utilisation de la protéomique comme biomarqueur d ...contribue probablement à la cornification...
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Gembloux
Facultéuniversitaire des Sciences agronomiques
Développement de biomarqueursd’exposition et d’effet par la protéomique
chez des invertébrés aquatiques pour déterminer les zones à risque et évaluer
la qualité des eaux de surface.
PromoteursPromoteursE. Haubruge, M. Paquot, J-P. Thomé, B. Wathelet
CollaborateursCollaborateursE. DePauw, L. Fagot, F. Francis, D. Leroy, L. Michel, N. Milants
22
IntroductionIntroduction
Contamination gContamination géénnééralisraliséée de la biosphe de la biosphèère par re par des polluants gdes polluants géénnéérréés par ls par l’’action de laction de l’’hommehomme
Directive Cadre 2000/60 Directive Cadre 2000/60 surveillance de la surveillance de la qualitqualitéé des eauxdes eaux
EcotoxicologieEcotoxicologie modernemoderne : 2 approches: 2 approches
Approche "Approche "classiqueclassique""
Approche basApproche baséée sur le sur l’’utilisation de utilisation de biomarqueursbiomarqueurs
33
Les Les biomarqueursbiomarqueurs
•• BiomarqueurBiomarqueur : Changement d’une réponse biologique, pouvant être mis en relation avec l’exposition à des substances chimiques ou avec les effets toxiques de celles-ci.
•• BiomarqueurBiomarqueur dd’’expositionexposition : : renseigne sur la présence dans un organisme d’une substance exogène, de ses métabolites, ou d’un produit formé par l’action du xénobiotique.
A distinguer des biomarqueursbiomarqueurs dd’’effeteffet
44
ObjectifsObjectifs
DDééveloppement de veloppement de biomarqueursbiomarqueurs chez des chez des invertinvertéébrbréés aquatiques s aquatiques
Mettre en Mettre en éévidence les effets de diffvidence les effets de difféérents rents xxéénobiotiquesnobiotiques chez ces invertchez ces invertéébrbréés s
Utilisation de mUtilisation de mééthodes molthodes molééculairesculaires ::•• ProtProtééomiqueomique•• Mesure dMesure d’’activitactivitéés enzymatiquess enzymatiques•• ……
55
GammarusGammarus pulexpulex
• Crustacé Amphipode dulçaquicole
• Petite taille (8-18 mm)
• Détritiphage vivant dans des eaux calmes et bien oxygénées
AvantagesAvantages ::Largement distribué et souvent abondant
Sensible aux polluants
Cycle de vie entièrement aquatique
Élevage en laboratoire possible
Nombreuses études
66
Le gammare comme espLe gammare comme espèèce ce sentinellesentinelle
RRééponses biochimiquesponses biochimiquesRRééponses morphologiquesponses morphologiquesFeedingFeeding rate et croissancerate et croissanceRRééponses comportementalesponses comportementalesReproductionReproduction
77
Maintien dMaintien d’’une population de une population de GammarusGammarus pulexpulex en laboratoireen laboratoire
Gammares prGammares préélevlevéés dans le Blanc Gravier s dans le Blanc Gravier àà ColonsterColonster et maintenus en et maintenus en éélevage en levage en laboratoirelaboratoire conditions de vie connues et conditions de vie connues et mamaîîtristrisééeses
ContaminationContamination de de G. G. pulexpulex àà ll’’aide de aide de diffdifféérents rents xxéénobiotiquesnobiotiques
99
Les Les PCBsPCBs
1 à 10 atomes de chlore
209 congénères
mono à décachlorés
• Stabilité thermique, résistance à l’oxydation et capacités diélectriques Utilisation à grande échelle
