untersuchungen zum replikationsverhalten des hepatitis c...
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Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der
Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
Untersuchungen zum Replikationsverhalten
des Hepatitis C Virus (HCV) in
Zellkultursystemen mit manipuliertem
2’- 5’Oligoadenylatsynthetase-System
vorgelegt von Christina Röser
geboren in Erfurt/Thüringen
Februar 2007
Eingereicht im Fachbereich 2 (Biologie/Chemie) der Universität Bremen
Erster Gutachter: PD Dr. rer. nat. Andreas Dotzauer
Universität Bremen, Fachbereich 2
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Reimer Stick
Universität Bremen, Fachbereich 2
Tag des öffentlichen Kolloquiums: 19. April 2007 (Universität Bremen)
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung.............................................................................................. 1 1.1. Hepatitis C Virus .................................................................................. 1
1.1.1. Taxonomie ............................................................................................ 1 1.1.2. Genomorganisation............................................................................... 2 1.1.3. Genotypen............................................................................................. 3 1.1.4. Verbreitung........................................................................................... 5 1.1.5. Replikation............................................................................................ 5 1.1.6. Übertragungswege ................................................................................ 7 1.1.7. Krankheitsbild und Therapie ................................................................ 7 1.1.8. Diagnostik............................................................................................. 9
1.1.8.1. Serologischer Antikörper Test.............................................................. 9 1.1.8.2. Virologische PCR Tests zum Nachweis von HCV RNA................... 10
1.1.9. Hepatitis C Virus in Zellkultur ........................................................... 11 1.2. Unspezifische Immunabwehr ............................................................. 13
1.2.1. 2’- 5’Oligoadenylatsynthetase-System und RNase L......................... 14 1.2.2. RNase L Inhibitor (RLI) ..................................................................... 16
1.3. Polymerase Kettenreaktion................................................................. 17 1.3.1. Historisches ........................................................................................ 17 1.3.2. Prinzip der PCR.................................................................................. 18 1.3.3. Real time PCR .................................................................................... 19 1.3.4. Fluoreszenzfarbstoffe ......................................................................... 20 1.3.5. ABI PRISM™ Systeme...................................................................... 21 1.3.6. RotorGene™....................................................................................... 22
1.4. Ziel der Arbeit .................................................................................... 24 2. Material und Methoden ...................................................................... 25
2.1. Materialien.......................................................................................... 25 2.1.1. Antikörper........................................................................................... 25 2.1.2. Bioreagenzien ..................................................................................... 25 2.1.3. Gebrauchsfertige Kits ......................................................................... 26 2.1.4. Geräte.................................................................................................. 26 2.1.5. Medien und Lösungen ........................................................................ 27 2.1.6. Oligonukleotide .................................................................................. 27 2.1.7. Plasmide.............................................................................................. 29 2.1.8. Restriktionsendonukleasen ................................................................. 30 2.1.9. Software.............................................................................................. 30 2.1.10. Verbrauchsmaterialien........................................................................ 31 2.1.11. virologische Materialien ..................................................................... 31 2.1.12. Zelllinien............................................................................................. 31
2.2. Methoden ............................................................................................ 32 2.2.1. Molekularbiologie .............................................................................. 32
2.2.1.1. Aufreinigung von Zell-RNA mit dem RNeasy® Mini Kit.................. 32 2.2.1.2. DNA-Auftrennung im Agarosegel ..................................................... 32 2.2.1.3. cDNA-Synthese .................................................................................. 32 2.2.1.4. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA ..................... 33 2.2.1.5. Full length Amplifikation des RNase L Inhibitor .............................. 34 2.2.1.6. Klonierung des RLI in pcDNA3.1/V5-His und Transformation
von E.coli............................................................................................ 35 2.2.1.7. Klonscreening mittels PCR ................................................................ 36 2.2.1.8. Präparation der rekombinanten Plasmide ........................................... 37 2.2.1.9. Sequenzierung .................................................................................... 37 2.2.1.10. Umklonierung des RLI aus pcDNA3.1/V5-His_RLI in pl.18............ 37 2.2.1.11. In vitro Transkription von HCV full length HCV RNA..................... 39 2.2.1.12. Entwicklung eines HCV RotorGene Nachweissystems ..................... 40
2.2.2. Zellkultur und virologische Methoden ............................................... 42 2.2.2.1. Kryokonservierung von Huh7- und FRhK-4-Zellen .......................... 42 2.2.2.2. Auftauen von Huh7- und FRhK-4-Zellen .......................................... 42 2.2.2.3. Passagieren von Huh7- und FRhK-4-Zellen ...................................... 42 2.2.2.4. Transfektion mit FuGene 6 Transfection Reagent ............................. 43 2.2.2.5. Transfektion mit jetPEI ...................................................................... 43 2.2.2.6. G418 Titration für Huh7-Zellen ......................................................... 43 2.2.2.7. Stabile Überexpression des RLI in Huh7- und FRhK-4-Zellen ......... 44 2.2.2.8. Immunfluoreszenz .............................................................................. 44 2.2.2.9. Stabilitätstest von HCV RNA in zellfreiem Medium......................... 45 2.2.2.10. HCV Infektion von FRhK-4-RLI-Klonen .......................................... 45 2.2.2.11. HCV Infektion transient RLI-transfizierter Huh7- und FRhK-4-Zellen............................................................................. 46 2.2.2.12. Transfektion in vitro transkribierter RNA in Huh7-
und FRhK-4-Zellen............................................................................. 46 2.2.2.13. Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA in
transient RLI-transfizierten Huh7- und FRhK-4-Zellen..................... 47 2.2.2.14. Aufreinigung viraler RNA mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit .. 47
3. Ergebnisse........................................................................................... 48 3.1. Erstellung der real time PCRs ............................................................ 48
3.1.1. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA .................... 48
3.1.1.1. Effizienz.............................................................................................. 49 3.1.1.2. Spezifität ............................................................................................. 51
3.1.2. Real time RT-PCR zum quantitativen Nachweis der HCV RNA ...... 52 3.1.2.1. Testung des HCV RotorGene Assay auf Kreuzreaktivität ................. 52 3.1.2.2. Sensitivität des HCV RotorGene Nachweissystems .......................... 53 3.1.2.3. Nachweis verschiedener HCV Subtypen............................................ 55
3.1.3. Zusammenfassung real time PCRs..................................................... 57 3.2. RNase L Inhibitor ............................................................................... 57
3.2.1. Sequenzierung RNase L Inhibitor ...................................................... 57 3.2.2. Transfektion mit jetPEI bzw. FuGene 6 Transfection Reagent .......... 59 3.2.3. RLI-Kinetik nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI ............ 61 3.2.4. Vergleich der Expressionsraten von pcDNA3.1/V5-His_RLI
und pl.18_RLI..................................................................................... 62 3.2.5. Nachweis der RLI-Expression mittels Immunfluoreszenz ................. 64 3.2.6. Stabile Überexpression des RLI in FRhK-4- und Huh7-Zellen ......... 65 3.2.7. RLI-Kinetik der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 .................................... 67 3.2.8. Kinetik der RLI-Expression stabil transfizierter FRhK-4-6er Klone . 68 3.2.9. Zusammenfassung RNase L Inhibitor ................................................ 70
3.3. HCV Infektion .................................................................................... 70 3.3.1. Titer- und Subtypenbestimmung von HCV-positivem Plasma
des Blutspendedienstes Hagen........................................................... 71
3.3.2. Stabilität von HCV RNA.................................................................... 72 3.3.3. HCV Infektion der RLI-Klone 4 und 5 .............................................. 74 3.3.4. HCV Infektion transient RLI-transfizierter Zellen ............................. 76 3.3.5. Zusammenfassung HCV Infektion ..................................................... 78
3.4. Transfektion in vitro transkribierter HCV full-length RNA............... 79 3.4.1. In vitro Transkription von full length HCV RNA .............................. 80 3.4.2. Transfektion in vitro transkribierter RNA in Huh7-
und FRhK-4-Zellen............................................................................. 81 3.4.3. Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA in
transient RLI-transfizierten Zellen ................................................... 84 3.4.4. Zusammenfassung Transfektion in vitro transkribierter
HCV full length RNA......................................................................... 90 4. Diskussion .......................................................................................... 91
4.1. Real time PCRs................................................................................... 91 4.1.1. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA
von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA ..................... 91 4.1.2. Real time PCRs zum quantitativen Nachweis der HCV RNA ........... 93
4.2. RNase L Inhibitor ............................................................................... 95 4.2.1. Isolation und Analyse des RLI aus FRhK-4- und humaner
gesamt-Zell-RNA ............................................................................... 95 4.2.2. stabile Überexpression des RNase L Inhibitors in Huh7-
und FRhK-4-Zellen............................................................................. 96 4.3. HCV Infektion und Transfektion von HCV full length RNA in RLI-transfizierte Zellen ...................................................................... 98
5. Zusammenfassung ............................................................................ 107 6. Literaturverzeichnis .......................................................................... 109 7. Anhang.............................................................................................. 117
7.1. Plasmidkarten ................................................................................... 117 7.2. Sequenzen und Alignments .............................................................. 121
8. Danksagung ...................................................................................... 1379. Publikationsliste................................................................................ 138 10. Lebenslauf ........................................................................................ 139 11. Erklärung .......................................................................................... 140
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Genomische Organisation des Hepatitis C Virus ........................................... 2Abbildung 2: Stammbaum der HCV Geno- und Subtypen sowie deren geographische
Verbreitung..................................................................................................... 4 Abbildung 3: Hepatitis C Prävalenz ..................................................................................... 5 Abbildung 4: Schematische Darstellung der HCV Replikation ........................................... 6 Abbildung 5: Darstellung von branched DNA Assay und reverser Transkriptase PCR.... 11 Abbildung 6: schematische Darstellung des 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System ......... 15 Abbildung 7: Schematische Darstellung der PCR.............................................................. 18 Abbildung 8: Sequenz-unabhängige Fluoreszenzfarbstoffe............................................... 20 Abbildung 9: Sequenzspezifische TaqMan Sonde ............................................................. 21 Abbildung 10: TaqMan 7900HT ........................................................................................ 22 Abbildung 11: Optisches System des ABI PRISM™ 7700 ............................................... 22 Abbildung 12: RotorGene™ 3000...................................................................................... 22 Abbildung 13: Querschnitt der Reaktionskammer des RotorGene™ 6000 ....................... 22 Abbildung 14: Verdünnungsreihe der RNase L ................................................................ 50 Abbildung 15: Verdünnungsreihe der RLI......................................................................... 50 Abbildung 16: Verdünnungsreihe der 18S rRNA .............................................................. 51 Abbildung 17: Verdünnungsreihe von GAPDH................................................................. 51 Abbildung 18: Spezifität der real time PCRs zum Nachweis der mRNAs von
RNase L, RLI, GAPDH sowie der 18S rRNA ........................................... 52 Abbildung 19: Kreuzreaktivitätstest des HCV RotorGene System.................................... 53 Abbildung 20: Analytische Sensitivität des HCV RotorGene System............................... 55 Abbildung 21: Nachweis verschiedener HCV Subtypen im HCV RotorGene Assay ....... 56 Abbildung 22: Sequenzierung der verwendeten RLI–Fragmente ...................................... 58 Abbildung 23: Vergleich der Transfektionsreagenzien jetPEI und FuGene 6 ................... 60 Abbildung 24: Einfluss der Transfektion auf die 18S rRNA ............................................. 61 Abbildung 25: RLI-Kinetik nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI .................... 62 Abbildung 26: Vergleich der RLI-Transkriptionsraten nach Transfektion mit
pcDNA3.1/V5-His_RLI und pl.18_RLI..................................................... 63 Abbildung 27: Immunfluoreszenzen gegen den His-Tag der transfizierten
pl.18_RLI Plasmide .................................................................................... 64 Abbildung 28: RLI-Expression in stabil transfizierten FRhK-4-Klonen ........................... 66 Abbildung 29: Bestimmung relativer Einheiten RLI-mRNA der FRhk-4-Klone 4 und 5. 67 Abbildung 30: RLI-Kinetik der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 ............................................ 68 Abbildung 31: RLI-Expression in FRhK-4-6er Zellen....................................................... 69 Abbildung 32: Titerbestimmung und Genotypenanalyse HCV-positiven Frischplasmas.. 72 Abbildung 33: Stabilität von HCV-RNA in DMEM (lineare Darstellung)........................ 74 Abbildung 34: Stabilität von HCV-RNA in DMEM (logarithmische Darstellung)........... 74 Abbildung 35: RLI-Expression der FRhK-4-RLI-Klone bei HCV Infektion .................... 76 Abbildung 36: RNase L-Expression der Klone bei HCV Infektion................................... 76 Abbildung 37: Transkriptionsrate des RLI 3 Wochen nach HCV Infektion
mit dreimaliger RLI-Transfektion .............................................................. 78 Abbildung 38: Transkriptionsrate der RNase L 3 Wochen nach HCV Infektion
mit dreimaliger RLI-Transfektion .............................................................. 78 Abbildung 39: RotorGene Lauf der in vitro transkribierten HCV-RNA............................ 81 Abbildung 40: RNase L-Expression in IVT-transfizierten Zellen ..................................... 82 Abbildung 41: HCV RNA-Titer in IVT-transfizierten Zellen............................................ 83
Abbildung 42: RLI-Expression in IVT-transfizierten Zellen ............................................. 84 Abbildung 43: RLI-Expression in IVT- und RLI-transfizierten Huh7-Zellen ................... 85 Abbildung 44: RLI-Expression in IVT- und RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen............... 86 Abbildung 45: HCV Titer in IVT- und RLI-transfizierten Zellen...................................... 88 Abbildung 46: RNase L-Expression in IVT- und RLI-transfizierten Huh7-Zellen ........... 89 Abbildung 47: RNase L-Expression in IVT- und RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen ....... 89 Abbildung 48: schematische Darstellung der zellulären viralen Abwehr mit
Angriffsstellen des Hepatitis C Virus......................................................... 99 Abbildung 49: schematische Darstellung von genomischer HCV RNA und
subgenomischer Replikon RNA ............................................................... 106
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Taxonomie der Familie Flaviviridae ................................................................... 1 Tabelle 2: In dieser Arbeit verwendete PCR-Primer.......................................................... 27 Tabelle 3: In dieser Arbeit verwendete Plasmide ............................................................... 29 Tabelle 4: In dieser Arbeit verwendete Restriktionsenzyme.............................................. 30 Tabelle 5: PCR-Effizienz.................................................................................................... 49 Tabelle 6: Zusammenfassung der Daten der Sensitivitätsläufe......................................... 54 Tabelle 7: berechnete Wahrscheinlichkeiten, mit denen die Proben im HCV RotorGene
System nachgewiesen werden konnten ............................................................ 54 Tabelle 8: Darstellung der kalkulierten Konzentrationen der HCV Eluate und
berechneten Konzentrationen der auf 50 IU/ml eingestellten Plasmaproben... 56
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung bDNA branched / verzweigte DNA bp basepair / Basenpaar(e) BSA Rinderserumalbumin bp Basenpaar bzw. beziehungsweise ca. circa cDNA komplementäre DNA cm2 Quadratzentimeter CMV Cytomegalie Virus cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure ct cycle treshold / Zyklus, in dem die Fluoreszenz erstmals über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt cp crossing point / entspricht dem ct °C Grad Celsius cop copy / Kopie CO2 Kohlendioxid d Tag(e) DMEM Dulbeccos Modification of Eagles Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleinsäure dNTPs desoxy-Nukleotidtriphosphate dsRNA doppelsträngiger RNA EBV Epstein Barr Virus EGTA Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylethyl)-tetraessigsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EIA Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest ELISA Enzyme Linked Immunosorbent AssayEMCV Enzephalomyokarditis Virus et al. et alteri / und andere Fa Firma FCS fetales calf serum / fötales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat FRhK-4 fetal monkey rhesus kidney cellsg Gramm GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase G418 Geneticindisulfat h Stunde(n) HAV Hepatitis A Virus HBV Hepatitis B Virus HCC hepatozelluläres Karzinom / Leberzellkarzinom HCV Hepatitis C Virus HIV human immunodeficiency virus / menschliches Immunschwäche Virus HSV Herpex Simplex Virus HTLV humanes T-Zell-Leukämie Virus Huh7 humane Hepatoma-Zellen IFN Interferon
IF-2 Initialisierungsfaktor 2 IRF-3 interferon regulated factor 3 IRES internal ribosomal entry sideIVT in vitro Transkript IU international unit / internationale Einheit μ l Mikroliter kb Kilobasen min Minute(n) ml Milliliter MOI multiplicity of infection / Anzahl der Infektionen mRNA messenger Ribonukleinsäure NaCl Natriumchlorid NCBI biologische Datenbank ng Nanogramm nm Nanometer OA 2’ 5’ Oligoadenylate OAS 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System / Oligoadenylatsynthetase ORF open reading frame / offener Leserahmen PCR polymerase chain reaction / Polymerase Kettenreation PBS phosphat buffered saline / Phosphat-gepufferte Salzlösung PCR Polymerase-Ketten-Reaktion pH pondus hydrogenii = negativer dekatischer Logarithmus der H+-Konzentration pH = -log [H+] polyIC polyinosinic acidPKR Proteinkinase R RFLP Restriktions-Fragmente-Längen-PolymorphismusRG RotorGene RIBA Recombinant Immunoblot AssayRLI RNase L Inhibitor RNA Ribonukleinsäure RT Reverse Transkriptase RT-PCR Reverse Transkription mit anschließender Polymerase-Ketten-Reaktion Real time PCR s Sekunde(n) Sd Sonde Tab. Tabelle rpm rounds per minute / Umdrehungen pro Minute UTR untranslatierte Region VSV Vesikuläres Stomatitis Virus z.B. zum Beispiel % Prozent
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1. Hepatitis C Virus
1.1.1. Taxonomie
Bis zu ihrer molekularen Identifikation aus dem Serum eines Schimpansen 1989 (Choo et
al., 1989) wurden die Hepatitis C Viren (HCV) den NonA-NonB-Hepatitisviren
zugeordnet. Zu diesen Viren werden alle Erreger von Leberentzündungen gezählt, die
nicht durch die Hepatitis A oder B Diagnostik erfasst werden (Modrow et al., 2003). Die
kugelförmigen Viruspartikel besitzen einen Durchmesser von 55 – 65 nm mit
stachelförmigen Oberflächenproteinen und lassen sich mit Hilfe der Sucrose-
Dichtezentrifugation in der 1,14 – 1,16 g/ml Fraktion anreichern (Kaito et al., 1994). Das
Genom des Hepatitis C Virus besteht wie das der Pestiviren und Flaviviren aus einer
einzelsträngigen RNA in Plusstrangorientierung. Der ähnliche Genomaufbau von HCV,
Pestiviren und Flaviviren führte zur Einordnung des Hepatitis C Virus als eigenständiges
Genus Hepacivirus in die Familie der Flaviviridae (Major et al., 2001). Die Familie der
Flaviviridae umfasst die drei Genera Flavivirus, Pestivirus und Hepacivirus (siehe
Tabelle 1).
Tabelle 1: Taxonomie der Familie Flaviviridae und charakteristische Vertreter der Genera Familie Genus Vertreter Natürlicher Wirt
Flavivirus Gelbfieber-Virus
West-Nil-Virus
Denguevirus
Mensch, Affen
Mensch, Vögel
Mensch, Affen
Flaviviridae
Pestivirus Schweinepest-Virus
Border-Disease-Virus
Schweine
Schafe
Hepacivirus Hepatitis C Virus Mensch
Nichtklassifizierte
Flaviviridae
Hepatitis G Virus Affen
Einleitung
2
1.1.2. Genomorganisation
Das Hepatitis C Virus ist ein RNA Virus mit einem ca. 9600 Basen großen RNA
Einzelstrang in positiver Orientierung. Der RNA Einzelstrang enthält einen offenen
Leserahmen (ORF), welcher für ein Polyprotein mit über 3000 Aminosäuren kodiert.
Nach der Spaltung durch virale und wirtsspezifische Enzyme entstehen aus diesem
Polyprotein zehn Polypeptide (siehe Abbildung 1)(Lyra et al., 2004).
Abbildung 1: Genomische Organisation des Hepatitis C Virus (Lyra et al., 2004). UTRs am 5’ und 3’Ende der RNA flankieren ein ca. 3000 Aminosäuren großes Polyprotein, welches in die zehn Polypeptide Core, E1 und E2, P7, NS2, NS3, NS4A/B und NS5A/B gespalten wird. Die Nukleotidpositionen entsprechen dem HCV Stamm J4 (Acc.nr D10749).
Die 5’untranslatierte Region (UTR) ist hoch konserviert und wird daher häufig als
Targetregion für diagnostische Assays verwendet. Das Core-Protein stellt das virale
Nukleokapsid, die Glykoproteine E1 und E2 die viralen Hüllproteine des Virus dar.
Die Proteine E1 und E2, mit molekularen Massen von 31 und 70 kDa interagieren
miteinander und bilden Heterodimere. Die E1 Region wird in der klinischen Diagnostik
zur Genotypisierung genutzt (Lyra et al., 2004). Das Glykoprotein E2 besitzt
Bindungsstellen für das Membranprotein CD81 und wird mit dem Viruseintritt in die
Leberzelle in Verbindung gebracht (Pileri et al., 1998). Das P7-Protein zwischen E2 und
NS2 ist ein sehr hydrophobes Polypeptid mit unbekannter Funktion (Bartenschlager &
Lohmann, 2000).
Das NS2-Protein ist ein Transmembranprotein, welches mit der C-terminalen Region im
Lumen des endoplasmatischen Retikulums und mit der N-terminalen Region im
Zytoplasma lokalisiert ist (Santolini et al., 1995).
Einleitung
3
Das NS3-Protein ist ein Protein mit Eigenschaften als Serinprotease, NTPase und RNA-
Helikase. Die katalytischen Eigenschaften der Serinprotease sind notwendig für die
Spaltung der Nicht-Strukturproteine NS3, NS4 und NS5.
Die NS4-Region wird in die Proteine NS4A und NS4B gespalten. Diese gelten als
Kofaktoren der NS3-Serinprotease.
NS5 wird ebenfalls in zwei kleinere Proteine gespalten: NS5A und NS5B. Die genauen
Aufgaben von NS5A und B sind noch nicht vollständig aufgeklärt. NS5A könnte als
Komponente im viralen Replikationszyklus beteiligt sein. NS5B könnte als virale RNA
Replikase während der HCV-RNA Synthese involviert sein (Tomei et al., 1993).
1.1.3. Genotypen
Der Vergleich der HCV Genome verschiedenster Isolate zeigt eine große genetische
Heterogenität. Es existieren verschiedene Modelle zur Genotypisierung von Hepatitis C
Viren. Dazu zählen zum Beispiel die RFLP Analyse (Restriktions-Fragment-Längen-
Polymorphismus, Methode beschrieben in Alberts et al. (1995)) der 5’ UTR, reverse Dot
Blot (Methode beschrieben in Saiki et al. (1989)) Hybridisierungsanalysen der 5’ UTR
oder die nested PCR (Methode beschrieben in Gassen et al. (1994)) der Core Genregion.
Die bewährteste Methode, um Sequenzunterschiede zwischen HCV Isolaten verschiedener
Genotypen festzustellen, sind PCR Amplifikationen und Sequenzierung definierter
Genomabschnitte wie Core, E1 und NS5.
Auf der Grundlage von Sequenzunterschieden der kodierenden und nichtkodierenden
Regionen wurden im Laufe der Zeit verschiedene Klassifikationssysteme vorgeschlagen.
Eine 1990 von Enomoto vorgeschlagene Unterteilung der Hepatitis C Viren in HCV-K1
und HCV-K2 basiert auf der Sequenzanalyse eines 400 bp großen cDNA Fragmentes des
NS5-Gens (Enomoto et al., 1990) (siehe auch Kapitel 1.1.2). 1992 wurde auf der Basis
von Sequenzunterschieden innerhalb begrenzter Core Genregionen eine Einteilung des
Hepatitis C Virus in die Genotypen I, II, III und IV entwickelt (Okamoto et al., 1992).
Durch die phylogenetischen Eigenschaften der Genotypen I bis IV schlugen Chan et al.
(1992) eine neue Nomenklatur vor, in der die Genotypen I und II als 1a/1b, Genotyp III
und IV als 2a/2b zusammengefasst werden sollten. In einer Studie von 1993 wurde von 51
HCV Isolaten die gesamte Nukleotidsequenz des E1 bestimmt und aus den Unterschieden
12 verschiedene Genotypen generiert (Bukh et al., 1993). Ebenfalls 1993 wurde die
Einleitung
4
Einteilung des Hepatitis C Virus in 6 Haupt-Genotypen und eine Reihe von Subtypen
anhand der phylogenetischen Analyse des NS5 vorgeschlagen (Simmonds et al., 1993).
Relativ konservierte Regionen des HCV Genoms wie Core, E1 oder NS5 wurden
ausführlich studiert und als Grundlage der heutigen Klassifikation der Isolate verwendet.
Die Einteilung des Hepatitis C Virus erfolgt in 6 Genotypen und mehr als 50 Subtypen
(Major et al., 2001). Die Genotypen werden mit arabischen Ziffern bezeichnet (1, 2, …),
unterschiedliche Subtypen zusätzlich mit kleinen Buchstaben (1a, 1b, …) charakterisiert.
Mit Hilfe phylogenetischer Stammbäume und der kompletten Sequenzanalyse von Core,
E1 und NS5 fand eine Reklassifizierung der HCV-Typen 7, 8, 9 und 11 in den
gemeinsamen Subtyp 6a sowie der Eingruppierung von 10a zu Genotyp 3 statt (Simmonds
et al., 1996). Genotypen unterscheiden sich in 31 % bis 33 % ihrer Nukleotidsequenz
voneinander, Subtypen in 20 % bis 25 % (Simmonds et al., 2005). Anhand der
Nukleotidsequenzen des kompletten offenen Leserahmens wurde von Simmonds et al.
(Simmonds et al., 2005) der Stammbaum der verschiedenen HCV Genotypen und
Subtypen erstellt (siehe Abbildung 2).
Abbildung 2: Stammbaum der HCV Geno- und Subtypen sowie deren geographische Verbreitung (Simmonds et al., 2005). Der Stammbaum ist aufgebaut auf den kompletten Sequenzen des offenen Leserahmens der verschiedenen HCV Genotypen.
Einleitung
5
1.1.4. Verbreitung
Das Hepatitis C Virus ist weltweit verbreitet, wobei ca. 3 % der Bevölkerung chronisch
mit dem Virus infiziert sind. Dabei sind, wie in Abbildung 3 ersichtlich, deutliche
regionale Unterschiede in der Durchseuchungsrate zu beobachten (Wasley & Alter, 2000).
Die Prävalenzraten reichen von 0,15 % in Skandinavien bis zu 44 % in Nordwest Ägypten
und Südkamerun. In Westeuropa, den USA, Indonesien und Japan liegen die
Prävalenzraten bei 0,2 - 2 %, in Südamerika und Asien bei 2,5 %. In den meisten
Afrikanischen Ländern liegt die Infektionsrate bei 5 % (Maertens & Stuyver, 1997). Die
einzelnen Genotypen sind weltweit unterschiedlich häufig zu finden. Genotyp 6 findet sich
beispielsweise fast ausschließlich in Vietnam, Genotyp 4 hauptsächlich in Ägypten und im
Nahen Osten. Genotyp 5 trat bisher lediglich in Südafrika auf. In Europa und den USA
findet sich am häufigsten der Genotyp 1, in Japan die Genotypen 1 und 2 (Dusheiko et al.,
1994). In Europa sind die Genotypen 1 und 3 am häufigsten vertreten, wobei Genotyp 3
vorwiegend bei Drogenabhängigen zu finden ist.
Abbildung 3: Hepatitis C Prävalenz. Quelle: WHO International Travel and Health 2003
1.1.5. Replikation
Aufgrund fehlender Zellkultursysteme und Tiermodelle ist der Replikationszyklus des
Hepatitis C Virus noch nicht vollständig bekannt. Auf der Basis verschiedener
Modellsysteme und den bekannten Replikationszyklen von Flaviviren und Pestiviren wird
die Replikation des Hepatitis C Virus wie in Abbildung 4 dargestellt vermutet.
Einleitung
6
Abbildung 4: Schematische Darstellung der HCV Replikation in Anlehnung an das Modell von Thomson & Liang (2000).
Als ein möglicher hepatozellulärer Rezeptor für das Hepatitis C Virus wurde das
Membranprotein CD81 identifiziert, da in vitro starke Wechselwirkungen zwischen CD81
und dem E2 festgestellt wurden (Bartosch et al., 2003; Lindenbach et al., 2005; Pileri et
al., 1998). Möglicherweise bindet das Hepatitis C Virus auch wie andere Vertreter der
Flaviviridae an den low-densitiy-lipoprotein (LDL) Rezeptor. Sowohl die Endozytose des
HCV-LDL-Rezeptorkomplexes als auch seine Inhibition durch einen Anti-LDL-Rezeptor-
Antikörper konnten in vitro bereits demonstriert werden (Major et al., 2001). Obwohl der
zelluläre Rezeptor für HCV bisher nicht eindeutig identifiziert werden konnte, ist die
Bedeutung des E2 unumstritten. Durch E2-spezifische Antikörper kann der Eintritt des
Virus in die Zelle verhindert werden (Rosa et al., 1996). Nach der Bindung an die
zelluläre Oberfläche wird das Virus mittels Endozytose aufgenommen. Durch Ansäuerung
des Endosoms verschmilzt die Endosomenmembran mit der Virushülle (uncoating). Das
HCV Genom wird direkt im Zytoplasma der Wirtszelle translatiert. Es ist nicht mit einer
Cap-Struktur versehen (Bartenschlager & Lohmann, 2000). Das HCV Genom besitzt eine
interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), welche die Translation am rauen
endoplasmatischen Retikulum vermittelt. An der Ausbildung eines Replikationskomplexes
sind alle Nicht-Strukturproteine des Virus beteiligt (Dimitrova et al., 2003). Es wird
zunächst ein Negativ-RNA-Strang produziert, der als Matritze für neue Plus-RNA-Stränge
Einleitung
7
dient. Die Hülle enthält das Virus durch Knospung vom endoplasmatischen Retikulum
(Bartenschlager & Lohmann, 2000).
1.1.6. Übertragungswege
Die Übertragung des Hepatitis C Virus erfolgt hauptsächlich durch Blut oder
Blutprodukte. Obwohl das Virus auch in diversen Körperflüssigkeiten nachweisbar ist,
schließen zahlreiche epidemiologische Studien eine Infektion durch Speichel, Schweiß,
Tränen, Sperma und Muttermilch nahezu aus (Schreier et al., 2003). Daher sind
intravenöse Injektionen (z.B. Drogenkonsum) oder Transfusionen die Hauptursache von
HCV Infektionen. Ein weiteres Infektionsrisiko geht von Organtransplantationen und
Dialysebehandlungen aus (Hepatitis C Ausbruch in der DDR 1978/79 (Roggendorf et al.,
2000)). In bis zu 30 % der HCV Infektionen lassen sich jedoch keine eindeutigen
Hinweise auf den Übertragungsweg feststellen (Hoofnagle, 1998). Der verbindliche HCV
Antikörpernachweis seit April 1991 für Vollblut und der HCV Genomnachweis mittels
Nukleinsäureamplifikation seit 1999 haben das Risiko bei Bluttransfusionen gesenkt
(Schreier & Höhne, 2001). Seit dem 1. Juli 1995 unterliegt außerdem nicht inaktiviertes
Plasma einer sechsmonatigen Quarantäne (Schreier et al., 2003). Nach dieser Zeit muss
der Spender erneut auf HCV getestet werden. Nur wenn dieser Test negativ ausfällt, darf
das tiefgefroren gelagerte Plasma als Frischplasma verwendet werden. Dadurch soll das
Restrisiko einer nicht erkannten Hepatitis C Infektion in der Fensterperiode minimiert
werden. Auch alle Organspender werden heute auf Hepatitis C Antikörper getestet.
1.1.7. Krankheitsbild und Therapie
Bei der Hepatitis C (griechisch hépar, hépatos = Leber, hépatitis = Leberentzündung)
handelt es sich um eine virale Leberinfektion, die zu Störungen der Leberzellen und deren
Organfunktion führen kann. Die Inkubationszeit des Hepatitis C Virus beträgt zwischen 3
und 12 Wochen. Innerhalb dieser Zeit ist der Infizierte symptomfrei. Die Ansteckung einer
weiteren Person ist jedoch bereits möglich. Bis zu 75 % der Infektionen verlaufen völlig
inapparent, lediglich bei einem kleinen Teil der Infizierten treten unspezifische Symptome
wie grippeähnliche Beschwerden, Müdigkeit oder Übelkeit auf. In ca. 25 % der
Erkrankungen tritt eine akute Gelbsucht auf. Bei der akuten Hepatitis C Infektion sind
schwere oder tödlich verlaufende Fälle selten (0,2 %). Das Risiko eines Übergangs in eine
Einleitung
8
chronische Hepatitis C Erkrankung liegt dagegen bei 50 bis 90 % (Wiese et al., 2000). Die
akute Hepatitis C ist durch negative Serologie und positive PCR gekennzeichnet.
Die chronische Hepatitis C ist durch positive Serologie, erhöhte Transaminasewerte und
positive PCR charakterisiert. Schätzungen des Center for Disease Control and Prevention
(CDC) zufolge entwickeln 20 - 50 % der chronisch infizierten Hepatitis C Patienten eine
Leberzirrhose, wobei sich die Leber verhärtet, schrumpft und in ihrer Funktionsfähigkeit
zunehmend eingeschränkt ist. Aus der Leberzirrhose entwickelt sich wiederum in 25 %
der Fälle ein Leberzellkarzinom (HCC) oder ein Leberversagen, welches eine
Lebertransplantation erfordert. Leberzellkarzinome entwickeln sich zum Teil erst nach
über 20 Jahren (Wiese et al., 2000).
Patienten mit einer akuten Hepatitis C haben gute Heilungschancen ohne zusätzliche
Behandlung. In einer Studie zeigte sich bei bis zu 52 % der Personen mit einer akuten
Hepatitis C innerhalb von 12 Wochen nach Ausbruch der Krankheit eine spontane
Viruselimierung. Dagegen entwickelten alle Hepatitis C Patienten ohne Symptome eine
chronische Hepatitis (Gerlach et al., 2003). Die Behandlung der chronischen Hepatitis C
erfolgt ab drei Monaten nach Ausbruch der Krankheit durch Interferon alpha (Protein mit
antiviraler Wirkung; Zytokin). Der Erfolg der Interferon-Monotherapie wird jedoch durch
Non-Responder (Patienten ohne Virusverringerung oder Eliminierung) und Rückfälle
herabgesetzt. Die Einführung der Kombinationstherapie von Interferon und Ribavirin
erhöhte die Therapieerfolge auf 30 – 40 %. Das Medikament Ribavirin ist unter den
Handelsnamen Copegus oder Rebetol erhältlich. Es handelt sich dabei um ein
Nukleosidanalogon mit virostatischer Wirkung. Gerade Patienten mit HCV Genotyp 1,
hoher Viruslast und ausgeprägter Fibrose oder Zirrhose reagierten deutlich besser auf die
Kombinationstherapie als auf Interferon-Monotherapie. Die heute eingesetzte
Kombinationstherapie aus pegyliertem Interferon und Ribavirin erreicht anhaltende
Therapieerfolgsraten von bis zu 60 % (Leung, 2002). Die Kopplung von Interferon an
Polyethylenglykol (= pegyliertes Interferon) bewirkt, dass die Interferonproteine eine
längere Verweildauer im Körper aufweisen. Pegyliertes Interferon ist unter dem
Handelsnamen PEGASYS erhältlich.
Eine standardisierte Therapiemethode für Patienten mit Hepatitis C existiert nicht.
Aufgrund der hohen Nebenwirkungen der Kombinationstherapie, fehlender Studien der
Ribavirinbehandlung bei Kindern oder der kontrainduzierenden Wirkung bei
Alkoholismus, Drogenabhängigkeit, Schilddrüsenfunktionsstörungen, Schwangerschaft
oder psychischen Erkrankungen muss die Behandlung individuell abgestimmt und
Einleitung
9
diskutiert werden. Für Patienten mit chronischer Hepatitis C wird generell eine Impfung
gegen Hepatitis A und B empfohlen, sofern noch keine spezifischen Antikörper dagegen
vorhanden sind (Schreier et al., 2003).
1.1.8. Diagnostik
Es existiert derzeit keine wirksame Schutzimpfung gegen das Hepatitis C Virus. Auch
eine überstandene Hepatitis C Infektion mit vollständiger Viruseliminierung stellt keinen
sicheren Schutz gegen eine erneute Infektion dar. Daher basieren alle Schutzmaßnahmen
auf der Vermeidung einer Ansteckung. Verschiedenste Tests werden verwendet, um
Patienten mit einer Hepatitis C zu erkennen und deren Therapieverläufe zu überwachen.
Serologische Tests wie Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (EIA) bzw. Enzyme
Linked Immunosorbent Assay (ELISA) werden zum Screening von Blutprodukten
eingesetzt (Urdea et al., 1997). Der ELISA wurde 1971 und 1972 von Engvall und
Perlmann beschrieben (Engvall & Perlman, 1971; Engvall & Perlmann, 1972). Diese
Tests basieren auf der Detektion von Hepatitis C Antikörpern im Serum, welche in nahezu
allen Patienten mit einer chronischen Hepatitis C vorkommen. Antikörper gegen das Core-
Protein lassen sich wenige Tage bis Wochen nach Beginn der Infektion nachweisen,
Antikörper gegen NS3, NS4 oder NS5 erst später (Modrow et al., 2003). Innerhalb der
Fensterperiode, d.h. der Zeit zwischen Ansteckung und dem Auftreten von Antikörpern,
fallen die Tests jedoch negativ aus. Zur Diagnose von Patienten mit einer akuten Hepatitis
C werden daher PCR Tests verwendet, welche das RNA Genom des Virus detektieren
(Major et al., 2001).
1.1.8.1. Serologischer Antikörper Test
Im Rahmen einer Studie wurde das erste HCV ELISA System entwickelt (Fa. Ortho-
Chemical Diagnostics, Rochester, NY). Es beruhte auf dem rekombinanten Polypeptid
c100-3, welches in Hefen exprimiert wurde. Das Polypeptid besteht aus 363
viruscodierenden Aminosäuren der NS4 Region (Cuthbert, 1994) und dient der Detektion
zirkulierender viraler Antikörper. Sowohl bei 80 % der Patienten mit chronischer, als auch
bei 15 % der Patienten mit einer akuten Hepatitis C konnten diese zirkulierenden
Antikörper nachgewiesen werden (Kuo et al., 1989), was jedoch weder hinsichtlich
Sensitivität noch Spezifität ausreichend war.
Einleitung
10
Im ORTHO HCV 2.0 ELISA wurden weitere Antikörper gegen das Hepatitis C Virus
detektiert. Der zusätzliche Nachweis des strukturellen Epitops c22-3 (Core-Region) und
des nichtstrukturellen Epitops c33-c (NS3-Region) bewirkten eine Sensitivitätssteigerung
in der Detektion sowohl einer chronischen als auch akuten Hepatitis C (Lazizi et al.,
1992). Im Vergleich zum ELISA der ersten Generation ermöglicht dieser ELISA der
zweiten Generation bereits einen Antikörpernachweis nach 6 statt 9 Wochen (Cuthbert,
1994).
Der ELISA der dritten Generation enthielt ein weiteres zusätzliches Antigen der
NS5-Region, was die Sensitivität nochmals steigerte. In den Assays aller drei
Generationen werden die rekombinanten Antigene als Fusionsprotein der Superoxid-
Dismutase in Saccharomyces cerevisiae exprimiert (Polywka et al., 2000).
Ein ergänzender Test zum Ausschluss falsch negativer ELISA Ergebnisse ist das
Recombinant Immunoblot Assay (RIBA) der Firma Chiron. In diesem System werden 5
synthetische Antigenpeptide der NS4-Region und 3 der Core-Region auf einem
Teststreifen gebunden, mit welchem das Patientenserum getestet wird (Urdea et al., 1997).
