestellt.
Diese Keimsuspension wurde mit 80 g Hackfleisch möglichst homogen vermengt. Die
90 g Hackfleisch-Portion wurde anschließend in drei Teilmengen à 25 g aufgeteilt (siehe
3.3.1.3).
25 g dotiertes Hackfleisch wurden mit 225 ml Halbfraser-Bouillon verdünnt (1:10, Masse zu
Volumen) und von dieser Verdünnung 50 g zur weiteren Untersuchung entnommen.
Eigene Untersuchungen
88
Die erste selektive Anreicherung der Keime erfolgte bei 37°C. Dies stellt eine Abweichung
von der Methode nach § 35 LMBG dar, die eine Erstanreicherung in Halbfraser-Bouillon bei
einer Temperatur von 30°C vorsieht. Die Verwendung von Halbfraser-Bouillon stellt eine
Abweichung von der Herstellerempfehlung für den ELISA dar, nach der die Erstanreicherung
in L-PALCAM-Bouillon erfolgen sollte.
Anschließend wurde von verschiedenen Proben 0,1 ml in 10 ml Fraser-Bouillon überführt und
sekundär bei 37°C angereichert.
Die Probennahme erfolgte an unterschiedlichen Zeitpunkten während der Inkubation. Dabei
wurde 1 ml der Anreicherungskultur entnommen und test-spezifisch aufbereitet (Doppel-
ansatz). Der Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA wurde nach der Anleitung des
Herstellers durchgeführt (siehe 3.3.2).
Aus der Erstanreicherungs- oder Zweitanreicherungskultur wurde je Probe ein- bzw. zweimal
1 ml (Einfach- bzw. Doppelansatz) in ein hitzebeständiges Röhrchen (2 ml-Eppendorfgefäß)
überführt.
Eigene Untersuchungen
89
3.3.6 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Feldproben
mittels molekularbiologischen Verfahren
3.3.6.1 Untersuchung von Listerien-positiven Feldproben mittels Agargel-
Elektrophorese und Microarray
Verschiedene Lebensmittel, i. d. R. hergestellt auf der Grundlage von tierischen Rohstoffen,
und Umweltproben waren im Gissel-Institut, Hannover, kulturell gemäß § 35 LMBG auf
Listeria monocytogenes untersucht worden. Die Zwischenlagerung der Halbfraser-
Anreicherungskulturen (24 Stunden inkubiert) erfolgte tiefgefroren (–20°C).
Von den insgesamt 71 Proben war mit der mikrobiologischen Untersuchung in 48 Proben
Listeria monocytogenes nachgewiesen worden. In einer weiteren Probe konnte die
Anwesenheit von Listeria spp. festgestellt werden. In 22 Proben hingegen konnten weder
Listeria monocytogenes noch andere Listerien-Spezies mikrobiologisch bestätigt werden.
Die aufgetauten Anreicherungskulturen wurden durchmischt, indem die Proben (in einem
50 ml-Sarstedt-Röhrchen) vorsichtig invertiert wurden.
Für die Untersuchung wurden von jeder Probe zweimal 1 ml (Doppelansatz) entnommen.
Nach der DNA-Extraktion wurden 2 verschiedene Master-Mixe (siehe 3.2.3 und 3.2.4)
bereitgestellt und die PCR (siehe 3.2.3) durchgeführt. Im Anschluß an die PCR wurden die
Amplifikate zum einen mittels Agargel-Elektrophorese und zum anderen mittels NUTRI®-
Chip-Analyse auf Monocytogenes-spezifische DNA untersucht.
Ergebnisse
90
4. Ergebnisse
4.1 Dotieren von Schweinehackfleisch mit Listeria monocytogenes sowie mit Listeria
innocua
4.1.1 Prüfung der Anreicherungsbedingungen zur Erzielung bestimmter Listeria
monocytogenes-Konzentrationen
Für die künstliche Kontamination von Hackfleisch sollten bestimmte Listeria monocytogenes-
Konzentrationen eingesetzt werden. Mit diesem Vorversuch wurde festgestellt, unter welchen
Bedingungen der Keim zu inkubieren war, damit Gesamtkeimzahlen zwischen 1,0 und 4,0 x
109 KbE pro ml Anreicherungsmedium vorlagen.
Die mittels Plattengusstechnik bzw. Spateltechnik (auf Blutagar) kultivierten Keime wurden
ausgezählt und die Gesamtkeimzahl berechnet. Damit ergaben sich die Gesamtkeimzahlen in
verschiedenen Anreicherungskulturen (Tab. 15).
Tab. 15: Gesamtkeimzahlen verschiedener Anreicherungskulturen zur Prüfung der Anreiche-rungsbedingungen.
KbE Listeria monocytogenes ml-1
AnreicherungskulturNr.
Plattengusstechnik Spateltechnik
1 1,6 x 109 1,7 x 109
2 4,0 x 109 0,9 x 109
3 3,4 x 109 3,4 x 109
4 3,8 x 109 -
Die Anreicherungsbedingungen (10 ml TSYE-Bouillon, Temperatur 37°C, Inkubationsdauer
20 Stunden) erwiesen sich als geeignet, die benötigten Keimzahlen zu erreichen.
Ergebnisse
91
Die Tatsache, dass die Auszählung von auf Blutagar gewachsenen Kolonien arbeits-
aufwendiger ist als bei der Plattengusstechnik, führte zu dem Entschluß, im folgenden mit der
einfacher zu arbeitenden Methode (Plattengusstechnik) zu arbeiten. Die Abweichung in der
ermittelten Gesamtkeimzahl für die Anreicherungskultur 2 läßt sich auf einen technischen
Fehler bei der Durchführung zurückführen; die ermittelten Gesamtkeimzahlen für die
Anreicherungskulturen 1 und 3 sprechen für eine Gleichwertigkeit der beiden Techniken.
4.1.2 Herstellen einer TK-Keimbank mit einem Freezing Medium
Jede Portion der TK-Keimbank sollte nach dem Auftauen eine Gesamtkeimzahl enthalten, die
der Gesamtkeimzahl vor dem Prozeß des Gefrierens möglichst entspricht. Von den
verschiedenen Chargen (= Gesamtheit halber Stammkulturen, die aus einer einzigen
Verdünnungsstufe einer Verdünnungsreihe hergestellt wurde) wurde von einer 1 ml-Portion
die Gesamtkeimzahl ermittelt.
Nach Auftauen der 1 ml-TK-Portionen bei Temperaturen von 6 – 8°C wurde eine
Verdünnungsreihe erstellt und die Gesamtkeimzahl mit Hilfe der Plattengusstechnik
bestimmt.
Die Gesamtkeimzahl betrug vor dem Einfrieren im Mittel 2,4 x 109 KbE je ml
Anreicherungskultur (unverdünnt). Nach dem Auftauen konnten im Durchschnitt je TK-
Portion (Verdünnungsstufe 10-6) 2,0 x 103 KbE wiedergefunden werden. Die Differenz
zwischen den Faktoren vor dem Einfrieren und den Faktoren nach dem Auftauen betrug im
Mittel 0,4 (Tab. 16).
Alle TK-Portionen entsprachen nach Auftauen hinsichtlich der Gesamtkeimzahl den
Erwartungen und enthielten zufriedenstellende Keimkonzentrationen, die sie für den Einsatz
in den Versuchen als gebrauchsfähig kennzeichneten.
Ergebnisse
92
Tab. 16: Gesamtkeimzahl von koloniebildenden Einheiten Listeria monocytogenes pro TK-Portion einer halben Stammkultur.
Charge KbE vor Einfrieren(pro ml Anreicherungskultur)
KbE nach Auftauen(pro TK-Portion)
DifferenzVOR - NACH
1 2,7 x 109 2,0 x 103 ─ 0,7
2 2,3 x 109 2,3 x 103 ± 0,0
3 2,1 x 109 1,7 x 103 ─ 0,4
4 2,3 x 109 2,1 x 103 ─ 0,2
5 2,5 x 109 1,9 x 103 ─ 0,6
6 2,3 x 109 1,8 x 103 ─ 0,5
7 2,3 x 109 1,9 x 103 ─ 0,4
Mittelwert 2,4 x 109 2,0 x 103 ─ 0,4
4.1.3 Dotieren (künstliche Kontamination) des Hackfleisches
Die homogene Verteilung der inokulierten Bakterien konnte über alle Versuche kontrolliert
erzielt werden. Dabei wurde von einer homogenen bakteriellen Verteilung ausgegangen,
wenn das Schweinehackfleisch in allen sichtbaren Teilen eine gleichmäßige Blaufärbung
angenommen hatte. Nach Unterbrechung des maschinellen Mischvorgangs und visueller
Beurteilung der Blaufärbung wurde in den meisten Fällen (wenn allzu deutlich ungefärbte
neben gefärbten Bereichen in Erscheinung traten) ein manuelles Mischen notwendig. Das
insgesamt 2-minütige Mischen im Stomacher konnte damit erfolgreich unterstützt werden.
4.1.4 Prüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Wirkungen auf das
kulturelle Wachstum von Listerien
Hemmhöfe oder Unterschiede im Bakterienwachstum unter Einfluß von Brillantschwarz nach
48 Stunden Inkubation bei 37°C wurden nicht beobachtet. Alle mit Listeria monocytogenes
beimpften TSYE-Agarplatten zeigten ein vergleichbares Wachstum des Testkeimes in Form
eines dichten Bakterienrasens.
Inhibierende Wirkungen des Zusatzstoffes Brillantschwarz auf das kulturelle Wachstum
wurden nicht festgestellt.
Ergebnisse
93
4.2 Nachweis von Listerien in Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode
4.2.1 Ermittlung des Zeitaufwandes für den qualitativen Nachweis von Listeria
monocytogenes in Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode
Um den zeitlichen Aufwand des kulturellen Referenzverfahrens in Anwendung auf
Schweinehackfleisch darzustellen, wurden 60 Schweinehackfleischverdünnungen mikrobio-
logisch untersucht.
Fünf Hackfleischportionen (Versuche 1 bis 5) zu je 80 g wurden mit dem Erreger dotiert und
enthielten danach zwischen 13,4 und 57,8 KbE pro Gramm. Von den dotierten Hackfleisch-
portionen wurden jeweils dreimal 25 g entnommen. Die drei 25 g-Portionen wurden verdünnt
und von jeder Verdünnung 4 Teilmengen entnommen. Auf diese Weise standen 60 Schweine-
hackfleischverdünnungen für die weitere Untersuchung zur Verfügung.
Die Anwesenheit von Listeria monocytogenes wurde in allen 60 dotierten Schweinehack-
fleischverdünnungen positiv bestätigt. Die Nachweisquote betrug 100 %. Das Ergebnis lag
jeweils nach 5 Untersuchungstagen vor.
Bei den parallel durchgeführten Untersuchungen der Negativkontrollen wurden durchweg
negative Ergebnisse erzielt. Die Positivkontrollen zeigten in allen Fällen die Wirksamkeit der
verwendeten Medien an.
Die Anzahl der Keime pro Gramm Hackfleisch wurde wie folgt bestimmt:
10 ml Keimsuspension mit x KbE L. monocytogenes + 80 g Schweinehackfleisch
= 90 g dotiertes Schweinehackfleisch
Anzahl KbE L. monocytogenes pro 90 g Hackfleisch → x KbE 90 g-1
= (x / 90) KbE g-1
x = Anzahl koloniebildender Einheiten in 1 ml Anreicherungskultur
Ergebnisse
94
ad Versuch 1: 10 ml Keimsuspension enthalten 5 200 KbE L. monocytogenes
� 57,8 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
ad Versuch 2: 10 ml Keimsuspension enthalten 2 000 KbE L. monocytogenes
� 22,2 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
ad Versuch 3: 10 ml Keimsuspension enthalten 2 190 KbE L. monocytogenes
� 24,3 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
ad Versuch 4: 10 ml Keimsuspension enthalten 2 145 KbE L. monocytogenes
� 23,8 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
ad Versuch 5: 10 ml Keimsuspension enthalten 1 210 KbE L. monocytogenes
� 13,4 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
Im Durchschnitt wurde das Schweinehackfleisch mit etwa 28 KbE g-1 beimpft.
Zusätzlich konnte festgestellt werden, dass der PALCAM-Agar deutlich effektiver als der
Oxford-Agar eine Unterdrückung der Begleitflora, die mit dem Schweinehackfleisch
eingebracht wurde, bewirkt. Auf keiner PALCAM-Agar-Platte konnte ein nenneswertes
Wachstum unerwünschter Begleitkeime beobachtet werden.
Die S c h w a r z f ä r b u n g der Halbfraser-Bouillon war in den meisten Fällen nach 24 h
entwickelt. In den Fällen, bei denen dieses nicht so war, waren dunkle Inseln innerhalb des
Untersuchungsmaterials deutlich zu erkennen. Nach Durchmischen der Probe bzw. spätestens
5 h später bei Raumtemperatur war die Schwarzfärbung vollständig ausgebildet. Auch waren
hier gelegentlich Listerien-negative Proben nach 2 – 3 Tagen schwarz gefärbt, ohne dass
Listerien nachweisbar waren (= negativ). Nach 48 h Inkubation war die Fraser-Bouillon, die
Listeria monocytogenes enthielt, immer vollständig schwarz.
Ergebnisse
95
4.2.2 Spezifität der mikrobiologischen Referenzmethode für Mischkulturen mit
Listeria innocua in Schweinehackfleisch
Zur Darstellung des Potentials der mikrobiologischen Referenzmethode bei gleichzeitiger
Kontamination eines Lebensmittels mit L. monocytogenes sowie mit L. innocua wurde dieses
Verfahren mit 56 künstlich kontaminierten Schweinehackfleischverdünnungen, die von 5
dotierten Hackfleischportionen stammten, geprüft.
Die 5 Hackfleischportionen (Versuche 1 bis 5) enthielten nach dem Dotieren zum einen
zwischen 13,4 und 57,8 KbE L. monocytogenes pro Gramm und zum anderen zwischen 17,8
und 63,3 KbE L. innocua pro Gramm. Im Hackfleisch lag damit eine Mischkultur aus
L. innocua und L. monocytogenes mit einem durchschnittlichen Verhältnis von 1:1,2 vor
(Tab. 17).
Von den dotierten Hackfleischportionen wurden jeweils dreimal 25 g entnommen. Die drei
25 g-Proben wurden verdünnt und von jeder Verdünnung 3 bzw. 4 Teilmengen entnommen.
Auf diese Weise standen 56 Schweinehackfleischverdünnungen für die weitere Untersuchung
zur Verfügung.
Von den 56 Schweinehackfleischverdünnungen, denen jeweils sowohl L. monocytogenes als
auch L. innocua zugesetzt wurden, enthielten nachweislich alle Listeria spp. Der positive
qualitative Nachweis von L. monocytogenes gelang in 30 Fällen. Dies entspricht einer Nach-
weisquote von 53,6 %. Das Ergebnis lag jeweils am Tag 5 der Untersuchung vor.
Die Ergebnisse von Negativ- und Positivkontrollen waren identisch mit denen unter 4.2.1
beschriebenen (negativer Listerien-Nachweis in allen Negativkontrollen).
Wie in Versuch 3.3.2.1 wurde auch in dieser Versuchsreihe die Effektivität des PALCAM-
Agars in Bezug auf das selektive Wachstum deutlich. Während auf Oxford-Agar-Platte
innerhalb dieser Studien stets das Wachstum von unspezifischer Begleitflora beobachtet
wurde, konnte mittels PALCAM-Agar in jedem Fall die Begleitflora vollständig unterdrückt
werden. Die inokulierten primären Anreicherungskulturen färbten sich immer innerhalb der
Inkubationszeiten vollständig schwarz.
Die Anzahl der Keime pro Gramm Hackfleisch wurde wie folgt bestimmt:
Ergebnisse
96
10 ml Keimsuspension mit x KbE L. monocytogenes sowie x KbE L. innocua + 80 g
Schweinehackfleisch = 90 g dotiertes Schweinehackfleisch
Anzahl KbE L. monocytogenes bzw. L. innocua pro 90 g Hackfleisch → x KbE 90 g-1
= (x / 90) KbE g-1
x = Anzahl koloniebildender Einheiten in 1 ml Anreicherungskultur
ad Versuch 1: 10 ml Keimsuspension enthalten 5 200 KbE L. monocytogenes
� 57,8 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
10 ml Keimsuspension enthalten 5 700 KbE L. innocua
� 63,3 KbE L. innocua / g Hackfleisch
ad Versuch 2: 10 ml Keimsuspension enthalten 2 000 KbE L. monocytogenes
� 22,2 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
10 ml Keimsuspension enthalten 2 130 KbE L. innocua
� 23,7 KbE L. innocua / g Hackfleisch
ad Versuch 3: 10 ml Keimsuspension enthalten 2 190 KbE L. monocytogenes
� 24,3 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
10 ml Keimsuspension enthalten 2 530 KbE L. innocua
� 28,1 KbE L. innocua / g Hackfleisch
ad Versuch 4: 10 ml Keimsuspension enthalten 2 145 KbE L. monocytogenes
� 23,8 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
10 ml Keimsuspension enthalten 2 245 KbE L. innocua
� 24,9 KbE L. innocua / g Hackfleisch
ad Versuch 5: 10 ml Keimsuspension enthalten 1 210 KbE L. monocytogenes
� 13,4 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
10 ml Keimsuspension enthalten 1 600 KbE L. innocua
� 17,8 KbE L. innocua / g Hackfleisch
Tab. 17: Verhältnis der Anzahl von L. innocua zur Anzahl von L. monocytogenes ininokuliertem Hackfleisch.
