vũ thị huệ - hus.vnu.edu.vn · thầy cô, cán bộ trong bộ môn hóa phân tích, các...

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

.....o0o…..

Vũ Thị Huệ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT THUỐC

KHÁNG SINH THUỘC NHÓM SULFAMID BẰNG PHƯƠNG PHÁP

PHỔ KẾ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------

Vũ Thị Huệ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT THUỐC

KHÁNG SINH THUỘC NHÓM SULFAMID BẰNG PHƯƠNG PHÁP

PHỔ KẾ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã Số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TẠ THỊ THẢO

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Tạ Thị

Thảo đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn

thành luận văn này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự hộ trợ kinh phí và thiết bị

máy móc từ đề tài nghị định thư với Cộng hòa Pháp Lotus 2014- 2016, mã

số 39/2014/HD- NĐT.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân cùng các

thầy cô, cán bộ trong bộ môn Hóa phân tích, các anh chị em học viên K23

chuyên ngành Hóa phân tích đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi rất nhiều trong

suốt quá trình nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 16 tháng 6 năm 2015

Học viên

Vũ Thị Huệ

Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

Chuyên ngành hóa phân tích Trường ĐHKHTN

Mục Lục

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ....................................................................................... 2

1.1. Tổng quan về thuốc giả và hiện trạng sử dụng thuốc tại Việt Nam………….2

1.1.1. Định nghĩa về thuốc giả ............................................................................ 2

1.1.2. Hiện trạng sử dụng thuốc giả .................................................................... 2

1.2. Tổng quan về thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid…………………………….3

1.2.1. Lịch sử ra đời nhóm Sulfamid .................................................................. 3

1.2.2. Cấu tạo chung của nhóm Sulfamid ........................................................... 4

1.2.3. Tính chất vật lý và hóa học của các sulfamid ........................................... 6

1.2.4. Phân loại sulfamid ..................................................................................... 6

1.2.5. Dược động học .......................................................................................... 7

1.2.6. Độc tính của sulfamid ............................................................................... 7

1.2.7. Giới thiệu về Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim............. 8

1.3. Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất nhóm sulfamid.............10

1.3.1. Phương pháp định tính sulfamid ............................................................. 10

1.3.2. Phương pháp định lượng ......................................................................... 11

1.3.1.1. Phương pháp chuẩn độ thể tích ........................................................ 11

1.3.1.2. Phương pháp trắc quang .................................................................. 12

1.3.1.3. Phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến .... 12

1.3.1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao .......................................... 13

1.4. Phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật

toán hồi quy đa biến..............................................................................................14

1.4.1. Sơ lược về phương pháp quang phổ hồng ngoại .................................... 14

1.4.1.1. Lịch sử ra đời của phương pháp phân tích phổ hồng ngoại ............. 14

1.4.1.2. Nguyên tắc của phép đo phổ hồng ngoại ......................................... 14

1.4.1.3. Điều kiện hấp thụ bức xạ hồng ngoại .............................................. 16

1.4.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại ................... 16

1.4.1.5. Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu và đo phổ hồng ngoại ........................... 17



1.4.1.6. Một số ứng dụng của phương pháp phổ hồng ngoại ....................... 18

1.4.2. Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung

bình kết hợp với chemometrics ......................................................................... 19

1.4.2.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp hồi quy đa biến ........................... 19

1.4.2.2. Xác định đồng thời các chất bằng phương pháp quang phổ hồng

ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến ...................... 27

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM................................................................................ 30

2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu……………………………………...30

2.1.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 30

2.1.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 30

2.2. Phương pháp phân tích đối chứng xác định các sulfamid.............................32

2.2.1. Phương pháp đối chứng xác định Sulfaguanidin .................................... 32

2.2.2. Phương pháp đối chứng xác định Sulfamethoxazol và Trimethoprim ... 32

2.3. Hóa chất và thiết bị…………………………………………………………34

2.3.1. Hóa chất .................................................................................................. 34

2.3.2. Thiết bị và phần mềm máy tính .............................................................. 34

2.4. Chương trình máy tính của các phương pháp hồi quy đa biến......................35

2.4.1. Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (CLS) ...................... 35

2.4.2. Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo ( ILS) .......................... 36

2.4.3. Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS) ............................ 37

2.4.4. Phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR) ............................................... 38

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 41

3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu xác định đồng thời sulfaguanidin, sulfamethoxazol

và trimethoprim trong cùng hỗn hợp....................................................................41

3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ của các hoạt chất .................................................. 41

3.1.2. Khảo sát tỷ lệ khối lượng mẫu / KBr ...................................................... 44

3.1.3. Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên ................................................ 44

3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược ...................................................... 45



3.2. Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính xác định riêng từng hoạt chất nhóm

sulfamid khi có mặt các tá dược………………………………………………...48

3.2.1. Xây dựng mô hình hồi quy đa biến gồm hoạt chất sulfaguanidin và các

tá dược………………………………………………………………………..48

3.2.2. Đánh giá phương pháp phân tích sulfaguanidin ..................................... 50

3.3. Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính PCR xác định đồng thời

sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim……………………………….58

3.3.1. Xây dựng phương trình đường chuẩn đa biến xác định sulfaguanidin,

sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phương pháp PCR.............................. 58

3.3.2. Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy đa biến ...................... 61

3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp hồi

quy cấu tử chính xác định đồng thời SFG, SFM, TMP và tá dược .................. 64

3.4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế……………………………………………65

3.4.1. Phương pháp xác định một số hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm

Sulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần và trung bình ................. 66

3.4.1.1. Định tính mẫu thực tế ...................................................................... 66

3.4.2. Định lượng mẫu thực tế .......................................................................... 72

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN ...................................................................................... 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………83



DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của Sulfaguanidin trên hai loại thiết bị khảo sát ............. 41

Hình 3.2: Phổ hồng ngoại của Sulfamethoxazol tren hai thiết bị khảo sát ............... 42

Hình 3.3: Phổ hồng ngoại của Trimethoprim trên hai loại thiết bị khảo sát ............. 42

Hình 3.4: Phổ hồng ngoại của ba hoạt chất Sulfaguanidin, sulfamethoxazol và

trimethoprim ............................................................................................ 43

Hình 3.5: Phổ hồng ngoại của Canxiphosphat .......................................................... 46

Hình 3.6: Phổ hồng ngoại của Tinh bột sắn .............................................................. 46

Hình 3.7: Phổ hồng ngoại của Maltodextrin ............................................................. 46

Hình 3.8: Phổ hồng ngoại của Magie Stearat ............................................................ 47

Hình 3.9: Phổ hồng ngoại của Talcum ...................................................................... 47

Hình 3.10: Đồ thị score plot và đồ thị loading plot của tín hiệu phân tích 25 mẫu

chuẩn ........................................................................................................ 54


chuẩn ........................................................................................................ 60

Hình 3.12: Phổ hồng ngoại của Sulfaguanidin ......................................................... 66

Hình 3.13: Phổ hồng ngoại của Sulfamethoxazol ..................................................... 66

Hình 3.14: Phổ hồng ngoại của Trimethoprim ......................................................... 67

Hình 3.15: Kết quả định tính mẫu tự tạo ................................................................... 67

Hình 3.16: Kết quả định tính mẫu thực tế S1 ............................................................ 68




Hình 3.20: Kết quả định tính mẫu thực tế ST1 ......................................................... 70






DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số Sulfamid phổ biến ...................................... 5

Bảng 3.1: Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr đến độ hấp thụ quang

tại các số sóng đặc trưng .......................................................................... 44

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ lặp lại giữa các lần ép viên ...................................... 45

Bảng 3.3: Ma trận hàm lượng bốn cấu tử SFT, Tbot, Malt, Ca3(PO4)2 trong hỗn hợp ....... 49

Bảng 3.4: Ma trận nồng độ các mẫu tự tạo chứa SFG, Tbot, Ca3(PO4)2 và Malt để

đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy ..................................... 50

Bảng 3.5: Hàm lượng SFG tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra .................... 51

Bảng 3.6: Hàm lượng Tbot tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra .................... 52

Bảng 3.7: Hàm lượng Ca3(PO4)2 tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra ........... 52

Bảng 3.8: Hàm lượng Malt tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra .................... 53

Bảng 3.9: Hàm lượng SFG và ba tá dược tìm được trong hỗn hợp các mẫu kiểm tra

................................................................................................................. 56

Bảng 3.10: Hàm lượng SFG và tổng tá dược tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm

tra theo phương pháp PCR....................................................................... 57

Bảng 3.11: Ma trận chuẩn hàm lượng bốn cấu tử SFG, SFM, TMP và tá dược trong

hỗn hợp .................................................................................................... 59

Bảng 3.12: Ma trận nồng độ các mẫu tự tạo chứa SFG, SFM, TMP và tá dược để

đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy ..................................... 62

Bảng 3.13: Hàm lượng SFT, SFM, TMP và tổng tá dược tìm được trong các hỗn

hợp mẫu kiểm tra theo phương pháp PCR .............................................. 63

Bảng 3.14: Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định đồng

thời SFG, SFM, TMP và tá dược ............................................................. 65

Bảng 3.15: Mẫu thực tế ............................................................................................. 65

Bảng 3.16: Khối lượng bột viên và tá dược tinh bột trộn thêm vào các mẫu ........... 73

Bảng 3.17: Hàm lượng (mg/viên) của SFG trong các mẫu thực tế ........................... 74

Bảng 3.18: Hàm lượng (mg/viên) của SFM và TMP trong các mẫu thực tế ............ 74



BẢNG KÍ HIỆU NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Bình phương tối thiểu thông thường

(classical least square) CLS

Bình phương tối thiểu nghịch đảo

(inverse least square) ILS

Bình phương tối thiểu từng phần

(partial least square) PLS

Cấu tử chính (Principal component) PC

Dược điển Anh 2009 BP 2009

Dược điển Mỹ 34 USP 34

Dược điển Việt Nam 4 DĐVN 4

Khối lượng trung bình viên KLTB

Hồi qui cấu tử chính (principal

component regression)

PCR

Maltodextrin Malt

Sulfaguanidin SFG

Sulfamethoxazol SFM

Tinh bột Tbot

Trimethoprim TMP

Ghi chú: Trong luận văn này chúng tôi sử dụng các tên hóa chất và hoạt

chất theo quy định trong Dược điển Việt Nam 4 [1]


Chuyên ngành hóa phân tích 1 Trường ĐHKHTN

MỞ ĐẦU

Từ xưa đến nay, việc sử dụng thuốc trong phòng, chữa bệnh và tăng cường

sức khỏe đã trở thành nhu cầu tất yếu quan trọng đối với đời sống con người. Cùng

với sự tiến bộ và phát triển của xã hội loài người các loại mặt hàng thuốc được

nghiên cứu, sản xuất và đưa ra thị trường cũng ngày một phong phú và đa dạng.

Tuy nhiên bên cạnh các loại thuốc chính hãng đảm bảo chất lượng thì trên thị

trường thuốc cũng tồn tại không ít các mặt hàng thuốc giả, thuốc kém chất lượng

của một bộ phận các cá nhân hay doanh nghiệp đưa ra thị trường vì mục đích trục

lợi. Việc kiểm soát chất lượng của các loại mặt hàng này thường đòi hỏi thời gian

dài với nhiều công đoạn phức tạp và chi phí kiểm định khá cao. Vì vậy ngày nay thế

giới đang có xu hướng tìm kiếm những phương pháp và thiết bị cho phép kiểm định

nhanh thuốc đang lưu thông trên thị trường.

So với phương pháp phân tích truyền thống để định lượng hoạt chất thuốc là

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thì định lượng chất bằng phương pháp quang

phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm đơn giản trong quá trình tiền xử lý

mẫu, phân tích trực tiếp mẫu rắn nhanh, giá thành rẻ do không tốn dung môi và nếu

kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến thì không phải tách riêng các chất trước khi

phân tích nên có thể phân tích đồng thời các thuốc trong cùng nhóm thuốc. Đây

chính là lí do chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất

thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần

và trung bình”. Luận văn này là một phần trong chương trình hợp tác quốc tế giữa

Việt Nam và Pháp với mục đích nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ

hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với các phương pháp hồi quy đa biến tuyến

tính để kiểm định nhanh chất lượng thuốc. Nghiên cứu này sẽ góp phần khẳng định

xu hướng đưa các phép phân tích ra khỏi nghiên cứu đơn thuần và áp dụng nhanh

trong thực tế, đồng thời cho phép tiết kiệm thời gian, hóa chất và đặc biệt là tăng

tính thời sự của công tác giám định chất lượng.



CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về thuốc giả và hiện trạng sử dụng thuốc tại Việt Nam

1.1.1. Định nghĩa về thuốc giả

Theo định nghĩa của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), thuốc giả là sản phẩm

được sản xuất và dán nhãn dưới dạng thuốc với ý đồ lừa đảo về nguồn gốc và lai

lịch sản phẩm. Các sản phẩm giả mạo có thể có dược chất sai hoặc không có dược

chất, không đủ lượng dược chất hoặc bao gói giả mạo [38].

Theo định nghĩa của Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA):

Thuốc giả bao gồm bất kỳ dược phẩm nhái hoặc kém chất lượng nào không đáp ứng

được tiêu chuẩn của FDA nhưng cố tình che giấu sự thật [36]. Thuốc giả có thể có

một hoặc nhiều hay tất cả các yếu tố sau:

- Quá mạnh hoặc quá yếu.

- Thiếu các thành phần chính.

- Được sản xuất từ các thành phần nguy hiểm.

- Nhiễm chất lạ, thậm chí có chất độc.

- Được sản xuất trong điều kiện mất vệ sinh hoặc không vô trùng.

- Được tạo ra theo các tiêu chuẩn không an toàn.

- Được dán nhãn, cất giữ hay bảo quản không đúng cách.

- Quá hạn sử dụng (hết hạn).

1.1.2. Hiện trạng sử dụng thuốc giả

Theo thống kê của WHO, đã có sự bùng nổ thuốc giả trên phạm vi toàn cầu.

Thuốc giả chiếm tới 10% thị trường dược phẩm thế giới với doanh thu 45 tỉ

euro/năm, trung bình mỗi năm có khoảng 200.000 người tử vong do thuốc giả [35].

Tại Việt Nam, theo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, năm 2011, trong

số hơn 31.000 mẫu thuốc được kiểm tra gần đây thì đã có hơn 1.000 mẫu không đạt

tiêu chuẩn chất lượng như nhiễm khuẩn, không đủ độ hòa tan, không đủ định lượng.

Nguồn tin từ Bộ Y tế cũng cho biết, trong hơn 10 ngày đầu tháng 2/2012, hầu như

ngày nào Bộ cũng phát hiện thuốc giả, thuốc kém chất lượng.[3]



Các thuốc giả, thuốc nhái có thể chứa bất cứ thành phần nào từ phấn bảng,

bê-tông nghiền, acid boric hoặc những gì tệ hơn thế và được bán như thuốc thật.

Thuốc giả không chỉ đánh lừa người tiêu dùng, chúng còn vô hiệu hóa các liệu pháp

điều trị để cứu sống bệnh nhân. Trong rất nhiều trường hợp thuốc giả gây ra tác hại

to lớn như gây ra các phản ứng dị ứng, nhiễm độc kim loại nặng cũng như làm bệnh

nhân dễ kháng thuốc [23]. Tuy nhiên, việc phát hiện thuốc giả lưu thông trên thị

trường gặp rất nhiều khó khăn. Thông thường, do doanh số bán (lượng tiêu thụ) của

một mặt hàng thuốc nào đó giảm nghiêm trọng, nhà sản xuất hoặc nhà phân phối

hàng chính hãng mới đặt vấn đề với cơ quan chức năng về hiện tượng làm giả thuốc

này và khi đó cơ quan chức năng mới tiến hành xác minh (kiểm tra đột xuất tại các

cơ sở sản xuất kinh doanh; niêm phong mẫu và đem phân tích theo các phương

pháp tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm, rồi đưa ra kết luận) [3]. Quá trình này

thường rất tốn kém và mất thời gian, do đó đòi hỏi cần phải nghiên cứu tìm ra một

phương pháp kiểm nghiệm mới, nhanh chóng, đơn giản và tiết kiệm để kiểm định

nhanh được chất lượng thuốc ngoài hiện trường.

1.2. Tổng quan về thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid

1.2.1. Lịch sử ra đời nhóm Sulfamid

Ngay từ những năm đầu thế kỉ các nhà khoa học nhận thấy rằng các phẩm

nhuộm có tác dụng kháng khuẩn, tuy nhiên các phẩm nhuộm thường rất độc. Trong

những cố gắng tìm những thuốc kháng khuẩn trên cơ sở các thuốc nhuộm năm

1913, người ta đã tìm thấy phẩm azoic cryzoidin có tác dụng diệt khuẩn và tương

đối ít độc [28]. Đồng thời khi thêm nhóm –SO2NH2 các phẩm nhuộm thường rất

bền vì gắn chặt vào protein, vì vậy người ta cũng gắn thêm vào phân tử cryzoidin

nhóm sulfamido, kết quả là cho một chất có khả năng chống tụ cầu và liên cầu

prontosil. Đây là chất kháng khuẩn đầu tiên thu được bằng phương pháp tổng hợp

toàn phần. Prontosil khó tan trong nước nên người ta thêm vào đó nhóm COOH từ

đó có thể tạo muối dễ tan. Năm 1935, Domagk, Trefouel và Levaditikhisi dùng

prontosil kháng khuẩn thì nhận thấy: mặc dù có kết quả tốt trên liên cầu trên in vivo

nhưng lại không có tác dụng trên in vitro, như vậy có thể khi vào cơ thể, prontosil



đã chuyển hóa thành chất khác có tác dụng kháng khuẩn [15]. Khi phân tích công

thức của prontosil ta thấy đó là các azoic được điều chế bằng cách diazo hóa p-

amino benzene sulfonamid(sulfanilamid) ngưng tụ với m-phenylendiamin. Khi thay

m-phenylendiamin bằng các amin hoặc các phenol khác chúng ta thu được các dẫn

chất có tác dụng kháng khuẩn nhưng khi thay sulfanilamid bằng các anilin khác

nhau thì thu được các chất không có tác dụng kháng khuẩn. Như vậy, có thể các

sulfanilamid là phần có tác dụng kháng khuẩn. Thật vậy, khi thử tác dụng của

sulfanilamid cho thấy có tác dụng kháng khuẩn tốt. Khi kiểm tra nước tiểu của

người uống prontosil thấy có mặt sulfanilamid dưới dạng acetyl hóa. [6, 13]

Sulfanilamid đã trở thành sulfamid đầu tiên trong lịch sử. Việc phát hiện ra

prontosil và sulfanilamid đã mở ra một kỉ nguyên mới cho việc hóa trị liệu các bệnh

nhiễm khuẩn. Dựa trên cấu trúc của sulfanilamid người ta đã tổng hợp rất nhiều

sulfamid, trong đó có khoảng 40 loại được sử dụng làm thuốc. Ngày nay, việc ra đời

của các kháng sinh có tác dụng kháng khuẩn rất mạnh nên các sulfamid được sử

dụng ít hơn. Tuy nhiên việc sử dụng các sulfamid có ưu điểm:

Có thể sản xuất lớn, giá thành rẻ

Nhiều sulfamid có tác dụng khác: lợi tiểu, hạ đường huyết

Các tác dụng phụ của sulfamid đã được khắc phục tốt

1.2.2. Cấu tạo chung của nhóm Sulfamid

Các sulfamid kháng khuẩn là dẫn chất của p- aminobenzensulfonamid, có

công thức cấu tạo chung là:

HNR2 SO2 NH R1

Trong đó thường gặp R2 là H, và cũng chỉ khi R2 là H thì sulfamid mới có

hoạt tính kháng khuẩn, khi R2 ≠H, thì chất đó là tiền thuốc. R1 có thể là mạch thẳng,

dị vòng. Tuy nhiên, nếu R1 là dị vòng thì hiệu lực kháng khuẩn mạnh hơn, thông

thường là các dị vòng 2 – 3 dị tố. Khi R1 và R2 đều là gốc hidro thì thu được

sulfamid là có cấu tạo đơn giản nhất (sulfanilamid) [6].



Sulfamid có công thức cấu tạo gần giống với PABA (para amino benzoic

acid) là nguồn nguyên liệu cần thiết cho vi khuẩn tổng hợp acid folic để phát triển.