Auch das RIBA durchlief analog zum ELISA die drei Generationen der Entwicklung. Eine
Genotypisierung anhand des Recombinant Immunoblot Assay ist ebenfalls möglich
(Schroter et al., 1999).
Die serologischen Nachweisverfahren der dritten Generation sind hochsensitiv und
spezifisch (98 - 100 %). Für Dialysepatienten wird jedoch eine Absicherung negativer
Ergebnisse mittels qualitativem HCV RNA Nachweis angeraten (Colin et al., 2001).
1.1.8.2. Virologische PCR Tests zum Nachweis von HCV RNA
Zum Nachweis der HCV RNA unterscheidet man zwei Methoden: die reverse
Transkriptase PCR (RT-PCR) und den Nachweis mittels branched DNA (bDNA) Assay
(siehe Abbildung 5).
Die Technik der RT-PCR beruht auf der Isolation viraler RNA und deren reverse
Transkription in komplementäre DNA (cDNA). Spezifische Nukleinsäuresequenzen dieser
cDNA werden anschließend amplifiziert, detektiert und quantifiziert (Urdea et al., 1997).
Die Detektion kann unter anderem durch konventionelle PCR mit anschließender
Agarosegelelektrophorese oder durch real time PCR (siehe Kapitel 1.3.3) erfolgen. Nur
bei negativer PCR ist ein zusätzlicher Antikörpertest notwendig. Fällt dieser positiv aus,
liegt eine ausgeheilte Hepatitis C vor (siehe 1.1.8). Zu den kommerziell erhältlichen HCV
Einleitung
11
PCR Nachweissystemen zählen das AMPLICOR HCV Monitor Assay der Firma Roche
Diagnostics (Major et al., 2001; Schroter et al., 2001) und das TM Versant HCV RNA
Assay der Bayer Corporation.
Bei der Technik der bDNA wird das Signal durch verzweigte DNA (engl. branched DNA)
verstärkt und nicht durch die Zielsequenz selbst. Eine der HCV RNA komplementäre
Sonde wird zunächst an das RNA Genom gebunden. An diese Sonde wird eine zweite
Sonde gebunden, welche viele Abzweigungen (engl. branches) mit Reportermolekülen
enthält. Diese Reportermoleküle ermöglichen die Detektion und Quantifizierung der HCV
RNA. Die bDNA Assays sind weniger sensitiv als die RT-PCR Systeme. Zu den
kommerziell erhältlichen bDNA Tests zählen die Versant HCV RNA Assays der Bayer
Corporation (http://www.mediwiss.de/Tests.htm, (Elbeik et al., 2004)).
Abbildung 5: Darstellung von branched DNA Assay und reverser Transkriptase PCR zur Detektion und Quantifizierung von HCV RNA (Quelle: Urdea et al., 1997)
1.1.9. Hepatitis C Virus in Zellkultur
Um die Replikation des Hepatitis C Virus, Wirtszell-Virus-Interaktionen oder mögliche
HCV-Therapieansätze genauer untersuchen zu können, ist ein effizientes Zellkultursystem
nötig. Bis vor kurzem war es nicht möglich, Hepatitis C Viren in Zellkultur zu züchten.
Um Informationen über den Verlauf von HCV Infektionen zu erhalten, wurden infizierte
Patienten (Lechner et al., 2000) oder experimentell infizierte Schimpansen (Thimme et al.,
2002) in die Studien einbezogen. Die heutigen Systeme zur Replikation viraler HCV RNA
in Zellkultur basieren auf Replikons. 1999 entwickelte Lohmann et al. auf der Grundlage
subgenomischer RNA das erste HCV Replikon (Lohmann et al., 1999). Dieses enthielt
Einleitung
12
zunächst nur die RNA der Nicht-Strukturproteine des HCV Genotyps 1 aus der Leber
eines chronisch infizierten Patienten. Die Replikationsrate der Replikons war sehr gering
und wurde durch verschiedene Mutationen in fast allen Nicht-Strukturproteinen erhöht
(Lohmann et al., 2001). Bis heute replizieren die hinsichtlich ihres Wachstums in
Zellkultur veränderten HCV Replikons nur effizient in der humanen Hepatomazelllinie
Huh7 (Bartenschlager et al., 2003). 2003 wurde zwar die Etablierung der HCV Replikons
in Hela-Zellen (Gebärmutterhalskrebszelllinie) und in Hepa1-6-Zellen (Maus-
Krebszelllinie) beschrieben (Zhu et al., 2003), jedoch enthielten auch diese Replikons
adaptive Mutationen in den NS4A- und NS4B-Genregionen. Durch zahlreiche adaptive
Mutationen in den Sequenzen von NS3, NS4B, NS5A und NS5B wurde die Effizienz der
ersten Replikonsysteme in Huh7-Zellen im Laufe der Zeit deutlich verbessert (Lohmann et
al., 2003), die HCV Sequenzen jedoch immer weiter von der natürlichen vorkommenden
HCV RNA entfernt. Experimente mit HCV Replikons müssen daher nicht einer Infektion
mit natürlichen Isolaten entsprechen.
2001 isolierten Kato et al. den hochinfektiösen HCV Stamm JFH-1 aus einem Patienten
mit einer fulminanten Hepatitis C (Kato et al., 2001). Die fulminante Hepatitis ist eine
seltene Ausnahme bei der HCV Infektion. Im Verlauf der fulminanten Hepatitis C
Infektion kommt es innerhalb kürzester Zeit zu einer dramatischen Verschlechterung des
Allgemeinzustandes bis hin zum Versagen der Leberfunktion. In der akuten Phase wurde
der Patient im Serum PCR positiv getestet, nach Auftreten von HCV Antikörpern negativ.
Phylogenetisch wurde JFH-1 als Subtyp 2a klassifizert, unterschied sich jedoch in 5’UTR,
Core, NS3 und NS5A deutlich zu den bisher bekannten Subtyp 2a Hepatitis C Viren. Im
subgenomischen Replikon replizierte diese RNA ohne anpassende Mutationen sehr
effizient in Zellkultur. 2005 wurden nach Transfektion der full length RNA von
JFH-1 in Huh7-Zellen die RNA repliziert und neue virale Partikel produziert (Kato &
Wakita, 2005). Mit Hilfe dieses Systems kann der gesamte Ablauf einer HCV Infektion
vom Viruseintritt bis hin zur Bildung neuer infektiöser Viruspartikel betrachtet werden.
Lindenbach et al. zeigten, dass die Virusnachkommen aus dem JFH-1-Replikon mit Hilfe
von Antikörpern gegen das Glykoprotein E2 neutralisiert werden (Lindenbach et al.,
2005). Sie zeigten weiterhin, dass die Virusreplikation unter anderem durch Interferon
alpha gehemmt wird.
Die Replikation des Hepatitis C Virus gelang bis heute jedoch nur in Huh7-Zellen und nur
mit dem HCV Stamm JFH-1. Es ist daher anzunehmen, dass diese Zellen eine bestimmte
Eigenschaft besitzen, welche die Replikation der HCV RNA ermöglicht. Bartenschlager et
Einleitung
13
al. vermuten die besondere Eignung der Huh7-Zellen für HCV-Replikationen in einem
Defekt der Zellen, auf doppelsträngige RNA zu reagieren (Bartenschlager et al., 2003).
Verschiedene Versuche weisen zwar auf mögliche Defekte der Zellen im Signalweg für
dsRNA hin, diese konnten jedoch nicht genauer charakterisiert werden (Cheng et al.,
2006; Lanford et al., 2003). Was diese Zellen für die HCV Replikonsysteme präferiert ist
damit nicht bekannt. Da alle Replikonsysteme aktiv in die Zelle gebracht werden müssen
(Transfektion), ist die Analyse des Zelleintritts weiterhin nur begrenzt möglich. Die
effiziente Replikation von JFH-1 verläuft wie die der Replikons nur in Huh7-Zellen.
Jedoch liefert JFH-1 die Möglichkeit, HCV Infektionen vom Viruseintritt bis hin zum
Virusaustritt zu untersuchen. Problematisch ist, dass JFH-1 zum Subtypen 2a gehört,
jedoch zu allen bekannten 2a Sequenzen deutliche Unterschiede aufweist. Erkenntnisse
durch Infektionen mit JFH-1 beziehen sich nur auf diesen speziellen, extrem virulenten
Virusstamm und können nicht unbedingt generalisiert werden. Es ist weiterhin nicht
möglich, natürliche Isolate aller Subtypen in Zellkultur anzuziehen. Die klinische
Relevanz liegt aufgrund seiner weltweiten Verbreitung und der schlechteren Reaktion auf
die Interferon-Therapie bei Genotyp 1. Subtypenspezifische Erkenntnisse sind bisher nur
durch Versuche entsprechender Replikons möglich. Die Korrelation experimenteller
Ergebnisse mit einer natürlichen Infektion kann nicht unbedingt vorausgesetzt werden.
Noch immer ist unklar, warum JFH-1 als einziges Isolat so infektiös ist. Die Unterschiede
in den Genomanalysen von JFH-1 und anderen Isolaten könnten erklären, warum einige
HCV Stämme unkultivierbar sind.
1.2. Unspezifische Immunabwehr
Die unspezifische Immunabwehr wird auch als natürliches oder angeborenes
Immunsystem bezeichnet. Sie besteht aus einer Vielzahl löslicher Stoffe, den Zytokinen.
Diese können zum einen Fremdstoffe (Erreger) direkt abwehren oder durch ihre Bindung
an Zellen Proliferation, Differenzierung und Apoptose auslösen. Zu den Zytokinen
gehören u.a. Interferone, Interleukine und der Tumor-Nekrose-Faktor. Die Interferone
wurden 1957 als antiviral wirkende Substanzen erstmals durch Isaacs und Lindenmann
beschrieben (Lindenmann & Isaacs, 1957). Sie können von den Zelltypen Fibroblasten, T-
Lymphozyten und Makrophagen produziert werden. Interferone werden in die Gruppen
Typ I und Typ II Interferone eingeteilt. Die Typ I Interferone werden auch virale
Interferone genannt, da sie durch virale Infektionen induziert werden. Zu ihnen zählen
Einleitung
14
unter anderem die Interferone α (Leukozyteninterferon) und β (Fibroblasteninterferon).
Das Typ II Interferon genannte Interferon γ wird als Immun-Interferon bezeichnet und
durch Mitogen- oder Antigenstimulierte T-Lymphozyten produziert (Samuel, 2001). Die
Produktion von Interferon α und β stellt eine frühe Reaktion der Zelle dar und besitzt
daher eine Schlüsselrolle in der viralen Abwehr.
Ein entscheidendes intrazelluläres Signal zur Produktion von Interferon ist das
Vorhandensein von doppelsträngiger RNA (dsRNA). Gesunde Zellen enthalten
normalerweise keine dsRNA, welche jedoch während vielen viralen Infektionen gebildet
wird (Biron, 1998). Die Anwesenheit von dsRNA führt in der Zelle zur Transkription und
Translation von Interferonen. Interferone agieren nicht direkt mit dem Virus, sondern
induzieren die Synthese von Proteinen, welche den antiviralen Status der Zelle vermitteln.
Interferone können zum einen die Expression der RNA abhängigen Proteinkinase (PKR),
zum anderen das 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System (OAS) stimulieren (Dougherty et
al., 1981). Die Expression der PKR wird vorwiegend durch Interferon α und β stimuliert.
Nach Bindung der PKR an dsRNA kommt es intrazellulär zur Aktivierung der PKR durch
Autophosphorylierung. Die aktivierte Proteinkinase phosphoryliert den eukaryontischen
Initiationsfaktor 2 (IF-2) der Proteinbiosynthese. IF-2 hat die Aufgabe, Met-tRNA zur 40S
Untereinheit des Ribosoms zu transportieren und dadurch die Translation zu initiieren.
Dabei wird jeweils an IF-2 gebundenes GDP durch GTP ausgetauscht. Durch die
Phosphorylierung des IF-2 entsteht ein inaktiver Komplex aus IF-2 und GDP, wodurch die
Translation gehemmt wird. Es scheint jedoch eine relative Selektivität für die Hemmung
der viralen Translation zu bestehen (Zeuzem et al., 2001).
1.2.1. 2’- 5’Oligoadenylatsynthetase-System und RNase L
Das RNase L System oder OAS ist neben der Hemmung der Proteinsynthese durch die
PKR ein wichtiger antiviraler Signalweg und setzt sich aus den drei folgenden
enzymatischen Aktivitäten zusammen: der Oligadenylatsynthetase, der
2’-5’-Phosphodiesterase und der RNase L (siehe Abbildung 6). Während Interferon die
Expression der Oligoadenylatsynthetase erhöht, ist dsRNA als Kofaktor für die
Aktivierung der Synthetase erforderlich (Han & Barton, 2002). Die OAS katalysiert die
Polymerisierung von ATP zu 2’-5’Oligoadenylaten (OA). Diese 2’-5’Oligoadenylate
aktivieren das Hauptenzym des 2’-5’OAS - die 2’-5’Oligoadenylatabhängige
Endoribonuclease L oder RNase L (Bisbal et al., 1995).
Einleitung
15
Abbildung 6: schematische Darstellung des 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System
Die RNase L wurde 1979 von Slattery als 185 kDa großes Protein mit einem
isoelektrischen Punkt von 5.5 beschrieben, wobei das Molekulargewicht durch die
Analysemethoden, Proteinkonzentrationen oder die Herkunft der Zellextrakte stark
schwanken kann (Slattery et al., 1979). Das Enzym kann mit nanomolaren Mengen von
2’-5’Oligoadenylate mit Kettenlängen von drei bis vier Adenylaten reversibel aktiviert
werden. Diadenylaten scheint die Fähigkeit der RNase L Aktivierung zu fehlen
(Dougherty et al., 1981). 1993 wurde ein 80 kDa großes Polypeptid kloniert, welches
2’-5’Oligoadenylate binden und RNA spalten kann (Zhou et al., 1993). Ein monoklonaler
Antikörper, welcher dieses 80 kDa Protein erkennt, neutralisiert die RNase L Aktivität
(Bisbal et al., 1995). Die Arbeitsgruppe um C. Bisbal vermutete, dass es sich bei dem
185 kDa großen Protein, welches Slattery als RNase L beschrieben hatte, um einen
Proteinkomplex aus mehreren Polypeptiden handelt.
Die RNase L wird durch ein einzelnes Gen kodiert und konstitutiv in den Zellen
exprimiert. Das latent vorliegende Enzym wird nicht durch Interferon reguliert (Player &
Torrence, 1998). An der reversiblen Aktivierung scheint die Bindung von
2’-5’Oligoadenylaten beteiligt zu sein. In Abwesenheit von 2’-5’Oligoadenylaten liegt die
RNase L als Monomer und inaktiv vor (Han & Barton, 2002). Nach der Bindung von
Einleitung
16
2’-5’Oligoadenylaten dimerisieren die Monomere, was zur Aktivierung des Enzyms führt
(Cole et al., 1997). Die aktive RNase L spaltet virale RNA hauptsächlich an den 3’Enden
von UA, UG oder UU Sequenzen in Regionen ohne Wasserstroffbrückenbindung
(Dougherty et al., 1981). Die 2’-5’Phosphodiesterase baut 2’-5’Oligoadenylate zu ATP
und AMP ab (Han & Barton, 2002), wodurch die Aktivität der RNase L reguliert wird.
Die Regulation der RNase L erfolgt sowohl durch die 2’-5’Phosphodiesterase als auch mit
Hilfe des RNase L Inhibitors (Benoit De Coignac et al., 1998).
1.2.2. RNase L Inhibitor (RLI)
1995 charakterisierten und klonierten Bisbal et al. ein Polypeptid, welches die RNase L
inhibiert (Bisbal et al., 1995). Dieses Polypeptid wurde RNase L Inhibitor (RLI) genannt.
Das Protein besitzt eine Größe von 68 kDA und bindet spezifisch an die RNase L.
Sequenzanalysen des RLI zeigen, dass die cDNA aus einer 5’ nicht kodierten Region von
118 Nukleotiden besteht, sowie einem ORF bis zu Nukleotid 1914 und einer 3’ nicht
translatierten Region von 1654 bp. In der Zelle existieren zwei RLI mRNAs verschiedener
Längen. Die mRNAs von 2.8 kb bzw. 3.5 kb unterscheiden sich lediglich in der Länge
ihrer 3’ nicht translatierten Region, kodieren jedoch für das gleiche RLI-Protein (Aubry et
al., 1996). Möglicherweise ist die 3’-UTR durch ihre Sekundärstruktur und Protein-RNA-
Interaktion an der Stabilität der mRNA beteiligt. Die biologische Relevanz der beiden
mRNAs ist nicht erforscht (Bisbal et al., 1995). Es wird angenommen, dass das RLI als
Regulatorprotein dient, welches die Bindung von 2’-5’Oligoadenylaten an die RNase L
inhibiert. Dabei geht das RLI möglicherweise eine direkte Verbindung mit der RNase L
ein, um die Bindungsstellen der OA zu blockieren (siehe Abbildung 6). Das RLI fördert
weder den Abbau der 2’-5’Oligoadenylate noch ist es selbst daran beteiligt (Bisbal et al.,
2001).
In Zellkulturversuchen mit dem Enzephalomyokarditis Virus (EMCV) wurde eine
verminderte Aktivität der RNase L detektiert (Cayley et al., 1982). Diese Inhibition
könnte das Resultat einer erhöhten RLI-Expression während der EMCV Infektion sein.
Western-Blot-Analysen der RNase L während der EMCV Infektion zeigten keine
verringerten Mengen an RNase L-Protein, während bereits 4 Stunden nach Infektion
gesteigerte Mengen RLI-Protein nachweisbar waren. Die stabile Transfektion eines RLI-
Antisense-Kontrukts führte zur Hemmung der RLI Inhibition und RNase L Inaktivierung
Einleitung
17
(Martinand et al., 1998). Das EMC-Virus scheint die Produktion des RLI-Proteins aktiv zu
steigern und dadurch die Aktivierung der RNase L zu hemmen.
Auch für das HI-Virus wurde ein Einfluss auf die Expression des RLI beschrieben
(Martinand et al., 1999). In Infektionsversuchen mit HIV in Zellkultur wurden erhöhte
Mengen an RLI-Protein nachgewiesen (Martinand et al., 1999). Strukturanalysen des
Proteins lassen vermuten, dass das RLI als ein ATP-angetriebenes Enzym an der
ribosomalen Biogenese und dem HIV Zusammenbau beteiligt ist (Karcher et al., 2005). In
klinischen Studien wurde ebenfalls festgestellt, dass die RNase L in Blutzellen von AIDS
Patienten inaktiv ist, obwohl 2’-5’Oligoadenylate als Aktivatoren der RNase L vorhanden
sind (Carter et al., 1987). Diese Hemmung der Aktivität der RNase L könnte auf das RLI
zurückzuführen sein.
In klinischen Studien mit Leberbiopsiematerial chronischer Hepatitis C Patienten wurde
dagegen eine signifikante Reduktion der Expression des RNase L Inhibitors festgestellt
(Yu et al., 2000). Es könnte daher eventuell ein Einfluss des RLI und der RNase L auf die
HCV Infektion vorliegen. Möglicherweise führt eine Reduktion des RLI durch die
Replikation des Hepatitis C Virus zu einer Aktivität der RNase L. Ein Gleichgewicht
zwischen Virusreplikation und RNase L-Aktivität könnte möglicherweise zur Ausbildung
der chronischen Hepatitis führen.
Für das Hepatitis C Virus wurden noch keine Zellkulturversuche unter Betrachtung des
RLI durchgeführt. Die Transkriptionsraten des RLI unter den experimentellen
Bedingungen der HCV Infektion sollten im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert
werden. Die experimentelle Überexpression des RLI sollte eine potentielle Aktivierung
der RNase L verhindern und eine initiale Replikation des Virus in Zellkultur ermöglichen.
1.3. Polymerase Kettenreaktion
1.3.1. Historisches
Bereits 1971 führte der Norweger Kjell Kleppe Versuche zur Vervielfältigung von DNA
mit Hilfe von Primern durch, welche jedoch nicht weiter verfolgt wurden (Kleppe et al.,
1971). 1982 wurde die eigentliche Polymerase Kettenreaktion (PCR) von Kary Mullis
erfunden, der 1993 für diese Technik den Nobelpreis erhielt. Mullis verwendete zunächst
eine DNA Polymerase, welche bei jedem Denaturierungsschritt zerstört und anschließend
neu hinzugefügt werden musste. Später wurde eine hitzestabile Polymerase aus
Einleitung
18
Thermophilus aquaticus (Taq) eingesetzt, wodurch die PCR deutlich vereinfacht werden
konnte. Kary Mullis arbeitete für die Firma Cetus Corporation, welche 1992 die Technik
sowie das Patent der Taq-Polymerase an die Firma Roche für 300 Millionen Dollar
verkaufte (Mullis, 1998). Sowohl in den USA als auch vor dem Europäischen Gerichtshof
wurde der Firma Hoffmann-La Roche das Patent für die hitzestabile Taq-Polymerase
wieder aberkannt, da die Polymerase aus Thermophilus aquaticus bereits 1980
beschrieben wurde (Kaledin et al., 1980). Das US-Patent für die eigentliche Technik der
PCR lief am 28. März 2005 aus.
1.3.2. Prinzip der PCR
Die PCR ist ein in vitro Verfahren zur selektiven Amplifikation von DNA-Bereichen
definierter Länge, die von zwei bekannten Sequenzen flankiert werden. Das
Originalprotokoll der PCR wurde 1985 in der Zeitschrift Science veröffentlicht. Saiki et
al. beschreiben in dieser Arbeit die Vervielfältigung des β-Globin Gens, welches zur
Diagnostik der Sichelzellanämie verwendet wurde (Saiki et al., 1985).
Das Prinzip der PCR basiert auf der Verdopplung der DNA. Jeder PCR-Zyklus setzt sich
aus drei Teilschritten mit verschiedenen Temperaturen zusammen, welche in mehreren
Zyklen wiederholt werden (siehe Abbildung 7).
Abbildung 7: Schematische Darstellung der PCR
Im ersten Schritt erfolgt die Auftrennung der Doppelstränge bei 90°C - 95°C in
Einzelstränge (Denaturierung). Beim zweiten PCR-Schritt hybridisieren spezifische
Einleitung
19
Primer bei 55°C - 65°C an die Einzelstränge (Annealing). Eine Taq-Polymerase
vervollständigt im dritten Schritt bei 72°C den neuen Doppelstrang (Amplifikation). Der
entstandene Doppelstrang wird im nächsten Zyklus zum Ausgangsmaterial. Durch die
mehrfache Wiederholung der Reaktionsfolge von Denaturierung, Hybridisierung und
Amplifikation kommt es in jedem Zyklus zu einer Verdoppelung der DNA. Nach n
Zyklen sollte die gesuchte DNA theoretisch 2n-fach vervielfacht worden sein. Die
Effizienz der PCR ist von Matrize zu Matrize unterschiedlich und vom Optimierungsstatus
der Methode abhängig.
1.3.3. Real time PCR
Die real time PCR basiert auf dem Prinzip der Polymerasekettenreaktion und wurde 1992
von Higuchi et al. entwickelt (Higuchi et al., 1992). Konventionelle PCRs detektieren die
Amplifikationsprodukte am Ende der Kettenreaktion z.B. mittels Gelelektrophorese,
während die real time PCR die Menge der Amplifikate innerhalb der exponentiellen Phase
bestimmt. Der Einsatz interkalierender Farbstoffe oder fluoreszenzmarkierter Sonden
ermöglicht die direkte Beobachtung des Reaktionsverlaufes. Dadurch ist in der real time
PCR eine Quantifizierung des Ausgangsmaterials möglich. Die Quantifizierung basiert auf
der Grundlage, dass eine quantitative Beziehung zwischen der Menge des
Ausgangsmaterials und der Menge des Amplifikates während der exponentiellen Phase
besteht (Bustin, 2004). Nach n Zyklen sollte die gesuchte DNA 2n-fach vervielfacht
worden sein, vorausgesetzt die Ausbeute beträgt in jedem Zyklus 100 %.
Zu Beginn der Reaktion liegt der Farbstoff nicht-fluoreszierend vor oder fluoresziert nur
so schwach, dass das Signal nicht vom Hintergrund unterschieden werden kann (Kubista
et al., 2006). Die Fluoreszenz nimmt proportional zur Menge der PCR-Produkte zu (siehe
Abbildung 8 und Abbildung 9). Entscheidend für die Quantifizierung ist der cycle
threshold oder auch crossing point (ct – oder cp Wert). Dieser Wert beschreibt den Zyklus,
in dem die Fluoreszenz erstmals die Hintergrund-Fluoreszenz übersteigt. Die Berechnung
der eingesetzten DNA-Menge mit Hilfe einer Standardreihe sowie die Berechnung der
PCR-Effizienz werden in Kapitel 2.2.1.4 beschrieben.
Vorteile der real time PCR sind die schnelle Durchführbarkeit, der Nachweis der
Amplifikation in Echtzeit und die Quantifizierung des Ausgangsmaterials durch eine
mitgeführte Standardreihe. Das kleine Reaktionsvolumen in verschlossenen
Einleitung
20
Reaktionsgefäßen vermindert außerdem die Kontaminationsgefahr. Verglichen mit
ELISA’s sind real time PCRs ebenso spezifisch und sensitiv (Klein et al., 2003).
1.3.4. Fluoreszenzfarbstoffe
Die Detektion der Amplifikate kann in der real time PCR mit Hilfe sequenz-
unspezifischer Farbstoffe (siehe Abbildung 8) oder sequenz-spezifischer Sonden (siehe
Abbildung 9) erfolgen. Zu den sequenz-unspezifischen Farbstoffen zählen
Ethidiumbromid und SybrGreen. Diese Farbstoffe interkalieren zwischen den
Basenpaaren der DNA, wodurch nach Anregung mit ultraviolettem Licht die PCR-
Amplifikate fluoreszieren. Ein Nachteil interkalierender Substanzen wie Ethidiumbromid
oder SybrGreen ist die geringe Spezifität, da zwischen verschiedenen PCR-Produkten
nicht unterschieden werden kann. Es werden sowohl spezifische als auch unspezifische
Amplifikate detektiert. Aus diesem Grund sind auch Multiplex-Reaktionen (Nachweis
verschiedener spezifischer Templates in einem PCR Reaktionsansatz) mit Hilfe
interkalierender Substanzen nicht möglich.
Abbildung 8: Sequenz-unabhängige Fluoreszenzfarbstoffe. Interkalierung von SybrGreen in doppelsträngige DNA
Spezifische Sonden sind teurer als interkalierende Farbstoffe, gewährleisten jedoch die
nötige Spezifität und ermöglichen Multiplex-PCR Analysen. Es existieren verschiedene
Sondenformate, z.B. HyProbes, TaqMan-Sonden, Molecular Beacons oder MGB Sonden
(Eurogentec, 2004; Kubista et al., 2006). Da in dieser Arbeit lediglich TaqMan-Sonden
verwendet wurden, sollen nur diese kurz erläutert werden (siehe Abbildung 9). TaqMan-
Sonden, auch Hydrolyse-Sonden genannt, sind sequenzspezifische Oligonukleotide,
welche an einem Ende mit einem sogenannten Quencher-Farbstoff (z.B. BHQ oder
Einleitung
21
Tamra), am anderen Ende mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff markiert sind (z.B.
Fam oder Joe). Durch die räumliche Nähe des Quenchers zum Farbstoff wird keine
Fluoreszenz detektiert. Während der Amplifikation wird die Sonde durch die
Endonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase stückchenweise abgebaut. Dadurch werden
Quencher und Fluoreszenzfarbstoff voneinander getrennt. Die Wirkung des Quenchers
zum Farbstoff wird aufgehoben und ein Anstieg der Fluoreszenz gemessen.
Abbildung 9: Sequenzspezifische TaqMan Sonde. Die Trennung von Fluorophor und Quencher durch Hydrolyse der Sonde führt zur Entstehung von Fluoreszenz.
1.3.5. ABI PRISM™ Systeme
Die ABI PRISM™ Systeme, auch TaqMan genannt, der Firma Applied Biosystems
verwenden 0,2 ml tubes (Reaktionsgefäße) oder 96-well-Platten. Die Beleuchtung der
Proben erfolgt in allen Geräten mit Hilfe einer Wolframlampe durch einen einzelnen
Anregungsfilter (siehe Abbildung 11). Die Detektion der Fluoreszenz erfolgt mittels
Spektograph und einer gekühlten CCD Kamera. Die Laser- oder Halogen-basierenden
ABI Systeme sind lediglich zur Detektion von TaqMan oder SybrGreen Chemie
entwickelt worden (Bustin, 2004).
Der TaqMan 7900HT (siehe Abbildung 10) gehört zur zweiten Generation der real time
Systeme von Applied Biosystems. Es ist das einzige Gerät, welches sowohl 96- als auch
384-well-Platten verwenden kann. Außerdem ist es möglich, die Beladung des Geräts
Einleitung
22
vollautomatisch durchführen zu lassen. Ein Laser scannt die wells der Reaktionsplatte und
regt alle Farbstoffe mit einer kontinuierlichen Wellenlänge von 500 bis 660 nm an.
(http://keck.med.yale.edu/affymetrix/rtpcr/quantitative/7900HTbrochure.pdf)
Abbildung 10: TaqMan 7900HT Abbildung 11: Optisches System des ABI PRISM™ 7700
1.3.6. RotorGene™
Der RotorGene™ der Firma Corbett Research (siehe Abbildung 12) unterscheidet sich
hauptsächlich durch sein rotierendes Probenkarussel von anderen real time PCR
Systemen.
Abbildung 12: RotorGene™ 3000 (Quelle: Operator Manual)
Abbildung 13: Querschnitt der Reaktionskammer des RotorGene™ 6000 (Quelle: Operator Manual)
Einleitung
23
Das Gerät verwendet entweder einen 32er Rotor für 0,2 ml PCR-Gefäße oder einen 72er
Rotor für spezielle 0,1 ml tubes. Alle Reaktionsgefäße rotieren mit ca. 500 rpm durch eine
luftgefüllte Kammer (Bustin, 2004). Temperaturunterschiede zwischen den einzelnen
Reaktionsgefäßen (edge effect), wie sie bei Plattensystemen vorkommen, treten im
RotorGene nicht auf. Zur Anregung und Detektion der Fluoreszenz bewegen sich alle
tubes über die gleiche Optik, wodurch eine Kalibrierung unnötig ist (siehe Abbildung 13).
Auch eine passive Referenz wie beispielsweise ROX ist aus diesem Grund nicht nötig
(http://www.corbettlifescience.com/shared/images/flash/rotor-gene_brochure_
a4_72dpi.pdf). Der RotorGene kann jede derzeitig verfügbare real time Sondenchemie
detektieren. Dabei verwendet das Gerät vier LEDs, welche die Farbstoffe mit den
Wellenlängen 470, 530, 585 und 625 nm anregen können. Der Detektionsfilter besitzt 6
Filter zwischen 510 und 660 nm (Bustin, 2004).
Einleitung
24
1.4. Ziel der Arbeit
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine initiale Replikation des Hepatitis C Virus in
Zellkultur zu ermöglichen. Hauptaspekt war dabei, die eingesetzte virale RNA nicht zu
verändern. In der Annahme, dass bei der HCV Infektion oder Transfektion von full length
RNA doppelsträngige Intermediate entstehen, welche die zelluläre RNase L über den
OAS-Weg aktivieren, sollte diese mit Hilfe der Überexpression des RLI ausgeschaltet
werden. Aktive RNase L degradiert doppelsträngige RNA und verhindert dadurch die
virale Replikation.
Es sollten Huh7- und FRhK-4-Zellen werden. Humane Leberzellen (Huh7) sind die
natürlichen Wirtszellen des Hepatitis C Virus und die Zellen, in denen HCV Replikons
und JFH-1 bereits effizient replizieren. Für Klone von FRhK-4-Zellen, welche mit dem
RLI transfiziert wurden, konnte in einer Diplomarbeit der Universität Bremen ein
gesteigertes HAV Wachstum beobachtet werden (Gotter, 1999). HAV ist wie das
Hepatitis C Virus ein einzelsträngiges RNA Virus in Plusstrangorientierung. Es sollte
analysiert werden, ob die Zelleigenschaft der FRhK-4-Klone auch auf die Replikation des
Hepatitis C Virus einen positiven Einfluß ausübt.
Der RNase L Inhibitor sollte aus humaner- und Affen-gesamt-Zell-RNA amplifiziert und
in einen Transfektionsvektor kloniert werden. Nach Transfektion in FRhK-4- und Huh7-
Zellen sollte die Expressionsrate mittels real time PCR nachgewiesen werden. Für den
Nachweis auf Genexpressionsebene sollten zunächst real time PCRs für die Analyse der
mRNAs von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA entwickelt werden. Es
sollte versucht werden, Transfektanten von Huh7- und FRhK-4-Zellen heranzuziehen,
welche das RLI stabil überexprimieren. Diese Zellen sollten mit HCV-positivem und
infektiösem Frischplasma infiziert werden. Zur Umgehung des kritischen Viruseintritts in
die Zellen sollte HCV full length RNA transfiziert werden. Zur Analyse der HCV RNA
sollte auf Basis eines existierenden HCV Primer- und Sondensystems der Firma QIAGEN
Hamburg GmbH (ehemals artus GmbH) ein neues real time RT-PCR System entwickelt
und optimiert werden. Aufgrund qualitativer Schwankungen verwendeter Enzyme im
bestehenden HCV Nachweissystem sollte eine Umstellung der Puffer und Enzyme
erfolgen. Hinsichtlich einer potentiellen kommerziellen Nutzung des HCV Assays waren
neben Spezifität und Sensitivität die Herstellungskosten des Systems ebenfalls Kriterium
der Neuentwicklung.
Material und Methoden
25
2. Material und Methoden
2.1. Materialien
2.1.1. Antikörper
Anti His(C-term)-FITC Antibody, Invitrogen, Karlsruhe, Catalog no. R933-25
2.1.2. Bioreagenzien
Alkalische Phosphatase Roche, Mannheim
Agarose analytical grade Gibco, Karlsruhe
β-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt
CIP-Puffer (Dephosphorylation buffer) Roche, Mannheim
DMEM Sigma, Deisenhofen
DNA-Marker, 100 bp MBI Fermentas, St. Leon-Roth
DNA-Marker, 1 kb MBI Fermentas, St. Leon-Roth
DNA-Marker, 100 bp ladder plus MBI Fermentas, St. Leon-Roth
DNA-Marker, Hyperladder V Bioline, USA
DNA-Marker, 1 kb Invitrogen, Karlsruhe
DNase I QIAGEN, Hilden
Ethanol p.a. Carl Roth, Karlsruhe
Ethidiumbromid Merck, Darmstadt
FCS Gibco, Karlsruhe
FuGene 6 Transfection Reagent Roche, Mannheim
Geneticin (G418) Gibco, Karlsruhe
Glycerol p.a. Roth, Karlsruhe
ISIS DNA Polymerase™ 5U/μ l QBiogene, USA
LB-Agar (Lennox L Agar) Invitrogen, Karlsruhe
LB Broth Base (Lennox Broth Base) Invitrogen, Karlsruhe
L-Glutamin Sigma, Deisenhofen
MgSO4 1M Sigma, Deisenhofen
NaHCO3 Sigma, Deisenhofen
Material und Methoden
26
Penicillin10000 U/ml /Streptomycin 10mg/ml Gibco, Karlsruhe
Platinum® Taq DNA Polymerase 5U/μ l Invitrogen, Karlsruhe
Pu3-5x-PCR-Puffer QIAGEN, Hamburg
Takara Taq HS 5U/μ l Takara, Japan
TaqMan® 2x Universal PCR Master Mix (ABI 2x Puffer) Applied Biosystem, USA
Tetrazyklinhydrochlorid Sigma, Deisenhofen
Trypsin-EDTA (2,5 mg/ml Trypsin + 1,25 mg/ml EDTA) Sigma, Deisenhofen
jetPEI QBiogene, USA
human liver total RNA Ambion, Austin / USA
human kidney total RNA Ambion, Austin / USA
2.1.3. Gebrauchsfertige Kits
Endofree Plasmid Maxi Kit QIAGEN, Hilden
MEGAscript® High Yield Transcription Kit Ambion, Austin / USA
NucleoSpin® Plasmid Kit Machery-Nagel, Düren
pcDNA3.1/V5-His© TOPO® TA Expression Kit Invitrogen, Karlsruhe
Rapid DNA Ligation Kit MBI Fermentas, St. Leon-Roth
RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit MBI Fermentas, St. Leon-Roth
RNeasy® Mini Kit QIAGEN, Hilden
QIAamp®Viral RNA Mini Kit QIAGEN, Hilden
QIAGEN® Plasmid Mini Kit QIAGEN, Hilden
QIAprep® Mini Kit QIAGEN, Hilden
QIAquick® Gel Extraction Kit QIAGEN, Hilden
RealArt TM HAV LC RT PCR Reagents QIAGEN, Hamburg
2.1.4. Geräte
ABI PRISM™ 7900HT Applied Biosystem, USA
Artus 3000/RotorGene™ 3000 Corbett, Research, Australia
BioPhotometer Eppendorf, Hamburg
Brutschrank Heraeus, Hanau
Elektrophoresekammer Bio-Rad, Herculas, CA, USA
Fluoreszenzmikroskop "Axioskop 2" Carl Zeiss, Jena
Material und Methoden
27
Geldokumentationsanlage Kodak, Stuttgart
Kolbenhubpipetten (verschiedene Größen) Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifugen Eppendorf und Heraeus
Schüttler LTF-Labortechnik, Wasserburg
Mastercycler 5330 Eppendorf, Hamburg
2.1.5. Medien und Lösungen
DMEM: DMEM Pulver für 500 ml, 2mM L-Glutamin, 26 mM NaHCO3, 50 ml FCS,
5 ml Penicillin/Streptomycin
Im Folgenden bezieht sich die Bezeichnung Medium oder DMEM immer auf das
komplette Medium mit allen zugefügten Komponenten.
PBS (Phosphat buffered saline/Phosphat-gepufferte Salzlösung): 1xPBS: 8 g NaCl, 0,2 g
KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 , 1l destilliertes Wasser, autoklaviert.
