utilizarea celulelor stem pluripotente … doctorat/rezumat... · de înlocuire a celulelor pentru...
TRANSCRIPT
1
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE
“Grigore T. Popa” Iaşi
FACULTATEA DE MEDICINĂ DENTARĂ
UTILIZAREA CELULELOR STEM
PLURIPOTENTE INDUSE (iPSC) DIN
FIBROBLASTE/STEM MEZENCHIMALE
ÎN PATOLOGIA OFTALMOLOGICĂ
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Îndrumător ştiinţific,
Prof. Dr. Marcel Costuleanu Doctorand,
Dr. Oana Cristina Răducanu
-- IAŞI, 2016 –
2
CUPRINS
1.STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII………..........…...................................…..1
1.1. Celulele stem iPSC şi derivatele acestora în oftalmologie...................................................................……...1
1.2. Factorii de creştere celulară şi proliferarea celulelor progenitoare/stem............................….………..9
1.2.1.Familia factorului de creştere epidermică...................................................................................10
1.2.2.Factorul de creştere derivat din plachete.................................................................................................11
1.2.3. Familia factorului de creştere transformant .................................................................................12 1.2.4. Familia factorului de creştere fibroblastică……..................................................................................12
1.2.5.Factorii de creştere asemănători insulinei ....................................................................................13
1.2.6.Factorul de creştere nervoasă.......................................................................................................14
1.2.8.Alţi factori de creştere celulară.................................................................................................................17 1.3. Factorii moleculari executori ai apoptozei celulelor progenitoare/stem.........................................................18
2.CONTRIBUŢII PERSONALE…………………….…..…….................……..41 2.1.Motivaţia alegerii temei........................................................................................................................................41 2.2.Scopul şi obiectivele ........................................................................................................…….……..…………..43
2.3.Materiale şi metode...............................................................................................................................................43
2.3.1. Efectele ionomicinei asupra potenţialului transmembranar mitocondrial
în condiţiile supraîncărcării citosolice cu Ca2+
..............................................................................45
2.3.2. Efectele CsA asupra potenţialului membranar mitocondrial........................................................46
2.3.3. Efectele CnB asupra potenţialului membranar mitocondrial……………............................……46
2.3.4. Efectele Citosporonei B în prezenţa CsA asupra potenţialului
membranar mitocondrial……………………...…………………………………………………..47
2.3.5. Efectele Tyrphostin AG 1295 asupra potenţialului membranar mitocondrial.............................48
2.3.6. Efectele Tyrphostin AG 494 asupra potenţialului membranar mitocondrial...............................49
2.3.7. Evidenţierea morţii celulare induse de deltametrin (DMT)
în celule de tip iPSC..........................................................................................................................50
2.3.8. Efectele Alpidem (ALP) asupra potenţialului membranar mitocondrial.....................................50
2.3.9. Efectele DCU asupra potenţialului membranar mitocondrial......................................................51
2.3.10. Efectele acidului 9 cis retinoic (9-R) asupra potenţialului membranar
mitocondrial........................................................................................................................................52
2.4. Rezultate...............................................................................................................................................................53
2.5. Discuţii...................................................................................................................................................................74 CONCLUZII FINALE …………………………….……………………...............……..…...120
BIBLIOGRAFIE ............………………...………………….................…..………………….121
3
2. CONTRIBUŢII PERSONALE
2.1. Motivaţia alegerii temei Celulele stem sunt celule capabile să se transforme în multiple tipuri celulare, de aceea ele reprezintă
candidatul ideal pentru menţinerea homeostaziei şi pentru repararea tisulară. Teoretic, celulele stem sunt avantajoase
deoarece au capacitatea de a se diferenţia şi înlocui orice tip de ţesut lezat precum şi de a influenţa diferitele căi
biologice prin semnalizarea paracrină.
Celulele stem embrionare (CSE), celulele stem pluripotente induse (celulele iPS), celulele stem
mezenchimale (CSM) și celulele stem adulte sunt surse potențiale pentru terapia celulară în medicina regenerativă.
După cum am menţionat deja, transplantul epiteliului pigmentat retinian (RPE) a fost dezvoltat ca şi terapie
de înlocuire a celulelor pentru degenerarea maculară legată de vârstă. Celulele stem embrionare umane (hESC) şi
celulele stem pluripotente induse (iPSC) - derivate RPE sunt transferate experimental din ce în ce mai mult spre
folosirea clinică. Celulele stem RPE umane (hRPESC) s-au introdus ca şi sursă alternativă de RPE. S-a demonstrat
că monostraturile polarizate ale hRPESC - derivate RPE, crescute pe membrane de polistiren (PET), au avut
caracteristici aproape native. Fragmentul de monostrat RPE pe PET a fost transplantat subretinian (SRS) la iepure,
constituind astfel un model experimental animal de ochi mare.
Dar, după 4 zile din momentul intervenţiei a fost observat edem retinian deasupra implantului, detectat prin
tomografie de coerenţă optică în domeniul spectral (SD-OCT) şi fundoscopie (Stanzel şi colab., 2014). După o
săptămână a fost observată atrofia retinei de deasupra transplantului atât la făt cât şi la adult, fenomenul rămânând
ulterior relativ stabil. Examenul histologic obținut la 4 săptămâni după implantare a confirmat existenţa unui
monostrat RPE polarizat uman continuu pe PET. Luate împreună, datele obţinute demonstrează că xeno-hiPSC-RPE
au supravieţuit în spațiul subretinian. Aceste experimente dovedesc că hiPSC-derivate RPE pot fi considerate a fi o
sursă potenţială pentru terapiile care utilizează transplantul. Nu se cunoaşte însă potenţialul funcţional şi integrativ al
acestor xenogrefe celulare.
Încercările de a compara răspunsurile imune în stratul subretinian (SRS) cu alte modele de xenogrefă nu pot
fi adecvate din cauza mediului imunologic unic de sub retină (mediu privilegiat imun). Există chiar date care arată
că, în cazul alogrefelor RPE, expresia complexului major de histocompatibilitate de tip II (Zhang şi Bok, 1998),
împreună cu producerea de citokine (IL-6 și interferon gama), au fost implicate în respingerea grefei (Enzmann și
colab., 2000).
În schimb, în cazul xenogrefelor RPE la şobolan sau iepure se observă infiltrare cu macrofage şi distrugere
ulterioară (Gabrielian și colab., 1999;Carr și colab., 2009).
Şi citokinele (IL-1 și IL-6) au fost implicate într-o astfel de reacție (Abe și colab., 1999). Infiltrarea cu
limfocite (timice) nu a fost demonstrată în mai mult de 20 de studii publicate despre xenogrefe RPE, dar atât
ciclosporina A (CsA) cât şi tacrolimus (TCA), care se crede că suprimă respingerea mediată de celulele T, au
demonstrat o oarecare eficacitate în întârzierea rejectului xenogrefei la iepuri (Lai și colab, 2000; Wang și colab.,
2002).
Ciclosporina are concentrații plasmatice neregulate (necesitând astfel măsurători serice frecvente) şi nu
împiedică respingerea alo- sau xenogrefei de RPE (suspensie) la şobolani sau iepuri (Carr și colab., 2009; Lai și
colab., 2000), punând astfel sub semnul întrebării utilitatea sa.
Tacrolimus are mecanisme similare de acțiune, dar un risc mai mare de efecte secundare toxice. Într-o
încercare de a ameliora modificările negative retiniene, s-a ales să se administreze dexametazonă (DXP), deoarece
suprimă previzibil toate tipurile de leucocite periferice la iepure (Jeklova și colab., 2008). Efectul advers al DXP
observat asupra supraviețuirii xenogrefei a fost neaşteptat, dar probabil mediat prin receptorul glucocorticoid RPE,
care promovează proliferarea RPE (He și colab., 1994).
În prezent nu există un protocol ideal bazat pe dovezi privind imunosupresia pentru modelele de xenogrefă
hRPE, dar datele indică faptul că administrarea TCA intravitros permite supraviețuirea hRPE timp de cel puțin 1
lună, indicând că acesta ar putea fi utilizat pentru studii pe termen lung. Cert este faptul că implantarea unor
4
transportatori în SRS, cu sau fără hRPE, a dus la o retină degenerată imediat deasupra implantului. Cauza nu este
clară şi ar putea fi multifactorială.
În ciuda rapoartelor contradictorii (Szurman și colab., 2006), se crede că este puțin probabil ca bRD să
determine degenerarea retinei, pentru că s-a constatat că producerea unei vezicule similare, dar fără inserţia ulterioară
a unui transportor, determină leziuni minime la nivelul fotoreceptorilor şi o degenerare neglijabilă a retinei,
constatare susţinută şi de alţi cercetători (Ivert și colab., 2002).
Retina iepurelui este merangiotică, adică doar o parte a retinei interne este irigată de către vasele retiniene şi
este, prin urmare, mai dependentă de coriocapilare pentru toate necesităţile metabolice, comparativ cu speciile
holangiotice, care au o vascularizație retiniană ce irigă toată retina internă, aşa cum este la oameni şi la şobolani.
Atunci când s-a introdus un dispozitiv transportator de 1 mm grosime între fotoreceptori și RPE s-au distrus
legăturile intercelulare normale printr-o barieră nenaturală, proces care probabil a condus la degenerarea retinei
externe. Observații similare au fost făcute folosind implanturi cu cipuri retiniene, în care variante impermeabile ale
implanturilor au dus la atrofia straturilor de celule fotoreceptoare (Montezuma și colab., 2006).
Activitățile de cercetare actuale s-au concentrat pe identificarea unui transportator de celule adecvat care
imită mai îndeaproape relaţia preţioasă dintre stratul exterior al retinei şi coriocapilare.
Porozitatea transportatorilor de celule pare să joace un rol crucial în menținerea sănătăţii şi a stratificării
neuronale retiniene, astfel încât implantarea unui transportor PET acelular cu diametrul porilor de 3 mm a dus la
conservarea mai bună a straturilor retiniene exterioare comparativ cu un purtător PET cu un diametru al porilor mai
mic, de 0.4 mm. Oricum, înafară de un mic studiu făcut de Lu și colab. (2012), nu au fost evaluate sistematic
membranele de transport cu porozitate optimă pentru conservarea retinei şi care să permită cultura RPE. Un astfel de
studiu este important, deoarece hRPE xenogrefate în SRS pe transportatori PET au indus edem retinian iniţial urmat,
în decurs de o săptămână, de o atrofie dramatică a tuturor straturilor retiniene de deasupra (Stanzel şi colab., 2014),
rezultate reconfirmate recent (Kashani, 2016).