Do đó sulfamid tranh chấp với PABA ngăn cản quá trình tổng hợp acid folic của vi

khuẩn. Ngoài ra, sulfamid còn ức chế dihydrofolat synthetase, một enzym tham gia

tổng hợp acid folic. Về mặt lý thuyết, phổ kháng khuẩn của sulfamid rất rộng, gồm

hầu hết các cầu khuẩn, trực khuẩn gram (+) và (-). Hiện nay, tỷ lệ kháng thuốc và

kháng chéo giữa các sulfamid đang rất cao nên đã hạn chế việc sử dụng sulfamid rất

nhiều. Mặt khác do có nhiều độc tính và đã có kháng sinh thay thế, sulfamid ngày

càng ít dùng một mình, thường dùng dạng phối hợp sulfamethoxazol với

trimethoprim để tăng khả năng điều trị của thuốc. Dưới đây là công thức cấu tạo của

một số sulfamid phổ biến

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số Sulfamid phổ biến

Tên Công thức

R1 R2

Sulfaguanidin C7H10N4O2S

NH2

NH

-H

Sulfadiazin C10H10N4O2S

N

N

-H

Sulfamethoxazol C10H11N3O3S

N

O

CH3

-H

Sulfadoxin C12H14N4O4S N

N

H3OC OCH3

-H



1.2.3. Tính chất vật lý và hóa học của các sulfamid

Tính chất vật lý

Sulfamid ở dạng tinh thể màu trắng hoặc màu vàng nhạt trừ prontosil, không

mùi, thường ít tan trong nước, benzen, chloroform. Sulfamid tan trong dung dịch

acid vô cơ loãng và hydroxyd kiềm (trừ sulfaguanidin) [6]. Các sulfamid có các

thông số xác định về: độ chảy, phổ IR, phổ UV (do có chứa nhân thơm).

Tính chất hóa học

Hầu hết các Sulfamid đều có tính chất lưỡng tính: [6]

- Tính acid (trừ sulfaguanidin): do có H ở N- amid linh động

- Tính bazơ: Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung

dịch acid.

Các sulfamid có thể tham gia phản ứng diazo hoá do có nhóm amin thơm tự

do (có thể tham gia phản ứng ghép đôi với 2-naphtol/kiềm để cho sản phẩm màu đỏ

da cam).

Tác dụng với một số muối kim loại (CuSO4, CoCl2) tạo thành phức màu tủa

với Cu2+

, Co2+

đặc trưng cho từng sulfamid, nên thường được dùng để phân biệt các

sulfamid với nhau. Đốt khô trong ống nghiệm, sulfamid bị phân huỷ, để lại cặn có

màu điển hình cho từng sulfamid, ví dụ, đốt sunfanilamid sẽ giải phóng ammoniac

và cho cặn màu xanh tím.

1.2.4. Phân loại sulfamid

Sulfamid là một trong những kháng sinh tổng hợp đầu tiên được loài người

phát hiện và sử dụng. Việc tìm thấy sulfamid đã mở ra một kỷ nguyên mới của các

thuốc chống nhiễm khuẩn trước khi có penicilin. Khi phân loại kháng sinh theo tác

dụng, nhóm sulfamid được xếp vào nhóm các loại kháng sinh có tác dụng kìm

khuẩn. Do tác dụng của sulfamid đều giống nhau, việc điều trị dựa vào dược động

học của thuốc cho nên người ta chia các sulfamid làm 4 loại: Loại hấp thu nhanh,

thải trừ nhanh: nồng độ tối đa trong máu sau uống là 2 - 4h. t1/2 =6-8h, thải trừ 95%

trong 24h. Dùng điều trị nhiễm khuẩn theo đường máu như sulfadiazin, sulfisoxazol

(Gantrisin), sulfamethoxazol (Gantazol). Loại hấp thu rất ít: dùng chữa viêm ruột,



viêm loét đại tràng như sufaguanidin (Ganidan). Loại thải trừ chậm: duy trì được

nồng độ điều trị trong máu lâu, t1/2 có thể tới 7 - 9 ngày nên chỉ cần uống 1 lần/ngày.

Hiện dùng sulfadoxin (Fanasil), phối hợp với pyrimethamin trong Fansidar để dự

phòng và điều trị sốt rét kháng cloroquin. Loại để dùng tại chỗ: ít hoặc khó tan

trong nước. Dùng điều trị các vết thương tại chỗ (mắt, vết bỏng) dưới dạng dung

dịch hoặc kem. Có sulfacetamid, silver sulfadiazin, mafenid. [2]

Hiện nay hầu hết các vi khuẩn đều kháng với sulfamid nên thuốc này rất ít

được sử dụng. Để khắc phục nhược điểm này người ta thường dùng sulfamid ở dạng

phối hợp. Dạng phối hợp phổ biến nhất của sulfamid là việc kết hợp giữa

sulfamethoxazol và trimethoprim với tỉ lệ 1 trimethoprim và 5 sulfamethoxazol

nhằm tạo ra kháng sinh có khả năng kháng khuẩn, tăng hiệu quả điều trị và giảm tỉ

lệ kháng thuốc của vi khuẩn, thuốc hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, t/2 của thuốc từ

9-11 giờ. [2]

1.2.5. Dược động học

Các sulfamid được hấp thu nhanh qua dạ dày và ruột (trừ loại sulfaguanidin),

70 - 80% liều uống vào được máu, gắn với protein huyết tương 40 - 80%, nồng độ

tối đa đạt được sau 2- 4 giờ. Từ máu, sulfamid khuếch tán rất dễ dàng vào các mô,

vào dịch não tuỷ (bằng 1/2 hoặc tương đương với nồng độ trong máu), qua rau thai,

gây độc. Các quá trình chuyển hóa chủ yếu ở gan của sulfamid gồm: Phản ứng liên

hợp với acid glucuronic thành dạng bất hoạt nhưng có tính hòa tan. Phản ứng acetyl

hóa tạo thành dạng bất hoạt và không tan nên thường gây độc (hình thành dạng tinh

thể ở thận). Sau đó các sulfamid được bài thải qua thận là chủ yếu (trừ các sulfamid

kháng khuẩn đường ruột), một ít qua phân, sữa. [2]

1.2.6. Độc tính của sulfamid

Tác dụng phụ khi sử dụng sulfamid là khoảng 5% khác nhau đối với mỗi cá

thể và đối với mỗi loại sulfamid. Dưới đây là một số tác dụng có thể gặp khi sử

dụng sulfamid:

Rối loạn hệ thống tạo máu: cơ chế tác dụng rất khác nhau, có trường hợp là

do mẫn cảm, trường hợp khác do sự tan huyết liên quan đến sự hoạt hóa glucose- 6



photsphat dehydrogenase. Phản ứng này không phụ thuộc vào nồng độ sulfamid mà

vào từng cá thể. Phản ứng thường xảy ra trong tuần đầu dùng thuốc. Triệu chứng có

thể là: buồn nôn, sốt, chóng mặt, vàng da, xanh xao, trong trường hợp nặng có thể là

thiếu máu bất sản. Một số trường hợp có thể gây tím tái do tạo methemoglobin.

Thận: đây là trường hợp không mong muốn thường gặp nhất khi sử dụng

sulfamid. Sulfamid có thể gây kết tinh ở thận, gây tổn thương thận, viêm thận, sỏi

thận, đái ra máu. Nhược điểm này đã được khắc phục dần do tìm được những

sulfamid ít acetyl hóa, ít kết tinh…

Phản ứng tăng nhạy cảm: phản ứng rất khác nhau với từng loại sulfamid và

với từng người, thường xuất hiện khi sử dụng các loại sulfamid tác động chậm.

Triệu chứng có thể là nổi ban đỏ, xuất huyết…Khi dùng ngoài da có thể gây nám da

do sự kích thích sự nhạy cảm của da khi tiếp xúc với tia tử ngoại. [2]

1.2.7. Giới thiệu về Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim

Trong số những kháng sinh nhóm sulfamid đã được tổng hợp, sulfaguanidin

và sulfamethoxazol là một trong những hoạt chất được sử dụng phổ biến nhất hiện

nay. Tuy nhiên, do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng nên hiện nay

người ta thường sử dụng dạng phối hợp của sulfamid với trimethoprim như

sulfamethoxazol, sulfadiazin với trimethoprim để tăng thêm hiệu quả điều trị [2].

Do đó trong luận văn này chúng tôi đã tiến hành đi sâu nghiên cứu ba hoạt chất là:

sulfaguanidin, sulfamethoxazol (thuộc nhóm sulfamid) và trimethoprim (dạng phối

hợp phổ biến với sulfamid).

Giới thiệu về Sulfaguanidin

Công thức: C7H10N4O2S

KLPT: 214,2

Sulfaguanidin là (4-aminophenylsulfonyl)guanidin, tồn tại ở dạng bột kết

tinh mịn màu trắng hoặc gần như trắng. Rất khó tan trong nước và ethanol 96 %,



khó tan trong aceton, thực tế không tan trong methylen clorid, tan trong dung dịch

acid vô cơ loãng. [6]

Sulfaguanidin được sử dụng để trị các bệnh đường ruột như tả, lỵ, viêm ruột.

Là kháng sinh ít tan trong kiềm, không hấp thu ở ruột, ít độc nên có thể dùng với

liều cao. Tuy nhiên sulfaguanidin có ảnh hưởng tới vi khuẩn đường ruột, nên khi

dùng nên uống thêm men tiêu hóa và uống kèm vitamin B1

Giới thiệu về Sulfamethoxazol

Công thức: C10H11N3O3S

KLPT: 253,3

Sulfamethoxazol là 4-amino-N-(5-methylisoxazol-3-yl)benzensulfonamid,

tồn tại ở dạng bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Thực tế không tan trong

nước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong ethanol 96 %, tan trong dung dịch natri

hydroxyd loãng và dung dịch acid loãng. [6]

Sulfamethoxazol là sulfamid có tác động trung gian dùng trị nhiễm trùng

đường tiểu, sinh dục, nhiễm trùng da.

Giới thiệu về Trimethoprim

Công thức: C14H18N4O3

KLPT: 290,3

Trimethoprim là 2,4 diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl) pyrimidin, tồn tại ở

dạng bột trắng hoặc trắng hơi vàng. Rất khó tan trong nước, khó tan trong ethanol

96 %, hơi tan trong cloroform, thực tế không tan trong ether. [6]



Triemthoprim được sử dụng trong các trường hợp điều trị đợt cấp của viêm

phế quản mạn, dự phòng lâu dài nhiễm khuẩn tiết niệu tái phát, nhiễm khuẩn tiết

niệu dưới cấp tính nhạy cảm với trimethoprim, viêm phổi do Pneumocystis carinii.

Hiện nay so khả năng kháng các thuốc nhóm sulfamid ngày càng cao nên

người ta thường sử dụng dạng phối hợp giữa sulfamethoxazol và trimethoprim để

tăng cường khả năng kháng khuẩn của thuốc. Bản chất của sulfamethoxazol là một

sulfonamid, ức chế cạnh tranh sự tổng hợp acid folic của vi khuẩn. Trimethoprim là

một dẫn chất của pyrimidin, ức chế đặc hiệu enzym dihydrofolat reductase của vi

khuẩn. Khi phối hợp trimethoprim và sulfamethoxazol như vậy sẽ ức chế hai giai

đoạn liên tiếp của sự chuyển hóa acid folic, do đó ức chế có hiệu quả việc tổng hợp

purin, thymin và cuối cùng DNA của vi khuẩn. Sự ức chế nối tiếp này có tác dụng

diệt khuẩn. Cơ chế hiệp đồng này cũng chống lại sự phát triển vi khuẩn kháng thuốc

và làm cho thuốc có tác dụng ngay cả khi vi khuẩn kháng lại từng thành phần của

thuốc. [2]

1.3. Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất nhóm sulfamid

1.3.1. Phương pháp định tính sulfamid

Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng là một phương pháp khá đơn giản được sử

dụng để định tính các sulfamid. Trong phương pháp này người ta thường sử dụng

các hệ dung môi khai triển như dicloromethan- methanol- acid formic khan

(70:20:10) để định tính sulfaguanidin; hệ cloroform - methanol - dimethylformamid

(20 : 2 : 1), hoặc cloroform - methanol (19 :1) để định tính sulfamethoxazol; hệ

heptan - cloroform - dung dịch methanol 5 % (v/v) trong ethanol - acid acetic băng

tỷ lệ (4 : 4 : 4 : 1) để định tính sulfadoxin [1]. Tiến hành chấm riêng biệt mỗi dung

dịch lên bản mỏng silica gel GF254. Triển khai sắc ký tới khi dung môi đi được

khoảng 15 cm, lấy bản mỏng ra để ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới ánh sáng tử

ngoại ở bước sóng 254 nm. Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù

hợp về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối

chiếu.



Phương pháp phổ hồng ngoại

Phương pháp phổ hồng ngoại cho phép nhận dạng sự xuất hiện và có mặt của

các nhóm chức đặc trưng [13, 7]. Cụ thể, xác định sự có mặt nhóm sulfoamid bậc 2

(-SO2-NH-) cho các băng sóng hấp thu ở gần 3265 cm-1

, dị vòng isoxazol có băng

sóng hấp thụ dao động trong vùng 3500- 3200 cm-1

, băng sóng hấp thụ ở 3335 cm-1

thuộc về dao động hóa trị của nhóm N-H (amin bậc 2). Băng sóng hấp thụ ở vùng

3100- 3000 cm-1

thuộc về dao động hóa trị của nhóm C-H thuộc vòng aren. Các dao

động hóa trị của C=N- thuộc vùng 1250-1020 cm-1

, vùng 1360- 1250 cm-1

là dao

động hóa trị của C-N (vòng thơm), vùng 1340-1250 cm-1

là vùng dao động hóa trị

của nhóm N-H (amin thơm bậc một).

Để định tính các mẫu thuốc, tiến hành đo phổ IR của các mẫu thử sau đó so

sánh với phổ IR của mẫu chuẩn trong các thư viện phổ tham chiếu.

1.3.2. Phương pháp định lượng

1.3.1.1. Phương pháp chuẩn độ thể tích

- Dựa trên cơ sở phản ứng diazo hóa các sulfamid trong môi trường acid các

Sulfamid được xác định theo phương pháp chuẩn độ nitrit chậm, điểm tương đương

được phát hiện bằng phương pháp chuẩn độ điện thế [1]. Đây là một phương pháp

định lượng rất nhanh chóng, đơn giản, tiết kiệm được áp dụng phổ biến để xác định

các Sulfamid trong dược phẩm

- Nhóm tác giả D. Amin, B. Shaba và các cộng sự đã sử dụng dung dịch

brôm làm thuốc thử để xác định các sulfamid trong dược phẩm bằng phương

pháp chuẩn độ gián tiếp [17]. Theo đó phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng

của các sulfamid với một lượng dư nước brom bão hòa để tạo thành các dẫn xuất

N- bromo tương ứng, quá trình này giải phóng một lượng tương đương của iot

khi phản ứng với iot. Iot tự do có thể được xác định bằng phương pháp chuẩn độ

vởi natri thiosulfat, sử dụng hồ tinh bột làm chỉ thị. Hiệu suất thu hồi của phương

pháp là từ 97,8- 102,1 %, hệ số biến thiên là từ 0,1- 2,2 % tùy thuộc vào hàm

lượng của các sulfamid trong dược phẩm.



1.3.1.2. Phương pháp trắc quang

Nhóm tác giả Nagaraja P1, Naik SD và cộng sự đã tìm ra một phương pháp

đơn giản, có độ nhạy cao dùng để xác định một số sulfamid trong các chế phẩm

dược [30]. Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng diazo hóa của sulfacetamid,

sulfadiazin, sulfaguanidin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamethoxazol và các liên

kết của chúng với 8-hydroxyquinolin trong môi trường kiềm tạo ra sản phẩm màu

đỏ có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 500 nm. Nồng độ tuân theo định luật Beer từ

0,1 đến 7,0 mg/ml. Giới hạn phát hiện và giới hạn đinh lượng của phương pháp lần

lượt là 0,03- 0,05 và 0,11-0,18 mg/ml. Độ chính xác của phương pháp là từ 97,3-

100,8 %. Phương pháp này khá thành công trong việc định lượng các sulfamid

trong các mẫu dược phẩm.

Cũng trên cơ sở phản ứng diazo hóa các sulfamid các tác giả Padmarajaiah

Nagaraja, Hemmige S Yathirajan, Kallanchira R Sunitha, Ramanathapura A

Vasantha [31] lại đưa ra phương pháp xác định các sulfamid như sulfathiazol,

sulfadiazine, sulfacetamid, sulfamethoxazol, sulfamerazin, sulfaguanidin và

sulfamethazin trong dược phẩm dựa trên phản ứng diazo hóa các sulfamid trên, sau

đó tiến hành tạo phức với dopamine trong sự có mặt của ion molybdat trong môi

trường acid H2SO4 tỷ lệ (1:1). Sản phẩm của phản ứng này là dung dịch có màu đỏ

có độ hấp thụ trong vùng từ 490-510 nm, các dung dịch này có độ bền trong 48 giờ

tại 27C. Nồng độ tuân theo định luật Beer từ 0,04 đến 8,0 µg/ml. Phương pháp này

được áp dụng thành công trong việc xác định các sulfamid trong các sản phẩm

thuốc viên và thuốc nhỏ mắt. Các tá dược trong thuốc không ảnh hưởng đến kết quả

đo. Do đó đây là phương pháp khá đơn giản, nhanh chóng, kinh tế và có độ nhạy

cao áp dụng để phân tích các sulfamid tron dược phẩm mà không cần chiết tách hay

gia nhiệt.

1.3.1.3. Phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến

Phương pháp trắc quang kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến như: bình

phương tối thiểu thông thường (CLS), bình phương tối thiểu từng phần (PLS ), hồi

qui cấu tử chính ( PCR) là một phương pháp khá đơn giản, nhanh chóng và tiết



kiệm để xác định đồng thời các thuốc kháng khuẩn như sulfamid và trimethoprim

trong dược phẩm. Tập hợp các dung dịch mẫu được hòa tan và pha loãng với dung

dịch ethanol pH = 9,9 đến nồng độ thích hợp và đo phổ hấp thụ trong vùng bước

sóng từ 200- 350 nm. Tiến hành nghiên cứu trên 5 hoạt chất: sulfadiazin,

sulfadimidin, sulfamethoxazol, sulfanilamid and trimethoprim xác định được

khoảng tuyến tính của các đường chuẩn đơn biến đều nằm trong khoảng nồng độ từ

1,0 – 24,0 mg/l, giới hạn phát hiện là 0,2 – 1,0 mg/l. Mô hình chuẩn của ba phương

pháp đa biến được xây dựng trên cơ sở dữ liệu phổ của các mẫu hỗn hợp chứa đồng

thời các hoạt chất trên. Kết quả phân tích cho thấy độ thụ hồi của hai mô hình PCR

và PLS xấp xỉ 100 %, trong khi mô hình CLS có độ thu hồi kém hơn hẳn. Mô hình

PCR dựa trên ma trận dữ liệu thô đã được lựa chọn áp dụng cho việc phân tích xác

định hàm lượng năm hoạt chất nghiên cứu trong các loại thuốc thành phẩm. [39]

1.3.1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp phổ biến có độ

chính xác, độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp được áp dụng rộng rãi để xác định

các sulfamid trong các sản phẩm dược phẩm.

Theo đó Sulfadoxin (trong viên nén Sulfadoxin và pyrimethamin) được định

lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng với hệ pha động là: Dung dịch đệm pH 5,9 -

acetonitril (4 : 1). Dung dịch đệm pH 5,9: Thêm 1 ml triethylamin và 200 ml

acetonitril vào 700 ml nước, điều chỉnh đến pH 5,9 bằng dung dịch acid acetic 1 %,

sau đó thêm nước vừa đủ 1000 ml, trộn đều, lọc. Điều kiện sắc ký: Cột thép không

gỉ (30 cm × 3,9 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 m) với detector quang phổ tử ngoại

đặt ở bước sóng 230 nm, tốc độ dòng: 2,0 ml/phút, thể tích tiêm: 20 l. [1].

Theo dược điển Mỹ USP 34- NF 29 [37] Sulfamethoxazol (trong hỗn hợp

thuốc chứa Sulfamethoxazol và trimethoprim) được xác định với điều kiện sắc ký:

Cột C 18 (250 x 4,6 mm; 5µm), detector UV: 254 nm, tốc độ dòng: 1,8 ml/ phút,

thể tích tiêm: 20 µl. Pha động: 700ml nước + 200ml Acetonitril + 1ml triethylamin

(điều chỉnh pH 5,9 ± 0,1 bằng dung dịch acid acetic 1% hoặc dung dịch natri

hydroxyd 0,2N, thêm nước vừa đủ 1000 ml.