Einfriermedium: 10%DMSO in FCS
LB-Medium: 20 g LB Broth Base, 1l destilliertes Wasser, autoklavieren
LB-Agarplatte: 32 g LB-Agar, 1l destilliertes Wasser, autoklavieren
Nach dem Autoklavieren ca. 25 ml LB-Agar pro Platte gießen und erkalten lassen
2.1.6. Oligonukleotide
Tabelle 2: In dieser Arbeit verwendete PCR-Primer (Metabion, Martinsried). Name Sequenz und Nukleotidposition Anwendung
RNase L for 5`-GAC CTG CTG GGT CAT CCC TT-3´
Nukleotidposition 1901-1920 NCBI NM_021133
Vorwärtsprimer RNase L
RNase L rev 5´-CAT TTC CCA CAT TCC GAA GC -3`
Nukleotidposition 1971-1952 NCBI NM_021133
Rückwärtsprimer RNase L
RNase L Sd 5´-FAM-TTT TGG ACT TGG GAG AGC CGC
TAT AGG A-TAMRA-3´
Nukleotidposition 1923-1950 NCBI NM_021133
Sonde RNase L
Material und Methoden
28
RLI for 5`-AAG ACT GAT GGC AGC TCG AGT T -3´
Nukleotidposition 898-919 NCBI X74987
Vorwärtsprimer RLI
RLI rev 5´- ATG ACG CGA TCC GCT AGA TAG -3`
Nukleotidposition 1007-987 NCBI X74987
Rückwärtsprimer RLI
RLI Sd 5´-FAM-CGT TTC ATA CTC CAT GCA AAA
AAG ACA GCC TTT -TAMRA-3´
Nukleotidposition 926-958 NCBI X74987
Sonde RLI
RLI full nah
for
5’ – TCG TTT CTC CAG AAG AGC TGG ATA
T – 3’
Nukleotidposition 79-103 NCBI X76388
Vorwärtsprimer für die full-
lenght Amplifikation des
RLI full nah
rev
5’ – GTA AAT ACT CCT TTT AAT AAA TGG
CTT ATC AAT – 3’
Nukleotidposition 1965-1933 NCBI X76388
Rückwärtsprimer für die
full- lenght Amplifikation
des RLI
RLI full for
direkt
5’ – ATG GCA GAC AAG TTA ACG AGA
ATT GCT – 3’
Nukleotidposition 118-144 NCBI X76388
Vorwärtsprimer für die full-
lenght Amplifikation des
RLI
RLI full rev
ohne Stop
5’ – CGA ATC ATC CAA GAA AAA GTA
GTT TCC ACT – 3’
Nukleotidposition 1898-1917 NCBI X76388
Rückwärtsprimer für die
full- lenght Amplifikation
des RLI ohne Stop-Codon
18S rRNA
for
5`- ACG GCT ACC ACA TCC AAG GA -3’
Nukleotidposition 550-569 NCBI M10098
Vorwärtsprimer 18S rRNA
18S rRNA
rev
5´- CCA ATT ACA GGG CCT CGA AA -3`
Nukleotidposition 660-640 NCBI M10098
Rückwärtsprimer 18S rRNA
18S rRNA
Sd
5´-FAM- CAG GCG CGC AAA TTA CCC ACT
CC -TAMRA-3´
Nukleotidposition 576-588 NCBI M10098
Sonde 18S rRNA
GAPDH for 5`- CCT GCA CCA CCA ACT GCT TAG -3´
Nukleotidposition 512-532 NCBI BC025925
Vorwärtsprimer GAPDH
GAPDH rev 5´- CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA -3`
Nukleotidposition 622-601 NCBI BC025925
Rückwärtsprimer GAPDH
GAPDH Sd 5´-FAM- ACA ACT TTG GTA TCG TGG AAG
GAC TCA TGA CC -TAMRA-3´
Nukleotidposition 557-588 NCBI BC025925
Sonde GAPDH
Material und Methoden
29
T7 5’ –TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG -3’ Vorwärtsprimer zur
Sequenzierung des Inserts
aus pcDNA3.1/V5-His
BGH rev 5’ –TAG AAG GCA CAG TCG AGG –3’ Rückwärtsprimer zur
Sequenzierung aus
pcDNA3.1/V5-His
2.1.7. Plasmide
Tabelle 3: In dieser Arbeit verwendete Plasmide.
Plasmid Charakteristika Herkunft
pcDNA3.1/V5-His
Topo TA
Vektor zur Klonierung von PCR-
Fragmenten in E.coli
Invitrogen, Karlsruhe
pcDNA3/RLI 3’ Klonierungsvektor, abgeleitet von
pcDNA3.1, der das humane RLI enthält
(Bisbal et al., 1995)
pcDNA3.1/V5-His-
m_RLI
Klonierungsvektor, abgeleitet von
pcDNA3.1/V5-His, der das Affen
(monkey) -RLI enthält
Teil dieser Arbeit
pcDNA3.1/V5-His-
h_RLI
Klonierungsvektor, abgeleitet von
pcDNA3.1/V5-His, der das humane-RLI
enthält
Teil dieser Arbeit
pl.18 Vektor zur Klonierung von PCR-
Fragmenten in E.coli
Jim Robertson; NCBI
pl.18-m_RLI Klonierungsvektor, abgeleitet von pl.18,
der das Affen (monkey) -RLI mit His-
Tag enthält
Teil dieser Arbeit
pl.18-h_RLI Klonierungsvektor, abgeleitet von pl.18,
der das humane-RLI mit His-Tag enthält
Teil dieser Arbeit
P90/HCV FL-long PU Klonierungsvektor, abgeleitet von
pBR322, der die komplette Konsensus
cDNA des HCV-Isolats H77
(Kolykhalov et al., 1997) vom Genotyp
1a unter der Kontrolle eines T7
Promoters enthält
Ph.D. C. M. Rice
(Washington University in
St. Louis, School of
Medicine, Department of
Molecular Microbiology)
Material und Methoden
30
pSV2neo Vektor mit G418 Resistenzgen zur
Kotransfektion von pl.18
Clontech, U.S.A
ZC-5.1 pBluescript abgeleiteter Vektor mit der
RNase L als Insert
zur Verfügung gestellt von
R.Silverman (Cleveland
Clinic Foundation)
2.1.8. Restriktionsendonukleasen
Tabelle 4: In dieser Arbeit verwendete Restriktionsenzyme.
Restriktionsenzym Schnittstelle Firma
EcoRI G↓AATTC Roche, Mannheim
EcoRV GAT↓ATC Roche, Mannheim
Hind III A↓AGCTT MBI Fermentas, St. Leon-Roth
Kpn I GGTAC↓C Roche, Mannheim
Mss I (Pme I) GTTT↓AAAC MBI Fermentas, St. Leon-Roth
Mva1269I (Bsm I) GAATGC(N)1/-1↓ MBI Fermentas, St. Leon-Roth
Xba I T↓CTAGA Roche, Mannheim
Xho I C↓TCGAG MBI Fermentas, St. Leon-Roth
2.1.9. Software
ABI 7900HT SDS 2.1 Applied Biosystem, USA
DNASTAR: MegAlign und EditSeq Vers 5.06 DNASTAR Inc., Madison
EndNote 5.0 Thomson Scientific, London
Kodak ds 1D Vers. 2.0.3 Kodak digital science,
Rochester, USA.
Microsoft Word/Exel 2002 Microsoft GmbH,
Unterschleißheim
Plasmid Processor 1.02 University of Kuopio, Finnland
Primer Express Version 2.0.0 Applied Biosystem, USA
PriProbit Vers. 1.63 Kyoto University, Kyoto, Japan
RotorGene Software Version 5.0.63 Corbett Research, Australia
Sequence Navigator Version 1.0.1 Perkin Elmer, USA
Material und Methoden
31
2.1.10. Verbrauchsmaterialien
Pipetten 10 ml, 25 ml Sarstedt, Nümbrecht
Zellkulturflaschen 75 cm2 Nunc, Wiesbaden
Zellkultkurplatten 6-well, 24-well, 96-well Nunc, Wiesbaden
Eppendorfgefäße 1,5 ml, 2 ml Eppendorf, Hamburg
Schalen 6 cm, 10 cm Nunc, Wiesbaden
Falkons 15 ml, 50 ml Sarstedt, Nümbrecht
0,5 ml Thermo-tubes Abgene, UK
96-well optical reaction plate Applied Biosystem, USA
RotorGene 0,1 ml tubes Corbett Research, Australia
2.1.11. virologische Materialien
Hepatitis C Panel Referenzzentrum für Hepatitis C, Universität Essen,
Virologisches Institut, Prof. Dr. M. Roggendorf
http://www.hepatitis-c-referenzzentrum.de/html/hcvpanel.htm
Hepatitis C Plasma Blutspendedienst Hagen, Frischplasma, infektiös
2.1.12. Zelllinien
FRhK-4-Zellen: Zelllinie von fetalen Rhesusaffennierenzellen, Center für Biologics
Evaluation and Research (CBER/FDA) Abteilung für Virologie, Bethesda, Maryland,
USA. FRhK-4-Zellen reagieren nicht auf Interferon, zeigen aber eine konstitutive
Expression der OAS und RNase L (Brack, 1999).
FRhK-4-6er Klone: Zelllinie von fetalen Rhesusaffennierenzellen stabil mit dem humanen
RNase L Inhibitor aus pcDNA3/RLI 3’ transfiziert, Diplomarbeit Jörn Gotter (1999),
Universität Bremen. In diesen Zellen zeigt das Hepatitis A Virus ein stärkeres Wachstum
als in FRhK-4-Zellen (Gotter, 1999).
Huh7-Zellen: Zelllinie von humanen Leberzellkarzinomzellen, Universität Bremen. Nur in
dieser Zelllinie war bisher die Anzucht des Hepatitis C Virus JFH-1 oder die Replikation
von HCV-RNA durch Replikonsysteme möglich (Bartenschlager et al., 2003; Kato &
Wakita, 2005)
Material und Methoden
32
2.2. Methoden
2.2.1. Molekularbiologie
2.2.1.1. Aufreinigung von Zell-RNA mit dem RNeasy® Mini Kit
Die Aufreinigung der zellulären RNA erfolgte nach Protokollangaben des Herstellers. Für
die Aufarbeitung transient transfizierter Zellen war ein zusätzlicher DNase Verdau zum
Abbau von Plasmid DNA nötig. Die Zellen wurden zunächst nach Protokoll aufgereinigt
und die QIAamp Säulen aufbewahrt. Das Eluat wurde erneut in 350 μ l RLT-Puffer
aufgenommen, mit 250 μ l Ethanol gemischt und auf die Säule gegeben. Nach dem RW1-
Wasch- und Zentrifugationsschritt erfolgt der DNase Verdau. Hierzu wurden 15 μ l
DNase I mit 90 μl RDD-Puffer gemischt, auf die Säule gegeben und bei Raumtemperatur
(20°C - 30°C) für mindestens 60 min inkubiert. Die weitere Aufarbeitung wurde nach
RNeasy® Protokoll ab dem RW1-Waschschritt durchgeführt.
2.2.1.2. DNA-Auftrennung im Agarosegel
Die Auftrennung von PCR-Produkt bzw. Plasmid-DNA erfolgte durch Agarosegel-
Elektrophorese. Je nach Fragmentgröße der zu trennenden DNA wurde ein 1, 2 oder
3%iges Agarosegel verwendet. 8 μ l DNA wurden mit 2 μl Ladepuffer (6x Loading Dye
MBI Fermentas, St. Leon-Roth) versetzt und bei 80 V elektrophoretisch analysiert. Je
nach Fragmentgröße wurden verschiedene Marker verwendet.
2.2.1.3. cDNA-Synthese
Die cDNA-Synthese wurde nach Protokoll des RevertAidTM H Minus First Strand cDNA-
Synthesis Kit durchgeführt. Es wurden 5 μ l der RNeasy® aufgereinigten Zell-RNA
eingesetzt und mit random hexamer Primern in cDNA umgeschrieben (Ausnahme:
cDNA-Synthese für die full length Amplifikation des RLI. Hier wurden oligodT-Primer
verwendet). Zur Kontrolle des DNase Verdaus wurde die Synthese sowohl mit als auch
ohne Reverse Transkriptase durchgeführt.
Material und Methoden
33
2.2.1.4. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI
und GAPDH sowie der 18S rRNA
Zur Kontrolle der RNA-Aufreinigung und des DNase Verdaus wurde die cDNA-Synthese
jeweils mit und ohne Reverse Transkriptase durchgeführt. Der Einsatz von cDNA ohne
Reverse Transkriptase in die PCR zeigte mindestens eine log-Stufe weniger Amplifikate
als der Einsatz von cDNA mit Reverser Transkriptase. Je später PCR-Signale von cDNA-
Templates ohne Reverser Transkriptase detektiert werden, desto erfolgreicher und
sauberer sind die RNA-Aufreinigung und der DNase Verdau verlaufen.
PCR-Ansatz:
Wasser 10,1 μ l
ABI 2x Puffer 12,5 μ l
Primer for (10 μM) 0,1 μ l
Primer rev (10 μM) 0,1 μ l
Platinum (5 U/μ l) 0,1 μ l
Template cDNA 2 μ l
Real time PCR Temperaturprofil:
Initiale Denaturierung 10 min, 95 °C
Denaturierung 15 sec, 95°C
Amplifikation 1 min, 55°C
Zyklenanzahl: 40
Spezifität der PCR: Die Spezifität ist ein Maß für die Wahrscheinlichkeit eines falsch-
positiven Ergebnisses.
Um unspezifische Amplifikationen durch die eingesetzten Primer auszuschließen, wurde
gesamt-Zell-RNA in cDNA umgeschrieben und als Template in die verschiedenen real
time PCRs (RLI, RNase L, 18S rRNA, GAPDH) eingesetzt. Die PCR-Amplifikate wurde
im 3%igen Agarosegel aufgetrennt und auf unspezifische Bandenmuster überprüft.
PCR-Effizienz: Die PCR-Effizienz ist ein Maß für das Verhältnis von Amplifikat- und
eingesetzter Probenmenge. Im Idealfall liegt eine Verdopplung der Amplifikate pro
Zyklus vor. In diesem Fall beträgt die PCR-Effizienz 100 %.
Material und Methoden
34
Zur Berechnung der PCR-Effizienz wurde die „slope“-Methode (Anstiegsmethode)
verwendet. Für diese Methode wird eine Verdünnungsreihe für jedes Template generiert
und der ct-Wert jedes Verdünnungspunktes bestimmt. In einem Diagramm werden die ct-
Werte gegen die jeweiligen logarithmischen Konzentrationen der cDNA aufgetragen. Eine
lineare Regressionsgerade (y = ax + b) wird berechnet und ihr Anstieg bestimmt. Der
erwartete Anstieg (a) einer logarithmischen Verdünnungsreihe beträgt -3,32, wenn die
PCR-Effizienz bei (E) = 1,0 (100 %) liegt. Die PCR-Effizienz berechnet sich mit der
Anstiegsmethode der linearen Regressionsgeraden nach der Formel: E = 10(-1/Anstieg) -1
(Eurogentec, 2004). Beispiel: Beträgt der Anstieg einer Regressionsgeraden -3,33, so
berechnet sich die PCR-Effizienz durch E = 10(-1/-3,33) -1. E = 1,995-1. Die PCR-Effizienz
beträgt somit 0.995 oder 99,5%.
Quantifizierung: Mit Hilfe der Regressionsgeraden oder Standardkurve erfolgt auch die
Quantifizierung der unbekannten Proben. Die Konzentrationen der Verdünnungspunkte
der Standardreihe werden definiert. Die RNA-Menge der unbekannten Proben wird
anschließend durch die Software des ABI 7900HT anhand der Standardkurve berechnet.
Es wird davon ausgegangen, dass das Verhältnis der eingesetzten cDNA proportional zur
mRNA ist, d.h. für jede spezifische mRNA während der cDNA Synthese in einem
konstanten Verhältnis entsprechend viel cDNA entsteht.
2.2.1.5. Full length Amplifikation des RNase L Inhibitor
Aus FRhK-4-Zellen wurde die RNA mit dem RNeasy® Mini Kit nach Protokoll
aufgereinigt und 5 μ l des Eluates in die cDNA-Synthese eingesetzt. Bei der Verwendung
humaner Nieren-gesamt-Zell-RNA von Ambion wurde 1 μl Probe in die cDNA-Synthese
eingesetzt. 2 μ l der cDNA wurden anschließend in die long-range PCR zur full length
Amplifikation des RLI verwendet. Für die Amplifikation des RLI wurden die Vor- und
Rückwärtsprimer „RLI full nah“ eingesetzt. Um den His-Tag des pcDNA3.1/V5-His zu
exprimieren, wurden in einer weiteren full length Amplifikation die Primer „RLI full
direkt for“ und „RLI full direkt rev ohne Stop“ verwendet, um das Stop-Codon
auszuschalten. Die long-range PCR wurde im Eppendorf Mastercycler durchgeführt.
Material und Methoden
35
PCR-Ansatz:
Wasser 34,35 μ l
Pu3-Puffer (5x) 10 μ l
dNTP (5 mM) 1,5 μ l
MgSO4 (50 mM) 1,5 μ l
Takara (5 U/μ l) 0,35 μ l
ISIS Taq (1 IU/μ l) 0,1 μ l
Primer for (10 μM) 0,1 μ l
Primer rev (10 μM) 0,1 μ l
Template cDNA 2 μ l
Long-range PCR Temperaturprofil:
Initiale Denaturierung 2 min, 95 °C
Denaturierung 1 min, 95°C
Amplifikation 1 min, 55°C
5 min, 72°C
10 min, 72°C
Zyklenanzahl: 40
Die Kontrolle der full length Amplifikation erfolgte im 1%igen Agarosegel.
2.2.1.6. Klonierung des RLI in pcDNA3.1/V5-His und Transformation von E.coli
Die Klonierung von humanem und Affen RNase L Inhibitor erfolgte mit dem
pcDNA3.1/V5-His© TOPO® TA Expression Kit nach den Protokollangaben des
Herstellers. Je 4 μ l PCR-Produkt wurden mit 1 μ l Salt-Solution und 1 μ l pcDNA3.1/V5-
His versetzt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Transformation wurde nach
der Hitzeschock-Methode (Hanahan, 1983) durchgeführt. Ein Röhrchen Top10 E.coli
Zellen wurde auf Eis aufgetaut und mit 2 μ l des Ligationsansatzes versetzt. Nach
3-minütiger Inkubation auf Eis erfolgte der Hitzeschock bei 42°C für 30 sec im
Wasserbad. Die Zellen wurden für 2 min auf Eis gestellt und anschließend mit 250 μl
SOC-Medium versetzt. Nach 1 h Inkubation im Schüttler bei 37°C und 500 rpm wurde der
komplette Transformationsansatz auf LB-Agar mit Ampicillin (100 μg/ml) ausgestrichen.
Über Nacht wurden die Agarplatten bei 37°C inkubiert. Die Klone wurden mit sterilen
Material und Methoden
36
Pipettenspitzen in 96-well-Mikrotiterplatten gepickt, welche pro Vertiefung 200 μ l LB
Medium 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Nach 24 h Inkubation bei 37°C wurden die
Klone per PCR auf das Insert (RLI) getestet. In die Vertiefungen der Mikrotiterplatte
wurden je 75 μ l 66%iges steriles Glycerol gegeben, vorsichtig gemischt und die Platte bei
-70°C eingefroren.
2.2.1.7. Klonscreening mittels PCR
In einer TaqMan Platte wurde in jede Vertiefung 10 μ l Wasser vorgelegt. Mit einer
Multipipette wurden die Bakterienkulturen der 96-well-Mikrotiterplatte einmal
aufgezogen und wieder in die Vertiefungen entlassen. Die Pipettenspitzen wurden
anschließend in den vorgelegten 10 μ l Wasser gespült. Jeder Vertiefung wurde 15 μ l PCR-
Mastermix zugegeben, die Platte verschlossen und die PCR im Eppendorf Mastercycler
durchgeführt.
PCR-Ansatz:
Wasser 8,2 μ l
Pu3-Puffer (5x) 5 μ l
dNTP (5 mM) 0,75 μ l
MgSO4 (50 mM) 0,75 μ l
Takara (5 U/μ l) 0,2 μ l
T7 Primer (10 μM) 0,05 μ l
RLI rev (10 μM) 0,05 μ l
PCR Temperaturprofil:
Initiale Denaturierung 10 min, 95°C
Denaturierung 1 min, 95°C
Amplifikation 1 min, 55°C
3 min, 72°C
10 min, 72°C
Zyklenanzahl: 35
Die Kontrolle der full length Amplifikation erfolgte im 1%igen Agarosegel.
Material und Methoden
37
2.2.1.8. Präparation der rekombinanten Plasmide
Einige ausgewählte E.coli Klone, welche das Insert enthalten, wurden über Nacht in 5 ml
LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C angezogen. Je 850 μ l Bakterienkultur
wurde mit 150 μ l sterilem Glycerol gemischt und bei -70°C eingefroren. Zur Aufreinigung
der Plasmid-DNA wurden je 3 ml Bakterienkultur in das NucleoSpin® Plasmid Kit
eingesetzt. Die Aufarbeitung erfolgt nach Protokollangaben des Herstellers. 1 μ l Eluat
wurde mit 50 μ l sterilem Wasser gemischt und die Konzentration der enthaltenen DNA im
Eppendorf BioPhotometer gemessen. Zur Kontrolle der Orientierung des Inserts wurden
die Plasmide einem Restriktionsverdau unterzogen. Je 8 μ l pcDNA3.1/V5-His-m_RLI
bzw. 8 μl pcDNA3.1/V5-His-h_RLI wurden mit 0,2 μ l Wasser, 1 μ l 10x Puffer R+ und je
0,4 μ l HindIII (10 U/μ l) und XhoI (10 U/μ l) versetzt. Die Restriktion erfolgte 90 min bei
37°C im Eppendorf Mastercyler.
Zur Transfektion von Plasmid-DNA in FRhK-4- und Huh7-Zellen wurden endotoxinfreie
Plasmide verwendet. Dazu wurden je 150 - 200 ml Bakterienkultur mit dem Endofree
Plasmid Maxi Kit nach Protokollangaben des Herstellers aufgereinigt. Die Plasmide
wurden photometrisch vermessen und mittels Restriktion kontrolliert.
2.2.1.9. Sequenzierung
Die Sequenzierung des humanen- und FRhK-4-RLI-Inserts der verwendeten Plasmide
pcDNA3.1/V5-His_RLI und pl.18_RLI wurde von Dr. H. Schmidt vom DNA-Cloning-
Service (Ohnhorststrasse 18, 22609 Hamburg) durchgeführt. Es wurden folgende Primer
verwendet: T7, BGH rev (beide nur für pcDNA3.1/V5-His_RLI), RLI for, RLI rev, RLI
full rev ohne Stop (nur für Plasmide mit ausgeschaltetem Stopcodon).
Die Auswertung der Sequenzdaten erfolgte mit dem Sequence Navigator Version 1.0.1.
2.2.1.10. Umklonierung des RLI aus pcDNA3.1/V5-His_RLI in pl.18
Restriktion: Das humane und das Affen RLI sollten mit dem His-Tag aus den
entsprechenden pcDNA3.1/V5-His_RLI Vektoren herausgeschnitten werden.
Restriktionsansatz 1. Schnitt: 2 μ l Puffer B + 1,4 μ l pcDNA3.1-V5/His_RLI
(2 μg) + 12,6 μ l H2O + 4 μ l MssI (5 U/μ l). Die Restriktion erfolgte für 2 h bei 37°C, die
Enzyminaktivierung anschließend bei 65°C für 20 min. Restriktionsansatz 2. Schnitt: Dem
Material und Methoden
38
ersten Restriktionsansatz wurden 2 μ l KpnI (10 U/μ l) zugegeben. Die Restriktion erfolgte
für 2 h bei 37°C, die Enzyminaktivierung anschließend bei 65°C für 20 min.
Der Klonierungsvektor pl.18 wurde ebenfalls mit zwei Restriktionsenzymen geschnitten.
Restriktionsansatz 1. Schnitt: 2 μ l Puffer L + 10 μl pl.18 (2 μg) + 2 μ l BSA (1 mg/ml) +
4 μ l H2O + 2 μ l KpnI (10 U/μ l). Die Restriktion erfolgte für 2 h bei 37°C, die
Enzyminaktivierung anschließend bei 65°C für 20 min. Restriktionsansatz 2. Schnitt: Dem
ersten Restriktionsansatz wurden 0,8 μ l 2,5 M NaCl und 2 μ l EcoRV (10 U/μ l)
zugegeben. Die Restriktion erfolgte für 2 h bei 37°C, die Enzyminaktivierung
anschließend bei 65°C für 20 min.
Dephosphorylierung von pl.18: Um das Religationsvermögen von pl.18 zu verringern,
wurde der geschnittene Vektor dephosphoryliert. Dephosphorylierungsansatz: pl.18
Restriktionsansatz + 2,2 μ l Dephophorylationbuffer + 2 μ l Alkalische Phophatase. Die
Inkubation erfolgte 30 min bei 37°C. Zur Inaktivierung der Alkalischen Phosphatase
wurden 4 μ l 100 mM EGTA zugegeben und 10 min bei 65°C inkubiert.
Aufreinigung des restringierten RLI: Die geschnittenen Vektoren pcDNA3.1/V5-His-
m_RLI und pcDNA3.1-V5/His-h_RLI wurden im 1%igen Agarosegel aufgetragen und die
Restriktion kontrolliert. Die RLI-Banden bei 18 kb wurden aus dem Gel ausgeschnitten
und mit dem QIAquick® Gel Extraction Kit nach Angaben des Herstellers aufgereinigt.
Die DNA-Fragmente wurde in je 30 μ l EB Puffer eluiert.
Ligation: Die Ligation von pl.18 und RLI erfolgt mittels Rapid DNA Ligation Kit nach
den Angaben des Herstellers. Ligationsansatz: je 13,6 μ l humanes- bzw. FRhk-4-RLI_His
+ 2,4 μ l pl.18 + 4 μ l 5x Rapid ligation buffer + 1 μ l T4 DNA Ligase (5 U/μ l). Nach
kurzem Vortexen und Zentrifugieren wurde 30 min bei 22 °C inkubiert.
Transformation: 50 μ l E.coli C600 wurden 10 min auf Eis aufgetaut und anschließend mit
2 μ l Ligationsansatz versetzt. Nach 20-minütiger Inkubation auf Eis wurde 2 min bei 42°C
im Wasserbad ein Hitzeschock durchgeführt, 2 min auf Eis inkubiert, danach 200 μ l LB++
Medium zugegeben. Nach 1 h bei 37°C auf dem Schüttler wurde der
Transformationsansatz auf LB-Agar mit 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert. Die Inkubation
erfolgte über Nacht bei 37°C. Je 8 Klone (humanes bzw. FRhK-4 pl.18_RLI) wurden in je
3 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 μg/ml) gepickt und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die Aufreinigung von je 1,5 ml Bakterienkultur erfolgte mit dem QIAprep® Mini Kit
nach Protokoll des Herstellers.
Material und Methoden
39
Kontrollrestriktion: Zur Kontrolle von pl.18_RLI wurden 20 μ l Eluat der
Plasmidpräparation mit 3 μ l Puffer H und 0,3 μ l XhoI versetzt und 2 h bei 37°C inkubiert.
Die Kontrolle der Restriktionen erfolgte im 1%igen Agarosegel.
2.2.1.11. In vitro Transkription von HCV full length HCV RNA
Transformation: Die Transformation wurde nach der Hitzeschock-Methode (Hanahan,
1983) durchgeführt. Ein Röhrchen Top10 E.coli Zellen wurde auf Eis aufgetaut und mit
2 μ l p90/HCV FL-long pU (100 ng/μ l) versetzt. Nach 3minütiger Inkubation auf Eis
erfolgte der Hitzeschock bei 42°C für 30 sec im Wasserbad. Die Zellen wurden für 2 min
auf Eis gestellt und anschließend mit 250 μ l SOC-Medium versetzt. Nach 1 h Inkubation
im Schüttler bei 37°C und 500 rpm wurde der komplette Transformationsansatz auf LB-
Agar mit Tetrazyklin (10 μg/ml) ausgestrichen. Über Nacht wurden die Agarplatten bei
37°C inkubiert. Sieben Klone wurden mit sterilen Pipettenspitzen in je 7 ml LB Medium
mit 10 μg/ml Tetrazyklin gepickt.
Miniprep und Kontrollrestriktion: Nach 24 h Inkubation bei 37°C wurden die Plasmide
mit dem QIAGEN® Plasmid Mini Kit aufgereinigt. Je 15 μ l der Plasmidpräparation
wurden mit 3 μl Puffer H, 0,3 μ l Xba I (10 U/μ l) und 0,3 μ l EcoR I (10 U/μ l) versetzt und
2 h bei 37°C inkubiert. Die Kontrolle der Restriktionen erfolgte im 1%igen Agarosegel.
Linearisierung des Plasmides: Für die in vitro Transkription war eine Linearisierung des
Plasmides nötig. Dazu wurden 10 μ l der Plasmidpräparation mit 1 μl Puffer R, 8,4 μ l H2O
und 0,6 μ l Bsm I (10 U/μ l) versetzt und 2 h bei 37°C inkubiert.
Gelkontrolle und Aufreinigung: Bsm I schneidet zweimal in p90/HCV FL-long pU,
wodurch Fragmente von 1427 bp und 11553 bp entstehen. Die Restriktionskontrolle
erfolgte im 1%igen Agarosegel. Die das HCV Insert enthaltene Bande von 11553 kb
wurde mit dem QIAquick® Gel Extraktion Kit nach Protokoll aufgereinigt. Eluiert wurde
in 30 μ l EB-Puffer. Die Kontrolle der Aufreinigung erfolgte ebenfalls im 1%igen
Agarosegel.
In vitro Transkription: Die in vitro Transkription wurde nach Protokoll des MEGAscript®
High Yield Transcription Kit durchgeführt. Je 2 μ l ATP, CTP, UTP und GTP wurden mit
2 μ l Puffer, 2 ml Enzymmix und 8 μ l linearisiertem Plasmid versetzt. Die in vitro
Transkription erfolgte für 4 h bei 37°C.
Aufreinigung der RNA, Gelkontrolle und Konzentrationsbestimmung: Um DNA-freie
RNA zu erhalten, wurde 1 μ l TURBO DNase zum Transkriptionsansatz gegeben und
Material und Methoden
40
20 min bei 37°C inkubiert. Die Aufreinigung der in vitro Transkription erfolgte mit Hilfe
des RNeasy® Mini Kit nach Protokoll. Nach Elution in 50 μ l RNase freiem Wasser
erfolgte die Kontrolle im 1%igen Agarosegel.
Zur Konzentrationsbestimmung der in vitro transkribierten RNA wurden 10 μ l des
Transkripts 10-6 verdünnt. 10 μ l dieser 10-6 Verdünnung wurde in das HCV RotorGene
Assay eingesetzt. Es wurden jeweils Doppelbestimmungen der IVT-Ansätze durchgeführt.
Mit Hilfe der mitgeführten Standardreihe wurde die Konzentration des HCV IVTs (in
vitro Transkripts) berechnet.
2.2.1.12. Entwicklung eines HCV RotorGene Nachweissystems
Die Primer und Sondensequenzen wurden von einem bestehenden HCV RotorGene Assay
der Firma artus GmbH (seit 2002 QIAGEN Hamburg) übernommen, welches in Puffer-
und Enzymzusammensetzung vollständig umgestellt, optimiert und validiert werden
sollte. Probleme des bestehenden Systems mit starken Qualitätsschwankungen der
Reversen Transkriptase sollten durch Umstellung auf Enzyme anderer Hersteller
eliminiert werden. Das neue System sollte außerdem kostengünstiger produziert werden
können, als das existierende HCV RotorGene System. Die finale Version des neu
entwickelten Nachweissystems für HCV RNA soll von der QIAGEN Hamburg GmbH als
Kit vertrieben werden. Die genaue Zusammensetzung der einzelnen Kit Komponenten
sowie die Sequenzen der Primer und Sonden unterliegen damit der Geheimhaltung und
werden in dieser Arbeit nicht veröffentlicht.
Optimierung: Auf Basis eines 5x in-house-Puffers sollte das HCV Nachweissystem unter
Verwendung der bereits existierenden Primer und Sonden entwickelt werden. Die
Optimierungsversuche wurden mit einer Standardreihe (in vitro Transkript) sowie bereits
aufgereinigten Positivkontrollen des Blutspendedienstes in Springe durchgeführt. Es
wurden verschiedene pH-Werte des Puffers ausgetestet, sowie diverse Enzyme
verschiedener Hersteller. Nach Auswahl des Puffer pH-Wertes folgten Titrationen der
verwendeten Enzyme, dNTPs, Magnesium, Primer und Sonden.
Material und Methoden
41
RT-PCR-Temperaturprofil:
Reverse Transkription: 10 min. 50°C
Aktivierung HotStart Enzym: 50 sec, 95°C
Touch down 8 sec, 95°C
20 sec, 65°C → Fluoreszenzmessung
20 sec, 72°C
10 Zyklen, bei jedem Zyklus wird die Annealing-Temperatur um 1°C abgesenkt
Amplifikation: 8 sec, 95°C
20 sec, 55°C → Fluoreszenzmessung
20 sec, 72°C
Zyklenanzahl: 45
Gesamtzyklenzahl: 55
Spezifität: Zur Kontrolle der RT-PCR-Spezifität wurden verschiedene ebenfalls in Blut
oder Plasma vorkommende Erregergenome (HIV, HAV, HBV, Parvo B19, HSV1+2, M.
pneumophiae, Enterovirus, WestNil-Virus, HHV6+7, CMV, EBV, HTLV1+2) in das
HCV System eingesetzt und auf unspezifische Amplifikation getestet. Zur Kontrolle der
spezifischen Amplifikation wurde die HCV in vitro Transkript-Standardreihe (5x100-
5x103 IU/ml) mitgeführt.
Sensitivität: die Sensitivität beschreibt die Nachweisgrenze eines Systems. Die
Nachweisgrenze einer PCR wird unterschiedlich definiert. In Anlehnung an die
Monographie „PCR“ der Europäischen Pharmakopöe wird als „positiver Grenzwert“ die
Konzentration der Zielnukleinsäure definiert, die in 95 % der Experimente noch
amplifiziert wird. Die Bestimmung dieses Wertes erfolgt durch Anwendung der Probit-
Analyse, einem statistischen Verfahren zur Beschreibung von alternativen und
quantitativen "Dosis-Wirkung"-Beziehungen.
Zur Bestimmung der Sensitivität wurden 6 Verdünnungsstufen von HCV positiven Plasma
des Blutspendedienstes aus Hagen in DMEM angesetzt und zu je 8 Replikaten mit dem
QIAamp®Viral RNA Mini Kit aufgereinigt. Die Elution der HCV RNA erfolgte in je 50 μ l
AVE-Puffer. Jedes Replikat der Verdünnungsstufen wurde in 3 unabhängigen RT-PCR-
Läufen analysiert. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit Hilfe der Software
PriProbit.
Material und Methoden
42
2.2.2. Zellkultur und virologische Methoden
In dieser Arbeit wurden FRhK-4-Zellen, FRhK-4-Klone und Huh7-Zellen verwendet. Alle
Zellen wurden mit DMEM 10 % FCS, 1% Penicillin, 1 % Streptomycin in 75 cm2
Zellkulturflasche bei 37°C, 5 % CO2 kultiviert.
Die virologischen Arbeiten mit dem Hepatitis C Virus wurden unter der Sicherheitsstufe 3
durchgeführt.
2.2.2.1. Kryokonservierung von Huh7- und FRhK-4-Zellen
In einer konfluent gewachsenen 75 cm2 Zellkulturflasche befinden sich ca. 2x107 Zellen.
Diese wurden mit 1xPBS gewaschen. Nach dem Ablösen mit 2 ml Trypsin wurden dem
Trypsin-Zellgemisch 8 ml DMEM 10 % FCS zugegeben. Die Zellen wurden bei 500 rpm
pelletiert und der Überstand verworfen. In ca. 10 ml FCS resuspendiert, wurde die Zell-
Suspension zu je 1,8 ml pro Kryoröhrchen aliquotiert und in einem Styroporgefäß bei
-70°C langsam eingefroren. Nach ca. 24 h wurden die Kryoröhrchen in den
Stickstoffbehälter überführt.
2.2.2.2. Auftauen von Huh7- und FRhK-4-Zellen
Die eingefrorenen Zellen wurden aus dem Stickstofftank geholt und bei 37°C im
Wasserbad aufgetaut. Mit 8 ml frischem DMEM wurden diese Zellen in eine
25 cm2 Zellkulturflasche gegeben und bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Nach ca. 24 h wurde
ein Mediumwechsel durchgeführt, um das restliche Einfriermedium zu entfernen.
2.2.2.3. Passagieren von Huh7- und FRhK-4-Zellen
Das Medium von konfluent gewachsenen Huh7- bzw. FRhK-4-Zellen in einer 75 cm2
Zellkulturflasche wurde abgenommen und die Zellen einmal mit 1xPBS gewaschen.
Anschließend wurden 2 ml Trypsin auf die Zellen gegeben, wobei das Ablösen der Zellen
im Mikroskop kontrolliert und durch Inkubation bei 37°C oder Klopfen der Flasche
unterstützt wurde. Nachdem alle Zellen in Lösung waren, wurde die Proteolyse durch
Zugabe von 8 ml Medium abgestoppt. Es wurde eine definierte Menge Zellen in eine neue
Material und Methoden
43
75 cm2 Zellkulturflasche überführt und nach Hinzufügen von ca. 18 ml frischem DMEM
bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert.
2.2.2.4. Transfektion mit FuGene 6 Transfection Reagent
Für eine 6-well-Platte wurden 2x106 Zellen ausgesät und über Nacht bei 37°C, 5 % CO2
inkubiert. Pro Transfektionsansatz wurden 100 μ l serumfreies Medium in sterile
Eppendorfgefäße abgefüllt und 15 μl FuGene so in die Flüssigkeit gegeben, dass das
Plastikgefäß nicht berührt wurde. Anschließend wurden 5 μg Plasmid-DNA zugegeben
und durch pipettieren gemischt. Das Medium der Zellen wurde abgenommen und durch je
3 ml serumfreies DMEM ersetzt. Nach 20 min Inkubationszeit wurde der
Transfektionsansatz tropfenweise auf die Zellen gegeben. Durch leichtes Schwenken der
Platte wurde gemischt. Nach 4 h 37°C, 5 % CO2 wurde das Transfektionsmedium durch je
5 ml DMEM mit allen Zusätzen ausgetauscht.
2.2.2.5. Transfektion mit jetPEI
Für eine 6-well-Platte wurden 2x106 Zellen ausgesät und über Nacht bei 37°C, 5 % CO2
inkubiert. Pro Transfektionsansatz wurden zwei Eppendorfgefäße benötigt. In jedes
Eppendorfgefäß wurden 250 μ l sterile 150 mM NaCl vorgelegt. In ein Gefäß wurden 5 μg
Plasmid-DNA pipettiert, 10 s gevortext und abzentrifugiert. In das andere Gefäß wurden
10 μ l jetPEI gegeben und ebenfalls 10 s gevortext und zentrifugiert. Die jetPEI-Lösung
wurde anschließend zur DNA-Lösung gegeben, 10 s gevortext, zentrifugiert und alles
20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Medium der Zellen wurde abgenommen und
durch je 4,5 ml serumfreies DMEM ersetzt. Nach der Inkubationszeit wurde der jetPEI-
DNA-Komplex tropfenweise auf die Zellen gegeben. Durch leichtes Schwenken der Platte
wurde gemischt. Nach 4 h 37°C, 5 % CO2 wurde das Transfektionsmedium durch je 5 ml
DMEM mit allen Zusätzen ausgetauscht.
2.2.2.6. G418 Titration für Huh7-Zellen
Auf eine 24-well-Platte wurden 106 Huh7-Zellen ausgesät und direkt mit der G418
Titration begonnen. Es wurden zwei wells mit DMEM als Kontrolle mitgeführt, alle
anderen wells wurden mit G418 von 0,2 mg/ml bis 4 mg/ml in 0,2er Verdünnungsschritten
Material und Methoden
44
versetzt. Alle 3 Tage wurde das Medium durch frisches DMEM mit entsprechender G418
Menge ersetzt. In den höheren Antibiotikakonzentrationen war bereits nach 2 Tagen ein
Absterben der Zellen zu beobachten. Nach 14 Tagen waren ab einer Konzentration von
0,4 mg/ml G418 alle Huh7 Zellen abgestorben. Es wurde daher für die Selektion G418-
resistenter Klone eine Konzentration von 0,6 mg/ml G418 eingesetzt. Diese Menge wurde
ebenfalls für die Selektion resistenter FRhK-4-Zellen verwendet. Die Titration von FRhK-
4-Zellen wurde bereits von Jörn Gotter in Rahmen seiner Diplomarbeit durchgeführt
(Gotter, 1999).
2.2.2.7. Stabile Überexpression des RLI in Huh7- und FRhK-4-Zellen
In 6 cm Schalen wurden 106 Zellen ausgesät und über Nacht bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert.
Die Transfektion erfolgte mit 10 μg der entsprechenden Plasmid-DNA. Da die pl.18_RLI
Plasmide kein Resistenzgen tragen, wurde mit pSV2neo nach Protokoll kotransfiziert
(Transfektionsansatz: je 8 μg pl.18-m_RLI bzw. pl.18-h_RLI, 2 μg pSV2neo, 30 μl
FuGene). 48 h nach Transfektion wurde das Medium gegen 4 ml Medium mit 0,6 mg/ml
G418 ausgetauscht. Die Kultivierung der Zellen erfolgt im Folgenden durchgehend mit
DMEM 0,6 mg/ml G418. Zellen, die kein Plasmid mit Geneticin-Resistenz aufgenommen
haben, sterben im Verlauf der Zeit ab. Alle 3 bis 4 Tage wurde das Medium gewechselt.