Un astfel de experiment a fost total diferit de controalele “carrier-only”, în care doar straturile retinei
exterioare au degenerat. “Topirea” retinei indusă de transplantul RPE (Del Priore și colab., 2001; Rezai și colab.,
2000) sau distrugerea fotoreceptorilor (Diniz și colab., 2013;. Zhang și Bok, 1998) a fost observată şi de alți
cercetători şi rămâne o problemă nerezolvată în xenotransplanturile RPE (da Cruz și colab., 2007). Multe lucrări
indică faptul că, mai sigur decât leziunile provocate prin traumatismul chirurgical, configurația implanturilor
subretiniene este cea care determină degenerarea retinei.
Optimizarea transportatorilor de celule RPE în sensul imitării mai bune a membranei fiziologice Bruch este
un subiect important şi este în curs de cercetare de către mulți alți cercetători (Liu și colab., 2013;. Hynes și Lavik,
2010;. Kearns și colab., 2012; Subrizi și colab., 2012). Reducerea degenerării retinei după grefarea hRPE în zona
subretiniană (SRS) la iepure va îmbunătăţi utilizarea iepurelui ca şi model ieftin de animal cu ochi mari.
Există o serie de date experimentale, deşi puţine, care sugerează că degenerarea retinei, după grefarea RPE
în zona subretiniană (SRS) la iepure şi la şobolan, s-ar datora apoptozei fotoreceptorilor, dar şi a celulelor de tip RPE
(Hao şi colab., 2011).
Studiile noastre au abordat administrarea de celule stem pluripotente induse din fibroblaste (iPSC) dintr-un
alt unghi: utilizarea acestora ca vehicule pentru administrarea locală şi ţintită de medicamente şi nanoparticule. Din
acest unghi, interesul major a fost reprezentat de apoptoza acestui tip celular şi de mecanismele moleculare care o
guvernează.
2.2. Scopul şi obiectivele Activitățile experimentale s-au concentrat pe identificarea unui transportator celular adecvat care să nu
altereze relaţia preţioasă dintre stratul exterior al retinei şi coriocapilare.
Astfel, primul obiectiv a fost reprezentat de obţinerea celulelor stem iPSC din fibroblastele gingivale de
şobolan prin creştere pe o matrice 3D (Reinnervate). Acestea au fost comparate cu celule stem mezenchimale,
obţinute din creasta iliacă de şobolan.
5
Apoptoza celor două tipuri celulare de mai sus a fost testată exhaustiv, având în vedere faptul că reprezintă
o etapă deosebită în toleranţa tisulară, la nivelul retinei, dar şi o modalitate de administrare ţintită a medicamentelor
şi nanoparticulelor la acest nivel, utilizând “sinuciderea celulară” ca modalitate terapeutică. Acesta a fost cel de al
doilea obiectiv major al studiului prezent.
Am utilizat fibroblastele gingivale de şobolan pentru obţinerea celulelor stem pluripotente induse pentru că
sunt mai uşor de obţinut şi la îndemână, având în vedere experienţa colectivului de îndrumare. Dezvoltarea
administrării celulelor modificate genetic va fi realizată în viitor tot pe şobolan ca model experimental.
Toate experimentele au fost avizate în prealabil de Comisia de Etică a Universităţii de Medicină şi Farmacie
“Grigore T. Popa” din Iaşi.
2.3. Materiale şi metode Obţinerea fibroblastelor s-a realizat prin explant din gingia de şobolan netratat. Şobolanii (200-250 g) în
număr de 5 au fost sacrificaţi, iar probele de gingie de la fiecare şobolan au fost mărunţite şi transferate în eprubete
cu ser fiziologic. Eprubetele cu gingia secţionatǎ au fost transferate în laborator pe pat de gheaţǎ. Probele de gingie
au fost mǎrunţite şi spǎlate de 6 ori cu PBS (phosphat buffered saline), dupǎ care au fost puse în plăcuţe Petri cu
mediu de culturǎ Mediu stem suplimentat cu 0,584g/l L-glutaminǎ , 4500mg/l glucozǎ, 10% FBS (fetal bovine
serum), 1% amestec antibiotic penicilinǎ/streptomicinǎ(0,06 mg / ml penicilină şi 0,1 mg / ml streptomicină sulfat),
1% amfotericinǎ B (Goriuc, 2011).
Probele au fost lǎsate între 2 şi 7 zile la 37°C şi 5 % CO2, dupǎ care gingia a fost îndepărtată iar
fibroblastele ataşate de peretele vasului au fost lǎsate sǎ se înmulţeascǎ în continuare în mediu proaspǎt la 37°C şi 5
% CO2 pentru încǎ 48-72 de ore. Când fibroblastele au ajuns la confluenţă de 90 % vasele au fost tripsinizate cu 2 ml
tripsină EDTA şi spǎlate prin centrifugare la 300xg timp de 5 minute, dupǎ care au fost resuspendate în 40 ml de
mediu stem suplimentat cu 0,584g/l L-glutaminǎ , 4500mg/l glucozǎ, 10% FBS ( fetal bovine serum), 1% antibiotic
penicilinǎ/streptomicinǎ(0,06 mg / ml penicilină şi 0,1 mg / ml streptomicină sulfat), 1% amfotericinǎ B. Mediul în
care se aflau celulele a fost agitat şi împǎrţit în 4 flascuri de culturǎ. În acest mediu au fost lǎsate pȃnǎ au ajuns la
confluenţa de 90% (aproximativ 7 zile). Dupǎ cele 7 zile toate vasele au fost tripsinizate, spǎlate prin centrifugare la
300xg timp de 5 minute şi apoi au fost resuspensionate în 1 ml de mediu şi numǎrate. Dupǎ numǎrare, celulele au
fost împǎrţite în mod egal în 4 loturi (flascuri) (aproximativ 100.000 de celule/flasc). În primul flasc celulele
au fost puse în mediu stem suplimentat cu 0,584g/l L-glutaminǎ, 4500mg/l glucozǎ, 10% FBS (fetal bovine serum),
1% antibiotic penicilinǎ/streptomicinǎ (0,06 mg / ml penicilină şi 0,1 mg / ml streptomicină sulfat), 1% amfotericinǎ
B şi a reprezentat lotul martor. Apoi toate flascurile au fost puse la 37°C şi 5 % CO2 pȃnǎ ajung la confluenţǎ. În
acest timp celulele au fost fotografiate la 7, 14 şi 30 de zile utilizând un microscop cu contrast de fază Nikon Eclipse
TE300 şi softul aferent. Fotografiile au fost realizate cu diferite obiective: 4x, 10x şi 20x.
Pentru obţinerea iPSC din fibroblastele gingivale am utilizat tehnica descrisă de Long şi colab. (2015),
respectiv un amestec chimic format din 10 µM 5-bromo-2’-deoxiuridină {5-Bromo-1-(2-deoxi-β-D-
ribofuranozil)uracil}, 10 µM CHIR99021 {6-[[2-[[4-(2,4-Dicloro-fenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-
pirimidinil]amino]ethil]amino]-3-piridincarbonitril}, 10 µM Repsox {2-[3-(6-Metil-2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-1,5-
naftiridin} şi 50 µM forskolin {7β-Acetoxi-8,13-epoxi-1α,6β,9α-trihidroxilabd-14-en-11-onă}. În plus, am utilizat un
agonist al receptorului acidului retinoic, AM580, în concentraţie de 100 nM, cu un randament mărit al procesului de
aproximativ 20 ori, în acord cu tehnica descrisă anterior (Wang şi colab., 2011).
Pentru evidenţierea transformării de tip iPSC am utilizat anticorpi specifici anti-fosfatază alcalină, anti-
Nanog şi anti-SSEA1 şi citometrie de flux (Long şi colab., 2015).
Atât celulele iPSC, induse din fibroblastele gingivale de şobolan, cât şi celulele mezenchimale din creasta
iliacă de şobolan, au fost separate înainte de experiment prin citometrie de flux selectivă, utilizând anticorpi selectivi
marcaţi cu fluoresceină.
În decursul dezvoltării, ambele linii celulare au prezentat caracteristici morfologice de celule embrionare în
cultură, demonstrând încă odată apartenenţa la acest tip celular. Totuşi, celulele stem mezenchimale, obţinute din
creasta iliacă de şobolan au fost mult mai puţin stabile, numărul de pasaje posibile fiind foarte redus.
6
Pentru obţinerea celulelor stem mezenchimale am utilizat măduva osoasă obţinută prin puncţia crestei iliace
la şobolani Wistar de 200-250 g, sub anestezie. Pe scurt, fragmentele de măduvă au fost suspendate în mediu esenţial
minim α (α-MEM), centrifugate şi depozitul celular resuspendat în α-MEM cu 10 % FBS, Celulele nucleate au fost
însămânţate pe vase Petri de 150 mm diametru şi incubate la 37℃ timp de 6 zile. Apoi, celulele neaderente au fost
îndepărtate şi startul de celule aderente a fost reincubat în mediu complet până la atingerea unei semi-
confluenţe. Celulele au fost apoi tripsinizate cu 0.25% tripsină-EDTA, resuspendate în mediu complet,
reînsămânţate la o densitate de 8.000 cells/cm2 şi incubate pentru 3 zile. Monostraturile de celule rezultate, denumite
celule stem mezenchimale de şobolan, au fost tripsinizate şi celulele rezultate îngheţate sau utilizate pentru
experimente (Seo şi colab., 2009).
Partea experimentală a constat în studierea şi analizarea efectelor unor diferiţi inductori ai morţii celulare
asupra celulelor de tip iPSC şi stem mezenchimale, utilizând tehnici de imunofluorescenţă, reprezentate în principal
de citometria de flux.
Studiul experimental a fost realizat în două centre de cercetare: laboratorul din cadrul Disciplinei de
Fiziopatologie, U.M.F. „Grigore T. Popa” Iaşi şi laboratorul din cadrul Disciplinei de Imunologie şi Alergologie,
U.M.F. „Grigore T. Popa” Iaşi.
Datele obţinute au fost prelucrate statistic utilizând metode fiabile precum testul One Way ANOVA
(completată cu metoda Student-Newman-Keuls), fapt care mi-a permis o interpretare obiectivă şi o analiză pertinentă
a rezultatelor.
2.3.1. Efectele ionomicinei asupra potenţialului transmembranar mitocondrial în
condiţiile supraîncărcării citosolice cu Ca2+
Experimentele au fost realizate pe celule IPSC şi stem mezenchimale, menţinute în mediu stem, suplimentat
cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 g/ml streptomicină, 10 % FBS decomplementat, în incubator, la
37oC şi atmosferă cu 5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de
aproximativ 5 x 105/ml înainte de tratamente.
Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +
Streptomicină 100 µg/ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), ionomicină 1mM (Sigma-Aldrich),
CaCl2 250 mM, valinomicină 1 mM (Sigma-Aldrich), staurosporină 1mM (Sigma-Aldrich), JC1 5 mg/ml (Sigma-
Aldrich), PBS (Sigma-Aldrich).
După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104 celule/ml
prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg /ml
streptomicină, 10% FBS).
Celulele au fost incubate cu ionomicină 5 µM în prezenţă de CaCl2 2,5 mM, în mediu stem complet, la 37ºC
şi atmosferă cu 5% CO2, pe o perioadă de timp de până la 24 h. Celulele IPSC, mezenchimale şi de control nu au
primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Verificarea funcţionalităţii fluoroforului s-a realizat prin incubarea unei suspensii de celule IPSC cu 10 µM
valinomicină, un ionofor de K+, care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial, la 37ºC şi
atmosferă cu 5% CO2.
Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei
suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubarea în prealabil timp de 20 min la
37ºC cu 5 µg/ml JC-1, un marker selectiv pentru potenţialul membranar mitocondrial. După spălare cu PBS de 2 ori
şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate la
citometrul de flux Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM
. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V,
FL2 310 V, FL1/FL2 - 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu
ajutorul softului BD CellQuest Pro Software.
2.3.2. Efectele Ciclosporinei A asupra potenţialului membranar mitocondrial
Experimentele au fost realizate pe celule IPSC şi stem mezenchimale. Celulele au fost menţinute în mediu
stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% ser bovin fetal
7
inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h,
celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml înainte de tratament.
Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +
Streptomicină 100 g/ml, FBS (Sigma-Aldrich), Ciclosporină A (CsA) 100µM, valinomicină 1 mM (Sigma-
Aldrich), JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenz-imidazol-carbocyanine iodide) 5 mg/ml (Sigma-Aldrich),
PBS (Sigma-Aldrich).
După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104
celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,
100 g/ml streptomicină, 10% FBS).
O parte din celule au fost incubate cu CsA 1 µM în mediu complet timp de 24 h, la 37oC şi atmosferă cu 5%
CO2. Celulele IPSC de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37oC şi
atmosferă cu 5% CO2.
De asemenea, s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o
parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM
valinomicină, un ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.
Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei
suspensii de celule IPSC şi stem mezenchimale cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la
37oC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele
martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux
Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM
Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2 -
4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo
7.6.1.
2.3.3. Efectele Citosporonei B asupra potenţialului membranar mitocondrial
Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină,
100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu
5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml
înainte de tratament.
Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +
Streptomicină 100 g/ml, FBS (Sigma-Aldrich), Ciclosporină B (CnB) 1mM Sigma-Aldrich, valinomicină 1 mM
(Sigma-Aldrich), JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazol-carbocyanine iodide) 5 mg/ml (Sigma-
Aldrich), PBS (Sigma-Aldrich).
După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104
celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,
100 g/ml streptomicină, 10% FBS).
O parte din celule au fost incubate cu CnB 50 µM în mediu complet timp de 24 h, la 37oC şi atmosferă cu
5% CO2. Celulele IPSC de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37oC şi
atmosferă cu 5% CO2.
De asemenea, s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o
parte din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM
valinomicină, un ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.
Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei
suspensii de celule IPSC şi stem mezenchimale cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la
37oC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele
martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux
Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM
Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2 -
4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo
7.6.1.
8
2.3.4. Efectele Citosporonei B în prezenţa CsA asupra potenţialului membranar mitocondrial
Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină,
100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu
5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml
înainte de tratament.
Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +
Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), Citosporonă B 1 mM (Sigma-Aldrich),
CsA 100 µM, CaCl2 250 mM, valinomicină 1 mM (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich), PBS (Sigma-
Aldrich).
După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104
celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,
100 µg/ml streptomicină, 10% FBS).
Pentru a evalua efectele citosporonei B în prezenţa CsA asupra potenţialului membranar mitocondrial, o
parte din celule au fost incubate cu 1 µM CsA şi 10µM, 25 µM, respectiv 50 µM citosporonă B, în mediu complet
timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2. De asemenea, o parte din celule au fost tratate doar cu citosporonă B,
10 µM, 25 µM şi respectiv 50 µM, timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură.
Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu
stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte
din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un
ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.
Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei
suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h şi respectiv 48h, după incubare în prealabil timp
de 20 min la 37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi
celulele martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de
flux Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM
. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V,
FL1/FL2 - 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului
FlowJo 7.6.1.
2.3.5. Efectele Tyrphostin AG 1295 asupra potenţialului membranar mitocondrial
Tyrphostin AG1295 este un inhibitor selectiv al tirozin-kinazei de la nivelul receptorului factorului de
creştere derivat din plachete (PDGF).
Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină,
100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu
5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml
înainte de tratament.
Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +
Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), AG 1295 (6,7-Dimethyl-2-phenylquino
xaline) în concentratii 1µm/ml, respectiv 5µm/ml, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich).
După centrifugare, suspensia de celule IPSC a fost adusă la densitatea de 104 celule/ml prin adaos de mediu
stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10%
FBS).
Pentru a evalua efectele Tyrphostin AG1295 asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din
celule au fost incubate cu 10 µl/ml AG1295 1mM, respectiv 10 µl/ml AG1295 5mM în mediu complet timp de 24 h,
la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Celulele IPSC de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu stem complet, la 37ºC şi
atmosferă cu 5% CO2.
9
De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte
din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un
ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.
Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei
suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la
37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele
martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux
Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM
. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2
- 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo
7.6.1.
2.3.6. Efectele Tyrphostin AG 494 asupra potenţialului membranar mitocondrial AG-494 este un
membru al familiei inhibitorilor de tirozin-kinază și este un inhibitor puternic al autofosforilării receptorilor EGF
(IC50 = 1,2 pM) și al creșterii celulare dependentă de EGF (IC50 = 6 pM). Sinonime: N-Phenyl-3,4-
dihydroxybenzylidene-cyanoacetamide, Tyrphostin B48 (Sigma-Aldrich).
Celulele IPSC au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,
100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2. Mediul de
cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml înainte de tratament.
Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +
Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), AG 494 (Sigma Aldrich) in concentratii
1µm/ml, respectiv 5µm/ml , PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich).
După centrifugare, suspensia de celule IPSC a fost adusă la densitatea de 104 celule/ml prin adaos de mediu
stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10%
FBS).
Pentru a evalua efectele Tyrphostin AG494 asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din celule
au fost incubate cu 10 µl/ml AG494 1mM, respectiv 10 µl/ml AG494 5mM în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC
şi atmosferă cu 5% CO2.
Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu
stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte
din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un
ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.
Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei
suspensii de celule IPSC şi stem mezenchimale cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la
37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele
martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux
Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM
. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2
- 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo
7.6.1.
2.3.7. Evidenţierea morţii celulare induse de deltametrin (DMT) în celule de tip IPSC
Deltametrinul (DMT) face parte din categoria piretrinelor semisintetice de tip II care acționează ca un
inhibitor puternic al calcineurinei (protein fosfataza 2B). Această acţiune inhibitoare are ca efect hiperexcitabilitatea
celulară prin rămânerea canalelor de calciu deschise pentru o perioadă extinsă de timp, ceea ce permite ionilor de
Ca2+
să intre în celulă.
Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină,
100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu
5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml
înainte de tratament.
10
Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +
Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), deltamethryn (Sigma Aldrich) 10
µm/ml, citosporona B 50 µL/ML, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich).
După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104
celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,
100 µg/ml streptomicină, 10% FBS).
Pentru a evalua efectele Deltametrin (DMT) asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din
celule au fost incubate cu 10 µl/ml DMT, respectiv 10 µl/ml DMT + 50 µL/ml CsB în mediu complet timp de 24 h,
la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu
stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte
din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un
ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.
Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei
suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mM timp de 24-48 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la
37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele
martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux
Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM
. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2
- 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo
7.6.1.
2.3.8. Efectele Alpidem (ALP) asupra potenţialului membranar mitocondrial
Alpidem, cunoscut şi sub denumirea de 2-3-cloro-8-(4-clorofenil)-1,7-diazabiciclo[4.3.0]nona-2,4,6,8-
tetraen-9-yl]-N,N-dipropil-acetamide (Sigma-Aldrich) este un antagonist puternic al receptorilor periferici de
benzodiazepine (PBR), care este situat pe membrana mitocondrială exterioară și interacționează cu porii de tranziție
a permeabilității mitocondriilor (MPT). Alpidem este un medicament anxiolitic din familia imidazopiridinelor.
Alpidem acționează selectiv asupra receptorilor de subtip α3 și în mai mică măsură, la subtipul α1 (Kd de 0.33nM și
respectiv 1.67nM), al receptorului benzodiazepinic.
Celulele IPSC şi stem mezenchimale au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină,
100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu
5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml
înainte de tratament.
Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +
Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), IL-3 murină recombinantă (Sigma-
Aldrich), alpidem (Sigma Aldrich) 10 µm/ml, citosporona B 50 µL/ML, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml
(Sigma-Aldrich.
După centrifugare, suspensia de celule IPSC a fost adusă la densitatea de 104 celule/ml prin adaos de mediu
stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10%
FBS).
Pentru a evalua efectele Alpidem (ALP) asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din celule au
fost incubate cu 10 µl/ml ALP, respectiv 10 µl/ml ALP + 50 µL/ml CsB în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC şi
atmosferă cu 5% CO2.
Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu
stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte
din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un
ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.
11
Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei
suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mM timp de 24-48 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la
37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele
martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux
Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM
. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2
- 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo
7.6.1.
2.3.9. Efectele DCU asupra potenţialului membranar mitocondrial
Celulele IPSC au fost menţinute în mediu stem, suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,
100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2. Mediul de
cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o densitate de aproximativ 5 x 105/ml înainte de tratament.
Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +
Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), DCU (Sigma Aldrich) 10 µm/ml
,citosporonaB 50 µL/ML, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich).
După centrifugare, suspensia de celule IPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104
celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,
100 µg/ml streptomicină, 10% FBS).
Pentru a evalua efectele DCU asupra potenţialului membranar mitocondrial, o parte din celule au fost
incubate cu 10 µl/ml DCU, respectiv 10 µl/ml DCU + 50 µL/ml CsB în mediu complet timp de 24 h, la 37ºC şi
atmosferă cu 5% CO2.
Celulele IPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu
stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte
din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un
ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.
Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei
suspensii de celule IPSC cu KCl 137 mM timp de 24-48 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la
37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele
martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux
Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM
. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2
- 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo
7.6.1.