• Dispersion généralisée dans la biosphère et bioaccumulation importante
• Toxicité hépatique, diminution de fécondité, altérations du développement, …
1010
Les Les PCBsPCBs
Contamination gContamination géénnééralisralisééee de de ll’’environnementenvironnement
EffetsEffets sur les organismes sur les organismes connusconnus
XENOBIOTIQUES MODELESXENOBIOTIQUES MODELES
UtilisUtiliséés pour valider ls pour valider l’’approche approche protprotééomiqueomique
1111
Le Le ChlordChlordééconecone
Pesticide organochlorPesticide organochloréé
Largement utilisLargement utiliséé en en Guadeloupe et en Martinique Guadeloupe et en Martinique (insecticide)(insecticide)
Difficilement dDifficilement déégradablegradable
CaractCaractèère lipophile re lipophile bioaccumulationbioaccumulation
DDéérréégulateurgulateur endocrinien puissantendocrinien puissant
1212
ToxicitToxicitéé aiguaiguëë du du ChlordChlordééconecone
Espèce Valeur de la LC50 à 96h SourceCrustacés: Palaemonetes pugio 121 µg/l Schimmel & Wilson (1977)
Gammarus pseudolimnaeus 180 µg/l Sanders et al (1981)Callinectes sapidus 210 µg/l EPA (2000)
Poissons: Leisostomus xanthurus 6,6 µg/l Schimmel & Wilson (1977)Pimephales promelas 69,5 µg/l Epa (2000), Mallatt & Barron (1988)Lamproie de mer 414 µg/l Epa (2000), Mallatt & Barron (1988)Ictalarus punctatus 514 µg/l Van Veld et al (1984)
Espèce Valeur de la LC50 à 48h SourceCrustacés: Paeneus aztecus 85 µg/l EPA, 2000 in Bocquené et Franco (2005)
GammarusGammarus pulexpulexLC50 96hLC50 96h 316,2 316,2 µµgg/l/l
1313
Le Le FFéénitrothionnitrothionInsecticide organophosphoré
Substance préoccupante (Directive Européenne 76/464/CEE)
Serait inducteur de l’ERODchez l’écrevisse Procamburus clarkii(Porte et Escartin, 1998)
1414
LC50 LC50 FFéénitrothionnitrothion
LC50 96h : 4,95 4,95 µµgg/l/l
LC1 LC10 LC25 LC50 LC75 LC90 LC99
1515
Contamination Contamination in vitroin vitro des des gammaresgammares
Utilisation de boîtes de Petri en verre (100 mm x 20 mm)
Un filtre circulaire (Ø : 8,5 cm) tapisse le fond
Dans chaque boîte : 40 ml de solution aqueuse + 10 gammares
Les solutions sont renouvelées toutes les 24 heures
Durée totale d’exposition aux toxiques : 144 heures
6 solutions de toxiques :
• PCBs
-) congénère n°169 (1 µg/L)
-) congénère n°77 (10 µg/L)-) 7 congénères "traceurs" en mélange (PCBs n° 28, 52, 101, 118,
138, 153 et 180) (1 µg/L)• Chlordécone (10 µg/l)
• Fénitrothion (1µg/l)
• 3-méthylcholanthrène (10 µg/l)
Conditions de l’expérience : 15°C, alternance 16 h jour/8h nuit
1616
Plan de travailPlan de travail
Récolte des organismes
Contamination
Elevage
LC50 96h
Chlordecone316,2 µg/l
Fénitrothion4,95 µg/l
Analyse de l’activitéenzymatique EROD
1717
LL’’ééthoxyrthoxyréésorufinesorufine--OO--ddééééthylasethylase (EROD)(EROD)
Appartient Appartient àà la famille CYPIA1 des la famille CYPIA1 des monooxygmonooxygéénasesnases àà cytochrome P450.cytochrome P450.
Catalyse la premiCatalyse la premièère phase de dre phase de déétoxication toxication de composde composéés apolaires tels que les s apolaires tels que les PCBsPCBs..
ActivitActivitéé induite par plusieurs familles de induite par plusieurs familles de xxéénobiotiquesnobiotiques: : PCBsPCBs, dioxines, furannes, , dioxines, furannes, HAPsHAPs..
