Úvod - crzp.uniag.skcrzp.uniag.sk/prace/2010/h/1d69ed35139e4ce1989a45402caa0c92.doc · web...
TRANSCRIPT
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE
FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA
2120307
APLIKÁCIA MIKROBIÁLNYCH PEPTIDÁZ PRI ÚPRAVE
BIELKOVINOVEJ SUROVINY PRE POTREBY HUMÁNNEJ VÝŹIVY
DIPLOMOVÁ PRÁCA
2010 Bc. Renáta Halásová
SLOVENSKÁ POĽNOSHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE
FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA
APLIKÁCIA MIKROBIÁLNYCH PEPTIDÁZ PRI ÚPRAVE
BIELKOVINOVEJ SUROVINY PRE POTREBY HUMÁNNEJ VÝŽIVY.
DIPLOMOVÁ PRÁCA
Študijný program: Technológia potravín
Študijný odbor: 6.1.13 Spracovanie poľnohospodárskych produktov
Katedra biochémie a biotechnológie
Vedúci záverečnej práce/školiteľ: doc. RNDr. Dana Urminská, CSc.
Nitra 2010 Bc. Renáta Halásová
Čestné vyhlásenie
Podpísaná Bc. Renáta Halásová vyhlasujem, že som diplomovú prácu na tému
„Aplikácia mikrobiálnych peptidáz pri úprave bielkovinovej suroviny pre potreby
humánnej výživy “ vypracovala samostatne s použitím uvedenej literatúry. Diplomová
práca bezprostredne nadväzuje na bakalársku záverečnú prácu „Proteolytické enzýmy
a ich využitie v potravinárstve“ vypracovanú v roku 2008.
Som si vedomá zákonných dôsledkov v prípade, ak hore uvedené údaje nie sú
pravdivé.
V Nitre, 16. apríla 2010 .......................................................................
Poďakovanie
Touto cestou by som rada vyjadrila úprimné poďakovanie svojej školiteľke
doc. RNDr. Dane Urminskej, CSc., za venovaný čas, odborný dohľad a cenné
pripomienky, ktoré mi poskytovala počas tvorby tejto práce.
Abstrakt
Cieľom diplomovej práce bolo podrobnejšie charakterizovať proteolytické
enzýmy Subtilizín Carlsberg a Deuterolyzín vo vzťahu k ich hydrolytickej účinnosti.
Substrátmi pre enzymatickú hydrolýzu boli šroty rastlinných materiálov: 1 % alebo 5 %
pšeničný, kukuričný a sójový šrot, ku ktorým boli v roztoku optimálneho pH pridané
enzýmy Subtilizín Carlsberg alebo Deuterolyzín. Hydrolýza sa realizovala pri teplote
37 oC v časových intervaloch 0, 30, 60 a 120 minút. Hydrolytická aktivita
mikrobiálnych enzýmov bola stanovená pomocou formolovej titrácie. Deuterolyzín sa
vyznačoval nižšou hydrolytickou účinnosťou ako Subtilizín Carlsberg. Najviac
aminokyselín (12,74 mg) bolo stanovených v produkte po pôsobení peptidázy Subtilizín
Carlsberg na 5% sójový šrot. Najmenej degradovateľným substrátom bol pšeničný šrot
(6,30 mg), pričom vyššie koncentrácie aminokyselín (stanovených ako mg N) boli
v produktoch s 5 % obsahom šrotu. Optimálny čas hydrolýzy bol interval 30 – 60 minút.
The aim of this diploma thesis was to characterise in detail proteolytic enzymes
Subtilizín Carlsberg and Deuterolyzín in terms of hydrolytic effectivity. The substrates
of enzymatic hydrolysis were groats of plant material: 1 % or 5 % wheat, maize or soy
groat to which were added enzymes Subtilizín Carlsberg or Deuterolyzín in the solution
of optimal pH. The hydrolysis was carried out by temperature of 37 ºC in time intervals
0, 30, 60 and 120 minutes. Hydrolytic activity of microbial enzymes was determined by
formol titration. Hydrolytical effectivity of Deuterolyzín has been shown lower than
hydrolytical effectivity of Subtilizín Carlsberg. Most of amino acids (12,74 mg) were
determined in final product after reaction of 5 % soy groat with Subtilizín Carlsberg
peptidase. The least degradationable substrate was wheat groat (6.30 mg). Higher
concentrations of amino acids were determined as mg N in products of 5 % wheat groat
content. The optimal time interval of hydrolysis lasted 30-60 minutes.
Kľúčové slová: peptidázy, enzýmová hydrolýza, enzýmové hydrolyzáty
Key words: peptidases, enzymatic hydrolysis, enzymatic hydrolysates
Obsah
Zoznam skratiek................................................................................................................6
Úvod..................................................................................................................................7
1 PREHĽAD O SÚČASNOM STAVE RIEŠENEJ PROBLEMATIKY........................9
1.1 Charakteristika a význam bielkovín ako surovín na prípravu humánnej výživy.....9
1.1. 1 Štruktúra bielkovín.........................................................................................9
1.1. 2 Význam bielkovín v potravinách.................................................................10
1.2 Charakteristika mikrobiálnych proteolytických enzýmov aplikovaných pre
cielenú úpravu bielkovinovej suroviny.......................................................................18
1. 2.1 Proteolytické enzýmy...................................................................................18
1. 3 Bielkovinové hydrolyzáty, charakteristika, význam , využitie...........................28
1. 3. 1 Charakteristika enzymatických hydrolyzátov..............................................28
2 CIEĽ PRÁCE..............................................................................................................43
3 MATERIÁL A METODIKA......................................................................................43
3.1 Proteolytické enzýmy............................................................................................43
3.2 Substráty - rastlinné bielkoviny.............................................................................43
3.3 Enzymatická hydrolýza bielkovín.........................................................................44
3.4 Formolová titrácia aminokyselín...........................................................................44
4 VÝSLEDKY A DISKUSIA........................................................................................45
5 Závery..........................................................................................................................48
6 Zoznam použitej literatúry..........................................................................................49
Zoznam skratiek
AAS - amino acid score
ACE - angiotensin converting enzyme
EAAI - essential amino acid index
CS - chemical score
LPT - lipid transfer protein
EAI - emulsion activity index
ESI - emulsion stability index
OPA - o-ftalaldehyd
EDTA - kyselina etyléndiamíntetraoctová
TNBS - kyselina 2,4,6-trinitrobenzénsulfónová.
IgE - imunoglobulín E
DH - degree of hydrolysis
P - prolín
E - kyselina glutámová
Q - glutamín
L - leucín
Y - tyrozín
6
Úvod
Bielkoviny, ako základné komponenty potravín majú širokú škálu funkčných
a štrukturálnych vlastností, ktoré výrazne ovplyvňujú vlastnosti potravín. V súčasnosti
sa bádanie sústreďuje na pochopenie bielkovinovej štruktúry a zlepšovanie bielkovín
ako multifunkčných zložiek pre potravinový priemysel.
Biologická a nutričná kvalita bielkovín je určená predovšetkým množstvom,
resp. potrebným zastúpením esenciálných aminokyselín, ktoré sú potrebné pre syntézu
látok bielkovinovej povahy v ľudskom organizme, ale aj hydrolyzovateľnosťou
bielkovín, ktorá limituje ich využitie z potravy. V technologickej praxi sa postupne
začínajú uplatňovať moderné biotechnologické postupy, medzi ktoré sa zaraďuje aj
enzymatická hydrolýza bielkovín použitím proteolytických enzýmov. Ideálne využitie
majú predovšetkým mikrobiálne enzýmy, ale v praxi (na základe historických
empirických skúseností) sa využívajú aj rastlinné alebo živočíšne enzýmy. Ďalším
problémom, ktorý súvisí s využiteľosťou potravinových bielkovín je skutočnosť, že
bielkoviny obsiahnuté v potravinách v prirodzenom stave nemusia mať optimálne
funkčné vlastnosti. Tieto vlastnosti môžu byť zmenené vystavením bielkovín rôznym
fyzikálnym, alebo chemickým vplyvom ako napríklad pH, iónová sila, teplota
a podobne, ako aj enzymatickým vplyvom napríklad využitím enzymatickej proteolýzy
(Nielsen – Nielsen, 1997). Aj v tomto smere je veľký priestor pre zlepšenie funkčných
vlastností bielkovín v potravinách parciálnou enzymatickou hydrolýzou. Z nutričného
hľadiska umožňuje enzýmová hydrolýza úpravu bielkovinových zdrojov a
optimalizáciu aminokyselinového a komponentného zloženia potravín.
Použitie enzymatickej hydrolýzy je „naturálny spôsob“ ako zmeniť vlastnosti
bielkovín. Enzýmy sú pomerne ľahko dostupné a ich využitím je možné dosiahnuť
požadované vlastnosti pri akceptovateľných nákladoch, pričom aj riziká vzniku
nežiadúcich reakcií a toxických produktov sú nižšie, ako pri iných metódach
modifikácie bielkovín. Hydrolýzou je možné zlepšiť fyzikálne, chemické, funkčné aj
nutričné vlastnosti bielkovín (Whei – Zhimin, 2006).
Enzýmovou hydrolýzou je možné získať širokú škálu produktov, ktoré
v závislosti od stupňa hydrolýzy majú rôzne účely použitia. Konečné zloženie
enzýmového hydrolyzátu je ovplyvnené predovšetkým voľbou substrátu, špecifikami
7
použitého enzýmu, podmienkami počas hydrolytickej reakcie a dĺžkou priebehu
hydrolýzy. Produkty s nízkym stupňom hydrolýzy sa väčšinou využívajú ako funkčné
zložky potravín (zlepšenie emulznej schopnosti, tvorba peny a pod.). Produkty so
stredným stupňom hydrolýzy sa využívajú v potravinách, ako zlepšovače chuti,
fortifikanty nealkoholických nápojov a džúsov (Panyam – Kilara, 1996, Vioque et al.,
2000), vo výžive športovcov a ako nutričné suplementy pre jedincov s tráviacimi
ťažkosťami. Produkty s najvyšším stupňom hydrolýzy majú uplatnenie v klinickej
výžive a v kojeneckej výžive.
8
1 PREHĽAD O SÚČASNOM STAVE RIEŠENEJ PROBLEMATIKY
1.1 Charakteristika a význam bielkovín ako surovín na prípravu
humánnej výživy
1.1. 1 Štruktúra bielkovín
Po chemickej stránke, bielkoviny, polypeptidy, proteíny sú organické
makromolekuly tvorené aminokyselinami, ktoré sú usporiadané do lineárneho
polypeptidového reťazca a pospájané peptidovými väzbami medzi aminoskupinou
a karboxylovou skupinou susedných aminokyselín (Voet – Voet, 2004).
Aminokyseliny sú opticky aktívne molekuly, väčšina prírodných aminokyselín sa
nachádza v L-konfigurácii. Vlastnosti bielkovín závisia od ionizačného (nábojového)
stavu bočných reťazcov aminokyselín, ktorý je funkciou pH. Podľa polarity
postranného reťazca sa delia na nepolárne (glycín, alanín, valín, leucín, izoleucín,
metionín, prolín, fenylalanín, tryptofán), polárne bez náboja (serín, treonín, asparagín,
glutamín, tyrozín, cysteín) a polárne s nábojom. Aminokyseliny s polárnym nabitým
reťazcom sú nabité kladne (zásadité aminokyseliny lyzín, arginín, histidín) alebo
záporne (kyslé aminokyseliny kys. asparágová, kys. glutámová).
Trojdimenziálna štruktúra bielkovín je popísaná na štyroch úrovniach. Primárna
štruktúra je daná genetickou informáciou, ktorá určuje poradie jednotlivých
aminokyselín v polypeptidovom reťazci. Zahŕňa tiež polohu základných kovalentných
väzieb, ako sú napr. väzby peptidové, disulfidové a esterové (Škárka – Ferenčík, 1987;
Ferenčík et. al, 2000). Pre sekundárnu štruktúru sú charakteristické pravidelné
konformácie (Michalík, 2003). Je to vlastne priestorové usporiadanie molekúl
polypeptidového reťazca, pri ktorom neberieme do úvahy postranné reťazce (Voet –
Voet, 2004). Medzi najrozšírenejšie elementy pravidelnej sekundárnej štruktúry patria
α-helix a skladaný list - β sheet. Nepravidelná konformácia bielkovinovej štruktúry je
charakterizovaná ako „náhodné klbko“ (Lehrman, 1990). Najčastejšie sa vyskytujúcou
štruktúrou u bielkovín je α-helix. Predstavuje najstabilnejšiu konformáciu vyznačujúcu
sa najnižšou energiou. Konformácia je stabilizovaná vodíkovými väzbami medzi
vodíkom naviazaným na peptidový dusík a kyslíkom karbonylu na štvrtom
aminokyselinovom zvyšku (v zmysle primárnej štruktúry) (Murray et al., 2002). Vzniká
9
tak silná vodíková väzba, rovnobežná s osou helixu, ktorá tvorí kostru bielkoviny.
Zatiaľ čo α – závitnica je tvorená aminokyselinami primárnej oblasti (štruktúry),
štruktúra skladaného listu v sebe zahŕňa úseky 5-10 aminokyselín z rôznych oblastí.
Peptidová kostra je v prípade skladaného listu takmer úplne extendovaná (Murray et al.,
2002).
Základný reťazec pozostávajúci z α a β štruktúr sa ďalej v priestore formuje a
vytvára konečnú fibrilárnu (vláknitú) alebo globulárnu (klbkovitú) formu bielkoviny
nazývanú ako terciárna štruktúra. Postranné reťazce sa vo vodnom prostredí na základe
elektrochemických silových pôsobení interagujú s cieľom vytvoriť nízkoenergetickú a
stabilnú formu. To znamená použitie čo najväčšieho množstva energie na denaturáciu,
rozrušenie, bielkoviny. Pritom druhé výrazné zníženie vnútornej energie predstavuje
natočenie hydrofóbnych častí proteínu "dovnútra" a hydrofilnych častí "vonku" do
vodného prostredia (Laššák, 2009). Množstvo bielkovín, hlavne s veľkosťou nad 100
kDa, je zložených z dvoch alebo viac polypeptidových reťacov, popisovaných ako
podjednotky bielkoviny. O presnom priestorovom usporiadaní týchto podjednotiek nám
udáva obraz kvartérna štruktúra.
Štruktúra bielkovín na všetkých úrovniach, primárnej, sekundárnej, terciálnej,
kvartérnej ovplyvňuje funkčné vlastnosti bielkovín v potravinách (Damodaran, 1997).
Trojdimenziálnu štruktúru bielkovín je možné sledovať pomocou X-lúčovej
kryštalografie alebo NMR technológiami. Purifikácia bielkovín od ostatných bunkových
komponentov je možná využitím viacerých techník, napríklad ultracentrifugáciou,
percipitáciou, elektroforézou a chromatografiou.
1.1. 2 V ýznam bielkovín v potravinách
Bielkoviny, ako zložky potravín spĺňajú dve základné úlohy:
(a) tú, ktorá sa vzťahujú k fyzikálno-chemickým vlastnostiam, esenciálnym pre
udržiavanie dobrej kvality potraviny;
(b) tú, ktorá poskytujú vyhovujúce nutričné požiadavky (Nakai –Modler, 1996).
Z uvedeného vyplýva, že význam bielkovín môžeme hodnotiť jednak z hľadiska
nutričného, a jednak z hľadiska technologického.
10
1.1.2.1. Nutričný význam bielkovín
Základnou požiadavkou racionálneho stravovania je dostatočný príjem
bielkovín v požadovanej kvalite a kvantite v závislosti od veku a životného štýlu
konzumenta.
Nutričná kvalita bielkovín v potravinách je daná:
koncentráciou bielkovín,
aminokyselinovým zložením bielkovín,
stráviteľnosťou bielkovín a dostupnosťou aminokyselín,
ďalšími faktormi, ako napríklad prítomnosť trypsínových inhibítorov a ďalších
antinutričných látok
Z pohľadu koncentrácie bielkovín sú majoritným zdrojom bielkovín najmä potraviny
živočíšneho pôvodu, mäso, hydina, ryby (9 – 29 %) a strukoviny. Semená strukovín
obsahujú podľa druhu 19 - 45 % bielkovín. Obsah bielkovín v semenách hrachu je 22-
28 %, v sóji 35 - 45 %. Bôb obsahuje 32 - 34 % hrubých bielkovín (z toho
stráviteľných bielkovín je až 19,5 %) a až 50 % výťažkových bezdusíkatých látok.
Z aspektu samotných bielkovín je dôležitá skladba aminokyselín, konkrétne vysoký
obsah esenciálnych aminokyselín (Krúdy, 2010). Cereálie s obsahom bielkovín 7 – 15
% sú z hľadiska množstva menej plnohodnotným zdrojom bielkovín. Z netradičných
druhov obilnín sa dostávajú do popredia pohánka (10 – 14 %), láskavec (8 – 14 %)
a mrlík (15 – 18 %). Bielkoviny pohánky majú unikátne zloženie esenciálnych
aminokyselín so špeciálnymi biologickými aktivitami. Podieľajú sa na znižovaní
hladiny cholesterolu, znižovaní krvného tlaku, pomáhajú pri liečbe zápchy, pozitívne
ovplyvňujú peristaltiku čriev (Li - Zhang, 2001; Pšenáková - Faragó, 2006)).
Z esenciálnych aminokyselín je dôležitý obsah lyzínu, metionínu a tryptofánu. Tieto sa
v ostatných obilninách nachádzajú v nedostatočnom množstve (Muchová, 2007;
Moudrý, 2005). Pri hodnotení nutričnej kvality semena láskavca je dôležitý obsah
bielkovín, zastúpenie jednotlivých frakcií bielkovín a s tým súvisiaci obsah
esenciálnych aminokyselín. Gálová et al. (2008) uvádzajú, že obsah cytoplazmatických
bielkovín (albumínov a globulínov), ktoré sa vyznačujú najvyššou nutričnou kvalitou
súvisiacou s vysokým zastúpením esenciálnych aminokyselín, v semenách láskavca
varíroval od 46,2 % do 60,0 %. Na druhej strane, zastúpenie neplnohodnotných frakcií
11
bielkovín – zásobných bielkovín, bolo v rozsahu 22 % − 37,19 %, čo je v porovnaní so
pšenicou približne o 50 % menej (Muchová et al., 2000; Michalík et al., 2006).
Aminokyselinové zloženie bielkovín je dôležitým faktorom hodnotenia kvality
bielkovín. Za plnohodnotnú bielkovinu sa pokladá tá, ktorej aminokyselinové zloženie
zodpovedá vlastnej bielkovine organizmu. Na základe potreby esenciálnych
aminokyselín pre ľudský organizmus sa pre stanovenie kvality bielkoviny začalo
stanovovať aminokyselinové skóre AAS (Amino Acid Score), niekedy interpretované
aj ako CS – Chemical Score. Esenciálne aminokyseliny (valín, leucín, izoleucín,
metionín, treonín, fenylalanín, tryptofán, lyzín) si nedokáže živý organizmus
syntetizovať, a musí ich konzumovať vo forme potravy.
Výpočet AAS:
AAS = 100 Ai / Asi
kde: Ai – obsah danej esenciálnej aminokyseliny v testovanom proteíne
Asi – obsah tej istej aminokyseliny v štandardnom (referenčnom) proteíne
Nutričnú hodnotu proteínu určuje tá esenciálna aminokyselina, ktorá má zo všetkých
esenciálnych aminokyselín najnižšiu hodnotu kritéria AAS. Nazýva sa limitujúca
aminokyselina. Najväčšie rozdiely v obsahu aminokyselín v rôznych zdrojoch bielkovín
sú hlavne v obsahu lyzínu, menšie v obsahu sírnych aminokyselín a tryptofánu.
Rastlinné bielkoviny sú bohatšie na aminokyseliny arginín a glycín, kým v živočíšnych
bielkovinách je vyšší výskyt sírnych aminokyselín, a obsahujú tiež viac fenylalanínu
a tyrozínu ako rastlinné bielkoviny (Rakowska - Ochodzki, 2001). Pri obilninách sa
jedná o deficienciu lyzínu, treonínu a tryptofánu. Naopak, pri strukovinách je
nedostatočne zastúpená - či už v semenách alebo vegetatívnych častiach rastliny najmä
esenciálna síru obsahujúca aminokyselina metionín (Faragó, 2007).
Pohánka obsahuje 18 rôznych aminokyselín, pričom množstvo lyzínu je v porovnaní
s ostatnými obilninami až štvornásobne vyššie (Moravčíková - Hozová, 2005).
Láskavec má pomerne vyváženú skladbu aminokyselín. Z esenciálnych aminokyselín je
v ňom zastúpený relatívne vo vysokom množstve lyzín (9,48 g.kg-1), čo je približne
trojnásobok oproti pšeničnej hladkej múke. Podiel esencialnych aminokyselín
v pšeničnej múke je 26,34 g.kg-1, kým v celozrnnej múke z láskavca je to až 43,23
g.kg-1. Nutrične vyvážené zloženie zrna láskavca mu dáva predpoklad k lepšiemu
12
využitiu v cereálnych technológiách. Mrlík má v porovnaní s obilninami vyšší obsah
lyzínu, histidínu, metionínu a cysteínu (Hozová-Moravčíková, 2010).
Kvalitu bielkoviny umožňuje určiť aj index esenciálnych aminokyselín EAAI (Esential
Amino Acid Index), ktorý je porovnaním aminokyselinového zloženia sledovanej
bielkoviny so zastúpením esenciálnych aminokyselín v štandardnej bielkovine vaječný
albumín (Muchová et al., 2007). Poskytuje informáciu o výživovej hodnote bielkoviny,
zahŕňa príspevok všetkých esenciálnych aminokyselín k výživovej hodnote proteínu.
Pre každú esenciálnu aminokyselinu sa určí hodnota AAS a vypočíta sa geometrický
priemer týchto hodnôt:
EAAI =
kde: EAAI - Esential Amino Acid Index
A – koncentrácia esenciálnych aminokyselín v sledovanej bielkovine, %
As – koncentrácia esenciálnych aminokyselín v štandardnej bielkovine, %.