Nhóm tác giả Cemal Akay, Sibel A. Ozkan [16] đã tiến hành nghiên cứu

thành công quy trình định lượng Sulfamethoxazol (trong hỗn hợp thuốc chứa

Sulfamethoxazol và trimethoprim) theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với

pha động là hỗn hợp của methanol : nước (60: 40) điều chỉnh đến pH=3,0 bằng acid

phosphoric 10 %. Điều kiện sắc ký: Cột C18, detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước

sóng 213 nm, tốc độ dòng 1,8 ml/min, thể tích tiêm 10 l. Khoảng tuyến tính của

phương pháp là từ 2,0-10,0 µg/ ml đối với trimethoprim và từ 10,0- 50,0 0 µg/ ml

đối với sulfamethoxazol. Giới hạn phát hiện tương ứng với trimethoprim và

sulfamethoxazol lần lượt là 0,45 và 1,21 µg/ ml.

1.4. Phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với

thuật toán hồi quy đa biến

1.4.1. Sơ lược về phương pháp quang phổ hồng ngoại

1.4.1.1. Lịch sử ra đời của phương pháp phân tích phổ hồng ngoại

Quang phổ hồng ngoại gần lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1881 bởi

Abney và Festing khi làm việc với các tấm ảnh [25]. Họ đã phát hiện ra sự tồn tại

của các bức xạ nhiệt ở ngoài vùng phổ của ánh sáng nhìn thấy và chứng minh được

sự hấp thụ của các bức xạ này có liên quan đến các thành phần hóa học trong các

hợp chất nghiên cứu. Wiliam W.Coblentz là một trong những người tiên phong đầu

tiên nghiên cứu về quang phổ hồng ngoại. Năm 1905, ông công bố kết quả nghiên

cứu của các hợp chất mà ông ghi lại từ 1000 nm đến 16.000 nm. Việc Coblentz

công bố kết quả đã tạo ra một bước đột phá mới cho các nhà nghiên cứu, có liên

quan đến quang phổ của các nhóm nguyên tử trong phân tử, liên quan đến sự hấp

thụ ở giữa (2500-50,000nm). Từ đó, chúng ta có thể hiểu về liên kết hóa học như

dao động giữa hai hay nhiều nguyên tử, các liên kết sẽ dao động và khi năng lượng

được bổ sung thì các dao động này sẽ mạnh hơn. Dao động hóa trị đòi hỏi năng

lượng cao hơn so với dao động biến dạng.

1.4.1.2. Nguyên tắc của phép đo phổ hồng ngoại

Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuật

phân tích rất hiệu quả. Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp



phổ hồng ngoại vượt hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia

X, cộng hưởng từ điện tử…) là phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc

phân tử nhanh, không đòi hỏi các phép tính toán phức tạp.[27]

Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chất hóa học có khả

năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại,

các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất

hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. [7]

Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các

nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học. Bởi vậy,

phổ hấp thụ hồng ngoại là phổ dao động quay vì khi hấp thụ bức xạ hồng ngoại thì

cả chuyển dộng dao động và chuyển động quay đều bị kích thích. Bức xạ hồng

ngoại (IR) là một vùng phổ bức xạ điện từ rộng nằm giữa vùng trông thấy và vùng

viba, vùng này có thể chia thành ba vùng nhỏ:

Hồng ngoại gần (near infrared): 14000- 4000 cm-1

(0,8- 2,5µm).

Hồng ngoại trung (medium infrared): 4000- 400 cm-1

(25- 2,5μm).

Hồng ngoại xa (far infrared): 400- 10 cm-1

(50-100µm).

Hầu hết các nhóm nguyên tử trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ ở vùng 4000-

650cm-1

. Vùng phổ từ 4000-1500 cm-1

được gọi là các vùng nhóm chức vì chứa hầu

hết các vân hấp thụ của các nhóm chức như OH, NH, C=O, C=N, C=C…Vùng phổ

nhóm chức tập trung làm bốn vùng mà mỗi vùng, tần số đặc trưng nhóm có giá trị

thay đổi phụ thuộc vào cấu tạo phân tử. Vùng 3650-2400 cm-1

chứa các vân dao

động hóa trị của X-H (X:O, N, C, S, P…); vùng từ 2400-1900 cm-1

gồm các vân

dao động hóa trị của các nhóm mang liên kết ba hoặc hai liên kết đôi kề nhau; vùng

1900-1500 cm-1

chứa các vân dao động hóa trị của các nhóm mang liên kết đôi và

do dao động biến dạng của nhóm –NH2. Vùng phổ từ 1500-700 cm-1

, mặc dù chứa

các vân hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của các liên kết đơn như C-C, C-N,

C-O…và các vân do dao động biến dạng của các liên kết C-H, C-C… nhưng thường

được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định các nhóm chức, vì ngoài

các vân hấp thụ trên còn có nhiều vân hấp thụ xuất hiện do tương tác mạnh giữa các



dao động. Các vân hấp thụ này đặc trưng cho chuyển động của các phân tử chứ

không thuộc riêng nhóm nguyên tử nào, và vì vậy, vùng phổ này thường được gọi là

vùng chỉ vân tay. Vùng phổ từ 650-250 cm-1

cung cấp các thông tin có giá trị đối

với hợp chất vô cơ và phức chất, vì chứa các vân phổ liên quan đến dao động hóa trị

của C-Br, C-I và M-X(M- kim loại;O,N,S,C…) nhưng không phải máy hồng ngoại

nào cũng đo được ở vùng này.[7]

1.4.1.3. Điều kiện hấp thụ bức xạ hồng ngoại

Không phải bất kỳ phần tử nào cũng có khả năng hấp thụ bức xạ hồng ngoại.

Mặt khác bản thân sự hấp thụ đó cũng có tính chất chọn lọc. Một phân tử chỉ có khả

năng hấp phụ bức xạ hồng ngoại khi chúng phải thỏa mãn 2 yếu tố sau [7]. Một là

tần số dao động tự nhiên của một phần phân tử (các nguyên tử hoặc nhóm nguyên

tử cấu tạo nên phân tử đó) bằng chính tần số dao động cùng tần số của bức xạ tới.

Hai là phân tử đó phải có momen lưỡng cực, vì khi phân tử lưỡng cực được giữ

trong điện trường, các điện tích trái dấu sẽ chịu ảnh hưởng bởi các lực theo những

chiều ngược nhau, và làm các nguyên tử tích điện này dao dộng, chúng hấp thụ bức

xạ hồng ngoại. Vì vậy các phân tử như O2, N2 không xuất hiện phổ hấp thụ hồng

ngoại.

1.4.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại

Tín hiệu đo phổ hồng ngoại đặc trưng cho tần số dao động của phân tử [7].

Do đó phổ hồng ngoại bị ảnh hưởng bởi các yếu tố chính như sau:

Ảnh hưởng do cấu trúc của phân tử: do tần số dao động của phân tử phụ

thuộc vào sự bền vững của liên kết, các hiệu ứng electron, hiệu ứng không gian và

liên kết nội phân tử.

Ảnh hưởng do tương tác giữa các phân tử: ở trạng thái khí các phân tử

chuyển động tự do và hầu như không có tương tác với nhau nên phổ hồng ngoại của

các chất ở thể kí phản ánh khá trung thực cấu trúc của phân tử. Tuy nhiên kỹ thuật

đo mẫu ở thể khí lại rất phức tạp, do đó thường đo mẫu hồng ngoại ở dạng rắn hoặc

dạng lỏng. Các phân tử ở dạng rắn có thế tồn tại dưới dạng các tinh thể khác nhau,

do đó phổ hồng ngoại của chúng có thể sẽ bị thay đổi do tương tác giữa cấc phân tử



khi thay đổi mạng tinh thể. Khi phân tử tồn tại ở các hệ dung môi khác nhau thì hấp

thụ hồng ngoại cũng khác nhau, nguyên nhân là do sự tạo thành liên kết hidro giữa

các phân tử làm dịch chuyển số sóng và mở rộng các vân hấp thu.

Ảnh hưởng của cường độ và hình dạng vân phổ hồng ngoại: Phương pháp

định lượng bằng phổ hồng ngoại có độ chính xác không cao còn do hệ số hấp thu

mol ít lặp lại giữa các lần đo. Ngoài ra khi trong quá trình ép viên mẫu rất khó có

thể xác định chính xác được độ dày viên mẫu (do mỗi viên mẫu chỉ có kích thước

tầm vài µm). Bên cạnh đó trạng thái vật lý, dung môi, nhiệt độ, đều đóng góp vào

ảnh hưởng đến cường độ, hình dạng peak của hợp chất [18].

1.4.1.5. Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu và đo phổ hồng ngoại

Các kỹ thuật đo phổ hồng ngoại

Hiện nay có hai phương pháp chính để đo phổ hồng ngoại là phương pháp đo

hấp thụ và phương pháp đo phản xạ. Hai phương pháp này được đặc trưng bởi hai

loại phổ kế là: phổ kế tán sắc và phổ kế biến đổi Fourier. Kỹ thuật đo phổ tán sắc là

loại phổ biến trước đây, máy ghi phổ quét trong cả vùng từ 4000 cm-1

đến 200 cm-1

,

tốc độ quét khoảng 1 phút/ mẫu nhanh hơn nhiều so với loại máy hồng ngoại sơ

khai đầu tiên nhưng vẫn rất chậm để phân tích thời gian thực. Phổ kế hồng ngoại

hiện đại là loại phổ kế biến đổi Fourier. Loại phổ kế mới này khác loại phổ kế tán

sắc cũ là thay bộ đơn sắc (lăng kính hoặc cách tử) bằng một giao thoa kế

Michelson cho phép khe sáng rộng hơn nên cường độ bức xạ vào detector cũng sẽ

lớn hớn. Tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) tăng lên nhờ giảm được nhiễu do đó phổ

nhận được có chất lượng tốt hơn, đặc biệt thời gian ghi phổ nhanh, chỉ khoảng 30

giây. Khi kết hợp với sự hỗ trợ của máy tính kết nối giúp cho việc đo phổ được tự

động hóa ở mức cao và phổ có thể được lưu trữ và đối chiếu với phổ chuẩn có trong

thư viện của máy. [7]

Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu

Phép đo phổ hồng ngoại cho phép đo các chất ở thể rắn, thể lỏng tinh khiết,

trong dung dịch hoặc thể hơi. Đối với mỗi thể khác nhau chúng ta có các cách

chuẩn bị mẫu tương ứng như sau:[7, 12]



- Mẫu ở thể rắn: có hai cách đo khi mẫu ở thể rắn

Phương pháp Nujol: trộn mẫu với parafin lỏng, nghiền kỹ và đều rồi bôi một

lớp mỏng lên mặt tấm cửa sổ, sau đó đặt vào giá cuvet để đo trên máy.

Phương pháp ép KBr (film): trộn mẫu thật đồng đều với bột KBr theo tỷ lệ

khối lượng/ khối lượng là 1:10 đến 1:100, nghiền kỹ bằng cối mã não. Ép mẫu

thành màng mỏng gần như trong suốt bằng bộ ép viên cầm tay hoặc máy ép thủy

lực, đặt mẫu vào giá đỡ cuvet để đo.

- Mẫu ở thể lỏng tinh khiết: chuẩn bị mẫu bằng cách ép một lượng nhỏ chất

lỏng giữa hai tấm NaCl để có một màng mỏng dày khoảng 0,01- 0,1 mm.

- Mẫu trong dung dịch: Thông thường dung dịch 1-5% của hợp chất được đưa

vào cuvet đặc biệt có độ dài 0,1 -1 mm và được làm bằng NaCl. Để loại bỏ các chất

hấp thụ của dung môi, một cuvet so sánh có chứa dung môi tinh khiết được đặt ở tia

sáng.

- Mẫu ở thể hơi: Hơi hay khí được đưa vào trong cuvet đặc biệt thường có độ

dài 10 cm và có thành làm bằng NaCl cho phép bức xạ IR truyền qua. Trong thực tế

để phân tích các chất hữu cơ phức tạp, người ta thường sử dụng máy hồng ngoại

được ghép với máy sắc ký khí, khi đó mỗi hợp phần sau khi được tách ra từ hệ sắc

ký khí sẽ được ghi phổ hồng ngoại và được lưu giữ lại trong máy tính.

1.4.1.6. Một số ứng dụng của phương pháp phổ hồng ngoại

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật phương pháp đo phổ hồng

ngoại ngày càng chứng minh được tính ưu việt của mình và dần trở thành phương

pháp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Dưới đây là một số những ứng dụng chính của

phương pháp này trong phân tích dược phẩm.

- Xác định kích thước hạt: sự khác nhau về kích thước hạt thường được quan

sát thấy dưới dạng một đường nền dốc, tăng lên về phía các bước sóng dài. Năm

1985, tác giả Ciurczak đã chứng minh rằng có sự liên hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ

tại bất kì bước sóng nào với kích thước hạt. [21]

- Độ ẩm: hàm lượng nước trong các mẫu là nguyên nhân chính gây ra hệ số

suy giảm cường độ hấp thụ trong phổ hồng ngoại của các vật liệu dược phẩm. Dựa



vào đặc tính này J. Luypaert và các đồng nghiệp đã sử dụng NIR để xác định hàm

lượng nước thông qua việc xác định độ ẩm của mẫu với nhiều loại hoạt chất. [25]

- Độ cứng: đây là một trong các ứng dụng quan trọng của phương pháp hồng

ngoại trong quá trình quản lý chất lượng của quá trình sản xuất. Phương pháp IR có

thể xác định được độ cứng của viên thuốc trong quá trình ép viên mà không cần phá

mẫu. Sự thay đổi về độ cứng của thuốc có thể dược quan sát dưới dạng đường phổ

nền dốc dịch chuyển khi độ cứng tăng lên thì độ hấp thụ cũng tăng lên. Điều này rõ

rệt hơn ở các bước sóng dài bởi hiệu ứng tán xạ của ánh sáng. [25, 29]

- Định lượng các hoạt chất trong dung môi hay trong hỗn hợp [7]: Cơ sở của

phương pháp này dựa trên phương trình định luật Lambert – Beer biểu hiện mối

quan hệ giữa sự hấp thụ ánh sáng và nồng độ chất:

Log

=

Theo phương trình trên, ở một bước sóng xác định, sự hấp thụ ánh sáng tỷ lệ

với nồng độ C, chiều dày cuvet d và bản chất của chất mẫu. Như vậy, khi phân tích

một chất, đo ở một bước sóng xác định với một cuvet có chiều dày d đã biết thì độ

hấp thụ quang A chỉ còn tỷ lệ với nồng độ C của mẫu chất. Do phương trình trên chỉ

chính xác với dung dịch có nồng độ loãng nên phương pháp phân tích định lượng

bằng phổ hồng ngoại chỉ áp dụng đo trong dung dịch, còn theo phương pháp ép mẫu

rắn (ép KBr) thì chỉ phân tích bán định lượng do tín hiệu độ hấp thụ quang bị ảnh

hưởng bởi các yếu tố như tính chất vật lý, nhiệt độ, độ ẩm, độ dày viên mẫu.

Phương pháp phổ hồng ngoại chỉ có thể áp dụng để phân tích định lượng hỗn hợp

các mẫu khi sử dụng các thuật toán hồi quy chemometris.

1.4.2. Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung

bình kết hợp với chemometrics

1.4.2.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp hồi quy đa biến

Chemometrics được định nghĩa là việc ứng dụng các phương pháp toán học,

thống kê, đồ hoạ,… để qui hoạch thực nghiệm, tối ưu hoá các thông tin hoá học

trích ra từ tập số liệu phân tích và đưa ra tối đa những thông tin hữu ích từ tập số



liệu ban đầu [8]. Ra đời từ những năm đầu của thập kỉ 70, cho tới nay

Chemometrics đã xác lập được một vị trí quan trọng cho mình trong ngành hoá học,

đặc biệt là trong hoá học phân tích hiện đại. Một mảng lớn trong Chemometrics

phát triển nhanh gắn liền với toán học và tin học là hồi qui đa biến – kỹ thuật đa

biến được dùng rộng rãi trong phòng thí nghiệm hoá học giúp giải quyết các bài

toán xác định đồng thời nhiều cấu tử cùng có mặt trong hỗn hợp mà không cần tách

loại trước. Về nguyên tắc, chỉ cần xây dựng dãy mẫu chuẩn có mặt tất cả các cấu tử

cần xác định với nồng độ biết trước trong hỗn hợp (các biến độc lập x), đo tín hiệu

phân tích của các dung dịch này dưới dạng một hay nhiều biến phụ thuộc y và thiết

lập mô hình toán học mô tả quan hệ giữa hàm y (tín hiệu đo) và các biến độc lập x

(nồng độ các chất trong hỗn hợp). Dựa trên mô hình này có thể tìm được nồng độ

của các cấu tử trong cùng mẫu định phân khi có tín hiệu phân tích của dung dịch đó.

Trong luận văn này chúng tôi đã sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại gần

và trung bình kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến tuyến tính để định lượng

các sulfamid. Tùy thuộc vào đặc điểm của hàm phụ thuộc, có thể chia các phương

pháp hồi qui đa biến tuyến tính thành 2 nhóm chính: các phương pháp hồi qui đa

biến tuyến tính sử dụng phổ toàn phần như phương pháp CLS, PLS, ... và phương

pháp sử dụng dữ liệu phổ riêng phần như ILS.

Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (classical least square-

CLS)

- Từ dạng tổng quát y = XK +e (1)

K là vecto hệ số của phương trình hồi qui. K là ma trận (kx1) nếu y là véc tơ

cột biểu diễn tín hiệu đo của một dung dịch chuẩn với y là vecto (mx1), X là ma

trận (mxk), và e là vecto số dư (mx1). K là ma trận (kxp) nếu y là số liệu dạng ma

trận (mxp) biểu diễn tín hiệu của dung dịch chuẩn được đo tại nhiều thời điểm (ví

dụ đo độ hấp thụ quang tại p bước sóng).



Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (inverse least squares-

ILS)

Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS) hay còn gọi là phuơng

pháp ma trận P được xây dựng trên giả thiết rằng nồng độ của tín hiệu phân tích là

hàm của tín hiệu đo [4, 5, 8]:

C = P . A

Trong phương pháp hồi qui đa biến, phương trình trên có thể khai triển

thành:

C1 = P11A1 + P12A2 + … + P1mAm

C2 = P21A1 + P22A2 + … + P2mAm

…

Cx = Px1A1 + Px2A2 + … + PxmAm

Trong đó:

Am : Giá trị tín hiệu đo ở thời điểm m

Pxm : Giá trị hệ số hồi qui của cấu tử thứ x tại thời điểm m.

Cx : Nồng độ cấu tử thứ x.

Các bước tính toán trong mô hình ILS bao gồm

* Xây dựng các ma trận dữ liệu chuẩn:

Để xây dựng đường chuẩn sử dụng kĩ thuật ILS ta cần xác định ma trận hệ số

hồi qui P từ mẫu chuẩn có ma trận nồng độ C và ma trận tín hiệu đo A. P là ma trận

chứa hệ số hồi qui của phương trình, trong đó mỗi hàng chứa hệ số hồi qui của một

cấu tử, vì vậy số hàng của P là số cấu tử, số cột là số thời điểm đo.

Do trong tập số liệu C và A đều có chứa sai số ngẫu nhiên nên để P mô tả

chính xác quan hệ giữa C và A ta cần xác định P bằng phương pháp bình phương tối

thiểu (tổng bình phương của sai số giữa giá trị tính theo mô hình và giá trị thực

nghiệm là nhỏ nhất).

* Xác định công thức tính P:

C = A . P



AT . C= A

T . A . P

[AT

. A]-1

. AT

. C = [AT

. A]-1

. [AT

. A] . P

[AT

. A]-1

. AT

. C = P

Để ma trận nghịch đảo của [AT

. A] - nghịch đảo giả của A - tồn tại, A cần có

số hàng tối thiểu bằng số cột. Mỗi hàng trong A là tín hiệu của một mẫu, mỗi cột là

tín hiệu của các mẫu ở một thời điểm nhất định. Vì vậy, trong phương pháp ILS số

mẫu không được ít hơn số thời điểm đo. Do yêu cầu về số mẫu tối thiểu như trên

nên để tiến hành sử dụng phương pháp này, ta cần lựa chọn số thời điểm đo tối

thiểu đặc trưng nhất trên toàn dải phổ, vì vậy, phương pháp ILS còn được gọi là

phương pháp phổ riêng phần. Các điểm đo đặc trưng này thường là những điểm

thỏa mãn các yêu cầu sau:

- Giá trị tín hiệu đo tại các thời điểm này lớn so với các điểm đo khác để tăng

độ nhạy.

- Tín hiệu của các cấu tử khác nhau tại mỗi điểm đo được lựa chọn phải biến

đổi khác nhau tức là có sự khác biệt lớn về tín hiệu đo tại mỗi điểm của các cấu tử.

- Tại các điểm này, tín hiệu của các ion cản trở phép đo là nhỏ nhất.

