variabilidad genÉtica de spongospora subterranea y su
TRANSCRIPT
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VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora subterranea Y SU VIRUS
ASOCIADO PMTV EN COLOMBIA
INEacuteS OSORIO GIRALDO
Tesis de Grado presentada para optar al Tiacutetulo de
Magiacutester en Ciencias-Geomorfologiacutea y Suelos
DIRECTOR
MAURICIO MARIacuteN MONTOYA PhD
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MEDELLIacuteN
FACULTAD DE CIENCIAS
2012
ii
Agradezco al Profesor Mauricio Mariacuten por su gran acompantildeamiento y apoyo al Profesor
Pablo Gutieacuterrez por su colaboracioacuten a mis compantildeeros del Laboratorio de Biologiacutea Celular
y Molecular de la Universidad Nacional de Colombia sede Medelliacuten y a la Profesora Elena
Paola Gonzaacutelez del Politeacutecnico Jaime Isaza Cadavid por su colaboracioacuten con el preacutestamo
de algunos equipos
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al soporte econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (Proyecto 090-2007S4527-87-08) y a la Universidad
Nacional de Colombia sede Medelliacuten
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Dedico este proyecto a mis Padres AGA y JIOH y a mi esposo JPPV
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TABLA DE CONTENIDO
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RESUMEN XI
ABSTRACT XII
1 INTRODUCCIOacuteN 1
2 OBJETIVOS 4
21 Objetivo general 4
22 Objetivos especiacuteficos 4
3 MARCO TEOacuteRICO 5
31 Generalidades del cultivo de la papa 5
32 Generalidades sobre Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) 7
321 Taxonomiacutea de Sss 7
322 Ciclo de vida Sss 8
323 Rango de hospedantes de Sss 10
324 Siacutentomas causados por Sss 11
325 Control de Sss 12
33 Deteccioacuten de Sss 16
34 Variabilidad geneacutetica de Sss 19
35 Generalidades del Potato mop-top virus (PMTV) 22
351 Taxonomiacutea de PMTV 23
352 Ciclo de la infeccioacuten por PMTV 24
353 Rango de hospederos de PMTV 25
354 Siacutentomas causados por PMTV 26
36 Deteccioacuten de PMTV 27
37 Variabilidad geneacutetica de PMTV 29
BIBLIOGRAFIA 31
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RESULTADOS 46
4 ARTIacuteCULO 1- VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora
subterranea f sp subterranea EN COLOMBIA 46
41 Anexos-Artiacuteculo 1 65
5 ARTIacuteCULO 2 ndash VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE LOS ARN 2 Y 3
DE AISLAMIENTOS COLOMBIANOS DE PMTV 84
51 Anexos-Artiacuteculo 2 109
6 ANEXOS GENERALES 124
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen) 124
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo 125
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y hongos
filamentosos (Qiagen) 126
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs 127
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
RT M-MuLV para muestras de ARN 128
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN 129
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa 130
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa 131
7 CONCLUSIONES GENERALES 132
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INDICE DE FIGURAS
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Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV 24
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp
subterranea en plantas de papa de Colombia 65
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja
var Criolla Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos
infestados con Spongospora subterranea f sp subterranea 66
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos
agallas o raiacuteces de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana 68
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8 69
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la
regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp
subterranea de Colombia 70
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb)
a partir de ADN de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum
tuberosum S phureja y Nicotiana benthamiana 71
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e
ITS2 del ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss)
de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo 75
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos
de S subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I
MspI TaqI y Tru1I mediante el programa Web-cutter 77
vii
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Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN
ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las
enzimas de restriccioacuten Bsp143I y Hin6I que permiten determinar los tres
Tipos de Sss identificados en este trabajo 82
Figura 410 Gel de RFLPs con la enzima Hind6I y Bsp143I con muestras de los
Tipos I II y III de Sss detectados en el estudio 83
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb)
dirigidos al gen de la caacutepside viral del Potato mop-top virus PMTV 109
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4
(417 pb) dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) del Potato
mop-top virus (PMTV) 110
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7
(2063 pb) PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al
ARN3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 112
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses
del mundo 115
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del
genoma de Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia
y otros paiacuteses del mundo 117
viii
Pag
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia
y Boyacaacute (Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw
Suecia 119
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con
secuencias de referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del
Potato mop-top virus (PMTV) 120
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias
De referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del Potato
mop-top virus (PMTV) 122
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INDICE DE TABLAS
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Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o
raiacuteces de plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea 67
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna
polvosa y de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad 72
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de
aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en
Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2
del ADN ribosomal 78
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S
E ITS2 del ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp
subterranea de Colombia y otros paiacuteses del mundo 81
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten
de los segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 111
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia 113
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 116
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 118
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato
mop-top virus en cuatro Departamentos cultivadores de papa de Colombia 118
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 118
x
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Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 123
xi
RESUMEN
El cultivo de papa es uno de los renglones agriacutecolas de mayor importancia en Colombia se
extiende a 128701 ha y genera una produccioacuten anual de 23 millones de ton antildeo-1
Desde el
punto vista fitosanitario la papa se ve afectada por diversos problemas destacaacutendose en los
uacuteltimos antildeos la reemergencia de la Sarna polvosa causada por el protozoario del suelo
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) El efecto de esta enfermedad se refleja en
el deterioro de la calidad del tubeacuterculo y en la reduccioacuten de la produccioacuten al afectar el
sistema radicular de las plantas Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus
(PMTV) uno de los virus prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarenteneario en diferentes paiacuteses del mundo En este trabajo se evaluaron los niveles de
variabilidad geneacutetica de aislamientos Sss y PMTV obtenidos en cultivos de papa de los
departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo En el caso de Sss se
estudiaron los niveles de variacioacuten de 127 aislamientos a partir de la secuenciaciacioacuten de
las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr) encontraacutendose la presencia de tres variantes
principales dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada Para PMTV se
evaluaron los niveles de identidad de 38 aislamientos de los cuatro departamentos bajo
estudio a partir de la secuenciacioacuten de los genes de la caacutepside viral (CP) y del segundo gen
del triple bloque de genes (TGB2) encontraacutendose la presencia de dos variantes del virus
una que representa el genotipo mundialmente reportado para este virus y la otra que hasta
ahora soacutelo se ha encontrado en Colombia y que dado el bajo nivel de identidad (76) con
respecto al primer grupo posiblemente representa una nueva especie de pomovirus
Finalmente dos de las cepas de PMTV de Antioquia y Boyacaacute fueron secuenciadas para
sus ARN 2 y 3 lograacutendose un 83 del segmento genoacutemico de ARN 2 y 87 para el ARN
3 y encontraacutendose que comparten niveles de identidad superiores al 97 con respecto a
otros aislamientos previamente caracterizados en el Norte de Europa Se espera que los
resultados de esta investigacioacuten sean utilizados para el disentildeo de herramientas de
xii
diagnoacutestico que apoyen los esquemas de certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas
de mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en Colombia
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum Potato mop-top
virus secuenciacioacuten
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea AND ITS
ASSOCIATED PMTV VIRUS IN COLOMBIA
ABSTRACT
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
The other hand Sss is a vector for Potato mop-top virus (PMTV) a prevalent virus in the
Andean region and quarentenary in several countries However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
xiii
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum Potato mop-top virus
RT-PCR Sequencing
1
1 INTRODUCCIOacuteN
En Colombia el cultivo de la papa ocupa cerca de 128701 ha distribuidas en 14
departamentos de los cuales Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo son responsables
del 80 de la produccioacuten que asciende a cerca de 23 millones de ton antildeo-1
y de la cual
dependen maacutes de 69000 familias del sector rural del paiacutes La cadena de la papa en
Colombia enfrenta un gran nuacutemero de desafiacuteos endoacutegenos y exoacutegenos que disminuyen su
competitividad respecto a los demaacutes paiacuteses del mundo y en especial con relacioacuten a los otros
miembros de la Comunidad Andina de Naciones Entre otros factores los maacutes limitantes
son aquellos relacionados con la carencia de tecnologiacutea en los sistemas de produccioacuten y de
post-cosecha la alta dependencia de insumos agriacutecolas y el bajo nivel de acople entre el
sector primario y el de procesamiento industrial (MADR 2006) Desde el punto vista
fitosanitario el cultivo de la papa se ve afectado por diversos fitopatoacutegenos e insectos
plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la reemergencia de la enfermedad denominada
Sarna polvosa de la papa causada por el protozoario Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) Su efecto no solo se debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten
al deterioro en la calidad y apariencia cosmeacutetica de los tubeacuterculos que afecta draacutesticamente
su valor en el mercado Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus (PMTV)
uno de los problemas virales prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarentenario para diferentes paiacuteses del mundo (Santala et al 2010)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 de las cosechas en las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro (Solanum tuberosum) y
papa criolla (S phureja) (SINAIPA 2002) Por otra parte se estima que el PMTV puede
causar peacuterdidas hasta del 25 en este cultivo lo cual adicionado al dantildeo causado por Sss
pudiera generar disminuciones de 50-80 en la produccioacuten (Jones y Harrison 1972
Guerrero 1997 2000) Aunque se cree que este virus tiene como centro de origen los
Andes suramericanos no se ha establecido con certeza su efecto sobre el rendimiento de las
variedades alliacute cultivadas ni determinado claramente los siacutentomas que causa en sus
hospedantes (Salazar 1995) De esta forma no es frecuente encontrar la sintomatologiacutea
asociada a este virus reportada para la regioacuten templada que incluye amarillamiento foliar
2
anillos necroacuteticos y cuarteamiento o agrietamiento de tubeacuterculos y moteados foliares tipo
ldquoAucubardquo (Salazar 1995 Xu et al 2004)
Adicionalmente a esta problemaacutetica la diseminacioacuten de Sss se viene incrementando
dramaacuteticamente en el paiacutes como resultado de la deficiente calidad de la semilla utilizada
por la mayoriacutea de los agricultores la ausencia de variedades tolerantes a dicho patoacutegeno y
la carenciadeficiencia de asistencia teacutecnica estatal o gremial que no cuenta con
herramientas apropiadas para el diagnoacutestico asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla
libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011)
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la ausencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos o bioloacutegicos efectivos por lo
tanto requiere de un manejo fitosanitario especial al afectar directamente la semilla
inhabilitar los suelos dedicados al cultivo afectar la calidad cosmeacutetica del producto fresco y
ser transmisor del PMTV lo que genera una barrera cuarentenaria para la apertura de
nuevos mercados Por lo anterior el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado bajo
un esquema de manejo integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como
rotacioacuten de cultivos manejo adecuado del riego y drenaje sanidad del tubeacuterculo semilla
utilizacioacuten de organismos antagonistas (pe Trichoderma spp) utilizacioacuten de cultivos
trampa desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos estrictos de
certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas son
utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado del
manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o de
Rhizoctoniasis
El desarrollo de metodologiacuteas seroloacutegicas y moleculares pueden ser una importante
herramienta para el monitoreo y deteccioacuten de estos patoacutegenos en el paiacutes Se destacan para
Sss la teacutecnica de ELISA (Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas) con anticuerpos
policlonales y monoclonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
3
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Ward et al 2004 Qu et al
2011) Para el caso de PMTV tambieacuten se han utilizado teacutecnicas de deteccioacuten utilizando
plantas trampa ELISA RT-PCR (Retrotranscripcioacuten - Reaccioacuten en cadena de la
polimerasa) qPCR (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa en tiempo real) y microplatos de
hibridizacioacuten y microarreglos (Arif et al 1994 Nielsen y Moslashlgaard 1997 Jeffries 1998
Davey 2009 Latvala-Kilby et al 2009 Nakayama et al 2009) Sin embargo estas
teacutecnicas son de aplicacioacuten limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas o validadas con
base en los genotipos locales de ambos patoacutegenos presentes en las regiones cultivadoras de
nuestro paiacutes motivo por el cual es fundamental emprender un estudio amplio de los niveles
de variabilidad geneacutetica de Sss y PMTV en Colombia
Este trabajo responde a dicha necesidad En eacutel se realizaron colecciones de material vegetal
y suelo de cuatro zonas productoras de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo (Colombia) y se realizaron extracciones de ADN o ARN seguacuten el
caso para mediante teacutecnicas moleculares determinar las secuencias de diferentes regiones
informativas del genoma de cada patoacutegeno Una vez obtenidas y editadas las secuencias se
realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos para comparar y agrupar aislamientos colombianos con
respecto a los reportados para Sss y PMTV en el mundo y determinar sus niveles de
identidad geneacutetica
Este estudio pretende apoyar el desarrollo de programas de diagnoacutestico de Sss y PMTV
tanto en Colombia como en la regioacuten Andina La informacioacuten generada es importante para
desarrollar programas de deteccioacuten asintomaacutetica y temprana de ambos patoacutegenos como una
herramienta fundamental para implementar una base tecnoloacutegica que apoye los esquemas
cuarentenarios dirigidos a evitar la diseminacioacuten de los patoacutegenos hacia zonas libres de la
enfermedad la certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas de mejoramiento geneacutetico
que conduzcan a generar variedades resistentes a este patosistema
4
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GENERAL
Evaluar los niveles de variacioacuten geneacutetica de Spongospora subterranea y de su virus asociado
PMTV en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y
Narintildeo
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de S subterranea de cultivos de
papa de cuatro departamentos de Colombia a partir de secuenciacioacuten de las
regiones ITS del ADN ribosomal
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de PMTV de cultivos de papa de cuatro
departamentos de Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de la caacutepside y TGB2 del
genoma viral
Definir las afinidades filogeneacuteticas entre las variantes de S subterranea y PMTV
detectadas en Colombia con aislamientos de dichos patoacutegenos de diferentes paiacuteses
que presenten secuencias disponibles en las bases de datos moleculares
Ampliar el nivel de informacioacuten disponible sobre las secuencias de los segmentos
del genoma de aislamientos de PMTV en Colombia
5
3 MARCO TEOacuteRICO
31 Generalidades del cultivo de la papa
La papa es el tubeacuterculo maacutes importante que se produce en el mundo Se cultiva en maacutes de
125 paiacuteses y es consumido diariamente por maacutes de mil millones de personas En los paiacuteses
en desarrollo es un cultivo de fuerte expansioacuten con cientos de millones de personas que
dependen de eacutel para su supervivencia Los paiacuteses en desarrollo son los maacutes grandes
productores (e importadores) de papa y de sus productos derivados (FAO 2009) China se
ha convertido recientemente en el primer productor mundial de papa y junto a India
responden por la tercera parte de la produccioacuten global de este tubeacuterculo En Ameacuterica Latina
y Aacutefrica las cosechas presentaron un menor volumen pero el rendimiento se incrementoacute
significativamente Ameacuterica del Norte fue el mayor productor del continente con un
rendimiento de maacutes de 40 ton ha-1
(FAO 2008)
Ameacuterica del Sur es la cuna de la papa pero esta regioacuten presenta los niveles maacutes bajos de
produccioacuten con menos de 16 millones de toneladas para el antildeo 2007 En la regioacuten Andina
la mayoriacutea de los pequentildeos campesinos manejan el cultivo de forma tradicional y se
siembran variedades de papa que son poco comerciales y desconocidas para el resto del
mundo sin embargo en paiacuteses como Argentina Brasil Colombia y Meacutexico la produccioacuten
comercial de papa estaacute aumentando paulatinamente (FAO 2008)
En Colombia el cultivo de la papa participa con el 71 de la superficie sembrada en
cultivos transitorios y aporta cerca de 78 de la produccioacuten agriacutecola generando alrededor
de 69000 empleos directos principalmente en los departamentos de Cundinamarca
Boyacaacute Narintildeo y Antioquia (MADR 2009a) En el 2009 el aacuterea sembrada de papa fue de
128701 ha con una produccioacuten de 2272772 ton y un rendimiento de 184 ton ha-1
(MADR-ENA 2009) La participacioacuten departamental en la produccioacuten nacional se
encuentra distribuida de la siguiente manera Cundinamarca 378 Boyacaacute 263 Narintildeo
6
164 Antioquia 65 Santander 56 y otros departamentos participan con el 64
(MADR 2009b)
La papa es el producto de origen agriacutecola que tiene la mayor demanda en Colombia por
fungicidas e insecticidas y la segunda en demanda de fertilizantes despueacutes del cafeacute Es la
actividad que maacutes utiliza los servicios de transporte terrestre con maacutes de 2 millones de
toneladas al antildeo sin incluir la movilizacioacuten de los insumos requeridos para su produccioacuten
(MADR 2005)
Los cultivos de papa se encuentran distribuidos en climas friacuteos con temperaturas de 13ordmC y
alturas de 2000 msnm hasta alcanzar zonas de paacuteramo con alturas cercanas a los 3500
msnm y temperaturas de 8ordmC Geograacuteficamente las unidades de produccioacuten estaacuten
dispersas principalmente en las regiones friacuteas de la zona Andina bajo una variada gama de
condiciones biofiacutesicas econoacutemicas y sociales En teacuterminos generales alrededor del 75
del aacuterea cultivada con papa en el paiacutes se encuentra en zonas de topografiacutea quebrada y
ondulada (MADR 2005)
Seguacuten Villareal et al (2007) en el paiacutes existen alrededor de 30 variedades de papa
cultivada pero soacutelo 10 de eacutestas tienen importancia comercial La Parda pastusa es la
variedad maacutes cultivada y consumida en fresco le siguen la variedad Diacol Capiro
utilizada para consumo en fresco exportacioacuten y por la industria de alimentos como materia
prima La variedad ICA-Puraceacute es utilizada en algunas regiones de clima templado del paiacutes
para consumo en fresco la Tuquerrentildea o Sabanera que se consume principalmente en
Bogotaacute y la Criolla que se cultiva principalmente en los departamentos de Antioquia y
Cundinamarca En el paiacutes se han desarrollado nuevas variedades que han ingresado al
mercado como las variedades Esmeralda Rubi UNICA e ICA Morita que tienen altas
posibilidades comerciales en el corto plazo
Una de las principales limitantes teacutecnicas del cultivo de la papa corresponde a las plagas y
enfermedades Dentro de las enfermedades el tizoacuten tardiacuteo o gota causado por
Phytophthora infestans es la amenaza maacutes seria del cultivo Ademaacutes tambieacuten se presentan
el tizoacuten temprano (Alternaria solani) la rontildea (Rhizoctonia solani) la sarna comuacuten
7
(Streptomyces scabies) la palomilla o mortaja blanca (Rosellinia sp) las virosis (PVY
PVX PLRV PYVV PVS PMTV) y la sarna polvosa Esta uacuteltima enfermedad se ha
convertido en una de las principales problemaacuteticas de cultivo a nivel mundial (Harrison et
al 1997 Merz y Falloon 2009) Es causada por el protozoo Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) paraacutesito obligado de plantas superiores Esta enfermedad causa dantildeos
directos sobre las raiacuteces y tubeacuterculos y ademaacutes es vector del PMTV (Jones y Harrison
1969 Harrison et al 1997 Andersen et al 2002 Merz y Fallon 2009) enfermedad viral
que afecta este cultivo en varias regiones productoras de papa en el mundo
En Colombia el manejo de la enfermedad se basa en el uso de semilla certificada por el
Instituto Colombiano Agropecuario ICA la utilizacioacuten de variedades medianamente
tolerantes y la rotacioacuten entre estas variedades con cultivos no hospedantes del patoacutegeno
(Jaramillo y Botero 2007)
32 Generalidades de Spongospora subterranea fsp subterranea
321 Taxonomiacutea
Sss es el agente causal de la enfermedad denominada Sarna polvosa de la papa El primer
reporte de esta enfermedad data de 1841 en Alemania (Wallroth 1842) y a partir de esta
fecha su registro incluye todos los continentes (Harrison et al 1997 Merz 2008) Seguacuten
Lyman y Rogers (1915) el patoacutegeno es originario de los Andes Suramericanos desde donde
se dispersoacute gracias al mercado mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber
transcurrido mas de 150 antildeos desde su primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado
importancia en las uacuteltimas deacutecadas como resultado de la siembra generalizada de materiales
altamente susceptibles al patoacutegeno la utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los
cambios de eacutepocas de siembra hacia periacuteodos huacutemedos las deficiencias en los sistemas de
rotacioacuten de cultivos la falta de programas cuarentenarios y los altos estaacutendares exigidos por
el mercado en la calidad cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
8
Sss es un pseudohongo plasmodial que taxonoacutemicamente se ha ubicado en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos Spongospora subterranea f sp
subterranea y Spongospora subterranea f sp nasturtii definidos como forma especialis
son importantes patoacutegenos de vegetales (Merz y Falloon 2009) Dick (2001) propone que
dichos microorganismos corresponden a especies diferentes
322 Ciclo de vida Sss
Sss y otros plasmodiophorales se caracterizan por presentar zoosporas biflageladas (3-4 microm
diaacutemetro) de desigual tamantildeo con mastigonemes y posicioacuten opuesta que se liberan a partir
de las estructuras de resistencia (quistes) Los quistes (4 microm diaacutemetro) pueden sobrevivir en
el suelo por largos periacuteodos de tiempo y generalmente se encuentran agregados formando
estructuras denominadas quistosoros (hasta 85 microm diaacutemetro) CITA los cuales son esfeacutericos
u ovoides y presentan un centro vaciacuteo En Colombia observaciones realizadas por
Jaramillo y Peacuterez (2008) han determinado que los quistosoros de aislamientos procedentes
de suelos del municipio de La Unioacuten (Antioquia) oscilaron entre 50 y 120 microm Bajo
condiciones de humedad es frecuente la liberacioacuten de una zoospora uninucleada aunque se
cree que la germinacioacuten de los quistes responde a un patroacuten escalonado que garantiza la
generacioacuten de inoacuteculo infectivo por largos periodos de tiempo Una vez en el suelo las
zooporas se desplazan varios centiacutemetros y son atraiacutedas por los exhudados de las raiacuteces de
sus plantas hospedantes adherieacutendose enquistando y formando un tubo germinativo que
ejerce fuerza mecaacutenica para su penetracioacuten directa en la planta Posteriormente el patoacutegeno
desarrolla un plasmodio multinucleado con membrana simple y ausencia de pared celular
Eventualmente el plasmodio se cliva dando lugar a muacuteltiples zooesporangios cada uno de
los cuales puede generar hasta 8 zoosporas que son liberadas por un poro germinativo y
continuacutean con la infeccioacuten de otras ceacutelulas radiculares Estas zoosporas denominadas
secundarias son indistinguibles de las que inician la infeccioacuten (primarias) y ambas pueden
infectar lenticelas no suberizadas de tubeacuterculos comenzando a inducir el siacutentoma tiacutepico de
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la sarna que toma apariencia corchosa a partir del desarrollo de una capa de proteccioacuten a
nivel del peridermo del tubeacuterculo Es frecuente ademaacutes que el patoacutegeno induzca hipertrofia
e hiperplasia en los tejidos afectados dando origen a las agallas y a las deformaciones
caracteriacutesticas de la enfermedad Al final del ciclo en los plasmodios se reorganiza su
contenido protoplasmaacutetico rodeaacutendo los nuacutecleos presentes de pared celular y generaacutendose
quistes que serviraacuten de inoacuteculo para sucesivas infecciones (Harrison et al 1997)
El ciclo de vida de Spongospora es diferenciado por Merz (2008) de acuerdo a la
ocurrencia de dos fases una fase esporogeacutenica y una segunda fase esporangial cada una
iniciada por la infeccioacuten de la ceacutelula hueacutesped a traveacutes de un plasmodio individual En la
fase esporangial numerosas zoosporas secundarias son formadas en el esporangio de
paredes delgadas en las ceacutelulas epidermales de la raiacutez y los pelos radicales del hueacutesped en
las cuales las zoosporas son formadas desde un plasmodio esporangiogeacutenico Las zoosporas
secundarias tambieacuten biflageladas pueden salir del hueacutesped e iniciar otro ciclo de infeccioacuten
La fase esporogeacutenica se presenta despueacutes de la divisioacuten nuclear dentro del plasmodio
esporogeacutenico El patoacutegeno produce esporas de reposo de pared gruesa las que son
altamente persistentes Cada espora de reposo libera una sola zoospora primaria
biflagelada
En Colombia Hoyos et al (2009) realizaron observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Sss encontrando plasmodios plasmodios enquistados plasmodios en
estado de divisioacuten ceacutelulas uacutenicas y quistosoros en raiacuteces de plantas de S tuberosum
asintomaacuteticas indicando que la infeccioacuten puede estar presente sin desarrollo evidente de
siacutentomas y que los quistosoros no son solamente las estructuras maacutes frecuentes en los
tejidos de los hospedantes afectados
10
323 Rango de hospedantes de Sss
Diversas investigaciones han encontrado la presencia de zoosporangios de Sss en plantas de
otras familias diferentes a la Solanaceae como Alzoaceae Apiaceae Asteraceae
Boraginaceae Brassicaceae Caryophyllaceae Chenopodiaceae Fabaceae Geraniaceae
Lamiaceae Plantaginaceae Papaveraceae Poaceae Polygonaceae Ranunculaceae
Rubiaceae Resedaceae Solanaceae y Urticaceae (Jones y Harrison 1969 Andersen et al
2002) Andersen et al (2002) encontraron diferentes tasas de infeccioacuten desarrolladas por el
patoacutegeno en especies como Artemisia vulgaris Cirsium arvense Chamomilla suaveolens
Chenopodium album Galium aparine Geranium pusillum Lapsana communis Matricaria
inodora Poa annua Polygonum avicular P convolvulus Rumex acetosa R acetosella
Solanum nigrum Sonchus arvensis Urtica urens y Viola tricolor lo que permitioacute
confirmar estas 17 especies como hospedantes de Sss
Aunque aparentemente Sss tiene un amplio rango de hospedantes el desarrollo de los
quistosoros nunca habiacutea sido observado en otros hospederos diferentes a S tubersosum Sin
embargo Qu y Christ (2006a) encontraron formacioacuten de quistosoros en seis especies de
plantas Solanum plycantum Dun Datura stramonium L Avena sativa L Dactylis
conglomerado L Solanum esculentum Mill y Brassica campestris L Esto indicoacute que el
patoacutegeno tiene la capacidad de completar su ciclo de vida en hospedantes alternos a las
plantas de papa lo que representa un aspecto epidemioloacutegico importante Asiacute mismo se
encontroacute que las siguientes especies tambieacuten son hospedantes del patoacutegeno Fagopyrum
esculentum Moench Phleum pratense L Raphanus sativus L Brassica napus L
Trifolium pratense L Secale cereale L Ambrosia artemisiifolia L Chenopodium album
L Amaranthus retroflexus L y Cyperus esculentus L Recientemente se ha encontrado
que el patoacutegeno puede producir agallas en S physalifolium y S nigrum y su patogenicidad
fue confirmada por inoculacioacuten a plantas de tomate (S esculentum) y de papa bajo
condiciones de invernadero (Shah et al 2010) Estos resultados tienen consecuencias para
el manejo de la enfermedad enfocado en cultivos de rotacioacuten porque se debe tener en
cuenta que existen especies cultivables y malezas que pueden albergar estructuras del
patoacutegeno y que el reporte de nuevas especies hospederas continua por ejemplo Sss causa
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agallas en las raices de Solanum sarrachoide en donde puede completar su ciclo de vida y
producir nuevas generaciones de quistosoros que son infectivos a papa (Nitzan et al 2009)
324 Siacutentomas causados por Sss
Los siacutentomas de la enfermedad incluyen la induccioacuten de lesiones pustulosas corchosas con
centros polvosos formados a partir de la agregacioacuten de los quistosoros del patoacutegeno Con el
avance de estas lesiones es frecuente la ruptura del peridermo aunque el nivel de
penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente superficial Bajo condiciones oacuteptimas para el
desarrollo de la enfermedad es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten
de los tejidos y la formacioacuten de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la
enfermedad ademaacutes de causar los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular
de las plantas al inducir la formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas (Cotes et al
2006) que causan la disminucioacuten de la superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo a la
marchitez y finalmente a la muerte de las plantas Durante el almacenamiento la sarna
polvosa puede ocasionar pudriciones secas que sirven de entrada a otros patoacutegenos y
saproacutefitos que deterioran auacuten maacutes el producto (Agrios 1996) La infeccioacuten en las raiacuteces
especialmente cuando se forman agallas pueden causar una reduccioacuten en el funcionamiento
de la raiacutez por la interrupcioacuten de la toma de agua y de nutrientes (Lister et al 2004 Falloon
et al 2005)
En Colombia en los departamentos de Cundinamarca Boyacaacute Narintildeo y Antioquia Sss
afecta severamente las variedades de papa (Solanum tuberosum) Parda Pastusa y Diacol
Capiro y a la papa criolla (Solanum phureja) Los siacutentomas se observan en raiacuteces y
tubeacuterculos pero hay variacioacuten en las zonas paperas en cuanto a la distribucioacuten de los
siacutentomas entre los diferentes oacuterganos de la planta En Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de
Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre los tubeacuterculos de las variedades Parda
Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el departamento de Narintildeo y en el Oriente de
Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces Hasta ahora no se sabe si estas diferencias
se deben a variaciones en las condiciones ambientales de una regioacuten a otra o quizaacutes se
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deban a la distribucioacuten regional de diferentes razas del patoacutegeno yo a su interaccioacuten con el
ambiente (Jaramillo y Botero 2007)
En el Oriente Antioquentildeo se determinoacute la incidencia y el grado de severidad de 23
poblaciones de Sss bajo el sistema de rotacioacuten entre ICA Puraceacute-Diacol Capiro y viceversa
en tres cosechas sucesivas en condiciones de casa de malla Se observoacute que las poblaciones
del patoacutegeno no afectaron el peso ni causaron siacutentomas de sarna polvosa en los tubeacuterculos
pero si en las raiacuteces con diferentes grados de severidad en las dos variedades siendo maacutes
susceptible la variedad Diacol Capiro que al parecer favorecioacute el incremento del inoacuteculo
mientras que la ICA Puraceacute fue levemente afectada y posiblemente presentoacute efecto
supresivo sobre los quistosoros en el suelo (Jaramillo y Botero 2007)
Estudios realizados en el departamento de Narintildeo presentaron diferencias en el grado de
desarrollo de la enfermedad en raiacuteces La variedad Parda Pastusa fue la maacutes susceptible a
Sss con desarrollo de agallas desde el momento de la emergencia de las plantas La
enfermedad alcanzoacute valores de susceptibilidad del 100 en dicha variedad mientras que en
Diacol Capiro fue de 48 En los tubeacuterculos la enfermedad se manisfestoacute por la formacioacuten
de escasas y pequentildeas puacutestulas de color castantildeo con poca presencia de masas pulverulentas
de esporas de resistencia del patoacutegeno lo que contrasta con la regioacuten Cundiboyacense en
donde estas variedades se caracterizan por presentar una alta susceptibilidad a la rontildea en
tubeacuterculos ocasionando lesiones severas en las que resulta faacutecil encontrar esporas de
resistencia (Benavides 2006)
325 Control de Sss
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la carencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos efectivos (Qu y Christ
2006a) Seguacuten Harrison et al (1997) el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado
bajo un esquema integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como la
rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del tubeacuterculo semilla la
utilizacioacuten de organismos antagonistas (ie Trichoderma spp) la utilizacioacuten de cultivos
trampa la desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
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restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos de certificacioacuten de
semilla Dos estrategias que en la actualidad se consideran fundamentales para apoyar los
programas MIC en papa incluyen el mejoramiento geneacutetico por resistencia al pseudohongo
y la utilizacioacuten de cultivos trampa (Merz et al 2004)
Para el caso del mejoramiento los primeros reportes en la regioacuten Andina fueron
presentados por Torres et al (1995) quienes evaluaron 467 accesiones encontrando la
existencia de 17 genotipos resistentes y 33 moderadamente resistentes Por otra parte Lees
(2000) en Escocia evaluoacute los niveles de resistencia a Sss de una serie de clones de S
phureja encontrando que algunos de eacutestos presentaron un adecuado nivel de resistencia
por lo que esta especie fue propuesta como fuente de genes de resistencia Merz (2000) al
evaluar la reaccioacuten de 11 cultivares determinoacute que existe correlacioacuten entre las pruebas de
invernadero utilizando plaacutentulas provenientes de cultivo de tejidos y la resistencia
presentada en campo
Fallon et al (2003) realizaron un estudio en Australia con 99 cultivares de papa y 13
liacuteneas de mejoramiento durante 11 antildeos Sus resultados indicaron que el 21 de los
materiales evaluados eran resistentes mientras que el 28 presentoacute una resistencia
moderada Estos autores tambieacuten reportaron que la expresioacuten de la resistencia variacutea entre
antildeos y que los bioensayos realizados en invernadero no siempre se correlacionan con la
respuesta presentada en campo sugiriendo una fuerte interaccioacuten genotipo-ambiente para
esta caracteriacutestica
Nitzan et al (2010) evaluaron la estabilidad de la resistencia geneacutetica de 24 genotipos de
papa a Sss en los estados de Washington e Idaho en Estados Unidos Se identificoacute que la
resistencia era estable a la formacioacuten de agallas en las raiacuteces causada por Sss y se determinoacute
que una gran proporcioacuten de la variacioacuten fue geneacutetica lo que permite a los mejoradores usar
genotipos resistentes y estables de papa como progenitores en el desarrollo de cultivares
comerciales con resistencia a este patoacutegeno debido a que contar con materiales geneacuteticos
resistentes es una de las principales estrategias de manejo de la enfermedad (Rodriacuteguez et
al 2009 Houser y Davidson 2010)
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Seguacuten Merz et al (2012) no existen meacutetodos de control eficientes y econoacutemicos que se
encuentren disponibles actualmente y la resistencia del hospedero es clave para el manejo
integrado de la enfermedad debido a esto se evaluaron 10 cultivares con diferentes rangos
de susceptibilidad a Sss y a PMTV en diferentes paiacuteses de Europa Para evitar discrepancias
en los criterios de evaluacioacuten se utilizoacute una escala estaacutendar para los niveles de la sarna
polvosa determinaacutendose que los cultivares se comportaron como estaba establecido en su
caracterizacioacuten inicial (a excepcioacuten de uno de ellos) Los resultados del ensayo de campo
indicaron que los diferentes meacutetodos de valoracioacuten son el principal factor de discrepancia
en las calificaciones de la resistencia y que las condiciones ambientales yo el nivel de
inoacuteculo del suelo juegan un papel menor
Otra estrategia con alto potencial para el manejo de la enfermedad es la rotacioacuten del cultivo
con plantas trampa que reducen el nivel de estructuras de resistencia de
plasmodiophoromycetes Por ejemplo es ampliamente conocido que la siembra de
Raphanus sativus reduce la cantidad de quistes de Plasmodiophora brassicae en el suelo
(Murakami et al 2000) mientras que la planta Datura stramonium redujo el nivel de Sss en
un 79 en cultivos de papa de Australia
En Colombia la buacutesqueda de herramientas para el manejo de la enfermedad bajo las
condiciones regionales de las zonas productoras de papa se enfoca en la evaluacioacuten de
sistemas de rotacioacuten de variedades comerciales que tradicionalmente se han considerado
altamente susceptibles a la enfermedad (ie Diacol Capiro) con variedades maacutes tolerantes al
ataque del patoacutegeno (ie ICA Puraceacute) encontraacutendose que efectivamente esta uacuteltima
variedad presenta un menor nivel de susceptibilidad a la sarna polvosa (Jaramillo et al
2003 Jaramillo y Botero 2007)
En cuanto al control bioloacutegico de Sss Gilchrist (2009) evaluoacute una cepa de Trichoderma
previamente considerada por Hoyos et al (2002) como potencialmente uacutetil para el control
bioloacutegico de Sss en la variedad Diacol Capiro Las pruebas fueron realizadas en campo
utilizando tres dosis de aplicacioacuten del biocontrolador Se encontroacute que la aplicacioacuten de T
asperellum T109 redujo un 64 y 54 los efectos de la sarna polvosa en el crecimiento y
15
en la produccioacuten de las variedades respectivamente De esta forma se resalta el potencial
de la cepa como biocontroladora contra Sss teniendo en cuenta que se debe ampliar el
conocimiento acerca de los factores que limitan la accioacuten de T asperellum T109 en el
campo y coacutemo compensarlo aumentando la frecuencia de aplicacioacuten En un trabajo similar
se investigoacute la influencia de cuatro aislamientos de T asperellum sobre la sarna polvosa en
tres tipos de suelo Andisol Entisol e Inceptisol No se encontraron diferencias
significativas entre las plantas de papa tratadas y no tratadas con T asperellum pero siacute se
encontroacute que la reduccioacuten del crecimiento y la produccioacuten estuvieron inversamente
asociadas con el contenido de Al2+
en los suelos sugiriendo que los efectos de la sarna
polvosa estaacuten fuertemente relacionados con las condiciones del suelo (Gilchrist et al 2009)
Estudios sobre la evaluacioacuten de estrategias de manejo de la rontildea polvosa en tres regiones
productoras de papa en Colombia han incluido resultados sobre la biologiacutea y patologiacutea de
Sss en la Sabana de Bogotaacute y sus hallazgos maacutes importantes consisten en la puesta en
marcha de un sistema de bioensayos en los cuales ha sido posible inducir la liberacioacuten de
zoosporas bajo condiciones de laboratorio Otros estudios incluyen la evaluacioacuten del efecto
de fungicidas aplicados al suelo para el manejo de Sss Sin embargo se determinoacute que
ninguno de los fungicidas evaluados (Tiabendazol Tolclofos metil Benomyl Carbendazin
Clorotalonil y Mancozeb) contribuyeron con el control del patoacutegeno en raiacuteces y tubeacuterculos
bajo las dosis y condiciones de tres localidades productoras de papa (Subachoque Medelliacuten
(Corregimiento Santa Elena) y Pasto) (Garciacutea y Navia 2002) En contraste Falloon et al
(2010) realizaron aplicaciones en campo del fungicida Mancozeb el cual contiene Zn y
Mn Las dosis estuvieron determinadas como baja similar y alta con respecto al contenido
de estos elementos en el suelo cultivado con papa cv Iwa (considerado muy susceptible a
Sss) Se encontroacute que niveles elevados de Zn y Mn generan infecciones moderadas de Sss
en las raiacuteces del cultivar evaluado de S tuberosum
Otras investigaciones para el manejo de Sss han incluiacutedo la evaluacioacuten de potenciales
biocontroladores (Trichoderma harzianum y Pseudomonas fluorescens) un consorcio de
micorrizas y viruta de pino como tratamientos Se encontraron diferencias estadiacutesticamente
significativas entre el testigo y P fluorescens y los tratamientos con T harzianum
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micorrizas y viruta presentando una incidencia en raiacuteces de 32 21 y 5 3 y 1
respectivamente Los tratamientos con T harzianum micorriza y viruta tuvieron los
porcentajes de incidencia maacutes altos pero contrastaron con niveles muy bajos de severidad
de la enfermendad (022 0088 y 0019 respectivamente) Sin embargo no se
obtuvieron incrementos en peso seco de raiacuteces peso de tubeacuterculos y peso seco de la parte
aeacuterea cuando se realizaron las inoculaciones de los diferentes agentes de control y las
aplicaciones de la viruta de pino (Restrepo et al 2009)
Arias (2011) realizoacute un anaacutelisis y comparacioacuten de glucosinolatos presentes en diferentes
accesiones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control de
Sss Se estandarizaron los procedimientos de extraccioacuten del compuesto y las diferentes
formulaciones fueron probadas como biofumigante en el suelo donde posteriormente se
sembraron tubeacuterculos de papa criolla Sin embargo los resultados obtenidos no permitieron
establecer un posible potencial biofumigante de las accesiones evaluadas y es necesario
profundizar en los estudios que permitan determinar el efecto de los glucosinolatos y de
otros compuestos sobre el patoacutegeno
33 Deteccioacuten de Sss
La deteccioacuten del inoacuteculo a nivel del suelo es compleja y es evaluada precariamente a partir
de sistemas de trampeo que utilizan plaacutentulas de tomate (Merz 1989) o de papa (Wale et al
1993) Estas evaluaciones son criacuteticas para definir relaciones entre el grado de infestacioacuten
de los suelos y los niveles de enfermedad observados en el campo requisito fundamental
para la implementacioacuten de cualquier medida de control (Merz et al 2005)
Con el objetivo de buscar alternativas para alcanzar mayores rangos de sensibilidad en la
deteccioacuten de Sss se han explorado diversas metodologiacuteas basadas en teacutecnicas seroloacutegicas y
moleculares Entre las primeras se destacan la generacioacuten de anticuerpos policlonales que
detectan quistosoros del protozoo bajo un sistema ELISA (Harrison et al 1993 Walsh et
al 1996) Sin embargo la utilidad de estos anticuerpos es reducida debido a que no detecta
el estado plasmodial (Ward et al 2004) Maacutes recientemente Merz et al (2005)
desarrollaron una prueba para la evaluacioacuten rutinaria de la presencia del patoacutegeno basada
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en anticuerpos monoclonales derivados de quistosoros como antiacutegenos alcanzando niveles
de sensibilidad de menos de un quistosoro por tubeacuterculo A partir de esto se generoacute la
herramienta ldquoSss AgriStriprdquo una prueba basada en un inmunoensayo de flujo lateral cuya
precisioacuten y sensibilidad fue evaluada por Bouchek-Mechiche et al (2011) para la
deteccioacuten de Sss Se comparoacute con teacutecnicas de microscopiacutea ELISA PCR y qPCR que
detectaron Sss en lesiones tiacutepicas de sarna polvosa Asiacute mismo se realizaron pruebas en los
lotes que presentaban lesiones tiacutepicas y atiacutepicas causadas por el patoacutegeno y se confirmoacute la
presencia de Sss en todas las lesiones con todos los meacutetodos probados Se concluyoacute que el
Sss AgriStrip es una prueba tan sensible como DAS- ELISA con un liacutemite de deteccioacuten de 1
a 10 quistosoros por mL de buffer
Con respecto a las metodologiacuteas moleculares se ha utilizado PCR convencional a partir de
los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 (Bulman y Marshall 1998) Sps1Sps2 (Bell et al
1999) y SsFSsR (Qu et al 2006) que amplifican las regiones ITS del ADNr
Los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 disentildeados por Bulman y Marshall (1998) detectaron
Sss en las muestras evaluadas y no presentaron reaccioacuten cruzada con otros
plasmodiophoridos como Spongospora subterranea f sp nasturtii Plasmodiophora
brassicae Sorosphaera veronicae y Polymyxa graminis asiacute como con el causante de la
sarna comuacuten Streptomyces scabies demostrando la utilidad de estos cebadores en la
deteccioacuten de Sss realizada por estos investigadores
Bell et al (1999) obtuvieron secuencias parciales del ITS de 391pb con los cebadores Sps
1 y Sps 2 para la deteccioacuten y cuantificacioacuten de Sss en la corteza tubeacuterculos lavados y
suelos cultivados con papa Las pruebas desarrolladas mostraron ser maacutes sensibles que los
inmunoensayos previamente reportados y fueron maacutes raacutepidas y sencillas que los ensayos
convencionales con plantas trampa
Qu et al (2006) utilizaron la teacutecnica de PCR para la identificacioacuten especiacutefica y
cuantificacioacuten de Sss Los cebadores SsF y SsR amplificaron un producto de 434 pb
proveniente de masas de esporas de Sss pero no se obtuvo el amplicoacuten cuando el ADN era
de papa sana de tubeacuterculos con sarna comuacuten o de otros plasmodiophoridos relacionados
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Asiacute mismo se detectoacute Sss en otros hospederos infectados que no presentaban siacutentomas y se
concluyoacute que la prueba es tan sensible que puede detectar 1 quiste g-1
Adicionalmente con
esta teacutecnica se logroacute la cuantificacioacuten de Sss en el suelo logrando identificar valores de 1 a
104 quistosoros por 025 g de suelo
La implementacioacuten de meacutetodos para la deteccioacuten de Sss ha permitido el desarrollo de
procedimientos que permiten una raacutepida y automatizada extraccioacuten de ADN combinada
con PCR en tiempo real utilizando sondas Taqmanreg para avanzar en el diagnoacutestico
rutinario de la sarna polvosa (Lees et al 2002 van de Graff et al 2003 Ward et al 2004
Qu et al 2011) o PCR competitivo o cuantitativo (Qu et al 2006 Shah et al 2009) En esta
prueba se utiliza un control interno de ADN de papa (citocromo oxidasa) para hacerla maacutes
confiable y evitar falsos negativos La validacioacuten de dicha metodologiacutea se realizoacute a partir
de la evaluacioacuten de 37 muestras de tubeacuterculos de varios cultivares procedentes de diversas
localidades del Reino Unido La prueba detectoacute el patoacutegeno en todas las muestras que eran
sospechosas de tenerlo asiacute como en tubeacuterculos que no presentaban quistosoros observables
La prueba con la sonda Taqman demostroacute ser 100 veces maacutes sensible que la PCR
convencional (Ward et al 2005) y la ELISA (Ward et al 2004) Estas pruebas han
permitido determinar el efecto del nivel de inoacuteculo en el suelo y de algunos factores
ambientales en la infeccioacuten y desarrollo de agallas en raiacuteces de papa causadas por Sss (van
de Graaf et al 2007) En Gran Bretantildea la teacutecnica de PCR en tiempo real permitioacute detectar
confiablemente y establecer la cantidad de ADN de los quistorosos zoosporas y
plasmodiozoosporangios del patoacutegeno asiacute mismo se determinoacute la viabilidad de los quistes
en el suelo y en combinacioacuten con el uso de plantas trampa se estudioacute la liberacioacuten de
zoosporas y los niveles de infeccioacuten en papa bajo diferentes condiciones ambientales
permitiendo conocer con maacutes detalle varios aspectos de la epidemiologiacutea de la enfermedad
(Lees et al 2008)
Otras variaciones de estas teacutecnicas como la muacuteltiple qPCR utilizando sondas TaqManreg ha
permitido la deteccioacuten y diferenciacioacuten simultaacutenea de la sarna polvosa y la sarna comuacuten
dos enfermedades del tubeacuterculo que causan siacutentomas similares pero que son ocasionadas
por patoacutegenos diferentes (Sss vs Streptomyces spp) (Qu et al 2011) Finalmente como una
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teacutecnica de diagnoacutestico simultaacuteneo de diferentes patoacutegenos de papa se ha desarrollado un
chip para su anaacutelisis en microarreglos siendo incorporada la deteccioacuten de Sss (Zhang et al
2008)
En Colombia la utilizacioacuten de meacutetodos de deteccioacuten de Sss en tubeacuterculos y suelos ha
estado dada por la evaluacioacuten visual de sintomatologiacuteas en raiacuteces y tubeacuterculos la
evaluacioacuten de bioensayos (Rodriacuteguez et al 2002) y la utilizacioacuten de PCR convencional
utilizando cebadores especiacuteficos (Jaramillo et al 2003 Carrentildeo 2009) Se han utilizado
combinaciones de diversos cebadores que permiten la amplificacioacuten de la regioacuten ITS del
ADNr del patoacutegeno (Spo1-Spo2 Spo8-Spo9 y Sps1- Sps2) los cuales permiten obtener
productos de 372 390 y 391 pb respectivamente (Saavedra et al 2004) Ramiacuterez (2010)
obtuvo amplificacioacuten de los fragmentos del tamantildeo esperado utilizando los cebadores
Spo8Spo9 y SsFSsR para analizar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de Sss
provenientes de La Unioacuten (Antioquia) encontrando una estructura clonal de los
aislamientos evaluados mientras que Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS
y SSCP (Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) con un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones del paiacutes establecioacute la presencia de subpoblaciones del
patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado
34 Variabilidad geneacutetica de Sss
La disponibilidad de cultivares resistentes a Sss debe ser una prioridad en el disentildeo de
futuras estrategias de manejo de la enfermedad Los mejoradores tratan de incluir
resistencia en los nuevos cultivares seleccionando liacuteneas contra un rango de patoacutegenos que
representan la diversidad geneacutetica conocida con el fin de seleccionar la resistencia maacutes
durable Sin embargo poco es conocido acerca de la variacioacuten geneacutetica de Sss o del papel
de la recombinacioacuten sexual en su ciclo de vida (Merz y Falloon 2009)
Los estudios geneacuteticos de Sss han sido difiacuteciles de aplicar debido a razones como las
siguientes obtener y mantener el patoacutegeno es complicado por su naturaleza de paraacutesito
obligado no han existido meacutetodos disponibles para el aislamiento de quistosoros
individuales el desarrollo de la sarna polvosa estaacute influenciado por condiciones
20
ambientales y los estaacutendares de inoculacioacuten y los cultivares de referencia no han sido bien
establecidos (Qu y Christ 2006b)
Los sistemas de deteccioacuten basados en aacutecidos nucleicos ofrecen sensibilidad y especificidad
para la cuantificacioacuten de inoacuteculo (Mutasa et al 1993) En estudios previos amplificando
regiones del ITS del ADNr fueron identificados dos agrupaciones de Sss en Australia y
Europa (tipo I y II) (Bulman y Marshall 1998) Posteriormente se realizoacute una
investigacioacuten sobre la variabilidad geneacutetica de 52 aislamientos de Islas Britaacutenicas y
Norteameacuterica que fueron amplificados por PCR Se identificaron dos grupos geneacuteticamente
diferentes (I y II) que representaron el 346 y el 654 de los aislamientos
respectivamente Sin embargo en Norteameacuterica los aislamientos soacutelo perteneciacutean al grupo
II (Qu y Christ 2004) Debido a que el anaacutelisis de secuencia de ITS se basa en un solo
locus para la deteccioacuten de la variacioacuten geneacutetica los anaacutelisis con marcadores moleculares
que comprendan diferentes partes del genoma del patoacutegeno son necesarios para obtener una
imagen amplia de la variacioacuten geneacutetica y estructura poblacional de Sss
El uso de marcadores moleculares tales como RAPDs (ADN polimoacuterfico amplificado al
azar) y AFLPs (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados) han sido
usados para estudiar la diversidad geneacutetica en muchos patoacutegenos de plantas sin embargo
tales marcadores no estaacuten disponibles para Sss Es complejo obtener estructuras
individuales del patoacutegeno y la uacutenica forma es la obtencioacuten de quistosoros que pueden traer
contaminantes secundarios o contener tejido de la planta Por lo tanto es difiacutecil obtener
ADN puro del patoacutegeno un paso indispensable para llevar a cabo la PCR basada en
marcadores moleculares (Qu y Christ 2006b)
Wuumlerzer (1964) caracterizoacute 17 colecciones de Sss de Europa y Ameacuterica seguacuten el tamantildeo
del quistosoro pero no encontroacute evidencia bioloacutegica significativa de este agrupamiento
Posteriormente se detectoacute variacioacuten geneacutetica (divergencia 51) en secuencias de ADN de
los ITS1 e ITS2 de colecciones de Sss originarias de diferentes continentes (Bulman y
Marshall 1998) Las colecciones de Australasia y Europa incluidas en el grupo II diferiacutean
de otra coleccioacuten de Escocia que fueacute ideacutentica a dos colecciones de Sur Ameacuterica agrupadas
21
en el tipo I La existencia de estos grupos fue confirmada por Qu y Christ (2004) quienes
tambieacuten identificaron ambos grupos en colecciones de Escocia pero demostraron que soacutelo
la secuencia de tipo II es de ocurrencia en colecciones de Canadaacute y Estados Unidos
Los marcadores RFLPs (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccioacuten) son
codominantes y locus especiacutefico (McDonald y Martiacutenez 1990) Han sido utilizados
ampliamente para evaluar diversos genomas de patoacutegenos de plantas A pesar de que
consumen maacutes tiempo que los meacutetodos basados en PCR los RFLPs son maacutes reproducibles
y menos sensibles a contaminacioacuten de ADN que las pruebas basadas en PCR Qu y Christ
(2006b) realizaron un estudio maacutes detallado de colecciones de quistosoros obtenidas de
Estados Unidos y Canadaacute empleando marcadores RFLPs Encontraron variacioacuten geneacutetica
entre las localidades geograacuteficas pero no entre los individuos de una misma localidad lo
que sugirioacute que las poblaciones del campo son clones y no estaban sometidas a
recombinacioacuten sexual El anaacutelisis de agrupamiento permitioacute separar los aislamientos en
dos grupos el grupo I que incluyoacute aislmientos del oeste de Norte Ameacuterica (exceptuando
aislamientos de Colorado) y el grupo II incluyoacute aislamientos originarios del este de Norte
Ameacuterica y de Colorado Este estudio muestra que el uso de marcadores moleculares para
diferenciar aislamientos de quistosoros individuales facilitaraacute investigaciones adicionales
para determinar la estructura geneacutetica de poblaciones de Sss
En Colombia Ramiacuterez (2010) realizoacute un estudio sobre la variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss de La Unioacuten Antioquia Encontroacute que los anaacutelisis de secuencias de la
regioacuten ITS del ADNr presentaron altos niveles de similitud con cepas obtenidas del
Departamento de Narintildeo asiacute como con secuencias de referencia de cepas del tipo II de Sss
Este resultado permitioacute plantear que el patoacutegeno presenta un comportamiento clonal
aunque es necesario obtener informacioacuten de otras regiones del genoma que permitan
realizar anaacutelisis de muacuteltiples loci que conduzcan a una mayor aproximacioacuten sobre las
condiciones de variacioacuten de este patoacutegeno en el paiacutes
Otro estudio realizado por Carrentildeo (2009) sobre la variabilidad geneacutetica de Sss en
Colombia mediante el anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr permitioacute establecer la
22
presencia de subpoblaciones del patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Se
encontroacute una asociacioacuten directa entre las secuencias ITS del patoacutegeno y el oacutergano de la
planta infectado El tipo de ITS I se asocia aparentemente con infecciones de tubeacuterculo y el
tipo de ITS II lo hace con infecciones de raiacutez Esta investigacioacuten permitioacute descartar la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar hospedero o zona
geograacutefica Sin embargo de acuerdo con esta investigacioacuten es necesario realizar pruebas
que aborden otras aacutereas del genoma para corroborar los resultados encontrados Asiacute mismo
se comproboacute que en el paiacutes existen variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las
reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno Tres
variantes geneacuteticas de las cinco encontradas en este estudio difieren de las reportadas en la
literatura mundial
35 Generalidades del Potato mop-top virus (PMTV)
El PMTV es el agente causal de una importante enfermedad viral del cultivo de la papa
cuya distribucioacuten se encuentra registrada en diferentes lugares productores de este
tubeacuterculo como Irlanda Inglaterra Escocia Republica Checa Suiza Noruega Suecia
Dinamarca y Finlandia (Santala et al 2010) asiacute como en Japoacuten (Nakayama et al 2010) En
Ameacuterica ha sido registrado en Canadaacute y Estados Unidos (Xu et al 2004) En eacuteste uacuteltimo
paiacutes se reportoacute recientemente en los estados de North Dakota (David et al 2010) y en
Washington (Crosslin 2011) Nuevos reportes de este virus se continuan presentado en
otros paiacuteses del mundo como Polonia (Budziszewska et al 2010)
En Ameacuterica Central se ha encontrado en Costa Rica (Montero-Astua 2008) y aunque se
considera que es originario de la regioacuten de los Andes (Surameacuterica) soacutelo fue detectado en
Colombia en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) con la reconfirmacioacuten de su presencia en el antildeo
2010 (Gil et al 2011) El PMTV puede causar peacuterdidas de hasta 26 en rendimiento lo
que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera ascender a valores de
50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 Guerrero 2000) Seguacuten Salazar (2006)
el PMTV es uno de los virus que ha sido prevalente en el cultivo de la papa en los Andes
23
suramericanos pero su efecto sobre las variedades cultivadas en esta regioacuten no se ha
cuantificado claramente
351 Taxonomiacutea de PMTV
El PMTV pertenece al geacutenero Pomovirus virus con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20
nm en diaacutemetro y tres partiacuteculas con longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm
El geacutenero Pomovirus deriva su nombre de la especie tipo Potato mop-top virus y
actualmente se ubica en el la familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Los anaacutelisis
filogeneacuteticos de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRps) indican que el PMTV
estaacute relacionado maacutes estrechamente con el Beet soil-borne virus (Pomovirus) Broad bean
necrosis virus (Pomovirus) y Soil-borne Wheat mosaic virus (Furovirus) (Savenkov et al
1999)
Contiene tres moleacuteculas de ARNss con tamantildeos de 64 kb 3 kb y 25 kb con caperuzas
hacia el extremo 5rsquo y una estructura tipo ARNt hacia el extremo 3rsquo (Savenkov et al 1999
2003) El coeficiente de sedimentacioacuten de las partiacuteculas es de 230 170 y 125S
respectivamente El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene motivos de
metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del codoacuten de
finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999) Cerca del extremo
3acutedel ARN 2 se presenta una proteiacutena asociada a la transmisioacuten por el vector y generada a
partir de la supresioacuten del codoacuten de terminacioacuten del ORF que codifica para la caacutepside (CP)
Esta proteiacutena parece ser la responsable de la peacuterdida de la estructura helicoidal en los
extremos del ARN durante el proceso de desensamblaje (Sandgren et al 2001) El ARN 3
codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Tres de las
proteiacutenas producidas (TGB1 TGB2 y TGB3) estaacuten involucradas en el movimiento ceacutelula a
ceacutelula (Zamyatnin et al 2004) La funcioacuten de la cuarta proteiacutena una proteiacutena rica en
cisteiacutena parece ser la de actuar en el incremento de la virulencia sin embargo no es
indispensable para el proceso infectivo (Lukhovitskaya et al 2005) (Figura 1)
24
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV En las cajas se observan las proteiacutenas
para las que codifica el genoma Las flechas indican las proteiacutenas originadas y los ARN
subgenoacutemicos (ARNsg) Fuente httpwwwexpasychviralzoneall_by_species643html
Modificado por Gallo (2012)
352 Ciclo de la infeccioacuten de PMTV
La especie PMTV es transmitida por zoosporas de Sss que afecta los sistemas radiculares
de sus hospedantes Este virus tambieacuten puede ser transmitido por semilla asexual El virus
puede permanecer en las estructuras de resistencia de sus vectores por varios antildeos en el
suelo (Astier et al 2007 Dijkstra y Khan 2006) En los ensayos de transmisioacuten del virus se
ha observado que eacuteste es transmitido eficientemente a plantas indicadoras (ej N tabacum y
N benthamiana) a partir de muestras de suelo infestadas con quistes del patoacutegeno
(Campbell 1996 Veacutelez 2007)
25
El PMTV constituye un pequentildeo grupo de virus que para su movimiento sisteacutemico en la
planta hospedante no requiere de la expresioacuten de CP ni de la formacioacuten del virioacuten
(McGeachy y Barker 2000) debido a que el TGB le ofrece la posibilidad de mover el ARN
infeccioso a traveacutes de largas distancias en la planta (Melander et al 2001) Actualmente se
generan nuevas teoriacuteas acerca del movimiento de TGB en la planta y de la funcioacuten de cada
una de las proteiacutenas TGBp1 TGBp2 y TGBp3 en el movimiento ceacutelula a ceacutelula de PMTV
Shemyakina et al (2011) analizaron la localizacioacuten subcelular y el transporte de TGBp1
de acuerdo con los resultados obtenidos propusieron que la asociacioacuten de TGBp1 con los