Obsah aminokyselín v potravinách je ovplyvnený aj spracovaním suroviny. Pri
priemyselnej výrobe potravín podlieha surovina rôznym vplyvom v závislosti od
spracovateľskej technológie. Pomerne často je surovina vystavená pôsobeniu vysokých
teplôt, tlaku, vody, alkalických alebo kyslých médií, čo tiež môže viesť k zmene
nutričnej hodnoty bielkovín. Pôsobením vysokých teplôt dochádza k stratám
esenciálnych aminokyselín a k zníženiu utilizácie bielkovín. Noguchi et.al. (1982) sa
zaoberali vplyvom extrúzie na bielkoviny a zistili, že počas extrúzie došlo k viac ako
40 % strate lyzínu v bielkovinovom substráte. Už Schroeder et al. (1961) skúmali vplyv
tepelného ošetrenia na nutričnú kvalitu bielkovín. V súlade s inými autormi dospeli
k záveru, že súčasne s nárastom pH a teploty stúpali aj interakcie sacharidov
s proteínmi, čo dokazoval aj pokles voľného aminodusíka. Z výsledkov vyvodili záver,
že nutričná hodnota bielkovín klesá so stúpajúcim množstvom sacharidov v substráte.
Stráviteľnosť a dostupnosť aminokyselín je ďalším ukazovateľom nutričnej kvality.
Využiteľnosť, ktorá sa udáva ako koeficient využiteľnosti, t.j. pomer absorbovaných
živín k prijatým živinám (Muchová et al., 2007).
13
Ťažko stráviteľné sú napríklad lepkové bielkoviny cereálií tvorené prolamínmi
a glutenínmi, ktoré sa vyznačujú nízkou rozpustnosťou a nedostatočnou
hydrolyzovateľnosťou proteolytickými enzýmami zažívacieho traktu monogastrov
(Michalík et. al., 2004). Dobrou stráviteľnosťou sa naopak vyznačujú bielkoviny
pohánky, láskavca a mrlíka, ktoré neobsahujú lepok, na základe čoho sú tieto suroviny
cenným zdrojom bielkovín pre osoby citlivé na lepok. Jednou z metód ako dosiahnuť
lepšiu utilizáciu rastlinných bielkovín je suplementácia potravín bielkovinovými
koncentrátmi (obsah bielkovín min. 65 a max. 90 %) alebo izolátmi (obsah bielkovín
min. 90 %). Bielkovinové izoláty získané zo zŕn sezamu, odtučnenej múky kukurice,
hrachu, ako aj pšenice a sójových bielkovín, sa pridávajú do rôznych produktov,
obyčajne ako náhrada vaječného bielka (López et al., 2003).
Prítomnosť antinutričných látok výrazne ovplyvňuje nutričnú hodnotu bielkovín.
Bohaté na antinutričné látky sú semená strukovín, ktoré môžu vyvolať dietetické
poruchy, zníženie stráviteľnosti, využitia a príjmu bielkovín, výsledkom čoho je
sprievodná strata stráviteľných bielkovín. Medzi látky ovplyvňujúce stráviteľnosť patria
inhibítory trypsínu (ich obsah je v sóji 10-krát vyšší ako v hrachu a bôbe), ktoré blokujú
tráviace enzýmy a taníny. Ako antinutričné faktory pôsobia aj saponíny, ktoré
hemolyzujú erytrocyty, spôsobujú horkú chuť, dráždia sliznicu tráviaceho traktu a môžu
narušiť nervový systém, ďalej lektíny aglutimujúce erytrocyty a antivitamíny.
Prítomnosť a nepriaznivý vplyv antinutričných látok sa dá pomerne bez výraznejších
nákladov obmedziť hydrotermickým a tlakovým ošetrením strukovín (extrudéry,
expanzéry ) (Javor et al, 2001).
1.1.2.2. Technologický význam bielkovín
Potreba zlepšovať kvalitu potravín vyvoláva v súčasnosti veľký záujem
potravinárskeho priemyslu o funkčné bielkovinové zložky. Pod pojmom funkčné
vlastnosti bielkovín rozumieme akékoľvek fyzikálne alebo chemické vlastnosti, ktoré
ovplyvnia charakter potraviny v priebehu jej spracovania, skladovania, distribúcie
(Kinsella, 2007; Sikorski, 2001). Tieto vlastnosti bielkovín závisia od štruktúry
bielkoviny a prostredia.
Funkčné vlastnosti bielkovín ako komponentov potravín sú ovplyvnené
molekulovou hmotnosťou a tvarom molekúl bielkovín, ich primárnou štruktúrou
a diverzitou; komformáciou ovplyvnenou kovalentnými a nekovalentnými väzbami, ako
14
i elektrickým nábojom bielkovinových molekúl. Funkčné vlastnosti bielkovín tiež
ovplyvňujú interakcie bielkovín s ostatnými proteínmi, lipidmi, sacharidmi, vodou,
iónmi a aromatickými zložkami potravín (Day et al., 2006).
Interakcia bielkovín s ostatnými zložkami potravín vplýva na senzorické a
reologické vlastnosti potravín, textúru a ďalšie (Belitz et al., 2009). Chuť a vôňu
potravín ovplyvňujú najmä štiepne produkty bielkovín a chemické reakcie s ostatnými
zložkami potravín. Z technologického hľadiska je dôležitá interakcia bielkovín s vodou
(absorpcia/retencia vody, schopnosť napučiavania, adhézia, rozptýliteľnosť,
rozpustnosť, viskozita) (http 1). Na väznosť vody vplýva aminokyselinová skladba
bielkovín, konformácia bielkovín, povrchová polarita/hydrofobicita, pH, teplota,
a ďalšie faktory .
Rozpustnosť bielkovín je funkciou pH, iónovej sily prostredia, teploty a tlaku.
Líši sa v závislosti od zdroja bielkoviny a spôsobu spracovania počas izolácie (Nielsen,
1997). Najnižšia je rozpustnosť bielkovín v okolí izoelektrického bodu, čo sa využíva
na separáciu a izoláciu proteínov. So zvýšenou koncentráciou solí rozpustnosť
bielkoviny narastá, pri veľmi vysokých koncentráciách však naopak dochádza
k vysoľovaniu, čo sa tiež využíva pri izoláciii a purifikácii proteínov. Rozpustnosť
bielkovín narastá aj so stúpajúcim stupňom hydrolýzy. Je to spôsobené hlavne
redukciou molekulovej hmotnosti a nárastom polárnych skupín (Zayas, 1997). Pri
miesení, tepelnom opracovaní potravín, chladení, mrazení je dôležitou vlastnosťou
viskozita. Koeficient viskozity rastie exponenciálne s koncentráciou bielkovín.
Dôležitou technologickou vlastnosťou bielkovín je schopnosť tvoriť gél. Gelácia
je dej, pri ktorom sa základné stavebné jednotky spájajú a v konecnej fáze vytvoria
jedinú makromolekulu s objemom limitovaným objemom nádoby. Vlastnosti gélov
závisia od podmienok pri agregácii, keď dochádza spájaniu menších polymérnych
jednotiek na väčšie častice (Jesenák, 2005). Agregáciu ovplyvňuje koncetrácia
proteínov, teplota a dĺžka tepelného pôsobenia, iónová sila a pH.
Medzi typické rastlinné bielkoviny, ktoré sa v potravinárstve využívajú pre svoje
gelačné schopnosti patria sójové bielkoviny (glycinín, conglicinín) a pšeničný lepok.
Pšeničný lepok má unikátne vlastnosti, ktoré výrazne ovplyvňujú reológiu cesta.
Uplatňujú sa už v prvej fáze tvorby cesta, počas miesenia, kedy dochádza
k mechanicko-fyzikálnym zmenám lepku v dôsledku tvorby disulfidických väzieb
medzi lepkovými frakciami. Počas miesenia dochádza k agregácií proteínových
reťazcov, hydratácii škrobových zŕn a čiastočne neškrobových polysacharidov.
15
Vytvárajú sa glykoproteíny a vzniká systém voda -škrob - lepok, ktorý je čiastočne
emulgovaný (napr. monoacylglycerolmi a ich estermi, ktoré sa prirodzene nachádzajú
v múke) a tak v konečnom dôsledku dochádza k vytvoreniu kompaktnej amorfnej
štruktúry cesta (Muchová et al., 2009). Vlastnosti lepku sú v závislosti od suroviny
ovplyvnené pomerom gliadínov ku glutenínom, ako aj podielom nízko a vysoko
molekulárnych glutenínových podjednotiek (Edwards et al., 2003). Vysoko molekulová
vetvená polymérna bielkovinová frakcia gliadín (prolamín) je zodpovedná za súdržnosť
cesta, kým nízkomolekulárna lineárna polymérna bielkovinová frakcia glutenín
(glutelín) ovplyvňuje odpor voči natiahnutiu (Hosseney, 1994; Gažar - Bojňanská,
2010). Lepkové bielkoviny sú tiež zodpovedné za udržiavanie vlhkosti počas pečenia,
čo v konečnom dôsledku vplýva na textúru striedky chleba. Z povrchových vlastností
bielkovín sú z technologického hľadiska dôležité schopnosť tvoriť emulziu a penu.
Je všeobecne známe, že bielkoviny z rôznych zdrojov majú odlišné vlastnosti
(Tab. 1.1; Tab.1. 2). Z vyššie uvedeného vyplýva, že vhodnosť surového rastlinného
alebo živočíšneho materiálu na rôzne technológie spracovania, závisí od obsahu,
množstva a vlastností bielkovín. Pri kulinárskej úprave mäsa je dôležitý obsah
chromoproteínov, ktoré vplývajú na farbu mäsa, nízky obsah kolagénu a bohatý
myofibrilárny systém, ktorý zabezpečí požadovanú textúru. Iné požiadavky sa kladú na
použitie funkčných mliečnych bielkovín (kazeínu, srvátkového proteínového
koncentrátu alebo izolátu, mliečnych hydrolyzátov) do potravín. Tu sa zameriavame na
také vlastnosti ako rozpustnosť, absorpcia/retencia vody, tvorba peny, emulgačná
kapacita.
Tab.1. 1 Požiadavky na funkčné vlastnosti bielkovín ako komponentov potravín
Vlastnosti Prisudzovaná funkcia v potravine
senzorické chuť, vôňa, textúra, farba
optické nepriehľadnosť, zákal, farba
hydratačné rozpustnosť, rozptýliteľnosť, tvorba gélu, viskozita
povrchová aktivita emulzia, penivosť, šľahateľnosť
16
textúra viskozita, adhézia, agregácia, tvorba gélu
reologické agregácia, tvorba gélu, viskozita, extrudovateľnosť
Zdroj: http://class.fst.ohio-state.edu/FST605/lectures/Lect12.html, upravené
Tabuľka 1. 2 Charakteristika funkčných vlastností bielkovín v niektorých
potravinách
BielkovinaEmugačná
schopnosťŠľahateľnosť
Tvorba
gélu
Tvorba
filmu
Stabilitatepelná/
v kyslom
prostredí
vaječný bielok
nízka vysoká vysoká stredná nie
vaječný žĺtok
vysoká nízka stredná nízka nie
kazeináty vysoká stredná nízka vysoká áno /nie
srvátka strednánízka až vysoká
nízka až vysoká
stredná nie / áno
sójový izolát
stredná až vysoká
nízka až stredná
strednástredná až
vysokánie / nie
zdroj: http://class.fst.ohio-state.edu/FST605/lectures/Lect12.html, upravené
Tabuľka 1. 3 Požiadavky na funkcie bielkovín v rôznych druhoch potravín
PotravinaPožadované funkcie pre
všetky produkty
Požadované funkcie pre niektoré
produkty
nápoje rozpustnosť, koloidná stabilitastabilita voči kyselinám, tvorba
emulzie, väznosť vody
pekárske produktyrozpustnosť, tvorba emulzie,
tvorba gélu
tvorba peny, stabilita peny, väznosť
vody, modifikácia gluténu
cukrovinky tvorba peny, rozpustnosť tvorba emulzie, tvorba gélu
mrazené krémytvorba emulzie, tvorba peny,
rozptýliteľnosť
rozpustnosť, väznosť vody, náhrada
tuku
napodobneniny
mliečnych výrob.
tvorba emulzie, koloidná
stabilita
rozpustnosť, tvorba peny, stabilita
peny
detská výživa nutričná hodnota, rozpustnosť,
tvorba emulzie, koloidná
náhrada zložiek materského mlieka
17
stabilita pri záhreve
upravené mäso tvorba emulzie, väznosť vodyslabá viskozita v roztoku, tvorba
gélu, náhrada tuku
šľahané omáčkytvorba emulzie, koloidná
stabilita pri záhreveväznosť vody, tvorba viskozity
Zdroj : http://class.fst.ohio-state.edu/FST605/lectures/Lect12.html, upravené
1.2 Charakteristika mikrobiálnych proteolytických enzýmov
aplikovaných pre cielenú úpravu bielkovinovej suroviny
1. 2.1 Proteolytické enzýmyProteolytické enzýmy- proteázy, sú fyziologicky a komerčne dôležitou skupinou
enzýmov. Patria do tretej triedy enzýmov – Hydrolázy (EC 3.4.). Katalyzujú
hydrolytické štiepenie peptidických väzieb -CO-NH- v bielkovinách a peptidoch.
V závislosti od miesta a spôsobu hydrolýzy sa delia na endopeptidázy a exopeptidázy
(Škárka – Ferenčík, 1987). Pre endopeptidázy sa v minulosti používal aj výraz
proteinázy. Názov peptidázy sa používal pre exopeptidázy. V roku 1992 Medzinárodná
organizácia pre biochémiu a molekulárnu biológiu (IUBMB) odporučila, aby sa pre
proteolytické enzýmy používal jednotný názov peptidázy (http 2).
Informácie vzťahujúce sa ku konkrétnym peptidázam sú zhrnuté vo viacerých
databázach. Medzi najznámejšie patria MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk)
a BRENDA (http://www.brenda-enzymes.org) databáza.
Databáza MEROPS využíva hierarchickú klasifikáciu, založenú na štruktúre
enzýmu. Umožňuje vyhľadať enzýmy a ich inhibítory podľa mena, identifikátora, názvu
génu, producentského organizmu a substrátovej špecifity (Rawlings, 2010). Databáza
BRENDA zahŕňa informácie o funkcii, štruktúre, lokalizácii, izolácii, a stabilite
všetkých identifikovaných enzýmov bez ohľadu na zdroj enzýmu.
1.2.1.1. Zdroje proteolytických enzýmov
Proteolytické enzýmy reprezentujú triedu enzýmov, ktorá má významnú úlohu vo
fyziologických procesoch organizmov a v súčasnosti patria do jednej z troch
najrozšírenejších komerčne využívaných skupín enzýmov. Predstavujú 60 % svetového
predaja enzýmov. Enzýmy môžu byť získavané viacerými spôsobmi, napríklad
18
extrakciou z rastlinných či živočíšnych zdrojov, alebo produkciou mikroorganizmami
(Sondergaard et al., 2005), pričom každá skupina enzýmov vykazuje určité špecifiká.
Z rastlín sa ako zdroje pre izoláciu peptidáz využívajú časti a plody rastlín:
Carica papaya (papaín), Ficus glabatra a Ficus carica (ficín) Ananas comosu
(bromelaín).
Enzýmy živočíšneho pôvodu (trypsín, chymotrypsín, pepsín, renín) sa získavajú
z pankreasu jatočných zvierat. Ich dostupnosť je obmedzená množstvom živočíšneho
materiálu. Nevýhodou živočíšnych aj rastlinných peptidáz je ich producentský
organizmus, pretože rast a vývoj týchto organizmov je časovo náročnejší, ako je to
u mikrobiálnych buniek. Najrozšírenejším zdrojom pre získavanie industriálnych
enzýmov sú mikroorganizmy (Ibrahim, 2008). Všeobecnou výhodou využívania
mikroorganizmov je ich rýchly rast, široké spektrum produkovaných enzýmov
a možnosti génových manipulácií s cieľom zvýšenia, alebo urýchlenia produkcie.
Väčšina industriálnych enzýmov je produkovaných relatívne malým počtom rodov
mikroorganizmov, z húb sú najviac využívané rody Aspergillus, Trichoderma a
Streptomyces a z baktérií rody Bacillus (Leisola et al., 2010).
Baktérie- produkujú najčastejšie neutrálne a alkalické peptidázy, z producentov
sa najčastejšie využíva rod Bacillus. Bakteriálne peptidázy majú zvyčajne nižšiu
peptidolytickú aktivitu voči makromolekulovým proteínom a využívajú sa na výrobu
hydrolyzátov s nízkym stupňom hydrolýzy (10 -15 DH). Z tohto dôvodu degradačné
produkty získané použitím bakteriálnych proteáz obsahujú veľké množstvo
vysokomolekulových peptidov. Niektoré neutrálne peptidázy patria k metalopeptidázam
napr. thermolysin z Bacillus thermoproteolyticus a niektoré, napr. subtilisin BPN’ z
Bacillus amyloliquefaciens patria k Ser-peptidázam (http 3).
Bakteriálne neutrálne peptidázy majú relatívne nízku termotoleranciu a sú
aktívne v úzkom rozpätí pH (pH 5 - 8). Napríklad Neutrase® 0.8L (DSM) sa inaktivuje
za 2 minúty pri teplote 85 °C, avšak stabilita enzýmu závisí aj od substrátu
(koncentrácia, pH a pod.) (http 4). Nízka termotolerancia je výhodou pre kontrolu
reaktivity neutráz počas enzýmovej hydrolýzy pri výrobe hydrolyzátov s nízkym
stupňom hydrolýzy. Využitie neutrálnych peptidáz v potravinárskom priemysle má svoj
význam, nakoľko ich proteínové hydrolyzáty vykazujú menej horkú chuť ako pri
použití živočíšnych peptidáz. Bakteriálne neutrázy sú charakteristické ich afinitou
k hydrofóbnym aminokyselinám. Nakoľko nie sú citlivé voči natívnym rastlinným
inhibítorom, sú vhodné na využitie v pivovarskom priemysle (Rao et al., 1998).
19
Bakteriálne alkalické peptidázy sú charakteristické aktivitou pri alkalickom pH
a širokou substrátovou špecifitou, pri teplotnom optime asi 60 °C. Tieto vlastnosti im
umožňujú uplatniť sa vo výrobe čistiacich prostriedkov.
Mikroskopické vláknité huby - Aspergillus flavus, A. niger, A.oryze, Rhizomucor
pussilus, R.meiherei, rod Rhizopus, produkujú širšiu paletu enzýmov ako baktérie,
pričom peptidázy vykazujú aktivitu pri širokom rozpätí pH (pH 4 - 11) pri širokej
substrátovej špecifite. Aspergillus oryzae produkuje kyslé, neutrálne, aj alkalické
peptidázy. Nevýhodou však je, že ich reaktivita je obmedzená nízkou odolnosťou
enzýmov voči teplotám. Kyslé peptidázy majú otimálne pH medzi 4 a 4,5 a sú stabilné
pri pH 2,5 - 6. Tieto vlastnosti sú však dobre využiteľné vo výrobe syrov.
Fungálne neutrálne peptidázy patria medzi metalopeptidázy. Sú aktívne pri pH 7
a inhibujú ich chelatačné činidlá. Využívajú sa ako doplnkové enzýmy k rastlinným
živočíšnym a bakteriálnym peptidázam, pre ich schopnosť hydrolyzovať hydrofóbne
aminokyselinové väzby, čím prispievajú k redukcii horkosti proteínových hydrolyzátov.
Fungálne alkalické peptidázy sa tiež využívajú na modifikáciu potravových bielkovín.
Ehren et al. (2009) porovnávali účinnosť hydrolýzy lepku pomocou aspergillopepsínu
z Aspergillus niger a dipeptidyl peptidázy IV z Aspergillus oryzae. Ani jedna
z peptidáz použitých samostatne nepreukázala účinok na imunotoxické petidy, najlepší
hydrolytický účinok zaznamenali pri použití kombinácie oboch enzýmov.
Vírusy- význam majú virálne peptidázy v medicíne, kde sa skúma ich vzťah
k mnohým chorobám, ako je AIDS alebo rakovina. V potravinárskom priemysle sa
peptidázy získané z vírusov nevyužívajú.
Exopeptidázy ( EC 3.4.11.-19. )
Exopeptidázy katalyzujú štiepenie peptidových väzieb od konca
polypeptidického reťazca. V závislosti od toho, na ktorý koniec bielkoviny pôsobia, sa
ďalej delia na aminopeptidázy, dipeptid-peptidázy a tripeptidyl-peptidázy,
karboxypeptidázy, peptidyl-dipeptidázy a omegapeptidázy (Vodrážka et al., 1998).
Aminopeptidázy (EC 3.4.11.) odštepujú voľné aminokyseliny od N-konca
polypeptidového reťazca. V prokaryotických aj eukaryotických bunkách sa nachádzajú
v mnohých subcelulárnych organelách, sú zložkami proteínov membrán a cytosólu.
Väčšina aminopeptidáz sú metaloproteíny zinku (Stano et al., 2007).
V metabolizme bielkovín majú okrem pôsobenia na N-konce peptidov, aj viaceré
špecifické funkcie, ako napríklad aktiváciu a inaktiváciu biologicky aktívnych
20
bielkovín alebo odstránenie N-koncového metionínu z novosyntetizovaných proteínov
(Wilk et al., 1998).
Aminopeptidázy baktérií a mikroskopických vláknitých húb vykazujú rôzne
substrátové špecifity. Klionski et al. (1990) uvádzajú, že aminopeptidáza 1 (EC
3.4.11.22) má veľkosť 640 kDa a jej aktivitu stimulujú ióny Zn2+ a Cl-. Metionyl
aminopeptidáza 1, Aminopeptidáza Y a Aminopeptidáza I sú aminopeptidázy
izolované zo Saccharomyces cerevisiae. Aminopeptidáza Y vyžaduje pre svoju aktivitu
prítomnosť iónov Co2+ a je inhibovaná prítomnosťou iónov Zn2+ a Mn2+. PepA
aminopeptidáza izolovaná z Escherichia coli vykazuje preferenciu pre leucín alebo
metionín a potrebuje pre svoju aktivitu prítomnosť zinku (Minh et al., 2009). Midwinter
– Pritchard (1994) izolovali Aminopeptidázu N s molekulovou hmotnosťou 96 kDa
zo Streptococcus salivarius subsp. thermophillus. Jej najvyššia aktivita bola
zaznamenaná v miestach väzby lyzínu, arginínu a leucínu. Arima et al. (2008)
purifikovali aminopeptidázu P z Streptomyces costaricanus. Enzým vykazoval širokú
substrátovú špecifitu a preferenciu pre ióny Zn2+.
Dipeptid-peptidázy (EC 3.4.13.) a tripeptidyl-peptidázy (EC
3.4.14.) hydrolyzujú dipeptidy a tripeptidy na príslušné aminokyseliny.
Karboxypeptidázy (EC 3.4.16.-18.) a peptidyl-dipeptidázy (EC 3.4.15.)
odštepujú koncovú aminokyselinu z C-konca polypeptidového reťazca (Polaina et al.,
2007).
