vŨ thỊ thu lÊ - gust.edu.vngust.edu.vn/media/27/uftai-ve-tai-day27516.pdf · vŨ thỊ thu lÊ...
TRANSCRIPT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
…………***…………
VŨ THỊ THU LÊ
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA LOÀI NÀNG NÀNG (CALLICARPA CANDICANS)
VÀ LOÀI TỬ CHÂU LÁ TO (CALLICARPA MACROPHYLLA)
Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
Mã số: 9.44.01.17
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
HÀ NỘI - 2020
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công
nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Phạm Thị Hồng Minh
Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2. GS.TS. Phạm Quốc Long
Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Phản biện 1: PGS. TS. Phan Minh Giang
Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học
Quốc gia Hà Nội
Phản biện 2: TS. Đỗ Hữu Nghị
Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Luận án đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp
Học viện họp tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Số 18
Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội.
Vào hồi ….. giờ…. ngày ….. tháng …. năm 2020
Có thể tìm luận án tại thư viện Quốc gia Việt Nam và thư
viện Học viện Khoa học và Công nghệ
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có nguồn thiên
nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loài dược liệu
quý. Việc sử dụng các loại thảo dược theo y học cổ truyền hay từ các
hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một
vị trí quan trọng trong nền y học. Những bài thuốc sử dụng thảo dược là
đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản
chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên, các kết quả nghiên cứu
sẽ góp phần giải thích rõ hơn về tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc
cổ truyền vẫn hay được sử dụng trong dân gian
Trên thế giới những nghiên cứu về các loài chi Callicarpa chủ
yếu tập trung nghiên cứu về: thực vật học, dược lý, hóa thực vật và lâm
sàng của nó. Nghiên cứu dược lý được thực hiện trên dịch chiết thô
hoặc các hợp chất tinh khiết cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng
truyền thống. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học chủ yếu tập trung
vào các hoạt tính: kháng viêm, cầm máu, mất trí nhớ, oxi hóa, kháng
khuẩn. Những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
trên thế giới chỉ ra rằng, các hợp chất diterpenoid và triterpenoid có
hoạt tính chống ung thư rất tốt mà các hoạt chất này là thành phần hóa
học phong phú nhất trong chi Callicarpa.
Việc nghiên cứu nhằm tìm ra những hoạt chất có ích của thực
vật đã và đang nhận được sự quan tâm của giới khoa học nhiều quốc
gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Đây cũng là lý do đề tài
“ Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và loài Tử châu lá to
(Callicarpa macrophylla ) ở Việt Nam.” được lựa chọn để nghiên cứu.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ loài C.
candicans và loài C. macrophylla thu hái ở Việt Nam.
Đánh giá hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư:
gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) của các hợp chất sạch
phân lập được.
Nghiên cứu thành phần hóa học trong tinh dầu loài C.
candicans và loài C. macrophylla
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
2
1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ lá loài C. candicans và loài C. macrophylla ở Việt Nam 2. Xác định thành phần hóa học tinh dầu của lá loài C. candicans và loài C. macrophylla ở Việt Nam bằng các phương pháp chưng cất lôi quấn hơi nước thông thường và phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng. 3. Đánh giá hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thư (gan - HepG2, tiền liệt tuyến - PC3, phổi - A549) và kháng vi sinh vật kiểm định in vitro của tinh dầu thu được từ lá loài C. candicans và loài C. macrophylla . 4. Đánh giá hoạt tính gây độc trên ba dòng ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) in vitro của các hợp chất sạch phân lập được từ lá loài C. candicans và loài C. macrophylla
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Phần tổng quan tài liệu là tập hợp các nghiên cứu trong nước và
quốc tế về các vấn đề:
1.1. Đặc điểm chung về thực vật học chi Callicarpa
1.2. Tác dụng dược lý của chi Callicarpa
1.3. Thành phần hóa học các thực vật chi Callicarpa
1.4. Hoạt tính sinh học các thực vật chi Callicarpa
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phần này mô tả chi tiết các quá trình xử lý mẫu, phương pháp
tạo cặn chiết, sắc ký và phân lập các hợp chất; xác định thành phần hóa
học của tinh dầu và các phương pháp thử hoạt tính sinh học.
2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Mẫu thực vật
Lá, thân cành và quả loài Nàng nàng (Callicarpa candicans
(Burm.f.) Hochr.) và Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla Vahl) thu
tại huyện Tam Đảo – Vĩnh Phúc vào tháng 10/2015 và huyện Đại Từ,
tỉnh Thái Nguyên vào tháng 10 năm 2017, được TS. Nguyễn Quốc
Bình (Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam - VAST) xác định tên khoa học,
mẫu số tiêu bản lưu tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam.
2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu cây
3
Việc phân tích, phân tách các phần dịch chiết của cây được thực
hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng
(TLC), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck), sắc ký
cột pha đảo với pha tĩnh là YMC RP 18 (Merck), sắc ký dây phân tử
với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck) và sắc ký điều chế pha tĩnh là
silica gel.
2.1.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa các
thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại như: điểm nóng chảy
(Mp), độ quay cực ([α]D), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), phổ khối
lượng phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-
MS), phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân gồm phổ 1 chiều (1H-, 13C-NMR và DEPT) phổ 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC và NOESY).
2.2. Phương pháp chiết xuất tinh dầu
2.2.1. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước dùng bộ cất tinh dầu vi lượng
2.2.2. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng
2.2.3.Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu
Xác định thành phần hóa học của tinh dầu bằng cách kết hợp hệ
thống máy GC –MS với thư viện phổ chuẩn và phần mềm khóa thời
gian lưu Mass Finder 4.0.
2.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học
Hoạt tính gây độc tế được thử nghiệm bằng phương pháp SRB trên
ba dòng ung thư: gan (Hep-G2), phổi (LU-1) và vú (MCF-7) và phương
pháp MTT [3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium
bromide] trên ba dòng ung thư gan (Hep-G2), tiền liệt tuyến (PC3) và
phổi (A549).
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được
tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết theo
phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane &
Kandel (1996) trên 8 chủng: Vi khuẩn Gram, nấm sợi và nấm men.
Các thử nghiệm được thực hiện tại tại Phòng Hoạt chất sinh học,
Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, VAST.
4
Chương 3. THỰC NGHIỆM
Phần thực nghiệm đã mô tả chi tiết các quá trình: Xử lý mẫu và
phân lập các chất sạch từ lá 2 loài Tử châu lá to (C. macrophylla) và
Nàng nàng (C. candicans); Hằng số vật lí và dữ kiện phổ của các hợp
chất phân lập được từ 2 loài được nghiên cứu.