microtuacutebulos puede ser importante para la formacioacuten de cuerpos de complejos de ribo-
nuacutecleo-proteiacutena viral destinada para el transporte a traveacutes de los plasmodesmos Estudios
similares han sido realizados por Wright et al (2010) cuyos resultados sugieren que TGB1
en PMTV requiere interaccioacuten con componentes nucleolares y posiblemente con
microtuacutebulos para el movimiento viral de ARN de larga distancia
El ARN desnudo se puede encontrar en tubeacuterculos asintomaacuteticos y causar una infeccioacuten
secundaria para la siguiente temporada de siembra (McGeachy y Barker 2000) La
manifestacioacuten de los siacutentomas caracteriacutesticos de la enfermedad depende de la presencia de
los tres ARN en el tejido (Savenkov et al 2003)
353 Rango de hospederos de PMTV
En condiciones experimentales el virus puede infectar plantas de las familias
Chenopodiaceae Solanaceae y Tetragoniaceae Dentro de estas se encuentran las plantas
que se usan para su diagnoacutestico las cuales corresponden a Nicotiana debneyi y
Chenopodium amaranticolor en las que se produce necrosis sisteacutemica y lesiones locales
conceacutentricas cafeacutes respectivamente Nicotiana benthamiana N debneyi N clevelandii y
N tabacum son las especies maacutes apropiadas para el mantenimiento y propagacioacuten del virus
bajo condiciones experimentales (ICTVdB 2006 Veacutelez 2007)
26
354 Siacutentomas causados por PMTV
La enfermedad inducida por PMTV presenta una amplia gama de siacutentomas dependiendo de
la variedad y de las condiciones ambientales siendo frecuente la presencia de anillos y
arcos de colores oscuros sobre la superficie de los tubeacuterculos mientras que internamente se
presentan arcos necrosados En infecciones secundarias los tubeacuterculos pueden mostrar
agrietamientos reticulados y profundos Adicionalmente los foliacuteolos de las plantas
afectadas pueden presentar moteados cloroacuteticos y liacuteneas con formas de V En la regioacuten
Andina la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos no es frecuente de observar pudiendo ser
igualmente inducidas por cepas necroacuteticas de PVY oacute por Streptomyces spp y Rhizoctonia
solani (Tenorio et al 2006) A nivel aeacutereo el virus tambieacuten puede inducir amarillamientos
enanismos y acortamiento de entrenudos (Salazar 1995)
En Escocia se estudioacute el efecto de los siacutentomas foliares causados por PMTV sobre el
rendimiento del cultivo los siacutentomas foliares y en el tubeacuterculo de varias generaciones de
siembra para la propagacioacuten de semilla de papa Se encontroacute que en los tubeacuterculos de
plantas sin siacutentomas rara vez se observan los siacutentomas foliares en la siguiente generacioacuten
Las plantas asintomaacuteticas produjeron maacutes tubeacuterculos infectados cuando eran derivadas de
plantas que presentaron siacutentomas foliares el antildeo anterior Adicionalmente la proporcioacuten de
plantas hijas con siacutentomas foliares provenientes de tubeacuterculos con siacutentomas foliares
tuvieron un rango de 19-41 en el antildeo y parecioacute estar asociado con la severidad de dichos
siacutentomas Asiacute mismo el siacutentoma de ldquospraingrdquo en los tubeacuterculos tendioacute a ser mayor en
plantas que presentaban siacutentomas foliares comparados con aquellas asintomaacuteticas Estos
resultados mostraron que la erradicacioacuten de plantas con siacutentomas foliares podriacutea mejorar la
fitosanidad del cultivo pero resulta impraacutectico cuando las plantas enfermas son muy
frecuentes (Carnegie et al 2010) Sin embargo los siacutentomas foliares son raramente
observados en variedades cultivadas actualmente en los paiacuteses noacuterdicos con excepcioacuten de
Noruega La razoacuten para estas diferencias de la etiologiacutea de la enfermedad no son
comprendidas pero puede ser que el clima marino maacutes huacutemedo en Noruega y Escocia
afecta la fisiologiacutea de la planta de papa e incrementa la infeccioacuten sisteacutemica por PMTV
(Santala et al 2010)
27
36 Deteccioacuten de PMTV
Para la deteccioacuten de PMTV se han utilizado diversas teacutecnicas de laboratorio Las primeras
pruebas incluyeron bioensayos con plantas indicadoras como Chenopodium amaranticolor
las cuales desarrollan los siacutentomas cuando son infectadas por PMTV Esta teacutecnica resulta
informativa pero tarda alrededor de 14 diacuteas para la expresioacuten de siacutentomas que en
ocasiones no son completamente confiables (Jeffries 1998)
Con el desarrollo de las pruebas ELISA se hizo posible la deteccioacuten de PMTV en dos diacuteas
sin embargo la generacioacuten de falsos negativos debido a la distribucioacuten erraacutetica del virus en
la planta ha hecho que se cuestione dicha teacutecnica Arif y Torrance (1996) realizaron
estudios de deteccioacuten de PMTV en muestras de tubeacuterculos de tres cultivares de papa
concluyendo que la combinacioacuten de tejidos de tubeacuterculos en la muestra incrementa la
probabilidad de deteccioacuten del virus En Dinamarca la utilizacioacuten de la teacutecnica DAS -
ELISA (Sandwich de anticuerpos doble - Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas)
tuvo alta confiabilidad para el seguimiento de la presencia de PMTV en 23 cultivares de
papa sembrados en campo (Nielsen y Moslashlgaard 1997)
La utilizacioacuten de teacutecnicas basadas en aacutecidos nucleicos ha llevado al desarrollo de meacutetodos
de deteccioacuten de alta sensibilidad La RT-PCR es uno de estos meacutetodos de deteccioacuten maacutes
sensible Arif et al (1994) compararon la confiabilidad de ELISA y RT-PCR en la
deteccioacuten de PMTV de raiacuteces y hojas de plantas trampa de Nicotiana debneyi Luego de
tres semanas de siembra la RT-PCR detectoacute el virus en ambos tejidos mientras que con
ELISA se obtuvo la deteccioacuten del virus soacutelo despueacutes de cinco semanas de la siembra A
pesar de que la teacutecnica RT-PCR es maacutes sensible la preparacioacuten de las muestras para este
meacutetodo lleva maacutes tiempo por lo tanto ELISA es considerada por algunos investigadores
como la teacutecnica maacutes econoacutemica y conveniente para el anaacutelisis rutinario de grandes
cantidades de muestras (Davey 2009)
Davey (2009) realizoacute estudios de deteccioacuten y cuantificacioacuten de PMTV utilizando qRT-
PCR y disentildeando un par de cebadores y una sonda para cada ARN del genoma del virus El
bioensayo desarrollado para las muestras de suelo fue muy efectivo en la deteccioacuten de
28
PMTV utilizando Solanum esculentum cv Monkeymaker como planta trampa y cuando se
usoacute en conjunto con qRT-PCR los resultados se obtuvieron maacutes raacutepidamente que los de
otros bioensayos previamente descritos por Arif et al (1994) quienes utilizaron
Chenopodium quinoa como planta trampa
Otros meacutetodos basados en RT-PCR han sido empleados en Japoacuten por Nakayama et al
(2010) mediante microplacas de hibridizacioacuten RT-PCR (RT-PCR-MPH) para la deteccioacuten
de PMTV con cebadores especiacuteficos y una sonda marcada en muestras provenientes de
raiacuteces de plantas de tomate Asiacute mismo el diagnoacutestico en muestras de suelo utilizando este
meacutetodo determinoacute que el 612 de los lotes muestreados estaban infectados con PMTV
La hibridizacioacuten especiacutefica basada en amplificacioacuten con cebadores con marcadores
fluorescentes (Flash-PCR) tambieacuten ha sido una teacutecnica basada en PCR que ha permitido la
deteccioacuten raacutepida y precisa de diferentes virus de la papa como el PMTV (Ryazantsev y
Zavriev 2009) De otro lado los microarreglos con sondas especiacutefica para virus pueden
detectar un nuacutemero casi ilimitado de especies de virus en un solo ensayo Nicolaisen
(2011) realizoacute un estudio de microarreglos con la utilizacioacuten de 152 sondas potencialmente
capaces de detectar 52 virus en papa (incluyendo PMTV) Las hibridizaciones del ADNc de
plantas infectadas mostraron que 49 de los 52 virus fueron positivos e identificados
correctamente a nivel de especie demostrando que esta teacutecnica puede contribuir a la
construccioacuten de microarreglos geneacutericos capaces de detectar la mayoriacutea sino todos los
virus de ARN de plantas
En Colombia la deteccioacuten de PMTV fue reportada por primera vez por Veacutelez (2007) Los
ensayos de RT-PCR permitieron determinar que el 81 de los suelos muestreados en el
estudio presentaron infeccioacuten por PMTV Este meacutetodo utilizando los cebadores H360
C819 fue maacutes sensible para la deteccioacuten de PMTV que la induccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras En estos bioensayos se encontroacute que las plantas de N tabacum fueron mejores
indicadoras de la expresioacuten de siacutentomas que las de N debneyi pero estas uacuteltimas son maacutes
sensibles para la deteccioacuten de PMTV por RT-PCR
29
Gil (2010) realizoacute la evaluacioacuten de la presencia del virus PMTV a partir de plantas de N
benthamiana inoculadas con quistosoros de Sss mediante pruebas de deteccioacuten seroloacutegica y
molecular Un total de 18 muestras de raiacuteces infectadas con Sss fueron evaluadas
encontraacutendose que cinco muestras de Antioquia y una de Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo
arrojaron resultados positivos en las pruebas de ELISA Al comparar estos resultados con
los obtenidos con qRT-PCR se encontroacute que la prueba de qRT-PCR determinoacute la presencia
del virus en el 45 de las muestras analizadas mientras que mediante ELISA y RT-PCR
convencional se diagnosticaron 25 y 28 de las muestras como positivas Sin embargo el
anaacutelisis estadiacutestico no indicoacute diferencias significativas al nivel del 95 entre las tres
pruebas analizadas Al observar individualmente la capacidad de las pruebas para detectar
PMTV resultoacute llamativo el hecho que algunas muestras fueran positivas para dos de las
tres pruebas e incluso se presentaron casos en los que la prueba de ELISA detectoacute el virus
pero no las pruebas basadas en RT-PCR lo cual sugirioacute problemas con la inhibicioacuten de las
reacciones enzimaacuteticas o con los cebadores empleados
37 Variabilidad geneacutetica de PMTV
A nivel mundial se han desarrollado investigaciones que reportan la presencia de bajos
niveles de variacioacuten entre genotipos de PMTV (Mayo et al 1996) Latvala-Kilby et al
(2009) caracterizaron el gen de la CP y un dominio de lectura continua del ARN 2 asiacute
como el gen 8K y la regioacuten no traducida 3acutedel ARN 3 (UTR) de 37 aislamientos de
Finlandia y Letonia Fueron encontrados dos tipos diferenciables de ARN 2 y ARN 3 La
secuenciacioacuten y los anaacutelisis de RFLP de los productos de PCR de dichas regiones
indicaron que la mayoriacutea de los aislamientos de PMTV que infectaron tubeacuterculos en estos
paiacuteses europeos comprenden los restrictotipos ARN 2-II y ARN 3-B
En estudios previos en los cuales las secuencias CP de tres aislamientos de Escocia y ocho
de Peruacute fueron analizadas por Mayo et al (1996) las cepas bajo anaacutelisis mostraron poca
variabilidad De forma similar las secuencias CP de seis aislamientos de Norteameacuterica
presentaron una identidad mayor al 97 con respecto a algunas secuencias de aislamientos
de PMTV de Europa (Xu et al 2004) En Dinamarca se reportoacute la presencia de dos grupos
30
de PMTV basado en anaacutelisis de las secuencias de CP encontrando que eacutestos comparten
98 de identidad pero con posibles diferencias en la reproduccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras (Nielsen y Nicolaisen 2003) Al parecer la variabilidad geneacutetica de los genes
de la CP en aislamientos de PMTV del norte de Europa y Norte Ameacuterica es limitada y
permite la deteccioacuten confiable del virus con los anticuerpos monoclonales y los cebadores
de la PCR usados actualmente (Santala et al 2010)
En Colombia Velez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo con alta identidad con aislamientos de Europa
y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por aislamientos colombianos Una
situacioacuten similar encontroacute Gil (2010) con aislamientos Colombianos de PMTV que
presentaron una estructura poblacional con bajos niveles de variabilidad pero con algunas
variantes divergentes con respecto a los genotipos de referencia mundial Dichas variantes
presentaron diferencias en sus secuencias de CP hasta del 24 con respecto al grupo
principal La contextualizacioacuten en el genoma viral de dos secuencias obtenidas por dicho
autor en cepas de PMTV del departamento de Antioquia indicoacute que se tratan de
aislamientos representativos del genoma ordinario de PMTV y no de las variantes
encontradas en el anaacutelisis filogeneacutetico Sus identidades para las porciones del ARN 2 y
ARN 3 secuenciadas fueron altas (gt97) con respecto a los genomas reportados en
trabajos anteriores (Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) por lo que se plantea la
necesidad de secuenciar dichas regiones en al menos un aislamiento de las variantes
referidas
Los resultados encontrados en esta investigacioacuten permiten plantear que el caso de PMTV
en Colombia es aparentemente singular dada la presencia de dos variantes geneacuteticas de los
altos niveles de infeccioacuten que genera Sss en cultivos de papa de diferentes departamentos y
de las diferencias notables en la manifestacioacuten de siacutentomas de la sarna polvosa entre
variedades locales (Carrentildeo 2009 Gilchrist et al 2009 Gil 2010) situacioacuten que amerita
continuar con los estudios de variabilidad geneacutetica y fenotiacutepica en dichos patosistemas
31
BIBLIOGRAFIA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Agrios GN 1996 Fitopatologiacutea Editorial Limusa Meacutexico
Andersen BAB Nicolaisen M Nielsen SL 2002 Alternative hosts for Potato mop-top
virus genus Pomovirus and its vector Spongospora subterranea Potato Research 45 37-
43
Arias CMM 2011 Anaacutelisis y comparacioacuten de los glucosinolatos presentes en diferentes
acceciones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control
del patoacutegeno de la papa Spongospora subterranea Tesis de Maestriacutea en Ciencias Quiacutemicas
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Departamento de quiacutemica
Bogataacute Colombia
Arif M Torrance L Reavy B 1994 Improved efficiency of detection of potato mop- top
furovirus in potato tubers and in the roots and leaves of soil-bait plants Potato Research
37 373-381
Arif M Torrance L 1996 Detection of Potato mop-top virus in potato tubers Proceedings
Crop Protection in Northern Britain 325-330
Astier S Albouy J Maury Y Robaglia C Lecoq H 2007 Principles of plant virology
genome pathogenicity virus ecology Science Publishers Enfield NH USA P 112
Bell KS Roberts J Verral S Cullen DW Williams NA Harison JG 1999 Detection and
quantification of Spongospora subterranea fsp subterranea in soils and on tubers using
specific primers PCR primers European Journal of Plant Pathology 105905-915
Benavides PJA 2006 Incidencia y severidad de la rontildea de la papa causada por
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh f sp subterranea Tomlinson en raiacuteces y
tubeacuterculos de Diacol Capiro y Parda Pastusa en tres eacutepocas de siembra en el departamento
32
de Narintildeo y su efecto en los rendimientos (Tesis de maestriacutea) Bogotaacute Colombia Facultad
de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid diagnostic
test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European Journal of Plant
Pathology 131 (2) 277-287
Budziszewska M Wieczorek P Nowaczyk K Borodynko N Pospieszny H Obrecircplaska-
Stecircplowska A 2010 First report of potato mop-top virus on potato in Poland Plant
Disease 94 (7) 920
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47759-766
Campell RN 1996 Fungal transmission of plant viruses Annuals Review of
Phytopathology 3487-108
Carnegie SF Cameron AM McCreath M 2010 Foliar symptoms caused by Potato mop-
top virus on potato plants during vegetative propagation in Scotland and their association
with tuber yield spraing and tuber infection Potato Research 53 83-93
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia (Tesis de Maestriacutea) Bogotaacute
Colombia Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Colombia
Cerovska N Pecenkeva T Filigarovaacute M Dedic P 2007 Sequences analysis of the Czech
Potato Mop-Top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica 52(1) 61-
64
Cotes J Jaramillo S Gonzaacutelez L 2006 Evaluacioacuten de la incidencia de sarna polvosa en
tres variedades de papas colombianas Congreso Internacional de papa John S
Niederhauser Meacutexicop O-7 ISBN 968-02-0270-4
33
Crosslin JM 2011 First report of potato mop-top virus on potatoes in Washington State
Plant Disease 95 (11)1483
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
David N Mallik I Crosslin JM Gudmestad NC 2010 Firt report of Potato mop-top virus
in North Dakota Plant Disease 94 (12)1506
Dick MW 2001 Straminipilous fungi systematic of the Peronosporomycetes including
accounts of the marine straminipilous protist the plasmodiophorids and similar organisms
Kluwer Dordrecht
Dijkstra J Khan JA 2006 Handbook of Plant Virology Haworth Press Inc New York
US Jawaid A Khan Jeanne Dijkstra editors P 452
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC Scott CL 2010 Elevated zinc and manganese
levels give moderate reductions in Spongospora subterranea infection of potato roots In
Proceedings 6th Australasian Soilborne Diseases Symposium Twin Waters Queensland 9-
10 August 2010 P 46
Falloon RE Russell AG Wallace AR Butler RC 2003 Susceptibility of potato (Solanum
tuberosum) cultivars to powdery scab (caused by Spongospora subterranea) and
relationships between tuber and root infection Australasian Plant Pathology 32377-385
FAO 2008 Antildeo internacional de la papa (Citado 14 enero 2011) Disponible en
httpwwwpotato2008orgesmundoamerica_latinahtml
FAO 2009 Sustainable potato production Guidelines for developing countries (Citado 14
enero 2011) Disponible en ftpftpfaoorgdocrepfao012i1127ei1127epdf
34
Gallo GYM 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea Facultad de Medicina Universidad Nacional de Colombia
Bogotaacute Colombia
Garciacutea C Navia E 2002 Evaluacioacuten de estrateacutegias de manejo de la rontildea polvosa
(Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en Colombia
(Citado 14 Ene 2011) Disponible en
httpwwwredepapaorgpracticasculturalesred3html
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Gil RJF Mariacuten M 2010 Diagnoacutestico y caracterizacioacuten molecular de virus asociados al
cultivo de la papa en Colombia con eacutenfasis en el virus Mop Top (PMTV Pomovirus)
(Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia
Gilchrist RE 2009 Alternativas para el manejo integrado de la sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) (Tesis de Doctorado) Medelliacuten Colombia
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia
Gilchrist E Jaramillo S Reynaldi S 2009 Efecto sobre la sarna polvosa de cuatro
aislamientos del hongo Trichoderma asperellum en tres tipos de suelo Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 624783ndash4792
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
35
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tuber by enzyme-linked immunosorbent assay Plant pathology
42181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato-a review
Plant pathology 461-25
Hoyos L Peacuterez JC Jaramillo S Orduz S Ntildeustez C 2002 Evaluacioacuten del efecto de
Trichoderma spp sobre Spongospora subterranea en papa variedad Diacol Capiro bajo
condiciones de invernadero Subproyecto 4 de Evaluacioacuten de las estrategias de manejo de la
rontildea polvosa (Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en
Colombia 2002 Disponible en wwwcevipapaorgco
Hoyos CL Villegas OM Gonzalez JEP 2009 Observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Spongospora subterranea f sp subterranea en papa Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 62(2) 5039-5045
Houser AJ Davidson RD 2010 Development a greenhouse assay to evaluate potato
germplasm for susceptibility to powdery scab American Journal of Potato Research 87
285-298
ICTVdB 2006 Management Potato mop-top virus The Universal Virus Database version
4 Buumlchen-Osmond C (Ed) Columbia University New York USA (Citado 20 Dic 2010)
Disponible en httpwwwncbinlmnihgovICTVdbICTVdB00086001001htm
Jaramillo S Calderoacuten H Narvaacuteez C Machuca A Afanador L Hincapieacute L Correa G 2003
Caracterizacioacuten de la variabilidad patogeacutenica y molecular de Spongospora subterranea
Informe final fase 2 Convenio Universidad Nacional Sede Medelliacuten y CEVIPAPA
Medelliacuten p 80
Jaramillo S Gonzaacutelez L Cotes J 2006 Efecto del tipo de suelo sobre la sarna polvosa
causada por Spongospora subterranea f sp subterranea (Wall) Lagerheim en papa
36
Congreso Internacional de papa John S Niederhauser Meacutexico p O-6ISBN 968-02-0270-
4
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos cultivares de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista de la Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 60(2)
3859-3876
Jaramillo VS Peacuterez AGA Hoyos CLM 2008 Variacioacuten morfoloacutegica de quistosoros de
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh fsp subterranea Revista Facultad de
Agronomiacutea ndash Medelliacuten 61(2)4511-4517
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Jones RAC Harrison BD 1969 The behaviour of Potato mop top virus in soil and
evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wall) Lagerh Annals Applied
Biology 63 1-17
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 71 47-57
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003 First
Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease 87872
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99(5)519-531
Lees AK 2000 Summary of the session on past and present research on powdery scab
Past and present Research Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery
scab Workshop Aberdeen Scottland July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) P 55-57
37
Lees AK van de Graaf P Cullen DW Duncan JM 2002 The development of a
quantitative real-time PCR assay for Spongospora subterranea f sp subterranea and its
use in epidemiological studies In Proceedings of the 5th
symposium of the international
working group on plant viruses with fungal vectors Institute of Plant Science Swiss
Federal Institute of Technology (ETH) Zurich Switzerland July 22-25 2002 P31
Lees AK van de Graaf P Wale S 2008 The identification and detection of Spongospora
subterranea and factors affecting infection and disease American Journal of Potato
Research 85 247-252
Lister RA Falloon RE Curtin D Butler C 2004 Spongospora subterranea reduces host
(Solanum tuberosum) growth Proceedings of 3rd
Australasian Soilborne Diseases
Symposium Barossa Valley South Australia 9-11 February 2004
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization and
effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal of
General Virology 862879-2889
Lyman GR Rogers JT 1915 The native habitat of Spongospora subterranea Science
42940-2
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2005 La cadena de la papa en
Colombia Una mirada a su estructura y dinaacutemica 1991-2005 Documento de trabajo Ndeg 54
(Citado 13 Ene 2011) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet2005112163731_caracterizacion_papapdf
MADR (Ministerio de agricultura y desarrollo rural) 2006 Observatorio agrocadenas
Colombia Documento de trabajo No 100 La cadena de la papa en Colombia Una mirada
global de su estructura y dinamica 1991-2005 (Citado 20 Dic de 2011) Disponible en
httpwwwagrocadenasgovco
38
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009a Memorias 2008- 2009
(Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwminagriculturagovcoarchivosmemorias_minagricultura_2009_completopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009b Anuario estadiacutestico del
sector agropecuario y pesquero Direccioacuten de poliacutetica sectorial Grupo sistemas de
informacioacuten Bogotaacute DC (Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwhtm3bpublicanuarioanuariopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural)ndashENA (Encuesta Nacional
Agropecuaria) 2009 Oferta Agropecuaria cifras 2009 (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet201046112648_RESULTADOS_ENA_200
9pdf
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C Salazar
LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top virus
from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
McDonald BA Martinez JP 1990 Restriction fragment length polymorphisms in Septoria
tritici occur at a high frequency Current Genetics 17133-138
McGeachy KD Barker H 2000 Potato mop-top virus RNA can move long distance in the
absence of coat protein Evidence from resistant transgenic plants Molecular Plant
Microbe Interactions 13125-128
Melander M Lee M Sandgren M 2001 Reduction in Potato mop-top virus accumulation
and incidence in tubers of potato transformed with a modified triple gene block gene of
PMTV Molecular Breeding 8197-206
Merz U 1989 Infectivity inoculum density and germination of Spongospora subterranea
resting spores a solution culture test system Bulletin OEPP 19 585-592
39
Merz U 2000 Powdery scab Research in Switzerland Past and present Research
Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery scab Workshop Scottland
July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) 2000 p 67-71
Merz U 2008 Powdery Scab of PotatomdashOccurrence Life Cycle and Epidemiology
American Journal of Potato Reserch 85241ndash246
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar
x environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Merz U Martiacutenez V Schwaumlrzel R 2004 The potencial for the rapid screening of potato
cultivars (Solanum tuberosum) for resistance to powdery scab (Spongospora subterranea)
using a laboratory bioassay European Journal of Plant Pathology 110 71-77
Merz U Walsh JA Bouchek-Mechiche K Oberhaumlnsli TH Bitterlin W 2005 Improved
immunological detection of Spongospora subterranea European Journal of Plant
Pathology 111371ndash379
Merz U Falloon RE 2009 Review Powdery scab of potato-increased knowledge of
pathogen biology and disease epidemiology for effective disease management Potato
Research 5217-37
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert HR 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar x
environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Montero-Astua M Vasquez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
40
Murakami H Tsushima S Akimoto T Murakami K Goto I Shishido Y 2000 Effects of
growing leafy daikon (Raphanus sativus) on populations of Plasmidiophora brassicae
(clubroot) Plant Pathology 49584-589
Mutasa ES Ward E Adams MJ Collier CR Chwarszcynska D Asher MJC 1993 A
sensitive DNA probe for the detection of Polymyxa betae in sugar beet roots Physiological
and Molecular Plant Pathology 43 379-390
Mutasa-Gottgens ES Chwarszczynska Halsey H Asher MJC 2000 Specific polyclonal
antibodies for the obligate plant parasite Polymyxa a targeted recombinant DNA approach
Plant Pathology 49276-87
Nakayama T Maoka T Hataya T Motoshige S Fuwa S Mori M 2010 Diagnosis of
Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-285
Nicolaisen M 2011 An oligonucleotide-based microarray for detection of plant RNA
viruses Journal of Virological Methods 173 137-143
Nielsen SL Moslashlgaard JP 1997 Incidence appearance and development of potato mop-top
furovirus-induced sprain in potato cultivars and the influence on yield distribution in
Denmark and detection of the virus in tubers by ELISA Potato Research 40101-110
Nielsen S Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups within
Potato mop-top virus Archives of Virology 148381ndash388
Nitzan N Boydston R Batchelor D Crosslin J Brown C 2009 Hairy nightshade is an
alternative host of Spongospora subterranea the potato powdery sacab pathogen
American Journal of Potato Research 86 297-303
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
41
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006a The host range of Spongospora subterranea f sp subterranea in
the United States American Journal of Potato Research 83343-347
Qu XS Christ BJ 2006b Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea fsp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Ramiacuterez GJG 2010 Variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp subterranea
en suelos del municipio de unioacuten cultivados con la coleccioacuten Central colombiana de
Solanum phureja (Tesis de Pregrado) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias
Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia 2010
Restrepo DAF Jaramillo VS Cotes TJM 2009 Efecto de dos microorganismos y un
consorcio de micorrizas en combinacioacuten con viruta de pino sobre el control de sarna
polvosa (Spongospora subterranea) en papa Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea
Medelliacuten 62(2) 5047-5054
Rodriacuteguez K Maldonado Y Murcia L Huertas W Vaacutesquez M Zambrano A Rivero R
Garciacutea C 2002 Evaluacioacuten de protocolos para la deteccioacuten de patoacutegenos del suelo en Papa
(Rhizoctonia Rosellinia y Spongospora) (Citado 15 Ene 2011) Disponible en
httpwwwtodopapacomarpdfprotocolospdf
42
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista Facultad Agronomiacutea 26 (4) Caracas
Ryazantsev DYu Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato plant pathogens Applied Molecular Biology 43(3) 515-523
Saavedra SCO Goacutemez GST Aacutengel DJE 2004 Deteccioacuten de secuencias especiacuteficas de
ADN de Spongospora subterranea en suelo y tubeacuterculos de papa Revista Colombiana de
Biotecnologiacutea 714-23
Salazar LF1995 Los virus de la papa y su control Centro Internacional de la Papa CIP
(Peruacute) Publicado por el Centro Internacional de la Papa P 226
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 49 43-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M Wieczorek
P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-Wiśniewska J Yin Z
Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E Taluntytė L Pūpola N
Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E Sozonov A Tikhonovich I
Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam G Valkonen JPT 2010 Detection
distribution and control of Potato mop-top virus a soil-borne virus in northern Europe
Annals of Applied Biology 157163-178
43
Savenkov EI Sandgren M Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003 Potato
mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich protein are
dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of General
Virology 841001-1005
Shah FA Falloon RE Bulman SR 2010 Nightshade weeds (Solanum spp) confirmed as
hosts of the potato pathogens Meloidogyne falax and Spongospora subterranea f sp
subterranea Australasian Plant Pathology 39 492-498
Shah FA Falloon RE Lister RA Butler RC McKay A Ophel-Keller K Khan I 2009
Relationships between Spongospora subterranea DNA in field soil and powdery scab in
harvested potatoes Conference Handbook 17th
Australasian Plant Pathology Society
Conference (APPS) 29 September-1 October 2009 P 148
Shemyakina EA Sclovyev AG Leonova OG Popenko VI Schiemann J Morozov SY
2011 The role of microtubule association in plasmodesmal targeting of potato mop-top
virus movement protein TGBp1 The Open Virology Journal 51-11
SINAIPA (Sistema nacional de informacioacuten de papa) 2002 La rontildea de la papa p 8-9 El
Correo de la Papa Boletiacuten mensual No 07 Colombia (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en wwwcevipapaorgcopublicacionespublicacionesphp
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Reserch 83423-31
Torres H Pacheco MA French ER 1995 Resistance of potato to powdery scab
(Spongospora subterranea) under Andean field conditions American Potato Journal
10355-363
44
van de Graff PV Lees AK Cullen DW Duncan JM 2003 Detection and quantification of
Spongospora subterranea soil water and tissue samples using real-time PCR European
Journal of Plant Pathology 109 589-597
van de Graff P Wale SJ Lees AK 2007 Factors affecting the incidence and severity of
Spongospora subterranea infection and galling in potato roots Plant Pathology 56 1005-
1013
Veacutelez B 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato mop- top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia (Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Nacional de Colombia
Villareal HJ Porras PD Santa A Lagoeyte J Muntildeoz D 2007 Costos de produccioacuten de
papa en las principales zonas productoras de Colombia Federacioacuten Colombiana de
productores de papa FEDEPAPA
Wale SJ Burgess PJ Burnett F 1993 Bioassay for Spongospora subterranea detection in
soil and its potential use in predicting scab in the field Abstract 1642 Sixth International
Congress of Plant Pathology Quebec Canada
Wallroth FW 1842 Der Knollenbrand der Kartoffel Linnaea 16 332
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea using monoclonal antibodies Plant pathology 44335-365
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2004 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165 875-85
Ward LI Beales PA Barnes AV Lane CR 2005 A Real-time PCR assay based method for
routine diagnosis of Spongospora subterranea on Potato tubers Journal Phytopathology
152 633-638
45
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI Torrance
L 2010 The N- terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required for the
nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant Microbe Interaction 23(1) 1486-1497
Wuumlrzer B 1964 Ergaumlzende Untersuchungen uumlber den Pulverschorf der Kartoffel und
dessen Erreger Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh diss Landwirtschaftliche
Hochschule Hohenheim Germany 1964
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top virus
in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
Zamyatnin JrAA Solovyev AG Savenkov EI Germundsson A Sandgren M Valkonen
JPT Morozov SY 2004 Transient coexpression of individual genes encoded by the triple
gene block of Potato mop-top virus reveals requirements for TGBp1 trafficking Molecular
Plant-Microbe Interactions 17(8) 921-930
Zhang N McCarthy ML Smart CD 2008 A macroarray system for the detection of fungal
and oomycete pathogens of solanaceous crops Plant Disease 92(6) 953-960
Zolan ME Pukilla PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinerus
Molecular and cellular Biology 6(1)195-200
46
RESULTADOS
4 ARTICULO 1
VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora subterranea f sp subterranea EN
COLOMBIA
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea IN
COLOMBIA
Ineacutes Osorio Giraldo1 Marcela Orozco Valencia
1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
1 Elena Paola
Gonzaacutelez Jaimes2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
Formato de la Revista Actualidades Bioloacutegicas ISSN 0304-3584
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
La Sarna polvosa de la papa (Spongospora subterranea fsp subterranea - Sss) es una de
las enfermedades re-emergentes maacutes importantes de este cultivo en Colombia El efecto
deleteacutereo de Sss no soacutelo se debe al dantildeo directo sobre el sistema radicular y la calidad de
los tubeacuterculos sino tambieacuten a que sus zoosporas transmiten el Potato mop-top virus
(PMTV Pomovirus) Sss genera quistosoros que actuacutean como estructuras de resistencia del
patoacutegeno en el suelo pudiendo permanecer viables por varias deacutecadas Por esto su manejo
debe fundamentarse en el uso de variedades tolerantes a la enfermedad y en el empleo de
tubeacuterculo-semilla certificado En esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variacioacuten de
127 aislamientos de Sss obtenidos en los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo con el fin de apoyar la seleccioacuten de aislamientos de Sss a evaluar
47
en programas de mejoramiento geneacutetico de papa y en el disentildeo de pruebas de deteccioacuten
asintomaacutetica del patoacutegeno Para esto se secuenciaron regiones ITS del ADN ribosomal y se
condujeron anaacutelisis filogeneacuteticos encontraacutendose la presencia de tres variantes principales
de Sss dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum
Abstract
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum
INTRODUCCIOacuteN
El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L) se ve afectado por diversos microorganismos
fitopatoacutegenos e insectos plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la re-emergencia de la
48
enfermedad denominada Sarna polvosa causada por el plasmodiofoacuterido Spongospora
subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp subterranea Tomlinson (Sss) Su efecto no solo se
debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten al deterioro en la calidad y apariencia
cosmeacutetica de los tubeacuterculos que reduce draacutesticamente su valor en el mercado (Merz y
Fallon 2009) Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop top virus (PMTV) uno de
los problemas virales de la papa que tiene caraacutecter cuarenteneario para diferentes paiacuteses del
mundo (Salazar 2006 Gil et al 2011)
Sss es originario de los Andes Surameacutericanos desde donde se dispersoacute gracias al mercado
mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber transcurrido maacutes de 150 antildeos desde su
primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado importancia en las uacuteltimas deacutecadas como
resultado de la siembra generalizada de materiales altamente susceptibles al patoacutegeno la
utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los cambios de eacutepocas de siembra hacia
periacuteodo huacutemedos las deficiencias en los sistemas de rotacioacuten de cultivos la falta de
programas de exclusioacuten y los altos estaacutendares exigidos por el mercado en la calidad
cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
Sss es un patoacutegeno obligado plasmodial que taxonoacutemicamente se ubica en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos son importantes patoacutegenos de vegetales
Spongospora subterranea fsp subterraena y f sp nasturtii Estos taxa fueron definidos
inicialmente como forma especialis (Merz y Falloon 2009) sin embargo con base en la
morfologiacutea de los zoosporangios rango de hospedantes y anaacutelisis filogeneacuteticos de regiones
ribosomales actualmente se acepta que representan dos especies diferentes (Qu y Christ
2004)
Los siacutentomas de la Sarna polvosa incluyen la induccioacuten en los tubeacuterculos de lesiones
pustulosas corchosas con centros pulverulentos formados a partir de la agregacioacuten de los
quistosoros del patoacutegeno (Figura 41) Con el avance de estas lesiones es frecuente la
49
ruptura del peridermo aunque el nivel de penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente
superficial (Carrentildeo 2009) Bajo condiciones oacuteptimas para el desarrollo de la enfermedad
es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten de los tejidos y la formacioacuten
de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la enfermedad ademaacutes de causar
los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular de las plantas al inducir la
formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas que causan la disminucioacuten de la
superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo marchitez y finalmente la muerte de las
plantas (Gilchrist 2009) La infeccioacuten en las raiacuteces especialmente cuando se forman
agallas puede causar una reduccioacuten en la toma de agua y de nutrientes por parte de las
plantas (Falloon et al 2005)
En los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Sss afecta
severamente las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y papa criolla (S phureja) Los
siacutentomas se observan en raiacuteces y tubeacuterculos pero hay variacioacuten entre las zonas paperas en
cuanto a la distribucioacuten de los siacutentomas en los diferentes oacuterganos de la planta En
Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre
los tubeacuterculos de las variedades Parda Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el
departamento de Narintildeo y el Oriente de Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces
Hasta ahora no se conoce si estas diferencias se deben a variaciones en las condiciones
ambientales de las regiones o a la ocurrencia de variantes geneacuteticas del patoacutegeno (Jaramillo
y Botero 2007 Carrentildeo 2009)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 en las cosechas de las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y Criolla Colombia
(Rodriacuteguez et al 2009 Gilchrist 2009) Adicionalmente a esta problemaacutetica la
diseminacioacuten del patoacutegeno se viene incrementando dramaacuteticamente en el paiacutes como
resultado de la baja calidad del tubeacuterculo-semilla utilizado por la mayoriacutea de los
agricultores la ausencia de variedades tolerantes al patoacutegeno y la deficiencia en la
asistencia teacutecnica que no cuenta con herramientas apropiadas para el diagnoacutestico
asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011) Su
manejo debe estar enmarcado bajo un esquema integrado del cultivo en el que se incluyan
50
aspectos como la rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del
tubeacuterculo-semilla utilizacioacuten de organismos antagonistas (ej Trichoderma spp) el empleo
de cultivos trampa la desinfeccioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten
que restrinja el movimiento de material contaminado y supervise maacutes detalladamente los
procesos de certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas
son utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado
del manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o
de Rhizoctoniasis (Carrentildeo 2009)
La problemaacutetica causada por esta enfermedad en las regiones cultivadoras de papa hace
necesario que se intensifiquen los esfuerzos por desarrollar metodologiacuteas de diagnoacutestico de
suelos y material vegetal que eviten la diseminacioacuten generalizada del plasmodiofoacuterido y de
su virus asociado PMTV entre regiones infectadas y libres de enfermedad siendo
especialmente importante el desarrollo de procedimientos que garanticen la sanidad de los
lotes dedicados a la produccioacuten de semilla Entre las diversas metodologiacuteas desarrolladas en
el mundo para el diagnoacutestico de este patoacutegeno se destacan la teacutecnica de ELISA con
anticuerpos policlonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Qu et al 2011) y pruebas de
flujo lateral (Bouchek-Mechiche et al 2011) Sin embargo estas teacutecnicas son de aplicacioacuten
limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas con base en los genotipos locales de los
patoacutegenos presentes en las regiones paperas del paiacutes Con el fin de suplir dicha carencia de
informacioacuten en esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss procedentes de las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia
mediante el anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr)
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Para la coleccioacuten de muestras de quistosoros de Sss proveniente de suelo raiacuteces y
tubeacuterculos se seleccionaron lotes en fincas con antecedentes de infeccioacuten seguacuten el registro
51
histoacuterico de los agricultores siguiendo la metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la
cual se utiliza un juego de tamices de 100 y 25 microm para la obtencioacuten de los quistosoros Por
cada lote se tomaron raiacuteces de plantas o tubeacuterculos sintomaacuteticos y una muestra de suelo de
500 gr Los sitios de coleccioacuten incluyeron las regiones cultivadoras de papa de los
municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio Subachoque y
Villa Pinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute Oicataacute (Boyacaacute) y Pasto e Ipiales
(Narintildeo) La investigacioacuten se propuso obtener un miacutenimo de 30 muestras de Sss por
departamento
Los quistosoros obtenidos a partir de muestras de suelos fueron inoculados en plantas de
Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo o plantas
trampa para incrementar el inoacuteculo siguiendo la metodologiacutea de Veacutelez (2007)
mantenieacutendose en casa de malla en el Centro Experimental Paysanduacute ubicado en el
corregimiento Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB 2550 msnm temperatura
media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) (Figura 42) Todas las muestras
fueron procesadas en los laboratorios de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad
Nacional de Colombia sede Medelliacuten y Sanidad Vegetal del Politeacutecnico Colombiano Jaime
Isaza Cadavid
Extraccioacuten de ADN
Para la obtencioacuten del ADN se empleoacute una modificacioacuten de la metodologiacutea de Doyle y
Doyle (1987) a partir de quistosoros extraiacutedos y de tejidos afectados de las plantas de papa
y plantas sentildeuelo En este procedimiento es necesaria la maceracioacuten con nitroacutegeno liacutequido
de los tejidos y se emplea como buffer de extraccioacuten una solucioacuten CTAB y 1
mercaptoetanol El lavado de la fase orgaacutenica se realiza con fenolcloroformo-alcohol
isoamiacutelico y la precipitacioacuten de los aacutecidos nucleicos con 1 voluacutemen de etanol absoluto y 01
voluacutemen de acetato de sodio 3M Finalmente el pellet generado es disuelto en agua
destilada esteacuteril y es sometido a digestioacuten de ARN mediante la adicioacuten de ribonucleasa A
(10 mgmL) (Ver protocolo 62) Cuando la presencia de inhibidores afectaba la eficiencia
52
de la PCR la extraccioacuten de ADN se realizoacute utilizando el kit DNeasy Plant (Qiagen
EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante con una ligera modificacioacuten en el paso
de elucioacuten de ADN que se realizoacute en dos etapas con 70 microL de agua destilada esteacuteril Para
determinar la concentracioacuten del ADN extraiacutedo se utilizoacute la lectura de absorbancia en las
longitudes de onda de 260 y 280 nm mediante un Nanodrop 2000C (Thermo EEUU)
obtenieacutendose un rango entre 10 y 112 ng de ADNμL con una relacioacuten 260280 de 15 a 19
(Tabla 41) La integridad del ADN se determinoacute realizando electroforesis en gel de agarosa
al 08 en buffer TBE 1X (TBE 5X 54 gL Tris 275 gL de aacutecido boacuterico 20 mLL de
EDTA 05M pH 80) suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) La visualizacioacuten de
las bandas se realizoacute utilizando el sistema digital de anaacutelisis Bio Doc Analyze (Biometra
Alemania) (Figura 43)
PCR de ITS del ADNr
Para la evaluacioacuten de los niveles de variacioacuten geneacutetica de Sss se realizaron PCR empleando
los cebadores especiacuteficos Spo8 (5 CTG GGT GCG ATT GTC TGT TG 3) y Spo9 (5 CAC
GCC AAT GGT TAG AGA CG 3) disentildeados por Bulman y Marshall (1998) asiacute como los
cebadores SsF (5acute GTC GGT TCT ACC GGC AGA CC 3acute) y SsR (5acute GCA CGC CAA
TGG TTA GAG ACG 3acute) reportados por Qu et al (2006) que amplifican productos de
391 y 434 pb de la regioacuten ITS del ADNr respectivamente Las reacciones de PCR
incluyeron 01 microM de cada cebador 1 U de Taq ADN polimerasa recombinante
(Fermentas Lithuania) 02 mM de cada dNTP 1X de buffer de enzima (100 mM Tris-HCl
(NH4)2SO2 pH 88) 2 mM MgCl2 1 microL de una dilucioacuten 50 ngmicroL de ADN y un volumen
total de 25 microL Las amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra) y
consistieron de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 35 ciclos de
94degC por 30 s 55degC por 30 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10
min Luego de la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se
separaron por electroforesis en gel de agarosa al 15 tal como se indicoacute anteriormente
53
Secuenciacioacuten
De ser necesario los amplicones obtenidos fueron purificados mediante los kits QIAquick
PCR Purification y QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para proceder a su secuenciacioacuten
directa en ambas direcciones utilizando los cebadores empleados en la PCR y el kit Big
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied Biosystems EEUU) Su
corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied
Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur) (Figura 44)
Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit
606 y Chromas 145 construyeacutendose secuencias consenso y confirmaacutendose su validez por
comparacioacuten con las bases de datos moleculares con el programa BLASTn
(httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) (Figura 45) Paralelamente se obtuvieron
del GenBank secuencias de Sss de las regiones estudiadas para su alineacioacuten con las
generadas en este trabajo mediante el software Clustal W Ademaacutes se utilizaron las
secuencias de los Plasmodiofoacuteridos Plasmodiophora brassicae Polymyxa graminis
Polymyxa betae S nasturtii y Sorosphaera viticola como grupos externos de anaacutelisis
(outgroups) Los alineamientos fueron utilizados en la construccioacuten de una matriz Nexus y
el anaacutelisis filogeneacutetico se realizoacute mediante un algoritmo de Maacutexima Parsimonia utilizando
el software PAUP 40b Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute
un anaacutelisis de Bootstrap con 500 iteraciones
RFLPs
Con el fin de proponer una prueba de diagnoacutestico molecular de las variantes de Sss se
realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs a partir de las secuencias de Sss generadas en esta
investigacioacuten y otras depositadas en el GenBank Para esto se utilizoacute el software webcutter
20 (httprnalundberggusecutter2) con las enzimas EcoRV EcoRI Bsp143I Hin6I
MspI Tru1I y TaqI seleccionadas por ser de faacutecil acceso para laboratorios de diagnoacutestico
molecular y utilizadas en la primera parte de exploracioacuten La validez de la prueba fue
54
confirmada mediante PCR-RFLPs con las enzimas Bsp143I y Hin6I y aislamientos
representativos de los grupos geneacuteticos principales detectados en el trabajo Las reacciones
consistieron de 15 microL conteniendo 15 microL de buffer 10X 2 microL de enzima y 115 microL de
producto de PCR Las reacciones fueron incubadas al bantildeo Mariacutea a 37degC durante 24 h La
separacioacuten de los fragmentos de restriccioacuten se efectuoacute por electroforesis en gel de agarosa
al 25 Se evaluaron los patrones electroforeacuteticos obtenidos para cada enzima de
restriccioacuten y se determinoacute el nuacutemero de bandas generadas y su tamantildeo aproximado por
comparacioacuten con el marcador de peso molecular GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus
(Fermentas)
RESULTADOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Se obtuvieron 210 muestras de tubeacuterculos y raiacuteces de papa con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos con historia de la presencia del patoacutegeno en los departamentos de Antioquia
Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Se realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos con las secuencias
que presentaron tamantildeos superiores a 390 pb lograacutendose el objetivo de contar con al
menos 30 secuencias por cada departamento bajo anaacutelisis
Anaacutelisis filogeneacutetico de regiones ITS del ADNr
Las reacciones de PCR produjeron amplicones del tamantildeo esperado de ~390 pb con los
cebadores Spo8-9 (Figura 46) y de ~430 pb cuando se usaron los cebadores SsF-SsR en
79 y 48 muestras respectivamente Para el anaacutelisis filogeneacutetico soacutelo se incluyeron los
consensos que resultaron de la secuenciacioacuten en ambos sentidos De esta forma se
obtuvieron 33 secuencias de Antioquia 30 secuencias de Boyacaacute 33 secuencias de
Cundinamarca y 31 secuencias de Narintildeo para un total de 127 secuencias completas (Tabla
42) El alineamiento final de las secuencias alcanzoacute 445 sitios de los cuales 156 caracteres
eran constantes 55 variables pero no informativos y 236 informativos La longitud del
aacuterbol filogeneacutetico con maacutexima parsimonia fue de 707 con iacutendices de consistencia (IC) y
retencioacuten (IR) de 078 y 088 respectivamente Dado el alto nuacutemero de muestras
55
secuenciadas se presenta un dendrograma resultado del anaacutelisis de redundancia mediante el
programa Decrease redundancy (httpwebexpasyorgdecrease_redundancy) (Figura
47) Se presentaron dos grandes clados (A y B) soportados por valores de bootstrap de
100 el primer clado corresponde a los aislamientos de Sss mientras que el otro grupo
incluyoacute las demaacutes especies de plasmodiofoacuteridos (S nasturtii P graminis P betae y Pl
brassicae) que presentaron un alto nuacutemero de cambios entre ellas El clado A se subdividioacute
a su vez en tres grupos (A1 A2 y A3) dos de los cuales corresponden a los Tipos I (A2) y
II (A1) definidos por Qu y Christ (2004) En teacuterminos porcentuales ambos Tipos
representan el 157 (Tipo I) y 189 (Tipo II) de los aislamientos de Sss obtenidos en
Colombia ademaacutes se incluyeron secuencias del patoacutegeno provenientes de Estados Unidos
Irlanda y Escocia para el Tipo I y de Suiza Nueva Zelanda y de Reino Unido para el Tipo
II El subgrupo que representa el Tipo I de Sss soacutelo presentoacute aislamientos obtenidos de
tubeacuterculos o de suelos pero no de raiacutez mientras que el subgrupo representando el Tipo II
incluyoacute indistintamente aislamientos de raiacutez tubeacuterculos y suelos
Por otra parte el tercer subgrupo (A3) incluyoacute el mayor nuacutemero de aislamientos
Colombianos de Sss (654) con algunos de sus miembros presentando hasta 10 cambios
entre ellos En este subgrupo se encontraron indistintamente aislamientos de los cuatro
departamentos diferentes fuentes de muestreo (raiacutez tubeacuterculo o suelo) y hospedantes
(diferentes variedades de S tuberosum y de S phureja var Criolla Colombia) Dadas las
diferencias en secuencias de estos aislamientos proponemos nombrar a este grupo como el
Tipo III de Sss
El anaacutelisis de redundancia permitioacute tambieacuten identificar 12 genotipos (Figura 48) entre los
127 aislamientos de Sss de Colombia cinco de los cuales estuvieron conformados por un
soacutelo aislamiento tres por dos aislamientos y cuatro presentaron maacutes de diez miembros
siendo el genotipo 11 representante del Tipo I el 12 del Tipo II y el 7 y 10 del genotipo III
(Tabla 43) porque los demaacutes genotipos al ser uacutenicos o con tener como maacuteximo dos
representantes no fueron definidos a nivel de Tipos Los niveles de identidad para la regioacuten
56
ribosomal secuenciada entre estos genotipos fueron superiores al 95 en todos los casos
con una divergencia de 33 entre los Tipos I y II del 5 entre los Tipos I y III y del 2
entre el II y III La divergencia entre secuencias de Sss y otras especies de plasmodiofoacuteridos
fue mayor al 44 lo que demuestra la utilidad taxonoacutemica de las regiones ITS para
establecer relaciones filogeneacuteticas en este grupo de protozoos (Tabla 44)
RFLPs
Los anaacutelisis de restriccioacuten indicaron la existencia de polimorfismos en los sitios de corte de
algunas de las enzimas empleadas entre los grupos principales sentildealados en el anaacutelisis
filogeneacutetico Lo anterior puede ser utilizado con fines praacutecticos cuando se requiera evaluar
el genotipo o la mezcla de genotipos asociados a un lote de cultivo plantas sintomaacuteticas o
de tubeacuterculo-semilla con siacutentomas de Sarna polvosa Por ejemplo los aislamientos
representativos del Tipo II de Sss presentan un sitio de corte para Bsp143I (p 92) mientras
que para los del Tipo I se presentan dos sitios (p 97 340) Los aislamientos del Tipo III
tienen tres sitios de corte para la enzima Hin6I (p 222 283 352) en contraste con dos sitios
en los del Tipo I y II (p226-355 221-350) (Figura 49) Por esto proponemos la realizacioacuten
de una prueba simple de PCR-RFLPs a partir de la amplificacioacuten de las regiones ITS con
cebadores especiacuteficos para Sss y su posterior digestioacuten con las enzimas Bsp143I y Hin6I
con el fin de identificar los tres Tipos de Sss Al evaluar la digestioacuten de amplicones
representantes de los tres Tipos de Sss detectados en el estudio se validoacute la utilidad de la
teacutecnica en geles de agarosa al 25 ya que los perfiles de restriccioacuten obtenidos con la
enzima Hin6I permiten diferenciar a los aislamientos de los Tipos I y II (fragmentos
visibles de 221 y 129 pb) del Tipo III (fragmentos visibles de 221 67 y 62 pb) (Figura
410A) mientras que los representantes de los Tipos I y II se diferencian por la digestioacuten
con la enzima Bsp143I al generar fragmentos visibles de 243 pb (Tipo I) y de 294 pb (Tipo
II) (Figura 410B) Es importante indicar que los fragmentos inferiores a 50 pb no se tienen
en cuenta en este anaacutelisis ya que salen del rango de resolucioacuten de la electroforesis en geles
de agarosa Fragmentos de este tamantildeo pueden ser visualizados en geles de poliacrilamida
que ofrecen una mayor resolucioacuten
57
DISCUSIOacuteN
La disponibilidad de cultivares de papa resistentes a Sss es una prioridad para el disentildeo de
estrategias de manejo de la Sarna polvosa en diferentes paiacuteses cultivadores de este
tubeacuterculo en el mundo (Nitzan et al 2010) Sin embargo las deficiencias en el
conocimiento que se tiene de los niveles de variacioacuten de Sss y de su ciclo de vida
representan un obstaacuteculo para el establecimiento de los programas de mejoramiento
geneacutetico contra este fitopatoacutegeno (Merz y Falloon 2009) Los estudios geneacuteticos de Sss han
sido difiacuteciles de aplicar debido a su naturaleza de patoacutegeno obligado que impide su
aislamiento en medios axeacutenicos afectando los procesos de extraccioacuten de ADN la
utilizacioacuten de marcadores moleculares convencionales como AFLPs SSR y RAPDs y el
empleo de cebadores universales comuacutenmente usados para estudios taxonoacutemicos y
poblacionales en diferentes microorganismos eucarioacuteticos Adicionalmente la
caracterizacioacuten patoacutegenica de Sss resulta compleja ya que el desarrollo de la expresioacuten de
la Sarna polvosa estaacute fuertemente influenciada por las condiciones ambientales las
metodologiacuteas de inoculacioacuten y los cultivares del hospedante (Qu y Christ 2006 Jaramillo y
Botero 2007)
Afortunadamente la existencia de cebadores especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del
ADNr como los desarrollados por Bulman y Marshall (1998) y Qu et al (2006) para
amplificar la regioacuten ITS1 58S e ITS2 han permitido la obtencioacuten de secuencias que entre
otras aplicaciones permitieron definir la afinidad filogeneacutetica de Sss con respecto a otros
miembros del orden Plasmodiophoridae y demostrar los bajos niveles de identidad de esta
especie con respecto a la formae specialis nasturtii Esta misma situacioacuten se encontroacute en
este estudio obtenieacutendose identidades entre Sss y S nasturtii cercanas al 56 Los anaacutelisis
intraespeciacuteficos utilizando dichas secuencias han permitido detectar dos ribotipos
principales de Sss en el mundo denominados como I y II Ambos Tipos han sido
encontrados en poblaciones de Sss de Australia y Europa (Bulman y Marshall 1998)
mientras que en Norte Ameacuterica los aislamientos corresponden exclusivamente al Tipo II
58
(Qu y Christ 2006) En dicho estudio se encontroacute que las secuencias del Tipo I diferiacutean con
respecto a las del Tipo II en tres nucleoacutetidos (p 60 127 157) y una insercioacuten de cinco
nucleoacutetidos (p 129 a 133) en el ITS1 mientras que para la regioacuten ITS2 se presentan seis
mutaciones puntuales (p 348 367 399 402 461 475) y dos deleciones (p 356 y 474) lo
que en su conjunto equivale a un 29 de divergencia entre ambos ribotipos Estas
diferencias fueron igualmente encontradas entre los aislamientos colombianos
representando ambos Tipos aunque algunos de ellos presentaron mutaciones adicionales
por ejemplo el genotipo 12 (conformado por 21 aislamientos) presentoacute dos cambios con
respecto al Tipo II reportado en GenBank (Accesioacuten AY604172) mientras que el genotipo
11 (conformado por 17 aislamientos) tuvo tres cambios con respecto al Tipo I (Accesioacuten
AY604171)
En Colombia hasta el presente estudio se habiacutean realizado dos estudios de variabilidad
geneacutetica de Sss con base en anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr En el primero de ellos
Hincapieacute (2006) encontroacute altos niveles de identidad geneacutetica entre los aislamientos de Sss
secuenciados y analizados mediante PCR-RFLP lo que condujo al autor a plantear la
posible ocurrencia de una estructura poblacional clonal para este patoacutegeno en el paiacutes En un
estudio maacutes reciente Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS y SSCP
(Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) que incluyoacute un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones establecioacute la presencia de subpoblaciones del patoacutegeno
relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Asiacute aislamientos con secuencias ITS del Tipo
I se asociaron exclusivamente con infecciones de tubeacuterculo mientras que aquellos del Tipo
II lo hicieron con siacutentomas de agallas en raiacutez En dicha investigacioacuten se descartoacute ademaacutes la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar del hospedero o la zona
geograacutefica de origen de los aislamientos Asiacute mismo se comproboacute que en el paiacutes existen
variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la
presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno dos de los cuales corresponden a los Tipos I y
II mientras que los tres restantes correspondiacutean a nuevas variantes no reportadas en otros
59
lugares del mundo (Carrentildeo 2009) desafortunadamente las secuencias resultantes de dicho
trabajo no fueron publicadas en GenBank y por tanto no pudieron ser incluidas en los
anaacutelisis filogeneacuteticos aquiacute presentados
El presente estudio amplia auacuten maacutes la base de conocimiento de los niveles de variacioacuten de
Sss en Colombia al detectar 12 genotipos a partir de 127 secuencias de igual nuacutemero de
aislamientos del patoacutegeno obtenidos en cultivos de los cuatro principales departamentos
productores de papa del paiacutes El anaacutelisis filogeneacutetico basado en dichas secuencias definioacute
la presencia de un clado que representa a Sss e incluye los dos Tipos mundialmente
conocidos para este patoacutegeno (Qu y Christ 2004) ademaacutes de un tercer subgrupo (III) que
presenta un 5 y 2 de divergencia con respecto a los Tipo I y II respectivamente Este
Tipo III contiene la mayor proporcioacuten de aislamientos del estudio e integroacute indistintamente
cepas de diferentes oriacutegenes geograacuteficos hospedantes tejidos sintomaacuteticos y suelo De gran
intereacutes resultoacute el hecho que los aislamientos asociados con el Tipo I procediacutean de puacutestulas
en tubeacuterculos o de suelos pero no de agallas de raiacutez lo cual confirma la asociacioacuten
realizada por Carrentildeo (2009) para esta variante de Sss Sin embargo los aislamientos
asociados al Tipo II proveniacutean indistintamente de raiacutez tubeacuterculos o suelos A partir de estos
resultados es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa del paiacutes Asiacute por ejemplo
es de intereacutes estudiar las reacciones de las variedades colombianas de papa a dichos
ribotipos asiacute como su capacidad de transmisioacuten de PMTV En este sentido Ward et al
(2005) evaluando el efecto de dos ribotipos de Polymyxa graminis un plasmodiofoacuterido que
afecta gramiacuteneas en la zona templada encontraron que los aislamientos del Tipo II fueron
detectados principalmente en plantas de trigo y estaban asociados a la transmisioacuten del Soil-
borne cereal mosaic virus (SBCMV) mientras que aquellos del Tipo I afectaban cebada y
su capacidad de transmisioacuten de SBCMV era muy baja
60
Los niveles de variacioacuten encontrados en esta investigacioacuten para el agente causal de la Sarna
polvosa de la papa en Colombia condujeron a plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y de certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla Para esto se realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs de regiones ITS del
ADNr con siete enzimas de restriccioacuten de uso frecuente en laboratorios de deteccioacuten
molecular de microorganismos Los resultados demostraron polimorfismos en los sitios de
corte de algunas de las enzimas utilizadas dos de las cuales permiten distinguir los tres
principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico De esta forma se confirmoacute que la
digestioacuten con la enzima Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos
del Tipo III mientras que el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los
Tipos I y II La prueba realizada en este estudio puede ser implementada con variaciones
como el uso de digestiones dobles y la utilizacioacuten de geles de poliacrilamida que generen
mayor resolucioacuten de los fragmentos de restriccioacuten de bajo peso molecular sin embargo el
esquema aquiacute presentado ofrece simplicidad y eficiencia en la separacioacuten de los tres Tipos
sin la necesidad de contemplar todos los productos de la digestioacuten Adicionalmente a esta