2.3.10. Efectele acidului 9 cis retinoic (9-R) asupra potenţialului membranar mitocondrial
Acidul 9-cis-retinoic (9-R) este un analog de vitamină A, care inhibă proliferarea celulară și induce
diferențierea celulară. Acidul 9-cis-retinoic este un inhibitor al COX-2 și un activator de RAR alfa, RAR beta, RAR
gamma și RXR.
Am utilizat culturi celulare de tip iPSC şi stem mezenchimale care au fost menţinute în mediu stem,
suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 10% FBS inactivat prin căldură, în
incubator la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la 48 h, celulele fiind menţinute la o
densitate de aproximativ 5 x 105/ml înainte de tratament.
Reactivi: Mediu stem + 2 mM L-glutamină (Sigma-Aldrich), soluţie de Penicilină 100 U/ml +
Streptomicină 100 µg /ml (Sigma-Aldrich), ser bovin fetal (Sigma-Aldrich), acid 9-cis retinoic (Sigma-Aldrich)
10µl/ml, PBS (Sigma-Aldrich), JC-1 5 mg/ml (Sigma-Aldrich).
După centrifugare, suspensia de celule iPSC şi stem mezenchimale a fost adusă la densitatea de 104
celule/ml prin adaos de mediu stem complet (Mediu stem suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină,
100 µg/ml streptomicină, 10% FBS).
12
Pentru a evalua efectele acidului 9-cis retinoic (9-R) asupra potenţialului membranar mitocondrial, am
utilizat solutii de lucru de 9-R 10µL/ml . Au fost pregatite probe din fiecare solutie cu 10 µl/ml în mediu complet
timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Celulele iPSC şi stem mezenchimale de control nu au primit nici un tratament, fiind menţinute în mediu
stem complet, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
De asemenea s-a realizat şi un control pozitiv pentru verificarea funcţionalităţii fluoroforului. Astfel, o parte
din celule au fost incubate timp de 24 h, în aceleaşi condiţii de temperatură şi atmosferă, cu 10 µM valinomicină, un
ionofor de K+ care determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial.
Martorul pozitiv pentru scăderea potenţialului transmembranar mitocondrial s-a realizat prin incubarea unei
suspensii de celule iPSC cu KCl 137 mM timp de 24 h, la 37ºC şi atmosferă cu 5% CO2.
Analiza prin metoda citofluorometrică s-a efectuat la 24 h, după incubare în prealabil timp de 20 min la
37ºC cu 5 µg/ml JC-1. După spălare cu PBS de 2 ori şi centrifugare, celulele tratate, controlul negativ şi celulele
martor au fost resuspendate în 1 ml PBS şi analizate prin metoda citofluorimetrică, utilizând un citometru de flux
Becton Dickinson de tip FACSCaliburTM
. Setările folosite pentru achiziţie au fost: FL1 360 V, FL2 310 V, FL1/FL2
- 4,3%, FL2/FL1 - 57%, 20.000 de evenimente, laser 488 nm. Datele au fost prelucrate cu ajutorul softului FlowJo
7.6.1.
2.4. Rezultate Pentru detectarea variaţiilor potenţialului electric transmembranar (ΔΨ) la nivel de celulă sau de
mitocondrie am utilizat cationul lipofilic iodură de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolil-carbocianină
(numit simplu JC-1). Această moleculă este capabilă să pătrundă selectiv în membrana mitocondriilor şi îşi modifică
reversibil culoarea de la verde la oranj, odată cu creşterea ΔΨm peste valori de aproximativ 80-100 mV. Această
proprietate se datorează formării reversibile a agregatelor JC-1 în condiţiile polarizării membranei mitocondriale,
care determină modificarea emisiei luminii de la 530 nm (emisia JC-1 sub formă de monomer) la 590 nm (emisia
JC-1 sub formă de agregate), când fluoroforul este excitat la 490 nm. Pe măsură ce membrana mitocondrială devine
mai polarizată, culoarea fluoroforului se modifică de la verde la oranj. Ambele culori pot fi detectate cu ajutorul
filtrelor montate pe majoritatea citometrelor de flux, astfel că emisia verde (JC-1 monomer) poate fi analizată în
canalul de fluorescenţă 1 (FL1), iar emisia oranj (JC-1 agregate), în FL2. Avantajul folosirii JC-1 este că analiza
probei se poate face atât calitativ, prin observarea modificării fluorescenţei de la verde la oranj, cât şi cantitativ,
considerând intensitatea fluorescenţei pure detectate atât în FL1, cât şi în FL2 (Cossarizza şi Salvioli, 2001).
În cazul experimentelor prezente, imaginile obţinute la analizarea citofluorimetrică a martorului JC-1 pentru
celulele iPSC, respectiv stem mezenchimale, sunt prezentate în figura 2.1. şi figura 2.2.
Figura 2.1. FACS reprezentativ pentru distribuţia raportului agregate/monomer pentru martorul JC-1 la 24 h
pentru celulele iPSC
13
Figura 2.2. FACS reprezentativ pentru distribuţia raportului agregate/monomer pentru martorul JC-1 la 24 h
pentru celulele stem mezenchimale
Figura 2.3. Histogramele de fluorescenţă pentru martorul JC-1 la 24 h pentru celulele iPSC
Figura 2.4. Histogramele de fluorescenţă pentru martorul JC-1 pentru celulele stem mezenchimale
14
Analiza imaginilor obţinute prin citometrie de flux a probelor martor pentru JC-1 la 24 h evidenţiază
predominanţa clară a agregatelor de JC-1 faţă de forma monomerică, reflectând predominanţa celulelor cu
mitocondrii polarizate.
Rolul controlului pozitiv este de verificare a funcţionalităţii fluoroforului şi de asemenea de a putea stabili
corect setările citometrului. Prin incubarea celulelor cu 10 µM valinomicină, un ionofor de K+ care exercită un efect
toxic şi determină prăbuşirea potenţialului membranar mitocondrial, am obţinut o populaţie de celule în care aproape
toate mitocondriile erau depolarizate, indicând cadranul în care se vor regăsi ulterior celulele cu caracteristici
similare.
Figura 2.5. Control pozitiv cu valinomicină la 24 h pentru celulele iPSC
Figura 2.6. Control pozitiv cu valinomicină la 24 h pentru celulele stem mezenchimale
Analiza imaginilor achiziţionate evidenţiază scăderea marcată a populaţiei de celule cu mitocondrii
polarizate la 24 h din proba martor pozitiv comparativ cu martorul de JC-1, ca urmare a acţiunii KCl 137 mM, fiind
cunoscut faptul că KCl induce reducerea potenţialului transmembranar mitocondrial, mediată prin depolarizarea
membranei mitocondriale atât pentru celulele iPSC, cât şi pentru celulele stem mezenchimale.
15
Figura 2.7. Histogramele de fluorescenţă pentru controlul cu valinomicină la 24 h pentru celulele iPSC
Figura 2.8. Histogramele de fluorescenţă pentru controlul cu valinomicină la 24 h pentru celulele stem
mezenchimale
Figura 2.9. Distribuţia raportului agregate/monomer după tratarea celulelor cu KCl 137 mM la 24 h pentru
celulele iPSC
16
Figura 2.10. Distribuţia raportului agregate/monomer după tratarea celulelor cu KCl 137 mM la 24 h pentru
celulele stem mezenchimale
Figura 2.11. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele tratate cu KCl 137 mM la 24 h pentru celulele
iPSC
Figura 2.12. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele tratate cu KCl 137 mM la 24 h pentru celulele
stem mezenchimale
17
Figura 2.13. Efectele ionomicinei 5 µM asupra ΔΨm în condiţiile supraîncărcării citosolice cu Ca
2+ la 24 h
pentru celulele iPSC
Figura 2.14. Efectele ionomicinei 5 µM asupra ΔΨm în condiţiile supraîncărcării citosolice cu Ca
2+ la 24 h
pentru celulele stem mezenchimale
Figura 2.15. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele tratate cu ionomicină 5 µM la 24 h pentru celulele
iPSC
18
Figura 2.16. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele tratate cu ionomicină 5 µM la 24 h pentru celulele
stem mezenchimale
Figura 2.17. Efectele Citosporonei B (50 µM) asupra ΔΨm în condiţiile asocierii tratamentului cu
Ciclosporină A (1 µM) la 24 h pentru celulele iPSC
Figura 2.18. Efectele Citosporonei B (50 µM) asupra ΔΨm în condiţiile asocierii tratamentului cu
Ciclosporină A (1 µM) la 24 h pentru celulele stem mezenchimale
19
Figura 2.19. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu Citosporonă B (50 µM) în
prezenţa Ciclosporinei A (1 µM) la 24 h
Figura 2.20. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu Citosporonă B (50
µM) în prezenţa Ciclosporinei A (1 µM) la 24 h
Figura 2.21. Efectele ciclosporinei A (CsA) 1 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h
pentru celulele iPSC
20
Figura 2.22. Efectele ciclosporinei A (CsA) 1 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h
pentru celulele stem mezenchimale
Figura 2.23. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu CsA 1 µM la 24 h
Figura 2.24. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu CsA 1 µM la 24 h
21
Figura 2.25. Efectele Citosporonei B (CnB) 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h
pentru celulele iPSC
Figura 2.26. Efectele Citosporonei B (CnB) 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h
pentru celulele stem mezenchimale
Figura 2.27. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu CnB 50 µM în prezenţa Ca2+
la 24
h
22
Figura 2.28. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu CnB 50 µM în
prezenţa Ca2+
la 24 h
Figura 2.29. Efectele Tyrphostin AG 1295 10 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h
pentru celulele iPSC
Figura 2.30. Efectele Tyrphostin AG 1295 10 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h
pentru celulele stem mezenchimale
23
Figura 2.31. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu Tyrphostin AG 1295 10 µM 24 h
Figura 2.32. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu Tyrphostin AG
1295 10 µM 24 h
Figura 2.33. Efectele Tyrphostin AG 494 10 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h
pentru celulele iPSC
24
Figura 2.34. Efectele Tyrphostin AG 494 10 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h
pentru celulele stem mezenchimale
Figura 2.35. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu Tyrphostin AG 494 10 µM 24 h
Figura 2.36. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu Tyrphostin AG 494
10 µM 24 h
25
Figura 2.37. Efectele DMT 1 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la
24 h pentru celulele iPSC
Figura 2.38. Efectele DMT 1 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la
24 h pentru celulele stem mezenchimale
Figura 2.39. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu DMT 1 µM şi Citosporonă B 50
µM 24 h
26
Figura 2.40. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu DMT 1 µM şi
Citosporonă B 50 µM 24 h
Figura 2.41. Efectele DMT 1 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele
iPSC
Figura 2.42. Efectele DMT 1 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele
stem mezenchimale
27
Figura 2.43. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu DMT 1 µM 24 h
Figura 2.44. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu DMT 1 µM 24 h
Figura 2.45. Efectele ALP 1 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la
24 h pentru celulele iPSC
28
Figura 2.46. Efectele ALP 1 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la
24 h pentru celulele stem mezenchimale
Figura 2.47. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu ALP 1 µM şi Citosporonă B 50
µM 24 h
Figura 2.48. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu ALP 1 µM şi
Citosporonă B 50 µM 24 h
29
Figura 2.49. Efectele ALP 1 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele iPSC
Figura 2.50. Efectele ALP 1 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem
mezenchimale
Figura 2.51. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu ALP 1 µM 24 h
30
Figura 2.52. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu ALP 1 µM 24 h
Figura 2.53. Efectele DCU 1 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la
24 h pentru celulele iPSC
Figura 2.54. Efectele DCU 1 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului membranar mitocondrial la
24 h pentru celulele stem mezenchimale
31
Figura 2.55. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu DCU 1 µM şi Citosporonă B 50
µM 24 h
Figura 2.56. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu DCU 1 µM şi
Citosporonă B 50 µM 24 h
Figura 2.57. Efectele acidului 9-cis retinoic 10 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului
membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele iPSC
32
Figura 2.58. Efectele acidului 9-cis retinoic 10 µM şi Citosporonă B 50 µM asupra potenţialului
membranar mitocondrial la 24 h pentru celulele stem mezenchimale
Figura 2.59. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele iPSC tratate cu acid 9-cisretinoiuc 10 µM şi
Citosporonă B 50 µM 24 h
Figura 2.60. Histogramele de fluorescenţă pentru celulele stem mezenchimale tratate cu acid 9-cisretinoiuc
10 µM şi Citosporonă B 50 µM 24 h
33
CONCLUZII FINALE
Activitățile experimentale s-au concentrat pe identificarea unui transportator celular adecvat la nivelul
ochiului, care să nu altereze relaţia preţioasă dintre stratul exterior al retinei şi coriocapilare.