1818
LL’’ééthoxyrthoxyréésorufinesorufine--OO--ddééééthylasethylase(EROD)(EROD)
BiomarqueurBiomarqueur dd’’exposition aux exposition aux PCBsPCBs, dioxines, , dioxines, HAPsHAPs,,……
1919
Dosage de lDosage de l’’activitactivitéé ERODEROD
Protocoles classiquement utilisés AUCUNE ACTIVITE MESUREE AUCUNE ACTIVITE MESUREE
MAIS
plusieurs paramètres peuvent être modifiés
Les xénobiotiques utilisés n’induiraient pas cette activité chez G. pulex
Utilisation d’autres xénobiotiques : fénitrothion (Porte et Escartin, 1998), 3-méthylcholanthrène
2020
Le 3Le 3--mmééthylcholanthrthylcholanthrèènene
Molécule couramment utilisée dans lesétudes biochimiques
Dérégulateur endocrinien
Inducteur connu de l’activité EROD
2121
Dosage de lDosage de l’’activitactivitéé ERODEROD
Protocoles classiquement utilisés AUCUNE ACTIVITE MESUREE AUCUNE ACTIVITE MESUREE
MAIS
plusieurs paramètres peuvent être modifiés
Les xénobiotiques utilisés n’induiraient pas cette activité chez G. pulex
Le temps d’incubation serait insuffisant
Le catalyseur utilisé ne serait pas assez efficace
La concentration en substrat serait insuffisante
Utilisation d’autres xénobiotiques : fénitrothion (Porte et Escartin, 1998), 3-méthylcholanthrène
Allongement jusqu’à 2h
Utilisation du NADH au lieu du NADPH (Snyder, 2000)
Augmentation de la concentration en substrat
2222
Dosage de lDosage de l’’activitactivitéé ERODEROD
Les inhibiteurs de protéase classiquement utilisés pour préparer les échantillons ne seraient pas suffisants
La mesure à température ambiante ne conviendrait pas
La quantité d’enzyme dans un seul individu serait insuffisante
Ajout d’autres inhibiteurs de protéases
Essai de mesure à la température de l’élevage
Pools d’organismes
Activités toujours inférieures aux limites de détection
HYPOTHESES :
• Activité non induite par ces composés chez G. pulex
• Pas d’activité EROD chez le gammare, une autre enzyme pourrait être induite à la place
2323
Plan de travailPlan de travail
Récolte des organismes
Contamination
Analyse de l’activitéenzymatique ERODElevage
LC50 96h
Analyse de l’activitéenzymatique GSTs
Chlordecone316,2 µg/l
Fénitrothion4,95 µg/l
2424
La biotransformation des polluants La biotransformation des polluants hydrophobeshydrophobes
• Phase I : Activation du xénobiotique par addition ou modification d’un groupement fonctionnel
X
X-0H
02
H20Monooxygénases à cytochrome P450
• Phase II : Conjugaison du xénobiotique activé avec un composéendogène polaire
Glutathion-S-transférases (GSTs)
2525
Les Les GSTsGSTsDosages individuels par colorimétrieConditions optimales : • pH = 6,5• T° = 25°C• Dosages sur animaux entiers
Activité GST décelée chez les gammares contaminés par différents congénères de PCBs et par le chlordecone
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
TA TNC Tacét CPCB169 CPCB77 CMix3 CChl10 CChl20
GST
(nm
ole/
min
*µg
de p
roté
ines
2626
Plan de travailPlan de travail
Récolte des organismes
Contamination
Analyse de l’activitéenzymatique EROD
Protéomique
Elevage
LC50 96h
Analyse de l’activitéenzymatique GSTs
Chlordecone316,2 µg/l
Fénitrothion4,95 µg/l
2727
La La protprotééomiqueomique
Ensemble de mEnsemble de mééthodes permettant de thodes permettant de ssééparer, identifier et caractparer, identifier et caractéériserriserll’’ensemble des ensemble des protprotééinesines relatives relatives àà un un ggéénome dans des conditions particulinome dans des conditions particulièères.res.
Modifications du Modifications du protprotééomeome apraprèès s exposition exposition àà un un xxéénobiotiquenobiotique..