prueba y con base en los resultados de las secuencias obtenidas en esta investigacioacuten y en
aquella de Gil et al (2011) nuestro grupo se encuentra disentildeando y evaluando pruebas de
PCR y RT-PCR en tiempo real para la deteccioacuten asintomaacutetica de Sss y de su virus asociado
PMTV Se espera que los resultados generados en estas investigaciones sean incorporados
raacutepidamente en los programas de manejo integrado de la Sarna polvosa en Colombia y
otros paiacuteses latinoamericanos afectados por esta enfermedad como Venezuela (Rodriacuteguez et
al 2009) y Costa Rica (Montero-Astua et al 2008)
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten el Politeacutecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid
Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo
por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el Departamento de Narintildeo
61
REFERENCIAS
Bell KS Roberts J Verrall S Cullen DW Williams NA Harrison JG Toth IK Cooke D
Duncan JM Claxton JR 1999 Detection and quantification of Spongospora subterranea
fsp subterranea in soils and on tubers using specific PCR primers European Journal of
Plant Pathology 105 905-915
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid
diagnostic test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European
Journal of Plant Pathology 131 277-287
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47 759-766
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33 69-84
62
Gilchrist E 2009 Alternativas para el manejo integrado de la Sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) Tesis de Doctorado en Ciencias Agrarias
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia sede Medelliacuten
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tubers by enzyme-linked immunosorbent assay Plant Pathology 42
181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato - A review
Plant Pathology 461-25
Hincapieacute LA 2006 Evaluacioacuten de la variabilidad molecular de Spongospora subterranea
(Wallroth) Lagerheim f sp subterranea en las principales zonas paperas de Colombia
Tesis de Maestriacutea en Biotecnologiacutea Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia sede Medelliacuten Colombia
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Merz U Fallon RE 2009 Powdery scab of potato-increased knowledge of pathogen
biology and disease epidemiology for effective disease management Potato Research
5217-37
Montero-Astua M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
63
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006 Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea f sp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la Sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista de la Facultad de Agronomiacutea Universidad del Zulia 26 508-531
Salazar LF 2006 Emerging and Re-emerging Potato Diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop - top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia Sede Bogotaacute
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea and quantification in soil Plant Pathology 45 884-895
64
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2005 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165875-885
Zolan ME Pukkila PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinereus
Molecular and Cellular Biology 6 195-200
65
41 Anexos
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp subterranea
en plantas de papa de Colombia a Quistosoros obtenidos de suelo b Plasmodios
formados en raiacutez de tomate (Solanum esculentum) c Lesiones tempranas producidas por
Sarna polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro d Lesiones tardiacuteas producidas por Sarna
polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro e f Agallas formadas en raiacuteces de S phureja
var Criolla Colombia
d
e f
c
a b
66
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja var Criolla
Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos infestados con Spongospora
subterranea f sp subterranea
67
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o raiacuteces de
plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea
MUESTRA A260 A280 RELACIOacuteN
260280
CONCENTRACIOacuteN
de ADN ng microl
AB1 0806 0465 173 403
AB2 0421 0244 172 21
Se7 0276 0149 184 138
Se8 0743 0415 179 371
MA11 2244 1366 164 1122
MA61 0277 0158 176 139
MA39 2135 1512 141 1067
MA56 0823 0361 228 412
MA60 021 0101 208 105
68
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos agallas o raiacuteces
de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana Carril 1 Marcador de peso 100 pb carril 2-
4 muestras MA16 MA17 MA18 MA11 MA39
500 pb
1 2 3 4 5 6
69
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora
subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8
70
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la regioacuten ITS del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp subterranea de Colombia
71
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb) a partir de ADN
de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum tuberosum S phureja y Nicotiana
benthamiana con presencia de quistosoros de Spongospora subterranea fsp subterranea
de cultivos de papa de los departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1
Marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas) carriles 2 a 6 muestras SE10 SE11
SE13 SE18 carril 7 control negativo
500 pb
100 pb
390 pb
1 2 3 4 5 6 7
72
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia
ANTIOQUIA CUNDINAMARCA
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE13 Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro SE8 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE18 La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro SE81 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
32UN La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE9 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
33UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE91 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34UN La Unioacuten Raiacutez accesioacuten C131-R2 SE12 Zipaquiraacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
35UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE14 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
80C La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE15 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Pastusa
Suprema
79C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE16 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
78C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE17 Villapinzoacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro
35 COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE19 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34COL La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE20 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
32COL La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum SE21 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
30COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 4fb Ventaquemada Raiacutez S tuberosum
29COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 5fb Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum
12fb La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 9fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
11fb La Unioacuten Raiacutez S tuberosum 10fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
1MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
ICA Nevada MA20 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
7MR Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro MA21 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
8MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA22 Villapinzoacuten
Raiacutez S tuberosum var ICA Pastusa Suprema
9MR La Unioacuten Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA23 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
11MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA24 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
12MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA25 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
13MR Santa Rosa Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA50 Desconocido Tubeacuterculo S tuberosum
14MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA51 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB2 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C87SJ MA52 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
73
AB3 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C81SJ MA53 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB4 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3SJ MA54 Tabio Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB6 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C8C MA55 Tabio Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB7 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3C MA56 Zipaquiraacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia
AB8 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA57 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA1 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA58 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA2 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA59 Villapinzoacuten
Tubeacuterculo S tuberosum var Diacol Capiro
MA41 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA60 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
BOYACAacute NARINtildeO
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE10 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE7 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE101 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
SE11 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 37COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE22 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 36COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
SE23 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA27 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE24 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA28 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
3fb Tunja Raiacutez S tuberosum MA31 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB1 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA32 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB9 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA33 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB10 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA34 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA35 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA3 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA36 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA4 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA37 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA5 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA38 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA7 Siachoque Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA39 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA9 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA40 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA11 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA61 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA62 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA14 Tunja Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA64 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA15 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA65 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA16 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA66 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA17 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA67 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
74
benthamiana
MA18 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA68 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA19 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA69 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA42 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA70 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA43 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA44 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA72 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA45 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA73 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA46 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA75 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA49 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA76 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA77 Ipiales Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
75
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) de cultivos de papa de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Como grupos externos de anaacutelisis se presentan
secuencias de otras especies de plasmodiofoacuteridos Meacutetodo de maacutexima parsimonia
utilizando la opcioacuten Heuristic search del programa PAUP 40b Los valores de Bootstrap (gt
80) se indican en la parte inferior de las ramas En letras mayuacutesculas se presentan las
denominaciones de los clados y subclados Adicionalmente se indican los grupos que
representan los Tipos de Sss
76
Sss TIPO I
395 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
MspI TaqI
cccgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgttttcgg base
pairs
gggcccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcaaaagcc 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
atactgaacttactaaagtggatcatttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgat base
pairs
tatgacttgaatgatttcacctagtaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgcta 76 to
150
EcoRI
gaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagtt base
pairs
cttcttgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaa 151
to 225
Hin6I TaqI EcoRV MspI
gcgctttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccgtgtgcgtg base
pairs
cgcgaaagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcggcacacgcac 226
to 300
Bsp143I MspI Hin6I
aaggggactctgagctctggtcggtccatggcttgaaagatcatgcaacccggtgcgcgtctctggcttctgatt base
pairs
ttcccctgagactcgagaccagccaggtaccgaactttctagtacgttgggccacgcgcagagaccgaagactaa 301
to 375
cgtctctaaccattggcgtg base pairs
gcagagattggtaaccgcac 376 to 395
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 2 97 340 gatc More info
EcoRI 1 190 gaattc More info
EcoRV 2 130 238 gatatc More info
Hin6I 2 226 355 gcgc More info
MspI 3 2 281 350 ccgg More info
TaqI 2 49 232 tcga More info
Tru1I 2 102 119 ttaa More info
77
Sss TIPO II
390 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
TaqI
cctgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgtattact base
pairs
ggacccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcataatga 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
gaacttactaaagtggatcgtttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgatgaaga base
pairs
cttgaatgatttcacctagcaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgctacttct 76 to
150
EcoRI Hin6I
acgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagttgcgct base
pairs
tgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaacgcga 151
to 225
TaqI EcoRV MspI
ttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccctgtgcgtggaagg base
pairs
aagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcgggacacgcaccttcc 226
to 300
MspI Hin6I
ggactatgagctctggtcggtccatggcttgaaagattatccaaccggtgcgcgtctctggcttctgattcgtct base
pairs
cctgatactcgagaccagccaggtaccgaactttctaataggttggccacgcgcagagaccgaagactaagcaga 301
to 375
ctanccattggcgtg base pairs
gatnggtaaccgcac 376 to 390
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 1 92 gatc More info
EcoRI 1 185 gaattc More info
EcoRV 2 125 233 gatatc More info
Hin6I 2 221 350 gcgc More info
MspI 2 276 345 ccgg More info
TaqI 2 49 227 tcga More info
Tru1I 2 97 114 ttaa More info
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos de S
subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I MspI TaqI y
Tru1I mediante el programa Web-cutter
78
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de aislamientos
de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en Colombia a partir de
anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal
GENOTIPO RFLPacutes MUESTRAS PROPORCIOacuteN
()
1
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185 EcoRV 2 125 233
Hind6I 2 221 351
MspI 2 276 346 TaqI 2 227 Tru1I
2 97 114
AB12 34UN 16
2
Bsp143I 1 93 EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277 347 TaqI 1 49 228
Tru1I 2 98 115
32UN 78C 16
3
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
11MR 08
4
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
9MR 08
5
Bsp143I 2 96 339 EcoRI 1 189
EcoRV 2 129 237
Hind6I 2 225 354
MspI 2 280 349 TaqI 1 231 Tru1I
2 101 118
8MR 13MR 16
79
6
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190
EcoRV 2 130 238 Hind6I 2 226 355
MspI 2 281 350
TaqI 1 232 Tru1I
2 102 119
MA12 08
7
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
MA37 SE7 SE8 SE9 SE10
SE11 SE12 SE13 SE14 SE15 SE16 80C 79C 37COL 36COL
35COL 34COL 32COL 30COL
12FB 10FB 11FB 9FB 1MR
SE71 SE81 SE91 SE101 AB2 AB3 AB4 AB6 AB7 MA1 MA7
MA9 MA14 MA20 MA21 MA22
MA23 MA24 MA25 MA28 MA31 MA32 MA33 MA34
MA35 MA36
393
8
Bsp143I 2 92 309 EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 289 351 MspI 2 276
346 TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
MA40 08
9
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 282 351 MspI 3 2 276
346 TaqI 1 227
Tru1I 2 97 114
MA43 08
10
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 3 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
29COL 33UN MA4 MA41
MA42 MA51 MA52 MA55
MA56 MA57 MA58 MA59 MA60 MA62 MA64 MA65
MA68 MA69 MA71 MA72
MA76 SE19 SE20 SE21 SE22 3FB 4FB 14MR
22
11
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190 EcoRV 2 130 238
Hind6I 2 226 355
MspI 3 2 281 350 TaqI 2 49 232
Tru1I 2 102 119
SE17 12MR AB1 AB8 MA2
MA15 MA16 MA17 MA18 MA19 MA45 MA46 MA49
MA50 MA53 SE23 SE24
134
80
12
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233 Hind6I 2 221 350
MspI 2 276 345
TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
SE18 35UN 7MR AB9 AB10
MA3 MA4 MA5 MA11 MA27 MA38 MA39 MA44 MA61
MA66 MA67 MA70 MA73
MA75 MA77 5FB
165
81
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluyen a S nasturtii y Plasmodiophora brassicae
como especies externas de anaacutelisis
SECUENCIA SE17 SE18 MA37 29COL AY604172 AY604171 AF310907 EF593112 AF102820 AF102819 EF195335 AF104308
SE17 Sss
Colombia
Tipo I
ID 0962 0957 0952 0964 0992 0564 0959 0992 0964 0586 0959
SE18 Sss
Colombia
Tipo II
0962 ID 0979 0974 0992 0959 0574 0987 0959 0992 0584 0987
MA37 Sss
Colombia
Tipo III
0957 0979 ID 0984 0982 0954 0579 0977 0954 0982 0598 0977
29COL Sss
Colombia
Tipo III
0952 0974 0984 ID 0982 0959 0579 0977 0959 0982 06 0977
AY604172
Sss EEUU
TipoII
0964 0992 0982 0982 ID 0967 0577 0994 0967 1 0589 0994
AY604171
Sss EEUU
Tipo I
0992 0959 0954 0959 0967 ID 0564 0962 1 0967 059 0962
AF310907 S
nasturtii 0564 0574 0579 0579 0577 0564 ID 0579 0564 0577 0566 0574
EF593112 Sss
Suiza 0959 0987 0977 0977 0994 0962 0579 ID 0962 0994 0589 0989
AF102820
Sss Escocia 0992 0959 0954 0959 0967 1 0564 0962 ID 0967 059 0962
AF102819
Sss Nueva
Zelanda
0964 0992 0982 0982 1 0967 0577 0994 0967 ID 0589 0994
EF195335 P
brassicae 0586 0584 0598 06 0589 059 0566 0589 059 0589 ID 0589
AF104308
Sss Reino
Unido
0959 0987 0977 0977 0994 0962 0574 0989 0962 0994 0589 ID
82
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las enzimas de restriccioacuten Bsp143I y
Hin6I que permiten determinar los tres Tipos de Sss identificados en este trabajo En la
izquierda se indican los genotipos representativos de cada Tipo (ver Tabla 3) y entre
pareacutentesis los sitios de corte referidos al Tipo I
83
Figura 410 (A) Gel de RFLPs con la enzima Hind6I con tres muestras de los Tipos I II y
III de Sss detectados en el estudio 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir Tipo
I 3-5 Digestioacuten de muestras Tipo I 6 Producto sin digerir Tipo II 7-9 Digestioacuten de
muestras Tipo II 10 Producto sin digerir Tipo III 11-13 Digestioacuten de muestras Tipo III
14 Marcador de peso 100 pb (B) Gel de RFLPs con la enzima Bsp143I con una muestra
del Tipo I y II de Sss 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir del Tipo II 3 Sin
muestra 4 Digestioacuten de muestra Tipo I 5 Digestioacuten de muestra Tipo II 6 Marcador de
peso 100 pb Con flechas se marcan los productos digeridos que presentan resolucioacuten
apropiada en geles de agarosa al 25
A B
84
5 Artiacuteculo 2 Variabilidad geneacutetica de los ARN 2 y 3 de aislamientos
Colombianos de PMTV
Genetic variability of RNA 2 and 3 in Colombian isolates of PMTV
Ineacutes Osorio Giraldo1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
1 Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Facultad de Ciencias Universidad Nacional
de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia 2
Laboratorio de Microbiologiacutea Industrial
Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia
Formato de la Revista Agronomiacutea Mesoamericana ISSN 1021-7444
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
El PMTV es un virus prevalente en los cultivos de papa de los Andes Sin embargo en esta
regioacuten es muy bajo el conocimiento de su biologiacutea patogenicidad y diversidad Con el fin
de suplir la falta de informacioacuten sobre este uacuteltimo aspecto en esta investigacioacuten se
obtuvieron secuencias de los genes de la caacutepside viral (CP) y del TGB2 de cepas de PMTV
de los cuatro principales departamentos cultivadores de papa en Colombia Adicionalmente
dos de los aislamientos fueron secuenciados en gt83 de sus ARN 2 y 3 Los anaacutelisis
filogeneacuteticos basados en CP indicaron la presencia de dos clados El primero contiene cepas
de referencia mundial de PMTV en conjunto con 19 de las cepas de este estudio mientras
que el segundo clado soacutelo agrupoacute cepas de Colombia las que compartieron menos de 76
de identidad con el primer grupo Esto posiblemente indica la ocurrencia de una nueva
especie de pomovirus aunque se requiere la secuenciacioacuten de todo el genoma para
confirmar dicha hipoacutetesis taxonoacutemica El anaacutelisis del TGB2 generoacute un solo clado
agrupando indistintamente las cepas colombianas de PMTV con las de otros paiacuteses El
anaacutelisis de los segmentos 2 y 3 del genoma viral indicoacute que los aislamientos colombianos
compartiacutean gt94 de identidad con las secuencias de cepas de Repuacuteblica Checa y Suecia
85
Se espera que estos hallazgos sean utilizados para el disentildeo de herramientas de diagnoacutestico
del PMTV en los Andes que apoyen los programas de certificacioacuten de tubeacuterculo-semilla y
mejoramiento geneacutetico de papa
Palabras clave Potato mop-top virus RT-PCR Secuenciacioacuten Solanum tuberosum
Abstract
PMTV is a prevalent virus in potato crops in the Andes However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words Potato mop-top virus RT-PCR Sequencing Solanum tuberosum
86
INTRODUCCIOacuteN
El Potato mop-top virus (PMTV) es la especie tipo del geacutenero Pomovirus y recientemente
se ha clasificado en la nueva familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Su rango de
hospedantes incluye un nuacutemero limitado de especies vegetales de las familias Solanaceae y
Chenopodiaceae siendo la papa (Solanum tuberosum L) su principal hospedante desde el
punto de vista econoacutemico (Kirk 2008) Es transmitido por tubeacuterculo semilla infectado y
por zoosporas del plasmodiofoacuterido Spongospora subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp
subterranea Tomlinson (Sss) agente causal de la sarna polvosa de la papa (Harrison y
Jones 1970) Su presencia se ha registrado principalmente en regiones con climas huacutemedos
y friacuteos como el Norte de Europa (Noruega Suecia Dinamarca y Finlandia) las islas
Britaacutenicas (Irlanda Inglaterra Escocia) Norte Ameacuterica (EEUU y Canadaacute) Japoacuten las zonas
montantildeosas de Costa Rica y los Andes Surameacutericanos (Peruacute Colombia Bolivia) (Xu et al
2004 Salazar 2006 Montero-Astuacutea et al 2008 Nakayama et al 2010 Santala et al
2010) A pesar de que se considera que el PMTV es originario de los Andes su presencia
en Colombia soacutelo fue detectada en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) y reconfirmada con base en
anaacutelisis de secuencias de la caacutepside viral (CP) y el segundo gen del triple bloque (TGB2) en
2011 (Gil et al 2011) Este virus puede causar peacuterdidas de hasta 26 en el rendimiento del
cultivo de la papa lo que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera
ascender a rangos de 50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 2000) Sin
embargo dichos niveles de peacuterdidas dependen de la susceptibilidad de las variedades
cultivadas (Xu et al 2004 Santala et al 2010) las variantes del patoacutegeno (Harrison y
Jones 1970 Nielsen y Nicolaisen 2003) y fundamentalmente de las condiciones
medioambientales prevalentes durante su infeccioacuten (Davey 2009 Latvala-Kilby et al
2009 Roos et al 2011)
El PMTV es un virus tripartita con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20 nm en diaacutemetro y
longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm Cada partiacutecula contiene una moleacutecula
de ARN de cadena sencilla con polaridad positiva (ARNss+) con tamantildeos de 6043 nt (ARN
1) 3134 nt (ARN 2) y 2964 nt (ARN 3) El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene
motivos de metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del
codoacuten de finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999 2003) El
87
ARN 2 contiene un ORF para la proteiacutena de la caacutepside de 20 kDa Tambieacuten codifica para
una proteiacutena de 90 kDa generada por lectura continua (readthrough CP-RT) gracias a la
presencia de un codoacuten de finalizacioacuten amber en el gen CP Diversos estudios han indicado
que esta proteiacutena RT esta involucrada en la transmisioacuten por Sss del PMTV siendo incluso
posible su localizacioacuten asociada con los extremos de las partiacuteculas virales mediante
anaacutelisis de inmuno-marcaje (Cowan et al 1997) En este sentido Torrance et al (1999)
demostraron que una delecioacuten de 109 nt en el extremo 3acute de las secuencias del dominio CP-
RT de aislamientos de PMTV de Escocia estaban asociadas con su imposibilidad de
transmisioacuten por Sss
El ARN 3 codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Los
primeros tres presentan secuencias similares a proteiacutenas del triple bloque de genes (TGB)
involucradas en el movimiento de ceacutelula a ceacutelula de algunos virus de plantas Las TGBs de
los pomovirus hacen parte de la clase 1 o grupo hordei de estas proteiacutenas en conjunto con
las codificadas por otros geacuteneros de la familia Virgaviridae y del geacutenero Hordeivirus Se
cree que TGB2 y TGB3 asisten a TGB1 en su funcioacuten de trasportar el genoma viral a traveacutes
de los plasmodesmos de las ceacutelulas vegetales (Lim et al 2008 2009) Recientemente se
encontroacute mediante fusioacuten de la regioacuten N-terminal de TGB1 con la proteiacutena verde
fluorescente (GFP por sus siglas en ingleacutes) que TGB1 se localizaba en la regioacuten nucleolar
y de microtuacutebulos infirieacutendose ademaacutes que aparentemente esta proteiacutena interactuacutea con los
factores de transcripcioacuten del hospedante (Wright et al 2010)
La cuarta proteiacutena (8 kDa) es rica en cisteiacutena (CRP) y aparentemente esta involucrada en el
movimiento sisteacutemico del PMTV en las plantas y en la expresioacuten de siacutentomas necroacuteticos en
hospedantes experimentales Interesantemente otros pomovirus no codifican para una
proteiacutena 8 kDa como la presente en PMTV y sus niveles de identidad con CRPs presentes
en otros geacuteneros como Hordeivirus Tobravirus y Furovirus son muy bajos (Lukhovitskaya
et al 2005)
Los siacutentomas que causa PMTV en papa se manifiestan por agrietamientos en la superficie
de los tubeacuterculos pudiendo estar acompantildeados por la presencia de anillos necroacuteticos en la
88
corteza o incluso la parte interna del mismo siacutentoma conocido como umlSprainguml (Calvert y
Harrison 1966) En las hojas de las plantas infectadas se puede observar un moteado en
forma de V tipo ldquoaucubardquo ademaacutes de la distorsioacuten del follaje y el acortamiento de los
entrenudos (umlmop-topuml) (Carnegie et al 2009) En la regioacuten Andina no es frecuente
observar la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos ni los moteados tipo umlaucubauml lo que no
permite asociar siacutentomas especiacuteficos con la presencia de PMTV situacioacuten que explica en
buena parte el porqueacute del desconocimiento de su efecto sobre las variedades sembradas en
esta regioacuten suramericana (Tenorio et al 2006 Gil et al 2011) Sin embargo seguacuten Salazar
(2006) el PMTV es uno de los virus prevalentes en el cultivo de la papa en los Andes
Adicionalmente a las caracteriacutesticas criacutepticas del PMTV existen dificultades teacutecnicas para
el diagnoacutestico de este virus debido a su distribucioacuten erraacutetica en las plantas que incluso
puede diferir entre yemas y brotes del mismo tubeacuterculo infectado y a los bajos tiacutetulos
virales que se encuentran en el tejido foliar Esto conduce a la generacioacuten de falsos
negativos por diferentes teacutecnicas de diagnoacutestico (Cerovska et al 2003 Kirk 2008) Dichas
teacutecnicas incluyen la observacioacuten visual de siacutentomas bioensayos con plantas indicadoras
como Chenopodium amaranticolor Nicotiana benthamiana N debneyi y N tabacum
(Jeffries 1998) que requieren largos periodos de tiempo para su lectura pruebas de ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay) con anticuerpos mono y policlonales (Torrance et
al 1993 Cerovska et al 2003) RT-PCR IC RT-PCR y qRT-PCR con cebadores
especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del genoma viral (Arif et al 1995 Mumford et
al 2000 Latvala-Kilby et al 2009 Davey 2009) Asiacute mismo se han empleado otras
teacutecnicas basadas en hibridizacioacuten especiacutefica (Ryazantsev y Zavriev 2009) y microplacas de
hibridizacioacuten con RT-PCR (Nakayama et al 2010) para la deteccioacuten de PMTV
En Colombia Gil et al (2011) utilizaron la teacutecnica de RT-PCR con los cebadores
PMTVF4-PMTVR4 y H360-C819 dirigidos a los genes TGB2 y CP respectivamente para
la deteccioacuten del virus en los principales departamentos productores de papa del paiacutes sin
embargo utilizaron un muy bajo nuacutemero de aislamientos virales Maacutes recientemente Gallo
(2012) obtuvo anticuerpos policlonales dirigidos a peacuteptidos sinteacuteticos con alta capacidad
89
inmunogeacutenica identificados a partir de la modelacioacuten de la caacutepside viral de aislamientos
colombianos de PMTV probando su efectividad en pruebas de ELISA y Dot-blot
A pesar de que aparentemente existe una amplia gama de teacutecnicas para la deteccioacuten del
PMTV eacutestas presentan la limitacioacuten de estar basadas en un bajo nuacutemero de aislamientos
virales especialmente del Norte de Europa (Latvala-Kilby et al 2009) siendo auacuten menor el
nuacutemero de cepas andinas para las que existen secuencias disponibles en las bases de datos
moleculares o cuyos viriones han sido purificados para la generacioacuten de pruebas
seroloacutegicas (Gil et al 2011)
A nivel mundial se ha reportado la presencia de bajos niveles de variacioacuten entre genotipos
de PMTV (Mayo et al 1996 Santala et al 2010) Latvala-Kilby et al (2009) comparando
secuencias de CP de 23 aislamientos de Finlandia y Letonia con respecto a secuencias
disponibles en GenBank para cepas de Escocia Dinamarca Suecia y Repuacuteblica Checa
encontraron identidades superiores al 98 entre eacutestas con soacutelo siete diferencias a nivel de
aminoaacutecidos (aa) entre todas las comparaciones Las evaluaciones de secuencias de CP-RT
tambieacuten presentaron altos niveles de identidad (98 a 100) aunque en este caso 24
posiciones en las secuencias de aa fueron variables Resultados similares reportaron Mayo
et al (1996) cuando compararon las secuencias de CP de tres aislamientos de Escocia y
ocho de Peruacute mientras que Xu et al (2004) encontraron que seis de las secuencias de CP
de aislamientos de PMTV de Norteameacuterica presentaron identidades superiores al 97 con
respecto a secuencias de aislamientos de diferentes paiacuteses de Europa A pesar de estos bajos
niveles de variacioacuten cuando se realizan anaacutelisis filogeneacuteticos con dichas secuencias se han
encontrado dos clados que dividen los aislamientos de PMTV y que pueden ser
identificados por anaacutelisis de RFLPs (Nielsen y Nicolaisen 2003) Sin embargo dichos
grupos aparentemente no estaacuten relacionados con diferencias en sus niveles de
patogenicidad sobre variedades de papa (Latvala-Kilby et al 2009)
En Colombia Veacutelez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo que presentaba altos niveles de identidad con
respecto a aislamientos de Europa y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por
90
aislamientos colombianos Esta situacioacuten fue confirmada posteriormente por Gil et al
(2011) quienes encontraron que las variantes de PMTV tan soacutelo presentaban un 76 y
86 de identidad para CP y TGB2 respectivamente con respecto a los aislamientos
mundialmente reportados de PMTV Sin embargo dichos anaacutelisis fueron conducidos con un
bajo nuacutemero de secuencias (cuatro para CP y tres para TGB2) debido a las dificultades
experimentales que representa el trabajo con este virus (bajo tiacutetulo en plantas de papa
distribucioacuten erraacutetica ausencia de cebadores especiacuteficos para cepas andinas etc)
Por lo anterior esta investigacioacuten se planteoacute con el propoacutesito de ampliar el nuacutemero de
secuencias de CP y TGB2 de aislamientos de PMTV obtenidos en diferentes regiones
cultivadoras de papa de Colombia de manera que fuera posible determinar si la presencia de
las variantes de este virus corresponde a una situacioacuten generalizada o por el contrario responde
al efecto de muestra dado el bajo nuacutemero de cepas analizadas por Veacutelez (2007) y Gil et al
(2011) Adicionalmente se realizoacute la secuenciacioacuten de una gran parte del ARN 2 y ARN 3 de
una cepa obtenida en el Departamento de Antioquia y otra en el Departamento de Boyacaacute
(Colombia) realizaacutendose un anaacutelisis de variacioacuten con respecto a las secuencias de referencia de
genomas completos disponibles en las bases de datos moleculares
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y preparacioacuten de muestras
Se obtuvieron muestras de raiacuteces y tubeacuterculos de papa con siacutentomas de sarna polvosa asiacute
como de suelos de lotes con reportes de la presencia de Sss en las zonas productoras de
papa de los municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio
Subachoque y Villapinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute y Oicataacute (Boyacaacute) y
Pasto e Ipiales (Narintildeo) Para la separacioacuten de los quistosoros del suelo se siguioacute la
metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la cual las muestras de suelo (500g) son
pasadas por un juego de tamices de 100 y 25 microm Los quistosoros obtenidos fueron
inoculados en Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo
para incrementar el inoacuteculo de PMTV a partir de la infeccioacuten de su vector Sss (Veacutelez
2007) El material vegetal fue mantenido en casa de malla en el Centro Experimental
91
Paysanduacute ubicado en el corregimiento de Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB
2550 msnm temperatura media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) Tres
meses despueacutes de la siembra se recolectaron las hojas y las raiacuteces de las plantas sentildeuelo
para su procesamiento en el laboratorio
Secuenciacioacuten de CP y TGB2
Se obtuvo el ARN total de plantas de N benthamiana y S phureja mediante el kit RNeasy
plant mini (Qiagen EEUU) a partir de 100 mg de tejido utilizando 450 μL de buffer RLT
para tejido foliar o RLC para raiacuteces y 45 μL de β-mercaptoetanol y siguiendo las
instrucciones del fabricante Al finalizar el procedimiento el ARN obtenido se eluyoacute en 40
μL de agua destilada esteacuteril tratada con DEPC
Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos En las reacciones de
retrotranscripcioacuten se utilizoacute un volumen final de 20 microL incluyendo 05 microL de agua
destilada esteacuteril 15 microL de PBST (05) 4 microL de buffer RT (5X) 4 microL de MgCl2 (25
mM) 2 microL de dNTPs (10 mM) 2 microL de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de
ARNasas (40UmicroL) 05 microL de enzima M-MuLV Transcriptasa Reversa (20 UmicroL)
(Fermentas Lituania) y 5 microL de ARN o alternativamente una dilucioacuten 15 El programa de
RT fue de 37degC por 60 min seguido de 70degC por 10 min para inactivar la enzima Las
muestras se almacenaron a 4degC hasta su uso posterior
Para las reacciones de PCR se emplearon los cebadores especiacuteficos H360 (5rsquo CAT GAA
GGC TGC CGT GAG GAA GT 3rsquo) y C819 (5rsquo CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA
CC-3rsquo) (MacKenzie 1996) para amplificar una regioacuten de 459 pb del gen CP entre las
posiciones 385 y 844 del genoma viral (Figura 51) y PMTVF4 (5rsquo CAG CAA CCA CAA
ACA GAC AGG 3rsquo) y PMTVR4 (5rsquo AGC CAC TAA CAA AAC ATACTGC 3rsquo) para
obtener amplicones de 415 pb del TGB2 entre las posiciones 1726 y 2141 del ARN 2 (Xu
et al 2004) (Figura 52) Para algunos aislamientos en los que se dificultaba la
amplificacioacuten del TGB2 se utilizaron los cebadores PMTV5 (5 GGT GAA CAC GAG
GAC AAG GT 3) y PMTV7 (5 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 3) (Lambert et al
2003) que amplifican un fragmento de 646 pb y se extienden entre las posiciones del
92
genoma 1417 a 2063 Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 microL
incluyendo 158 microL de agua destilada esteacuteril 25 microL de buffer de enzima (10X) 18 microL de
MgCl2 (25 mM) 05 microL de dNTPs (10 mM) 05 microL de cada cebador (10 microM) 02 microL de
Albuacutemina de suero bovino (20 mgml) (Fermentas) 02 microL de Taq ADN polimerasa (5
UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ADNc aunque en algunas ocasiones dada la falta de
amplicones fue necesario preparar diluciones de 15 110 o 125 de ADNc Las
amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra Alemania) y consistieron
de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 40 ciclos de 94degC por 30 s
53degC por 45 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10 min Luego de
la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se separaron por
electroforesis en gel de agarosa al 15 suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) y
su tamantildeo se verificoacute por comparacioacuten con el marcador de peso molecular Generuler 100
pb DNA ladder (Fermentas)
Los amplicones del tamantildeo esperado correspondientes al menos a cuatro aislamientos
representativos de cultivos de papa de cada uno de los cuatro departamentos bajo estudio
fueron purificados del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para realizar
su secuenciacioacuten directa en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores empleados en
la PCR y el kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied
Biosystems EEUU) Su corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism
3730xl (PE Applied Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur)
A partir de las secuencias obtenidas con cada cebador se construyeron las secuencias
consenso mediante el software BioEdit 606 (Hall 1999) y Chromas Lite (Technelysium
2009) Posteriormente se confirmoacute su origen viral por comparacioacuten con las bases de datos
moleculares con el programa BLASTn (httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) y
se obtuvieron secuencias de PMTV del GenBank de otras regiones del mundo para realizar
un anaacutelisis filogeneacutetico Para esto se generoacute un alineamiento mediante Clustal W (Larkin et
al 2007) del Software Bioedit 606 Los alineamientos fueron utilizados para construir una
una matriz de distancia geneacutetica utilizando el meacutetodo de Maacutexima verosimilitud basado en
el modelo de Tamura-Nei (1993) implementado en el software MEGA v40 (Tamura et al
93
2007) Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute un anaacutelisis de
Bootstrap con 1000 remuestreos (Felsenstein 1985)
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Con el fin de obtener un mayor nivel de informacioacuten sobre las caracteriacutesticas de los
segmentos ARN 2 y ARN 3 del genoma de aislamientos Colombianos de PMTV se realizoacute
un proceso de secuenciacioacuten con minado de cebadores previamente reportados para la
amplificacioacuten de diferentes regiones de cada uno de dichos segmentos (Tabla 51 Figura
53) y buscando que generaran traslape de secuencias de manera que fuera posible la
construccioacuten de un contig general para cada segmento Para esto se seleccionaron cuatro
cepas de PMTV representativas de cada uno de los departamentos bajo anaacutelisis Con cada
cepa se realizaron por lo menos dos amplificaciones con cada cebador de manera que las
secuencias reportadas correspondieran al consenso para cada amplicoacuten Los procedimientos
de extraccioacuten de ARN PCR y secuenciacioacuten fueron similares a los descritos anteriormente
aunque las RT se realizaron con la enzima Transcriptasa Reversa Maximareg (Fermentas)
que ofrece mayores niveles de estabilidad teacutermica (hasta 65degC) y eficiencia que las
transcriptasas reversas convencionales En este caso las reacciones de RT consistieron de
95 microL de agua libre de nucleasas 4 microL de buffer RT (5X) 1 microL de dNTPs (10 mM) 1 microL
de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de ARNasas (40UmicroL) 1 microL de enzima
Transcriptasa Reversa Maximareg (200 UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ARN para un volumen
final de 20 microL La incubacioacuten se realizoacute a 50degC por 30 min y la enzima se inactivoacute a 85degC
por 5 min
Las secuencias se editaron mediante el software Chromas Lite generaacutendose los consensos
con ambos cebadores usando el programa Bioedit 606 y se procedioacute al ensamblaje de los
contigs resultantes utilizando el programa CAP3 (Huang y Madan 1999) Posteriormente
se verificoacute el marco de lectura correcto utilizando el servidor de Expasy (Expasy Proteomic
Server httpwwwexpasychtoolsdnahtml) y se realizoacute su alineamiento con respecto a
los dos segmentos genoacutemicos de aislamientos cuyas secuencias completas se encontraban
disponibles en GenBank (DQ102381 DQ144451 AJ243719 AJ277556) (Sandgren et al
2001 Cerovska et al 2007)
94
Finalmente las secuencias de nt fueron traducidas a aa realizaacutendose comparaciones de
porcentajes de identidad y nuacutemero de posiciones variables a lo largo de las regiones bajo
estudio y generaacutendose aacuterboles filogeneacuteticos basados en los contigs obtenidos en la
investigacioacuten mediante el programa Mega v 40 bajo los paraacutemetros antes descritos
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Variabilidad geneacutetica de PMTV de Colombia
En total se obtuvieron 25 secuencias para la regioacuten amplificada de CP y 38 secuencias para
TGB2 Estas secuencias correspondieron a por lo menos cuatro aislamientos por cada
departamento bajo anaacutelisis (Tabla 52) De esta forma se aumentaron las secuencias
parciales de los genes CP y TGB2 de PMTV con respecto al trabajo reciente realizado por
nuestro grupo (Gil et al 2011) en donde soacutelo se obtuvieron cuatro y tres secuencias para
CP y TGB2 lo cual implica que las diferentes modificaciones realizadas a los
procedimientos necesarios para el estudio de este virus desde la forma de obtencioacuten de las
muestras hasta la purificacioacuten de los amplicones pasando por la eliminacioacuten de inhibidores
de las polimerasas resultaron altamente eficientes Esta situacioacuten abre la posibilidad de
plantear en el futuro proacuteximo un estudio de incidencia de PMTV basado en la deteccioacuten del
virus mediante RT-PCR con un muestreo estratificado en los diferentes pisos teacutermicos
donde se cultiva la papa en Colombia y realizando comparaciones con respecto a los
niveles de incidencia de Sss de manera que sea posible determinar la dimensioacuten de los
niveles de dispersioacuten de este virus en este paiacutes suramericano Un trabajo similar fue
realizado por Montero-Astuacutea et al (2008) en Costa Rica pero utilizando pruebas de ELISA
tanto para la deteccioacuten de Sss como de PMTV En este caso se encontroacute que el virus era
maacutes frecuentemente detectado en las regiones con mayores altitudes donde las condiciones
de alta humedad y bajas temperaturas aparentemente favorecen su infeccioacuten Sin embargo
es probable que la utilizacioacuten de pruebas de ELISA para la deteccioacuten del virus haya
conducido a una subestimacioacuten de los niveles de incidencia detectados en dicho trabajo
pues la distribucioacuten erraacutetica del virus su capacidad de movimiento ceacutelula-ceacutelula con ayuda
de proteiacutenas de movimiento codificadas por el TGB y no necesariamente en su forma
95
encapsidada y la utilizacioacuten de anticuerpos disentildeados a partir de cepas del norte de Europa
pueden influir negativamente en la deteccioacuten seroloacutegica del PMTV (Gallo et al 2012)
El anaacutelisis filogeneacutetico para CP incluyoacute 404 posiciones a partir de 46 secuencias 15 de las
cuales corresponden a aislamientos de referencia de Europa Asia y Norte Ameacuterica y las 4
previamente reportadas de aislamientos Colombianos por Gil et al (2011) El dendrograma
presentoacute dos grupos soportados por valores de bootstrap del 100 (Figura 54) El primer
clado agrupoacute todas las secuencias de referencia con 19 de los aislamientos Colombianos
obtenidos en este estudio y presentaron niveles de identidad superiores al 99 en todos los
casos (Tabla 53) Por otra parte el segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo seis de las aquiacute obtenidas y dos de las reportadas por Gil et
al (2011) Al interior de este clado se presentaron mayores niveles de variacioacuten (11 a
13) y su identidad con respecto a los miembros del primer clado fue de tan solo 76 La
secuencia de Beet Soil-Borne Virus de China utilizada como grupo externo de anaacutelisis se
ubicoacute en posicioacuten externa a los dos clados y compartioacute niveles de identidad inferiores al
59 con respecto a los aislamientos de PMTV
Estos resultados confirman los hallazgos de Veacutelez (2007) y Gil et al (2011) en referencia a
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que incluso bajo los paraacutemetros
definidos por Adams et al (2009) para la definicioacuten de especies al interior de la familia
Virgaviridae (ej cepas con identidades superiores a 80 y 90 a nivel de secuencias de CP
y del genoma completo respectivamente) podriacutea representar una nueva especie del geacutenero
Pomovirus (Familia Virgaviridae) hasta ahora no registrada en otros lugares del mundo Si
se considera que seis de las 25 secuencias de CP obtenidas en este trabajo correspondieron
a dicha variante es evidente que su presencia no es marginal en los cultivos de papa de
Colombia ya que para la muestra obtenida aunque evidentemente sesgada por la coleccioacuten
de suelos y tejidos con presencia de estructuras de Sss su proporcioacuten es del 23 La
diversidad entre aislamientos podriacutea deberse a que la regioacuten andina ha sido propuesta como
el centro de origen del PMTV (Mayo et al 1996)
96
Estos resultados representan un viraje con respecto a lo encontrado en los estudios de
variabilidad de PMTV con base en secuencias de CP de diferentes oriacutegenes geograacuteficos
por cuanto indistintamente se habiacutea encontrado que los niveles de identidad presentes en
este gen superaban el 98 en todas las comparaciones establecidas Asiacute por ejemplo
Latvala-Kirby et al (2009) al comparar 28 secuencias de Finlandia Letonia Escocia
Dinamarca Repuacuteblica Checa y Suecia encontraron que casi todas eran ideacutenticas siendo tan
soacutelo detectado un 2 de variacioacuten entre las maacutes distantes lo cual representa cambios en tan
soacutelo siete posiciones a nivel de la secuencia de aa de la proteiacutena resultante Similarmente
Xu et al (2004) reportaron que aislamientos de PMTV de Estados Unidos y Canadaacute eran
ideacutenticos y que eacutestos a su vez tan soacutelo diferiacutean en maacuteximo 3 de sus secuencias de CP con
respecto a cepas de Peruacute (Mayo et al 1996) Escocia y Escandinavia (Reavy et al 1997)
De esta forma de gran intereacutes resultaraacute emprender estudios que permitan evaluar las
diferencias bioloacutegicas de dichas variantes de PMTV sobre distintas variedades de papa e
incluso sobre hospedantes experimentales debido a que siacute existen diferencias de
patogenicidad entre aislamientos de PMTV que presentan tan bajos niveles de variacioacuten
(Nielsen y Nicolaisen 2003) es posible que dicho efecto sea auacuten mayor cuando se evaluacuteen
las variantes aquiacute reportadas
Con respecto al anaacutelisis filogeneacutetico basado en las secuencias de TGB2 se incluyeron 330
posiciones de 49 secuencias siete de las cuales fueron de aislamientos de referencia de
diferentes paiacuteses y tres de Colombia previamente analizadas por Gil et al (2011) El
dendrograma generado presentoacute un solo clado que incluyoacute todas las secuencias (Figura
55) las que compartieron niveles de identidad superiores a 98 (Tabla 54) Estos
resultados son un indicativo de que la variacioacuten encontrada entre aislamientos Colombianos
con respecto a CP no necesariamente se presentan a lo largo de los diferentes segmentos
genoacutemicos de PMTV y especiacuteficamente no se ven reflejadas en las secuencias de TGB2
que en los pocos estudios donde se ha secuenciado presenta niveles de identidad superiores
a 948 e incluso se ha encontrado que aislamientos de oriacutegenes geograacuteficos diferentes
pueden compartir hasta el 100 de identidad en la secuencia de aa para este gen (ej
aislamiento Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa y aislamientos 54-15 y 54-19 de
Dinamarca) (Cerovska et al 2007) Los altos niveles de conservacioacuten de este gen entre
97
aislamientos de PMTV que presentan diferencias en otras regiones del genoma como las
aquiacute encontradas para CP posibilitan que los cebadores utilizados para su amplificacioacuten
sean una herramienta uacutetil para el diagnoacutestico de este virus Asiacute por ejemplo Lambert et al
(2003) disentildearon los cebadores PMTV5 y PMTV7 dirigidos a amplificar una regioacuten de 646
pb comprendida entre TGB1 y TGB2 cuando reportaron por primera vez la presencia del
PMTV en EEUU Posteriormente Xu et al (2004) utilizaron la regioacuten que codifica para
TGB2 para el disentildeo de los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 en su estudio de evaluacioacuten de
distribucioacuten de PMTV en EEUU y Canadaacute
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Todos los cebadores utilizados en las reacciones de RT-PCR para amplificar diferentes
regiones de los ARN 2 y 3 del genoma de PMTV generaron los amplicones del fragmento
esperado en al menos un aislamiento evaluado Sin embargo en los aislamientos de Narintildeo
y Cundinamarca no fue posible la obtencioacuten de un contig completo para toda la regioacuten
secuenciada de ambos segmentos auacuten luego de diferentes intentos y modificaciones de los
paraacutemetros de la RT-PCR De esta forma para el caso de los aislamientos de Narintildeo no se
lograron amplicones del ARN2 con los cebadores PMTV759 ndash PMTV1552R PMTV759F
ndash 2017R y 1948F ndash 123end para el ARN 3 no fue posible obtener fragmentos con
RNA3F1ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end y F388 ndash PMTV7 Para el caso de
Cundinamarca no se lograron amplicones para el ARN 2 con PMTV759 ndash PMTV1552R y
PMTV759F ndash 2017R y para ARN 3 con RNA3F1 ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end
F388-PMTV7 Considerando que las variantes detectadas mediante la secuenciacioacuten de una
porcioacuten de CP presentaron bajos niveles de identidad con respecto a los genotipos
globalmente distribuidos de PMTV es posible que la ausencia de amplificacioacuten se deba a
diferencias en los sitios de reconocimiento de uno o ambos cebadores situacioacuten que impide
la amplificacioacuten de los fragmentos respectivos y por tanto su secuenciacioacuten posterior De
gran intereacutes seraacute continuar el proceso de secuenciacioacuten de dichas variantes para lo cual es
necesario la clonacioacuten de los respectivos cDNAs de cada segmento y el disentildeo de nuevos
cebadores especiacuteficos que permitan completar los vaciacuteos (gaps)
98
Por las razones antes expuestas para los anaacutelisis de secuencias de ARN2 y 3 soacutelo se
incluyeron los aislamientos representativos de Antioquia (Ant) y Boyacaacute (Boy) (Tabla
55) Para el ARN 2 se obtuvieron contigs de 2577 nt y 2584 para los aislamientos
Antioquia y Boyacaacute mientras que para el ARN 3 los contigs tuvieron una extensioacuten de
2617 y 2360 nt respectivamente Esto implica que para el ARN 2 se obtuvo un porcentaje
de cobertura del 83 de este segmento genoacutemico y del 87 para el ARN 3 en
comparacioacuten con el aislamiento Sw de PMTV (AJ243719 y AJ277556) (Sandgren et al
2001) En teacuterminos de aa los contigs del ARN2 incluyeron 150 de los aa de CP (posiciones
26 a 176) y 799 de CP-RT (posiciones 26 a 825) Para el ARN 3 se obtuvo la secuencia
completa de aa de TGB1 (463 aa) y TGB2 (119 aa) asiacute como 146 de 190 aa de TGB3
(posiciones 1 a 146) para el aislamiento de Boyacaacute y la totalidad de dicha proteiacutena para la
cepa de Antioquia Las demaacutes secuencias obtenidas corresponden a regiones UTR de los
extremos 3acute para el ARN 2 y 5acute para el ARN 3
Con el fin de realizar un anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las dos cepas obtenidas
con respecto al genoma de la cepa de PMTV de Suecia ndash Sw cuyo genoma completo estaacute
depositado en GenBank bajo el coacutedigo PRJNA14789 (Savenkov et al 1999 Sandgren et
al 2001) se incluyeron 1956 nt (651 aa) para CP-RT 531 nt (176 aa) para CP y 1392 (463
aa) para las tres regiones del TGB En teacuterminos generales se encontraron muy altos niveles
de identidad en las tres regiones analizadas siendo la CP la maacutes uniforme con 99 en la
secuencia de nt y 100 en aa para las tres cepas CP-RT presentoacute un nivel de identidad
para nt de 994 entre las cepas de Antioquia y Boyacaacute y del 975 - 976 con respecto a
la secuencia de referencia mientras que estos valores fueron superiores al 982 cuando se
comparoacute la secuencia de aa Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos compartieron
un 999 de identidad en nt y aa (Figura 56) Las pocas diferencias a nivel de aa
encontradas en este estudio correspondieron a cambios en 15 posiciones para el producto
del ARN 2 siendo la maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la posicioacuten 81
de CP Para el caso de TGB se encontraron 10 cambios a lo largo de las tres proteiacutenas
analizadas con la presencia de una delecioacuten en la posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
99
Por otra parte el anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2569 nt para ARN 2 con
secuencias de referencia de los aislamientos Corneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia (Figura 57) arrojoacute un dendrograma con dos
clados soportados por 100 de bootstrap separaacutendose los aislamientos de Colombia de los
de Europa sin embargo los niveles de identidad entre ambos grupos fueron muy altos
(gt975) (Tabla 56) Al calcular los niveles de diversidad (promedio del nuacutemero de
sustituciones de nucleoacutetidos por cada sitio) para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos
(dNS) se encontroacute una diversidad muy baja con tan soacutelo 0017 (SE= 0003) para dNS y
0009 (SE=0002) para dS La relacioacuten promedia entre dNSdS fue de 18 lo cual indica
que las cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten positiva para este componente del
genoma Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 3 mientras que para las
europeas fue de 12 La distancia geneacutetica o nuacutemero de sustituciones promedio por sitio
basada en el meacutetodo de Kimura-2 paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0015
El anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de
referencia de los aislamientos Korneta-Nemilkov (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia generoacute
un dendrograma con dos clados de aislamientos europeos mientras que los aislamientos
Colombianos se presentaron en forma individual sobre ramas soportadas por 100 de
bootstrap (Figura 58) A pesar de dichas agrupaciones los niveles de identidad entre todos
los aislamientos fueron superiores a 967 (Tabla 57) Al calcular los niveles de
diversidad para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos (dNS) se encontroacute una diversidad
muy baja para todos los aislamientos con tan soacutelo 0011 (SE= 0002) para dNS y 0044
(SE=0006) para dNS La relacioacuten media entre dNSdS fue de 025 lo cual indica que las
cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten estabilizadora en dicho segmento de ARN
Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 019 mientras que para los
aislamientos europeos fue de 039 La distancia geneacutetica basada en el meacutetodo de Kimura -2
paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0020 (SE 0002)
Los bajos niveles de variacioacuten encontrados en los anaacutelisis de genomas de PMTV (Savenkov
et al 1999 Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) y que nuevamente fueron inferidos
100
en el presente estudio para las cepas del clado que representa PMTV sensu stricto indican
que este virus se encuentra bajo fuertes presiones de seleccioacuten determinadas
presumiblemente por las propias caracteriacutesticas de su genoma el estrecho rango de
hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica por parte de su vector Sss (Kirk
2008 Santala et al 2010)
Para el primer caso la restriccioacuten selectiva se manifiesta por los bajos valores de dNSdS
calculados para dicho segmento y ocurre fundamentalmente al presentarse traslape de genes
en el ARN 3 Sin embargo para el ARN 2 dicha relacioacuten fue gt1 lo cual sugiere una
seleccioacuten positiva que puede explicarse por el hecho que este segmento presenta la
estrategia de supresioacuten del codoacuten de parada tipo amber para la traduccioacuten de las dos
proteiacutenas codificantes (CP y CP-RT) lo cual supone menos restricciones para la fijacioacuten de
mutaciones De otra parte la presencia de un estrecho rango de hospedantes para el virus
que se restringe a algunas especies de las familias Solanaceae y Chenopodiaceae (Kirk
2008) aunada a su transmisioacuten por Sss supone fuertes restricciones sobre los cambios en
las diferentes proteiacutenas del virus que interactuacutean con sus hospedantes y vectores lo cual
impide altas tasas de variacioacuten tales como las que presentan otros virus de ARNss(+) como
los potyvirus que en general tienen amplios rangos de hospedantes y cuya transmisioacuten por
aacutefidos poliacutefagos es del tipo no persistente (Hu et al 2009)
A pesar de los altos valores de uniformidad general encontrados de gran intereacutes resultoacute la
presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los aislamientos
colombianos de PMTV Por esto es necesario en el futuro evaluar el significado bioloacutegico
de dichos cambios por ejemplo si estan relacionadas con el efecto de las variedades nativas
de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas que las poblaciones de Sss
tienen en las regiones Andinas donde se presentan mayores niveles de variacioacuten que en
aquellas encontradas en las regiones cultivadoras de papa del hemisferio norte tal como lo
planteoacute Carrentildeo (2009) El efecto de estas inserciones y de diferentes sustituciones
detectadas en este trabajo sobre diferentes regiones de los segmentos de ARN 2 y 3
requiere un tratamiento futuro detallado a partir de anaacutelisis de mutantes y de sus efectos
sobre el ciclo infectivo viral
101
Esta investigacioacuten representa un avance importante en la caracterizacioacuten geneacutetica del
PMTV en las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia Sus resultados
confirman la presencia de dos genotipos principales de este virus en el paiacutes uno que
representa al PMTV sensu stricto destacado por presentar muy bajos niveles de variacioacuten
entre sus cepas y otro que representa una variante hasta ahora soacutelo identificada en
Colombia y que por presentar porcentajes de identidad inferiores al 80 con respecto al
grupo principal podriacutea representar una nueva especie de pomovirus que requiere ser
evaluada bioloacutegica patogeacutenica y molecularmente Finalmente es imperativo estudiar el
efecto de ambos genotipos virales sobre la produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de
papa en Colombia de manera que los organismos de sanidad vegetal estatales gremios de
productores y agroindustrias puedan valorar la necesidad de incluir la deteccioacuten del PMTV
en los programas de certificacioacuten de semilla y de mejoramiento geneacutetico de papa que se
adelantan en el paiacutes
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz
Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el
Departamento de Narintildeo
102
BIBLIOGRAFIacuteA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Arif M Torrance L Reavy B 1995 Acquisition and transmission of Potato mop-top
furovirus by a culture of Spongospora subterranea f sp subterranea derived from a single
cystosorus Annals of Applied Biology 126493-503
Calvert E Harrison BD 1966 Potato mop-top a soil-borne virus Plant Pathology
15134ndash139
Carnegie SF Saddler GS Peters JC 2009 Cultivar susceptibility to Potato mop-top virus
(PMTV) infection and symptom expression Aspects of Applied Biology 94 (Potatoes
Viruses and their Vectors) 51ndash54
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea
fsp subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Cerovska N Moravec T Rosecka P Filigarova M Pecenkova T 2003 Nucleotide
sequences of coat protein coding regions of six potato mop-top virus isolates Acta
Virologica 4737-40
Cerovska N Pecenkova M Foligarova M Dedic P 2007 Sequence analysis of the
Czech Potato mop-top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica
5261-64
103
Cowan GH Torrance L Reavy B1997 Detection of Potato mop-top virus capsid
readthrough protein in virus particles Journal of General Virology 781779-1783
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
Scotland
Felsenstein J 1985 Confidence limits on phylogenies an approach using the bootstrap
Evolution 39(4)783-791
Gallo Y 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea en Bioquiacutemica Facultad de Medicina Universidad Nacional
de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Gil JF Gutieacuterrez P Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
Hall TA 1999 BioEdit a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis
program for Windows 9598NT Nucleic Acids Symposium Series 4195-98
Harrison BD Jones RAC 1970 Host range and some properties of Potato mop-
top virus Annals Applied Biology 65393-402
104
Hu X Karasev AV Brown CJ Lorenzen JH 2009 Sequence characteristics of potato
virus Y recombinants Journal of General Virology 903033ndash3041
Huang X Madan A 1999 CAP3 A DNA sequence assembly program Genome
Research 9868-877
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 7147-57
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Kirk HG 2008 Mop-top virus relationship to its vector American Journal of Potato
Research 85 261-265
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003
First Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease
87872
Larkin M Blackshields G Brown NP Chenna R McGettigan PA McWilliam H
Valentin F Wallace IM Wilm A Loacutepez R Thompson JD Gibson TJ Higgins DG
2007 Clustal W and Clustal X version 20 Bioinformatics 23(21)2947-2948
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99519-531
105
Lim HS Bragg J N Ganesan U Lawrence DM Yu J L Isogai M Hammond J
Jackson AO 2008 Triple gene block protein interactions involved in movement of Barley
stripe mosaic virus Journal Virology 824991-5006
Lim HS Bragg J N Ganesan U Ruzin S Schichnes D Lee MY Vaira AM Ryu KH
Hammond J Jackson AO 2009 Subcellular localization of the Barley stripe mosaic virus
triple gene block proteins Journal Virology 839432-9448
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization
and effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal
of General Virology 862879-2889
MacKenzie DJ 1996 Detection of potato mop-top virus in leaf or tuber tissue by reverse
transcription-polymerase chain reaction Document CPHBT96K03 Centre for Plant Health
Agriculture and Agri-Food Canada Sidney BC Canada
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C
Salazar LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top
virus from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