Astfel, primul obiectiv a fost reprezentat de obţinerea celulelor stem iPSC din fibroblastele gingivale de
şobolan prin creştere pe o matrice 3D (Reinnervate). Acestea au fost comparate cu celule stem mezenchimale,
obţinute din creasta iliacă de şobolan.
Apoptoza celor două tipuri celulare de mai sus a fost testată exhaustiv, având în vedere faptul că reprezintă
o etapă deosebită în toleranţa tisulară, la nivelul retinei, dar şi o modalitate de administrare ţintită a medicamentelor
şi nanoparticulelor la acest nivel, utilizând “sinuciderea celulară” ca modalitate terapeutică. Acesta a fost cel de al
doilea obiectiv major al studiului prezent.
Am utilizat fibroblastele gingivale de şobolan pentru obţinerea celulelor stem pluripotente induse pentru că
sunt mai uşor de obţinut şi la îndemână, având în vedere experienţa colectivului de îndrumare. Dezvoltarea
administrării celulelor modificate genetic va fi realizată în viitor tot pe şobolan ca model experimental.
Pentru obţinerea iPSC din fibroblastele gingivale am utilizat o tehnică simplă, fără vectori virali, respectiv
un amestec chimic format din 10 µM 5-bromo-2’-deoxiuridină, 10 µM CHIR99021, 10 µM Repsox şi 50 µM
forskolin. În plus, am utilizat un agonist al receptorului acidului retinoic, AM580, în concentraţie de 100 nM, cu un
randament mărit al procesului de aproximativ 20 ori.
Pentru evidenţierea transformării de tip iPSC am utilizat anticorpi specifici anti-fosfatază alcalină, anti-
Nanog şi anti-SSEA1 şi citometria de flux.
Atât celulele iPSC, induse din fibroblastele gingivale de şobolan, cât şi celulele mezenchimale din creasta
iliacă de şobolan, au fost separate înainte de experiment prin citometrie de flux selectivă, utilizând anticorpi selectivi
marcaţi cu fluoresceină.
În decursul dezvoltării, ambele linii celulare au prezentat caracteristici morfologice de celule embrionare în
cultură, demonstrând încă o dată apartenenţa la acest tip celular. Totuşi, celulele stem mezenchimale, obţinute din
creasta iliacă de şobolan au fost mult mai puţin stabile, numărul de pasaje posibile fiind foarte redus.
În ceea ce priveşte apoptoza indusă experimental au existat diferenţe semnificative între celulele iPSC şi
celulele stem mezenchimale.
În primul rând, pentru ambele tipuri celulare, apoptoza indusă de Citosporona B în prezenţa Ciclosporinei A
a fost evidentă, dar mult mai importantă pentru celulele de tip iPSC. Acest lucru demonstrează implicarea Nur77 în
apoptoză în prezenţa blocării calcineurinei.
În prezenţa Tyrphostin AG 494, DMT şi acidului 9-cis-retinoic mecanismele apoptotice se declanşează
pentru celulele de tip iPSC, nu şi pentru cele stem mezenchimale, demonstrând implicarea unor mecanisme specifice:
inhibarea calcineurinei, inhibarea epoxid hidrolazei importante în biosinteza mediatorilor inflamaţiei şi a
mecanismelor ce induc diferenţierea celulară.
Următoarea etapă va fi reprezentată de o nouă conversie a celulelor iPSC către derivate ale epiteliului
retinian şi aplicarea acestora în ţintirea terapeutică.
34
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA
ABE, T., TAKEDA, Y., YAMADA, K., AKAISHI, K., TOMITA, H., SATO, M. & TAMAI, M. 1999.
Cytokine gene expression after subretinal transplantation. Tohoku J Exp Med, 189, 179-89.
AGRAWAL, V., TOTTEY, S., JOHNSON, S. A., FREUND, J. M., SIU, B. F. & BADYLAK, S. F. 2011.
Recruitment of progenitor cells by an extracellular matrix cryptic peptide in a mouse model of digit amputation.
Tissue Eng Part A, 17, 2435-43.
AGREN, A., EDGREN, G., AMBROSIO, D., GRYFELT, G., OSTLUND, A. & WIKMAN, A. 2016.
Haemostasis monitored in stored red blood cells, plasma and platelet concentrates in the proportion of 4 : 4 : 1
diluted with crystalloids and colloids. Blood Coagul Fibrinolysis, 27, 334-9.
BABIZHAYEV, M. A. & YEGOROV, Y. E. 2015. Tissue formation and tissue engineering through host
cell recruitment or a potential injectable cell-based biocomposite with replicative potential: Molecular mechanisms
controlling cellular senescence and the involvement of controlled transient telomerase activation therapies. J Biomed
Mater Res A, 103, 3993-4023.
BAKER, D. E., HARRISON, N. J., MALTBY, E., SMITH, K., MOORE, H. D., SHAW, P. J., HEATH, P.
R., HOLDEN, H. & ANDREWS, P. W. 2007. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis
in vivo. Nat Biotechnol, 25, 207-15.
BARRITT, P. W. 1992. General practitioners and asthma. Thorax, 47, 669-70.
BARRY, P. J., RONAN, N. & PLANT, B. J. 2015. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
modulators: the end of the beginning. Semin Respir Crit Care Med, 36, 287-98.
BELIZARIO, J. E., ALVES, J., OCCHIUCCI, J. M., GARAY-MALPARTIDA, M. & SESSO, A. 2007. A
mechanistic view of mitochondrial death decision pores. Braz J Med Biol Res, 40, 1011-24.
BENEDIKT, J., INYUSHIN, M., KUCHERYAVYKH, Y. V., RIVERA, Y., KUCHERYAVYKH, L. Y.,
NICHOLS, C. G., EATON, M. J. & SKATCHKOV, S. N. 2012. Intracellular polyamines enhance astrocytic
coupling. Neuroreport, 23, 1021-5.
BERKOWITZ, B. A., ROBERTS, R., STEMMLER, A., LUAN, H. & GRADIANU, M. 2007. Impaired
apparent ion demand in experimental diabetic retinopathy: correction by lipoic Acid. Invest Ophthalmol Vis Sci, 48,
4753-8.
CAILLET-BOUDIN, M. L., BUEE, L., SERGEANT, N. & LEFEBVRE, B. 2015. Regulation of human
MAPT gene expression. Mol Neurodegener, 10, 28.
CALDWELL, J. L., SMITH, C. E., TAYLOR, R. F., KITMITTO, A., EISNER, D. A., DIBB, K. M. &
TRAFFORD, A. W. 2014. Dependence of cardiac transverse tubules on the BAR domain protein amphiphysin II
(BIN-1). Circ Res, 115, 986-96.
CALLOE, K., DI DIEGO, J. M., HANSEN, R. S., NAGLE, S. A., TREAT, J. A. & CORDEIRO, J. M.
2016. A dual potassium channel activator improves repolarization reserve and normalizes ventricular action
potentials. Biochem Pharmacol, 108, 36-46.
CAO, Z., LI, X., ZOU, X., GREENWOOD, M., GERWICK, W. H. & MURRAY, T. F. 2015. Involvement
of JNK and caspase activation in hoiamide A-induced neurotoxicity in neocortical neurons. Mar Drugs, 13, 903-19.
CAPPELLARI, O., BENEDETTI, S., INNOCENZI, A., TEDESCO, F. S., MORENO-FORTUNY, A.,
UGARTE, G., LAMPUGNANI, M. G., MESSINA, G. & COSSU, G. 2013. Dll4 and PDGF-BB convert committed
skeletal myoblasts to pericytes without erasing their myogenic memory. Dev Cell, 24, 586-99.
CHUNG, S., KIM, I. H., LEE, D., PARK, K., KIM, J. Y., LEE, Y. K., KIM, E. J., LEE, H. W., CHOI, J. S.,
SON, G. H., SUN, W., SHIN, K. S. & KIM, H. 2016. The role of inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A in
regulating emotional behavior and amygdala function. Sci Rep, 6, 23757.
CHWEE, J. Y., KHATOO, M., TAN, N. Y. & GASSER, S. 2016. Apoptotic Cells Release IL1 Receptor
Antagonist in Response to Genotoxic Stress. Cancer Immunol Res, 4, 294-302.
35
COLWELL, A. S., LONGAKER, M. T. & LORENZ, H. P. 2003. Fetal wound healing. Front Biosci, 8,
s1240-8.
CORRADI, V., VERGANI, P. & TIELEMAN, D. P. 2015. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance
Regulator (CFTR): CLOSED AND OPEN STATE CHANNEL MODELS. J Biol Chem, 290, 22891-906.