* Dự đoán thông tin của mẫu chưa biết:

Với mẫu chưa biết nồng độ, từ ma trận tín hiệu đo Aunk của mẫu sẽ xác định

được nồng độ các chất dựa vào ma trận P đã tính:

Cunk = Aunk . P

Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (partial least square-PLS )

PLS là phương pháp đa biến dùng để mô hình hoá mối quan hệ giữa biến độc

lập X và biến phụ thuộc Y, từ đó có thể đoán được thông tin trong Y khi đã biết các

thông tin của X và ngược lại. PLS sẽ tối ưu hoá giá trị đồng phương sai (covariance)

giữa ma trận X và Y. Hai ma trận X và Y được phân tích thành một ma trận số

(score matrices) T chung và ma trận nạp (loading matrices) P và Q.

Hay X= T x P + E



Y= T x Q + F

Tính chất quan trọng của PLS là chúng ta có thể nhận được một ma trận T

chung cho cả 2 phương trình [4, 8].

Phương pháp hồi qui cẩu tử chính (principal component regression-PCR)

PCR - phương pháp hồi quy cấu tử chính, gồm 2 quá trình: Phân tích cấu tử

chính chuyển sang tập dữ liệu mới, chứa một số ít các yếu tố quan trọng, cần thiết.

Sau đó sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo để phân tích tập dữ

liệu mới này.

Trước tiên, chiếu tập số liệu tín hiệu phân tích đó lên không gian có ít chiều

hơn theo PCA mà không làm mất đi các thông tin quan trọng và tiến hành phân tích

hồi qui đa biến trên không gian mới này. Nó giả thiết rằng mỗi thành phần trong tập

số liệu có thể được gán một giá trị định lượng đầu tiên cần tạo mô hình PCA cho tập

số liệu và sử dụng giá trị riêng của các biến ảo (score) để xây dựng phương trình hồi

qui đa biến tuyến tính trong đó giá trị y là giá trị hàm mục tiêu.

Cũng cần lưu ý rằng, do phương pháp này phát triển trên cơ sở của phương

pháp ILS nên để sử dụng được các phương pháp này trong phân tích phổ hồng

ngoại chúng ta cần số mẫu chuẩn tối thiểu phải bằng số thời điểm sử dụng trong

đường chuẩn mã hóa, tức là số mẫu chuẩn không nhỏ hơn số PC lựa chọn. Lấy một

ví dụ cụ thể, khi đo phổ của 15 mẫu chuẩn tại 100 bước sóng, để sử dụng phương

pháp ILS, chúng ta cần phải giảm kích thước phổ xuống số bước sóng không quá

15. Cách đơn giản nhất là chọn ít hơn 15 bước sóng để đo độ hấp thụ nhưng sai số

sẽ lớn nếu không chọn được các bước sóng đặc trưng cho phổ các chất. Với mô

hình PCR ta có thể sử dụng toàn phổ để tính các PC, sau đó chọn số PC nhỏ hơn 15

để tính toán tiếp. Thông thường, với một tập số liệu có mức độ tập trung tốt thì chỉ

có một số ít các PC đầu tiên là có nghĩa (có tổng phương sai tích lũy đủ lớn để coi

rằng chúng đã chứa toàn bộ thông tin hữu ích đặc trưng của tập số liệu). Như vậy,

sử dụng mô hình PCR có thể giảm được kích thước tập số liệu mà không làm mất

thông tin đồng thời có thể loại được tín hiệu nhiễu của dữ liệu gốc [4, 8].



* Các bước chính của PCR bao gồm:

1. Xử lý ban đầu (không bắt buộc)

Nội dung chính của bước này là chuẩn hóa tập số liệu.

2. Các xử lý cần thiết:

Với một tập số liệu đã chuẩn hóa hoặc chưa chuẩn hóa, trước khi sử dụng đều cần

bước bình phương toàn tập dữ liệu - đây là yêu cầu bắt buộc đối với hầu hết các

hàm tính vectơ riêng.

D = AT. A

Trong đó A là ma trận số liệu biểu diễn độ hấp thụ quang theo các thời điểm đo của

các dung dịch chuẩn và AT là ma trận chuyển vị của ma trận A.

3. Xác định các vectơ riêng hay các PC:

Có thể tính toán các vectơ riêng của tập số liệu bằng nhiều hàm toán học khác nhau.

Có 3 hàm chính, thường sử dụng là hàm NIPALS (hàm phi tuyến lặp sử dụng kĩ

thuật bình phương tối thiểu riêng phần), hàm SVD (hàm phân tách các giá trị riêng)

và hàm Princomp (hàm tính các cấu tử chính). Cần lưu ý rằng, tất cả các hàm này

đều tính toán và đưa ra tất cả các cấu tử nhưng thường không sử dụng tất cả mà chỉ

sử dụng N cấu tử đầu đủ để xác định không gian mới :

NIPALS là hàm lặp thường sử dụng cho các tập số liệu kích thước lớn hoặc

có độ đa cộng tuyến cao. Với tập số liệu có kích thước nhỏ, quá trình tính lặp trong

hàm NIPALS sẽ làm khuếch đại sai số của tập số liệu nên thông thường người ta

không sử dụng hàm này để tính các PC.

SVD là hàm tính PC sử dụng phương pháp tách tập số liệu ban đầu thành các

nhân tố. Các vectơ riêng và trị riêng của ma trận dữ liệu đều là những tập con riêng

của các nhân tố trong SVD. Hàm SVD sử dụng hình thức chéo hóa cho phép khống

chế thang đo một cách hợp lí nên giảm thiểu được sai số do làm tròn. Vì vậy hàm

này sử dụng được với các kiểu tập số liệu rộng rãi hơn hàm NIPALS.

Princomp là hàm tính toán trực tiếp các cấu tử chính (PC) có vai trò tương

đương các vectơ riêng. Tuy nhiên, so với hàm SVD thì việc sử dụng hàm Princomp

với tập số liệu lớn có ưu điểm là phương sai tập trung không cao nên vị trí các PC



sẽ chênh lệch không quá lớn, do đó sai số trong quá trình làm tròn số và chuyển hóa

tập số liệu sẽ nhỏ hơn.

Các hàm toán học trên đều đưa ra một ma trận cột chứa các vectơ riêng - Vc -

là ma trận trong đó mỗi cột là một vectơ hay nhân tố mới - PC - của ma trận dữ liệu

và số hàng ma trận là số thời điểm đo. Mỗi nhân tố hay vectơ này lại là tổ hợp bậc

nhất của các điểm phổ ban đầu, phần đóng góp của các điểm này vào mỗi vectơ là

khác nhau tùy thuộc vào giá trị hàm phụ thuộc tại điểm đó. Những điểm có giá trị

đóng góp lớn vào các PC chứa phương sai lớn sẽ là những điểm đo có ảnh hưởng

quyết định tới kết quả tính ma trận hệ số hồi qui và kết quả hồi qui sau đó. Ma trận

kết quả thứ hai cũng rất quan trọng là ma trận phương sai của các PC: đó là dạng ma

trận chéo đối với hàm SVD, là một vectơ cột đối với hàm NIPALS và hàm

Princomp.

4. Lựa chọn các vectơ có nghĩa

Đây là bước có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến bước xử lý tiếp theo. Nếu

giữ lại nhiều vectơ hơn số cần dùng thì những vectơ đó sẽ chứa cả tín hiệu nhiễu và

như vậy, kết quả hồi qui sẽ mắc phải sai số. Nếu giữ lại không đủ số vecto cần thiết

sẽ làm mất đi thông tin có ích từ tập dữ liệu, điều này cũng sẽ gây nên sai lệch giữa

mô hình hồi qui thu được và mô hình thực. Vì vậy, việc đánh giá và lựa chọn các

vectơ có nghĩa là rất quan trọng. Dưới đây là một số phương pháp phổ biến để xác

định số PC có nghĩa :

Dùng các hàm chỉ thị: Có rất nhiều hàm chỉ thị khác nhau như CPV

(tính phần trăm phương sai tích lũy), hàm IEF, ...

Tính toán PRESS (tổng bình phương sai số dự đoán) để đánh giá thông

tin từ dữ liệu.

Phương pháp đánh giá chéo

Phương pháp đánh giá Xu – Kailath

Đánh giá theo tiêu chuẩn Akaike

Tính phương sai của sai số tái lập VRE



Các phương pháp này đều có những ưu điểm riêng khi sử dụng và kết quả

đánh giá tương đối thống nhất với nhau. Phương pháp được sử dụng rộng rãi để lựa

chọn các PC có nghĩa khi các PC này được tính bằng hàm SVD hay Princomp là

phương pháp tính và đánh giá qua phần trăm phương sai tích lũy của các PC đó.

Cách tính này đơn giản hơn và các hàm tính PC trên đã cho sẵn dữ liệu để có thể

đánh giá nhanh.

5. Tính toán lại

Sau khi loại bỏ các vectơ riêng không có nghĩa, chúng ta cũng loại được tín

hiệu nhiễu của dữ liệu gốc và cần tính lại dữ liệu sau khi loại bỏ sai số. Như vậy,

khi tính toán ở hệ tọa độ mới ta đã loại bỏ được tín hiệu nhiễu trong tập dữ liệu ban

đầu.

6. Xây dựng đường chuẩn

Khi xây dựng đường chuẩn PCR theo phương pháp ILS, điểm khác biệt duy

nhất là tập số liệu sử dụng.

Các bước tiến hành bao gồm:

- Xác định phép chiếu trong hệ tọa độ mới:

Aj = A . Vc

Trong đó:

Aj: ma trận số liệu ở hệ tọa độ mới

A: ma trận gốc

Vc: ma trận các vectơ riêng có nghĩa

- Thay thế A bằng Aj trong phương trình hồi quy

C = Aj . F , trong đó F được tính theo công thức:

F = (AjT . Aj)

-1 . Aj

T . C

Nồng độ chất phân tích trong mẫu chưa biết được tính theo công thức:

Cx = Ax . Vc . F

= Ax . Fcal

với Fcal = Vc . F đóng vai trò tương tự ma trận P trong phương trình của ILS

Ưu điểm của phương pháp PCR:



- Hội tụ đầy đủ các ưu điểm của phương pháp ILS đồng thời khắc phục

được các nhược điểm của phương pháp ILS do tiến hành tính toán trên toàn phổ.

- Phương pháp này cho phép loại bỏ sai số nhiễu phổ và sai số ngẫu

nhiên trong quá trình đo khi lựa chọn được số PC phù hợp.

- Đối với trường hợp sử dụng phổ toàn phần, khi dùng các phương pháp

khác như CLS, kết quả tính cuối cùng là kết quả tính trung bình trên toàn phổ nên

kém chính xác hơn trường hợp dùng phổ chọn lọc. Khi sử dụng mô hình PCR, tuy

kết quả vẫn tính trên tất cả các điểm nhưng đóng góp của các điểm đo sẽ khác nhau

tùy theo lượng đóng góp của từng điểm này vào các PC được chọn mà lượng đóng

góp này lại được phân tích dựa trên tín hiệu đo tại từng điểm của các mẫu chuẩn.

Do có sự phân biệt và chọn lọc trong đánh giá mỗi điểm đo nên kết quả thu được sẽ

chính xác hơn phương pháp tính trung bình trên toàn phổ ở các phương pháp phổ

toàn phần khác [4, 8].

1.4.2.2. Xác định đồng thời các chất bằng phương pháp quang phổ hồng

ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến

Trong vòng hai thập kỷ trở lại đây NIR đã trở thành một trong những công

cụ hữu ích ứng dụng trong phân tích công nghiệp. Đây là một kỹ thuật phân tích rất

nhanh: chỉ với cần một máy quang phổ hồng ngoại ta có thể đo phổ hồng ngoại chỉ

trong vòng một vài giây [22]. So với phương pháp phân tích truyền thống để định

lượng hoạt chất thuốc là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thì định lượng chất hữu

cơ trong phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm nổi trội về đơn giản trong

quá trình tiền xử lý mẫu, lượng mẫu phân tích ít, quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản,

chi phí thấp do đó có thể hạn chế được các sai số trong quá trình chuẩn bị mẫu [25].

Tuy nhiên, NIR có một số nhược điểm như: giới hạn phát hiện cao do đó không phù

hợp với các phép phân tích lượng vết, không đưa ra được các thông tin đặc trưng

nếu chỉ đo tại một bước sóng. Kết quả đo phổ hồng ngoại chịu ảnh hưởng mạnh mẽ

của các thông số như điều kiện vật lý của mẫu, môi trường đo mẫu, độ dày của viên

mẫu, tỷ lệ ép viên. Vì thế NIR thường không được sử dụng như một kỹ thuật phân

tích trực tiếp.



Việc sử dụng phổ hồng ngoại kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến đã

góp phần đưa phương pháp phổ hồng ngoại tham gia vào các quá trình định lượng

mẫu. Năm 2011, Mafalda Cruz Sarraguca và các cộng sự [27] đã nghiên cứu thành

công phương pháp định lượng nhanh aminoglycosides bằng phép đo hồng ngoại

gần. Không giống như các phương pháp định lượng truyền thống là dựa trên cơ sở

các phản ứng dẫn xuất hay phương pháp xét nghiệm vi sinh để định lượng

aminoglycosides [34, 37], trong nghiên cứu này các tác giả đã đưa ra một phương

pháp hoàn toàn mới để xác định các hoạt chất này. Theo đó, phương pháp này đã

được phát triển dựa trên nền mẫu thuốc thương mại có chứa neomycin sulphate và

ba tá dược là lactose, bột talc và magnesi stearat. Các mẫu tổng hợp và mẫu thêm đã

được chế tạo cho mục đích này, đồng thời họ cũng đã sử dụng ba lô mẫu thuốc rắn

thương mại để thực hiện việc nghiên cứu xác định neomycin sulphate. Mẫu được

tiến hành đo phổ hồng ngoại gần với chế độ đo phản xạ sử dụng biến đổi Fourier.

Phương pháp hồi quy đa biến đã được sử dụng để hiệu chỉnh phổ hồng ngoại gần

phù hợp với hàm lượng neomycin sulphate. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để kiểm tra hàm lượng neomycin sulphate trong các

mẫu thương mại. Kết quả thu được cho thấy neomycin sulphate đã được xác định

thành công bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại gần với sai số 6,6%.

Đối với roxithromycin thông thường người ta sẽ sử dụng phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao với các loại detector khác nhau để xác định. Tuy nhiên phương

pháp này đòi hỏi một lượng lớn hóa chất, dung môi để xử lý và chạy sắc ký. S.T.H.

Sherazi [33] đã sử dụng phương pháp hồng ngoại biến đổi Fourier để xác định

roxithromycin từ phổ của mẫu thuốc kết hợp với phương pháp hồi quy phân tích

thống kê đa biến. Phương pháp này cho phép rút ngắn thời gian phân tích xuống còn

khoảng 3 phút nên rất phù hợp để áp dụng kiểm tra nhanh các mẫu.

Thêm một ứng dụng thành công của phương pháp đo phổ hồng ngoại gần kết

hợp với kỹ thuật thống kê đa biến cho phép giám sát liên tục để phân tích đồng thời

glycerol và clavulanic acid trong một hỗn hợp kháng sinh phức tạp [32].



Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với chemometric đã mở ra một kỷ

nguyên mới cho phép phân tích nhanh, hiệu quả, thân thiện với môi trường- công

nghệ hóa học xanh. Tuy nhiên, đây vẫn là một hướng nghiên cứu khả mới mẻ trên

thế giới. Hiện nay, tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích thuộc AgroParisTech (Pháp),

nhóm nghiên cứu đã ứng dụng các thuật toán để xử lý các tín hiệu phân tích của hỗn

hợp các chất trong sự tương tác phức tạp đa biến và đưa ra các kết quả của từng

biến đã có rất nhiều nghiên cứu thu được kết quả tốt [20, 22, 24]. Đặc biệt, việc áp

dụng các thuật toán đã mở ra những phương pháp đo nhanh có thể đưa các phép

phân tích ra khỏi phòng thí nghiệm. Tại các nước như Mỹ, Anh cũng có giới thiệu

các thiết bị cầm tay để xác định thuốc giả. Các máy này đều có ưu điểm là khá gọn

nhẹ, nhưng có hạn chế là khi đo chất trong các nền khác nhau thường không đưa ra

được các kết quả có độ chính xác cao. Phần mềm và cơ sở dữ liệu của chúng lại

không cho phép can thiệp nên khó khăn trong việc bổ sung thêm cơ sở dữ liệu. Do

đó việc nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình

kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến để kiểm tra nhanh chất lượng thuốc là

một vấn đề vô cùng cần thiết.

Hiện tại chưa có một nghiên cứu nào về định lượng nhanh nhóm Sulfamid

bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình được công bố. Đây

chính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn tiến hành nghiên cứu định lượng một số hoạt

chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp quang phổ kế hồng

ngoại gần và trung bình. Kết quả thu được từ nghiên cứu này mở ra hướng nghiên

cứu mới sử dụng các thiết bị đơn giản để xác định nhanh các chất trong mẫu đo

phức tạp mà không cần phá mẫu hoặc xử lý nhanh tại chỗ, tạo điều kiện đưa phép

phân tích ra khỏi phòng thí nghiệm.



CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM

2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1.1. Nội dung nghiên cứu

Để xây dựng qui trình phân tích định lượng nhanh ba hoạt chất

sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phương pháp phổ hồng ngoại

kết hợp với chemometrics cần giải quyết các vấn đề sau:

- Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện tối ưu để đo phổ IR trong vùng hồng

ngoại gần và trung bình của các hoạt chất sulfaguanidin, sulfamethoxazol và

trimethoprim.

- Nghiên cứu xây dựng thuật toán hồi qui đa biến tuyến tính, lựa chọn các

thông số tối ưu của các mô hình trên cơ sở của mẫu chuẩn.

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo độ hấp thụ của chất phân

tích trong vùng hồng ngoại gần và trung bình.

- Nghiên cứu xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương

pháp hồi quy đa biến xác định đồng thời các hoạt chất trên.

- Ứng dụng phương pháp nghiên cứu được để định lượng nhanh thành phần

hoạt chất trong các mẫu thuốc đang lưu thông trên thị trường. So sánh kết quả tìm

được với phương pháp tiêu chuẩn qui định trong dược điển

2.1.2. Phương pháp nghiên cứu

Cơ sở của phương pháp nghiên cứu là dựa vào phổ hấp thụ của ba hoạt chất

là sulfaguanidin, sulfamethoxazol (thuộc nhóm sulfamid) và trimethoprim (thường

dùng kết hợp với sulfamethoxazol để tăng cường khả năng kháng khuẩn của thuốc)

trong vùng phổ hồng ngoại từ 3600- 3000 cm-1

để định lượng nhanh các hoạt chất

trên trong dược phẩm bằng phương pháp hồi quy đa biến.

Tiến hành xây dựng mô hình hồi quy đa biến xác định một hoạt chất và các

tá dược gồm 25 mẫu chuẩn và 10 mẫu kiểm tra, mô hình hồi quy đa biến xác định

cả ba hoạt chất và các tá dược gồm 30 mẫu chuẩn và 15 mẫu kiểm tra bằng cách

chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra theo như quy trình như dưới đây:



- Bước 1: chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra chứa đồng thời các hoạt

chất là sulfaguanidin, sulfamethoxazol, và trimethoprim cùng với ba tá dược là tinh

bột sắn, maltodextrin, Ca3(PO4)2 với tỷ lệ thay đổi trong khoảng nồng độ khảo sát

sao cho tín hiệu độ hấp thụ thay đổi trong vùng tuyến tính.

- Bước 2: Nghiền và trộn từng mẫu trong 15 phút để hỗn hợp được đồng

nhất.

- Bước 3: Lấy 2 mg chất vừa trộn được trộn với 98 mg KBr rồi tiến hành

nghiền mịn đồng nhất mẫu trong cối mã não trong 10 phút.

- Bước 4: Lấy khoảng 15 mg lượng bột vừa nghiền được cho vào bộ ép viên

để thu được viên mẫu đem đo phổ hồng ngoại trong vùng phổ nghiên cứu từ 3600-

3000 cm- 1

, ghi lại độ hấp thụ quang của từng mẫu, xuất số liệu thu được dưới dạng

ASCII và chuyển toàn bộ dữ liệu vào phần mềm matlab để tính toán kết quả.

- Bước 5: Đường chuẩn đa biến và các bộ dữ liệu dự đoán được xây dựng

trên ma trận độ hấp thụ quang của các mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra đã chuẩn bị ở

phần trên. Nhập số liệu ma trận nồng độ các mẫu chuẩn, ma trận các mẫu kiểm tra

và các ma trận tín hiệu đo tương ứng vào phần mềm Matlab, chạy chương trình tính

toán ma trận hệ số hồi qui theo 4 phương pháp CLS, ILS, PLS và PCR trên phần

mềm và sử dụng ma trận này để tìm nồng độ mỗi hoạt chất trong từng mẫu. So sánh

sai số tương đối của mỗi phương pháp, lựa chọn ra phương pháp tối ưu nhất để tiến

hành định lượng các mẫu thực tế.

