SPEKTROSKOPI

Laboratorium Biokimia Fakultas Biologi UGM

Prinsip spektroskopi

Spektroskopi mempelajari tentang penyerapan (absorpsi) dan pantulan (emisi) radiasi dari suatu bahan.

Aspek yang mudah diamati dari absorpsi radiasi adalah warna yang dimiliki oleh suatu bahan yang menyerap radiasi pada daerah tampak dari spektrum cahaya.

Substansi yang mengeluarkan emisi radiasi menunjukkan warna tertentu apabila radiasitersebut pada daerah tampak spektrum.

Pengukuran intensitas dan panjang gelombang radiasi yang terserap atau terpantulkan oleh suatu bahan, menjadi dasar metode deteksi dan kuantifikasi yang sensitif (peka) spektrofotometri (absorpsi) dan fluorometri (emisi/pantulan)

Radiasi adalah bentuk energi dan menunjukkan sifat elektrisitas dan kemagnitan (radiasi elektromagnetik cahaya)

Spektroskopi :Spektroskopi :

Ilmu yang mempelajari interaksi antara Ilmu yang mempelajari interaksi antara cahayacahaya dan dan materimateri

Jenis Spektroskopi :Jenis Spektroskopi : • Absorpsi• Emisi• Refleksi• Scattering• Fluorosensi dan Fosforesensi

Radiasi Elektromagnetik (cahaya) :Radiasi Elektromagnetik (cahaya) : mempunyai sifat dualisme, sebagai mempunyai sifat dualisme, sebagai GELOMBANGGELOMBANG dan dan PARTIKELPARTIKEL (disebut foton (disebut foton atau quanta)atau quanta)

Jenis Spektroskopi :Jenis Spektroskopi :

ABSORPSIABSORPSI EMISIEMISI

REFLEKSIREFLEKSI SCATTERINGSCATTERING

Teknik laboratorium yang dasarnya adalah spektroskopi

1. Spektrofotometri2. Fluorometri3. Spemtrofotometri serapan atom (atomic absorption

spectrophotometry = AAS)

Definisi:

Spektrofotometri merupakan suatu metode untuk menentukan konsentrasi suatu senyawa berdasarkan pengukuran sinar yang diserap atau dilewatkan (ditransmisikan) oleh suatu larutan dengan menggunakan alat spektrofotometer.

SPEKTROFOTOMETRI

Prinsip Spektrofotometer

• Spektrofotometer menghasilkan spektrum• Spektrum : range dari semua frekuensi radiasi

elektromagnetik• Spektrum suatu obyek atau materi adalah

karakteristik distribusi radiasi elektromagnetik dari obyek atau materi tersebut

• Spektrum dihasilkan karena adanya interaksi gelombang elektromagnetik dengan materi

Spektroskopi UV-Vis

UV-Vis• Quinon berwarna kuning; Klorofil berwarna

hijau; aspirin tidak berwarna• Panjang gelombang UV : 200 – 400 nm• Panjang gelombang visible : 400 – 800 nm

AbsorbsiSinar yang mengenai molekul akan

diabsorbsi (diserap)

Bila yang diserap gelombang elektromagnetik di daerah :

• UV atau Vis digunakan untuk transisi elektron

Nilai OD (optical density) atau absorbansi dikoreksi dengan blanko

Blanko adalah larutan yang berisi pelarut atau reagen yang sesuai dengan pelarut atau reagen yang digunakan untuk preparasi sampel ditambah dengan aquades sebagai pengganti sampel

Kegunaan spektrofotometer

-Mengukur konsentrasi senyawa biomoleku, misalnyal: asam nukleat (DNA, RNA), protein, glukosa, khlorofil.

-Mengukur aktivitas enzim melalui pengukuran kadar substrat atau produknya setelah reaksi enzimatis berlangsung dalam waktu tertentu.

- Mengukur konsentrasi/jumlah mikroorganisme, misalnya: bakteri, khamir.

Instrumentasi

Kuvet yakni tempat untuk meletakkan sampel larutan yang akan dibaca dengan alat spektrofotometer.

Ada 2 macam kuvet:

1. Kuvet kwarsa/silika untuk mengukur sampel dengan panjang gelombang UV ( λ < 400 )

2. Kuvet gelas atau bahan plastik untuk mengukur sampel dengan panjang gelombang visible(λ > 400)

Kuvet memiliki ketebalan standar yakni 1 cm untuk sisi yang dilewati cahaya

Alat spektrofotometer

Cara pengoperasian spektrofotometer

1. Menyalakan alat spektrofotometer 5 – 10 menit (sesuai petunjuk alat) sebelum digunakan.

2. Atur panjang gelombang, filter dan pembacaan: misalnya: absorbansi, transmisi atau konsentrasi.

3. Kalibrasi alat dengan H2O murni dalam kuvet, untuk koreksi alat terhadap perubahan kecil pada sifat optik

4. Masukkan larutan blanko dalam kuvet, letakkan dalam spektrofotometer dan ditutup, kemudian atur absorbansinya menjadi 0.

5. Seperti langkah no. 4, masukkan larutan sampel dalam kuvet dan diukur absorbansinya.

6. Larutan yang mudah menguap (misalnya: pelarutnya khloroform) dimasukkan dalam kuvet tertutup (menghindari penguapan).

7.Selama digunakan untuk pengukuran, spektrofotometer harus dalam kondisi tertutup.

8. Setelah selesai digunakan, kuvet segera dicuci bersih dengan air ,atau direndam dalam larutan asam nitrat selama setengah jam.

9. Apabila selama pengukuran ada larutan yang tumpah, maka alat spektrofotometer harus dibersihkan dari tumpahan.