3.1. Lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla)
3.1.1. Thu nhận các dịch chiết từ lá cây Tử châu lá to
Quá trình xử lý mẫu lá cây Tử châu lá to
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ ngâm chiết lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla)
3.1.2. Phân lập, tinh chế các chất từ các cặn chiết lá Tử châu lá to
Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane và ethyl
acetate của lá cây Tử châu lá to như Sơ đồ 3.2
Sơ đồ 3.2. Phân lập cặn n-hexane và ethyl acetate lá cây Tử châu lá to
3.2. Lá cây Nàng nàng (C. candicans)
5
3.2.1. Thu nhận các dịch chiết từ lá cây Nàng nàng
Quá trình xử lý mẫu lá cây Nàng nàng như Sơ đồ 3.3.
Sơ đồ 3.3. Sơ đồ ngâm chiết lá cây Nàng nàng (C. candicans)
3.2.2. Phân lập, tinh chế các chất từ các cặn chiết lá Nàng nàng Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn n-hexane và ethyl
acetate lá cây Nàng nàng như Sơ đồ 3.4
Sơ đồ 3.4. Sơ đồ phân lập cặn n-hexane và ethyl acetate của lá cây Nàng nàng
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chương 4 trình bày về cách xác định cấu trúc của các hợp chất
phân lập được, thành phần hóa học của tinh dầu và kết quả thử hoạt tính
sinh học của các thành phần.
4.1. Thành phần hóa học tinh dầu cây Nàng nàng và Tử châu lá to
Phân tích GC - MS trong thành phần lá khô Nàng nàng có 39
cấu tử, chiếm 92,57% tổng hàm lượng. Trong đó có 25 sesquiterpene
6
hydrocacbon (62,98%) và 11 sesquiterpen có chứa oxi (22,46%). Cấu
tử chính được xác định trong tinh dầu là α-Gurjunene (21,97%).
Trong tinh dầu của lá cây Nàng nàng tươi có 47 cấu tử được
phát hiện chiếm 93,17% tổng hàm lượng tinh dầu. Trong số đó, có 28
sesquiterpene hydrocarbon (69,84%), 12 sesquiterpen (16,50%). Trong
đó, cấu tử chiếm hàm lượng lớn nhất là α-gurjunene (21,31%)
Thành phần hóa học tinh dầu từ hoa Nàng nàng cho biết có
tổng 47 cấu tử, chiếm 92,86% tổng hàm lượng. Các cấu tử có hàm
lượng cao được xác định trong tinh dầu hoa là. Các cấu tử có hàm
lượng chính được xác định trong tinh dầu hoa cây Nàng nàng là E-
caryophyllene (5,07%), α- selinene (5,66%), δ-cadinene (5,44%).
Thành phần hóa học tinh dầu lá tươi cây Tử châu lá to phát hiện có
50 cấu tử, chiếm 90,59% tổng hàm lượng. Cấu tử chính được xác định trong
tinh dầu là Phytol (11,03%).
4.2. Các hợp chất phân lập được từ lá Tử châu lá to và Nàng nàng
Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Tử châu
lá to 10 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học,
gồm 7 hợp chất terpenoid: callimacrophylla B (M8), 3β-
hydroxyolean-12-ene (M2), β-amyrin (M3), ursolic acid (M6),
oleanolic acid (M10), callimacrophylla A (M1) và ent-1β-acetoxy-
7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) và 3 hợp chất steroid:
spinasterol (M5), β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9). Trong đó,
callimacrophylla A (M1) và callimacrophylla B (M8) là hai hợp
chất mới. Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Nàng nàng
(C. candicans) 11 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa
học, gồm 4 hợp chất flavonoid: 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon
(C1), 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3), Hợp chất genkwanin
(C9) và cynaroside (C10); 5 hợp chất terpenoid: ursolic acid (M6),
2α-hydroxy-ursolic acid (C7), 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic
acid (C8), seco-hinokiol (C5) và methyl seco-hinokiol (C6) và 2 hợp
chất steroid: β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9). Trong đó, hợp
chất methyl seco-hinokiol lần đầu phân lâp được từ tự nhiên.
Thành phần hóa học chính của 2 loài thực vật chi Callicarpa
được nghiên cứu chủ yếu là các hợp chất flavonoid, diterpennoid và
7
triterpenoid. Một số hợp chất phân lập được giống nhau ở hai loài như:
ursolic acid, β-sitosterol và daucosterol.
Các hợp chất triterpenoid phân lập được từ 2 loài nghiên cứu cho thấy
thành phần hóa học chính là các hợp chất khung ursane và oleane, phù hợp với
thành phần hóa học chính của các hợp chất triterpenoid trong chi Callicarpa
trong các tài liệu đã công bố.
Các hợp chất diterpene phân lập được từ 2 loài nghiên cứu cho thấy
thành phần hóa học chính là các hợp chất khung ent-kaurane và abietane, phù
hợp với thành phần hóa học chính của các hợp chất diterpenoid trong chi
Callicarpa trong các tài liệu đã công bố.
Các hợp chất phân lập được từ lá 2 loài nghiên cứu
Bảng 4.26. Các hợp chất phân lập được từ 2 loài nghiên cứu
Tên hợp chất Lớp chất Loài phân lập KL
(mg) Tính mới
callimacrophylla A (M1) Diterpneoid C. macrophylla 10,8 M ent-1α-acetoxy-7β,14 α-dihydroxy-kaur-16-en-15-on (M7)
Diterpenoid C. macrophylla 12,5 H
seco-hinokiol (C5) Diterpenoid C. candicans 22,8 H methyl seco-hinokiol (C6) Diterpenoid C. candicans 31,0 H
3β-hydroxyolean-12-ene (M2) Triterpenoid C. macrophylla 10,3 L
8
β-amyrin (M3) Triterpenoid C. macrophylla 12,7 L
ursolic acid (M6) Triterpenoid C. macrophylla C. candicans
15,5 15,7
L L
callimacrophylla B (M8) Triterpenoid C. macrophylla 10,1 M 2α-hydroxy-ursolic acid (C7) Triterpenoid C. candicans 12,5 L 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8)
Triterpenoid C. candicans 11,5 L
oleanolic acid (M10) Triterpenoid C. macrophylla 8,5 spinasterol (M5) Steroid C. macrophylla 11,2 L
β–sitosterol (M4) Steroid
C. macrophylla C. candicans
20,0 19,0
daucosterol (M9) Steroid C. macrophylla C. candicans
16,5
5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1) Flavonoid C. candicans 8,5 L 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3) Flavonoid C. candicans 11,2 L genkwanin (C9) Flavonoid C. candicans 13,0 L cynaroside (C10) Flavonoid C. candicans 10,8 L
M: Hợp chất mới; L: Lần đầu tiên phân lập từ loài; H: Lần đầu tiên phân lập từ họ
Hai hợp chất mới thu được gồm 1 chất thuộc lớp chất diterpenoid và triterpenoid. Chúng được xác định cấu trúc dựa trên các dữ liệu phổ như sau: 4.2.1.1. Hợp chất callimacrophylla A (M1) – Hợp chất mới
Hợp chất M1 thu được dưới dạng tinh thể trắng. Công thức phân tử của hợp chất M1 được xác định là C20H28O5 dựa trên sự xuất hiện của các píc ion giả phân tử trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại m/z 387,1940 [M + 35Cl] (tính toán lý thuyết cho C20H32O5
35Cl: m/z 387,1938) và m/z 389,1918 [M + 37Cl] (tính toán lý thuyết cho C20H32O5
37Cl: 389,1909).