- Bước 6: Tiến hành định lượng các mẫu thực tế bằng cách trộn một lượng

bột viên với tá dược để pha loãng nồng độ hoạt chất về nồng độ nằm trong ma trận

chuẩn đã xây dựng, đo phổ của các mẫu này, ghi lại phổ và chuyển dữ liệu thu được

vào phần mềm Matlab để tính toán kết quả. Từ đó tiến hành tính toán hàm lượng

hoạt chất trong các mẫu thuốc viên theo công thức dưới đây:

( / ê ) tb

t

X mHL mg vi n

m



Trong đó:

X: Lượng (mg) hoạt chất tìm được từ mô hình hồi qui đa biến

mt: khối lượng cân của mẫu thử (mg)

mtb: khối lượng trung bình của 1 viên của thuốc (mg)

2.2. Phương pháp phân tích đối chứng xác định các sulfamid

2.2.1. Phương pháp đối chứng xác định Sulfaguanidin

Tiến hành: Định lượng bằng phương pháp chuẩn độ thể tích theo DĐVN 4.

Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn. Cân

chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 0,2 g sulfaguanidin, thêm 15

ml dung dịch acid hydrocloric 25% và 50 ml nước. Lắc kỹ, tiến hành chuẩn độ bằng

nitrit (1 ml dung dịch natri nitrit 0,1M tương đương với 21,42 mg C7H10N4O2S.).

Hàm lượng (%) sulfaguanidin trong chế phẩm được tính toán theo công thức

dưới đây

21,42( / ê ) t a TB

T

V k mHL mg vi n

m

Trong đó: Vt: thể tích dung dịch natri nitrit 0,1M đã chuẩn độ (ml)

ka: hệ số hiệu chỉnh của dung dịch natri nitrit nếu nồng độ của

dung dịch này không phải là 0,1M.

mt: khối lượng cân của mẫu thử (mg)

mtb: khối lượng trung bình của một viên thuốc (mg)

21,42: là hệ số quy đổi 1 ml dung dịch natri nitrit 0,1M tương

đương với 21,42 mg C7H10N4O2S.

2.2.2. Phương pháp đối chứng xác định Sulfamethoxazol và Trimethoprim

Tiến hành theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như dược điển Mỹ

USP 34- NF 29 [37]. như sau:

Điều kiện sắc ký: Cột C 18 (250 x 4,6 mm; 5µm), detector UV: 254 nm, tốc

độ dòng: 1,8 ml/ phút, thể tích tiêm: 20 µl. Pha động: 700ml nước + 200ml

Acetonitril + 1ml triethylamin, điều chỉnh pH 5,9 ± 0,1 bằng dung dịch acid acetic

1% hoặc dung dịch natri hydroxyd 0,2N, thêm nước vừa đủ 1000 ml.



- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 320mg sulfamethoxazol chuẩn và

khoảng 64mg trimethoprim chuẩn vào bình định mức 100,0 ml, thêm 50ml

methanol, lắc siêu âm hoà tan để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều. Hút chính

xác 5,0 ml dịch trên vào bình định mức 50,0ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch.

Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm.

- Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình rồi nghiền thành

bột mịn. Cân chính xác một lượng bột chế phẩm tương ứng khoảng 320mg

Sulfamethoxazol vào bình định mức 100,0ml, thêm 50ml methanol, lắc siêu âm hoà

tan để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc bỏ dịch đầu. Hút chính xác 5,0

ml dịch lọc trên vào bình định mức 50,0ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch. Lắc

đều, lọc qua màng lọc 0,45µm. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và

dung dịch thử. Tính lượng hàm lượng Sulfamethoxazol (C10H11N3O3S) và

Trimethoprim (C14H18N4O3) có trong chế phẩm dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ

của dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng của Sulfamethoxazol chuẩn,

Trimethoprim chuẩn và các thông số liên quan.

Công thức tính toán hàm lượng sulfamethoxazol (mg/ viên)

S S tbT

S t

m HL m EHL (mg/viê )=

E m n

Trong đó: ES, Et: lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn, thử

mS, mt: lần lượt là khối lượng cân của chuẩn, của thử (mg)

HLS: hàm lượng nguyên trạng của sulfamethoxazol chuẩn (%)


Công thức tính toán hàm lượng trimethoprim (mg/ viên)

S S tbT

S t

m HL m EHL (mg/viê )=

E m n

Trong đó: ES, Et: lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn, thử

mS, mt: lần lượt là khối lượng cân của chuẩn, của thử (mg)

HLS: hàm lượng nguyên trạng của trimethoprim chuẩn (%)




2.3. Hóa chất và thiết bị

2.3.1. Hóa chất

- Chất chuẩn Sulfaguanidin (viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, chuẩn

phòng thí nghiệm), số kiểm soát: 0100111. Hàm lượng: 100,7% C7H10N4O2S

(khan). Độ ẩm: 7,89%. Hàm lượng nguyên trạng: 92,11%

- Chất chuẩn Sulfamethoxazol (viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, chuẩn

dược điển Việt Nam), số kiểm soát: 0107110. Hàm lượng: 100,24% C10H11N3O3S

( khan). Độ ẩm: 0,19%. Hàm lượng nguyên trạng: 100,05%

- Chất chuẩn Trimethoprim (viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, chuẩn

dược điển Việt Nam), số kiểm soát: 0201109. Hàm lượng: 99,89% C14H18N4O3

(khan). Độ ẩm 0,1%. Hàm lượng nguyên trạng: 99,79%

- KBr (Merck)

- Tinh bột sắn (Nhà máy sản xuất tinh bột mì Quảng Ngãi), đạt tiêu chuẩn đã

kiểm tra theo DĐVN 4

- Ca3(PO4)2 (Công ty cổ phần hóa dược Việt Nam), đạt tiêu chuẩn đã kiểm

tra theo BP 2009.

- Maltodextrin (Yisui dadi Corn developing Co., LTD), đạt tiêu chuẩn đã

kiểm tra theo BP 2009.

- Magie stearat (Peter Greven Asia SDN. BHD), đạt tiêu chuẩn đã kiểm tra

theo USP34.

- Bột Talc (Công ty cổ phần hóa dược Việt Nam), đạt tiêu chuẩn đã kiểm tra

theo DĐVN 4

- Hóa chất tinh khiết phân tích: Acid Acetic, NaOH, Acetonitrin,

triethylamin, Methanol (Merck)

2.3.2. Thiết bị và phần mềm máy tính

- Cân phân tích Sartorious độ chính xác ± 0,0001g.

- Máy quang phổ hồng ngoại Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR

spectrometer, dải số sóng đo 7500-2800 cm-1

. Detector nhiệt DTGS



- Bộ dụng cụ ép viên: Agilent Technologies standard sampling kit (part no:

Pike - 162 - 1000).

- Thư viện phổ chuẩn: ST- Japan spectral libraries (part no: K8159 - 1000)

- Phần mềm Matlab 7.6: Chương trình hồi qui đa biến tuyến tính PLS, CLS,

ILS và PCR để phân tích đồng thời các cấu tử trong cùng hỗn hợp.

- Hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu LC-20A.; Cột sử dụng: C18 (250 x 4,6

mm; 5µm)

2.4. Chương trình máy tính của các phương pháp hồi quy đa biến

2.4.1. Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (CLS)

* Các bước tính toán CLS trong phần mềm Matlab:

- Khởi động phần mềm MATLAB

- Nhập các ma trận dữ liệu trong cửa sổ WORKSPACE

+ Nhập ma trận nồng độ X0 (mxk) của m mẫu chuẩn chứa k cấu tử

+ Nhập ma trận tín hiệu phân tích Y0(mxn) (n là số tín hiệu đo)

+ Nhập tín hiệu phân tích Y của mẫu cần định phân

- Lưu các dữ liệu vừa nhập vào thành 1 file trong Matlab : CLS.mat. [4, 8]

- Mở một M-file trong cửa sổ EDITOR và viết các câu lệnh tại đó:

%Phuong phap CLS:

%Goi cac bien su dung trong phuong phap

load CLS.mat;

%Tinh ma tran he so hoi quy K:

K=inv(X0'*X0)*X0'*Y0 ;

%KIỂM TRA ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA PHƯƠNG PHÁP:

%Nhap ma tran tin hieu do hap thu quang cua mau kiem tra: Yktra

%Nhap ma tran nong do cua mau ktra: X0ktra

%Tinh nong do mau kiem tra:

Xktra=Yktra*K'*inv(K*K');

%Tinh sai so giua nong do chuan voi nong do xac dinh duoc tu phuong

phap CLS:



Saiso=(X0ktra-Xktra)*100./X0ktra;

%TÌM NỒNG ĐỘ CỦA CHẤT TRONG MẪU BẤT KÌ

%Nhap ma tran tin hieu do hap thu quang cua mau: Y

X=Y*K'*inv(K*K');

- Lưu lại M-file vừa thực hiện được và đặt tên file: CLS

- Gọi hàm M-file vừa viết được trong cửa sổ COMMAND WINDOW

>> CLS

- Chương trình sẽ tự động thực hiện các lệnh theo yêu cầu và hiển thị kết quả.

- Kích chuột vào giá trị Saiso, X trong WORKSPACE thu được các dữ liệu

mong muốn.

2.4.2. Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo ( ILS)

* Các bước tính toán ILS trong phần mềm Matlab:



+ Nhập ma trận nồng độ X0 (mxk) của m mẫu chuẩn chứa k cấu tử

(m hàng, k cột)



- Lưu các dữ liệu vừa nhập vào thành 1 file trong Matlab : ILS.mat [4, 8]

- Mở một M-file và viết các câu lệnh tại đó:

%Phuong phap ILS:

%Goi cac bien su dung trong phuong phap

load ILS.mat;

%Tinh ma tran he so hoi quy:

P=inv(Y0'*Y0)*Y0'*X0;

%KIỂM TRA ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA PHƯƠNG PHÁP:

%Tinh nong do chat trong mau kiem tra:

Xktra=Yktra*P;

%Tinh sai so giua nong do chuan voi nong do xac dinh duoc tu ILS:



Saiso= (X0ktra-Xktra)*100./X0ktra

% TÍNH NỒNG ĐỘ CỦA CHẤT TRONG MẪU BẤT KÌ

%Tinh nong do cua mau:

X=Y*P

- Lưu lại M-file vừa thực hiện được: ILS.m

- Gọi M-file vừa viết được trong cửa sổ COMMAND WINDOW

>> ILS

- Chương trình sẽ tự động thực hiện các yêu cầu mong muốn và trả lại kết quả

dưới dạng ma trận. Kích chuột vào giá trị Saiso, X trong WORKSPACE để

hiển thị các ma trận số liệu đó.

2.4.3. Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS)

* Các bước tính toán PLS trong phần mềm Matlab:



+ Nhập ma trận nồng độ X0 (mxk) của m mẫu chuẩn chứa k cấu tử (m hàng,

k cột)



- Lưu các dữ liệu vừa nhập vào thành 1 file trong Matlab : PLS.mat [4, 8]

- Mở một M-file và viết các câu lệnh tại đó:

%Phuong phap PLS:

%Goi cac bien can dung trong phuong phap

load PLS.mat;

%Tinh vecto trong so:

w=(Y0'*X0)*inv(X0'*X0);

%Tinh tri so va trong so:

t=Y0*w;

P=(Y0'*t)*inv(t'*t);

Q=(X0'*t)*inv(t'*t);



b=w*inv(P'*w)*Q;

a=mean(X0)-mean(Y0)*b;

% NẾU MUỐN KIỂM TRA ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA PHƯƠNG PHÁP:

% do kich thuoc cua ma tran a và Yktra*b la khac nhau, thuc hien buoc dong

% nhat cua 2 ma tran. Neu so cau tu la 2 thi a(1) duoc tao thanh bang

cach

% tao thanh 2 cot trong ma tran. Neu so cau tu la n thi tuong tu ta them

n % cot

a1=[ones(m,1)*a(1) ones(m,1)*a(2)]; % m la so mau kiem tra

% Nhap ma tran do hap thu quang cua mau kiem tra:Yktra

% Tinh nong do mau kiem tra theo PLS:

Xktra=a1+Yktra*b;

% Tinh sai so giua nong do chuan voi nong do xac dinh duoc tu PLS:

Saiso=(X0ktra-Xktra)*100./X0ktra ;

% TÍNH NỒNG ĐỘ CỦA CHẤT TRONG MẪU BẤT KÌ

a2=[ones(m1,1)*a(1) ones(m1,1)*a(2)]; % m1 la so mau phan tich

% Nhap ma tran do hap thu quang cua mau thuc: Y

X=a2+Y*b;

- Lưu lại M-file vừa thực hiện được PLS.m

- Gọi hàm M-file vừa viết được trong cửa sổ COMMAND WINDOW

>> PLS


mong muốn

2.4.4. Phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR)

* Các bước tính toán PCR trong phần mềm Matlab:



+ Nhập ma trận nồng độ X0 (mxk) của m mẫu chuẩn chứa k cấu tử (m hàng,

k cột)





- Lưu các dữ liệu vừa nhập vào thành 1 file trong Matlab: PCR.mat [4, 8]

%Phuong phap PCR:

load PCR.mat;

%Binh phuong tap so lieu chua bien phu thuoc Y0

D = Y0'*Y0;

% Su dung mot trong 3 ham tinh PC de xac dinh cac PC theo cau lenh

% su dung ham SVD

[V S] = svd(D);

% Tinh ma tran phan tram phuong sai cua cac PC

d = diag(S)/sum(diag(S))*100;

% Tu gia tri phan tram phuong sai cua cac PC, can cu vao yeu cau cu the cua

% bai toan de quyet dinh so PC lam co so cho khong gian moi cua tap so lieu

% (n):

f = V(:,1:n);

% Chuyen doi tap so lieu ban dau va tinh ma tran he so hoi qui voi 3 cau tu

chinh:

Yj = Y0*f;

F = inv(Yj'*Yj)*Yj'*X0;

Fj=f*F

% Nhap ma tran bien phu thuoc cua k mau can dinh phan va tinh nong do

mau

% theo cong thuc:X=Y*Fj

% NEU MUON KIEM TRA DO CHINH XAC CUA PHUONG PHAP

% Nhap ma tran do hap thu quang cua mau kiem tra:Yktra

%Tinh nong do mau kiem tra theo PCR:

Xktra=Yktra*Fj;

%Tinh sai so giua nong do chuan voi nong do xac dinh duoc tu PLS:



Saiso=(X0ktra-Xktra)*100./X0ktra ;

% TINH NONG DO CUA CHAT TRONG MAU BAT KI.

%Nhap ma tran do hap thu quang cua mau thuc: Y

X=Y*Fj;

% TINH LOD, LOQ CỦA PHUONG PHAP

%Nhap ma tran do lech chuan cua tin hieu do lap lai mau trang: Z

%Tinh toan cac gia tri LOD, LOQ theo PCR:

LOD=(3*Z)*Fj;

LOQ=(10*Z)*Fj;

- Lưu lại M-file vừa thực hiện được: PCR.m

- Gọi hàm M-file vừa viết được trong cửa sổ COMMAND WINDOW :

>> PCR


mong muốn.



CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu xác định đồng thời sulfaguanidin,

sulfamethoxazol và trimethoprim trong cùng hỗn hợp

3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ của các hoạt chất

Nhận thấy trong cấu trúc phân tử các hoạt chất sulfaguanidin,

sulfamethoxazol và trimethoprim chứa các nhóm chức như: -SO2NH-, NH2, C-H,

O-H có khả năng hấp thụ trong vùng hồng ngoại gần và trung bình nên chúng tôi đã

tiến hành khảo sát phổ hồng ngoại của 3 hoạt chất này trong vùng từ 4000- 400cm- 1

bằng thiết bị đo phổ hồng ngoại GX- PerkinElmer- USA thuộc bộ môn Hóa vật

liệu- Khoa Hóa, trường đại học Khoa Học Tự Nhiên và vùng 7500-2800 cm-1

bằng

thiết bị đo phổ hồng ngoại Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR

spectrometer tại bộ môn Hóa phân tích. Phổ hấp thụ hồng ngoại của 3 hoạt chất

trong vùng hồng ngoại gần và trung bình được trình bày trong các hình 3.1, 3.2, 3.3.

Kết quả trên máy GX- PerkinElmer- USA

vùng phổ 4000- 400cm- 1

Kết quả trên máy Agilent Technologies

Cary 600 vùng phổ 7500-2800 cm-1

Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của Sulfaguanidin trên hai loại thiết bị khảo sát




vùng phổ 4000- 400cm- 1



Hình 3.2: Phổ hồng ngoại của Sulfamethoxazol tren hai thiết bị khảo sát


vùng phổ 4000- 400cm- 1



Hình 3.3: Phổ hồng ngoại của Trimethoprim trên hai loại thiết bị khảo sát



Dựa vào phổ hấp thụ của 3 hoạt chất trên chúng tôi nhận thấy rằng các hoạt

chất này đều có phổ hấp thụ mạnh trong vùng phổ 3600- 3000 cm-1

và 1700- 1000

cm-1

. Tuy nhiên vùng phổ 3600- 3000 cm-1

là vùng hấp thụ của nhóm sulfoamid bậc

2 (-SO2-NH-) đặc trưng cho các sulfamid. Do đó chúng tôi đã lựa chọn thiết bị đo

Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR spectrometer với vùng phổ đặc trưng từ

3600- 3000 cm-1

của nhóm sulfamid để tiến hành các thực nghiệm tiếp theo.

Khi tiến hành chồng phổ của ba hoạt chất trong vùng phổ từ 4000-400 cm-1

,

chúng tôi đã thu được kết quả như hình 3.4 dưới đây:

Hình 3.4: Phổ hồng ngoại của ba hoạt chất Sulfaguanidin, sulfamethoxazol và

trimethoprim

Nhận thấy có sự xen phủ giữa các phổ của các hoạt chất với nhau do đó

không thể dùng phương pháp định lượng thông thường dựa trên mối quan hệ giữa

độ hấp thụ quang và nồng độ để định lượng các chất mà phải sử dụng phương pháp

phổ hồng ngoại kết hợp với chemometrics để định lượng được từng hoạt chất này.

: Sulfaguanidin

: Sulfamethoxazol

: Trimethoprim



3.1.2. Khảo sát tỷ lệ khối lượng mẫu / KBr

Tiến hành trộn bột thuốc của mẫu thuốc viên Bisepton ngoài thị trường (chứa

hàm lượng sulfamethoxazol 400 mg và trimethoprim 80 mg trên một viên) với KBr

theo tỷ lệ khối lượng mẫu trên KBr là x/y với x= 1-10 và y = 100- x. Đo phổ hổng

ngoại trong dải bước sóng từ 3600-3000 cm- 1

kết quả thu được ở bảng 3.1.

Bảng 3.1: Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr đến độ hấp thụ quang

tại các số sóng đặc trưng

Chất/ KBr (w/w)

ῡ (cm-1

) 1/99 2/98 3/97 6/94 10/90

3118 0,6643 1,1966 1,2963 1,3715 1,8788

3221 0,6925 1,3904 1,4995 1,6354 2,3611

3318 0,7116 1,5362 1,6405 1,8243 2,6605

3339 0,7159 1,5716 1,6725 1,8641 2,7271

3469 0,7233 1,6247 1,7434 1,9383 2,8270

Nhìn vào bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy khi tỷ lệ khối lượng mẫu/ KBr tăng

thì độ hấp thụ quang của các mẫu viên cũng tăng lên. Tuy nhiên khi độ hấp thụ

quang càng cao thì độ lặp lại của phép đo càng kém. Mặt khác, nếu lượng mẫu đưa

vào quá nhỏ thì dễ gây sai số trong quá trình cân, do đó chúng tôi đã lựa chọn tỷ lệ

mẫu/ KBr là 2/98 cho những nghiên cứu tiếp theo.