Nach Erreichen eines konfluenten Zellrasens wurden die Zellen in hohen Verhältnissen
umgesetzt (1:1.000 bis 1:10.000), um einzelne Kolonien zu erhalten. Zum Selektieren der
Klone wurden ausreichend gewachsene Kolonien markiert, das Medium abgenommen und
Klonierungszylinder (abgeschnittene Eppendorfhütchen) mit Silicon Grease (Beckmann)
aufgesetzt. Mit 100 μ l Trypsin wurden die Zellen innerhalb der Zylinder abgelöst und in
24-well-Platten vereinzelt. Zellen konfluent bewachsener Vertiefungen wurden in 6-well-
Platten überführt. Die Kontrolle der Klone auf RLI-Überexpression erfolgte mittels PCR.
2.2.2.8. Immunfluoreszenz
In jede Vertiefung einer 6-well-Platte wurden drei runde, autoklavierte Deckgläschen
gelegt, darauf die Zellen ausgesät und bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Die Transfektion
wurde ca. 16 - 24 h nach Protokoll durchgeführt. Als Negativkontrolle dienten nicht
transfizierte Zellen. Die Auswertung mittels Immunfluoreszenz erfolgte 3 Tage nach
Transfektion.
Material und Methoden
45
Nach Abnahme des Mediums und zweimaligem Waschen der Zellen mit je 1 ml 1xPBS
wurden die Zellen durch 2 ml Ethanol für 5 min bei Raumtemperatur fixiert. Die Fixierzeit
von 5 Minuten sollte nicht überschritten werden. Es wurde 5-mal mit je 2 ml 1xPBS für je
2 Minuten gewaschen. Durch 20 min Inkubation mit 2 ml PBS 10 % FCS wurde geblockt.
1 ml 1xPBS 10 % FCS wurde mit 0,2 μ l Trypanblau und 2 μ l Anti His(C-term)-FITC
Antikörper gemischt und auf die Zellen gegeben. Nach 1 h Inkubation im Dunkeln bei
Raumtemperatur wurden die Zellen zweimal mit je 4 ml 1xPBS gewaschen. Die
Deckgläschen wurden aus den Vertiefungen entnommen, an der Luft getrocknet und mit
den Zellen nach unten auf Objektträger mit einem Tropfen Glycerin gegeben. Mit Hilfe
von Nagellack wurden die Deckgläschen auf dem Objektträger fixiert und anschließend
im Fluoreszenzmikroskop analysiert.
2.2.2.9. Stabilitätstest von HCV RNA in zellfreiem Medium
Es wurden 4 μ l HCV positives Plasma in 4 ml DMEM gegeben und zu je 1 ml auf 4 wells
einer 12-well-Platte verteilt. Die Zellkulturplatte wurde im Brutschrank bei konstanten
Bedingungen (37°C, 5 % CO2) inkubiert. Im Abstand von 2 Tagen wurden je 140 μl
Medium abgenommen und mittels RT-PCR der Virus RNA-Titer bestimmt. Die
Aufreinigung der HCV RNA erfolgte mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit nach
Protokoll. Eluiert wurde in 50 μ l AVE-Puffer. Die entnommene Mediumsmenge wurde
mit 140 μ l DMEM aufgefüllt.
2.2.2.10. HCV Infektion von FRhK-4-RLI-Klonen
2x106 Zellen der FRhK-4-RLI-Klone wurden in einer 6-well-Platte ausgesät und bei 37°C,
5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Medium entnommen und pro well
150 μ l HCV positives Frischplasma zugegeben (MOI = 1). Nach 2 h Inkubation im
Brutschrank wurde das Inokulum abgenommen und dreimal mit 1xPBS gewaschen.
Anschließend wurde frisches Medium zugegeben. 140 μl Überstand wurden als 0 d - Wert
zur Bestimmung der HCV RNA herangezogen. Die entnommenen 140 μ l wurden durch
frisches Medium aufgefüllt.
Material und Methoden
46
2.2.2.11. HCV Infektion transient RLI-transfizierter Huh7- und FRhK-4-Zellen
2x106 Zellen Huh7 bzw. FRhK-4 wurden in einer 24-well-Platte ausgesät und bei 37°C,
5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag wurden die wells mit je 3 μg des entsprechenden
pl.18_RLI-Plasmides nach Protokoll transfiziert. 48 h nach Transfektion wurde das
Medium entnommen und pro well 150 μ l HCV Frischplasma zugegeben (MOI = 1). Nach
2 h Inkubation im Brutschrank wurde das Inokulum abgenommen und dreimal mit 1xPBS
gewaschen. Anschließend wurde frisches Medium zugegeben. 140 μ l Überstand wurden
als 0 d - Wert zur Bestimmung der HCV RNA herangezogen. Die entnommenen 140 μ l
wurden durch frisches Medium aufgefüllt. 5 Tage nach Infektion (6 Tage nach
Transfektion) wurden die Zellen in eine 12-well-Platte überführt. Der Überstand wurde
zuvor abgenommen und 140 μ l zur Bestimmung der HCV-RNA eingesetzt. Die
Aufreinigung der HCV RNA erfolgte mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit nach
Protokoll. Eluiert wurde in 50 μ l AVE-Puffer. 24 h nach Umsetzung wurden die Zellen
zur Aufrechterhaltung der RLI-Expression erneut wie beschrieben transfiziert (Einsatz von
5 μg des entsprechenden pl.18_RLI-Plasmides). Weitere 6 Tage später wurden die Zellen
in eine 6-well-Platte überführt und am folgenden Tag mit 5 μg des entsprechenden RLI-
Plasmides transfiziert.
2.2.2.12. Transfektion in vitro transkribierter RNA in Huh7- und FRhK-4-Zellen
Für die Transfektion von in vitro transkribierter HCV RNA (IVT) in FRhK-4- oder Huh7-
Zellen war die Angabe der IVT Konzentration in [ng/μ l] notwendig. Die Umrechnung von
[IU/μ l] in [g/μ l] wurde folgendermaßen berechnet:
Konz [g/μ l] = cop/μ l*330 g/mol*10 kb/6*1023
Dabei entsprachen 330 g/mol dem Gewicht der RNA und 10 kb der Länge des IVT.
Die Angabe der HCV Viruslast in Internationale Einheit (IU) ist eine mehr oder weniger
willkürlich festgesetzte Einheit. Der Umrechnungsfaktor von IU zu Kopien liegt zwischen
2 und 5. Für die Umrechnung von HCV Internationalen Einheiten in Kopien wurde in der
vorliegenden Arbeit der Faktor 3 verwendet (http://www.hepatitis-c.de/titer.htm).
Material und Methoden
47
2x106 Zellen Huh7 bzw. FRhK-4 wurden in einer 24-well-Platte ausgesät und bei 37°C,
5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag erfolgte die Transfektion von IVT ebenfalls mit
dem FuGene 6 Transfection Reagent nach bereits beschriebenem Protokoll. Pro well der
24-well-Platte wurden 250 ng IVT für die Transfektion eingesetzt. Nach 4stündiger
Inkubationszeit wurde der IVT-haltige Überstand abgenommen, zweimal mit 1xPBS
gewaschen und frisches DMEM auf die Zellen gegeben.
2.2.2.13. Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA in transient
RLI-transfizierten Huh7- und FRhK-4-Zellen
2x106 Zellen Huh7 bzw. FRhK-4 wurden in einer 24-well-Platte ausgesät und bei 37°C,
5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag wurden die wells mit je 3 μg des entsprechenden
pl.18_RLI-Plasmides nach Protokoll transfiziert. Um den Zellen die RLI Expression zu
ermöglichen, wurde 48 h bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Die Transfektion von HCV full
length IVT erfolgte ebenfalls mit dem FuGene 6 Transfection Reagent nach bereits
beschriebenem Protokoll. Pro well der 24-well-Platte wurden 250 ng HCV IVT zur
Transfektion eingesetzt. Nach vierstündiger Inkubation wurde der HCV IVT-haltige
Überstand abgenommen, zweimal mit 1xPBS gewaschen und frisches DMEM auf die
Zellen gegeben.
2.2.2.14. Aufreinigung viraler RNA mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit
Die Aufreinigung der viralen RNA aus Zellkulturüberstand oder virushaltigem Medium
erfolgte mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit nach Protokollangaben des Herstellers.
Eluiert wurde in 50 μ l AVE-Puffer. Die Berechnung der RNA-Konzentration der
eingesetzten Probe errechnet sich nach folgender Formel:
RNA-Konz. der eingesetzten Probe [IU/μ l]= calc. Konz. [IU/μ l] * 50 μ l / 140 μ l
calc. Konz. = kalkulierte Konzentration der Probe durch die Software der RotorGene™
anhand der mitgeführten Standardreihe
50 μ l = Menge des Eluates
140 μ l = Menge der eingesetzten Probe
Ergebnisse
48
3. Ergebnisse
3.1. Erstellung der real time PCRs
Unter den Bedingungen der experimentellen HCV Infektion wurden die Expressionsraten des
RLI und der RNase L analysiert. Zur Analyse und Auswertung der mRNA Transkription von
RNase L und RNase L Inhibitor war daher die Erstellung spezifischer und quantitativer real
time PCRs notwendig. Ebenfalls wurden real time PCRs für die konstitutiv in Zellen
exprimierten Referenzgene 18S rRNA und GAPDH entwickelt.
Zum Nachweis und zur Quantifizierung von HCV RNA wurde ein HCV RotorGene System
auf der Basis eines bestehenden Systems entwickelt. Vorhandene Primer und Sonden der
Firma QIAGEN Hamburg wurden in einem neuen Puffer- und Enzymsystem optimiert und
validiert. Wegen großer Probleme des alten Systems aufgrund qualitätiver Schwankungen der
reversen Transkriptase erfolgte eine Umstellung der bisher verwendeten Enzyme auf Enzyme
anderer Hersteller. Das neue System kann außerdem kostengünstiger als das bisherige System
produziert werden.
3.1.1. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI
und GAPDH sowie der 18S rRNA
Die Analyse der mRNA Transkription von RNase L, RLI, und GAPDH sowie der 18S rRNA
erfolgte mit Hilfe einer two-step PCR. Nach der cDNA Synthese zellulärer RNA mit random
hexamer Primern erfolgte in der real time PCR die spezifische Amplifikation der zu
analysierenden Gene. Nach Design und Auswahl spezifischer Primer und Sonden für die
RNase L, das RLI sowie die Referenzgene 18S rRNA und GAPDH (sieheTabelle 2) erfolgte
die Optimierung der real time PCRs auf dem ABI 7900HT. Zum PCR-Ansatz von 10,1 μl
Wasser, 12,5 μ l ABI 2x Puffer, je 0,1 μ l Primer und Sonde sowie 0,1 μ l Platinum Taq wurden
2 μ l cDNA Template gegeben und im TaqMan amplifiziert (initiale Denaturierung: 10 min -
95°C;
40 Zyklen: Denaturierung 15 sec - 95°C, Amplifikation 1 min - 55°C). Zur relativen
Quantifizierung der eingesetzten Proben, wurden logarithmische Verdünnungsreihen aus
ZC-5.1 (RNase L), pcDNA3.1/RLI 3’ (RLI) und cDNA aus Nieren gesamt-Zell-RNA
(18S rRNA und GAPDH) mitgeführt. Mit Hilfe dieser definierten Standardreihen berechnete
Ergebnisse
49
die ABI 7900HT SDS 2.1 Software die in den unbekannten Proben enthalte RNA. Dabei wird
davon ausgegangen, dass das Verhältnis der cDNA proportional zur mRNA ist. Für jede
spezifische mRNA entsteht während der cDNA Synthese in einem konstanten Verhältnis
entsprechend viel cDNA.
3.1.1.1. Effizienz
Die PCR-Effizienz ist ein Maß für das Verhältnis von Amplifikat- und eingesetzter
Probenmenge. Im Idealfall liegt eine Verdopplung der Amplifikate pro Zyklus vor, was einer
PCR-Effizienz von 100 % entsprechen würde. Zur Berechnung der PCR-Effizienz wurde die
„slope“-Methode (Anstiegsmethode) verwendet. Bei dieser Methode wird eine logarithmische
Verdünnungsreihe für jedes Template (RNase L, RNase L Inhibitor, 18S rRNA, GAPDH)
hergestellt und der ct-Wert jedes Verdünnungspunktes bestimmt. Da in humaner gesamt-Zell-
RNA zu wenig RNase L und RLI vorhanden sind, um Verdünnungsreihen über mehrere
Logstufen herzustellen, wurden für diese Parameter die entsprechenden Plasmide ZC-5.1
(RNase L) und pcDNA3/RLI 3’ (RLI) verwendet. Für die Erstellung der Verdünnungsreihen
von 18S rRNA und GAPDH wurde cDNA aus humaner Nieren (kidney) gesamt-Zell-RNA
verwendet.
In Abbildung 14 bis Abbildung 17 wurden die ct-Werte der einzelnen Verdünnungspunkte
gegen die jeweiligen logarithmischen Konzentrationen der cDNA aufgetragen. Eine lineare
Regressionsgerade (y = ax + b) wurde durch die ABI 7900HT SDS Software generiert und ihr
Anstieg bestimmt. Liegt die PCR-Effizienz bei (E) = 1,0 (100 %), würde der erwartete
Anstieg (a) einer logarithmischen Verdünnungsreihe -3,32 betragen. Die PCR-Effizienz
berechnet sich mit der Anstiegsmethode der linearen Regressionsgeraden nach der Formel:
E = 10(-1/Anstieg) -1 (Eurogentec, 2004). Nach Ermittlung des Anstiegs der Regressionsgeraden
ergab sich für die erstellten PCRs von RNase L, RLI, 18S rRNA und GAPDH eine Effizienz
von über 99 %. (siehe Tabelle 5)
Tabelle 5: PCR-Effizienz Anstieg E = 10(-1/Anstieg) -1 PCR-Effizienz
RLI -3,34 E = 10(0.299) -1 99,2%
RNase L -3,3 E = 10(0,3) -1 100%
18S rRNA -3,33 E = 10(0,3) -1 99,7%
GAPDH -3,169 E = 10(0,31) -1 101%
Ergebnisse
50
Abbildung 14: Verdünnungsreihe der RNase L aus dem Plasmid ZC-5.1. Die ct-Werte der Verdünnungspunkte wurden gegen die logarithmische Konzentration des Plasmides aufgetragen und eine Regressionsgerade generiert.
Abbildung 15: Verdünnungsreihe der RLI aus dem Bisbal-Plasmid. Die ct-Werte der Verdünnungspunkte wurden gegen die logarithmische Konzentration des Plasmides aufgetragen und eine Regressionsgerade generiert.
Ergebnisse
51
Abbildung 16: Verdünnungsreihe der 18S rRNA aus kidney cDNA. Die ct-Werte der Verdünnungspunkte wurden gegen die logarithmische Konzentration der cDNA aufgetragen und eine Regressionsgerade generiert.
Abbildung 17: Verdünnungsreihe von GAPDH aus kidney cDNA. Die ct-Werte der Verdünnungspunkte wurden gegen die logarithmische Konzentration der cDNA aufgetragen und eine Regressionsgerade generiert.
3.1.1.2. Spezifität
Um unspezifische Amplifikate mit positivem Signal im TaqMan auszuschließen, wurde
gesamt-Zell-RNA in cDNA umgeschrieben und als Template in die verschiedenen real time
PCRs (RLI, RNase L, 18S rRNA, GAPDH) eingesetzt. Die PCR-Amplifikate wurden im
3%igen Agarosegel überprüft (siehe Abbildung 18). Es konnten keine unspezifischen Banden
beobachtet werden. Die spezifischen Proben zeigten Banden der erwarteten Größen von 60 bp
für die RNase L, 111 bp für das RLI, 110 bp für die 18S rRNA und 100 bp für GAPDH.. Alle
Wasserkontrollen zeigten weder ein Signal in der real time PCR noch eine Bande im
Agarosegel.
Ergebnisse
52
60 bp →← 100 bp
Abbildung 18: Spezifität der real time PCRs zum Nachweis der mRNAs von RNase L, RLI, GAPDH sowie der 18S rRNA: Spur 1-2: RNase L aus FRhK-4-RNA (Fragmentgröße 60 pb); Spur 3-4: RNase L Wasserkontrolle; Spur 5-6: RLI aus pcDNA3.1_RLI (Fragmentgröße 111 bp); Spur 7-8: RLI Wasserkontrolle; Spur 9-10: 18S rRNA aus FRhK-4-RNA (Fragmentgröße 110 bp); Spur 11-12: 18S rRNA Wasserkontrolle; Spur 13-14: GAPDH aus FRhK-4-RNA (Fragmentgröße 100 bp), Spur 15-16: GAPDH Wasserkontrolle; M: 100 pb Marker Fermentas
3.1.2. Real time RT-PCR zum quantitativen Nachweis der HCV RNA
Auf der Basis existierender Primer und Sonden der Firma QIAGEN Hamburg (ehemals artus
GmbH) wurde ein neues one-step HCV Nachweissystem für den RotorGene entwickelt. Es
wurden verschiedene pH-Werte eines 5x-in-house-Puffers ausgetestet, sowie diverse Enzyme
verschiedener Hersteller. Nach Auswahl des Puffer-pH-Wertes wurden Enzyme, dNTPs,
Magnesium, Primer und Sonden titriert. Die finale Version des neu entwickelten HCV RT-
PCR Nachweissystems soll von der QIAGEN Hamburg GmbH als Kit vertrieben werden. Die
genaue Zusammensetzung der einzelnen Kit Komponenten sowie die Sequenzen von Primer
und Sonden unterliegen der Geheimhaltung und werden deshalb in dieser Arbeit nicht
veröffentlicht. Die Optimierungsversuche wurden mit in vitro transkribierter RNA sowie
bereits aufgereinigten Positivkontrollen des Blutspendedienstes in Springe durchgeführt. In
einem RT-PCR-Ansatz von 25 μ l (15 μ l Master + 10 μ l Probe) wurden die Proben dieser
Arbeit im RotorGene amplifiziert (Temperaturprofil siehe 2.2.1.12).
3.1.2.1. Testung des HCV RotorGene Assay auf Kreuzreaktivität
Um falsch positive Ergebnisse im RotorGene auszuschließen, wurden verschiedene Erreger-
Genome auf mögliche Amplifikation im HCV Assay getestet (siehe Abbildung 19): Unter
Ergebnisse
53
anderem wurden aufgereinigte Erregermaterialien wie HAV, HIV, Parvo, HSV 1 und 2, VZV,
und CMV getestet, die wie das Hepatitis C Virus in Blutprodukten oder Plasma vorkommen
können (weitere getestete Erregermaterialien siehe Abbildung 19). Bei keinem der
eingesetzten Erregermaterialien konnte ein positives Signal in der RT-PCR nachgewiesen
werden. Zur Kontrolle der RT-PCR wurde die HCV Standardreihe mitgeführt.
Abbildung 19: Kreuzreaktivitätstest des HCV RotorGene System: Es wurden verschiedene Erreger-Genome ins HCV RG System eingesetzt und auf potentielle Amplifikation getestet. Es wurde lediglich die HCV Standardreihe amplifiziert.
3.1.2.2. Sensitivität des HCV RotorGene Nachweissystems
Zur Bestimmung der Senstitivität des HCV RotorGene Systems wurde eine Probit-Analyse
durchgeführt. Es wurden 6 Verdünnungsstufen von HCV-positivem Frischplasma des
Blutspendedienstes aus Hagen in DMEM angesetzt und zu je 8 Replikaten mit dem
QIAamp®Viral RNA Mini Kit aufgereinigt. Die Elution der HCV RNA erfolgte in je 50 μl
AVE-Puffer. Jedes Replikat der Verdünnungsstufen wurde in drei unabhängigen RT-PCR-
Läufen analysiert. Die Daten der drei Sensitivitätsläufe wurden mit Hilfe des Programms
PriProbit Vers. 1.63 analysiert. Die von dem Programm berechneten Daten wurden mit Excel
graphisch ausgewertet (siehe Abbildung 20). Dabei wurden die Wahrscheinlichkeiten, mit
denen eine Anzahl an Internationalen Einheiten (IU, dose) noch nachgewiesen werden kann,
gegen den Logarithmus der entsprechenden IUs aufgetragen. Durch die Datenpunkte wurde
anschließend eine Sigmoidalkurve gelegt und der 95 % Wert durch zwei sich kreuzende
Ergebnisse
54
Linien gekennzeichnet. Das Programm PriProbit errechnet diesen 95 % Wert aus der
Gleichung für die Sigmoidalkurve. Die Zusammenfassung der Daten ist in Tabelle 6
dargestellt. Die berechneten Wahrscheinlichkeiten, mit denen die Proben im RotorGene
Assay detektiert werden können, sind in Tabelle 7 aufgeführt. Die graphische Auswertung der
Probitanalyse ist in der darauf folgenden Abbildung 20 dargestellt. Die Probit-Analyse ergab
eine Nachweisgrenze von 35 IU/ml auf einem Signifikanzniveau von 0,05. Das heißt, in dem
entwickelten HCV RotorGene System können 35 IU/ml mit einer Wahrscheinlichkeit von
95 % nachgewiesen werden.
Die Menge an Viren, die in einer definierten Menge Plasma vorkommt wird als Viruslast
bezeichnet. Die Angabe der Viruslast erfolgt in IU/ml. Diese Einheit ist mehr oder weniger
willkürlich festgesetzt. Für die Umrechnung von Internationalen Einheiten (IU) in
Viruskopien werden verschiedene Faktoren verwendet. Diese liegen zwischen 2 und 5 Viren
pro IU. Für diese Arbeit wurde der Faktor 3 verwendet. Das bedeutet, bei einer analytischen
Nachweisgrenze von 35 IU/ml können im HCV RotorGene System noch 105 cop/ml mit einer
Wahrscheinlichkeit von 95 % detektiert werden.
Tabelle 6: Zusammenfassung der Daten der Sensitivitätsläufe
Tabelle 7: berechnete Wahrscheinlichkeiten, mit denen die Proben im HCV RotorGene System nachgewiesen werden konnten
IU/ml N Anzahl positiver Proben
100 24 24
50 24 24
25 24 21
12.5 24 18
6.25 24 16
3.125 24 10
N: Gesamtprobenzahl
A
Log (dose) Wahrscheinlichkeit
2.000 1.000
1.699 1.000
1.398 0.875
1.097 0.750
0.796 0.667
0.495 0.417
Geradengleichung: Y = -1.119 + 1.791X
B
Ergebnisse
55
Probit-Analyse: Hepatitis C Virus (RotorGene 3000)
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3log (dose)
Pro
port
ions
1.54363 ~ 34.965 IU/ml (95%)
95%
Abbildung 20: Analytische Sensitivität des HCV RotorGene System. Aufgetragen sind die logarithmischen Konzentrationen der gesteteten Proben gegen die Wahrscheinlichkeiten, mit denen diese im HCV RotorGene System nachgewiesen werden konnten. Die Nachweisgrenze (95 % -Wert) lag bei 35 IU/ml. Für eine Angabe der HCV RNA in Viruskopien ergab sich eine Nachweisgrenze von 105 cop/ml.
3.1.2.3. Nachweis verschiedener HCV Subtypen
Um sicherzustellen, dass mit dem HCV RotorGene Assay alle HCV Subtypen detektiert
werden, wurde das Subtypenpanel der Universität Essen aufgereinigt und im HCV RotorGene
System getestet. Das Subtypenpanel umfasst die Subtypen 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 2i, 3a, 4, 5a und
6. Die Konzentrationen der verschiedenen Plasmaproben waren vom Hersteller bekannt. Alle
Plasmaproben wurden auf eine Konzentration von 50 IU/ml eingestellt, mit dem
QIAamp®Viral RNA Mini Kit aufgereinigt und 10 μ l Eluat im HCV RotorGene Assay
eingesetzt. Es wurden alle HCV-positiven Proben im RotorGene Assay detektiert (siehe
Abbildung 21), während die Negativkontrolle kein Signal lieferte. Anhand der mitgeführten
Standardreihe wurde durch die RotorGene Software die Konzentration der eingesetzten Eluate
kalkuliert. Aus diesen Werten wurden die Konzentrationen der Plasmaproben berechnet (siehe
Tabelle 8). Die berechneten Konzentrationen der Proben lagen zwischen 27 IU/ml (Subtyp
3a) und 143 IU/ml (Subtyp 4). Die Konzentrationen unter 50 IU/ml ergeben sich aufgrund
von Aufreinigungsverlusten oder Pipettierschwankungen. Ein Faktor von 2 ist durch
Pipettierschwankungen sowohl bei der Aufreinigung als auch der RT-PCR möglich und
akzeptabel. Da die Standardreihe aus in vitro Transkripten von Subtyp 1a besteht, sind
Schwankungsfaktoren auch durch unterschiedliche Sensitivitäten und Spezifitäten in der
Ergebnisse
56
Detektion anderer Subtypen möglich. Um dies auszuschließen, müsste zur genauen
Quantifizierung der einzelnen Subtypen für jeden Subtyp eine spezifische Standardreihe
mitgeführt werden. Da für alle Versuche die gleiche Standardreihe verwendet wird, ist dies
nicht nötig. Ein möglicher Faktor würde für alle Proben gleichermaßen gelten.
Abbildung 21: Nachweis verschiedener HCV Subtypen im HCV RotorGene Assay. Getestet wurden die Subtypen 1 bis 6. Alle Subtypen wurden detektiert, während die Wasserkontrolle kein Signal zeigte.
Tabelle 8: Darstellung der kalkulierten Konzentrationen der HCV Eluate und berechneten Konzentrationen der auf 50 IU/ml eingestellten Plasmaproben
Subtyp calc. IU/μl IU/ml Probe 1a 0.2438 87.07 1b 0.2455 87.68 2a 0.3486 124.50 2b 0.1199 42.82 2c 0.2199 78.54 2i 0.1175 41.96 3a 0.0746 26.64 4 0.4004 143.00 5a 0.2612 93.29 6 0.1465 52.32
Ergebnisse
57
3.1.3. Zusammenfassung real time PCRs
Es wurden quantitative real time PCRs zum spezifischen Nachweis der mRNAs von
RNase L und RLI entwickelt. In two-step Reaktionen erfolgten zunächst die cDNA Synthese
aus gesamt-Zell-RNA mit random hexamer Primern und anschließend die spezifischen real
time PCRs. Zur relativen Quantifizierung wurden die zellulären Housekeeping-Gene
18S rRNA und GAPDH verwendet, für welche ebenfalls spezifische real time PCRs
entwickelt wurden. Keine der erstellten real time PCRs zum Nachweis der mRNAs von
RNase L, RLI und GAPDH sowie von 18S rRNA zeigte unspezifische Amplifikationen. Alle
PCR-Effizienzen betrugen mindestens 99 %.
Ebenfalls wurde ein neues HCV RotorGene Nachweissystem entwickelt und optimiert. Der
Nachweis der HCV RNA erfolgte in einer one-step RT-PCR. Auf der Basis existierender
Primer und Sonden wurde nach Umstellung des gesamten Puffer- und Enzymsystems ein in
seiner Herstellung kostengünstiges und in seiner Anwendung reproduzierbares Assay
entwickelt. Die Probleme des vorangegangenen HCV Systems durch Qualtitätsschwankungen
der Reversen Transkriptase wurden durch die Verwendung der RT eines anderen Herstellers
eliminiert. Das neue System zeigte keinerlei Kreuzreaktivität mit verschiedenen RNA- oder
DNA-Erregermaterialien. Die analytische Nachweisgrenze des HCV RotorGene Systems lag
bei 35 IU/ml bzw. 105 cop/ml.
3.2. RNase L Inhibitor
Um eine potentielle Aktivität der RNase L auszuschalten, wurde in der vorliegenden Arbeit
der RNase L Inhibitor sowohl in FRhK-4- als auch in Huh7-Zellen überexprimiert. Da das
Referenzplasmid pcDNA3/RLI 3’ die Sequenz des humanen RLI enthielt, wurde das RLI aus
FRhK-4 Zellen full length amplifiziert und kloniert. Parallel zu dieser Amplifikation wurde
das humane RLI aus Nieren-gesamt-Zell-RNA erneut full length amplifiziert und ebenfalls
kloniert. In einer weiteren full length Amplifikation wurde das Stop-Codon des RLI
ausgeschaltet, um den His-Tag des Klonierungsverktors pcDNA3.1/V5-His zu exprimieren
3.2.1. Sequenzierung RNase L Inhibitor
Nach Isolation, full length Amplifikation und Klonierung des RNase L Inhibitors wurde
dieser in den pcDNA3.1/V5-His-Plasmiden sequenziert und anhand der Datenbanksequenz
Ergebnisse
58
Acc.nr. X74987 (Bisbal et al., 1995) analysiert. Gegenüber der Datenbanksequenz zeigten
sowohl das humane als auch das FRhK-4 RLI gehäufte Nukleotidaustausche in den
Abschnitten 520 bp bis 540 bp und 1412 bp bis 1422 bp (siehe Abbildung 22 A und B). Die
Nukleotidunterschiede bewirken eine Veränderung der Aminosäuresequenz innerhalb dieser
Bereiche (siehe Abbildung 22 C und D). Um Mutationen durch full length Amplifikation und
Klonierung auszuschließen, wurde das RLI im Referenzplasmid pcDNA3/RLI 3’ von C.
Bisbal sequenziert. Das RLI-Insert des pcDNA3/RLI 3’ zeigte ebenfalls die Nukleotid- und
Aminosäuresequenz der full length amplifizierten RLI-Gene aus humaner- bzw. FRhK-4-
gesamt-Zell-RNA. Damit unterschieden sich sowohl die Sequenz des Referenzplasmides
pcDNA3/RLI 3’ als auch die in dieser Arbeit amplifizierten RLI-Genabschnitte von der
Datenbanksequenz. Es ist anzunehmen, dass ein Sequenzierfehler zu der in der Datenbank
angegebenen Sequenz geführt hat. Sequenzen und Alignments des kompletten RNase L
Inhibitors aus humaner- bzw. FRhK-4-gesamt-Zell-RNA sowie des Bisbal-Plasmides und der
NCBI Referenz befinden sich im Anhang dieser Arbeit (siehe Kapitel 7.2).
1
2
3
4
A
1
2
3
4
B
1
2
3
4
C
1
2
3
4
D
Abbildung 22: Sequenzierung der verwendeten RLI–Fragmente: A und B: Nukleotidsequenz und Alignment; C und D: Aminosäuresequenz im Einbuchstaben-Code und Alignment; 1 = RLI Sequenz NCBI Acc.nr X74987, 2 = RLI aus pcDNA3/RLI 3’, 3 = RLI full lengthamplifiziert aus humaner gesamt-RNA, 4 = RLI full length amplifiziert aus FRhK-4-gesamt-Zell-RNA
Ergebnisse
59
3.2.2. Transfektion mit jetPEI bzw. FuGene 6 Transfection Reagent
Für die Transfektion des klonierten RLI in FRhK-4- und Huh7-Zellen wurden die
Transfektionsreagenzien jetPEI der Firma QBiogene und FuGene 6 Transfection Reagent der
Firma Roche getestet.
Das kationische Polymer jetPEI (Polyethylenimin) bildet Komplexe mit der Plasmid-DNA.
Die positive Nettoladung dieser Komplexe ermöglicht die Interaktion mit anionischen
Glykoproteinen auf der Zelloberfläche und anschließend die Aufnahme der jetPEI-DNA-
Komplexe in die Zelle durch Endocytose. Auch die Transfektion mit FuGene 6 erfolgt durch
Komplexbildung. Die kationischen Lipide des FuGene 6 Transfection Reagent binden an die
negativ geladene Plasmid-DNA und können als Liposomen-Nukleinsäure-Komplex mit der
Plasmamembran der Zelle fusionieren.
Die Transfektion wurde sowohl mit jetPEI als auch mit dem FuGene 6 Transfection Reagent
und den RLI-Plasmiden pcDNA3.1/V5-His-m_RLI für FRhK-4- und pcDNA3.1/V5-His-
h_RLI für Huh7-Zellen durchgeführt und die Zellen nach 24 h geerntet. Die verschiedenen
Transfektionsreagenzien wurden mit und ohne Plasmid getestet. Dadurch wurde
ausgeschlossen, dass die Transfektionsreagenzien einen regulativen Einfluss auf die mRNA-
Transkription des konstitutiv exprimierten zellulären RLI ausüben. Die zelluläre RNA wurde
mit dem RNeasy® Mini Kit aufgereinigt und DNase I verdaut. Mittels real time PCR wurden
die RLI-Transkriptionsraten bestimmt (siehe Abbildung 23). Mit jetPEI zeigten die FRhK-4-
und Huh7-Zellen eine sechsfach erhöhte Transkription des RNase L Inhibitors. Der Einsatz
von FuGene 6 führte zu einer fünffachen Überexpression des RLI in FRhK-4-Zellen und zu
einer siebenfachen Überexpression des RLI in Huh7-Zellen. Ohne Zusatz des pcDNA3.1/V5-
His_RLI konnte keine erhöhte RLI-Expression detektiert werden. Mit diesem Ergebnis wurde
ein potentieller Einfluss von jetPEI oder FuGene 6 auf die Transkription des zellulären RLI
ausgeschlossen. Die Grenzwerte der Genexpression wurden bei 0,5 und 2 definiert. Diese
Werte entsprechen Transkriptionsabweichungen um Faktoren von -/+ 2 und gelten damit als
nicht reguliert.
Ergebnisse
60
0
1
2
3
4
5
6
7
8re
lati
ve E
inh
eite
n R
LI-
mR
NA
in R
elat
ion
zur
18S
rR
NA
un
d un
beha
ndel
ter
Kon
trol
le
jetPEI+pcDNA3.1/V5-His_RLIjetPEIFuGene+pcDNA3.1/V5-His_RLIFuGene
A
0
1
2
3
4
5
6
7
8
rela
tive
Ein
hei
ten
RL
I-m
RN
A
in R
elat
ion
zur
18S
rR
NA
und
unb
ehan
delte
r K
ontr
olle
jetPEI+pcDNA3.1/V5-His_RLIjetPEIFuGene+pcDNA3.1/V5-His_RLIFuGene
B
Abbildung 23: Vergleich der Transfektionsreagenzien jetPEI und FuGene 6 hinsichtlich der relativen Einheiten an RLI-mRNA. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA. Es wurden sowohl die Transfektionsreagenzien mit RLI-Plasmid als auch ohne Plasmid getestet. Die Auswertung der Expressionsdaten erfolgte 24 h nach Transfektion. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. Der Einsatz der Transfektionsreagenzien ohne Plasmid hatte keinen Einfluss auf die RLI-Expression. A: Huh7-Zellen, B: FRhK-4-Zellen
Der Einfluss der Transfektion mit und ohne RLI-Plasmid auf die 18S rRNA der Zellen ist in
Abbildung 24 dargestellt. Weder jetPEI noch FuGene 6 hatten innerhalb von 24 h einen
quantitativen Einfluss auf die 18S rRNA der Zellen. In Transfektionsversuchen mit jetPEI
über längere Inkubationszeiten, zeigte sich eine übermäßig starke Zunahme toter Zellen
(Daten nicht gezeigt, da mikroskopische Beobachtungen). Diese Beobachtungen waren
unabhängig davon, ob die Transfektionen mit oder ohne Zusatz der RLI-Plasmide
durchgeführt wurden. Aus diesem Grund ist davon auszugehen, dass jetPEI einen Einfluss auf
die Vitalität und Lebensfähigkeit der Zellen hat. Diese Langzeit-Auswirkungen konnten bei
der Verwendung von FuGene 6 Transfection Reagent nicht beobachtet werden, so dass in den
weiteren Versuchen FuGene 6 als Transfektionsreagenz verwendet wurde.
Ergebnisse
61
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600re
lati
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inh
eite
n 1
8S r
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A
jetPEI+pcDNA3.1/V5-His_RLIjetPEIFuGene+pcDNA3.1/V5-His_RLIFuGene
A
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
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Ein
hei
ten
18S
rR
NA
jetPEI+pcDNA3.1/V5-His_RLIjetPEIFuGene+pcDNA3.1/V5-His_RLIFuGene
B
Abbildung 24: Einfluss der Transfektion auf die 18S rRNA. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten 18S rRNA. Es wurden sowohl der Einsatz der Transfektionsreagenzien mit RLI-Plasmid als auch ohne Plasmid im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen getestet. Die Auswertung der Expressionsdaten erfolgte 24 h nach Transfektion. Die Berechnung der relativen 18S rRNA Einheiten erfolgte durch eine externe Verdünnungsreihe von cDNA aus Nieren-gesamt-Zell-RNA A: Huh7-Zellen, B: FRhK-4-Zellen
3.2.3. RLI-Kinetik nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI
Die Überexpression des RLI sollte über eine möglichst lange Inkubationszeit mit möglichst
hohen Expressionsraten erfolgen. Um den Verlauf der transienten Transkription des RLI zu
analysieren, wurde eine Kinetik erstellt. RLI-transfizierte Zellen wurden 1 bis 4 Tage nach
Transfektion geerntet, die RNA mit dem RNeasy® Mini Kit aufgereinigt und DNase I verdaut.
Die Bestimmung der Transkriptionsraten erfolgte mittels real time PCR (siehe Abbildung 25).
Nach 24 h wurde in den FRhK-4-Zellen eine leicht erhöhte RLI-Transkription um den Faktor
3 detektiert. Der Höhepunkt der Überexpression wurde nach 2 Tagen mit einer gesteigerten
relativen RLI-mRNA-Menge um den Faktor 6 gemessen. Nach 3 Tagen überschritt die
Transkriptionsrate gerade noch den Grenzwert der nicht-regulierten Genexpression von
zweifach und war nach 4 Tagen nicht mehr nachweisbar. Die Huh7-Zellen erreichten bereits
nach 24 h die maximale Steigerung der RLI-mRNA-Menge um den Faktor 5. In den weiteren
Tagen nahm die relative mRNA-Menge des RLI stetig ab. Nach 4 Tagen konnte nur noch eine
erhöhte Expression des RNase L Inhibitors um den Faktor 3 nachgewiesen werden. Die
Ergebnisse der Expressionshöhe und der Expressionsdauer des RLI waren weder für die
FRhk-4- noch für die Huh7-Zellen zufriedenstellend. Die maximalen Transkriptionsraten und
die Dauer der erhöhten Expression von 4 Tagen waren viel zu gering. Aus diesen Gründen
Ergebnisse
62
wurden sowohl die Möglichkeiten eines anderen Expressionsvektors (pl.18) als auch der
stabilen Transfektion (statt transiente Transfektion) zur Steigerung der Transkriptionsraten
und Expressionsdauer herangezogen.
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Abbildung 25: RLI-Kinetik nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Zeit. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7-Zellen, B: FRhK-4-Zellen
3.2.4. Vergleich der Expressionsraten von pcDNA3.1/V5-His_RLI und pl.18_RLI
Da die maximalen Transkriptionsraten des pcDNA3.1/V5-His_RLI sehr gering ausfielen und
bereits nach 4 Tagen kaum eine erhöhte Transkription mehr nachgewiesen werden konnte,
wurde das RLI mit angehängten His-Tag in den Vektor pl.18 umkloniert. Dieser Vektor
zeichnet sich durch besonders hohe Expressionsraten aus und sollte eine stärkere und länger
anhaltende Expression des RLI ermöglichen. Um die Transkriptionsraten der Plasmide zu
vergleichen, wurden Huh7- und FRhK-4-Zellen zum einen mit den entsprechenden
pcDNA3.1/V5-His_RLI, zum anderen mit den entsprechenden pl.18_RLI transfiziert (siehe
Abbildung 26).
Ergebnisse
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pcDNA3.1V5-His/RLI pl.18-h_RLI
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pcDNA3.1V5-His/RLI pl.18-m_RLI
B
Abbildung 26: Vergleich der RLI-Transkriptionsraten nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI und pl.18_RLI. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7-Zellen, B: FRhK-4-Zellen
Bereits nach 24 h zeigten die Transfektionsansätze mit den pl.18_RLI Plasmiden eine deutlich
stärkere RLI-Transkription als die Ansätze mit den entsprechenden pcDNA3.1/V5-His_RLI.