Verhältnis inMischkultur
Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Versuch 4 Versuch 5 gesamt
L. innocua :L. monocytogenes 1:1,1 1:1,1 1:1,2 1:1,1 1:1,3 1:1,16
Ergebnisse
97
4.3 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels PCR
4.3.1 Versuche zur Sensitivität und Spezifität der PCR
4.3.1.1 Sensitivität der PCR nach Anreicherung von Listeria monocytogenes in
TSYE- respektive Halbfraser-Bouillon
Zur Darstellung der Nachweisgrenze des verwendeten PCR-Systems wurde der Teststamm
in TSYE-Bouillon angereichert.
Die Verdünnungsstufen 0 bis 9 (je 1 ml) der Anreicherungskultur wurden aufbereitet und der
molekularbiologische Nachweis mittels PCR und nachfolgender Agargel-Elektrophorese
geführt. Die Gesamtkeimzahl in der Anreicherungskultur wurde bestimmt.
Analog zu dieser Vorgehensweise wurde eine weitere Untersuchung durchgeführt, bei der die
TSYE-Bouillon gegen Halbfraser-Bouillon ausgetauscht wurde.
Die Gesamtkeimzahlen der beimpften und bebrüteten TSYE-Bouillons beliefen sich auf
3,4 und 3,8 x 109 KbE Listeria monocytogenes. Die Gesamtkeimzahl in der Halbfraser-
Bouillon betrug nach der Inkubation 1,4 x 109 KbE Listeria monocytogenes.
Die Nachweisgrenze (s. Tab. 18) deutete sich in einem Bereich an, in dem sich die
Keimkonzentration zwischen log 3 und log 4 KbE Listeria monocytogenes bewegte (1.400 bis
34.000 KbE).
4.3.1.2 Prüfung der Spezifität der PCR mit DNA von Listeria innocua
Neben Listeria monocytogenes wird in Fleisch und Fleischerzeugnissen besonders häufig
Listeria innocua gefunden.
Von einer Listeria innocua-Anreicherungskultur, die 2,0 x 109 KbE pro ml enthielt, wurde die
DNA aus 1 ml extrahiert, anschließend amplifiziert und mittels Agargel-Elektrophorese auf
gebildete Banden hin untersucht.
Ergebnisse
98
In dem Gel war eine Bande zu erkennen, die eindeutig nicht Listeria monocytogenes-
spezifisch war (s. Abb. 1).
Die Bande wurde von DNA-Fragmenten gebildet, die nur wenige Basenpaare länger waren
als die Listeria monocytogenes-spezifischen, aus je 234 bp gebildeten DNA-Fragmente. Die
sichere definitive Unterscheidung zwischen Monocytogenes- und Innocua-Banden war
eindeutig vorzunehmen und wurde durch einen Vergleich mit der Positivkontrolle bestätigt.
Abb. 1: Spezifität der Multiplex-PCR: Agargel-Elektrophorese zum Nachweis von L. monocytogenes-DNA aus Reinkulturen sowie der DNA einer L. innocua-Anreicherung.
Linien 1 und 20: Bandenmarker; Linien 2 bis 11: Verdünnungsreihe 100 bis 10-9 einer 20 Stunden-Anreicherungskultur (L. monocytogenes) (s. Text); Linie 12: Extraktionskontrolle; Linie 13: L. innocua; Linie 14: Negativkontrolle; Linien 15 bis 18: Inhibitionskontrollen; Linie 19: Positivkontrolle L. monocytogenes
Tab. 18: Sensitivität der PCR in Verbindung mit Agargel-Elektrophorese.
Verdünnungsstufe 100 10-4 10-5 10-6 10-7
Nachweis von L. monocytogenes
in 3,4 x 10x KbE
pro ml TSYEB-Anreicherung
positiv
3,4 x 109
positiv
3,4 x 105
positiv
3,4 x 104
negativ
3,4 x 103
negativ
3,4 x 102
Nachweis von L. monocytogenes
in 3,8 x 10x KbE
pro ml TSYEB-Anreicherung
positiv
3,8 x 109
positiv
3,8 x 105
positiv
3,8 x 104
positiv
3,8 x 103
negativ
3,8 x 102
Nachweis von L. monocytogenes
in 1,4 x 10x KbE
pro ml Halbfraser-Anreicherung
positiv
1,4 x 109
positiv
1,4 x 105
positiv
1,4 x 104
positiv
1,4 x 103
negativ
1,4 x 102
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Ergebnisse
99
4.3.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis von
Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels PCR
Zur Ermittlung der Mindestanreicherungszeit wurde Hackfleisch vom Schwein mit Listeria
monocytogenes beimpft (pro Gramm mit 22,2 bzw. 18,9 KbE). Nach Verdünnen des
Hackfleisches mit Halbfraser-Bouillon wurden 50 g der Hackfleischverdünnung entnommen
und bei 37°C bis zu 18 Stunden inkubiert. Die Probennahmen sowie die Durchführung der
Nachweismethode erfolgten nach 10, 12, 14, 16 und 18 Stunden Inkubation.
Unabhängig von der Einwaage (10 g bzw. 25 g Hackfleisch) waren alle Proben immer nach
mindestens 16-stündiger Anreicherung im ersten selektiven Anreicherungsmedium positiv,
d. h. Listeria monocytogenes wurde nachgewiesen (Tab. 19 u. 20).
Die Mindestanreicherungszeit für den Nachweis von Listeria monocytogenes mittels PCR in
Kombination mit Agargel-Elektrophorese betrug 16 Stunden (s. Abb. 2).
Abb. 2: Sensitivität der Multiplex-PCR: Agargel-Elektrophorese zum Nachweis von L. monocytogenes-DNA aus Schweinehackfleischproben.
Linien 1 und 18: Bandenmarker; Linien 2 bis 6: 10g-Proben; Linien 8 bis 12: 25g-Proben; Anreicherungszeiten: 10 (Linien 2 u. 8), 12 (L. 3 u. 9), 14 (L. 4 u. 10), 16 (L. 5 u. 11) und 18 Stunden (L. 6 u. 12); Linien 7 u. 13: Extraktionskontrollen; Linie 14 und 15: Schweinehackfleisch nicht inokuliert; Linie 16: Negativkontrolle; Linien 17: Positivkontrolle. Alle nicht-beimpften Hackfleischproben erwiesen sich als Monocytogenes-negativ.
Die Anzahl der Keime pro Gramm Hackfleisch in den Vorversuchen wurde wie unter 4.2.1
bestimmt.
ad Versuch I-V: 10 ml Keimsuspension enthalten 2 000 KbE L. monocytogenes
� 22,2 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
ad Versuch VI-IX: 10 ml Keimsuspension enthalten 1 700 KbE L. monocytogenes
� 18,9 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Ergebnisse
100
Tab. 19: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 25 g inokuliertem Schweinhackfleisch mittels PCR und Agargel-Elektrophorese in Abhängigkeit von der Dauer der Anreicherung.
Proben- volumen
25 g
(pro Gramm ca. 20 KbE L. monocytogenes)
Dauer der Anreicherung [h]
Versuchs- reihe
18 16 14 12 10 8 6
I positiv positiv positiv neg* neg neg N. d.
II positiv positiv positiv neg** neg* neg N. d.
III positiv positiv positiv positiv neg neg N. d.
IV positiv positiv positiv neg neg neg N. d.
V positiv positiv neg* neg neg neg N. d.
VI positiv positiv neg** neg* neg neg N. d.
VII positiv positiv positiv positiv neg* neg N. d.
VIII positiv positiv positiv positiv neg** N. d. N. d.
IX positiv positiv neg** neg** neg** N. d. N. d.
neg* = negativ; aber bereits Bildung e i n e r spezifischen, schwachen Bande neg** = negativ; aber bereits Bildung e i n e r spezifischen Bande N. d. = nicht durchgeführt, da Reaktionsansatz nicht lieferbar
Ergebnisse
101
Tab. 20: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 10 g inokuliertem Schweinhackfleisch mittels PCR und Agargel-Elektrophorese in Abhängigkeit von der Dauer der Anreicherung.
Proben- volumen
10 g
(pro Gramm ca. 20 KbE L. monocytogenes)
Dauer der Anreicherung [h]
Versuchs- reihe
18 16 14 12 10 8 6
I positiv positiv neg** neg* neg N. d. N. d.
II positiv positiv neg** neg* neg N. d. N. d.
III positiv positiv positiv neg* neg N. d. N. d.
IV positiv positiv positiv neg neg N. d. N. d.
V positiv positiv zweifel-
haft neg neg N. d. N. d.
VI positiv positiv neg** neg neg N. d. N. d.
VII positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.
VIII positiv positiv positiv neg** neg* N. d. N. d.
IX positiv positiv positiv neg** neg* N. d. N. d.
neg* = negativ; aber bereits Bildung e i n e r spezifischen, schwachen Bande neg** = negativ; aber bereits Bildung e i n e r spezifischen Bande zweifelhaft = zwei spezifische, allerdings nur andeutungsweise ausgebildete Banden N. d. = nicht durchgeführt, da Reaktionsansatz nicht lieferbar
Ergebnisse
102
4.4 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels Microarray
4.4.1 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis von
Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels Microarray
Zur Ermittlung der Mindestanreicherungszeit wurde Hackfleisch vom Schwein mit Listeria
monocytogenes beimpft (pro Gramm mit 22,2 bzw. 18,9 KbE). Nach Verdünnen des
Hackfleischs mit Halbfraser-Bouillon wurden 50 g der Hackfleischverdünnung entnommen
und bei 37°C bis zu 18 Stunden inkubiert. Die Probennahmen sowie die Durchführung des
Nachweisverfahrens erfolgten nach 10, 12, 14, 16 und 18 Stunden Inkubation (s. auch 4.3.2).
Unabhängig von der Einwaage (10 g bzw. 25 g Hackfleisch) waren alle Proben immer nach
mindestens 10-stündiger Anreicherung in erstem selektiven Anreicherungsmedium positiv,
d. h. Listeria monocytogenes wurde nachgewiesen (s. Tab. 21 u. 22).
Mit dem System PCR/NUTRI®-Chip konnte bei Einwaage von 25 g Hackfleisch in allen
Fällen nach einer Mindestanreicherungszeit von 10 Stunden Listeria monocytogenes
nachgewiesen werden.
Alle nicht-beimpften Hackfleischproben erwiesen sich als Monocytogenes-negativ (siehe auch
4.3.2).
Zur Berechnung der dotierten Keimkonzentrationen siehe 4.3.2.
Ergebnisse
103
Tab. 21: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 25 g inokuliertem Schweinhackfleisch mittels PCR und Microarray-Analyse in Abhängigkeit von der Dauer der Anreicherung.
Proben- volumen
25 g
(pro Gramm ca. 20 KbE L. monocytogenes)
Dauer der Anreicherung [h]
Versuchs- reihe
18 16 14 12 10 8 6
I positiv positiv positiv positiv positiv positiv positiv
II positiv positiv positiv positiv positiv positiv neg
III positiv positiv positiv positiv positiv neg neg
IV positiv positiv positiv positiv positiv positiv neg
V positiv positiv positiv positiv positiv neg positiv
VI positiv positiv positiv positiv positiv positiv neg
VII positiv positiv positiv positiv positiv positiv neg
Ergebnisse
104
Tab. 22: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 10 g inokuliertem Schweinhackfleisch mittels PCR und Microarray-Analyse in Abhängigkeit von der Dauer der Anreicherung.
Proben- volumen
10 g
(pro Gramm ca. 20 KbE L. monocytogenes)
Dauer der Anreicherung [h]
Versuchs- reihe
18 16 14 12 10 8 6
I positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.
II positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.
III positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.
IV positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.
V positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.
VI positiv positiv positiv neg* positiv N. d. N. d.
VII positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.
neg* = negativ; aber bereits schwache, spezifische Signale (typischer Kreis) N. d. = nicht durchgeführt, da Reaktionsansatz nicht lieferbar
Ergebnisse
105
4.4.2 Molekularbiologischer Nachweis von Listeria monocytogenes mittels Microarray
in Anwesenheit von Listeria innocua
Mit diesem Versuch wurde zum einen die Spezifität und zum anderen der Zeitaufwand des
Microarray-Verfahrens (NUTRI®-Chip) untersucht.
Als Proben dienten 56 Schweinehackfleischverdünnungen, die parallel mit dem kulturellen
Verfahren auf Listeria monocytogenes untersucht wurden (siehe 3.3.2.2). Vor der Ver-
dünnung und der selektiven Anreicherung wurde das Schweinehackfleisch mit 13,4 – 57,8
KbE L. monocytogenes und 17,8 – 63,3 KbE L. innocua beimpft, d. h. in einem Verhältnis
von 1:1,6 (siehe 3.3.2.2).
Mit dem verwendeten NUTRI®-Chip konnte in allen 56 Schweinehackfleischverdünnungen
Monocytogenes-spezifische DNA nachgewiesen werden. Die Nachweisquote / Spezifität
betrug 100 %.
Mittels Biochip-Technologie wurden keine falsch-positiven Ergebnisse durch den L. innocua-
Teststamm hervorgerufen. Nach Kontrolle der Extraktion konnte in jedem Fall eine
Kontamination mit Ziel-DNA ausgeschlossen werden.
Für den erfolgreichen Nachweis genügte eine 24-stündige Inkubation der Keime in
Halbfraser-Bouillon. Ein Ergebnis lag nach Anreicherungskultur, DNA-Extraktion, PCR und
Detektion der DNA mit dem NUTRI®-Biochip am dritten Tag der Untersuchung vor.
Die Listerienkontamination pro 90 Gramm dotiertem Schweinehackfleisch belief sich auf
(siehe 4.2.2):
1. 5,2 x 103 KbE L. monocytogenes und 5,7 x 103 KbE L. innocua
2. 2,0 x 103 KbE L. monocytogenes und 2,1 x 103 KbE L. innocua
3. 2,2 x 103 KbE L. monocytogenes und 2,5 x 103 KbE L. innocua
4. 2,2 x 103 KbE L. monocytogenes und 2,3 x 103 KbE L. innocua
5. 1,2 x 103 KbE L. monocytogenes und 1,6 x 103 KbE L. innocua
Die Listerienkonzentration pro Gramm dotiertes Schweinehackfleisch betrug: siehe 4.2.2.
Ergebnisse
106
Tab. 23 a und b: Ergebnisse und Angaben über die Höhe und Art der Inokulation für den Listeria monocytogenes–Nachweis mittels kultureller Referenzmethode nach DIN EN ISO 11290-1 (1996): Tab. 23 a: Beimpfung ausschließlich mit L. monocytogenes (s. 4.2.1); Tab. 23 b: Beimpfung mit L. monocytogenes und L. innocua (s. 4.2.2).
Ergebnisse
Parameter
I II III IV V
Gesamt
Anzahl der Proben mit L. monocytogenes 12 12 12 12 12 60
KbE g-1
L. mono 57,8
22,2
24,4 24,4 13,3 13 – 58
Anzahl der Proben mit positivem Nachweis von
L. monocytogenes (Kultur) 12 12 12 12 12 60
Ergebnisse
Parameter
I II III IV V
Gesamt
Anzahl der Proben mit L. monocytogenes &
L. innocua 8 12 12 12 12 56
KbE g-1
L. innocua 63,3 23,3 27,8 25,6 17,8 18 - 63
Anzahl der Proben mit positivem Nachweis von
L. monocytogenes (Kultur) 0 10 12 1 7 30
Anzahl der Proben mit positivem Nachweis von
L. monocytogenes (Biochip)
8 12 12 12 12 56
Ergebnisse
107
4.5 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels ELISA
4.5.1 Überprüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Einflüsse auf die
ELISA-Methode (Transia plate® Listeria moncytogenes-ELISA) sowie der vom
Hersteller angegebenen Sensitivität für das Testkit
Sowohl mit Zusatz als auch ohne Zusatz von Brillantschwarz gelang der eindeutige Listeria
monocytogenes-Nachweis mittels ELISA ab log 7 KbE pro ml.
Die Proben, die 105 bzw. 106 KbE pro ml enthielten, waren nach der Untersuchung als
zweifelhaft positiv anzusehen (Tab. 24).
Inhibierende Wirkungen des Zusatzstoffes Brillantschwarz auf die ELISA-Reaktionen wurden
nicht festgestellt. Die Sensitivität des ELISA-Testkits entspricht den Herstellerangaben, und
die Nachweisgrenze lag in den konkreten Fällen zwischen 105 und 107 KbE Listeria mono-
cytogenes pro ml (Tab. 24). Je höher die Konzentration von Zielzellen, desto größer ist die
gemessene optische Dichte.