3.1.3. Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên

Độ lặp lại của quá trình ép viên được tiến hành bằng cách trộn hỗn hợp

sulfaguanidin và KBr với tỷ lệ khối lượng (2:98), nghiền mịn đồng nhất mẫu trong

cối mã não trong 10 phút. Tiến hành chuẩn bị các mẫu viên bằng cách ép lặp lại 5

lần mẫu của hỗn hợp vừa thu được, đem đo phổ hồng ngoại của từng mẫu này trong

vùng phổ từ 3600-3000 cm- 1

, ghi lại phổ hồng ngoại của mỗi mẫu thu được. Kết

quả thu được trình bày ở bảng 3.2



Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ lặp lại giữa các lần ép viên

Mẫu

ῡ (cm-1

) 1 2 3 4 5 RSD (%)

3222 1,4141 1,6457 1,4363 1,9174 1,4107 14,1

3340 1,8211 2,3543 2,1289 2,8675 1,9556 18,5

3342 1,8293 2,3689 2,1417 2,8898 1,9656 18,6

3400 1,8737 2,4614 2,2431 3,0176 2,0231 19,2

3435 1,7992 2,3230 2,1032 2,8425 1,9135 18,8

Nhìn vào bảng 3.2 chúng tôi nhận thấy độ hấp thụ quang thay đổi sau mỗi

lần ép viên với cùng mẫu ban đầu, do đó không thể dùng phương pháp định lượng

thông thường dựa trên mối quan hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ quang và nồng độ để

định lượng chất phân tích. Nhận thấy kỹ thuật đo hồng ngoại chỉ là một phương

pháp bán định lượng nên để xác định được chính xác hàm lượng các hoạt chất trong

mẫu chúng ta cần phải kết hợp phương pháp này với các công cụ chemometrics. Do

ưu điểm của chemometrics là trích xuất thông tin về chất theo mối quan hệ giữa

hàm lượng các chất với nhau chứ không phải theo giá trị tuyệt đối của độ hấp thụ,

nên hoàn toàn có thể sử dụng để định lượng các hoạt chất phân tích.

3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược

Do thành phần tá dược trong mỗi mẫu thuốc thay đổi theo từng nhà sản xuất

khác nhau. Vì thế, chúng tôi đã khảo sát phổ hồng ngoại của một số loại tá dược

thường được sử dụng để sản xuất các kháng sinh nhóm sulfamid như: tinh bột sắn,

magie stearate, bột talc, canxi phosphat, maltodextrin.

Tiến hành lấy lần lượt 2 mg từng tá dược trộn với 98 mg KBr, nghiền mịn

đồng nhất từng mẫu trong cối mã não trong 10 phút. Lấy khoảng 15 mg lượng bột

vừa nghiền được cho vào bộ ép viên để thu được mẫu viên của các tá dược, sau đó

đem đo phổ hồng ngoại của các mẫu này trong vùng phổ từ 7500-2800 cm- 1

, ghi lại

phổ hồng ngoại của từng mẫu. Kết quả đo được trình bày lần lượt trong các hình

dưới đây



Hình 3.5: Phổ hồng ngoại của Canxiphosphat

Hình 3.6: Phổ hồng ngoại của Tinh bột sắn

Hình 3.7: Phổ hồng ngoại của Maltodextrin

canxiphosphat

7400 7200 7000 6800 6600 6400 6200 6000 5800 5600 5400 5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

1.40

1.35

1.30

1.25

1.20

1.15

1.10

1.05

1.00

0.95

Wavenumber

Absorb

ance

tinh bot san

7400 7200 7000 6800 6600 6400 6200 6000 5800 5600 5400 5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

1.9

1.8

1.7

1.6

1.5

1.4

1.3

1.2

1.1

Wavenumber

Absorb

ance

Maltodextrin

7400 7200 7000 6800 6600 6400 6200 6000 5800 5600 5400 5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

Wavenumber

Absorb

ance



Hình 3.8: Phổ hồng ngoại của Magie Stearat

Hình 3.9: Phổ hồng ngoại của Talcum

Nhìn vào các hình trên chúng tôi nhận thấy: mẫu bột talc hấp thụ mạnh trong

vùng hồng ngoại 3750-3650 cm- 1

, mẫu bột magie stearat hấp thụ mạnh trong vùng

phổ hồng ngoại từ 2950-2800 cm- 1

, ba tá dược: tinh bột sắn, maltodextrin và

canxiphosphat đều cho phổ hấp thụ hồng ngoại hấp thụ mạnh trong vùng phổ khảo

sát từ 3600- 3000 cm- 1

. Do đó không thể xác định riêng rẽ các hoạt chất khi có mặt

của ba loại tá dược trên. Ảnh hưởng của các tá dược trong vùng khảo sát sẽ được

loại trừ bằng cách phân tích đồng thời cả tá dược và hoạt chất trong mẫu sử dụng

thuật toán hồi qui đa biến.

mau bot magie stearat

7400 7200 7000 6800 6600 6400 6200 6000 5800 5600 5400 5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

3.2

3.0

2.8

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

Wavenumber

Absorb

ance

mau bot Talcum

7400 7200 7000 6800 6600 6400 6200 6000 5800 5600 5400 5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

1.25

1.20

1.15

1.10

1.05

1.00

0.95

0.90

0.85

Wavenumber

Absorb

ance



3.2. Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính xác định riêng từng hoạt chất

nhóm sulfamid khi có mặt các tá dược

3.2.1. Xây dựng mô hình hồi quy đa biến gồm hoạt chất sulfaguanidin và các

tá dược

Mô hình phương trình đường chuẩn xác định hoạt chất sulfaguanidin và các

tá dược dựa trên các thuật toán bình phương tối thiểu sử dụng phổ toàn phần. Ma

trận nồng độ mẫu chuẩn có kích thước (25x4) được xây dựng dựa trên nồng độ của

25 mẫu chuẩn chứa đồng thời sulfaguanidin và 3 tá dược thường sử dụng trong

thành phần viên thuốc là tinh bột sắn, maltodextrin và canxiphosphat trong vùng số

sóng đã lựa chọn.

Tiến hành chuẩn bị 25 mẫu chuẩn chứa hỗn hợp gồm sulfaguanidin cùng với

ba tá dược là tinh bột sắn, maltodextrin và Ca3(PO4)2 theo như quy trình phân tích

trong mục 2.2. Đo phổ hấp thụ hồng ngoại của các mẫu này trong vùng phổ từ

3600-3000 cm-1

với 312 số sóng, ghi lại độ hấp thụ quang của từng mẫu. Lưu lại kết

quả dưới dạng ma trận tín hiệu đo có kích thước (25x312) và chuyển dữ liệu vào

phần mềm Matlab để tính toán kết quả.



Bảng 3.3: Ma trận hàm lượng bốn cấu tử SFT, Tbot, Malt, Ca3(PO4)2 trong hỗn hợp

Mẫu SFG (mg) Tá dược (mg)

Tbot Ca3(PO4)2 Malt Ʃ tá dược

1 8,1 57,1 10,8 11,5 79,4

2 10,9 56,7 11,2 10,2 78,1

3 18,1 53,2 18,7 16,1 88,0

4 17,5 57,3 14,0 10,0 81,3

5 22,2 52,5 17,8 21,6 91,9

6 23,7 53,2 10,0 12,2 75,4

7 25,1 50,7 14,4 10,0 75,1

8 25,8 45,9 14,3 14,5 74,7

9 23,5 40,2 15,5 19,2 74,9

10 19,8 59,9 5,2 10,0 75,1

11 37,5 40,6 10,3 17,2 68,1

12 47,5 41,1 13,2 16,4 70,7

13 46,8 39,9 11,4 15,1 66,4

14 19,2 55,0 10,1 10,9 76,0

15 14,8 45,6 15,6 15,0 76,2

16 16,2 46,6 11,3 18,9 76,8

17 27,2 41,3 10,0 13,3 64,6

18 50,5 25,1 10,1 13,4 48,6

19 44,6 30,0 7,9 21,5 59,4

20 43,9 29,0 11,0 15,5 55,5

21 45,8 34,5 11,8 11,7 58,0

22 46,3 32,6 12,5 11,0 56,1

23 16,4 54,9 14,1 16,8 85,8

24 16,9 53,6 13,8 13,7 81,1

25 20,1 50,6 15,1 15,4 81,1



3.2.2. Đánh giá phương pháp phân tích sulfaguanidin

Xây dựng ma trận mẫu kiểm tra với hàm lượng các cấu tử biết trước nằm

trong khoảng đường chuẩn đã xây dựng để kiểm chứng tính phù hợp của các mô

hình hồi quy. Tiến hành chuẩn bị 10 mẫu kiểm tra chứa hỗn hợp gồm sulfaguanidin

cùng với ba tá dược là tinh bột sắn, maltodextrin và Ca3(PO4)2 theo như quy trình

phân tích trong mục 2.2. Đo phổ hồng ngoại của các mẫu này trong vùng phổ từ

3600-3000 cm-1

, ghi lại độ hấp thụ quang của từng mẫu. Lưu lại kết quả dưới dạng

ma trận tín hiệu đo có kích thước (10x312) và chuyển dữ liệu vào phần mềm Matlab

để tính toán kết quả. (Bộ dữ liệu tín hiệu đo ma trận chuẩn, ma trận kiểm tra xem

phụ lục 1- đĩa CD đính kèm).

Bảng 3.4: Ma trận nồng độ các mẫu tự tạo chứa SFG, Tbot, Ca3(PO4)2 và Malt để

đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy

Mẫu SFG (mg) Tá dược (mg)

Tbot Ca3(PO4)2 Malt Ʃ tá dược

1 37,7 42,0 11,5 14,1 67,6

2 39,0 32,9 10,9 12,4 56,2

3 33,2 29,9 9,5 11,8 51,2

4 49,5 23,2 9,0 12,3 44,5

5 21,1 35,8 9,5 9,8 54,3

6 59,5 35,3 13,8 17,2 66,3

7 35,1 34,2 10,7 14,2 59,1

8 43,9 33,2 11,0 15,5 59,7

9 45,8 34,5 13,5 15,3 63,3

10 8,1 57,1 12,4 12,8 82,3



Kết quả kiểm chứng tính phù hợp của các mô hình CLS, ILS, PLS

Thực hiện tính toán trên phần mềm Malab như ở phần 2.4 với ba phương

pháp: bình phương tối thiểu thông thường (CLS), bình phương tối thiểu nghịch đảo

(ILS), bình phương tối thiểu từng phần (PLS). Các kết quả hàm lượng SFG, Tbot,

Ca3(PO4)2, Malt trong 10 mẫu tự tạo và sai số tương đối của mỗi phương pháp thu

được được trình bày lần lượt trong các bảng như dưới đây

Bảng 3.5: Hàm lượng SFG tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra

Mẫu

Hàm

lượng

(mg)

Hàm lượng tìm thấy (mg) Sai số tương đối (%)

CLS ILS PLS CLS ILS PLS

(x10^5)

1 37,7 45,3 63,8 23500 -20,2 -69,3 -0,6

2 39,0 45,9 62,9 8000 -17,7 -61,2 -0,2

3 33,2 35,9 50,2 -13000 -8,1 -51,1 0,4

4 49,5 53,7 72,7 13800 -8,5 -47,0 -0,3

5 21,1 23,4 34,7 -27800 -10,8 -64,2 1,3

6 59,5 61,0 63,0 60100 -2,6 -5,9 -1,0

7 35,1 38,3 51,3 -6200 -9,0 -46,3 0,2

8 43,9 50,0 53,8 26200 -14,0 -22,5 -0,6

9 45,8 52,7 56,3 33800 -15,1 -22,9 -0,7

10 8,1 7,2 13,4 -12500 11,2 -65,7 1,5



Bảng 3.6: Hàm lượng Tbot tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra

Mẫu

Hàm

lượng

(mg)



(x10^5)

1 42,0 40,3 102,1 -69300 4,0 -143,1 1,7

2 32,9 30,1 95,6 -23400 8,5 -190,5 0,7

3 29,9 29,7 70,6 38600 0,5 -136,3 -1,3

4 23,2 31,1 105,4 -40500 -34,0 -354,2 1,7

5 35,8 34,1 69,8 82300 4,9 -95,0 -2,3

6 35,3 54,5 80,3 -177300 -54,5 -127,4 5,0

7 34,2 27,0 62,4 18400 21,1 -82,4 -0,5

8 33,2 37,4 73,2 -77200 -12,8 -120,5 2,3

9 34,5 37,6 81,0 -99600 -8,8 -134,7 2,9

10 57,1 61,9 87,2 37100 -8,4 -52,6 -0,6

Bảng 3.7: Hàm lượng Ca3(PO4)2 tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra

Mẫu

Hàm

lượng

(mg)



(x10^6)

1 11,5 21,7 28,7 175100 -88,3 -149,4 -1,5

2 10,9 25,1 24,1 59000 -130,1 -120,9 -0,5

3 9,5 13,8 21,9 -97400 -45,7 -130,1 1,0

4 9,0 3,3 18,8 102300 63,5 -109,3 -1,1

5 9,5 25,6 25,4 -207500 -169,1 -167,1 2,2

6 13,8 -22,2 26,2 447400 261,1 -89,9 -3,2

7 10,7 13,3 17,4 -46300 -24,7 -63,0 0,4

8 11,0 8,9 24,0 194800 19,2 -117,7 -1,8

9 13,5 15,0 25,4 251500 -11,0 -88,2 -1,9

10 12,4 6,9 19,5 -93400 44,0 -57,6 0,8



Bảng 3.8: Hàm lượng Malt tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra

Mẫu

Hàm

lượng

(mg)



(x10^5)

1 14,1 20,5 33,0 137400 -45,5 -133,9 -9,7

2 12,4 21,3 32,8 46300 -71,4 -164,3 -3,7

3 11,8 14,4 25,9 -76400 -22,0 -119,4 6,5

4 12,3 3,8 31,5 80300 69,1 -156,2 -6,5

5 9,8 16,8 37,2 -162900 -71,6 -279,8 16,6

6 17,2 -7,9 33,6 351100 146,0 -95,5 -20,4

7 14,2 24,0 33,6 -36400 -68,7 -136,3 2,6

8 15,5 16,4 31,8 152900 -5,9 -105,0 -9,9

9 15,3 21,6 28,8 197300 -41,3 -88,3 -12,9

10 12,8 9,9 22,4 137400 22,5 -74,8 5,7

Từ kết quả tính được chúng tôi nhận thấy, sai số của các phương pháp (tính

theo giá trị tuyệt đối) dao động trong khoảng lần lượt là:

- Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (CLS): từ 5,9 - 146,0%

- Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS): từ 74,8- 279,8%

- Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS): từ (2,6 - 20,4)x10^5.

Mô hình CLS, ILS và PLS đều có sai số lớn ở một số mẫu có thể giải thích

như sau:

Sai số của mô hình CLS là do mô hình này tính toán trên cơ sở tập số liêu

thô ban đầu, kết quả tính cuối cùng là kết quả tính trung bình trên toàn phổ phụ

thuộc vào giá trị tuyệt đối của độ hấp thụ A mà giá trị này lại thay đổi theo từng

phép đo và bị ảnh hưởng rất lớn của nền mẫu ngay cả KBr.

Trong phương pháp ILS, sai số lớn do chỉ sử dụng một số giá trị độ hấp thụ

tại một số số sóng đặc trưng do đó nếu các số sóng lựa chọn không phù hợp thì sẽ

gây ra nguồn sai số lớn.



Mô hình PLS không phụ thuộc vào tập số liệu thô đưa vào mà phụ thuộc vào

các mô hình trung gian lựa chọn. Tuy nhiên khi áp dụng mô hình này lại có sai số

rất lớn, điều này có thể giải thích là do về cơ bản mô hình này giống với mô hình

ILS chỉ sử dụng một số giá trị số sóng không đặc trưng nên mô hình trung gian tìm

được chưa phù hợp với hệ 4 cấu tử.

Tóm lại, từ kết quả thu được từ các mẫu kiểm tra, chứng minh cả ba phương

pháp CLS, ILS và PLS đều mắc sai số rất lớn (đặc biệt là PLS). Do đó không thể sử

dụng được các thuật toán này để phân tích đồng thời sulfaguanidin và ba tá dược.

Kết quả kiểm chứng tính phù hợp của các mô hình PCR

Phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR) là phương pháp bình phương tối

thiểu nghịch đảo trên tập dữ liệu mới thu được trong phép chiếu tập dữ liệu lên các

vectơ đơn vị của không gian mới dựa trên các thành phần chính (PC – principal

components).

- Trước tiên, chúng tôi phân tích cấu tử chính chuyển sang tập dữ liệu mới,

chứa một số ít các yếu tố quan trọng, cần thiết. Tiến hành chuyển toàn bộ dữ liệu

ma trận tín hiệu của độ hấp thụ quang của 25 mẫu chuẩn vào phần mềm minitab 16,

thực hiện kỹ thuật PCA chúng tôi thu được kết quả như dưới đây

403020100-10-20-30

5

4

3

2

1

0

-1

-2

-3

-4

First Component

Se

co

nd

C

om

po

ne

nt

Score Plot of C1, ..., C312

0.060.050.040.030.020.010.00

0.10

0.05

0.00

-0.05

-0.10

First Component

Se

co

nd

C

om

po

ne

nt

C312C311C310C309C308C307C306C305C304C303C302C301C300C299C298C297C296C295C294C293C292C291C290C289C288C287C286C285C284C283C282C281C280C279C278C277C276C275C274C273C272C271C270C269C268C267C266C265C264C263C262C261C260C259C258C257C256C255C254C253C252C251C250C249C248C247C246C245C244C243C242C241C240C239C238C237C236C235C234C233C232C231C230C229C228C227C226C225C224C223C222C221C220C219C218C217C216C215C214C213C212C211C210C209C208C207C206C205C204C203C202C201C200C199C198C197C196C195C194C193C192C191C190C189C188C187C186C185C184C183C182C181C180C179C178C177C176C175C174C173C172C171C170C169C168C167C166C165C164C163C162C161C160C159C158C157C156C155C154C153C152C151C150C149C148C147C146C145C144C143C142C141C140C139C138C137C136C135C134C133C132C131C130C129C128C127C126C125C124C123C122C121C120C119C118C117C116C115C114C113C112C111C110C109C108C107C106C105C104C103C102C101C100C99C98C97C96C95C94C93C92C91C90C89C88C87C86C85C84C83C82C81C80C79C78C77C76C75C74C73C72C71C70C69C68C67C66C65C64C63C62C61C60C59C58C57C56C55C54C53C52C51C50C49C48C47C46C45C44C43C42C41C40C39C38C37C36C35C34C33C32C31C30C29C28C27C26C25C24C23C22C21C20C19C18C17C16C15C14C13C12C11C10C9C8C7C6C5C4C3C2C1

Loading Plot of C1, ..., C312


chuẩn



Principal Component Analysis: C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11……. Eigenanalysis of the Correlation Matrix

Eigenvalue 305.36 4.95 1.59 0.08 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00

Proportion 0.979 0.016 0.005 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

Cumulative 0.979 0.995 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

Eigenvalue 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

Proportion 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

Cumulative 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

Eigenvalue 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

Proportion 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

Cumulative 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

Về nguyên tắc khi dùng PCA từ ma trận tín hiệu độ hấp thụ (25x312) sẽ thu

được 312 cấu tử (PC) nhưng kết quả chạy trên minitab cho thấy cấu tử 1 (PC1) đã

chiếm 97,9% lượng thông tin của tập dữ liệu, nếu thêm cấu tử thứ hai (PC2) thì

phương sai tích lũy đã đạt 99,5%. Khi thêm một cấu tử nữa (PC3) thì 3 cấu tử đầu

này đã chiếm 100% lượng thông tin tập dữ liệu. Từ cấu tử thứ 4 trở đi lượng thông

tin thu được không thay đổi. Do đó có thể kết luận 3 cấu tử ban đầu có ảnh hưởng

chính tới các thông tin chứa trong tập số liệu, vì vậy chúng tôi lựa chọn số cấu tử

chính là 3 để làm cơ sở tính toán cho không gian mới của tập số liệu.

Sau khi lựa chọn được số cấu tử chính phù hợp chúng tôi tiến hành nhập các

ma trận nồng độ, ma trận tín hiệu của các mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra vào trong phần

mềm matlab sử dụng các bước tính toán trong PCR để phân tích tập dữ liệu mới

này. Kết quả hàm lượng các mẫu đối chứng và sai số tương đối của phương pháp

PCR được trình bày trong bảng 3.9.



Bảng 3.9: Hàm lượng SFG và ba tá dược tìm được trong hỗn hợp các mẫu kiểm tra

Mẫu Hàm lượng tìm thấy (mg) Sai số tương đối (%)

SFG Tbot Ca3(PO4)2 Malt SFG Tbot Ca3(PO4)2 Malt

1 41,2 40,3 12,4 15,2 -9,3 4,0 -7,7 -8,0

2 40,8 31,7 10,5 13,1 -4,7 3,7 3,4 -5,7

3 32,9 29,2 9,2 11,7 0,9 2,3 3,0 1,2

4 50,6 23,5 9,6 13,0 -2,1 -1,3 -6,8 -5,5

5 20,4 35,0 9,5 9,8 3,4 2,2 -0,5 0,2

6 61,3 38,0 13,5 18,9 -3,0 -7,6 2,1 -10,1

7 34,8 31,6 9,6 14,0 1,0 7,5 9,8 1,5

8 46,8 35,7 11,7 16,1 -6,5 -7,5 -6,5 -3,9

9 48,5 38,0 12,4 16,9 -5,9 -10,2 8,4 -10,5

10 9,1 57,8 13,3 13,8 -11,9 -1,2 -7,0 -7,9

Từ kết quả ở trên chúng tôi nhận thấy mô hình PCR thu được cho kết quả tốt

hơn rất nhiều so với các phương pháp hồi quy đa biến đã sử dụng. Tất cả các kết

quả đều nằm trong giới hạn cho phép của phương pháp. Điều này có thể được giải

thích bởi phương pháp này có có một số ưu điểm sau:

So với ILS, phương pháp PCR hội tụ đầy đủ các ưu điểm của phương

pháp ILS đồng thời lại khắc phục được các nhược điểm của phương pháp

này, do PCR tiến hành tính toán trực tiếp trên toàn phổ.

