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Validazione di un metodo di analisi
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Argomenti trattati
Introduzione alla validazione dei metodi analitici
Parametri che caratterizzano un metodo analitico
esempio pratico
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Validazione
Validazione di un metodo analitico:
“Conferma attraverso l’esame e l’apporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per l’utilizzazione prevista siano soddisfatti”
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Quando validare un metodo? Quando un metodo è non normato sviluppato e/o progettato dal laboratorio normato ma utilizzato al di fuori del proprio scopo e campo di applicazione
prefissato
le più comuni situazioni sperimentali che impongono la validazione sono le seguenti:
un nuovo metodo è sviluppato per scopi particolari; un metodo analitico normato deve essere aggiornato, migliorato o
esteso ad un nuovo problema analitico; il controllo di qualità evidenzia variazioni temporali dei parametri di
qualità; un metodo stabilito deve essere usato in un diverso laboratorio, da un
diverso analista, con diversa strumentazione; è necessario dimostrare l’equivalenza del metodo in esame con un
metodo standard.
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Validazione
Il laboratorio che utilizza un metodo deve avere la documentazione che dimostri l’appropriata validazione del metodo stesso.
È responsabilità dell’utilizzatore assicurare che la validazione documentata sia sufficientemente completa
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Validazione
Non ci sono linee guida ufficiali per la sequenza degli esperimenti necessari per la validazione
La sequenza ottimale può dipendere dal metodo stesso
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Parametri che caratterizzano un metodo analitico
Campo di misura Specificità-selettività analitica limite di rivelabilità e di quantificazione range dinamico e lineare accuratezza intesa come esattezza più
precisione (quest’ultima a sua volta distinta in ripetibilità, precisione intermedia e riproducibilità)
incertezza di misurazione robustezza.
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Campo di misura (validità)Intervallo tra il più alto e il più basso livello
dell’analita determinabili con precisione ed accuratezza applicando il metodo stesso
Il campo di misura (validità) è espresso nella stessa unità di misura dell’analita
Dipende dallo scopo del metodo
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Specificità: Si riferisce ad un metodo che produce una singola risposta
Selettività: si riferisce ad un metodo che produce più risposte (metodo separativo)
ABILITÀ DI MISURARE ACCURATAMENTE L’ANALITA IN PRESENZA DI INTERFERENTI
Specificità-Selettività analitica
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Limite di rilevabilitàÈ la più bassa concentrazione dell’analita
che può essere rilevata, ma non necessariamente determinata quantitativamente, nelle condizioni sperimentali del metodo
LdR=3*Sb/S• Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni)
• S =coefficiente angolare della curva di taratura
• per metodi cromatografici
• Sb = D/5
• dove
• D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di fondo
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Limite di quantizzazione La Più bassa concentrazione analitica che
può essere determinata quantitativamente con accettabile precisione ed esattezza nelle condizioni sperimentali del metodo
LdQ = 10*Sb/S• Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni)
• S =coefficiente angolare della curva di taratura
• per metodi cromatografici
• Sb = D/5
• dove
• D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di fondo
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Linearità
La linearità di un metodo analitico è la sua abilità di dare risultati che sono direttamente proporzionali alla concentrazione degli analiti nei campioni all’interno di un determinato campo di validità
la proporzionalità può essere raggiunta anche attraverso trasformazioni matematiche ben definite
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Linearità Deve essere verificata attraverso il calcolo del coefficiente di
correlazione della curva di taratura eseguita, quando possibile, con aggiunte standard alla matrice da analizzare. Curve di taratura su matrici diverse o in soluzioni standard (contenenti soltanto il solvente e l'analita) possono essere utilizzate previa specificazione delle motivazioni nel metodo di prova. Sono generalmente accettati coefficienti di correlazione (r secondo il metodo dei minimi quadrati) pari almeno a 0,99.
Una non-linearità significativa dovrebbe essere corretta mediante l'utilizzo dì funzioni di taratura non lineari o eliminata restringendo l’intervallo di concentrazioni in cui si opera.
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LinearitàSi deve effettuare almeno da 3 a 6 repliche
di 4 o più concentrazioniNella validazione del metodo devono essere
riportati il coefficiente di correlazione, la pendenza, l’intercetta e i residui, oltre ad un grafico dei dati sperimentali e della curva calcolata
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EsattezzaGrado di concordanza tra il valore medio
ottenuto a partire da un grande insieme dì risultati di prova, e un valore dì riferimento accettato
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Per la valutazione dell’esattezza:Confronto con un metodo analitico di ordine
metrologico superioreAnalisi di idonei materiali di riferimento
certificati a diversi livelli di concentrazioneConfronto con i valori attesi in studi
collaborativi (circuiti interlaboratorio)Analisi di idonei campioni costruiti
aggiungendo alla matrice quantità certificate di analita (Spike) a diversi livelli di concentrazione
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Ripetibilità
concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenutì con lo stesso metodo su materiali ídentici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo brevi (stessa serie analitica)
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Per valutare la ripetibilità si possono usare:
Campioni realiMateriali di riferimento certificati nella
stessa matriceMateriali di riferimento in matrice ottenuti
per aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della sostanza pura
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Precisione intermedia
Concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su material identici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo lunghi (diverse serie analitiche con possibilità di cambiamento del lotto dei reattivi e dei materiali di consumo).