Hình 4.7. Phổ ESI-MS của M1
Phổ 1H-NMR của hợp chất M1 cho thấy sự xuất hiện hai tín
hiệu dưới dạng singlet của 2 nhóm methyl [H 0,65 (3H, s, H3-19) và
1,02 (3H, s, H3-20)], 1 nhóm oxymethine [H 3,62 (1H, dd, J = 10,5; 5,5
9
Hz, H-7)], tín hiệu của 2 nhóm oxymethylen [H 2,85 (1H, dd, J = 10,5;
5,0 Hz, Ha-18); 3,18 (1H, dd, J = 10,5; 5,0 Hz, Hb-18) và H 3,45 (1H,
dd, J = 12,0; 6,5 Hz, Ha-17); 3,54 ((1H, dd, J = 12,0; 4,5 Hz, Hb-17)]
và tín hiệu của các proton khác nằm trong khoảng từ H 0,93 đến 2,38
ppm. Ngoài ra, phổ 1H-NMR của hợp chất M1 còn xuất hiện tín hiệu
của 4 nhóm hydroxyl [H 4,30 (1H, d, J = 5,0 Hz, 7-OH); 4,78 (1H, s,
16-OH); 4,43 (1H, dd, J = 4,5; 6,5 Hz, 17-OH)] và H 4,49 (1H, dd, J =
5,0; 10,0 Hz, 18-OH) (Bảng 4.3).
Hình 4.8. Phổ 1H-NMR của M1
Hình 4.9. Phổ 13C-NMR của M1
Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất M1 xuất hiện tín
hiệu của 20 nguyên tử carbon, bao gồm 1 nhóm keton tại C 219,3 (C-
15), 1 nhóm oxymethine tại C 69,5 (C-7), 2 nhóm oxymethylene [C
61,4 (C-17) và 69,9 (C-18)], 2 nhóm methyl tại C 17,4 (C-19) và C
17,7 (C-20), 4 tín hiệu carbon bậc 4 [C 36,9 (C-4), 38,6 (C-1), 58,4 (C-
10
8) và 78,4 (C-16)], 6 nhóm methylene [C 38,6 (C-1), 17,3 (C-2), 34,7
(C-3), 26,9 (C-6), 17,9 (C-11), 28,0 (C-12) và 25,3 (C-14)] và 3 nhóm
methine [C 44,9 (C-5), 52,6 (C-9) và 38,7 (C-13)]. Các dữ liệu trên cho
thấy hợp chất M1 là một hợp chất ent-kaurane diterpen và có cấu trúc
tương tự hợp chất ent-7α,16β,17-trihydroxy-18-acetoxykaur-15-one
ngoại trừ nhóm acetoxy tại C-18 của hợp chất ent-7α,16β,17-
trihydroxy-18-acetoxykaur-15-one [101].
Hình 4.10. Phổ DEPT của M1
Phổ HSQC cho thấy các proton tại H 0,65 (H3-19); H 1,02 (H3-20)
và H 3,62 (H-7) liên kết với các nguyên tử carbon tương ứng C 17,4 (C-19);
C 17,7 (C-20) và C 69,5 (C-7) cũng như các proton tại H 2,85/3,18 (H-18)
và H 3,45/3,54 (H-17) có tương tác với các nguyên tử carbon tương ứng tại
C 69,9 (C-18) và 64,1 (C-17). Ngoài ra, bốn tín hiệu proton tại H 4,30 (7-
OH); 4,43 (17-OH); 4,49 (18-OH) và H 4,78 (16-OH) không liên kết với bất
kỳ nguyên tử carbon nào trên phổ HSQC chứng tỏ rằng hợp chất M1 có 4
nhóm hydroxyl (hình 4.6 và bảng 4.3).
11
Hình 4.11. Phổ HSQC của M1
Hình 4.12. Phổ HMBC của M1
Phổ HMBC của hợp chất M1 xuất hiện các tương tác xa dị hạt
nhân của các proton tại H 0,65 (H3-19) và 2,85/3,18 (H-18) với các
nguyên tử carbon tại C 34,7 (C-3), 36,9 (C-4) và C 44,9 (C-5); proton
tại H 1,02 (H-20) với C 38,6 (C-1), C 44,9 (C-5), C 52,6 (C-9) và C
38,5 (C-10). Hơn nữa, các liên kết từ proton tại H 3,45/3,54 (H-17) đến
các nguyên tử carbon tại C 38,7 (C-13), C 219,3 (C-15) và C 78,4
(C-16) cũng xuất hiện trên phổ HMBC, điều đó khẳng định rằng 3
nhóm hydroxyl nằm ở vị trí C-18, C-6 và C-17 (Hình 4.6). Nhóm
hydroxyl cuối cùng được xác định tại C-7 bởi các liên kết HMBC
giữa proton tại H 4,30 (7-OH) với các nguyên tử carbon tại C 26,9
(C-6), C 69,5 (C-7) và C 58,4 (C-8). Ngoài ra, các liên kết từ proton
12
tại H 4,49 (18-OH) với các nguyên tử carbon tại C 69,9 (C-18) và C
36,9 (C-4); từ proton tại H 4,78 (16-OH) với các nguyên tử carbon tại
C 38,7 (C-13), C 219,3 (C-15), C 26,9 (C-16) và từ proton tại H
4,43 (17-OH) tới các nguyên tử carbon tại C 61,4 (C-17)/C 78,4 (C-
16) cũng xuất hiện trên phổ HMBC (Hình 4.6). Mặt khác, độ dịch
chuyển hóa học carbon tại vị trí C-18 (C 69,9) và C-19 (C 17,4) của
hợp chất M1 tương tự hợp chất scopariusol L [C 71,1 (C-18) và C
17,8 (C-19)] [102] và khác hẳn so với hợp chất diterpen SL-II [C 22,8
(C-18) và C 64,3 (C-19) [103] khẳng định thêm sự tồn tại của nhóm
hydroxyl ở vị trí C-18. Hằng số ghép lớn của H-7 (J = 10,5 Hz) giống
với hợp chất 7β,16α,17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid [104] xác
định hướng α của nhóm hydroxyl (7-OH) trong hợp chất M1. Độ dịch
chuyển hóa học của các nguyên tử carbon tại C-16 (C 78,4) và C-17
(C 61,4) của hợp chất M1 phù hợp với các giá trị carbon tương ứng
của hợp chất ent-7α,16β,17-trihydroxykaur-18-acetoxy-15-one [C 77,4
(C-16) và C 63,1 (C-17)] [101] và khác hẳn so với hợp chất 16α,17-
dihydroxy-15-oxo-ent-kaur-19-oic acid [C 83,0 (C-16) và C 65,3 (C-
17)] [105] đề xuất cấu hình β của nhóm hydroxyl (16-OH). Từ các dữ
liệu trên, hợp chất M1 được xác định là ent-7α,16β,17,18-
tetrahydroxykaur-15-one. Đây là một hợp chất mới và được đặt tên là
callimacrophylla A.