Tab. 24: Nachweisgrenze des ELISA mit und ohne Brillantschwarz.
OD = optische Dichte OD der Negativkontrolle: 0,206 bzw 0,207 Zähler; OD der Positivkontrolle: 2,419 Zähler → positiver Grenzwert OD 0,3565 und negativer Grenzwert OD 0,3209; dazwischenliegende Zähler führen zu der Beurteilung „zweifelhaft positiv“.
mit Brillant-schwarz 1,3 x 109 1,3 x 108 1,3 x 107 1,3 x 106 1,3 x 105
Anzahl KbE pro
ml ohne Brillant-schwarz 1,4 x 109 1,4 x 108 1,4 x 107 1,4 x 106 1,4 x 105
mit Brillant-schwarz
POSITIV 2,688
POSITIV 2,252
POSITIV 0,887
zw. positiv 0,328
zw. positiv 0,348 ELISA-
Ergebnis (OD) ohne Brillant-
schwarz POSITIV
2,319 POSITIV
1,970 POSITIV
0,914 zw. positiv
0,350 zw. positiv
0,321
Verdünnungsstufe 100 10-1 10-2 10-3 10-4
Ergebnisse
108
4.5.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis von
Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels ELISA
Für einen sicheren qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln
beträgt die Empfehlung des Herstellers des Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA
bezüglich der Dauer der Anreicherung 48 Stunden.
Hier sollte für das Lebensmittel Hackfleisch (vom Schwein) die kürzeste Inkubationsdauer
festgestellt werden, nach der ein sicherer Nachweis mittels dieser immunologischen
Nachweismethode tatsächlich erfolgt (Mindestanreicherungszeit).
Hackfleischportionen zu je 80 g wurden mit dem Erreger dotiert und enthielten danach
zwischen 18,9 und 33,3 KbE pro Gramm. Von den dotierten Hackfleischportionen wurden
jeweils dreimal 25 g entnommen. Die 25 g-Proben wurden nach Verdünnung und verschieden
langen Inkubationszeiträumen mit Hilfe des Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA
immunologisch auf die Anwesenheit von L. monocytogenes untersucht.
In Versuch I betrug die Anreicherungszeit für einen nachfolgenden positiven Nachweis
insgesamt 45 Stunden, d. h. der Nachweis wurde nach etwa 48 Stunden erbracht. Damit
wurde die empfohlene Anreicherungszeit unterschritten.
Mit Blick auf dieses Ergebnis wurde im folgenden die Dauer der Erst- bzw.
Zweitanreicherung sukzessive reduziert. Dabei wurde in weiteren Vorversuchen L. mono-
cytogenes in Hackfleisch nach 45, 44, 42, 39, 35 und 31 Stunden (Gesamtzeitaufwand)
eindeutig nachgewiesen.
Weitere Versuche zeigten, dass die Anreicherung in Halbfraser-Bouillon bzw. die
Anreicherung in Halbfraser- plus Fraser-Bouillon (18 Stunden Halbfraser-Anreicherung
kombiniert mit 6 Stunden Fraser-Anreicherung) auf 24 Stunden beschränkt werden kann, um
in allen Fällen einen positiven L. monocytogenes-Nachweis zu führen.
Ergebnisse
109
Die Anzahl der Keime pro Gramm Hackfleisch (Tab. 25) wurde wie unter 4.2.1 beschrieben
bestimmt.
Tab. 25: Berechnete Anzahl KbE L. monocytogenes in 1 g dotiertem Hackfleisch.
Versuch Nr.
Anzahl KbE L. monocytogenes in
10 ml Keimsuspension*
Anzahl KbE L. monocytogenes in
1 g dotiertem Hackfleisch
I 1,7 x 103 18,9
II 2,1 x 103 23,3
III 2,1 – 2,5 x 103 23,3 – 27,8
IV 2,2 – 2,6 x 103 24,4 – 28,9
V 1,9 – 3,0 x 103 21,1 – 33,3
VI (1.Teil) ** 1,9 x 103 21,1
VI (2. Teil) 1,8 x 103 20,0
VII 1,9 x 103 21,1
VIII 1,96 x 103 21,8
* Die Anzahl koloniebildender Einheiten in 10 ml Keimsuspension ergab sich nach der Bestimmung der Keimzahl in einer TK-Portion. ** Versuch VI spaltet sich aus labortechnischen Gründen in 2 Teile.
Ergebnisse
110
4.6 Qualitativer Nachweis von Listeria monocytogenes in Feldproben mittels
Agargel-Elektrophorese und Microarray
Verschiedene Lebensmittel, i. d. R. hergestellt auf der Grundlage von tierischen Rohstoffen,
und Umfeldproben waren im Gissel-Institut, Hannover, kulturell gemäß § 35 LMBG
(Umsetzung des DIN EN ISO-Standards 11290-1 von 1996) auf Listeria monocytogenes
untersucht worden. Die Zwischenlagerung der Halbfraser-Anreicherungskulturen, 24 Stunden
inkubiert, erfolgte tiefgefroren (–20°C).
Von den insgesamt 71 Proben war mit der mikrobiologischen Untersuchung in 49 Proben
Listeria monocytogenes nachgewiesen worden. In 22 Proben hingegen konnte Listeria
monocytogenes nicht mikrobiologisch diagnostiziert werden.
Bemessen an den Resultaten nach der DIN EN ISO 11290-1-Methode wurden mit der
Agargel-Elektrophorese und der NUTRI®-Chip-Analyse positive (45 und 45), negative (16
und 17), falsch-positive (6 und 5) sowie falsch-negative (4 und 4) Untersuchungsergebnisse
erhalten (Abb. 3). Die Ergebnisse von 57 L. monocytogenes-positiven und –negativen
Feldproben (80,3%) korrelierten mit allen drei Verfahren (vgl. Abb. 4).
Wenn die molekularbiologischen Untersuchungsergebnisse im Verhältnis zum kulturellen
Referenzverfahren betrachtet werden, ergeben sich für die beiden molekularbiologischen
Methoden im Durchschnitt eine Spezifität von 75 %, eine Sensitivität von 91,8 % und eine
Übereinstimmung von 86,6 % (Tab. 26).
Tab. 26: Spezifität und Sensitivität der molekularbiologischen Methoden und deren Übereinstimmung mit der kulturellen Methode.
Methoden Gel Microarray
Spezifität 72,7 % 77,3 %
Sensitivität 91,8 % 91,8 %
Übereinstimmung 85,9 % 87,3 %
Ergebnisse
111
49
45 45
22
17 16
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Anz
ahl P
robe
n
Positiv Negativ
Untersuchung von Feldproben mit drei verschiedenen Methoden
Kulturelles Referenzverfahren
Agargel-Elektrophorese
Micorarray-Analyse
Abb. 3: Positive und negative Untersuchungsergebnisse von Feldproben mit Agargel-Elektrophorese und NUTRI®-Chip-Analyse (bezogen auf die kulturelle Referenzmethode).
Vergleich der Untersuchung von Feldproben mit drei verschiedenen Methoden
22
49
21
50
20
51
13
44
0
10
20
30
40
50
60
Positiv Negativ
Anz
ahl d
er P
robe
n
Kulturelles Referenzverfahren
Agargel-ElektrophoreseMicroarray-AnalyseÜbereinstimmung
Abb. 4: Positive und negative Untersuchungsergebnisse von Feldproben mit Agargel-Elektrophorese und Microarray-Analyse (in der Annahme, dass jedes positive Testergebnis unabhängig von der Methode als richtig-positiv zu bewerten ist).
Ergebnisse
112
Die Abbildungen 3 und 4 verdeutlichen die Unterschiede in der Anzahl der positiven bzw.
negativen Diagnosen, je nachdem, welche Ergebnisse als Bezug gewählt werden. In dem Fall,
dass jedes positive Testergebnis als richtig-positiv beurteilt wird, wurde mit der Analyse von
Microarrays die größte Anzahl positiver Proben identifiziert (Abb. 4).
Von den 49 kulturell Listeria monocytogenes-positiven Feldproben enthielten 62,0 % (44 von
71 Feldproben) nachweislich Erreger-spezifische DNA (Tab. 27):
Die gesuchten Amplifikate konnten sowohl in einem Agarosegel als auch mit Hilfe der
NUTRI®-Chip-Analyse dargestellt werden.
In 5 von 49 Fällen waren die Ergebnisse von Kultur, PCR & Gel sowie PCR & Microarray
nicht bzw. nicht eindeutig übereinstimmend:
• In 3 Feldproben wurde der positive kulturelle L. monocytogenes-Nachweis mit keinem
PCR-System bestätigt. Der Erreger war dabei in einem Fall aus 1 g Probenmaterial
isoliert worden.
• Für eine weitere Feldprobe zeigte der NUTRI®Chip ein negatives Ergebnis, und im
Gel waren bei einem der Doppelansätze positive spezifische Banden erkennbar.
• Für eine andere Feldprobe konnten bei der NUTRI®Chip-Analyse visuell Signale
gefunden werden, die gerade für eine positive Diagnose ausreichten (Gel negativ).
Die kulturell Listeria monocytogenes-negativen Untersuchungsergebnisse von 22 Feldproben
korrelierten in 13 Fällen mit denen der beiden PCR-Systeme (Abb. 4 u. Tab. 28).
Zwar war in einem Fall eine einzige positive spezifische Bande im Agarosegel vorhanden,
jedoch wurde diese Bande alleine nicht als positiv sondern als verdächtig bewertet. Hier
müsste der Verdacht verifiziert werden.
In 9 weiteren Fällen stimmten die Ergebnisse dagegen nicht bzw. nicht eindeutig überein.
Zwei dieser Proben waren in beiden PCR-Systemen positiv, vier Proben wurden mittels
PCR/Agargel-Elektophorese positiv bewertet, während drei weitere Proben lediglich mit
PCR/Microarray-Analyse positiv ausfielen (Tab. 28).
Ergebnisse
113
Tab. 27: Monocytogenes-positive Proben (nach der kulturellen Methode gemäß § 35 LMBG).
* Eine Probe mit NUTRI®-Chip-Analyse auf Anhieb positiv; mit Agargelelektrophorese erst nach zweiter Extraktion der DNA.
** Davon eine Probe kulturell in 1g Probenmaterial L. mono-positiv. *** Die positive Aussage wurde nach visueller Auswertung der NUTRI®-Chip-Analyse getroffen.
Die Signale waren gerade ausreichend für einen positiven Befund.
Tab. 28: Monocytogenes-negative Proben (nach der kulturellen Methode gemäß § 35 LMBG).
*In einem Fall war eine einzige positive spezifische Bande im Agarosegel vorhanden, jedoch wurde diese Bande alleine nicht als positiv sondern als verdächtig bewertet. Hier müsste der Verdacht verifiziert werden.
Ergebnisse mit den Detektionsmethoden
des molekularbiologischen Nachweissystems
Gelelektrophorese NUTRI®-Chip
Anzahl der Proben (insgesamt 49)
positiv positiv 44*
negativ negativ 3**
positiv negativ 1
negativ positiv 1***
Ergebnisse mit den Detektionsmethoden
des molekularbiologischen Nachweissystems
Gelelektrophorese NUTRI®-Chip
Anzahl der Proben (insgesamt 22)
negativ negativ 13*
positiv positiv 2
positiv negativ 4
negativ positiv 3
Ergebnisse
114
Von dem Ergebnis der kulturellen Methode wichen insgesamt 19,7 % der molekular-
biologischen Untersuchungsergebnisse (14 Feldproben) ab. Die beiden PCR-Systeme
korrelierten hierbei nunmehr in 2 Fällen. Die Befunde waren häufig uneindeutig (z. B. nur in
einem Doppelansatz oder nur in 1 Lokalisation des Microarrays positiv; s. Tab. 29).
Tab. 29: Von der herkömmlichen Referenzmethode abweichende Untersuchungsergebnisse der Schnellmethoden.
Kultur Gel Microarray Anzahl
- ++ / ++ + - positiv 1
- ++ / - - + - positiv 1
- ++ / ++ - - Nur Gel positiv, Microarray negativ 1
- ++ / - - - - Nur Gel positiv, Microarray negativ 3
- - - / - - ++ NUTRI®-Chip positiv 1
- - - / - - + - NUTRI®-Chip positiv 2
+ - - / - - - - Nur Kultur positiv 3
+ ++* / - - - - Kultur und Gel positiv 1
+ - - / - - ++** ** visuell bewertet NUTRI®-Chip positiv 1
- 6 5 Falsch-positive insgesamt 9
+ 4 4 Falsch-negative insgesamt 5
+ = positiv, - = negativ; ++ / ++ bzw. - - / - - = beide Ansätze positiv bzw. negativ; ++ bzw. - - = beide Lokalisationen positiv bzw. negativ, + - = eine Lokalisation positiv, andere Lokalisation negativ.
Diskussion
115
5. Diskussion
5.1 Diskussion des Dotierens von Schweinehackfleisch
Mit verschiedenen Prozeduren kann der Inhomogenität des Probenmaterials bezüglich der
physikalischen Eigenschaften entgegengesteuert werden. Die Wahl der Prozedur hängt von
der Zusammensetzung eines Lebensmittels ab. Zur Vorbereitung auf die chemische
Untersuchung von Fleisch und Fleischerzeugnissen sind Vorschriften in der Amtlichen
Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG (L 06.00-1) enthalten. Diese sollen
sicherstellen, dass die Probe zum Zeitpunkt der Untersuchung in allen Teilen dieselben
physikalischen Eigenschaften aufweist.
Um falsch-negative Resultate durch inhomogene Verteilung der Zielkeime praktisch
auszuschließen, existieren keine amtlichen Vorschriften. Das Homogenisieren bzw.
Herstellen der Verdünnungen erfolgte grundsätzlich in Orientierung an BAUMGART (1997).
Das dotierte Schweinehackfleisch wurde hier auf eine homogene Verteilung der
Keimsuspension hin kontrolliert. Die Methode, das Einfärben des Hackfleisches mit
Brillantschwarz (Lebensmittelfarbstoff E 151), wurde bei LUBENOW (2002) beschrieben.
Eine inhibierende Wirkung von Brillantschwarz auf die Vermehrungsfähigkeit der Listerien
bzw. Nachweisreaktionen wurde nicht festgestellt.
Die Methode zur Kontrolle des gleichmäßigen Dotierens ist nach den gewonnenen
Erfahrungen notwendig und zweckentsprechend. Trotzdem ist ansonsten keine Ver-
öffentlichung bekannt, die eine Erfolgskontrolle der gleichmäßigen Inokulation beinhaltete.
Gerade wenn für eine Beimpfung von Proben sehr niedrige Keimzahlen herangezogen
werden, besteht das Problem der gleichmäßigen Verteilung der Keime über das
Untersuchungsgut (FELDSINE et al. 1997). Heterogene Verteilungen können v. a. bei
Listerien, die im Vergleich zu anderen, in Lebensmitteln vorkommenden Mikroorganismen
nur langsam wachsen, den Wert einer Studie beeinträchtigen.
Insbesondere für Inokulationsversuche, in denen mit Listerien und / oder mit geringgradigen
Kontaminationsraten operiert wird, ist die Anwendung der Brillantschwarz-Färbemethode zur
Sicherstellung der Homogenität empfehlenswert.
Diskussion
116
Das Tiefgefrieren und Auftauen der Inokulate führt nach GOLDEN et al. (1988) zu Schäden
der Bakterien; die Kolonie-bildenden Einheiten, die die Prozedur überleben, sind zu über
80 % geschädigt.
Die für die Inokulationen herangezogenen Keime aus TK-Portionen hätten demnach eine
herabgesetzte Vitalität besessen. Die Gesamtkeimzahlen (vor und nach dem Tiefgefrieren
ermittelt) deuteten darauf hin, dass die für die Inokulation herangezogenen Keime
eingeschränkt vermehrungsfähig waren.
5.2 Diskussion zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode
Schweinehackfleisch, beimpft mit durchschnittlich ca. 28 KbE g-1 (niedrigstes In-
okulationsniveau 13 KbE g-1), wurde mit Hilfe der derzeitigen kulturellen Referenzmethode
(amtliches Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG, Umsetzung der DIN EN ISO 11290-1
von 1996) qualitativ auf Listeria monocytogenes untersucht.
In Abwesenheit von Listeria innocua belief sich die diagnostische Sensitivität auf 100 %.
Am Tag 5 der Untersuchung konnte Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch, das im
Allgemeinen mindestens 105 – 106 KbE kompetitive Keime pro Gramm enthält, immer sicher
identifiziert werden. Dies ist der frühest mögliche Zeitpunkt, mit Hilfe der kulturellen
Referenzmethode Listeria monocytogenes zu identifizieren. Bei Anwendung der Methode auf
andere Lebensmittel kann ein Ergebnis auch erst am Tag 7 oder später vorliegen.