Na základe charakteru aminokyselinových zvyškov v aktívnom mieste enzýmu
sa delia do troch skupín: karboxypeptidázy serínového typu (EC 3.4.16.) sú izolované
z Penicillium spp., Saccharomyces spp. a Aspergillus spp.. Majú podobnú substrátovú
špecifitu, ale vykazujú rôznorodosť v oblasti pH optima, stability, molekulárnej
hmotnosti a efektu inhibítorov. Metalokarboxypeptidázy (EC 3.4.17.) sú izolované z
rodov Saccharomyces a Pseudomonas a vyžadujú pre svoju aktivitu ióny Zn2+ a Co2+ .
Omegapeptidázy (EC 3.4.19. ) katalyzujú hydrolýzu koncových zvyškov
substituovaných, cyklizovaných alebo izopeptidovými väzbami spájaných aminokyselín
(Rao, 1998). Galvao et al. (2009) využili karboxypeptidázu A na odstránenie
fenylalanínu z hydrolyzátu srvátkového proteínu, čím dosiahli možné využitie
srvátkového hydrolyzátu pre ľudí trpiacich fenylketonúriou.
21
Endopeptidázy ( EC 3.4.21-99 )
Endopeptidázy štiepia peptidové väzby vo vnútri proteínovej štruktúry
vzdialené od konca substrátu. Naughton už v roku 1960 (Naughton et al., 1960) popísal
štyri rozličné typy katalytického mechanizmu endopeptidáz. Toto pozorovanie bolo
rozvinuté do praktického systému klasifikácie týchto enzýmov. Podľa typu zlúčeniny,
ktorá inhibuje ich aktivitu sa delia na: serínové, cysteínové, aspartátové,
metaloendopeptidázy, treonínové a zatiaľ neklasifikované endopeptidázy, ktoré nemajú
ešte presne charakterizovanú štruktúru katalytického miesta (Urminská, 1997).
Serínové peptidázy ( EC 3.4.21.)
Serínové peptidázy tvoria veľmi významnú skupinu enzýmov, či už z hľadiska
potravinárskeho alebo farmakologického. Zúčastňujú sa širokej škály fyziologických
procesov organizmu, vrátane trávenia, hemostázy a imunitnej odpovede (Zakharova et
al., 2009). Majú širokú substrátovú špecifitu a ich katalytické centrum je tvorené
serínovým zvyškom s voľnou hydroxylovou skupinou. Sú najrozšírenejšou skupinou
proteolytických enzýmov mikroorganizmov a živočíchov Patria sem predovšetkým
tráviace enzýmy živočíchov a enzýmy produkované mikroorganizmami (North, 1982).
Serínové peptidázy sú zvyčajne endopeptidázy a katalyzujú hydrolýzu peptidových
väzieb vo vnútri polypeptidového reťazca, ale boli popísané aj serínové peptidázy
katalyzujúcich odštiepenie jednej alebo viac aminokyselín z konca polypeptidového
reťazca (Cera, 2009).
Serínové peptidázy sú aktívne pri neutrálnom a alkalickom pH s optimom medzi
hodnotami 7-11. Majú širokú substrátovú špecificitu a vyznačujú sa aj esterolytickou
aktivitou. Sú to enzýmy s molekulovou hmotnosťou 18,5 - 35 kDa (Vodrážka et al.,
1998). Najviac preštudovanými Ser-peptidázami sú tráviace enzýmy trypsín a
chymotrypsín.
Trypsín (EC 3.4.21.4) je proteáza živočíšneho pôvodu, produkovaná
v pankrease. Štiepi polypeptidový reťazec len v miestach, kde sa v peptidovej väzbe
viaže karboxylová skupina arginínu alebo lyzínu, pri optimálnom pH 7 – 9 (Ferenčík et
al., 2000). Trypsín je produkovaný vo forme inaktívneho trypsinogénu, z ktorého
vzniká účinkom enzýmu enteropeptidáza. Trypsín je relatívne malý enzým s
molekulovou hmotnosťou 23,3 kDa a pH optimom 7 – 9. V súčasnosti patrí medzi
najčastejšie komerčne využívané enzýmy. V potravinárstve sa používa napríklad
Trypsín Novo vyrábaný firmou Novo Nordisk v Dánsku, získavaný z pankreasu
22
ošípaných. V kombinácii s chymotrypsínom sa využívajú na úpravu špeciálnych
bielkovín pre prípravu hypoalergénnych diét (Bonomi et al., 2000).
Úspešne sa tiež využíva na prípravu koncentrátov srvátkových proteínov. Mota
et al. (2006) skúmali pôsobenie trypsínu za rôznych podmienok teploty a pH. Hydrolýza
prebehla v časovom rozpätí 15 min. teplote 37° C a pH 9, ako aj pri použití teploty 50
°C a pH 8. Naopak pomalý priebeh hydrolýzy (120 min.) zaznamenali pri teplote 37 °C
a pH 8. Kyung-Koh et al. (2008) pozorovali hydrolytické účinky trypsínu na pšeničný
lepok. HPLC analýza preukázala zníženie množstva vysokomolekulárnych a zvýšenie
množstva nízkomolekulárnych frakcií. Beran et al. (2009) skúmali vplyv vysokého
(500 MPa) hydrostatického tlaku na tryptickú a chymotryptickú hydrolýzu mliečnych
bielkovín a hovädzieho sérového albumínu. Po aplikácii vysokého hydrostatického
tlaku v priebehu tryptickej hydrolýzy β-laktoglobulínu, α-laktoalbumínu a hoväzieho
sérového albumínu boli zistené významné zmeny peptidových profilov a progresívne
zníženie množstva pôvodne prítomných nerozštiepených bielkovín. Okrem toho bolo
zistené významné zníženie zvyškových imunoreaktívnych produktov tryptického
hydrolyzátu β-laktoglobulínu a chymotryptického α-laktoalbumínu.
Chymotrypsín (EC 3.4.21.1) vzniká v tenkom čreve živočíchov a štiepi
substrát na miestach, kde sa na tvorbe peptidovej väzby zúčastňuje karboxylová skupina
aromatických aminokyselín (tyrozín, fenylalanín) alebo aminokyselín s rozmerným
nepolárnym reťazcom (metionín, leucín, tryptofán) (Lieberman – Marks, 2009).
Chymotrypsín je proteolytický enzým s pH optimom okolo 8. Vznik aktívneho
chymotrypsínu z chymotrypsinogénu prebieha v tenkom čreve účinkom trypsínu
(Ferenčík et al., 2000). Je inaktivovaný pankreatickým trypsínovým inhibítorom, ale za
účinku Ca2+ katiónov je tento proces spomaľovaný (Fioretti et al., 1994). Chymotrypsín
sa používa ako súčasť liekov pri liečení podliatin, zlomenín a rán. Castillo-Yáñez et al.
(2006) izolovali chymotrypsín z tráviacej sústavy sardiniek, ktorý sa môže využiť ako
biotechnologický preparát pre využitie odpadu v priemysle spracovania rýb, ako
materiálu pre produkciu kvalitného bielkovinového hydrolyzátu.
Karamac- Rybarczyk (2008) popísali chymotrypsínovú hydrolýzu šošovicových
bielkovín. Hydrolýza s dosiahnutým stupňom hydrolýzy 13 % prebiehala 120 min. a
bola kontrolovaná metódou pH-stat. Na rozdelenie produktov hydrolýzy podľa
molekulových veľkostí použili metódy SDS-PAGE a SE-HPLC. V hydrolyzáte boli
prítomné nehydrolyzované proteíny, ale prevládajúcu skupinu tvorili produkty
23
hydrolýzy s molekulovou hmotnosťou 0,5- 6,5 kDa, pričom sa nepozorovalo výrazné
zhorknutie hydrolyzátu.
Mikrobiálne Ser-peptidázy sú produkované všetkými druhmi
mikroorganizmov, no pre výrobný účel sa používajú hlavne baktérie, ktoré sú
producentami veľkého množstva extracelulárnych enzýmov (Vodrážka, 1993).
Serínové peptidázy trypsínového typu prednostne štiepia peptidové väzby
tvorené zásaditými aminokyselinami a ich optimálne pH je 8. Na ich získavanie sa
prevažne využíva produkcia baktériami rodu Streptomyces (Morihara et al., 1967;
Sinha et al., 1991; Fuhong et al., 2010).
Alkalické Ser-peptidázy vykazujú najvyššiu aktivitu pri pH10 a ich
producentmi sú baktérie rodu Bacillus, mikroskopické huby Aspergillus sp.,
Neurospora crassa a kvasinky Sacharomyces cerevisiae. Veľmi často využívanou
alkalickou proteázou je „Subtilizín“ produkovaný baktériou Bacillus licheniformis.
Nachádza sa v komerčných produktoch pod názvami Alkalase 2,4L (Novozymes) a
Protex L (Genencor). Alkaláza z Bacillus licheniformis bola použitá na hydrolýzu
proteínového izolátu z fazule mungo. Hong-Li et al. (2005) skonštatovali, že hydrolyzát
obsahuje vysokú ACE inhibítorovú aktivitu, pričom najvyššia aktivita bola
zaznamenaná po 120 min. hydrolýzy. Nehydrolyzovaný proteín inhibítorovú aktivitu
nevykazoval. Z výsledkov vyplýva, že alkalázou hydrolyzovaný proteínový izolát
fazule mungo má perspektívu pre použitie pri výrobe fyziologicky funkčných potravín
s antihypertezívnou aktivitou.
Aspergillus oryzae produkuje Ser-peptidázu distribuovanú pod názvom
Flavourzyme (Novo Nordisk) používanú na produkciu mäsových aróm z rastlinných
proteínov (Wu et al., 2000), alebo na získavanie rybích hydrolyzátov s dobrými
funkčnými vlastnosťami (Karam - Nicell, 1997).
Myxobacter alfa-lytické ser-peptidázy, produkované rodom Sorangium,
sú špecifické na štiepenie väzieb obsahujúcich karboxylové skupiny neutrálnych
alifatických aminokyselín. Do tejto podtriedy patrí aj enzým elastáza (Urminská, 1997).
Stafylokokové ser-peptidázy produkované Staphylococcus aureus
pôsobia špecificky na väzby kyslých aminokyselín pri pomerne širokom
pH optime 4,0 – 7,8 (Morihara, 1974).
24
Cysteínové peptidázy ( EC 3.4.22 )
Aktívne centrum cysteínových peptidáz je tvorené trojicou aminokyselín:
cysteínu, histidínu a glutamínu (Storer - Menard, 1994; Wagstaff et al.,2002). Patria
sem známe rastlinné enzýmy ako napríklad papaín, bromelaín, ficín, kaspázy, ako aj
rôzne enzýmy mikrobiálneho pôvodu.
V potravinárstve, najmä v mäsovom priemysle, má využitie na vápniku závislá
peptidáza kalpaín. V súčasnosti sa pozornosť sústreďuje na vysvetlenie vzťahov medzi
kalpaínom a jeho inhibítorom kalpastatínom v súvislosti s ovplyvnením postmortálnej
tenderizácie mäsa (Bracho – Timaure, 2008).
Historické využitie, založené na empírii, v potravinárstve má peptidáza papaín
(EC 3.4.22.2), ktorá sa získava zo zelených a nezrelých plodov papáje Carica papaya.
Okrem peptidových väzieb hydrolyzuje aj amidové a esterové väzby. Svojím účinkom
sa podobá chymotrypsínu, ale optimálne pôsobí pri neutrálnom pH. V potravinárstve sa
používa na prípravu proteínových hydrolyzátov a tenderizáciu mäsa a mäsových
produktov, v pivovarníctve pri čírení piva, v menšej miere v cukrovinkárstve na výrobu
žuvačiek a v mliekarenstve pri výrobe syrov (James – Simpson, 1996). Taktiež sa
využíva aj v iných oblastiach, napríklad vo farmaceutickom a textilnom priemysle napr.
pri postupe úpravy nezrážavej vlny. Výrobca papaínu, firma Deerland (http. 5) uvádza,
že optimálne pH pre aktivitu papaínu sa pohybuje v rozpätí pH 5-7, pri pH pod 3,5
a nad pH 10 je enzým inaktivovaný. V porovnaní s inými peptidázami je papaín
termostabilný, jeho teplotné optimum sa pohybuje medzi 65 – 80 °C, inaktivujú ho
teploty nad 90 °C. Bandyopadhyay – Ghosh (2002) použili papaín na hydrolýzu
proteínového izolátu sezamu. Najvyšší stupeň hydrolýzy sa dosiahol do 10 min. od
začiatku hydrolýzy, pričom počas hydrolýzy bolo pozorované signifikantné zníženie
molekulárnych hmotností peptidov. Výsledný hydrolyzát mal tiež iné funkčné vlastnosti
ako pôvodný proteín, výrazne sa zvýšila rozpustnosť, EAI (Emulsion Activity Index)
a ESI (Emulsion Stability Index). V praxi sa papaín aplikuje v pečivárňach pri výrobe
pečív z cícerovej múky pre potrebu bezlepkovej diéty. Cícerová múka dáva za
normálnych okolností drobivé cesto, ale po aplikácii papaínu je cesto kompaktnejšie a
lepšie tvarovateľné (Mikušová, 2010).
Ficín (EC 3.4.22.3) sa získava z latexu stromu Ficus glabatra a Ficus carica.
Zelené figy o hmotnosti 10 – 15 g obsahujú až 100 – 150 mg enzýmu. Ficín sa používa
na hydrolýzu rôznych bielkovín, na stabilizáciu piva a v nedávnej minulosti aj ako
25
alternatívna metóda na získavanie striebra z použitých fotografických filmov (Vodrážka
et al., 1998).
Bromelaín je skupinové pomenovanie enzýmov objavených v rôznych druhoch
čeľade Bromeliaceae, najviac je využívaný ananás Ananas comosus. Európsky výrobca
rastlinných proteáz firma S.A. BIOCHEM EUROPE (http 6) udáva, že najväčšia
koncentrácia bromelaínu sa nachádza v nižšie položenej – stopkovej časti zrelej rastliny
ananásu, v komerčne zaujímavom množstve je prítomný tiež v plodoch a listoch.
Podobne ako papaín má širokú škálu využitia vo všetkých odvetviach potravinárskeho
priemyslu. Bromelaín je známy svojou aplikáciou pri hydrolýze väčšiny rozpustných
proteínov, napr. pri výrobe oblátiek a napolitánok (Ortiz – Anon, 2000). V bielkovinách
štiepi predovšetkým v mieste Z-Arg-Arg. Bromelaín je aktívny pri pH 5 – 9 a teplotou
inaktivovaný pri 70 °C. Na rozdiel od papaínu a ficínu je glykoproteínom. Významné
využitie má aj vo farmácii, kde bol dokázaný protizápalový, protizrážací a
fibrinolytický účinok bromelaínu (Maurer, 2001).
Zingipain je názov pre GP-I a GP-II petidázy papaínového typu izolované
z rizómu zázvora (Zingiber officinale). Peptidázy GP-I a GP-II prednostne hydrolyzujú
peptidy s prolínovým zvyškom na P2 pozícii peptidu (Choi – Laursen, 2000). Peptidázy
sú inhibované iónmi kovov Hg2+, Cu2+, Cd2+ and Zn2+ (Ohtsuki et al., 1995).
Mikrobiálne cysteínové peptidázy sa podľa producenta delia do dvoch skupín:
clostripaínové peptidázy - producentom ktorých je Clostridium histolyticum, ktoré
špecificky pôsobia na bázické aminokyseliny a streptokokové peptidázy, ktoré sú
produkované baktériami Streptococcus sp. ako zymogény, ktoré sú autokatalyticky
aktivované na enzým. Tieto enzýmy majú širokú substrátovú špecifitu
a v potravinárstve sa využíva najmä peptidáza zo Streptococcus thermophilus, ktorou sa
odstraňujú tzv. horké peptidy (Fernandez-Espla – Rul, 1999).
Asparátové peptidázy ( EC 3.4.23 )
Označujú sa aj ako karboxylové endopeptidázy, lebo majú v katalytickom mieste
dve karboxylové skupiny, ktoré sú súčasťou kyseliny asparágovej. Medzi živočíšne
Asp-peptidázy patrí predovšetkým pepsín, ktorý sa nachádza v žalúdočnej šťave
stavovcov a vytvára sa z pepsinogénu A. Štiepi peptidové väzby, ktoré tvoria
hydrofóbne, predovšetkým aromatické zvyšky aminokyselín (Kageyama et al., 2009).
Štiepenie nastáva na C-konci od fenylalanínu, leucínu a kys. glutámovej, neštiepi pri
valíne, alaníne alebo glycíne. Optimálne pH pepsínu A je 2 - 4 a stabilný je pri teplote
26
60 °C. Pepsín je nevratne inaktivovaný pri pH > 6 (Ferenčík et al., 2000). Produkty jeho
pôsobenia sa nazývajú aj peptóny. Využíva sa na prípravu bielkovinových
hydrolyzátov pre špeciálnu výživu (detská výživa, instantné cereálie), pri výrobe syrov
a k prevencii chladového zákalu piva ( Vodrážka et al., 1998 ).
Mikrobiálne asparátové peptidázy sa delia na peptidázy pepsínového typu
a renínového typu.
Asparátové petidázy pepsínového typu produkujú Aspergillus, Penicillium,
Rhizopus, Trametes a Neurospora crassa (Rao et al., 1998). Sú to extracelulárne
enzýmy, ktoré majú rozsiahle komerčné využitie napr. pri výrobe sójových omáčok.
Mikrobiálny pepsínový typ aspartátových proteáz má veľmi jednoduché fyzikálne a
chemické vlastnosti živočíšneho pepsínu, vrátane nízkej esterolytickej aktivity.
Aspartátové peptidázy renínového typu produkujú rôzne mikroorganizmy,
Endothia parasitica, Mucor sp. a Aspergillus candidus (Rao et al, 1998)). Enzýmy z
Endothia a Mucor sa používajú pri výrobe syrov (Kalitz, 1988). V humánnej medicíne
sa skúmajú aspararátové peptidázy produkované kvasinkami Candida albicans
a Candida tropicalis, ktoré sú považované za vážny faktor virulencie vírusu HIV
(Hidalgo – Vazques, 2010). Prítomnosť týchto enzýmov je esenciálna pre životný
cyklus retrovírusov a toto môže byť dobrý smer pre chemoterapiu špecifickými
inhibítormi.
Metaloendopeptidázy ( EC 3.4.24 )
Metalopeptidázy môžu byť charakterizované na základe svojej substrátovej
špecifity:
a) stromelyzíny, prednostne degradujúce proteoglykány a bázické membránové
komponenty,
b) želatinázy, prednostne hydrolyzujúce želatíny,
c) kolagenázy, ktoré štiepia kolagén (Okada et al., 1986; Means et al., 2004).
Okrem niekoľkých výnimiek sa všetky komerčne využívané kolagenázy izolujú
z anaeróbnej baktérie Clostridium histolyticum. V prostetickej skupine metalopeptidáz
je prítomný ión kovu, zvyčajne zinku, ktorý môže byť v niektorých prípadoch
nahradený aj iným prechodným kovom. Prednostne katalyzujú hydrolýzu peptidov
s hydrofóbnymi postrannými reťazcami, obsahujúcimi napríklad fenylalanín a leucín.
Sú citlivé voči chelatačným činidlám ako napr. EDTA, ale inhibícia je zvyčajne vratná
27
pridaním iónov zinku, kobaltu a vápnika (Gripon et al ., 1980). Komerčný význam majú
predovšetkým mikrobiálne metalopeptidázy.
Kyslé metalopeptidázy produkuje Penicillium caseicolum, Penicillium
roqueforti, Aspergillus sojae a Aspergillus oryzae (Gripon et al., 1980). Neutrálne
metalopeptidázy sú špecifické voči hydrofóbnym a objemným aminokyselinovým
zvyškom. Okrem jedného atómu zinku sa v ich molekule nachádzajú aj dva až štyri ióny
vápnika, čo plní veľmi dôležitú úlohu v termostabilite týchto enzýmov. Z producentov
možno spomenúť Aspergillus sp. a Bacillus thermoproteolyticus, ktorý produkuje
enzým termolyzín (Grandi et al., 2009). Hatanaka et al. (2008) charakterizovali novú
metalopeptidázu z Streptomyces aureofaciens s názvom kybilyzín. Peptidáza
vykazovala substrátovú špecifitu pre tyrozín, prolín a leucín.
Alkalické metalopeptidázy sú produkované Pseudomonas aeruginosa
a Serratia marcescens. Myxobacter peptidáza I je enzým špecificky pôsobiaci na
malé aminokyseliny a je produkovaný Sorrangium, Arthrobacte crystallopoites a
ďalšími Gram pozitívnymi baktériami. Myxobacter peptidáza II má vysokú
špecifitu pre peptidové väzby, ktorých sa zúčastňuje aminokyselina lyzín (Kalitz, 1998).
1.2.1.2. Príprava proteolytických enzýmov
Proteolytické enzýmy sa spravidla pripravujú submerznou kultiváciou
produkčného kmeňa rodu Bacillus (Bacillus subtilis alebo Bacillus licheniformis).
Enzýmový preparát sa z kultivačného prostredia získava centrifugáciou alebo filtráciou,
po separácii bakteriálnych buniek od média, s následným zrážaním anorganickými
soľami alebo organickými rozpúšťadlami. Získaný percipitát sa ďalej purifikuje
chromatografickými metódami, ako gélová filtrácia, ionomeničová a afinitná
chromatografia (Szabová, 2006).
1.3. Bielkovinové hydrolyzáty, charakteristika, význam , využitie
1. 3. 1 Charakteristika enzymatických hydrolyzátov
1.3.1. 1 Bielkovinové suroviny využívané na prípravu hydrolyzátov
Bielkovinové hydrolyzáty sú zmesi oligopeptidov, polypeptidov a voľných
aminokyselín. Enzymatickou hydrolýzou sa získa z pôvodnej bielkoviny zmes
28
štiepnych produktov od vysokomolekulových peptidov, cez nízkomolekulové peptidy
až po aminokyseliny.
Enzymatická modifikácia bielkovín je efektívna metóda, ako zlepšiť rôzne
funkčné vlastnosti bielkovín a rozšíriť možnosti aplikácie bielkovín použitím správneho
enzýmu, podmienok hydrolýzy a stupňa hydrolýzy, ktoré sú rozhodujúce Hydrolýza
potravinových bielkovín je široko využívaná pre pridanú hodnotu ako: zlepšenie
nutričných znakov, brzdenie zhoršenia kvality, zlepšenie funkčných vlastností
a odstránenie toxických alebo inhibičných zložiek (Clemente, 2000) pre zlepšenie
funkčných vlastností bielkoviny.