CORREA, F., BUELNA-CHONTAL, M., CHAGOYA, V., GARCIA-RIVAS, G., VIGUERAS, R. M.,
PEDRAZA-CHAVERRI, J., GARCIA-NINO, W. R., HERNANDEZ-PANDO, R., LEON-CONTRERAS, J. C. &
ZAZUETA, C. 2015. Inhibition of the nitric oxide/cyclic guanosine monophosphate pathway limited the
cardioprotective effect of post-conditioning in hearts with apical myocardial infarction. Eur J Pharmacol, 765, 472-
81.
CORVOL, H., THOMPSON, K. E., TABARY, O., LE ROUZIC, P. & GUILLOT, L. 2016. Translating the
genetics of cystic fibrosis to personalized medicine. Transl Res, 168, 40-9.
DONOHUE, P. J., ALBERTS, G. F., HAMPTON, B. S. & WINKLES, J. A. 1994. A delayed-early gene
activated by fibroblast growth factor-1 encodes a protein related to aldose reductase. J Biol Chem, 269, 8604-9.
DOZMOROV, M., WU, W., CHAKRABARTY, K., BOOTH, J. L., HURST, R. E., COGGESHALL, K. M.
& METCALF, J. P. 2009. Gene expression profiling of human alveolar macrophages infected by B. anthracis spores
demonstrates TNF-alpha and NF-kappab are key components of the innate immune response to the pathogen. BMC
Infect Dis, 9, 152.
DU, Y., BUDMAN, H. M. & DUEVER, T. A. 2016. Classification of Normal and Apoptotic Cells from
Fluorescence Microscopy Images Using Generalized Polynomial Chaos and Level Set Function. Microsc Microanal,
1-12.
DU, Y., VEENSTRA, A., PALCZEWSKI, K. & KERN, T. S. 2013. Photoreceptor cells are major
contributors to diabetes-induced oxidative stress and local inflammation in the retina. Proc Natl Acad Sci U S A, 110,
16586-91.
DURAN-GONZALEZ, J., MICHI, E. D., ELORZA, B., PEREZ-CORDOVA, M. G., PACHECO-
OTALORA, L. F., TOUHAMI, A., PAULSON, P., PERRY, G., MURRAY, I. V. & COLOM, L. V. 2013. Amyloid
beta peptides modify the expression of antioxidant repair enzymes and a potassium channel in the septohippocampal
system. Neurobiol Aging, 34, 2071-6.
EBRAHIM, M., MULAY, S. R., ANDERS, H. J. & THOMASOVA, D. 2015. MDM2 beyond cancer:
podoptosis, development, inflammation, and tissue regeneration. Histol Histopathol, 30, 1271-82.
ELSAYED, A. M., ABDELGHANY, T. M., AKOOL EL, S., ABDEL-AZIZ, A. A. & ABDEL-BAKKY,
M. S. 2016. All-trans retinoic acid potentiates cisplatin-induced kidney injury in rats: impact of retinoic acid
signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 389, 327-37.
ENGLAND, P. J. 1986. Intracellular calcium receptor mechanisms. Br Med Bull, 42, 375-83.
ENZMANN, V., FAUDE, F., WIEDEMANN, P. & KOHEN, L. 2000. The local and systemic secretion of
the pro-inflammatory cytokine interleukin-6 after transplantation of retinal pigment epithelium cells in a rabbit
model. Curr Eye Res, 21, 530-4.
FADILAH, S. A., VUCKOVIC, S., KHALIL, D. & HART, D. N. 2007. Cord blood CD34+ cells cultured
with FLT3L, stem cell factor, interleukin-6, and IL-3 produce CD11c+CD1a-/c- myeloid dendritic cells. Stem Cells
Dev, 16, 849-55.
FEDICK, A., JALAS, C. & TREFF, N. R. 2014. A deleterious mutation in the PEX2 gene causes Zellweger
syndrome in individuals of Ashkenazi Jewish descent. Clin Genet, 85, 343-6.
FELIZOLA, S. J., MAEKAWA, T., NAKAMURA, Y., SATOH, F., ONO, Y., KIKUCHI, K., ARITOMI,
S., IKEDA, K., YOSHIMURA, M., TOJO, K. & SASANO, H. 2014. Voltage-gated calcium channels in the human
adrenal and primary aldosteronism. J Steroid Biochem Mol Biol, 144 Pt B, 410-6.
HAZRA, S., JARAJAPU, Y. P., STEPPS, V., CABALLERO, S., THINSCHMIDT, J. S., SAUTINA, L.,
BENGTSSON, N., LICALZI, S., DOMINGUEZ, J., KERN, T. S., SEGAL, M. S., ASH, J. D., SABAN, D. R.,
BARTELMEZ, S. H. & GRANT, M. B. 2013. Long-term type 1 diabetes influences haematopoietic stem cells by
reducing vascular repair potential and increasing inflammatory monocyte generation in a murine model.
Diabetologia, 56, 644-53.
36
HE, S., WANG, H. M., YE, J., OGDEN, T. E., RYAN, S. J. & HINTON, D. R. 1994. Dexamethasone
induced proliferation of cultured retinal pigment epithelial cells. Curr Eye Res, 13, 257-61.
HEESE, K., LOW, J. W. & INOUE, N. 2006. Nerve growth factor, neural stem cells and Alzheimer's
disease. Neurosignals, 15, 1-12.
HELLINGMAN, C. A., KOEVOET, W., KOPS, N., FARRELL, E., JAHR, H., LIU, W., BAATENBURG
DE JONG, R. J., FRENZ, D. A. & VAN OSCH, G. J. 2010. Fibroblast growth factor receptors in in vitro and in vivo
chondrogenesis: relating tissue engineering using adult mesenchymal stem cells to embryonic development. Tissue
Eng Part A, 16, 545-56.
HOLTHOFF, H. P., GOEBEL, S., LI, Z., FASSBENDER, J., REIMANN, A., ZEIBIG, S., LOHSE, M. J.,
MUNCH, G. & UNGERER, M. 2015. Prolonged TSH receptor A subunit immunization of female mice leads to a
long-term model of Graves' disease, tachycardia, and cardiac hypertrophy. Endocrinology, 156, 1577-89.
JAFARI, A., NOURSADEGHI, E., KHODAGHOLI, F., SAGHIRI, R., SAUVE, R., ALIAGHAEI, A. &
ELIASSI, A. 2015. Brain mitochondrial ATP-insensitive large conductance Ca(+)(2)-activated K(+) channel
properties are altered in a rat model of amyloid-beta neurotoxicity. Exp Neurol, 269, 8-16.
JAHNS, R., SCHLIPP, A., BOIVIN, V. & LOHSE, M. J. 2010. Targeting receptor antibodies in immune
cardiomyopathy. Semin Thromb Hemost, 36, 212-8.
JANSSEN, L. J., MUKHERJEE, S. & ASK, K. 2015. Calcium Homeostasis and Ionic Mechanisms in
Pulmonary Fibroblasts. Am J Respir Cell Mol Biol, 53, 135-48.
JEKLOVA, E., LEVA, L., JAGLIC, Z. & FALDYNA, M. 2008. Dexamethasone-induced
immunosuppression: a rabbit model. Vet Immunol Immunopathol, 122, 231-40.
JEPPS, T. A., OLESEN, S. P., GREENWOOD, I. A. & DALSGAARD, T. 2016. Molecular and functional
characterization of Kv 7 channels in penile arteries and corpus cavernosum of healthy and metabolic syndrome rats.
Br J Pharmacol, 173, 1478-90.
JIA, F., WILSON, K. D., SUN, N., GUPTA, D. M., HUANG, M., LI, Z., PANETTA, N. J., CHEN, Z. Y.,
ROBBINS, R. C., KAY, M. A., LONGAKER, M. T. & WU, J. C. 2010. A nonviral minicircle vector for deriving
human iPS cells. Nat Methods, 7, 197-9.
JIN, N., JIN, X., GU, X., NA, W., ZHANG, M. & ZHAO, R. 2015. Screening biomarkers of bladder cancer
using combined miRNA and mRNA microarray analysis. Mol Med Rep, 12, 3170-6.
JIPU, R., AMITITELOAIE, C., ZONDA, G. I., IANCU, R. I., CARASEVICI, E. & COSTULEANU, M.
2012. Thapsigargin-induced endoplasmic reticulum stress is not accompanied by mitochondrial membrane potential
dissipation in murine pro-B cells. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, 116, 557-62.
KIKUCHI, H., MIURA, H., YAMAMOTO, H., TAKEUCHI, T., DEI, T. & WATANABE, M. 1989.
Characteristic sequences in the upstream region of the human tyrosinase gene. Biochim Biophys Acta, 1009, 283-6.
KIM, D. H., PARK, H. K., PARK, Y. H., LEE, S. H., JOO, H. C., LEE, S., YOUN, Y. N. & SHIN, H. J.
2015. Degenerative Calcification of Pericardial Bioprostheses: Comparison of Five Implantation Methods in a
Rabbit Model. J Heart Valve Dis, 24, 621-8.
KIM, J. B., SEBASTIANO, V., WU, G., ARAUZO-BRAVO, M. J., SASSE, P., GENTILE, L., KO, K.,
RUAU, D., EHRICH, M., VAN DEN BOOM, D., MEYER, J., HUBNER, K., BERNEMANN, C., ORTMEIER, C.,
ZENKE, M., FLEISCHMANN, B. K., ZAEHRES, H. & SCHOLER, H. R. 2009. Oct4-induced pluripotency in adult
neural stem cells. Cell, 136, 411-9.
KIM, K. S., PARK, J. M., KONG, T., KIM, C., BAE, S. H., KIM, H. W. & MOON, J. 2015. Retinal
angiogenesis effects of TGF-beta1, and paracrine factors secreted from human placental stem cells in response to a
pathological environment. Cell Transplant.
KIM, N., MIN, K. W., KANG, K. H., LEE, E. J., KIM, H. T., MOON, K., CHOI, J., LE, D., LEE, S. H. &
KIM, J. W. 2014. Regulation of retinal axon growth by secreted Vax1 homeodomain protein. Elife, 3, e02671.
KIM, W. S., ZHU, Y., DENG, Q., CHIN, C. J., HE, C. B., GRIECO, A. J., DRAVID, G. G., PAREKH, C.,
HOLLIS, R. P., LANE, T. F., BOUHASSIRA, E. E., KOHN, D. B. & CROOKS, G. M. 2014. Erythropoiesis from
human embryonic stem cells through erythropoietin-independent AKT signaling. Stem Cells, 32, 1503-14.