Bei Anwendung auf Schweinehackfleisch, das mit definierten M i s c h k u l t u r e n
(Verhältnis ca. 1:1,2) aus Listeria monocytogenes (durchschnittlich 28,3 KbE g-1) und Listeria
innocua (durchschnittlich 31,6 KbE g-1) präpariert war, sank die diagnostische Sensitivität der
kulturellen Referenzmethode drastisch. Falsch-negative Diagnosen mussten für nahezu die
Hälfte der Proben (46,4 %), die Krankheitserreger u n d Indikator enthielten, hingenommen
werden. Damit verringerte sich die diagnostische Sensitivität der kulturellen Referenzmethode
auf nunmehr 53,6 %.
Tatsächlich bestehende Kontaminationen blieben unerkannt, und anstelle des Zielkeims
wurde, wie in anderen Studien (CURIALE u. LEWUS 1994; BRUNNER u. BÜLTE 2001),
zuverlässig die apathogene Art Innocua differenziert.
Diskussion
117
Grund dafür ist die Generationszeit von Listeria innocua, die z. B. durch Akriflavin-Gehalte
in selektiven Anreicherungsmedien gegenüber der Generationszeit von Listeria monocyto-
genes verkürzt ist (BEUMER u. HAZELEGER 2003). Der Zielkeim wird somit „maskiert“.
In den Dotierungsversuchen von CURIALE und LEWUS (1994) waren verhältnismäßig mehr
Kolonie-bildende Einheiten Innocua (Verhältnis L. m. : L. i. = 1:2) für die künstliche
Kontamination von Fleisch (Rind) eingesetzt worden. Dieses Verhältnis ließ den
Erregernachweis in sogar nur jeder 20. Probe zu. Bei einem Verhältnis von annähernd 1:1 und
einer Sensitivität von 53,6 % wird L. monocytogenes mit großer Wahrscheinlichkeit in jeder
2. Probe nachgewiesen. Der Kontext erlaubt zumindest zwei mögliche Deutungen: Die hier
verwendete kulturelle Methode resp. die Differenzierungsmedien erfüllen ihren Zweck
womöglich besser als die damaligen. Und: Der unbestreitbar h o h e negative Einfluß, den
Listeria innocua auf die diagnostische Sensitivität ausübt, ist methodisch bedingt und bislang
mit der amtlich vorgeschriebenen kulturellen Methode noch nicht vermeidbar.
Die Hackfleisch-spezifische Begleitflora wird in der Kombination aus Anreicherung plus
Nährboden mit besserem Erfolg unterdrückt als es bei anderen Fleischerzeugnissen z. T. der
Fall ist (s. ANON. 2002).
Die gewonnenen Erfahrungen und Ergebnisse sprechen dafür, dass Halbfraser-Bouillon die
Vermehrung von Listerien hinreichend fördert.
Die generelle Befürwortung der parallelen Verwendung verschiedener Anreicherungsmedien
(HAYES et al. 1992; SCHMIDT et al. 1988; RYSER et al. 1996; SCOTTER et al. 2001)
kann speziell für den hier untersuchten Nachweis nicht unterstützt werden.
Selbst bei n i e d r i g s t e n Kontaminationsraten erwies sich die Halbfraser-Bouillon für
den Zweck eines positiven qualitativen L. monocytogenes-Nachweises in Hackfleisch als
effektives Selektivmedium (KLEINER u. SCHINKEL 2003).
Die S c h w a r z f ä r b u n g der Halbfraser-Bouillon ist nicht immer nach 24 h entwickelt,
was die Beobachtung von WALKER et al. (1990) bestätigt. Auch hier waren gelegentlich
Listerien-negative Proben nach 2 – 3 Tagen schwarz gefärbt, ohne dass Listerien nachweisbar
waren.
Diskussion
118
Als Indikator ist die Halbfraser-Bouillon dennoch geeignet, denn es zeichnet sich ab, dass die
Schwarzfärbung umso schneller eintritt, wenn Listerien anwesend sind und je mehr anwesend
sind. Nach 48 h Inkubation war die Fraser-Bouillon immer vollständig schwarz.
Mit n i c h t – s e l e k t i v e r Anreicherung wuchs L. monocytogenes neben anderen
Pathogenen, nach einer kürzeren Regenerationszeit, zu Konzentrationen heran, die über der
Nachweisgrenze einer Schnellmethode lagen (CLOAK et al. 1999; KRISMER et al. 2002).
Allerdings war PALCAM zu wenig selektiv, um die Kolonien von Listerien darstellen zu
können (KRISMER et al. 2002). Der Vorteil der kürzeren Generationszeit des Erregers in
nicht-selektiven Medien kann womöglich dann in Erwägung gezogen werden, wenn feste
Medien, die selektiver sind als Oxford und PALCAM, etabliert sind.
Es bestätigte sich, dass der PALCAM-Agar deutlich effektiver als Oxford-Agar originäre
kompetitive Keime unterdrücken kann. Auf keiner PALCAM-Agar-Platte konnte ein
nennenswertes Wachstum unerwünschter Begleitkeime beobachtet werden (die Verdachts-
kolonien lagen quasi in „Reinkultur“ vor), während auf Oxford stets ein deutliches Wachstum
der unspezifischen Begleitflora auffällig wurde. Größe und Charakteristika der Verdachts-
kolonien auf einzelnen Nährböden waren abhängig von der Dichte des bakteriellen
Wachstums: je dichter der Bewuchs, desto kleiner und uncharakteristischer die Ausbildung
der Kolonien.
Wenn auf Oxford die kompetitive Flora nur gering bis mäßig ausgeprägt wuchs, entwickelten
die Verdachtskolonien in jedem Fall und früher die typischen Merkmale, was mit einer
leichteren Interpretation einherging (bestätigt WALKER et al. 1990).
Oft konnte die Begleitflora nicht an einem hochgradigen Wachstum gehindert werden, was
die Isolation von Listeria spp. sehr erschwerte, und es brauchte viel Erfahrung, damit diese
nicht teilweise unmöglich wurde (bestätigt BUNČIĆ 1991; KORSAK et al. 1998).
Gerade in Proben aus rohem Fleisch scheint die Tendenz zu bestehen, dass Oxford ein
hochgradiges Wachstum der kompetitiven Flora wie Mikrokokken unterstützt bzw. nicht
verhindert (vgl. KORSAK et al. 1998). Beobachtet wurden hier Kolonien mit Merkmalen von
Staphylokokken.
Diskussion
119
Speziell Mischkontaminationen: Obwohl präsumtive Listerienkolonien wieder zahlreich
wuchsen (trotz eines oft erneut hochgradigen Wachstums der kompetitiven Nicht-Listerien-
Flora), handelte es sich bei den je insgesamt 10 Verdachtskolonien vorzugsweise um Listeria
innocua. Auf PALCAM wuchsen wieder praktisch „reine“ präsumtive Listerien-Kulturen
heran. Die Nachweisrate wurde demnach besonders effektiv durch Anwesenheit von Listeria
innocua reduziert. Weniger Einfluß übten hingegen offensichtlich die kompetitiven Bakterien
aus. Vermutungen anderer Autoren (z. B. ANON. 2002) ließen offen, inwieweit das
kompetitive Wachstum als bedeutsam einzuschätzen wäre.
Die Henry’sche Beleuchtung (ohne Blaufilter) erwies sich als zuverlässiges Mittel, um den
Listerien-Verdacht auf TSYEA zu bestätigen. Hervorragend eignet sich die Hämolyse-
Reaktion in Verbindung mit dem CAMP-Test für die Differenzierung auf Speziesebene; beide
Bestätigungsprüfungen konnten direkt in Anschluß an die Beleuchtungsprüfung erfolgreich
durchgeführt werden.
Speziell Mischkontaminationen: Die Ergebnisse der biochemischen und kulturellen
Eigenschaften konnten jeweils eindeutig und problemlos interpretiert werden. In der Literatur
wird allerdings von derartigen Schwierigkeiten berichtet, die insbesondere bei der
Interpretation der Hämolyse-Reaktion auftraten, die immer zusammen mit dem CAMP-Test
durchgeführt werden sollte (NOACK u. JÖCKEL 1993; SCOTTER et al. 2001).
Die Arbeitsschritte, die in der amtlichen Methode dargestellt sind, sollten evtl. ausführlicher
bzw. anschaulicher formuliert werden.
Eine fehlerhafte Interpretation von Listeria innocua als Listeria monocytogenes wird für die
Untersuchungen, die dieser Arbeit zugrunde liegen, ausgeschlossen.
Speziell Mischkontaminationen: Die „Fehler“ passierten an dem Punkt der Untersuchung, an
dem zahlreiche Verdachtskolonien zur Auswahl standen; aufgrund der kürzeren
Generationszeit handelte es sich bei den meisten um Kolonien von Listera innocua.
Wenn es ein selektives Anreicherungsmedium gäbe, das s p e z i e l l die A r t
Monocytogenes im Wachstum fördern könnte, wäre dies ein großer Vorteil. Es sind jedoch
hier keine Veröffentlichungen über die Existenz eines Mediums mit dieser Eigenschaft
bekannt. Das gleiche gilt für Kenntnisse darüber, ob und / oder inwieweit diese beiden Arten
unterschiedliche Ansprüche an ein flüssiges Medium stellen.
Diskussion
120
In einigen Studien wurde favorisiert, für die Bestätigung von L. monocytogenes im Rahmen
kultureller Untersuchungen die Anzahl der zu untersuchenden Verdachtskolonien auf 10 je
Platte zu verdoppeln. Wahrscheinlich würden dadurch falsch-negative Ergebnisse vermieden.
Der Arbeitsaufwand ist bisher allerdings schon sehr hoch und verdoppelte sich damit noch.
Eine andere Möglichkeit, dieses Problem zu lösen, ist, zu diesem Zeitpunkt verdächtige
Kolonien anhand von kulturellen Eigenschaften in z. B. „pathogene Spezies“ und „nicht
pathogene Spezies“ zu klassifizieren.
Dafür bieten sich neue, teilweise chromogene Nährböden wie ALOA, BCM-, LMBA- oder
Rapid’L. mono-Agar an. Sie ermöglichen ein differenziertes Wachstum von Listeria
monocytogenes. Anderen Studien zufolge ist von ihnen ALOA der überlegene Nährboden;
ALOA war für die Analyse von Rinderhackfleisch (Sensitivität von ALOA 92 %) geeignet
(GRACIEUX et al. 2002; BÜLTE et al. 2003).
In Anbetracht der Tatsache, dass das Laborpersonal über unterschiedliche Erfahrungswerte
verfügt (s. Ringversuch SCOTTER et al. 2001) und der hier gewonnenen Ergebnisse, ist die
(statistische) Präzision der ISO-Methode 11290-1 (1996) (ANON. 1998) einmal mehr in
Frage zu stellen.
Fazit:
Die diagnostische Sensitivität (53,6 %) der kulturellen Referenzmethode nach § 35 LMBG
bei Mischkontaminationen bedeutet, dass damit Listeria monocytogenes nicht zuverlässig in
Schweinehackfleisch nachgewiesen werden kann.
Die durchgeführten Untersuchungen erhärten den Verdacht, dass ein hoher Anteil – im
Schrifttum wurde von 25 % der untersuchten Lebensmittel ausgegangen (HAYES et al. 1992)
– untersuchten Schweinehackfleisches Kontaminationen mit Listeria monocytogenes enthält,
die kulturell nicht nachweisbar sind; das Auftreten von falsch-negativen Ergebnissen selbst
bei standardisierten kulturellen Methoden ist wahrscheinlich noch immer alltäglich.
Ursache dafür ist im wesentlichen Listeria innocua, der den Erreger durch schnelleres
Wachstum „maskiert“; die Medien aus den 90er Jahren bzw. noch ältere verfügen nicht über
ein ausreichendes Potential, zwischen L. monocytogenes und L. innocua zu unterscheiden
(JOHANSSON 1998; SCOTTER et al 2001).
Diskussion
121
Der ausschließliche Nachweis von nicht-pathogenen Listerien in Schweinehackfleisch
schließt nicht die Möglichkeit aus, dass der gesuchte Zoonoseerreger in untersuchtem
Schweinehackfleisch – nicht nachweisbar aufgrund fehlender diagnostischer Sensitivität –
enthalten ist. Zusammenfassend bewertet, leidet die kulturelle Referenzmethode an dem
Unvermögen der angewandten Selektivnährböden Oxford und PALCAM, Listeria
monocytogenes von apathogenen Listerien unterscheiden zu können.
In Anbetracht der Tatsache, dass L. innocua, Indikatorkeim für L. monocytogenes, nicht in
Ausnahmefällen sondern mit regelmäßiger Häufigkeit in Lebensmitteln vorkommt, ist die
Integration eines Mediums in die amtliche Methode empfehlenswert, das makroskopisch die
Unterscheidung zwischen Listeria monocytogenes und anderen Listerien ermöglicht (z. B.
ALOA). Der Agar Listeria nach Ottaviani und Agosti (ALOA) hat sich anderen Medien
gegenüber, die sich durch diese Eigenschaften grundsätzlich auszeichnen (Rapid’L. mono-
Agar und Listeria monocytogenes-Blutagar, LMBA) bisher als überlegen erwiesen. Er kann
allerdings die vorgeschriebenen Medien nicht vollständig ersetzen, weil er selbst ebenfalls
keine vollständige Nachweissicherheit garantieren kann.
Diskussion
122
5.3 Diskussion zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels PCR
Methodische Charakterisierung des PCR-Systems
Die Nachweisgrenze des PCR-Systems – festgestellt mit Hilfe von Reinkulturen aus TSYE-
bzw. Halbfraser-Bouillon – bewegt sich in einem Bereich zwischen 103 und 104 KbE
Listeria monocytogenes pro ml. Die methodische Sensitivität anderer PCR-Systeme für den
Nachweis aus Reinkulturen betrug zwischen 5 KbE im günstigsten Fall und l06 KbE im
ungünstigsten Fall. Die Häufung einer sehr niedrigen Nachweisgrenze (wie z. B. 5 KbE pro
ml) in älteren Studien (DENEER u. BOYCHUK 1991; FURRER et al. 1991; FITTER et al.
1992; WIEDMANN et al. 1993) zum Nachweis von Monocytogenes-DNA wird in neueren
Studien, in denen teilweise auch kommerziell erhältliche PCR-Nachweissysteme besprochen
werden, nicht mehr erreicht. Das mit einem einfachen PCR-System derart niedrige
Konzentrationen heutzutage nachweisbar sind, ist daher zweifelhaft.
Das PCR-System der Fa. GeneScan Analytics GmbH erfüllt die Anforderungen, die bezüglich
der methodischen Sensitivität gestellt werden können; die methodische Sensitivität der
Multiplex-PCR ist vergleichbar mit derjenigen des wohl am meisten in Veröffentlichungen
besprochenen kommerziellen PCR-Systems (BAXTM for Screening/Listeria monocytogenes).
Gewöhnlich beläuft sich die Kontamination von Lebensmitteln mit Listeria monocytogenes
auf weniger als 100 KbE pro Gramm. Daher ist aufgrund der Nachweisgrenze des PCR-
Systems die Anreicherung der Zielkeime vor der Durchführung der DNA-Extraktion
erforderlich bzw. ist die Anwendung einer direkten PCR bei diesem Erreger nicht sinnvoll.
Mit Hilfe dieses Multiplex-PCR-Systems werden Abschnitte von zwei voneinander
unabhängigen Virulenzgenen des Listerioseerregers parallel vervielfältigt. Die Banden sind
eindeutig identifizierbar und unterscheidbar; eine Verifizierung der Amplifikate durch z. B.
Restriktionsenzymanalyse oder Southern-Blot zur Bestätigung der Diagnose ist nicht
notwendig (vgl. FURRER et al. 1991; NIEDERHAUSER et al. 1992).
Diskussion
123
Mittels chromosomaler L. innocua-DNA wird ein PCR-Produkt amplifiziert. Die Lauflänge
der L. innocua-Fragmente ist zwar nur geringgradig kürzer als die des L. monocytogenes-
spezifischen 234 bp-DNA-Fragmentes, aber die Banden sind ohne weiteres – letztendlich
durch einen Vergleich mit der Positivkontrolle – zu unterscheiden.
Bei diesem Amplifikat kann es sich entweder um L. innocua-spezifische oder Listerien-
spezifische DNA-Abschnitte handeln, und es könnte ggf. geprüft werden, inwieweit dieses für
den parallelen Nachweis aus Lebensmittelproben nutzbar wäre.
Das verwendete PCR-System ermöglicht demnach die Amplifikation sowohl von
L. moncytogenes-spezifischer DNA als auch von L. innocua-DNA, wodurch sich das PCR-
System von anderen unterscheidet, die entweder die Gattung Listeria oder die Art Listeria
monocytogenes detektierten (DENEER u. BOYCHUK 1991; FURRER et al. 1991).
Bis zu 4 verschiedene Primerpaare wurden in einer Multiplex-PCR zum Nachweis von
verschiedenen Listeria (monocytogenes)-DNA-Fragmenten parallel eingesetzt (BORDER et
al. 1990; BUBERT et al. 1999).