Enzymatická hydrolýza sa aplikuje tak na suroviny zo živočíšnych zdrojov, ako
aj rastlinných. Zo živočíšnych surovín sa najčastejšie využívajú mliečne bielkoviny,
mäsové bielkoviny: jatočná krv, kolagén, želatína, vaječný albumín. Mnoho autorov sa
venuje aj hydrolýze bielkovín rýb. Z rastlinných zdrojov sa využívajú strukoviny
(fazuľa, šošovica, vika, hrach, bôb, lupina, cícer), olejniny (repka, slnečnica, sezam) aj
obilniny. Zo strukovín je však využívanejším substrátom sója (Molina – Wagner, 2002;
Surówka et al., 2004; Zhong et al., 2007; Ryan et al., 2008). Z obilnín sa využívajú
bielkoviny ryže, kukurice, jačmeňa a pšeničný lepok, ktorý patrí zasa medzi najčastešiu
surovinu spomedzi obilnín.Veľký význam začínajú v súčasnosti nadobúdať aj
hydrolyzáty menej známych obilnín a pseudoobilnín ako napríklad ovos, láskavec,
pohánka a proso, ktoré sú dobrou alternatívou pre ľudí trpiacich intoleranciou na
pšeničný lepok.
Hydrolýzou bielkovín sa získavajú produkty, ktoré kvalitatívne zlepšujú
vlastnosti potravín a umožňujú prípravu hypoalergénnych a diétnych potravín (Lahl -
Braun, 1994; Vandenplas, 1995; Perrot et al., 1999; Yeboah, et al.,1999; Clemente,
2000). Klasickým spôsobom je kyslá hydrolýza za použitia anorganických kyselín.
Podstatne šetrnejším a menej agresívnym spôsobom je však enzymatická hydrolýza.
Umožňuje cielené pôsobenie, širšie využitie bielkovín a modifikáciu ich funkčných
vlastností (Javorský et al., 1987; Klomklao et al., 2006).
1. 3. 1. 2 Faktory ovplyvňujúce hydrolýzu, metódy zisťovania stupňa hydrolýzy
Pri reakciách enzýmovej hydrolýzy musíme brať do úvahy špecifitu enzýmu a
nasledovné faktory, ktoré ovplyvňujú celý proces:
29
koncentráciu substrátu a pomer enzýmu k substrátu;
rôznorodosť reakčných komponentov, t.j. peptidové fragmenty sú tak
produkty, ako aj reaktanty nasledujúcej reakcie;
rozmanitosť reakcíí, t.j. množstvo peptidových väzieb je narušených
paralelne aj v sekvenciách súčasne;
komplexnosť reakčnej skupiny t.j. existencia substrátovej inhibície,
produktovej diverzity a enzýmovej inaktivácie počas hydrolýzy;
početné exogénne vplyvy vrátane pH, teploty, iónovej sily a iné (Whei -
Zhimin, 2006).
Konečné zloženie hydrolyzátu závisí od odpoužitia konkrétneho enzýmu a od
stupňa naštiepenia bielkoviny (Krkošková - Šimková, 1998). Stupeň hydrolýzy (Degree
of Hydrolysis, DH) nám udáva, koľko z existujúcich peptidových väzieb bolo
hydrolýzou prerušených. Z technologického hľadiska je dôležité poznať mieru
hydrolýzy, resp. hydrolyzovateľnosti, pretože hydrolyzáty bielkovín majú odlišné
vlastnosti ako pôvodná bielkovina, prípadne je potrebné sledovať priebeh hydrolýzy
počas technologického procesu pri výrobe potravín.
Stupeň hydrolýzy možno stanoviť viacerými postupmi, najčastejšie využívané sú
však metódy OPA, TNBS, pH stat a formolová titrácia. OPA a TNBS sú metódy
založené na reakciách primárnych aminoskupín, ktorých množstvo stúpa so zvyšujúcim
sa stupňom hydrolýzy. Pri OPA metóde je činidlom o-ftalaldehyd a pri TNBS kyselina
2,4,6-trinitrobenzénsulfónová.
Metóda pH-stat je založená na monitorovaní pH a udržiavaní konštantnej
hodnoty pH pomocou acidobázickej titrácie. Množstvo prerušených peptidových väzieb
je úmerné množstvu spotrebovanej kyseliny resp. zásady počas enzymatickej reakcie.
Výhodou pH statu oproti metódam OPA a TNBS je, že túto metódu je možné použiť
počas hydrolýzy (Kuipers, 2007).
Formolova titrácia je založená na poznatku, že pri štiepení peptidových vätieb
dochádza k uvoľneniu karboxylových skupín aj aminoskupín. Naviazaním
formaldehydu na aminoskupiny sa umožní titrácia karboxylových skupín na vhodný
indikátor. Keďže výsledky jednotlivých metód nie sú zhodné, je potrebné pre
stanovenie stupňa hydrolýzy kombinovať minimálne dve metódy
30
Pre ukončenie reakcie je potrebné enzým inaktivovať. To sa môže uskutočniť
zmenou pH, zahriatím hydrolyzátu na takú teplotu, pri ktorej dôjde k denaturácii
enzýmu, alebo prídavkom enzýmového inhibítora (Kuipers, 2007).
V závislosti od molekulovej hmotnosti vzniknutých peptidov sa účinkom
proteolytických enzýmov predovšetkým zlepšuje rozpustnosť ako aj emulgačná
schopnosť bielkovín.
Klasifikácia hydrolyzátov podľa Pedrocheho
Pedroche et. al. (2003) zaradil hydrolyzáty produkované pre potravinársky
priemysel do troch skupín, v závislosti sa od dosiahnutého stupňa hydrolýzy
nasledovne:
1. Hydrolyzáty s nízkym stupňom hydrolýzy (nižším ako 10 %), ktoré sa
využívajú na zlepšenie funkčných vlastností potravín ako rozpustnosť,
penivosť, emulgačná schopnosť, absorpcia vody a tuku; využívajú sa pri
výrobe chleba, pekárenských výrobkov, zmrzliny, majonézy, mäsových
derivátov;
2. Hydrolyzáty s premenlivým stupňom hydrolýzy, obyčajne vyšším, ktoré sa
využívajú pre zlepšenie chuti. Sem patria aj hydrolyzáty lepku NFE-PN,
resp. NFE-S , ktoré sa využívajú ako arómotvorné zložky potravín. Tieto
hydrolyzáty sa používajú do polievok, mäsových vývarov, omáčiek,
predvarených jedál a mäsových produktov. Všeobecne známe sú napríklad
rastlinné hydrolyzáty (sójová omáčka), ktoré dodávajú do jedál chuť umami.
Posledné štúdie japonských a idonézskych sójových omáčiek vykázali, že
táto chuť je daná komponentami s nižšou molekulovou hmotnosťou ako 500
Da (Lioe et al., 2010);
3. Hydrolyzáty sa vysokým stupňom hydrolýzy, nazývané tiež ako extenzívne
hydrolyzáty (stupeň hydrolýzy vyšší ako 10 %), ktoré sa využívajú
v nutričných doplnkoch a v lekárskych diétach (hypoalergénne mlieka a
pod.). Zahŕňajú aj hydrolyzáty, ktorých cieľom je využiť alebo zlepšiť
nutričné vlastnosti bielkovín z ktorých boli vyrobené.
1.3.1.3 Využitie bielkovinových hydrolyzátov vo výžive človeka
31
Bielkovinové hydrolyzáty majú vo výžive ľudí široké využitie jednak ako
fortifikanty do energetických nápojov, geriatrických výrobkov, výživy športovcov a diét
na reguláciu hmotnosti a jednak na klinické použitie (Tab.1. 4). Ich hlavnými
výhodami sú vysoká rozpustnosť a ich optimálna absorpcia v črevách človeka.
Z dôvodu ľahšej absorpcie pre niektoré špecifické aplikácie vo výžive (výživa
podvyživených detí, choroby tráviaceho traktu dospelých) je potrebné aby potrava
obsahovala zmes malých peptidov a nie zmes voľných aminokyselín. Absorpcia
peptidov s krátkym reťazcom (di- a tripeptidov) sa považuje za účinnejšiu metódu
absorpcie aminokyselín v porovnaní s ekvivalentným množstvom voľných
aminokyselín. Nízkomolekulové peptidy sú tiež menej hypertonické ako
aminokyseliny, čo umožňuje dobrú absorpciu iných dietetických zložiek a eliminuje
osmotické problémy (Clemente et al., 1999).
32
Tab.1. 4 Možnosti využitie hydrolyzátov v o výžive človeka
Možnosti využitia hydrolyzátov vo výžive
Fotifikácia potravín hydrolyzátmi bielkovín
energetické nápoje
geriatrické výrobky
výživa športovcov
diéty na reguláciu hmotnosti
Klinické použitie
fenylketonúria (PKU)
tyrozinémia
hypoalergénna kojenecká výživa
akútne a chronické ochorenie pečene
syndróm krátkeho čreva
pankreatitída
vredový zápal hrubého črevazdroj:http://www.agroporadenstvi.cz/poradenstvi/ustavy/uzpi/aktuality/PAvyz05_01.pdf upravené
Z hľadiska prípravy výživovo hodnotnej potravy, diétnej alebo hypoalergénnej
potravy, má veľký význam príprava hydrolyzátov rastlinných bielkovín. Takéto
produkty majú široké použitie ako náhrada bielkovín živočíšneho pôvodu, pričom
surovinová základňa pre ich prípravu je vhodnejšia, prístupnejšia a aj menej
ekonomicky náročná ako je u živočíšnych zdrojov. Presnou, cielenou enzymatickou
hydrolýzou sa získa z rastlinných bielkovín zmes štiepnych produktov od
vysokomolekulových peptidov, cez nízkomolekulové peptidy až po aminokyseliny.
Konečné zloženie hydrolyzátu závisí od použitia konkrétneho enzýmu a od stupňa
naštiepenia bielkoviny (Krkošková - Šimková, 1998). Enzymatickou hydrolýzou
surovín pre hypoalergénne potraviny sa zaoberali Barca et al. (2000). Pôsobením zmesi
pankreatických enzýmov na sójový šrot získali peptidy a aminokyseliny s veľmi nízkou
relatívnou molekulovou hmotnosťou (menšou ako 10 kDa), ktoré sú vynikajúco
rozpustné vo vodných roztokoch a stratili schopnosť pôsobiť ako alergén.
Zaujímavé sú práce niektorých autorov (Hong-Li et al, 2005; Gibs et al., 2003;
Tovar-Pérez et al., 2009), ktorí uvádzajú, že niektoré bielkovinové hydrolyzáty sóje,
33
fazule, láskavca, kazeínu (Contreras et al., 2009), môžu byť dobrými zdrojmi
bioaktívnych peptidov. Gibs et al. (2003) podrobili defosforylovaný a deglykolizovaný
sójový hydrolyzát pôsobeniu rôznych endopeptidáz (pronáza, trypsín, Glu C proteáza)
a purifikovali peptidy, ktoré vykazovali širokú škálu biologických aktivít (ACE
inhibítory, povrchovo aktívne a antitrombotické peptidy a peptidy s antioxidačnými
vlastnosťami). Tovar-Pérez et al. (2009) získali ACE inhibítory z albumínovej
a globulínovej frakcie bielkovín láskavca. Najvyššiu ACE – inhibítorovú aktivitu (až 40
% inhibíciu) dokázali v peptidoch pripravených po 18 a 15-hodinovej hydrolýze
albumínov a globulínov alkalázou.
Hydrolýza hrachových bielkovín má pomerne veľký komerčný význam, pretože
umožňuje lepšie trávenie a súčasne odstraňuje natívne inhibítory tráviacich enzýmov,
ktoré sú bielkovinovej povahy. Napr. Perrot et al. (1999) hydrolyzovali hrachové
bielkoviny legumín a vicilín peptidázami pepsín a trypsín. Zistili, že legumín je
rezistentný voči pôsobeniu peptidáz.
Majoritnými alergénmi hrachu sú vicilicín (Pis s 1) a convicilicín (Pis s 2). Tieto
bielkoviny sú rezistentné proti tráviacim enzýmom (Fréres, 2008). Szymkiewicz-
Jędrychowski (2005) vystavili enzýmovej hydrolýze globulíny hrachu s cieľom znížiť
imunoreaktivitu globulínov. Enzýmy Alkaláza, pepsín a trypsín, pôsobili pri teplotách
37 °C a 50 °C po dobu 180 minút. Najvyšší stupeň hydrolýzy zaznamenali pri použití
Alkalázy (DH 25 % pri teplote 50°C). Najvyššiu redukciu imunoreaktívnych peptidov
legumínu a vicilínu zaznamenali pri hydrolýze trypsínom (DH 12 %), pričom
imunoreaktivita vicilínu sa znížila v menšej miere ako imunoreaktivita legumínu.
Častým alergénom sú aj legumíny šošovice. Cabanillas et al. (2010) sa zaoberali
hydrolýzou proteínov šošovice endopeptidázou (Alkaláza) a exopeptidázou
(Flavourzyme) za účelom redukcie imunoreaktívnych peptidov. Hodnotenie
imunoreaktivity hydrolyzátov bolo založené na detekcii IgE pomocou Elisa testu
použitím sér pacientov s dokumentovanou alergiou na legumíny. Napriek tomu, že pri
in vitro experimentoch zaznamenali značnú deštrukciu IgE epitopov, v sérach pacientov
boli detekované alergické proteíny.
Legumíny bôbu, hrachu a šošovice hydrolyzovali aj Sormus et al. (2009).
Majoritné zásobné globulíny (11 S globulíny) boli hydrolyzované pepsínom
a trypsínom po dobu 1, 5, 15, a 30 minút. Elektorforetická analýza hydrolyzátu
natívnych globulínov pomocou preukázala, že hydrolýzou danými enzýmami vzniklo
34
veľké množstvo krátkych peptidov a voľných aminokyselín, čo v konečnom dôsledku
viedlo k nižšej imunoreaktivite antigénu.
Výroba hypoalergénnych mliek je ďalšou oblasťou uplatnenia sa bielkovinových
hydrolyzátov. Úloha hypoalergénnych mliek spočíva v znížení alergicity všetkých
zložiek mliečnej bielkoviny. To sa dosiahne štiepením bielkovín kravského mlieka
použitím tepelnej a enzýmovej hydrolýzy. Mliečne prípravky s hydrolyzovanou
bielkovinou sa vyrábajú v dvoch formách - formule s nízkym stupňom hydrolýzy
(čiastočné hydrolyzáty, označované aj ako H.A.) – určené na prevenciu alergie a
formule s vysokým stupňom hydrolýzy (vysoké hydrolyzáty) – určené na liečbu alergie
na bielkovinu kravského mlieka (Košťálová et al., 2005). Extenzívne (vysoké)
hydrolyzované formule obsahujú peptidy s molekulovou hmotnosťou menej ako 1500
Da, zatiaľ čo parciálne hydrolyzované formule obsahujú zložky s molekulovou
hmotnosťou 3000-10000 Da. Mliečne hydrolyzáty môžu byť so 100 % obsahom
srvátkového proteínu, srvátka: kazeín v pomere 60 : 40, alebo s obsahom 100 %
kazeínu (Pedrosa et al., 2006). Ďalej sú dostupné antialergénne formule zo sójového
proteínu. Wróblewska et al. (2005) hydrolyzovali kazeínový izolát systémom
dvojkrokovej hydrolýzy bakteriálnymi peptidázami Subtilizín Carlsberg a Alcalase
2.4 FG (Novo Nordisk), pronase z Streptomyces griseus a papain (Sigma). Pre
hydrolýzu produktov využili chromatografické, elektrofoterické a imunochemické
metódy. Zistili, že napriek značnému úbytku imunoreaktívnych frakcií kazeínu,
vykazoval hydrolyzát prítomnosť alergénnych epitopov.
Pšeničný glutén ako alergén
Intentívne bádanou oblasťou je hydrolýza pšeničného gluténu, ako alergénu
spôsobujúceho celiakiu (celiakálna sprue, maloabsorpčný syndróm). Na odštartovanie
celiakálneho ochorenia vplývajú viaceré vlastnosti zásobných bielkovín zrna obilnín
(exogénne príčiny), ale aj endogénne príčiny dané receptivitou organizmu na príjem
lepkových bielkovín. Medzi exogénne príčiny treba zaradiť najmä faktor množstva a
faktor primárnej a sekundárnej štruktúry prolamínových determinant (Michalík -
Urminská, 2006). Z celkového obsahu bielkovín v celozrnom obilnom šrote tvorí 60 až
70 % frakcia ťažko rozpustných zásobných bielkovín. Práve tieto ťažko rozpustné
frakcie lepku a predovšetkým prolamíny s nízkou molekulovou hmotnosťou okolo 30
kDa sú zodpovedné za vznik celiakie (Szabová et al., 2003). Hydrolyzovať túto frakciu
je nesmierne náročné, čo potvrdzujú práce viacerých autorov.
35
T-bunky pacientov s celiakiou rozpoznávajú tri aminokyselinové sekvencie,
resp. peptidy, ktoré sú súčasťou α-gliadínových bielkovín a sú v nich intenzívne
zastúpené aminokyseliny prolín a glutamín: PEPQPQLPY, PQPQPLPYPQ
a PYPQPQLPY (Socha et al., 2010). V snahe hydrolyzovať práve tieto sekvencie
aminokyselín v gliadínoch zistili Shan et al. (2002), že trávením α-gliadínu
žalúdočnými a pankreatickými enzýmami in vitro sa produkuje vysokostabilný 33-
mérny peptid, ktorý obsahuje všetky tri T-bunkové epitopy.
De Angelis et al. (2009) hydrolyzovali glutén rôznych kultivarov Triticum
turgidum L. var. durum mikrobiálnymi peptidázami po dobu 72 hodín pri 37 °C.
Zistili, že na úplnú detoxikáciu 33-mérneho peptidu boli potrebné tri peptidázy
(aminopeptidázy typu X-prolyl- dipeptidylaminopeptidázy endopeptidáza) a na totálnu
hydrolýzu 33-mérneho peptidu na voľné aminokyseliny bola potrebná kombinácia
aspoň 6 rôznych peptidáz.
1. 3.1. 4 Bielkovinové hydrolyzáty pre zlepšenie funkčných vlastností bielkovín v
potravinách
Súčasné potravinárske technológie kladú vysoké požiadavky na bielkoviny, ako
funkčné komponenty potravín. S rozvojom nových technológií a produktov, musia
bielkoviny spĺňať nielen nutričné atribúty, ale aj náročné technologické požiadavky
moderného potravinárskeho priemyslu. Enzýmová hydrolýza je jednou z možností, ako
tieto požiadavky naplniť.
Produkty enzýmovej hydrolýzy sa vyznačujú lepšími fyzikálno - chemickými
vlastnosťami, predovšetkým zlepšenou rozpustnosťou a emulgačnou schopnosťou.
Okrem rastlinných hydrolyzátov má pre potravinárstvo veľký význam aj využitie
živočíšnych bielkovín a produktov ich hydrolýzy. Ako substráty sa využívajú
predovšetkým bielkoviny srvátky alebo čistý kazeín (Lu et al., 1996; Pintado et al.,
1999; Morato et al., 2000; Kumar et al., 2001; Cornelly van der Ven et al., 2002;
Gauthier – Pouliot, 2003).
Konrad et al. (2004) hydrolyzovali srvátkový koncentrát za účelom zlepšenia
penotvorných a emulgačných vlastností mliečnych výrobkov. Na hydrolýzu použili
pepsín, ktorý však neštiepil hlavnú bielkovinu srvátky – β-laktoglobulín.
Najrozšírenejšími hydrolyzátmi rastlinného pôvodu sú sójové hydrolyzáty.
Sójové bôby sú zdrojom proteínov rastlinného pôvodu, ktoré sú svojou kvalitou
36
porovnateľné s proteínmi živočíšneho pôvodu (Hrčková et al., 2001). Hydrolytickou
úpravou sójovej múky, alebo izolovaných proteínov, peptidázami sa produkujú proteíny
s modifikovanými funkčnými vlastnosťami, ako je vyššia rozpustnosť, stabilita peny
a emulgačná kapacita. Získané produkty nespôsobujú pri aplikácii problémy so
želatínovaním, zákalom a cudzou arómou (James - Simpson, 1996; Lukáčová -
Zemanovič, 1998; Hrčková et al., 2001; Hrčková - Šturdík et al., 2002). Problémom
enzymatickej hydrolýzy je však vznik horkých peptidov, kde intenzita horkosti
hydrolyzátu závisí od stupňa hydrolýzy (Lukáčová - Zemanovič, 1998; Hrčková -
Šturdík et al., 2002). Horké peptidy, prítomné v hydrolyzátoch, sú obyčajne tvorené 3 -
15 aminokyselinami hydrofóbneho charakteru. Skoro všetky peptidy, ktoré obsahujú
aminokyseliny ako leucín, izoleucín, tyrozín, prolín, valín, fenylalanín a tryptofán sú
horké a intenzita horkej chuti je úmerná počtu hydrofóbnych aminokyselín a dĺžke
peptidu. Na odstránenie horkej chuti proteínových hydrolyzátov, teda ďalšiu čiastočnú
hydrolýzu vzniknutých peptidov, sú komerčne dostupné preparáty aminopeptidáz
a karboxypeptidáz, ktoré postupným pôsobením od koncov peptidov skrátia chuťovo
horký produkt na zlúčeninu s toleranovanou chuťou (Hrčková et al., 2002). Kombinácia
endopeptidáz v primárnej hydrolýze a aminopeptidáz v sekundárnej hydrolýze
zabezpečí hydrolytický produkt s redukovanou horkosťou (Rao et al., 1998).
Witczak et al. (2005) sledovali reologické vlastnosti sójového hydrolyzátu,
ktorý pripravili zo sójovej múky s obsahom bielkovín 50,6 % pomocou enzýmov
Neutráza a Protamex produkovaných Bacillus (Novo Nordisk). Hydrolýza prebiehala
pri teplote 50 °C, pH 6,8 60 minút, pričom na 1g proteínu bolo pridaných 13 g vody.
Reologické vlastnosti hydrolyzátov sa stanovovali rotačným reometrom pri stálej
teplote 25 °C. Zistli, že zdanlivá viskozita suspenzie hyrolyzátu získaného pomocou
Neutrázy bola nižšia ako hydrolyzátu získaného pomocou Protamexu. Analýzou
suspenzie sa ukázalo, že štruktúra hydrolyzátu produkovaného Neutrázou nie je
homogénna, na rozdiel od suspenzie Protamexového hydrolyzátu, ktorá vykazovala
homogénnu a kompaktnú štruktúru. Z uvedeného vyplýva, že použitím vhodného
enzýmu sa môžu ovplyvniť reologické vlastnosti hydrolyzátov s ohľadom na cieľ
využitia.