37
KLUEVA, J., GUNDELFINGER, E. D., FRISCHKNECHT, R. R. & HEINE, M. 2014. Intracellular
Ca(2)(+) and not the extracellular matrix determines surface dynamics of AMPA-type glutamate receptors on aspiny
neurons. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 369, 20130605.
KOCAB, A. J. & DUCKETT, C. S. 2016. Inhibitor of apoptosis proteins as intracellular signaling
intermediates. FEBS J, 283, 221-31.
KRAFT, D., RALL, M., VOLCIC, M., METZLER, E., GROO, A., STAHL, A., BAUER, L.,
NASONOVA, E., SALLES, D., TAUCHER-SCHOLZ, G., BONIG, H., FOURNIER, C. & WIESMULLER, L.
2015. NF-kappaB-dependent DNA damage-signaling differentially regulates DNA double-strand break repair
mechanisms in immature and mature human hematopoietic cells. Leukemia, 29, 1543-54.
KRITIS, A. A., STAMOULA, E. G., PANISKAKI, K. A. & VAVILIS, T. D. 2015. Researching glutamate
- induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study. Front Cell Neurosci, 9, 91.
KUCUKALI, C. I., KURTUNCU, M., AKCAY, H. I., TUZUN, E. & OGE, A. E. 2015. Peripheral nerve
hyperexcitability syndromes. Rev Neurosci, 26, 239-51.
LAI, C. C., GOURAS, P., DOI, K., TSANG, S. H., GOFF, S. P. & ASHTON, P. 2000. Local
immunosuppression prolongs survival of RPE xenografts labeled by retroviral gene transfer. Invest Ophthalmol Vis
Sci, 41, 3134-41.
LANGE, I. & KOOMOA, D. L. 2014. MycN promotes TRPM7 expression and cell migration in
neuroblastoma through a process that involves polyamines. FEBS Open Bio, 4, 966-75.
LE GUEN, L., MARCHAL, S., FAURE, S. & DE SANTA BARBARA, P. 2015. Mesenchymal-epithelial
interactions during digestive tract development and epithelial stem cell regeneration. Cell Mol Life Sci, 72, 3883-96.
LEE, P., HOCK, A. K., VOUSDEN, K. H. & CHEUNG, E. C. 2015. p53- and p73-independent activation
of TIGAR expression in vivo. Cell Death Dis, 6, e1842.
LEE, W. S., JOO, Y. D., OH, K. H., WON, H. J., LEE, S. M., CHOI, M. Y., HAN, G. H., PARK, S. G.,
CHOI, I. W., CHOI, I. & SEO, S. K. 2012. G-CSF-induced myeloid cells stimulated by TLR2 enhance engraftment
after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Immunol Lett, 143, 177-83.
LIU, Z., CAI, H., DANG, Y., QIU, C. & WANG, J. 2016. Adenosine triphosphate-sensitive potassium
channels and cardiomyopathies (Review). Mol Med Rep, 13, 1447-54.
LOGOTHETIS, D. E., MAHAJAN, R., ADNEY, S. K., HA, J., KAWANO, T., MENG, X. Y. & CUI, M.
2015. Unifying Mechanism of Controlling Kir3 Channel Activity by G Proteins and Phosphoinositides. Int Rev
Neurobiol, 123, 1-26.
LONG, Y., WANG, M., GU, H. & XIE, X. 2015. Bromodeoxyuridine promotes full-chemical induction of
mouse pluripotent stem cells. Cell Res, 25, 1171-4.
LOPEZ-CONTRERAS, A. J., DE LA MORENA, M. E., RAMOS-MOLINA, B., LAMBERTOS, A.,
CREMADES, A. & PENAFIEL, R. 2013. The induction of cardiac ornithine decarboxylase by beta2 -adrenergic
agents is associated with calcium channels and phosphorylation of ERK1/2. J Cell Biochem, 114, 1978-86.
LORENZ, H. P., LONGAKER, M. T., PERKOCHA, L. A., JENNINGS, R. W., HARRISON, M. R. &
ADZICK, N. S. 1992. Scarless wound repair: a human fetal skin model. Development, 114, 253-9.
LU, B., ZHU, D., HINTON, D., HUMAYUN, M. S. & TAI, Y. C. 2012. Mesh-supported submicron
parylene-C membranes for culturing retinal pigment epithelial cells. Biomed Microdevices, 14, 659-67.
LUTZ, A., SANWALD, J., THOMAS, M., FEUER, R., SAWODNY, O., EDERER, M., BORNER, C.,
HUMAR, M. & MERFORT, I. 2014. Interleukin-1beta enhances FasL-induced caspase-3/-7 activity without
increasing apoptosis in primary mouse hepatocytes. PLoS One, 9, e115603.
MACCONI, D., REMUZZI, G. & BENIGNI, A. 2014. Key fibrogenic mediators: old players. Renin-
angiotensin system. Kidney Int Suppl (2011), 4, 58-64.
MOEHRLE, B. M., NATTAMAI, K., BROWN, A., FLORIAN, M. C., RYAN, M., VOGEL, M.,
BLIEDERHAEUSER, C., SOLLER, K., PROWS, D. R., ABDOLLAHI, A., SCHLEIMER, D., WALTER, D.,
MILSOM, M. D., STAMBROOK, P., PORTEUS, M. & GEIGER, H. 2015. Stem Cell-Specific Mechanisms Ensure
Genomic Fidelity within HSCs and upon Aging of HSCs. Cell Rep, 13, 2412-24.
38
MONTALDO, E., VITALE, C., COTTALASSO, F., CONTE, R., GLATZER, T., AMBROSINI, P.,
MORETTA, L. & MINGARI, M. C. 2012. Human NK cells at early stages of differentiation produce CXCL8 and
express CD161 molecule that functions as an activating receptor. Blood, 119, 3987-96.
MONTEZUMA, S. R., LOEWENSTEIN, J., SCHOLZ, C. & RIZZO, J. F., 3RD 2006. Biocompatibility of
materials implanted into the subretinal space of Yucatan pigs. Invest Ophthalmol Vis Sci, 47, 3514-22.
MU, C., YANG, Y., LUO, Z., GUAN, L. & ZHU, W. 2016. The Colonic Microbiome and Epithelial
Transcriptome Are Altered in Rats Fed a High-Protein Diet Compared with a Normal-Protein Diet. J Nutr, 146, 474-
83.
NAFFAA, M. M., CHEBIB, M., HIBBS, D. E. & HANRAHAN, J. R. 2015. Comparison of templates for
homology model of rho1 GABAC receptors: More insights to the orthosteric binding site's structure and
functionality. J Mol Graph Model, 62, 43-55.
NEHME, R., GROTE, P., TOMASI, T., LOSER, S., HOLZKAMP, H., SCHNABEL, R. & CONRADT, B.
2010. Transcriptional upregulation of both egl-1 BH3-only and ced-3 caspase is required for the death of the male-
specific CEM neurons. Cell Death Differ, 17, 1266-76.
NEWTON, F. G., HARRIS, R. E., SUTCLIFFE, C. & ASHE, H. L. 2015. Coordinate post-transcriptional
repression of Dpp-dependent transcription factors attenuates signal range during development. Development, 142,
3362-73.
NICHOLS, J. M., MAIELLARO, I., ABI-JAOUDE, J., CURCI, S. & HOFER, A. M. 2015. "Store-
operated" cAMP signaling contributes to Ca2+-activated Cl- secretion in T84 colonic cells. Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol, 309, G670-9.
OBUROGLU, L., ROMANO, M., TAYLOR, N. & KINET, S. 2016. Metabolic regulation of hematopoietic
stem cell commitment and erythroid differentiation. Curr Opin Hematol, 23, 198-205.
OCANA, A., PEREZ-PENA, J., DIEZ-GONZALEZ, L., SANCHEZ-CORRALES, V., TEMPLETON, A.,
SERUGA, B., AMIR, E. & PANDIELLA, A. 2016. Transcriptomic analyses identify association between mitotic
kinases, PDZ-binding kinase and BUB1, and clinical outcome in breast cancer. Breast Cancer Res Treat, 156, 1-8.
PUCKERIN, A., AROMOLARAN, K. A., CHANG, D. D., ZUKIN, R. S., COLECRAFT, H. M.,
BOUTJDIR, M. & AROMOLARAN, A. S. 2016. hERG 1a LQT2 C-terminus truncation mutants display hERG 1b-
dependent dominant negative mechanisms. Heart Rhythm, 13, 1121-30.
PUHL, A. C., MILTON, F. A., CVORO, A., SIEGLAFF, D. H., CAMPOS, J. C., BERNARDES, A.,
FILGUEIRA, C. S., LINDEMANN, J. L., DENG, T., NEVES, F. A., POLIKARPOV, I. & WEBB, P. 2015.
Mechanisms of peroxisome proliferator activated receptor gamma regulation by non-steroidal anti-inflammatory
drugs. Nucl Recept Signal, 13, e004.
RAJAIYA, J., YOUSUF, M. A., SINGH, G., STANISH, H. & CHODOSH, J. 2012. Heat shock protein 27
mediated signaling in viral infection. Biochemistry, 51, 5695-702.
RAJASHEKHAR, G., RAMADAN, A., ABBURI, C., CALLAGHAN, B., TRAKTUEV, D. O., EVANS-
MOLINA, C., MATURI, R., HARRIS, A., KERN, T. S. & MARCH, K. L. 2014. Regenerative therapeutic potential
of adipose stromal cells in early stage diabetic retinopathy. PLoS One, 9, e84671.
RAMASWAMY, S., JAIN, S. & RAVINDRAN, V. 2016. Hematopoietic stem cell transplantation for auto
immune rheumatic diseases. World J Transplant, 6, 199-205.
RANGASAMY, S., JU, H., UM, S., OH, D. C. & SONG, J. M. 2015. Mitochondria and DNA Targeting of
5,10,15,20-Tetrakis(7-sulfonatobenzo[b]thiophene) Porphyrin-Induced Photodynamic Therapy via Intrinsic and
Extrinsic Apoptotic Cell Death. J Med Chem, 58, 6864-74.
RATAJCZAK, J., SHIN, D. M., WAN, W., LIU, R., MASTERNAK, M. M., PIOTROWSKA, K.,
WISZNIEWSKA, B., KUCIA, M., BARTKE, A. & RATAJCZAK, M. Z. 2011. Higher number of stem cells in the
bone marrow of circulating low Igf-1 level Laron dwarf mice--novel view on Igf-1, stem cells and aging. Leukemia,
25, 729-33.
REDDY, J. K. & CHU, R. 1996. Peroxisome proliferator-induced pleiotropic responses: pursuit of a
phenomenon. Ann N Y Acad Sci, 804, 176-201.