Hình 4.6. Cấu trúc hóa học, tương tác chính HMBC(HC) của M1
Bảng 4.3. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của M1 và chất tham khảo
TT Hợp chất M1 [103]
δC δH (mult., J Hz) #δC #δH (mult., J Hz)
1 38,6 0,57 (1H, m)/ 1,66 (1H, m) 41,7 3,57 (m)
2 17,3 1,38 (1H, m)/ 1,57 (1H, m) 20,3 2,03 (m) 1,85 (overlap)
3 34,7 1,11 (1H, m)/ 1,40 (1H, m) 39,2 2,01 (m) 1,42 (m)
4 36,9 - 44,2
13
5 44,9 - 48,1 1,63 (dd, 11,9, 1,7)
6 26,9 1,75 (1H, m)/ 1,66 (1H, m) 30,5 1,75 (m) 1,40 (m)
7 69,5 3,62 (1H, dd, 10,5; 5,5) 78,1 2,28 (dt, 13,3, 4,1) 1,33 (overlap)
8 58,4 - 49,0 -
9 52,6 0,94 (1H, d, 9,0) 51,1 1,85 (overlap)
10 38,5 1,20 (1H, m)/ 1,53 (1H, m) 40,4 -
11 17,9 1,20 (1H, m)/ 1,53 (1H, m) 19,1 3,66 (dd, 10,7, 6,0) 1,68 (m)
12 28,0 1,18 (1H, m)/ 1,60 (1H, m) 27,6 1,98 (m) 1,57 (m)
13 38,7 2,21 (1H, br d, 3,5) 46,1 2,95 (br s)
14 25,3 1,66 (1H, m)/ 2,38 (1H, m) 37,5 2,45 (d, 11,8) 1,33 (overlap)
15 219,3 - 219,3 -
16 78,4 - 82,9 -
17 61,4 3,45 (1H, dd, 6,5; 12,0) 3,54 (1H, dd, 4,5; 12,0)
66,7 6,02 (br s) 5,16 (br s)
18 69,9 2,85 (1H, dd, 5,0; 10,5) 3,18 (1H, dd, 5,0; 10,5)
71,0 3,64 (d, 10,5) 3,32 (d, 10,5)
19 17,4 0,65 (3H, s) 16,8 0,88 (s)
20 17,7 1,02 (3H, s) 16,1 1,44 (s)
7-OH 4,30 (1H, d, 5,0)
16-OH 4,78 (1H, s)
17-OH 4,43 (1H, dd, 4,5; 6,5)
18-OH 4,49 (1H, dd, 5,0; 10,0)
#δH và #δC của scopariusol L (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz, pyridine-d5) [102]
4.2.2.1. Hợp chất callimacrophylla B (M8)- Hợp chất mới Hợp chất M8 thu được dưới dạng tinh thể trắng. Công thức phân tử
của hợp chất M8 được xác định là C32H50O4 dựa trên sự xuất hiện của các píc ion giả phân tử trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại m/z 499,3786 [M + H]+ (tính toán lý thuyết cho C32H51O4: m/z 499,3786).
Phổ 1H-NMR của hợp chất M8 xuất hiện 6 nhóm methyl singlet tại H 0,83 (3H, s, H3-28); 1,17 (3H, s, H3-26); 1,18 (3H, s, H3-25); 1,34 (3H, s, H3-27); 0,89 (6H, s, H3-23 và H3-24), 2 nhóm methyl dưới dạng doublet tại H 0,80 (3H, J = 6,5 Hz, H3-29) và 0,93 (3H, J = 6,5 Hz, H3-30) và 1 nhóm methyl tại H 2,05 (3H, s, CH3CO) của nhóm acetoxy. Phổ 1H-NMR của M8 còn cho thấy sự xuất hiện của 6 nhóm methien [H 4,53 (1H, dd, J = 11,5; 4,5, H-3); 0,82 (1H, m, H-5); 2,50 (1H, s, H-9), 2,43 (1H, dd, J = 11,5; 1,5, H-18); 1,42 (1H, m, H-19) và 1,08 (1H, m, H-20)] và 8 nhóm methine có độ dịch chuyển hóa học
14
trong khoảng H 0,95-2,75 (H-1, H-2, H-6, H-7, H-15, H-16, H-21 và H-22), một proton singlet tại H 6,27 (1H, s, 12-OH) (Bảng 4.7)
Hình 4.17. Phổ HR-ESI-MS của M8
Hình 4.18. Phổ 1H-NMR của M8
Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy hợp chất M8 có 32 nguyên tử cacbon, trong đó có 8 cacbon bậc bốn [C 38,0 (C-4); 45,5 (C-8); 37,0 (C-10); 195,2 (C-11); 144,5 (C-12); 134,4 (C-13); 41,7 (C-14) và 33,4 (C-17)], 6 nhóm methine [C 80,5 (C-3); 55,0 (C-5); 59,7 (C-9); 48,9 (C-18); 39,3 (C-19) và 40,8 (C-20)], 8 nhóm methilen [C
38,9 (C-1); 23,5 (C-2); 17,4 (C-6); 32,9 (C-7); 27,3 (C-15); 27,5 (C-16); 31,2 (C-21) và 41,2 (C-22)] và 8 nhóm methyl [C 28,0 (C-23); 16,6 (C-24); 16,7 (C-25); 18,6 (C-26); 21,0 (C-27); 28,8 (C-28); 16,6 (C-29) và 20,9 (C-30)]. Ngoài ra, còn có tín hiệu của 01 nhóm acetoxy tại C 170,9 (CH3CO) và 21,3 (CH3CO) cũng thu được từ phổ 13C-NMR
15
Hình 4.19. Phổ 13C-NMR của M8
Tất cả dữ liệu trên gợi ý cho biết hợp chất M8 là một triterpene
khung ursane chứa một nhóm acetoxy và có cấu trúc giống hợp chất 3β-
acetoxy-urs-12-ene-11-one [94], ngoại trừ sự khác biệt về độ dịch chuyển
hóa học của các nguyên tử cacbon tại vị trí C-11, C-12 và C-13. Khi so sánh
dữ liệu NMR của các hợp chất M8 và hợp chất 3β-acetoxy-urs-12-ene-11-
one (TLTK) có thế thấy ở TLTK tín hiệu proton của nhóm olefin tại H 5,54
(1H,s) liên kết trực tiếp với C-12 là một cacbon bậc 4(không liên kết với
hydro) có độ chuyển dịch hóa học C 144,5 ppm (C-12). Đồng thời tại vị trí
C-12 có gắn với nhóm hydroxy cũng được thể hiện bởi phổ khối phân giải
cao. Ngoài ra còn được xác định bởi tương tác xa dị hạt nhân của proton tại
H 6,27 (1H, s, 12-OH) với các nguyên tử cacbon tại C 195,2 (C-11); 144,5
(C-12) và 134,4 (C-13). Thêm vào đó, các liên kết trên phổ HMBC giữa H-
18 (H 2,43) và C-12 (144,5)/C-13 (C 134,4) chỉ ra vị trí của liên kết đôi tại
C-12/C-13 và nhóm keton tại C-11 (Hình 4.16)
Hình 4.20. HSQC của M8
16
Hình 4.21. Phổ HMBC của M8
Bên cạnh đó, liên kết giữa các proton methyl tại H-23/H-24 (H
0,89) với C-3(C 80,5)/C-4 (C 38,0) và C-5(C 55,0) cũng như liên kết
giữa H-3 (H 4,53)/CH3CO (H 2,05) với nguyên tử carbon tại C 170,9
(CH3CO), kết hợp với hằng số ghép lớn của H-3 (J = 11,5 Hz) trên phổ 1H-NMR xác nhận nhóm acetoxy liên kết tại C-3 có hướng β. Ngoài ra,
proton H-3 có hướng α được xác định bởi các liên kết từ H-2α (H 1,65)
và H3-23 (H 0,89) đến H-3 (H 4,53) cũng như từ H3-25 (H 1,18) đến
H-2β (H 1,72) trên phổ ROESY. Mặt khác, các liên kết giữa H-20 với
H-29/H-19 và giữa các proton H-2 với H-1/H-3 cũng được tìm thấy trên
phổ 1H-1H COSY.