Lamsala et al. (2006) sledovali rozpustnosť sójového hydrolyzátu pripraveného
peptidázou bromelaín, do stupňa hydrolýzy 2 % a 4 %. Zistili, že hydrolyzát vykazuje
vyššiu rozpustnosť vo vode pri pH od 3 do 7 oproti pôvodnému sójovému proteínu.
37
Hydrolyzáty si zachovali želatinačnú schopnosť. Analýza textúry sójového gélu
preukázala, že tvrdosť gélu sójového proteínu je po hydrolýze menšia.
Zaujímavé výsledky dosiahli Zhang et al. (2009) pri analýze antioxidačnej
aktivity sójových hydrolyzátov. Sójový hydrolyát vyrobili použitím troch komerčne
dostupných peptidáz: neutrálnej peptidázy z Bacillus subtilis (NP), validázy z
Aspergillus oryze (VAL), a alkalickej peptidázy z Bacillus licheniformis (AP). Výsledné
hydrolyzáty frakcionovali a zistili, že všetkých 12 frakcií vykazuje vysokú kapacitu
odstraňovania voľných radikálov. Tri frakcie s najvyššou antioxidačnou aktivitou, NP-
F1, Val-F1, a AP-F3, boli inkorportované do pomletého hovädzieho mäsa. Po 15. dňoch
skladovania stanovili, že frakcia Val-F1 nepreukázala signifikantný výsledok, ale
frakcia AP-F3 redukovala oxidáciu lipidov mletého mäsa o 20,1 % a frakcia NP- F1
o 12,9 %.
Zhao - Hou (2009) porovnávali 8 proteínových hydrolyzátov: 4 vyrobené zo sójového
proteínového koncentrátu (SPK) a 4 sójového izolátu (SI) limitovanou hydrolýzou
trypsínom a neutrázou, so stupňm hydrolýzy 1 a 2 %. Analýza produktov pomocou
SDS-PAGE ukázala, že hydroláty SPK a SI vyrobené trypsínom obsahovali viac
veľkých peptidov ako hydrolyzáty vyrobené pomocou neutrázy. Trypsínové
hydrolyzáty vykazovali tiež väčšiu emulgačnú aktivitu, pričom najlepšia bola
v hydrolyzátoch so stupňom hydrolýzy 1 %. Tieto výsledky korešpondujú so závermi
Chanpu et al. (2009), ktorí tiež zistli vysokú antioxidačnú aktivitu hydrolyzátov
hordeínu jačmeňa a bielkovín ryže pripravených pôsobením pepsínu a trypsínu.
Antioxidačnú aktivitu pepsínových hydrolyzátov cícera sledovali aj Arkan –
Yemenicioglu (2009). Z výsledkov vyplýva, že produkty kontrolovanej pepsínovej
hydrolýzy možno úspešne použiť na zvýšenie vychytávania voľných radikálov
a zvýšenie obsahu rozpustných bielkovín cícera. Antioxidačná aktivita proteínov
hydrolyzovaných pepsínom bola v emulzii olej vo vode porovnateľná s
nehydrolyzovanými cícerovými bielkovínami. Avšak enzýmové ošetrenie znížilo
stabilitu emulzie a peny.
Betancur – Ancona (2009) enzymaticky štiepili proteínový izolát fazule (Phaseolus
lunatus) pri 50 °C a pH 8 enzýmami Alkaláza a Flavourzým. Alkalázou sa pri 5 a 15
minútovej reakcii dosiahol väčší stupeň hydrolýzy ako s Flavourzýme, pričom
Alkalázou pripravené hydrolyzáty mali aj väčšie zastúpenie nízkomolekulárnych
peptidov. Obidva hydrolyzáty mali vyššiu rozpustnosť ako pôvodný proteínový izolát.
38
Celkovo hydrolyzát získaný Alkalázou vykazoval lepšiu rozpustnosť, zatiaľ čo
hydrolyzát pipravený pomocou Flavourzyme vykazoval lepšiu emulgačnú kapacitu.
Význam peptidáz stúpa aj so zmenou surovinovej základne potravinárskeho
priemyslu. Napr. Hindi-Tamelikecht et al. (1997) hydrolyzovali bielkoviny cícera
bromelaínom a chymotrypsínom, pričom získali nízkomolekulové peptidy a zmes
voľných aminokyselín. Bejosano a Corke (1999) použili ako substrát bielkoviny
láskavca. Zistili, že v porovnaní so sójovými proteínmi sú bielkoviny láskavca lepšie
rozpustné, a tým aj prístupnejšie pre pôsobenie peptidáz.
Netradičným využitím peptidáz je ich účasť na izolácii veľmi čistého olivového
oleja (Vioque et al., 2000), čo má význam pri príprave emulzií typu „olej vo vode“.
Tieto zmesi obsahujú predovšetkým sójový olej a hydrolyzáty rastlinných bielkovín,
pričom ale najkvalitnejší produkt sa získa z olív, a to keď sa uskutoční len 27 %
hydrolýza (Ramkumar et al., 2000).
Radha et al. (2008) pripravili hydrolyzát so 40 % DH zo zmesi olejnín (sója,
sezam a podzemnica olejná v pomere 1,1:1,7:0,7) a porovnali fyzikálno-chemické
a funkčné vlastnosti získanej zmesi peptidov so sójovým hydrolyzátom. Rozpustnosť
produktu bola nad 90 % pri pH 2-10 a zaznamenali signifikatný nárast množstva
voľných aminokyselín pri zlepšených funkčných vlastnostiach hydrolyzátu.
Kapp - Bamforth (2002), skúmali vplyv hydrolýzy albumínových
a hordeínových frakcií jačmeňa na stabilitu peny piva, pričom skonštatovali, že
albumíny sú rezistentné na cysteínové peptidázy ficín a papaín, ale sú hydrolyzovateľné
serínovou peptidázou trypsínom, pričom však hydrolýza je spojená so stratou stability
peny. Naopak, hordeín je rezistentný k digescii trypsínom, ale podlieha hydrolýze
ficínom a papaínom a limitovaná proteolýza viedla k vylepšeniu penovej stability
hordeínu. Proteináza A hydrolyzovala albumíny aj globulíny, čo však viedlo k zníženej
stabilite peny. Tieto závery sa zhodujú so závermi Breya et al. (2003), ktorí
skonštatovali, že proteináza A podstatne vplýva na degradácii hydrofóbnych
polypeptidov zodpovedných za stabilitu peny piva. Len približne 20 % hydrofóbnych
polypeptidov a 57 % LPT 1 proteínov bolo počas hydrolýzy rezistetných voči
proteináze A. Yalcın – Celik (2007) hydrolyzovali jačmenný proteínový izolát
Alkalázou za nasledovných podmienok: pH 8, teplota 37 °C, pomer enzýmu k substrátu
1:300, do DH 3 % a 6 % (pH-stat). Analýza pomocou SDS-PAGE preukázala, že
hydroláty obsahovali podstane väčšie množstvo peptidov s molekulovou hmotnosťou
menšou ako 6500 Da v porovnaní s pôvodnou bielkovinou. Pri analýze rozpustnosti
39
zistili, že rozpustnosť hydrolyzátov v destilovanej vode a v soľnom roztoku sa líšila
v závislosti od pH. V destilovanej vode bola nyjvyššia rozpustnosť pri pH 11 a najnižšia
pri pH 6, čo je hodnota blízka izoelektrickému bodu. So znižujúcim sa pH však
rozpustnosť narastala. Rozpustnosť hydrolyzátov v soľnom roztoku sa znižovala
úmerne s narastajúcou koncentráciou soli v roztoku. Z uvedeného vyplýva, že
rozpustnosť hydrolyzátov do veľkej miery závisí od pH a iónovej sily média.
Sladové mláto, ako surovinu na získanie proteínového koncentrátu a jeho
následnú hydrolýzu,využili Celus et al. (2009). Hydrolýza prebiehala Alkalázou pri pH
9 a teplote 60 °C, po dobu 1,7 a 120 minút, pričom získali hydrolyzáty s nízkym (1 %)
a s vysokým stupňom hydrolýzy (9 %). Po separácii produktov zistili, že frakcie
s dobrými emulgačnými vlatnosťami obsahovali menej ako 40 % peptidov s
molekulovou hmotnosťou vyššou ako 14500 da, pričom tieto frakcie mali vysokú
povrchovú hydrofóbnosť. Frakcie s dobrými penotvornými schopnosťami obsahovali
menej ako 10 % peptidov s molekulovou hmotnosťou menšou ako 1700 Da. Frakcie
s dobrými penotvornými vlastnosťami vykazovali nižšiu povrchovú hydrofóbnosť,
okrem frakcií s vyšším obsahom proteínov s molekulovou hmotnosťou presahujúcou
14500 Da. Z uvedených zistení vyvodili záver, že pre dobré emulgačné vlastnosti
hydrolyzátu sa vyžadujú iné fyzikálno-chemické vlastností peptidov a bielkovín ako
pre penotvorné schopnosti.
Pšeničný glutén je vedľajší produktom pri výrobe pšeničného škrobu a je
dostupný vo veľkom množstve a v relatívne nízkej cene (Popineau et al., 2002).
Utilizácia pšeničného gluténu v potravinárstve je obmedzená hlavne jeho nízkou
rozpustnosťou, čo je spôsobené vysokou koncentráciou nepolárnych aminokyselinových
zvyškov, ako prolín, leucín, glutamín a nízkou koncentráciou ionizovateľných
postranných reťazcov, ako lyzín, arginín, kyseliny glutámová a asparágová.
Enzymatickou modifikáciou gluténu je možné získať surovinu s vyššou rozpustnosťou,
ako aj ďalšími zlepšenými vlastnosťami, napríklad zlepšené emulgačné a penotvorné
vlastnosti. Zlepšenie rozpustnosti pri pH 3-10, penivej schopnosti gluténu dosiahli
Wang et al. (2008) pomocou hydrolýzy 8 % disperzie pšeničného gluténu papaínom
a následnou frakcionáciou membrámovou ultrafiltráciou. Michalík et al. (1994)
použitím enzýmov Trypsín, Fc (fi. ABM Chemicals), Maxatáza (fi. Gist Brocades) a
bakteriálnej proteázy pripravenej na Katedre biochémie a biotechnológie FBP,
hydrolyzovali bielkoviny zrna pšenice. Najintenzívnejšiu produkciu štiepnych látok
stanovili v prvých časových fázach reakcie, čo je v zhode aj so závermi Bystrického
40
(1991), ktorý pozoroval analogický priebeh kinetiky hydrolýzy bielkovín semien
hrachu po pôsobení trypsínu, chymotrypsínu a elastázy. Wang et al. (2007)
hydrolyzovali pšeničný glutén pomocou enzýmu ProtamexTM (Novozymes) pri pH 4,8
pri teplote 48 °C. Po inaktivácii enzýmu z proteolytického hydrolyzátu pšeničného
gluténu membrámovou ultrafiltráciou (filter s pórmi 50 kDa) separovali dve frakcie
(retentát a permeát). Cieľom bolo zistiť ich vplyv na vlastnosti pšeničnej múky pri
pečení chleba. Zistili, že prídavok hydrolyzovaného pšeničného gluténu a jeho frakcií
zlepšili viskoelastickú charakteristiku pšeničnej múky, pričom najvýraznejší vplyv na
zmenu vlastností mal prídavok retentátu. Prídavok retentátu tiež zvýšil tvrdosť kôrky
chleba. Pri chlebe vyrobenom zo pšeničnej múky s prídavkom hydrolyzovaného
pšeničného gluténu a permeátu bola kôrka mäkkšia. Na predĺženie trvanlivosti chleba
mali priaznivý efekt obidve frakcie. Kong et al. (2006) enzymaticky hydrolyzovali
glutén niekoľkými komerčne dostupnými peptidázami (Alcalase 2.4L, PTN 6.0S,
Pepsin, Pancreatin, Neutrase and Protamex™), pričom porovnávali aj hydrolytický
efekt použitých enzýmov. Alkaláza preukázala najvyšší hydrolytický efekt (DH 15,8
%) a získaný produkt mal dobrú rozpustnosť, viac ako 60 %, pri pH 2-12.
Sendrejová et al. (2007) použili frakcie pšeničných bielkovín získané
diskontinuálnou frakcionáciou podľa Michalíka et al. (2002) na hydrolýzu živočíšnymi
peptidázami trypsín a pepsín. Hydrolýza prebiehala pri teplote 50 °C, pH 2,0 alebo pH
8,0 v časových intervaloch od 5 do 120 minút. Pri stanovovaní stupňa hydrolýzy
využitím metód pH-stat a OPA zistili, že DH určené metódou pH-stat pre hydrolyzáty
albumínov a globulínov (DH 3 %) a glutenínov (DH 3,19 %) trypsínom a pre
hydrolyzáty gliadínov (DH 0,52 %), glutenínov (DH 0,76 %) pepsínom boli nižšie ako
hodnoty stanovené metódou OPA. Výnimkou sú gliadíny hydrolyzované trypsínom, kde
bolo DH pHstat 2 %. V prípade frakcie pšeničných albumínov a globulínov, bol oboma
metódami zistený približne rovnaký DH.
Na zlepšenie vlastností gluténu využili limitovanú hydrolýzu pšeničného gluténu
chymotrypsínom Agyare et al. (2009). Hydrolyzovaný pšeničný glutén bol pripravený
proteolýzou chymotrypsínom pri 37 °C po dobu 4 hodín (DH 6,4 %). Hydrolyzát bol
následne podrobený pôsobeniu transglutaminázy (MTGase) pri 55 °C 1 hod. alebo 18
hod .pri 5 °C, pričom bolo stanovené zvýšenie emulgačnej aktivity pri pH 6,5.
Paraman et al. (2007) regulovanou enzymatickou hydrolýzou upravili rozpustnosť
a emulgačné vlastnosti bielkovín ryže. Optimálny stupeň hydrolýzy pre dobrú
41
emulgačnú kapacitu ryžového proteínu stanovili na 6 -10 %. Zistili, že napriek
vysokému stupňu hydrolýzy boli proteíny nerozpustné.
Kanu et al. (2009) hydrolyzovali odtučnenú sézamovú múku peptidázami
Alcalase® a Flavourzyme, pričom vznikli produkty s rôznymi stupňami hydrolýzy (1,19
– 18,8 %). Výsledné hydrolyzáty vykazovali výrazne vyššiu penivosť a emulgačnú
schopnosť, ale nižšiu stabilitu peny. Celkovo vykazoval proteínový hydrolyzát sézamu
získaný Alkalázou lepšie funkčné vlastnosti v porovnaní s hydrolyzátom získaným
použitím Flavourzýme.
1.3. 1.5 Faktory ovplyvňujúce aplikáciu hydrolyzátov
Aby mohli byť bielkovinové hydrolyzáty využité ako zložky potravín, musia
spĺňať niekoľko vlastností:
musia byť rozpustné a/alebo rozptýliteľné pri pH potraviny, do ktorej sú
pridané (napríklad, pre použitie do proteínových nápojov musia byť
vyššie uvedené hydrolyzáty rozpustné pri kyslom pH);
musia mať akceptovateľnú chuť;
nemali by prejavovať príliš vysokú hygroskopicitu.
Zvýšená rozpustnosť po hydrolýze je všeobecný efekt hydrolýzy. Problematické
je však dosiahnutie akceptovateľnej chute, nakoľko živočíšne aj rastlinné zdroje
bielkovín sa podieľajú na charakteristickej horkej chuti, ktorá je ťažko maskovateľná
prídavkom ochucovadiel a sladidiel (Gianna et al, 1998).
Horká chuť je spôsobená prítomnosťou peptidov s nízkou molekulovou
hmotnosťou (>10 kDa) a hydrofóbnymi aminokyselinami v koncovej pozícii peptidov
Jedným z riešení je odstránenie horkých komponentov extrakciou v rozpúšťadle –
využíva sa napríklad sekundárny butylalkohol, v extrakčnom procese však dochádza
k strate 50 - 70 % esenciálnych aminokyselín. Ani adsorpcia horkých peptidov na
matricu (fenolové živice, rastlinný adsorbent, iónomeničové živice, silioxány) nie je
metódou, pri ktorej nedochádza k strate aminokyselín. Maskovanie horkosti aditívami
(polyfosfáty, cylodextríny, kyslé oligopeptidy) má nevýhodu vo zvýšení ceny
hydrolyzátu, pričom horká chuť nemusí byť dostatočne prekrytá (Vishwas et al., 2007).
42
Progresívnejšou metódou sa javí aplikácia prolín-špecifických exo-
a endopeptidáz, s ohľadom na predpokladaný vplyv prolínových zvyškov na horkosť
hydrolyzátov. Damie et al. (2005) upravili horkosť sójových a kazeínových
hydrolyzátov aplikáciou imobilizovanej aminopeptidázy izolovanej z intestinálneho
traktu kurčiat, pričom pri senzorickej analýze zaznamenali výrazné zníženie horkosti.
Výrazný vplyv na rozvoj horkosti produktu majú aj podmienky hydrolýzy
(FitzGerald - O´Cuinn, 2006). Li et al. (2008) napr. dosiahli zlepšenie chute sójového
hydrolyzátu, keď ho vystavili kombinovanému pôsobeniu enzýmu Alkaláza 2.4L a
enzýmov z extraktu Actinomucor elegans. Pri príprave bielkovinových hydrolyzátov
hrachu odporúčajú viacerí autori, ktorí sa zaoberali prípravou bielkovinových
hydrolyzátov z hrachu pred enzymatickou hydrolýzou rastlinný substrát tepelne
upravovať tak, aby sa inaktivovalo antitryptické pôsobenie.
Ďalšou problematickou vlastnosťou hydrolyzátov je ich hydroskopicita. Určitou
alternatívou sa javí enkapsulácia hydrolyzátov s použitím sušenia rozprašovanín (spray-
drying). Favaro-Trindade et al. (2009) využili zmes želatíny a sójového izolátu ako
„nosičov“ s cieľom zamaskovať alebo redukovať horkosť kazeínového hydrolyzátu,
pričom analyzovali 6 kombinácií: 3 vzorky s 20 % hydrolyzátu a 80 % zmesi želatína -
sójový proteínový izolát s podielom 50/50, 40/60 a 60/40 %; a tri vzorky s 30 %
hydrolyzátu a 70 % amesi želatíny a sójového izolátu s podielom 50/50, 40/60 a 60/40
%. Všetky vzorky vykazovali nižšiu hygroskopicitu ako samostatný kazeínový
hydrolyzát.
V ďalšej práci Mendanha et al. (2009) enkapsulovali kazeínový hydrolyzát
komplexnou koacerváciou so sójovým proteínovým izolátom a pektínom. Následne
hodnotili morfológiu, vlhkosť, hygroskopicitu, rozpustnosť, hydrofóbnosť a povrchové
napätie vzorky. Zitili, že hydrofóbnosť sa nepriamo úmerne znižovala s obsahom
hydrolyzátu v mikrokapsuli. Enkapsulované vzorky mali podobné povrchové napätie,
ale nižšiu hygroskopicitu, ako voľné hydrolyzáty.
43
2 CIEĽ PRÁCE
Cieľom diplomovej práce bola príprava enzymatických hydrolyzátov bielkovín
pôsobením mikrobiálnych peptidáz, s cieľom získať produkty - zmes peptidov a
voľných aminokyselín s vyššou nutričnou kvalitou a lepšou stráviteľnosťou.
Pre splnenie cieľa bolo potrebné:
- charakterizovať substráty pre pôsobenie proteolytických enzýmov – peptidy
a bielkoviny,
- spracovať literárny prehľad o charakteristike, rozdelení a využívaní proteolytických
enzýmov,
- uskutočniť hydrolýzu niektorých rastlinných substrátov pôsobením mikrobiálnych
petidáz,
- porovnať účinnosť jednotlivých enzýmov stanovením stupňa hydrolýzy formolovou
titráciou.
3 MATERIÁL A METODIKA
3.1 Proteolytické enzýmy Na prípravu enzymatických bielkovinových hydrolyzátov boli použité
proteolytické enzýmy (Sigma Aldrich Chemicals):
Subtilizín Carlsberg (EC 3.4.21.62) - je bakteriálna peptidáza z Bacillus
licheniformis s aktivitou 10,5 U.mg-1,
Deuterolyzín (EC 3.4.24.39) – je fungálna peptidáza z Aspergillus oryzae s
aktivitou 1,7 U.mg-1. Enzýmové preparáty boli do reakčných zmesí pridávané
rozpustené v tlmivom roztoku optimálneho pH v koncentrácii 1 % (hm.). pH optimum
uvedených enzýmov je podľa Sendrejovej (2008) nasledovné: subtilizín Carlberg 8,0 a
Deuterolyzín 3,5.
3.2 Substráty - rastlinné bielkovinySubstrátmi pre hydrolýzu pôsobením mikrobiálnych peptidáz boli rastlinné
suroviny - pšeničný, sójový a kukuričný šrot, ktoré boli v hydrolytickej reakčnej zmesi
v koncentrácii 1 % (hm.) a 5 % (hm.).
44
3.3 Enzymatická hydrolýza bielkovín Enzymatická hydrolýza bola realizovaná v bankách (banky s okrúhlym dnom)
v objeme 10 ml tak, že k naváženým 0,1 a 0,5 g substrátu bolo pridaných 10 ml
tlmivého roztoku, ktorého pH zodpovedalo pH optimu daného enzýmu.
Použité boli roztoky: 0,1 mol.dm-1 fosforečnanový tlmivý roztok pH 8,0 a
0,1 mol.dm-3 octanový tlmivý roztok pH 3,5 (Methods in
Enzymology, 1955). Banky boli uzatvorené zátkami a umiestnené do vodného kúpeľa,
ktorý bol temperovaný na teplotu 37 oC. Reakcia sa uskutočnila za stáleho mierneho
premiešavania 0 min., 30 min., 60 min. a 120 minút. Podľa postupu pre formolovú
titráciu bola hydrolýza zastavená inaktiváciou enzýmu pridaním 5 ml formaldehydu.
3.4 Formolová titrácia aminokyselín Formolová titrácia je založená na skutočnosti, že v dôsledku amfotérneho
charakteru aminokyselín sa nemôžu pre ich stanovenie využiť bežné acidometrické a
alkalimetrické titrácie, ale ak sa zablokuje zásaditá NH2 - skupina formaldehydom za
vzniku Schiffovej bázy, uplatní sa iba kyslý charakter COOH - skupiny a potom sa
môžu aminokyseliny titrovať anorganickými zásadami (Karlubík - Kyselovič, 1990).
