Bol. San. Veg. Plagas, 31: 71-77, 2005

TERAPÉUTICA

Variabilidad genética en Bemisia tabaci (Gennadius) enmecanismos de resistencia inducida en plantas de tomate

C. CALLEJAS, M. D. OCHANDO

Hoy en día, los posibles cambios genéticos subyacentes en mecanismos de resisten-cia inducida, son prácticamente desconocidos. Sin embargo, resulta evidente la necesi-dad de esa información genética en la planificación de los programas de control inte-grado si queremos una lucha contra las plagas más eficaz y ecológicamente aceptable.El cultivo del tomate en España constituye un importante elemento de nuestra agricul-tura, y una de las plagas más dañinas sobre ese cultivo es Bemisia tabaci, que a su capa-cidad de infestación une la de ser transmisora de un elevado número de virosis a los cul-tivos que ataca. Así, en el presente trabajo hemos analizado los cambios genéticos pro-vocados en B. tabaci por la presencia de un elicitor, el benzotiacidol (BTH), en sus plan-tas hospedadoras, tomate. Los resultados, aún cuando preliminares, evidencian algunaspequeñas diferencias genéticas entre diferentes muestras (tratadas y testigo), que resul-tan interesantes para avanzar en el conocimiento de las relaciones huésped-parásito y, enconcreto, en el caso de la resistencia inducida.

C. CALLEJAS, M. D. OCHANDO. Dpto. de Genética. Facultad de Ciencias Biológicas. U.Complutense. 28040- Madrid, dochando@bio.ucm.es

Palabras clave: Bemisia tabaci, resistencia inducida, RAPD-PCR, variabilidadgenética

INTRODUCCIÓN

En las relaciones huésped-parásito, sub-yace una interacción genética que de maneraobligada conlleva la coevolución de ambos,fundamentalmente por presiones selectivasrecíprocas, aunque también provocadas porotros factores ambientales bióticos y abióti-cos. Es evidente la necesidad del conoci-miento de esas interacciones en la planifica-ción de programas de control integrado.Pero, desafortunadamente, los aspectosgenéticos han sido poco analizados y comoconsecuencia la información en este campoes muy escasa.

En general, los pocos estudios existenteshan incidido o bien en la identificación taxo-nómico-molecular de biotipos ya estableci-

dos (FEDER et al., 1988; FEDER y BUSH,

1991; BROWN et al, 1995, 1996; Hnxis etal., 1996), o bien en la búsqueda de genesconcretos y/o cambios drásticos en su fre-cuencia, que guardasen alguna relación conaspectos, fundamentalmente, de resistencia(TLTET et al, 2001; DABORN et al, 2002;HEMINGWAY et al., 2002; RANSON et al.,2002). Este enfoque es importante, pero nosolvidamos de que el enfrentamiento de unaplaga a una nueva circunstancia ambiental,como puede ser la presencia de un elicitor,puede inducir cambios genéticos necesariospara su respuesta adaptativa al nuevo retoambiental. Estos posibles cambios genéticosimplicarían, no sólo algún gen concreto rela-cionado con la resistencia, sino un amplionúmero de loci responsables del metabolis-

mo de ese elicitor, así como otros cambiosdel fondo genético como consecuencia deinteracciones diversas. Por tanto, este tipo deestudios resultan fundamentales cuando loque se pretende es una lucha eficaz contra laplaga mediante métodos de control selecti-vos y ecológicamente aceptables. Y comoconsecuencia, a la larga, económicamentemás rentables y menos dañinos para nuestrasalud.