Die Spezifität der Primer für die Virulenzgene von Listeria monocytogenes musste hier nicht
weiter untersucht werden, da das spezifische Vorkommen der Pathogenitätsfaktoren von
L. monocytogenes (v. a. Listeriolysin O) bereits in vielen Studien hinreichend unter Beweis
gestellt wurde (wie bei BESSESEN et al. 1990; BORDER et al. 1990; DENEER u.
BOYCHUK 1991; FITTER et al. 1992).
Kommerzielle Reaktionsansätze (soweit bekannt nicht-Multiplex-PCR-Systeme) enthalten
teilweise eine interne Reaktionskontrolle. Mit dieser steigt die Diagnosesicherheit, indem das
Risiko der DNA-Kontamination und der Arbeitsaufwand der Präanalyse reduziert werden.
Das hier verwendete PCR-System enthielt eine solche interne Kontrolle der erfolgten PCR-
Reaktion bisher nicht.
Diskussion
124
Diagnostische Charakterisierung der verwendeten PCR-Systeme zum Nachweis von
Listeria monocytogenes-spezifischer DNA aus Schweinehackfleisch
Die diagnostische Sensitivität eines PCR-Systems hängt sowohl von den Eigenschaften des
Nachweissystems als auch von der Art des Lebensmittels und der Anreicherung ab.
Aufgrund der Höhe der methodischen Sensitivität – s. o. – und dem Auftreten von PCR-
Inhibitionen allgemein bei der Analyse von Lebensmitteln ist die Anreicherung der Zielkeime
vor der PCR erforderlich.
Hier wurde die Dauer der Anreicherung ermittelt, die mindestens erforderlich ist, in a l l e n,
vor Untersuchungsbeginn gleich- und regelmäßig inokulierten Schweinehackfleischproben
L. monocytogenes-spezifische DNA nachzuweisen (Mindestanreicherungszeit).
Aus Schweinehackfleisch, das mit ca. 20 KbE pro Gramm kontaminiert ist, kann Listeria
monocytogenes-spezifische DNA nach einstufiger Anreicherung sicher mit den genutzten
molekularbiologischen Systemen detektiert werden.
In Anlehnung an die ISO-Methode wurde Halbfraser-Bouillon erfolgreich als selektives
Anreicherungsmedium in den PCR-Nachweis integriert. Weil im Rahmen der vorliegenden
Arbeit der geringst mögliche Zeitbedarf ermittelt werden sollte, und die Wachstumsrate der
Listerien bei 37°C höher ist als bei 30°C, erfolgte die Inkubation abweichend vom ISO-
Standard nicht bei 30°C sondern bei 37°C.
Die Mindestanreicherungszeiten unterschieden sich je nachdem, welches Verfahren zur
Detektion der Listeria monocytogenes-spezifischen DNA-Fragmente angewendet wurde
(Mindestanreicherungszeit für Agargel-Elektrophorese 16 Stunden bzw. für Microarray-
Analyse 10 Stunden).
Innerhalb von 10 bzw. 16 Stunden vermehrt sich Listeria monocytogenes unter den oben
genannten Bedingungen zu Konzentrationen, die s i c h e r oberhalb der Nachweisgrenze der
PCR-Systeme liegen.
Dieser Sachverhalt belegt außerdem, dass der Nachweis mittels Hybridisierung anhand einer
geringeren Anzahl von Zielkeimen möglich ist. Die Hybridisierungstechnik ist damit der
Agargel-Elektrophorese hinsichtlich diagnostischer Sensitivität überlegen.
Diskussion
125
Diese Beobachtung deckt sich mit den Ergebnissen anderer Studien (KLEIN u. JUNEJA
1997). Im Vergleich zu einer DNA-Detektion mittels Agargel-Elektrophorese kann mit der
Microarray-Analyse die Mindestanreicherungszeit zur Vermehrung von Listeria
monocytogenes um annähernd 40 % reduziert werden kann. Die kurze Mindest-
anreicherungszeit ist Ausdruck der vielfach höheren methodischen Sensitivität einer
Hybridisierungs-Technik gegenüber der vielfach gebräuchlichen Agargel-Elektrophorese. Die
höhere Sensitivität basiert auf der Testgrundlage (Hybridisierung von Nukleinsäuren).
Mindestanreicherungszeiten für den Nachweis mittels PCR stehen also unter dem Einfluß der
Detektionsmethode. Bei Einsatz der Microarray-Analyse kann aufgrund der höheren
Sensitivität die Anreicherung zeitlich stärker reduziert werden.
Wie anhand anderer Studien gezeigt wurde, ist die Mindestanreicherungszeit multifaktoriell
bestimmt. Das PCR-System, die Anreicherungsbedingungen und die Lebensmittelmatrix
führen zu deutlichen Unterschieden für den positiven Nachweis in spezifischen Fällen.
Auch die hier gewonnenen Erfahrungen stützen die Sichtweise, jede molekularbiologische
Nachweisführung für sich als ein i n t e g r a l e s S y s t e m (KRISMER et al. 2002) zu
betrachten.
Je weiter die Mindestanreicherungszeit unterschritten wurde, desto geringer wurde der Anteil
positiver Diagnosen. Während nach Stunde 14 der Inkubation Agargel-elektrophoretisch mehr
als die Hälfte der Proben als positiv identifiziert wurde, ist der Nachweis ab 12 Stunden und
darunter relativ unsicher.
Dies korreliert mit der Beobachtung, dass das hlyA-Gen in der frühen stationären
Wachstumsphase des Erregers verstärkt transkripiert wird, was mit maximaler hämolytischer
Aktivität in diesem Zeitraum einhergeht (GEOFFROY et al. 1989; MENGAUD et al. 1991b).
D. h., dass hier indirekt deutlich wird, dass die beimpften, inokulierten Erreger in diesem
Zeitraum in der Halbfraser-Bouillon bei 37°C in die frühe stationäre Wachstumsphase
eintreten. Im folgenden ist allmählich mit einer Abnahme der hämolytischen Aktivität zu
rechnen, die schließlich nach 48 Stunden anhand des Hämolysins nicht mehr nachgewiesen
werden kann (MENGAUD et al. 1991b).
Diskussion
126
Für die selektive Anreicherung wurde Halbfraser-Anreicherungsbouillon ausgewählt, weil
sich diese u. a. bei lebensmittelrechtlichen Fragestellungen bewährt hat.
Wenn zur Diagnostik mit verschiedenen Nachweismethoden Analysen vorgenommen werden,
ist die Arbeit mit einem einzigen Anreicherungsmedium ökonomischer. Voraussetzung ist
aber, dass beide Methoden mit dem Anreicherungsmedium kompatibel sind.
Unter Berücksichtigung der Ergebnisse anderer Autoren (ANON. 2002), zeichnet sich ein
Trend dahingehend ab, dass Listeria monocytogenes in Fleisch i. d. R. bereits nach der
Primäranreicherung (reguläre Inkubationszeit: 24 h ±) anhand von DNA nachgewiesen
werden kann. Bei der Anwendung von PCR-Systemen auf Fleisch sollte dies zunächst immer
bedacht werden und getestet werden, ob Materialien und Arbeit (und Zeit) für sekundäre
Anreicherungen im konkreten Fall eingespart werden können.
Einschränkend sollte aber immer der integrale Charakter des PCR-Nachweises Berück-
sichtigung finden, solange für ein System nicht im ausreichenden Maße empirische Daten
vorliegen. So empfiehlt der Hersteller des PROBELIATM-Testkits für Lebensmittel mit
Fleischkomponenten, sekundär eine Fraser-Anreicherung durchzuführen. Welche Daten
dieser Empfehlung zugrunde liegen, ist hier nicht bekannt.
Potentielle originäre PCR-Inhibitoren, enthalten in der Fraser-Bouillon und im
Schweinehackfleisch (ROSSEN et al. 1992; LANTZ et al. 1998), wurden im Rahmen der
Probenaufbereitung ausreichend verdünnt. Wie sich hier zeigte, kann Halbfraser-Bouillon, die
die als PCR-Inhibitoren identifizierten Stoffe (ROSSEN et al. 1992) in geringeren
Konzentrationen als Fraser enthält, durchaus in ein PCR-System zum Nachweis von
L. monocytogenes in Schweinehackfleisch integriert werden.
Das Risiko falsch-positiver Diagnosen durch nicht vermehrungsfähige Zielkeime ist bedingt
durch die Verdünnung unwahrscheinlich. Außerdem beugt die Sensitivität des PCR-Systems,
die eben nicht absolut ist, mit einer Nachweisgrenze von 103 KbE Listeria monocytogenes pro
ml Anreicherungskultur dem Entstehen falsch-positiver Ergebnisse wirksam vor.
Diskussion
127
Die PCR-Produkte sind spezifisch und nach gelelektrophoretischer Auftrennung auf
Grundlage molekularer Größenunterschiede leicht und eindeutig zu identifizieren.
Es kommt aber mit der DNA des Schweinehackfleisches bzw. mit der DNA der kompetitiven
Flora zu Fehlannealing von Primern, wodurch ein typisches Bandenmuster entsteht. Je länger
die Dauer der Inkubation (Zunahme der Anzahl von Zielzellen), desto undeutlicher werden
diese Banden und verschwinden schließlich ganz.
Bei der Analyse von Schweinehackfleisch mit dem PCR/Agargel-Elektrophorese-System
kann es also zu einer Amplifikation von nicht-listerieller DNA kommen, die allerdings zu
keiner Fehlinterpretation im Sinne einer falsch-positiven Diagnose führte.
In der Hybridierungsregion eines Microarrays sind Sonden mit bekannter Spezifität (z. B.
Amplifikat einer Moncytogenes-DNA-Sequenz) an bestimmten Lokalisationen (Sondenfelder)
gebunden.
Die Nukleinsäuren-Hybridisierung ist eine hochempfindliche Reaktion komplementärer
Einzelstränge. Wenn ein unspezifisches DNA-Fragment vorliegt, kann der NUTRI®-Chip als
„functional gene array“ (FGA) dieses so lange von den Ziel-DNA-Fragmenten differenzieren,
wie der Anteil homologer Sequenzen des unspezifischen Fragmentes ca. 85 % nicht
übersteigt. Daher ist, wenn außer den vorgesehenen PCR-Produkten unspezifische Amplifi-
kate entstehen, eine Interferenz auf dem Microarray sehr unwahrscheinlich und wurde hier bei
Einsatz von Innocua-DNA nicht beobachtet.
Die Mehrzahl der im Schrifttum dargestellten PCR-Analysen, die Fleisch, Fleischerzeugnisse
sowie Geflügel umfassen, wurde nach einem oder auch zwei Anreicherungsschritten
durchgeführt. Dabei wurden Nachweisgrenzen zwischen 0,1 und 100 KbE Listeria
monocytogenes pro Gramm Lebensmittel ermittelt.
Als Bestandteile integraler PCR-Systeme – dotiertes Schweinehackfleisch (Einwaage von
25 g Hackfleisch mit ca. 20 KbE L monocytogenes pro Gramm), Inkubation in Halbfraser-
Bouillon bei 37°C, PCR-Reaktionsansätze für Agargel-Elektrophorese bzw. Microarray-
Analyse – haben sich die PCR-Systeme hier bewährt; sie sind schnell, hochsensitiv und
hochspezifisch.
Diskussion
128
Die Feldproben (v. a. LM auf Basis tierischer Rohstoffe) wurden 3-fach untersucht: mittels
kultureller Methode nach § 35 LMBG, PCR/Agargel-Elektrophorese und PCR/Microarray-
Analyse. Die Methoden zeigten eine gute Übereinstimmung.
Es lässt sich daraus ableiten, dass die Wahrscheinlichkeit, dass das Ergebnis einer Probe
richtig ist, relativ hoch ist. Die Nachweisergebnisse mittels Microarray-Analyse deuten an,
dass diese Methode sowohl spezifischer als auch sensitiver als die Agargel-Elektrophorese ist.
Die beiden molekularbiologischen Methoden produzierten mehr positive Ergebnisse als die
kulturelle Nachweismethode. Weil sich molekularbiologische Detektionsmethoden bereits in
früheren Arbeiten als mindestens so spezifisch und sensitiv erwiesen haben wie kulturelle
Methoden, ist davon auszugehen, dass es sich dabei um „richtig“-positive Nachweise von
Listeria monocytogenes handelt, die jedoch kulturell nicht identifiziert werden konnten.
Falsch-negative kulturelle Nachweise von Listeria monocytogenes sind zudem hinreichend
bekannt.
Für drei kulturell positive Feldproben konnte die Diagnose molekularbiologisch nicht
bestätigt werden. Eine Ursache wäre eine besonders niedrige initiale Kontamination mit
Listeria monocytogenes; in diesem Fall wäre die Nachweisgrenze der PCR-Systeme innerhalb
der 24-Stunden Anreicherung womöglich nicht erreicht worden.
Eine andere Möglichkeit ist, dass die Verwendung von älteren, zuvor tiefgefrorenen
Anreicherungskulturen tatsächlich nicht empfehlenswert ist, weil es darin bereits zu einer
Degradation der (Ziel-)DNA gekommen ist, wie NIEDERHAUSER et al. (1992) vermuteten.
Gezeigt wurde hier, dass mit einer molekularbiologischen Schnellmethode
(PCR/Microarray-Analyse) möglich ist, was nicht mit derselben Nachweissicherheit
kulturell erreicht werden konnte: Der Nachweis von Listeria monocytogenes in
Mischkontamination mit Listeria innocua.
Mit dem verwendeten NUTRI®-Chip können 13 KbE L. monocytogenes pro Gramm in
Schweinehackfleisch mit einer Sensitivität von 100 % nachgewiesen werden.
Dasselbe ist nach Anreicherung möglich, wenn das Schweinefleisch mit einer Mischkultur
kontaminiert ist (Verhältnis von Listeria monocytogenes zu Listeria innocua etwa 1:1,2).
Diese Bedingungen führten zwingend dazu, dass die DNA-Extrakte der Proben relativ mehr
Innocua-DNA als Monocytogenes-DNA enthielten.
Diskussion
129
In allen Proben erfolgte trotzdem mit uneingeschränkter Sicherheit die Wiederfindung des
Erregers anhand der Detektion spezifischer DNA. Alles deutet darauf hin, dass die
diagnostische Sensitivität (100 %) der Microarray-Analyse in keiner Weise durch das
kompetitive Wachstum von L. innocua beeinträchtigt ist.
Das PCR-Microarray-System ist damit dem kulturellen Referenzverfahren (Sensitivität bei
Mischkontaminationen im 1:1,2-Verhältnis: 53,6 %) nach DIN EN ISO Standard 11290-1
(1996) überlegen.
Für den erfolgreichen Nachweis wurde eine 24-stündige Inkubation der kompetitiven Keime
in vorgenommen. Die Signale, die die Anzahl der stattgehabten Hybridisierungen zwischen
Gensonden und Monocytogenes-Fragmenten semiquantitativ wiedergeben, waren über-
wiegend sehr stark; es ist davon auszugehen, dass der positive Nachweis auch nach einer
kürzeren Inkubationszeit möglich ist, als noch keine Analysen bezüglich einer
Mindestanreicherungszeit durchgeführt wurden. Weil der PCR-Reaktionsansatz für das
PCR/Agargel-Elektrophorese-System z. Z. der Durchführung der eigenen Untersuchungen
nicht lieferbar war, konnten mit diesem System zum Nachweis von Listeria monocytogenes
leider keine Versuchsreihen mit L. innocua-Mischkulturen in die Untersuchungen einbezogen
werden. Die Nachweissensitivität molekularbiologischer Nachweissysteme scheint aber nicht
durch L. innocua-DNA beeinflusst zu werden. L. monocytogenes erreichte in Mischkulturen
mit L. innocua – durchaus bei einem initialen Verhältnis von ca. 1:1 in Lebensmitteln – die
Nachweisgrenzen (STEWART u. GENDEL 1998; BESSER 2000).
Es ist auch aufgrund der molekularbiologischen Prinzipien (Spezifität der Primer für
Abschnitte von Virulenzgenen, Spezifität der Oligonukleotidsonden für Zielsequenzen) davon
auszugehen, dass auch hier kein negativer Einfluß zu ermitteln gewesen wäre.
Nach Kontrolle der Extraktion konnte in jedem Fall eine Kontamination mit Ziel-DNA
ausgeschlossen werden. Es wurden keine falsch-positiven Ergebnisse durch L. innocua-DNA
hervorgerufen.
Zur Kontrolle von mikrobiellen Kontaminationen in Lebensmitteln stellt die Microarray-
Analyse eine brauchbare Alternative zu kulturellen Methoden aber auch Schnellmethoden dar,
was die Erfahrungen anderer Autoren bestätigt (BUSCH et al. 2002).