2828
La protéomique
Electrophorèse-2D
ImagerieAnalyse des gels et excision des spots de protéines
Coloration des gels
X 3
Extraits de protéinestotales
2929
Gammares contaminGammares contaminéés aux s aux PCBsPCBs
G. pulex contaminés avec les PCBs coplanaires (77 et 169)
pI
pM
CB169: surexpression de 10 spots, sous expression de 3 spots
CB77: surexpression de 4 spots, sous expression de 13 spots 7 traceurs : surexpression de
8 spots, sous expression de 12 spots
G. pulex contaminés avec les 7 PCBs traceurs
pI
pM
Variation de 5 spots commune aux deux types de PCBs
3030
Gammares contaminGammares contaminéés au s au ChlordChlordééconecone
Chlordécone :
Total de 22 spots variables
pM
pI G. pulex contaminés au chlordecone
Variation spots : PCBs ≠ chlordecone
3131
Gel d’électrophorèse coloréau nitrate d’argent
Digestion à la trypsine
Protéines excisées
EFGDLVKSéquences protéiques Tag
+ Spectrométrie de masse (MS)
M/Z
Intensité
Liquid ChromatographyElectrospray Ionization
Recherche dans les bases de données
(Génomique/EST/Protéine)
M/Z
AA1
AA2AA3
AA4
Intensité
+ Spectrométrie de masse (MS)
3232
Identification des protIdentification des protééines : gammares ines : gammares contamincontaminéés aux s aux PCBsPCBs coplanairescoplanaires
Spot number Protein Fonction MW (kDA) pI (pH unit) Mowse score
52Bloom syndrome protein homolog (EC 3.6.1.-
) (xBLM) (Xenopus laevis )Participe à la réplication et à la réparation du
DNA 154,281 8,41 31
55
Enolase (EC 4.2.1.11) (2-phosphoglycerate dehydratase) (2-phospho-D-glycerate hydro-
lyase) (Homarus gammarus )
Intervient dans la glycolyse en catalysant la conversion du 2-phosphoglycerate en 2-
phosphoenolpyruvate (PEP) 47,525 5,85 28
56
Actin, cytoskeletal 1 (LPC1) (Lytechinus pictus )
Protéine bi-globulaire importante pour l'architecture et les mouvements cellulaires 42,157 5,38 130
58
Filensin (Beaded filament structural protein 1) (Lens fiber cell beaded-filament structura)
(Homo sapiens ) protéine membranaire du crystallin 74,784 5,09 35
59
Actin, aortic smooth muscle (Alpha-actin-2) (Bos taurus )
Protéine bi-globulaire importante pour l'architecture et les mouvements cellulaires 42,381 5,23 55
60
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 (EC 1.2.1.12) (GAPDH-1) (Caenorhabditis
elegans )
Intervient dans la glycolyse en catalysant la conversion du glycéraldéhyde-3-phosphate en
1,3-bisphosphoglycérate36,531 7.68 121
61
Probable arginine kinase F46H5.3 (EC 2.7.3.3) (AK) (Caenorhabditis elegans )
Catalyse la phosphorylation de l'azote des résidus guanidine de l'arginine en présence
d'ATP et d'un cation divalent avec formation de phosphorylarginine et d'ADP
44,653 6,84 26
65
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 (EC 1.2.1.12) (GAPDH-1) (Caenorhabditis
elegans )
Intervient dans la glycolyse en catalysant la conversion du glycéraldéhyde-3-phosphate en
1,3-bisphosphoglycérate36,531 7,68 121
66Catalase (EC 1.11.1.6) (Danio rerio )
Rôle dans la protection cellulaire : décompose le peroxyde d'hydrogène en eau et
en oxygène59,902 8,12 28
67Catalase (EC 1.11.1.6) (Danio rerio )
Rrôle dans la protection cellulaire : décompose le peroxyde d'hydrogène en eau et
en oxygène59,902 8,12 40
70
Arginine kinase (EC 2.7.3.3) (AK) (Drosophila melanogaster )
Catalyse la phosphorylation de l'azote des résidus guanidine de l'arginine en présence
d'ATP et d'un cation divalent avec formation de phosphorylarginine et d'ADP
40,126 6,04 62
3333
Identification des protIdentification des protééines : gammares ines : gammares contamincontaminéés au s au chlordchlordééconecone
Spot number Proteine Fonction MW (kDA) pI (pH unit) Mowse score
6 Vacuolar ATP synthase subunit B (Gallus gallus )
hydrolyse d'ATP en absence de gradient de protons, rôle d'acidification de la lumière des
compartiments50,536 5,31 23
7 Tubulin beta chain (Beta tubulin) (Fragment) (Haliotis discus) formation des microtubules protofilamentaires 38,554 5,85 24
10Chaperonin homolog Hsp-60, mitochondrial
precursor (Heat shock protein 60) (Caenorhabditis elegans )
impliquée dans l'import de protéines mitochondriales et dans l'assemblage de
macromolécules, peut faciliter le repliement correct de protéines importées, peut aussi
