Uzm. Bio. NUR YILDIRIM

Genlerin çok büyük ve çok sayıda ekzondan oluştuğu göz önüne

alındığında, bu genleri Sanger sekanslama ve genom boyu SNP

genotiplemesi gibi klasik genetik metodlarla taramak hem maddi

açıdan çok pahalı olmakta hem de zaman bakımından çok uzun

sürmektedir.

Tüm ekzom sekanslama, 2009 yılında klasik

genetik metotlarına alternatif olarak

tanımlanmış bir metotdur .

Bu metot, yeni nesil teknolojiler yardımıyla

dönüşümsel bir yaklaşım sağlayarak kompleks

ve monogenik hastalıkdaki, etkili mutasyonu

saptamakta kullanılmaktadır.

İnsan genomu

yaklaşık 3 milyar

bazdan meydana

gelmektedir.

Ancak bunun çok

küçük yani

yaklaşık %1.5’luk

bir kısmı protein

üretmektedir yani

fonksiyoneldir.

Ekzon kelimesi

“ifade olan bölge”

kelimelerinin

İngilizce

karşılıklarından

(EXpressed

regiON)

oluşturulmuştur.

Ekzom terimi ise

genom içerisinde

bulunan tüm

protein kodlayan

dizileri yani

ekzonları

tanımlamak

amacıyla

kullanılan bir

terimdir.

•Tüm ekzom sekanlama yöntemi, sık veya nadir

olmasına bakmaksızın ekzomdaki her bazın

tanımlanmasını sağlamaktadır.

•Bu nedenle bu yüksek çözünürlüklü sekanslama

yöntemi gün geçtikçe bilim adamları tarafından

nadir varyantları tanımlamada tercih edilen bir

yöntem halini almaktadır.

Hastalık yapıcı mutasyonların yaklaşık olarak %85’i, proteinin

amino asit dizisini etkileyecek şekilde, genlerin ekzon veya

ekzon-intron birleşme bölgelerinde bulunmaktadır. Bu bölgeler

de genomun %1,5’lik bir bölümünü oluşturmaktadır.

Bu nedenle etkilenmiş bireylerde öncelikle tüm genom

sekanslaması yapmak hem iş gücünü hem de maddi

yükü arttırmaktadır.

Öncelikle tüm ekzom sekanslama yöntemini kullanarak

genomdaki sadece protein kodlayan bölgelerin

sekanslanması daha uygundur.

Bu yöntem yardımı ile çok çeşitli hastalıklara neden

olan nadir varyantların tanımlanabileceği yapılan

çalışmalarla kanıtlanmış ve günümüzde yaygın bir

kullanım alanına sahip olmuştur.

Yöntem temel olarak hedef bölgelerin seçimi ve

sekanslanması olmak üzere iki basamak

içermektedir.

Hedef bölgelerin seçimi yani “capture” aşamasında

genomik DNA rastgele yerlerden parçalanarak

fragmentlerine ayrılmaktadır.

Bu parçalama işlemi sonikasyon (ses dalgalarının

enerjisinden yararlanarak biyolojik maddenin parçalanması)

tekniği kullanılarak gerçekleştirilmektedir.

Tüm ekzom sekanslama yönteminde hedef bölgelerin seçimi işlemi bir

adet kalıp DNA üzerinden gerçekleşmemektedir. Yani işleme başlarken

kullanılan 100 μL DNA’nın içerisinde çok sayıda aynı kalıp DNA

bulunmaktadır.

Sonikasyon işleminden sonra rastgele yerlerinden parçalanan bu kalıp

DNA’lar, aynı bölgelerden parçalanmazlar. Bu nedenle tek bir baz

üzerinden konuşursak, bu bazı farklı lokalizasyonlarda içeren çok

sayıda farklı fragment oluşmaktadır.