La detección general de cambios genéti-cos necesitaría una técnica molecular capazde identificar marcadores a todo lo largo delgenoma. De las posibles metodologías dis-ponibles, la técnica de amplificación al azarde ADN polimórfico mediante el uso de lareacción en cadena de la polimerasa, en con-junto con cortos cebadores de secuenciaconocida y arbitraria (RAPD-PCR), haresultado extraordinariamente atractiva debi-do a una serie de ventajas que ofrece. Noresulta sorprendente que en los últimos añoslos marcadores RAPD-PCR se hayan usadoen todo tipo de organismos para el estudio demuy diversos tipos de problemas (HAYMER yMCINNIS 1994; BARUFFI et al., 1995; REYES

et al, 1996; REYES y OCHANDO, 1998). Ennuestro caso concreto, estos marcadoresposeen, entre otras, la ventaja de explorartodo el genoma, de poder utilizarse indivi-dualmente en organismos de tamaño muypequeño, y la aparente desventaja de repre-sentar ADN tanto codificante como no codi-ficante, tanto secuencias únicas como repe-titivas, etc. No obstante, esta aparente des-ventaja puede constituir una aproximaciónmucho más realista a ciertos problemas. Si loque pretendemos es conocer si se dan dife-rencias genéticas entre grupos muéstrales,sea por la causa que sea (determinística oaleatoria), un completo examen del genomanos acercará más a la realidad, aún cuandolos resultados puedan resultar menos llama-tivos cuantitativamente hablando.

En España, el tomate constituye hoy endía un importante elemento en nuestra agri-cultura, con amplias zonas dedicadas a sucultivo, fundamentalmente en Canarias ysudeste de la Península (Almería, Málaga,

Murcia). Una de las plagas más graves enestos cultivos la constituye B. tabaci (Gen-nadius) (Hemiptera: Aleyrodidae), descritaen España por primera vez en 1943 (GOMEZ-MENOR, 1943), y que a partir de los años 80se convierte en un importante problema agrí-cola (CARNERO et al., 1990; CELIX et al.,1996). Es una especie muy polífaga, capazde atacar más de 500 especies y variedadesde nuestros cultivos, con la gravedad añadi-da provocada por su capacidad de transmitirun elevado número de virosis, de las cualesgran parte afecta a la planta de tomate.

De hecho, la técnica RAPD-PCR ya se haaplicado a B. tabaci, tanto en España comoen otros países, para la identificación de bió-tipos, estudios taxonómicos y de poblacio-nes (GAWEL y BARTLETT, 1993; DE BARRO yDRIVER, 1997; GUIRAO et al., 1994, 1997;ABDULLAHI et al., 2003). Pero un paso másallá se encuentra el análisis del proceso deformación de dichos biótipos, como respues-ta a resistencia inducida a diferentes elicito-res. Y en concreto, la utilización de marca-dores del tipo RAPD-PCR para la detecciónde posibles efectos selectivos, en la relaciónhuésped- plaga, sólo ha sido utilizada en unaocasión, por nuestro propio equipo (CALLE-JAS etal., 2001).

Considerando todo lo anterior, hemosaplicado a B. tabaci, la técnica de RAPD-PCR para generar ADN polimórfico amplifi-cado al azar, con la finalidad de estudiar,desde un punto de vista genético, posiblesefectos de respuesta a resistencia inducidaprovocada por la aplicación de benzotiacidol(BTH), sobre la planta de tomate. Esta infor-mación podría ayudarnos en la comprensiónde las relaciones huésped-parásito y ser deutilidad en la gestión de los programas decontrol integrado de plagas.

MATERIAL Y MÉTODOS

Muestras de Bemisia tabaci.Se estudiaron cuatro muestras poblacio-

nales, biótipo B, procedentes de un cultivomantenido en el INI A de Madrid. Dos deellas provenientes de hospedadores someti-

dos a un mecanismo de resistencia inducidacon benzotiacidol (BTH), y las otras dospoblaciones testigo. En ambos casos, se ana-lizaron las generaciones 0 y 1. La denomina-ción establecida fue Bo y B¡, para las dosmuestras "tratadas", y To y f , para las dosmuestras testigo, siendo analizados 20 indi-viduos en cada caso.