prévenir le mauvais repliement et promouvoir le repliement et l'assemblage correct de
polypeptides dépliés générés sous des conditions de stress dans la matrice mitochondriale
60,235 5,31 63
12 Heat shock 70 kDa protein A (Caenorhabditis elegans )
chaperonnes moléculaires, fonctions cytoprotectrices (repliement des protéines, conservation des structures, transfert des
protéines à travers les membranes)
69,965 5,44 37
20 Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal (Cytokeratin-2e) (K2e) (CK 2e) (Homo sapiens )
contribue probablement à la cornification terminale associée à l'activation ,la prolifération et
la kératinisation des kératinocytes66,11 8,07 23
38 Probable citrate synthase, mitochondrial precursor (EC 2.3.3.1) (Caenorhabditis elegans)
enzyme mitochondriale impliquée dans le cycle de Krebs 51,793 7,68 47
39 Arginine kinase (EC 2.7.3.3) (AK) (Drosophila melanogaster )
Catalyse la phosphorylation de l'azote des résidus guanidine de l'arginine en présence
d'ATP et d'un cation divalent avec formation de phosphorylarginine et d'ADP
40,126 6,04 20
42 Malate dehydrogenase, mitochondrial precursor (EC 1.1.1.37) (Homo sapiens )
enzyme qui participe à la gluconéogénèse en oxydant le malate issu de la mitochondrie 35,965 8,92 84
47Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1
(EC 1.2.1.12) (GAPDH-1) (Caenorhabditis elegans )
Intervient dans la glycolyse en catalysant la conversion du glycéraldéhyde-3-phosphate en
1,3-bisphosphoglycérate36,531 7,68 33
48Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1
(EC 1.2.1.12) (GAPDH-1) (Caenorhabditis elegans )
Intervient dans la glycolyse en catalysant la conversion du glycéraldéhyde-3-phosphate en
1,3-bisphosphoglycérate36,531 7,68 95
Tubulin alpha-1 chain (Aplysia californica )8 484,9350,686formation des microtubules protofilamentaires
3434
Plan de travailPlan de travail
Récolte des organismes
Contamination
Analyse de l’activitéenzymatique EROD
Protéomique
Elevage
LC50 96h
Analyse de l’activitéenzymatique GSTs
Analyse des HSPs
Chlordecone316,2 µg/l
Fénitrothion4,95 µg/l
3535
Les Les HSPsHSPs
«« HeatHeat ShockShock ProteinsProteins »» ((HSPsHSPs) ) PROTEINES DE PROTEINES DE STRESSSTRESS
• Gènes hautement conservés
• 5 familles :
HSP110HSP110 (110 kDa)
HSP90HSP90 (83-90 kDa)
HSP70HSP70 (68-75 kDa)
HSP60HSP60
Et la famille des ««petitespetites»» HSPHSP (15-40 kDa)
3636
Les Les HSPsHSPs•• Formes inductiblesFormes inductiblesProtectionProtection et rrééparationparation des cellules en
réponse aux stress
Chaperonnes molChaperonnes molééculairesculairesMinimisent agrégation
Facilitent le folding correct des protéines
et l’élimination des protéines dénaturées
dénaturation de protéines
•• Formes constitutives Formes constitutives Rôles dans la physiologie cellulaire basaleRôles dans la physiologie cellulaire basale
3737
Les Les HSPsHSPs
•• HSP70HSP70Famille Famille ubiquiste ubiquiste
SSééquencesquences les plus les plus conservconservéées es et les pluset les plusrréépanduespandues
Les plus Les plus sensibles sensibles àà la templa tempéératurerature
Fonction de Fonction de chaperonnes molchaperonnes molééculairesculaires
3939
Plan de travailPlan de travail
Récolte des organismes
Contamination
Analyse de l’activitéenzymatique EROD
Protéomique
Elevage
LC50 96h
Analyse de l’activitéenzymatique GSTs
Analyse de l’activitéenzymatique MROD
Analyse des HSPs
Chlordecone316,2 µg/l
Fénitrothion4,95 µg/l
4040
La La mmééthoxyrthoxyréésorufinesorufine--OO--ddéémmééthylasethylase (MROD)(MROD)
CYP6G1 activité MROD
Famille largement exprimée chez les insectes
Résistance aux xénobiotiques chez la drosophileDosage de l'activité MROD chez Gammarus pulex.
0
2
4
6
8
10
12
Témoins PCB169 Fénitrothion Chlordécone
4141
ConclusionConclusion
Mise en Mise en éévidence de vidence de variations du variations du protprotééomeome suite suite àà la contamination de la contamination de G. G. pulexpulex par des par des xxéénobiotiquesnobiotiquesIdentification des protIdentification des protééinesines dont dont ll’’expression varie et des voies expression varie et des voies mméétaboliques impliqutaboliques impliquééesesUtilisation de ces protUtilisation de ces protééines pour le ines pour le ddééveloppement de veloppement de biomarqueursbiomarqueurs