Bu baz; bazı fragmentlerde baş, bazı fragmentlerde orta,

bazılarında ise son kısma denk gelmektedir. Böylelikle bu baz

farklı fragmentlerce birden çok kez kapsamına alınmıştır.

Bu bazın farklı fragmentler tarafından kapsanma sayısını

(sekanslama aşamasında ise; kaç kere okunduğu yani

sekanslandığı sayı) ifade etmek için “coverage” terimi

kullanılmaktadır.

Kapsanma sayısı her baz için değişkenlik göstermektedir.

•Bunun sebeplerinden biri

genomun o bölgesindeki GC

baz içeriğidir.

•Diğer bir neden ise örneğin

kalitesidir.

Bu yöntem için

kullanılacak örneğin

yüksek kalitede olması

elde edilecek sonuç

açısından çok

önemlidir.

Degrade olmuş yani bir

takım sebeplerden

dolayı parçalanmış bir

DNA örneği, sonikasyon

işlemi ile parçalanacağı

için istenilenden çok

daha küçük boyutta

fragmentler

oluşturmaktadır.

Bu fragmentler de

pürifikasyon

aşamalarında

atılmaktadır.

Sonikasyon aşamasından sonra elde edilen DNA fragmentleri

•Elde edilen bu fragmentlerin uçlarına sekanslama işleminde kullanılmak

amacıyla bir takım adaptörler bağlanmaktadır. Ardından bu fragmentlerin

pürifikasyon aşaması gerçekleştirilir ve elde edilen ürün örneğinizin

hazırlanmış kütüphanesidir.

• Ardından sekanslamak istediğiniz bölgeye özgü hazırlanmış kitler

sayesinde elinizdeki kütüphaneden bu bölgelerin seçimi aşaması

gerçekleştirilir. Bu seçim bir hibrid seçimidir.

• Bu işlem sonucunda hibrid oluşturmayan fragmentler

temizlenerek uzaklaştırılır. Elde edilen hibridli fragmentler

pürifiye edildikten sonra sekanslama aşamasına geçilmektedir.

Tüm ekzom sekanslama yönteminin akış şeması

Sekans örnekleri

Örnek takibi

Hazırlık basamakları

Verilerin toplanması

Veriler

Genetikte bir devrim niteliğindedir.

Her bir yürütmede 1.4 milyar baz okuma yapılabilmektedir.

Klonal olarak amplifiye edilip taneciklere bağlanan DNA fragmentlerinin, toplu ve paralel sekanslanması temeline dayanır.

Yeni nesil dizileme teknolojisi; mRNA, küçük RNA profili, transkripsiyon

faktörleri bağlanma bölgelerinin genom boyu karakterizasyonu,

kromatin yapısı ve metilasyon paterni, atasal DNA mikrobiyolojisi ve

metagenomik için yeni ve hızlı yollar sağlar.

Yeni nesil dizileme; genom, transkriptom, DNA-protein etkileşimlerinin

geniş kapsamlı analizini ucuz (?), rutin ve yaygın hale dönüştürdüğü

için biyolojik araştırmaları önemli ölçüde hızlandırmaktadır.

Yeni nesil DNA dizileme sistemleriyle yüksek doğrulukla, hızlı bir

şekilde dizileme yapılabilmektedir.

Son yıllarda geliştirilen yeni nesil DNA dizileme teknolojisi,

genetik/epigenetik düzenleyici ağların, kromatin yapısı, nükleer

yapılanma ve genom varyasyonları (çeşitliliği) hakkında bilgi üretimini

sağlayan önemli bir araçtır.

Bu yöntemle elde edilen bir mikrobiyal genom dizisi araştırmacılara başka hiçbir deneysel yöntem ile elde edilemeyecek kadar zengin ve özgün bilgi sağlamaktadır.

Örneğin 4.6 Mb'lık E. coli genomu tek bir okuma ile tamamlanabilmektedir.