Método experimental.La obtención de las muestras de B. tabaci

fue realizada en el INIA (Dra. S. Pascual).Plántulas de tomate, variedad Marmande sepulverizaron hasta goteo con BTH (Bion®)3gl"!. Igualmente, otras tantas plántulas fue-ron tratadas con agua destilada. Transcurridostres días, dichas plántulas se colocaron enjau-las de cría en las que también fueron introdu-cidas moscas del biótipo B. Dos días mástarde se recogieron de las plántulas las moscasque constituyeron las muestras poblacionalesBo y To. Los huevos puestos por dichas mos-cas se dejaron desarrollar hasta el estadioadulto y se obtuvieron las poblaciones Bi yTla Las moscas adultas se conservaron en eta-nol al 70% hasta su posterior análisis.

Extracción y amplificación del ADNEl ADN genómico se extrajo de cada indi-

viduo de acuerdo con el protocolo de HIGUCHI

(1989), con ligeras modificaciones. Cadamosca se disgregó con una punta de pipeta enun tubo Eppendorf de 0,5 mi que contenía 50\ú de tampón de lisis [Tampón PCR StoffellOx(PEAppliedBiosystems), l^mMMgCl2,3 |¿g de Proteinasa K y 0,5 ui del detergenteTween 20]. El homogenizado se incubó a 60°Cdurante una hora y diez minutos a 95°C parainactivar la Proteinasa K. Las muestras sealmacenaron a -20°C hasta su amplificaciónmediante la técnica RAPD-PCR.

Para las reacciones de amplificación sesiguió el protocolo de WILLIAMS et al.(1990), con algunas adaptaciones, en unvolumen final de 12,5 ui, conteniendo 1,25ui de tampón, MgCl2 4 mM, 0,2 mM de cadauno de los desoxinucleótidos dATP, dCTP,dGTP, dTTP, 2,5 picomoles del oligodecá-mero correspondiente, 12 ng de ADN genó-mico y 0,625 U de la ADN Polimerasa Frag-mento Stoffel (PE Biosystems).

Se ha analizado un total de 80 individuosempleando 3 cebadores diferentes para lasamplificaciones. Los cebadores utilizados,de 10 nucleótidos de longitud, fueron de lasseries A y C de Operon Technologies: A07(GAAACGGGTG), COI (TTCGAGCCAG)yCló(CACACTCCAG).

El programa utilizado para las amplifica-ciones fue: un ciclo inicial de 5 minutos a

Figura 1. Gei de azarosa que muestra el perfil de bandas de ADN (RAPD-PCR) obtenido con el cebador C16 en B.tabaci. La primera columna corresponde a un marcador de peso molecular escalera de 100 pares de bases (pb) y el

resto de columnas a distintos individuos de B. tabaci.

94 °C, para desnaturalización, 45 ciclos deamplificación en tres pasos (1 minuto a 94°C, 1 minuto a 36° C, 6 minutos a 72° C), yun último ciclo de terminación de 6 minutosa 72° C. Para la obtención de los perfiles deRAPD se utilizó un termociclador progra-mable Peltier PTC (MJ Research).

Los productos de amplificación se resol-vieron en geles de agarosa al 2 % con tam-pón Tris-Acético-EDTA (TAE). Por últimose visualizaron tras tinción con bromuro deetidio (EtBr, lmg/ml) con un transilumina-dor de luz ultravioleta y se fotografiaron.

Todos los cebadores proporcionaron ban-das de ADN claras y reproducibles. En laFigura 1 se muestra un ejemplo de amplifi-cación del ADN de B. tabaci con el cebadorC16.

Análisis de datos.Los resultados de amplificación se inter-

pretaron en forma de presencia o ausencia debandas, sin considerar las diferencias deintensidad.

En primer lugar, se buscaron bandasexclusivas de especie, es decir, bandasmonomórficas presentes en todos los indivi-duos de las cuatro muestras. También se bus-caron bandas exclusivas de población, queson bandas monomórficas presentes en todoslos individuos de una determinada muestra yausentes en las demás. A continuación serealizaron comparaciones entre las frecuen-cias de las bandas variables o polimórficas,aquellas presentes en todas las muestras peroen distintas frecuencias.