Postup formolovej titrácie: K 10 ml bielkovinového hydrolyzátu sa pridá 5 ml
zneutralizovaného formaldehydu a zmes sa titruje 0,1 mol.dm-3 NaOH do intenzívneho
ružového sfarbenia. Ďalej sa pridá také množstvo 0,1 mol.dm-3 H2SO4, aby zmes zostala
len veľmi slabo sfarbená do ružova. Vzorka sa titruje 0,1 mol.dm-3 NaOH do rovnakého
sfarbenia ako vzorka kontrolného pokusu. Nakoniec sa pridajú ku kontrolnej vzorke
ešte 4 kvapky 0,1 mol.dm-3 NaOH a zároveň sa do analyzovanej vzorky pridá také
množstvo 0,1 mol.dm-3 NaOH, aby sa dosiahlo rovnako intenzívne sfarbenie ako v
kontrolnej vzorke. Sfarbenie je dôsledkom acidobázickej zmeny indikátora fenolftaleín,
ktorý sa pridáva do neutralizovaného roztoku formaldehydu (Karlubík - Kyselovič,
1990). Pri titrácii hydrolyzátu (zmesi aminokyselín) sa vyjadruje výsledok v mg
aminodusíka, pričom platí, že 1ml 0,1 mol.dm-3 NaOH zodpovedá 1,4 mg N.
45
4 VÝSLEDKY A DISKUSIA
Diplomová práca je zameraná na využitie mikrobiálnych peptidáz, a preto boli do
hydrolytických zmesí aplikované dva enzýmy – bakteriálna peptidáza Subtlizín
Carlsberg a fungálna peptidáza Deuterolyzín. Guan et al. (2007) uvádzajú, že stupeň
hydrolýzy je vo veľkej miere ovplyvnený podmienkami, ktoré limitujú rozpustnosť
substrátov – aplikované enzýmy sa výrazne líšia svojím pH optimom, preto sme
predpokladali, že získame rozdielne hydrolyzované produkty.
Subtilizíny sú extracelulárne produkované serínové endopeptidázy, ktoré sa
vyznačujú pomerne dobrou termostabilitou (do 60 oC). Pomenovanie týchto enzýmov
vychádza z prvého produkčného mikroorganizmu, ktorým bola baktéria Bacillus
subtilis, ale v súčasnosti sa získavajú z viacerých druhov a kmeňov baktérií rodu
Bacillus (Štosová et al., 2005). Konkrétne Subtilizín Carlsberg je produkovaný
vysokoprodukčným kmeňom Bacillus licheniformis (Novo Nordisk, Sumantha et al.,
2006). Substrátová špecifita subtilizínov je pre aromatické a hydrofóbne zvyšky
aminokyselín (tyrozín, fenylalanín a leucín) (Gupta et al., 2002; Beg - Gupta, 2003).
Fungálne peptidázy z Aspergillus oryzae sú substrátovo špecifické pre
hydrofóbne aminokyseliny (Sumantha et al., 2006). V potravinárskom priemysle sa
používajú pri úprave vlastností múky, mäsa, na odstraňovanie horkej chuti hydrolyzátov
(Kanekanian et al., 2000; Saha - Hayashi, 2001; Hrčková et al., 2004).
Substrátmi pre enzymatickú hydrolýzu boli šroty rastlinných materiálov: zrna
pšenice, kukurice a sóje. Sóju sme použili ako neupravený substrát, teda nebola
odtučnená, ani tepelne upravená. Hydrolytická zmes obsahovala 1 % alebo 5 %
pšeničný, kukuričný a sójový šrot, ku ktorým boli v roztoku optimálneho pH pridané
enzýmy Subtilizín Carlsberg alebo Deuterolyzín. Hydrolýza sa realizovala pri teplote
37 oC v časových intervaloch 0, 30, 60 a 120 minút. To znamená, že pre každú
koncentráciu každého substrátu boli pripravené 4 reakčné zmesi s každým enzýmom.
Čas hydrolýzy 0 minút zodpovedá množstvu voľných aminokyselín, ktoré sa
nachádzajú prirodzene v substráte a do prostredia sa uvoľnia rozpustením v použitom
tlmivom roztoku. Zistili sme (Tab. 4. 1), že najviac voľných aminokyselín obsahoval
sójový šrot – 1,4 mg (spotreba NaOH pri titrácii bola 1 ml).
46
Tab. 4. 1 Enzymatická hydrolýza rastlinných substrátov peptidázou Subtilizín
Carlsberg.
Čas hydrolýzy, min Pšeničný šrot Kukuričný šrot Sójový šrot
1 % 5 % 1 % 5 % 1 % 5 % mg N
0 0,42 0,42 0,70 0,84 1,4 1,430 2,52 2,94 1,40 1,40 2,52 3,2260 3,50 3,64 3,92 5,46 4,62 9,24120 5,46 6,30 5,60 7,56 7,14 12,74
Hydrolytickú aktivitu mikrobiálnych enzýmov sme stanovili pomocou formolovej
titrácie, pri ktorej sa množstvo uvoľnených aminokyselín stanovuje titračne ako počet
mg aminodusíka.
Pôsobením peptidázy Subtilizín Carlsberg (Tab. 4. 1) bolo najviac aminokyselín
stanovených v produkte po hydrolýze sójového šrotu, a to 12,74 mg v reakcii s 5 %
substrátom. Pri aplikácii 1 % substrátu sme získali iba 7,14 mg N. Najvýraznejšia
aktivita enzýmu bola v čase medzi 30 a 60 minútou pôsobenia (nárast produktov
o 65,15 %), zatiaľ čo predĺžením pôsobenia enzýmu o ďalších 60 minút sme získali iba
o 27,47 % viac voľných aminokyselín. Sója obsahuje vysoké koncentrácie
peptidázových inhibítorov (trypsín inhibítora, Korének et al., 2003), a preto sa odporúča
takéto substráty pred enzymatickou hydrolýzou termicky upravovať. Predpokladáme,
že sa tým výrazne zvýši množstvo uvoľnených aminokyselín v produkte.
Napriek prítomnosti inhibičných látok sú strukoviny považované za veľmi
kvalitný zdroj surovín – bielkovín pre enzymatickú hydrolýzu, pretože tieto bielkoviny
sú najmä albumíny a globulíny, čo sú proteíny dobre rozpustné vo vodných roztokoch
solí a obsahujúce aj aminokyseliny esenciálne pre humánnu výživu. Bielkoviny
strukovím sú preto častým predmetom záujmu v oblasti prípravy peptidov
a aminokyselín. Napr. Krkošková et al. (1997) získali enzýmovou hydrolýzou
pôsobením Neutrázy na hrachové bielkoviny až 10,32 % - 15,12 % hydrolýzu. Karamać
et al. (2002) aplikovali na bielkoviny hrachu enzým trypsín a dosiahli stupeň hydrolýzy
10,4 % - 13,2 % pri teplote 50 °C. Vynikajúce výsledky získali Hrčková et al. (2001),
ktorí pôsobením enzýmu Flavourzyme na sójové bielkoviny pripravili produkt so
stupňom hydrolýzy až 39,5 %.
47
Hydrolýzou kukuričného šrotu sme získali 5,60 mg, rep. 7,56 mg N. Čo sa týka
množstva aminokyselín, je 5 % šrot vhodnejším substrátom, ale s pohľadu efektívnejšej
(a ekonomickejšej) prípravy hydrolyzovaných peptidov nie je rozdiel medzi 1 % a 5 %
substrátom významný. Päť-násobne vyššie množstvo substrátu malo za následok iba
1,35-násobné zvýšenia koncentrácie produktov.
Najmenej vhodným substrátom je pšeničný šrot. V reakčnej zmesi, ktorá obsahovala 1
% substrát sme po 60 minútach hydrolýzy získali iba 3,50 mg N, a v zmesi ktorá
obsahovala 5 % substrát 3,64 mg N. Najintenzívnejšie prebiehala hydrolýza v intervale
medzi 60 a 120 minútou pôsobenia, kedy sme v 5 % substráte stanovili nárast produktov
o 42,22 %.
Deuterolyzín je kyslá fungálna endopeptidáza. Zistili sme, že pôsobením tohto
enzýmu sa uvoľňuje výrazne menej aminokyselín z použitých rastlinných substrátov
ako pôsobením slabo alkalickej peptidázy Subtilizín Carlsberg (Tab. 4.2).
Tab. 4. 2 Enzymatická hydrolýza rastlinných substrátov peptidázou Deuterolyzín.
Čas hydrolýzy, min Pšeničný šrot Kukuričný šrot Sójový šrot
1 % 5 % 1 % 5 % 1 % 5 % mg N
0 0,28 0,28 0,42 0,56 0,70 0,7030 0,70 0,98 0,84 1,26 1,40 1,4060 1,40 1,54 1,26 1,82 2,94 4,06120 1,54 1,68 2,10 2,66 5,04 6,58
Najvyššie koncentrácie voľných aminokyselín sme získali z reakčnej zmesi, ktorá
obsahovala 5 % sójový šrot po čase hydrolýzy 120 minút. Enzým bol najviac aktívny
v čase medzi 30. a 60. minútou pôsobenia, predĺžením hydrolýzy o ďalších 60 minút
sme nezistili výraznejší nárast v množstve produktov.
Na základe záskaných výsledkov môžeme konštatovať, že lepšou hydrolytickou
účinnosťou vo vzťahu k rastlinným substrátom sa vyznačuje bakteriálna alkalická
peptidáza Subtilizín Carlsberg ako fungálna kyslá peptidáza Deuterolyzín. Napriek
tomu, že ani jeden substrát nebol pred enzymatickou hydrolýzou upravovaný, zistili
sme, že najvhodnejším je sójový šrot, potom kukuričný šrot a najmenej vhodným
substrátom pre enzymatickú hydrolýzu je pšeničný šrot.
48
Obidva aplikované enzýmy boli najviac aktívne čase od 30 do 60 minúty
pôsobenia pri teplot 37 oC. Výsledky súhlasia so závermi Krkoškovej – Macovej
(2006), ktoré peptidázu z Aspergillus oryzae použili na hydrolýzu pšeničných bielkovín
a Guan et al. (2007), ktorí aplikovali trypsín na hydrolýzu bielkovín ovsa. Spomalenie
hydrolytickej reakcie hydrolýzy môže byť spôsobené „vyčerpaním“ prístupných
peptidových väzieb v substráte (Zemanovič et al., 1991 a, b).
5 Závery
Výsledky diplomovej práce prehlbujú poznatky o využívaní peptidáz na úpravu
vlastností bielkovín, ako súčastí, alebo samostatných surovín pre prípravu potravín. Na
základe získaných výsledkov ke možné:
podrobnejšie charakterizovať proteolytické enzýmy Subtilizín Carlsberg a
Deuterolyzín vo vzťahu k ich hydrolytickej účinnosti,
určiť bielkovinové substráty vhodné na prípravu enzymatických hydrolyzátov
pôsobením enzýmov Subtilizín Carlsberg a Deuterolyzín,
pripraviť bielkovinové hydrolyzáty s predpkladanými lepšími fyzikálno-chemickými a
nutričnými vlastnosťami,
Subtilizín Carlsberg sa vyznačuje vyššou hydrolytickou účinnosťou ako
Deuterolyzín,
vhodným substrátom je sójový šrot, najmenej vhodným je pšeničný šrot, pričom
vyššie koncentrácie aminokyselín (stanovených ako mg N) boli v produktoch s 5 %
koncentráciou substrátov,
optimálnym časom hydrolýzy je interval 30 – 60 minút.
49
6 Zoznam použitej literatúry
1 AGYARE, K. K. - ADDO, K. - XIONG, Y. L.2009. Emulsifying and foaming
properties of transglutaminase-treated wheat gluten hydrolysate as influenced by
pH, temperature and salt. In: Food hydrocolloids vol. 23, 2009,no.1, p. 72-81.
ISSN 0268-005X http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=20662757
1 ARCAN, I. - YEMENICIOG˘LU, A. 2009. Effects of controlled pepsin
hydrolysis on antioxidant potential and fractional changes of chickpea proteins.
In: Food Research International. vol.43, 2010, no. 1, p. 140–147.
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2009.09.012
2 ARIMA, J. – UESUGI, Y. – IWABUCHI, M. – HATANAKA, T. 2008.
Streptomyces aminopeptidase P: biochemical characterization and insight into
the roles of its N-terminal domain. In: Protein Engineering Design and Selection
vol. 21, 2008, no. 1, p.45-53.Doi:10.1093/protein/gzm068
3 BANDYOPADHYAY, K. - GHOSH, S. 2002 Preparation and Characterization
of Papain-Modified Sesame (Sesamum indicum L.) Protein Isolates In: J. Agric.
Food Chem. vol. 50, 2002, no.23, p. 6854–6857. DOI: 10.1021/jf020320x
Dostupné na internete: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf020320x
4 BARCA, A. M. C. – MEDRANO, A. W. – JARA MARINI, M. – GONZALES
CORDOVA, A. F. – RUIZ SALAZAR, A. 2000. Enzymatic modification of the
functional, nutritional and sensorial properties of soya protein for special
nutrition. In: Arch. Latinoam. Nutri. vol. 50, 2000, no. 1, p. 26 – 34. PMID:
11048568
5 BERAN, M. - KLUBAL, R .- MOLIK P. - STROHALM J. - URBAN M.-
KLAUDYOVA, A. A. - PRAJZLEROVA, K. (2009): Influence of high
hydrostatic pressure on tryptic and chymotryptic hydrolysis of cow milk proteins.
[Vliv vysokého hydrostatického tlaku na tryptickou a chymotryptickou hydrolýzu
mléčných bílkovin.] High Pressure Research. vol. 29, 2009, no.1, p. 23-27. ISSN
0895-7959.
50
6 BEJOSANO, P. F. – CORKE, H. 1999. Poperties of protein concentrates and
hydrolysates from Amaranthus and buckwheat. In: Indus.Crops Prod., vol.10,
1999, no. 3, p. 175 – 183. Doi: 10.1016/S0926-6690(99)00021-7
7 BEG, Q.- K. – GUPTA, R. 2003. Purification and characterization of an
oxidation-stable, thiol-dependent serine alkaline protease from Bacillus
mojavensis. In: Enz. Microbial. Technol., vol. 32, 2003, p. 294 – 304.
http://dx.doi.org/10.1016/S0141-0229(02)00293-4
8 BELITZ, H.D. – GROSCH, W. – SCHIEBERLE, P. 2009. Amino Acids,
Peptides, Proteins. Food Chemistry.4.vyd. Springer Berlin Heidelberg.pg. 8-92.
ISBN(Online) 978-3-540-69934-7
9 BETANCUR-ANCONA, D. - MARTÍNEZ-ROSADO,R. - CORONA-CRUZ, A.
- CASTELLANOS-RUELAS, A. -JARAMILLO-FLORES,E.M.- CHEL-
GUERRERO,L. 2009 Functional properties of hydrolysates from <i>Phaseolus
lunatus</i> seeds In: International Journal of Food Science & Technology, vol.
44, 2009, no. 1, p. 128-137. Dostupné na internete:
http://www.citeulike.org/user/biblio24/article/3798369
10 BRACHO, S.U. - TIMAURE, N.J. 2008. Factors affecting activity of the
calcium-dependendt proteases and their participation in the process of meat
tenderisation. In: Asociación Latinoamericana de Producción Animal. vol 16,
2008, no 3, p.166-174. ISSN 1022-1301. Dostupné na internete:
http://www.alpa.org.ve/PDF/Arch%2016_3/alpa-2007-637.pdf
11 BREY, S.- COSTA S.- ROGERS, P.J. _ BRYCE, J. H. - MORRIS, P. C. -
MITCHELL, W. J. - STEWART, G. G. 2003. The effect of proteinase A on
foam-active polypeptides during high and low gravity fermentation. In. Journal
of the Institute of Brewing. vol. 109, 2003, no 3, p. 194-202. ISSN 0046-9750,
dostupné na internete: http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=15310479
12 BYSTRICKÝ, P. 1991. Biochemická charakteristika hydrolýzy rastlinných
bielkovín. Autoreferát k dizertačnej práci, VŠV Košice, 1991, 26 s.
51
13 CABANILLAS, B.- PEDROSA,M.M - RODRÍGUEZ, J. - GONZÁLEZ, A. -
MUZQUIZ, M. - CUADRADO, C. 2010. Effects of enzymatic hydrolysis on
lentil allergenicity. In: Molecular Nutrition & Food Research. 2010. Published
online: 19 Mar 2010. PMID: 20306474
14 CASTILLO -YÁÑEZ,.F. J. - PACHECO-AGUILAR, R. – GARCÍA -
CARREÑO, L. F. - NAVARRETE-DEL TORO,M.Á. - FÉLIX LÓPEZ , M.
2006. Purification and biochemical characterization of chymotrypsin from the
viscera of Monterey sardine (Sardinops sagax caeruleus). In: Food Chem., vol.
99, 2006, no. 2, p. 252-259, Doi: 10.1016./j.foodchem.2005.06.052
15 CHANPUT, W.-THEERAKULKAIT,CH.-NAKAI,S. 2009. Antioxidative
properties of partially purified barley hordein, rice bran protein fractions and
their hydrolysates. In: Journal of Cereal Science vol.49, 2009, no3, p. 422–428.
doi:10.1016/j.jcs.2009.02.001
16 CELUS, I.- BRIJS, K.- DELCOUR.A.J. 2009. Fractionation and
Characterization of Brewers’ Spent Grain Protein Hydrolysates. In: J. Agric.
Food Chem. vol. 57, 2009, no. 12, p. 5563–5570 5563. DOI:10.1021/jf900626
dostupné na internete:
https://lirias.kuleuven.be/bitstream/123456789/239390/1/Celus+2009+J+Agr+Fo
od+Chem+57+5563-5570+.pdf
17 CERA, D.C. 2009. Serine proteases. In: IUBMB Life. vol.61, 2009, no. 5, p. 510
-515. Published Online: 29 Jan 2009. Dostupné na internete:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2675663/
18 CLEMENTE, A. – VIOQUE, J. – VIOQUE, R.S. – PEDROCHE, J. – MILLÁN,
F. 1999. Production of Extensive Chickpea (Cicer arietinum L.) Protein
Hydrolysates with Reduced Antigenic Activity. In: Journal of Agricultural and
Food Chemistry vol.47, 1993, no.9, p.776-3781. DOI: 10.1021/jf981315p
19 CLEMENTE, A. 2000 Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition. In:
Trends in Food Sci. and Technol. Vol.11, 2000, no.7,p. 254-262.
http://dx.doi.org/10.1016/S0924-2244(01)00007-3
52
20 CONTRERAS, M.M. – CARRÓN, R. – MONTERO, J.M. – RAMOS, M. –
RECIO, I. 2009. Novel casein-derived peptides with antihypertensive activityIn:
International Dairy Journal. Vol. 19, 2009, no.10, p. 566-573.
http://dx.doi.org/10.1016/j.idairyj.2009.05.004
21 CORNELLY VAN DER VEN - GRUPEN, H. – DRIES, B.A. DE BONT, -
VORAGEN, G.J ALPHONS. 2002. Optimisation of the angiotensin converting
enzyme inhibition by whey protein hydrolysats using response surface
methodology. In: Int. Dairy J. vol. 12, 2002, no. 10, p. 813 – 820. Doi:
10.1016/S0958-6946(02)00077-8
22 DE ANGELIS,M.- CASSONE, A - RIZZELLO,CARLO G. -GAGLIARDI, F.-
MINERVINI, F.- CALASSO, M.- DI CAGNO, R.- FRANCAVILLA,
R.GOBBETTI, M.2009 Mechanism of degradation of immunogenic gluten
epitopes (Triticum turgidum L. var. durum) by sourdough lactobacilli and fungal
proteases In:Appl. Environ. Microbiol. 2009 0: AEM.01630-09, Online ISSN:
1098-5336. dotupné na internete:
http://aem.asm.org/cgi/content/abstract/AEM.01630-09v1
23 EHREN, J. - MORÓN, B. - MARTIN, E. - BETHUNE, M.T. – GRAY. G.M.,
ET AL. 2009. A Food-Grade Enzyme Preparation with Modest Gluten
Detoxification Properties. PLoS ONE. vol. 4, 2009, no.7. e6313.
doi:10.1371/journal.pone.0006313 dostupné na internete:
http://www.plosone.org/article/info:doi
%2F10.1371%2Fjournal.pone.0006313;jsessionid=50A7BE49B7F68806346B20
2E2C319D56
24 FAVARO - TRINDADE, C.S. - SANTANA, A. - SMONTERREY -
QUINTERO. . E.S. - TRINDADE, , M.A - NETTO, F.M. 2010 . The use of
spray drying technology to reduce bitter taste of casein hydrolysate, In: Food
Hydrocolloids, vol.24, 2010, no. 4, p. 336-340. ISSN 0268-005X,
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodhyd.2009.10.012
53
25 FERNANDEZ- ESPLA, M.D. - RUL, F. 1999. PepS from Streptococcus
thermophilus . A new member of the aminopeptidase T family of thermophilic
bacteria. In: Eur. J. Bioch., vol. 263, 1999, no. 2, p. 502–510. doi:10.1046/j.1432-
1327.1999.00528.x
26 DAMLE, M.V. JAMDAR, S.N. - HARIKUMAR, P. 2005. Modification of
protein hydrolysates by chicken intestinal aminopeptidases. poster . dostupné na
internete: http://www.barc.ernet.in/publications/nl/2006/200610-36.pdf
27 DAY, L. - AUGUSTIN,M.A. - BATEY,I.L - WRIGLEY,C.W.2006. Wheat-
gluten uses and industry needs. In: Trends in Food science&Technology.vol17,
2006 , p .82-90. Dostupné na internete:
http://www.agronavigator.cz/attachments/psenicny_lepek.pdf
28 EDWARD, N. M. – MULVANEY, S. J. – SCANLON, M. G. – DEXTER, J. E.
2003. Role of gluten and its components in determining durum semolina dough
viscoelastic properties. In:Cereal Chemistry, 2003, vol. 80, p. 755 – 763.
ISSN 0009-0352
29 FARAGÓ, J. 2007. Druhá generácia transgénnych plodín na trhu: transgénne
rastliny so zvýšenou nutričnou hodnotou. poznatky z genetiky a šľachtenia
poľnohospodárskych rastlín Zborník zo 14. vedeckej konferencie, Piešťany :
VÚRV, 2007. Dostupné na internete: http://www.vurv.sk/files/53/zbornik_i.pdf
30 FERENČÍK, M. – ŠKÁRKA, B. – NOVÁK, M. – TURECKÝ, L. 2000.
Biochémia. Slovak akademia press, Bratislava, 2000. 924s. ISBN 80-88908-57-4
31 FITZGERALD, R.J - O'CUINN, G. 2006 Enzymatic debittering of food protein
hydrolysates.In: Biotechnology Advances, vol.24, 2006, no.2, p. 234-237.
dostupné na internete: http://dx.doi.org/10.1016/j.biotechadv.2005.11.002
32 FIORETTI, E. - ANGELETTI, M. - LUPIDI, G. - COLETTA, M. 1994.
Heterotrophic modulation of the protease-inhibitor-recognition process. Cations
effect the binding properties of alpha-chymotrypsin. In: Eur. J. Biochem., vol.