Yapılan bir çalışmada E. coli genomu dört kere, herbir koşmada 400.000 okuma yapılarak de novo dizilenmiş ve sekanslamalann %99.997 ila %99.999 arasında doğrulukla yapıldığı tespit edilmiştir.

Bütün Genom Dizileme Sistemi ile dizileme:

Küçük DNA parçacıkları ve adaptör dizilerinin pikolitre hacimlerde büyük çaplı paralel dizileme ile dizilenmesi

prensibine dayanmaktadır.

Yeni Nesil

DNA Dizi

Analizi

Applied

Biosystem

SOLID

Roche 454

GS FLX

Roche GS

Junior

Ion

Torrent

Pasific

Bioscience

Helicos

Illumina

Genome

Analyzer

Sanger metodu ile uzun DNA bölgelerinin dizilenmesi için dizileme öncesi uygulanması gereken klonlama ve koloni seçimi işlemlerinin çok uzun süre alan zahmetli işlemler olması bilim adamlarını alternatif dizileme yöntemleri arayışına sokmuştur.

1996'da Ronaghi ve arkadaşları "Sentez Yoluyla Dizileme" (sequencing by synthesis) prensibine dayalı "Pirodizileme" metodunu geliştirmiştir.

Pirodizileme yüksek işlem hacmi ve düşük maaliyeti sayesinde geleneksel Sanger dizilemenin yerini almıştır.

Pirodizilemenin temeli, DNA polimeraz aktivitesinin kemilüminesan bir

enzim aracılığıyla tespitine dayanmaktadır. Dizilenecek DNA'nın tek

sarmalı (ssDNA) üzerinde tamamlayıcı sarmalın sentezlenmesi

şeklinde ilerler.

Çift zincirli DNA 400-800 bç'lik küçük fragmanlara ayrılır.

Bu fragmanlara dizileme primerlerini taşıyan adaptörler eklenir.

Adaptörleri taşıyan DNA fragmanlarının mikroreaktörler içerisinde emülsiyon bazlı klonal amplifikasyonu (em-PCR) gerçekleştirilir.

Bu aşama sonucunda yaklaşık olarak 10 milyon kopyaya çıkarılmış DNA fragmanları sentez yoluyla dizileme yöntemiyle yaklaşık 3.6 milyon kuyu içeren bir platede dizilenir.

Dizileme primeriyle sabitlenen tek sarmallı kalıp DNA üzerine ardışık olarak akan A, C, G, T nükleotitlerinin kalıp DNA dizisine tamamlayıcı olması durumunda ortamda bir ışık oluşur.

Bu ışığı yaratan kemilüminesan sinyalin hangi nükleotidin bağlanması sırasında oluştuğu tespit edilir.

Sabitlenen ssDNA, DNA polimeraz, ATP sülfirilaz, lüsiferaz, apiraz, APS ve lusiferin ile inkübe edilir.

Nükleotid akışı sırasında tamamlayıcı nükleotidin gelmesi durumunda DNA polimeraz pirofosfat (PPi) açığa çıkmasını sağlar. ATP sülfirilaz enzimi bu PPi'ı kantitatif olarak ATP'ye dönüştürür.

ATP, lüsiferaz enzimi aracılığıyla lusiferinin oksilusiferine dönüşmesini sağlar. Oksilusiferin görülebilir bir ışık yaratır. Bu ışığın şiddeti ATP miktarıyla doğru orantılıdır ve bu sayede aynı dizi üzerindeki tek nükleotid tekrarları (homopolimer) tespit edilir.

Ortaya çıkan bu ışık CCD kamera tarafından kaydedilir ve bilgisayar programı yardımıyla dizi verilerine (flogram) dönüştürülür.

Pirodizileme yöntemi kullanılarak, klonlama yapmaksızın, 7.5 saatte

100-500 milyon bazlık dizileme yapmak mümkündür.

DNA'nın çift sarmallı yapısını bulan Nobel ödüllü araştırmacı Dr. James

Watson'in genomu bu yöntemle dizilenmiştir.