Hình 4.22 Phổ 1H-1H COSY và NOESY của M8
Kết hợp các dữ liệu phổ với HMBC, 1H-1H COSY và ROESY
và so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất 3β-acetoxy-urs-12-ene-11-
one [94] trong tài liệu tham khảo cho phép khẳng định hợp chất M8 là
3β-acetoxy-urs-12-ene-11-one-12-ol. Đây là một hợp chất mới và
được đặt tên là callimacrophylla B
17
Hình 4.16. Cấu trúc hóa học, tương tác chính HMBC (HC) của M8
Bảng 4.7. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của M8 và chất tham khảo
Vị trí M8 [94]
δC δH (mult., J Hz) #δC #δH (mult., J Hz)
1 38,9 2,75 (1H, dt, 6,5; 3,5)
1,13 (1H, m) 38,9 2,75(lH,ddd, 3,5;3,5;13,5)
2 23,5 1,65 (1H, m) / 1,72 (1H, m) 23,6 3 80,5 4,53 (1H, dd, 11,5; 4,5) 80,7 4,51 (lH, dd, 4,6; 11,7) 4 38,0 - 38,1 5 55,0 0,82 (1H, m) 55,1 6 17,4 1,43 (1H, m)/ 1,58 (1H, m) 17,5 7 32,9 1,43 (1H, m)/ 1,68 (1H, m) 32,8 8 45,5 - 45,2 9 59,7 2,50 (1H, s) 61,5 2,34 (1H, s)
10 37,0 - 36,7 11 195,2 - 199,5 12 144,5 - 130,5 5,54 (1H, s) 13 134,4 - 164,8 14 41,7 - 43,7 15 27,3 0,95 (1H, m)/ 2,10 (1H, m) 27,2 16 27,5 1,17 (1H, m)/ 1,90 (1H, m) 27,3 17 33,4 - 33,9 18 48,9 2,43 (1H, dd, 11,5; 1,5) 59,1 19 39,3 1,42 (1H, m) 39,2 20 40,8 1,08 (1H, m) 39,3 21 31,2 1,25 (1H, m)/ 1,43 (1H, m) 30,9 22 41,2 1,39 (1H, m)/ 1,47 (1H, m) 40,9 23 28,0 0,89 (3H, s) 28,1 0,87 (3H, s) 24 16,6 0,89 (3H, s) 16,7 0,88 (3H, s) 25 16,7 1,18 (3H, s) 16,5 1,16 (3H, s) 26 18,6 1,17 (3H, s) 18,6 1,18 (3H, s)
27 21,0 1,34 (3H, s) 20,5 1,29 (3H, s)
28 28,8 0,83 (3H, s) 28,9 0,81 (3H, s) 29 16,6 0,80 (3H, d, 6,5) 17,5 0,80 (3H,d, 6,0) 30 20,9 0,93 (3H, d, 6,5) 21,2 0,94 (3H, d, 6,0)
CH3CO 170,9 - 170,9 -
18
CH3CO 21,3 2,05 (3H, s) 21,1 2,04 (3H, s) 12-OH 6,27 (1H, s) #δH và #δC của 3β-acetoxy-urs-12-ene-11-one (1H: 500 MHz,13C:125MHz,CDCl3) [94]
4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của Nàng nàng và lá Tử châu lá to
4.3.1. Đánh giá hoạt tính sinh học của tinh dầu lá Nàng nàng và Tử châu lá to
Kết quả cho thấy, tinh dầu lá Nàng nàng khô thể hiện hoạt tính
yếu trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 (IC50 = 94,5 µg/mL). Tinh
dầu lá tươi được chiết xuất bằng phương pháp chưng cất lôi quấn hơi
nước thông thường và tinh dầu lá tươi Tử châu lá to không thể hiện
hoạt tính trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm.
Bảng 4.20. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro của tinh dầu lá Nàng
nàng và Tử châu lá to trên các dòng tế bào ung thư: gan (Hep-G2), ung thư tiền
liệt tuyến (PC3) và ung thư phổi (A549).