Bei Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI wiesen die FRhK-4-Zellen eine gesteigerte
RLI-mRNA-Menge um den Faktor 4, die Huh7-Zellen um den Faktor 8 auf. Demgegenüber
lag die Erhöhung der RLI-mRNA-Menge durch pl.18_RLI für die FRhK-4-Zellen um einen
Faktor von 20 und für die Huh7-Zellen um einen Faktor von 38. Im Vergleich zum 24 h –
Wert (1 d) zeigte der 72 h – Wert (3 d) für die Transfektionen mit pcDNA3.1/V5-His_RLI
keine weitere Steigerung der RLI-Transkription. Durch Transfektion mit pl.18_RLI wurde
nach 3 Tagen für beide Zelllinien eine Überexpression um Faktoren oberhalb von 40 erreicht.
Nach 120 h (5 d) sanken die Transkriptionsraten mit pl.18_RLI wieder ab, lagen jedoch für
beide Zelllinien noch um den Faktor 10 höher als in den transfizierten Kontrollzellen. Unter
dem Einfluss von pcDNA3.1/V5-His_RLI war die Expression sowohl für FRhK-4- als auch
für Huh7-Zellen nur noch um den Faktor 2,5 erhöht. Aufgrund der deutlich besseren
Transkriptionsraten der pl.18_RLI Plasmide im Vergleich zu den pcDNA3.1/V5-His_RLI
Plasmiden wurden in den weiteren Versuchen die pl.18_RLI Plasmide verwendet.
Ergebnisse
64
3.2.5. Nachweis der RLI-Expression mittels Immunfluoreszenz
Um nachzuweisen, ob die hohen RLI-Transkriptionsraten mit der RLI-Proteinsynthese
korrelieren, wurden diese mittels Immunfluoreszenz kontrolliert. Dazu wurden FRhK-4- und
Huh7-Zellen auf Deckgläschen angezogen und mit den entsprechenden pl.18_RLI Plasmiden
transfiziert. 3 Tage nach Transfektion wurden die Zellen mit Ethanol auf den Deckgläschen
fixiert und die synthetisierten RLI-Proteine mit Hilfe eines spezifischen FITC-gekoppelten
Antikörper gegen den angefügten His-Tag im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht (siehe
Abbildung 27).
A1
A2
B1
B2 Abbildung 27: Immunfluoreszenzen gegen den His-Tag der transfizierten pl.18_RLI Plasmide. Aufgenommen unter Blaulicht mit 40x Vergrößerung. A: Huh7-Zellen: A1 ohne RLI, A2 mit RLI, B: FRhK-4-Zellen: B1 ohne RLI, B2 mit RLI
In den nicht transfizierten Kontrollzellen waren weder bei FRhK-4- noch bei Huh7-Zellen
fluoreszierende Zellen zu finden (siehe Abbildung 27 A1 und B1). Die transfizierten Huh7-
Zellen zeigten sehr wenige leuchtende Zellen (siehe Abbildung 27 A2). Die transfizierten
FRhK-4-Zellen wiesen im Vergleich zu den Huh7-Zellen eine größere Anzahl und deutlich
Ergebnisse
65
stärker leuchtende Zellen auf. Generell gab es jedoch keine nebeneinanderliegenden
fluoreszierenden Zellen. Die Transfektionsrate betrug maximal 10 %. Nach der Messung
erhöhter RLI-mRNA um Faktoren von bis zu 40 nach 3 Tagen (siehe Abbildung 26) wurden
deutlich mehr leuchtende Zellen in der Analyse der Immunfluoreszenz erwartet. Es kann nicht
beurteilt werden, ob lediglich diese geringe Anzahl an Zellen transfiziert wurde oder die
Proteindichte für den Nachweis durch die Immunfluoreszenz noch oder nicht mehr
ausreichend war.
3.2.6. Stabile Überexpression des RLI in FRhK-4- und Huh7-Zellen
Da in transient RLI-transfizierten Zellen bereits nach 1 Woche keine erhöhte Menge an RLI-
mRNA mehr nachweisbar war, sollte das RLI stabil in FRhK-4- und Huh7-Zellen
überexprimiert werden. Dadurch sollte eine dauerhafte und konstante Transkriptionsrate des
RLI erreicht werden. FRhK-4- und Huh7-Zellen wurden mit den entsprechenden pl.18_RLI
Plasmiden transfiziert und potentielle Klone mit Hilfe von G418 selektiert. Eine Woche nach
Transfektion wurden die Zellen in Ansätzen von 1:500 bis 1:5000 gesplittet und das
Wachstum einzelner Klonkolonien beobachtet. Die Selektion stabil transfizierter Huh7-Klone
war nicht möglich, da Huh7-Zellen bei dem sehr hohen Umsetzungsverhältnis im Rahmen der
Klonselektion ihr Wachstum komplett einstellten. Es konnten lediglich Mischklone selektiert
werden, bei denen jedoch nach kurzer Zeit keine erhöhte RLI-Transkriptionsrate mehr
nachgewiesen werden konnte. Von den FRhK-4-Zellen wurden 11 Klonkolonien selektiert
und auf RLI-Überexpression untersucht. 5 Wochen nach Transfektion zeigten noch 6 dieser
11 Klone eine erhöhte Menge an RLI-mRNA (siehe Abbildung 28 A). Die Klone 4, 5 und 8
zeigten gesteigerte Transkriptionsraten um Faktoren von 5 bis 6,5. Die Klone 1, 7 und 11
zeigten erhöhte Transkriptionen um Faktoren von 7,5 bis 8,5. Gegenüber der relativen
Mengen an RLI-mRNA von Tag 3 bis 5 bei einer transienten Transfektion (siehe Abbildung
26 B) zeigten alle stabil transfizierten FRhK-4-RLI-Klone vergleichsweise geringe
Überexpressionswerte des RNase L Inhibitors. 8 Wochen nach Transfektion wurden Aliquots
der Klone eingefroren und zu diesem Zeitpunkt die Transkriptionsraten erneut bestimmt
(siehe Abbildung 28 B). Es zeigte sich, bis auf Klon 5, eine Abnahme der relativen Mengen
an RLI-mRNA gegenüber den relativen Mengen an RLI-mRNA 5 Wochen nach Transfektion.
Die Transkriptionsraten der Klone 8 und 11 überschritten kaum noch den Grenzwert von 2.
Alle anderen Klone zeigten nur noch leicht erhöhte Transkriptionen um Faktoren von 4 bis 6.
Ergebnisse
66
Lediglich Klon 5 zeigte noch eine RLI-Überexpression um den Faktor 8, was gegenüber dem
5 Wochen-Wert eine Steigerung der Transkription bedeutete.
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Abbildung 28: RLI-Expression in stabil transfizierten FRhK-4-Klonen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Nummer der Klone. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: 5 Wochen nach Transfektion; B: 8 Wochen nach Transfektion
Die Klone 4 und 5 wurden zur Weiterkultivierung ausgewählt. Klon 4 mit einer
vergleichsweise niedrigen RLI-Überexpression und Klon 5 mit einer höheren
Transkriptionsrate. Die Zellen wurden geteilt, umgesetzt und die RLI-Transkriptionsrate nach
einer weiteren Woche erneut analysiert (siehe Abbildung 29). Klon 4 zeigte noch immer eine
leicht erhöhte RLI-mRNA-Menge um einen Faktor von ca. 4. Für Klon 5 konnte keine
Überexpression des RNase L Inhibitor mehr nachgewiesen werden. Somit konnten auch für
die FRhK-4 Zellen keine Klone mit konstant stabiler Überexpression des RNase L Inhibitors
gewonnen werden.
Durch mikroskopische Betrachtung wurden weder morphologische Veränderung der Zellen
noch ein erhöhtes Maß an toten Zellen festgestellt. Trotzdem ist nicht auszuschließen, dass
eine erhöhte RLI-Transkription mit anschließender RLI-Proteinsynthese toxisch auf die
Zellen wirkt und diese dadurch absterben.
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Abbildung 29: Bestimmung relativer Einheiten RLI-mRNA der FRhk-4-Klone 4 und 5. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Nummer der Klone. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. 10 Wochen nach RLI-Transfektion
3.2.7. RLI-Kinetik der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5
Die RLI-Expression der stabil transfizierten FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 wurde genauer
analysiert. Zur Erstellung einer RLI-Kinetik wurden Aliquots der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5
aufgetaut und angezogen. Die Klone sowie nichttransfizierte FRhK-4-Zellen wurden in 6-
well-Platten ausgesät und nach 0, 2, 4, 6, 10 und 14 Tagen geerntet. Mittels real time PCR
wurden die relativen Mengen an RLI-mRNA in den aufgereinigten RNAs bestimmt. Die
stabil transfizierten FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 zeigten über einen Zeitraum von 14 Tage
keine gleichbleibende Transkription des RLI sondern deutliche Schwankungen (siehe
Abbildung 30). Sowohl Klon 4 als auch Klon 5 wiesen RLI-Transkriptionsraten um Faktoren
von unter 2 bis über 8 auf. Je nach Inkubationszeit der Zellen schwankten die relativen
mRNA-Mengen des RLI in den FRhK-4-RLI-Klonen 4 und 5 sehr stark. Die maximale
relative Steigerung des RLI-mRNA-Gehalts um Faktoren von 8 bis 10 konnte in mehrfachen
Versuchsansätzen nicht reproduziert werden. In manchem Versuchsansatz war die maximale
Menge an relativer RLI-mRNA bereits bei einem Faktor von 4 erreicht. Aus diesem Grund
wurde in Abbildung 30 lediglich ein Einzelexperiment abgebildet. Die Messung der mRNA-
Mengen von RLI sowie der 18S rRNA wurde mit der real time PCR in Doppelbestimmung
durchgeführt. Eine stabil und gleichmäßig erhöhte Expression des RNase L Inhibitors in
FRhK-4-Klonen konnte nicht gezeigt werden. Auch mit Hilfe der Immunfluoreszenz zum
Nachweis von RLI-Protein konnten keine leuchtenden Zellen in den FRhK-4-Klon 4-Zellen
Ergebnisse
68
detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Trotz erhöhter RLI-Transkription lag die Menge an
produziertem RLI mit angehängtem His-Tag deutlich unter der Nachweisgrenze. Auch in
diesem Fall konnte nicht unterschieden werden, ob Zellen mit gesteigerter RLI-Expression
und möglicherweise erhöhtem RLI-Proteinanteil absterben oder die Menge an RLI-Protein für
den Nachweis mittels Immunfluoreszenz nicht ausreichend war.
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Abbildung 30: RLI-Kinetik der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Klon 4, B: Klon 5
3.2.8. Kinetik der RLI-Expression stabil transfizierter FRhK-4-6er Klone
Da eine stabile Transfektion des RLI in FRhK-4-Zellen nicht möglich schien, wurde die RLI-
Transkription in einem bereits vorhandenen potentiellen RLI-Klon analysiert. 1999 wurden
von Jörn Gotter im Rahmen seiner Diplomarbeit (Gotter, 1999) FRhK-4-Zellen mit dem
pcDNA3/RLI 3’ Plasmid stabil transfiziert. Eine Analyse der RLI-Transkription wurde jedoch
nie durchgeführt. In Infektionsversuchen mit HAV wurde eine gesteigerte Replikationsrate
von HAV in den gewonnenen FRhK-4-6er Klonen gegenüber nicht transfizierten FRhK-4-
Zellen festgestellt. Das führte zu der Annahme, dass die FRhK-4-6er-Zellen das RLI
überexprimieren. Die FRhK-4-6er Zellen wurden im Stickstofftank aufbewahrt. Ein Aliquot
dieser Zellen wurde aufgetaut und angezogen. Es wurden 6-well-Platten mit FRhK-4-6er
Zellen ausgesät und die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet. Die zelluläre RNA
Ergebnisse
69
wurde mit dem RNeasy® Mini Kit aufgereinigt und nach der cDNA-Synthese die relativen
RLI-mRNA-Mengen mittels real time PCR bestimmt (siehe Abbildung 31).
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Abbildung 31: RLI-Expression in FRhK-4-6er Zellen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zu FRhK-4-Zellen als Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression.
Es waren Transkriptionsraten des RNase L Inhibitors zwischen Faktoren von 0,3 und 2,7 zu
detektieren. Lediglich für die Tage 1 und 5 der Probennahme wurden die Grenzen der
Genexpression überschritten. Diese Tage entsprechen den Tagen nach Aussaat und
Mediumwechsel. Über den Inkubationszeitraum von 14 Tagen konnten keine stabil erhöhten
Mengen an RLI-mRNA in den FRhK-4-6er Klonen festgestellt werden. Die gesteigerte HAV-
Replikationsrate in diesen Zellen ist nach diesem Ergebnis mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht
auf eine Überexpression des RNase L Inhibitors zurückzuführen, sondern auf eine nicht
definierte Eigenschaft der FRhK-4-6er Klone. Möglicherweise zeigten die FRhK-4-6er-Klone
nach Transfektion mit pcDNA3/RLI 3’ zunächste eine Überexpression des RLI, welche
jedoch wie bei den FRhK-4 Klon 4- und Klon 5-Zellen der vorliegenden Arbeit nicht
aufrechterhalten wurde.
Ergebnisse
70
3.2.9. Zusammenfassung RNase L Inhibitor
Aus humaner- und Rhesusaffen-gesamt-Zell-RNA wurde der RNase L Inhibitor full length
amplifiziert. Dabei wurde das Stop-Codon ausgeschaltet, um die Expression des RLI mit dem
His-Tag des Klonierungsvektors zu ermöglichen. Nach Klonierung des RLI in das Plasmid
pcDNA3.1-V5/His zeigten sowohl die FRhK-4- als auch die Huh7-Zellen eine gesteigerte
RLI-Transkription um Faktoren von maximal 7, welche jedoch bereits nach 4 Tagen nicht
mehr nachweisbar war. Zur Steigerung der RLI-Expression wurde das RLI in den Vektor
pl.18 umkloniert und zeigte in beiden verwendeten Zelllinien eine gesteigerte RLI-Expression
um Faktoren von bis zu 45. Allerdings konnte auch mit Hilfe der entsprechenden pl.18_RLI-
Plasmide eine erhöhte Transkription nicht länger als 1 Woche nachgewiesen werden. Aus
diesem Grund sollte das RLI stabil in die Zellen transfiziert werden. Eine stabile Transfektion
des RLI war weder in Huh7- noch in FRhK-4-Zellen erfolgreich. Die Huh7-Zellen stellten bei
dem hohen Umsetzungsverhältnis, welches Vorrausetzung für die Selektion von potentiellen
RLI-Klonen war, ihr Wachstum komplett ein. Auch durch die Selektion transfizierter FRhK-
4-Zellen konnten keine Klone gewonnen werden, die das RLI stabil und dauerhaft
überexprimieren. Die relativen Mengen an RLI-mRNA der FRhK-4-Klone 4 und 5 unterlagen
starken Schwankungen oder waren häufig nicht erhöht. Es wurde angenommen, dass FRhK-
4-6er Zellen, welche in einer vorangegangenen Diplomarbeit aus der stabilen Transfektion
von FRhK-4-Zellen mit pcDNA3/RLI 3’ gewonnen wurden, das RLI überexprimieren. Im
Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte auch in diesen Zellen keine gesteigerte Menge an
RLI-mRNA gegenüber nicht transfizierten FRhK-4-Zellen nachgewiesen werden.
3.3. HCV Infektion
In diesem Teil der Arbeit wurden RLI überexprimierende Huh7- und FRhK-4-Zellen mit dem
Hepatitis C Virus aus infektiösem Frischplasma infiziert. Das für die Infektion verwendete
Frischplasma wurde zunächst mit Hilfe des HCV RotorGene Systems und durch
Sequenzierung genauer charakterisiert. Die Infektion erfolgte sowohl bei den FRhK-4-RLI-
Klonen 4 und 5 (siehe Kapitel 3.2.6) als auch bei transient RLI-transfizierten Huh7- und
FRhK-4-Zellen. Huh7-Zellen sind derzeitig die einzige Zelllinie, in der das Hepatitis C Virus
JFH-1 oder HCV-Replikons effizient replizieren, so dass aus diesem Grund Huh7-Zellen in
dieser Arbeit verwendet wurden. In HAV-Infektionsversuchen mit RLI-transfizierte FRhK-4-
Zellen zeigte sich ein stärkeres Viruswachstum. Es wurde daher versucht, diese Eigenschaft
Ergebnisse
71
der RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen auf das Hepatitis C Virus zu übertragen. Neben der
Bestimmung der HCV-RNA wurde die Expression von RNase L und RLI analysiert. Obwohl
bisher keine Regulation der RNase L in der Literatur beschrieben wurde, wurde diese
ebenfalls analysiert. In Infektionsversuchen mit HAV einer parallel laufenden Arbeit zeigte
die Datenlage zwischenzeitlich eine mögliche gesteigerte Expression der RNase L. Aus
diesem Grund wurde auch die Expression der RNase L im Rahmen der vorliegenden Arbeit
unter den Bedingungen einer HCV-Infektion analysiert. Es wurde überprüft, ob das Virus
möglicherweise einen Einfluss auf die RNase L ausübt und ob sich die Überexpression des
RLI positiv auf die Replikation des HCV auswirkt.
3.3.1. Titer- und Subtypenbestimmung von HCV-positivem Plasma des
Blutspendedienstes Hagen
HCV-positives und infektiöses Frischplasma vom Blutspendedienst Hagen (in der RotorGene
Beschriftung Abbildung 32 A Hagenplasma genannt) wurde für die Infektion von Huh7- und
FRhK-4 Zellen verwendet. Zunächst wurde der Virustiter des Plasmas im HCV RotorGene
System quantifiziert und durch Sequenzierung des Amplifikates der Subtyp des Virus
bestimmt (siehe Abbildung 32). Anhand der mitgeführten Standardreihe wurde die
Konzentration des eingesetzten Eluates durch die RotorGene Software kalkuliert und
anschließend ein HCV Titer im Plasma von ca. 2,76 x 106 IU/ml berechnet. Die Auswertung
der Sequenz des PCR Amplifikates mit Hilfe der HCV Datenbank http://hcv.lanl.gov/cgi-
bin/BASIC_BLAST/basic_blast.cgi ergab eine 100%ige Übereinstimmung mit dem HCV
Subtyp 3a (siehe Abbildung 32 B). Der Subtyp 3a ist wie 1a und 1b weltweit verbreitet, findet
sich jedoch hauptsächlich bei Drogenabhängigen.
Ergebnisse
72
A
5’ - GCC CCC CCC TCC CGG GAG AGC CAT AGT GGT CTG CGG AAC CGG TGA GTA CAC CGG AAT CGC TGG GGT GAC CGG GTC CTT TCT TGG AAC AAC CCG CTC AAT ACC CAG AAA TTT GGG CGT GCC CCC GCA AGA TCA CTA GCC GAG TAG TGT TGG GTC GCG AAA GGC CTT GTG GTA CTG CCT GAT AGG GTG CTT GCG AGA – 3’
B
Abbildung 32: Titerbestimmung und Genotypenanalyse HCV-positiven FrischplasmasA: Amplifikation des aufgereinigten Plasmas im HCV RotorGene System. blau: Standardreihe, rot: HCV Eluat in 10fach-Bestimmung; grün: Wasserkontrolle; B: Sequenz des Amplifikates.
3.3.2. Stabilität von HCV RNA
Um die Ergebnisse der HCV RNA-Bestimmung von infizierten Zellen nach verschiedenen
Inkubationszeiten beurteilen zu können, wurde zunächst die Stabilität von Hepatitis C Virus
RNA im Viruskapsid bestimmt. Die Stabilität der RNA wurde in Medium und unter
Brutschrankbedingungen, jedoch ohne den Einfluss zellulärer Enzyme bestimmt. Anhand der
Inkubationszeit nachweisbarer RNA im zellfreien Medium wurde beurteilt, ob die detektierte
HCV RNA in den Infektionsversuchen noch vom Inokulum an den Zellen haften könnte oder
repliziert wurde. Durch die zusätzlichen zellulären RNasen in den Infektionsversuchen wurde
davon ausgegangen, dass die zeitliche Nachweisgrenze von Inokulum RNA deutlich vor dem
Zeitpunkt liegt, an dem die Nachweisgrenze der HCV RNA im zellfreien Medium erreicht
wurde.
Für den Stabilitätstest wurden 4 μ l HCV-positives Frischplasma (entspricht ca. 104 IU) in
4 ml DMEM gegeben und zu je 1 ml auf 4 wells einer 12-well-Platte verteilt. Die
Konzentration pro well betrug somit ca. 2500 IU/ml. Die Zellkulturplatte wurde im
Ergebnisse
73
Brutschrank bei konstanten Bedingungen (37°C, 5 % CO2) inkubiert. Im Abstand von 2
Tagen wurden je 140 μ l Medium abgenommen und mittels real time RT-PCR die
Konzentration der Virus RNA bestimmt. Zur besseren Veranschaulichung wurden die RNA-
Konzentrationen sowohl linear (siehe Abbildung 33Abbildung 34) als auch logarithmisch
(siehe Abbildung 34) dargestellt. Nach 30 Tagen waren in den einzelnen wells lediglich noch
300 μ l Medium vorhanden. Aufgrund der konstanten Inkubationsbedingungen und
gleichbleibender Mediumoberfläche wird eine Verdunstung von ca. 23 μ l pro Tag (entspricht
700 μ l in 30 Tagen) angenommen. Diese Verdunstungsmenge wurde in die Berechnung der
Virusmenge pro ml einbezogen. Bis zu Tag 18 (432 h) konnte für alle Proben ein
reproduzierbar positives Signal in der real time RT-PCR detektiert werden. Die Virusmenge
sank innerhalb dieser Tage stetig von ursprünglichen 2800 IU auf 20 IU pro ml Medium.
Ohne den rechnerischen Faktor der Verdunstung enthielten die aufgereinigten
Mediumsproben von Tag 18 eine RNA-Konzentration von durchschnittlich 34 IU/ml. Diese
RNA-Konzentration korreliert mit dem 95 % Wert der Sensitivitätsbestimmung (siehe
Abbildung 20) und entspricht der Konzentration, die noch zu 95 % mit dem RotorGene
System nachgewiesen werden kann. D.h. an Tag 18 wurde die Nachweisgrenze des HCV
RotorGene Systems erreicht. Niedrigere HCV Konzentrationen im Medium waren nicht mehr
reproduzierbar detektierbar. In den Versuchstagen nach Tag 18 nahm die Anzahl der
Signalausfälle stetig zu. Nach 30 Tagen waren alle Proben RT-PCR negativ. In keinem der 4
Ansätze war noch HCV-RNA nachweisbar. Ohne RNA-Abbau hätte sich die Anzahl der
Internationalen HCV Einheiten alle 2 Tage lediglich um die Anzahl der in 140 μ l Probe
enthaltenen Internationalen Einheiten verringern müssen (siehe Abbildung 33 und Abbildung
34 blaue Balken). Die entnommenen HCV-Mediumsuspensionen von je 140 μ l wurden durch
je 140 μ l Medium aufgefüllt, so dass ohne RNA-Abbau nach 30 Tagen rechnerisch noch eine
RNA-Konzentration von 90 IU/ml vorhanden gewesen wäre. Durch den Abbau der HCV
RNA in DMEM im Brutschrank war jedoch nach 30 Tagen im HCV RotorGene System keine
RNA mehr nachweisbar. Durch das zusätzliche Vorhandensein zellulärer RNasen in den
Infektionsversuchen, ist davon auszugehen, dass die Nachweisgrenze von 35 IU/ml HCV
RNA im RotorGene System bereits vor Ablauf von 18 Tagen Inkubationszeit erreicht sein
wird. Nach maximal 30 Tagen Inkubationszeit ist ein Nachweis von HCV Inokulum-RNA in
den Infektionsversuchen sehr unwahrscheinlich.
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Abbildung 33: Stabilität von HCV-RNA in DMEM (lineare Darstellung). Aufgetragen wurde die Menge an HCV-RNA gegen die Inkubationszeit. blau: therotische IU/ml HCV ohne RNA Abbau, dunkelgrau: berechnete IU/ml HCV RNA im Versuchsansatz.
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berechnete IU/ml theoretische IU/ml ohne Abbau
Abbildung 34: Stabilität von HCV-RNA in DMEM (logarithmische Darstellung): Aufgetragen wurde die Menge HCV-RNA gegen die Inkubationszeit. blau: therotische IU/ml HCV ohne RNA Abbau, dunkelgrau: berechnete IU/ml HCV RNA im Versuchsansatz.
3.3.3. HCV Infektion der RLI-Klone 4 und 5
Die FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 wurden trotz möglicherweise niedriger Expression des
RNase L Inhibitors mit infektiösem, HCV-positivem Frischplasma infiziert. Es wurden Zellen
der RLI-Klone 4 und 5 in 6-well-Platten ausgesät und nach 24 h mit 150 μ l HCV-positivem
Frischplasma (MOI = 1) infiziert. Nach 2 Stunden Inkubation wurden die Zellen gewaschen
Ergebnisse
75
und mit frischem Medium versehen. Durch diesen Waschschritt wurde die in Kapitel 3.3.2
bestimmte maximale zeitliche Nachweisgrenze der HCV RNA von 30 Tagen nochmals
verringert. Direkt nach dem Mediumwechsel (= 0 d), nach 2 d, 4 d, 6 d, 10 d und nach 14 d
wurden die Zellen von je einem well des Infektionsversuchsansatzes geerntet. Aus Zellen und
Zellüberstand wurde die RNA aufgereinigt. Die Eluate der aufgereinigten Zellen wurden nach
der cDNA-Synthese in den entsprechenden real time PCRs auf die relativen Mengen an
mRNA von RNase L und RLI bzw. HCV RNA untersucht. Die Normalisierung der relativen
mRNA-Mengen von RNase L und RLI erfolgte auf die 18S rRNA und auf die nicht
transfizierten Kontrollzellen. Klon 4 zeigte für die 4 d -, 6 d - und 14 d - Werte eine
gesteigerte RLI-Transkription um Faktoren von 3 bis 7 (siehe Abbildung 35 A) im Vergleich
zu den nicht transfizierten Kontrollen. Der 10 d - Wert zeigte keine erhöhte relative Menge an
RLI-mRNA. Da alle Zeitpunkte Probennahmen einzelner unabhängiger wells waren,
verdeutlich dieser Wert ein weiteres Mal die starken Schwankungen der RLI-Expression in
den transfizierten Klonen. Für alle anderen Zeitpunkte entsprechen die relativen Einheiten an
RLI-mRNA für Klon 4 nahezu den relativen Einheiten der in Abbildung 30 A dargestellten
Kinetik. Die Expression des RNase L Inhibitors während der HCV Infektion war für Klon 5
zu keinem Zeitpunkt deutlich erhöht (siehe Abbildung 35 B). Lediglich der 14 d - Wert
(336 h) zeigt eine leicht gesteigerte relative Menge an RLI-mRNA um den Faktor 2,8.
Aufgrund der Schwankungen der relativen Mengen an RLI-mRNA zwischen den
Experimenten wurde in Abbildung 35 lediglich ein Einzelexperiment dargestellt. Die
Messung der mRNA-Mengen von RLI sowie der 18S rRNA wurde mit der real time PCR in
Doppelbestimmung durchgeführt.
Die Transkriptionsraten der RNase L lagen über den gesamten Zeitraum der Probennahmen
für beide Klone innerhalb der Schwankungsgrenzen (siehe Abbildung 36).
Die Eluate der RNA-Aufreinigung der Zellen und der Zellkulturüberstände wurden im HCV
RG System auf HCV RNA getestet. Sowohl die nicht infizierten FRhK-4-Kontrollzellen als
auch die FRhK4-RLI-Klon 4- und Klon 5 - Zellen waren nach 4 Tagen intrazellulär und
extrazellulär HCV negativ. Da keine virale Replikation in den Zellen stattgefunden hat, kann
über einen potentiellen Einfluss des HCV auf die Expression der RNase L keine Aussage
getroffen werden.
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Abbildung 35: RLI-Expression der FRhK-4-RLI-Klone bei HCV Infektion. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelten Linien kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression. A: Klon 4, B: Klon 5
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Abbildung 36: RNase L-Expression der Klone bei HCV Infektion. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Klon 4, B: Klon 5
3.3.4. HCV Infektion transient RLI-transfizierter Zellen
Da es nicht möglich war, RLI-Klone von FRhK-4- und Huh7-Zellen zu etablieren, welche das
RLI stabil überexprimieren, wurde der Verlauf einer HCV Infektion in transient transfizierten
Zellen untersucht. 2 Tage nach Transfektion erfolgte die Infektion mit HCV-positivem und
infektiösem Frischplasma (siehe Kapitel 2.2.2.10). Um eine Überexpression des RNase L
Ergebnisse
77
Inhibitors über einen Zeitraum von 4 Wochen zu garantieren, wurden die Zellen dreimal im
Abstand von je einer Woche mit dem Plasmid pl.18_RLI transfiziert. Nach je einer Woche
wurden alle Zellen eines wells in ein neues gegebenenfalls größeres well überführt und nach
24 h Inkubationszeit transfiziert. Während des Versuches wurden keine Zellen abgenommen,
um die RLI-Transkriptionsrate zu bestimmen. Aus den Ergebnissen der vorangegangenen
Versuche wurde davon ausgegangen, dass nach einer Woche noch eine erhöhte Menge an
RLI-mRNA in den Zellen vorhanden war. Das Aufrechterhalten der erhöhten Transkription
über einen längeren Inkubationszeitraum als eine Woche erfolgte durch die erneute
Transfektion. Die Bestimmung der relativen Mengen an RLI-mRNA mit Hilfe der real time
PCR wurde am Ende des Versuches durchgeführt.
Der mehrfache Austausch des Zellkulturüberstandes durch Transfektionsansatz, 1xPBS und
frisches Medium führte bereits nach einer Woche dazu, dass keine HCV RNA im Überstand
mehr nachgewiesen werden könnte. Nach insgesamt 4 Wochen wurden alle Zellen geernten.
Die zelluläre RNA wurde mit dem RNeasy® Mini Kit aufgereinigt und die Eluate in den
entsprechenden real time PCRs auf die relativen Mengen an mRNA von RNase L und RLI
bzw. HCV RNA untersucht.
Auf Genexpressionsebene wurden sowohl die Transkriptionsraten des RLI (siehe Abbildung
37) als auch der RNase L analysiert (siehe Abbildung 38). Die FRhK-4- und die Huh7-Zellen
zeigten 4 Wochen nach Versuchsbeginn noch eine deutliche Überexpression des RNase L
Inhibitors. Sowohl auf das Referenzgen 18S rRNA als auch auf GAPDH bezogen, wiesen die
Huh7-Zellen erhöhte Mengen an RLI-mRNA um Faktoren von 32 bis 40 auf (siehe
Abbildung 37 A). Für die FRhK-4-Zellen konnten mit Hilfe der real time PCR gesteigerte
relative mRNA-Einheiten des RNase L Inhibitors um Fakoren von 17 bis 30 detektiert werden
(siehe Abbildung 37 B).
Weder in den FRhK-4- noch in den Huh7-Zellen wurde eine gesteigerte Transkription der
RNase L detektiert (siehe Abbildung 38). Für beide Zelllinien lagen die relativen Einheiten
der RNase L-mRNA innerhalb der Schwankungsgrenzen von 0,5 bis 2.
Intrazellulär und extrazellulär konnte 4 Wochen nach Infektion keine HCV RNA mehr
nachgewiesen werden. Die Überexpression des RLI hatte auch in diesem Fall keinen positiven
Einfluss auf die HCV Replikation.
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Referenzgen 18S RNA Referenzgen GAPDH
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Referenzgen 18S rRNA Referenzgen GAPDH
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Abbildung 37: Transkriptionsrate des RLI 3 Wochen nach HCV Infektion mit dreimaliger RLI-Transfektion. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA bzw. der mRNA von GAPDH und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7, B: FRhK-4
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Referenzgen 18S RNA Referenzgen GAPDH
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Abbildung 38: Transkriptionsrate der RNase L 3 Wochen nach HCV Infektion mit dreimaliger RLI-Transfektion. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA bzw. der mRNA von GAPDH und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelten Linien kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7, B: FRhK-4
3.3.5. Zusammenfassung HCV Infektion
Die Charakterisierung des HCV-positiven und infektiösen Frischlasmas vom
Blutspendedienst Hagen erfolgte im HCV RotorGene System. Mit einer Viruskonzentration
Ergebnisse
79
von 2,76x106 IU/ml ist das Plasma als sehr hoch positiv einzuschätzen. Nach Sequenzierung
des Amplifikates konnte das Virus im Plasma dem HCV Subtypen 3a zugeordnet werden.
Im Stabilitätstest der HCV RNA konnte gezeigt werden, dass ohne den Einfluss zellulärer
Enzyme HCV RNA bis zu 30 Tagen bei 37°C nachweisbar ist. Dieser Versuch diente dazu,
den Inkubationszeitraum zu bestimmen, in dem HCV Inokulum mit Hilfe des HCV
RotorGene Systems noch nachgewiesen werden kann. In den HCV Infektionsversuchen sollte
die maximale Nachweisgrenze von 30 Tagen durch das Waschen der Zellen und das
Vorhandensein zellulärer RNasen deutlich unterschritten werden. Reproduzierbar positive
Nachweisbarkeit von HCV Inokulum wird in den Infektionsversuchen nur unter 18 Tagen
erwartet.
Nach HCV Infektion der FRhK-4-Klon 4 und 5 Zellen konnte keine Replikation der Viren
festgestellt werden. 4 Tage nach Infektion waren intrazellulär und extrazellulär alle Proben
HCV negativ. Klon 4 wies innerhalb des Infektionsversuches erhöhte relative Mengen an
RLI-mRNA um Faktoren von 2 bis 6 auf. In Klon 5 konnte keine gesteigerte RLI-Expression
nachgewiesen werden. Obwohl für die RNase L in der Literatur keine Regulation auf
Genexpressionsebene beschrieben wurde, wurde diese im Rahmen der Manipulation des
2’-5’Oligoadenylatsynthetasesystem ebenfalls analysiert. Die relativen Mengen an mRNA der
RNase L zeigten in HCV infizierten FRhK-4-Klon 4 und 5 Zellen keinen Unterschied zu nicht
infizierten Zellen. Da keine virale Replikation in den Zellen stattgefunden hat, kann keine
Aussage über einen potentieller Einfluss des HCV auf die Expression der RNase L getroffen
werden.
Die Analyse der relativen Mengen an mRNA des RNase L Inhibitors in transient RLI-
transfizierte Huh7- und FRhK-4-Zellen zeigte erhöhte Transkriptionen um Faktoren bis zu 40.
Durch dreimalige Transfektion mit den entsprechenenden pl.18_RLI Plasmiden wurde die
Überexpression über einen Inkubationszeitraum von 4 Wochen aufrecht erhalten. Nach
Ablauf der 4 Wochen konnte weder in den Huh7- noch in den FRhK-4-Zellen intrazellulär
oder extrazellulär HCV RNA nachgewiesen werden. Die Expression der RNase L wurde auch
in transient RLI-transfizierte Huh7- und FRhK-4-Zellen nicht durch die HCV Infektion
beeinflusst.
3.4. Transfektion in vitro transkribierter HCV full-length RNA
Um zu gewährleisten, dass die Aufnahme der HCV RNA in das Zytoplasma der Zellen
erfolgt, wurde der Schritt des Viruseintritts experimentell umgangen und HCV full length
Ergebnisse
80
RNA transfiziert. Dazu wurde zunächst das Plasmid p90/HCV FL-long pU angezogen,
welches die full length RNA vom HCV Subtyp 1a enthält. Nach Linearisierung des Plasmids
erfolgte die in vitro Transkription der HCV full length RNA. Um einen Einfluss der
Transfektion von in vitro Transkript (IVT) auf die Transkription der RNase L und des
zellulären RLIs auszuschließen, sollte ein möglichst langes nicht virales IVT im Vergleich
zum HCV IVT in FRhK-4- und Huh7-Zellen transfiziert werden. Daher wurde der 2 kb lange
Elongationsfaktor von Xenopus (Krallenfrosch) aus dem Plasmid pTRI, welches als
Kontrollplasmid im MEGAscript® High Yield Transcription Kit enthalten ist, ebenfalls in
vitro transkribiert. Der potentielle Einfluss der Transfektion von HCV IVT auf die
Transkription der RNase L und des zellulären RLI wurden analysiert. Die Auswertung der
HCV RNA erfolgte neben den zellulären Standardbedingungen auch unter den Bedingungen
erhöhter RLI-Expression durch Transfektion von pl.18-RLI.
3.4.1. In vitro Transkription von full length HCV RNA
Nach der Transformation von Plasmid p90/HCV FL-long pU, wurden E.coli Klone
herangezogen. Mit Hilfe des QIAGEN® Plasmid Mini Kit wurde das Plasmid aufgereinigt und
für die full length Transkription mit dem Restriktionsenzym Bsm I linearisiert. Dieses Enzym
schnitt zweimal in p90/HCV FL-long pU, wodurch Fragmente von 1427 bp und 11553 bp
enstanden. Der komplette Linearisationsansatz wurde im Agarosegel aufgetrennt und die das
HCV Insert enthaltene Bande von 11553 bp aufgereinigt. Die Kontrolle dieser Aufreinigung
im 1%igen Agarosegel zeigte eine saubere Bande bei 11553 bp ohne weitere Nebenbanden.
Die in vitro Transkription wurde nach Protokoll des MEGAscript® High Yield Transcription
Kit für 4 h bei 37°C durchgeführt. Die Kontrolle des IVT im 1%igen Agarosegel zeigte
deutlich die DNA-Bande des linearisierten Plasmides. Nach DNase-Verdau und RNA-
Aufreinigung war die DNA vollständig abgebaut und ein sauberes IVT im Eluat enthalten.
Zur Konzentrationsbestimmung wurde die 10-6 Verdünnung der in vitro transkribierte RNA in
das HCV RotorGene Assay eingesetzt (siehe Abbildung 39). Es wurden jeweils
Doppelbestimmungen der IVT-Ansätze durchgeführt. Mit Hilfe der mitgeführten
Standardreihe wurden die Konzentrationen der HCV IVTs berechnet. Für alle Ansätze der in
vitro transkribierten RNA ergab sich eine Konzentration von 104 IU/μ l. Nach der in Kapitel
2.2.2.12 angegebenen Formel für die Umrechnung von IU/μ l in g/μ l ergaben sich für die
einzelnen in vitro Transkripte Mengen zwischen 115 ng/μ l und 175 ng/μl.
Ergebnisse
81
Abbildung 39: RotorGene Lauf der in vitro transkribierten HCV-RNA. rot: Standardreihe; schwarz: HCV IVTs in Doppelansätzen; grün: Wasserkontrolle
3.4.2. Transfektion in vitro transkribierter RNA in Huh7- und FRhK-4-Zellen
Obwohl bekannt ist, dass Antikörper gegen CD81 die HCV Infektion in Huh7-Zellen
hemmen (Zhong et al., 2005), d.h. die Huh7-Zellen den CD81-Rezeptor exprimieren, wurde
der Viruseintritt umgangen und die HCV RNA transfiziert. In der Literatur gibt es jedoch
keine Angaben über das Vorhandensein des CD81-Rezeptors in FRhK-4-Zellen. Es besteht
sowohl für die FRhK-4- als auch für die Huh7-Zellen die Möglichkeit, dass in den
Infektionsversuchen das Hepatitis C Virus nicht in die Zellen gelangt ist. Daher wurde die
Rezeptor-abhängige Virusaufnahme umgangen und die HCV RNA in die Zellen transfiziert.
Mit Hilfe der Transfektion wurde sichergestellt, dass die HCV RNA in das Zytoplasma der
Zellen gelangt. Durch einen Vergleichsversuch (Transfektion von HCV IVT bzw. IVT des
Elongationsfaktors II von Xenopus = pTRI IVT) wurde ein potentieller Einfluss der
Transfektion von IVT auf die Transkription der RNase L und des zellulären RLI überprüft.
Nach vierstündiger Inkubation der Transfektionsansätze mit den Zellen wurden diese
gewaschen und mit frischem Medium versehen. Direkt nach dem Mediumwechsel (= 0 h),
nach 3 h, 6 h, 9 h, 12 h und nach 24 h wurden die Zellen von je einem well geerntet.