Yine Neandertal genomu ve nesli tükenen mamut türünün genomu bu

yöntemlerle kısa sürelerde bütünüyle dizilenebilmiştir.

Bu yöntem bu tip karmaşık genomların haricinde, bakteri ve virus gibi

daha basit genomların da bir gün içinde tüm genomunun

dizilenebilmesini sağlar.

DNA molekülleri öncelikle slide üzerindeki primerlere bağlanıp amplifiye edilir (bridge amplification).

Dört tip ddNTP eklenir ve yeni sentezlenen ipliğin yapısına girmeyen ddNTP'ler yıkanarak uzaklaştırılır.

Pirodizilemeden farklı olarak, DNA her yıkamadan sonra, bir nükleotid uzar. Floresan işaretli nükleotidler kamera aracılığı ile tespit edildikten sonra, 3' ucundaki sonlandırıcı kimyasal olarak çıkartılır ve sonraki siklusa geçilir.

Bu metotta da pirodizilemedeki gibi emülsiyon

PCR yapılır.

Primerler adaptör diziler yardımıyla kalıp ipliğe

hibridize olur.

Farklı olarak DNA polimeraz yerine DNA ligaz

enzimi kullanılır.

Floresan işaretli oligonükleotid probları kullanılır,

problar kalıp DNA'ya hibridize olur ve primerle

ligasyona girer.

Floresan deteksiyonundan sonra oligonükleotid

probların işaretleri 5' fosfat ucu kesilerek yeni bir

ligasyon siklusuna geçilir.

Ligasyon, deteksiyon ve ayrılma siklusları

tekrarlanarak DNA dizisi belirlenir.

Bu metot DNA'nın polimerizasyonu sırasında ortaya çıkan hidrojen iyonlarının

saptanmasına dayanır. Tek bir kalıp DNA dizisini içeren mikro kuyuya tek tip

nükleotid akışı uygulanır. Verilen nükleotid kalıp ipliğe komplementer olduğu

durumda yeni oluşan ipliğin yapısına katılır ve hidrojen iyonu salınımı olur.

Hidrojen iyonları hipersensitif iyon sensörleri tarafından algılanır. Kalıp

DNA'da homopolimer tekrarların varlığı durumunda tek siklusta birden fazla

nükleotid yeni ipliğin yapısına girecek ve salınan hidrojen iyonlarının sayısına

göre daha fazla elektronik sinyal elde edilmesiyle DNA dizisi belirlenir.

Polimeraz ve nükleotit trifosfatlar, DNA bazlarını tanımlamak için doğrudan moleküler algılayıcılar (nano-dizileme makineleri) olarak davranmak üzere kullanılır.

DNA ipliği nano gözenekten geçerken, gözeneğin yanlarına yerleştirilmiş elektrotlar aracılığıyla elektrik akımı kaydedilir.

Dört farklı baza karşılık gelen akım değişiklikleri belirlenmek suretiyle nano gözenekten geçen DNA’nın dizisi belirlenir.

Pacific Bioscience cihazı nano dizileme prensibi ile çalışmaktadır.

5500 W Series Genetic Analysis Systems: Next-Generation

Sequencing

Ion Personal Genome Machine™ Sequencer

Roche GS Junior System 454 sequencing

Applied Biosystems Ion Torrent

EMÜLSİYON PCR

Roche 454 ve SOLID Sistemler tarafından kullanılır.

Primerler boncuk (bead) yüzeyine tutunur.

Adaptör takılı fragmentler yağın içerisindeki bir su

damlasının içinde amplifiye olur.

Yeni Nesil

DNA Dizi

Analizi

Applied

Biosystem

SOLID

Roche 454

GS FLX

Roche GS

Junior

Ion

Torrent

Pasific

Bioscience

Helicos

Illumina

Genome

Analyzer

Yeni nesil sekans sistemi kanıtlanmış teknolojisi, geniş uygulama alanları, pratik ve ekonomik olarak tasarlanmış bir sistemdir. Uzun okuma teknolojisi ile yüksek kalitede doğrulukla dizileme yapabilmektedir.