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Per valutare la Precisione intermedia si possono usare:
Campioni realiMateriali di riferimento certificati nella
stessa matriceMateriali di riferimento in matrice ottenuti
per aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della sostanza pura
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Riproducibilità
concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su materiali identici, in laboratori diversi, da operatori diversi, usando apparecchiature diverse e in intervalli di tempo diversi
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Incertezza di misura
stima legata ad un risultato di prova che caratterizza l'escursione dei valori entro cui si suppone che cada il valore vero del misurando ‑ Ha le dimensioni di uno scarto tipo e si indica con ”U"
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Per valutare l’incertezza può essere riassunto nei seguenti punti:
specificazione del misurando (eseguita nel metodo di prova)
definizione della relazione che lo lega alle grandezze misurate nel metodo di prova (ad esempio modello matematico per la misura della concentrazione specificato nel metodo di prova)
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identificazione dei fattori che possono contribuire all'Incertezza di misura per ogni stadio del processo eseguito in laboratorio (indicati nel metodo di prova)
raccolta dei dati relativi alle prestazioni del metodo (studi collaborativi, studi di validazione in laboratorio, circuiti inetrlaboratorio)
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quantificazione dei vari contributi all'incertezza dai dati relativi alle prestazioni del metodo, esprimendole come varianze o scarti tipo (incertezze tipo):
u(xi)
combinazione delle incertezze tipo per ottenere l'incertezza composta:
uc(y)
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trasformazione dell'incertezza composta in incertezza estesa
U(y) = K uc (y)
moltiplicando per il fattore di copertura (K)
In generale K=2.
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Robustezza
Insensibilità a piccole variazioni dei parametri sperimentali
Variazioni deliberate
% solventi organici
pH
temperatura
Flusso
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Esempio di validazione
Come esempio si riporta la validazione della determinazione dei cloruri solubili negli aggregati per confezione di calcestruzzi in cui abbiamo avuto la necessità di adattare un metodo normato (secondo la norma UNI 8520) ad un metodo più veloce e preciso.
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Il metodo normato, dopo l’attacco della sostanza prevede la determinazione dei cloruri in acqua, dopo precipitazione con AgNO3, con un metodo gravimetrico, pesando dopo essiccazione il precipitato, o volumetrico, riprendendo il precipitato e poi retrotitolando con NH4CNS l’argento in eccesso. Questo procedimento è stato semplificato utilizzando la tecnica della cromatografia ionica.
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Principio del metodo
Il campione è sottoposto a una solubilizzazione degli ioni attraverso acqua calda, su questa soluzione vengono determinati, tramite cromatografia ionica, i cloruri.
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Campo di misura
Il campo di misura varia tra 0,002 % e 0,050 % in peso di cloruri
che rappresenta il range 10 % - 160 % del limite della presenza di cloruri in inerti per la confezione di calcestruzzi.
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Taratura Cromatografo IonicoStandard iniziale soluzione a 1000 ± 5 mg/l di
cloruriCon micropipetta prelevati 100 µl, 250 µl, 400
µl, 500 µl e portati tutti a 100 ml con acqua deionizzata
Ottenute le seguenti concentrazioni:1,00/ 2,50/ 4,00/ 5,00 mg/lSono state effettuate quattro repliche per ogni
concentrazione
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Retta di taraturaretta di taratura cloruri
y = 1,07E+06x - 1,15E+04
R2 = 9,98E-01
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00
concentrazione mg/l
con
teg
gi d
'are
a
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Analisi dei residui
-150000
-100000
-50000
0
50000
100000
150000
0 1 2 3 4 5 6
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Limiti di quantizzazione e di rilevabilità
LdR=0,01 mg/l LdQ = 0,05 mg/l
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Incertezza
Ora valutiamo l’incertezza della misura analizzando i vari contributi all’incertezza
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Incertezza della taratura Incertezza della vetreria e della diluizione:Matraccio da 100 ml: 0,00058Micropipetta: std 1,00 mg/l = 0,00141std 2,50 mg/l = 0,000776std 4,00 mg/l = 0,000663std 5,00 mg/l = 0,000635Da cui :INCtot: 0,00185
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Incertezza dovuta alla bilanciaDal certificato di taratura della bilancia,
l’incertezza determinata (per n = 10 misure con i.c. 95%) è 0,040 mg
INCbil = 0.0177 mg
INC/P(10 g) = 0.00000177
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Incertezza ripetibilità
Le prove sono state effettuate su un campione di inerte analizzandolo 5 volte ottenendo il seguente risultato:
0,0346 ± 0,00123 da cuiINC=0,0158
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Incertezza dovuta alla taratura lineare
Un aliquota di campione analizzato secondo la procedura precedentemente descritta porta ad avere una incertezza, dovuta alla taratura strumentale di:
INC=0,0103
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Incertezza vetreria analisi
Matraccio da 1000 mlINC=0,00058
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Incertezza composta ed estesa
INCglob= 0,0189
Quindi in termini percentuali l’incertezza associata alla determinazione dei cloruri negli inerti è pari a 1,89 % del valore trovato
nel caso precedente si può esprimere il risultato:
Cloruri = 0,0346 ± K*0.000654
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Accuratezza
Sono state effettuate 3 serie di 5 misure in giorni diversi su un campione noto, si è ottenuto una media di 0,0345 ± 0,00121 , il campione è dato 0,0352 ± 0,00100 per cui il dato sperimentale rientra nel range del dato sperimentale.
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Conclusioni
L’esempio riportato mostra come l’incertezza della misura può essere stimata considerando tutti gli stadi della procedura valutando i singoli contributi.