Tên mẫu IC50 (µg/mL)
Hep-G2 PC3 A549
Tinh dầu lá khô 94,53 >100 >100
Tinh dầu lá tươi cất thông thường >100 >100 >100
Tinh dầu lá tươi sử dụng lò vi sóng 14,65 23,87 56,21
Tinh dầu lá tươi Tử châu lá to >100 >100 >100
Đối chứng (paclitaxel) 4,03 3,48 3,69
Kết quả còn cho biết phương pháp cất tinh dầu có hỗ trợ vi
sóng đã thu được các cấu tử hoặc hỗn hợp cấu tử trong tinh dầu lá Nàng
nàng có hoạt tính sinh học tốt hơn so với phương pháp chưng cất tinh
dầu lôi quấn hơi nước thông thường. Điều đó có ý nghĩa quan trọng cho
định hướng nghiên cứu tiếp theo về tinh dầu loài Nàng nàng nói riêng
và các tinh dầu từ các loài thực vật khác nói chung. Bảng 4.21. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu
lá Nàng nàng và Tử châu lá to
Tên mẫu MIC (g/mL)
EC PA BS SA AN FO SC CA
Tinh dầu lá khô >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200
Tinh dầu lá tươi cất thông
thường >200 >200 >200 >200 >200 200 >200 200
Tinh dầu lá tươi dùng lò
vi sóng >200 >200 >200 >200 >200 100 >200 200
Tinh dầu lá Tử châu lá to >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 EC: Escherichia coli, PA: Pseudomonas aeruginosa, BS: Bacillus subtillis, SA: Staphylococcus aureus, AN: Aspergillus niger, FO: Fusarium oxysporum, SC: Saccharomyces cerevisiae, CA: Candida albicans
19
4.3.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của cao chiết từ loài
Tử châu lá to và Nàng nàng
Các số liệu từ bảng 4.22 cho thấy cặn chiết ethanol từ lá, quả,
thân loài Tử châu lá to và Nàng nàng thể hiện hoạt tính ức chế tốt trên 3
dòng tế bào ung thư thử nghiệm với các giá trị CS(%) từ 29,69 0,8
đến 89,62 1,2%. Đặc biệt cặn chiết ethanol của lá loài Tử châu lá to
và Nàng nàng (L.CM và L.CC) có tác dụng ức chế tốt với giá trị CS(%)
lần lượt là 47,84 2,1 và 56,28 2,6 (đối với dòng tế bào ung thư Hep-
G2); 39,40 2,2 và 29,69 0,8 (đối với dòng tế bào ung thư Lu-1) và
30,23 1,5 và 35,18 1,0 (đối với dòng tế bào ung thư MCF-7). Kết
quả sàng lọc sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào ung thư đối với ba dòng tế
bào ung thư Hep-G2, Lu-1 và MCF-7 cho thấy lá loài Tử châu lá to và
Nàng nàng có tác dụng mạnh hơn quả và thân cành của chúng. Do vậy,
các nghiên cứu về thành phần hóa học tiếp theo ưu tiên tập trung vào lá
loài Tử châu lá to và Nàng nàng.
Bảng 4.22. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các cặn chiết tổng ethanol
từ lá, quả và thân cành cây Tử châu lá to và Nàng nàng
TT KH mẫu Nồng độ
đầu
(g/mL)
Giá trị CS (%) Dòng tế bào
Hep-G2 LU-1 MCF-7
DMSO - 100 100 100
Chứng (+) 5 1,34 0,8 2,66 0,9 1,21 0,71
1 Q.CC 20 89,29 1,1 33,04 1,4 40,43 2,79
2 T.CC 20 89,62 1,2 33,53 1,6 91,29 0,32
3 L.CC 20 56,28 2,6 29,69 0,8 35,18 1,0
4 Q.CM 20 60,02 2,3 47,31 1,5 38,86 2,26
5 T.CM 20 64,66 2,2 55,64 2,8 90,22 0,15
6 L.CM 20 47,84 2,1 39,40 2,2 30,23 1,5
(Q: quả, T: thân cành, L: lá, CC: C. candicans, CM: C. macrophylla)
Tiếp tục thử hoạt tính của các cặn chiết phân đoạn n-hexane,
EtOAc và methanol của lá cây Tử châu lá to và Nàng nàng đối với
dòng tế bào ung thư Hep-G2, Lu-1 và MCF-7. Ngoại trừ cặn chiết phân
đoạn methanol hầu như không thể hiện hoạt tính, cả 2 cặn chiết phân
đoạn còn lại của lá loài hai loài này đều có tác dụng ở các mức độ khác
nhau, trong đó phân đoạn n-hexane (L.CM.H) của cây Tử châu lá to và
20
EtOAc (L.CC.E) của lá cây Nàng nàng thể hiện hoạt tính mạnh nhất
với các giá trị CS(%) thấp với giá trị CS (%) từ 12,49 1,4 - 30,17
0,1 %. Kết quả này được giải thích là do sự hiện diện của các nhóm
chất có hoạt tính gây độc tế bào mạnh như terpenoid và flavonoid trong
các phân đoạn có độ phân cực yếu và trung bình. Bảng 4.23. Hoạt tính gây độc tế bào của các cặn chiết phân đoạn từ lá loài
Tử châu lá to và Nàng nàng
TT KH mẫu Nồng độ đầu
(g/mL)
Giá trị CS (%)
Dòng tế bào
Hep-G2 LU-1 MCF-7
DMSO - 100 100 100
Chứng (+) 5 1,34 0,8 2,66 0,9 1,21 0,71
1 L.CM.H 20 20,18 0,8 12,49 1,4 11,61 2,11
2 L.CM.E 20 98,03 0,9 18,20 1,3 40,43 2,79
3 L.CM.M 20 100 100 91,29 0,32
4 L.CC.H 20 98,84 0,9 73,04 1,5 38,86 2,26
5 L.CC.E 20 30,17 0,1 15,69 2,3 19,93 0,11
6 L.CC.M 20 100 100 90,22 0,15
(L: lá, H: n-hexane, E: ethyl acetate, M: methanol, CC: C. candicans,
CM: C. macrophylla)
4.3.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất
sạch phân lập được từ lá Tử châu lá to và Nàng nàng
Bảng 4.24. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các chất trên các dòng tế bào ung thư (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7)
TT Hợp chất
Giá trị IC50 (g/mL) Dòng tế bào
HepG2 Lu1 MCF7
Ellipticine 0,29 0,51 0,48
1 methyl seco-hinokiol (C6) 8,65 8,53 2,20
2 seco-hinokiol (C5) 8,25 9,13 2,46
3 callimacrophylla A (M1) 2,72 2,68 1,57
4 ent-1β-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) 0,31 1,55 0,23
5 callimacrophylla B (M8) 0,32 1,87 0,28
6 ursolic acid (M6) 0,25 0,31 0,21
7 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8) - - -
8 β-amyrin (M3) - - -
9 3β-hydroxyolean-12-ene (M2) 5,85 - 2,36
10 spinasterol (M5) 8,22 8,29 1,82
21
11 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1) - - -
12 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3) - - -
13 genkwanin (C9) - - -
14 cynaroside (C10) - - - Đánh giá hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm:
Bảng 4.24 cho thấy hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) của các hợp chất terpenoid mạnh hơn so với các hợp chất steroid và flavonoid. Các hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) tốt hơn dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và phổi (Lu-1). Hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) trong số 14 hợp chất thử kết quả hoạt tính có 6 hợp chất không có hoạt tính với IC50 > 100 (g/mL) gồm: 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1), 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3), 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8), Genkwanin (C9) và cynaroside (C10) và β-amyrin (M3). Các hợp chất còn lại thể hiện hoạt tính tương mạnh là methyl seco-hinokiol (C6), seco-hinokiol (C5), ent-1 α-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7), callimacrophylla B (M8), ursolic acid (M6), spinasterol (M5), 3β-hydroxyolean-12-ene (M2), callimacrophylla A (M1) với 0,2 g/mL < IC50 < 9,2 g/mL. Đặc biệt hợp chất ursolic acid (M6) có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) rất mạnh với giá trị IC50 = 0,25; 0,31 và 0,21 g/mL nhỏ hơn cả nồng độ chất đối chứng Ellipticine với IC50 = 2,9; 0,51 và 0,48 g/mL. Hợp chất ent-1α -acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) và callimacrophylla B (M8) thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư vú MCF-7 mạnh với IC50= 0,23 và 0,21 g/mL, mạnh hơn so với chất đối chứng Ellipticine với IC50 = 0,48 g/mL. Hai hợp chất abietane (methyl seco-hinokiol (C6), seco-hinokiol (C5)) và một hợp chất steroid (spinasterol (M5) thể hiện hoạt tính gây độc mạnh đối với dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) với giá trị IC50 trong khoảng 1,82 g/mL < IC50 < 2,46 g/mL nhưng thể hiện hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) với giá trị 8,22 g/mL < IC50 < 9,13 g/mL, kém hơn khoảng 5 lần so với ung thư vú (MCF-7). Các hợp chất có hoạt tính còn lại đều thể hiện hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) mạnh hơn không đáng kể so với dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1). Trừ hợp chất 3β-hydroxyolean-12-ene (M2) không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng ung thư phổi (Lu-1), hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng ung thư vú (MCF-7) tốt hơn đối với dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) với giá trị IC50 tương ứng bằng 2,36 g/mL và 5,85 g/mL
Đối với dòng ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) các hợp chất khung ent-kaurane diterpenoid (callimacrophylla A (M1) và ent-1β-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7)) và ursane-triterpenoid (callimacrophylla B (M8) và ursolic acid (M6) với 0,25 g/mL < IC50 < 2,72 g/mL biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn gấp 8 lần so với các hợp chất khung abietane (methyl seco-hinokiol (C6), seco-hinokiol (C5)) và steroid (spinasterol (M5)) với 8,22 g/mL < IC50 < 9,13 g/mL. Đối với dòng ung thư vú (MCF-7) các hợp chất này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào gần tương đương nhau với giá trị 0,21 g/mL < IC50 < 2,46 g/
22
mL. Trừ hợp chất ursane-triterpenoid: 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8) không thể hiện hoạt tính.