Montero-Astuacutea M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U and Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Mumford RA Walsh K Barker I Boonham N 2000 Detection of Potato mop top virus
and Tobacco rattle virus using a multiplex real-time fluorescent reverse transcription
polymerase chain reaction assay Phytopathology 90448-453
106
Nakayama T Maoka T Hataya T Shimizu M Fuwa H Tsuda S Motoyuki M 2010
Diagnosis of Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-225
Nielsen SL Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups
within Potato mop-top virus Archives of Virology 148 381-388
Reavy B Sandgren M Barker H Heino P Oxelfelt P 1997 A coat protein transgene
from a Scottish isolate of Potato mop-top virus mediates strong resistance against
Scandinavian isolates which have similar coat protein genes European Journal of Plant
Pathology 103829-834
Roos J Hopkins R Kvarnheden A Dixelius C 2011 The impact of global warming on
plant diseases and insect vectors in Sweden European Journal of Plant Pathology 1299-19
Ryazantsev DY Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato viral pathogens Molecular Biology 43515-523
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M
Wieczorek P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-
Wiśniewska J Yin Z Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E
Taluntytė L Pūpola N Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E
107
Sozonov A Tikhonovich I Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam
G Valkonen JPT 2010 Detection distribution and control of Potato mop-top virus a soil-
borne virus in northern Europe Annals of Applied Biology 157163-178
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003
Potato mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich
protein are dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of
General Virology 841001-1005
Savenkov EI Sandgren MY Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Tamura K Dudley J Nei M Kumar S 2007 MEGA4 Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) software version 40 Molecular Biology and Evolution 241596-1599
Tamura K Nei M 1993 Estimation of the number of nucleotide substitutions in the
control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Molecular Biology and
Evolution 10512-526
Technelysium 2009 Chromas 20 Consultado el 15 de Febrero de 2009 Disponible en
httpwwwtechnelysiumcomauchromas_litehtml
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Research 83423-31
Torrance L Cowan GH Pereira LG 1993 Monoclonal antibodies specicreg for Potato
mop-top virus and some properties of the coat protein Annals of Applied Biology 122311-
322
108
Torrance L Cowan GH Sokmen M A Reavy B 1999 A naturally occurring deleted
form of RNA 2 of Potato mop-top virus Journal of General Virology 802211-2215
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop-top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI
Torrance L 2010 The N-Terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required
for nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant-Microbe Interaction 23(11)1486-1497
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top
virus in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
109
51 Anexos
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb) dirigidos al
gen de la caacutepside viral de PMTV a partir de muestras de tejido de raiacutez de plantas de N
benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea del
Departamento de Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador 100 pb Carril 2 BS8T Carril 3
BS9T Carril 4 BS4T Carril 5 BS11P Carril 6BS4T Carril 7 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7
500 pb
110
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb)
dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) de PMTV a partir de muestras de tejido de
raiacutez de plantas de N benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S
subterranea de los Departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador
100 pb Carril 2-4 Control positivo (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 5-7
SRL5 (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 8-10 SRL7 (ADN directo
110150 respectivamente) Carril 11-13 BS8T (ADN directo 110150
respectivamente) Carril 1415 BS4T1 (ADN directo y 110) Carril 16 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
500 pb
111
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten de los
segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV)
Cebador Secuencia 5acute- 3 Posicioacuten en el
genoma (nt) Referencia
RNA3 F1 CGCTCGAGTTTAGGTGACACTATAGGTATTTCA
ACTCTACCTAG 1 a 388
Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003 PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
PMTVF4 CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG 1726 a 1746 Xu et al
2004
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
F388
CGGGATCCGAAGTAGACCACACAGAGTG
1 a 388 Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011 PMTV1552R GCC AAT TGT CTC AAT CAT ACA CTG 1865 a 1888
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011
2017R CCA CTG CAA AAG AAC CGA TTT C Mumford
et al 2000
1948F GTG ATC AGA TCC GCG TCC TT Mumford et al 2000
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
112
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7 (2063 pb)
PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al ARN3 del genoma
del Potato mop-top virus (PMTV) a partir de tejido de raiacutez de plantas de N benthamiana y
S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea de cuatro departamentos de
Colombia Carril 1 Marcador 100 pb plus carriles 2-5 con cebadores RNA3F1-PMTV7
SRL5 SRL6 BS9T1 BS9T2 carril 6-12 con cebadores PMTV5-PMTV7 23T 24T
SRL5 SRL6 BS4T BS8T BS9T carril 13-20 con cebadores PMTVF4-123 end Villa1
NS19P1 23T 24T SRL4 SRL5 SRL6 BS4T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1000 pb 500 pb
113
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos cultivadores de papa de
Colombia
Gen CP Gen TGB2
ANTIOQUIA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
25 La Unioacuten Suelo S tuberosum 25(1) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL4 Santa Rosa S tuberosum var Diacol Capiro 25(2) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL4 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle La Unioacuten Suelo S tuberosum SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle1 La Unioacuten Suelo S tuberosum
Valle2 La Unioacuten Suelo S tuberosum
BOYACAacute
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
BS2T Oicataacute Suelo S tuberosum BS1P1 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4P Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS1P2 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4T Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS4T1 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS8T Soracaacute Suelo S tuberosum BS4T2 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS9T Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum BS8T1 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11P Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS8T2 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11T Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS9T1 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS12P Tunja Suelo con Pennisetum clandestinum BS9T2 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS9T3 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS11T1 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS11T2 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS13P Tunja Suelo S tuberosum
CUNDINAMARCA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
CS1T Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa CS1P1 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2P Subachoque Suelo S tuberosum CS1P2 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2T Subachoque Suelo S tuberosum CS2P Subachoque Suelo S tuberosum
CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Mad Madrid Suelo S tuberosum Villa1 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
114
Villa2 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
NARINtildeO
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
NS1P Pasto Suelo S tuberosum NS3P1 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS2T Pasto Suelo S tuberosum NS3P2 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro NS3P3 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8P Pasto Suelo S tuberosum NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8PF Pasto Suelo S tuberosum
NS10T Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS19P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS19P2 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P2 Ipiales Suelo S tuberosum
115
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de Potato
mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo
Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus (China)
Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte inferior de
las ramas
116
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
BS4T
Boyacaacute
Colombia
CS1T
Cundinamarca
Colmbia
NS2T
Narintildeo
Colombia
NS6P
Narintildeo
Colombia
71MY
Cundinamarca
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AJ243719
PMTV
Suecia
EF545141
Beet Soil-
Borne
Virus
China
BS4T Boyacaacute
Colombia ID 0997 0764 0752 0762 0995 0995 0599
CS1T
Cundinamarca
Colombia
0997 ID 0764 0752 0762 0992 0992 0599
NS2T Narintildeo
Colombia 0764 0764 ID 0891 0876 0769 0769 0571
NS6P Narintildeo
Colombia 0752 0752 0891 ID 0967 0752 0752 0596
71MY
Cundinamarca
Colombia
0762 0762 0876 0967 ID 0762 0762 0599
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0995 0992 0769 0752 0762 ID 1 0594
AJ243719
PMTV Suecia 0995 0992 0769 0752 0762 1 ID 0594
EF545141 Beet
Soil-Borne
Virus China
0599 0599 0571 0596 0599 0594 0594 ID
117
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del
mundo Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus
(China) Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte
inferior de las ramas
118
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
23T
Antioquia
Colombia
NS22P1
Narintildeo
Colombia
Villa2
Cundinamarca
Colombia
DQ144451
Repuacuteblica
Checa
NC_003725
Suecia
EF545142 Beet
Soil-Borne Virus
China
23T Antioquia
Colombia ID 0981 0981 0984 0981 0699
NS22P1 Narintildeo
Colombia 0981 ID 099 0984 0981 0708
Villa2 Cundinamarca
Colombia 0981 099 ID 0987 0984 0708
DQ144451 Repuacuteblica
Checa 0984 0984 0987 ID 099 0714
NC_003725 Suecia 0981 0981 0984 099 ID 0711
EF545142 Beet Soil-
Borne Virus China 0699 0708 0708 0714 0711 ID
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato mop-top virus en cuatro
Departamentos cultivadores de papa de Colombia
Muestra Hospedante Municipio Planta sentildeuelo
Ant (23T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
La Unioacuten (Antioquia)
N benthamiana
Boy (BS4T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Siachoque
(Boyacaacute) N benthamiana
Cund(CS1T) Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
Subachoque (Cundinamarca)
N benthamiana
Nar (NS6P) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro Pasto (Narintildeo) S phureja
119
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia y Boyacaacute
(Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw Suecia A Niveles de
identidad de nucleoacutetidos y aminoaacutecidos (entre pareacutentesis) de las regiones CP CP-RT y
TGB analizadas y la cepa NC_003724 B Regioacuten CP-RT se incluyeron 1956 nt (651 aa)
para CP-RT y 531 nt (176 aa) para CP Se presentaron cambios en 15 posiciones para el
producto del ARN 2 siendo lo maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la
posicioacuten 81 de CP C Regioacuten TGB se incluyeron 1392 nt (463 aa) Se presentan 10
cambios a lo largo de las tres proteiacutenas analizadas con la presencia de una delecioacuten en la
posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
120
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con secuencias de
referencia de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia y secuencias Colombianas de PMTV
procedentes de Antioquia y Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de
Bootstrap (100 ) se indican sobre las ramas La escala representa las sustituciones
promedio por sitio
121
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica Checa
AJ243719
PMTV Suecia
Antioquia
Colombia ID 0994 0979 0976
Boyacaacute
Colombia 0994 ID 0978 0975
DQ102381 PMTV
Repuacuteblica Checa 0979 0978 ID 0995
AJ243719 PMTV
Suecia 0976 0975 0995 ID
122
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de referencia
de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19
(AY353719) y 54-10 (AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd
(D30753) de Escocia y secuencias Colombianas de PMTV procedentes de Antioquia y
Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de Bootstrap (100 ) se indican
sobre las ramas La escala representa las sustituciones promedio por sitio
123
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AY426745
PMTV
Dinamarca
AY353719
Dinamarca
AJ277556
PMTV
Suecia
D30753
PMTV
Escocia
Antioquia
Colombia ID 0979 0988 0987 0986 0973 0967
Boyacaacute
Colombia 0979 ID 0980 0980 0979 0980 0969
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0988 0980 ID 0998 0997 0979 0971
AY426745
PMTV
Dinamarca
0987 0980 0998 ID 0997 0979 0970
AY353719
PMTV
Dinamarca
0986 0979 0997 0997 ID 0978 0969
AJ277556
PMTV Suecia 0973 0980 0979 0979 0978 ID 0986
D30753 PMTV
Escocia 0967 0969 0971 0970 0969 0986 ID
124
6 ANEXOS GENERALES
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen)
1 Homogenizar 100 mg de tejido de planta en nitroacutegeno liacutequido utilizando un mortero
Adicionar 400 microL de buffer AP1 y 4 microL de la solucioacuten de ARNase A (100mgmL) a
un maacuteximo de 100 mg (peso huacutemedo) o 20 mg (peso seco) de tejido de planta
homogenizado y agitar vigorosamente
2 Incubar la mezcla por 10 min a 65degC Mezclar por inversioacuten 2 oacute 3 veces durante la
incubacioacuten
3 Agregar 130 microL de buffer AP2 al lisado mezclar e incubar por 5 min en hielo
4 Recomendado Centrifugar el lisado por 5 min a 20000 x g (14000 rpm)
5 Pipetear el lisado en la columna QIAshredder Mini spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a 20000 x g (14000 rpm)
6 Transferir la fraccioacuten que pasoacute por la columna del paso 5 en un nuevo tubo sin
disturbar el sedimento de restos celulares
7 Agregar 15 voluacutemenes de buffer AP3E al lisado aclarado y mezclar por pipeteo
8 Pipetear 650 microL de la mezcla de paso 7 incluyendo cualquier precipitado que se
pueda haber formado en la columna DNeasy Mini spin column colocando en un
tubo de coleccioacuten de 2 ml Centrifugar por 1 min a 6000 x g (corresponde a 8000
rpm para la mayoriacutea de las microcentrifugas) y descartar el liacutequido Reutilizar el
tubo de coleccioacuten en el paso 9
9 Repetir el paso 8 con la muestra restante Desechar el liacutequido que atraviesa la
membrana y el tubo de coleccioacuten
10 Colocar la columna DNeasy Mini spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2 ml
agregar 500 microL de buffer AW y centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rpm)
Descartar el liacutequido que atraviesa la membrana y reutilizar el tubo de coleccioacuten en
el paso 12
11 Adicionar 500 microL de buffer AW a la columna DNeasy Mini spin y centrifugar por 2
min a 20000 x g (14000 rpm) para secar la membrana
12 Transferir la columna DNeasy Mini spin a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL y
pipetear 40 microL de Agua bi-destilada directamente en la membrana de DNeasy
Incubar por 5 min a temperatura ambiente (15-25degC) y luego centrifugar por 1 min
a 6000 x g (8000 rpm) para eluir
13 Repetir el paso 12 una vez
125
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo (Doyle y Doyle 1987)
Previo a dar inicio a al procedimiento se debe asegurar de contar con
Nitroacutegeno liacutequido
Bantildeo Mariacutea a 65degC
Enfriar morteros a -20degC
Preparar solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2
Preparar el volumen de buffer CTAB+ β-Mercaptoetanol correspondiente al
nuacutemero de muestras
Desinfestar las muestras con hipoclorito y agua destilada durante 1 min
1 Tomar la raiacutez previamente desinfestada macerarla en nitroacutegeno liacutequido y pasarla a
un tubo eppendorf de 2 mL hasta completar un volumen de 400-500 microL
2 Adicionar 500 microL de buffer de extraccioacuten (CTAB) y 1 de β-Mercaptoetanol (5
microL) previamente preparado
Mezclar por inversioacuten
3 Incubar los tubos a 65degC por 30 min Durante este tiempo hacer inversioacuten de los
tubos cada 5 min
4 Adicionar 250 microL de fenol y 250 microL de cloroformo alcohol isoamiacutelico (241)
Mezclar por inversioacuten
5 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 10 min
6 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL
7 Adicionar un volumen de cloroformo alcohol isoamiacutelico (respecto al sobrenadante)
Mezclar por inversioacuten y centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 5 min
8 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL y repetir
el paso 7
9 Adicionar un volumen de isopropanol friacuteo y 01 voluacutemenes de acetato de sodio 3M
invertir varias veces para precipitar el ADN Llevar las muestras a -20degC por 60 min
como miacutenimo o durante toda la noche Periodos maacutes largos pueden aumentar la
produccioacuten
10 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 15 min a temperatura ambiente
11 Descartar el sobrenadante invirtiendo raacutepida y suavemente los tubos y adicionar 200
microL de etanol friacuteo al 70 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 2 min
12 Descartar el sobrenadante por inversioacuten y secar el pellet a temperatura ambiente
invirtiendo los tubos sobre papel absorbente
13 Resuspender el pellet en 50 microL de agua ultrapura esteacuteril
14 Adicionar 4 microL de ARNasa a cada muestra e incubar en el bantildeo Mariacutea a 37degC
durante miacutenimo 2 horas o durante toda la noche
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
126
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y
hongos filamentosos (Qiagen)
1 Determinar la cantidad de material de planta No usar maacutes de 100 mg
2 Colocar inmediatamente el tejido pesado en nitroacutegeno liacutequido Macerar bien en
un mortero Pasar el tejido en polvo a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL
manteniendo los tubos en nitroacutegeno liacutequido Eacuteste se puede evaporar pero no se
debe permitir que el tejido se descongele Proceder inmediatamente al paso 3
3 Adicionar 450 microL de buffer RLC a un maacuteximo de 100 mg de tejido en polvo
Hacer vortex vigorosamente Nota Asegurar que el B-mercaptoetanol (β-ME)
haya sido agregado al buffer RLC antes de su uso (10 microL de β-ME1 mL de
buffer RLC)
4 Transferir el lisado a la columna QIAshredder spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a maacutexima velocidad (13000 rpm
oacute 18500 x g) Transferir cuidadosamente el sobrenadante que pasoacute por la
columna a un nuevo tubo de microcentriacutefuga sin disturbar el sedimento de
restos celulares en el tubo de coleccioacuten Usar soacutelo el sobrenadante en los pasos
siguientes
5 Adicionar 05 voluacutemenes de etanol (96-100) al lisado aclarado y mezclar
por pipeteo inmediatamente No centrifugar Proceder inmediatamente al paso 6
6 Transferir la muestra (usualmente 650 microL) incluyendo cualquier precipitado
que se haya formado a una columna RNeasy spin (rosada) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL (suministrado) Cerrar suavemente la tapa y centrifugar
por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que pasoacute por la
membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 7
7 Adicionar 700 microL de buffer RW1 a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 8
8 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo en el paso 8 Nota Asegurar que el
buffer RPE tenga adicionado el etanol antes de su uso
9 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 2 min a 8000 x g (10000 rpm) para lavar la membrana
de la columna
10 Opcional Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2
mL (suministrado) y descartar el tubo anterior con el liacutequido Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar a velocidad maacutexima por 1 min (13000 rpm oacute 18500 x g)
11 Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 15 mL
(suministrado) Adicionar 20 microL de agua tratada con DEPC (Dietil
pirocarbonato Qiagen) directamente a la membrana de la columna Cerrar
suavemente la tapa y centrifugar por 1 min a 8000 x g (10000 rpm) para eluir
el ARN
12 Repetir el paso 11
127
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Volumen del componente
para 15 microL de mezcla
Producto de PCR 8 μl
Buffer de la enzima 1 (1X) 1 5 μl
Buffer de la enzima 2 (1X) 1 5 μl
Enzima de restriccioacuten 1 2 μl
Enzima de restriccioacuten 2 2 μl
Volumen total 15 μl
2 Incubar las muestras al bantildeo Mariacutea a 37degC por 12 h-24 h
3 Ralizar el anaacutelisis en gel de agarosa al 25
128
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa RT M-
MuLV para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del componente
para 20 microL de mezcla
Agua bi-destilada 05 microL
PBST (05) 004 15 microL
Buffer RT M-MuLV 5X 1X 4 microL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 microL
dNTPs 10 mM 1 mM 2 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 1 microM 2 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa M-MuLV 20 UmicroL 05 microL
ARN 5 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
129
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 20 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 95 microL
Buffer RT Maacutexima 5X 1X 4 microL
dNTPs 10 mM 05 mM 1 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 05 microM 1 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa Maximareg 200 UmicroL 1 microL
ARN 3 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
130
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes de
descongelar
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 146 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 25 mM 02 mM 2 microL
Primer F 10 microM 05 microM 125 microL
Primer R 10 microM 5 microM 125 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 04 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN Molde 1microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Condiciones del ciclo de la PCR para Sss
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 55 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
131
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes del
descongelamiento
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25
microL de mezcla
Agua bi-destilada 158 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 10 mM 02 mM 05 microL
Primer F 10 microM 2 microM 05 microL
Primer R 10 microM 2 microM 05 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 02 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN copia 3 microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 53 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
134
7 CONCLUSIONES GENERALES
En este estudio se encontroacute que las poblaciones Colombianas de Spongospora subterranea
f sp subterranea (Sss) presentan una estructura baacutesica consistente en tres tipos geneacuteticos
(I II y III) El subgrupo III difiere de los reportados mundialmente como Tipo I y Tipo II
en 5 y 2 respectivamente El Tipo III presentoacute la mayor proporcioacuten de aislamientos de
Sss en este estudio con cepas de diferentes departamentos hospedantes y tejidos
sintomaacuteticos mientras que el Tipo I no fue encontrado en muestras procedentes de agallas
de raiacutez Es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa en Colombia asiacute como su
epidemiologiacutea y capacidad para la transmisioacuten de PMTV
Los anaacutelisis de RFLPs de regiones ITS del ADNr de Sss demostraron polimorfismos en los
sitios de corte de las enzimas Hin6I y Bsp143I Se confirmoacute que la digestioacuten con la enzima
Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos del Tipo III mientras que
el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los Tipos I y II permitiendo
separar los tres principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico de Sss Los
resultados obtenidos sugieren la viabilidad de plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla
El anaacutelisis filogeneacutetico para el gen CP de PMTV permitioacute separar dos grupos de
aislamientos del virus El primer clado agrupoacute todas las secuencias de referencia mundial
con 19 de los aislamientos Colombianos obtenidos en este estudio que presentaron niveles
de identidad superiores al 99 El segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo dos de las reportadas en investigaciones previas y seis
obtenidas en el presente estudio con niveles de variacioacuten del 11 al 13 y con una identidad
de tan solo 76 con respecto a los miembros del primer clado Estos resultados confirman
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que no ha sido registrada en otros
Osorio 2012
135
135
lugares del mundo Es necesario estudiar el efecto de ambos genotipos virales sobre la
produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de papa en Colombia de manera que se generen
tecnologiacuteas para la deteccioacuten de PMTV en los programas de certificacioacuten de semilla y de
mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en el paiacutes
En el anaacutelisis de las regiones parciales de CP y CP-RT del ARN2 y TGB del ARN3 de
PMTV sensu stricto se encontraron niveles muy altos de identidad en las tres regiones
estudiadas siendo la CP la maacutes uniforme Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos
compartieron un 999 de identidad en nt y aa Asiacute mismo los anaacutelisis filogeneacuteticos para el
ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Europeos y Colombianos demostraron que los niveles de
identidad entre ambos grupos fueron muy altos gt975 para ARN 2 y gt967 para el
ARN 3 Estos bajos niveles de variacioacuten permiten inferir que este virus se encuentra bajo
fuertes presiones de seleccioacuten determinadas presumiblemente por las propias caracteriacutesticas
de su genoma el estrecho rango de hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica
por parte de su vector Sss Sin embargo a pesar de los altos valores de uniformidad general
encontrados la presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los
aislamientos colombianos de PMTV resulta interesante para el desarrollo de
investigaciones que permitan determinar si se trata de adaptaciones del genoma viral a las
variedades nativas de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas propias de
las poblaciones de Sss en las regiones Andinas
NS1P Pasto (Nar) Suelo S tuberosum
ii
Agradezco al Profesor Mauricio Mariacuten por su gran acompantildeamiento y apoyo al Profesor
Pablo Gutieacuterrez por su colaboracioacuten a mis compantildeeros del Laboratorio de Biologiacutea Celular
y Molecular de la Universidad Nacional de Colombia sede Medelliacuten y a la Profesora Elena
Paola Gonzaacutelez del Politeacutecnico Jaime Isaza Cadavid por su colaboracioacuten con el preacutestamo
de algunos equipos
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al soporte econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (Proyecto 090-2007S4527-87-08) y a la Universidad
Nacional de Colombia sede Medelliacuten
iii
Dedico este proyecto a mis Padres AGA y JIOH y a mi esposo JPPV
iv
TABLA DE CONTENIDO
Pag
RESUMEN XI
ABSTRACT XII
1 INTRODUCCIOacuteN 1
2 OBJETIVOS 4
21 Objetivo general 4
22 Objetivos especiacuteficos 4
3 MARCO TEOacuteRICO 5
31 Generalidades del cultivo de la papa 5
32 Generalidades sobre Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) 7
321 Taxonomiacutea de Sss 7
322 Ciclo de vida Sss 8
323 Rango de hospedantes de Sss 10
324 Siacutentomas causados por Sss 11
325 Control de Sss 12
33 Deteccioacuten de Sss 16
34 Variabilidad geneacutetica de Sss 19
35 Generalidades del Potato mop-top virus (PMTV) 22
351 Taxonomiacutea de PMTV 23
352 Ciclo de la infeccioacuten por PMTV 24
353 Rango de hospederos de PMTV 25
354 Siacutentomas causados por PMTV 26
36 Deteccioacuten de PMTV 27
37 Variabilidad geneacutetica de PMTV 29
BIBLIOGRAFIA 31
v
Pag
RESULTADOS 46
4 ARTIacuteCULO 1- VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora
subterranea f sp subterranea EN COLOMBIA 46
41 Anexos-Artiacuteculo 1 65
5 ARTIacuteCULO 2 ndash VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE LOS ARN 2 Y 3
DE AISLAMIENTOS COLOMBIANOS DE PMTV 84
51 Anexos-Artiacuteculo 2 109
6 ANEXOS GENERALES 124
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen) 124
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo 125
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y hongos
filamentosos (Qiagen) 126
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs 127
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
RT M-MuLV para muestras de ARN 128
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN 129
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa 130
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa 131
7 CONCLUSIONES GENERALES 132
vi
INDICE DE FIGURAS
Pag
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV 24
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp
subterranea en plantas de papa de Colombia 65
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja
var Criolla Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos
infestados con Spongospora subterranea f sp subterranea 66
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos
agallas o raiacuteces de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana 68
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8 69
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la
regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp
subterranea de Colombia 70
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb)
a partir de ADN de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum
tuberosum S phureja y Nicotiana benthamiana 71
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e
ITS2 del ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss)
de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo 75
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos
de S subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I
MspI TaqI y Tru1I mediante el programa Web-cutter 77
vii
Pag
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN
ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las
enzimas de restriccioacuten Bsp143I y Hin6I que permiten determinar los tres
Tipos de Sss identificados en este trabajo 82
Figura 410 Gel de RFLPs con la enzima Hind6I y Bsp143I con muestras de los
Tipos I II y III de Sss detectados en el estudio 83
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb)
dirigidos al gen de la caacutepside viral del Potato mop-top virus PMTV 109
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4
(417 pb) dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) del Potato
mop-top virus (PMTV) 110
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7
(2063 pb) PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al
ARN3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 112
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses
del mundo 115
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del
genoma de Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia
y otros paiacuteses del mundo 117
viii
Pag
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia
y Boyacaacute (Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw
Suecia 119
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con
secuencias de referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del
Potato mop-top virus (PMTV) 120
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias
De referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del Potato
mop-top virus (PMTV) 122
ix
INDICE DE TABLAS
Pag
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o
raiacuteces de plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea 67
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna
polvosa y de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad 72
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de
aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en
Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2
del ADN ribosomal 78
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S
E ITS2 del ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp
subterranea de Colombia y otros paiacuteses del mundo 81
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten
de los segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 111
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia 113
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 116
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 118
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato
mop-top virus en cuatro Departamentos cultivadores de papa de Colombia 118
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 118
x
Pag
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 123
xi
RESUMEN
El cultivo de papa es uno de los renglones agriacutecolas de mayor importancia en Colombia se
extiende a 128701 ha y genera una produccioacuten anual de 23 millones de ton antildeo-1
Desde el
punto vista fitosanitario la papa se ve afectada por diversos problemas destacaacutendose en los
uacuteltimos antildeos la reemergencia de la Sarna polvosa causada por el protozoario del suelo
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) El efecto de esta enfermedad se refleja en
el deterioro de la calidad del tubeacuterculo y en la reduccioacuten de la produccioacuten al afectar el
sistema radicular de las plantas Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus
(PMTV) uno de los virus prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarenteneario en diferentes paiacuteses del mundo En este trabajo se evaluaron los niveles de
variabilidad geneacutetica de aislamientos Sss y PMTV obtenidos en cultivos de papa de los
departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo En el caso de Sss se
estudiaron los niveles de variacioacuten de 127 aislamientos a partir de la secuenciaciacioacuten de
las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr) encontraacutendose la presencia de tres variantes
principales dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada Para PMTV se
evaluaron los niveles de identidad de 38 aislamientos de los cuatro departamentos bajo
estudio a partir de la secuenciacioacuten de los genes de la caacutepside viral (CP) y del segundo gen
del triple bloque de genes (TGB2) encontraacutendose la presencia de dos variantes del virus
una que representa el genotipo mundialmente reportado para este virus y la otra que hasta
ahora soacutelo se ha encontrado en Colombia y que dado el bajo nivel de identidad (76) con
respecto al primer grupo posiblemente representa una nueva especie de pomovirus
Finalmente dos de las cepas de PMTV de Antioquia y Boyacaacute fueron secuenciadas para
sus ARN 2 y 3 lograacutendose un 83 del segmento genoacutemico de ARN 2 y 87 para el ARN
3 y encontraacutendose que comparten niveles de identidad superiores al 97 con respecto a
otros aislamientos previamente caracterizados en el Norte de Europa Se espera que los
resultados de esta investigacioacuten sean utilizados para el disentildeo de herramientas de
xii
diagnoacutestico que apoyen los esquemas de certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas
de mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en Colombia
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum Potato mop-top
virus secuenciacioacuten
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea AND ITS
ASSOCIATED PMTV VIRUS IN COLOMBIA
ABSTRACT
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
The other hand Sss is a vector for Potato mop-top virus (PMTV) a prevalent virus in the
Andean region and quarentenary in several countries However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
xiii
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum Potato mop-top virus
RT-PCR Sequencing
1
1 INTRODUCCIOacuteN
En Colombia el cultivo de la papa ocupa cerca de 128701 ha distribuidas en 14
departamentos de los cuales Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo son responsables
del 80 de la produccioacuten que asciende a cerca de 23 millones de ton antildeo-1
y de la cual
dependen maacutes de 69000 familias del sector rural del paiacutes La cadena de la papa en
Colombia enfrenta un gran nuacutemero de desafiacuteos endoacutegenos y exoacutegenos que disminuyen su
competitividad respecto a los demaacutes paiacuteses del mundo y en especial con relacioacuten a los otros
miembros de la Comunidad Andina de Naciones Entre otros factores los maacutes limitantes
son aquellos relacionados con la carencia de tecnologiacutea en los sistemas de produccioacuten y de
post-cosecha la alta dependencia de insumos agriacutecolas y el bajo nivel de acople entre el
sector primario y el de procesamiento industrial (MADR 2006) Desde el punto vista
fitosanitario el cultivo de la papa se ve afectado por diversos fitopatoacutegenos e insectos
plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la reemergencia de la enfermedad denominada
Sarna polvosa de la papa causada por el protozoario Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) Su efecto no solo se debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten
al deterioro en la calidad y apariencia cosmeacutetica de los tubeacuterculos que afecta draacutesticamente
su valor en el mercado Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus (PMTV)
uno de los problemas virales prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarentenario para diferentes paiacuteses del mundo (Santala et al 2010)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 de las cosechas en las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro (Solanum tuberosum) y
papa criolla (S phureja) (SINAIPA 2002) Por otra parte se estima que el PMTV puede
causar peacuterdidas hasta del 25 en este cultivo lo cual adicionado al dantildeo causado por Sss
pudiera generar disminuciones de 50-80 en la produccioacuten (Jones y Harrison 1972
Guerrero 1997 2000) Aunque se cree que este virus tiene como centro de origen los
Andes suramericanos no se ha establecido con certeza su efecto sobre el rendimiento de las
variedades alliacute cultivadas ni determinado claramente los siacutentomas que causa en sus
hospedantes (Salazar 1995) De esta forma no es frecuente encontrar la sintomatologiacutea
asociada a este virus reportada para la regioacuten templada que incluye amarillamiento foliar
2
anillos necroacuteticos y cuarteamiento o agrietamiento de tubeacuterculos y moteados foliares tipo
ldquoAucubardquo (Salazar 1995 Xu et al 2004)
Adicionalmente a esta problemaacutetica la diseminacioacuten de Sss se viene incrementando
dramaacuteticamente en el paiacutes como resultado de la deficiente calidad de la semilla utilizada
por la mayoriacutea de los agricultores la ausencia de variedades tolerantes a dicho patoacutegeno y
la carenciadeficiencia de asistencia teacutecnica estatal o gremial que no cuenta con
herramientas apropiadas para el diagnoacutestico asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla
libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011)
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la ausencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos o bioloacutegicos efectivos por lo
tanto requiere de un manejo fitosanitario especial al afectar directamente la semilla
inhabilitar los suelos dedicados al cultivo afectar la calidad cosmeacutetica del producto fresco y
ser transmisor del PMTV lo que genera una barrera cuarentenaria para la apertura de
nuevos mercados Por lo anterior el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado bajo
un esquema de manejo integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como
rotacioacuten de cultivos manejo adecuado del riego y drenaje sanidad del tubeacuterculo semilla
utilizacioacuten de organismos antagonistas (pe Trichoderma spp) utilizacioacuten de cultivos
trampa desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos estrictos de
certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas son
utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado del
manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o de
Rhizoctoniasis
El desarrollo de metodologiacuteas seroloacutegicas y moleculares pueden ser una importante
herramienta para el monitoreo y deteccioacuten de estos patoacutegenos en el paiacutes Se destacan para
Sss la teacutecnica de ELISA (Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas) con anticuerpos
policlonales y monoclonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
3
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Ward et al 2004 Qu et al
2011) Para el caso de PMTV tambieacuten se han utilizado teacutecnicas de deteccioacuten utilizando
plantas trampa ELISA RT-PCR (Retrotranscripcioacuten - Reaccioacuten en cadena de la
polimerasa) qPCR (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa en tiempo real) y microplatos de
hibridizacioacuten y microarreglos (Arif et al 1994 Nielsen y Moslashlgaard 1997 Jeffries 1998
Davey 2009 Latvala-Kilby et al 2009 Nakayama et al 2009) Sin embargo estas
teacutecnicas son de aplicacioacuten limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas o validadas con
base en los genotipos locales de ambos patoacutegenos presentes en las regiones cultivadoras de
nuestro paiacutes motivo por el cual es fundamental emprender un estudio amplio de los niveles
de variabilidad geneacutetica de Sss y PMTV en Colombia
Este trabajo responde a dicha necesidad En eacutel se realizaron colecciones de material vegetal
y suelo de cuatro zonas productoras de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo (Colombia) y se realizaron extracciones de ADN o ARN seguacuten el
caso para mediante teacutecnicas moleculares determinar las secuencias de diferentes regiones
informativas del genoma de cada patoacutegeno Una vez obtenidas y editadas las secuencias se
realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos para comparar y agrupar aislamientos colombianos con
respecto a los reportados para Sss y PMTV en el mundo y determinar sus niveles de
identidad geneacutetica
Este estudio pretende apoyar el desarrollo de programas de diagnoacutestico de Sss y PMTV
tanto en Colombia como en la regioacuten Andina La informacioacuten generada es importante para
desarrollar programas de deteccioacuten asintomaacutetica y temprana de ambos patoacutegenos como una
herramienta fundamental para implementar una base tecnoloacutegica que apoye los esquemas
cuarentenarios dirigidos a evitar la diseminacioacuten de los patoacutegenos hacia zonas libres de la
enfermedad la certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas de mejoramiento geneacutetico
que conduzcan a generar variedades resistentes a este patosistema
4
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GENERAL
Evaluar los niveles de variacioacuten geneacutetica de Spongospora subterranea y de su virus asociado
PMTV en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y
Narintildeo
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de S subterranea de cultivos de
papa de cuatro departamentos de Colombia a partir de secuenciacioacuten de las
regiones ITS del ADN ribosomal
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de PMTV de cultivos de papa de cuatro
departamentos de Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de la caacutepside y TGB2 del
genoma viral
Definir las afinidades filogeneacuteticas entre las variantes de S subterranea y PMTV
detectadas en Colombia con aislamientos de dichos patoacutegenos de diferentes paiacuteses
que presenten secuencias disponibles en las bases de datos moleculares
Ampliar el nivel de informacioacuten disponible sobre las secuencias de los segmentos
del genoma de aislamientos de PMTV en Colombia
5
3 MARCO TEOacuteRICO
31 Generalidades del cultivo de la papa
La papa es el tubeacuterculo maacutes importante que se produce en el mundo Se cultiva en maacutes de
125 paiacuteses y es consumido diariamente por maacutes de mil millones de personas En los paiacuteses
en desarrollo es un cultivo de fuerte expansioacuten con cientos de millones de personas que
dependen de eacutel para su supervivencia Los paiacuteses en desarrollo son los maacutes grandes
productores (e importadores) de papa y de sus productos derivados (FAO 2009) China se
ha convertido recientemente en el primer productor mundial de papa y junto a India
responden por la tercera parte de la produccioacuten global de este tubeacuterculo En Ameacuterica Latina
y Aacutefrica las cosechas presentaron un menor volumen pero el rendimiento se incrementoacute
significativamente Ameacuterica del Norte fue el mayor productor del continente con un
rendimiento de maacutes de 40 ton ha-1
(FAO 2008)
Ameacuterica del Sur es la cuna de la papa pero esta regioacuten presenta los niveles maacutes bajos de
produccioacuten con menos de 16 millones de toneladas para el antildeo 2007 En la regioacuten Andina
la mayoriacutea de los pequentildeos campesinos manejan el cultivo de forma tradicional y se
siembran variedades de papa que son poco comerciales y desconocidas para el resto del
mundo sin embargo en paiacuteses como Argentina Brasil Colombia y Meacutexico la produccioacuten
comercial de papa estaacute aumentando paulatinamente (FAO 2008)
En Colombia el cultivo de la papa participa con el 71 de la superficie sembrada en
cultivos transitorios y aporta cerca de 78 de la produccioacuten agriacutecola generando alrededor
de 69000 empleos directos principalmente en los departamentos de Cundinamarca
Boyacaacute Narintildeo y Antioquia (MADR 2009a) En el 2009 el aacuterea sembrada de papa fue de
128701 ha con una produccioacuten de 2272772 ton y un rendimiento de 184 ton ha-1
(MADR-ENA 2009) La participacioacuten departamental en la produccioacuten nacional se
encuentra distribuida de la siguiente manera Cundinamarca 378 Boyacaacute 263 Narintildeo
6
164 Antioquia 65 Santander 56 y otros departamentos participan con el 64
(MADR 2009b)
La papa es el producto de origen agriacutecola que tiene la mayor demanda en Colombia por
fungicidas e insecticidas y la segunda en demanda de fertilizantes despueacutes del cafeacute Es la
actividad que maacutes utiliza los servicios de transporte terrestre con maacutes de 2 millones de
toneladas al antildeo sin incluir la movilizacioacuten de los insumos requeridos para su produccioacuten
(MADR 2005)
Los cultivos de papa se encuentran distribuidos en climas friacuteos con temperaturas de 13ordmC y
alturas de 2000 msnm hasta alcanzar zonas de paacuteramo con alturas cercanas a los 3500
msnm y temperaturas de 8ordmC Geograacuteficamente las unidades de produccioacuten estaacuten
dispersas principalmente en las regiones friacuteas de la zona Andina bajo una variada gama de
condiciones biofiacutesicas econoacutemicas y sociales En teacuterminos generales alrededor del 75
del aacuterea cultivada con papa en el paiacutes se encuentra en zonas de topografiacutea quebrada y
ondulada (MADR 2005)
Seguacuten Villareal et al (2007) en el paiacutes existen alrededor de 30 variedades de papa
cultivada pero soacutelo 10 de eacutestas tienen importancia comercial La Parda pastusa es la
variedad maacutes cultivada y consumida en fresco le siguen la variedad Diacol Capiro
utilizada para consumo en fresco exportacioacuten y por la industria de alimentos como materia
prima La variedad ICA-Puraceacute es utilizada en algunas regiones de clima templado del paiacutes
para consumo en fresco la Tuquerrentildea o Sabanera que se consume principalmente en
Bogotaacute y la Criolla que se cultiva principalmente en los departamentos de Antioquia y
Cundinamarca En el paiacutes se han desarrollado nuevas variedades que han ingresado al
mercado como las variedades Esmeralda Rubi UNICA e ICA Morita que tienen altas
posibilidades comerciales en el corto plazo
Una de las principales limitantes teacutecnicas del cultivo de la papa corresponde a las plagas y
enfermedades Dentro de las enfermedades el tizoacuten tardiacuteo o gota causado por
Phytophthora infestans es la amenaza maacutes seria del cultivo Ademaacutes tambieacuten se presentan
el tizoacuten temprano (Alternaria solani) la rontildea (Rhizoctonia solani) la sarna comuacuten
7
(Streptomyces scabies) la palomilla o mortaja blanca (Rosellinia sp) las virosis (PVY
PVX PLRV PYVV PVS PMTV) y la sarna polvosa Esta uacuteltima enfermedad se ha
convertido en una de las principales problemaacuteticas de cultivo a nivel mundial (Harrison et
al 1997 Merz y Falloon 2009) Es causada por el protozoo Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) paraacutesito obligado de plantas superiores Esta enfermedad causa dantildeos
directos sobre las raiacuteces y tubeacuterculos y ademaacutes es vector del PMTV (Jones y Harrison
1969 Harrison et al 1997 Andersen et al 2002 Merz y Fallon 2009) enfermedad viral
que afecta este cultivo en varias regiones productoras de papa en el mundo
En Colombia el manejo de la enfermedad se basa en el uso de semilla certificada por el
Instituto Colombiano Agropecuario ICA la utilizacioacuten de variedades medianamente
tolerantes y la rotacioacuten entre estas variedades con cultivos no hospedantes del patoacutegeno
(Jaramillo y Botero 2007)
32 Generalidades de Spongospora subterranea fsp subterranea
321 Taxonomiacutea
Sss es el agente causal de la enfermedad denominada Sarna polvosa de la papa El primer
reporte de esta enfermedad data de 1841 en Alemania (Wallroth 1842) y a partir de esta
fecha su registro incluye todos los continentes (Harrison et al 1997 Merz 2008) Seguacuten
Lyman y Rogers (1915) el patoacutegeno es originario de los Andes Suramericanos desde donde
se dispersoacute gracias al mercado mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber
transcurrido mas de 150 antildeos desde su primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado
importancia en las uacuteltimas deacutecadas como resultado de la siembra generalizada de materiales
altamente susceptibles al patoacutegeno la utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los
cambios de eacutepocas de siembra hacia periacuteodos huacutemedos las deficiencias en los sistemas de
rotacioacuten de cultivos la falta de programas cuarentenarios y los altos estaacutendares exigidos por
el mercado en la calidad cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
8
Sss es un pseudohongo plasmodial que taxonoacutemicamente se ha ubicado en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos Spongospora subterranea f sp
subterranea y Spongospora subterranea f sp nasturtii definidos como forma especialis
son importantes patoacutegenos de vegetales (Merz y Falloon 2009) Dick (2001) propone que
dichos microorganismos corresponden a especies diferentes
322 Ciclo de vida Sss
Sss y otros plasmodiophorales se caracterizan por presentar zoosporas biflageladas (3-4 microm
diaacutemetro) de desigual tamantildeo con mastigonemes y posicioacuten opuesta que se liberan a partir
de las estructuras de resistencia (quistes) Los quistes (4 microm diaacutemetro) pueden sobrevivir en
el suelo por largos periacuteodos de tiempo y generalmente se encuentran agregados formando
estructuras denominadas quistosoros (hasta 85 microm diaacutemetro) CITA los cuales son esfeacutericos
u ovoides y presentan un centro vaciacuteo En Colombia observaciones realizadas por
Jaramillo y Peacuterez (2008) han determinado que los quistosoros de aislamientos procedentes
de suelos del municipio de La Unioacuten (Antioquia) oscilaron entre 50 y 120 microm Bajo
condiciones de humedad es frecuente la liberacioacuten de una zoospora uninucleada aunque se
cree que la germinacioacuten de los quistes responde a un patroacuten escalonado que garantiza la
generacioacuten de inoacuteculo infectivo por largos periodos de tiempo Una vez en el suelo las
zooporas se desplazan varios centiacutemetros y son atraiacutedas por los exhudados de las raiacuteces de
sus plantas hospedantes adherieacutendose enquistando y formando un tubo germinativo que
ejerce fuerza mecaacutenica para su penetracioacuten directa en la planta Posteriormente el patoacutegeno
desarrolla un plasmodio multinucleado con membrana simple y ausencia de pared celular
Eventualmente el plasmodio se cliva dando lugar a muacuteltiples zooesporangios cada uno de
los cuales puede generar hasta 8 zoosporas que son liberadas por un poro germinativo y
continuacutean con la infeccioacuten de otras ceacutelulas radiculares Estas zoosporas denominadas
secundarias son indistinguibles de las que inician la infeccioacuten (primarias) y ambas pueden
infectar lenticelas no suberizadas de tubeacuterculos comenzando a inducir el siacutentoma tiacutepico de
9
la sarna que toma apariencia corchosa a partir del desarrollo de una capa de proteccioacuten a
nivel del peridermo del tubeacuterculo Es frecuente ademaacutes que el patoacutegeno induzca hipertrofia
e hiperplasia en los tejidos afectados dando origen a las agallas y a las deformaciones
caracteriacutesticas de la enfermedad Al final del ciclo en los plasmodios se reorganiza su
contenido protoplasmaacutetico rodeaacutendo los nuacutecleos presentes de pared celular y generaacutendose
quistes que serviraacuten de inoacuteculo para sucesivas infecciones (Harrison et al 1997)
El ciclo de vida de Spongospora es diferenciado por Merz (2008) de acuerdo a la
ocurrencia de dos fases una fase esporogeacutenica y una segunda fase esporangial cada una
iniciada por la infeccioacuten de la ceacutelula hueacutesped a traveacutes de un plasmodio individual En la
fase esporangial numerosas zoosporas secundarias son formadas en el esporangio de
paredes delgadas en las ceacutelulas epidermales de la raiacutez y los pelos radicales del hueacutesped en
las cuales las zoosporas son formadas desde un plasmodio esporangiogeacutenico Las zoosporas
secundarias tambieacuten biflageladas pueden salir del hueacutesped e iniciar otro ciclo de infeccioacuten
La fase esporogeacutenica se presenta despueacutes de la divisioacuten nuclear dentro del plasmodio
esporogeacutenico El patoacutegeno produce esporas de reposo de pared gruesa las que son
altamente persistentes Cada espora de reposo libera una sola zoospora primaria
biflagelada
En Colombia Hoyos et al (2009) realizaron observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Sss encontrando plasmodios plasmodios enquistados plasmodios en
estado de divisioacuten ceacutelulas uacutenicas y quistosoros en raiacuteces de plantas de S tuberosum
asintomaacuteticas indicando que la infeccioacuten puede estar presente sin desarrollo evidente de
siacutentomas y que los quistosoros no son solamente las estructuras maacutes frecuentes en los
tejidos de los hospedantes afectados
10
323 Rango de hospedantes de Sss
Diversas investigaciones han encontrado la presencia de zoosporangios de Sss en plantas de
otras familias diferentes a la Solanaceae como Alzoaceae Apiaceae Asteraceae
Boraginaceae Brassicaceae Caryophyllaceae Chenopodiaceae Fabaceae Geraniaceae
Lamiaceae Plantaginaceae Papaveraceae Poaceae Polygonaceae Ranunculaceae
Rubiaceae Resedaceae Solanaceae y Urticaceae (Jones y Harrison 1969 Andersen et al
2002) Andersen et al (2002) encontraron diferentes tasas de infeccioacuten desarrolladas por el
patoacutegeno en especies como Artemisia vulgaris Cirsium arvense Chamomilla suaveolens
Chenopodium album Galium aparine Geranium pusillum Lapsana communis Matricaria
inodora Poa annua Polygonum avicular P convolvulus Rumex acetosa R acetosella
Solanum nigrum Sonchus arvensis Urtica urens y Viola tricolor lo que permitioacute
confirmar estas 17 especies como hospedantes de Sss
Aunque aparentemente Sss tiene un amplio rango de hospedantes el desarrollo de los
quistosoros nunca habiacutea sido observado en otros hospederos diferentes a S tubersosum Sin
embargo Qu y Christ (2006a) encontraron formacioacuten de quistosoros en seis especies de
plantas Solanum plycantum Dun Datura stramonium L Avena sativa L Dactylis
conglomerado L Solanum esculentum Mill y Brassica campestris L Esto indicoacute que el
patoacutegeno tiene la capacidad de completar su ciclo de vida en hospedantes alternos a las
plantas de papa lo que representa un aspecto epidemioloacutegico importante Asiacute mismo se
encontroacute que las siguientes especies tambieacuten son hospedantes del patoacutegeno Fagopyrum
esculentum Moench Phleum pratense L Raphanus sativus L Brassica napus L
Trifolium pratense L Secale cereale L Ambrosia artemisiifolia L Chenopodium album
L Amaranthus retroflexus L y Cyperus esculentus L Recientemente se ha encontrado
que el patoacutegeno puede producir agallas en S physalifolium y S nigrum y su patogenicidad
fue confirmada por inoculacioacuten a plantas de tomate (S esculentum) y de papa bajo
condiciones de invernadero (Shah et al 2010) Estos resultados tienen consecuencias para
el manejo de la enfermedad enfocado en cultivos de rotacioacuten porque se debe tener en
cuenta que existen especies cultivables y malezas que pueden albergar estructuras del
patoacutegeno y que el reporte de nuevas especies hospederas continua por ejemplo Sss causa
11
agallas en las raices de Solanum sarrachoide en donde puede completar su ciclo de vida y
producir nuevas generaciones de quistosoros que son infectivos a papa (Nitzan et al 2009)
324 Siacutentomas causados por Sss
Los siacutentomas de la enfermedad incluyen la induccioacuten de lesiones pustulosas corchosas con
centros polvosos formados a partir de la agregacioacuten de los quistosoros del patoacutegeno Con el
avance de estas lesiones es frecuente la ruptura del peridermo aunque el nivel de
penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente superficial Bajo condiciones oacuteptimas para el
desarrollo de la enfermedad es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten
de los tejidos y la formacioacuten de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la
enfermedad ademaacutes de causar los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular
de las plantas al inducir la formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas (Cotes et al
2006) que causan la disminucioacuten de la superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo a la
marchitez y finalmente a la muerte de las plantas Durante el almacenamiento la sarna
polvosa puede ocasionar pudriciones secas que sirven de entrada a otros patoacutegenos y
saproacutefitos que deterioran auacuten maacutes el producto (Agrios 1996) La infeccioacuten en las raiacuteces
especialmente cuando se forman agallas pueden causar una reduccioacuten en el funcionamiento
de la raiacutez por la interrupcioacuten de la toma de agua y de nutrientes (Lister et al 2004 Falloon
et al 2005)
En Colombia en los departamentos de Cundinamarca Boyacaacute Narintildeo y Antioquia Sss
afecta severamente las variedades de papa (Solanum tuberosum) Parda Pastusa y Diacol
Capiro y a la papa criolla (Solanum phureja) Los siacutentomas se observan en raiacuteces y
tubeacuterculos pero hay variacioacuten en las zonas paperas en cuanto a la distribucioacuten de los
siacutentomas entre los diferentes oacuterganos de la planta En Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de
Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre los tubeacuterculos de las variedades Parda
Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el departamento de Narintildeo y en el Oriente de
Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces Hasta ahora no se sabe si estas diferencias
se deben a variaciones en las condiciones ambientales de una regioacuten a otra o quizaacutes se
12
deban a la distribucioacuten regional de diferentes razas del patoacutegeno yo a su interaccioacuten con el
ambiente (Jaramillo y Botero 2007)
En el Oriente Antioquentildeo se determinoacute la incidencia y el grado de severidad de 23
poblaciones de Sss bajo el sistema de rotacioacuten entre ICA Puraceacute-Diacol Capiro y viceversa
en tres cosechas sucesivas en condiciones de casa de malla Se observoacute que las poblaciones
del patoacutegeno no afectaron el peso ni causaron siacutentomas de sarna polvosa en los tubeacuterculos
pero si en las raiacuteces con diferentes grados de severidad en las dos variedades siendo maacutes
susceptible la variedad Diacol Capiro que al parecer favorecioacute el incremento del inoacuteculo
mientras que la ICA Puraceacute fue levemente afectada y posiblemente presentoacute efecto
supresivo sobre los quistosoros en el suelo (Jaramillo y Botero 2007)
Estudios realizados en el departamento de Narintildeo presentaron diferencias en el grado de
desarrollo de la enfermedad en raiacuteces La variedad Parda Pastusa fue la maacutes susceptible a
Sss con desarrollo de agallas desde el momento de la emergencia de las plantas La
enfermedad alcanzoacute valores de susceptibilidad del 100 en dicha variedad mientras que en
Diacol Capiro fue de 48 En los tubeacuterculos la enfermedad se manisfestoacute por la formacioacuten
de escasas y pequentildeas puacutestulas de color castantildeo con poca presencia de masas pulverulentas
de esporas de resistencia del patoacutegeno lo que contrasta con la regioacuten Cundiboyacense en
donde estas variedades se caracterizan por presentar una alta susceptibilidad a la rontildea en
tubeacuterculos ocasionando lesiones severas en las que resulta faacutecil encontrar esporas de
resistencia (Benavides 2006)
325 Control de Sss
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la carencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos efectivos (Qu y Christ
2006a) Seguacuten Harrison et al (1997) el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado
bajo un esquema integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como la
rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del tubeacuterculo semilla la
utilizacioacuten de organismos antagonistas (ie Trichoderma spp) la utilizacioacuten de cultivos
trampa la desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
13
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos de certificacioacuten de
semilla Dos estrategias que en la actualidad se consideran fundamentales para apoyar los
programas MIC en papa incluyen el mejoramiento geneacutetico por resistencia al pseudohongo
y la utilizacioacuten de cultivos trampa (Merz et al 2004)
Para el caso del mejoramiento los primeros reportes en la regioacuten Andina fueron
presentados por Torres et al (1995) quienes evaluaron 467 accesiones encontrando la
existencia de 17 genotipos resistentes y 33 moderadamente resistentes Por otra parte Lees
(2000) en Escocia evaluoacute los niveles de resistencia a Sss de una serie de clones de S
phureja encontrando que algunos de eacutestos presentaron un adecuado nivel de resistencia
por lo que esta especie fue propuesta como fuente de genes de resistencia Merz (2000) al
evaluar la reaccioacuten de 11 cultivares determinoacute que existe correlacioacuten entre las pruebas de
invernadero utilizando plaacutentulas provenientes de cultivo de tejidos y la resistencia
presentada en campo
Fallon et al (2003) realizaron un estudio en Australia con 99 cultivares de papa y 13
liacuteneas de mejoramiento durante 11 antildeos Sus resultados indicaron que el 21 de los
materiales evaluados eran resistentes mientras que el 28 presentoacute una resistencia
moderada Estos autores tambieacuten reportaron que la expresioacuten de la resistencia variacutea entre
antildeos y que los bioensayos realizados en invernadero no siempre se correlacionan con la
respuesta presentada en campo sugiriendo una fuerte interaccioacuten genotipo-ambiente para
esta caracteriacutestica
Nitzan et al (2010) evaluaron la estabilidad de la resistencia geneacutetica de 24 genotipos de
papa a Sss en los estados de Washington e Idaho en Estados Unidos Se identificoacute que la
resistencia era estable a la formacioacuten de agallas en las raiacuteces causada por Sss y se determinoacute
que una gran proporcioacuten de la variacioacuten fue geneacutetica lo que permite a los mejoradores usar
genotipos resistentes y estables de papa como progenitores en el desarrollo de cultivares
comerciales con resistencia a este patoacutegeno debido a que contar con materiales geneacuteticos
resistentes es una de las principales estrategias de manejo de la enfermedad (Rodriacuteguez et
al 2009 Houser y Davidson 2010)
14
Seguacuten Merz et al (2012) no existen meacutetodos de control eficientes y econoacutemicos que se
encuentren disponibles actualmente y la resistencia del hospedero es clave para el manejo
integrado de la enfermedad debido a esto se evaluaron 10 cultivares con diferentes rangos
de susceptibilidad a Sss y a PMTV en diferentes paiacuteses de Europa Para evitar discrepancias
en los criterios de evaluacioacuten se utilizoacute una escala estaacutendar para los niveles de la sarna
polvosa determinaacutendose que los cultivares se comportaron como estaba establecido en su
caracterizacioacuten inicial (a excepcioacuten de uno de ellos) Los resultados del ensayo de campo
indicaron que los diferentes meacutetodos de valoracioacuten son el principal factor de discrepancia