Tüm genom dizileme, amplicon dizileme, alt tür ve türümsü tayini, mutasyon tespiti ve genotiplendirme gibi pek çok uygulama alanında kullanılmaktadır. Sistem multiplex çalışma yapmaya uygundur. Sisteme adapte edilmiş; onkoloji, genetik, viroloji, hematoloji panelleri mevcuttur.

Roche 454 Sequencing - GS Junior System

Amplifikasyon: Emulsiyon PCR

Sekans Reaksiyonu:

Pirodizileme

Yürütme Başına Kalıp Molekül : 1 milyon

400 Mb /okuma / 7,5 – 8 saat

Roche 454 Sequencing - GS Junior System

Pirodizilemenin paralelleştirilmiş bir versiyonu 454 Life Sciences tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntemde bir yağ solüsyonu içindeki su damlacıklarında yer alan DNA, PCR ile çoğaltılır (emülsiyon PCR).

Tek bir DNA kalıbının tek bir primer kaplı boncuğa bağlı olduğu her damlacık, sonra klonal bir koloni oluşturur.

Dizileme cihazı çok sayıda pikolitre hacimli kuyulara sahiptir, bunların her biri tek bir boncuk ve dizileme enzimleri içerir.

Pirodizilemede lüsiferaz enzimi kullanılır, bu enzimin ürettiği ışık ile büyümekte olan DNA'ya eklenen her bir nükleotit tespit edilir. Veriler birleştirilerek dizi okumaları üretilir.

Roche 454 Sequencing - GS Junior System

Illumina Solexa sisteminde kullanılır.

Bridging (köprü kurma) adı verilen yöntemle DNA

fragmentleri çoğaltılıp kümeler haline getirilir.

DNA fragmentlerinin iki ucuna adaptör takılır ve bu

adaptörler çiplere utturulur

Yeni Nesil

DNA Dizi

Analizi

Applied

Biosystem

SOLID

Roche 454

GS FLX

Roche GS

Junior

Ion

Torrent

Pasific

Bioscience

Helicos

Illumina Genome

Analyzer

Illumina yeni nesil sekans sistemlerine yeni bir soluk

getirmiştir.

Sınıfında ilk ve tek yeni nesil sekanslama sistemi olan Hiseq2500, Hiseq sekans sistemlerinin en yeni üyesi olarak karşımıza çıkıyor.

Aynı platformda sekans kütüphane hazırlama sistemini de bulunduran Hiseq2500, bir sekanslama çalışmasını en az süreye indirgeyerek yüksek kapasite ve hızı aynı anda gerçekleştirebiliyor.

Yüksek output modülde, yüksek sayıda genome, exome ve transcriptomu tek bir run da sekanslar.

Hızlı modülde ise, bir genomu 30x’de veya exome resekanslama ve RNA sekanslamayı bir günde tamamlar.

Hızlı run modülünde sekans kütüphane hazırlama ve paired-end modül sisteme entegre olduğu için hiçbir şekilde kullanıcı müdahalesine gerek duymaksızın sistem otomatik olarak çalışır.

Amplifikasyon:

Bridge PCR

Sekans Reaksiyonu: Reverse Terminator

Yürütme Başına

Kalıp Molekül: 40 milyon

Günlük Veri Üretimi: >17 Gb /okuma /

3-6 saat

Bu metotta da pirodizilemedeki gibi emülsiyon

PCR yapılır.

Primerler adaptör diziler yardımıyla kalıp ipliğe

hibridize olur.

Farklı olarak DNA polimeraz yerine DNA ligaz

enzimi kullanılır.