Phương pháp PCR cho phép loại bỏ sai số nhiễu phổ và sai số ngẫu nhiên

trong quá trình đo khi lựa chọn được số PC phù hợp.

Đối với trường hợp sử dụng phổ toàn phần, khi dùng các phương pháp

khác như CLS, kết quả tính cuối cùng là kết quả tính trung bình trên toàn

phổ nên kém chính xác hơn trường hợp dùng phổ chọn lọc. Khi sử dụng

mô hình PCR, tuy kết quả vẫn tính trên tất cả các điểm nhưng đóng góp

của các điểm đo sẽ khác nhau tùy theo lượng đóng góp của từng điểm này

vào các PC được chọn mà lượng đóng góp này lại được phân tích dựa trên

tín hiệu đo tại từng điểm của các mẫu chuẩn. Do có sự phân biệt và chọn



lọc trong đánh giá mỗi điểm đo nên kết quả thu được sẽ chính xác hơn

phương pháp tính trung bình trên toàn phổ ở các phương pháp phổ toàn

phần khác.

Tóm lại từ những kết quả trên chúng tôi nhận thấy chỉ có thể áp dụng

phương pháp PCR để xác định đồng thời các cấu tử SFG, Tbot, Ca3(PO4)2 và Malt

trong cùng hỗn hợp mà không cần tách loại chúng ra khỏi nhau. Do đó, chúng tôi đã

lựa chọn phương pháp hồi quy cấu tử chính PCR cho các nghiên cứu tiếp theo.

Trong quá trình thực tế khi phân tích các mẫu dược phẩm chúng ta chỉ quan

tâm nhiều đến hàm lượng các hoạt chất đưa vào có đúng và đủ hàm lượng như nhà

sản xuất công bố trên thị trường hay không. Do đó, khi lập ma trận nồng độ có thể

gộp các thành phần tá dược vào một cột để quá trình tính toán không quá cồng

kềnh. Kết quả số liệu thu được sau khi gộp các thành phần tá dược lại được chúng

tôi trình bày lần lượt trong các bảng 3.10 như dưới đây.

Bảng 3.10: Hàm lượng SFG và tổng tá dược tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm

tra theo phương pháp PCR


SFG ƩTá dược SFG ƩTá dược

1 41,2 67,9 -9,3 -0,5

2 40,8 55,3 -4,7 1,6

3 32,9 50,1 0,9 2,2

4 50,6 46,1 -2,1 -3,6

5 20,4 54,3 3,4 1,4

6 61,3 70,4 -3,0 -6,2

7 34,8 55,3 1,0 6,5

8 46,8 63,5 -6,5 -6,4

9 48,5 67,3 -5,9 -6,3

10 9,1 84,9 -11,9 -3,1



Từ kết quả thu được ở trên chúng tôi nhận thấy khi gộp các thành phần tá dược

vào một cột kết quả Sulfaguanidin thu được không khác với kết quả ban đầu, trong

khi đó sai số của thành phần tá dược gộp lại sai khác không đáng kể so với nồng độ

ban đầu. Do đó hoàn toàn có thể gộp các thành phần tá dược vào thành một cột để

kết quả thu được không quá phức tạp.

3.3. Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính PCR xác định đồng thời

sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim

3.3.1. Xây dựng phương trình đường chuẩn đa biến xác định sulfaguanidin,

sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phương pháp PCR

Xây dựng phương trình đường chuẩn xác định đồng thời ba hoạt chất

sulfaguanidin, sulfamethoxazol, trimethoprim và tổng hàm lượng tá dược dựa trên

thuật toán bình phương tối thiểu sử dụng phổ toàn phần PCR. Ma trận nồng độ mẫu

chuẩn có kích thước (30x4) được xây dựng dựa trên nồng độ của 30 mẫu chuẩn

chứa đồng thời sulfaguanidin, sulfamethoxazol, trimethoprim và tổng ba tá dược:

tinh bột sắn, maltodextrin và canxi phosphat trong vùng số sóng đã lựa chọn.

Tiến hành chuẩn bị 30 mẫu chuẩn chứa hỗn hợp gồm sulfaguanidin cùng với

ba tá dược là tinh bột sắn, maltodextrin và Ca3(PO4)2 theo như quy trình phân tích

trong mục 2.2. Đo phổ hồng ngoại của các mẫu này trong vùng phổ từ 3600-3000

cm-1

, ghi lại độ hấp thụ quang của từng mẫu. Lưu lại kết quả dưới dạng ma trận tín

hiệu đo có kích thước (30x312) và chuyển dữ liệu vào phần mềm minitab 16 (để lựa

chọn số cấu tử chính), matlab để tính toán kết quả theo mục 2.4.4.



Bảng 3.11: Ma trận chuẩn hàm lượng bốn cấu tử SFG, SFM, TMP và tá dược trong

hỗn hợp

STT SFG

(mg)

SFM

(mg)

TMP

(mg)

Tá dược (mg)

Tbot Malt Ca3(PO4)2 Ʃ Tá dược

1 13,0 40,0 7,8 10,1 9,3 20,1 39,5

2 15,2 37,0 10,7 9,2 5,0 25,5 39,7

3 15,9 35,1 10,4 12,4 11,6 10,8 34,8

4 17,6 32,9 11,0 10,4 6,0 22,5 38,9

5 18,4 30,7 5,0 4,3 4,6 34,9 43,8

6 18,8 31,8 4,9 4,7 5,2 34,5 44,4

7 20,4 31,4 11,9 4,7 5,7 26,9 37,3

8 20,1 32,2 10,0 4,4 7,2 29,8 41,4

9 22,2 36,0 5,5 5,3 10,1 24,0 39,4

10 23,9 35,6 5,8 5,4 12,3 20,8 38,5

11 24,7 28,6 10,5 4,2 10,7 24,1 39,0

12 26,1 25,3 9,4 9,0 13,3 15,5 37,8

13 25,0 25,9 9,8 10,1 14,3 14,6 39,0

14 28,5 24,3 10,0 9,6 11,5 20,5 41,6

15 27,5 21,7 10,1 14,4 15,7 10,3 40,4

16 29,4 20,6 10,7 14,8 10,1 15,9 40,8

17 29,7 16,2 15,6 9,0 8,3 11,0 28,3

18 30,1 13,5 14,4 10,6 12,4 21,6 44,6

19 30,2 13,4 19,0 8,5 11,0 20,3 39,8

20 31,0 10,2 18,6 9,6 11,1 19,8 40,5

21 30,2 10,8 204,0 9,3 8,8 25,0 43,1

22 0,0 39,7 8,7 12,8 12,5 23,5 48,8

23 0,0 40,4 8,4 5,2 11,2 37,8 54,2

24 0,0 39,6 8,8 9,2 11,6 30,3 51,1

25 28,6 0,0 12,0 12,4 10,6 41,8 64,8

26 41,6 0,0 9,5 10,6 15,1 26,6 52,3

27 13,9 40,2 0,0 11,6 11,0 30,8 53,4

28 22,5 28,5 7,4 10,0 12,9 22,1 45,0



29 45,8 0,0 0,0 34,5 11,8 11,7 58,0

30 46,3 0,0 0,0 32,6 12,5 11,0 56,1

- Kết quả phân tích tìm số cấu tử chính trên phần mềm minitab thu được kết

quả như dưới đây

50403020100-10-20-30

7.5

5.0

2.5

0.0

-2.5

-5.0

First Component

Se

co

nd

C

om

po

ne

nt

Score Plot of C1, ..., C312

0.060.050.040.030.020.010.00

0.10

0.05

0.00

-0.05

-0.10

First Component

Se

co

nd

C

om

po

ne

nt

C312C311C310C309C308C307C306C305C304C303C302C301C300C299C298C297C296C295C294C293C292C291C290C289C288C287C286C285C284C283C282C281C280C279C278C277C276C275C274C273C272C271C270C269C268C267C266C265C264C263C262C261C260C259C258C257C256C255C254C253C252C251C250C249C248C247C246C245C244C243C242C241C240C239C238C237C236C235C234C233C232C231C230C229C228C227C226C225C224C223C222C221C220C219C218C217C216C215C214C213C212C211C210C209C208C207C206C205C204C203C202

C201

C200

C199

C198

C197C196

C195

C194C193C192C191C190C189C188C187C186C185C184C183C182C181C180C179C178C177C176C175C174C173C172C171C170C169C168C167C166C165C164C163C162C161C160

C159

C158

C157C156C155C154C153C152C151C150C149C148C147C146C145C144C143C142C141C140C139C138C137C136C135C134C133C132C131C130C129C128C127C126C125C124C123C122C121C120C119C118C117C116C115C114C113C112C111C110C109C108C107C106C105C104C103C102C101C100C99C98C97C96C95C94C93C92C91C90C89C88C87C86C85C84C83C82C81C80C79C78C77C76C75C74C73C72C71C70C69C68C67C66C65C64C63C62C61C60C59C58C57C56C55C54C53C52C51C50C49C48C47C46C45C44C43C42C41C40C39C38C37C36C35C34C33C32C31C30C29C28C27C26C25C24C23C22C21C20C19C18C17C16C15C14C13C12C11C10C9C8C7C6C5C4C3C2C1

Loading Plot of C1, ..., C312


chuẩn

Principal Component Analysis: C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12 Eigenanalysis of the Correlation Matrix

Eigenvalue 300.89 7.22 2.68 1.04 0.11 0.03 0.02 0.01 0.00

Proportion 0.964 0.023 0.009 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

Cumulative 0.964 0.988 0.996 0.999 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

Eigenvalue 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

Proportion 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

Cumulative 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

Eigenvalue 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

Proportion 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

Cumulative 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000



Từ kết quả tính toán trên phần mềm minitab chúng tôi nhận thấy cấu tử 1

(PC1) đã chiếm 96,4% lượng thông tin của tập dữ liệu, nếu thêm cấu tử thứ hai

(PC2) thì phương sai tích lũy đã đạt 98,8%. Khi thêm một cấu tử nữa (PC3) thì 3

cấu tử đầu này đã chiếm 99,6% lượng thông tin tập dữ liệu. Từ cấu tử thứ 4 trở đi

lượng thông tin thu được thay đổi không đáng kể. Do đó có thể kết luận 3 cấu tử

ban đầu có ảnh hưởng chính tới các thông tin chứa trong tập số liệu, vì vậy chúng

tôi lựa chọn số cấu tử chính là 3 để làm cơ sở tính toán cho không gian mới của tập

số liệu.

3.3.2. Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy đa biến

Xây dựng ma trận mẫu kiểm tra với hàm lượng các cấu tử biết trước nằm

trong khoảng đường chuẩn đã xây dựng để kiểm chứng tính phù hợp của mô hình

hồi quy. Tiến hành chuẩn bị 15 mẫu chuẩn chứa hỗn hợp gồm sulfaguanidin,

sulfamethoxazol, trimethoprim cùng với các tá dược là tinh bột sắn, maltodextrin và

Ca3(PO4)2 với nồng độ biết trước nằm trong dãy đường chuẩn theo như quy trình

phân tích như trong mục 2.2. Đo phổ hồng ngoại của các mẫu này trong vùng phổ

từ 3600-3000 cm-1

, ghi lại độ hấp thụ quang của từng mẫu. Lưu lại kết quả dưới

dạng ma trận tín hiệu đo có kích thước (15x312) và chuyển dữ liệu vào phần mềm

Matlab để tính toán kết quả. (Bộ dữ liệu tín hiệu đo ma trận chuẩn, ma trận kiểm tra

xem phụ lục 2- đĩa CD đính kèm).



Bảng 3.12: Ma trận nồng độ các mẫu tự tạo chứa SFG, SFM, TMP và tá dược để

đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy

STT SFG

(mg)

SFM

(mg)

TMP

(mg)

Tá dược (mg)

Tbot Malt Ca3(PO4)2 Ʃ Tá dược

1 22,5 28,5 15,3 10,6 12,9 25,3 48,8

2 11,3 30,1 10,6 7,0 9,2 21,3 37,5

3 10,0 35,2 11,5 6,5 9,4 22,1 38,0

4 10,8 32,6 10,0 5,5 7,5 20,5 33,5

5 15,3 45,3 15,2 8,2 12,3 27,1 47,6

6 7,1 38,0 13,8 7,1 10,0 30,3 47,4

7 6,5 34,1 12,9 6,0 9,5 25,4 40,9

8 11,6 30,1 11,8 7,9 9,9 24,8 42,6

9 8,2 37,5 13,2 6,8 11,2 28,1 46,1

10 31,8 12,0 16,5 14,2 12,0 21,0 47,2

11 12,6 25,1 12,4 8,3 7,8 21,1 37,2

12 22,6 13,8 12,5 10,0 10,0 19,6 39,6

13 41,8 4,0 13,5 16,9 12,4 15,2 44,5

14 12,6 31,5 12,9 6,8 10,5 26,3 43,6

15 22,5 28,8 16,9 10,5 12,9 25,2 48,6

Từ kết quả khảo sát ở phần 3.3.2 chúng tôi tiến hành thực hiện tính toán trên

phần mềm Malab như ở phần 2.4.4 - phương pháp hồi quy cấu tử chính (PCR) với

số cấu tử chính lựa chọn là 3. Các kết quả nồng độ SFG, SFM, TMP và tổng các tá

dược trong 15 mẫu tự tạo và sai số tương đối của mỗi mẫu được trình bày trong

bảng 3.13



Bảng 3.13: Hàm lượng SFT, SFM, TMP và tổng tá dược tìm được trong các hỗn

hợp mẫu kiểm tra theo phương pháp PCR


SFG SFM TMP ƩTá

dược SFG SFM TMP

ƩTá

dược

1 23,3 27,6 16,1 49,4 -3,5 3,3 -5,2 -1,3

2 12,2 29,3 11,0 35,5 -8,0 2,8 -3,8 5,4

3 10,0 34,7 11,9 38,6 -0,5 1,3 -3,3 -1,6

4 10,3 33,4 9,5 32,1 4,9 -2,5 5,4 4,2

5 16,5 46,2 14,3 47,9 -7,9 -2,0 5,7 -0,6

6 6,9 40,6 14,3 45,6 2,4 -6,8 -3,4 3,7

7 5,7 33,0 12,0 38,1 11,7 3,4 7,1 6,9

8 12,2 28,7 12,8 39,9 -4,8 4,7 -8,2 6,3

9 8,9 36,8 14,0 44,5 -8,8 1,8 -6,3 3,5

10 33,9 11,1 15,9 46,9 -6,7 7,4 3,5 0,7

11 13,7 24,3 11,8 36,8 -8,7 3,4 4,7 1,2

12 22,0 14,7 12,7 37,9 2,8 -6,7 -1,3 4,3

13 40,4 3,4 14,8 43,2 3,4 14,7 -9,9 3,0

14 11,9 30,7 13,4 42,0 5,8 2,4 -4,0 3,7

15 23,3 27,6 16,1 49,4 -3,5 4,3 4,8 -1,7

Từ kết quả thu được ở trên chúng tôi nhận thấy phương pháp hồi quy đa biến

sử dụng mô hình hồi quy cấu tử chính cho kết quả tương đối tốt. Nồng độ SFG,

SFM, TMP tính được sai khác không đáng kể so với nồng độ đã pha (sai số tương

đối tính theo phương pháp này đều thuộc khoảng sai số cho phép, trừ một số thí

nghiệm có chứa chất phân tích ở hàm lượng rất nhỏ). Do đó hoàn toàn có thể áp

dụng phương pháp này để xác định đồng thời các hoạt chất trên trong cùng một hỗn

hợp mà không cần tách loại.



3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp hồi

quy cấu tử chính xác định đồng thời SFG, SFM, TMP và tá dược

Việc xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là

công đoạn đánh giá vô cùng quan trọng và cần thiết để xác định khả năng ứng dụng

của phương pháp hồi quy đa biến.

- Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ

thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay

tín hiệu nền [9]. Theo đó nếu tính giới hạn phát hiện dựa trên tỷ số tín hiệu/nhiễu

(S/N) thì LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3

lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3

- Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) được định nghĩa là nồng độ

chất phân tích nhỏ nhất mà phép phân tích vẫn định lượng được chính xác với độ tin

cậy 95%. Theo lý thuyết thống kê thì giới hạn định lượng là nồng độ chất phân tích

có tín hiệu phân tích gấp 10 lần tín hiệu nhiễu của đường nền. [9]

Từ nền tảng lý thuyết ở trên, chúng tôi đã đưa tiến hành đo lặp lại 5 lần phổ

đường nền của mẫu phân tích, từ đó thu được ma trận tín hiệu độ hấp thụ của 5 mẫu

đường nền, tính độ lệch chuẩn của các tín hiệu này ta thu được ma trận Z có kích

thước (1x312). Khi đó giá trị LOD, LOQ sẽ được tính toán theo công thức như dưới

đây:

(3 )LOD Z Fj

(10 )LOQ Z Fj

Trong đó:

Z: Là ma trận độ lệch chuẩn tín hiệu của các mẫu trắng

Fj: là ma trận hệ số hồi quy của phương trình hồi quy đa biến theo phương

pháp PCR.

(Các ma trận Z, Fj được trình bày trong phụ lục 2 - đĩa CD đính kèm).



Bảng 3.14: Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định đồng

thời SFG, SFM, TMP và tá dược

Tên LOD (µg/viên ép) LOQ (µg/viên ép)

SFG 5,9 19,7

SFM 10,4 34,5

TMP 14,2 47,5

Tá dược 39,5 13,2

3.4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế

Chúng tôi đã tiến hành lấy một số mẫu thuốc thực tế trên thị trường của các

nhà sản xuất khác nhau như trong bảng 3.24 để tiến hành nghiên cứu đánh giá hiệu

suất thu hồi của phương pháp quang phổ hồng ngoại gần kết hợp với thuật toán hồi

quy đa biến. Kết quả thu được từ phương pháp này được đối chứng với phương

pháp phân tích tiêu chuẩn trong dược điển.

Bảng 3.15: Mẫu thực tế

Mã

hóa Tên mẫu Nhà sản xuất

Lô sản

xuất

Hạn sử

dụng

S1 Sulfaganin

500 CTCP Hóa - Dược phẩm Mekophar 12008AN 10/07/16

S2 Sulfaguanidin

500 mg CTCP Dược phẩm TW1 - Pharbaco 14004 03/06/17

S3 Sulfaguanidin

500 mg CTCP Dược phẩm Hà Tây 711012 18/10/15

S4 Sulfaguanidin

500 mg CTCP Dược phẩm TW2- Dopharma 00113 22/07/16

ST1 Trimesepton CTCP Dược phẩm Hà Tây 281014 13/10/17

ST2 Vamidol 480 Công ty cổ phần SPM 1402003 21/02/17

ST3 Biseptol

SX nhượng quyền của:

Pharmaceutical Works Polfa-

Pabanice, Poland tại công ty cổ

phần SPM

1401003 17/01/17

ST4 Trimezola CTCP Dược phẩm TW2- Dopharma 00113 11/11/16



3.4.1. Phương pháp xác định một số hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm

Sulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần và trung bình

3.4.1.1. Định tính mẫu thực tế

Định tính mẫu phân tích là một trong những khâu đầu tiên và vô cùng quan

trọng trong quá trình phân tích mẫu thực tế ngoài hiện trường bằng phương pháp

phổ hồng ngoại. Dữ liệu phổ mà quá trình định tính đưa ra chứng minh mẫu phân

tích có hay không chứa hoạt chất cần xác định [10]. Do đó trước khi tiến hành định

lượng các hoạt chất sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim trong các mẫu

thực tế phải tiến hành định tính các mẫu này.