en las calificaciones de la resistencia y que las condiciones ambientales yo el nivel de
inoacuteculo del suelo juegan un papel menor
Otra estrategia con alto potencial para el manejo de la enfermedad es la rotacioacuten del cultivo
con plantas trampa que reducen el nivel de estructuras de resistencia de
plasmodiophoromycetes Por ejemplo es ampliamente conocido que la siembra de
Raphanus sativus reduce la cantidad de quistes de Plasmodiophora brassicae en el suelo
(Murakami et al 2000) mientras que la planta Datura stramonium redujo el nivel de Sss en
un 79 en cultivos de papa de Australia
En Colombia la buacutesqueda de herramientas para el manejo de la enfermedad bajo las
condiciones regionales de las zonas productoras de papa se enfoca en la evaluacioacuten de
sistemas de rotacioacuten de variedades comerciales que tradicionalmente se han considerado
altamente susceptibles a la enfermedad (ie Diacol Capiro) con variedades maacutes tolerantes al
ataque del patoacutegeno (ie ICA Puraceacute) encontraacutendose que efectivamente esta uacuteltima
variedad presenta un menor nivel de susceptibilidad a la sarna polvosa (Jaramillo et al
2003 Jaramillo y Botero 2007)
En cuanto al control bioloacutegico de Sss Gilchrist (2009) evaluoacute una cepa de Trichoderma
previamente considerada por Hoyos et al (2002) como potencialmente uacutetil para el control
bioloacutegico de Sss en la variedad Diacol Capiro Las pruebas fueron realizadas en campo
utilizando tres dosis de aplicacioacuten del biocontrolador Se encontroacute que la aplicacioacuten de T
asperellum T109 redujo un 64 y 54 los efectos de la sarna polvosa en el crecimiento y
15
en la produccioacuten de las variedades respectivamente De esta forma se resalta el potencial
de la cepa como biocontroladora contra Sss teniendo en cuenta que se debe ampliar el
conocimiento acerca de los factores que limitan la accioacuten de T asperellum T109 en el
campo y coacutemo compensarlo aumentando la frecuencia de aplicacioacuten En un trabajo similar
se investigoacute la influencia de cuatro aislamientos de T asperellum sobre la sarna polvosa en
tres tipos de suelo Andisol Entisol e Inceptisol No se encontraron diferencias
significativas entre las plantas de papa tratadas y no tratadas con T asperellum pero siacute se
encontroacute que la reduccioacuten del crecimiento y la produccioacuten estuvieron inversamente
asociadas con el contenido de Al2+
en los suelos sugiriendo que los efectos de la sarna
polvosa estaacuten fuertemente relacionados con las condiciones del suelo (Gilchrist et al 2009)
Estudios sobre la evaluacioacuten de estrategias de manejo de la rontildea polvosa en tres regiones
productoras de papa en Colombia han incluido resultados sobre la biologiacutea y patologiacutea de
Sss en la Sabana de Bogotaacute y sus hallazgos maacutes importantes consisten en la puesta en
marcha de un sistema de bioensayos en los cuales ha sido posible inducir la liberacioacuten de
zoosporas bajo condiciones de laboratorio Otros estudios incluyen la evaluacioacuten del efecto
de fungicidas aplicados al suelo para el manejo de Sss Sin embargo se determinoacute que
ninguno de los fungicidas evaluados (Tiabendazol Tolclofos metil Benomyl Carbendazin
Clorotalonil y Mancozeb) contribuyeron con el control del patoacutegeno en raiacuteces y tubeacuterculos
bajo las dosis y condiciones de tres localidades productoras de papa (Subachoque Medelliacuten
(Corregimiento Santa Elena) y Pasto) (Garciacutea y Navia 2002) En contraste Falloon et al
(2010) realizaron aplicaciones en campo del fungicida Mancozeb el cual contiene Zn y
Mn Las dosis estuvieron determinadas como baja similar y alta con respecto al contenido
de estos elementos en el suelo cultivado con papa cv Iwa (considerado muy susceptible a
Sss) Se encontroacute que niveles elevados de Zn y Mn generan infecciones moderadas de Sss
en las raiacuteces del cultivar evaluado de S tuberosum
Otras investigaciones para el manejo de Sss han incluiacutedo la evaluacioacuten de potenciales
biocontroladores (Trichoderma harzianum y Pseudomonas fluorescens) un consorcio de
micorrizas y viruta de pino como tratamientos Se encontraron diferencias estadiacutesticamente
significativas entre el testigo y P fluorescens y los tratamientos con T harzianum
16
micorrizas y viruta presentando una incidencia en raiacuteces de 32 21 y 5 3 y 1
respectivamente Los tratamientos con T harzianum micorriza y viruta tuvieron los
porcentajes de incidencia maacutes altos pero contrastaron con niveles muy bajos de severidad
de la enfermendad (022 0088 y 0019 respectivamente) Sin embargo no se
obtuvieron incrementos en peso seco de raiacuteces peso de tubeacuterculos y peso seco de la parte
aeacuterea cuando se realizaron las inoculaciones de los diferentes agentes de control y las
aplicaciones de la viruta de pino (Restrepo et al 2009)
Arias (2011) realizoacute un anaacutelisis y comparacioacuten de glucosinolatos presentes en diferentes
accesiones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control de
Sss Se estandarizaron los procedimientos de extraccioacuten del compuesto y las diferentes
formulaciones fueron probadas como biofumigante en el suelo donde posteriormente se
sembraron tubeacuterculos de papa criolla Sin embargo los resultados obtenidos no permitieron
establecer un posible potencial biofumigante de las accesiones evaluadas y es necesario
profundizar en los estudios que permitan determinar el efecto de los glucosinolatos y de
otros compuestos sobre el patoacutegeno
33 Deteccioacuten de Sss
La deteccioacuten del inoacuteculo a nivel del suelo es compleja y es evaluada precariamente a partir
de sistemas de trampeo que utilizan plaacutentulas de tomate (Merz 1989) o de papa (Wale et al
1993) Estas evaluaciones son criacuteticas para definir relaciones entre el grado de infestacioacuten
de los suelos y los niveles de enfermedad observados en el campo requisito fundamental
para la implementacioacuten de cualquier medida de control (Merz et al 2005)
Con el objetivo de buscar alternativas para alcanzar mayores rangos de sensibilidad en la
deteccioacuten de Sss se han explorado diversas metodologiacuteas basadas en teacutecnicas seroloacutegicas y
moleculares Entre las primeras se destacan la generacioacuten de anticuerpos policlonales que
detectan quistosoros del protozoo bajo un sistema ELISA (Harrison et al 1993 Walsh et
al 1996) Sin embargo la utilidad de estos anticuerpos es reducida debido a que no detecta
el estado plasmodial (Ward et al 2004) Maacutes recientemente Merz et al (2005)
desarrollaron una prueba para la evaluacioacuten rutinaria de la presencia del patoacutegeno basada
17
en anticuerpos monoclonales derivados de quistosoros como antiacutegenos alcanzando niveles
de sensibilidad de menos de un quistosoro por tubeacuterculo A partir de esto se generoacute la
herramienta ldquoSss AgriStriprdquo una prueba basada en un inmunoensayo de flujo lateral cuya
precisioacuten y sensibilidad fue evaluada por Bouchek-Mechiche et al (2011) para la
deteccioacuten de Sss Se comparoacute con teacutecnicas de microscopiacutea ELISA PCR y qPCR que
detectaron Sss en lesiones tiacutepicas de sarna polvosa Asiacute mismo se realizaron pruebas en los
lotes que presentaban lesiones tiacutepicas y atiacutepicas causadas por el patoacutegeno y se confirmoacute la
presencia de Sss en todas las lesiones con todos los meacutetodos probados Se concluyoacute que el
Sss AgriStrip es una prueba tan sensible como DAS- ELISA con un liacutemite de deteccioacuten de 1
a 10 quistosoros por mL de buffer
Con respecto a las metodologiacuteas moleculares se ha utilizado PCR convencional a partir de
los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 (Bulman y Marshall 1998) Sps1Sps2 (Bell et al
1999) y SsFSsR (Qu et al 2006) que amplifican las regiones ITS del ADNr
Los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 disentildeados por Bulman y Marshall (1998) detectaron
Sss en las muestras evaluadas y no presentaron reaccioacuten cruzada con otros
plasmodiophoridos como Spongospora subterranea f sp nasturtii Plasmodiophora
brassicae Sorosphaera veronicae y Polymyxa graminis asiacute como con el causante de la
sarna comuacuten Streptomyces scabies demostrando la utilidad de estos cebadores en la
deteccioacuten de Sss realizada por estos investigadores
Bell et al (1999) obtuvieron secuencias parciales del ITS de 391pb con los cebadores Sps
1 y Sps 2 para la deteccioacuten y cuantificacioacuten de Sss en la corteza tubeacuterculos lavados y
suelos cultivados con papa Las pruebas desarrolladas mostraron ser maacutes sensibles que los
inmunoensayos previamente reportados y fueron maacutes raacutepidas y sencillas que los ensayos
convencionales con plantas trampa
Qu et al (2006) utilizaron la teacutecnica de PCR para la identificacioacuten especiacutefica y
cuantificacioacuten de Sss Los cebadores SsF y SsR amplificaron un producto de 434 pb
proveniente de masas de esporas de Sss pero no se obtuvo el amplicoacuten cuando el ADN era
de papa sana de tubeacuterculos con sarna comuacuten o de otros plasmodiophoridos relacionados
18
Asiacute mismo se detectoacute Sss en otros hospederos infectados que no presentaban siacutentomas y se
concluyoacute que la prueba es tan sensible que puede detectar 1 quiste g-1
Adicionalmente con
esta teacutecnica se logroacute la cuantificacioacuten de Sss en el suelo logrando identificar valores de 1 a
104 quistosoros por 025 g de suelo
La implementacioacuten de meacutetodos para la deteccioacuten de Sss ha permitido el desarrollo de
procedimientos que permiten una raacutepida y automatizada extraccioacuten de ADN combinada
con PCR en tiempo real utilizando sondas Taqmanreg para avanzar en el diagnoacutestico
rutinario de la sarna polvosa (Lees et al 2002 van de Graff et al 2003 Ward et al 2004
Qu et al 2011) o PCR competitivo o cuantitativo (Qu et al 2006 Shah et al 2009) En esta
prueba se utiliza un control interno de ADN de papa (citocromo oxidasa) para hacerla maacutes
confiable y evitar falsos negativos La validacioacuten de dicha metodologiacutea se realizoacute a partir
de la evaluacioacuten de 37 muestras de tubeacuterculos de varios cultivares procedentes de diversas
localidades del Reino Unido La prueba detectoacute el patoacutegeno en todas las muestras que eran
sospechosas de tenerlo asiacute como en tubeacuterculos que no presentaban quistosoros observables
La prueba con la sonda Taqman demostroacute ser 100 veces maacutes sensible que la PCR
convencional (Ward et al 2005) y la ELISA (Ward et al 2004) Estas pruebas han
permitido determinar el efecto del nivel de inoacuteculo en el suelo y de algunos factores
ambientales en la infeccioacuten y desarrollo de agallas en raiacuteces de papa causadas por Sss (van
de Graaf et al 2007) En Gran Bretantildea la teacutecnica de PCR en tiempo real permitioacute detectar
confiablemente y establecer la cantidad de ADN de los quistorosos zoosporas y
plasmodiozoosporangios del patoacutegeno asiacute mismo se determinoacute la viabilidad de los quistes
en el suelo y en combinacioacuten con el uso de plantas trampa se estudioacute la liberacioacuten de
zoosporas y los niveles de infeccioacuten en papa bajo diferentes condiciones ambientales
permitiendo conocer con maacutes detalle varios aspectos de la epidemiologiacutea de la enfermedad
(Lees et al 2008)
Otras variaciones de estas teacutecnicas como la muacuteltiple qPCR utilizando sondas TaqManreg ha
permitido la deteccioacuten y diferenciacioacuten simultaacutenea de la sarna polvosa y la sarna comuacuten
dos enfermedades del tubeacuterculo que causan siacutentomas similares pero que son ocasionadas
por patoacutegenos diferentes (Sss vs Streptomyces spp) (Qu et al 2011) Finalmente como una
19
teacutecnica de diagnoacutestico simultaacuteneo de diferentes patoacutegenos de papa se ha desarrollado un
chip para su anaacutelisis en microarreglos siendo incorporada la deteccioacuten de Sss (Zhang et al
2008)
En Colombia la utilizacioacuten de meacutetodos de deteccioacuten de Sss en tubeacuterculos y suelos ha
estado dada por la evaluacioacuten visual de sintomatologiacuteas en raiacuteces y tubeacuterculos la
evaluacioacuten de bioensayos (Rodriacuteguez et al 2002) y la utilizacioacuten de PCR convencional
utilizando cebadores especiacuteficos (Jaramillo et al 2003 Carrentildeo 2009) Se han utilizado
combinaciones de diversos cebadores que permiten la amplificacioacuten de la regioacuten ITS del
ADNr del patoacutegeno (Spo1-Spo2 Spo8-Spo9 y Sps1- Sps2) los cuales permiten obtener
productos de 372 390 y 391 pb respectivamente (Saavedra et al 2004) Ramiacuterez (2010)
obtuvo amplificacioacuten de los fragmentos del tamantildeo esperado utilizando los cebadores
Spo8Spo9 y SsFSsR para analizar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de Sss
provenientes de La Unioacuten (Antioquia) encontrando una estructura clonal de los
aislamientos evaluados mientras que Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS
y SSCP (Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) con un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones del paiacutes establecioacute la presencia de subpoblaciones del
patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado
34 Variabilidad geneacutetica de Sss
La disponibilidad de cultivares resistentes a Sss debe ser una prioridad en el disentildeo de
futuras estrategias de manejo de la enfermedad Los mejoradores tratan de incluir
resistencia en los nuevos cultivares seleccionando liacuteneas contra un rango de patoacutegenos que
representan la diversidad geneacutetica conocida con el fin de seleccionar la resistencia maacutes
durable Sin embargo poco es conocido acerca de la variacioacuten geneacutetica de Sss o del papel
de la recombinacioacuten sexual en su ciclo de vida (Merz y Falloon 2009)
Los estudios geneacuteticos de Sss han sido difiacuteciles de aplicar debido a razones como las
siguientes obtener y mantener el patoacutegeno es complicado por su naturaleza de paraacutesito
obligado no han existido meacutetodos disponibles para el aislamiento de quistosoros
individuales el desarrollo de la sarna polvosa estaacute influenciado por condiciones
20
ambientales y los estaacutendares de inoculacioacuten y los cultivares de referencia no han sido bien
establecidos (Qu y Christ 2006b)
Los sistemas de deteccioacuten basados en aacutecidos nucleicos ofrecen sensibilidad y especificidad
para la cuantificacioacuten de inoacuteculo (Mutasa et al 1993) En estudios previos amplificando
regiones del ITS del ADNr fueron identificados dos agrupaciones de Sss en Australia y
Europa (tipo I y II) (Bulman y Marshall 1998) Posteriormente se realizoacute una
investigacioacuten sobre la variabilidad geneacutetica de 52 aislamientos de Islas Britaacutenicas y
Norteameacuterica que fueron amplificados por PCR Se identificaron dos grupos geneacuteticamente
diferentes (I y II) que representaron el 346 y el 654 de los aislamientos
respectivamente Sin embargo en Norteameacuterica los aislamientos soacutelo perteneciacutean al grupo
II (Qu y Christ 2004) Debido a que el anaacutelisis de secuencia de ITS se basa en un solo
locus para la deteccioacuten de la variacioacuten geneacutetica los anaacutelisis con marcadores moleculares
que comprendan diferentes partes del genoma del patoacutegeno son necesarios para obtener una
imagen amplia de la variacioacuten geneacutetica y estructura poblacional de Sss
El uso de marcadores moleculares tales como RAPDs (ADN polimoacuterfico amplificado al
azar) y AFLPs (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados) han sido
usados para estudiar la diversidad geneacutetica en muchos patoacutegenos de plantas sin embargo
tales marcadores no estaacuten disponibles para Sss Es complejo obtener estructuras
individuales del patoacutegeno y la uacutenica forma es la obtencioacuten de quistosoros que pueden traer
contaminantes secundarios o contener tejido de la planta Por lo tanto es difiacutecil obtener
ADN puro del patoacutegeno un paso indispensable para llevar a cabo la PCR basada en
marcadores moleculares (Qu y Christ 2006b)
Wuumlerzer (1964) caracterizoacute 17 colecciones de Sss de Europa y Ameacuterica seguacuten el tamantildeo
del quistosoro pero no encontroacute evidencia bioloacutegica significativa de este agrupamiento
Posteriormente se detectoacute variacioacuten geneacutetica (divergencia 51) en secuencias de ADN de
los ITS1 e ITS2 de colecciones de Sss originarias de diferentes continentes (Bulman y
Marshall 1998) Las colecciones de Australasia y Europa incluidas en el grupo II diferiacutean
de otra coleccioacuten de Escocia que fueacute ideacutentica a dos colecciones de Sur Ameacuterica agrupadas
21
en el tipo I La existencia de estos grupos fue confirmada por Qu y Christ (2004) quienes
tambieacuten identificaron ambos grupos en colecciones de Escocia pero demostraron que soacutelo
la secuencia de tipo II es de ocurrencia en colecciones de Canadaacute y Estados Unidos
Los marcadores RFLPs (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccioacuten) son
codominantes y locus especiacutefico (McDonald y Martiacutenez 1990) Han sido utilizados
ampliamente para evaluar diversos genomas de patoacutegenos de plantas A pesar de que
consumen maacutes tiempo que los meacutetodos basados en PCR los RFLPs son maacutes reproducibles
y menos sensibles a contaminacioacuten de ADN que las pruebas basadas en PCR Qu y Christ
(2006b) realizaron un estudio maacutes detallado de colecciones de quistosoros obtenidas de
Estados Unidos y Canadaacute empleando marcadores RFLPs Encontraron variacioacuten geneacutetica
entre las localidades geograacuteficas pero no entre los individuos de una misma localidad lo
que sugirioacute que las poblaciones del campo son clones y no estaban sometidas a
recombinacioacuten sexual El anaacutelisis de agrupamiento permitioacute separar los aislamientos en
dos grupos el grupo I que incluyoacute aislmientos del oeste de Norte Ameacuterica (exceptuando
aislamientos de Colorado) y el grupo II incluyoacute aislamientos originarios del este de Norte
Ameacuterica y de Colorado Este estudio muestra que el uso de marcadores moleculares para
diferenciar aislamientos de quistosoros individuales facilitaraacute investigaciones adicionales
para determinar la estructura geneacutetica de poblaciones de Sss
En Colombia Ramiacuterez (2010) realizoacute un estudio sobre la variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss de La Unioacuten Antioquia Encontroacute que los anaacutelisis de secuencias de la
regioacuten ITS del ADNr presentaron altos niveles de similitud con cepas obtenidas del
Departamento de Narintildeo asiacute como con secuencias de referencia de cepas del tipo II de Sss
Este resultado permitioacute plantear que el patoacutegeno presenta un comportamiento clonal
aunque es necesario obtener informacioacuten de otras regiones del genoma que permitan
realizar anaacutelisis de muacuteltiples loci que conduzcan a una mayor aproximacioacuten sobre las
condiciones de variacioacuten de este patoacutegeno en el paiacutes
Otro estudio realizado por Carrentildeo (2009) sobre la variabilidad geneacutetica de Sss en
Colombia mediante el anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr permitioacute establecer la
22
presencia de subpoblaciones del patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Se
encontroacute una asociacioacuten directa entre las secuencias ITS del patoacutegeno y el oacutergano de la
planta infectado El tipo de ITS I se asocia aparentemente con infecciones de tubeacuterculo y el
tipo de ITS II lo hace con infecciones de raiacutez Esta investigacioacuten permitioacute descartar la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar hospedero o zona
geograacutefica Sin embargo de acuerdo con esta investigacioacuten es necesario realizar pruebas
que aborden otras aacutereas del genoma para corroborar los resultados encontrados Asiacute mismo
se comproboacute que en el paiacutes existen variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las
reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno Tres
variantes geneacuteticas de las cinco encontradas en este estudio difieren de las reportadas en la
literatura mundial
35 Generalidades del Potato mop-top virus (PMTV)
El PMTV es el agente causal de una importante enfermedad viral del cultivo de la papa
cuya distribucioacuten se encuentra registrada en diferentes lugares productores de este
tubeacuterculo como Irlanda Inglaterra Escocia Republica Checa Suiza Noruega Suecia
Dinamarca y Finlandia (Santala et al 2010) asiacute como en Japoacuten (Nakayama et al 2010) En
Ameacuterica ha sido registrado en Canadaacute y Estados Unidos (Xu et al 2004) En eacuteste uacuteltimo
paiacutes se reportoacute recientemente en los estados de North Dakota (David et al 2010) y en
Washington (Crosslin 2011) Nuevos reportes de este virus se continuan presentado en
otros paiacuteses del mundo como Polonia (Budziszewska et al 2010)
En Ameacuterica Central se ha encontrado en Costa Rica (Montero-Astua 2008) y aunque se
considera que es originario de la regioacuten de los Andes (Surameacuterica) soacutelo fue detectado en
Colombia en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) con la reconfirmacioacuten de su presencia en el antildeo
2010 (Gil et al 2011) El PMTV puede causar peacuterdidas de hasta 26 en rendimiento lo
que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera ascender a valores de
50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 Guerrero 2000) Seguacuten Salazar (2006)
el PMTV es uno de los virus que ha sido prevalente en el cultivo de la papa en los Andes
23
suramericanos pero su efecto sobre las variedades cultivadas en esta regioacuten no se ha
cuantificado claramente
351 Taxonomiacutea de PMTV
El PMTV pertenece al geacutenero Pomovirus virus con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20
nm en diaacutemetro y tres partiacuteculas con longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm
El geacutenero Pomovirus deriva su nombre de la especie tipo Potato mop-top virus y
actualmente se ubica en el la familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Los anaacutelisis
filogeneacuteticos de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRps) indican que el PMTV
estaacute relacionado maacutes estrechamente con el Beet soil-borne virus (Pomovirus) Broad bean
necrosis virus (Pomovirus) y Soil-borne Wheat mosaic virus (Furovirus) (Savenkov et al
1999)
Contiene tres moleacuteculas de ARNss con tamantildeos de 64 kb 3 kb y 25 kb con caperuzas
hacia el extremo 5rsquo y una estructura tipo ARNt hacia el extremo 3rsquo (Savenkov et al 1999
2003) El coeficiente de sedimentacioacuten de las partiacuteculas es de 230 170 y 125S
respectivamente El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene motivos de
metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del codoacuten de
finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999) Cerca del extremo
3acutedel ARN 2 se presenta una proteiacutena asociada a la transmisioacuten por el vector y generada a
partir de la supresioacuten del codoacuten de terminacioacuten del ORF que codifica para la caacutepside (CP)
Esta proteiacutena parece ser la responsable de la peacuterdida de la estructura helicoidal en los
extremos del ARN durante el proceso de desensamblaje (Sandgren et al 2001) El ARN 3
codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Tres de las
proteiacutenas producidas (TGB1 TGB2 y TGB3) estaacuten involucradas en el movimiento ceacutelula a
ceacutelula (Zamyatnin et al 2004) La funcioacuten de la cuarta proteiacutena una proteiacutena rica en
cisteiacutena parece ser la de actuar en el incremento de la virulencia sin embargo no es
indispensable para el proceso infectivo (Lukhovitskaya et al 2005) (Figura 1)
24
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV En las cajas se observan las proteiacutenas
para las que codifica el genoma Las flechas indican las proteiacutenas originadas y los ARN
subgenoacutemicos (ARNsg) Fuente httpwwwexpasychviralzoneall_by_species643html
Modificado por Gallo (2012)
352 Ciclo de la infeccioacuten de PMTV
La especie PMTV es transmitida por zoosporas de Sss que afecta los sistemas radiculares
de sus hospedantes Este virus tambieacuten puede ser transmitido por semilla asexual El virus
puede permanecer en las estructuras de resistencia de sus vectores por varios antildeos en el
suelo (Astier et al 2007 Dijkstra y Khan 2006) En los ensayos de transmisioacuten del virus se
ha observado que eacuteste es transmitido eficientemente a plantas indicadoras (ej N tabacum y
N benthamiana) a partir de muestras de suelo infestadas con quistes del patoacutegeno
(Campbell 1996 Veacutelez 2007)
25
El PMTV constituye un pequentildeo grupo de virus que para su movimiento sisteacutemico en la
planta hospedante no requiere de la expresioacuten de CP ni de la formacioacuten del virioacuten
(McGeachy y Barker 2000) debido a que el TGB le ofrece la posibilidad de mover el ARN
infeccioso a traveacutes de largas distancias en la planta (Melander et al 2001) Actualmente se
generan nuevas teoriacuteas acerca del movimiento de TGB en la planta y de la funcioacuten de cada
una de las proteiacutenas TGBp1 TGBp2 y TGBp3 en el movimiento ceacutelula a ceacutelula de PMTV
Shemyakina et al (2011) analizaron la localizacioacuten subcelular y el transporte de TGBp1
de acuerdo con los resultados obtenidos propusieron que la asociacioacuten de TGBp1 con los
microtuacutebulos puede ser importante para la formacioacuten de cuerpos de complejos de ribo-
nuacutecleo-proteiacutena viral destinada para el transporte a traveacutes de los plasmodesmos Estudios
similares han sido realizados por Wright et al (2010) cuyos resultados sugieren que TGB1
en PMTV requiere interaccioacuten con componentes nucleolares y posiblemente con
microtuacutebulos para el movimiento viral de ARN de larga distancia
El ARN desnudo se puede encontrar en tubeacuterculos asintomaacuteticos y causar una infeccioacuten
secundaria para la siguiente temporada de siembra (McGeachy y Barker 2000) La
manifestacioacuten de los siacutentomas caracteriacutesticos de la enfermedad depende de la presencia de
los tres ARN en el tejido (Savenkov et al 2003)
353 Rango de hospederos de PMTV
En condiciones experimentales el virus puede infectar plantas de las familias
Chenopodiaceae Solanaceae y Tetragoniaceae Dentro de estas se encuentran las plantas
que se usan para su diagnoacutestico las cuales corresponden a Nicotiana debneyi y
Chenopodium amaranticolor en las que se produce necrosis sisteacutemica y lesiones locales
conceacutentricas cafeacutes respectivamente Nicotiana benthamiana N debneyi N clevelandii y
N tabacum son las especies maacutes apropiadas para el mantenimiento y propagacioacuten del virus
bajo condiciones experimentales (ICTVdB 2006 Veacutelez 2007)
26
354 Siacutentomas causados por PMTV
La enfermedad inducida por PMTV presenta una amplia gama de siacutentomas dependiendo de
la variedad y de las condiciones ambientales siendo frecuente la presencia de anillos y
arcos de colores oscuros sobre la superficie de los tubeacuterculos mientras que internamente se
presentan arcos necrosados En infecciones secundarias los tubeacuterculos pueden mostrar
agrietamientos reticulados y profundos Adicionalmente los foliacuteolos de las plantas
afectadas pueden presentar moteados cloroacuteticos y liacuteneas con formas de V En la regioacuten
Andina la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos no es frecuente de observar pudiendo ser
igualmente inducidas por cepas necroacuteticas de PVY oacute por Streptomyces spp y Rhizoctonia
solani (Tenorio et al 2006) A nivel aeacutereo el virus tambieacuten puede inducir amarillamientos
enanismos y acortamiento de entrenudos (Salazar 1995)
En Escocia se estudioacute el efecto de los siacutentomas foliares causados por PMTV sobre el
rendimiento del cultivo los siacutentomas foliares y en el tubeacuterculo de varias generaciones de
siembra para la propagacioacuten de semilla de papa Se encontroacute que en los tubeacuterculos de
plantas sin siacutentomas rara vez se observan los siacutentomas foliares en la siguiente generacioacuten
Las plantas asintomaacuteticas produjeron maacutes tubeacuterculos infectados cuando eran derivadas de
plantas que presentaron siacutentomas foliares el antildeo anterior Adicionalmente la proporcioacuten de
plantas hijas con siacutentomas foliares provenientes de tubeacuterculos con siacutentomas foliares
tuvieron un rango de 19-41 en el antildeo y parecioacute estar asociado con la severidad de dichos
siacutentomas Asiacute mismo el siacutentoma de ldquospraingrdquo en los tubeacuterculos tendioacute a ser mayor en
plantas que presentaban siacutentomas foliares comparados con aquellas asintomaacuteticas Estos
resultados mostraron que la erradicacioacuten de plantas con siacutentomas foliares podriacutea mejorar la
fitosanidad del cultivo pero resulta impraacutectico cuando las plantas enfermas son muy
frecuentes (Carnegie et al 2010) Sin embargo los siacutentomas foliares son raramente
observados en variedades cultivadas actualmente en los paiacuteses noacuterdicos con excepcioacuten de
Noruega La razoacuten para estas diferencias de la etiologiacutea de la enfermedad no son
comprendidas pero puede ser que el clima marino maacutes huacutemedo en Noruega y Escocia
afecta la fisiologiacutea de la planta de papa e incrementa la infeccioacuten sisteacutemica por PMTV
(Santala et al 2010)
27
36 Deteccioacuten de PMTV
Para la deteccioacuten de PMTV se han utilizado diversas teacutecnicas de laboratorio Las primeras
pruebas incluyeron bioensayos con plantas indicadoras como Chenopodium amaranticolor
las cuales desarrollan los siacutentomas cuando son infectadas por PMTV Esta teacutecnica resulta
informativa pero tarda alrededor de 14 diacuteas para la expresioacuten de siacutentomas que en
ocasiones no son completamente confiables (Jeffries 1998)
Con el desarrollo de las pruebas ELISA se hizo posible la deteccioacuten de PMTV en dos diacuteas
sin embargo la generacioacuten de falsos negativos debido a la distribucioacuten erraacutetica del virus en
la planta ha hecho que se cuestione dicha teacutecnica Arif y Torrance (1996) realizaron
estudios de deteccioacuten de PMTV en muestras de tubeacuterculos de tres cultivares de papa
concluyendo que la combinacioacuten de tejidos de tubeacuterculos en la muestra incrementa la
probabilidad de deteccioacuten del virus En Dinamarca la utilizacioacuten de la teacutecnica DAS -
ELISA (Sandwich de anticuerpos doble - Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas)
tuvo alta confiabilidad para el seguimiento de la presencia de PMTV en 23 cultivares de
papa sembrados en campo (Nielsen y Moslashlgaard 1997)
La utilizacioacuten de teacutecnicas basadas en aacutecidos nucleicos ha llevado al desarrollo de meacutetodos
de deteccioacuten de alta sensibilidad La RT-PCR es uno de estos meacutetodos de deteccioacuten maacutes
sensible Arif et al (1994) compararon la confiabilidad de ELISA y RT-PCR en la
deteccioacuten de PMTV de raiacuteces y hojas de plantas trampa de Nicotiana debneyi Luego de
tres semanas de siembra la RT-PCR detectoacute el virus en ambos tejidos mientras que con
ELISA se obtuvo la deteccioacuten del virus soacutelo despueacutes de cinco semanas de la siembra A
pesar de que la teacutecnica RT-PCR es maacutes sensible la preparacioacuten de las muestras para este
meacutetodo lleva maacutes tiempo por lo tanto ELISA es considerada por algunos investigadores
como la teacutecnica maacutes econoacutemica y conveniente para el anaacutelisis rutinario de grandes
cantidades de muestras (Davey 2009)
Davey (2009) realizoacute estudios de deteccioacuten y cuantificacioacuten de PMTV utilizando qRT-
PCR y disentildeando un par de cebadores y una sonda para cada ARN del genoma del virus El
bioensayo desarrollado para las muestras de suelo fue muy efectivo en la deteccioacuten de
28
PMTV utilizando Solanum esculentum cv Monkeymaker como planta trampa y cuando se
usoacute en conjunto con qRT-PCR los resultados se obtuvieron maacutes raacutepidamente que los de
otros bioensayos previamente descritos por Arif et al (1994) quienes utilizaron
Chenopodium quinoa como planta trampa
Otros meacutetodos basados en RT-PCR han sido empleados en Japoacuten por Nakayama et al
(2010) mediante microplacas de hibridizacioacuten RT-PCR (RT-PCR-MPH) para la deteccioacuten
de PMTV con cebadores especiacuteficos y una sonda marcada en muestras provenientes de
raiacuteces de plantas de tomate Asiacute mismo el diagnoacutestico en muestras de suelo utilizando este
meacutetodo determinoacute que el 612 de los lotes muestreados estaban infectados con PMTV
La hibridizacioacuten especiacutefica basada en amplificacioacuten con cebadores con marcadores
fluorescentes (Flash-PCR) tambieacuten ha sido una teacutecnica basada en PCR que ha permitido la
deteccioacuten raacutepida y precisa de diferentes virus de la papa como el PMTV (Ryazantsev y
Zavriev 2009) De otro lado los microarreglos con sondas especiacutefica para virus pueden
detectar un nuacutemero casi ilimitado de especies de virus en un solo ensayo Nicolaisen
(2011) realizoacute un estudio de microarreglos con la utilizacioacuten de 152 sondas potencialmente
capaces de detectar 52 virus en papa (incluyendo PMTV) Las hibridizaciones del ADNc de
plantas infectadas mostraron que 49 de los 52 virus fueron positivos e identificados
correctamente a nivel de especie demostrando que esta teacutecnica puede contribuir a la
construccioacuten de microarreglos geneacutericos capaces de detectar la mayoriacutea sino todos los
virus de ARN de plantas
En Colombia la deteccioacuten de PMTV fue reportada por primera vez por Veacutelez (2007) Los
ensayos de RT-PCR permitieron determinar que el 81 de los suelos muestreados en el
estudio presentaron infeccioacuten por PMTV Este meacutetodo utilizando los cebadores H360
C819 fue maacutes sensible para la deteccioacuten de PMTV que la induccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras En estos bioensayos se encontroacute que las plantas de N tabacum fueron mejores
indicadoras de la expresioacuten de siacutentomas que las de N debneyi pero estas uacuteltimas son maacutes
sensibles para la deteccioacuten de PMTV por RT-PCR
29
Gil (2010) realizoacute la evaluacioacuten de la presencia del virus PMTV a partir de plantas de N
benthamiana inoculadas con quistosoros de Sss mediante pruebas de deteccioacuten seroloacutegica y
molecular Un total de 18 muestras de raiacuteces infectadas con Sss fueron evaluadas
encontraacutendose que cinco muestras de Antioquia y una de Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo
arrojaron resultados positivos en las pruebas de ELISA Al comparar estos resultados con
los obtenidos con qRT-PCR se encontroacute que la prueba de qRT-PCR determinoacute la presencia
del virus en el 45 de las muestras analizadas mientras que mediante ELISA y RT-PCR
convencional se diagnosticaron 25 y 28 de las muestras como positivas Sin embargo el
anaacutelisis estadiacutestico no indicoacute diferencias significativas al nivel del 95 entre las tres
pruebas analizadas Al observar individualmente la capacidad de las pruebas para detectar
PMTV resultoacute llamativo el hecho que algunas muestras fueran positivas para dos de las
tres pruebas e incluso se presentaron casos en los que la prueba de ELISA detectoacute el virus
pero no las pruebas basadas en RT-PCR lo cual sugirioacute problemas con la inhibicioacuten de las
reacciones enzimaacuteticas o con los cebadores empleados
37 Variabilidad geneacutetica de PMTV
A nivel mundial se han desarrollado investigaciones que reportan la presencia de bajos
niveles de variacioacuten entre genotipos de PMTV (Mayo et al 1996) Latvala-Kilby et al
(2009) caracterizaron el gen de la CP y un dominio de lectura continua del ARN 2 asiacute
como el gen 8K y la regioacuten no traducida 3acutedel ARN 3 (UTR) de 37 aislamientos de
Finlandia y Letonia Fueron encontrados dos tipos diferenciables de ARN 2 y ARN 3 La
secuenciacioacuten y los anaacutelisis de RFLP de los productos de PCR de dichas regiones
indicaron que la mayoriacutea de los aislamientos de PMTV que infectaron tubeacuterculos en estos
paiacuteses europeos comprenden los restrictotipos ARN 2-II y ARN 3-B
En estudios previos en los cuales las secuencias CP de tres aislamientos de Escocia y ocho
de Peruacute fueron analizadas por Mayo et al (1996) las cepas bajo anaacutelisis mostraron poca
variabilidad De forma similar las secuencias CP de seis aislamientos de Norteameacuterica
presentaron una identidad mayor al 97 con respecto a algunas secuencias de aislamientos
de PMTV de Europa (Xu et al 2004) En Dinamarca se reportoacute la presencia de dos grupos
30
de PMTV basado en anaacutelisis de las secuencias de CP encontrando que eacutestos comparten
98 de identidad pero con posibles diferencias en la reproduccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras (Nielsen y Nicolaisen 2003) Al parecer la variabilidad geneacutetica de los genes
de la CP en aislamientos de PMTV del norte de Europa y Norte Ameacuterica es limitada y
permite la deteccioacuten confiable del virus con los anticuerpos monoclonales y los cebadores
de la PCR usados actualmente (Santala et al 2010)
En Colombia Velez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo con alta identidad con aislamientos de Europa
y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por aislamientos colombianos Una
situacioacuten similar encontroacute Gil (2010) con aislamientos Colombianos de PMTV que
presentaron una estructura poblacional con bajos niveles de variabilidad pero con algunas
variantes divergentes con respecto a los genotipos de referencia mundial Dichas variantes
presentaron diferencias en sus secuencias de CP hasta del 24 con respecto al grupo
principal La contextualizacioacuten en el genoma viral de dos secuencias obtenidas por dicho
autor en cepas de PMTV del departamento de Antioquia indicoacute que se tratan de
aislamientos representativos del genoma ordinario de PMTV y no de las variantes
encontradas en el anaacutelisis filogeneacutetico Sus identidades para las porciones del ARN 2 y
ARN 3 secuenciadas fueron altas (gt97) con respecto a los genomas reportados en
trabajos anteriores (Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) por lo que se plantea la
necesidad de secuenciar dichas regiones en al menos un aislamiento de las variantes
referidas
Los resultados encontrados en esta investigacioacuten permiten plantear que el caso de PMTV
en Colombia es aparentemente singular dada la presencia de dos variantes geneacuteticas de los
altos niveles de infeccioacuten que genera Sss en cultivos de papa de diferentes departamentos y
de las diferencias notables en la manifestacioacuten de siacutentomas de la sarna polvosa entre
variedades locales (Carrentildeo 2009 Gilchrist et al 2009 Gil 2010) situacioacuten que amerita
continuar con los estudios de variabilidad geneacutetica y fenotiacutepica en dichos patosistemas
31
BIBLIOGRAFIA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Agrios GN 1996 Fitopatologiacutea Editorial Limusa Meacutexico
Andersen BAB Nicolaisen M Nielsen SL 2002 Alternative hosts for Potato mop-top
virus genus Pomovirus and its vector Spongospora subterranea Potato Research 45 37-
43
Arias CMM 2011 Anaacutelisis y comparacioacuten de los glucosinolatos presentes en diferentes
acceciones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control
del patoacutegeno de la papa Spongospora subterranea Tesis de Maestriacutea en Ciencias Quiacutemicas
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Departamento de quiacutemica
Bogataacute Colombia
Arif M Torrance L Reavy B 1994 Improved efficiency of detection of potato mop- top
furovirus in potato tubers and in the roots and leaves of soil-bait plants Potato Research
37 373-381
Arif M Torrance L 1996 Detection of Potato mop-top virus in potato tubers Proceedings
Crop Protection in Northern Britain 325-330
Astier S Albouy J Maury Y Robaglia C Lecoq H 2007 Principles of plant virology
genome pathogenicity virus ecology Science Publishers Enfield NH USA P 112
Bell KS Roberts J Verral S Cullen DW Williams NA Harison JG 1999 Detection and
quantification of Spongospora subterranea fsp subterranea in soils and on tubers using
specific primers PCR primers European Journal of Plant Pathology 105905-915
Benavides PJA 2006 Incidencia y severidad de la rontildea de la papa causada por
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh f sp subterranea Tomlinson en raiacuteces y
tubeacuterculos de Diacol Capiro y Parda Pastusa en tres eacutepocas de siembra en el departamento
32
de Narintildeo y su efecto en los rendimientos (Tesis de maestriacutea) Bogotaacute Colombia Facultad
de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid diagnostic
test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European Journal of Plant
Pathology 131 (2) 277-287
Budziszewska M Wieczorek P Nowaczyk K Borodynko N Pospieszny H Obrecircplaska-
Stecircplowska A 2010 First report of potato mop-top virus on potato in Poland Plant
Disease 94 (7) 920
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47759-766
Campell RN 1996 Fungal transmission of plant viruses Annuals Review of
Phytopathology 3487-108
Carnegie SF Cameron AM McCreath M 2010 Foliar symptoms caused by Potato mop-
top virus on potato plants during vegetative propagation in Scotland and their association
with tuber yield spraing and tuber infection Potato Research 53 83-93
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia (Tesis de Maestriacutea) Bogotaacute
Colombia Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Colombia
Cerovska N Pecenkeva T Filigarovaacute M Dedic P 2007 Sequences analysis of the Czech
Potato Mop-Top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica 52(1) 61-
64
Cotes J Jaramillo S Gonzaacutelez L 2006 Evaluacioacuten de la incidencia de sarna polvosa en
tres variedades de papas colombianas Congreso Internacional de papa John S
Niederhauser Meacutexicop O-7 ISBN 968-02-0270-4
33
Crosslin JM 2011 First report of potato mop-top virus on potatoes in Washington State
Plant Disease 95 (11)1483
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
David N Mallik I Crosslin JM Gudmestad NC 2010 Firt report of Potato mop-top virus
in North Dakota Plant Disease 94 (12)1506
Dick MW 2001 Straminipilous fungi systematic of the Peronosporomycetes including
accounts of the marine straminipilous protist the plasmodiophorids and similar organisms
Kluwer Dordrecht
Dijkstra J Khan JA 2006 Handbook of Plant Virology Haworth Press Inc New York
US Jawaid A Khan Jeanne Dijkstra editors P 452
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC Scott CL 2010 Elevated zinc and manganese
levels give moderate reductions in Spongospora subterranea infection of potato roots In
Proceedings 6th Australasian Soilborne Diseases Symposium Twin Waters Queensland 9-
10 August 2010 P 46
Falloon RE Russell AG Wallace AR Butler RC 2003 Susceptibility of potato (Solanum
tuberosum) cultivars to powdery scab (caused by Spongospora subterranea) and
relationships between tuber and root infection Australasian Plant Pathology 32377-385
FAO 2008 Antildeo internacional de la papa (Citado 14 enero 2011) Disponible en
httpwwwpotato2008orgesmundoamerica_latinahtml
FAO 2009 Sustainable potato production Guidelines for developing countries (Citado 14
enero 2011) Disponible en ftpftpfaoorgdocrepfao012i1127ei1127epdf
34
Gallo GYM 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea Facultad de Medicina Universidad Nacional de Colombia
Bogotaacute Colombia
Garciacutea C Navia E 2002 Evaluacioacuten de estrateacutegias de manejo de la rontildea polvosa
(Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en Colombia
(Citado 14 Ene 2011) Disponible en
httpwwwredepapaorgpracticasculturalesred3html
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Gil RJF Mariacuten M 2010 Diagnoacutestico y caracterizacioacuten molecular de virus asociados al
cultivo de la papa en Colombia con eacutenfasis en el virus Mop Top (PMTV Pomovirus)
(Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia
Gilchrist RE 2009 Alternativas para el manejo integrado de la sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) (Tesis de Doctorado) Medelliacuten Colombia
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia
Gilchrist E Jaramillo S Reynaldi S 2009 Efecto sobre la sarna polvosa de cuatro
aislamientos del hongo Trichoderma asperellum en tres tipos de suelo Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 624783ndash4792
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
35
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tuber by enzyme-linked immunosorbent assay Plant pathology
42181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato-a review
Plant pathology 461-25
Hoyos L Peacuterez JC Jaramillo S Orduz S Ntildeustez C 2002 Evaluacioacuten del efecto de
Trichoderma spp sobre Spongospora subterranea en papa variedad Diacol Capiro bajo
condiciones de invernadero Subproyecto 4 de Evaluacioacuten de las estrategias de manejo de la
rontildea polvosa (Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en
Colombia 2002 Disponible en wwwcevipapaorgco
Hoyos CL Villegas OM Gonzalez JEP 2009 Observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Spongospora subterranea f sp subterranea en papa Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 62(2) 5039-5045
Houser AJ Davidson RD 2010 Development a greenhouse assay to evaluate potato
germplasm for susceptibility to powdery scab American Journal of Potato Research 87
285-298
ICTVdB 2006 Management Potato mop-top virus The Universal Virus Database version
4 Buumlchen-Osmond C (Ed) Columbia University New York USA (Citado 20 Dic 2010)
Disponible en httpwwwncbinlmnihgovICTVdbICTVdB00086001001htm
Jaramillo S Calderoacuten H Narvaacuteez C Machuca A Afanador L Hincapieacute L Correa G 2003
Caracterizacioacuten de la variabilidad patogeacutenica y molecular de Spongospora subterranea
Informe final fase 2 Convenio Universidad Nacional Sede Medelliacuten y CEVIPAPA
Medelliacuten p 80
Jaramillo S Gonzaacutelez L Cotes J 2006 Efecto del tipo de suelo sobre la sarna polvosa
causada por Spongospora subterranea f sp subterranea (Wall) Lagerheim en papa
36
Congreso Internacional de papa John S Niederhauser Meacutexico p O-6ISBN 968-02-0270-
4
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos cultivares de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista de la Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 60(2)
3859-3876
Jaramillo VS Peacuterez AGA Hoyos CLM 2008 Variacioacuten morfoloacutegica de quistosoros de
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh fsp subterranea Revista Facultad de
Agronomiacutea ndash Medelliacuten 61(2)4511-4517
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Jones RAC Harrison BD 1969 The behaviour of Potato mop top virus in soil and
evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wall) Lagerh Annals Applied
Biology 63 1-17
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 71 47-57
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003 First
Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease 87872
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99(5)519-531
Lees AK 2000 Summary of the session on past and present research on powdery scab
Past and present Research Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery
scab Workshop Aberdeen Scottland July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) P 55-57
37
Lees AK van de Graaf P Cullen DW Duncan JM 2002 The development of a
quantitative real-time PCR assay for Spongospora subterranea f sp subterranea and its
use in epidemiological studies In Proceedings of the 5th
symposium of the international
working group on plant viruses with fungal vectors Institute of Plant Science Swiss
Federal Institute of Technology (ETH) Zurich Switzerland July 22-25 2002 P31
Lees AK van de Graaf P Wale S 2008 The identification and detection of Spongospora
subterranea and factors affecting infection and disease American Journal of Potato
Research 85 247-252
Lister RA Falloon RE Curtin D Butler C 2004 Spongospora subterranea reduces host
(Solanum tuberosum) growth Proceedings of 3rd
Australasian Soilborne Diseases
Symposium Barossa Valley South Australia 9-11 February 2004
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization and
effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal of
General Virology 862879-2889
Lyman GR Rogers JT 1915 The native habitat of Spongospora subterranea Science
42940-2
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2005 La cadena de la papa en
Colombia Una mirada a su estructura y dinaacutemica 1991-2005 Documento de trabajo Ndeg 54
(Citado 13 Ene 2011) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet2005112163731_caracterizacion_papapdf
MADR (Ministerio de agricultura y desarrollo rural) 2006 Observatorio agrocadenas
Colombia Documento de trabajo No 100 La cadena de la papa en Colombia Una mirada
global de su estructura y dinamica 1991-2005 (Citado 20 Dic de 2011) Disponible en
httpwwwagrocadenasgovco
38
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009a Memorias 2008- 2009
(Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwminagriculturagovcoarchivosmemorias_minagricultura_2009_completopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009b Anuario estadiacutestico del
sector agropecuario y pesquero Direccioacuten de poliacutetica sectorial Grupo sistemas de
informacioacuten Bogotaacute DC (Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwhtm3bpublicanuarioanuariopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural)ndashENA (Encuesta Nacional
Agropecuaria) 2009 Oferta Agropecuaria cifras 2009 (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet201046112648_RESULTADOS_ENA_200
9pdf
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C Salazar
LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top virus
from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
McDonald BA Martinez JP 1990 Restriction fragment length polymorphisms in Septoria
tritici occur at a high frequency Current Genetics 17133-138
McGeachy KD Barker H 2000 Potato mop-top virus RNA can move long distance in the
absence of coat protein Evidence from resistant transgenic plants Molecular Plant
Microbe Interactions 13125-128
Melander M Lee M Sandgren M 2001 Reduction in Potato mop-top virus accumulation
and incidence in tubers of potato transformed with a modified triple gene block gene of
PMTV Molecular Breeding 8197-206
Merz U 1989 Infectivity inoculum density and germination of Spongospora subterranea
resting spores a solution culture test system Bulletin OEPP 19 585-592
39
Merz U 2000 Powdery scab Research in Switzerland Past and present Research
Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery scab Workshop Scottland
July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) 2000 p 67-71
Merz U 2008 Powdery Scab of PotatomdashOccurrence Life Cycle and Epidemiology
American Journal of Potato Reserch 85241ndash246
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar
x environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Merz U Martiacutenez V Schwaumlrzel R 2004 The potencial for the rapid screening of potato
cultivars (Solanum tuberosum) for resistance to powdery scab (Spongospora subterranea)
using a laboratory bioassay European Journal of Plant Pathology 110 71-77
Merz U Walsh JA Bouchek-Mechiche K Oberhaumlnsli TH Bitterlin W 2005 Improved
immunological detection of Spongospora subterranea European Journal of Plant
Pathology 111371ndash379
Merz U Falloon RE 2009 Review Powdery scab of potato-increased knowledge of
pathogen biology and disease epidemiology for effective disease management Potato
Research 5217-37
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert HR 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar x
environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Montero-Astua M Vasquez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
40
Murakami H Tsushima S Akimoto T Murakami K Goto I Shishido Y 2000 Effects of
growing leafy daikon (Raphanus sativus) on populations of Plasmidiophora brassicae
(clubroot) Plant Pathology 49584-589
Mutasa ES Ward E Adams MJ Collier CR Chwarszcynska D Asher MJC 1993 A
sensitive DNA probe for the detection of Polymyxa betae in sugar beet roots Physiological
and Molecular Plant Pathology 43 379-390
Mutasa-Gottgens ES Chwarszczynska Halsey H Asher MJC 2000 Specific polyclonal
antibodies for the obligate plant parasite Polymyxa a targeted recombinant DNA approach
Plant Pathology 49276-87
Nakayama T Maoka T Hataya T Motoshige S Fuwa S Mori M 2010 Diagnosis of
Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-285
Nicolaisen M 2011 An oligonucleotide-based microarray for detection of plant RNA
viruses Journal of Virological Methods 173 137-143
Nielsen SL Moslashlgaard JP 1997 Incidence appearance and development of potato mop-top
furovirus-induced sprain in potato cultivars and the influence on yield distribution in
Denmark and detection of the virus in tubers by ELISA Potato Research 40101-110
Nielsen S Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups within
Potato mop-top virus Archives of Virology 148381ndash388
Nitzan N Boydston R Batchelor D Crosslin J Brown C 2009 Hairy nightshade is an
alternative host of Spongospora subterranea the potato powdery sacab pathogen
American Journal of Potato Research 86 297-303
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
41
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006a The host range of Spongospora subterranea f sp subterranea in
the United States American Journal of Potato Research 83343-347
Qu XS Christ BJ 2006b Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea fsp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Ramiacuterez GJG 2010 Variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp subterranea
en suelos del municipio de unioacuten cultivados con la coleccioacuten Central colombiana de
Solanum phureja (Tesis de Pregrado) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias
Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia 2010
Restrepo DAF Jaramillo VS Cotes TJM 2009 Efecto de dos microorganismos y un
consorcio de micorrizas en combinacioacuten con viruta de pino sobre el control de sarna
polvosa (Spongospora subterranea) en papa Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea
Medelliacuten 62(2) 5047-5054
Rodriacuteguez K Maldonado Y Murcia L Huertas W Vaacutesquez M Zambrano A Rivero R
Garciacutea C 2002 Evaluacioacuten de protocolos para la deteccioacuten de patoacutegenos del suelo en Papa
(Rhizoctonia Rosellinia y Spongospora) (Citado 15 Ene 2011) Disponible en
httpwwwtodopapacomarpdfprotocolospdf
42
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista Facultad Agronomiacutea 26 (4) Caracas
Ryazantsev DYu Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato plant pathogens Applied Molecular Biology 43(3) 515-523
Saavedra SCO Goacutemez GST Aacutengel DJE 2004 Deteccioacuten de secuencias especiacuteficas de
ADN de Spongospora subterranea en suelo y tubeacuterculos de papa Revista Colombiana de
Biotecnologiacutea 714-23
Salazar LF1995 Los virus de la papa y su control Centro Internacional de la Papa CIP
(Peruacute) Publicado por el Centro Internacional de la Papa P 226
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 49 43-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M Wieczorek
P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-Wiśniewska J Yin Z
Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E Taluntytė L Pūpola N
Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E Sozonov A Tikhonovich I
Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam G Valkonen JPT 2010 Detection
distribution and control of Potato mop-top virus a soil-borne virus in northern Europe
Annals of Applied Biology 157163-178
43
Savenkov EI Sandgren M Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003 Potato
mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich protein are
dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of General
Virology 841001-1005
Shah FA Falloon RE Bulman SR 2010 Nightshade weeds (Solanum spp) confirmed as
hosts of the potato pathogens Meloidogyne falax and Spongospora subterranea f sp
subterranea Australasian Plant Pathology 39 492-498
Shah FA Falloon RE Lister RA Butler RC McKay A Ophel-Keller K Khan I 2009
Relationships between Spongospora subterranea DNA in field soil and powdery scab in
harvested potatoes Conference Handbook 17th
Australasian Plant Pathology Society
Conference (APPS) 29 September-1 October 2009 P 148
Shemyakina EA Sclovyev AG Leonova OG Popenko VI Schiemann J Morozov SY
2011 The role of microtubule association in plasmodesmal targeting of potato mop-top
virus movement protein TGBp1 The Open Virology Journal 51-11
SINAIPA (Sistema nacional de informacioacuten de papa) 2002 La rontildea de la papa p 8-9 El
Correo de la Papa Boletiacuten mensual No 07 Colombia (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en wwwcevipapaorgcopublicacionespublicacionesphp
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Reserch 83423-31
Torres H Pacheco MA French ER 1995 Resistance of potato to powdery scab
(Spongospora subterranea) under Andean field conditions American Potato Journal
10355-363
44
van de Graff PV Lees AK Cullen DW Duncan JM 2003 Detection and quantification of
Spongospora subterranea soil water and tissue samples using real-time PCR European
Journal of Plant Pathology 109 589-597
van de Graff P Wale SJ Lees AK 2007 Factors affecting the incidence and severity of
Spongospora subterranea infection and galling in potato roots Plant Pathology 56 1005-
1013
Veacutelez B 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato mop- top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia (Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Nacional de Colombia
Villareal HJ Porras PD Santa A Lagoeyte J Muntildeoz D 2007 Costos de produccioacuten de
papa en las principales zonas productoras de Colombia Federacioacuten Colombiana de
productores de papa FEDEPAPA
Wale SJ Burgess PJ Burnett F 1993 Bioassay for Spongospora subterranea detection in
soil and its potential use in predicting scab in the field Abstract 1642 Sixth International
Congress of Plant Pathology Quebec Canada
Wallroth FW 1842 Der Knollenbrand der Kartoffel Linnaea 16 332
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea using monoclonal antibodies Plant pathology 44335-365
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2004 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165 875-85
Ward LI Beales PA Barnes AV Lane CR 2005 A Real-time PCR assay based method for
routine diagnosis of Spongospora subterranea on Potato tubers Journal Phytopathology
152 633-638
45
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI Torrance
L 2010 The N- terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required for the
nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant Microbe Interaction 23(1) 1486-1497
Wuumlrzer B 1964 Ergaumlzende Untersuchungen uumlber den Pulverschorf der Kartoffel und
dessen Erreger Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh diss Landwirtschaftliche
Hochschule Hohenheim Germany 1964
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top virus
in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
Zamyatnin JrAA Solovyev AG Savenkov EI Germundsson A Sandgren M Valkonen
JPT Morozov SY 2004 Transient coexpression of individual genes encoded by the triple
gene block of Potato mop-top virus reveals requirements for TGBp1 trafficking Molecular
Plant-Microbe Interactions 17(8) 921-930
Zhang N McCarthy ML Smart CD 2008 A macroarray system for the detection of fungal
and oomycete pathogens of solanaceous crops Plant Disease 92(6) 953-960
Zolan ME Pukilla PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinerus
Molecular and cellular Biology 6(1)195-200
46
RESULTADOS
4 ARTICULO 1
VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora subterranea f sp subterranea EN
COLOMBIA
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea IN
COLOMBIA
Ineacutes Osorio Giraldo1 Marcela Orozco Valencia
1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
1 Elena Paola
Gonzaacutelez Jaimes2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
Formato de la Revista Actualidades Bioloacutegicas ISSN 0304-3584
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
La Sarna polvosa de la papa (Spongospora subterranea fsp subterranea - Sss) es una de
las enfermedades re-emergentes maacutes importantes de este cultivo en Colombia El efecto
deleteacutereo de Sss no soacutelo se debe al dantildeo directo sobre el sistema radicular y la calidad de
los tubeacuterculos sino tambieacuten a que sus zoosporas transmiten el Potato mop-top virus
(PMTV Pomovirus) Sss genera quistosoros que actuacutean como estructuras de resistencia del
patoacutegeno en el suelo pudiendo permanecer viables por varias deacutecadas Por esto su manejo
debe fundamentarse en el uso de variedades tolerantes a la enfermedad y en el empleo de
tubeacuterculo-semilla certificado En esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variacioacuten de
127 aislamientos de Sss obtenidos en los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo con el fin de apoyar la seleccioacuten de aislamientos de Sss a evaluar
47
en programas de mejoramiento geneacutetico de papa y en el disentildeo de pruebas de deteccioacuten
asintomaacutetica del patoacutegeno Para esto se secuenciaron regiones ITS del ADN ribosomal y se
condujeron anaacutelisis filogeneacuteticos encontraacutendose la presencia de tres variantes principales
de Sss dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum
Abstract
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum
INTRODUCCIOacuteN
El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L) se ve afectado por diversos microorganismos
fitopatoacutegenos e insectos plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la re-emergencia de la
48
enfermedad denominada Sarna polvosa causada por el plasmodiofoacuterido Spongospora
subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp subterranea Tomlinson (Sss) Su efecto no solo se
debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten al deterioro en la calidad y apariencia
cosmeacutetica de los tubeacuterculos que reduce draacutesticamente su valor en el mercado (Merz y
Fallon 2009) Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop top virus (PMTV) uno de
los problemas virales de la papa que tiene caraacutecter cuarenteneario para diferentes paiacuteses del
mundo (Salazar 2006 Gil et al 2011)
Sss es originario de los Andes Surameacutericanos desde donde se dispersoacute gracias al mercado
mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber transcurrido maacutes de 150 antildeos desde su
primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado importancia en las uacuteltimas deacutecadas como
resultado de la siembra generalizada de materiales altamente susceptibles al patoacutegeno la
utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los cambios de eacutepocas de siembra hacia
periacuteodo huacutemedos las deficiencias en los sistemas de rotacioacuten de cultivos la falta de
programas de exclusioacuten y los altos estaacutendares exigidos por el mercado en la calidad
cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
Sss es un patoacutegeno obligado plasmodial que taxonoacutemicamente se ubica en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos son importantes patoacutegenos de vegetales
Spongospora subterranea fsp subterraena y f sp nasturtii Estos taxa fueron definidos
inicialmente como forma especialis (Merz y Falloon 2009) sin embargo con base en la
morfologiacutea de los zoosporangios rango de hospedantes y anaacutelisis filogeneacuteticos de regiones
ribosomales actualmente se acepta que representan dos especies diferentes (Qu y Christ
2004)
Los siacutentomas de la Sarna polvosa incluyen la induccioacuten en los tubeacuterculos de lesiones
pustulosas corchosas con centros pulverulentos formados a partir de la agregacioacuten de los
quistosoros del patoacutegeno (Figura 41) Con el avance de estas lesiones es frecuente la
49
ruptura del peridermo aunque el nivel de penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente
superficial (Carrentildeo 2009) Bajo condiciones oacuteptimas para el desarrollo de la enfermedad
es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten de los tejidos y la formacioacuten
de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la enfermedad ademaacutes de causar
los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular de las plantas al inducir la
formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas que causan la disminucioacuten de la
superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo marchitez y finalmente la muerte de las
plantas (Gilchrist 2009) La infeccioacuten en las raiacuteces especialmente cuando se forman
agallas puede causar una reduccioacuten en la toma de agua y de nutrientes por parte de las
plantas (Falloon et al 2005)
En los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Sss afecta
severamente las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y papa criolla (S phureja) Los
siacutentomas se observan en raiacuteces y tubeacuterculos pero hay variacioacuten entre las zonas paperas en