Floresan işaretli oligonükleotid probları kullanılır,

problar kalıp DNA'ya hibridize olur ve primerle

ligasyona girer.

Floresan deteksiyonundan sonra oligonükleotid

probların işaretleri 5' fosfat ucu kesilerek yeni bir

ligasyon siklusuna geçilir.

Ligasyon, deteksiyon ve ayrılma siklusları

tekrarlanarak DNA dizisi belirlenir.

Yeni Nesil

DNA Dizi

Analizi

Applied Biosystem

SOLID

Roche

454 GS

FLX

Roche GS

Junior

Ion

Torrent

Pasific

Bioscience

Helicos

Illumina

Genome

Analyzer

Amplifikasyon:

Emülsiyon PCR

Sekans Reaksiyonu:

Ligasyon

Yürütme Başına Kalıp Molekül:

85 milyon

Günlük Veri Üretimi:

10-15 Gb /okuma / 6 gün

Elde edilen boncukların her birinde aynı DNA'nın kopyaları bulunmaktadır, bu boncuklar bir cam slaytın üzerine yerleştirilir.

Veriler bilgisayar programı tarafından işlenir.

Applied Biosystems'in SOLiD teknolojisinde ligasyon yoluyla dizileme yöntemi kullanılır.

Burada, belli uzunluktaki tüm olası oligonükleotitlerin bir karışımı dizilenen konuma göre işaretlenir.

Oligonükleotitler toplanır ve ligasyona uğrar; DNA ligazın birbiriyle eşleşen dizileri bağlanma tercihi nedeniyle, o pozisyon için bilgilendirici bir sinyal elde edilir.

Dizilemeden önce DNA emülsiyonu PCR ile çoğaltılır.

Yeni Nesil

DNA Dizi

Analizi

Applied

Biosystem

SOLID

Roche 454

GS FLX

Roche GS

Junior Ion Torrent

Pasific

Bioscience

Helicos

Illumina

Genome

Analyzer

Yeni Nesil

DNA Dizi

Analizi

Applied

Biosystem

SOLID

Roche 454

GS FLX

Roche GS

Junior

Ion

Torrent

Pasific

Bioscience

Helicos

Illumina

Genome

Analyzer

Nano boyuttaki karbon tüpler kullanılmaktadır.

Tüm DNA zinciri geçirilir, parçalanıp birleştirmeye gerek yoktur.

Elektrik tunneling adı verilen bir sistem ile sensörler aracılığı ile bazlar arasındaki elektrokimyasal farklılıklar belirlenmektedir.

Veriler bilgisayarda işlenmektedir.

Amplifikasyon:

YOK

Sekans Reaksiyonu:

Tek molekül

gerçek zamanlı

sekanslama

Yürütme Başına Kalıp

Molekül:

-

Günlük Veri Üretimi:

-

Yeni Nesil

DNA Dizi

Analizi

Applied

Biosystem

SOLID

Roche 454

Genome

Analyzer

Roche GS

Junior

Ion

Torrent

Pasific

Bioscience

Helicos

Illumina

Genome

Analyzer

Amplifikasyon:

YOK

Sekans Reaksiyonu:

Sentezleterek

molekül sekanslama

Yürütme Başına Kalıp

Molekül:

800 milyon

Günlük Veri Üretimi:

21-28 Gb /okuma /

8 gün

Yeni Nesil Dizileme Teknolojisinin Uygulama Alanları

•1. Metagenomik

•2. Bitkiler ve Tarımsal Biyoteknoloji

•3. Atasal DNA

•4. Transkriptom

•5. Küçük RNA’lar

•6. Metilasyon Analizi

•7. Kromatin İmmunpresipitasyon

Dizileme (ChIP-Seq)

1. Metagenomik

Çevresel ortamda hangi mikrop, ne miktarda (sadece

kendi ortamında büyüyen mikroorganizmalar için)

Toplu arı ölümleri

Obezite-mide florası arasındaki ilişki

Hastane enfeksiyonları

Ağız-diş sağlığı

2. Bitkiler ve Tarımsal Biyoteknoloji

3. Atasal DNA

Fosilden, saç, kemik gibi donmuş korunmuş

örneklerden elde edilen DNA’dan genomik analiz

gerçekleştirilerek filogenetik analiz yapılabilir.