Intrazelluläre und extrazelluläre RNA wurden aufgereinigt und die Eluate in den
entsprechenden real time PCRs auf die Menge an mRNA von RNase L, RLI sowie der
Ergebnisse
82
18S rRNA bzw. auf die Menge an HCV RNA untersucht. Die relativen mRNA-Mengen der
RNase L der Huh7-Zellen lagen sowohl bei der Transfektion mit HCV IVT als auch mit pTRI
IVT über den gesamten Inkubationszeitraum von 24 h innerhalb der Schwankungsgrenzen der
nicht regulierten Genexpression von 0,5 bis 2 (siehe Abbildung 40 A). Auch in den FRhK-4-
Zellen konnte keine signifikante Erhöhung der RNase L-Expression festgestellt werden.
Lediglich der 24 h - Wert zeigte eine leicht erhöhte Transkription der RNase L um den Faktor
2,5 (siehe Abbildung 40 B). In den folgenden Abbildungen werden jeweils Einzelexperimente
dargestellt. Die Analyse der verschiedenen mRNAs sowie der HCV RNA erfolgten in
Einzelbestimmungen.
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Abbildung 40: RNase L-Expression in IVT-transfizierten Zellen. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelten Linien kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7, B: FRhK-4
Die Konzentration der HCV RNA nahm sowohl intrazellulär als auch extrazellulär über die
Inkubationszeit kontinuierlich ab. Die Transfektion erfolgte mit 250 ng HCV IVT, was nach
der in Kapitel 2.2.2.12 angegebenen Formel 4,5*104 Kopien bzw. 1,5*104 IU entspricht. Für
die Huh7-Zellen waren nach 24 Stunden extrazellulär noch 43 IU/μ l Probe nachweisbar. In
einem Milliliter Zellkulturüberstand enspricht diese Konzentration 4,3*104 Internationalen
Einheiten HCV RNA. Diese Menge an HCV RNA ist größer als die rechnerisch eingesetzte
Menge von 1,5*104 IU. Da die Abnahme der HCV RNA im Verlauf der Probennahme gegen
eine Zunahme der HCV RNA innerhalb von 24 Stunden spricht, ist diese RNA-Menge sehr
wahrscheinlich durch Pipettierungenauigkeiten bei der IVT Transfektion zu erklären. Bereits
Ergebnisse
83
1 μ l Pipettierungenauigkeit bewirken einen Unterschied von 7,5*103 IU HCV RNA. Es ist
daher davon auszugehen, dass im Inokulum mehr als 1,5*104 IU HCV RNA eingesetzt
wurden. Anhand der in Abbildung 41 A dargestellten extrazellulären RNA-Konzentration des
0 h - Wertes, betrug die tatsächliche Inokulummenge mindestens 5*105 IU. Intrazellulär war
nach 24 Stunden noch HCV RNA von 180 IU/μ l pro relative 18S rRNA-Einheiten zu
detektieren (siehe Abbildung 41 A). Das entsprach in 50 μ l gesamt-Zelleluat einer HCV-
Menge von 9*103 IU bzw. 2,7*104 Kopien. In den RNA-Eluaten der FRhK-4-
Zellkulturüberstände wurden nach 24 h noch 60 IU/μ l nachgewiesen, d.h. im
Zellkulturüberstand von einem Milliliter wurden noch 6*104 IU HCV RNA detektiert.
Intrazellulär lag die RNA-Konzentration bei 17 (IU/μ l)/relative 18S rRNA-Einheiten. In 50 μ l
gesamt-Zelleluat ensprach das einer HCV-Menge von 850 IU oder 2,55*103 Kopien. Die
intrazellulären 0 h - Werte der Analyse der HCV RNA von 5,6*104 (Huh7-Zellen) bzw.
1,4*104 (Frhk4-Zellen) weisen auf eine gelungene Transfektion der RNA in das Zytoplasma
der Zellen hin. Eine Replikation der RNA konnte jedoch nicht beobachtet werden.
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extrazellulär [IU/μl]intrazellulär [(IU/μl)/18S rRNA]
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extrazellulär [IU/μl]intrazellulär [(IU/μl)/18S rRNA]
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Abbildung 41: HCV RNA-Titer in IVT-transfizierten Zellen. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten HCV-RNA gegen die Zeit. A: Huh7, B: FRhK-4
Die Transkription des zellulären RLI wurde unter den Bedingungen der IVT-Transfektion
(siehe Abbildung 42) ebenfalls analysiert. Weder bei den Huh7- noch bei den FRhK-4-Zellen
konnte eine RLI-Expression ausserhalb der Schwankungsbereiche festgestellt werden. Weder
die Transfektion von HCV full length RNA noch die Transfektion der RNA des Xenopus
Elongationsfaktors hatte einen Einfluss auf die Transkription des zellulären RLI.
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HCV IVT pTRI IVT
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Abbildung 42: RLI-Expression in IVT-transfizierten Zellen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7, B: FRhK-4
3.4.3. Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA in transient
RLI-transfizierten Zellen
Um den Einfluss des überexprimierten RLI auf die Replikation von in vitro transkribierter
HCV full length RNA zu untersuchen, wurden FRhK-4- und Huh7-Zellen in 24-well-Platten
ausgesät und nach 24 Stunden Inkubationszeit mit den entsprechenden pl.18-RLI Plasmiden
bzw. dem pl.18-Leervektor transfiziert. 2 Tage nach RLI-Transfektion erfolgte die
Transfektion mit in vitro transkribierter HCV full length RNA bzw. dem pTRI IVT. Nach
vierstündiger Inkubation der IVT-Transfektionsansätze wurden die Zellen gewaschen und mit
frischem Medium versehen. Direkt nach dem Mediumwechsel (= 0 h), nach 3 h, 6 h, 9 h,
12 h, 24 h, 36 h, 2 d, 3 d und nach 4 d wurde je ein well der Zellen geerntet und die
intrazelluläre und extrazelluläre RNA aufgereinigt. Die intrazellulären RNA Eluate wurden
hinsichtlich HCV RNA und relativer mRNA-Mengen an RNase L bzw. RLI analysiert. In den
extrazellulären RNA Eluaten wurde lediglich die Menge an HCV RNA bestimmt. Der
gesamte Zellansatz eines weiteren wells wurde nach 4 Tagen in eine 6-well-Platte umgesetzt
und nach 24 h Inkubationszeit erneut mit den entsprechenden pl.18 Plasmiden transfiziert.
Nach einer weiteren Woche (11 Tage nach HCV-Transfektion) wurde der Zellansatz dieses
wells gesplittet. Ein Teil der Zellen wurde im Brutschrank weiter inkubiert und nach 24 h
Inkubationszeit erneut mit den entsprechenden pl.18 Plasmiden transfiziert. Die RNA der
Ergebnisse
85
zweiten Splithälfte wurde aufgereinigt und hinsichtlich HCV RNA und relativer mRNA-
Mengen an RNase L bzw. RLI analysiert. Ein weiterer Split mit anschließender Transfektion
oder RNA-Aufreinigung erfolgte nach insgesamt 3 Wochen (26 d / 624 h). 33 Tage nach
Versuchsbeginn wurden die Zellen erneut geteilt, jedoch nicht mehr transfiziert.
Die relativen Einheiten an RLI-mRNA der Huh7-Zellen sanken innerhalb von 4 Tagen nach
HCV-Transfektion von einem erhöhten Faktor von 180 auf einem Faktor von 16 (siehe
Abbildung 43). Nach 11 Tagen war die Transkriptionsrate des RNase L Inhibitors noch um
einen Faktor von 18 erhöht, nach 26 Tagen um einen Faktor von 8. 33 Tage nach
Versuchsbeginn konnte in den Huh7-Zellen keine Überexpression des RLI mehr
nachgewiesen werden.
0
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olle
pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV
Abbildung 43: RLI-Expression in IVT- und RLI-transfizierten Huh7-Zellen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Es wurde entweder das pl.18-h_RLI oder der pl.18 Leervektor transfiziert.
Die Expressionsrate des RNase L Inhibitors der FRhK-4-Zellen nahm von einer maximalen
Erhöhung um den Faktor von 180 stetig bis auf einen Faktor von 34 nach 4 Tagen ab (siehe
Abbildung 44). Dabei zeigten die RLI Transkriptionsraten keinen so schönen kinetischen
Verlauf wie die Daten der relativen Einheiten an RLI-mRNA der Huh7-Zellen. Die maximale
Überexpession des RLI der FRhK-4-Zellen wurde erst 6 h nach IVT-Transfektion erreicht.
Nach einer Woche erfolgte eine zweite RLI-Transfektion, wodurch die relative Menge an
RLI-mRNA nach insgesamt 11 Tagen sogar noch um einen Faktor von 120 erhöht war. 26
Ergebnisse
86
Tage nach Versuchsbeginn und nach der dritten Transfektion zeigte der RNase L Inhibitor
noch eine leicht erhöhte Expression um einen Faktor von 5. 33 Tage nach Versuchsbeginn
konnte in den FRhK-4-Zellen keine Überexpression des RLI mehr nachgewiesen werden.
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pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV
Abbildung 44: RLI-Expression in IVT- und RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Es wurde entweder das pl.18-m_RLI oder der pl.18 Leervektor transfiziert.
Der HCV RNA Titer nahm sowohl in den FRhK-4- als auch in den Huh7-Zellen extrazellulär
und intrazellulär über die Inkubationszeit kontinuierlich ab. Unterschiedliche
Ausgangsmengen an HCV RNA im Überstand zwischen RLI-transfiziertem Ansatz und dem
Vergleichsansatz mit dem pl.18-Leervektor sind auf verschieden gute Wascheffekte nach der
Transfektion zurückzuführen (siehe Abbildung 45 A2 und B2). Der mehrfache Austausch des
Zellkulturüberstandes durch Transfektionsansatz, 1xPBS und frisches Medium führten nach
dem Umsetzen der Zellen in die 6-well-Platte zur vollständigen Entfernung der HCV RNA im
Zellkulturüberstand.
Intrazellulär nahm die HCV RNA Menge der RLI-transfizierten Huh7-Zellen von
0,55 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA bis auf 0,06 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA nach
11 Tagen ab (siehe Abbildung 45 A1). Für das gesamt-Zelleluat von 50 μ l entsprachen diese
Werte 22 IU (3 h nach Infektion) und 3 IU (11 Tage / 254 h nach Infektion). Direkt nach
Abnahme des Inokulums wurden intrazellulär 2,76 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA, d.h.
135 IU in 50 μ l gesamt-Zelleluat detektiert (Datenpunkt in Abbildung 45 A1 nicht
Ergebnisse
87
abgebildet). Da für die Transfektion 1,5*104 IU (250 ng) HCV RNA eingesetzt wurden, weist
der 0 h - Wert von 135 IU in der Zelle auf eine nur sehr geringe Aufnahme der RNA hin.
Auch in den Kontrollzellen mit dem pl.18-Leervektor konnte für den 0 h - Wert nur eine sehr
geringe intrazelluläre HCV RNA Menge von 185 IU in 50 μ l gesamt-Zelleluat detektiert
werden (Datenpunkt in Abbildung 45 A1 nicht abgebildet). Warum in diesem
Transfektionsversuch nur sehr wenig HCV RNA in die Huh7-Zellen aufgenommen wurde ist
unklar. 3 h nach HCV Transfektion wurden noch 0,6 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA
nachgewiesen, was in 50 μ l gesamt-Zelleluat einer Menge von 30 IU entsprach. Die RNA-
Konzentration nahm wie bei der Transfektion mit dem humanen RLI-Plasmid innerhalb von
11 Tagen auf 0,07 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA ab.
Die HCV RNA Menge der RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen nahm von 0,16 (IU/μ l)/relative
Einheit 18S rRNA auf 0,02 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA ab (siehe Abbildung 45 B1).
Diese Konzentrationen entsprachen schon ab dem 3 h - Wert in 50 μ l gesamt-Zelleluat
weniger als 0,4 IU und damit weniger als einer HCV Kopie. Im Kontrollansatz mit dem pl.18-
Leervektor konnten 3 Stunden nach HCV Transfektion 0,4 (IU/μ l)/relative Einheit 18S rRNA
nachgewiesen werden, was 18 IU in 50 μ l gesamt-Zelleluat entsprach. Für den 0 h - Wert
wurden im gesamt-Zelleluat der Kontrollzellen 2200 IU HCV RNA detektiert, während in den
transfizierten Zellen mit dem Affen RLI-Plasmid 1770 IU HCV RNA detektiert wurden
(Datenpunkte in Abbildung 45 B1 nicht abgebildet). Die für die Transfektion eingesetzte
HCV RNA von 1,5*104 IU (250 ng) wurde von den FRhK-4-Zellen besser aufgenommen als
von den Huh7-Zellen. Ob die starke Abnahme der HCV RNA innerhalb der ersten drei
Inkubationsstunden auf den Abbau der HCV RNA oder auf absterbende, transfizierte Zellen
zurückzuführen ist, ist unklar. Es wurden mikroskopisch einige tote Zellen beobachtet, jedoch
nicht in unerwartet hoher Zahl. 11 Tage nach HCV Transfektion konnten sowohl in den RLI-
transfizierten FRhK-4-Zellen als auch in den Kontrollzellen nur noch weniger als
0,5 IU HCV RNA in 50 μ l gesamt-Zellelulat detekiert werden. In den Proben der Tage 26 und
33 konnte weder in den Huh7- noch in den FRhK-4-Zellansätzen noch HCV RNA
nachgewiesen werden. Der intrazelluläre 0 h - Wert der HCV RNA lag für alle Ansätze 1,5
Logstufen über dem 3 h - Wert. Zur besseren grafischen Darstellung der niedriger
konzentrierten HCV-Zellproben ab dem 3 h – Wert, wurden die 0 h - Werte nicht in die
Abbildungen einbezogen.
Ergebnisse
88
0.0
0.1
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48 h
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[(I
U/μ
l)/1
8S r
RN
A]
pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV
B1
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3 h
6 h
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24 h
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48 h
72 h
96 h
HC
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NA
Tit
er [
IU/μ
l]
pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV
B2Abbildung 45: HCV Titer in IVT- und RLI-transfizierten Zellen. Aufgetragen wurden die relativen RNA Einheiten gegen die Zeit. A: Huh7, B: FRhK-4, A1/B1: intrazellulärer HCV Titer, A2/B2: HCV Titer im Überstand
Die relativen Einheiten an RNase L-mRNA lagen sowohl für die FRhK-4- als auch für die
Huh7-Zellen über den gesamten Zeitraum der Probennahmen innerhalb der definierten
Grenzen der Genexpression (siehe Abbildung 46 und Abbildung 47). Die mit dem pl.18-
Leervektor transfizierten Huh7-Zellen zeigten nach 3 und 4 Tagen eine leicht verringerte
RNase-L Transkription mit Faktoren von 0,4 und 0,3. Die mit dem Leervektor transfizierten
FRhK-4-Kontrollzellen zeigten ein ähnliches Ergebnis 3 Stunden nach HCV-Transfektion mit
relativen Einheiten an RNase L-mRNA von 0,35. Die Verringerung der RNase L-mRNA-
Mengen hatte weder in den FRhK-4- noch in den Huh7-Zellen eine Auswirkung auf die
kontinuierliche Abnahme der HCV-Konzentration (siehe Abbildung 45). Insgesamt zeigten
Ergebnisse
89
weder die RLI-transfizierten Zellen noch die Kontrollzellen mit dem Leervektor eine
signifikante Erhöhung oder Verringerung der RNase L-Transkription.
0.0
0.2
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Abbildung 46: RNase L-Expression in IVT- und RLI-transfizierten Huh7-Zellen. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h 264 h 624 h 792 h
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pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV
Abbildung 47: RNase L-Expression in IVT- und RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelten Linien kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression.
Ergebnisse
90
3.4.4. Zusammenfassung Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA
Es wurde HCV full length RNA sowie die RNA des Elongationsfaktors von Xenopus in vitro
transkribiert und in FRhK-4- bzw. Huh7-Zellen transfiziert. Die Transfektion von IVT hatte
keinen Einfluss auf die endogene Expression der RNase L oder des zellulären RNase L
Inhibitors. 24 h nach Transfektion konnte in beiden Zelllinien sowohl extrazellulär als auch
intrazellulär nur noch sehr geringe Konzentrationen an HCV RNA nachgewiesen werden. Die
Transfektion von in vitro transkribierter HCV full length RNA hatte auch in RLI-
transfizierten Zellen keinen Einfluss auf die Expressionsrate der RNase L. Die
Überexpression des RNase L Inhibitors sank von Faktoren von 140 innerhalb einer Woche auf
Faktoren von 10. Durch dreimalige Transfektion wurde die erhöhte Expression des RLI über
einen Inkubationszeitraum von 4 Wochen erhalten. Trotz erhöhter RLI-Expression konnte in
den Zellkulturüberständen von FRhK-4- und Huh7-Zellen 96 h nach Transfektion keine HCV
RNA mehr nachgewiesen werden. Intrazellulär war 11 Tage nach Transfektion keine HCV
RNA mehr im HCV RotorGene System zu detektieren. Damit scheint die Überexpression des
RNase L Inhibitors keinen Einfluss auf die Replikation der transfizierten full length HCV
RNA zu haben.
Diskussion
91
4. Diskussion
4.1. Real time PCRs
4.1.1. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI
und GAPDH sowie der 18S rRNA
In der vorliegenden Arbeit sollten die Expressionsraten des RLI sowie der RNase L unter den
experimentellen Bedingungen einer HCV Infektion analysiert werden. Es sollte sowohl der
Einfluss der HCV RNA auf die Expression des zellulären RLI als auch der Einfluss des
überexprimierten RLI auf die potentielle Replikation von HCV RNA untersucht werden.
Obwohl bisher keine Regulation der RNase L in der Literatur beschrieben wurde, sollte diese
ebenfalls analysiert werden. In Infektionsversuchen mit HAV in einer parallel laufenden
Arbeit zeigte die Datenlage zwischenzeitlich eine mögliche Steigerung der Expression der
RNase L. Aus diesem Grund sollte auch die Expression der RNase L unter den Bedingungen
einer HCV Infektion im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert werden.
Um die Transkriptionsraten von RNase L und RLI detektieren und auswerten zu können,
mussten die entsprechenden real time PCRs erstellt werden. Zur Messung der relativen
Genexpression mit Hilfe der real time PCR wurde zunächst eine geeignete endogene
Kontrolle ausgewählt. Die endogene Kontrolle wird, wie das zu untersuchende Gen, von der
Proben-cDNA amplifiziert. Sie wird genutzt, um die Menge der in der Reaktion eingesetzten
RNA zu standardisieren (Eurogentec, 2004). Häufig werden Housekeeping-Gene wie GAPDH
oder 18S rRNA als endogene Kontrollen verwendet. Idealerweise sollte das Kontrollgen stabil
exprimiert und nicht durch die experimentellen Bedingungen beeinflusst werden. In
verschiedenen Versuchen mit Hepatitis C Viren oder viraler RNA wurde GAPDH als
endogene Kontrolle verwendet (Kapadia et al., 2003; Uprichard et al., 2006), so dass in dieser
Arbeit real time PCRs sowohl für GAPDH als auch für 18S rRNA erstellt wurden.
Verschiedene Untersuchungen mit Tumorzelllinien oder Zellkulturen zeigten
widersprüchliche Ergebnisse mit GAPDH, während 18S rRNA sehr gute Ergebnisse lieferte
(Aerts et al., 2004). Für GAPDH wurden RNA-bindende Eigenschaften festgestellt. Es bindet
an untranslatierte RNA-Sequenzen verschiedener Viren wie beispielsweise Influenza, HAV
oder HBV (Yi et al., 2000). Die von Yi et al. nachgewiesene Interaktion von GAPDH mit
viraler RNA wurde sowohl mit den in dieser Arbeit verwendeten FRhK-4- als auch den
Diskussion
92
Huh7-Zellen gezeigt (Yi et al., 2000). Für das Hepatitis C Virus konnten bisher, auch
aufgrund fehlender Zellkultursysteme, keine Wechselwirkungen mit GAPDH belegt werden.
Um einen möglichen Einfluss von Hepatitis C Virus RNA oder HCV IVT auf GAPDH
auszuschließen, wurde für alle Versuche 18S rRNA als endogene Kontrolle zur Auswertung
der Genepression herangezogen. Lediglich in Kapitel 3.3.4 „HCV Infektion transient RLI-
transfizierter Zellen“ wurden die Expressionsraten von RNase L und RLI sowohl auf GAPDH
als auch auf 18S rRNA normalisiert. Weder die relativen Einheiten der RNase L-mRNA noch
die relativen Einheiten der RLI-mRNA zeigten durch die Normalisierungen auf GAPDH bzw.
18S rRNA signifikante Unterschiede. Bezogen auf beide Referenzgene zeigten sowohl die
FRhK-4- als auch die Huh7-Zellen nach RLI Transfektion eine deutlich erhöhte RLI-
Expression um Faktoren oberhalb von 20 (siehe Abbildung 37). Für beide Zelllinien waren
die detektieren relativen Mengen an RNase L-mRNA weder durch die Normalisierung auf
GAPDH noch auf 18S rRNA außerhalb der Grenzen der nicht regulierten Genexpression von
0,5 und 2 (siehe Abbildung 38).
Da jedoch zum Zeitpunkt der Auswertung keine HCV RNA nachgewiesen werden konnte,
kann über einen möglichen Einfluss viraler HCV RNA auf GAPDH keine Aussage getroffen
werden.
Um reproduzierbare Ergebnisse in der Auswertung der Genepressionsdaten zu generieren,
sollten die Effizienzen der real time PCRs bei nahezu 100 % liegen. Die Effizienz wird neben
dem GC-Gehalt der Amplifikate oder der Sekundärstrukturen von Primern und Sonden
maßgeblich durch die Länge der Amplifikate beeinflusst. Je kürzer das zu bildende
Amplifikat, desto höher die Effizienz der PCR. Aus diesem Grund werden für die
Quantifizierung mit dem TaqMan Amplifikatlängen von bis zu 150 bp empfohlen
(Eurogentec, 2004; Schield, 1998). Die zu amplifizierenden Genabschnitte der vorliegenden
Arbeit hatten Längen von 60 bp (RNase L) und 111 bp (RLI). Aus dem Anstieg der
Standardgeraden konnte die Effizienz der PCR berechnet werden. Alle Effizienzen der im
Rahmen dieser Arbeit erstellten real time PCRs zum Nachweis der Genepressionen betrugen
mindestens
99 % (siehe Tabelle 5). Mit Hilfe der Standardkurve erfolgte auch die Quantifizierung der
RNA. Für jede Probe wurde die Menge der enthaltenen RNA anhand dieser Standardkurve
berechnet (Eurogentec, 2004). Der Faktor von spezifischem Signal (RNase L, RLI) und
endogener Kontrolle (18S rRNA) konnte für jede Probe bestimmt und damit normalisiert
werden. Eine weitere Methode der relativen Quantifizierung ist die ΔΔct-Methode (Pfaffl,
Diskussion
93
2001). Die ct-Werte von spezifischer Probe und endogener Kontrolle werden bei dieser
Methode voneinander abgezogen. Voraussetzung dieser Auswertung ist eine gleiche Effizienz
der beteiligten PCR-Reaktion. Auch wenn die PCR-Effizienzen der real time PCRs von
RNase L, RLI, GAPDH und 18S rRNA nahezu gleich waren, wurde die
Standardkurvenmethode gewählt, um mögliche Schwankungen zwischen den einzelnen PCR-
Läufen auszuschließen. Die in dieser Arbeit erstellten und optimierten real time PCRs
lieferten sehr genaue und reproduzierbare Ergebnisse in den Messungen der zellulären
Expressionsraten von RNase L und RLI.
4.1.2. Real time PCRs zum quantitativen Nachweis der HCV RNA
Ziel der Arbeit war es, die initiale Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur zu
ermöglichen. Dafür sollte nicht verändertes Virus bzw. in vitro transkribierte full length RNA
zur Infektion oder Transfektion von FRhK-4- bzw. Huh7-Zellen und Zellen mit
überexprimiertem RLI eingesetzt werden. Um eine potentielle Replikation der HCV RNA zu
detektieren, war es notwenig, ein sensitives und quantitatives Nachweissystem für die
Hepatitis C Virus RNA zu entwickeln. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein real
time System zum Nachweis der HCV RNA auf der Basis existierender Primer und Sonden der
Firma QIAGEN Hamburg in einem neuen Puffer- und Enzymsystem hinsichtlich Sensitivität,
Spezifität und Herstellungskosten optimiert. Die Probleme des vorangegangenen Systems mit
Qualitätsschwankungen der Reversen Transkriptase wurden durch den Einsatz von Reverser
Transkriptase eines anderen Herstellers eliminiert. Eine hohe Sensitivität des Systems war
neben dem potentiellen kommerziellen Einsatz des HCV RotorGene Nachweissystems durch
die QIAGEN Hamburg für die durchgeführten Zellkulturexperimente dieser Arbeit
entscheidend, um auch geringe Mengen replizierter RNA detektieren zu können
Mit Hilfe der Probit-Analyse wurde für das entwickelte HCV RotorGene Assay eine
Nachweisgrenze von 35 IU/ml bestimmt. Für Assays zum qualitativen Nachweis von HCV
RNA besteht die Vorgabe, Konzentrationen von 50 IU/ml oder weniger nachweisen zu
können. Ebenso muß die Detektion aller Subtypen gewährleistet sein (Chevaliez &
Pawlotsky, 2006). Sowohl der Nachweis von mindestens 50 IU/ml als auch die Detektion
aller Subtypen waren mit dem entwickelten HCV RotorGene System gegeben (siehe Kapitel
3.1.2). Die Nachweisgrenze ist von der eingesetzten Probenmenge und deren
Aufkonzentrierung durch die Aufreinigung abhängig. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit
wurde für die Aufreinigung der Zellkulturüberstände das QIAamp®Viral RNA Mini Kit
Diskussion
94
genutzt. Durch die Kooperation der Universität Bremen und der QIAGEN Hamburg GmbH
sollte eine auf QIAGEN-Produkten basierende Aufreinigung verwendet werden. Für eine
möglichst breite Einsetzbarkeit der Aufreinigung, standen die manuellen
Aufreinigungssysteme QIAamp®Viral RNA Mini Kit und QIAamp®DSP Virus Kit zur
Auswahl. Das QIAamp®DSP Virus Kit basiert auf einem Vakuum-System, was für den
Anwender einen höheren Anschaffungsaufwand bedeutet als das QIAamp®Viral RNA Mini
Kit. Für dieses Kit wird lediglich eine in allen Laboratorien vorhandene Zentrifuge benötigt.
In die Aufreinigung mit dem QIAamp®DSP Virus Kit werden im Vergleich zum
QIAamp®Viral RNA Mini Kit 500 μ l statt 140 μ l Probe eingesetzt. Da in den, für diese
Arbeit, verwendeten 24-well-Zellkulturplatten maximal 1 ml Zellkulturüberstand pro well
vorhanden war, mußte ein Aufreinigungssystem verwendet werden, das möglichst wenig
Zellkulturmaterial verbraucht. Die Auswertung der Proben sollte in Doppelbestimmung
möglich sein, und bei einer potentiellen HCV Replikation sollte eine Reinfektion mit den
Zellkulturüberständen erfolgen. Aus diesen Gründen wurde das QIAamp®Viral RNA Mini
Kit für die Aufreinigung der Zellkulturüberstände verwendet. Es wurden 140 μ l
Zellkulturüberstand in die Aufreinigung eingesetzt und in einem Volumen von 50 μ l eluiert.
Das entsprach einem Aufkonzentrierungsfaktor von 3. Von diesem Eluat wurden 10 μ l, d.h.
ein fünftel in die PCR eingesetzt. Für einen möglichen Einsatz des HCV RotorGene System
zum Monitoring von HCV Therapien, könnte die Sensitivität durch Änderung der
Aufreinigung (QIAamp®DSP Virus Kit oder Aufreinigungsroboter) mit stärkerer
Aufkonzentrierung der Proben gesteigert werden. Für die Auswertung der Versuche der
voliegenden Arbeit war die erzielte Nachweisgrenze von 35 IU/ml jedoch hervorragend
geeignet, da eine Replikation des Virus eine Erhöhung der RNA-Konzentration zur Folge
gehabt hätte. Eine gesteigerte Sensitivität des Assays hätte lediglich den Zeitpunkt
verschoben, an dem die HCV RNA in den durchgeführten Versuchen nicht mehr nachweisbar
gewesen wäre. Da im Falle einer potentiellen Replikation des Viruses nur sehr geringe
Mengen replizierter RNA erwartet wurde, hätten niedrigere Sensitivitäten des HCV
RotorGene Systems zu falschen Versuchsergebnissen führen können. Um eine Zunahme der
RNA detektieren zu können war ein quantitatives Assay notwendig. Durch den Nachweis der
HCV RNA mittels konventioneller PCR und anschließender Geldokumentation wäre eine
quantitative Analyse der RNA nicht möglich gewesen. Die Erstellung und Optimierung eines
spezifischen, sensitiven und quantitativen HCV Nachweissystem war somit Voraussetzung
für die Auswertung der HCV Infektions- und Transfektionsversuche der vorliegenden Arbeit.
Diskussion
95
4.2. RNase L Inhibitor
4.2.1. Isolation und Analyse des RLI aus FRhK-4- und humaner gesamt-Zell-RNA
Das in dieser Arbeit aus FRhK-4- und humaner gesamt-Zell-RNA isolierte und full length
amplifizierte RLI-Gen wurde sequenziert und mit der Referenzsequenz Accesion nr. X74987
verglichen (siehe Abbildung 22). Es wurden Unterschiede innerhalb der Basensequenz des
RLI in den Bereichen von 520 bp bis 540 bp und 1412 bp bis 1422 bp nachgewiesen, welche
Veränderungen der Aminosäuresequenz zur Folge haben. Das Referenzplasmid (Bisbal et al.,
1995), auf welchem die veröffentlichte RLI-Sequenz beruht, wurde daraufhin ebenfalls
sequenziert und zeigte analoge Ergebnisse zu den Sequenzen des isolierten und full length
amplifizierten RNase L Inhibitors. Die unter NCBI angegebene Referenzsequenz X74987
entstand höchstwahrscheinlich durch Sequenzierfehler. Bei 521 bp fehlt in der
Referenzsequenz ein Adenin, wodurch sich die folgenden Basen verschieben. Bei 538 bp ist
dagegen ein Guanin zu viel, wodurch die Sequenzen von Referenzplasmid und full length
Amplifikat des RLI anschließend wieder übereinstimmten. Zwischen 1412 bp und 1422 bp
sind jeweils die Basen Guanin und Cytosin vertauscht, was ebenfalls auf einen Fehler in der
Auswertung der Sequenzierung von Bisbal et al. (1995) schließen lässt. Da alle Ergebnisse
durch Sequenzierung überlappender Abschnitte bestätigt wurden, sind Fehler in den
Sequenzdaten der vorliegenden Arbeit ausgeschlossen. 1996 führten Aubry et al. Versuche
zur chromosomalen Lokalisation das RLI durch (Aubry et al., 1996). Im Rahmen dieser
Arbeit wurden die Sequenzunterschiede, welche in der vorliegenden Arbeit zum Referenz-
RLI festgestellt wurden, ebenfalls detektiert. Eine Aktualisierung der Sequenz in der
Datenbank ist jedoch nicht erfolgt. Die Sequenzierung der RLI-Referenzsequenz X74987
wurde 1995 nach der Didesoxymethode (Sanger et al., 1977) mit Hilfe des T7 Sequencing
Kits der Firma Pharmacia durchgeführt. Auch Aubry et al. verwendeten das T7 Sequencing
Kit. Die Sequenzunterschiede der Ergebnisse von Bisbal et al. (1995) und Aubry et al. (1996)
weisen auf eine Anfälligkeit der Sequenzierergebnisse mit diesem Kit hin. Nach Auftrennung
der DNA-Fragmente im Polyacrylamidgel erfolgte die Auswertung der Radioaktivität mittels
Audioradiographie (Amersham-Pharmacia, 1994). Heute existieren optimiertere Methoden
zur Sequenzierung. Neben der radioaktiven Markierung der DNA-Fragmente werden mit
Fluoreszenz-Farbstoffen markierte Didesoxynukleotidtriphosphate eingesetzt, wodurch der
Umgang mit Radioisotopen entfällt. Die gelelektrophoretischen Auftrennungen wurden
Diskussion
96
optimiert und in ihrer Auflösung deutlich verbessert. Die Sequenzierungen der vorliegenden
Arbeit wurden von Dr. H. Schmidt vom DNA-Cloning-Service durchgeführt. PCR-
Amplifikate des RLI wurden zunächst mit den Restriktionsenzymen Exonuklease I und
Shrimp-Alkaline-Phosphatase (Exo/SAP) verdaut, um Primer- und dNTPs zu beseitigen.
Anschließend erfolgte die Sequenzierung ebenfalls nach der Sanger-Methode mit dem
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit der Firma Applied Biosystems. Mit dem
3100 Genetic Analyzer von ABI wurden die DNA-Fragmente aufgetrennt und detektiert. Der
3100 Genetic Analyzer ist ein automatisches Kapillarelektrophorese-System, in dem bis zu 16
Kapillaren analysiert und detektiert werden können. Die Fluoreszenz der markierten
Fragmente wird durch eine CCD Kamera aufgenommen, zum Computer übertragen und von
diesem mit Hilfe der Sequenzier-Software ausgewertet (ABI, 2001). Es ist davon auszugehen,
dass die in der vorliegenden Arbeit verwendete optimierte Sequenziermethode im Vergleich
zu den früher verwendeten Verfahren genauer ist. Die vorliegenden Ergebnisse werden neben
reproduzierten Sequenzdaten durch die Arbeit von Aubry et al. (1996) bestätigt. Eine
Revision der in der Datenbank NCBI angegeben Sequenz des RNase L Inhibitors wäre daher
anzustreben. Die Aminosäuresequenzen der in der vorliegenden Arbeit isolierten RLI-Gene
aus Rhesusaffe und Mensch zeigten keinerlei Unterschiede. Einzelne Basenaustausche hatten
keine Auswirkung auf die Aminosäuresequenz der entsprechenden RLI-Proteine. Es ist nicht
auszuschließen, dass einzelne Basenaustausche im Rahmen der Klonierung oder
Sequenzierung eingebaut wurden. Aufgrund der gleichen Aminosäuresequenz wird das
humane RLI auch in Affenzellen aktiv sein und das FRhK-4-RLI auch in humanen Zellen
wirken.
4.2.2. stabile Überexpression des RNase L Inhibitors in Huh7- und FRhK-4-Zellen
Um einen möglichen Einfluss des RNase L Inhibitors auf die experimentelle zelluläre
Infektion mit dem Hepatitis C Virus zu testen, sollte der Inhibitor stabil transfiziert werden.
Wie in Kapitel 3.2.6 „Stabile Überexpression des RLI in FRhK-4- und Huh7-Zellen“
dargestellt, konnte der RNase L Inhibitor nicht in konstantem Maße und dauerhaft
überexprimiert werden. 8 Wochen nach Transfektion konnten nur noch in 4 von 6 selektierten
FRhK-4-RLI-Klonen erhöhte relative Mengen an RLI-mRNA um Faktoren von 4 bis 8
nachgewiesen werden (siehe Abbildung 28). Die Kinetik von zwei ausgewählten RLI-Klonen
(Klon 4 und Klon 5) zeigte deutliche Transkriptionsunterschiede des RNase L Inhibitors im
Versuchszeitraum von 14 Tagen. Innerhalb dieser Inkubationszeit wurden relative Mengen an
Diskussion
97
RLI-mRNA um Faktoren von 2 bis zu Faktoren von 10 detektiert (siehe Abbildung 30). Eine
stabile und konstante Überexpression des RLI konnte nicht erreicht werden. Für die Huh7-
Zellen war eine Selektion potentieller RLI-Klonen nicht möglich, da die Zellen bei dem sehr
hohen Umsetzungsverhältnis im Rahmen der Klonselektion ihr Wachstum eingestellt haben.
Möglicherweise wäre eine schrittweise Selektion mit kleineren Umsetzungsverhältnissen
erfolgversprechender gewesen. In Huh7-RLI-Mischklonen konnte jedoch bereits nach kurzer
Zeit keine RLI-Überexpression mehr nachgewiesen werden.
Ob die Zellen das Gen eliminieren oder überexprimierende Zellen frühzeitig absterben ist
völlig unklar. Eine möglicherweise letale Wirkung gesteigerter Mengen an RLI-Protein kann
nicht beurteilt werden. Ob die Verwendung von pcDNA3.1/V5-His_RLI wegen seiner
geringeren Überexpressionsraten für eine stabile Transfektion gegenüber pl.18_RLI günstiger
gewesen wäre, ist nicht auszuschließen. Potentiell letal wirkende hohe Mengen an RLI-
Protein hätten durch die geringen Transkriptionsraten der pcDNA3.1/V5-His_RLI Plasmide
mit maximalen relativen Einheiten an RLI-mRNA um Faktoren von 6 möglicherweise
unterschritten werden können. Jedoch wurde bereits 1999 im Rahmen einer Diplomarbeit
schon einmal versucht, FRhK-4-Zellen stabil mit dem pcDNA3/RLI 3’ zu transfizieren
(Gotter, 1999). Die dadurch gewonnenen FRhK-4-6er Klone zeichneten sich in HAV
Infektionsexperimenten durch eine stärkere Replikation des HAV aus, wodurch von einer
Überexpression des RLI ausgegangen wurde. Ein Nachweis der RLI-Transkription auf
Genexpressionsebene ist nicht erfolgt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die FRhK-
4-6er Klon-Zellen auf ihre RLI-Transkriptionsrate getestet und zeigten keine erhöhten
Mengen relativer Einheiten an RLI-mRNA (siehe Abbildung 31). Diese Ergebnisse
unterstützen die Vermutung, dass auch bei dem Versuch einer stabilen Überexpression des
RLI mit pcDNA3.1/V5-His_RLI keine dauerhaft stabilen Transfektanten gewonnen werden
können.
In der Literatur gibt es keine Daten zur Überexpression des RNase L Inhibitors in FRhK-4-
oder Huh7-Zellen. Generell gibt es nur sehr wenig Arbeiten mit Bezug zum RNase L
Inhibitor. Diese wenigen Arbeiten wurden fast ausschließlich mit Hela-Zellen (Epithelzellen
aus Gebärmutterhalskrebs) durchgeführt (Bisbal et al., 1995; Martinand et al., 1998).
Ausnahme bilden zwei Arbeiten, in denen H9- (humane T Lymphozytenzellen) bzw. Daudi-
Zellen (Burkitt-Lymphomzellen) verwendet wurden (Bisbal et al., 2001; Martinand et al.,
1999). In diesen Arbeiten wurde die Überexpression des RLI zwar benannt, jedoch nicht mit
Daten belegt. Auch ist in den Arbeiten häufig unklar, ob für die Versuche stabil transfizierte
Zellen verwendet wurden oder eine transiente Transfektion durchgeführt wurde. Fehlende
Diskussion
98
Angaben über die Herkunft der verwendeten stabil transfizierten RLI-Klone in den
verschiedenen Arbeiten lassen mutmaßen, dass die stabil transfizierten Zellen für jede Arbeit
neu hergestellt wurden. Dies wäre ein Hinweis auf eine nicht mögliche, dauerhafte
Überexpression des RNase L Inhibitors. Aus diesen Gründen wurden für die Versuche der
vorliegenden Arbeit transiente RLI-Transfektionen durchgeführt. Mit Hilfe der transienten
RLI-Transfektion konnte die Überexpression des RNase L Inhibitors für mindestens 5 Tage
mit erhöhten relativen Mengen an RLI-mRNA um Faktoren von mindestens 10 sichergestellt
werden (siehe Abbildung 26). Durch Mehrfachtransfektion konnte die Dauer der RLI
Überexpression über einen beliebig langen Inkubationszeitraum verlängert werden.
4.3. HCV Infektion und Transfektion von HCV full length RNA in RLI-transfizierte
Zellen
Ziel der HCV Infektions- und Transfektionsversuche der vorliegenden Arbeit war es, mit
Hilfe der Überexpression des RLI die RNase L auszuschalten und dadurch eine initiale
Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur zu ermöglichen. Hauptaspekt war dabei, die
eingesetzte virale RNA nicht zu verändern. Das Passagieren geringer Mengen an
Virusnachkommen sollte eine Anpassung der Viren an die Zellkultur bewirken.