Nhóm hydroxyl ở vị trí C-3 trong hợp chất seco-hinokiol (C5) được thay thế bằng nhóm CH3O- tại vị trí C-3 trong methyl seco-hinokiol (C6) của hai hợp chất khung abietane-diterpenoid dẫn đến hoạt tính hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng ung 25 g/mL và 8,65 g/ mL) nhưng lại kém hơn dòng tế bào ung thư phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) (giá trị IC50 tương ứng 9,13 g/ml và 8,53 g/ml đối với dòng ung thư Lu-1; 2,46 g/mL và 2,20 g/mL đối với dòng ung thư MCF-7) tuy nhiên sự khác nhau không đáng kể.
Sự biến mất của nhóm hydroxy tại vị trí C-18; xuất hiện thêm nhóm α-acetoxy ở vị trí C-1 và β-OH ở vị trí C-14 và thay thế nhóm β-OH, α-CH2-OH tại C-17 thành nhóm olefin của hợp chất ent-1 α-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) so với hợp chất callimacrophylla A (M1) thuộc bộ khung ent-kaurane-triterpenoid dẫn đến làm tăng hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) với giá trị tương ứng 0,31 g/mL và 2,72 g/mL; 1,55 g/mL và 2,68 g/mL; và 0,23 g/mL và 1,57 g/ mL.
Đối với các hợp chất khung ursane-triterpenoid, ursolic acid (M6) có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) rất mạnh với giá trị IC50 = 0,25; 0,31 và 0,21 g/mL, còn hợp chất 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8) không thể hiện hoạt tính. Điều này có thể do sự xuất hiện của hai nhóm hidroxy ở vị trí C-2 và C-23 đã làm giảm hoạt tính gây độc đối với tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7). Một hợp chất ursane-triterpenoid khác, callimacrophylla B (M8) có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) rất mạnh với giá trị IC50 = 0,32; 1,87 và 0,28 g/mL, tương đương với ursolic acid, điều này có thể liên quan tới nhóm keton ở C-11.
KẾT LUẬN Thành phần hóa học các chất sạch phân lập
1. Luận án lần đầu tiên nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài thực vật Nàng nàng (C. candicans) và loài Tử châu lá to (C. macrophylla) thuộc chi Callicarpa ở Việt Nam. Đã phân lập được 21 hợp chất trong đó có 2 hợp chất mới, một hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên.
2. Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Tử châu lá to 10 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, gồm 7 hợp chất terpenoid: callimacrophylla B (M8), 3β-hydroxyolean-12-ene (M2), β-amyrin (M3), ursolic acid (M6), oleanolic acid (M10),
23
callimacrophylla A (M1) và ent-1β-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) và 3 hợp chất steroid: spinasterol (M5), β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9). Trong đó, callimacrophylla A (M1) và callimacrophylla B (M8) là hợp chất mới.
3. Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Nàng nàng (Callicarpa candicans) 11 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, gồm 4 hợp chất flavonoid: 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1), 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3), genkwanin (C9) và cynaroside (C10); 5 hợp chất terpenoid: ursolic acid (M6), 2α-hydroxy-ursolic acid (C7), 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8), seco-hinokiol (C5) và methyl seco-hinokiol (C6) và 2 hợp chất steroid: β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9). Trong đó, hợp chất methyl seco-hinokiol lần đầu phân lâp từ tự nhiên.
Thành phần hóa học trong tinh dầu 4. Thành phần hóa học tinh dầu lá và hoa Nàng nàng
Theo phương pháp chưng cất thông thường. Phân tích GC - MS trong thành phần lá khô Nàng nàng có 39 cấu tử, chiếm 92,57% tổng hàm lượng. Cấu tử chính được xác định trong tinh dầu là α-Gurjunene (21,97%). Trong tinh dầu của lá tươi cây Nàng nàng có 47 cấu tử chiếm 93,17% tổng hàm lượng tinh dầu. Cấu tử chính được xác định trong tinh dầu là α-Gurjunene (21,31%). Thành phần tinh dầu hoa Nàng nàng có 47 cấu tử chiếm 92,86% tổng hàm lượng. Cấu tử có hàm lượng chính được xác định trong tinh dầu hoa cây Nàng nàng là E-caryophyllene (5,07%), α- selinene (5,66).
Theo phương pháp chưng cất hơi nước có hỗ trợ vi sóng Phân tích GC - MS trong thành phần lá tươi Nàng nàng có 46 cấu tử chiêm 93,4% tổng hàm lượng. Cấu tử chính được xác định trong tinh dầu lá Nàng nàng tươi là β-caryophyllene (10,45%), δ - cadinene (10,28%).
5. Thành phần hóa học tinh dầu lá Tử châu lá to Thành phần tinh dầu lá tươi Tử châu lá to có 50 cấu tử, chiếm 90,59% tổng hàm lượng. Cấu tử chính được xác định trong tinh dầu là phytol (11,03%).