Se realizaron análisis de la varianza mole-cular (EXCOFFIER et al., 1992) para determinarqué proporción de la variabilidad total eraatribuible a la varianza entre distintos grupos,entre muestras y entre individuos pertene-cientes a una misma muestra. También se lle-varon a cabo pruebas x2 para cada una de lasbandas de ADN con el fin de detectar posiblesdiferencias estadísticamente significativas encuanto a su frecuencia en las distintas mues-tras. Y por último, se aplicaron análisis dediferencias estandarizadas para comprobar si

Cuadro 1. Resultados del análisis de la varianza molecular (AMOVA). En la columna 1 se muestran los distintosanálisis, bien para el conjunto de las cuatro muestras, (1er análisis), o bien agrupando dichas muestras en dos

grupos diferentes. 2a columna: grados de libertad. 3a columna: estimas de los componentes de la varianza en losdistintos análisis. 4a columna: significación de los componentes de la varianza (tras 10000 permutaciones al

azar). 5a columna: porcentaje de la varianza con el que cada componente contribuye a la varianza total.

1 grupo

Entre muestras

Entre individuos de la misma muestra

2 grupos: generaciones 0 y 1

Entre los 2 grupos

Entre muestras dentro de grupos

Entre individuos de la misma muestra

2 grupos: tratadas (B) y controles (T)

Entre los dos grupos

Entre muestras dentro de grupos

Entre individuos de la misma muestra

2 grupos: B1 y resto

Entre grupos

Entre muestras dentro de grupos

Entre individuos de la misma muestra

Fuente de variación Grados de Componente Valor de P % de lalibertad de la varianza varianza total

la frecuencia de una banda concreta en unadeterminada población era mayor o menorque en el conjunto de las muestras.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Con los tres cebadores utilizados se obtu-vo un total de 44 bandas diferentes, de lascuales 10 fueron invariables, presentes en el100 % de los individuos estudiados y portanto, y en principio, "diagnóstico" desde elpunto de vista taxonómico y de identifica-ción. Es decir, el biótipo B de B. tabaci, ori-gen de nuestras muestras, puede resultarinambiguamente identificado mediante mar-cadores RAPD-PCR y con los cebadores uti-lizados, lo que aporta nuevas llaves taxonó-micas a las ya conocidas (GAWEL y BAR-TLETT, 1993; GUIRAO et al., 1994, 1997; deBARRO y DRIVER, 1997). Lógicamente, antesde considerar estas bandas invariables detec-tadas en el total de individuos y muestrasanalizadas como claramente "diagnóstico",sería preciso descartar su presencia en otrosbiótipos.

La detección y diferenciación de biótiposes habitual en entomología aplicada. Inicial-mente basada en información estrictamentemorfológica, pasó posteriormente a realizar-se mediante análisis enzimático (MENKEN YULENBERG, 1987; LOXDALE y HOLLANDER,(eds.) 1989; BROWN ex al. 1995) y actualmen-te, a escala genómica (GASPARICH et al.y1995; HILLIS et al., 1996; HAYMER et al,

1997; SMITH y BUSH, 1997; REYES y OCHAN-DO, 1998). Pero el estudio del proceso en sí,de los cambios genéticos que se producen yque son fundamentales especialmente en loscasos de resistencia inducida, resulta muchomás dificultoso y por ende, la información aeste respecto es escasa cuando no inexistente.

En el presente trabajo se ha pretendidodetectar, a diferentes niveles, posibles dife-rencias genéticas entre cuatro diferentesmuestras de B. tabaci, como consecuenciade posibles efectos provocados por mecanis-mos de resistencia inducida a un elicitorespecífico, el benzotiacidol (BTH), aplicadosobre su planta hospedador, el tomate.

Figura 2. Bandas de ADN que presentan diferenciasestadísticamente significativas en cuanto a sus

frecuencias entre las poblaciones analizadas al realizarpruebas de c2.