Der gewählte Versuchsansatz, durch Überexpression des RLI die RNase L auszuschalten und
dadurch eine initiale Replikation des HCV zu ermöglichen, soll kurz erläutert werden. Dazu
werden bekannte inhibitorische Effekte des Hepatitis C Virus auf zelluläre antivirale
Abwehrmechanismen in die Betrachtung einbezogen.
Cheng et al. vermuten, dass das Hepatitis C Virus den antiviralen Signalweg nach dessen
Aktivierung blockiert (Cheng et al., 2006). Die Transfektion von polyIC in JFH-1 infizierten
Zellen hat gezeigt, dass Hepatitis C Viren die Aktivierung von IRF-3 (interferon regulated
factor 3) durch dsRNA blockieren. Auch Foy et al. zeigten in ihrer Arbeit, dass die viralen
Proteine NS3/4A die intrazelluläre virale Antwort unterbrechen, welche die IFN β-Expression
induzieren (Foy et al., 2005). Die Blockade der Interferon-Produktion verhindert somit die
Induktion der Oligoadenylatsynthetase-Expression (siehe Abbildung 48). Ebenfalls wurde
bereits 2000 die Fähigkeit des Hepatitis C Virus beschrieben, durch Bindung des NS5A-
Proteins an die Proteinkinase R dessen Aktivierung zu verhindern (Francois et al., 2000).
Auch das E2-Protein blockiert die Kinase Aktivität der PKR und dadurch deren hemmenden
Effekt auf die Proteinsynthese (Taylor et al., 1999). Durch das Verhindern der Induktion der
Oligoadenylatsynthetase und durch die Inaktivierung der PKR werden sowohl das
Diskussion
99
2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System als auch die PKR als Interferon-induzierte antivirale
Signalweges durch das Hepatitis C Virus unterwandert (siehe Abbildung 48). In klinischen
Studien mit Leberbiopsiematerial chronischer Hepatitis C Patienten wurde eine signifikante
Reduktion der Expression des RNase L Inhibitors festgestellt (Yu et al., 2000). Es könnte
daher eventuell ein Einfluss des RLI oder der RNase L auf die HCV Infektion vorliegen.
Möglicherweise führt eine Reduktion des RLI durch die Replikation des Hepatitis C Virus zu
einer Aktivität der RNase L. Ein Gleichgewicht zwischen Virusreplikation und RNase L-
Aktivität könnte möglicherweise zur Ausbildung der chronischen Hepatitis führen. Ob die
Expression der latent vorliegenden RNase L oder des zellulären RLI durch das Hepatitis C
Virus bei der experimentellen Infektion von FRhK-4- und Huh7-Zellen beeinflusst werden,
wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert. Eine potentielle Aktivierung der RNase
L wurde durch die Überexpression des RLI verhindert.
Abbildung 48: schematische Darstellung der zellulären viralen Abwehr mit Angriffsstellen des Hepatitis C Virus
Man muss bedenken, dass alle Erkenntnisse über die Interaktion der HCV-Proteine auf
Versuchen mit Replikonsystemen oder dem HCV Stamm JFH-1 beruhen. Ohne adaptive
Diskussion
100
Mutationen der HCV-Replikons an die Bedingungen der verwendeten Zellen war eine
Replikation nicht möglich (Bartenschlager et al., 2003). Diese adaptiven Mutationen sowie
die Unterschiede von JFH-1 in 5’UTR, Core-Protein und verschiedenen Nicht-
Strukturproteinen zu allen bekannten HCV Sequenzen spiegeln deshalb nicht zwangsläufig
die zelluläre Replikation des Hepatitis C Virus wider. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit
wurde daher unabhängig von Adaptionen oder dem besonders virulenten HCV-Stamm JFH-1
ein möglicher Einfluss der HCV Infektion auf die zellulären antiviralen Signalwege
analysiert. In klinischen Studien mit Leberbiopsiematerial chronischer Hepatitispatienten
wurden sowohl auf mRNA-Ebene als auch immunohistochemisch erhöhte Expressionen der
Proteinkinase R festgestellt (Shimada et al., 1998; Yu et al., 2000). Die Ergebnisse einer
gesteigerten aktiven PKR widersprechen der experimentell festgestellten Fähigkeit des
Hepatitis C Virus, die Proteinkinase R zu inhibieren (Francois et al., 2000; Taylor et al.,
1999). Yu et al. beobachteten weiterhin eine signifikante Reduktion der RLI-mRNA, jedoch
keine Veränderung des RNase L-Expressionsmusters (Yu et al., 2000). Keiner der
Studienpatienten erhielt eine zusätzliche Interferontherapie, so dass Expressionsunterschiede
zu Leberbiopsieproben gesunder Personen aufgrund der Gabe von Interferon ausgeschlossen
werden können. Die manuelle Zugabe von Interferon erhöht innerhalb der Zellen deutlich den
Anteil an 2’-5’Oligoadenylaten. Auf der dadurch gesteigerten Aktivität der RNase L und der
anschließenden Spaltung viraler RNA beruht der Erfolg der Interferonbehandlung zahlreicher
Virusinfektionen (Williams et al., 1979). Für HCV Infektionen wird angenommen, dass der
Erfolg der Interferontherapie direkt mit der Fähigkeit der Spaltung von HCV RNA durch die
RNase L korreliert (Han & Barton, 2002). Einige HCV Typen wie beispielsweise Subtyp 1a
zeigen sich gegenüber Interferon weniger sensitiv als andere HCV Subtypen. Wie jedoch in
der Arbeit von Han und Barton gezeigt werden konnte, werden die RNAs aller HCV
Subtypen effektiv durch die RNase L gespalten (Han & Barton, 2002). Die Ausschaltung der
RNase L-Aktivität mit Hilfe der Überexpression des RLI stellt daher einen Versuch dar, die
Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur zu ermöglichen.
Um die Ergebnisse der HCV RNA-Bestimmung infizierter Zellen nach verschiedenen
Inkubationszeiten beurteilen zu können, wurde zunächst die Stabilität von Hepatitis C Virus
RNA im Viruskapsid bestimmt. Dieser Versuch diente dazu, abschätzen zu können, wie lange
Hepatitis C Virus RNA des Inokulums nachgewiesen werden kann. Die Nachweisgrenze von
35 IU/ml wurde bereits 18 Tage nach Versuchsbeginn erreicht. In den nachfolgenden
Probennahmen konnte die HCV RNA nicht mehr reproduzierbar detektiert werden. In
Diskussion
101
Zellkulturmedium und unter Brutschrankbedingungen, jedoch ohne den Einfluss zellulärer
Enzyme, konnte bis zu maximal 30 Tagen nach Versuchsbeginn in einzelnen Proben HCV
RNA detektiert werden. Nach 30 Tagen Inkubationszeit waren alle Proben im HCV
RotorGene System negativ (siehe 3.3.2). Gegen ubiquitär vorkommende RNasen ist die HCV
RNA durch die virale Hülle relativ geschützt, während zelluläre RNasen in diesem
Versuchsansatz keine Rolle spielten. Für die HCV Infektionsversuche wird aufgrund
vorhandener zellulärer RNasen angenommen, dass die zeitliche Nachweisgrenze der
Inokulum-RNA deutlich unter 30 Tagen liegt. Reproduzierbare positive Ergebnisse für HCV
Inokulum-RNA sollten sogar unter 18 Tagen liegen. Auch durch das Waschen der Zellen
nach Infektion und durch Mediumwechsel werden die Mengen an Inokulum-RNA weiter
deutlich herabgesetzt. Dadurch wird der Zeitraum der Detektierbarkeit von Inokulum-RNA
stark reduziert. Es ist daher davon auszugehen, dass ab 30 Tagen nach Infektion mit sehr
hoher Wahrscheinlichkeit keine Inokulum-RNA mehr nachgewiesen werden kann. Durch die
Erstellung eines sensitiven und quantitativen Nachweises für HCV RNA im Rahmen der
vorliegenden Arbeit ist bei einem Anstieg der HCV RNA Konzentrationen in den
Zellkulturproben mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer Replikation auszugehen.
Alle bisherigen Versuche, natürliche HCV Isolate verschiedener Subtypen in Zellkultur
anzuzüchten, verliefen erfolglos (Ausnahme JFH-1). Die effiziente Replikation des Hepatitis
C Virus gelang bis heute nur in Huh7-Zellen und nur mit Replikonsystemen oder mit dem
hochinfektösen HCV Stamm JFH-1 (Bartenschlager et al., 2003; Kato et al., 2001). Die
Infektionsversuche der vorliegenden Arbeit wurden parallel mit FRhK-4- und Huh7-Zellen
durchgeführt. Huh7-Zellen stellen als Vertreter der humanen Leberzellen die natürlichen
Wirtszellen des Hepatitis C Virus dar. Für Klone von FRhK-4-Zellen konnte im Rahmen
einer Diplomarbeit der Universität Bremen ein gesteigertes HAV Wachstum gezeigt werden
(Gotter, 1999). Aus diesem Grund wurden die FRhK-4-Zellen parallel zu den Huh7-Zellen
verwendet.
Bartenschlager et al. vermuten die besondere Eignung der Huh7-Zellen für HCV-
Replikationen in einem Defekt der Zellen, auf doppelsträngige RNA zu reagieren und die
dsRNA-abhängigen antiviralen Signalwege zu aktivieren (Bartenschlager et al., 2003).
Allerdings wurde die Fähigkeit der Huh7-Zellen, auf doppelsträngige RNA zu reagieren,
durch Cheng et al. mit Hilfe von polyIC (synthetischer dsRNA) gezeigt (Cheng et al., 2006).
16 Stunden nach Transfektion von polyIC war die Interferon-β Expression induziert. Auch die
Diskussion
102
Versuche von Lanford et al. mit Huh7-Zellen weisen zwar auf einen Defekt der Zellen in
einigen Teilen des Signalweges für dsRNA hin, diese beeinflussen jedoch nicht die Reaktion
auf Interferon α oder Interferon γ (Lanford et al., 2003). Ob der nicht genauer beschriebene
Defekt einen Einfluss auf die Replikationsfähigkeit von JFH-1 oder HCV-Replikons besitzt
ist nicht bekannt.
Doppelsträngige RNA aktiviert als Kofaktor die Oligoadenylatsynthetase. Gesteigerte
Interferon β-Expression und ein aktiviertes Oligoadenylatsynthetase-System führen zur
Aktivierung der RNase L. Eine Regulation der RNase L-Expression wurde in der Literatur
bisher nicht beschrieben. In HAV Infektionsversuchen einer parallel verlaufenden
Doktorarbeit sah die Datenlage zwischenzeitlich jedoch so aus, als ob eine gesteigerte
Expression der RNase L durch HAV erfolgen würde. Aus diesem Grund wurde die
Expression der RNase L während der Infektionsversuche mit HCV ebenfalls analysiert. Eine
Regulation der RNaseL-mRNA-Mengen durch das Hepatitis C Virus konnte nicht festgestellt
werden (siehe Abbildung 38). Man muß jedoch beachten, dass die Analyse der mRNA der
RNase L erst 4 Wochen nach der HCV Infektion erfolgt ist. Um alle potentiell HCV
infizierten Zellen über einen möglichst langen Zeitraum mit überexprimiertem RLI zu
kultivieren, wurden während des Versuches keine Zellen zur Analyse der mRNA-Menge von
RNase L bzw. RLI abgenommen. Aus diesem Grund könnte eine potentiell erhöhte
Expression der RNase L zu Beginn der Inkubationszeit bereits wieder abgeklungen sein. Da
jedoch keine HCV Replikation in den infizierten Zellen stattgefunden hat, kann über einen
potentiellen Einfluss des Hepatitis C Virus auf die Expression der RNase L keine Aussage
getroffen werden.
Zu den FRhK-4-Zellen ist bekannt, dass sie nicht auf Interferon reagieren. Trotz Anwesenheit
des von ihnen produzierten Interferons bleiben diese Zellen permissiv für eine VSV Infektion,
was auf eine Blockade innerhalb der Interferon-Signaltransduktion hindeutet (Brack, 1999).
Oligoadenylatsynthetase und RNase L werden jedoch konstitutiv in diesen Zellen exprimiert
(Brack, 1999). In den HCV Infektionsversuchen der vorliegenden Arbeit konnte auch für die
FRhK-4-Zellen keine Regulation der RNase L-Expression festgestellt werden. Die relativen
Einheiten der RNase L-mRNA der stabil RLI-transfizierten FRhK-4-Klone 4 und 5 sowie der
transient RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen lagen innerhalb der Grenzen nicht regulierter
Genexpression (siehe Abbildung 36 und Abbildung 38). Auch die Analyse der RNase L-
Expression in transient RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen erfolgte erst 4 Wochen nach
Infektion. Aus diesem Grund könnte wie bereits für die Huh7-Zellen beschrieben eine
potentiell erhöhte Expression der RNase L zu Beginn der Inkubationszeit bereits wieder
Diskussion
103
abgeklungen sein. Da auch in den FRhK-4 Zellen keine HCV Replikation erfolgt ist, kann
über einen möglichen Einfluss des Hepatitis C Virus auf die Expression der RNase L auch in
diesem Fall keine Aussage getroffen werden.
Sowohl in den FRhK-4- als auch in den Huh7-Zellen kann latent vorhandene RNase L durch
doppelsträngige RNA während der HCV Infektion aktiviert werden. Diese Aktivierung ist
mittels real time PCR nicht messbar. Versuche, die RNase L im Western-Blot nachzuweisen
scheiterten an vermutlich viel zu geringen Konzentrationen an RNase L-Protein in den
Versuchsansätzen. Die Überexpression des RLI hatte weder in den FRhK-4- noch in den Huh-
Zellen einen positiven Einfluss auf eine potentielle Replikation des Hepatitis C Virus. In
transient RLI-transfizierten Zellen ergab die Analyse der RLI-mRNA 4 Wochen nach HCV
Infektion noch ein Erhöhung um Faktoren von über 30 für Huh7- und FRhK-4-Zellen (siehe
Abbildung 37). Weder intrazellulär noch extrazellulär konnte jedoch HCV RNA
nachgewiesen werden. Es ist daher davon auszugehen, dass das
2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System mit dem Effektorenzym RNase L höchstwahrscheinlich
keinen Einfluss auf die experimentelle HCV Infektion in Huh7- bzw. FRhK-4-Zellen ausübt.
Im Rahmen der Infektionsversuche stellt der Viruseintritt in die Zellen einen wichtigen
Aspekt dar. Der CD81-Rezeptor wird mit dem Eintritt des Hepatitis C Virus in die
Leberzellen in Verbindung gebracht (Bartosch et al., 2003; Pileri et al., 1998). Es ist bekannt,
dass Antikörper gegen CD81 die HCV Infektion in Huh7-Zellen hemmen (Zhong et al.,
2005), d.h. die Huh7-Zellen den CD81-Rezeptor exprimieren. In der Literatur gibt es jedoch
keine Angaben über das Vorhandensein des CD81-Rezeptors in FRhK-4-Zellen. Es ist daher
möglich, dass diese Zellen den Rezeptor nicht besitzen und bei den Infektionsversuchen kein
Viruseintritt in die Zellen erfolgt ist. Trotz Expression des CD81 in Huh7-Zellen kann auch
für die Infektionsversuche dieser Zellen nicht davon ausgegangen werden, dass die Aufnahme
des Hepatitis C Virus in die Zellen erfolgt ist. Aus diesen Gründen wurde der Viruseintritt
umgangen und HCV full length RNA in die Zellen transfiziert. Dadurch wurde sichergestellt,
dass die HCV RNA in das Zytoplasma der Zellen gelangt. Ein möglicher Einfluss der
Transfektion von RNA in vitro Transkript auf die Expression von RNase L und zellulärem
RLI wurde durch die Transfektion von in vitro transkribierter RNA des Elongationsfaktors II
von Xenopus ausgeschlossen. Weder die Transfektion von HCV IVT noch von Xenopus IVT
führten zu einer erhöhten Expression der RNase L in FRhK-4- oder Huh7-Zellen (siehe
Abbildung 40). Die Expression des zellulären RLI wurde durch die Transfektion von IVT
ebenfalls nicht beeinflusst. In einem Inkubationszeitraum von 24 Stunden nach Transfektion
Diskussion
104
lagen die relativen Mengen an RLI-mRNA sowohl in den FRhK-4- als auch in den Huh7-
Zellen innerhalb der Grenzen nicht regulierter Genexpression (siehe Abbildung 42). Die
Expression der RNase L wurde auch durch die Transfektion von HCV IVT in transient RLI-
transfizierte FRhK-4- oder Huh7-Zellen nicht reguliert (siehe Abbildung 46 und Abbildung
47). Die relativen Mengen an RLI-mRNA waren aufgrund der transienten RLI-Transfektion
bis zu 26 Tagen nach HCV Transfektion um Faktoren von mindestens 5 erhöht. Zum
Zeitpunkt der HCV Transfektion waren die relativen mRNA-Einheiten des RLI sogar um
Faktoren von 140 (FRhK-4-Zellen) bzw. 180 (Huh7-Zellen) erhöht (siehe Abbildung 43 und
Abbildung 44). 26 Tage nach HCV Transfektion konnte jedoch weder für die FRhK-4- noch
für die Huh7-Zellen intrazellulär oder extrazellulär HCV RNA nachgewiesen werden (siehe
Abbildung 45). Die Überexpression des RLI hatte daher keinen positiven Effekt auf die
potentielle HCV Replikation. Eine Replikation der HCV RNA ist offensichtlich nicht erfolgt.
Ob die in vitro transkribierte HCV RNA möglicherweise bereits vor der Transfektion
abgebaut wurde, ist nicht bekannt. Ohne Proteinhülle sind die „nackt“ vorliegenden in vitro
Transkripte gegenüber RNasen sehr ungeschützt. Die Stabilität von RNA ist von der Länge
des polyA-Anhangs oder besonderer Sequenzen in der 3’-UTR abhängig (Alberts et al.,
1995). Durch das Einfrieren und Auftauen könnte der polyA-Anhang der IVTs bereits
verkürzt oder abgebaut und dadurch die Stabilität der RNA stark beeinträchtigt worden sein.
Eine Stabilitätsbestimmung der in vitro transkribierten RNA ist im Rahmen der vorliegenden
Arbeit nicht durchgeführt worden. Da im HCV RotorGene System lediglich ein kurzer
Genabschnitt der 5’-UTR amplifiziert wird, ist eine Aussage über die Länge oder Qualität der
Ausgangs-RNA nicht möglich. In vitro transkribierte RNA besitzt jedoch eine hohe
Empfindlichkeit gegenüber ubiquitär vorkommenden RNasen. Auch wenn das
Transfektionsreagenz einen Schutz vor RNasen bieten sollte, ist ein Abbau der RNA während
der 20minütigen Inkubation von IVT und Transfektionsreagenz nicht auszuschließen.
Intrazellulär wäre der Abbau des IVTs durch latent vorliegende unnd möglicherweise aktive
RNase L zu erklären. Eine Aktivierung der RNase L wurde jedoch durch die Überexpression
des RLI ausgeschlossen. In der Arbeit von Han und Barton wurde ausserdem eine minimale
HCV RNA Konzentration von 20nM zur Aktivierung der Oligoadenylatsynthetase und RNase
L bestimmt. Geringere RNA Mengen waren innerhalb des Versuchsaufbaus stabil. Größere
Mengen an RNA führen zur schnellen und effektiven Spaltung durch die RNase L (Han &
Barton, 2002). Die in dieser Arbeit für die Transfektion eingesetzten 250 ng IVT entsprechen
einer Konzentration von ca. 8 nM. Diese Konzentration liegt deutlich unter der von Han und
Barton bestimmten minimalen Aktivierungkonzentration von 20nM, so dass eine Aktivierung
Diskussion
105
der RNase L durch das IVT nicht erfolgt sein sollte. Die Abnahme der in vitro transkribierten
RNA-Konzentration ist in diesem Falle auf ubiquitär vorkommende RNasen und nicht auf
eine Aktivierung der RNase L zurückzuführen. Eine Aktivierung der RNase L wäre erst bei
einer erhöhten RNA Menge nach einer Replikation der HCV RNA erfolgt. In diesem Fall
hätte die Überexpression des RNase L Inhibitors dieser Aktivierung jedoch entgegengewirkt
und eine weitere Replikation der HCV RNA ermöglicht. Da keine Replikation des Hepatitis C
Virus in Zellkultur erfolgt ist, ist eine Aktivierung der RNase L durch HCV RNA sehr
unwahrscheinlich. Die Überexpression des RLI hatte auf die potentielle Replikation der HCV
RNA keinen positiven Einfluss.
Es ist weiterhin nicht möglich, eine Aussage darüber zu treffen, ob die transfizierte RNA
innerhalb der Zelle translatiert wurde. Wie in Kapitel 1.1.9 „Hepatitis C Virus in Zellkultur“
beschrieben, existieren derzeitig keine Zellkultursysteme zur Anzucht des Hepatitis C Virus
aus Patientenmaterial oder full length RNA (Sonderfall JFH-1 mit deutlichen
Sequenzunterschieden zu den bekannten Hepatitis C Viren in fast allen Nicht-
Strukturproteinen). Replikationen sind bisher lediglich auf der Basis von Replikonsystemen
möglich (Lohmann et al., 1999). Alle diese Replikonsysteme enthalten eine zusätzliche
internal ribosomal entry side des Enzephalomyokarditis Virus (EMCV-IRES). Diese
zusätzlich eingebrachte IRES ermöglicht die Translation der nachfolgenden Sequenzen der
HCV Nicht-Strukturproteine (siehe Abbildung 49). Möglicherweise erfolgt die HCV-IRES-
induzierte Translation der HCV RNA in geringerem Maße als durch die EMCV-IRES. Eine
potentielle sehr geringe Replikation wäre in diesem Falle nicht detektiert worden.
Möglicherweise wurde für den Fall einer sehr schwachen Translation durch die HCV-IRES
auch zu wenig RNA transfiziert, um die sehr geringen Mengen HCV RNA einer potentiellen
Replikation zu detektieren.
Diskussion
106
Abbildung 49: schematische Darstellung von genomischer HCV RNA und subgenomischer Replikon RNA (Uprichard et al., 2006). Im Gegensatz zum full length Replikon enthält das subgenomische Replikon lediglich die Core-Sequenz der HCV IRES, nicht jedoch die Sequenzen für die Strukturproteine.
In möglicherweise folgenden Versuchen sollte die Transfektion mit größeren Mengen viraler
RNA durchgeführt werden. Geringe Mengen transfizierter RNA führen eventuell dazu, dass
die sehr kleinen Mengen replizierter HCV RNA nicht detektiert werden. Potentiell aktivierte
RNase L kann durch die Überexpression des RLI gehemmt werden. Aufgrund der Ergebnisse
der vorliegenden Arbeit ist ein Einfluss des 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-Systems mit dem
Effektorenzym RNase L auf die experimentelle HCV Infektion sehr unwahrscheinlich.
Ausserdem ist anzuraten, die Transfektions- und Infektionsversuche in weiteren Zelllinien
durchzuführen. Möglicherweise könnte die stabile Überexpression des RNase L Inhibitors in
anderen Zelllinien erfolgversprechender verlaufen. Da ein Einfluss der RNase L und ihrer
Ausschaltung aufgrund gesteigerter RLI-Expression auf die experimentelle HCV Infektion
sehr unwahrscheinlich ist, sollte ein Schwerpunkt folgender Arbeiten möglicherweise auf die
Betrachtung der Proteinkinase R gerichtet werden. Unterschiedliche Erkenntnisse aus in vivo
(Shimada et al., 1998; Yu et al., 2000) und in vitro Studien (Francois et al., 2000; Taylor et
al., 1999) geben möglicherweise einen Anlass, die Proteinkinase R unter den experimentellen
Bedingungen der HCV Infektion detaillierter zu analysieren.
Zusammenfassung
107
5. Zusammenfassung
Das Hepatitis C Virus ist weltweit verbreitet, wobei ca 3 % der Bevölkerung chronisch mit
dem Virus infiziert sind. Nach Schätzungen des CDC entwickeln 20 – 50 % der chronisch
infizierten Hepatitis C Patienten eine Leberzirrhose. Aus der Leberzirrhose entwickeln sich
wiederum in 25 % der Fälle ein Leberzellkarzinom oder ein Leberversagen. Patienten einer
akuten Hepatitis C haben gute Heilungschancen ohne zusätzliche Behandlung, während
Patienten mit einer chronischen Hepatitis heute mit einer Kombinationstherapie aus
pegyliertem Interferon und Ribavirin behandelt werden. Diese Behandlung erreicht
langanhaltende Therapieerfolgsraten von bis zu 60 %. Standardisierte Therapiemethoden oder
Erfolgsgarantien der Therapie für Patienten mit Hepatitis C existieren nicht.
Das Hauptproblem der Erforschung des Hepatitis C Virus liegt bis heute in einem fehlenden
Zellkulturmodell. Bisher ist es nicht gelungen, natürliche Isolate aller Hepatitis C Subtypen in
Zellkultur anzuziehen. Effektive Replikationen des Hepatitis C Virus gelangen bisher nur mit
HCV Replikonsystemen oder dem hochinfektiösen Virustyp JFH-1. Alle existierenden HCV
Replikons enthalten jedoch adaptive Mutationen in fast allen Nicht-Strukturproteinen. Und
auch JFH-1 weist zu allen bekannten HCV Subtyp 2a Sequenzen deutliche Unterschiede auf.
Aus diesen Gründen sollte das Ziel der vorliegenden Arbeit sein, eine initiale Replikation des
Hepatitis C Virus in Zellkultur zu ermöglichen. Hauptaspekt war dabei, die virale RNA nicht
zu verändern. Eine Manipulation sollte auf Seiten der zellulären viralen Abwehr durch
Überexpression des RLI erfolgen. Dadurch sollte die RNase L als Effektorenzym des
2’-5’Oligoadenylatsynthetase-Systems ausgeschaltet werden.
Zur Analyse der HCV RNA wurde auf der Basis existierender Primer und Sonden ein
spezifisches, sensitives und quantitatives HCV RotorGene Nachweissystem entwickelt. Zur
Analyse der zellulären Genexpression wurden spezifische und quantitative real time PCRs
zum Nachweis der mRNA-Mengen von RLI, RNase L und GAPDH sowie der 18S rRNA
entwickelt.
Die Infektionsversuche wurden sowohl in Huh7- als auch in FRhK-4-Zellen durchgeführt.
Humane Leberzellen (Huh7) sind die natürlichen Wirtszellen des Hepatitis C Virus und die
Zellen, in denen HCV Replikons und JFH-1 bereits effizient replizieren. Für Klone von RLI-
transfizierten FRhK-4-Zellen konnte in einer Diplomarbeit der Universität Bremen ein
gesteigertes HAV Wachstum beobachtet werden. Es sollte analysiert werden, ob diese
Eigenschaft auch auf die Replikation von HCV einen positiven Einfluss ausübt.
Zusammenfassung
108
Der RNase L Inhibitor wurde aus humaner- und Affen-gesamt-Zell-RNA isoliert und
sequenziert. Die Auswertungen der RLI-Sequenzen ergaben Unterschiede in den Nuklein-
und Aminosäuresequenzen zur RLI-Referenzsequenz der NCBI Datenbank. Die Ergebnisse
der vorliegenden Arbeit wurden jedoch durch Reproduktion und eine existierende Publikation
von 1999 bestätigt. Die RNase L Inhibitoren von Mensch und Affe sind in ihren
Aminosäuresequenzen vollkommen identisch.
Die stabile Überexpression des RLI ist weder in Huh7- noch in FRhK-4-Zellen gelungen. Ob
das RLI-Gen aus den Zellen elimiert wird oder das Vorhandensein größerer Mengen an RLI-
Protein letal auf die Zellen wirkt ist unklar. Transiente Überexpressionen des RLI waren um
Faktoren von bis zu 200 möglich. Nach einer Woche Inkubationszeit konnte noch eine
erhöhte RLI-mRNA-Menge um Faktoren von mindestens 6 detektiert werden. Durch
Mehrfachtransfektion konnte die Dauer der RLI-Überexpression beliebig verlängert werden.
Es wurden sowohl HCV Infektionsversuche, als auch Transfektionsversuche mit in vitro
transkribierter HCV RNA durchgeführt. Durch Transfektion der HCV RNA wurde der
kritische Schritt des Viruseintritts in die Zelle umgangen. Weder die HCV Infektion noch die
Transfektion von in vitro transkribierter full length RNA hatten einen Einfluss auf die
Expression des zellulären RLI. Die Überexpression des RLI hatte wiederum keinen positiven
Effekt auf die Replikation der HCV RNA. Weder in Huh7- noch in FRhK-4-Zellen ist die
initiale Replikation des Hepatitis C Virus mit Hilfe der Überexpression des RLI gelungen. Da
eine Replikation von Hepatitis C Virus RNA weder in RLI-transfizierten noch in nicht
transfizierten Zellen erfolgt ist, kann über einen potentiellen Einfluss der HCV RNA auf die
Expression der RNase L keine Aussage getroffen werden. Es ist jedoch sehr wahrscheinlich,
dass das 2’-5’Oligoadenylatsynthetases-System mit dem Effektorenzym RNase L keinen
Einfluss auf die Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur hat.
Anhang
109
6. Literaturverzeichnis
ABI (2001). ABI Prism 3100 Genetic Analyzer. Foster City: Applied Biosystems.
Aerts, J. L., Gonzales, M. I. & Topalian, S. L. (2004). Selection of appropriate control genes to assess expression of tumor antigens using real-time RT-PCR. Biotechniques 36, 84-86, 88, 90-91.
Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. & Watson, J. D. (1995).Molekularbiologie der Zelle, 3rd edn, pp. 355-357. Edited by B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH.
Amersham-Pharmacia (1994). T7 Sequencing™ Kit. Cleveland, Ohio: Amersham.
Aubry, F., Mattei, M. G., Barque, J. P. & Galibert, F. (1996). Chromosomal localization and expression pattern of the RNase L inhibitor gene. FEBS Lett 381, 135-139.
Bartenschlager, R. & Lohmann, V. (2000). Replication of hepatitis C virus. J Gen Virol 81, 1631-1648.
Bartenschlager, R., Kaul, A. & Sparacio, S. (2003). Replication of the hepatitis C virus in cell culture. Antiviral Res 60, 91-102.
Bartosch, B., Vitelli, A., Granier, C., Goujon, C., Dubuisson, J., Pascale, S., Scarselli, E., Cortese, R., Nicosia, A. & other authors (2003). Cell entry of hepatitis C virus requires a set of co-receptors that include the CD81 tetraspanin and the SR-B1 scavenger receptor. J Biol Chem 278, 41624-41630.
Benoit De Coignac, A., Bisbal, C., Lebleu, B. & Salehzada, T. (1998). cDNA cloning and expression analysis of the murine ribonuclease L inhibitor. Gene 209, 149-156.
Biron, C. A. (1998). Role of early cytokines, including alpha and beta interferons (IFN-alpha/beta), in innate and adaptive immune responses to viral infections. Semin Immunol 10, 383-390.
Bisbal, C., Martinand, C., Silhol, M., Lebleu, B. & Salehzada, T. (1995). Cloning and characterization of a RNAse L inhibitor. A new component of the interferon-regulated 2-5A pathway. J Biol Chem 270, 13308-13317.
Bisbal, C., Salehzada, T., Silhol, M., Martinand, C., Le Roy, F. & Lebleu, B. (2001). The 2-5A/RNase L pathway and inhibition by RNase L inhibitor (RLI). Methods Mol Biol 160, 183-198.
Brack, K. (1999). Mechanismus und genetische Basis der Cytopathogenität einer Hepatitis A-Virusvariante in Zellkultur, Dissertationsarbeit der Universität Bremen.
Bukh, J., Purcell, R. H. & Miller, R. H. (1993). At least 12 genotypes of hepatitis C virus predicted by sequence analysis of the putative E1 gene of isolates collected worldwide. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 8234-8238.
Anhang
110
Bustin, E. S. E. (2004). A-Z of Quantitative PCR. Edited by I. F. Tsigelny. La Jolla, California: International University Line.
Carter, W. A., Strayer, D. R., Brodsky, I., Lewin, M., Pellegrino, M. G., Einck, L., Henriques, H. F., Simon, G. L., Parenti, D. M. & other authors (1987). Clinical, immunological, and virological effects of ampligen, a mismatched double-stranded RNA, in patients with AIDS or AIDS-related complex. Lancet 1, 1286-1292.
Cayley, P. J., Knight, M. & Kerr, I. M. (1982). Virus-mediated inhibition of the ppp(A2'p)nA system and its prevention by interferon. Biochem Biophys Res Commun 104, 376-382.
Chan, S. W., McOmish, F., Holmes, E. C., Dow, B., Peutherer, J. F., Follett, E., Yap, P. L. & Simmonds, P. (1992). Analysis of a new hepatitis C virus type and its phylogenetic relationship to existing variants. J Gen Virol 73, 1131-1141.
Cheng, G., Zhong, J. & Chisari, F. V. (2006). Inhibition of dsRNA-induced signaling in hepatitis C virus-infected cells by NS3 protease-dependent and -independent mechanisms. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 8499-8504.
Chevaliez, S. & Pawlotsky, J. M. (2006). Hepatitis C Virus Serologic and Virologic Tests and Clinical Diagnosis of HCV-Related Liver Disease. Int J Med Sci 3, 35-40.
Choo, Q. L., Kuo, G., Weiner, A. J., Overby, L. R., Bradley, D. W. & Houghton, M. (1989). Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science 244, 359-362.
Cole, J. L., Carroll, S. S., Blue, E. S., Viscount, T. & Kuo, L. C. (1997). Activation of RNase L by 2',5'-oligoadenylates. Biophysical characterization. J Biol Chem 272, 19187-19192.
Colin, C., Lanoir, D., Touzet, S., Meyaud-Kraemer, L., Bailly, F. & Trepo, C. (2001).Sensitivity and specificity of third-generation hepatitis C virus antibody detection assays: an analysis of the literature. J Viral Hepat 8, 87-95.
Cuthbert, J. A. (1994). Hepatitis C: progress and problems. Clin Microbiol Rev 7, 505-532.
Dimitrova, M., Imbert, I., Kieny, M. P. & Schuster, C. (2003). Protein-protein interactions between hepatitis C virus nonstructural proteins. J Virol 77, 5401-5414.
Dougherty, J. P., Samanta, H., Floyd-Smith, G., Broeze, R., Jayaram, B. M. & Lengyel, P. (1981). Enzymology of interferon action. The (2'-5')(A)n synthetase-RNase L pathway. Tex Rep Biol Med 41, 443-451.
Dusheiko, G., Schmilovitz-Weiss, H., Brown, D., McOmish, F., Yap, P. L., Sherlock, S., McIntyre, N. & Simmonds, P. (1994). Hepatitis C virus genotypes: an investigation of type-specific differences in geographic origin and disease. Hepatology 19, 13-18.
Elbeik, T., Surtihadi, J., Destree, M., Gorlin, J., Holodniy, M., Jortani, S. A., Kuramoto, K., Ng, V., Valdes, R. & other authors (2004). Multicenter evaluation of the performance characteristics of the bayer VERSANT HCV RNA 3.0 assay (bDNA). J Clin Microbiol 42, 563-569.
Anhang
111
Engvall, E. & Perlman, P. (1971). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8, 871-874.
Engvall, E. & Perlmann, P. (1972). Enzyme-linked immunosorbent assay, Elisa. 3. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labeled anti-immunoglobulin in antigen-coated tubes. J Immunol 109, 129-135.
Enomoto, N., Takada, A., Nakao, T. & Date, T. (1990). There are two major types of hepatitis C virus in Japan. Biochem Biophys Res Commun 170, 1021-1025.
Eurogentec (2004). Real-Time PCR Supplier. Seraing: Eurogentec.
Foy, E., Li, K., Sumpter, R. j., Loo, Y. M., Johnson, C. L., Wang, C., Fish, P. M., Yoneyama, M., Fujita, T. & other authors (2005). Control of antiviral defenses through hepatitis C virus disruption of retinoic acid-inducible gene-I signaling. PNAS 102, 2986-2991.
Francois, C., Duverlie, G., Rebouillat, D., Khorsi, H., Castelain, S., Blum, H. E., Gatignol, A., Wychowski, C., Moradpour, D. & other authors (2000). Expression of hepatitis C virus proteins interferes with the antiviral action of interferon independently of PKR-mediated control of protein synthesis. J Virol 74, 5587-5596.
Gassen, H. G., Sachse, G. E. & Schulte, A. (1994). Grundlagen und Anwendungen der Polymerase-Kettenreaktion. Edited by G. E. Sachse & A. Schulte. Stuttgart: Gustav Fischer Verlag.
Gerlach, J. T., Diepolder, H. M., Zachoval, R., Gruener, N. H., Jung, M. C., Ulsenheimer, A., Schraut, W. W., Schirren, C. A., Waechtler, M. & other authors (2003). Acute hepatitis C: high rate of both spontaneous and treatment-induced viral clearance. Gastroenterology 125, 80-88.
Gotter, J. (1999). Einfluss eines RNAse L-Inhibitors auf die Apoptoseinduktion durch die cytopathogene Hepatits A-Variante HAVcyt/HB1.1, Diplomarbeit der Universität Bremen.
Han, J. Q. & Barton, D. J. (2002). Activation and evasion of the antiviral 2'-5' oligoadenylate synthetase/ribonuclease L pathway by hepatitis C virus mRNA. RNA 8, 512-525.
Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol166, 557-580.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S. & Griffith, R. (1992). Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y) 10, 413-417.
Hoofnagle, J. H. (1998). Therapy of viral hepatitis. Digestion 59, 563-578.
Kaito, M., Watanabe, S., Tsukiyama-Kohara, K., Yamaguchi, K., Kobayashi, Y., Konishi, M., Yokoi, M., Ishida, S., Suzuki, S. & other authors (1994). Hepatitis C virus particle detected by immunoelectron microscopic study. J Gen Virol 75, 1755-1760.
Kaledin, A. S., Sliusarenko, A. G. & Gorodetskii, S. I. (1980). Isolation and properties of DNA polymerase from extreme thermophylic bacteria Thermus aquaticus YT-1. Biokhimiia45, 644-651.
Anhang
112
Kapadia, S. B., Brideau-Andersen, A. & Chisari, F. V. (2003). Interference of hepatitis C virus RNA replication by short interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 2014-2018.
Karcher, A., Buttner, K., Martens, B., Jansen, R. P. & Hopfner, K. P. (2005). X-ray structure of RLI, an essential twin cassette ABC ATPase involved in ribosome biogenesis and HIV capsid assembly. Structure 13, 649-659.
Kato, T., Furusaka, A., Miyamoto, M., Date, T., Yasui, K., Hiramoto, J., Nagayama, K., Tanaka, T. & Wakita, T. (2001). Sequence analysis of hepatitis C virus isolated from a fulminant hepatitis patient. J Med Virol 64, 334-339.
Kato, T. & Wakita, T. (2005). Production of infectious hepatitis C virus in cell culture. Uirusu 55, 287-295.
Klein, S. A., Karsten, S., Ruster, B., Klebba, C., Pape, M., Ottmann, O. G., Hoelzer, D. & Roth, W. K. (2003). Comparison of TaqMan real-time PCR and p24 Elisa for quantification of in vitro HIV-1 replication. J Virol Methods 107, 169-175.
Kleppe, K., Ohtsuka, E., Kleppe, R., Molineux, I. & Khorana, H. G. (1971). Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. J Mol Biol 56, 341-361.
Kolykhalov, A. A., Agapov, E. V., Blight, K. J., Mihalik, K., Feinstone, S. M. & Rice, C. M. (1997). Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science 277, 570-574.
Kubista, M., Andrade, J. M., Bengtsson, M., Forootan, A., Jonak, J., Lind, K., Sindelka, R., Sjoback, R., Sjogreen, B. & other authors (2006). The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med 27, 95-125.
Kuo, G., Choo, Q. L., Alter, H. J., Gitnick, G. L., Redeker, A. G., Purcell, R. H., Miyamura, T., Dienstag, J. L., Alter, M. J. & other authors (1989). An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A, non-B hepatitis. Science244, 362-364.