cuanto a la distribucioacuten de los siacutentomas en los diferentes oacuterganos de la planta En
Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre
los tubeacuterculos de las variedades Parda Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el
departamento de Narintildeo y el Oriente de Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces
Hasta ahora no se conoce si estas diferencias se deben a variaciones en las condiciones
ambientales de las regiones o a la ocurrencia de variantes geneacuteticas del patoacutegeno (Jaramillo
y Botero 2007 Carrentildeo 2009)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 en las cosechas de las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y Criolla Colombia
(Rodriacuteguez et al 2009 Gilchrist 2009) Adicionalmente a esta problemaacutetica la
diseminacioacuten del patoacutegeno se viene incrementando dramaacuteticamente en el paiacutes como
resultado de la baja calidad del tubeacuterculo-semilla utilizado por la mayoriacutea de los
agricultores la ausencia de variedades tolerantes al patoacutegeno y la deficiencia en la
asistencia teacutecnica que no cuenta con herramientas apropiadas para el diagnoacutestico
asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011) Su
manejo debe estar enmarcado bajo un esquema integrado del cultivo en el que se incluyan
50
aspectos como la rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del
tubeacuterculo-semilla utilizacioacuten de organismos antagonistas (ej Trichoderma spp) el empleo
de cultivos trampa la desinfeccioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten
que restrinja el movimiento de material contaminado y supervise maacutes detalladamente los
procesos de certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas
son utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado
del manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o
de Rhizoctoniasis (Carrentildeo 2009)
La problemaacutetica causada por esta enfermedad en las regiones cultivadoras de papa hace
necesario que se intensifiquen los esfuerzos por desarrollar metodologiacuteas de diagnoacutestico de
suelos y material vegetal que eviten la diseminacioacuten generalizada del plasmodiofoacuterido y de
su virus asociado PMTV entre regiones infectadas y libres de enfermedad siendo
especialmente importante el desarrollo de procedimientos que garanticen la sanidad de los
lotes dedicados a la produccioacuten de semilla Entre las diversas metodologiacuteas desarrolladas en
el mundo para el diagnoacutestico de este patoacutegeno se destacan la teacutecnica de ELISA con
anticuerpos policlonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Qu et al 2011) y pruebas de
flujo lateral (Bouchek-Mechiche et al 2011) Sin embargo estas teacutecnicas son de aplicacioacuten
limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas con base en los genotipos locales de los
patoacutegenos presentes en las regiones paperas del paiacutes Con el fin de suplir dicha carencia de
informacioacuten en esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss procedentes de las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia
mediante el anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr)
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Para la coleccioacuten de muestras de quistosoros de Sss proveniente de suelo raiacuteces y
tubeacuterculos se seleccionaron lotes en fincas con antecedentes de infeccioacuten seguacuten el registro
51
histoacuterico de los agricultores siguiendo la metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la
cual se utiliza un juego de tamices de 100 y 25 microm para la obtencioacuten de los quistosoros Por
cada lote se tomaron raiacuteces de plantas o tubeacuterculos sintomaacuteticos y una muestra de suelo de
500 gr Los sitios de coleccioacuten incluyeron las regiones cultivadoras de papa de los
municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio Subachoque y
Villa Pinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute Oicataacute (Boyacaacute) y Pasto e Ipiales
(Narintildeo) La investigacioacuten se propuso obtener un miacutenimo de 30 muestras de Sss por
departamento
Los quistosoros obtenidos a partir de muestras de suelos fueron inoculados en plantas de
Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo o plantas
trampa para incrementar el inoacuteculo siguiendo la metodologiacutea de Veacutelez (2007)
mantenieacutendose en casa de malla en el Centro Experimental Paysanduacute ubicado en el
corregimiento Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB 2550 msnm temperatura
media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) (Figura 42) Todas las muestras
fueron procesadas en los laboratorios de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad
Nacional de Colombia sede Medelliacuten y Sanidad Vegetal del Politeacutecnico Colombiano Jaime
Isaza Cadavid
Extraccioacuten de ADN
Para la obtencioacuten del ADN se empleoacute una modificacioacuten de la metodologiacutea de Doyle y
Doyle (1987) a partir de quistosoros extraiacutedos y de tejidos afectados de las plantas de papa
y plantas sentildeuelo En este procedimiento es necesaria la maceracioacuten con nitroacutegeno liacutequido
de los tejidos y se emplea como buffer de extraccioacuten una solucioacuten CTAB y 1
mercaptoetanol El lavado de la fase orgaacutenica se realiza con fenolcloroformo-alcohol
isoamiacutelico y la precipitacioacuten de los aacutecidos nucleicos con 1 voluacutemen de etanol absoluto y 01
voluacutemen de acetato de sodio 3M Finalmente el pellet generado es disuelto en agua
destilada esteacuteril y es sometido a digestioacuten de ARN mediante la adicioacuten de ribonucleasa A
(10 mgmL) (Ver protocolo 62) Cuando la presencia de inhibidores afectaba la eficiencia
52
de la PCR la extraccioacuten de ADN se realizoacute utilizando el kit DNeasy Plant (Qiagen
EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante con una ligera modificacioacuten en el paso
de elucioacuten de ADN que se realizoacute en dos etapas con 70 microL de agua destilada esteacuteril Para
determinar la concentracioacuten del ADN extraiacutedo se utilizoacute la lectura de absorbancia en las
longitudes de onda de 260 y 280 nm mediante un Nanodrop 2000C (Thermo EEUU)
obtenieacutendose un rango entre 10 y 112 ng de ADNμL con una relacioacuten 260280 de 15 a 19
(Tabla 41) La integridad del ADN se determinoacute realizando electroforesis en gel de agarosa
al 08 en buffer TBE 1X (TBE 5X 54 gL Tris 275 gL de aacutecido boacuterico 20 mLL de
EDTA 05M pH 80) suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) La visualizacioacuten de
las bandas se realizoacute utilizando el sistema digital de anaacutelisis Bio Doc Analyze (Biometra
Alemania) (Figura 43)
PCR de ITS del ADNr
Para la evaluacioacuten de los niveles de variacioacuten geneacutetica de Sss se realizaron PCR empleando
los cebadores especiacuteficos Spo8 (5 CTG GGT GCG ATT GTC TGT TG 3) y Spo9 (5 CAC
GCC AAT GGT TAG AGA CG 3) disentildeados por Bulman y Marshall (1998) asiacute como los
cebadores SsF (5acute GTC GGT TCT ACC GGC AGA CC 3acute) y SsR (5acute GCA CGC CAA
TGG TTA GAG ACG 3acute) reportados por Qu et al (2006) que amplifican productos de
391 y 434 pb de la regioacuten ITS del ADNr respectivamente Las reacciones de PCR
incluyeron 01 microM de cada cebador 1 U de Taq ADN polimerasa recombinante
(Fermentas Lithuania) 02 mM de cada dNTP 1X de buffer de enzima (100 mM Tris-HCl
(NH4)2SO2 pH 88) 2 mM MgCl2 1 microL de una dilucioacuten 50 ngmicroL de ADN y un volumen
total de 25 microL Las amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra) y
consistieron de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 35 ciclos de
94degC por 30 s 55degC por 30 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10
min Luego de la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se
separaron por electroforesis en gel de agarosa al 15 tal como se indicoacute anteriormente
53
Secuenciacioacuten
De ser necesario los amplicones obtenidos fueron purificados mediante los kits QIAquick
PCR Purification y QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para proceder a su secuenciacioacuten
directa en ambas direcciones utilizando los cebadores empleados en la PCR y el kit Big
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied Biosystems EEUU) Su
corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied
Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur) (Figura 44)
Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit
606 y Chromas 145 construyeacutendose secuencias consenso y confirmaacutendose su validez por
comparacioacuten con las bases de datos moleculares con el programa BLASTn
(httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) (Figura 45) Paralelamente se obtuvieron
del GenBank secuencias de Sss de las regiones estudiadas para su alineacioacuten con las
generadas en este trabajo mediante el software Clustal W Ademaacutes se utilizaron las
secuencias de los Plasmodiofoacuteridos Plasmodiophora brassicae Polymyxa graminis
Polymyxa betae S nasturtii y Sorosphaera viticola como grupos externos de anaacutelisis
(outgroups) Los alineamientos fueron utilizados en la construccioacuten de una matriz Nexus y
el anaacutelisis filogeneacutetico se realizoacute mediante un algoritmo de Maacutexima Parsimonia utilizando
el software PAUP 40b Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute
un anaacutelisis de Bootstrap con 500 iteraciones
RFLPs
Con el fin de proponer una prueba de diagnoacutestico molecular de las variantes de Sss se
realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs a partir de las secuencias de Sss generadas en esta
investigacioacuten y otras depositadas en el GenBank Para esto se utilizoacute el software webcutter
20 (httprnalundberggusecutter2) con las enzimas EcoRV EcoRI Bsp143I Hin6I
MspI Tru1I y TaqI seleccionadas por ser de faacutecil acceso para laboratorios de diagnoacutestico
molecular y utilizadas en la primera parte de exploracioacuten La validez de la prueba fue
54
confirmada mediante PCR-RFLPs con las enzimas Bsp143I y Hin6I y aislamientos
representativos de los grupos geneacuteticos principales detectados en el trabajo Las reacciones
consistieron de 15 microL conteniendo 15 microL de buffer 10X 2 microL de enzima y 115 microL de
producto de PCR Las reacciones fueron incubadas al bantildeo Mariacutea a 37degC durante 24 h La
separacioacuten de los fragmentos de restriccioacuten se efectuoacute por electroforesis en gel de agarosa
al 25 Se evaluaron los patrones electroforeacuteticos obtenidos para cada enzima de
restriccioacuten y se determinoacute el nuacutemero de bandas generadas y su tamantildeo aproximado por
comparacioacuten con el marcador de peso molecular GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus
(Fermentas)
RESULTADOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Se obtuvieron 210 muestras de tubeacuterculos y raiacuteces de papa con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos con historia de la presencia del patoacutegeno en los departamentos de Antioquia
Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Se realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos con las secuencias
que presentaron tamantildeos superiores a 390 pb lograacutendose el objetivo de contar con al
menos 30 secuencias por cada departamento bajo anaacutelisis
Anaacutelisis filogeneacutetico de regiones ITS del ADNr
Las reacciones de PCR produjeron amplicones del tamantildeo esperado de ~390 pb con los
cebadores Spo8-9 (Figura 46) y de ~430 pb cuando se usaron los cebadores SsF-SsR en
79 y 48 muestras respectivamente Para el anaacutelisis filogeneacutetico soacutelo se incluyeron los
consensos que resultaron de la secuenciacioacuten en ambos sentidos De esta forma se
obtuvieron 33 secuencias de Antioquia 30 secuencias de Boyacaacute 33 secuencias de
Cundinamarca y 31 secuencias de Narintildeo para un total de 127 secuencias completas (Tabla
42) El alineamiento final de las secuencias alcanzoacute 445 sitios de los cuales 156 caracteres
eran constantes 55 variables pero no informativos y 236 informativos La longitud del
aacuterbol filogeneacutetico con maacutexima parsimonia fue de 707 con iacutendices de consistencia (IC) y
retencioacuten (IR) de 078 y 088 respectivamente Dado el alto nuacutemero de muestras
55
secuenciadas se presenta un dendrograma resultado del anaacutelisis de redundancia mediante el
programa Decrease redundancy (httpwebexpasyorgdecrease_redundancy) (Figura
47) Se presentaron dos grandes clados (A y B) soportados por valores de bootstrap de
100 el primer clado corresponde a los aislamientos de Sss mientras que el otro grupo
incluyoacute las demaacutes especies de plasmodiofoacuteridos (S nasturtii P graminis P betae y Pl
brassicae) que presentaron un alto nuacutemero de cambios entre ellas El clado A se subdividioacute
a su vez en tres grupos (A1 A2 y A3) dos de los cuales corresponden a los Tipos I (A2) y
II (A1) definidos por Qu y Christ (2004) En teacuterminos porcentuales ambos Tipos
representan el 157 (Tipo I) y 189 (Tipo II) de los aislamientos de Sss obtenidos en
Colombia ademaacutes se incluyeron secuencias del patoacutegeno provenientes de Estados Unidos
Irlanda y Escocia para el Tipo I y de Suiza Nueva Zelanda y de Reino Unido para el Tipo
II El subgrupo que representa el Tipo I de Sss soacutelo presentoacute aislamientos obtenidos de
tubeacuterculos o de suelos pero no de raiacutez mientras que el subgrupo representando el Tipo II
incluyoacute indistintamente aislamientos de raiacutez tubeacuterculos y suelos
Por otra parte el tercer subgrupo (A3) incluyoacute el mayor nuacutemero de aislamientos
Colombianos de Sss (654) con algunos de sus miembros presentando hasta 10 cambios
entre ellos En este subgrupo se encontraron indistintamente aislamientos de los cuatro
departamentos diferentes fuentes de muestreo (raiacutez tubeacuterculo o suelo) y hospedantes
(diferentes variedades de S tuberosum y de S phureja var Criolla Colombia) Dadas las
diferencias en secuencias de estos aislamientos proponemos nombrar a este grupo como el
Tipo III de Sss
El anaacutelisis de redundancia permitioacute tambieacuten identificar 12 genotipos (Figura 48) entre los
127 aislamientos de Sss de Colombia cinco de los cuales estuvieron conformados por un
soacutelo aislamiento tres por dos aislamientos y cuatro presentaron maacutes de diez miembros
siendo el genotipo 11 representante del Tipo I el 12 del Tipo II y el 7 y 10 del genotipo III
(Tabla 43) porque los demaacutes genotipos al ser uacutenicos o con tener como maacuteximo dos
representantes no fueron definidos a nivel de Tipos Los niveles de identidad para la regioacuten
56
ribosomal secuenciada entre estos genotipos fueron superiores al 95 en todos los casos
con una divergencia de 33 entre los Tipos I y II del 5 entre los Tipos I y III y del 2
entre el II y III La divergencia entre secuencias de Sss y otras especies de plasmodiofoacuteridos
fue mayor al 44 lo que demuestra la utilidad taxonoacutemica de las regiones ITS para
establecer relaciones filogeneacuteticas en este grupo de protozoos (Tabla 44)
RFLPs
Los anaacutelisis de restriccioacuten indicaron la existencia de polimorfismos en los sitios de corte de
algunas de las enzimas empleadas entre los grupos principales sentildealados en el anaacutelisis
filogeneacutetico Lo anterior puede ser utilizado con fines praacutecticos cuando se requiera evaluar
el genotipo o la mezcla de genotipos asociados a un lote de cultivo plantas sintomaacuteticas o
de tubeacuterculo-semilla con siacutentomas de Sarna polvosa Por ejemplo los aislamientos
representativos del Tipo II de Sss presentan un sitio de corte para Bsp143I (p 92) mientras
que para los del Tipo I se presentan dos sitios (p 97 340) Los aislamientos del Tipo III
tienen tres sitios de corte para la enzima Hin6I (p 222 283 352) en contraste con dos sitios
en los del Tipo I y II (p226-355 221-350) (Figura 49) Por esto proponemos la realizacioacuten
de una prueba simple de PCR-RFLPs a partir de la amplificacioacuten de las regiones ITS con
cebadores especiacuteficos para Sss y su posterior digestioacuten con las enzimas Bsp143I y Hin6I
con el fin de identificar los tres Tipos de Sss Al evaluar la digestioacuten de amplicones
representantes de los tres Tipos de Sss detectados en el estudio se validoacute la utilidad de la
teacutecnica en geles de agarosa al 25 ya que los perfiles de restriccioacuten obtenidos con la
enzima Hin6I permiten diferenciar a los aislamientos de los Tipos I y II (fragmentos
visibles de 221 y 129 pb) del Tipo III (fragmentos visibles de 221 67 y 62 pb) (Figura
410A) mientras que los representantes de los Tipos I y II se diferencian por la digestioacuten
con la enzima Bsp143I al generar fragmentos visibles de 243 pb (Tipo I) y de 294 pb (Tipo
II) (Figura 410B) Es importante indicar que los fragmentos inferiores a 50 pb no se tienen
en cuenta en este anaacutelisis ya que salen del rango de resolucioacuten de la electroforesis en geles
de agarosa Fragmentos de este tamantildeo pueden ser visualizados en geles de poliacrilamida
que ofrecen una mayor resolucioacuten
57
DISCUSIOacuteN
La disponibilidad de cultivares de papa resistentes a Sss es una prioridad para el disentildeo de
estrategias de manejo de la Sarna polvosa en diferentes paiacuteses cultivadores de este
tubeacuterculo en el mundo (Nitzan et al 2010) Sin embargo las deficiencias en el
conocimiento que se tiene de los niveles de variacioacuten de Sss y de su ciclo de vida
representan un obstaacuteculo para el establecimiento de los programas de mejoramiento
geneacutetico contra este fitopatoacutegeno (Merz y Falloon 2009) Los estudios geneacuteticos de Sss han
sido difiacuteciles de aplicar debido a su naturaleza de patoacutegeno obligado que impide su
aislamiento en medios axeacutenicos afectando los procesos de extraccioacuten de ADN la
utilizacioacuten de marcadores moleculares convencionales como AFLPs SSR y RAPDs y el
empleo de cebadores universales comuacutenmente usados para estudios taxonoacutemicos y
poblacionales en diferentes microorganismos eucarioacuteticos Adicionalmente la
caracterizacioacuten patoacutegenica de Sss resulta compleja ya que el desarrollo de la expresioacuten de
la Sarna polvosa estaacute fuertemente influenciada por las condiciones ambientales las
metodologiacuteas de inoculacioacuten y los cultivares del hospedante (Qu y Christ 2006 Jaramillo y
Botero 2007)
Afortunadamente la existencia de cebadores especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del
ADNr como los desarrollados por Bulman y Marshall (1998) y Qu et al (2006) para
amplificar la regioacuten ITS1 58S e ITS2 han permitido la obtencioacuten de secuencias que entre
otras aplicaciones permitieron definir la afinidad filogeneacutetica de Sss con respecto a otros
miembros del orden Plasmodiophoridae y demostrar los bajos niveles de identidad de esta
especie con respecto a la formae specialis nasturtii Esta misma situacioacuten se encontroacute en
este estudio obtenieacutendose identidades entre Sss y S nasturtii cercanas al 56 Los anaacutelisis
intraespeciacuteficos utilizando dichas secuencias han permitido detectar dos ribotipos
principales de Sss en el mundo denominados como I y II Ambos Tipos han sido
encontrados en poblaciones de Sss de Australia y Europa (Bulman y Marshall 1998)
mientras que en Norte Ameacuterica los aislamientos corresponden exclusivamente al Tipo II
58
(Qu y Christ 2006) En dicho estudio se encontroacute que las secuencias del Tipo I diferiacutean con
respecto a las del Tipo II en tres nucleoacutetidos (p 60 127 157) y una insercioacuten de cinco
nucleoacutetidos (p 129 a 133) en el ITS1 mientras que para la regioacuten ITS2 se presentan seis
mutaciones puntuales (p 348 367 399 402 461 475) y dos deleciones (p 356 y 474) lo
que en su conjunto equivale a un 29 de divergencia entre ambos ribotipos Estas
diferencias fueron igualmente encontradas entre los aislamientos colombianos
representando ambos Tipos aunque algunos de ellos presentaron mutaciones adicionales
por ejemplo el genotipo 12 (conformado por 21 aislamientos) presentoacute dos cambios con
respecto al Tipo II reportado en GenBank (Accesioacuten AY604172) mientras que el genotipo
11 (conformado por 17 aislamientos) tuvo tres cambios con respecto al Tipo I (Accesioacuten
AY604171)
En Colombia hasta el presente estudio se habiacutean realizado dos estudios de variabilidad
geneacutetica de Sss con base en anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr En el primero de ellos
Hincapieacute (2006) encontroacute altos niveles de identidad geneacutetica entre los aislamientos de Sss
secuenciados y analizados mediante PCR-RFLP lo que condujo al autor a plantear la
posible ocurrencia de una estructura poblacional clonal para este patoacutegeno en el paiacutes En un
estudio maacutes reciente Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS y SSCP
(Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) que incluyoacute un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones establecioacute la presencia de subpoblaciones del patoacutegeno
relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Asiacute aislamientos con secuencias ITS del Tipo
I se asociaron exclusivamente con infecciones de tubeacuterculo mientras que aquellos del Tipo
II lo hicieron con siacutentomas de agallas en raiacutez En dicha investigacioacuten se descartoacute ademaacutes la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar del hospedero o la zona
geograacutefica de origen de los aislamientos Asiacute mismo se comproboacute que en el paiacutes existen
variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la
presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno dos de los cuales corresponden a los Tipos I y
II mientras que los tres restantes correspondiacutean a nuevas variantes no reportadas en otros
59
lugares del mundo (Carrentildeo 2009) desafortunadamente las secuencias resultantes de dicho
trabajo no fueron publicadas en GenBank y por tanto no pudieron ser incluidas en los
anaacutelisis filogeneacuteticos aquiacute presentados
El presente estudio amplia auacuten maacutes la base de conocimiento de los niveles de variacioacuten de
Sss en Colombia al detectar 12 genotipos a partir de 127 secuencias de igual nuacutemero de
aislamientos del patoacutegeno obtenidos en cultivos de los cuatro principales departamentos
productores de papa del paiacutes El anaacutelisis filogeneacutetico basado en dichas secuencias definioacute
la presencia de un clado que representa a Sss e incluye los dos Tipos mundialmente
conocidos para este patoacutegeno (Qu y Christ 2004) ademaacutes de un tercer subgrupo (III) que
presenta un 5 y 2 de divergencia con respecto a los Tipo I y II respectivamente Este
Tipo III contiene la mayor proporcioacuten de aislamientos del estudio e integroacute indistintamente
cepas de diferentes oriacutegenes geograacuteficos hospedantes tejidos sintomaacuteticos y suelo De gran
intereacutes resultoacute el hecho que los aislamientos asociados con el Tipo I procediacutean de puacutestulas
en tubeacuterculos o de suelos pero no de agallas de raiacutez lo cual confirma la asociacioacuten
realizada por Carrentildeo (2009) para esta variante de Sss Sin embargo los aislamientos
asociados al Tipo II proveniacutean indistintamente de raiacutez tubeacuterculos o suelos A partir de estos
resultados es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa del paiacutes Asiacute por ejemplo
es de intereacutes estudiar las reacciones de las variedades colombianas de papa a dichos
ribotipos asiacute como su capacidad de transmisioacuten de PMTV En este sentido Ward et al
(2005) evaluando el efecto de dos ribotipos de Polymyxa graminis un plasmodiofoacuterido que
afecta gramiacuteneas en la zona templada encontraron que los aislamientos del Tipo II fueron
detectados principalmente en plantas de trigo y estaban asociados a la transmisioacuten del Soil-
borne cereal mosaic virus (SBCMV) mientras que aquellos del Tipo I afectaban cebada y
su capacidad de transmisioacuten de SBCMV era muy baja
60
Los niveles de variacioacuten encontrados en esta investigacioacuten para el agente causal de la Sarna
polvosa de la papa en Colombia condujeron a plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y de certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla Para esto se realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs de regiones ITS del
ADNr con siete enzimas de restriccioacuten de uso frecuente en laboratorios de deteccioacuten
molecular de microorganismos Los resultados demostraron polimorfismos en los sitios de
corte de algunas de las enzimas utilizadas dos de las cuales permiten distinguir los tres
principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico De esta forma se confirmoacute que la
digestioacuten con la enzima Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos
del Tipo III mientras que el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los
Tipos I y II La prueba realizada en este estudio puede ser implementada con variaciones
como el uso de digestiones dobles y la utilizacioacuten de geles de poliacrilamida que generen
mayor resolucioacuten de los fragmentos de restriccioacuten de bajo peso molecular sin embargo el
esquema aquiacute presentado ofrece simplicidad y eficiencia en la separacioacuten de los tres Tipos
sin la necesidad de contemplar todos los productos de la digestioacuten Adicionalmente a esta
prueba y con base en los resultados de las secuencias obtenidas en esta investigacioacuten y en
aquella de Gil et al (2011) nuestro grupo se encuentra disentildeando y evaluando pruebas de
PCR y RT-PCR en tiempo real para la deteccioacuten asintomaacutetica de Sss y de su virus asociado
PMTV Se espera que los resultados generados en estas investigaciones sean incorporados
raacutepidamente en los programas de manejo integrado de la Sarna polvosa en Colombia y
otros paiacuteses latinoamericanos afectados por esta enfermedad como Venezuela (Rodriacuteguez et
al 2009) y Costa Rica (Montero-Astua et al 2008)
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten el Politeacutecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid
Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo
por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el Departamento de Narintildeo
61
REFERENCIAS
Bell KS Roberts J Verrall S Cullen DW Williams NA Harrison JG Toth IK Cooke D
Duncan JM Claxton JR 1999 Detection and quantification of Spongospora subterranea
fsp subterranea in soils and on tubers using specific PCR primers European Journal of
Plant Pathology 105 905-915
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid
diagnostic test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European
Journal of Plant Pathology 131 277-287
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47 759-766
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33 69-84
62
Gilchrist E 2009 Alternativas para el manejo integrado de la Sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) Tesis de Doctorado en Ciencias Agrarias
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia sede Medelliacuten
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tubers by enzyme-linked immunosorbent assay Plant Pathology 42
181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato - A review
Plant Pathology 461-25
Hincapieacute LA 2006 Evaluacioacuten de la variabilidad molecular de Spongospora subterranea
(Wallroth) Lagerheim f sp subterranea en las principales zonas paperas de Colombia
Tesis de Maestriacutea en Biotecnologiacutea Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia sede Medelliacuten Colombia
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Merz U Fallon RE 2009 Powdery scab of potato-increased knowledge of pathogen
biology and disease epidemiology for effective disease management Potato Research
5217-37
Montero-Astua M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
63
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006 Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea f sp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la Sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista de la Facultad de Agronomiacutea Universidad del Zulia 26 508-531
Salazar LF 2006 Emerging and Re-emerging Potato Diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop - top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia Sede Bogotaacute
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea and quantification in soil Plant Pathology 45 884-895
64
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2005 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165875-885
Zolan ME Pukkila PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinereus
Molecular and Cellular Biology 6 195-200
65
41 Anexos
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp subterranea
en plantas de papa de Colombia a Quistosoros obtenidos de suelo b Plasmodios
formados en raiacutez de tomate (Solanum esculentum) c Lesiones tempranas producidas por
Sarna polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro d Lesiones tardiacuteas producidas por Sarna
polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro e f Agallas formadas en raiacuteces de S phureja
var Criolla Colombia
d
e f
c
a b
66
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja var Criolla
Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos infestados con Spongospora
subterranea f sp subterranea
67
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o raiacuteces de
plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea
MUESTRA A260 A280 RELACIOacuteN
260280
CONCENTRACIOacuteN
de ADN ng microl
AB1 0806 0465 173 403
AB2 0421 0244 172 21
Se7 0276 0149 184 138
Se8 0743 0415 179 371
MA11 2244 1366 164 1122
MA61 0277 0158 176 139
MA39 2135 1512 141 1067
MA56 0823 0361 228 412
MA60 021 0101 208 105
68
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos agallas o raiacuteces
de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana Carril 1 Marcador de peso 100 pb carril 2-
4 muestras MA16 MA17 MA18 MA11 MA39
500 pb
1 2 3 4 5 6
69
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora
subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8
70
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la regioacuten ITS del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp subterranea de Colombia
71
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb) a partir de ADN
de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum tuberosum S phureja y Nicotiana
benthamiana con presencia de quistosoros de Spongospora subterranea fsp subterranea
de cultivos de papa de los departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1
Marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas) carriles 2 a 6 muestras SE10 SE11
SE13 SE18 carril 7 control negativo
500 pb
100 pb
390 pb
1 2 3 4 5 6 7
72
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia
ANTIOQUIA CUNDINAMARCA
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE13 Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro SE8 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE18 La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro SE81 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
32UN La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE9 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
33UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE91 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34UN La Unioacuten Raiacutez accesioacuten C131-R2 SE12 Zipaquiraacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
35UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE14 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
80C La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE15 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Pastusa
Suprema
79C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE16 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
78C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE17 Villapinzoacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro
35 COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE19 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34COL La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE20 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
32COL La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum SE21 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
30COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 4fb Ventaquemada Raiacutez S tuberosum
29COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 5fb Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum
12fb La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 9fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
11fb La Unioacuten Raiacutez S tuberosum 10fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
1MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
ICA Nevada MA20 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
7MR Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro MA21 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
8MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA22 Villapinzoacuten
Raiacutez S tuberosum var ICA Pastusa Suprema
9MR La Unioacuten Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA23 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
11MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA24 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
12MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA25 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
13MR Santa Rosa Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA50 Desconocido Tubeacuterculo S tuberosum
14MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA51 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB2 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C87SJ MA52 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
73
AB3 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C81SJ MA53 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB4 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3SJ MA54 Tabio Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB6 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C8C MA55 Tabio Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB7 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3C MA56 Zipaquiraacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia
AB8 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA57 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA1 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA58 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA2 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA59 Villapinzoacuten
Tubeacuterculo S tuberosum var Diacol Capiro
MA41 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA60 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
BOYACAacute NARINtildeO
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE10 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE7 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE101 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
SE11 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 37COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE22 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 36COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
SE23 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA27 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE24 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA28 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
3fb Tunja Raiacutez S tuberosum MA31 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB1 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA32 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB9 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA33 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB10 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA34 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA35 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA3 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA36 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA4 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA37 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA5 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA38 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA7 Siachoque Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA39 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA9 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA40 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA11 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA61 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA62 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA14 Tunja Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA64 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA15 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA65 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA16 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA66 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA17 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA67 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
74
benthamiana
MA18 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA68 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA19 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA69 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA42 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA70 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA43 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA44 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA72 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA45 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA73 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA46 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA75 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA49 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA76 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA77 Ipiales Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
75
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) de cultivos de papa de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Como grupos externos de anaacutelisis se presentan
secuencias de otras especies de plasmodiofoacuteridos Meacutetodo de maacutexima parsimonia
utilizando la opcioacuten Heuristic search del programa PAUP 40b Los valores de Bootstrap (gt
80) se indican en la parte inferior de las ramas En letras mayuacutesculas se presentan las
denominaciones de los clados y subclados Adicionalmente se indican los grupos que
representan los Tipos de Sss
76
Sss TIPO I
395 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
MspI TaqI
cccgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgttttcgg base
pairs
gggcccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcaaaagcc 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
atactgaacttactaaagtggatcatttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgat base
pairs
tatgacttgaatgatttcacctagtaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgcta 76 to
150
EcoRI
gaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagtt base
pairs
cttcttgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaa 151
to 225
Hin6I TaqI EcoRV MspI
gcgctttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccgtgtgcgtg base
pairs
cgcgaaagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcggcacacgcac 226
to 300
Bsp143I MspI Hin6I
aaggggactctgagctctggtcggtccatggcttgaaagatcatgcaacccggtgcgcgtctctggcttctgatt base
pairs
ttcccctgagactcgagaccagccaggtaccgaactttctagtacgttgggccacgcgcagagaccgaagactaa 301
to 375
cgtctctaaccattggcgtg base pairs
gcagagattggtaaccgcac 376 to 395
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 2 97 340 gatc More info
EcoRI 1 190 gaattc More info
EcoRV 2 130 238 gatatc More info
Hin6I 2 226 355 gcgc More info
MspI 3 2 281 350 ccgg More info
TaqI 2 49 232 tcga More info
Tru1I 2 102 119 ttaa More info
77
Sss TIPO II
390 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
TaqI
cctgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgtattact base
pairs
ggacccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcataatga 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
gaacttactaaagtggatcgtttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgatgaaga base
pairs
cttgaatgatttcacctagcaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgctacttct 76 to
150
EcoRI Hin6I
acgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagttgcgct base
pairs
tgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaacgcga 151
to 225
TaqI EcoRV MspI
ttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccctgtgcgtggaagg base
pairs
aagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcgggacacgcaccttcc 226
to 300
MspI Hin6I
ggactatgagctctggtcggtccatggcttgaaagattatccaaccggtgcgcgtctctggcttctgattcgtct base
pairs
cctgatactcgagaccagccaggtaccgaactttctaataggttggccacgcgcagagaccgaagactaagcaga 301
to 375
ctanccattggcgtg base pairs
gatnggtaaccgcac 376 to 390
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 1 92 gatc More info
EcoRI 1 185 gaattc More info
EcoRV 2 125 233 gatatc More info
Hin6I 2 221 350 gcgc More info
MspI 2 276 345 ccgg More info
TaqI 2 49 227 tcga More info
Tru1I 2 97 114 ttaa More info
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos de S
subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I MspI TaqI y
Tru1I mediante el programa Web-cutter
78
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de aislamientos
de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en Colombia a partir de
anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal
GENOTIPO RFLPacutes MUESTRAS PROPORCIOacuteN
()
1
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185 EcoRV 2 125 233
Hind6I 2 221 351
MspI 2 276 346 TaqI 2 227 Tru1I
2 97 114
AB12 34UN 16
2
Bsp143I 1 93 EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277 347 TaqI 1 49 228
Tru1I 2 98 115
32UN 78C 16
3
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
11MR 08
4
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
9MR 08
5
Bsp143I 2 96 339 EcoRI 1 189
EcoRV 2 129 237
Hind6I 2 225 354
MspI 2 280 349 TaqI 1 231 Tru1I
2 101 118
8MR 13MR 16
79
6
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190
EcoRV 2 130 238 Hind6I 2 226 355
MspI 2 281 350
TaqI 1 232 Tru1I
2 102 119
MA12 08
7
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
MA37 SE7 SE8 SE9 SE10
SE11 SE12 SE13 SE14 SE15 SE16 80C 79C 37COL 36COL
35COL 34COL 32COL 30COL
12FB 10FB 11FB 9FB 1MR
SE71 SE81 SE91 SE101 AB2 AB3 AB4 AB6 AB7 MA1 MA7
MA9 MA14 MA20 MA21 MA22
MA23 MA24 MA25 MA28 MA31 MA32 MA33 MA34
MA35 MA36
393
8
Bsp143I 2 92 309 EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 289 351 MspI 2 276
346 TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
MA40 08
9
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 282 351 MspI 3 2 276
346 TaqI 1 227
Tru1I 2 97 114
MA43 08
10
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 3 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
29COL 33UN MA4 MA41
MA42 MA51 MA52 MA55
MA56 MA57 MA58 MA59 MA60 MA62 MA64 MA65
MA68 MA69 MA71 MA72
MA76 SE19 SE20 SE21 SE22 3FB 4FB 14MR
22
11
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190 EcoRV 2 130 238
Hind6I 2 226 355
MspI 3 2 281 350 TaqI 2 49 232
Tru1I 2 102 119
SE17 12MR AB1 AB8 MA2
MA15 MA16 MA17 MA18 MA19 MA45 MA46 MA49
MA50 MA53 SE23 SE24
134
80
12
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233 Hind6I 2 221 350
MspI 2 276 345
TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
SE18 35UN 7MR AB9 AB10
MA3 MA4 MA5 MA11 MA27 MA38 MA39 MA44 MA61
MA66 MA67 MA70 MA73
MA75 MA77 5FB
165
81
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluyen a S nasturtii y Plasmodiophora brassicae
como especies externas de anaacutelisis
SECUENCIA SE17 SE18 MA37 29COL AY604172 AY604171 AF310907 EF593112 AF102820 AF102819 EF195335 AF104308
SE17 Sss
Colombia
Tipo I
ID 0962 0957 0952 0964 0992 0564 0959 0992 0964 0586 0959
SE18 Sss
Colombia
Tipo II
0962 ID 0979 0974 0992 0959 0574 0987 0959 0992 0584 0987
MA37 Sss
Colombia
Tipo III
0957 0979 ID 0984 0982 0954 0579 0977 0954 0982 0598 0977
29COL Sss
Colombia
Tipo III
0952 0974 0984 ID 0982 0959 0579 0977 0959 0982 06 0977
AY604172
Sss EEUU
TipoII
0964 0992 0982 0982 ID 0967 0577 0994 0967 1 0589 0994
AY604171
Sss EEUU
Tipo I
0992 0959 0954 0959 0967 ID 0564 0962 1 0967 059 0962
AF310907 S
nasturtii 0564 0574 0579 0579 0577 0564 ID 0579 0564 0577 0566 0574
EF593112 Sss
Suiza 0959 0987 0977 0977 0994 0962 0579 ID 0962 0994 0589 0989
AF102820
Sss Escocia 0992 0959 0954 0959 0967 1 0564 0962 ID 0967 059 0962
AF102819
Sss Nueva
Zelanda
0964 0992 0982 0982 1 0967 0577 0994 0967 ID 0589 0994
EF195335 P
brassicae 0586 0584 0598 06 0589 059 0566 0589 059 0589 ID 0589
AF104308
Sss Reino
Unido
0959 0987 0977 0977 0994 0962 0574 0989 0962 0994 0589 ID
82
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las enzimas de restriccioacuten Bsp143I y
Hin6I que permiten determinar los tres Tipos de Sss identificados en este trabajo En la
izquierda se indican los genotipos representativos de cada Tipo (ver Tabla 3) y entre
pareacutentesis los sitios de corte referidos al Tipo I
83
Figura 410 (A) Gel de RFLPs con la enzima Hind6I con tres muestras de los Tipos I II y
III de Sss detectados en el estudio 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir Tipo
I 3-5 Digestioacuten de muestras Tipo I 6 Producto sin digerir Tipo II 7-9 Digestioacuten de
muestras Tipo II 10 Producto sin digerir Tipo III 11-13 Digestioacuten de muestras Tipo III
14 Marcador de peso 100 pb (B) Gel de RFLPs con la enzima Bsp143I con una muestra
del Tipo I y II de Sss 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir del Tipo II 3 Sin
muestra 4 Digestioacuten de muestra Tipo I 5 Digestioacuten de muestra Tipo II 6 Marcador de
peso 100 pb Con flechas se marcan los productos digeridos que presentan resolucioacuten
apropiada en geles de agarosa al 25
A B
84
5 Artiacuteculo 2 Variabilidad geneacutetica de los ARN 2 y 3 de aislamientos
Colombianos de PMTV
Genetic variability of RNA 2 and 3 in Colombian isolates of PMTV
Ineacutes Osorio Giraldo1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
1 Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Facultad de Ciencias Universidad Nacional
de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia 2
Laboratorio de Microbiologiacutea Industrial
Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia
Formato de la Revista Agronomiacutea Mesoamericana ISSN 1021-7444
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
El PMTV es un virus prevalente en los cultivos de papa de los Andes Sin embargo en esta
regioacuten es muy bajo el conocimiento de su biologiacutea patogenicidad y diversidad Con el fin
de suplir la falta de informacioacuten sobre este uacuteltimo aspecto en esta investigacioacuten se
obtuvieron secuencias de los genes de la caacutepside viral (CP) y del TGB2 de cepas de PMTV
de los cuatro principales departamentos cultivadores de papa en Colombia Adicionalmente
dos de los aislamientos fueron secuenciados en gt83 de sus ARN 2 y 3 Los anaacutelisis
filogeneacuteticos basados en CP indicaron la presencia de dos clados El primero contiene cepas
de referencia mundial de PMTV en conjunto con 19 de las cepas de este estudio mientras
que el segundo clado soacutelo agrupoacute cepas de Colombia las que compartieron menos de 76
de identidad con el primer grupo Esto posiblemente indica la ocurrencia de una nueva
especie de pomovirus aunque se requiere la secuenciacioacuten de todo el genoma para
confirmar dicha hipoacutetesis taxonoacutemica El anaacutelisis del TGB2 generoacute un solo clado
agrupando indistintamente las cepas colombianas de PMTV con las de otros paiacuteses El
anaacutelisis de los segmentos 2 y 3 del genoma viral indicoacute que los aislamientos colombianos
compartiacutean gt94 de identidad con las secuencias de cepas de Repuacuteblica Checa y Suecia
85
Se espera que estos hallazgos sean utilizados para el disentildeo de herramientas de diagnoacutestico
del PMTV en los Andes que apoyen los programas de certificacioacuten de tubeacuterculo-semilla y
mejoramiento geneacutetico de papa
Palabras clave Potato mop-top virus RT-PCR Secuenciacioacuten Solanum tuberosum
Abstract
PMTV is a prevalent virus in potato crops in the Andes However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words Potato mop-top virus RT-PCR Sequencing Solanum tuberosum
86
INTRODUCCIOacuteN
El Potato mop-top virus (PMTV) es la especie tipo del geacutenero Pomovirus y recientemente
se ha clasificado en la nueva familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Su rango de
hospedantes incluye un nuacutemero limitado de especies vegetales de las familias Solanaceae y
Chenopodiaceae siendo la papa (Solanum tuberosum L) su principal hospedante desde el
punto de vista econoacutemico (Kirk 2008) Es transmitido por tubeacuterculo semilla infectado y
por zoosporas del plasmodiofoacuterido Spongospora subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp
subterranea Tomlinson (Sss) agente causal de la sarna polvosa de la papa (Harrison y
Jones 1970) Su presencia se ha registrado principalmente en regiones con climas huacutemedos
y friacuteos como el Norte de Europa (Noruega Suecia Dinamarca y Finlandia) las islas
Britaacutenicas (Irlanda Inglaterra Escocia) Norte Ameacuterica (EEUU y Canadaacute) Japoacuten las zonas
montantildeosas de Costa Rica y los Andes Surameacutericanos (Peruacute Colombia Bolivia) (Xu et al
2004 Salazar 2006 Montero-Astuacutea et al 2008 Nakayama et al 2010 Santala et al
2010) A pesar de que se considera que el PMTV es originario de los Andes su presencia
en Colombia soacutelo fue detectada en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) y reconfirmada con base en
anaacutelisis de secuencias de la caacutepside viral (CP) y el segundo gen del triple bloque (TGB2) en
2011 (Gil et al 2011) Este virus puede causar peacuterdidas de hasta 26 en el rendimiento del
cultivo de la papa lo que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera
ascender a rangos de 50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 2000) Sin
embargo dichos niveles de peacuterdidas dependen de la susceptibilidad de las variedades
cultivadas (Xu et al 2004 Santala et al 2010) las variantes del patoacutegeno (Harrison y
Jones 1970 Nielsen y Nicolaisen 2003) y fundamentalmente de las condiciones
medioambientales prevalentes durante su infeccioacuten (Davey 2009 Latvala-Kilby et al
2009 Roos et al 2011)
El PMTV es un virus tripartita con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20 nm en diaacutemetro y
longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm Cada partiacutecula contiene una moleacutecula
de ARN de cadena sencilla con polaridad positiva (ARNss+) con tamantildeos de 6043 nt (ARN
1) 3134 nt (ARN 2) y 2964 nt (ARN 3) El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene
motivos de metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del
codoacuten de finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999 2003) El
87
ARN 2 contiene un ORF para la proteiacutena de la caacutepside de 20 kDa Tambieacuten codifica para
una proteiacutena de 90 kDa generada por lectura continua (readthrough CP-RT) gracias a la
presencia de un codoacuten de finalizacioacuten amber en el gen CP Diversos estudios han indicado
que esta proteiacutena RT esta involucrada en la transmisioacuten por Sss del PMTV siendo incluso
posible su localizacioacuten asociada con los extremos de las partiacuteculas virales mediante
anaacutelisis de inmuno-marcaje (Cowan et al 1997) En este sentido Torrance et al (1999)
demostraron que una delecioacuten de 109 nt en el extremo 3acute de las secuencias del dominio CP-
RT de aislamientos de PMTV de Escocia estaban asociadas con su imposibilidad de
transmisioacuten por Sss
El ARN 3 codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Los
primeros tres presentan secuencias similares a proteiacutenas del triple bloque de genes (TGB)
involucradas en el movimiento de ceacutelula a ceacutelula de algunos virus de plantas Las TGBs de
los pomovirus hacen parte de la clase 1 o grupo hordei de estas proteiacutenas en conjunto con
las codificadas por otros geacuteneros de la familia Virgaviridae y del geacutenero Hordeivirus Se
cree que TGB2 y TGB3 asisten a TGB1 en su funcioacuten de trasportar el genoma viral a traveacutes
de los plasmodesmos de las ceacutelulas vegetales (Lim et al 2008 2009) Recientemente se
encontroacute mediante fusioacuten de la regioacuten N-terminal de TGB1 con la proteiacutena verde
fluorescente (GFP por sus siglas en ingleacutes) que TGB1 se localizaba en la regioacuten nucleolar
y de microtuacutebulos infirieacutendose ademaacutes que aparentemente esta proteiacutena interactuacutea con los
factores de transcripcioacuten del hospedante (Wright et al 2010)
La cuarta proteiacutena (8 kDa) es rica en cisteiacutena (CRP) y aparentemente esta involucrada en el
movimiento sisteacutemico del PMTV en las plantas y en la expresioacuten de siacutentomas necroacuteticos en
hospedantes experimentales Interesantemente otros pomovirus no codifican para una
proteiacutena 8 kDa como la presente en PMTV y sus niveles de identidad con CRPs presentes
en otros geacuteneros como Hordeivirus Tobravirus y Furovirus son muy bajos (Lukhovitskaya
et al 2005)
Los siacutentomas que causa PMTV en papa se manifiestan por agrietamientos en la superficie
de los tubeacuterculos pudiendo estar acompantildeados por la presencia de anillos necroacuteticos en la
88
corteza o incluso la parte interna del mismo siacutentoma conocido como umlSprainguml (Calvert y
Harrison 1966) En las hojas de las plantas infectadas se puede observar un moteado en
forma de V tipo ldquoaucubardquo ademaacutes de la distorsioacuten del follaje y el acortamiento de los
entrenudos (umlmop-topuml) (Carnegie et al 2009) En la regioacuten Andina no es frecuente
observar la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos ni los moteados tipo umlaucubauml lo que no
permite asociar siacutentomas especiacuteficos con la presencia de PMTV situacioacuten que explica en
buena parte el porqueacute del desconocimiento de su efecto sobre las variedades sembradas en
esta regioacuten suramericana (Tenorio et al 2006 Gil et al 2011) Sin embargo seguacuten Salazar
(2006) el PMTV es uno de los virus prevalentes en el cultivo de la papa en los Andes
Adicionalmente a las caracteriacutesticas criacutepticas del PMTV existen dificultades teacutecnicas para
el diagnoacutestico de este virus debido a su distribucioacuten erraacutetica en las plantas que incluso
puede diferir entre yemas y brotes del mismo tubeacuterculo infectado y a los bajos tiacutetulos
virales que se encuentran en el tejido foliar Esto conduce a la generacioacuten de falsos
negativos por diferentes teacutecnicas de diagnoacutestico (Cerovska et al 2003 Kirk 2008) Dichas
teacutecnicas incluyen la observacioacuten visual de siacutentomas bioensayos con plantas indicadoras
como Chenopodium amaranticolor Nicotiana benthamiana N debneyi y N tabacum
(Jeffries 1998) que requieren largos periodos de tiempo para su lectura pruebas de ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay) con anticuerpos mono y policlonales (Torrance et
al 1993 Cerovska et al 2003) RT-PCR IC RT-PCR y qRT-PCR con cebadores
especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del genoma viral (Arif et al 1995 Mumford et
al 2000 Latvala-Kilby et al 2009 Davey 2009) Asiacute mismo se han empleado otras
teacutecnicas basadas en hibridizacioacuten especiacutefica (Ryazantsev y Zavriev 2009) y microplacas de
hibridizacioacuten con RT-PCR (Nakayama et al 2010) para la deteccioacuten de PMTV
En Colombia Gil et al (2011) utilizaron la teacutecnica de RT-PCR con los cebadores
PMTVF4-PMTVR4 y H360-C819 dirigidos a los genes TGB2 y CP respectivamente para
la deteccioacuten del virus en los principales departamentos productores de papa del paiacutes sin
embargo utilizaron un muy bajo nuacutemero de aislamientos virales Maacutes recientemente Gallo
(2012) obtuvo anticuerpos policlonales dirigidos a peacuteptidos sinteacuteticos con alta capacidad
89
inmunogeacutenica identificados a partir de la modelacioacuten de la caacutepside viral de aislamientos
colombianos de PMTV probando su efectividad en pruebas de ELISA y Dot-blot
A pesar de que aparentemente existe una amplia gama de teacutecnicas para la deteccioacuten del
PMTV eacutestas presentan la limitacioacuten de estar basadas en un bajo nuacutemero de aislamientos
virales especialmente del Norte de Europa (Latvala-Kilby et al 2009) siendo auacuten menor el
nuacutemero de cepas andinas para las que existen secuencias disponibles en las bases de datos
moleculares o cuyos viriones han sido purificados para la generacioacuten de pruebas
seroloacutegicas (Gil et al 2011)
A nivel mundial se ha reportado la presencia de bajos niveles de variacioacuten entre genotipos
de PMTV (Mayo et al 1996 Santala et al 2010) Latvala-Kilby et al (2009) comparando
secuencias de CP de 23 aislamientos de Finlandia y Letonia con respecto a secuencias
disponibles en GenBank para cepas de Escocia Dinamarca Suecia y Repuacuteblica Checa
encontraron identidades superiores al 98 entre eacutestas con soacutelo siete diferencias a nivel de
aminoaacutecidos (aa) entre todas las comparaciones Las evaluaciones de secuencias de CP-RT
tambieacuten presentaron altos niveles de identidad (98 a 100) aunque en este caso 24
posiciones en las secuencias de aa fueron variables Resultados similares reportaron Mayo
et al (1996) cuando compararon las secuencias de CP de tres aislamientos de Escocia y
ocho de Peruacute mientras que Xu et al (2004) encontraron que seis de las secuencias de CP
de aislamientos de PMTV de Norteameacuterica presentaron identidades superiores al 97 con
respecto a secuencias de aislamientos de diferentes paiacuteses de Europa A pesar de estos bajos
niveles de variacioacuten cuando se realizan anaacutelisis filogeneacuteticos con dichas secuencias se han
encontrado dos clados que dividen los aislamientos de PMTV y que pueden ser
identificados por anaacutelisis de RFLPs (Nielsen y Nicolaisen 2003) Sin embargo dichos
grupos aparentemente no estaacuten relacionados con diferencias en sus niveles de
patogenicidad sobre variedades de papa (Latvala-Kilby et al 2009)
En Colombia Veacutelez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo que presentaba altos niveles de identidad con
respecto a aislamientos de Europa y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por
90
aislamientos colombianos Esta situacioacuten fue confirmada posteriormente por Gil et al
(2011) quienes encontraron que las variantes de PMTV tan soacutelo presentaban un 76 y
86 de identidad para CP y TGB2 respectivamente con respecto a los aislamientos
mundialmente reportados de PMTV Sin embargo dichos anaacutelisis fueron conducidos con un
bajo nuacutemero de secuencias (cuatro para CP y tres para TGB2) debido a las dificultades
experimentales que representa el trabajo con este virus (bajo tiacutetulo en plantas de papa
distribucioacuten erraacutetica ausencia de cebadores especiacuteficos para cepas andinas etc)
Por lo anterior esta investigacioacuten se planteoacute con el propoacutesito de ampliar el nuacutemero de
secuencias de CP y TGB2 de aislamientos de PMTV obtenidos en diferentes regiones
cultivadoras de papa de Colombia de manera que fuera posible determinar si la presencia de
las variantes de este virus corresponde a una situacioacuten generalizada o por el contrario responde
al efecto de muestra dado el bajo nuacutemero de cepas analizadas por Veacutelez (2007) y Gil et al
(2011) Adicionalmente se realizoacute la secuenciacioacuten de una gran parte del ARN 2 y ARN 3 de
una cepa obtenida en el Departamento de Antioquia y otra en el Departamento de Boyacaacute
(Colombia) realizaacutendose un anaacutelisis de variacioacuten con respecto a las secuencias de referencia de
genomas completos disponibles en las bases de datos moleculares
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y preparacioacuten de muestras
Se obtuvieron muestras de raiacuteces y tubeacuterculos de papa con siacutentomas de sarna polvosa asiacute
como de suelos de lotes con reportes de la presencia de Sss en las zonas productoras de
papa de los municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio
Subachoque y Villapinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute y Oicataacute (Boyacaacute) y
Pasto e Ipiales (Narintildeo) Para la separacioacuten de los quistosoros del suelo se siguioacute la
metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la cual las muestras de suelo (500g) son
pasadas por un juego de tamices de 100 y 25 microm Los quistosoros obtenidos fueron
inoculados en Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo
para incrementar el inoacuteculo de PMTV a partir de la infeccioacuten de su vector Sss (Veacutelez
2007) El material vegetal fue mantenido en casa de malla en el Centro Experimental
91
Paysanduacute ubicado en el corregimiento de Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB
2550 msnm temperatura media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) Tres
meses despueacutes de la siembra se recolectaron las hojas y las raiacuteces de las plantas sentildeuelo
para su procesamiento en el laboratorio
Secuenciacioacuten de CP y TGB2
Se obtuvo el ARN total de plantas de N benthamiana y S phureja mediante el kit RNeasy
plant mini (Qiagen EEUU) a partir de 100 mg de tejido utilizando 450 μL de buffer RLT
para tejido foliar o RLC para raiacuteces y 45 μL de β-mercaptoetanol y siguiendo las
instrucciones del fabricante Al finalizar el procedimiento el ARN obtenido se eluyoacute en 40
μL de agua destilada esteacuteril tratada con DEPC
Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos En las reacciones de
retrotranscripcioacuten se utilizoacute un volumen final de 20 microL incluyendo 05 microL de agua
destilada esteacuteril 15 microL de PBST (05) 4 microL de buffer RT (5X) 4 microL de MgCl2 (25
mM) 2 microL de dNTPs (10 mM) 2 microL de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de
ARNasas (40UmicroL) 05 microL de enzima M-MuLV Transcriptasa Reversa (20 UmicroL)
(Fermentas Lituania) y 5 microL de ARN o alternativamente una dilucioacuten 15 El programa de
RT fue de 37degC por 60 min seguido de 70degC por 10 min para inactivar la enzima Las
muestras se almacenaron a 4degC hasta su uso posterior
Para las reacciones de PCR se emplearon los cebadores especiacuteficos H360 (5rsquo CAT GAA
GGC TGC CGT GAG GAA GT 3rsquo) y C819 (5rsquo CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA
CC-3rsquo) (MacKenzie 1996) para amplificar una regioacuten de 459 pb del gen CP entre las
posiciones 385 y 844 del genoma viral (Figura 51) y PMTVF4 (5rsquo CAG CAA CCA CAA
ACA GAC AGG 3rsquo) y PMTVR4 (5rsquo AGC CAC TAA CAA AAC ATACTGC 3rsquo) para
obtener amplicones de 415 pb del TGB2 entre las posiciones 1726 y 2141 del ARN 2 (Xu
et al 2004) (Figura 52) Para algunos aislamientos en los que se dificultaba la
amplificacioacuten del TGB2 se utilizaron los cebadores PMTV5 (5 GGT GAA CAC GAG
GAC AAG GT 3) y PMTV7 (5 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 3) (Lambert et al
2003) que amplifican un fragmento de 646 pb y se extienden entre las posiciones del
92
genoma 1417 a 2063 Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 microL
incluyendo 158 microL de agua destilada esteacuteril 25 microL de buffer de enzima (10X) 18 microL de
MgCl2 (25 mM) 05 microL de dNTPs (10 mM) 05 microL de cada cebador (10 microM) 02 microL de
Albuacutemina de suero bovino (20 mgml) (Fermentas) 02 microL de Taq ADN polimerasa (5
UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ADNc aunque en algunas ocasiones dada la falta de
amplicones fue necesario preparar diluciones de 15 110 o 125 de ADNc Las
amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra Alemania) y consistieron
de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 40 ciclos de 94degC por 30 s
53degC por 45 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10 min Luego de
la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se separaron por
electroforesis en gel de agarosa al 15 suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) y
su tamantildeo se verificoacute por comparacioacuten con el marcador de peso molecular Generuler 100
pb DNA ladder (Fermentas)
Los amplicones del tamantildeo esperado correspondientes al menos a cuatro aislamientos
representativos de cultivos de papa de cada uno de los cuatro departamentos bajo estudio
fueron purificados del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para realizar
su secuenciacioacuten directa en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores empleados en
la PCR y el kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied
Biosystems EEUU) Su corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism
3730xl (PE Applied Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur)
A partir de las secuencias obtenidas con cada cebador se construyeron las secuencias
consenso mediante el software BioEdit 606 (Hall 1999) y Chromas Lite (Technelysium
2009) Posteriormente se confirmoacute su origen viral por comparacioacuten con las bases de datos