Örneğin, 38.000 yaşında Neandertal fosili ile modern

insan ve şempanze genomu kıyaslanmış, 500.000 yıl

önce modern insan ile Neandertalin birbirinden

ayrıldığı tespit edilmiştir.

4. Transkriptom

- Transkriptom dizileme,

- mRNA transkripsiyon-ekspresyon analizi,

- Yeni genlerin keşfi,

- Henüz genomu tamamıyla tanımlanmamış organizmalarda gen

bölgelerinin tanımlanması,

- Tüm gen dizisinin oluşturulması,

- Tek nükleotid polimorfizmlerin (SNP) belirlenmesi,

- İnsersiyon-delesyonlar ve splicing varyantların tespiti,

- Allel spesifik ekspresyonların analizi ve kromozomal yeni

düzenlenmelerin belirlenmesini kapsar.

5. Küçük RNA’lar

Küçük RNA'lar; microRNA'lar, endojen

siRNA'lar ve Piwi-interacting RNA'ların dahil

olduğu gruptur.

Bu sistem sayesinde bakteri içerisinde

klonlanma yapılmadan, yüzlerce hatta

binlercesi tanımlanabilir ve miktarı

belirlenebilir.

Daha önce tanımlanmamış küçük RNA'lar

tespit edilebilir ve farklı ekspresyon profili

çıkartılabilir veya küçük RNA transkriptomları

ile karşılaştırılabilir.

5. Küçük RNA’lar

Küçük RNA'ların analizi için öncelikle total RNA

(~12.5%) denatüre poliakrilamid jelde yürütülerek

fragmanların büyüklüklerine göre ayrılması sağlanır.

Küçük RNA büyüklüğü 15-30 baz arasında olduğu için

bu büyüklüğe denk gelen bölge jelden alınarak RNA

saflaştırılır.

Önce 3' ucuna, sonra 5' ucuna T4 RNA ligaz ile adaptör

eklenir ve oligo (dT)-adaptör primerleri kullanılarak tek

iplik cDNA sentezi yapılır.

Daha sonra PCR yapılarak cDNA'lar çoğaltılır. cDNA’lara

adaptör eklenir, pirodizilemedeki basamaklar tekrar

edilir.

6. Metilasyon Analizi

Hedef genomik dizideki metilasyon

belirlenir.

Ayrıca hipermetile olan CpG

dinükleotidlerinde birbirleri arasında

metilasyon farkları da tespit edilebilir.

7. Kromatin İmmünpresipitasyon (ChIP-seq)

Kromatin immunopresipitasyon (CHP) sonucu elde edilen kromatin

materyalinin high-throughput paralel dizi analizi, ChIP-Seq olarak

adlandılırmış olup ilk kez 2007 yılında uygulanmıştır.

Bu yöntemde DNA'ya bağlanan proteinlerin (transkripsiyon

faktörleri, histon proteinleri gibi), genom üzerindeki tüm bağlanma

bölgelerinin dizilenmesi mümkündür.

Genom boyunca bağlanma bölgelerinin analizi gen ekspresyonunu

düzenleyici mekanizmaların anlaşılması için gereklidir.

Yeni nesil DNA dizileme teknolojisinin başarılı bir

şekilde kullanılması için gelişmiş biyoinformatik

analiz araçlarına ihtiyaç duyulmaktadır.

Yeni nesil DNA dizileme teknolojisi çok fazla bilgi ve

yeni yaklaşım sağladığından bu kadar çok bilginin

depolanması, analizi ve değerlendirmesi oldukça

zordur.