Diskussion
130
Multiplex-PCR/Agargel-Elektrophorese im Vergleich mit anderen molekularbiologischen
Testsystemen (außer Microarray-Technologie)
Eine im Jahre 2002 veröffentlichte Studie beschreibt Untersuchungen von
Schweinehackfleisch mit dem kommerziellen BAX-System (BECKER und HOLZAPFEL
2002). Das Inokulationsniveau war dem hier gewählten sehr ähnlich (10 Kbe g-1), und die
Bebrütungstemperatur wurde ebenfalls auf 37°C erhöht. Der positive Nachweis erfolgte dort
immer nach 24 h PA und 3 h SA in Schweinehackfleisch mit 10 - 100 KbE g-1. Bei BECKER
und HOLZAPFEL (2002) wurde jedoch nicht die Inkubationsdauer sondern die Inokulations-
höhe variiert (bis 105 KbE g-1).
Diese Ergebnisse korrespondieren mit den eigenen Resultaten.
Sowohl in Rinder- als auch in Schweinehackfleisch betrug die Nachweisgrenze einer
Multiplex-PCR 40 KbE pro 10 Gramm, wobei die Anreicherung zwischen 20 und 24 Stunden
dauerte (NIEDERHAUSER et al. 1992). Nach 24 Stunden selektiver Anreicherung konnten
1,2 KbE pro Gramm Rinderhackfleisch nachgewiesen werden (GOLSTEYN THOMAS et al.
1991).
Allerdings wurden keine Untersuchungen zur Mindestanreicherungszeit durchgeführt, und die
Analysefaktoren stimmen – die Nachweisführung als integrale Systeme betrachtend – nicht
mit den hier verwendeten überein.
Es lässt sich aber mutmaßen (und wäre zu überprüfen), dass bei einer Verlängerung der
Inkubation um 8 Stunden (Studie GOLSTEYN THOMAS et al. 1991) bzw. 4 bis zu 8
Stunden (NIEDERHAUSER et al. 1992) auch mit dem hier verwendeten PCR-System die
Identifizierung von Ziel-DNA möglich wäre.
Die kürzesten Inkubationszeiten bei r o h e m Hackfleisch (Rind) belaufen sich auf 4 bzw. 6
Stunden (DUFFY et al. 1999). Das Inokulationsniveau war allerdings deutlich höher (etwa
200 KbE pro Gramm), und es folgte zudem ein zusätzlicher Konzentrierungsschritt der
Keime. V. a. aufgrund dieser Sachverhalte ist ein Vergleich – wenn überhaupt – nur schwer
vorzunehmen.
Interessant ist, dass nach 16 Stunden Inkubation weniger als 1 KbE L. monocytogenes in
einem nicht-selektiven Anreicherungsmedium nachgewiesen wurde. Jede Probe war dabei mit
insgesamt drei Pathogenen (inkl. Salmonellen) inokuliert worden (KRISMER et al. 2002).
Diskussion
131
Es ist nicht bekannt, ob die Anreicherungszeiten weiter unterschritten wurden. Und es bleibt
fraglich, ob dieses Ergebnis infolge der Tatsache, dass es sich um ein anderes PCR-System
(Multiplex-seminested PCR) oder um eine andere Probenart (Leberpastete) handelte, zustande
kam.
Die eigenen Ergebnisse stellen die Möglichkeit in Aussicht, dass auch für die verwendeten
PCR-Systeme eine nicht-selektive Anreicherung kompatibel ist. Der Erfolg ist zwar möglich
aber eher fraglich, denn die Lebensmittel-typische Hackfleischflora liegt bekanntlich in hohen
Konzentrationen vor. Nichtsdestotrotz ist ein gleichzeitiger Nachweis mehrerer Zielkeime aus
einer einzigen Anreicherung reizvoll, weil es ein ökonomischeres Arbeiten bedeutete. Erste
Erfahrungen dazu sind vorhanden (BAILEY u. COX 1992; CLOAK 1999).
Multiplex-PCR/Microarray-Analyse im Vergleich mit anderen molekularbiologischen
Schnellmethoden
Die Mindestanreicherungszeit von 10 Stunden wird von keinem bekannten integralen PCR-
System unterschritten, das dem hier aufgestellten genügend ähnelt.
Die einzige Studie, die unter ähnlichen Größen eine kürzere Mindestanreicherungszeit
(2 Stunden) präsentiert, ist die von KLEIN und JUNEJA (1997). Leider hinkt der Vergleich
insofern, als dass das Hackfleisch (Rind) im gegarten Zustand beimpft wurde. Die
kompetitive Flora war somit praktisch nicht mehr vorhanden, was einem soliden Vergleich
die Grundlage entzieht.
Microarrays lassen sich hervorragend automatisiert analysieren. Sie unterscheiden sich damit
von der Agargel-Elektrophorese, bei der das Probenaufkommen je Durchgang begrenzt ist;
zudem entfällt die Visualisierung der DNA-Banden mittels Ethidiumbromid, das umfang-
reiche Vorsichtsmaßnahmen im Umgang zum Schutz vor einer mutagenen / teratogenen
Gesundheitsgefährdung erfordert.
Fazit:
Die Leistungsfähigkeit der verwendeten PCR-Systeme entspricht – mindestens bezüglich der
Anwendung auf Schweinehackfleischproben – somit den Anforderungen, die an ein
molekularbiologisches Verfahren gestellt werden können. Die Kompatibilität der einzelnen
Faktoren zueinander konnte belegt werden.
Diskussion
132
5.4 Diskussion zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in
Schweinehackfleisch mittels ELISA
Methodische Charakterisierung des Sandwich-ELISA
Die methodische Sensitivität dieses ELISA-Tests entspricht den Herstellerangaben. Die
Nachweisgrenze lag bei 107 KbE Listeria monocytogenes pro ml. Ab 105 KbE werden
„zweifelhaft positive“ Nachweise erhalten.
Der Zusatz von Brillantschwarz wirkte sich nicht nachteilig auf die Nachweisgrenze aus.
Diagnostische Charakterisierung des Sandwich-ELISA
Schweinehackfleisch enthielt nach dem Dotieren etwa 20 – 30 KbE Listeria monocytogenes
pro Gramm. Die Mindestanreicherungszeit (Dauer der Anreicherung, nach der zum ersten
Mal in allen 25 g-Proben L. monocytogenes nachgewiesen werden konnte) in Halbfraser-
Bouillon bzw. zweistufig in Halbfraser- plus Fraser-Bouillon (18 Stunden PA plus 6 Stunden
SA) betrug in Verbindung mit dem Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA
24 Stunden.
Für einen sicheren qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln mit
dem Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA konnte die Herstellerempfehlung für die
Dauer der Anreicherung (48 Stunden) damit weit unterschritten werden. Die Ergebnisse lagen
ca. 27,5 Stunden nach Beginn der Inkubation vor.
Nach der Empfehlung des BgVV sollte die L. monocytogenes-Konzentration nicht mehr als
100 KbE pro Gramm Lebensmittel betragen. Die Inkubationszeiten für Schweinehackfleisch
können kürzer sein, als die vom Hersteller – allgemein für alle Lebensmittel – empfohlene
Gesamtinkubationszeit einer 2-stufigen Anreicherung (48 Stunden).
Um Monocytogenes-Konzentrationen in Schweinehackfleisch, die weit unterhalb des BgVV-
Richtwertes liegen, nachzuweisen, sind wahrscheinlich Inkubationszeiten (weit) u n t e r
48 Stunden ausreichend.
Der Hersteller des Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA empfiehlt als erstes
selektives Anreicherungsmedium den Einsatz von L-PALCAM-Bouillon (anstelle von Halb-
fraser-Bouillon). Aliquote von Halbfraser- bzw. Fraser-Anreicherungskulturen (0,1 ml; hitze-
denaturiert) konnten hier der ELISA-Analyse direkt und erfolgreich zugeführt werden.
Diskussion
133
Die integralen Bestandteile des Testsystems, bestehend aus
a) Halbfraser- und Fraser-Bouillon,
b) Inkubationstemperatur 37°C,
c) 1-stufiger bzw. 2-stufiger selektiver Anreicherung (Mindestanreicherungszeit 24
Stunden),
d) Schweinehackfleisch (kontaminiert mit ca. 20 – 30 KbE Listeria monocytogenes pro
Gramm) und
e) Sandwich-ELISA (Transia plate® Listeria monocytogenes)
erwiesen sich als kompatibel.
Die Zuhilfenahme einer Anreicherung zum Erreichen der Zielkeim-Konzentration ist
außerdem insofern vorteilhaft, da weniger Anteile der Lebensmittelprobe in dem Aliquot, das
mit dem ELISA zu untersuchen ist, vorhanden sind. Ein negativer Einfluß auf die
Nachweisgrenze des ELISA-Systems wird dadurch unwahrscheinlicher (BECKER et al.
1998). Im Rahmen der eigenen Arbeiten gestaltete sich insbesondere das Aliquotieren der
Primäranreicherung, d. h. das Pipettieren eines kleinen Volumens von 100 µl mit einer
entsprechend englumigen Pipette, als nicht unproblematisch. Bestandteile des Schweine-
hackfleisches (v. a. Faszien, fetthaltig) erschwerten den Arbeitsschritt z. T. beträchtlich.
Allerdings muß für das Vornehmen einer Sekundäranreicherung die gleiche Menge überführt
werden, was den Arbeitsaufwand relativiert.
Bei Unterschreiten der Mindestanreicherungszeit waren nach einstufiger Anreicherung
(21 Stunden und weniger) noch immer mehr Proben positiv als nach der zweistufigen
Anreicherung (18 Stunden plus 5 bzw. 4 Stunden).
Eine Inhibition der Immunoreaktion durch Lebensmittelkomponenten in einer 24-Stunden-
PA-Anreicherungskultur beeinträchtigte die Nachweisrate weniger als das Verdünnen von 0,1
ml PA-Anreicherungskultur in 10 ml SA-Anreicherungsmedium (enthielt dann annähernd
105 KbE pro ml). Nach 6 Stunden SA erreichte die Erregerkonzentration wieder die
Nachweisgrenze des ELISA.
Diskussion
134
Der Vorteil einer Anreicherung mit nachfolgender Denaturierung der Zellen, wie es in vielen
Fällen vor der Durchführung eines ELISA üblich ist, bietet Laboranten den Vorteil, in
geringerem Umfang mit infektiösen Materialien umgehen zu müssen. Dieser Vorteil besteht
v. a. gegenüber den direkten Konzentrierungsmethoden (wie bei SHERIDAN et al. 1991;
1997).
KERDAHI und ISTAFANOS (2000) untersuchten Lebensmittel (mit zwei unterschiedlichen
Kontaminationsniveaus dotiert) mit VIDAS LMO. Bei geringer kontaminierten Lebensmitteln
erhielten auch sie zunächst für etwa jede zehnte Probe ein falsch-negatives Resultat. Nach
einer Reinkubation über 24 Stunden waren allerdings auch in diesen Anreicherungskulturen
die Nachweisgrenzen erreicht, und der Test lieferte in allen dotierten Proben positive
Nachweise von L. monocytogenes.
Die Nachweisrate steht also in deutlicher Abhängigkeit zur anfänglichen Kontaminationsrate
bzw. zur Dauer der Anreicherung (KERR et al. 1990; KERDAHI u. ISTAFANOS 2000;
KLEINER u. SCHINKEL 2002); letzteres kann anhand der eigenen Ergebnisse bestätigt
werden.
In vielen Studien wird die sekundäre Anreicherung über 24 ± wenige Stunden praktiziert. Die
primäre Anreicherungskultur in Halbfraser unterstützt aber das Listerienwachstum in dem
Maße, dass angenommen werden kann, dass ein relativ k u r z e r zweiter
Anreicherungsschritt von wenigen Stunden genügen müsste, den Listerien eine Vermehrung
bis über die Nachweisgrenze eines ELISA-(oder auch PCR-)Systems zu ermöglichen
(s. eigene Ergebnisse; BECKER u. HOLZAPFEL 2002).
In anderen Studien wurde die Abhängigkeit des immunologischen Listerien-Nachweises von
der untersuchten Lebensmittelmatrix deutlich (vgl. BEUMER u. BRINKMAN 1989;
HEISICK et al. 1989; BARBUTI et al. 1995). Zwar wurde im Rahmen der vorliegenden
Arbeit ausschließlich mit Hackfleisch vom Schwein und dem Transia plate Listeria
monocytogenes gearbeitet, aber mit Blick auf die bereits veröffentlichten Studien kann
hypothetisch von der Annahme ausgegangen werden, dass der ELISA-Nachweis von
Listerien in Schweinehackfleisch mit einer höheren Sensitivität einhergeht als der ELISA-
Nachweis von Listerien in Fleischerzeugnissen bzw. mit einer geringeren methodischen
Sensitivität einhergeht als der ELISA-Nachweis von Listerien in Milch.
Diskussion
135
Ergebnisse verschiedener Testkits lassen sich nur bedingt einem Vergleich unterziehen. Ein
verlässlicher Vergleich wäre nur dann möglich, wenn alle Faktoren eines Testsystems mit
Ausnahme des zu vergleichenden Testkits identisch wären.
Beachtet man z. B. die Vorgehensweise von BECKER et al. (1998), wird die unterschiedliche
Effektivität von Listeria-Anreicherungsmedien deutlich.
So könnte z. B. nicht automatisch davon ausgegangen werden, dass für L-PALCAM-Bouillon
dieselbe Mindestanreicherungszeit ermittelt worden wäre. Wahrscheinlich wären mit dem hier
untersuchten Testsystem, bei dem nur der integrale Bestandteil „Art der Lebensmittelprobe“
verändert wäre, die Mindestanreicherungszeit für z. B. eine Salami gegenüber der des
Schweinehackfleischs verlängert (vgl. BARBUTI et al. 1995).
Bei Studien über die Leistungsfähigkeit des Pathalert Listeria monocytogenes war dieses
Testsystem (wie auch der VIDAS LMO) für falsch-negative Ergebnisse anfällig. Es konnte
aber gezeigt werden, dass der Nachweis aus Mischkulturen von L. monocytogenes und
L. innocua möglich ist (BECKER et al. 1998). Die Untersuchungen wurden anhand von
Feldproben – also mit unbekanntem Kontaminationsgrad – durchgeführt, wobei es sich aber
v. a. um Käsearten und in keinem Fall um Fleisch oder Fleischerzeugnisse handelte.
Speziell für den Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA in Verbindung mit DIN EN
ISO-Standard 11290-1 (1996) ist belegt, dass der Zoonoseerreger immunologisch mit der
gleichen Sensitivität wie die ISO-Methode nachgewiesen werden kann (KLEINER und
SCHINKEL 2002).
Der ELISA identifizierte den Zielkeim dabei noch bei n i e d r i g s t e n initialen
Kontaminationsraten nach 43 / 47 Stunden Gesamtinkubationszeit.
Auch allgemein verfügten ELISA-Systeme mindestens über dieselbe Sensitivität wie die
bisher entwickelten kulturellen Methoden (BEUMER u. BRINKMAN 1989; MATTINGLY
et al. 1988; WALKER et al. 1990; KERR et al. 1990; HEISICK et al. 1989;
UYTTENDAELE et al. 1995; BECKER et al. 1998). Verschiedene kulturelle Verfahren (u. a.
Referenzmethode nach § 35 LMBG) produzieren, auch gegenüber immunologischen
Systemen, falsch-negative Ergebnisse. Abzuwarten ist, inwieweit die Kombination eines
immunologischen Verfahrens mit einer Gensonde (KERDAHI und ISTAFANOS 2000) sich
auf künftige Nachweisgrenzen - auch innerhalb kürzerer Anreicherungszeiten - auswirkt.
Diskussion
136
Für den Nachweis von Listeria monocytogenes in der Lebensmitteldiagnostik erwies sich der
Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA besonders unter den speziellen Versuchs-
bedingungen (Hackfleisch vom Schwein, Anreicherungsmedium Halbfraser- bzw. Fraser-
Bouillon, Inkubation bei 37°C) als sehr gut geeignet.
5.5 Bedeutung der Halbfraser-Anreicherungskultur in Verbindung mit Schnell-
methoden
Die Schwärzung der Halbfraser-Anreicherungskultur zeigt präsumtiv die Anwesenheit von
Listerien in einer Probe an. Je höher die Kontaminationsrate ist, desto früher setzt der
Farbumschlag ein. Der Farbumschlag verläuft graduell, bis schließlich die endgültige
schwarze Farbe vorliegt. Der Grad der Färbung erlaubt somit indirekt Rückschlüsse auf eine
mögliche Listerien-Konzentration.
Wenn bereits erste Merkmale des Farbumschlags erkennbar sind, könnten diese indizieren,
dass die Analyse mit einer Schnellmethode zu diesem Zeitpunkt bereits Aussicht auf Erfolg
hat. Eine k u r z e Verlängerung der Inkubation um wenige Stunden bzw. ein kurzer
sekundärer Anreicherungsschritt könnte in diesem Fall möglicherweise ausreichen, um den
Nachweis zu ermöglichen.