No es habitual utilizar marcadores RAPD-PCR en la búsqueda de efectos de procesosselectivos como el de resistencia inducida.Ello se debe fundamentalmente al hecho deque este tipo de marcadores examina todo elgenoma, y por tanto, gran parte de los marca-dores moleculares detectados deben corres-ponder a secuencias posiblemente no codifi-cadoras, o repetitivas (WILLIAMS et al., 1990;GAWEL y BARTLETT, 1993), que es esperablese encuentren sometidas en mucho menorgrado, si en alguno, a las presiones selectivas.Sin embargo, precisamente por ello, constitu-yen una muestra mucho más realista que la decualquier otro tipo de marcadores para unanálisis de la relación huésped-parásito encasos de resistencia inducida, y de los posi-bles efectos sobre el genoma de la plaga.

Los resultados del presente trabajo consti-tuyen una aproximación preliminar a estosproblemas, sobre todo considerando que lasmuestras analizadas pertenecen a dos sucesi-vas generaciones. No obstante, los datos obte-nidos han resultado interesantes e indicativos.

Cualitativamente, se han detectado 4 ban-das distintas entre las muestras tratadas y notratadas, aún cuando están presentes en bajafrecuencia. Tres de estas bandas sólo estánpresentes en la muestra testigo de la genera-ción 1 (T,), una originada por el cebadorCOI y cuya frecuencia es 0,053, y dos con elcebador A07, con frecuencias de 0,053 y0,158. También se ha detectado una bandapresente sólo en las muestras tratadas con

BTH (Bo y Bj), originada con el cebadorCOI y con frecuencias de 0,053 en la mues-tra Bo y de 0,133 en la muestra Bj.

Cuantitativamente, el análisis de lavarianza molecular (AMOVA) atribuyó a lasdiferencias entre muestras un bajo porcenta-je, comprendido entre 3,12 y 3,96%, de lavariabilidad total observada (Cuadro 1). Esdecir, ha puesto de manifiesto que la varia-ción detectada se debe en mayor proporcióna variabilidad genética intrapoblacional. Enconcordancia con ello, la frecuencia de lamayoría de las bandas es muy parecida entodas las muestras, si bien los análisis de x2

han mostrado que 5 de las 44 bandas anali-zadas (11,36%) presentan diferencias signi-ficativas entre muestras (Figura 2). Es intere-sante resaltar que 2 de estas 5 bandas mani-fiestan esas diferencias atribuibles a la mues-tra tratada de la generación 1 (Tj).

Así pues, tanto en lo que se refiere a ban-das exclusivas de población, como a marca-

dores con frecuencias diferentes en unas yotras muestras, se evidencia la existencia deciertas diferencias genéticas entre las mues-tras analizadas, muy probablemente atribui-bles a la presencia del elicitor. Diferenciasque pueden representar el inicio de una ten-dencia, sin descartar un aspecto aleatorio ode la estructura familiar de las muestras ana-lizadas. En cualquier caso podríamos afirmarque nuestros marcadores ofrecen una gransensibilidad en un análisis detallado de losprocesos de formación de biótipos de resis-tencia, fundamentales para una lucha máseficaz contra las plagas.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a la Dra. S. Pascual que nosproporcionase el material biológico. El pre-sente trabajo ha sido financiado mediantesubvenciones concedidas al ProyectoAGL2000-1591C02-01.

ABSTRACT

CALLEJAS C , M. D. OCHANDO. 2005. Genetic variability in Bemisia tabaci (Genna-dius) related to induced resistance on tomato plants. Bol. San. Veg. Plagas, 31: 71-77.

At present, the possible genetic changes underlying induced resistance mechanismsare practically unknown. Nonetheless, such information is necessary for an efficient inte-grated control pests. The tomato crop presents a large commercial production in Spainand B. tabaci constitutes one of its most important pests due to levels of plants infesta-tion and virus transmission. In this work, genetic changes in B. tabaci owing to an elici-tor presence in tomato host-plants have been analyzed. Preliminary results suggest somegenetic differences among samples. These differences could provide a better understan-ding of host-parasitic interactions and induced resistance mechanisms.

Key words: Bemisia tabaci, induced resistance, RAPD-PCR, genetic variability

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(Recepción: 27 febrero 2004)(Aceptación: 8 julio 2004)