moleculares con el programa BLASTn (httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) y
se obtuvieron secuencias de PMTV del GenBank de otras regiones del mundo para realizar
un anaacutelisis filogeneacutetico Para esto se generoacute un alineamiento mediante Clustal W (Larkin et
al 2007) del Software Bioedit 606 Los alineamientos fueron utilizados para construir una
una matriz de distancia geneacutetica utilizando el meacutetodo de Maacutexima verosimilitud basado en
el modelo de Tamura-Nei (1993) implementado en el software MEGA v40 (Tamura et al
93
2007) Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute un anaacutelisis de
Bootstrap con 1000 remuestreos (Felsenstein 1985)
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Con el fin de obtener un mayor nivel de informacioacuten sobre las caracteriacutesticas de los
segmentos ARN 2 y ARN 3 del genoma de aislamientos Colombianos de PMTV se realizoacute
un proceso de secuenciacioacuten con minado de cebadores previamente reportados para la
amplificacioacuten de diferentes regiones de cada uno de dichos segmentos (Tabla 51 Figura
53) y buscando que generaran traslape de secuencias de manera que fuera posible la
construccioacuten de un contig general para cada segmento Para esto se seleccionaron cuatro
cepas de PMTV representativas de cada uno de los departamentos bajo anaacutelisis Con cada
cepa se realizaron por lo menos dos amplificaciones con cada cebador de manera que las
secuencias reportadas correspondieran al consenso para cada amplicoacuten Los procedimientos
de extraccioacuten de ARN PCR y secuenciacioacuten fueron similares a los descritos anteriormente
aunque las RT se realizaron con la enzima Transcriptasa Reversa Maximareg (Fermentas)
que ofrece mayores niveles de estabilidad teacutermica (hasta 65degC) y eficiencia que las
transcriptasas reversas convencionales En este caso las reacciones de RT consistieron de
95 microL de agua libre de nucleasas 4 microL de buffer RT (5X) 1 microL de dNTPs (10 mM) 1 microL
de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de ARNasas (40UmicroL) 1 microL de enzima
Transcriptasa Reversa Maximareg (200 UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ARN para un volumen
final de 20 microL La incubacioacuten se realizoacute a 50degC por 30 min y la enzima se inactivoacute a 85degC
por 5 min
Las secuencias se editaron mediante el software Chromas Lite generaacutendose los consensos
con ambos cebadores usando el programa Bioedit 606 y se procedioacute al ensamblaje de los
contigs resultantes utilizando el programa CAP3 (Huang y Madan 1999) Posteriormente
se verificoacute el marco de lectura correcto utilizando el servidor de Expasy (Expasy Proteomic
Server httpwwwexpasychtoolsdnahtml) y se realizoacute su alineamiento con respecto a
los dos segmentos genoacutemicos de aislamientos cuyas secuencias completas se encontraban
disponibles en GenBank (DQ102381 DQ144451 AJ243719 AJ277556) (Sandgren et al
2001 Cerovska et al 2007)
94
Finalmente las secuencias de nt fueron traducidas a aa realizaacutendose comparaciones de
porcentajes de identidad y nuacutemero de posiciones variables a lo largo de las regiones bajo
estudio y generaacutendose aacuterboles filogeneacuteticos basados en los contigs obtenidos en la
investigacioacuten mediante el programa Mega v 40 bajo los paraacutemetros antes descritos
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Variabilidad geneacutetica de PMTV de Colombia
En total se obtuvieron 25 secuencias para la regioacuten amplificada de CP y 38 secuencias para
TGB2 Estas secuencias correspondieron a por lo menos cuatro aislamientos por cada
departamento bajo anaacutelisis (Tabla 52) De esta forma se aumentaron las secuencias
parciales de los genes CP y TGB2 de PMTV con respecto al trabajo reciente realizado por
nuestro grupo (Gil et al 2011) en donde soacutelo se obtuvieron cuatro y tres secuencias para
CP y TGB2 lo cual implica que las diferentes modificaciones realizadas a los
procedimientos necesarios para el estudio de este virus desde la forma de obtencioacuten de las
muestras hasta la purificacioacuten de los amplicones pasando por la eliminacioacuten de inhibidores
de las polimerasas resultaron altamente eficientes Esta situacioacuten abre la posibilidad de
plantear en el futuro proacuteximo un estudio de incidencia de PMTV basado en la deteccioacuten del
virus mediante RT-PCR con un muestreo estratificado en los diferentes pisos teacutermicos
donde se cultiva la papa en Colombia y realizando comparaciones con respecto a los
niveles de incidencia de Sss de manera que sea posible determinar la dimensioacuten de los
niveles de dispersioacuten de este virus en este paiacutes suramericano Un trabajo similar fue
realizado por Montero-Astuacutea et al (2008) en Costa Rica pero utilizando pruebas de ELISA
tanto para la deteccioacuten de Sss como de PMTV En este caso se encontroacute que el virus era
maacutes frecuentemente detectado en las regiones con mayores altitudes donde las condiciones
de alta humedad y bajas temperaturas aparentemente favorecen su infeccioacuten Sin embargo
es probable que la utilizacioacuten de pruebas de ELISA para la deteccioacuten del virus haya
conducido a una subestimacioacuten de los niveles de incidencia detectados en dicho trabajo
pues la distribucioacuten erraacutetica del virus su capacidad de movimiento ceacutelula-ceacutelula con ayuda
de proteiacutenas de movimiento codificadas por el TGB y no necesariamente en su forma
95
encapsidada y la utilizacioacuten de anticuerpos disentildeados a partir de cepas del norte de Europa
pueden influir negativamente en la deteccioacuten seroloacutegica del PMTV (Gallo et al 2012)
El anaacutelisis filogeneacutetico para CP incluyoacute 404 posiciones a partir de 46 secuencias 15 de las
cuales corresponden a aislamientos de referencia de Europa Asia y Norte Ameacuterica y las 4
previamente reportadas de aislamientos Colombianos por Gil et al (2011) El dendrograma
presentoacute dos grupos soportados por valores de bootstrap del 100 (Figura 54) El primer
clado agrupoacute todas las secuencias de referencia con 19 de los aislamientos Colombianos
obtenidos en este estudio y presentaron niveles de identidad superiores al 99 en todos los
casos (Tabla 53) Por otra parte el segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo seis de las aquiacute obtenidas y dos de las reportadas por Gil et
al (2011) Al interior de este clado se presentaron mayores niveles de variacioacuten (11 a
13) y su identidad con respecto a los miembros del primer clado fue de tan solo 76 La
secuencia de Beet Soil-Borne Virus de China utilizada como grupo externo de anaacutelisis se
ubicoacute en posicioacuten externa a los dos clados y compartioacute niveles de identidad inferiores al
59 con respecto a los aislamientos de PMTV
Estos resultados confirman los hallazgos de Veacutelez (2007) y Gil et al (2011) en referencia a
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que incluso bajo los paraacutemetros
definidos por Adams et al (2009) para la definicioacuten de especies al interior de la familia
Virgaviridae (ej cepas con identidades superiores a 80 y 90 a nivel de secuencias de CP
y del genoma completo respectivamente) podriacutea representar una nueva especie del geacutenero
Pomovirus (Familia Virgaviridae) hasta ahora no registrada en otros lugares del mundo Si
se considera que seis de las 25 secuencias de CP obtenidas en este trabajo correspondieron
a dicha variante es evidente que su presencia no es marginal en los cultivos de papa de
Colombia ya que para la muestra obtenida aunque evidentemente sesgada por la coleccioacuten
de suelos y tejidos con presencia de estructuras de Sss su proporcioacuten es del 23 La
diversidad entre aislamientos podriacutea deberse a que la regioacuten andina ha sido propuesta como
el centro de origen del PMTV (Mayo et al 1996)
96
Estos resultados representan un viraje con respecto a lo encontrado en los estudios de
variabilidad de PMTV con base en secuencias de CP de diferentes oriacutegenes geograacuteficos
por cuanto indistintamente se habiacutea encontrado que los niveles de identidad presentes en
este gen superaban el 98 en todas las comparaciones establecidas Asiacute por ejemplo
Latvala-Kirby et al (2009) al comparar 28 secuencias de Finlandia Letonia Escocia
Dinamarca Repuacuteblica Checa y Suecia encontraron que casi todas eran ideacutenticas siendo tan
soacutelo detectado un 2 de variacioacuten entre las maacutes distantes lo cual representa cambios en tan
soacutelo siete posiciones a nivel de la secuencia de aa de la proteiacutena resultante Similarmente
Xu et al (2004) reportaron que aislamientos de PMTV de Estados Unidos y Canadaacute eran
ideacutenticos y que eacutestos a su vez tan soacutelo diferiacutean en maacuteximo 3 de sus secuencias de CP con
respecto a cepas de Peruacute (Mayo et al 1996) Escocia y Escandinavia (Reavy et al 1997)
De esta forma de gran intereacutes resultaraacute emprender estudios que permitan evaluar las
diferencias bioloacutegicas de dichas variantes de PMTV sobre distintas variedades de papa e
incluso sobre hospedantes experimentales debido a que siacute existen diferencias de
patogenicidad entre aislamientos de PMTV que presentan tan bajos niveles de variacioacuten
(Nielsen y Nicolaisen 2003) es posible que dicho efecto sea auacuten mayor cuando se evaluacuteen
las variantes aquiacute reportadas
Con respecto al anaacutelisis filogeneacutetico basado en las secuencias de TGB2 se incluyeron 330
posiciones de 49 secuencias siete de las cuales fueron de aislamientos de referencia de
diferentes paiacuteses y tres de Colombia previamente analizadas por Gil et al (2011) El
dendrograma generado presentoacute un solo clado que incluyoacute todas las secuencias (Figura
55) las que compartieron niveles de identidad superiores a 98 (Tabla 54) Estos
resultados son un indicativo de que la variacioacuten encontrada entre aislamientos Colombianos
con respecto a CP no necesariamente se presentan a lo largo de los diferentes segmentos
genoacutemicos de PMTV y especiacuteficamente no se ven reflejadas en las secuencias de TGB2
que en los pocos estudios donde se ha secuenciado presenta niveles de identidad superiores
a 948 e incluso se ha encontrado que aislamientos de oriacutegenes geograacuteficos diferentes
pueden compartir hasta el 100 de identidad en la secuencia de aa para este gen (ej
aislamiento Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa y aislamientos 54-15 y 54-19 de
Dinamarca) (Cerovska et al 2007) Los altos niveles de conservacioacuten de este gen entre
97
aislamientos de PMTV que presentan diferencias en otras regiones del genoma como las
aquiacute encontradas para CP posibilitan que los cebadores utilizados para su amplificacioacuten
sean una herramienta uacutetil para el diagnoacutestico de este virus Asiacute por ejemplo Lambert et al
(2003) disentildearon los cebadores PMTV5 y PMTV7 dirigidos a amplificar una regioacuten de 646
pb comprendida entre TGB1 y TGB2 cuando reportaron por primera vez la presencia del
PMTV en EEUU Posteriormente Xu et al (2004) utilizaron la regioacuten que codifica para
TGB2 para el disentildeo de los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 en su estudio de evaluacioacuten de
distribucioacuten de PMTV en EEUU y Canadaacute
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Todos los cebadores utilizados en las reacciones de RT-PCR para amplificar diferentes
regiones de los ARN 2 y 3 del genoma de PMTV generaron los amplicones del fragmento
esperado en al menos un aislamiento evaluado Sin embargo en los aislamientos de Narintildeo
y Cundinamarca no fue posible la obtencioacuten de un contig completo para toda la regioacuten
secuenciada de ambos segmentos auacuten luego de diferentes intentos y modificaciones de los
paraacutemetros de la RT-PCR De esta forma para el caso de los aislamientos de Narintildeo no se
lograron amplicones del ARN2 con los cebadores PMTV759 ndash PMTV1552R PMTV759F
ndash 2017R y 1948F ndash 123end para el ARN 3 no fue posible obtener fragmentos con
RNA3F1ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end y F388 ndash PMTV7 Para el caso de
Cundinamarca no se lograron amplicones para el ARN 2 con PMTV759 ndash PMTV1552R y
PMTV759F ndash 2017R y para ARN 3 con RNA3F1 ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end
F388-PMTV7 Considerando que las variantes detectadas mediante la secuenciacioacuten de una
porcioacuten de CP presentaron bajos niveles de identidad con respecto a los genotipos
globalmente distribuidos de PMTV es posible que la ausencia de amplificacioacuten se deba a
diferencias en los sitios de reconocimiento de uno o ambos cebadores situacioacuten que impide
la amplificacioacuten de los fragmentos respectivos y por tanto su secuenciacioacuten posterior De
gran intereacutes seraacute continuar el proceso de secuenciacioacuten de dichas variantes para lo cual es
necesario la clonacioacuten de los respectivos cDNAs de cada segmento y el disentildeo de nuevos
cebadores especiacuteficos que permitan completar los vaciacuteos (gaps)
98
Por las razones antes expuestas para los anaacutelisis de secuencias de ARN2 y 3 soacutelo se
incluyeron los aislamientos representativos de Antioquia (Ant) y Boyacaacute (Boy) (Tabla
55) Para el ARN 2 se obtuvieron contigs de 2577 nt y 2584 para los aislamientos
Antioquia y Boyacaacute mientras que para el ARN 3 los contigs tuvieron una extensioacuten de
2617 y 2360 nt respectivamente Esto implica que para el ARN 2 se obtuvo un porcentaje
de cobertura del 83 de este segmento genoacutemico y del 87 para el ARN 3 en
comparacioacuten con el aislamiento Sw de PMTV (AJ243719 y AJ277556) (Sandgren et al
2001) En teacuterminos de aa los contigs del ARN2 incluyeron 150 de los aa de CP (posiciones
26 a 176) y 799 de CP-RT (posiciones 26 a 825) Para el ARN 3 se obtuvo la secuencia
completa de aa de TGB1 (463 aa) y TGB2 (119 aa) asiacute como 146 de 190 aa de TGB3
(posiciones 1 a 146) para el aislamiento de Boyacaacute y la totalidad de dicha proteiacutena para la
cepa de Antioquia Las demaacutes secuencias obtenidas corresponden a regiones UTR de los
extremos 3acute para el ARN 2 y 5acute para el ARN 3
Con el fin de realizar un anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las dos cepas obtenidas
con respecto al genoma de la cepa de PMTV de Suecia ndash Sw cuyo genoma completo estaacute
depositado en GenBank bajo el coacutedigo PRJNA14789 (Savenkov et al 1999 Sandgren et
al 2001) se incluyeron 1956 nt (651 aa) para CP-RT 531 nt (176 aa) para CP y 1392 (463
aa) para las tres regiones del TGB En teacuterminos generales se encontraron muy altos niveles
de identidad en las tres regiones analizadas siendo la CP la maacutes uniforme con 99 en la
secuencia de nt y 100 en aa para las tres cepas CP-RT presentoacute un nivel de identidad
para nt de 994 entre las cepas de Antioquia y Boyacaacute y del 975 - 976 con respecto a
la secuencia de referencia mientras que estos valores fueron superiores al 982 cuando se
comparoacute la secuencia de aa Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos compartieron
un 999 de identidad en nt y aa (Figura 56) Las pocas diferencias a nivel de aa
encontradas en este estudio correspondieron a cambios en 15 posiciones para el producto
del ARN 2 siendo la maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la posicioacuten 81
de CP Para el caso de TGB se encontraron 10 cambios a lo largo de las tres proteiacutenas
analizadas con la presencia de una delecioacuten en la posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
99
Por otra parte el anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2569 nt para ARN 2 con
secuencias de referencia de los aislamientos Corneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia (Figura 57) arrojoacute un dendrograma con dos
clados soportados por 100 de bootstrap separaacutendose los aislamientos de Colombia de los
de Europa sin embargo los niveles de identidad entre ambos grupos fueron muy altos
(gt975) (Tabla 56) Al calcular los niveles de diversidad (promedio del nuacutemero de
sustituciones de nucleoacutetidos por cada sitio) para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos
(dNS) se encontroacute una diversidad muy baja con tan soacutelo 0017 (SE= 0003) para dNS y
0009 (SE=0002) para dS La relacioacuten promedia entre dNSdS fue de 18 lo cual indica
que las cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten positiva para este componente del
genoma Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 3 mientras que para las
europeas fue de 12 La distancia geneacutetica o nuacutemero de sustituciones promedio por sitio
basada en el meacutetodo de Kimura-2 paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0015
El anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de
referencia de los aislamientos Korneta-Nemilkov (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia generoacute
un dendrograma con dos clados de aislamientos europeos mientras que los aislamientos
Colombianos se presentaron en forma individual sobre ramas soportadas por 100 de
bootstrap (Figura 58) A pesar de dichas agrupaciones los niveles de identidad entre todos
los aislamientos fueron superiores a 967 (Tabla 57) Al calcular los niveles de
diversidad para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos (dNS) se encontroacute una diversidad
muy baja para todos los aislamientos con tan soacutelo 0011 (SE= 0002) para dNS y 0044
(SE=0006) para dNS La relacioacuten media entre dNSdS fue de 025 lo cual indica que las
cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten estabilizadora en dicho segmento de ARN
Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 019 mientras que para los
aislamientos europeos fue de 039 La distancia geneacutetica basada en el meacutetodo de Kimura -2
paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0020 (SE 0002)
Los bajos niveles de variacioacuten encontrados en los anaacutelisis de genomas de PMTV (Savenkov
et al 1999 Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) y que nuevamente fueron inferidos
100
en el presente estudio para las cepas del clado que representa PMTV sensu stricto indican
que este virus se encuentra bajo fuertes presiones de seleccioacuten determinadas
presumiblemente por las propias caracteriacutesticas de su genoma el estrecho rango de
hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica por parte de su vector Sss (Kirk
2008 Santala et al 2010)
Para el primer caso la restriccioacuten selectiva se manifiesta por los bajos valores de dNSdS
calculados para dicho segmento y ocurre fundamentalmente al presentarse traslape de genes
en el ARN 3 Sin embargo para el ARN 2 dicha relacioacuten fue gt1 lo cual sugiere una
seleccioacuten positiva que puede explicarse por el hecho que este segmento presenta la
estrategia de supresioacuten del codoacuten de parada tipo amber para la traduccioacuten de las dos
proteiacutenas codificantes (CP y CP-RT) lo cual supone menos restricciones para la fijacioacuten de
mutaciones De otra parte la presencia de un estrecho rango de hospedantes para el virus
que se restringe a algunas especies de las familias Solanaceae y Chenopodiaceae (Kirk
2008) aunada a su transmisioacuten por Sss supone fuertes restricciones sobre los cambios en
las diferentes proteiacutenas del virus que interactuacutean con sus hospedantes y vectores lo cual
impide altas tasas de variacioacuten tales como las que presentan otros virus de ARNss(+) como
los potyvirus que en general tienen amplios rangos de hospedantes y cuya transmisioacuten por
aacutefidos poliacutefagos es del tipo no persistente (Hu et al 2009)
A pesar de los altos valores de uniformidad general encontrados de gran intereacutes resultoacute la
presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los aislamientos
colombianos de PMTV Por esto es necesario en el futuro evaluar el significado bioloacutegico
de dichos cambios por ejemplo si estan relacionadas con el efecto de las variedades nativas
de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas que las poblaciones de Sss
tienen en las regiones Andinas donde se presentan mayores niveles de variacioacuten que en
aquellas encontradas en las regiones cultivadoras de papa del hemisferio norte tal como lo
planteoacute Carrentildeo (2009) El efecto de estas inserciones y de diferentes sustituciones
detectadas en este trabajo sobre diferentes regiones de los segmentos de ARN 2 y 3
requiere un tratamiento futuro detallado a partir de anaacutelisis de mutantes y de sus efectos
sobre el ciclo infectivo viral
101
Esta investigacioacuten representa un avance importante en la caracterizacioacuten geneacutetica del
PMTV en las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia Sus resultados
confirman la presencia de dos genotipos principales de este virus en el paiacutes uno que
representa al PMTV sensu stricto destacado por presentar muy bajos niveles de variacioacuten
entre sus cepas y otro que representa una variante hasta ahora soacutelo identificada en
Colombia y que por presentar porcentajes de identidad inferiores al 80 con respecto al
grupo principal podriacutea representar una nueva especie de pomovirus que requiere ser
evaluada bioloacutegica patogeacutenica y molecularmente Finalmente es imperativo estudiar el
efecto de ambos genotipos virales sobre la produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de
papa en Colombia de manera que los organismos de sanidad vegetal estatales gremios de
productores y agroindustrias puedan valorar la necesidad de incluir la deteccioacuten del PMTV
en los programas de certificacioacuten de semilla y de mejoramiento geneacutetico de papa que se
adelantan en el paiacutes
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz
Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el
Departamento de Narintildeo
102
BIBLIOGRAFIacuteA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Arif M Torrance L Reavy B 1995 Acquisition and transmission of Potato mop-top
furovirus by a culture of Spongospora subterranea f sp subterranea derived from a single
cystosorus Annals of Applied Biology 126493-503
Calvert E Harrison BD 1966 Potato mop-top a soil-borne virus Plant Pathology
15134ndash139
Carnegie SF Saddler GS Peters JC 2009 Cultivar susceptibility to Potato mop-top virus
(PMTV) infection and symptom expression Aspects of Applied Biology 94 (Potatoes
Viruses and their Vectors) 51ndash54
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea
fsp subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Cerovska N Moravec T Rosecka P Filigarova M Pecenkova T 2003 Nucleotide
sequences of coat protein coding regions of six potato mop-top virus isolates Acta
Virologica 4737-40
Cerovska N Pecenkova M Foligarova M Dedic P 2007 Sequence analysis of the
Czech Potato mop-top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica
5261-64
103
Cowan GH Torrance L Reavy B1997 Detection of Potato mop-top virus capsid
readthrough protein in virus particles Journal of General Virology 781779-1783
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
Scotland
Felsenstein J 1985 Confidence limits on phylogenies an approach using the bootstrap
Evolution 39(4)783-791
Gallo Y 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea en Bioquiacutemica Facultad de Medicina Universidad Nacional
de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Gil JF Gutieacuterrez P Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
Hall TA 1999 BioEdit a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis
program for Windows 9598NT Nucleic Acids Symposium Series 4195-98
Harrison BD Jones RAC 1970 Host range and some properties of Potato mop-
top virus Annals Applied Biology 65393-402
104
Hu X Karasev AV Brown CJ Lorenzen JH 2009 Sequence characteristics of potato
virus Y recombinants Journal of General Virology 903033ndash3041
Huang X Madan A 1999 CAP3 A DNA sequence assembly program Genome
Research 9868-877
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 7147-57
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Kirk HG 2008 Mop-top virus relationship to its vector American Journal of Potato
Research 85 261-265
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003
First Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease
87872
Larkin M Blackshields G Brown NP Chenna R McGettigan PA McWilliam H
Valentin F Wallace IM Wilm A Loacutepez R Thompson JD Gibson TJ Higgins DG
2007 Clustal W and Clustal X version 20 Bioinformatics 23(21)2947-2948
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99519-531
105
Lim HS Bragg J N Ganesan U Lawrence DM Yu J L Isogai M Hammond J
Jackson AO 2008 Triple gene block protein interactions involved in movement of Barley
stripe mosaic virus Journal Virology 824991-5006
Lim HS Bragg J N Ganesan U Ruzin S Schichnes D Lee MY Vaira AM Ryu KH
Hammond J Jackson AO 2009 Subcellular localization of the Barley stripe mosaic virus
triple gene block proteins Journal Virology 839432-9448
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization
and effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal
of General Virology 862879-2889
MacKenzie DJ 1996 Detection of potato mop-top virus in leaf or tuber tissue by reverse
transcription-polymerase chain reaction Document CPHBT96K03 Centre for Plant Health
Agriculture and Agri-Food Canada Sidney BC Canada
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C
Salazar LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top
virus from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
Montero-Astuacutea M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U and Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Mumford RA Walsh K Barker I Boonham N 2000 Detection of Potato mop top virus
and Tobacco rattle virus using a multiplex real-time fluorescent reverse transcription
polymerase chain reaction assay Phytopathology 90448-453
106
Nakayama T Maoka T Hataya T Shimizu M Fuwa H Tsuda S Motoyuki M 2010
Diagnosis of Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-225
Nielsen SL Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups
within Potato mop-top virus Archives of Virology 148 381-388
Reavy B Sandgren M Barker H Heino P Oxelfelt P 1997 A coat protein transgene
from a Scottish isolate of Potato mop-top virus mediates strong resistance against
Scandinavian isolates which have similar coat protein genes European Journal of Plant
Pathology 103829-834
Roos J Hopkins R Kvarnheden A Dixelius C 2011 The impact of global warming on
plant diseases and insect vectors in Sweden European Journal of Plant Pathology 1299-19
Ryazantsev DY Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato viral pathogens Molecular Biology 43515-523
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M
Wieczorek P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-
Wiśniewska J Yin Z Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E
Taluntytė L Pūpola N Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E
107
Sozonov A Tikhonovich I Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam
G Valkonen JPT 2010 Detection distribution and control of Potato mop-top virus a soil-
borne virus in northern Europe Annals of Applied Biology 157163-178
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003
Potato mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich
protein are dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of
General Virology 841001-1005
Savenkov EI Sandgren MY Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Tamura K Dudley J Nei M Kumar S 2007 MEGA4 Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) software version 40 Molecular Biology and Evolution 241596-1599
Tamura K Nei M 1993 Estimation of the number of nucleotide substitutions in the
control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Molecular Biology and
Evolution 10512-526
Technelysium 2009 Chromas 20 Consultado el 15 de Febrero de 2009 Disponible en
httpwwwtechnelysiumcomauchromas_litehtml
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Research 83423-31
Torrance L Cowan GH Pereira LG 1993 Monoclonal antibodies specicreg for Potato
mop-top virus and some properties of the coat protein Annals of Applied Biology 122311-
322
108
Torrance L Cowan GH Sokmen M A Reavy B 1999 A naturally occurring deleted
form of RNA 2 of Potato mop-top virus Journal of General Virology 802211-2215
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop-top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI
Torrance L 2010 The N-Terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required
for nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant-Microbe Interaction 23(11)1486-1497
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top
virus in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
109
51 Anexos
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb) dirigidos al
gen de la caacutepside viral de PMTV a partir de muestras de tejido de raiacutez de plantas de N
benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea del
Departamento de Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador 100 pb Carril 2 BS8T Carril 3
BS9T Carril 4 BS4T Carril 5 BS11P Carril 6BS4T Carril 7 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7
500 pb
110
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb)
dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) de PMTV a partir de muestras de tejido de
raiacutez de plantas de N benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S
subterranea de los Departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador
100 pb Carril 2-4 Control positivo (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 5-7
SRL5 (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 8-10 SRL7 (ADN directo
110150 respectivamente) Carril 11-13 BS8T (ADN directo 110150
respectivamente) Carril 1415 BS4T1 (ADN directo y 110) Carril 16 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
500 pb
111
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten de los
segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV)
Cebador Secuencia 5acute- 3 Posicioacuten en el
genoma (nt) Referencia
RNA3 F1 CGCTCGAGTTTAGGTGACACTATAGGTATTTCA
ACTCTACCTAG 1 a 388
Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003 PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
PMTVF4 CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG 1726 a 1746 Xu et al
2004
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
F388
CGGGATCCGAAGTAGACCACACAGAGTG
1 a 388 Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011 PMTV1552R GCC AAT TGT CTC AAT CAT ACA CTG 1865 a 1888
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011
2017R CCA CTG CAA AAG AAC CGA TTT C Mumford
et al 2000
1948F GTG ATC AGA TCC GCG TCC TT Mumford et al 2000
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
112
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7 (2063 pb)
PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al ARN3 del genoma
del Potato mop-top virus (PMTV) a partir de tejido de raiacutez de plantas de N benthamiana y
S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea de cuatro departamentos de
Colombia Carril 1 Marcador 100 pb plus carriles 2-5 con cebadores RNA3F1-PMTV7
SRL5 SRL6 BS9T1 BS9T2 carril 6-12 con cebadores PMTV5-PMTV7 23T 24T
SRL5 SRL6 BS4T BS8T BS9T carril 13-20 con cebadores PMTVF4-123 end Villa1
NS19P1 23T 24T SRL4 SRL5 SRL6 BS4T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1000 pb 500 pb
113
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos cultivadores de papa de
Colombia
Gen CP Gen TGB2
ANTIOQUIA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
25 La Unioacuten Suelo S tuberosum 25(1) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL4 Santa Rosa S tuberosum var Diacol Capiro 25(2) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL4 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle La Unioacuten Suelo S tuberosum SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle1 La Unioacuten Suelo S tuberosum
Valle2 La Unioacuten Suelo S tuberosum
BOYACAacute
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
BS2T Oicataacute Suelo S tuberosum BS1P1 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4P Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS1P2 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4T Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS4T1 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS8T Soracaacute Suelo S tuberosum BS4T2 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS9T Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum BS8T1 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11P Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS8T2 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11T Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS9T1 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS12P Tunja Suelo con Pennisetum clandestinum BS9T2 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS9T3 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS11T1 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS11T2 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS13P Tunja Suelo S tuberosum
CUNDINAMARCA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
CS1T Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa CS1P1 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2P Subachoque Suelo S tuberosum CS1P2 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2T Subachoque Suelo S tuberosum CS2P Subachoque Suelo S tuberosum
CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Mad Madrid Suelo S tuberosum Villa1 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
114
Villa2 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
NARINtildeO
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
NS1P Pasto Suelo S tuberosum NS3P1 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS2T Pasto Suelo S tuberosum NS3P2 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro NS3P3 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8P Pasto Suelo S tuberosum NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8PF Pasto Suelo S tuberosum
NS10T Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS19P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS19P2 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P2 Ipiales Suelo S tuberosum
115
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de Potato
mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo
Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus (China)
Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte inferior de
las ramas
116
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
BS4T
Boyacaacute
Colombia
CS1T
Cundinamarca
Colmbia
NS2T
Narintildeo
Colombia
NS6P
Narintildeo
Colombia
71MY
Cundinamarca
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AJ243719
PMTV
Suecia
EF545141
Beet Soil-
Borne
Virus
China
BS4T Boyacaacute
Colombia ID 0997 0764 0752 0762 0995 0995 0599
CS1T
Cundinamarca
Colombia
0997 ID 0764 0752 0762 0992 0992 0599
NS2T Narintildeo
Colombia 0764 0764 ID 0891 0876 0769 0769 0571
NS6P Narintildeo
Colombia 0752 0752 0891 ID 0967 0752 0752 0596
71MY
Cundinamarca
Colombia
0762 0762 0876 0967 ID 0762 0762 0599
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0995 0992 0769 0752 0762 ID 1 0594
AJ243719
PMTV Suecia 0995 0992 0769 0752 0762 1 ID 0594
EF545141 Beet
Soil-Borne
Virus China
0599 0599 0571 0596 0599 0594 0594 ID
117
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del
mundo Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus
(China) Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte
inferior de las ramas
118
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
23T
Antioquia
Colombia
NS22P1
Narintildeo
Colombia
Villa2
Cundinamarca
Colombia
DQ144451
Repuacuteblica
Checa
NC_003725
Suecia
EF545142 Beet
Soil-Borne Virus
China
23T Antioquia
Colombia ID 0981 0981 0984 0981 0699
NS22P1 Narintildeo
Colombia 0981 ID 099 0984 0981 0708
Villa2 Cundinamarca
Colombia 0981 099 ID 0987 0984 0708
DQ144451 Repuacuteblica
Checa 0984 0984 0987 ID 099 0714
NC_003725 Suecia 0981 0981 0984 099 ID 0711
EF545142 Beet Soil-
Borne Virus China 0699 0708 0708 0714 0711 ID
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato mop-top virus en cuatro
Departamentos cultivadores de papa de Colombia
Muestra Hospedante Municipio Planta sentildeuelo
Ant (23T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
La Unioacuten (Antioquia)
N benthamiana
Boy (BS4T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Siachoque
(Boyacaacute) N benthamiana
Cund(CS1T) Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
Subachoque (Cundinamarca)
N benthamiana
Nar (NS6P) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro Pasto (Narintildeo) S phureja
119
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia y Boyacaacute
(Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw Suecia A Niveles de
identidad de nucleoacutetidos y aminoaacutecidos (entre pareacutentesis) de las regiones CP CP-RT y
TGB analizadas y la cepa NC_003724 B Regioacuten CP-RT se incluyeron 1956 nt (651 aa)
para CP-RT y 531 nt (176 aa) para CP Se presentaron cambios en 15 posiciones para el
producto del ARN 2 siendo lo maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la
posicioacuten 81 de CP C Regioacuten TGB se incluyeron 1392 nt (463 aa) Se presentan 10
cambios a lo largo de las tres proteiacutenas analizadas con la presencia de una delecioacuten en la
posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
120
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con secuencias de
referencia de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia y secuencias Colombianas de PMTV
procedentes de Antioquia y Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de
Bootstrap (100 ) se indican sobre las ramas La escala representa las sustituciones
promedio por sitio
121
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica Checa
AJ243719
PMTV Suecia
Antioquia
Colombia ID 0994 0979 0976
Boyacaacute
Colombia 0994 ID 0978 0975
DQ102381 PMTV
Repuacuteblica Checa 0979 0978 ID 0995
AJ243719 PMTV
Suecia 0976 0975 0995 ID
122
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de referencia
de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19
(AY353719) y 54-10 (AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd
(D30753) de Escocia y secuencias Colombianas de PMTV procedentes de Antioquia y
Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de Bootstrap (100 ) se indican
sobre las ramas La escala representa las sustituciones promedio por sitio
123
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AY426745
PMTV
Dinamarca
AY353719
Dinamarca
AJ277556
PMTV
Suecia
D30753
PMTV
Escocia
Antioquia
Colombia ID 0979 0988 0987 0986 0973 0967
Boyacaacute
Colombia 0979 ID 0980 0980 0979 0980 0969
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0988 0980 ID 0998 0997 0979 0971
AY426745
PMTV
Dinamarca
0987 0980 0998 ID 0997 0979 0970
AY353719
PMTV
Dinamarca
0986 0979 0997 0997 ID 0978 0969
AJ277556
PMTV Suecia 0973 0980 0979 0979 0978 ID 0986
D30753 PMTV
Escocia 0967 0969 0971 0970 0969 0986 ID
124
6 ANEXOS GENERALES
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen)
1 Homogenizar 100 mg de tejido de planta en nitroacutegeno liacutequido utilizando un mortero
Adicionar 400 microL de buffer AP1 y 4 microL de la solucioacuten de ARNase A (100mgmL) a
un maacuteximo de 100 mg (peso huacutemedo) o 20 mg (peso seco) de tejido de planta
homogenizado y agitar vigorosamente
2 Incubar la mezcla por 10 min a 65degC Mezclar por inversioacuten 2 oacute 3 veces durante la
incubacioacuten
3 Agregar 130 microL de buffer AP2 al lisado mezclar e incubar por 5 min en hielo
4 Recomendado Centrifugar el lisado por 5 min a 20000 x g (14000 rpm)
5 Pipetear el lisado en la columna QIAshredder Mini spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a 20000 x g (14000 rpm)
6 Transferir la fraccioacuten que pasoacute por la columna del paso 5 en un nuevo tubo sin
disturbar el sedimento de restos celulares
7 Agregar 15 voluacutemenes de buffer AP3E al lisado aclarado y mezclar por pipeteo
8 Pipetear 650 microL de la mezcla de paso 7 incluyendo cualquier precipitado que se
pueda haber formado en la columna DNeasy Mini spin column colocando en un
tubo de coleccioacuten de 2 ml Centrifugar por 1 min a 6000 x g (corresponde a 8000
rpm para la mayoriacutea de las microcentrifugas) y descartar el liacutequido Reutilizar el
tubo de coleccioacuten en el paso 9
9 Repetir el paso 8 con la muestra restante Desechar el liacutequido que atraviesa la
membrana y el tubo de coleccioacuten
10 Colocar la columna DNeasy Mini spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2 ml
agregar 500 microL de buffer AW y centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rpm)
Descartar el liacutequido que atraviesa la membrana y reutilizar el tubo de coleccioacuten en
el paso 12
11 Adicionar 500 microL de buffer AW a la columna DNeasy Mini spin y centrifugar por 2
min a 20000 x g (14000 rpm) para secar la membrana
12 Transferir la columna DNeasy Mini spin a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL y
pipetear 40 microL de Agua bi-destilada directamente en la membrana de DNeasy
Incubar por 5 min a temperatura ambiente (15-25degC) y luego centrifugar por 1 min
a 6000 x g (8000 rpm) para eluir
13 Repetir el paso 12 una vez
125
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo (Doyle y Doyle 1987)
Previo a dar inicio a al procedimiento se debe asegurar de contar con
Nitroacutegeno liacutequido
Bantildeo Mariacutea a 65degC
Enfriar morteros a -20degC
Preparar solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2
Preparar el volumen de buffer CTAB+ β-Mercaptoetanol correspondiente al
nuacutemero de muestras
Desinfestar las muestras con hipoclorito y agua destilada durante 1 min
1 Tomar la raiacutez previamente desinfestada macerarla en nitroacutegeno liacutequido y pasarla a
un tubo eppendorf de 2 mL hasta completar un volumen de 400-500 microL
2 Adicionar 500 microL de buffer de extraccioacuten (CTAB) y 1 de β-Mercaptoetanol (5
microL) previamente preparado
Mezclar por inversioacuten
3 Incubar los tubos a 65degC por 30 min Durante este tiempo hacer inversioacuten de los
tubos cada 5 min
4 Adicionar 250 microL de fenol y 250 microL de cloroformo alcohol isoamiacutelico (241)
Mezclar por inversioacuten
5 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 10 min
6 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL
7 Adicionar un volumen de cloroformo alcohol isoamiacutelico (respecto al sobrenadante)
Mezclar por inversioacuten y centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 5 min
8 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL y repetir
el paso 7
9 Adicionar un volumen de isopropanol friacuteo y 01 voluacutemenes de acetato de sodio 3M
invertir varias veces para precipitar el ADN Llevar las muestras a -20degC por 60 min
como miacutenimo o durante toda la noche Periodos maacutes largos pueden aumentar la
produccioacuten
10 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 15 min a temperatura ambiente
11 Descartar el sobrenadante invirtiendo raacutepida y suavemente los tubos y adicionar 200
microL de etanol friacuteo al 70 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 2 min
12 Descartar el sobrenadante por inversioacuten y secar el pellet a temperatura ambiente
invirtiendo los tubos sobre papel absorbente
13 Resuspender el pellet en 50 microL de agua ultrapura esteacuteril
14 Adicionar 4 microL de ARNasa a cada muestra e incubar en el bantildeo Mariacutea a 37degC
durante miacutenimo 2 horas o durante toda la noche
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
126
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y
hongos filamentosos (Qiagen)
1 Determinar la cantidad de material de planta No usar maacutes de 100 mg
2 Colocar inmediatamente el tejido pesado en nitroacutegeno liacutequido Macerar bien en
un mortero Pasar el tejido en polvo a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL
manteniendo los tubos en nitroacutegeno liacutequido Eacuteste se puede evaporar pero no se
debe permitir que el tejido se descongele Proceder inmediatamente al paso 3
3 Adicionar 450 microL de buffer RLC a un maacuteximo de 100 mg de tejido en polvo
Hacer vortex vigorosamente Nota Asegurar que el B-mercaptoetanol (β-ME)
haya sido agregado al buffer RLC antes de su uso (10 microL de β-ME1 mL de
buffer RLC)
4 Transferir el lisado a la columna QIAshredder spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a maacutexima velocidad (13000 rpm
oacute 18500 x g) Transferir cuidadosamente el sobrenadante que pasoacute por la
columna a un nuevo tubo de microcentriacutefuga sin disturbar el sedimento de
restos celulares en el tubo de coleccioacuten Usar soacutelo el sobrenadante en los pasos
siguientes
5 Adicionar 05 voluacutemenes de etanol (96-100) al lisado aclarado y mezclar
por pipeteo inmediatamente No centrifugar Proceder inmediatamente al paso 6
6 Transferir la muestra (usualmente 650 microL) incluyendo cualquier precipitado
que se haya formado a una columna RNeasy spin (rosada) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL (suministrado) Cerrar suavemente la tapa y centrifugar
por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que pasoacute por la
membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 7
7 Adicionar 700 microL de buffer RW1 a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 8
8 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo en el paso 8 Nota Asegurar que el
buffer RPE tenga adicionado el etanol antes de su uso
9 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 2 min a 8000 x g (10000 rpm) para lavar la membrana
de la columna
10 Opcional Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2
mL (suministrado) y descartar el tubo anterior con el liacutequido Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar a velocidad maacutexima por 1 min (13000 rpm oacute 18500 x g)
11 Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 15 mL
(suministrado) Adicionar 20 microL de agua tratada con DEPC (Dietil
pirocarbonato Qiagen) directamente a la membrana de la columna Cerrar
suavemente la tapa y centrifugar por 1 min a 8000 x g (10000 rpm) para eluir
el ARN
12 Repetir el paso 11
127
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Volumen del componente
para 15 microL de mezcla
Producto de PCR 8 μl
Buffer de la enzima 1 (1X) 1 5 μl
Buffer de la enzima 2 (1X) 1 5 μl
Enzima de restriccioacuten 1 2 μl
Enzima de restriccioacuten 2 2 μl
Volumen total 15 μl
2 Incubar las muestras al bantildeo Mariacutea a 37degC por 12 h-24 h
3 Ralizar el anaacutelisis en gel de agarosa al 25
128
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa RT M-
MuLV para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del componente
para 20 microL de mezcla
Agua bi-destilada 05 microL
PBST (05) 004 15 microL
Buffer RT M-MuLV 5X 1X 4 microL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 microL
dNTPs 10 mM 1 mM 2 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 1 microM 2 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa M-MuLV 20 UmicroL 05 microL
ARN 5 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
129
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 20 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 95 microL
Buffer RT Maacutexima 5X 1X 4 microL
dNTPs 10 mM 05 mM 1 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 05 microM 1 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa Maximareg 200 UmicroL 1 microL
ARN 3 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
130
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes de
descongelar
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 146 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 25 mM 02 mM 2 microL
Primer F 10 microM 05 microM 125 microL
Primer R 10 microM 5 microM 125 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 04 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN Molde 1microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Condiciones del ciclo de la PCR para Sss
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 55 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
131
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes del
descongelamiento
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25
microL de mezcla
Agua bi-destilada 158 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 10 mM 02 mM 05 microL
Primer F 10 microM 2 microM 05 microL
Primer R 10 microM 2 microM 05 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 02 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN copia 3 microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 53 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
134
7 CONCLUSIONES GENERALES
En este estudio se encontroacute que las poblaciones Colombianas de Spongospora subterranea
f sp subterranea (Sss) presentan una estructura baacutesica consistente en tres tipos geneacuteticos
(I II y III) El subgrupo III difiere de los reportados mundialmente como Tipo I y Tipo II
en 5 y 2 respectivamente El Tipo III presentoacute la mayor proporcioacuten de aislamientos de
Sss en este estudio con cepas de diferentes departamentos hospedantes y tejidos
sintomaacuteticos mientras que el Tipo I no fue encontrado en muestras procedentes de agallas
de raiacutez Es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa en Colombia asiacute como su
epidemiologiacutea y capacidad para la transmisioacuten de PMTV
Los anaacutelisis de RFLPs de regiones ITS del ADNr de Sss demostraron polimorfismos en los
sitios de corte de las enzimas Hin6I y Bsp143I Se confirmoacute que la digestioacuten con la enzima
Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos del Tipo III mientras que
el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los Tipos I y II permitiendo
separar los tres principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico de Sss Los
resultados obtenidos sugieren la viabilidad de plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla
El anaacutelisis filogeneacutetico para el gen CP de PMTV permitioacute separar dos grupos de
aislamientos del virus El primer clado agrupoacute todas las secuencias de referencia mundial
con 19 de los aislamientos Colombianos obtenidos en este estudio que presentaron niveles
de identidad superiores al 99 El segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo dos de las reportadas en investigaciones previas y seis
obtenidas en el presente estudio con niveles de variacioacuten del 11 al 13 y con una identidad
de tan solo 76 con respecto a los miembros del primer clado Estos resultados confirman
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que no ha sido registrada en otros
Osorio 2012
135
135
lugares del mundo Es necesario estudiar el efecto de ambos genotipos virales sobre la
produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de papa en Colombia de manera que se generen
tecnologiacuteas para la deteccioacuten de PMTV en los programas de certificacioacuten de semilla y de
mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en el paiacutes
En el anaacutelisis de las regiones parciales de CP y CP-RT del ARN2 y TGB del ARN3 de
PMTV sensu stricto se encontraron niveles muy altos de identidad en las tres regiones
estudiadas siendo la CP la maacutes uniforme Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos
compartieron un 999 de identidad en nt y aa Asiacute mismo los anaacutelisis filogeneacuteticos para el
ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Europeos y Colombianos demostraron que los niveles de
identidad entre ambos grupos fueron muy altos gt975 para ARN 2 y gt967 para el
ARN 3 Estos bajos niveles de variacioacuten permiten inferir que este virus se encuentra bajo
fuertes presiones de seleccioacuten determinadas presumiblemente por las propias caracteriacutesticas
de su genoma el estrecho rango de hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica
por parte de su vector Sss Sin embargo a pesar de los altos valores de uniformidad general
encontrados la presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los
aislamientos colombianos de PMTV resulta interesante para el desarrollo de
investigaciones que permitan determinar si se trata de adaptaciones del genoma viral a las
variedades nativas de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas propias de
las poblaciones de Sss en las regiones Andinas
NS1P Pasto (Nar) Suelo S tuberosum
iii
Dedico este proyecto a mis Padres AGA y JIOH y a mi esposo JPPV
iv
TABLA DE CONTENIDO
Pag
RESUMEN XI
ABSTRACT XII
1 INTRODUCCIOacuteN 1
2 OBJETIVOS 4
21 Objetivo general 4
22 Objetivos especiacuteficos 4
3 MARCO TEOacuteRICO 5
31 Generalidades del cultivo de la papa 5
32 Generalidades sobre Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) 7
321 Taxonomiacutea de Sss 7
322 Ciclo de vida Sss 8
323 Rango de hospedantes de Sss 10
324 Siacutentomas causados por Sss 11
325 Control de Sss 12
33 Deteccioacuten de Sss 16
34 Variabilidad geneacutetica de Sss 19
35 Generalidades del Potato mop-top virus (PMTV) 22
351 Taxonomiacutea de PMTV 23
352 Ciclo de la infeccioacuten por PMTV 24
353 Rango de hospederos de PMTV 25
354 Siacutentomas causados por PMTV 26
36 Deteccioacuten de PMTV 27
37 Variabilidad geneacutetica de PMTV 29
BIBLIOGRAFIA 31
v
Pag
RESULTADOS 46
4 ARTIacuteCULO 1- VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora
subterranea f sp subterranea EN COLOMBIA 46
41 Anexos-Artiacuteculo 1 65
5 ARTIacuteCULO 2 ndash VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE LOS ARN 2 Y 3
DE AISLAMIENTOS COLOMBIANOS DE PMTV 84
51 Anexos-Artiacuteculo 2 109
6 ANEXOS GENERALES 124
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen) 124
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo 125
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y hongos
filamentosos (Qiagen) 126
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs 127
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
RT M-MuLV para muestras de ARN 128
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN 129
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa 130
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa 131
7 CONCLUSIONES GENERALES 132
vi
INDICE DE FIGURAS
Pag
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV 24
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp
subterranea en plantas de papa de Colombia 65
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja
var Criolla Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos
infestados con Spongospora subterranea f sp subterranea 66
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos
agallas o raiacuteces de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana 68
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8 69
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la
regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp
subterranea de Colombia 70
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb)
a partir de ADN de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum
tuberosum S phureja y Nicotiana benthamiana 71
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e
ITS2 del ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss)
de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo 75
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos
de S subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I
MspI TaqI y Tru1I mediante el programa Web-cutter 77
vii
Pag
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN
ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las
enzimas de restriccioacuten Bsp143I y Hin6I que permiten determinar los tres
Tipos de Sss identificados en este trabajo 82
Figura 410 Gel de RFLPs con la enzima Hind6I y Bsp143I con muestras de los
Tipos I II y III de Sss detectados en el estudio 83
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb)
dirigidos al gen de la caacutepside viral del Potato mop-top virus PMTV 109
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4
(417 pb) dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) del Potato
mop-top virus (PMTV) 110
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7
(2063 pb) PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al
ARN3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 112
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses
del mundo 115
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del
genoma de Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia
y otros paiacuteses del mundo 117
viii
Pag
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia
y Boyacaacute (Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw
Suecia 119
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con
secuencias de referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del
Potato mop-top virus (PMTV) 120
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias
De referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del Potato
mop-top virus (PMTV) 122
ix
INDICE DE TABLAS
Pag
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o
raiacuteces de plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea 67
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna
polvosa y de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad 72
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de
aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en
Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2
del ADN ribosomal 78
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S
E ITS2 del ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp
subterranea de Colombia y otros paiacuteses del mundo 81
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten
de los segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 111
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia 113
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 116
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 118
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato
mop-top virus en cuatro Departamentos cultivadores de papa de Colombia 118
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 118
x
Pag
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 123
xi
RESUMEN
El cultivo de papa es uno de los renglones agriacutecolas de mayor importancia en Colombia se
extiende a 128701 ha y genera una produccioacuten anual de 23 millones de ton antildeo-1
Desde el
punto vista fitosanitario la papa se ve afectada por diversos problemas destacaacutendose en los
uacuteltimos antildeos la reemergencia de la Sarna polvosa causada por el protozoario del suelo
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) El efecto de esta enfermedad se refleja en
el deterioro de la calidad del tubeacuterculo y en la reduccioacuten de la produccioacuten al afectar el
sistema radicular de las plantas Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus
(PMTV) uno de los virus prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarenteneario en diferentes paiacuteses del mundo En este trabajo se evaluaron los niveles de
variabilidad geneacutetica de aislamientos Sss y PMTV obtenidos en cultivos de papa de los
departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo En el caso de Sss se
estudiaron los niveles de variacioacuten de 127 aislamientos a partir de la secuenciaciacioacuten de
las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr) encontraacutendose la presencia de tres variantes
principales dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada Para PMTV se
evaluaron los niveles de identidad de 38 aislamientos de los cuatro departamentos bajo
estudio a partir de la secuenciacioacuten de los genes de la caacutepside viral (CP) y del segundo gen
del triple bloque de genes (TGB2) encontraacutendose la presencia de dos variantes del virus
una que representa el genotipo mundialmente reportado para este virus y la otra que hasta
ahora soacutelo se ha encontrado en Colombia y que dado el bajo nivel de identidad (76) con
respecto al primer grupo posiblemente representa una nueva especie de pomovirus
Finalmente dos de las cepas de PMTV de Antioquia y Boyacaacute fueron secuenciadas para
sus ARN 2 y 3 lograacutendose un 83 del segmento genoacutemico de ARN 2 y 87 para el ARN
3 y encontraacutendose que comparten niveles de identidad superiores al 97 con respecto a
otros aislamientos previamente caracterizados en el Norte de Europa Se espera que los
resultados de esta investigacioacuten sean utilizados para el disentildeo de herramientas de
xii
diagnoacutestico que apoyen los esquemas de certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas
de mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en Colombia
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum Potato mop-top
virus secuenciacioacuten
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea AND ITS
ASSOCIATED PMTV VIRUS IN COLOMBIA
ABSTRACT
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
The other hand Sss is a vector for Potato mop-top virus (PMTV) a prevalent virus in the
Andean region and quarentenary in several countries However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
xiii
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum Potato mop-top virus
RT-PCR Sequencing
1
1 INTRODUCCIOacuteN
En Colombia el cultivo de la papa ocupa cerca de 128701 ha distribuidas en 14
departamentos de los cuales Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo son responsables
del 80 de la produccioacuten que asciende a cerca de 23 millones de ton antildeo-1
y de la cual
dependen maacutes de 69000 familias del sector rural del paiacutes La cadena de la papa en
Colombia enfrenta un gran nuacutemero de desafiacuteos endoacutegenos y exoacutegenos que disminuyen su
competitividad respecto a los demaacutes paiacuteses del mundo y en especial con relacioacuten a los otros
miembros de la Comunidad Andina de Naciones Entre otros factores los maacutes limitantes
son aquellos relacionados con la carencia de tecnologiacutea en los sistemas de produccioacuten y de
post-cosecha la alta dependencia de insumos agriacutecolas y el bajo nivel de acople entre el
sector primario y el de procesamiento industrial (MADR 2006) Desde el punto vista
fitosanitario el cultivo de la papa se ve afectado por diversos fitopatoacutegenos e insectos
plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la reemergencia de la enfermedad denominada
Sarna polvosa de la papa causada por el protozoario Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) Su efecto no solo se debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten
al deterioro en la calidad y apariencia cosmeacutetica de los tubeacuterculos que afecta draacutesticamente
su valor en el mercado Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus (PMTV)
uno de los problemas virales prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarentenario para diferentes paiacuteses del mundo (Santala et al 2010)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 de las cosechas en las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro (Solanum tuberosum) y
papa criolla (S phureja) (SINAIPA 2002) Por otra parte se estima que el PMTV puede
causar peacuterdidas hasta del 25 en este cultivo lo cual adicionado al dantildeo causado por Sss
pudiera generar disminuciones de 50-80 en la produccioacuten (Jones y Harrison 1972
Guerrero 1997 2000) Aunque se cree que este virus tiene como centro de origen los
Andes suramericanos no se ha establecido con certeza su efecto sobre el rendimiento de las
variedades alliacute cultivadas ni determinado claramente los siacutentomas que causa en sus
hospedantes (Salazar 1995) De esta forma no es frecuente encontrar la sintomatologiacutea
asociada a este virus reportada para la regioacuten templada que incluye amarillamiento foliar
2
anillos necroacuteticos y cuarteamiento o agrietamiento de tubeacuterculos y moteados foliares tipo
ldquoAucubardquo (Salazar 1995 Xu et al 2004)
Adicionalmente a esta problemaacutetica la diseminacioacuten de Sss se viene incrementando
dramaacuteticamente en el paiacutes como resultado de la deficiente calidad de la semilla utilizada
por la mayoriacutea de los agricultores la ausencia de variedades tolerantes a dicho patoacutegeno y
la carenciadeficiencia de asistencia teacutecnica estatal o gremial que no cuenta con
herramientas apropiadas para el diagnoacutestico asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla
libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011)
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la ausencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos o bioloacutegicos efectivos por lo
tanto requiere de un manejo fitosanitario especial al afectar directamente la semilla
inhabilitar los suelos dedicados al cultivo afectar la calidad cosmeacutetica del producto fresco y
ser transmisor del PMTV lo que genera una barrera cuarentenaria para la apertura de
nuevos mercados Por lo anterior el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado bajo
un esquema de manejo integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como
rotacioacuten de cultivos manejo adecuado del riego y drenaje sanidad del tubeacuterculo semilla
utilizacioacuten de organismos antagonistas (pe Trichoderma spp) utilizacioacuten de cultivos
trampa desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos estrictos de
certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas son
utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado del
manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o de