5.6 Vergleich der Schnellmethoden
Betrachtet man die Mindestanreicherungszeiten der Schnellmethoden (PCR/Agargel-
Elektrophorese, PCR/Microarray-Analyse und Sandwich-ELISA), ergibt sich für diese
„integralen“ Systeme folgende Sensitivitätsreihe (Abb. 5):
PCR/ PCR/ Microarray-Analyse >> Agargel-Elektrophorese >> Sandwich-ELISA
Mindestanreicherungszeit
10 h
Mindestanreicherungszeit
16 h
Mindestanreicherungszeit
24 h
Abb.5: Sensitivitätsreihe der verwendeten Schnellmethoden (erstellt unter Berücksichtigung der Mindestanreicherungszeit).
Diskussion
137
Die Abhängigkeit – sowohl einer molekularbiologischen als auch einer immunologischen
Analyse bei dem Nachweis von Listerien – von verschiedenen Faktoren (Lebensmittelmatrix
inkl. deren begleitende Flora, Anreicherungsmedium, Inkubationsdauer, Nachweisgrenze des
Testsystems und möglicherweise auch die Inkubationstemperatur) erschwert einen Vergleich
zwischen verschiedenen Studien, deren Versuchsbedingungen sich zumeist in mehr als einem
dieser Faktoren unterscheiden. Nur integrale Systeme, die sich lediglich in einem Faktor
(z. B. Lebensmittel) unterscheiden, können miteinander verglichen werden.
Das bedeutet außerdem, dass die oben erstellte Sensitivitätsreihe ausschließlich für die hier
verwendeten Versuchsbedingungen ohne Einschränkungen angenommen werden kann.
Der Zeitaufwand in Abhängigkeit von der verwendeten Methode ist der Tabelle 30 zu
entnehmen. Alle Schnellmethoden führten zu einer drastischen Reduzierung der Analysen-
dauer. Microarray und ELISA sind dabei besonders interessante Technologien, weil die
Analyse automatisiert durchgeführt werden kann.
Tab. 30: Mindestanreicherungszeiten und Zeitaufwand für einen zuverlässigen positiven Nachweis von Listeria monocytogenes in künstlich kontaminiertem Hackfleisch vom Schwein.
Methode PCR
Microarray-Analyse (NUTRI®-Chip)
PCR Agarosegel-
Elektrophorese
Transia plate® Listeria
monocytogenes- Sandwich-ELISA
*Mindest-anreicherungszeit
10 h 16 h 24 h
**Arbeitsschritte zwischen
Anreicherung und Analye
11,5 – 13,5 h 9,5 –10,5 h 25 Minuten
Analyse 5 Minuten 45 Minuten 3 h
Zeitaufwand insgesamt 24 h max. 28 h 27,5 h
* Gilt bei Einsatz von Halbfraser-Bouillon wie nach § 35 LMBG beschrieben. ** Der Zeitaufwand für diese Zwischenschritte ist abhängig von der Probenanzahl. Die Angabe beruht auf eigenen Erfahrungswerten.
Diskussion
138
Die Mindestanreicherungszeiten bestätigen die theoretischen Erwartungen an die Sensitivität
eines PCR-Systems. Das überlegene Prinzip der Hybridisierung gegenüber der Detektion
mittels Agargel-Elektrophorese wurde bereits in anderen Studien demonstriert (KLEIN u.
JUNEJA 1997).
Ausblick
Alle drei Methoden würden von einer verbesserten Anreicherungsprozedur bzw. einem
verbesserten Konzentrierungsschritt profitieren.
Die Präparation der DNA ist ein wichtiger Schritt in der Analyse, der noch
anpassungsbedürftig ist: Die CTAB-Methode – beschrieben in der Amtlichen Sammlung zur
Durchführung der PCR – kann durch andere Extraktionsmethoden ersetzt werden, die
innerhalb von 50 % der benötigten Zeit brauchbare DNA-Extrakte liefern, mit denen die
Identifizierung von Monocytogenes-spezifischer DNA möglich ist.
Jedenfalls ist hier noch Potential zur Verkürzung der Nachweisdauer gegeben (DNA-
Extraktion für BAX-System benötigt ca. 2,5 Stunden). Mit der derzeit erhältlichen Version
des NUTRI®-Chips wäre dann der Nachweis von Listeria monocytogenes bereits innerhalb
von ca. 20 Stunden möglich.
Der Anspruch zur Verkürzung der Nachweiszeit sollte damit allerdings noch nicht erfüllt sein.
Weiterhin gilt es festzustellen, ob der Nachweis von Listeria monocytogenes mit einer
Methode in Anwesenheit einer starken kompetitiven Begleitflora (in der vorliegenden Studie
vertreten durch Listeria innocua) beeinträchtigt ist. Darüberhinaus ist von Interesse, inwieweit
dieser Einfluß ein Nachweissystem beeinträchtigt, was z. B. anhand der Ermittlung der
Mindestanreicherungszeit ermessen werden kann.
Die gleichzeitige Prüfung verschiedener Methoden unter denselben Bedingungen kann eine
graduelle Gewichtung über den praktischen Wert dieser Methoden ermöglichen.
Speziell für die Microarray-Analyse wäre der nächste Schritt nach Abschluß dieser Studie, die
Sensitivität mit der Mindestanreicherungszeit als Parameter in Gegenwart von z. B. Listeria
Diskussion
139
innocua zu testen. Das ELISA- wie auch das Multiplex-PCR-System sollten in gleicher Weise
getestet werden.
Dabei ist es nicht die methodische Sensitivität, die in Frage gestellt wird, sondern die
Effektivität der selektiven Anreicherung.
Zwar wurde in der vorliegenden Arbeit dargestellt, dass übliche selektive Anreicherungs-
medien (hier Halbfraser-Bouillon) das Wachstum von Listerien ausreichend fördern, aber in
welchem Maße eine stark vermehrungsfähige begleitende Flora die Nachweisqualität
beeinflusst, kann hier nur am Beispiel von Listeria innocua erahnt werden.
Enzymimmunoassays, die vielfach als ELISA konzipiert sind und eine breite Akzeptanz
genießen, sind in einer größeren Anzahl auf dem Markt erhältlich; die meisten sind ebenfalls
voll automatisierbar. Ein Format wie eine 96-Loch-Mikrotiterplatte ist aber auch für kleinere
(betriebliche) Labore geeignet. Das Potential zur Steigerung der methodischen Sensitivität für
Enzymimmunoassays besteht in der Entwicklung neuer, rekombinanter Antikörper (VON
BLANKENFELD-ENKVIST u. BRÄNNBACK 2002). Die PCR ist für größere Betriebs-
einheiten geeignet. Das Potential ist auch heutzutage noch nicht ausgeschöpft bzw. an die
Anwendung in der Lebensmitteldiagnostik angepasst.
Wie sich hier zeigte, sind methodische und diagnostische Sensitivität des Microarray-
Systems, hier repräsentiert durch den NUTRI®-Chip, anderen Methoden überlegen.
Der Vorteil eines Microarrays ist, dass die Anzahl der Sondenfelder mit unterschiedlichen
Spezifitäten praktisch beliebig ist. Aus diesem Grund erwartet man im Bereich der
mikrobiologischen (Lebensmittel-)Diagnostik einen Durchbruch der Microarray-Analyse, die
allgemein als die vielversprechendste unter den (Schnell-)Methoden anzusehen und zudem
kostengünstig und im routinemäßigen Gebrauch einsetzbar ist.
Im Rahmen von HACCP-Konzepten besteht damit erstmals die Möglichkeit, geeignete
Kontrollmaßnahmen insbesondere auch im Bereich roher Lebensmittel / Rohstoffe von
Lebensmitteln hinsichtlich bakterieller Parameter von Critical Control Points (CCPs) zu
konstruieren.
Zusammenfassung
140
6. Zusammenfassung
Melanie Tina Leidreiter
Untersuchungen zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweine-
hackfleisch: Kulturelle Referenzmethode, ELISA, PCR und Microarray.
Die vorliegende Untersuchung diente dem vergleichenden Nachweis von Listeria
monocytogenes in dotiertem Hackfleisch mittels kultureller Referenzmethode nach § 35
LMBG, ELISA (Transia plate Listeria monocytogenes), Multiplex-PCR und Microarray in
Hinblick auf Sensitivität und Spezifität. Daneben erfolgte eine vergleichende Untersuchung
von 71 Feldproben von Lebensmitteln, von denen in 49 Proben zuvor kulturell der Nachweis
von Listeria monocytogenes erfolgt war.
Schweinehackfleisch wurde unter kontrollierten Bedingungen mit 20 – 30 KbE L. monocyto-
genes pro Gramm inokuliert. Die homogene Verteilung wurde über Färbeversuche des
Probengutes mit einem zu der Keimsuspension zugemischten Lebensmittelfarbstoff (Brillant-
schwarz, E 151) kontrolliert.
Außerdem wurden in einem weiteren Ansatz Hackfleischproben mit Mischkulturen von
Listeria monocytogenes und Listeria innocua im Verhältnis 1:1,2 inokuliert.
Die dotierten Proben wurden anschließend in selektiven Anreicherungsmedien inkubiert. Für
die kulturelle Referenzmethode wurde eine primäre Anreicherung bei 30°C und für ELISA,
PCR und Microarray eine Anreicherung bei 37°C in Halbfraser-Bouillon durchgeführt. Für
die kulturelle Nachweisführung erfolgte zudem eine Sekundäranreicherung.
Zur Bestimmung der für die Schnellmethoden erforderlichen Mindestanreicherungszeiten,
anhand derer die Sensitivität der einzelnen Methoden zu bemessen war, wurde die Dauer der
Inkubation variiert und sukzessive reduziert. Der Zeitraum der Inkubation, nach dem erstmals
jede Probe als Listeria monocytogenes-positiv bewertet werden konnte, wurde als
Mindestanreicherungszeit definiert.
Zusammenfassung
141
Mit der kulturellen Nachweismethode konnte Listeria monocytogenes mit einem Gesamt-
untersuchungsaufwand von 5 Tagen in 100 % der Proben nachgewiesen werden. Bei
Mischinokulationen mit Listeria innocua war der Zielkeim Listeria monocytogenes in 46,7 %
der Proben nicht nachweisbar.
Mit dem ELISA wurde Listeria monocytogenes nach einer Mindestanreicherungszeit von 24
Stunden in allen Proben nachgewiesen.
Die Multiplex-PCR führte bereits nach einer Anreicherungszeit von 16 Stunden in 100 % der
Proben zum sicheren Nachweis von Listeria monocytogenes.
Als sensitivste Nachweismethode wurde die Microarray-Analyse identifiziert, bei der eine
Mindestanreicherungszeit von lediglich 10 Stunden erforderlich war, um eine ursprüngliche
Kontamination von 13 KbE Listeria monocytogenes pro Gramm sicher nachzuweisen.
Beeinträchtigungen durch Mischkontaminationen mit Listeria innocua traten ebenfalls nicht
auf.
Der Vergleich der Nachweismethoden anhand von Untersuchungen von Feldproben auf eine
natürliche Kontamination mit Listeria monocytogenes ergab insgesamt eine 86,6 %ige Über-
einstimmung der Schnellmethoden mit den kulturell erhobenen Ergebnissen. In 6 bzw. 5 von
22 Proben konnte mit PCR bzw. Microarray eindeutig Listeria monocytogenes nachgewiesen
werden, obwohl diese mittels kultureller Referenzmethode als negativ diagnostiziert wurden.
Summary
142
7. Summary
Melanie Tina Leidreiter
Investigations on the detection of Listeria monocytogenes in minced pork:
Cultural reference method, ELISA, PCR, and Microarray.
Abstract Species-specific detection of Listeria monocytogenes contaminating ground pork was
demonstrated by performing various methods. For this purpose, samples were artificially
inoculated with about 20 - 30 cfu g-1. Special care was taken with the homogenous
distribution of the inoculated bacteria by colouring of the ground pork with an additive
(E 151). For control, the inoculated ground pork had to get evenly blue-coloured.
As a conventional method, DIN EN ISO 11290-1 (1996), and as rapid methods multiplex
PCR (detection of target DNA with agarose gel electrophoresis and also with microarray
analysis, respectively) as well as a sandwich-ELISA were performed. Generally, to reach
level of detection, the amount of target cells needed to be increased. This was done by
selective enrichment carried out in half-Fraser broth at 30°C (conventional method) or 37°C
(rapid methods). Conditions served well to support growth of target cells in a most
satisfactory way.
As long as Listeria innocua was absent, cultural DIN EN ISO method (1996) gave no false-
negative results. The rate of detection was 100 %, and results were obtained within 5 days.
However, in presence of Listeria innocua, which is the most frequent indicator for a
contamination with Listeria monocytogenes in meat and meat products (often occurs in mixed
contamination with this pathogen), sensitivity was reduced considerably. Almost 50 % of the
samples, contaminated artificially with both species in mixed culture, escaped detection.
Therefore, new types of solid media, which have been designed to differentiate between
Listeria monocytogenes and other Listeriae, e. g. ALOA, a chromogenic medium, should be
integrated with the current official cultural method (according to § 35 LMBG).
Summary
143
Transia plate™ Listeria monocytogenes ELISA system served as well as the other rapid
methods did. It is to be found superior to the current official cultural method, since positive or
negative findings are possibly available within 28 hours after starting enrichment. The
minimum enrichment period – determined with 24 hours – represents the high sensitivity of
the ELISA method, though the ELISA is not as sensitive as methods based on molecular
biology techniques.
By amplification of two virulence gene fragments, multiplex PCR followed by agarose gel
electrophoresis gives evidence of Listeria monocytogenes with equal reliability. The detection
of DNA was less sensitive when performed with microarrays: with agarose gel
electrophoresis, it took 16 hours of enrichment to detect the pathogen in every sample.
Running DNA microarray analysis, this innovative method of detection proved to be the most
rapid, since the most reduced enrichment period led to a positive finding. For this purpose,
enrichment period could be reduced to a minimum of 10 hours. Positive detection was
possible with the smallest amounts of target cells in comparison with the other methods used
here.
In contrast to the official cultural method, microarray analysis, at any rate, made detection of
Listeria monocytogenes feasible even in mixed contamination with Listeria innocua. With
naturally contaminated foods, both PCR detection systems led to satisfactory results.
Microarray analysis is predetermined for automation. Furthermore, the employed NUTRI™-
Chip is also prepared with probes against specific DNA-sequences of Salmonella and
Campylobacter. A simultaneous detection of three food-borne pathogens in one food sample
then becomes possible.
However when tested, each detection system proved especially compatible with any of the
single factors given: target organism, enrichment medium, length of incubation or minimum
enrichment period (characteristics of applied detection methods). Furthermore, they constitute
integral systems that should be useful for routine application.
These rapid methods are most r e l i a b l e and t i m e – s a v i n g with diagnosis obtained
on the second day of analysis. Microarray analysis is the most sensitive rapid method.
Schrifttumsverzeichnis
144
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Anhang
169
9. Anhang
9.1 Nähr- und Differenzierungsmedien
Columbia-Agar mit SchafblutPLUS
PB 5039 A, Oxoid, Wesel
Halbfraser-Anreicherungsbouillon / Fraser-Anreicherungsbouillon
Grundmedium (1.10398., VWR, Darmstadt)
Supplement (1.10399., VWR, Darmstadt)
aqua dest.
auf pH 7,0 ± 0,1 einstellen
15 min bei 121°C autoklavieren
Supplemente in je 1 ml sterilem aqua dest. lösen, zur Basisbouillon
(abgekühlt auf 50°C) geben, homogen verteilen durch vorsichtiges
Schwenken
55 ,0 g
je 1 Flasche
ad 1000 ml
NaCl-Lösung
Natriumchlorid zur Analyse (1.06404., Merck, Darmstadt)
Trytone (L 42, Oxoid, Wesel)
aqua dest.
auf pH 7,0 ± 0,1 einstellen
in Reagenzgläser à 9 ml abfüllen
15 min bei 121°C autoklavieren
8,5 g
1,0 g
ad 1000 ml
Oxford-Agar
Grundmedium (1.07004., VWR, Darmstadt)
Supplemente (1.07006., VWR, Darmstadt)
aqua dest.
auf pH 7,2 ± 0,2 einstellen, im Dampftopf 35 – 40 min lösen
15 min bei 121°C autoklavieren
Supplemente in je 5,0 ml sterilem Ethanol-H2O-Gemisch (1:1) lösen,
zur Basisbouillon geben (abgekühlt auf < 50°C), mischen
in Petrischalen ausgießen
29,25 g
je 1 Flasche
ad 500 ml
Anhang
170
PALCAM-Agar
Grundmedium (1.11755., VWR, Darmstadt)
Supplement (1.12122., VWR, Darmstadt)
aqua dest.
auf pH 7,0 ± 0,2 einstellen, im Dampftopf 35-40 min lösen,
15 min bei 121°C autoklavieren
Supplement in 1 ml sterilem aqua dest. lösen, zur Basisbouillon
(abgekühlt auf < 50°C) geben, mischen
in Petrischalen ausgießen
34,4 g
1 Flasche
ad 500 ml
Standard-I-Agar
Granulat (1.07214., VWR, Darmstadt)
aqua dest.
auf pH 7,5 ± 0,2 einstellen, ggf. in Reagenzgläser à 9 ml abfüllen
15 min bei 121°C autoklavieren
in Petrischalen ausgießen, ggf. als Schrägagar erstarren lassen
37,0 g
ad 1000 ml
TSYE-Agar
TSYE-Caso-Agar (1.05458., VWR, Darmstadt)
aqua dest.
auf pH 7,3 ± 0,2 einstellen, im Dampftopf 35-40 min lösen,
15 min bei 121°C autoklavieren
in Petrischalen ausgießen
40,0 g
ad 1000 ml
TSYE-Bouillon
TSYE-Caso-Bouillon (1.05459., VWR, Darmstadt)
aqua dest.
auf pH 7,3 ± 0,2 einstellen
in Reagenzgläser à 10 ml abfüllen
15 min bei 121°C autoklavieren
30,0 g
ad 1000 ml
Anhang
171
Kohlenhydrat-Bouillon
Grundmedium:
verdautes Gewebe
Fleischextrakt
NaCl
Bromkresolrot
aqua dest.
je 500 ml 15 min bei 121°C autoklavieren
je 500 ml L-Rhamnose / D-Xylose lösen
10 g
1 g
5 g
0,02 g
ad 1000 ml
25 g
10x Freezing Medium
K2H PO4
KH2 PO4
Na-Citrat
MgSO4 x 7 H2O
(NH4)2 SO4
Glycerin
aqua dest.
