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Utilisation du modèle de co-culture cellules endothéliales/Plasmodium falciparum pour l’étude de la
pathogénicité des isolats plasmodiaux
CIRMF & INSERM 511
Fousseyni Touré-Ndouo, A Siau, O Oukem, U Bisvigou, O Moussa, S Bisser, D Mazier
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Interactions hôte-Plasmodium falciparum
Cellules endothéliales vasculaires
Foie
Lars Hvid et al. 2005 (modifié)
Hématie
Pf
Cytoadhérence, Séquestration
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Séquestration au cours du neuropaludisme
2
Blocage mécaniquedes capillaires
Rosette
Autoagglutinationdes HP
cytokines proinflammatoires (1), toxines (2).
1
Flux sanguin
Cytoadhérence des HP
1
Modèle Lékana-Douki et al. 2003
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Apoptose
P. falciparum 3D7 (souche de laboratoire) induit l’apoptose de la cellule endothéliale pulmonaire humaine par contact physique (cytoadhérence)
Pino et al. 2003
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Objectif général
Analyser le rôle des molécules de transduction du signal dans la pathogenèse du paludisme
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Objectifs spécifiques
• Analyser la capacité des isolats plasmodiaux à cytoadhérer et à induire des modifications (apoptoseetc.) de la cellule endothéliale
• Etablir une corrélation entre ces modifications et l’état clinique des patients
• Identifier les ligands et récepteurs impliqués dans la pathogénicité pour la perspective vaccinale et/ou thérapeutique
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Matériels et méthodes
� Recrutement de patients, collecte de données cliniques et d’ isolats plasmodiaux
� Culture de cellules endothéliales pulmonaires humaines (HLEC)
� Maturation des isolats P.f
� Co-cultures HLEC-Isolats P.f
� Réalisation des tests (cytoadhérence, ELISA apoptose, préparation des ARNm, DNA microarray ou Biopuce)
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Collection des isolats plasmodiaux et formes sanguines
680.000 anneaux /µl de sang
Goutte épaisse A Goutte épaisse B
250.000 trophozoïtes /µl de sang
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Maturation ex vivo (24 – 48 h)
12% Schizontes
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Enrichissement en schizontes
80%
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Co-culture: HLEC/ isolats Pf
Suspension de schizontes
HLEC HLEC HLEC
1 2 3
Cytoadhérence (1h) Apoptose (4 h) Contact (4h) collection ARNm
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Cytoadhérence
5.619 PRBC/mm2 HLEC
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Cytoadhérence
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
PR
BC
/mm
2 H
LE
C
D1 F17 F28 F3 F31 F33 F36 F39 F43 F45 F48 F50 F54 F59 F62 F64 F69 F37 F5 F52 F61
Isolats Pf
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La cytoadhérence n’est pas associée à la charge parasitaire
216
937
1686
5619
197
1561
592
437
5
230
4881
23760
27324
26080
26730
13365
26730
3960
18810
4703
F3
F31
F69
F32
F37
F42
F53
F62
F60
F26
Cytoadhérence
PRBC/mm2HLEC
Nombre de schizontes
x 103
Isolats Pf
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ELISA apoptose (1)
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
1,800
2,000
2,200
2,400
D1 F1 F4 F7 F9 F16 F18 F21 F26 F30 F31 F33 F36 F38 F49 F51 F54 F55 F56 F59 F61 F63 F67 F69
DO échantillons
DO GRS
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
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ELISA apoptose (2)
Uncomplicated malaria 35 10
5
N = 45 P.f
Paludisme simple 35 Paludisme sévère 10
5 apoptotiques 4 apoptotiques
20% d’isolats apoptotiques
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L’apoptose n’est pas associée à la gravité du paludisme (p=0,11)
Les isolats apoptotiques se rencontrent aussi bien dans les cas simples que dans les cas sévères
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L’apoptose est associée aux signes neurologiquesFisher exact test p= 0,02
Prostration
Prostration
Coma
Hyperparasitémie
Hyperparasitémie
Hyperparasitémie
Hyperparasitémie
Prostration
Hyperparasitémie
Anémie
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
F3
F31
F69
F32
F37
F42
F53
F62
F63
F26
Critères de sévérité
(OMS 2000)
ApoptoseIsolats Pf
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Hypothèse
L’apoptose pourrait être impliquée dans les dommages causés à la barrière hématoméningée au cours du
neuropaludisme
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Apoptose CE et barrière hématoméningée
Modèle Bisser et al. 2006
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Relation entre cytoadhérence et apoptose
0
5
10
15
20
25
1 10 100 1000 10000
Cytoadhérence PRBC
HL
EC
ap
op
tose
▲ Paludisme sévère avec signes neurologiques (prostration ou coma);
���� Paludisme sévère sans signes neurologiques (anémie et hyperparasitémie)���� Paludisme simple
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Transcriptome associé à l’induction de l’apoptose
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
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Recherche PlasmoDB
Ces gènes codent en grande majorité pour des antigènes de surface dont certains sont impliqués dans la
cytoadhérence
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Résumé
• Environ 20% des isolats plasmodiaux de Franceville (Gabon) induisent l’apoptose de la cellule endothéliale
• L’apoptose est associée aux signes neurologiques
• 23 gènes associés à la pathogénicité des isolats plasmodiaux ont été identifiés
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Perspectives
• Expression d’antigènes recombinants correspondant à certains de ces gènes
• Analyses immunologiques (recherche de candidats vaccins potentiels)
• Co-culture cellules endothéliales cérébrales/P. falciparum
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Remerciements (1)
• Patients et leurs parents
• Hôpital AMISSA BONGO
• CIRMF
• INSERM 511
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Remerciements (2)
• Directeur de l’Institut Pasteur de Madagascar
• Initiateurs et organisateurs de l’Atelier Paludisme
• Peuple Malgache
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Merci