Trên cơ sở dữ liệu quét phổ của ba chất chuẩn sulfaguanidin,

sulfamethoxazol và trimethoprim trong vùng phổ từ 7500-2800 cm-1

chúng tôi đã

thu được các dự liệu phổ chuẩn của ba hoạt chất lần lượt như các hình dưới đây

Hình 3.12: Phổ hồng ngoại của Sulfaguanidin

Hình 3.13: Phổ hồng ngoại của Sulfamethoxazol

3399.981 10.3513339.877 29.497

3221.336 12.793

sulfaguanidin chuan

7400 7200 7000 6800 6600 6400 6200 6000 5800 5600 5400 5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

Wavenumber

Absorb

ance

3471.074 71.641

3318.761 39.419

3157.269 9.682

3127.010 44.807

2932.061 13.722

2834.709 8.736

sulfamethoxazol chuan

7400 7200 7000 6800 6600 6400 6200 6000 5800 5600 5400 5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600

8.0

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

Wavenumber

Absorb

ance



Hình 3.14: Phổ hồng ngoại của Trimethoprim

Trên cơ sở các dữ liệu phổ này tiến hành xây dựng thư viện phổ chuẩn

mẫu tự tạo của ba hoạt chất này lưu kết quả thu được vào thư viện phổ tự tạo nhóm

Sulfamid. Tiến hành định tính các mẫu bằng cách so sánh dữ liệu phổ đo được với

các dữ liệu trong thư viện phổ tự tạo nhóm Sulfamid và thư viện phổ tham chiếu

ST- Japan spectral libraries. Khi định tính mẫu tự tạo (gồm sulfaguanidin và 3 tá

dược) – mẫu số 1 trong mục 3.2.2 chúng tôi đã thu được kết quả như hình dưới đây.

Hình 3.15: Kết quả định tính mẫu tự tạo

Từ kết quả thu được chúng tôi nhận thấy phổ hồng ngoại của mẫu tự tạo phù

hợp với phổ hồng ngoại của Sulfaguanidin chuẩn trong hai thư viện tự tạo và thư

3469.601 53.216

3318.080 27.823

3118.465 147.776

3013.759 2.868

2931.384 10.111

2834.314 6.099

Trimethoprim chuan

7400 7200 7000 6800 6600 6400 6200 6000 5800 5600 5400 5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

4.0

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

Wavenumber

Absorb

ance

Mau tu tao

3950 3900 3850 3800 3750 3700 3650 3600 3550 3500 3450 3400 3350 3300 3250 3200 3150 3100 3050 3000 2950 2900 2850 2800

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

Wavenumber

Absorb

ance



viên tham chiếu. Do đó hoàn toàn có thể kết luận được mẫu tự tạo có chứa hoạt chất

sulfaguanidin. Tiếp tục định tính các mẫu thực tế đã lựa chọn chúng tôi đã thu được

các kết quả lần lượt như sau:

Hình 3.16: Kết quả định tính mẫu thực tế S1


T1

3950 3900 3850 3800 3750 3700 3650 3600 3550 3500 3450 3400 3350 3300 3250 3200 3150 3100 3050 3000 2950 2900 2850 2800

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

Wavenumber

Absorb

ance

T2

3950 3900 3850 3800 3750 3700 3650 3600 3550 3500 3450 3400 3350 3300 3250 3200 3150 3100 3050 3000 2950 2900 2850 2800

1.9

1.8

1.7

1.6

1.5

1.4

1.3

1.2

1.1

1.0

0.9

0.8

Wavenumber

Absorb

ance





T3

3950 3900 3850 3800 3750 3700 3650 3600 3550 3500 3450 3400 3350 3300 3250 3200 3150 3100 3050 3000 2950 2900 2850 2800

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

Wavenumber

Absorb

ance

T4

3950 3900 3850 3800 3750 3700 3650 3600 3550 3500 3450 3400 3350 3300 3250 3200 3150 3100 3050 3000 2950 2900 2850 2800

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

Wavenumber

Absorb

ance



Hình 3.20: Kết quả định tính mẫu thực tế ST1


T5

3950 3900 3850 3800 3750 3700 3650 3600 3550 3500 3450 3400 3350 3300 3250 3200 3150 3100 3050 3000 2950 2900 2850 2800

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

Wavenumber

Absorb

ance

T6

3950 3900 3850 3800 3750 3700 3650 3600 3550 3500 3450 3400 3350 3300 3250 3200 3150 3100 3050 3000 2950 2900 2850 2800

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

Wavenumber

Absorb

ance





T7

3950 3900 3850 3800 3750 3700 3650 3600 3550 3500 3450 3400 3350 3300 3250 3200 3150 3100 3050 3000 2950 2900 2850 2800

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

Wavenumber

Absorb

ance

T8

3950 3900 3850 3800 3750 3700 3650 3600 3550 3500 3450 3400 3350 3300 3250 3200 3150 3100 3050 3000 2950 2900 2850 2800

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

Wavenumber

Absorb

ance



Thông qua việc so sánh dữ liệu phổ với thư viện phổ tự tạo của nhóm

sulfamid và thư viện phổ tham chiếu ST- Japan spectral libraries chúng tôi nhận

thấy tất cả các mẫu thực tế phân tích đều có chứa hoạt chất theo công bố của nhà

sản xuất. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành định lượng các mẫu bằng phương pháp

quang phổ hồng ngoại gần theo quy trình phân tích đã nghiên cứu ở trên.

3.4.2. Định lượng mẫu thực tế

Tiến hành cân 20 viên thuốc, tính khối lượng trung bình viên và nghiền

thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột mẫu (mt ) và thêm một lượng tá dược là

tinh bột như trong bảng 3.16 để pha loãng hàm lượng hoạt chất trong các mẫu thực

tế về khoảng hàm lượng đã khảo sát trong đường chuẩn, tiếp đó tiến hành như quy

trình phân tích trong mục 2.2. Đo phổ hồng ngoại của các mẫu này trong vùng phổ

từ 3600-3000 cm-1

, ghi lại độ hấp thụ của từng mẫu. Lưu lại kết quả và chuyển dữ

liệu vào phần mềm Matlab, tính toán kết quả trên cơ sở sử dụng đường chuẩn (30

mẫu x bốn cấu tử) được xây dựng ở phần 3.3.1 để tính toán kết quả. (Bộ dữ liệu tín

hiệu đo ma trận mẫu thực tế xem phụ lục 2- đĩa CD đính kèm).



Bảng 3.16: Khối lượng bột viên và tá dược tinh bột trộn thêm vào các mẫu

Mẫu KLTB của một viên

(mg) STT

mbột viên(mg)

lấy phân tích

mtinh bột (mg)

thêm vào

S1 586,0

Lần 1 63,6 45,9

Lần 2 58,1 58,6

Lần 3 57,6 43,9

S2 661,4

Lần 1 57,9 53,4

Lần 2 70,3 40,5

Lần 3 60,1 46,2

S3 566,5

Lần 1 61,9 40,3

Lần 2 57,1 48,3

Lần 3 58,5 48,4

S4 597,3

Lần 1 57,8 50,1

Lần 2 61,7 43,5

Lần 3 65,0 37,3

ST1 611,0

Lần 1 63,6 32,5

Lần 2 58,1 26,9

Lần 3 57,6 23,1

ST2 636,1

Lần 1 57,9 22,0

Lần 2 70,3 26,1

Lần 3 60,1 24,6

ST3 667,1

Lần 1 61,9 36,7

Lần 2 57,1 35,3

Lần 3 58,5 33,7

ST4 609,6

Lần 1 57,8 43,5

Lần 2 61,7 33,6

Lần 3 65,0 27,3



Bảng 3.17: Hàm lượng (mg/viên) của SFG trong các mẫu thực tế

(đã tính hệ số pha loãng)

Mẫu Phương pháp hồng ngoại

(mg/viên) với n=3

Phương pháp đối chứng

(mg/viên) với n=3

Hàm lượng trên bao

bì (mg/viên)

S1 465,9±2,2 483,5±0,4 500

S2 464,1±0,8 486,1±0,3 500

S3 454,0±1,2 494,4±0,3 500

S4 460,6±0,5 490,8±0,2 500

Bảng 3.18: Hàm lượng (mg/viên) của SFM và TMP trong các mẫu thực tế

(đã tính hệ số pha loãng)

Mẫu

Hàm lượng SFM (mg/viên) với n=3 Hàm lượng TMP (mg/viên) với n=3

PP hồng

ngoại

PP đối

chứng

HLtrên

bao bì

PP hồng

ngoại

PP đối

chứng

HLtrên bao

bì

ST1 364,6±1,8 391,2±0,2 400 76,9±1,8 77,5±0,3 80

ST2 371,2±1,2 395,2±0,9 400 78,1±1,2 81,6±0,4 80

ST3 365,9±1,0 394,4±0,2 400 77,0±1,0 77,5±0,2 80

ST4 368,6±0,7 389,2±0,6 400 77,6±0,70 80,6±0,4 80

Từ các kết quả thu được chúng tôi nhận thấy hàm lượng các hoạt chất thu

được theo phương hồi quy đa biến với phương pháp phân tích tiêu chuẩn trong dược

điển sai khác không đáng kể. Độ chệch tương đối hàm lượng sulfaguanidin giữa

phương pháp hồng ngoại và phương pháp đối chứng lần lượt là: 3,6%; 4,5%; 8,2%

và 6,2 %, sulfamethoxazol lần lượt là: 6,8%; 6,1%; 7,2% và 5,3%, trimethoprim lần

lượt là: 0,8%; 4,3%; 0,6% và 3,7%. Do đó, phương pháp phổ hồng ngoại gần và

trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến tỏ ra khá ưu việt khi áp dụng vào

phân tích một số hoạt chất nhóm sulfamid. Đây là một kỹ thuật phân tích rất nhanh:



chỉ với cần một máy quang phổ hồng ngoại ta có thể đo phổ hồng ngoại chỉ trong

vòng một vài giây quá trình xử lí và chuẩn bị mẫu khá đơn giản, lượng mẫu phân

tích ít, không cần phá hủy mẫu phân tích chi phí thấp do không tốn dung môi hóa

chất (như phương pháp phân tích truyền thống HPLC), hạn chế được các sai số

trong quá trình chuẩn bị mẫu. Do đó hoàn toàn có thể áp dụng phổ biến để phân tích

nhanh hàm lượng các mẫu thuốc ngoài thị trường.



CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN

Với mục tiêu ban đầu đặt ra cho bài nghiên cứu này là đinh lượng một số

hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp quang phổ kế

hồng ngoại gần và trung bình chúng tôi đã thu được một số kết quả sau:

- Đã tiến hành khảo sát điều kiện tối ưu xác định đồng thời 3 hoạt chất

sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phương pháp phổ kế hồng

ngoại gần và trung bình: lựa chọn vùng phổ nghiên cứu trong khoảng từ 3600-3000

cm- 1

, tỷ lệ trộn mẫu/ KBr là (2:98).

- Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên: nhận thấy độ hấp thụ quang thay

đổi sau mỗi lần ép viên. Mặt khác khi nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần tá

dược đi kèm trong các loại thuốc đến tín hiệu phổ hấp thụ hồng ngoại dựa trên cở

sở của 5 loại tá dược thường được sử dụng để sản xuất sulfamid là: tinh bột sắn,

magie stearate, bột talc, canxi phosphat và maltodextrin. Kết quả thu được cho thấy

ba tá dược: tinh bột sắn, maltodextrin và canxiphosphat đều hấp thụ mạnh trong

vùng hồng ngoại khảo sát từ 3600 - 3000 cm- 1

. Do đó phải sử dụng phương pháp

quang phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để tiến hành định

lượng sulfamid.

- Đã nghiên cứu khả năng xác định đồng thời 3 hoạt chất sulfaguanidin,

sulfamethoxazol và trimethoprim sử dụng các mô hình hồi quy đa biến tuyến tính.

Kết quả thu được cho thấy cả 3 phương pháp CLS, ILS và PLS đều mắc sai số rất

lớn (đặc biệt là PLS). Phương pháp PCR với ưu điểm là tính toán trên toàn tập số

liệu nhưng kết quả thu được từ mô hình này lại không phụ thuộc vào tập số liệu thô

đầu vào mà phụ thuộc vào các mô hình trung gian lựa chọn. Phương pháp này cho

phép loại bỏ sai số nhiễu phổ và sai số ngẫu nhiên trong quá trình đo khi lựa chọn

được số PC phù hợp. Áp dụng phương pháp PCR với 3 cấu tử chính để phân tích

các mẫu kiểm chứng đều cho kết quả khá tốt: từ 0,2 - 10,5% (đều nằm trong ngưỡng



cho phép). Vì thế, phương pháp này đã được lựa chọn để xác định các hoạt chất

trong mẫu cần nghiên cứu.

- Nghiên cứu xác định thành công giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

của phương pháp. Giá trị LOD của SFG, SFM, và TMP lần lượt là: 5,9; 10,4 và

14,2 µg/viên. Giá trị LOQ của SFG, SFM, và TMP lần lượt là: 19,7; 34,5 và 47,5

µg/ viên.

- Ứng dụng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần kết hợp với thuật toán

hồi quy cấu tử chính PCR để định lượng nhanh thành phần hoạt chất trong các mẫu

thuốc đang lưu thông trên thị trường. So sánh phương pháp nghiên cứu với phương

pháp tiêu chuẩn qui định trong dược điển. Nhận thấy sai khác giữa hai phương pháp

là không đáng kể. Độ chệch tương đối hàm lượng giữa hai phương pháp của

sulfaguanidin không quá 8,2%, sulfamethoxazol không quá 7,2%, trimethoprim

không quá 4,3%. Do đó hoàn toàn có thể áp dụng phương pháp phổ hồng ngoại kết

hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng nhanh một số hoạt chất thuốc

thuộc nhóm sulfamid.

Kết quả thu được từ nghiên cứu này mở ra hướng nghiên cứu mới sử dụng

các thiết bị đơn giản để xác định nhanh các chất trong mẫu đo phức tạp mà không

cần phá mẫu hoặc xử lý nhanh tại chỗ, tạo điều kiện đưa phép phân tích ra khỏi

phòng thí nghiệm.



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam tái bản lần thứ 4, Nhà xuất bản Y học, Hà

Nội.

2. Bộ Y Tế, Dược lý học tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

3. Nguyễn Bạch Đằng (2011), “ Thuốc giả- hiểm họa khôn lường”, báo Sức khỏe và

đời sống, phát hành ngày 15/05/2011.

4. Trần Quang Khánh (2013), Matlab ứng dụng Tập 1, Nhà xuất bản khoa học và kỹ

thuật, Hà Nội.

5. Trần Quang Khánh (2013), Matlab ứng dụng Tập 2, Nhà xuất bản khoa học và kỹ

thuật, Hà Nội.

6. Trương Phương, Trần Thành Đạo (2011), Hóa dược tập 2, NXB Giáo dục Việt

Nam, Hà Nội.

7. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng trong hóa

học, Bộ môn hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự

Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

8. Tạ Thị Thảo (2005), Giáo trình chemometrics, NXB Đại học Khoa Học Tự

Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội.

9. Tạ Thị Thảo (2012), Giáo trình thống kê trong hóa phân tích, NXB Đại học

Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội.

10. Tạ Thị Thảo, Phạm Hồng Quân, Nguyễn Xuân Trung (2010), “Ứng dụng

phương pháp thống kê đa biến và hệ thống thông tin địa lý để đánh giá ô

nhiễm kim loại nặng trong nước ngầm xã Nam Tân, Nam Sách, Hải Dương”,

Tạp chí Hóa học, 48 (4C), tr. 576-582.



11. Lê Minh Trí, Huỳnh Thị Ngọc Phương (2010), Hóa dược tập 1, NXB Giáo dục

Việt Nam, Hà Nội.

12. Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hóa học,

NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.

13. Trường Đại Học Dược Hà Nội (2013), Kĩ thuật bào chế và sinh dược học các

loại thuốc tập I, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

14. Trường Đại Học Dược Hà Nội (2014), Kiểm nghiệm dược phẩm tái bản lần thứ

4, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

Tiếng Anh

15. Arnold Dem. Welch (1937), “The pharmacologic basis for sulfanilamide

therapy”, The Journal of pediatrics, 11 (2), pp. 159-166.

16. Cemal Akay, Sibel A. Ozkan (2002), “Simultaneous LC determination of

trimethoprim and sulphamethoxazole in pharmaceutical formulations”,

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 30, pp. 1207-1213.

17. D. Amin, B. Shaba (1988), “An application of a bromine reagent to the assay of

sulfa drugs”, Microchemical Journal, Vol. 37, Issue 1, pp. 30-35.

18. Department of Essential Drug and Other Medicines World Health Organization

Geneva, Switzerland, Guidelines for the development of measures to combat

counterfeit drugs, WHO/EDM/QSM/99.1 (1999).

19. Di Wu, Jianyang Chen, Baiyi Lu, Lina Xiong, Yong He, Ying Zhang (2012),

“Application of near infrared spectroscopy for the rapid determination of

antioxidant activity of bamboo leaf extract”, Food Chemistry, 135, pp. 2147-

2156.

20. E. Jungman, C. Laugel, D.N. Rutledge, P. Dumas, A. Baillet-Guffroy (2013),

“Development of a percutaneous penetration predictive model by SR-FTIR”,

International Journal of Pharmaceutics, 441, pp. 628– 635.



21. Emil W.Ciurczak (2002), Pharmaceutical and Medical Applications of Near-

Infrared Spectroscopy, Marcel Dekker, New York.

22. Faten Ammari, DelphineJouan-Rimbaud-Bouveresse, Ne´ ziha Boughanmi,

Douglas N.Rutledge (2012), “Study of the heat stability of sunflower oil

enriched in natural antioxidants by different analytical techniques and front-

face fluorescence spectroscopy combined with Independent Components

Analysis”. Talanta, 99, pp. 323–329.

23. H. Wright and J. Nicholson (2009), “Combating counterfeit medicines”,

Pharm. J, 282, pp. 193.

24. Julien Boccard, Douglas N. Rutledge (2013), “A consensus orthogonal partial

least squares discriminant analysis (OPLS-DA) strategy for multiblock

Omics data fusion”, Analytica Chimica Acta, 769, pp. 30– 39.

25. J. Luypaert, D.L. Massart, Y. Vander Heyden (2006), “Review Near-infrared

spectroscopy applications in pharmaceutical analysis”, Talanta, 72 , pp. 865-

883.

26. L.K.H. Bittnera, N. Heigla, C.H. Pettera, M.F. Noisternigb, U.J. Griesserb, G.K.

Bonna, C.W. Hucka (2011), “Near-infrared reflection spectroscopy (NIRS)

as a successful tool for simultaneous identification and particle size

determination of amoxicillin trihydrate”, Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, 54, pp. 1059-1064.

27. Mafalda Cruz Sarraguc¸ a, Sandra Oliveira Soares, João Almeida Lopes (2011),

“ A near-infrared spectroscopy method to determine aminoglycosides in

pharmaceutical formulations”, Vibrational Spectroscopy, 56, pp. 184-192.

28. Mark Wainwright, Jette E. Kristiansen (2011), “On the 75th anniversary of

Prontosil”, Dyes and Pigments, 88 (3), pp. 231-234.



29. Marzena Jamrógiewicz (2012), “Application of the near-infrared

spectroscopy in the pharmaceutical technology”, Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 66, pp.1-10.

30. Nagaraja P1, Naik SD, Shrestha AK, Shivakumar A (2007), “A sensitive

spectrophotometric method for the determination of sulfonamides in

pharmaceutical preparations”, Acta Pharm, 57(3), pp. 333-342.

31. Padmarajaiah Nagaraja, Hemmige S Yathirajan, Kallanchira R Sunitha,

Ramanathapura A Vasantha (2002), “A new, sensitive, and rapid

spectrophotometric method for the determination of sulfa drugs”, J AOAC Int

2002 Jul-Aug, 85(4), pp. 869-874.

32. Payal Roychoudhury, Brian McNeil, Linda M. Harvey (2007), “Simultaneous

determination of glycerol and clavulanic acid in an antibiotic bioprocess

using attenuated total reflectance mid infrared spectroscopy”, Analytica

Chimica Acta, 585, pp. 246-252.

33. S.T.H. Sherazi, M. Ali, S.A. Mahesar (2011), “Application of Fourier-transform

infrared (FT-IR) transmission spectroscopy for the estimation of

roxithromycin in pharmaceutical formulations”, Vibrational Spectroscopy,

55, pp. 115-118.

34. The British Pharmacopoeia 2009

35. T. Mackey and B. Liang (2011), “The global counterfeit drug trade: Patient

safety and public health risks”, J. Pharm. Sci, 100(11), pp. 4571.

36. The United State Food and Drug Administration (2007), “Counterfeit Drugs

Questions and Answers”, Pharmaceutical online Newsletter, 23/10/2007

37. The United State Pharmacopoeia 34 (2012).



38. World Health Organization (2010), Report of the situation of counterfeit

medicines based on data collection tool who regions for Africa and Eastern

Mediterranean, WHO/ACM/3.

39. Yongnian Ni, Zhengbao Qi, Serge Kokot (2005), “Simultaneous ultravioles-

spectrophotometric determination of sulfonamides by multivariate calibration

approaches”, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems,82, pp.241-

247.

vũ thị huệ - hus.vnu.edu.vn · thầy cô, cán bộ trong bộ môn hóa phân tích, các...

Documents