225, 1994, no. 1, p. 459–465. doi:10.1111/j.1432-1033.1994.00459.x
54
33 FERENČÍK, M. - ŠKÁRKA, B. - NOVÁK, M. - TURECKÝ, L. 2000.
Biochémia. Bratislava: Slovak Academic Press, 2000, 924 s.,
ISBN 8088908582
34 FRÉREZ, R. 2008. Allergenicity of yellow pea protein. DHI,Final report.
Dostupné na internete:
http://www.dhi.pl/~/media/CC3AD16A1D7E4D54AB17EEAF17250437.ashx
[cit. 18.12.2009]
35 FUHONG, X. – YAPENG, CH. – XIUQING, Y. – JING, Y.- ZHIQUAN, X.-
YUANMING. L. – SHIJUN, Q. 2010. Purification and characterization of four
keratinases produced by Streptomyces sp. Strain 16 in native human foot skin
medium. In: Bioresource Technology. Vol. 101, 2010, p. 344–350. Dostupné na
internete: http://www.im.ac.cn/UserFiles/File/2009/200910/bioresource
%20technology.pdf [cit.18.2.2010]
36 GÁLOVÁ, Z. − PALENČÁROVÁ, E. −BALÁŽOVÁ, Ž. 2008. Nutričná kvalita
kolekcie genotypov láskavca.Nové poznatky z genetiky a šľachtenia
poľnohospodárskych rastlín Zborník z 15. vedeckej konferencie, Piešťany :
VÚRV, 2008. Dostupné na internete:
http://www.vurv.sk/files/105/zbornik_postery.pdf
37 GALVAO, C.M.A. – PINTO, G.A. – JESUS, CH.D.F. – GIORDANO, R.C. -
GIORDANO, R.L.C. 2009. Producing a phenylalanine-free pool of peptides after
tailored enzymatic hydrolyses of cheese whey.In: Journal of food engineering .
vol. 91, 2009, no.1, p. 109-117. ISSN 0260-8774 . Dostupné na internete:
http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=21252726
38 GAŽAR, R. - BOJŇANSKÁ, T. 2010. Zmeny konzistencie, vývinu a stability
cesta po prídavku pohánkovej, ovsenej, šošovicovej a cícerovej múky.In:
Potravinárstvo. mimoriadne číslo, február 2010. dostupné na internete:
http://www.potravinarstvo.com/dokumenty/mc_februar_2010/pdf/1/Gazar.pdf
39 GAUTHIER, S. F. – POULIOT, Y. 2003. Functional and Biological Properties
of Peptides Obtained by Enzymatic Hydrolysis of Whey Proteins. In: J. Dairy
55
Sci., vol. 86, 2003, p. 78 – 87. Dostupné na internete:
http://jds.fass.org/cgi/content/abstract/86/13_suppl/E78 [cit.14.2.2010]
40 GIBSS BERNARD, F - ZOUGMANB, A. - MASSEA, R. - MULLIGANC, C.
2003. Production and characterization of bioactive peptides from soy hydrolysate
and soy-fermented food. In: Food Research International.vol.37, 2004, no. 2, p.
123-131. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2003.09.010
41 GIANNA, R. – GREGORIS, E. – RENZO,B. 1988. Process for the enzymatic
hydrolysis of a protein material. Patentový dokument: European Patent
Application EP0320717. Dostupné na internete:
http://www.freepatentsonline.com/EP0320717.html [cit. 10.12.2009]
42 GRANDI, C. – VITA, C. – DALZOPPO, D. - FONTANA, A. 2009.
Thermolysin and Bacillus subtilis neutral protease. In: International Journal of
Peptide and Protein Research.vol.16, 2009, no.4 , p. 327 – 338. DOI:
10.1111/j.1399-3011.1980.tb02594.x
43 GRIPON, J.C. - AUBERGER, B. - LENOIR, J. 1980. Metalloproteases from
Penicillium caseicolum and P. roqueforti: comparison of specificity and chemical
characterization. In: Int. J. Biochem., vol. 12, 1980, no. 3, p. 451-455. PMID
6998789
44 GUAN, H.L. - GUO, W.L. – HUAN, L. 2005. Mung-bean Protein Hydrolysates
Obtained with Alcalase Exhibit Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory
Activity In: Food Science and Technology International. vol. 11, 2005, no. 4, p.
281-287. DOI: 10.1177/1082013205056781
45 GUAN, X. – YAO, H. – CHEN, Z. – SHAN, L. – ZHANG, M. 2007. Some
functional properties of oat bran protein concentrate modified by trypsin. In:
Food Chem., vol. 101, 2007, p. 163 – 170.
HTTP://DX.DOI.ORG/10.1016/J.FOODCHEM.2006.01.011
46 GUPTA, R. – BEG, Q.K. – LORENZ, P. 2002. Bacterial alkaline proteases:
molecular approaches and industrial applications. In: Appl. Microbiol.
56
Biotechnol., vol. 59, no. 1, 2002, p. 15 – 32. Dostupné na internete:
http://xray.bmc.uu.se/Courses/PT/Lectures/Gupta.pdf
47 HATANAKA, T. - UESUGI, Y.- ARIMA, J.-USUKI, H. - WABUCHI, M.
2008 Biochemical characterization of a novel metalloendopeptidase from
Streptomyces aureofaciens TH-3 with post-proline hydrolysis activity In:
Enzyme and Microbial Technology. vol. 44, 2009, no. 5, p. 295-301.
http://dx.doi.org/10.1016/j.enzmictec.2008.11.005
48 HIDALGO, J.A. – VAZQUES, J.A. 2010. Candisiasis. Dostupné na internete:
http://emedicine.medscape.com/article/213853-overview. Updated: Jan 11, 2010.
[cit. 10.4.2010]
49 HINDI-TAMELIKECHT, F. – DAUPHIN, C. – HAMON, M. – GRANGAUD,
J. P. – PRADEAU, D. 1997. Analytic and immunologic characterization of
chickpea (Cicer arietinum) protein hydrolysates obtained by bromelain and
chymotrypsin. In: J. Agri. Food Chem., vol. 45, 1997, p. 4758- 4762.
50 HOSSENEY, R. C. 1994. Principles of Cereal Science and Technology, second
ed. AACC, 1994, St. Paul, Minesota, 40. Pp.378. ISBN: 0913250430
51 HOZOVÁ, B. – MORAVČÍKOVÁ, P. 2010. Netradičné obilniny. Dostupné na
internete: http://www.potravinari.sk/page979sk.html [cit.15.3.2010]
52 HRČKOVÁ, M. – ZEMANOVIČ, J. – RUSŇAKOVÁ, M. 2001. Enzýmová
proteolýza sójovej odtučnenej múky. In: Bull. potravin. výskumu, vol. 40, 2001,
no. 4, p.. 301 – 310. ISSN 0231-9950
53 HRČKOVÁ, M. – ŠTURDLÍK, E. - ZEMANOVIČ, J. 2002. Potravinárske
využitie proteolytických enzýmov.In: Bull. potravin. výskumu, vol. 41, 2002, no.
2, p. 85 – 97. ISSN 0231-9950
54 HRČKOVÁ, M. – ŠTURDÍK, E. – MALIAR, T. – ZEMANOVIČ, J. 2004.
Biochemické vlastnosti proteolytických enzýmov. In: Chem. Listy, vol. 98, 2004,
no. 9, p. 842 – 850. ISSN 1213-7103, 0009-2770
57
55 CHOI, KH,.- LAURSEN, RA. 2000 Amino-acid sequence and glycan structures
of cysteine proteases with proline specificity from ginger rhizome Zingiber
officinale..In: Eur J Biochem. Vol. 267, 2000, no.5, PMID: 10691991 [dostupné
na internete: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10691991?dopt=abstract
56 IBRAHIM, C.O. 2008. Development of applications of industrial enzymes from
Malaysian indigenous microbial sources. In: Bioresource Technology. vol. 99,
2008, no. 11,p. 4572-4582. http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2007.07.040
57 JAMES, J. – SIMPSON, B. K. 1996. Application of enzymes in food processing.
In: Crit. Rev. Food Sci. Nutri., vol. 36, 1996, no. 5, p. 437 – 463. ISSN 1040-
8398
58 JAVOR, Ľ. – SUROVČÍK, J. a kol. 2001 Technológia pestovania strukovín.
Dostupné na internete :
http://www.agroporadenstvo.sk/rv/strukoviny/strukoviny_uvod.htm
[cit.10.2.2010]
59 JAVORSKÝ, P. – KREČMER, F. – UHNÁK, J. 1987. Chemické rozbory v
zemědělských laboratořích. Praha, Ministerstvo zemědělství a výživy ČSR, 1987,
s. 9 – 32
60 JESENÁK, K. 2005.. Agregácia. In: Sól-gélové metódy. Bratislava, UK. ISBN
80-223-2071-4. dostupné na internete:
http://www.fns.uniba.sk/fileadmin/knihy/jesenak/2005metody/06.pdf [cit.
15.2.2010]
61 KALITZ, H.M. et al. 1988. Microbial Proteinases. In: Adv. Biochem. Engin./
Biotechnol., vol. 36, 1988, p. 1 – 65. ISSN 0724-6145
62 KAGEYAMA, H. – UEDA, H. - TEZUKA, T. – OGASAWARA, A. –
NARITA, Y. – KAYEGAMA, T. – ICHINOSE, M. 2009. Differences in the P1
´substrate specifities of pepsin A and chymosin. In: Journal of Biochemistry vol.
147, 2010, no.2, p. 167-174; Online ISSN 1756-2651
58
63 KANEKANIAN, A. – GALLAGHER, J. – EVANS, E.P. 2000. Casein
hydrolysis and peptide mapping. In: Int. J. Dairy Technol., vol. 53, 2000, no. 1,
p. 1 – 5. DOI: 10.1111/j.1471-0307.2000.tb02648.x
64 KANU, P.J. - KANU, J.B. - SANDY, E.H. - KANDEH, J.B.A - MORNYA,
P.M.P. - HUIMING, Z. 2009. Optimization of enzymatic hydrolysis of defatted
sesame flour by different proteases and their effect on the functional properties of
the resulting protein hydrolysate. Am. J. Food Technol., vol.4, 2009, no.6, p.226-
240. DOI: 10.3923/ajft.2009.226.240 URL: http://scialert.net/abstract/?
doi=ajft.2009.226.240
65 KAPP, G.R. – BAMFORTH, C.W. 2002 The foaming properties of proteins
isolated from barley. In:Journal of the Science of Food and Agriculture, vol.82,
2002, no. 11, p. 1276-1281. DOI: 10.1002/jsfa.1177dostupné na internete:
http://www.ingentaconnect.com/content/jws/jsfa/2002/00000082/00000011/
art01177#avail
66 KARAM, J. - NICELL, J.A. 1997. Potential applications of enzymes in waste
treatment. In: J. Chem. Technol. Biotechnol., vol. 69, 1997, no. 2, p. 141-153.
ISSN 0268-2575
67 KARAMAĆ, M. – AMAROWICZ, R. – KOSTYRA, H. 2002. Effect of
temperature and enzyme/substrate ratio on the hydrolysis of pea protein isolates
by trypsin. In: Czech J. Food Sci., vol. 20, 2002, no. 1, p. 1 – 6. Dostupné na
internete http://www.cazv.cz/2003/2002/potr1_02/karamac.pdf
68 KARAMAC, M . - RYBARCZYK, A. 2008. Chymotryptic hydrolysis of lentil
proteins and characteristics of the resulting hydrolysates.In: Polish journal of
food and nutrition sciences. vol. 58, 2008, no. 3, p. 351-357. ISSN 1230-0322
dostupné na internete: http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=20635495
69 KARLUBÍK, M. – KYSELOVIČ,J. – 1990. Biochémia. Bratislava: Príroda,
1990. 260s. ISBN 80-07-00340-1.
59
70 KINSELLA, J.E. 2007. Functional properties of soy proteins. In: Journal of the
American Oil Chemists' Society. vol. 56, 2007, no. 3, p. 242-258. Dostupné na
internete: http://www.springerlink.com/content/q472251t76x55g73
71 KLIONSKI, D.J. – HERMAN, P.K. – EMR, S.D. 1990. The fungal vacuole:
composition, finction, biogenesis. In: Microbiological reviews.vol.54. 1990, no. 3
p. 266-292. Dostupné na internete: http://mmbr.asm.org/cgi/reprint/54/3/266.pdf
72 KLOMKLAO, S. – BENJAKUL, S. – VISESSANGUAN, W. – KISHIMURA,
H. – SIMPSON, B. K. 2006. Proteolytic degradation of sardine proteins by
trypsin from skipjack tuna spleen. In: Food Chem. vol. 98, 2006, p. 14 -22. ISSN
0308-8146
73 KRKOŠKOVÁ, B. - MACOVÁ, E. 2006. Hydrolýza bielkovín alternatívnych
obilnín. In: Trendy v potravinárstve, roč. 13, č. 1, 2006, s. 10 - 11. ISBN 1336-
085X
74 KRKOŠKOVÁ, B. – ŠIMKOVÁ, M. – STRÁŽNICKÁ, H. 1997. Enzýmová
hydrolýza bielkovín hrachu, In: Bulletin potravinárskeho výskumu, roč. 36, č. 4,
1997, s. 273 – 281.
75 KRKOŠKOVÁ, B. – ŠIMKOVÁ, M. 1998. Využitie enzýmov pri úprave
bielkovinovej zložky strukovín. In: Biotechnológie prípravy biologicky
aktívnych látok a ich využitie v pôdohospodárstve. Nitra: SPU, 1998, s. 37 – 43.
76 KORÉNEK, M.- VAŠKO, L. – KORENEKOVÁ, B.- ŠUTIAK, V.- NEUSCHL,
J.- KAŠTEL, R.- SOBEKOVÁ, A. – KREMEŇ, J.- LOHAJOVÁ Ľ.- HÚSKA,
M. 2003. Štúdium hydrolýzy albumínov hrachu proteázami tráviaceho traktu in
vitro. In Rizikové faktory potravového reťazca. [elektronický zdroj] : zborník
vedeckých prác z 3. medzinárodnej vedeckej konferencie, Nitra, s. 59 - 60. ISBN
80-8069-282-3. Dostupné na internete :
http://www.slpk.sk/eldo/rizikove_faktory03/korenek3.pdf.
77 KONG, X.- ZHOUA,H- QIANA, H 2006. Enzymatic hydrolysis of wheat gluten
by proteases and properties of the resulting hydrolysates In: Food Chemistry, vol.
60
102, 2007, no. 3,p. 759-763. doi:10.1016/j.foodchem.2006.06.062 , dostupné na
internete: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2006.06.062
78 KONRAD, G. - KLEINSCHMIDT, TH. - ROHENKOHL, H. 2004. Enzyme
modification of milk protein concentrate for the improvement of foam and
emulsifying characters. Part 2.Effects on the surface area characters. In: Deutsche
Milchwirtschaft, vol. 55, 2004, no. 19, p. 780-783
79 KOŠŤÁLOVÁ, Ľ. – KOVÁCS, L. A KOL. 2005. Úvod do pediatrie.
Elektronická učebnica www.fmed.uniba.sk . Dostupné na internete:
http://www.fmed.uniba.sk/fileadmin/user_upload/editors/akademicka_kniznica/
dokumenty_PDF/1_Uvod_do_pediatrie_pre_nemedicinske_smery.pdf [cit.
5.4.2010]
80 KRÚDY, M. 2010. Strukoviny. Dostupné na internete: http://www.osivo.sk/?
id=STRUKOVINY [cit. 9.4.2010]
81 KUMAR, H. R. H. – MONTEIRO, P. V. – BHAT, G. S. – RAO, H. G. R. 2001.
Effectes of enzymatic modification of milk proteins on flavour and textural
qualities of set youghurt. In: J. Sci. Food Agric., 81, 2001, p. 42 – 45.
82 KYUNG-KOH, BONG. - AH- SONG, K. 2008. Effects of trypsin-hydrolyzed
wheat gluten peptide on wheat flour dough 2008. In: Journal of the Science of
Food and Agriculture, vol. 88, 2008, no. 14.pp. 2445-2450. dostupné na
internete:http://www.ingentaconnect.com/content/jws/jsfa/2008/00000088/00000
014/art00006
83 LAHL, W.J. – BRAUN, S.D. 1994. Enzymatic production of protein
hydrolysates for food use. In: Food Technol., vol. 48, 1994, no. 10, p. 68.
84 LAMSALA, B.P. - JUNG, S. - JOHNSON, L.A. 2006. Rheological properties
of soy protein hydrolysates obtained from limited enzymatic hydrolysis. In: Food
sciece and technology. Vol. 40, 2007, no. 7, p. 1215-1223.
http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2006.08.021
61
85 LAŠŠÁK, M. 2009. Rosetta@home- Tajomstvo bielkovín. [cit.29.1.2010]
http://www.boinc.sk/clanky/rosetta-home-tajomstvo-bielkovin?page=full.
86 LEHRMAN, S.R. 1990. Fundamentals of protein biotechnology (edited by
Stanley, Stein). Marcel Dekker Inc, New York, 1990. p. 9- 38., pp 310. ISBN 0-
8247-8346-8
87 LEISOLA, M. – JOKELA, J.- PASTINEN, O. – TURUNEN, O. 2010. Industrial
use of enzymes. Dostupné na internete: http://66.102.9.104/search?
q=cache:QiFl0yb0330J:www.tkk.fi/Units/BioprocessEngineering/Kem-70.415/
INDUSTRIAL_USE_OF_ENZYMES.DOC+way+,producing,
+enzyme,proteolytic,Bacillus,submerged+fermentation,
+proces&hl=sk&ct=clnk&cd=21&gl=sk&client=firefox-a [cit. 1.2.2010]
88 LI, S. – ZHANG, Q.H. 2001. Advances in the development of functional foods
from buckwheat. In Critical Review in Food Science and Nutrition, vol.41, 2001,
no. 6, p. 451-454.
89 LI, L - YANG,Z.Z. – YANG, X.Q. - ZHANG, G.H. - TANG,S.Z.- CHEN, F.
2008. Debittering effect of Actinomucor elegans peptidases on soybean protein
hydrolysates. In: Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, vol.35,
2008, no. 1, p. 41 – 47. DOI - 10.1007/s10295-007-0264-y dostupné na
internete:- http://www.springerlink.com/content/h48855823015uw55
90 LIEBERMAN, M. – MARKS, A.D. 2009. Markś basic medical biochemistry
a clinical approach. 3.vyd. Lippincot William&Wilkins. p. 79, pp. 997. ISBN
13:978-0-7817-7022-4..
91 LIOE, N. H.- SELAMAT,J.- YASUDA, M. 2010. Soy Sauce and Its Umami
Taste: A Link from the Past to Current Situation. In: Journal of Food Science.
dostupné na internete: http://dx.doi.org/10.1111/j.1750-3841.2010.01529.x
92 LÓPEZ, G. – FLORES, I. – GÁLVEZ, A. – QUIRASCO, M. – FARRÉS, A.
2003. Development of a liquid nutritional supplement using a Sesamum indicum
L. protein isolate. In: Lebensm.-Wiss. U.-Technol., vol. 36, 2003, p. 67 – 74.
62
93 LU, X. J. – LIANG, L. L. – HUANG, H. J. – QIN, Y. – NING, Z. X. 1996. Effects of free amino acids on food taste. In: Food Sci., 1996, p. 10 – 12
94 LUKÁČOVÁ, V. – ZEMANOVIČ, J. 1998. Enzýmová hydrolýzy proteínov pri
výrobe potravín. In: Bull. potrav. výskumu, vol. 37, 1998, no.1, p. 19 – 31. ISSN
02319950
95 MAURER, H. R. 2001. Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical
use. In: Cell Mol. Life Sci., vol. 58, 2001, no. 9, p. 1234-1245. PMID 11577981
96 MENDANHA, D.V - MOLINA ORTIZ,S.E.- CARMEN S. TRINDADE,F. -
MAURI,A. - QUINTERO,M. E. - THOMAZINI,M. 2009 Microencapsulation of
casein hydrolysate by complex coacervation with SPI/pectin, 2009 In: Food
Research International, vol. 42, 2009, no. 8, p. 1099-1104. ISSN 0963-9969.
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2009.05.007
97 METHODS IN ENZYMOLOGY I. 1955. Edited by COLOWICK, S.P. –
KAPLAN, N.O., Section I. General preparative procedures, 16. Preparation of
buffers for use in enzyme studies. By G. GOMORI. Academic Press Inc.: New
York, 1955, p. 3 – 146.
98 MIDWINTER, G.R. – PRITCHARD, G.G. 2008. Aminopeptidase N from
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus NCDO 573: purification and
properties.In: Journal of Applied Microbiology. vol. 77, 1994, no. 3, p. 288-295.
10.1111/j.1365-2672.1994.tb03076.x. Dostupné na internete:
http://www3.interscience.wiley.com/journal/119974069/abstract?
CRETRY=1&SRETRY=0
99 MICHALÍK, I. 1994. Charakteristika cereálnych bielkovín, ich výživná kvalita
a vplyv na zdravotný stav. In: Výživa a zdravie, roč. 39, 1994, č 8, s. 159-160.