K2H PO4 und KH2 PO4 getrennt von den anderen Substanzen in 300 ml
aqua dest. lösen und autoklavieren
restliche Substanzen in 700 ml aqua dest. lösen und autoklavieren
nach Autoklavieren: Lösungen mischen
vor der Verwendung: mit sterilem aqua dest. 1:10 verdünnen
63 g
18 g
4,5 g
0,9 g
9 g
440 g
ad 1000 ml
Anhang
172
9.2 ELISA-Materialien
Transia plate Listeria monocytogenes ELISA Transia GmbH, Obermörlen
9.3 Materialien für molekularbiologische Untersuchungen
9.3.1 Reagenzien
2-Propanol, 6752.1
Agarose NEEO, 2267.4
Bromphenolblau, A512.1
Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), 9161.2
Chloroform, 3313.1
Control-DNA für Listeria monocytogenes,
150 µl: 1000 copies
EDTA, 8043.1
Glycerin, 3783.1
HotStarTaq Polymerase (1000)
Lysozym, 8259.1
Natriumacetat, 6773.2
Natriumchlorid, 3957.1
Natriumhydroxid, 6771.1
NUTRI®-Chip-Kit
PREMaster LiD – C/A (Listeria Duplex)
Proteinase K, 7528.2
puC 19 MSP I, T149.1
RNAse, 7156.1
Synthetische Luft, 2310152
tri-Natriumcitrat-Dihydrat, 3580.1
TRIS-Base, 4855.2
Tween®20, 9127.1
Roth GmbH, Karlsruhe
Roth GmbH, Karlsruhe
Roth GmbH, Karlsruhe
Roth GmbH, Karlsruhe
Roth GmbH, Karlsruhe
GeneScan Analytics GmbH, Bremen
Roth GmbH, Karlsruhe
Roth GmbH, Karlsruhe
Qiagen, Hilden
Roth GmbH, Karlsruhe
Roth GmbH, Karlsruhe
Roth GmbH, Karlsruhe
Roth GmbH, Karlsruhe
GeneScan Analytics GmbH, Bremen
GeneScan Analytics GmbH, Bremen
Roth GmbH, Karlsruhe
Roth GmbH, Karlsruhe
Roth GmbH, Karlsruhe
Linde Gas AG, Hannover
Roth GmbH, Karlsruhe
Roth GmbH, Karlsruhe
Roth GmbH, Karlsruhe
Anhang
173
9.3.2 Rezepturen
CTAB-Puffer:
Natriumchlorid
Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)
TRIS-Base
EDTA
Pufferlösung mit HCl auf pH 8,0 einstellen
aqua dest.
1 M Tris-HCL :
TRIS-Base
Pufferlösung mit HCl auf pH 8,3 einstellen
aqua dest.
autoklavieren
1 x TE:
1 M Tris-HCl pH 8,3
0,5 M EDTA pH 8,0
aqua dest.
autoklavieren
0,2 x TE:
1 x TE
aqua dest.
autoklavieren
81,8 g
20,0 g
12,1 g
5,8 g
ad 1000 ml
ad 1000 ml
10,0 ml
2,0 ml
ad 1000 ml
200 ml
ad 1000 ml
Anhang
174
10 x TBE:
TRIS-Base
Borsäure
EDTA pH 8,3
aqua dest.
Blaumarker:
Glycerin
60 % Glycerin gesättigt mit Bromphenolblau
1 x TBE
Proteinase-K-Lösung:
Proteinase K
aqua dest.
Lysozym-Lösung:
Lysozym
aqua dest.
RNAse-Lösung:
RNAse
aqua dest.
Natriumacetat-Lösung:
Natriumacetat
aqua dest.
Lösung mit HCl auf pH 5,0 einstellen
Natriumacetat-Lösung:
Natriumacetat
aqua dest.
Lösung mit HCl auf pH 5,0 einstellen
107,8 g
55,0 g
9,3 g
ad 1000 ml
400,0 µl
50,0 µl
550,0 µl
20,0 mg
1,0 ml
10,0 mg
1,0 ml
20,0 mg
1,0 ml
24,609 g
ad 100 ml
24,609 g
ad 100 ml
Anhang
175
9.6 Geräte und Verbrauchsmaterialien
BioDetect 645
Brillantschwarz für die Mikroskopie
Brutschrank 30°C
Brutschrank 37°C
Centrifuge 5417 R
Dri-Block®
Einmal-Küvetten 1,5 ml halbmikro
Elektrophorese Apparat Horizon® 20.25
Elektrophorese Apparat Horizon® 58
Fleischwolf
GelCam
Gelgießstation H20-25
Hybridisierungsinkubator 7601
Kämme für Gelgießstation:
20, 30 oder 42 Zähne
Kolbenhubpipetten:
GeneScan Analytics GmbH, Bremen
Merck, Darmstadt
Heraeus, Hanau
Memmert, Schwabach
Eppendorf GmbH, Hamburg
Labtech International GmbH,
Burkhardtsdorf
Brand, Wertheim
GibcoBRL Life Technologies, Eggenstein
GibcoBRL Life Technologies, Eggenstein
Alexanderwerk, Remscheid
Polaroid GmbH, Offenbach
GibcoBRL Life Technologies, Eggenstein
GFL mbH, Burgwedel
GibcoBRL Life Technologies, Eggenstein
Eppendorf GmbH, Hamburg
0,5 – 10,0 µl
2,0 – 20,0 µl
20,0 – 200 µl
100 – 1000 µl
Mµlti-Ultra Tubes 0,2 ml, H561.1
Magnet-Heizrührer, Variomag® Monotherm
Microbank™-System
Microcentrifuge, C-1200
Mikrobiologische Sicherheitswerkbank,
CA / REV 3
Mikro-Zentrifuge 3-1820
Roth GmbH, Karlsruhe
H + P Labortechnik GmbH,
Oberschleißheim
MAST DIAGNOSTICA, Reinfeld
neoLab® GmbH, Heidelberg
Clean Air Techniek bv, Woerden, NL
neoLab® GmbH, Heidelberg
Anhang
176
Minishaker MK1
Petrischalen 94/16
Photometer Heλios β
IKA-Works Inc., Wilmington, USA
Greiner, Kemsmünster, Österreich
Unicam, Cambridge, UK
Pipettenspitzen: Sorenson™ BioScience, Inc., Salt Lake City, USA
0,5 – 10,0 µl
5,0 – 200 µl
30,0 µl
100 – 1000 µl
PowerPac 300
Reaktionsgefäße 8-Strips, 0,2 ml
Safe-Lock-Tubes (Eppendorfgefäß):
1,5 und 2,0 ml
Steriles Abstrichbesteck 10000230
Stomacher 400
Stomacherbeutel Model 400
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
neoLab®, Heidelberg
Eppendorf GmbH, Hamburg
Technolab Labortechnik, Herne
Seward, London, UK
Seward, London, UK
Thermocycler, GeneAmp® PCR-System 9700 PE Applied Biosystems, Norwalk, USA
Transilluminator, TI 4 und TI 2
UNIPREP Schüttelgerät
Waage 466-41
Waage BP 221 S
Waage Mettler
Biometra®, Göttingen
Uni Equip GmbH, Martinsried
Kern, Albstadt
Sartorius, Göttingen
Omnilab, Bremen
Anhang
177
9.5 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Charakteristische Merkmale zur Differenzierung der Spezies innerhalb der
Gattung Listeria.
Tab. 2: Konzentrationen von L. monocytogenes (L. m.) oder Listeria spp. in Fleisch.
Tab. 3: Inzidenz von L. monocytogenes sowie Listeria spp. und L. innocua in Fleisch
und Fleischerzeugnissen.
Tab. 4: Leistungsfähigkeit des kulturellen Referenzverfahrens nach § 35 LMBG (DIN
EN ISO 11290-1 (1996).
Tab. 5: Charakterisierung des Antigens p60 (sowie des p60-kodierenden Gens iap).
Tab. 6: Nachweisgrenzen verschiedener Listeria spp.-spezifischer immunologischer
Nachweissysteme nach Untersuchungen von dotierten Lebensmitteln.
Tab. 7: Sensitivität und Spezifität verschiedener Listeria spp.-spezifischer immuno-
logischer Nachweissysteme nach Untersuchungen von Feldproben.
Tab. 8: Nachweisgrenzen L. monocytogenes-spezifischer immunologischer Nachweis-
systeme nach Untersuchungen von dotierten Lebensmitteln.
Tab. 9: Typen von Microarrays und deren Charakteristika.
Tab. 10: Nachweisgrenzen und Spezifität von PCR-Systemen bei Untersuchungen von
Listeria monocytogenes-Reinkulturen.
Tab. 11: Untersuchungen zur Nachweisgrenze von PCR-Systemen zum Nachweis von
L.monocytogenes aus dotierten Lebensmitteln (mit oder ohne Anreicherung).
Tab. 12: Sensitivität und Spezifität verschiedener PCR-Systeme nach Untersuchungen
von Feldproben.
Tab. 13: Funktionen der einzelnen Zyklen und Temperatur-Zeit-Profil.
Tab. 14: Hybridisierungsregion des Microarrays: Anordnung der verschiedenen Sonden
und ihre Funktionen.
Tab. 15: Gesamtkeimzahlen verschiedener Anreicherungskulturen zur Prüfung der
Anreicherungsbedingungen.
Tab. 16: Gesamtkeimzahl von koloniebildenden Einheiten Listeria monocytogenes pro
TK-Portion einer halben Stammkultur.
Tab. 17: Verhältnis der Anzahl von L. innocua zur Anzahl von L. monocytogenes in
inokuliertem Hackfleisch.
Anhang
178
Tab. 18: Sensitivität der PCR in Verbindung mit Agargel-Elektrophorese.
Tab. 19: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 25 g inokuliertem Schweinehack-
fleisch mittels PCR und Agargel-Elektrophorese in Abhängigkeit von der
Dauer der Anreicherung.
Tab. 20: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 10 g inokuliertem Schweinehack-
fleisch mittels PCR und Agargel-Elektrophorese in Abhängigkeit von der
Dauer der Anreicherung.
Tab. 21: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 25 g inokuliertem Schweinehack-
fleisch mittels PCR und Microarray-Analyse in Abhängigkeit von der Dauer
der Anreicherung.
Tab. 22: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 10 g inokuliertem Schweinehack-
fleisch mittels PCR und Microarray-Analyse in Abhängigkeit von der Dauer
der Anreicherung.
Tab. 23 a, b: Ergebnisse und Angaben über die Höhe und Art der Inokulation für den
Listeria monocytogenes–Nachweis mittels kultureller Referenzmethode nach
DIN EN ISO 11290-1 (1996).
Tab. 24: Nachweisgrenze des ELISA mit und ohne Brillantschwarz.
Tab. 25: Berechnete Anzahl KbE L. monocytogenes in 1 g dotiertem Hackfleisch.
Tab. 26: Spezifität und Sensitivität der molekularbiologischen Methoden und deren
Übereinstimmung mit der kulturellen Methode.
Tab. 27: Monocytogenes-positive Proben (nach der kulturellen Methode gemäß § 35
LMBG).
Tab. 28: Monocytogenes-negative Proben (nach der kulturellen Methode gemäß § 35
LMBG).
Tab. 29: Von der herkömmlichen Referenzmethode abweichende Untersuchungs-
ergebnisse der Schnellmethoden.
Tab. 30: Mindestanreicherungszeiten und Zeitaufwand für einen zuverlässigen
positiven Nachweis von Listeria monocytogenes in künstlich kontaminiertem
Hackfleisch vom Schwein.
Anhang
179
9.6 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Spezifität der Multiplex-PCR: Agargel-Elektrophorese zum Nachweis von
L. monocytogenes-DNA aus Reinkulturen sowie der DNA einer L. innocua-
Anreicherung.
Abb. 2: Spezifität der Multiplex-PCR: Agargel-Elektrophorese zum Nachweis von
L. monocytogenes-DNA aus Schweinehackfleischproben.
Abb. 3: Positive und negative Untersuchungsergebnisse von Feldproben mit Agargel-
Elektrophorese und NUTRI®-Chip-Analyse (bezogen auf die kulturelle
Referenzmethode).
Abb. 4: Positive und negative Untersuchungsergebnisse von Feldproben mit Agargel-
Elektrophorese und Microarray-Analyse (in der Annahme, dass jedes positive
Testergebnis unabhängig von der Methode als richtig-positiv zu bewerten ist).
Abb. 5: Sensitivitätsreihe der verwendeten Schnellmethoden (erstellt unter Berück-
sichtigung der Mindestanreicherungszeit).
Danksagung
Das Thema dieser Arbeit wurde mir durch die Hand von Herrn Prof. Dr. Siegfried Wenzel (im
Ruhestand) überlassen. Ihm möchte ich sehr herzlich danken für jegliche gewährte
Unterstützung und manches persönliche Wort. Ersteres war die essentielle Grundlage für die
vorliegende Arbeit, letzteres werde ich beherzigen.
Herr Privatdozent Dr. Michael Kühne, der von Beginn an als Betreuer an meiner Seite war,
übernahm die verantwortliche Leitung, nachdem Herr Prof. Dr. Siegfried Wenzel in den, um
mit dessen eigenen Worten zu sprechen, „Unruhezustand“ getreten ist.
Immer konnte ich auf die Unterstützung meines Betreuers und nun auch Doktorvaters zählen,
und ganz besonders wichtig war mir dies in der letzten Phase, in der er einmal mehr seine
bald schon berühmte Geduld aufbrachte. Das schätze ich sehr, und auch dafür will ich mich
sehr herzlich bedanken!
An die Assistenten, die mir gerne und bereitwillig mit Kenntnissen aushalfen, geht ebenfalls
mein aufrichtiger Dank. Die technischen Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter der Zentrums-
abteilung für Lebensmittelkunde, Fleischhygiene und -technologie müsste ich genau-
genommen alle – ohne Ausnahme – mit Namen aufzählen. Sie alle unterstützten mich in
meiner Arbeit, je nach Erfordernis mit einem kleineren oder größeren Anteil, mit ihrem
Wissen und/oder ihrer praktischen Hilfe.
Die Kenntnisse und Fähigkeiten für die praktischen Arbeiten im mikrobiologischen Labor
(ein weites Feld!) erwarb ich im wesentlichen durch Frau Christina Degenhardt. Nicht nur
dafür, sondern auch für ihren geduldigen Einsatz, wenn sie mir zeigte, was ich suchte, obwohl
es eigentlich direkt vor meiner Nase stand, möchte ich mich bedanken!
Herrn Prof. Dr. Gunter Amtsberg danke ich sehr herzlich für die mir zur Verfügung gestellten
Teststämme.
Frau Bendix und Frau Heppner, Gissel-Institut, haben mich ebenfalls immer sorgfältig und
bereitwillig unterstützt, und ich danke ihnen dafür und für die bereitgestellten Feldproben.
Frau Anja Gresch gilt mein Dank für das gewinnbringende Gegenlesen der englischen
Zusammenfassung.
Von der Dr. Eberhard Lienhop Stiftung wurden die ELISA-Untersuchungen maßgeblich
finanziell gefördert, was ich hier ebenfalls dankend betonen möchte.
Mein ganz persönlicher Dank gilt Frau TÄ Roswitha Merle und Herrn Manfred Krückeberg.
Beide waren immer für mich da, und sie halfen mir und meinem PC tatkräftig durch so
manche Krise. Manfred, mein PC verdankt Dir sein Leben!
An die, welche – bewusst oder unbewusst – für mich in dieser Lebensphase wichtig waren,
die mir Wärme, Zeit und Nähe geschenkt haben: Danke – es ist schön, dass es Euch gibt!
Schließlich und endlich verdanke ich meinen Eltern die Möglichkeit, diese Arbeit anfertigen
zu können. Danke für Euer Verständnis; Ihr habt mir eine sehr wichtige Zeit geschenkt.