Hoạt tính sinh học 6. Kết quả thử hoạt tính gây độc trên 3 dòng ung thư gan (Hep-G2), ung
thư phổi (Lu-1) và ung thư vú (MCF-7) của một số chất sạch phân lập được, cho biết 2 hợp chất mới (callimacrophylla A và callimacrophylla B) thể hiện hoạt tính mạnh, hầu hết các chất còn lại
24
đều thể hiện hoạt tính ở mức khá. Trong đó, hợp chất ursolic acid (M6) có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) rất mạnh với giá trị IC50 = 2,5; 0,31 và 0,21 g/mL; hợp chất ent-1β-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) và callimacrophylla B (M8) thể hiện hoạt tính kháng tế bào ưng thư vú CF-7 mạnh với IC50 = 0,23 và 0,21 g/mL, nhỏ hơn cả nồng độ chất đối chứng Ellipticine.
7. Tinh dầu lá tươi Nàng nàng thu được từ phương pháp sử dụng lò vi sóng thể hiện hoạt tính tốt trên cả 3 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư tiền liệt tuyến (PC3), ung thư phổi (A549) được thử nghiệm với các giá trị IC50 tương ứng bằng14,65; 23,87 và 56,21 µg/mL và thể hiện hoạt tính ức chế nấm Fusarium oxysporum tốt với giá trị MIC bằng 100 g/mL. Các mẫu còn lại: tinh dầu lá khô và hoa tươi Nàng nàng, lá tươi Tử châu lá to chưng cất theo phương pháp lôi quấn hơi nước thông thường không thể hiện hoạt tính
KIẾN NGHỊ
Các kết quả nghiên cứu trong luận án cho thấy các loài chi Callicarpa là nguồn giàu có các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học thú vị. Vì vậy, trong tương lai tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính chống ung thư của các bộ phận còn lại của hai loài trên và các loài chi Callicarpa khác nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính chống ung thư và hoạt tính sinh học khác từ các loài thuộc chi Callicarpa của Việt Nam, để khẳng định thêm giá trị khoa học của các loài này, góp phần trong việc tạo ra các sản phẩm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Luận án lần đầu tiên đã nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài
thực vật: Nàng nàng (C. candicans) và Tử châu lá to (C. macrophylla) thuộc chi Callicarpa ở Việt Nam. Đã phân lập được 21 hợp chất sạch. Trong đó, callimacrophylla A và callimacrophylla B là hai hợp chất mới và hợp chất methyl seco-hinokiol lần đầu phân lập từ tự nhiên.
25
Lần đâu tiên tinh dầu của 2 loài Nàng nàng và Tử châu lá to được nghiên cứu tại Việt Nam. Riêng tinh dầu Nàng nàng ở trên thế giới chưa có một công trình nào nghiên cứu.
Lần đâu tại Việt Nam đã nghiên cứu tác dụng gây độc trên một số dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu-1) và ung thư vú (MCF-7) của 14 hợp chất sạch phân lập được từ loài Tử châu lá to (C.macrophylla) và Nàng nàng (C. Candicans). Trong đó 2 hợp chất mới thể hiện hoạt tính mạnh, hầu hết các chất còn lại đều thể hiện hoạt tính ở mức khá.
Tinh dầu lá tươi Nàng nàng thu được từ phương pháp sử dụng lò vi sóng thể hiện hoạt tính tốt trên cả ba dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư tiền liệt tuyến (PC3), ung thư phổi (A549) được thử nghiệm với các giá trị IC50 tương ứng bằng14,65; 23,87 và 56,21 µg/mL và thể hiện hoạt tính ức chế nấm Fusarium oxysporum tốt với giá trị MIC bằng 100 g/mL. Các mẫu còn lại: tinh dầu lá khô và hoa tươi Nàng nàng, lá tươi Tử châu lá to chưng cất theo phương pháp lôi quấn hơi nước thông thường không thể hiện hoạt tính.
26
CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ
Bài báo quốc tế (ISI/Scopus):
1. Vũ Thị Thu Lê, Lại Phương Phương Thảo, Phạm Thị Hồng Minh,
Hoàng Thị Bích, Đỗ Tiến Lâm, Đinh Thị Thu Thủy, Phạm Minh Quân,
Phạm Quốc Long, Đào Việt Hùng, Trần Quốc Toàn, Essential oil of
Callicarpa candicans (Burm.f.) Hochr, Asian Journal of Chemistry,
2019 (chấp nhận đăng) (Scopus).
2. Do Tien Lam, Vu Thi Thu Le, Pham Minh Quan, Pham Thi Hong
Minh, Bui Huu Tai, and Phan Van Kiem, Two new terpenoids from the
leaves of Callicarpa macrophylla, Natural Product Research, 2019, 34,
688 (SCIE).
3. Quoc Toan Tran, Thu Le Vu Thi , Tien Lam Do, Hong Minh Pham
Thi, Bich Hoang Thi, Quang Truyen Chu, Phuong Thao Lai Phuong,
Huu Nghi Do , Hoai Thu Hoang Than , Thu Thuy Ta Thi, Van Huyen
Luu, Mai Duong Phuong Thi Thu Huong Phung Thi, Optimization of
Microwave-Assisted Extraction Process of Callicarpa candicans
(Burm.f.) Hochr Essential Oil and Its Inhibitory Properties against
Some Bacteria and Cancer Cell Lines, Processes, 2020, 8(2):173
(SCIE).
Bài báo trong nước:
4. Vũ Thị Thu Lê, Luân Thị Thu, Phạm Thị Hồng Minh, Đỗ Tiến Lâm,
Nguyễn Phi Hùng, Đoàn Lan Phương, Nguyễn Thị Hồng Vân, Phạm Quốc
Long, Một số kết quả nghiên cứu ban đầu về dịch chiết n-hexan của cây
Nàng nàng (Callicarpa candicans (Burm.F) Hochr) ở Việt Nam, Tạp
chí Khoa học và Công nghệ, 2016, 54 (2B), 251-257.
5. Vũ Thị Thu Lê, Đỗ Tiến Lâm, Cầm Thị Ính, Đoàn Lan Phương,
Phạm Quốc Long, Trần Đăng Thạch, Tạ Thị Thu Thủy, Phạm Thị
Hồng Minh, nghiên cứu thành phần hóa học cặn chiết etyl axetat của
cây Nàng nàng (Callicarpa candicans (burm.f) hochr.) ở Việt Nam,
Tạp chí Khoa học và công nghệ, 2018, 178(2), 1859-2171.
6. Vũ Thị Thu Lê, Đỗ Tiến Lâm, Cầm Thị Ính, Phạm Quốc Long, Trần
Đăng Thạch, Nguyễn Thị Hồng Vân, Phạm Thị Hồng Minh,
Triterpenoid và flavonoid từ dịch chiết etyl axetat của cây Nàng nàng
(Callicarpa candicans (Burm. f. Hochr.) Ở Việt Nam, Tạp chí Hóa học,
2018, 56(3), 341-345.
27
7. Do Tien Lam, Pham Minh Quan, Vu Thi Thu Le, Nguyen Thi Hong
Van, Cam Thi Inh, Ta Thi Thu Thuy, Pham Thi Hong Minh, Terpene
compounds isolated from Callicarpa macrophylla in Vietnam Journal of
Science and Technology, 2018, 56 (4A), 213-220.