Lanford, R. E., Guerra, B., Lee, H., Averett, D. R., Pfeiffer, B., Chavez, D., Notvall, L. & Bigger, C. (2003). Antiviral effect and virus-host interactions in response to alpha interferon, gamma interferon, poly(i)-poly(c), tumor necrosis factor alpha, and ribavirin in hepatitis C virus subgenomic replicons. J Virol 77, 1092-1104.
Lazizi, Y., Elfassi, E. & Pillot, J. (1992). Detection of hepatitis C virus sequences in sera with controversial serology by nested polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 30, 931-934.
Lechner, F., Wong, D. K., Dunbar, P. R., Chapman, R., Chung, R. T., Dohrenwend, P., Robbins, G., Phillips, R., Klenerman, P. & other authors (2000). Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J Exp Med 191, 1499-1512.
Leung, N. W. (2002). Management of viral hepatitis C. J Gastroenterol Hepatol 17 Suppl, 146-154.
Anhang
113
Lindenbach, B. D., Evans, M. J., Syder, A. J., Wolk, B., Tellinghuisen, T. L., Liu, C. C., Maruyama, T., Hynes, R. O., Burton, D. R. & other authors (2005). Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science 309, 623-626.
Lindenmann, J. & Isaacs, A. (1957). Research on viral interference. Schweiz Z Pathol Bakteriol 20, 640-646.
Lohmann, V., Korner, F., Koch, J., Herian, U., Theilmann, L. & Bartenschlager, R. (1999). Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science285, 110-113.
Lohmann, V., Korner, F., Dobierzewska, A. & Bartenschlager, R. (2001). Mutations in hepatitis C virus RNAs conferring cell culture adaptation. J Virol 75, 1437-1449.
Lohmann, V., Hoffmann, S., Herian, U., Penin, F. & Bartenschlager, R. (2003). Viral and cellular determinants of hepatitis C virus RNA replication in cell culture. J Virol 77, 3007-3019.
Lyra, A. C., Fan, X. & Di Bisceglie, A. M. (2004). Molecular biology and clinical implication of hepatitis C virus. Braz J Med Biol Res 37, 691-695.
Maertens, G. & Stuyver, L. (1997). Genotypes and Genetic Vatiation of Hepatitis C Virus. In The Molecular Medicine of Viral Hepatitis, pp. 183-233. Edited by H. T. J. & A. J. Zuckerman. London: John Wiley & Sons Inc.
Major, M. E., Rehermann, B. & Feinstone, S. M. (2001). Hepatitis C Viruses. In Fields Virology, 4th edn, pp. 1127-1161. Edited by D. M. Knipe & P. M. Howley. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins Desktop Division.
Martinand, C., Salehzada, T., Silhol, M., Lebleu, B. & Bisbal, C. (1998). RNase L inhibitor (RLI) antisense constructions block partially the down regulation of the 2-5A/RNase L pathway in encephalomyocarditis-virus-(EMCV)-infected cells. Eur J Biochem 254, 248-55.
Martinand, C., Montavon, C., Salehzada, T., Silhol, M., Lebleu, B. & Bisbal, C. (1999).RNase L inhibitor is induced during human immunodeficiency virus type 1 infection and down regulates the 2-5A/RNase L pathway in human T cells. J Virol 73, 290-296.
Modrow, S., Falke, D. & Truyen, U. (2003). Molekulare Virologie, 2nd edn, pp. 142-163. Edited by S. Modrow, D. Falke & U. Truyen. Heidelberg, Berlin: Spektrum Akademischer Verlag.
Mullis, K. (1998). Dancing naked in the mind field. Edited by K. Mullis. New York: Vintage Books.
Okamoto, H., Sugiyama, Y., Okada, S., Kurai, K., Akahane, Y., Sugai, Y., Tanaka, T., Sato, K., Tsuda, F. & other authors (1992). Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and tracing infectious sources. J Gen Virol 73, 673-679.
Pfaffl, M. W. (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29, 2002-2007.
Anhang
114
Pileri, P., Uematsu, Y., Campagnoli, S., Galli, G., Falugi, F., Petracca, R., Weiner, A. J., Houghton, M., Rosa, D. & other authors (1998). Binding of hepatitis C virus to CD81. Science 282, 938-941.
Player, M. R. & Torrence, P. F. (1998). The 2-5A system: modulation of viral and cellular processes through acceleration of RNA degradation. Pharmacol Ther 78, 55-113.
Polywka, S., Feucht, H.-H., Schröter, M. & Laufs, R. (2000). Diagnostik der Hepatitits-C-Virusinfektion: Die Bedeutung von Bestätigungstesten, Originalarbeit Susanne Polywka am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie, Universitätsklinik Eppendorf, Hamburg.
Roggendorf, M., Meisel, H. & Viazov, S. (2000). Natural history of hepatitis C. Mem Inst Oswaldo Cruz 95, 189-192.
Rosa, D., Campagnoli, S., Moretto, C., Guenzi, E., Cousens, L., Chin, M., Dong, C., Weiner, A. J., Lau, J. Y. & other authors (1996). A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 1759-1763.
Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A. & Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350-1354.
Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H. & Erlich, H. A. (1989). Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 6230-6234.
Samuel, C. E. (2001). Antiviral actions of interferons. Clin Microbiol Rev 14, 778-809.
Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A 74, 5463-5467.
Santolini, E., Pacini, L., Fipaldini, C., Migliaccio, G. & Monica, N. (1995). The NS2 protein of hepatitis C virus is a transmembrane polypeptide. J Virol 69, 7461-7471.
Schield, D. T. A. (1998). Einführung in die Real-Time TaqMan PCR Technologie. In TaqMan SDS Manual vs. 2.1. Weiterstadt: Applied Biosystems.
Schreier, E. & Höhne, M. (2001). Hepatitis C - Epidemiologie und Prävention, pp. 554-561. Bundesgesundheitsblatt Robert Koch Institut, Berlin: Springer Verlag.
Schreier, E., Radun, D., Neuhauser, H. & Stark, K. (2003). Hepatitis C - Gesundheitsbereicht des Bundes. Gesundheitsberichterstattung des Bundes Heft 15, Berlin: Robert Koch Institut.
Schroter, M., Feucht, H. H., Schafer, P., Zollner, B. & Laufs, R. (1999). Serological determination of hepatitis C virus subtypes 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, and 4a by a recombinant immunoblot assay. J Clin Microbiol 37, 2576-2580.
Anhang
115
Schroter, M., Zollner, B., Schafer, P., Laufs, R. & Feucht, H. H. (2001). Quantitative detection of hepatitis C virus RNA by light cycler PCR and comparison with two different PCR assays. J Clin Microbiol 39, 765-768.
Shimada, A., Shiota, G., Miyata, H., Kamahora, T., Kawasaki, H., Shiraki, K., Hino, S. & Terada, T. (1998). Aberrant expression of double-stranded RNA-dependent protein kinase in hepatocytes of chronic hepatitis and differentiated hepatocellular carcinoma. Cancer Res58, 4434-4438.
Simmonds, P., Holmes, E. C., Cha, T. A., Chan, S. W., McOmish, F., Irvine, B., Beall, E., Yap, P. L., Kolberg, J. & other authors (1993). Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region. J Gen Virol 74, 2391-2399.
Simmonds, P., Mellor, J., Sakuldamrongpanich, T., Nuchaprayoon, C., Tanprasert, S., Holmes, E. C. & Smith, D. B. (1996). Evolutionary analysis of variants of hepatitis C virus found in South-East Asia: comparison with classifications based upon sequence similarity. J Gen Virol 77, 3013-3024.
Simmonds, P., Bukh, J., Combet, C., Deleage, G., Enomoto, N., Feinstone, S., Halfon, P., Inchauspe, G., Kuiken, C. & other authors (2005). Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes. Hepatology 42, 962-973.
Slattery, E., Ghosh, N., Samanta, H. & Lengyel, P. (1979). Interferon, double-stranded RNA, and RNA degradation: activation of an endonuclease by (2'-5')An. Proc Natl Acad Sci U S A 76, 4778-4782.
Taylor, D. R., Shi, S. T., Romano, P. R., Barber, G. N. & Lai, M. M. (1999). Inhibition of the interferon-inducible protein kinase PKR by HCV E2 protein. Science 285, 107-110.
Thimme, R., Bukh, J., Spangenberg, H. C., Wieland, S., Pemberton, J., Steiger, C., Govindarajan, S., Purcell, R. H. & Chisari, F. V. (2002). Viral and immunological determinants of hepatitis C virus clearance, persistence, and disease. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 15661-15668.
Thomson, M. & Liang, T. J. (2000). Molecular biology of hepatitis c virus. In Biomedical Research Reports, pp. 1-24. Edited by T. Liang & J. Hoofnagle. London: Academic Press.
Tomei, L., Failla, C., Santolini, E., De Francesco, R. & La Monica, N. (1993). NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein. J Virol 67, 4017-4026.
Uprichard, S. L., Chung, J., Chisari, F. V. & Wakita, T. (2006). Replication of a hepatitis C virus replicon clone in mouse cells. J Virol 3, 89.
Urdea, M. S., Wuestehube, L. J., Laurenson, P. M. & Wilber, J. C. (1997). Hepatitis C - diagnosis and monitoring. Clin Chem 43, 1507-1511.
Wasley, A. & Alter, M. J. (2000). Epidemiology of hepatitis C: geographic differences and temporal trends. Semin Liver Dis 20, 1-16.
Anhang
116
Wiese, M., Berr, F., Lafrenz, M., Porst, H. & Oesen, U. (2000). Low frequency of cirrhosis in a hepatitis C (genotype 1b) single-source outbreak in germany: a 20-year multicenter study. Hepatology 32, 91-96.
Williams, B. R., Golgher, R. R., Brown, R. E., Gilbert, C. S. & Kerr, I. M. (1979). Natural occurrence of 2-5A in interferon-treated EMC virus-infected L cells. Nature 282, 582-586.
Yi, M., Schultz, D. E. & Lemon, S. M. (2000). Functional significance of the interaction of hepatitis A virus RNA with glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH): opposing effects of GAPDH and polypyrimidine tract binding protein on internal ribosome entry site function. J Virol 74, 6459-6468.
Yu, S. H., Nagayama, K., Enomoto, N., Izumi, N., Marumo, F. & Sato, C. (2000).Intrahepatic mRNA expression of interferon-inducible antiviral genes in liver diseases: dsRNA-dependent protein kinase overexpression and RNase L inhibitor suppression in chronic hepatitis C. Hepatology 32, 1089-1095.
Zeuzem, S., Sarrazin, C. & Herrmann, E. (2001). Wirkungsweise von Interferonen auf Nukleosidanaloga und ihr Einfluss auf Viruskinetiken. In Hepatitis C, pp. 65-79. Edited by D. H. u. C. Niederau. Berlin: Blackwell Wissenschafts-Verlag.
Zhong, J., Gastaminza, P., Cheng, G., Kapadia, S., Kato, T., Burton, D. R., Wieland, S. F., Uprichard, S. L., Wakita, T. & other authors (2005). Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 9294-9299.
Zhou, A., Hassel, B. A. & Silverman, R. H. (1993). Expression cloning of 2-5A-dependent RNase: a uniquely regulated mediator of interferon action. Cell 72, 753-765.
Zhu, Q., Guo, J. T. & Seeger, C. (2003). Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells. J Virol 77, 9204-9210.
Anhang
117
7. Anhang
7.1. Plasmidkarten
pcDNA3/RLI 3’
Dieses Plasmid ist von pcDNA3 (Invitrogen) abgeleitet und enthält die Sequenz der humanen
RLI cDNA (Bisbal et al., 1995).
pcDNA 3.1/V5-His Topo TA (Invitrogen)
Dieses Plasmid der Firma Invitrogen dient als Klonierungvektor von PCR-Fragmenten in
E.coli.
Anhang
118
pcDNA3.1/V5-His_RLI
Dieses Plasmid ist abgeleitet von pcDNA3.1/V5His TOPO TA und enthält die Sequenz des
RNase L Inhibitors. pcDNA3.1/V5-His-m_RLI enthält die Sequenz des FRhk-4-RLI
(monkey-RLI) und pcDNA3.1/V5-His-h_RLI enthält die Sequenz des humanen RLI.
pl.18
Dieses Plasmid dient als Klonierungvektor von PCR-Fragmenten in E.coli.Es zeichnet sich
durch seine sehr hohe Expressionrate aus.
Anhang
119
pl.18_RLI
Dieses Plasmid ist abgeleitet von pl.18 und enthält die RLI Sequenz mit angehängtem V5-
His. Das Insert wurde mit Hilfe von KpnI und MssI/PmeI aus pcDNA3.1/V5His_RLI
herausgeschnitten und in pl.18 einkloniert. pl.18-m_RLI enthält die Sequenz des FRhk-4-RLI
(monkey-RLI) und pl.18-h_RLI enthält die Sequenz des humanen RLI.
p90/HCV FL-long pU
p90/HCV FL-long pU ist ein Klonierungsvektor, abgeleitet von pBR322, der die komplette
Konsensus cDNA des HCV-Isolats H77 (Kolykhalov et al., 1997) vom Genotyp 1a unter der
Kontrolle eines T7 Promoters enthält.
Anhang
120
ZC-5.1
Dieses Plasmid ist abgeleitet von ZC-5.1 und enthält die Sequenz des humanen RNase-L-
Gens. Die angegebenen Basen im Hind-III-Fragment der Rnase L entspricht den Positionen
im RNase L Gen. Die Positionen im Vektor sind durch einen hochgestellten *
gekennzeichnet.
Anhang
121
7.2. Sequenzen und Alignments
H.sapiens mRNA for 2'-5' oligoadenylate binding protein (RLI); NCBI Accesion nr. X74987
humanes RLI mit angehängtem His-Tag aus Plasmid 8_14_27
FRhK-4 RLI mit angehängtem His-Tag aus Plasmid 6_5_2
Anhang
122
nachsequenziertes RLI aus dem Plasmid von C. Bisbal (Bisbal et al., 1995)
Anh
ang
123
Alig
nmen
ts :
Pla
smid
e 8_
14_2
7+H
is (
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anes
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LI
Plas
mid
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d 6_
5_2+
His
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RL
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asm
id)
vers
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LI-
Sequ
enz
NC
BI
Acc
.nr.
X74
987
(Bis
bal e
t al.,
199
5)
10 20 30 40 50 60
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1 A T G G C A G A C A A G T T A A C G A G A A T T G C T A T T G T C A A C C A T G A C A A A T G T A A A C C T A A G A A A X74987
1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
70 80 90 100 110 120
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
61 T G T C G A C A G G A A T G C A A A A A G A G T T G T C C T G T A G T T C G A A T G G G A A A A T T A T G C A T A G A G X74987
61 . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
61 . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
130 140 150 160 170 180
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
121 G T T A C A C C C C A G A G C A A A A T A G C A T G G A T T T C C G A A A C T C T T T G T A T T G G T T G T G G T A T C X74987
121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
190 200 210 220 230 240
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
181 T G T A T T A A G A A A T G C C C C T T T G G C G C C T T A T C A A T T G T C A A T C T A C C A A G C A A C T T G G A A X74987
181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . 8-14-27+His
181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . 6-5-2+His
250 260 270 280 290 300
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
241 A A A G A A A C C A C A C A T C G A T A T T G T G C C A A T G C C T T C A A A C T T C A C A G G T T G C C T A T C C C T X74987
241 . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
241 . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
310 320 330 340 350 360
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
301 C G T C C A G G T G A A G T T T T G G G A T T A G T T G G A A C T A A T G G T A T T G G A A A G T C A G C T G C T T T A X74987
301 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . 8-14-27+His
301 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
370 380 390 400 410 420
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
361 A A A A T T T T A G C A G G A A A A C A A A A G C C A A A C C T T G G A A A G T A C G A T G A T C C T C C T G A C T G G X74987
361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
430 440 450 460 470 480
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
421 C A G G A G A T T T T G A C T T A T T T C C G T G G A T C T G A A T T A C A A A A T T A C T T T A C A A A G A T T C T A X74987
421 . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . G . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . 8-14-27+His
421 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
Anh
ang
124
490 500 510 520 530 540
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
481 G A A G A T G A C C T A A A A G C C A T C A T C A A A C C T C A A T A T G T A G C C A G A T T C C T A A G G C T G G C A X74987
481 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C A G A . T . C T . A . G C T . . . 8-14-27+His
481 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C A G A . T . C T . A . A C T . . . 6-5-2+His
550 560 570 580 590 600
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
541 A A G G G G A C A G T G G G A T C T A T T T T G G A C C G A A A A G A T G A A A C A A A G A C A C A G G C A A T T G T A X74987
541 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
541 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
610 620 630 640 650 660
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
601 T G T C A G C A G C T T G A T T T A A C C C A C C T A A A A G A A C G A A A T G T T G A A G A T C T T T C A G G A G G A X74987
601 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
601 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
670 680 690 700 710 720
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
661 G A G T T G C A G A G A T T T G C T T G T G C T G T C G T T T G C A T A C A G A A A G C T G A T A T T T T C A T G T T T X74987
661 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . 8-14-27+His
661 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . 6-5-2+His
730 740 750 760 770 780
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
721 G A T G A G C C T T C T A G T T A C C T A G A T G T C A A G C A G C G T T T A A A G G C T G C T A T T A C T A T A C G A X74987
721 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
721 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
790 800 810 820 830 840
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
781 T C T C T A A T A A A T C C A G A T A G A T A T A T C A T T G T G G T G G A A C A T G A T C T A A G T G T A T T A G A C X74987
781 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 8-14-27+His
781 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 6-5-2+His
850 860 870 880 890 900
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
841 T A T C T C T C C G A C T T C A T C T G C T G T T T A T A T G G T G T A C C A A G C G C C T A T G G A G T T G T C A C T X74987
841 . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
841 . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
910 920 930 940 950 960
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
901 A T G C C T T T T A G T G T A A G A G A A G G C A T A A A C A T T T T T T T G G A T G G C T A T G T T C C A A C A G A A X74987
901 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
901 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
970 980 990 1000 1010 1020
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
961 A A C T T G A G A T T C A G A G A T G C A T C A C T T G T T T T T A A A G T G G C T G A G A C A G C A A A T G A A G A A X74987
961 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
961 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
Anh
ang
125
1030 1040 1050 1060 1070 1080
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1021 G A A G T T A A A A A G A T G T G T A T G T A T A A A T A T C C A G G A A T G A A G A A A A A A A T G G G A G A A T T T X74987
1021 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 8-14-27+His
1021 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 6-5-2+His
1090 1100 1110 1120 1130 1140
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1081 G A G C T A G C A A T T G T A G C T G G A G A G T T T A C A G A T T C T G A A A T T A T G G T G A T G C T G G G G G A A X74987
1081 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1081 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1150 1160 1170 1180 1190 1200
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1141 A A T G G A A C G G G T A A A A C G A C A T T T A T C A G A A T G C T T G C T G G A A G A C T T A A A C C T G A T G A A X74987
1141 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1141 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1210 1220 1230 1240 1250 1260
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1201 G G A G G A G A A G T A C C A G T T C T A A A T G T C A G T T A T A A G C C A C A G A A A A T T A G T C C C A A A T C A X74987
1201 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1201 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1270 1280 1290 1300 1310 1320
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1261 A C T G G A A G T G T T C G C C A G T T A C T A C A T G A A A A G A T A A G A G A T G C T T A T A C T C A C C C A C A A X74987
1261 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . 8-14-27+His
1261 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1330 1340 1350 1360 1370 1380
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1321 T T T G T G A C C G A T G T A A T G A A G C C T C T G C A A A T T G A A A A C A T C A T T G A T C A A G A G G T G C A G X74987
1321 . . . . . . . . A . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1321 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1390 1400 1410 1420 1430 1440
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1381 A C A T T A T C T G G T G G T G A A C T A C A G C G A G T A C G T T T A C G C C T T T G C T T G G G C A A A C C T G C T X74987
1381 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C . . . . G C . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1381 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C . . . . G C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1450 1460 1470 1480 1490 1500
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1441 G A T G T C T A T T T A A T T G A T G A A C C A T C T G C A T A T T T G G A T T C T G A G C A A A G A C T G A T G G C A X74987
1441 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1441 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1510 1520 1530 1540 1550 1560
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1501 G C T C G A G T T G T C A A A C G T T T C A T A C T C C A T G C A A A A A A G A C A G C C T T T G T T G T G G A A C A T X74987
1501 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1501 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
Anh
ang
126
1570 1580 1590 1600 1610 1620
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1561 G A C T T C A T C A T G G C C A C C T A T C T A G C G G A T C G C G T C A T C G T T T T T G A T G G T G T T C C A T C T X74987
1561 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1561 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1630 1640 1650 1660 1670 1680
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1621 A A G A A C A C A G T T G C A A A C A G T C C T C A A A C C C T T T T G G C T G G C A T G A A T A A A T T T T T G T C T X74987
1621 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1621 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1690 1700 1710 1720 1730 1740
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1681 C A G C T T G A A A T T A C A T T C A G A A G A G A T C C A A A C A A C T A T A G G C C A C G A A T A A A C A A A C T T X74987
1681 . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1681 . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1750 1760 1770 1780 1790 1800
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1741 A A T T C A A T T A A G G A T G T A G A A C A A A A G A A G A G T G G A A A C T A C T T T T T C T T G G A T G A T T A G X74987
1741 . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . 8-14-27+His
1741 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . 6-5-2+His
1800 X74987
1801 A A G G G C A A T T C T G C A G A T A T C C A G C A C A G T G G C G G C C G C T C G A G T C T A G A G G G C C C G C G G 8-14-27+His
1801 A A G G G C A A T T C T G C A G A T A T C C A G C A C A G T G G C G G C C G C T C G A G T C T A G A G G G C C C G C G G 6-5-2+His
1800 X74987
1861 T T C G A A G G T A A G C C T A T C C C T A A C C C T C T C C T C G G T C T C G 8-14-27+His
1861 T T C G A A G G T A A G C C T A T C C C T A A C C C T C T C C T C G G T C T C G 6-5-2+His
Nac
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7498
7
10 20 30 40 50 60
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1 A T G G C A G A C A A G T T A A C G A G A A T T G C T A T T G T C A A C C A T G A C A A A T G T A A A C C T A A G A A A X74987
1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
70 80 90 100 110 120
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
61 T G T C G A C A G G A A T G C A A A A A G A G T T G T C C T G T A G T T C G A A T G G G A A A A T T A T G C A T A G A G X74987
61 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
130 140 150 160 170 180
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
121 G T T A C A C C C C A G A G C A A A A T A G C A T G G A T T T C C G A A A C T C T T T G T A T T G G T T G T G G T A T C X74987
121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
Anh
ang
127
190 200 210 220 230 240
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
181 T G T A T T A A G A A A T G C C C C T T T G G C G C C T T A T C A A T T G T C A A T C T A C C A A G C A A C T T G G A A X74987
181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
250 260 270 280 290 300
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
241 A A A G A A A C C A C A C A T C G A T A T T G T G C C A A T G C C T T C A A A C T T C A C A G G T T G C C T A T C C C T X74987
241 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
310 320 330 340 350 360
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
301 C G T C C A G G T G A A G T T T T G G G A T T A G T T G G A A C T A A T G G T A T T G G A A A G T C A G C T G C T T T A X74987
301 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
370 380 390 400 410 420
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
361 A A A A T T T T A G C A G G A A A A C A A A A G C C A A A C C T T G G A A A G T A C G A T G A T C C T C C T G A C T G G X74987
361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
430 440 450 460 470 480
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
421 C A G G A G A T T T T G A C T T A T T T C C G T G G A T C T G A A T T A C A A A A T T A C T T T A C A A A G A T T C T A X74987
421 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
490 500 510 520 530 540
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
481 G A A G A T G A C C T A A A A G C C A T C A T C A A A C C T C A A T A T G T A G C C A G A T T C C T A A G G C T G G C A X74987
481 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C A G A . T . C T . A . A C T . . . Bisbal-Plasmid
550 560 570 580 590 600
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
541 A A G G G G A C A G T G G G A T C T A T T T T G G A C C G A A A A G A T G A A A C A A A G A C A C A G G C A A T T G T A X74987
541 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
610 620 630 640 650 660
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
601 T G T C A G C A G C T T G A T T T A A C C C A C C T A A A A G A A C G A A A T G T T G A A G A T C T T T C A G G A G G A X74987
601 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
670 680 690 700 710 720
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
661 G A G T T G C A G A G A T T T G C T T G T G C T G T C G T T T G C A T A C A G A A A G C T G A T A T T T T C A T G T T T X74987
661 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
730 740 750 760 770 780
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
721 G A T G A G C C T T C T A G T T A C C T A G A T G T C A A G C A G C G T T T A A A G G C T G C T A T T A C T A T A C G A X74987
721 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
790 800 810 820 830 840
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
781 T C T C T A A T A A A T C C A G A T A G A T A T A T C A T T G T G G T G G A A C A T G A T C T A A G T G T A T T A G A C X74987
781 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
Anh
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128
850 860 870 880 890 900
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
841 T A T C T C T C C G A C T T C A T C T G C T G T T T A T A T G G T G T A C C A A G C G C C T A T G G A G T T G T C A C T X74987
841 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
910 920 930 940 950 960
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
901 A T G C C T T T T A G T G T A A G A G A A G G C A T A A A C A T T T T T T T G G A T G G C T A T G T T C C A A C A G A A X74987
901 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
970 980 990 1000 1010 1020
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
961 A A C T T G A G A T T C A G A G A T G C A T C A C T T G T T T T T A A A G T G G C T G A G A C A G C A A A T G A A G A A X74987
961 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
1030 1040 1050 1060 1070 1080
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1021 G A A G T T A A A A A G A T G T G T A T G T A T A A A T A T C C A G G A A T G A A G A A A A A A A T G G G A G A A T T T X74987
1021 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
1090 1100 1110 1120 1130 1140
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1081 G A G C T A G C A A T T G T A G C T G G A G A G T T T A C A G A T T C T G A A A T T A T G G T G A T G C T G G G G G A A X74987
1081 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
1150 1160 1170 1180 1190 1200
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1141 A A T G G A A C G G G T A A A A C G A C A T T T A T C A G A A T G C T T G C T G G A A G A C T T A A A C C T G A T G A A X74987
1141 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
1210 1220 1230 1240 1250 1260
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1201 G G A G G A G A A G T A C C A G T T C T A A A T G T C A G T T A T A A G C C A C A G A A A A T T A G T C C C A A A T C A X74987
1201 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
1270 1280 1290 1300 1310 1320
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1261 A C T G G A A G T G T T C G C C A G T T A C T A C A T G A A A A G A T A A G A G A T G C T T A T A C T C A C C C A C A A X74987
1261 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
1330 1340 1350 1360 1370 1380
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1321 T T T G T G A C C G A T G T A A T G A A G C C T C T G C A A A T T G A A A A C A T C A T T G A T C A A G A G G T G C A G X74987
1321 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
1390 1400 1410 1420 1430 1440
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1381 A C A T T A T C T G G T G G T G A A C T A C A G C G A G T A C G T T T A C G C C T T T G C T T G G G C A A A C C T G C T X74987
1381 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C . . . . G C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
1450 1460 1470 1480 1490 1500
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1441 G A T G T C T A T T T A A T T G A T G A A C C A T C T G C A T A T T T G G A T T C T G A G C A A A G A C T G A T G G C A X74987
1441 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
Anh
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129
1510 1520 1530 1540 1550 1560
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1501 G C T C G A G T T G T C A A A C G T T T C A T A C T C C A T G C A A A A A A G A C A G C C T T T G T T G T G G A A C A T X74987
1501 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
1570 1580 1590 1600 1610 1620
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1561 G A C T T C A T C A T G G C C A C C T A T C T A G C G G A T C G C G T C A T C G T T T T T G A T G G T G T T C C A T C T X74987
1561 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
1630 1640 1650 1660 1670 1680
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1621 A A G A A C A C A G T T G C A A A C A G T C C T C A A A C C C T T T T G G C T G G C A T G A A T A A A T T T T T G T C T X74987
1621 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
1690 1700 1710 1720 1730 1740
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1681 C A G C T T G A A A T T A C A T T C A G A A G A G A T C C A A A C A A C T A T A G G C C A C G A A T A A A C A A A C T T X74987
1681 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
1750 1760 1770 1780 1790 1800
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1741 A A T T C A A T T A A G G A T G T A G A A C A A A A G A A G A G T G G A A A C T A C T T T T T C T T G G A T G A T T A G X74987
1741 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Plasmid
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7
10 20 30 40 50 60
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1 A T G G C A G A C A A G T T A A C G A G A A T T G C T A T T G T C A A C C A T G A C A A A T G T A A A C C T A A G A A A X74987
1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
70 80 90 100 110 120
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
61 T G T C G A C A G G A A T G C A A A A A G A G T T G T C C T G T A G T T C G A A T G G G A A A A T T A T G C A T A G A G X74987
61 . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
61 . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
61 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
130 140 150 160 170 180
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
121 G T T A C A C C C C A G A G C A A A A T A G C A T G G A T T T C C G A A A C T C T T T G T A T T G G T T G T G G T A T C X74987
121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
190 200 210 220 230 240
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
181 T G T A T T A A G A A A T G C C C C T T T G G C G C C T T A T C A A T T G T C A A T C T A C C A A G C A A C T T G G A A X74987
181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . 8-14-27+His
181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . 6-5-2+His
Anh
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130
181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
250 260 270 280 290 300
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
241 A A A G A A A C C A C A C A T C G A T A T T G T G C C A A T G C C T T C A A A C T T C A C A G G T T G C C T A T C C C T X74987
241 . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
241 . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
241 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
310 320 330 340 350 360
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
301 C G T C C A G G T G A A G T T T T G G G A T T A G T T G G A A C T A A T G G T A T T G G A A A G T C A G C T G C T T T A X74987
301 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . 8-14-27+His
301 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
301 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
370 380 390 400 410 420
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
361 A A A A T T T T A G C A G G A A A A C A A A A G C C A A A C C T T G G A A A G T A C G A T G A T C C T C C T G A C T G G X74987
361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
430 440 450 460 470 480
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
421 C A G G A G A T T T T G A C T T A T T T C C G T G G A T C T G A A T T A C A A A A T T A C T T T A C A A A G A T T C T A X74987
421 . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . G . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . 8-14-27+His
421 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
421 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
490 500 510 520 530 540
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
481 G A A G A T G A C C T A A A A G C C A T C A T C A A A C C T C A A T A T G T A G C C A G A T T C C T A A G G C T G G C A X74987
481 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C A G A . T . C T . A . G C T . . . 8-14-27+His
481 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C A G A . T . C T . A . A C T . . . 6-5-2+His
481 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C A G A . T . C T . A . A C T . . . Bisbal-Pl.seq
550 560 570 580 590 600
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
541 A A G G G G A C A G T G G G A T C T A T T T T G G A C C G A A A A G A T G A A A C A A A G A C A C A G G C A A T T G T A X74987
541 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
541 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
541 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
610 620 630 640 650 660
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
601 T G T C A G C A G C T T G A T T T A A C C C A C C T A A A A G A A C G A A A T G T T G A A G A T C T T T C A G G A G G A X74987
601 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
601 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
601 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
670 680 690 700 710 720
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
661 G A G T T G C A G A G A T T T G C T T G T G C T G T C G T T T G C A T A C A G A A A G C T G A T A T T T T C A T G T T T X74987
661 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . 8-14-27+His
661 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . 6-5-2+His
661 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
Anh
ang
131
730 740 750 760 770 780
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
721 G A T G A G C C T T C T A G T T A C C T A G A T G T C A A G C A G C G T T T A A A G G C T G C T A T T A C T A T A C G A X74987
721 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
721 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
721 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
790 800 810 820 830 840
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
781 T C T C T A A T A A A T C C A G A T A G A T A T A T C A T T G T G G T G G A A C A T G A T C T A A G T G T A T T A G A C X74987
781 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 8-14-27+His
781 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 6-5-2+His
781 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
850 860 870 880 890 900
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
841 T A T C T C T C C G A C T T C A T C T G C T G T T T A T A T G G T G T A C C A A G C G C C T A T G G A G T T G T C A C T X74987
841 . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
841 . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
841 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
910 920 930 940 950 960
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
901 A T G C C T T T T A G T G T A A G A G A A G G C A T A A A C A T T T T T T T G G A T G G C T A T G T T C C A A C A G A A X74987
901 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
901 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
901 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
970 980 990 1000 1010 1020
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
961 A A C T T G A G A T T C A G A G A T G C A T C A C T T G T T T T T A A A G T G G C T G A G A C A G C A A A T G A A G A A X74987
961 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
961 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
961 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
1030 1040 1050 1060 1070 1080
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1021 G A A G T T A A A A A G A T G T G T A T G T A T A A A T A T C C A G G A A T G A A G A A A A A A A T G G G A G A A T T T X74987
1021 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 8-14-27+His
1021 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . 6-5-2+His
1021 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1081 G A G C T A G C A A T T G T A G C T G G A G A G T T T A C A G A T T C T G A A A T T A T G G T G A T G C T G G G G G A A X74987
1081 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1081 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1081 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
1150 1160 1170 1180 1190 1200
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1141 A A T G G A A C G G G T A A A A C G A C A T T T A T C A G A A T G C T T G C T G G A A G A C T T A A A C C T G A T G A A X74987
1141 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
Anh
ang
132
1141 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1141 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
1210 1220 1230 1240 1250 1260
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1201 G G A G G A G A A G T A C C A G T T C T A A A T G T C A G T T A T A A G C C A C A G A A A A T T A G T C C C A A A T C A X74987
1201 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1201 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1201 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
1270 1280 1290 1300 1310 1320
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1261 A C T G G A A G T G T T C G C C A G T T A C T A C A T G A A A A G A T A A G A G A T G C T T A T A C T C A C C C A C A A X74987
1261 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . 8-14-27+His
1261 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1261 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
1330 1340 1350 1360 1370 1380
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1321 T T T G T G A C C G A T G T A A T G A A G C C T C T G C A A A T T G A A A A C A T C A T T G A T C A A G A G G T G C A G X74987
1321 . . . . . . . . A . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1321 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1321 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
1390 1400 1410 1420 1430 1440
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1381 A C A T T A T C T G G T G G T G A A C T A C A G C G A G T A C G T T T A C G C C T T T G C T T G G G C A A A C C T G C T X74987
1381 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C . . . . G C . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1381 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C . . . . G C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1381 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C . . . . G C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
1450 1460 1470 1480 1490 1500
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1441 G A T G T C T A T T T A A T T G A T G A A C C A T C T G C A T A T T T G G A T T C T G A G C A A A G A C T G A T G G C A X74987
1441 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1441 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1441 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
1510 1520 1530 1540 1550 1560
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1501 G C T C G A G T T G T C A A A C G T T T C A T A C T C C A T G C A A A A A A G A C A G C C T T T G T T G T G G A A C A T X74987
1501 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1501 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1501 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
1570 1580 1590 1600 1610 1620
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
1561 G A C T T C A T C A T G G C C A C C T A T C T A G C G G A T C G C G T C A T C G T T T T T G A T G G T G T T C C A T C T X74987
1561 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1561 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1561 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
1630 1640 1650 1660 1670 1680
------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-------------------+-
Anh
ang
133
1621 A A G A A C A C A G T T G C A A A C A G T C C T C A A A C C C T T T T G G C T G G C A T G A A T A A A T T T T T G T C T X74987
1621 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-14-27+His
1621 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
1621 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
1690 1700 1710 1720 1730 1740
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1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-5-2+His
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181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
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361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D Q I P K A . 8-14-27+His
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361 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D Q I P K T . Bisbal-Pl.seq
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1621 K N T V A N S P Q T L L A G M N K F L S Q L E I T F R R D P N N Y R P R I N K L N S I K D V E Q K K S G N Y F F L D D . X74987
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1621 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bisbal-Pl.seq
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1798 Bisbal-Pl.seq
136
8. Danksagung
Mein Dank geht zunächst an PD Dr. rer. nat. Andreas Dotzauer für die Bereitstellung
dieses interessanten Themas und seiner Diskussionsbereitschaft und Unterstützung bei
Fragen und Problemen.
Danken möchte ich der QIAGEN Hamburg GmbH (ehemals artus GmbH) für die Stellung
meines Arbeitsplatzes, was mir diese Arbeit und die vielen Erfahrungen sowohl in der
Wirtschaft als auch in der Wissenschaft überhaupt erst ermöglicht hat.
Vielen Dank an alle Mitarbeiter der Qiagen Hamburg GmbH, in der ein supernettes
Arbeitsklima herrscht und ich mich immer wohlgefühlt habe. Danke für die vielen
Gespräche auf dem Flur und gemeinsame Kaffee- und Mittagspausen.
Mein ganz persönlicher und besonderer Dank geht an Dr. Meike Eickhoff, die trotz
eigenem vollen Terminplan immer ein offenes Ohr für meine Fragen und Probleme hatte.
Mein besonderer Dank geht auch an Oliver Janssen-Weets, für die gute Zusammenarbeit
und die ständige Hilfsbereitschaft bei allen Fragen und Unklarheiten. Für die baldige
Beendigung seiner Doktorarbeit wünsche ich ihm ganz viel Glück und Erfolg.
Nicht zuletzt geht mein Dank natürlich auch an meine Freunde und meine Familie, die
mich all die Jahre unterstützt haben und mir dadurch diese Arbeit ermöglicht haben.
Ein ganz persönlicher Gruß geht an die Menschen, die mir in meinem Leben sehr viel
bedeutet haben, aber diesen Lebensabschnitt leider nicht mehr miterleben dürfen. Oma,
Opa, Tante Inge – ich hab euch nicht vergessen
137
9. Publikationsliste
Günther, S., Asper, M., Röser, C., Luna, L. K., Drosten, C., Becker-Ziaja, B.,
Borowski, P., Chen, H.M. & Hosmane R.S. (2004). Application of real-time PCR for
testing antiviral compounds against Lassa virus, SARS coronavirus and Ebola virus in
vitro. Antiviral Research. 63, 209-215
Posterbeiträge:
Röser, C., Asper, M., Borowski, P. & Günther, S. (2003). Cell culture system für
screening antiviral compounds against Lassa virus. Kongress der Gesellschaft für Virology
e.V.
Röser, C., Laue, T. & Dotzauer, A. (2005). Cloning of the RNase L inhibitor (RLI) for
manipulation of the 2’-5’oligoadenylate synthetase (OAS) assay in virus infected cells.
Kongress der Gesellschaft für Virology e.V.
138
10. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name Christina Röser
Anschrift Münchener Strasse 150 28215 Bremen
geboren am 07.07.1978 in Erfurt
Familienstand ledig
Schulausbildung
09.1985 – 08.1991 Grundschule Erfurt
09.1991 – 07.1997 Kooperative Gesamtschule am Schwemmbach Erfurt
Abschluß: Abitur (Notendurchschnitt 1,9)
Hochschulstudium
10.1997 - 06.2003 Biologiestudium an der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster
Diplomarbeit am Bernhard-Nocht-Institut Hamburg
Thema: „Etablierung eines Zellkultursystems und Testung potentieller Inhibitoren des Lymphocytären Choriomeningitis Virus und Lassa-Virus“
Abschluss: Diplom (Notendurchschnitt 1,6)
Praktika
17.09.2001 – 31.10.2001 Praktikum am Bernhard-Nocht-Institut Hamburg
Thema: „Untersuchung zur bakteriellen Expression und Aufreinigung von Nukleoprotein und Polymerase des Lassa-Virus“
Berufliche Weiterbildung
01.05.2003 - 30.6.2003 Promotionsstudium an der Universität Gießen
seit 01.07.2003 Promotionstudent bei der artus GmbH Hamburg in
Kooperation mit der Universität Bremen Abt. Virologie
(1.10.2005 Umbenennung der artus GmbH Hamburg in Qiagen Diagnostics Hamburg)
Fremdsprachen Englisch
Weiterbildung
10.-11.10.2005 Ausbildung zum Ersthelfer/Betriebshelfer
139
11. Erklärung
Hiermit erkläre ich nach §6 (5) der Promotionsordnung,
1) die Arbeit ohne unerlaubte fremde Hilfe angefertig zu haben.
2) keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt zu haben.
3) die den benutzen Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche
kenntlich gemacht zu haben.
Ort, Datum Unterschrift