ISSN 00429406
100 MICHALÍK, I. 2003. Biochémia. 4. Upravené vydanie. Nitra: SPU 2003, 226 s.
ISBN 80-8069-171-1
63
101 MICHALÍK, I – URMINSKÁ, D. – PETR, J. – GÁLOVÁ, Z. –
KNOBLOCHOVÁ, H. 2004. Variabilita frakčnej skladby zásobných bielkovín
zrna cereálií a pseudocereálií. In: Proteíny 2004. s.17-20, ISBN 80-7157-779-0
102 MICHALÍK, I. et al. 2006. Výživná a technologická kvalita rastlinných
produktov a ich potravinárske využitie. Nitra: SPU, 2006. 198 s. ISBN 80-8069-
780-9
103 MICHALÍK,I. – URMINSKÁ,D. 2006. Bielkovinové determinanty celiakálneho
ochorenia. Protein determination of coeliac disease. In: Nové poznatky
z genetiky šľachtenia poľnohospodárskych rastlín. Zborník z13. Vedeckej
konferencie, Piešťany.VÚRV 2006, str.16 -19. dostupné na internete:
http://www.vurv.sk/files/25/zbornik_nove_poznatky..1._cast.pdf
104 MIKUŠOVÁ, I. 2010. Využitie papaínu v pečivárňach. [správa elektronickej
pošty] Správa pre: Renáta Halásová. 12.2.2010. [cit.12.2.2010]
105 MINH, P.N. – DEVROEDE, N. – MASSANT, J. – MAES, D. – CHARLIER,
D. 2009.Insights into the architecture and stoichiometry of Escherichia coli
PepA•DNA complexes involved in transcriptional control and site-specific DNA
recombination by atomic force microscopy. In: Nucleic Acids Research, 2009,
vol. 37, 2009, no 5, p. 1463-1476. Online ISSN 1362-4962. Dostupné na
internete: http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/gkn1078
106 MOLINA ORTIZ, S.E. - WAGNER, J.R. 2002. Hydrolysates of native and
modified soy protein isolates, structural characteristics, solubility and foaming
properties. In: Food Res. Int. vol. 35, 2002, no. 6, p. 511-518.
http://dx.doi.org/10.1016/S0963-9969(01)00149-1
107 MORATO, A. F. – CARREIRA, R. L . – JUNQUEIRA, R. G. – SILVESTRE,
M. P. C. 2000. Optimization of casein hydrolysis for obtaining high contens of
small peptides: use of subtilisin and trypsin. In: J. Food Com. Anal., 13, 2000,
no. 5, p. 843 – 857. http://dx.doi.org/10.1006/jfca.2000.0912
108 MORAVČÍKOVÁ, P., HOZOVÁ, B.2005. Netradičné obilniny. Výživa a
Zdravie, vol. 49, 2005, no.1.p. 6- 11.
64
109 MORIHARA, K. 1974. Comparative specificity of microbial proteinases. In:
Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., vol. 41, 1974, p. 179-243, Online ISBN:
9780470122860.
110 MORIHARA, K .- OKA, T.- TSUZUKIi, H., 1967. Multiple proteolytic
enzymes of Streptomyces fradiae. Production, isolation, and preliminary
characterization. Biochimica et Biophysica Acta. vol.139, 1967, no. 2, p. 382–
397. http://dx.doi.org/10.1016/0005-2744(67)90042-3
111 MOTA M. V. T. - FERREIRA I. M. P. L. V. O. - OLIVEIRA M. B. P.-
ROCHA C. - TEIXEIRA J. A.- TORRES D. -GONCALVES M. P. 2006 Trypsin
hydrolysis of whey protein concentrates : Characterization using multivariate
data analysis in: Food chemistry ISSN 0308-8146 2006, vol. 94, no.2, p. 278-
286
112 MOUDRÝ, J. a kol. 2005. Pohanka a proso. Praha: ÚZAPI, 2005. 206 s. ISBN
80-7271-162-8
113 MUCHOVÁ, Z. et al., 2000. Bielkovinové frakcie semena láskavca
(Amaranthus SP.). In Rostlinná výroba, roč. 46, 2000, č.7, s. 331-336.
114 MUCHOVÁ, Z. et al., 2007. Hodnotenie surovín a potravín rastlinného pôvodu.
Nitra : SPU 2007. ISBN 80-7137-614-0
115 MUCHOVÁ Z. 2007. Technológia spracovania cereálií. 2. vyd. Nitra: SPU,
2007, 148 s. ISBN 978-80-8069-980-2
116 MUCHOVÁ, Z. - ŽITNÝ, B.- FRANČÁKOVÁ, H. 2009. Variabilita
kvalitatívnych parametrov pšeničných múk a modifikácia vlastností ciest
miesením. In: Acta fytotechnica et zootechnica.Mimoriad. číslo 2009, s.486-498
117 MURRAY, R.K. – GRANNER, K.D. – MAYES, A.P. – RODWELL, W. V.
2002. Harperova biochemie, 4.vyd. Nakladatelství H&H, Jihlava 2002. 871s.,
ISBN 80-7319-013-3
118 NAKAI, H.S. – MODLER, W. 1996. Food proteins properties and
charakterization. Wiley-VCH, 1996. p.1-15, 560 pp, ISBN-10: 0471186147).
65
119 NIELSEN, M.P. – DAMODARAN, S. – PARAF, A. 1997. Food proteins and
their aplications. Edited by Srinivasan Damodaran, Alain Paraf. Marcel Dekker,
Inc. New York, 1997. 664pp. ISBN 0-8247-9820-1
120 NOGUCHI, A. – MASSO, C. – DEL ROSARIO , R.R. 1982. Mailard reaction
during extrusion- cooking of protein enriched bisquit Lebensm. Wiss. Technol.
1982, 15,105.
121 OHTSUKI, K. - TAGUCHI, K. - SATO, K. - KAWABATA, M. 1995.
Purification of ginger proteases by DEAE-Sepharose and isoelectric focusing, In:
Biochimica et Biophysica Acta. Vol. 1243, 1995, no.2, p. 181-184. ISSN 0304-
4165. http://dx.doi.org/10.1016/0304-4165(94)00145-N
122 OKADA, Y. – NAGASE.H – HARRIS, E.D. . 1986. A Metalloproteinase from
human rheumatoid synovial fibroblasts that digests connective tissue matrix
components. In: J. Biol. Chem., vol. 261, 1986, no. 30, p. 14245–14255.
123 ORTIZ MOLINA, S. E. – ANÓN, M. C. 2001. Enzymatic hydrolysis of soy
protein isolates, DSC study. In: J. Thermal. Analysis and Calorimetry, vol. 66,
2001, p. 489- 499
124 PANYAM, D. - KILARA, A. 1996. Enhancing the functionality of food
proteins by enzymatic modification. In: Trends Food Sci Technology. Vol.7,
1996, n.4. p.120-125. http://dx.doi.org/10.1016/0924-2244(96)10012-1
125 PARAMAN,I. - HETTIARACHCHY, N. S. - SCHAEFER,CH.- BECK,I.M.
2007. Hydrophobicity, Solubility, and Emulsifying Properties of Enzyme-
Modified Rice Endosperm Protein Cereal Chemistry. vol. 84, 2007, no.4, p. 343-
349. DOI:10.1094/CCHEM-84-4-0343 dostupné na internete:
http://cerealchemistry.aaccnet.org/doi/abs/10.1094/CCHEM-84-4-0343?
cookieSet=1&journalCode=cchem
126 PEDROCHE, J. – YUST, M.M. – GIRÓN-GALLE, J. – VIOQWUE, J. –
ALAIZ, M. – MILLÁN, F. 2003. Plant protein hydrolysates and tailor –made
66
foods. In: Elektron J. Environ. Agric. Food chem. vol.2, 2003, n.1, p. 233-235.
ISSN 1579-4377
127 PEDROSA, M PASCUAL, C. Y.- LARCO, JI - MARTÍN ESTEBAN, M. 2006.
Palatability of Hydrolysates and Other Substitution Formulas for Cow’s Milk-
Allergic Children: A Comparative Study of Taste, Smell, and Texture Evaluated
by Healthy Volunteers In: J Investig Allergol Clin Immunol. vol. 16, 2006, no. 6,
351 - 356. Dostupné na internete: http://www.jiaci.org/issues/vol16issue06/4.pdf
128 PERROT, C. – QUILLIEN, L. – GUEGUEN, J. 1999. Identification by
immunoblotting of pea (Pisum sativum L) proteins resistant to in vitro enzymatic
hydrolysis. In: Sci. Aliments, vol. 19, 1999, p. 377 – 390.
129 PINTADO, M. E. – MALCATA, F. X. 2000. Hydrolysis of ovine, carpine and
bovine whey proteins by trypsin and pepsin. In: Bioprocess Engineering, vol. 23,
2000, p. 275- 282 ISSN1615-7605.
130 POLAINA, J. – MAC CABE, A.P. 2007. Industrial enzymes: structure, function
and applications. Springer pub. p. 169 pp.. 641. ISBN 978-1-4020-5376-4
131 POPINEAU, Y. - HUCHET, B. - LARRE, C. - BEROT, S. (2002). Foaming
and emulsifying properties of fractions of gluten peptides obtained by limited
enzymatic hydrolysis and ultrafiltration. Journal of Cereal Science, vol.35, 2002,
no. 3, p. 327–335. http://dx.doi.org/10.1006/jcrs.2001.0437
132 PŠENÁKOVÁ, I. – FARAGÓ, J. 2006. Rastlinné flavonoidy a ich potenciál pre
funkčné potraviny a nutraceutiká. Nové poznatky z genetiky a šľachtenia
poľnohospodárskych rastlín. Zborník z 13. vedeckej konferencie, Piešťany
VÚRV, 2006 . dostupné na internete:
http://www.vurv.sk/files/25/zbornik_nove_poznatky..1._cast.pdf
133 RADHA, C. - KUMAR, P.R. – PRAKASH, V. 2008.Preparation and
characterization of a protein hydrolysate from an oilseed flour mixture. In: Food
Chemistry. Vol. 108, 2008, no. 3, p. 1027.
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.07.063
67
134 RAKOWSKA, M. – OCHODZKI, P. 2001. Nutritive role of food protein.
Properties of food proteins, ed. by Zdzislaw E. Sikorski 2001. CRC Press LLC.
p.217-232, 490 pp. ISBN 1-56676-960-4.
135 RAMKUMAR, C. - HARJINDER, S. - MUNRO, P. A. - SINGH, A. M. -
SINGH, H. 2000. Influence of calcium, magnesium, or potassium ions on the
formation and stability of emulsions prepared using highly hydrolyzed whey
proteins. In: J. Agric. Food Chem. vol. 48, 2000, no. 5, p. 1598 - 1604.
136 RAO, M.L. - TANKSALE, A.M. - GHATGE, M.S. - DESHPANDE, V.V. 1998.
Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. In: Microbiol.
Mol. Biotech. Rev., vol. 62, 1998, no. 3, p. 597-635. Dostupné na internete:
http://mmbr.asm.org/cgi/content/abstract/62/3/597
137 RAWLINGS, N.D. - BARRET, A.J. – BATEMAN, A. 2010. MEROPS: the
peptidase database. In: Nucleic acid research. vol38, 2010, D227-233. Online
ISSN 1362-4962. Dostupné na internete:
http://nar.oxfordjournals.org/cgi/screenpdf/38/suppl_1/D227 [cit.7.4.2010]
138 SAHA, B.C. – HAYASHI, K. 2001. Debittering of protein hydrolyzates.
In: Biotechnol. Adv., vol. 19, no. 5, 2001, p. 355 – 370.
139 SZABOVÁ, E. - URMINSKÁ, D. –MICHALÍK, P. 2003. Využitie
pseudocereálií na prípravu potravín pre pacientov s celiakiou.In: zbornik 2003
proceeding book rffch kfzfbp uniag konferencie/ 143 - 143 Rizikové faktory
potravového reťazca III, Nitra, 2003 dostupné na internete:
http://www.oxygy.com/zbornik2003-proceeding-book-rffch-kfzfbp-uniag-
konferencie/143
140 SZABOVÁ, E. 2006. Optimalizácia produkcie bakteriálnej peptidázy a jej
purifikácia chromatografickými metódami. Autoreferát dizertačnej práce. SPU,
FBP, Nitra, 2006, s. 5.
141 SENDREJOVÁ, E. - KARAMAĆ,M. - KOSIŃSKA,M. - AMAROWICZ, R. -
URMINSKÁ, D.2007. Pšeničné bielkoviny ako substráty na prípravu
enzymatických hydrolyzátov. 8. vedecká konferencia doktorandov a mladých
68
vedeckých pracovníkov, 2007, FPV UKF Nitra. p.274 – 276. Dostupné na
internete:
http://citadel.ukf.sk/konferencia/papers/PDF_Chemia/Sendrejova_Urminska.pdf
142 SHAN, L. – MOLBERG, O. – PARROT, I. et al. 2002. Structural basisi for
gluten intolerance in celiac sprue. In: Science. 2002, vol. 297, 2002, p. 2275-
2279. DOI: 10.1126/science.1074129
143 SCHROEDER, L. J. - IACOBELLIS, M. - SMITH, A. H. 1961. Influence of
Heat on the Digestibility of Meat Proteins. In: Journal of nutrition. vol 73, 1961,
p. 143-150
144 SINHA, U. - WOLZ, S.A. – LAD, P.J. 1991. Two new extracellular serine
proteases from Streptomyces fradiae. In: J. Biochem. vol.23, 1991, no. 10, p.
979–984. PMID: 1786859
145 SORMUS, C. P. – NEVES, V. A. - MACHADO, M. B. M. 2009. Enzymatic
Hydrolysis of Sweet Lupin, Chickpea, and Lentil 11S Globulins Decreases their
Antigenic Activity .In: Journal of Agricultural and Food Chemistry. Vol. 57,
2009, no. 3, p. 1070-1075. DOI: 10.1021/jf803108c.
146 SONDERGAARD, A.H. - GRUNERT, G. K.- SCHOLDERER,J. 2005.
Consumer Attitudes to Enzymes in Food Production. In: Trends in Food Science
& Technology, vol.16, 2005, no. 10, p. 466-474. ISSN 0921-2244
147 STORER, A.C. – MENARD, R. 1994. Catalytic mechanism in papain family of
cysteine peptidases. Methods in Enzymology vol. 244, pg. 486–511 ISSN: 0076-
6879
148 SUMANTHA, A. – LARROCHE, CH. – PANDEY, A. 2006. Microbiology
and industrial biotechnolgy of food-grade proteases: a perspective. In: Food
Technol. Biotechnol., vol. 44, no. 2, 2006, p. 211 – 220. ISSN 1330-9862.
149 SURÓWKA, K. - MUDZISKI, D. - FIK, M. – MACURA, R. - ASOCHA, W.
2004. New protein preparations from soy flour obtained by limited enzymic
69
hydrolysis of extrudates. In: Innov. Food Sci. Emer. Tech., vol. 5, 2004, no. 2, p.
225-234. Dostupné na internete http://dx.doi.org/10.1016/ j.ifset.2004.01.005
150 SZABOVÁ, E. 2006. Optimalizácia produkcie bakteriálnej peptidázy a jej
purifikácia chromatografickými metódami. Dizertačná práca. Nitra : SPU, 2006
151 ŠKÁRKA, B. – FERENČÍK, M. 1987. Biochémia,2. prepracované vydanie.
Vyd. Alfa, Bratislava, 1987. 741 s.
152 ŠTOSOVÁ, T. – HAVLÍŠ, J. – LENOBEL, R. – ŠEBELA, M. 2005.
Proeteolytické enzýmy: Význam pro proteomiku. In: Chem. Listy, roč. 99, č. 12,
2005, p. 896 – 905. ISSN 1213-7103
153 TOVAR-PÉREZ, E.G. - GUERRERO-LEGARRETA, I.- FARRÉS-
GONZÁLEZ, A. - SORIANO-SANTOS, J. 2009. Angiotensin I-converting
enzyme-inhibitory peptide fractions from albumin 1 and globulin as obtained of
amaranth grain In: Food Chemistry. Vol. 116, 2009, no. 2, p. 437-444.
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.02.062
154 SOCHA, P. - RAŽDÍKOVÁ, A.- URMINSKÁ, D. 2010. Optimalizácia
stanovenia prítomnosti celiakálne aktívnych bielkovín v cereáliách. In:
Potravinárstvo, ročník 4. Feb. 2010. p 497-508. Dostupné na internete:
http://www.potravinarstvo.com/dokumenty/mc_februar_2010/pdf/5/Socha.pdf
155 URMINSKÁ, D. 1997. Biotechnológia prípravy bakteriálnych Ser-proteáz a ich
biochemická charakteristika: Habilitačná práca. Nitra: SPU. 1997, s. 70.
156 VANDENPLAS, Y. 1995. The use of hydrolysates in allergy prevention
programmes. In: Eur. J. Clin. Nutr. vol. 49, 1995, no. 1, p. 84 – 9. PMID:
8647068
157 VISHWAS, D.M. – NARAYAN, J.S. – PADMANABHKURUP, H. 2007
Patentový dokument WO/2007/080599 : Enzymatic process for debittering of
protein hydrolyzate using imobilized peptidases. PCT/IN2006/000025. Pu. Date:
July 19, 2007. Dostupné na internete :
70
http://www.sumobrain.com/patents/wipo/Enyzmatic-process-debittering-protein-
hydro/WO2007080599.html [cit.12.12.2009]
158 VODRÁŽKA, Z. Biochemie 1, 2, 3. - 1. vyd. Praha : Academia, 1993. 506 s.
ISBN 8020004386.
159 VODRÁŽKA, Z. – RAUCH, P. – KÁŠ, J. 1998. Enzymologie. 3. preprac.
Vydanie, Praha: VŠChT, 1998, 171 s. ISBN 8070801247
160 VOET, D. – VOET, .J.G. 2004. Biochemistry. Printed in the United States of
America, 2004. 1523s. ISBN 0-471-19350-x.
161 WAGSTAFF, C. – LEVERENTZ, M.K. – GRIFFITHS, G. - THOMAS, B. –
CHANASUT, U. - STEAD, A.D. – ROGERS, H.J.2002. Cysteine protease gene
expression and proteolytic activity during senescence of Alstroemeria petals. In:
J. Exp. Bot. Vol.53, 2002, no. 367, p. 233-240. Online ISSN 1460-2431.
162 WANG,J.- ZHAO, M. - JIANG.Y. 2007. Effects of Wheat Gluten Hydrolysate
on Dough Properties. In: Food Technol. Biotechnol. Vol. 45, 2007, no.4, p. 410–
414. ISSN 1330-9862.
163 WANG, S. J.- ZHAO,M. M. - BAO, Y.- HONG, T.- ROSELLA, C.M. 2008.
Preparation and characterization of modified wheat gluten by enzymatic
hydrolysis-ultrafiltration. In: Journal of food biochemistry. vol.32, 2008, no.3, p.
316-334. ISSN 0145-8884.
164 WEI, Q. – ZHIMIN, H. 2006. Enzynatic hydrolysis of protein: Mechanism of
kinetic model. In: Journal Frontiers of chemistry in China. Vol.1, 2006, no.3, pp
308-314. ISSN 1673-3614(online).Dostupné na internete:
http://www.springerlink.com/content/441119195516572m/
165 VIOQUE, J. – CLEMENTE, A. – SANCHEZ VIOQUE, R. – PEDROCHE, J. –
MILLAN, F. 2000. Effect of AlcalaseTM on olive pomace protein extraction. In:
J. American Oil Chemists´ Society, vol. 77, 2000, no. 2, p. 181- 185. ISSN 1558-
9331 (Online).
71
166 WITCZAK, M. - PTASZEK, A. - MUDZIN´SKI, D. Z. - SURÓWKA, K. –
GRZESIK, M. 2005. Rheological and AFM Characteristic of Hydrolysates
Produced by Limited Enzymatic Hydrolysis of Soy Flour Extrudates. In: Chem.
Pap. Vol. 59, 2005, no. 6b, p. 491—495. dostupné na internete:
http://www.chempap.org/papers/596ba491.pdf [cit. 3.2.2010]
167 WRÓBLEWSKA, B. - JĘDRYCHOWSKI, L. - SZABÓ, E.- HAJÓS, GY. 2005.
The reduction of cow milk proteins immunoreactivity by two-step enzymatic
hydrolysis. In: Acta Alimentaria. Vol. 34, 2005, no. 3, p. 307- 315. Online ISSN
1588-2535
168 YALCIN, E. – CELIK, S. 2007. Solubility properties of barley flour, protein
isolates and hydrolysates. In: Food Chemistry. Vol. 104, 2007, no.4, p. 1641–
1647 http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.03.029
169 YEBOAH, F. K. - ALLI, I. - SIMPSON, B. K. - KONISHI, Y. - GIBBS, B. F.
1999. Tryptic fragments of phaseolin from protein isolates of phaseolus beans.
In: Food Chem. vol. 67, 1999, no. 2, p. 105 – 112.
http://dx.doi.org/10.1016/S0308-8146(98)00058-2
170 ZAKHAROVA, E. – HORVATH, M.P. – GOLDENBERG, D. 2009. Structure
of a serine protease poised to resynthesize a peptide bond. In: PNAS. vol. 106,
2009, no. 27, p. 11034-11039. Dostupné na internete:
http://www.pnas.org/content/106/27/11034.full#abstract-1 [cit.6.4.2010]
171 ZAYAS, J. F. 1997. Functionality of proteins in food. Springer-Verlag Berlin
Heidelberg New York. Pp. 373, p. 6. ISBN 3-540-60252-6.
172 ZEMANOVIČ, J. – ŠTOLFOVÁ, D. – SILLOVÁ, J. 1991a. Enzýmová
hydrolýza kazeínu v membránovom reaktore. In: Bulletin potravinárskeho
výskumu, roč. 30 (10), č. 4, 1991, s. 299 – 304.
173 ZEMANOVIČ, J – SILLOVÁ, J. – ŠTOLFOVÁ, D. 1991b. Enzýmová
hydrolýza proteínov. In: Bulletin potravinárskeho výskumu, roč. 30 (10), č. 4,
1991, s. 291 – 297
72
174 ZHANG, L. - LI, J. - ZHOU, K. 2009. Chelating and radical scavenging
activities of soy protein hydrolysates prepared from microbial proteases and their
effect on meat lipid peroxidation. In: Bioresource Technology. vol. 101, 2010,
no. 7, p. 2084-2089. http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2009.11.078
175 ZHAO, X. - HOU, Y. 2009. Limited hydrolysis of soybean protein concentrate
and isolate with two proteases and the impact on emulsifying activity index of
hydrolysates. In: African Journal of Biotechnology. vol. 8, 2009, no.14, p. 3314-
3319. ISSN 1684–5315
176 ZHONG, F. – WANG, Z. – XU, S.-Y. – SHOEMAKER, CH.F. 2007. The
evaluation of proteases as coagulants for soy protein dispersion. In: Food Chem.,
vol. 100, 2007, p. 1371 – 1376.
Elektronické zdroje
http 1 PROTEIN FUNCTIONALITY. IFTSA
http://www.iftsa.org/outreach/so/tutorials/ProteinFunctionality.pdf [cit.
18.1.2010]
http 2 ENZYME NOMENKLATURE
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/intro.html [cit. 11.1.2010]
http 3 MEROPS databáza. http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/family_index?
type=P#S [cit. 1.1.2010]
http 4 DSM. Neutrase® 0.8 L Description.
http://www.dsm.com/en_US/html/dnpus/an_neutrase_8_l.htm [cit.2.2.2010]
http 5 DEERLAND http://www.deerland-enzymes.com/enzymes.php?id=45
[cit. 5.3.2010]
http 6 S.A. BIOCHEM EUROPE http://www.biochem-europe.be/produits-
en.htm [cit.20.12.2009]
73