39
ROSENBERG, A. R., SYRJALA, K. L., MARTIN, P. J., FLOWERS, M. E., CARPENTER, P. A., SALIT,
R. B., BAKER, K. S. & LEE, S. J. 2015. Resilience, health, and quality of life among long-term survivors of
hematopoietic cell transplantation. Cancer, 121, 4250-7.
ROSEWEIR, A. K., QAYYUM, T., LIM, Z., HAMMOND, R., MACDONALD, A. I., FRASER, S.,
OADES, G. M., AITCHISON, M., JONES, R. J. & EDWARDS, J. 2016. Nuclear expression of Lyn, a Src family
kinase member, is associated with poor prognosis in renal cancer patients. BMC Cancer, 16, 229.
SALIBA, A., DU, Y., LIU, H., PATEL, S., ROBERTS, R., BERKOWITZ, B. A. & KERN, T. S. 2015.
Photobiomodulation Mitigates Diabetes-Induced Retinopathy by Direct and Indirect Mechanisms: Evidence from
Intervention Studies in Pigmented Mice. PLoS One, 10, e0139003.
SCARDIGLI, R., CAPELLI, P., VIGNONE, D., BRANDI, R., CECI, M., LA REGINA, F., PIRAS, E.,
CINTOLI, S., BERARDI, N., CAPSONI, S. & CATTANEO, A. 2014. Neutralization of nerve growth factor impairs
proliferation and differentiation of adult neural progenitors in the subventricular zone. Stem Cells, 32, 2516-28.
SHABIR, I., KHURANA, M. L., JOSEPH, A. A., EUNICE, M., MEHTA, M. & AMMINI, A. C. 2015.
Phenotype, genotype and gender identity in a large cohort of patients from India with 5alpha-reductase 2 deficiency.
Andrology, 3, 1132-9.
SHAHIDULLAH, M., MANDAL, A. & DELAMERE, N. A. 2015. Damage to lens fiber cells causes
TRPV4-dependent Src family kinase activation in the epithelium. Exp Eye Res, 140, 85-93.
SHAIKH, S. A., SAHOO, S. K. & PERIASAMY, M. 2016. Phospholamban and sarcolipin: Are they
functionally redundant or distinct regulators of the Sarco(Endo)Plasmic Reticulum Calcium ATPase? J Mol Cell
Cardiol, 91, 81-91.
SHAO, R. G., CAO, C. X., NIEVES-NEIRA, W., DIMANCHE-BOITREL, M. T., SOLARY, E. &
POMMIER, Y. 2001. Activation of the Fas pathway independently of Fas ligand during apoptosis induced by
camptothecin in p53 mutant human colon carcinoma cells. Oncogene, 20, 1852-9.
SHENG, Y., GOURAS, P., CAO, H., BERGLIN, L., KJELDBYE, H., LOPEZ, R. & ROSSKOTHEN, H.
1995. Patch transplants of human fetal retinal pigment epithelium in rabbit and monkey retina. Invest Ophthalmol Vis
Sci, 36, 381-90.
SHOSHAN-BARMATZ, V., BEN-HAIL, D., ADMONI, L., KRELIN, Y. & TRIPATHI, S. S. 2015. The
mitochondrial voltage-dependent anion channel 1 in tumor cells. Biochim Biophys Acta, 1848, 2547-75.
SIEBER, T. & DOBNER, T. 2007. Adenovirus type 5 early region 1B 156R protein promotes cell
transformation independently of repression of p53-stimulated transcription. J Virol, 81, 95-105.
SINGER, A. J. & CLARK, R. A. 1999. Cutaneous wound healing. N Engl J Med, 341, 738-46.
SINGH, R., PHILLIPS, M. J., KUAI, D., MEYER, J., MARTIN, J. M., SMITH, M. A., PEREZ, E. T.,
SHEN, W., WALLACE, K. A., CAPOWSKI, E. E., WRIGHT, L. S. & GAMM, D. M. 2013. Functional analysis of
serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest Ophthalmol Vis Sci, 54, 6767-78.
SKIBSBYE, L., WANG, X., AXELSEN, L. N., BOMHOLTZ, S. H., NIELSEN, M. S., GRUNNET, M.,
BENTZEN, B. H. & JESPERSEN, T. 2015. Antiarrhythmic Mechanisms of SK Channel Inhibition in the Rat
Atrium. J Cardiovasc Pharmacol, 66, 165-76.
SONG, Y. 2016. Function of Membrane-Associated Proteoglycans in the Regulation of Satellite Cell
Growth. Adv Exp Med Biol, 900, 61-95.
SOO, C., SHAW, W. W., ZHANG, X., LONGAKER, M. T., HOWARD, E. W. & TING, K. 2000.
Differential expression of matrix metalloproteinases and their tissue-derived inhibitors in cutaneous wound repair.
Plast Reconstr Surg, 105, 638-47.
TSAI, F. Y., CHENG, Y. T. & TSOU, T. C. 2014. A recombinant PPRE-driven luciferase bioassay for
identification of potential PPAR agonists. Vitam Horm, 94, 427-35.
TSE, G. & YEO, J. M. 2015. Conduction abnormalities and ventricular arrhythmogenesis: The roles of
sodium channels and gap junctions. Int J Cardiol Heart Vasc, 9, 75-82.
TSUCHIYA, Y., NAKABAYASHI, O. & NAKANO, H. 2015. FLIP the Switch: Regulation of Apoptosis
and Necroptosis by cFLIP. Int J Mol Sci, 16, 30321-41.
40
TUBY, H., MALTZ, L. & ORON, U. 2011. Induction of autologous mesenchymal stem cells in the bone
marrow by low-level laser therapy has profound beneficial effects on the infarcted rat heart. Lasers Surg Med, 43,
401-9.
TUKAJ, S., ZILLIKENS, D. & KASPERKIEWICZ, M. 2015. Heat shock protein 90: a pathophysiological
factor and novel treatment target in autoimmune bullous skin diseases. Exp Dermatol, 24, 567-71.
TUNBAK, H., GEORGIOU, C., GUAN, C., RICHARDSON, W. D. & CHITTKA, A. 2016. Zinc fingers 1,
2, 5 and 6 of transcriptional regulator, PRDM4, are required for its nuclear localisation. Biochem Biophys Res
Commun.
TZENG, H. H., HSU, C. H., CHUNG, T. H., LEE, W. C., LIN, C. H., WANG, W. C., HSIAO, C. Y., LEU,
Y. W. & WANG, T. H. 2015. Cell Signaling and Differential Protein Expression in Neuronal Differentiation of Bone
Marrow Mesenchymal Stem Cells with Hypermethylated Salvador/Warts/Hippo (SWH) Pathway Genes. PLoS One,
10, e0145542.
VIDAL-SANZ, M., VALIENTE-SORIANO, F. J., ORTIN-MARTINEZ, A., NADAL-NICOLAS, F. M.,
JIMENEZ-LOPEZ, M., SALINAS-NAVARRO, M., ALARCON-MARTINEZ, L., GARCIA-AYUSO, D.,
AVILES-TRIGUEROS, M., AGUDO-BARRIUSO, M. & VILLEGAS-PEREZ, M. P. 2015. Retinal
neurodegeneration in experimental glaucoma. Prog Brain Res, 220, 1-35.
WANG, F., YAN, Z., LIU, Z., WANG, S., WU, Q., YU, S., DING, J. & DAI, Q. 2016. Molecular basis of
toxicity of N-type calcium channel inhibitor MVIIA. Neuropharmacology, 101, 137-45.
WATERHAM, H. R. & EBBERINK, M. S. 2012. Genetics and molecular basis of human peroxisome
biogenesis disorders. Biochim Biophys Acta, 1822, 1430-41.
WEN, X., WU, J., WANG, F., LIU, B., HUANG, C. & WEI, Y. 2013. Deconvoluting the role of reactive
oxygen species and autophagy in human diseases. Free Radic Biol Med, 65, 402-10.
WENKEL, H. & STREILEIN, J. W. 2000. Evidence that retinal pigment epithelium functions as an
immune-privileged tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci, 41, 3467-73.
WESA, A. K. & GALY, A. 2001. Regulation of T cell cytokine production by dendritic cells generated in
vitro from hematopoietic progenitor cells. Cell Immunol, 208, 115-24.
WEST, D. C., SHAW, D. M., LORENZ, P., ADZICK, N. S. & LONGAKER, M. T. 1997. Fibrotic healing
of adult and late gestation fetal wounds correlates with increased hyaluronidase activity and removal of hyaluronan.
Int J Biochem Cell Biol, 29, 201-10.
XU, H., WASHINGTON, S., VERDERAME, M. F. & MANNI, A. 2008. Role of non-receptor and receptor
tyrosine kinases (TKs) in the antitumor action of alpha-difluoromethylornithine (DFMO) in breast cancer cells.
Breast Cancer Res Treat, 112, 255-61.
XU, J. H., YANG, Z. B., WANG, H. & TANG, F. R. 2014. Co-localization of L-type voltage dependent
calcium channel alpha 1D subunit (Ca(v)1.3) and calbindin (CB) in the mouse central nervous system. Neurosci Lett,
561, 80-5.
YOKOTA, J., CHOSA, N., SAWADA, S., OKUBO, N., TAKAHASHI, N., HASEGAWA, T., KONDO,
H. & ISHISAKI, A. 2014. PDGF-induced PI3K-mediated signaling enhances the TGF-beta-induced osteogenic
differentiation of human mesenchymal stem cells in a TGF-beta-activated MEK-dependent manner. Int J Mol Med,
33, 534-42.
YU, G. J., CHOI, I. W., KIM, G. Y., HWANG, H. J., KIM, B. W., KIM, C. M., KIM, W. J., YOO, Y. H. &
CHOI, Y. H. 2015. Induction of reactive oxygen species-mediated apoptosis by purified Schisandrae semen essential
oil in human leukemia U937 cells through activation of the caspase cascades and nuclear relocation of mitochondrial
apoptogenic factors. Nutr Res, 35, 910-20.
YVON, C., RAMSDEN, C. M., LANE, A., POWNER, M. B., DA CRUZ, L., COFFEY, P. J. & CARR, A.
J. 2015. Using Stem Cells to Model Diseases of the Outer Retina. Comput Struct Biotechnol J, 13, 382-9.
ZHANG, H., LIU, J., SUN, S., PCHITSKAYA, E., POPUGAEVA, E. & BEZPROZVANNY, I. 2015.
Calcium signaling, excitability, and synaptic plasticity defects in a mouse model of Alzheimer's disease. J
Alzheimers Dis, 45, 561-80.