Rhizoctoniasis
El desarrollo de metodologiacuteas seroloacutegicas y moleculares pueden ser una importante
herramienta para el monitoreo y deteccioacuten de estos patoacutegenos en el paiacutes Se destacan para
Sss la teacutecnica de ELISA (Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas) con anticuerpos
policlonales y monoclonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
3
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Ward et al 2004 Qu et al
2011) Para el caso de PMTV tambieacuten se han utilizado teacutecnicas de deteccioacuten utilizando
plantas trampa ELISA RT-PCR (Retrotranscripcioacuten - Reaccioacuten en cadena de la
polimerasa) qPCR (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa en tiempo real) y microplatos de
hibridizacioacuten y microarreglos (Arif et al 1994 Nielsen y Moslashlgaard 1997 Jeffries 1998
Davey 2009 Latvala-Kilby et al 2009 Nakayama et al 2009) Sin embargo estas
teacutecnicas son de aplicacioacuten limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas o validadas con
base en los genotipos locales de ambos patoacutegenos presentes en las regiones cultivadoras de
nuestro paiacutes motivo por el cual es fundamental emprender un estudio amplio de los niveles
de variabilidad geneacutetica de Sss y PMTV en Colombia
Este trabajo responde a dicha necesidad En eacutel se realizaron colecciones de material vegetal
y suelo de cuatro zonas productoras de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo (Colombia) y se realizaron extracciones de ADN o ARN seguacuten el
caso para mediante teacutecnicas moleculares determinar las secuencias de diferentes regiones
informativas del genoma de cada patoacutegeno Una vez obtenidas y editadas las secuencias se
realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos para comparar y agrupar aislamientos colombianos con
respecto a los reportados para Sss y PMTV en el mundo y determinar sus niveles de
identidad geneacutetica
Este estudio pretende apoyar el desarrollo de programas de diagnoacutestico de Sss y PMTV
tanto en Colombia como en la regioacuten Andina La informacioacuten generada es importante para
desarrollar programas de deteccioacuten asintomaacutetica y temprana de ambos patoacutegenos como una
herramienta fundamental para implementar una base tecnoloacutegica que apoye los esquemas
cuarentenarios dirigidos a evitar la diseminacioacuten de los patoacutegenos hacia zonas libres de la
enfermedad la certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas de mejoramiento geneacutetico
que conduzcan a generar variedades resistentes a este patosistema
4
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GENERAL
Evaluar los niveles de variacioacuten geneacutetica de Spongospora subterranea y de su virus asociado
PMTV en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y
Narintildeo
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de S subterranea de cultivos de
papa de cuatro departamentos de Colombia a partir de secuenciacioacuten de las
regiones ITS del ADN ribosomal
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de PMTV de cultivos de papa de cuatro
departamentos de Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de la caacutepside y TGB2 del
genoma viral
Definir las afinidades filogeneacuteticas entre las variantes de S subterranea y PMTV
detectadas en Colombia con aislamientos de dichos patoacutegenos de diferentes paiacuteses
que presenten secuencias disponibles en las bases de datos moleculares
Ampliar el nivel de informacioacuten disponible sobre las secuencias de los segmentos
del genoma de aislamientos de PMTV en Colombia
5
3 MARCO TEOacuteRICO
31 Generalidades del cultivo de la papa
La papa es el tubeacuterculo maacutes importante que se produce en el mundo Se cultiva en maacutes de
125 paiacuteses y es consumido diariamente por maacutes de mil millones de personas En los paiacuteses
en desarrollo es un cultivo de fuerte expansioacuten con cientos de millones de personas que
dependen de eacutel para su supervivencia Los paiacuteses en desarrollo son los maacutes grandes
productores (e importadores) de papa y de sus productos derivados (FAO 2009) China se
ha convertido recientemente en el primer productor mundial de papa y junto a India
responden por la tercera parte de la produccioacuten global de este tubeacuterculo En Ameacuterica Latina
y Aacutefrica las cosechas presentaron un menor volumen pero el rendimiento se incrementoacute
significativamente Ameacuterica del Norte fue el mayor productor del continente con un
rendimiento de maacutes de 40 ton ha-1
(FAO 2008)
Ameacuterica del Sur es la cuna de la papa pero esta regioacuten presenta los niveles maacutes bajos de
produccioacuten con menos de 16 millones de toneladas para el antildeo 2007 En la regioacuten Andina
la mayoriacutea de los pequentildeos campesinos manejan el cultivo de forma tradicional y se
siembran variedades de papa que son poco comerciales y desconocidas para el resto del
mundo sin embargo en paiacuteses como Argentina Brasil Colombia y Meacutexico la produccioacuten
comercial de papa estaacute aumentando paulatinamente (FAO 2008)
En Colombia el cultivo de la papa participa con el 71 de la superficie sembrada en
cultivos transitorios y aporta cerca de 78 de la produccioacuten agriacutecola generando alrededor
de 69000 empleos directos principalmente en los departamentos de Cundinamarca
Boyacaacute Narintildeo y Antioquia (MADR 2009a) En el 2009 el aacuterea sembrada de papa fue de
128701 ha con una produccioacuten de 2272772 ton y un rendimiento de 184 ton ha-1
(MADR-ENA 2009) La participacioacuten departamental en la produccioacuten nacional se
encuentra distribuida de la siguiente manera Cundinamarca 378 Boyacaacute 263 Narintildeo
6
164 Antioquia 65 Santander 56 y otros departamentos participan con el 64
(MADR 2009b)
La papa es el producto de origen agriacutecola que tiene la mayor demanda en Colombia por
fungicidas e insecticidas y la segunda en demanda de fertilizantes despueacutes del cafeacute Es la
actividad que maacutes utiliza los servicios de transporte terrestre con maacutes de 2 millones de
toneladas al antildeo sin incluir la movilizacioacuten de los insumos requeridos para su produccioacuten
(MADR 2005)
Los cultivos de papa se encuentran distribuidos en climas friacuteos con temperaturas de 13ordmC y
alturas de 2000 msnm hasta alcanzar zonas de paacuteramo con alturas cercanas a los 3500
msnm y temperaturas de 8ordmC Geograacuteficamente las unidades de produccioacuten estaacuten
dispersas principalmente en las regiones friacuteas de la zona Andina bajo una variada gama de
condiciones biofiacutesicas econoacutemicas y sociales En teacuterminos generales alrededor del 75
del aacuterea cultivada con papa en el paiacutes se encuentra en zonas de topografiacutea quebrada y
ondulada (MADR 2005)
Seguacuten Villareal et al (2007) en el paiacutes existen alrededor de 30 variedades de papa
cultivada pero soacutelo 10 de eacutestas tienen importancia comercial La Parda pastusa es la
variedad maacutes cultivada y consumida en fresco le siguen la variedad Diacol Capiro
utilizada para consumo en fresco exportacioacuten y por la industria de alimentos como materia
prima La variedad ICA-Puraceacute es utilizada en algunas regiones de clima templado del paiacutes
para consumo en fresco la Tuquerrentildea o Sabanera que se consume principalmente en
Bogotaacute y la Criolla que se cultiva principalmente en los departamentos de Antioquia y
Cundinamarca En el paiacutes se han desarrollado nuevas variedades que han ingresado al
mercado como las variedades Esmeralda Rubi UNICA e ICA Morita que tienen altas
posibilidades comerciales en el corto plazo
Una de las principales limitantes teacutecnicas del cultivo de la papa corresponde a las plagas y
enfermedades Dentro de las enfermedades el tizoacuten tardiacuteo o gota causado por
Phytophthora infestans es la amenaza maacutes seria del cultivo Ademaacutes tambieacuten se presentan
el tizoacuten temprano (Alternaria solani) la rontildea (Rhizoctonia solani) la sarna comuacuten
7
(Streptomyces scabies) la palomilla o mortaja blanca (Rosellinia sp) las virosis (PVY
PVX PLRV PYVV PVS PMTV) y la sarna polvosa Esta uacuteltima enfermedad se ha
convertido en una de las principales problemaacuteticas de cultivo a nivel mundial (Harrison et
al 1997 Merz y Falloon 2009) Es causada por el protozoo Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) paraacutesito obligado de plantas superiores Esta enfermedad causa dantildeos
directos sobre las raiacuteces y tubeacuterculos y ademaacutes es vector del PMTV (Jones y Harrison
1969 Harrison et al 1997 Andersen et al 2002 Merz y Fallon 2009) enfermedad viral
que afecta este cultivo en varias regiones productoras de papa en el mundo
En Colombia el manejo de la enfermedad se basa en el uso de semilla certificada por el
Instituto Colombiano Agropecuario ICA la utilizacioacuten de variedades medianamente
tolerantes y la rotacioacuten entre estas variedades con cultivos no hospedantes del patoacutegeno
(Jaramillo y Botero 2007)
32 Generalidades de Spongospora subterranea fsp subterranea
321 Taxonomiacutea
Sss es el agente causal de la enfermedad denominada Sarna polvosa de la papa El primer
reporte de esta enfermedad data de 1841 en Alemania (Wallroth 1842) y a partir de esta
fecha su registro incluye todos los continentes (Harrison et al 1997 Merz 2008) Seguacuten
Lyman y Rogers (1915) el patoacutegeno es originario de los Andes Suramericanos desde donde
se dispersoacute gracias al mercado mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber
transcurrido mas de 150 antildeos desde su primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado
importancia en las uacuteltimas deacutecadas como resultado de la siembra generalizada de materiales
altamente susceptibles al patoacutegeno la utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los
cambios de eacutepocas de siembra hacia periacuteodos huacutemedos las deficiencias en los sistemas de
rotacioacuten de cultivos la falta de programas cuarentenarios y los altos estaacutendares exigidos por
el mercado en la calidad cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
8
Sss es un pseudohongo plasmodial que taxonoacutemicamente se ha ubicado en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos Spongospora subterranea f sp
subterranea y Spongospora subterranea f sp nasturtii definidos como forma especialis
son importantes patoacutegenos de vegetales (Merz y Falloon 2009) Dick (2001) propone que
dichos microorganismos corresponden a especies diferentes
322 Ciclo de vida Sss
Sss y otros plasmodiophorales se caracterizan por presentar zoosporas biflageladas (3-4 microm
diaacutemetro) de desigual tamantildeo con mastigonemes y posicioacuten opuesta que se liberan a partir
de las estructuras de resistencia (quistes) Los quistes (4 microm diaacutemetro) pueden sobrevivir en
el suelo por largos periacuteodos de tiempo y generalmente se encuentran agregados formando
estructuras denominadas quistosoros (hasta 85 microm diaacutemetro) CITA los cuales son esfeacutericos
u ovoides y presentan un centro vaciacuteo En Colombia observaciones realizadas por
Jaramillo y Peacuterez (2008) han determinado que los quistosoros de aislamientos procedentes
de suelos del municipio de La Unioacuten (Antioquia) oscilaron entre 50 y 120 microm Bajo
condiciones de humedad es frecuente la liberacioacuten de una zoospora uninucleada aunque se
cree que la germinacioacuten de los quistes responde a un patroacuten escalonado que garantiza la
generacioacuten de inoacuteculo infectivo por largos periodos de tiempo Una vez en el suelo las
zooporas se desplazan varios centiacutemetros y son atraiacutedas por los exhudados de las raiacuteces de
sus plantas hospedantes adherieacutendose enquistando y formando un tubo germinativo que
ejerce fuerza mecaacutenica para su penetracioacuten directa en la planta Posteriormente el patoacutegeno
desarrolla un plasmodio multinucleado con membrana simple y ausencia de pared celular
Eventualmente el plasmodio se cliva dando lugar a muacuteltiples zooesporangios cada uno de
los cuales puede generar hasta 8 zoosporas que son liberadas por un poro germinativo y
continuacutean con la infeccioacuten de otras ceacutelulas radiculares Estas zoosporas denominadas
secundarias son indistinguibles de las que inician la infeccioacuten (primarias) y ambas pueden
infectar lenticelas no suberizadas de tubeacuterculos comenzando a inducir el siacutentoma tiacutepico de
9
la sarna que toma apariencia corchosa a partir del desarrollo de una capa de proteccioacuten a
nivel del peridermo del tubeacuterculo Es frecuente ademaacutes que el patoacutegeno induzca hipertrofia
e hiperplasia en los tejidos afectados dando origen a las agallas y a las deformaciones
caracteriacutesticas de la enfermedad Al final del ciclo en los plasmodios se reorganiza su
contenido protoplasmaacutetico rodeaacutendo los nuacutecleos presentes de pared celular y generaacutendose
quistes que serviraacuten de inoacuteculo para sucesivas infecciones (Harrison et al 1997)
El ciclo de vida de Spongospora es diferenciado por Merz (2008) de acuerdo a la
ocurrencia de dos fases una fase esporogeacutenica y una segunda fase esporangial cada una
iniciada por la infeccioacuten de la ceacutelula hueacutesped a traveacutes de un plasmodio individual En la
fase esporangial numerosas zoosporas secundarias son formadas en el esporangio de
paredes delgadas en las ceacutelulas epidermales de la raiacutez y los pelos radicales del hueacutesped en
las cuales las zoosporas son formadas desde un plasmodio esporangiogeacutenico Las zoosporas
secundarias tambieacuten biflageladas pueden salir del hueacutesped e iniciar otro ciclo de infeccioacuten
La fase esporogeacutenica se presenta despueacutes de la divisioacuten nuclear dentro del plasmodio
esporogeacutenico El patoacutegeno produce esporas de reposo de pared gruesa las que son
altamente persistentes Cada espora de reposo libera una sola zoospora primaria
biflagelada
En Colombia Hoyos et al (2009) realizaron observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Sss encontrando plasmodios plasmodios enquistados plasmodios en
estado de divisioacuten ceacutelulas uacutenicas y quistosoros en raiacuteces de plantas de S tuberosum
asintomaacuteticas indicando que la infeccioacuten puede estar presente sin desarrollo evidente de
siacutentomas y que los quistosoros no son solamente las estructuras maacutes frecuentes en los
tejidos de los hospedantes afectados
10
323 Rango de hospedantes de Sss
Diversas investigaciones han encontrado la presencia de zoosporangios de Sss en plantas de
otras familias diferentes a la Solanaceae como Alzoaceae Apiaceae Asteraceae
Boraginaceae Brassicaceae Caryophyllaceae Chenopodiaceae Fabaceae Geraniaceae
Lamiaceae Plantaginaceae Papaveraceae Poaceae Polygonaceae Ranunculaceae
Rubiaceae Resedaceae Solanaceae y Urticaceae (Jones y Harrison 1969 Andersen et al
2002) Andersen et al (2002) encontraron diferentes tasas de infeccioacuten desarrolladas por el
patoacutegeno en especies como Artemisia vulgaris Cirsium arvense Chamomilla suaveolens
Chenopodium album Galium aparine Geranium pusillum Lapsana communis Matricaria
inodora Poa annua Polygonum avicular P convolvulus Rumex acetosa R acetosella
Solanum nigrum Sonchus arvensis Urtica urens y Viola tricolor lo que permitioacute
confirmar estas 17 especies como hospedantes de Sss
Aunque aparentemente Sss tiene un amplio rango de hospedantes el desarrollo de los
quistosoros nunca habiacutea sido observado en otros hospederos diferentes a S tubersosum Sin
embargo Qu y Christ (2006a) encontraron formacioacuten de quistosoros en seis especies de
plantas Solanum plycantum Dun Datura stramonium L Avena sativa L Dactylis
conglomerado L Solanum esculentum Mill y Brassica campestris L Esto indicoacute que el
patoacutegeno tiene la capacidad de completar su ciclo de vida en hospedantes alternos a las
plantas de papa lo que representa un aspecto epidemioloacutegico importante Asiacute mismo se
encontroacute que las siguientes especies tambieacuten son hospedantes del patoacutegeno Fagopyrum
esculentum Moench Phleum pratense L Raphanus sativus L Brassica napus L
Trifolium pratense L Secale cereale L Ambrosia artemisiifolia L Chenopodium album
L Amaranthus retroflexus L y Cyperus esculentus L Recientemente se ha encontrado
que el patoacutegeno puede producir agallas en S physalifolium y S nigrum y su patogenicidad
fue confirmada por inoculacioacuten a plantas de tomate (S esculentum) y de papa bajo
condiciones de invernadero (Shah et al 2010) Estos resultados tienen consecuencias para
el manejo de la enfermedad enfocado en cultivos de rotacioacuten porque se debe tener en
cuenta que existen especies cultivables y malezas que pueden albergar estructuras del
patoacutegeno y que el reporte de nuevas especies hospederas continua por ejemplo Sss causa
11
agallas en las raices de Solanum sarrachoide en donde puede completar su ciclo de vida y
producir nuevas generaciones de quistosoros que son infectivos a papa (Nitzan et al 2009)
324 Siacutentomas causados por Sss
Los siacutentomas de la enfermedad incluyen la induccioacuten de lesiones pustulosas corchosas con
centros polvosos formados a partir de la agregacioacuten de los quistosoros del patoacutegeno Con el
avance de estas lesiones es frecuente la ruptura del peridermo aunque el nivel de
penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente superficial Bajo condiciones oacuteptimas para el
desarrollo de la enfermedad es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten
de los tejidos y la formacioacuten de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la
enfermedad ademaacutes de causar los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular
de las plantas al inducir la formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas (Cotes et al
2006) que causan la disminucioacuten de la superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo a la
marchitez y finalmente a la muerte de las plantas Durante el almacenamiento la sarna
polvosa puede ocasionar pudriciones secas que sirven de entrada a otros patoacutegenos y
saproacutefitos que deterioran auacuten maacutes el producto (Agrios 1996) La infeccioacuten en las raiacuteces
especialmente cuando se forman agallas pueden causar una reduccioacuten en el funcionamiento
de la raiacutez por la interrupcioacuten de la toma de agua y de nutrientes (Lister et al 2004 Falloon
et al 2005)
En Colombia en los departamentos de Cundinamarca Boyacaacute Narintildeo y Antioquia Sss
afecta severamente las variedades de papa (Solanum tuberosum) Parda Pastusa y Diacol
Capiro y a la papa criolla (Solanum phureja) Los siacutentomas se observan en raiacuteces y
tubeacuterculos pero hay variacioacuten en las zonas paperas en cuanto a la distribucioacuten de los
siacutentomas entre los diferentes oacuterganos de la planta En Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de
Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre los tubeacuterculos de las variedades Parda
Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el departamento de Narintildeo y en el Oriente de
Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces Hasta ahora no se sabe si estas diferencias
se deben a variaciones en las condiciones ambientales de una regioacuten a otra o quizaacutes se
12
deban a la distribucioacuten regional de diferentes razas del patoacutegeno yo a su interaccioacuten con el
ambiente (Jaramillo y Botero 2007)
En el Oriente Antioquentildeo se determinoacute la incidencia y el grado de severidad de 23
poblaciones de Sss bajo el sistema de rotacioacuten entre ICA Puraceacute-Diacol Capiro y viceversa
en tres cosechas sucesivas en condiciones de casa de malla Se observoacute que las poblaciones
del patoacutegeno no afectaron el peso ni causaron siacutentomas de sarna polvosa en los tubeacuterculos
pero si en las raiacuteces con diferentes grados de severidad en las dos variedades siendo maacutes
susceptible la variedad Diacol Capiro que al parecer favorecioacute el incremento del inoacuteculo
mientras que la ICA Puraceacute fue levemente afectada y posiblemente presentoacute efecto
supresivo sobre los quistosoros en el suelo (Jaramillo y Botero 2007)
Estudios realizados en el departamento de Narintildeo presentaron diferencias en el grado de
desarrollo de la enfermedad en raiacuteces La variedad Parda Pastusa fue la maacutes susceptible a
Sss con desarrollo de agallas desde el momento de la emergencia de las plantas La
enfermedad alcanzoacute valores de susceptibilidad del 100 en dicha variedad mientras que en
Diacol Capiro fue de 48 En los tubeacuterculos la enfermedad se manisfestoacute por la formacioacuten
de escasas y pequentildeas puacutestulas de color castantildeo con poca presencia de masas pulverulentas
de esporas de resistencia del patoacutegeno lo que contrasta con la regioacuten Cundiboyacense en
donde estas variedades se caracterizan por presentar una alta susceptibilidad a la rontildea en
tubeacuterculos ocasionando lesiones severas en las que resulta faacutecil encontrar esporas de
resistencia (Benavides 2006)
325 Control de Sss
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la carencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos efectivos (Qu y Christ
2006a) Seguacuten Harrison et al (1997) el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado
bajo un esquema integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como la
rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del tubeacuterculo semilla la
utilizacioacuten de organismos antagonistas (ie Trichoderma spp) la utilizacioacuten de cultivos
trampa la desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
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restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos de certificacioacuten de
semilla Dos estrategias que en la actualidad se consideran fundamentales para apoyar los
programas MIC en papa incluyen el mejoramiento geneacutetico por resistencia al pseudohongo
y la utilizacioacuten de cultivos trampa (Merz et al 2004)
Para el caso del mejoramiento los primeros reportes en la regioacuten Andina fueron
presentados por Torres et al (1995) quienes evaluaron 467 accesiones encontrando la
existencia de 17 genotipos resistentes y 33 moderadamente resistentes Por otra parte Lees
(2000) en Escocia evaluoacute los niveles de resistencia a Sss de una serie de clones de S
phureja encontrando que algunos de eacutestos presentaron un adecuado nivel de resistencia
por lo que esta especie fue propuesta como fuente de genes de resistencia Merz (2000) al
evaluar la reaccioacuten de 11 cultivares determinoacute que existe correlacioacuten entre las pruebas de
invernadero utilizando plaacutentulas provenientes de cultivo de tejidos y la resistencia
presentada en campo
Fallon et al (2003) realizaron un estudio en Australia con 99 cultivares de papa y 13
liacuteneas de mejoramiento durante 11 antildeos Sus resultados indicaron que el 21 de los
materiales evaluados eran resistentes mientras que el 28 presentoacute una resistencia
moderada Estos autores tambieacuten reportaron que la expresioacuten de la resistencia variacutea entre
antildeos y que los bioensayos realizados en invernadero no siempre se correlacionan con la
respuesta presentada en campo sugiriendo una fuerte interaccioacuten genotipo-ambiente para
esta caracteriacutestica
Nitzan et al (2010) evaluaron la estabilidad de la resistencia geneacutetica de 24 genotipos de
papa a Sss en los estados de Washington e Idaho en Estados Unidos Se identificoacute que la
resistencia era estable a la formacioacuten de agallas en las raiacuteces causada por Sss y se determinoacute
que una gran proporcioacuten de la variacioacuten fue geneacutetica lo que permite a los mejoradores usar
genotipos resistentes y estables de papa como progenitores en el desarrollo de cultivares
comerciales con resistencia a este patoacutegeno debido a que contar con materiales geneacuteticos
resistentes es una de las principales estrategias de manejo de la enfermedad (Rodriacuteguez et
al 2009 Houser y Davidson 2010)
14
Seguacuten Merz et al (2012) no existen meacutetodos de control eficientes y econoacutemicos que se
encuentren disponibles actualmente y la resistencia del hospedero es clave para el manejo
integrado de la enfermedad debido a esto se evaluaron 10 cultivares con diferentes rangos
de susceptibilidad a Sss y a PMTV en diferentes paiacuteses de Europa Para evitar discrepancias
en los criterios de evaluacioacuten se utilizoacute una escala estaacutendar para los niveles de la sarna
polvosa determinaacutendose que los cultivares se comportaron como estaba establecido en su
caracterizacioacuten inicial (a excepcioacuten de uno de ellos) Los resultados del ensayo de campo
indicaron que los diferentes meacutetodos de valoracioacuten son el principal factor de discrepancia
en las calificaciones de la resistencia y que las condiciones ambientales yo el nivel de
inoacuteculo del suelo juegan un papel menor
Otra estrategia con alto potencial para el manejo de la enfermedad es la rotacioacuten del cultivo
con plantas trampa que reducen el nivel de estructuras de resistencia de
plasmodiophoromycetes Por ejemplo es ampliamente conocido que la siembra de
Raphanus sativus reduce la cantidad de quistes de Plasmodiophora brassicae en el suelo
(Murakami et al 2000) mientras que la planta Datura stramonium redujo el nivel de Sss en
un 79 en cultivos de papa de Australia
En Colombia la buacutesqueda de herramientas para el manejo de la enfermedad bajo las
condiciones regionales de las zonas productoras de papa se enfoca en la evaluacioacuten de
sistemas de rotacioacuten de variedades comerciales que tradicionalmente se han considerado
altamente susceptibles a la enfermedad (ie Diacol Capiro) con variedades maacutes tolerantes al
ataque del patoacutegeno (ie ICA Puraceacute) encontraacutendose que efectivamente esta uacuteltima
variedad presenta un menor nivel de susceptibilidad a la sarna polvosa (Jaramillo et al
2003 Jaramillo y Botero 2007)
En cuanto al control bioloacutegico de Sss Gilchrist (2009) evaluoacute una cepa de Trichoderma
previamente considerada por Hoyos et al (2002) como potencialmente uacutetil para el control
bioloacutegico de Sss en la variedad Diacol Capiro Las pruebas fueron realizadas en campo
utilizando tres dosis de aplicacioacuten del biocontrolador Se encontroacute que la aplicacioacuten de T
asperellum T109 redujo un 64 y 54 los efectos de la sarna polvosa en el crecimiento y
15
en la produccioacuten de las variedades respectivamente De esta forma se resalta el potencial
de la cepa como biocontroladora contra Sss teniendo en cuenta que se debe ampliar el
conocimiento acerca de los factores que limitan la accioacuten de T asperellum T109 en el
campo y coacutemo compensarlo aumentando la frecuencia de aplicacioacuten En un trabajo similar
se investigoacute la influencia de cuatro aislamientos de T asperellum sobre la sarna polvosa en
tres tipos de suelo Andisol Entisol e Inceptisol No se encontraron diferencias
significativas entre las plantas de papa tratadas y no tratadas con T asperellum pero siacute se
encontroacute que la reduccioacuten del crecimiento y la produccioacuten estuvieron inversamente
asociadas con el contenido de Al2+
en los suelos sugiriendo que los efectos de la sarna
polvosa estaacuten fuertemente relacionados con las condiciones del suelo (Gilchrist et al 2009)
Estudios sobre la evaluacioacuten de estrategias de manejo de la rontildea polvosa en tres regiones
productoras de papa en Colombia han incluido resultados sobre la biologiacutea y patologiacutea de
Sss en la Sabana de Bogotaacute y sus hallazgos maacutes importantes consisten en la puesta en
marcha de un sistema de bioensayos en los cuales ha sido posible inducir la liberacioacuten de
zoosporas bajo condiciones de laboratorio Otros estudios incluyen la evaluacioacuten del efecto
de fungicidas aplicados al suelo para el manejo de Sss Sin embargo se determinoacute que
ninguno de los fungicidas evaluados (Tiabendazol Tolclofos metil Benomyl Carbendazin
Clorotalonil y Mancozeb) contribuyeron con el control del patoacutegeno en raiacuteces y tubeacuterculos
bajo las dosis y condiciones de tres localidades productoras de papa (Subachoque Medelliacuten
(Corregimiento Santa Elena) y Pasto) (Garciacutea y Navia 2002) En contraste Falloon et al
(2010) realizaron aplicaciones en campo del fungicida Mancozeb el cual contiene Zn y
Mn Las dosis estuvieron determinadas como baja similar y alta con respecto al contenido
de estos elementos en el suelo cultivado con papa cv Iwa (considerado muy susceptible a
Sss) Se encontroacute que niveles elevados de Zn y Mn generan infecciones moderadas de Sss
en las raiacuteces del cultivar evaluado de S tuberosum
Otras investigaciones para el manejo de Sss han incluiacutedo la evaluacioacuten de potenciales
biocontroladores (Trichoderma harzianum y Pseudomonas fluorescens) un consorcio de
micorrizas y viruta de pino como tratamientos Se encontraron diferencias estadiacutesticamente
significativas entre el testigo y P fluorescens y los tratamientos con T harzianum
16
micorrizas y viruta presentando una incidencia en raiacuteces de 32 21 y 5 3 y 1
respectivamente Los tratamientos con T harzianum micorriza y viruta tuvieron los
porcentajes de incidencia maacutes altos pero contrastaron con niveles muy bajos de severidad
de la enfermendad (022 0088 y 0019 respectivamente) Sin embargo no se
obtuvieron incrementos en peso seco de raiacuteces peso de tubeacuterculos y peso seco de la parte
aeacuterea cuando se realizaron las inoculaciones de los diferentes agentes de control y las
aplicaciones de la viruta de pino (Restrepo et al 2009)
Arias (2011) realizoacute un anaacutelisis y comparacioacuten de glucosinolatos presentes en diferentes
accesiones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control de
Sss Se estandarizaron los procedimientos de extraccioacuten del compuesto y las diferentes
formulaciones fueron probadas como biofumigante en el suelo donde posteriormente se
sembraron tubeacuterculos de papa criolla Sin embargo los resultados obtenidos no permitieron
establecer un posible potencial biofumigante de las accesiones evaluadas y es necesario
profundizar en los estudios que permitan determinar el efecto de los glucosinolatos y de
otros compuestos sobre el patoacutegeno
33 Deteccioacuten de Sss
La deteccioacuten del inoacuteculo a nivel del suelo es compleja y es evaluada precariamente a partir
de sistemas de trampeo que utilizan plaacutentulas de tomate (Merz 1989) o de papa (Wale et al
1993) Estas evaluaciones son criacuteticas para definir relaciones entre el grado de infestacioacuten
de los suelos y los niveles de enfermedad observados en el campo requisito fundamental
para la implementacioacuten de cualquier medida de control (Merz et al 2005)
Con el objetivo de buscar alternativas para alcanzar mayores rangos de sensibilidad en la
deteccioacuten de Sss se han explorado diversas metodologiacuteas basadas en teacutecnicas seroloacutegicas y
moleculares Entre las primeras se destacan la generacioacuten de anticuerpos policlonales que
detectan quistosoros del protozoo bajo un sistema ELISA (Harrison et al 1993 Walsh et
al 1996) Sin embargo la utilidad de estos anticuerpos es reducida debido a que no detecta
el estado plasmodial (Ward et al 2004) Maacutes recientemente Merz et al (2005)
desarrollaron una prueba para la evaluacioacuten rutinaria de la presencia del patoacutegeno basada
17
en anticuerpos monoclonales derivados de quistosoros como antiacutegenos alcanzando niveles
de sensibilidad de menos de un quistosoro por tubeacuterculo A partir de esto se generoacute la
herramienta ldquoSss AgriStriprdquo una prueba basada en un inmunoensayo de flujo lateral cuya
precisioacuten y sensibilidad fue evaluada por Bouchek-Mechiche et al (2011) para la
deteccioacuten de Sss Se comparoacute con teacutecnicas de microscopiacutea ELISA PCR y qPCR que
detectaron Sss en lesiones tiacutepicas de sarna polvosa Asiacute mismo se realizaron pruebas en los
lotes que presentaban lesiones tiacutepicas y atiacutepicas causadas por el patoacutegeno y se confirmoacute la
presencia de Sss en todas las lesiones con todos los meacutetodos probados Se concluyoacute que el
Sss AgriStrip es una prueba tan sensible como DAS- ELISA con un liacutemite de deteccioacuten de 1
a 10 quistosoros por mL de buffer
Con respecto a las metodologiacuteas moleculares se ha utilizado PCR convencional a partir de
los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 (Bulman y Marshall 1998) Sps1Sps2 (Bell et al
1999) y SsFSsR (Qu et al 2006) que amplifican las regiones ITS del ADNr
Los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 disentildeados por Bulman y Marshall (1998) detectaron
Sss en las muestras evaluadas y no presentaron reaccioacuten cruzada con otros
plasmodiophoridos como Spongospora subterranea f sp nasturtii Plasmodiophora
brassicae Sorosphaera veronicae y Polymyxa graminis asiacute como con el causante de la
sarna comuacuten Streptomyces scabies demostrando la utilidad de estos cebadores en la
deteccioacuten de Sss realizada por estos investigadores
Bell et al (1999) obtuvieron secuencias parciales del ITS de 391pb con los cebadores Sps
1 y Sps 2 para la deteccioacuten y cuantificacioacuten de Sss en la corteza tubeacuterculos lavados y
suelos cultivados con papa Las pruebas desarrolladas mostraron ser maacutes sensibles que los
inmunoensayos previamente reportados y fueron maacutes raacutepidas y sencillas que los ensayos
convencionales con plantas trampa
Qu et al (2006) utilizaron la teacutecnica de PCR para la identificacioacuten especiacutefica y
cuantificacioacuten de Sss Los cebadores SsF y SsR amplificaron un producto de 434 pb
proveniente de masas de esporas de Sss pero no se obtuvo el amplicoacuten cuando el ADN era
de papa sana de tubeacuterculos con sarna comuacuten o de otros plasmodiophoridos relacionados
18
Asiacute mismo se detectoacute Sss en otros hospederos infectados que no presentaban siacutentomas y se
concluyoacute que la prueba es tan sensible que puede detectar 1 quiste g-1
Adicionalmente con
esta teacutecnica se logroacute la cuantificacioacuten de Sss en el suelo logrando identificar valores de 1 a
104 quistosoros por 025 g de suelo
La implementacioacuten de meacutetodos para la deteccioacuten de Sss ha permitido el desarrollo de
procedimientos que permiten una raacutepida y automatizada extraccioacuten de ADN combinada
con PCR en tiempo real utilizando sondas Taqmanreg para avanzar en el diagnoacutestico
rutinario de la sarna polvosa (Lees et al 2002 van de Graff et al 2003 Ward et al 2004
Qu et al 2011) o PCR competitivo o cuantitativo (Qu et al 2006 Shah et al 2009) En esta
prueba se utiliza un control interno de ADN de papa (citocromo oxidasa) para hacerla maacutes
confiable y evitar falsos negativos La validacioacuten de dicha metodologiacutea se realizoacute a partir
de la evaluacioacuten de 37 muestras de tubeacuterculos de varios cultivares procedentes de diversas
localidades del Reino Unido La prueba detectoacute el patoacutegeno en todas las muestras que eran
sospechosas de tenerlo asiacute como en tubeacuterculos que no presentaban quistosoros observables
La prueba con la sonda Taqman demostroacute ser 100 veces maacutes sensible que la PCR
convencional (Ward et al 2005) y la ELISA (Ward et al 2004) Estas pruebas han
permitido determinar el efecto del nivel de inoacuteculo en el suelo y de algunos factores
ambientales en la infeccioacuten y desarrollo de agallas en raiacuteces de papa causadas por Sss (van
de Graaf et al 2007) En Gran Bretantildea la teacutecnica de PCR en tiempo real permitioacute detectar
confiablemente y establecer la cantidad de ADN de los quistorosos zoosporas y
plasmodiozoosporangios del patoacutegeno asiacute mismo se determinoacute la viabilidad de los quistes
en el suelo y en combinacioacuten con el uso de plantas trampa se estudioacute la liberacioacuten de
zoosporas y los niveles de infeccioacuten en papa bajo diferentes condiciones ambientales
permitiendo conocer con maacutes detalle varios aspectos de la epidemiologiacutea de la enfermedad
(Lees et al 2008)
Otras variaciones de estas teacutecnicas como la muacuteltiple qPCR utilizando sondas TaqManreg ha
permitido la deteccioacuten y diferenciacioacuten simultaacutenea de la sarna polvosa y la sarna comuacuten
dos enfermedades del tubeacuterculo que causan siacutentomas similares pero que son ocasionadas
por patoacutegenos diferentes (Sss vs Streptomyces spp) (Qu et al 2011) Finalmente como una
19
teacutecnica de diagnoacutestico simultaacuteneo de diferentes patoacutegenos de papa se ha desarrollado un
chip para su anaacutelisis en microarreglos siendo incorporada la deteccioacuten de Sss (Zhang et al
2008)
En Colombia la utilizacioacuten de meacutetodos de deteccioacuten de Sss en tubeacuterculos y suelos ha
estado dada por la evaluacioacuten visual de sintomatologiacuteas en raiacuteces y tubeacuterculos la
evaluacioacuten de bioensayos (Rodriacuteguez et al 2002) y la utilizacioacuten de PCR convencional
utilizando cebadores especiacuteficos (Jaramillo et al 2003 Carrentildeo 2009) Se han utilizado
combinaciones de diversos cebadores que permiten la amplificacioacuten de la regioacuten ITS del
ADNr del patoacutegeno (Spo1-Spo2 Spo8-Spo9 y Sps1- Sps2) los cuales permiten obtener
productos de 372 390 y 391 pb respectivamente (Saavedra et al 2004) Ramiacuterez (2010)
obtuvo amplificacioacuten de los fragmentos del tamantildeo esperado utilizando los cebadores
Spo8Spo9 y SsFSsR para analizar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de Sss
provenientes de La Unioacuten (Antioquia) encontrando una estructura clonal de los
aislamientos evaluados mientras que Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS
y SSCP (Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) con un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones del paiacutes establecioacute la presencia de subpoblaciones del
patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado
34 Variabilidad geneacutetica de Sss
La disponibilidad de cultivares resistentes a Sss debe ser una prioridad en el disentildeo de
futuras estrategias de manejo de la enfermedad Los mejoradores tratan de incluir
resistencia en los nuevos cultivares seleccionando liacuteneas contra un rango de patoacutegenos que
representan la diversidad geneacutetica conocida con el fin de seleccionar la resistencia maacutes
durable Sin embargo poco es conocido acerca de la variacioacuten geneacutetica de Sss o del papel
de la recombinacioacuten sexual en su ciclo de vida (Merz y Falloon 2009)
Los estudios geneacuteticos de Sss han sido difiacuteciles de aplicar debido a razones como las
siguientes obtener y mantener el patoacutegeno es complicado por su naturaleza de paraacutesito
obligado no han existido meacutetodos disponibles para el aislamiento de quistosoros
individuales el desarrollo de la sarna polvosa estaacute influenciado por condiciones
20
ambientales y los estaacutendares de inoculacioacuten y los cultivares de referencia no han sido bien
establecidos (Qu y Christ 2006b)
Los sistemas de deteccioacuten basados en aacutecidos nucleicos ofrecen sensibilidad y especificidad
para la cuantificacioacuten de inoacuteculo (Mutasa et al 1993) En estudios previos amplificando
regiones del ITS del ADNr fueron identificados dos agrupaciones de Sss en Australia y
Europa (tipo I y II) (Bulman y Marshall 1998) Posteriormente se realizoacute una
investigacioacuten sobre la variabilidad geneacutetica de 52 aislamientos de Islas Britaacutenicas y
Norteameacuterica que fueron amplificados por PCR Se identificaron dos grupos geneacuteticamente
diferentes (I y II) que representaron el 346 y el 654 de los aislamientos
respectivamente Sin embargo en Norteameacuterica los aislamientos soacutelo perteneciacutean al grupo
II (Qu y Christ 2004) Debido a que el anaacutelisis de secuencia de ITS se basa en un solo
locus para la deteccioacuten de la variacioacuten geneacutetica los anaacutelisis con marcadores moleculares
que comprendan diferentes partes del genoma del patoacutegeno son necesarios para obtener una
imagen amplia de la variacioacuten geneacutetica y estructura poblacional de Sss
El uso de marcadores moleculares tales como RAPDs (ADN polimoacuterfico amplificado al
azar) y AFLPs (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados) han sido
usados para estudiar la diversidad geneacutetica en muchos patoacutegenos de plantas sin embargo
tales marcadores no estaacuten disponibles para Sss Es complejo obtener estructuras
individuales del patoacutegeno y la uacutenica forma es la obtencioacuten de quistosoros que pueden traer
contaminantes secundarios o contener tejido de la planta Por lo tanto es difiacutecil obtener
ADN puro del patoacutegeno un paso indispensable para llevar a cabo la PCR basada en
marcadores moleculares (Qu y Christ 2006b)
Wuumlerzer (1964) caracterizoacute 17 colecciones de Sss de Europa y Ameacuterica seguacuten el tamantildeo
del quistosoro pero no encontroacute evidencia bioloacutegica significativa de este agrupamiento
Posteriormente se detectoacute variacioacuten geneacutetica (divergencia 51) en secuencias de ADN de
los ITS1 e ITS2 de colecciones de Sss originarias de diferentes continentes (Bulman y
Marshall 1998) Las colecciones de Australasia y Europa incluidas en el grupo II diferiacutean
de otra coleccioacuten de Escocia que fueacute ideacutentica a dos colecciones de Sur Ameacuterica agrupadas
21
en el tipo I La existencia de estos grupos fue confirmada por Qu y Christ (2004) quienes
tambieacuten identificaron ambos grupos en colecciones de Escocia pero demostraron que soacutelo
la secuencia de tipo II es de ocurrencia en colecciones de Canadaacute y Estados Unidos
Los marcadores RFLPs (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccioacuten) son
codominantes y locus especiacutefico (McDonald y Martiacutenez 1990) Han sido utilizados
ampliamente para evaluar diversos genomas de patoacutegenos de plantas A pesar de que
consumen maacutes tiempo que los meacutetodos basados en PCR los RFLPs son maacutes reproducibles
y menos sensibles a contaminacioacuten de ADN que las pruebas basadas en PCR Qu y Christ
(2006b) realizaron un estudio maacutes detallado de colecciones de quistosoros obtenidas de
Estados Unidos y Canadaacute empleando marcadores RFLPs Encontraron variacioacuten geneacutetica
entre las localidades geograacuteficas pero no entre los individuos de una misma localidad lo
que sugirioacute que las poblaciones del campo son clones y no estaban sometidas a
recombinacioacuten sexual El anaacutelisis de agrupamiento permitioacute separar los aislamientos en
dos grupos el grupo I que incluyoacute aislmientos del oeste de Norte Ameacuterica (exceptuando
aislamientos de Colorado) y el grupo II incluyoacute aislamientos originarios del este de Norte
Ameacuterica y de Colorado Este estudio muestra que el uso de marcadores moleculares para
diferenciar aislamientos de quistosoros individuales facilitaraacute investigaciones adicionales
para determinar la estructura geneacutetica de poblaciones de Sss
En Colombia Ramiacuterez (2010) realizoacute un estudio sobre la variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss de La Unioacuten Antioquia Encontroacute que los anaacutelisis de secuencias de la
regioacuten ITS del ADNr presentaron altos niveles de similitud con cepas obtenidas del
Departamento de Narintildeo asiacute como con secuencias de referencia de cepas del tipo II de Sss
Este resultado permitioacute plantear que el patoacutegeno presenta un comportamiento clonal
aunque es necesario obtener informacioacuten de otras regiones del genoma que permitan
realizar anaacutelisis de muacuteltiples loci que conduzcan a una mayor aproximacioacuten sobre las
condiciones de variacioacuten de este patoacutegeno en el paiacutes
Otro estudio realizado por Carrentildeo (2009) sobre la variabilidad geneacutetica de Sss en
Colombia mediante el anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr permitioacute establecer la
22
presencia de subpoblaciones del patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Se
encontroacute una asociacioacuten directa entre las secuencias ITS del patoacutegeno y el oacutergano de la
planta infectado El tipo de ITS I se asocia aparentemente con infecciones de tubeacuterculo y el
tipo de ITS II lo hace con infecciones de raiacutez Esta investigacioacuten permitioacute descartar la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar hospedero o zona
geograacutefica Sin embargo de acuerdo con esta investigacioacuten es necesario realizar pruebas
que aborden otras aacutereas del genoma para corroborar los resultados encontrados Asiacute mismo
se comproboacute que en el paiacutes existen variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las
reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno Tres
variantes geneacuteticas de las cinco encontradas en este estudio difieren de las reportadas en la
literatura mundial
35 Generalidades del Potato mop-top virus (PMTV)
El PMTV es el agente causal de una importante enfermedad viral del cultivo de la papa
cuya distribucioacuten se encuentra registrada en diferentes lugares productores de este
tubeacuterculo como Irlanda Inglaterra Escocia Republica Checa Suiza Noruega Suecia
Dinamarca y Finlandia (Santala et al 2010) asiacute como en Japoacuten (Nakayama et al 2010) En
Ameacuterica ha sido registrado en Canadaacute y Estados Unidos (Xu et al 2004) En eacuteste uacuteltimo
paiacutes se reportoacute recientemente en los estados de North Dakota (David et al 2010) y en
Washington (Crosslin 2011) Nuevos reportes de este virus se continuan presentado en
otros paiacuteses del mundo como Polonia (Budziszewska et al 2010)
En Ameacuterica Central se ha encontrado en Costa Rica (Montero-Astua 2008) y aunque se
considera que es originario de la regioacuten de los Andes (Surameacuterica) soacutelo fue detectado en
Colombia en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) con la reconfirmacioacuten de su presencia en el antildeo
2010 (Gil et al 2011) El PMTV puede causar peacuterdidas de hasta 26 en rendimiento lo
que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera ascender a valores de
50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 Guerrero 2000) Seguacuten Salazar (2006)
el PMTV es uno de los virus que ha sido prevalente en el cultivo de la papa en los Andes
23
suramericanos pero su efecto sobre las variedades cultivadas en esta regioacuten no se ha
cuantificado claramente
351 Taxonomiacutea de PMTV
El PMTV pertenece al geacutenero Pomovirus virus con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20
nm en diaacutemetro y tres partiacuteculas con longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm
El geacutenero Pomovirus deriva su nombre de la especie tipo Potato mop-top virus y
actualmente se ubica en el la familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Los anaacutelisis
filogeneacuteticos de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRps) indican que el PMTV
estaacute relacionado maacutes estrechamente con el Beet soil-borne virus (Pomovirus) Broad bean
necrosis virus (Pomovirus) y Soil-borne Wheat mosaic virus (Furovirus) (Savenkov et al
1999)
Contiene tres moleacuteculas de ARNss con tamantildeos de 64 kb 3 kb y 25 kb con caperuzas
hacia el extremo 5rsquo y una estructura tipo ARNt hacia el extremo 3rsquo (Savenkov et al 1999
2003) El coeficiente de sedimentacioacuten de las partiacuteculas es de 230 170 y 125S
respectivamente El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene motivos de
metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del codoacuten de
finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999) Cerca del extremo
3acutedel ARN 2 se presenta una proteiacutena asociada a la transmisioacuten por el vector y generada a
partir de la supresioacuten del codoacuten de terminacioacuten del ORF que codifica para la caacutepside (CP)
Esta proteiacutena parece ser la responsable de la peacuterdida de la estructura helicoidal en los
extremos del ARN durante el proceso de desensamblaje (Sandgren et al 2001) El ARN 3
codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Tres de las
proteiacutenas producidas (TGB1 TGB2 y TGB3) estaacuten involucradas en el movimiento ceacutelula a
ceacutelula (Zamyatnin et al 2004) La funcioacuten de la cuarta proteiacutena una proteiacutena rica en
cisteiacutena parece ser la de actuar en el incremento de la virulencia sin embargo no es
indispensable para el proceso infectivo (Lukhovitskaya et al 2005) (Figura 1)
24
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV En las cajas se observan las proteiacutenas
para las que codifica el genoma Las flechas indican las proteiacutenas originadas y los ARN
subgenoacutemicos (ARNsg) Fuente httpwwwexpasychviralzoneall_by_species643html
Modificado por Gallo (2012)
352 Ciclo de la infeccioacuten de PMTV
La especie PMTV es transmitida por zoosporas de Sss que afecta los sistemas radiculares
de sus hospedantes Este virus tambieacuten puede ser transmitido por semilla asexual El virus
puede permanecer en las estructuras de resistencia de sus vectores por varios antildeos en el
suelo (Astier et al 2007 Dijkstra y Khan 2006) En los ensayos de transmisioacuten del virus se
ha observado que eacuteste es transmitido eficientemente a plantas indicadoras (ej N tabacum y
N benthamiana) a partir de muestras de suelo infestadas con quistes del patoacutegeno
(Campbell 1996 Veacutelez 2007)
25
El PMTV constituye un pequentildeo grupo de virus que para su movimiento sisteacutemico en la
planta hospedante no requiere de la expresioacuten de CP ni de la formacioacuten del virioacuten
(McGeachy y Barker 2000) debido a que el TGB le ofrece la posibilidad de mover el ARN
infeccioso a traveacutes de largas distancias en la planta (Melander et al 2001) Actualmente se
generan nuevas teoriacuteas acerca del movimiento de TGB en la planta y de la funcioacuten de cada
una de las proteiacutenas TGBp1 TGBp2 y TGBp3 en el movimiento ceacutelula a ceacutelula de PMTV
Shemyakina et al (2011) analizaron la localizacioacuten subcelular y el transporte de TGBp1
de acuerdo con los resultados obtenidos propusieron que la asociacioacuten de TGBp1 con los
microtuacutebulos puede ser importante para la formacioacuten de cuerpos de complejos de ribo-
nuacutecleo-proteiacutena viral destinada para el transporte a traveacutes de los plasmodesmos Estudios
similares han sido realizados por Wright et al (2010) cuyos resultados sugieren que TGB1
en PMTV requiere interaccioacuten con componentes nucleolares y posiblemente con
microtuacutebulos para el movimiento viral de ARN de larga distancia
El ARN desnudo se puede encontrar en tubeacuterculos asintomaacuteticos y causar una infeccioacuten
secundaria para la siguiente temporada de siembra (McGeachy y Barker 2000) La
manifestacioacuten de los siacutentomas caracteriacutesticos de la enfermedad depende de la presencia de
los tres ARN en el tejido (Savenkov et al 2003)
353 Rango de hospederos de PMTV
En condiciones experimentales el virus puede infectar plantas de las familias
Chenopodiaceae Solanaceae y Tetragoniaceae Dentro de estas se encuentran las plantas
que se usan para su diagnoacutestico las cuales corresponden a Nicotiana debneyi y
Chenopodium amaranticolor en las que se produce necrosis sisteacutemica y lesiones locales
conceacutentricas cafeacutes respectivamente Nicotiana benthamiana N debneyi N clevelandii y
N tabacum son las especies maacutes apropiadas para el mantenimiento y propagacioacuten del virus
bajo condiciones experimentales (ICTVdB 2006 Veacutelez 2007)
26
354 Siacutentomas causados por PMTV
La enfermedad inducida por PMTV presenta una amplia gama de siacutentomas dependiendo de
la variedad y de las condiciones ambientales siendo frecuente la presencia de anillos y
arcos de colores oscuros sobre la superficie de los tubeacuterculos mientras que internamente se
presentan arcos necrosados En infecciones secundarias los tubeacuterculos pueden mostrar
agrietamientos reticulados y profundos Adicionalmente los foliacuteolos de las plantas
afectadas pueden presentar moteados cloroacuteticos y liacuteneas con formas de V En la regioacuten
Andina la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos no es frecuente de observar pudiendo ser
igualmente inducidas por cepas necroacuteticas de PVY oacute por Streptomyces spp y Rhizoctonia
solani (Tenorio et al 2006) A nivel aeacutereo el virus tambieacuten puede inducir amarillamientos
enanismos y acortamiento de entrenudos (Salazar 1995)
En Escocia se estudioacute el efecto de los siacutentomas foliares causados por PMTV sobre el
rendimiento del cultivo los siacutentomas foliares y en el tubeacuterculo de varias generaciones de
siembra para la propagacioacuten de semilla de papa Se encontroacute que en los tubeacuterculos de
plantas sin siacutentomas rara vez se observan los siacutentomas foliares en la siguiente generacioacuten
Las plantas asintomaacuteticas produjeron maacutes tubeacuterculos infectados cuando eran derivadas de
plantas que presentaron siacutentomas foliares el antildeo anterior Adicionalmente la proporcioacuten de
plantas hijas con siacutentomas foliares provenientes de tubeacuterculos con siacutentomas foliares
tuvieron un rango de 19-41 en el antildeo y parecioacute estar asociado con la severidad de dichos
siacutentomas Asiacute mismo el siacutentoma de ldquospraingrdquo en los tubeacuterculos tendioacute a ser mayor en
plantas que presentaban siacutentomas foliares comparados con aquellas asintomaacuteticas Estos
resultados mostraron que la erradicacioacuten de plantas con siacutentomas foliares podriacutea mejorar la
fitosanidad del cultivo pero resulta impraacutectico cuando las plantas enfermas son muy
frecuentes (Carnegie et al 2010) Sin embargo los siacutentomas foliares son raramente
observados en variedades cultivadas actualmente en los paiacuteses noacuterdicos con excepcioacuten de
Noruega La razoacuten para estas diferencias de la etiologiacutea de la enfermedad no son
comprendidas pero puede ser que el clima marino maacutes huacutemedo en Noruega y Escocia
afecta la fisiologiacutea de la planta de papa e incrementa la infeccioacuten sisteacutemica por PMTV
(Santala et al 2010)
27
36 Deteccioacuten de PMTV
Para la deteccioacuten de PMTV se han utilizado diversas teacutecnicas de laboratorio Las primeras
pruebas incluyeron bioensayos con plantas indicadoras como Chenopodium amaranticolor
las cuales desarrollan los siacutentomas cuando son infectadas por PMTV Esta teacutecnica resulta
informativa pero tarda alrededor de 14 diacuteas para la expresioacuten de siacutentomas que en
ocasiones no son completamente confiables (Jeffries 1998)
Con el desarrollo de las pruebas ELISA se hizo posible la deteccioacuten de PMTV en dos diacuteas
sin embargo la generacioacuten de falsos negativos debido a la distribucioacuten erraacutetica del virus en
la planta ha hecho que se cuestione dicha teacutecnica Arif y Torrance (1996) realizaron
estudios de deteccioacuten de PMTV en muestras de tubeacuterculos de tres cultivares de papa
concluyendo que la combinacioacuten de tejidos de tubeacuterculos en la muestra incrementa la
probabilidad de deteccioacuten del virus En Dinamarca la utilizacioacuten de la teacutecnica DAS -
ELISA (Sandwich de anticuerpos doble - Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas)
tuvo alta confiabilidad para el seguimiento de la presencia de PMTV en 23 cultivares de
papa sembrados en campo (Nielsen y Moslashlgaard 1997)
La utilizacioacuten de teacutecnicas basadas en aacutecidos nucleicos ha llevado al desarrollo de meacutetodos
de deteccioacuten de alta sensibilidad La RT-PCR es uno de estos meacutetodos de deteccioacuten maacutes
sensible Arif et al (1994) compararon la confiabilidad de ELISA y RT-PCR en la
deteccioacuten de PMTV de raiacuteces y hojas de plantas trampa de Nicotiana debneyi Luego de
tres semanas de siembra la RT-PCR detectoacute el virus en ambos tejidos mientras que con
ELISA se obtuvo la deteccioacuten del virus soacutelo despueacutes de cinco semanas de la siembra A
pesar de que la teacutecnica RT-PCR es maacutes sensible la preparacioacuten de las muestras para este
meacutetodo lleva maacutes tiempo por lo tanto ELISA es considerada por algunos investigadores
como la teacutecnica maacutes econoacutemica y conveniente para el anaacutelisis rutinario de grandes
cantidades de muestras (Davey 2009)
Davey (2009) realizoacute estudios de deteccioacuten y cuantificacioacuten de PMTV utilizando qRT-
PCR y disentildeando un par de cebadores y una sonda para cada ARN del genoma del virus El
bioensayo desarrollado para las muestras de suelo fue muy efectivo en la deteccioacuten de
28
PMTV utilizando Solanum esculentum cv Monkeymaker como planta trampa y cuando se
usoacute en conjunto con qRT-PCR los resultados se obtuvieron maacutes raacutepidamente que los de
otros bioensayos previamente descritos por Arif et al (1994) quienes utilizaron
Chenopodium quinoa como planta trampa
Otros meacutetodos basados en RT-PCR han sido empleados en Japoacuten por Nakayama et al
(2010) mediante microplacas de hibridizacioacuten RT-PCR (RT-PCR-MPH) para la deteccioacuten
de PMTV con cebadores especiacuteficos y una sonda marcada en muestras provenientes de
raiacuteces de plantas de tomate Asiacute mismo el diagnoacutestico en muestras de suelo utilizando este
meacutetodo determinoacute que el 612 de los lotes muestreados estaban infectados con PMTV
La hibridizacioacuten especiacutefica basada en amplificacioacuten con cebadores con marcadores
fluorescentes (Flash-PCR) tambieacuten ha sido una teacutecnica basada en PCR que ha permitido la
deteccioacuten raacutepida y precisa de diferentes virus de la papa como el PMTV (Ryazantsev y
Zavriev 2009) De otro lado los microarreglos con sondas especiacutefica para virus pueden
detectar un nuacutemero casi ilimitado de especies de virus en un solo ensayo Nicolaisen
(2011) realizoacute un estudio de microarreglos con la utilizacioacuten de 152 sondas potencialmente
capaces de detectar 52 virus en papa (incluyendo PMTV) Las hibridizaciones del ADNc de
plantas infectadas mostraron que 49 de los 52 virus fueron positivos e identificados
correctamente a nivel de especie demostrando que esta teacutecnica puede contribuir a la
construccioacuten de microarreglos geneacutericos capaces de detectar la mayoriacutea sino todos los
virus de ARN de plantas
En Colombia la deteccioacuten de PMTV fue reportada por primera vez por Veacutelez (2007) Los
ensayos de RT-PCR permitieron determinar que el 81 de los suelos muestreados en el
estudio presentaron infeccioacuten por PMTV Este meacutetodo utilizando los cebadores H360
C819 fue maacutes sensible para la deteccioacuten de PMTV que la induccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras En estos bioensayos se encontroacute que las plantas de N tabacum fueron mejores
indicadoras de la expresioacuten de siacutentomas que las de N debneyi pero estas uacuteltimas son maacutes
sensibles para la deteccioacuten de PMTV por RT-PCR
29
Gil (2010) realizoacute la evaluacioacuten de la presencia del virus PMTV a partir de plantas de N
benthamiana inoculadas con quistosoros de Sss mediante pruebas de deteccioacuten seroloacutegica y
molecular Un total de 18 muestras de raiacuteces infectadas con Sss fueron evaluadas
encontraacutendose que cinco muestras de Antioquia y una de Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo
arrojaron resultados positivos en las pruebas de ELISA Al comparar estos resultados con
los obtenidos con qRT-PCR se encontroacute que la prueba de qRT-PCR determinoacute la presencia
del virus en el 45 de las muestras analizadas mientras que mediante ELISA y RT-PCR
convencional se diagnosticaron 25 y 28 de las muestras como positivas Sin embargo el
anaacutelisis estadiacutestico no indicoacute diferencias significativas al nivel del 95 entre las tres
pruebas analizadas Al observar individualmente la capacidad de las pruebas para detectar
PMTV resultoacute llamativo el hecho que algunas muestras fueran positivas para dos de las
tres pruebas e incluso se presentaron casos en los que la prueba de ELISA detectoacute el virus
pero no las pruebas basadas en RT-PCR lo cual sugirioacute problemas con la inhibicioacuten de las
reacciones enzimaacuteticas o con los cebadores empleados
37 Variabilidad geneacutetica de PMTV
A nivel mundial se han desarrollado investigaciones que reportan la presencia de bajos
niveles de variacioacuten entre genotipos de PMTV (Mayo et al 1996) Latvala-Kilby et al
(2009) caracterizaron el gen de la CP y un dominio de lectura continua del ARN 2 asiacute
como el gen 8K y la regioacuten no traducida 3acutedel ARN 3 (UTR) de 37 aislamientos de
Finlandia y Letonia Fueron encontrados dos tipos diferenciables de ARN 2 y ARN 3 La
secuenciacioacuten y los anaacutelisis de RFLP de los productos de PCR de dichas regiones
indicaron que la mayoriacutea de los aislamientos de PMTV que infectaron tubeacuterculos en estos
paiacuteses europeos comprenden los restrictotipos ARN 2-II y ARN 3-B
En estudios previos en los cuales las secuencias CP de tres aislamientos de Escocia y ocho
de Peruacute fueron analizadas por Mayo et al (1996) las cepas bajo anaacutelisis mostraron poca
variabilidad De forma similar las secuencias CP de seis aislamientos de Norteameacuterica
presentaron una identidad mayor al 97 con respecto a algunas secuencias de aislamientos
de PMTV de Europa (Xu et al 2004) En Dinamarca se reportoacute la presencia de dos grupos
30
de PMTV basado en anaacutelisis de las secuencias de CP encontrando que eacutestos comparten
98 de identidad pero con posibles diferencias en la reproduccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras (Nielsen y Nicolaisen 2003) Al parecer la variabilidad geneacutetica de los genes
de la CP en aislamientos de PMTV del norte de Europa y Norte Ameacuterica es limitada y
permite la deteccioacuten confiable del virus con los anticuerpos monoclonales y los cebadores
de la PCR usados actualmente (Santala et al 2010)
En Colombia Velez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo con alta identidad con aislamientos de Europa
y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por aislamientos colombianos Una
situacioacuten similar encontroacute Gil (2010) con aislamientos Colombianos de PMTV que
presentaron una estructura poblacional con bajos niveles de variabilidad pero con algunas
variantes divergentes con respecto a los genotipos de referencia mundial Dichas variantes
presentaron diferencias en sus secuencias de CP hasta del 24 con respecto al grupo
principal La contextualizacioacuten en el genoma viral de dos secuencias obtenidas por dicho
autor en cepas de PMTV del departamento de Antioquia indicoacute que se tratan de
aislamientos representativos del genoma ordinario de PMTV y no de las variantes
encontradas en el anaacutelisis filogeneacutetico Sus identidades para las porciones del ARN 2 y
ARN 3 secuenciadas fueron altas (gt97) con respecto a los genomas reportados en
trabajos anteriores (Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) por lo que se plantea la
necesidad de secuenciar dichas regiones en al menos un aislamiento de las variantes
referidas
Los resultados encontrados en esta investigacioacuten permiten plantear que el caso de PMTV
en Colombia es aparentemente singular dada la presencia de dos variantes geneacuteticas de los
altos niveles de infeccioacuten que genera Sss en cultivos de papa de diferentes departamentos y
de las diferencias notables en la manifestacioacuten de siacutentomas de la sarna polvosa entre
variedades locales (Carrentildeo 2009 Gilchrist et al 2009 Gil 2010) situacioacuten que amerita
continuar con los estudios de variabilidad geneacutetica y fenotiacutepica en dichos patosistemas
31
BIBLIOGRAFIA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Agrios GN 1996 Fitopatologiacutea Editorial Limusa Meacutexico
Andersen BAB Nicolaisen M Nielsen SL 2002 Alternative hosts for Potato mop-top
virus genus Pomovirus and its vector Spongospora subterranea Potato Research 45 37-
43
Arias CMM 2011 Anaacutelisis y comparacioacuten de los glucosinolatos presentes en diferentes
acceciones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control
del patoacutegeno de la papa Spongospora subterranea Tesis de Maestriacutea en Ciencias Quiacutemicas
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Departamento de quiacutemica
Bogataacute Colombia
Arif M Torrance L Reavy B 1994 Improved efficiency of detection of potato mop- top
furovirus in potato tubers and in the roots and leaves of soil-bait plants Potato Research
37 373-381
Arif M Torrance L 1996 Detection of Potato mop-top virus in potato tubers Proceedings
Crop Protection in Northern Britain 325-330
Astier S Albouy J Maury Y Robaglia C Lecoq H 2007 Principles of plant virology
genome pathogenicity virus ecology Science Publishers Enfield NH USA P 112
Bell KS Roberts J Verral S Cullen DW Williams NA Harison JG 1999 Detection and
quantification of Spongospora subterranea fsp subterranea in soils and on tubers using
specific primers PCR primers European Journal of Plant Pathology 105905-915
Benavides PJA 2006 Incidencia y severidad de la rontildea de la papa causada por
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh f sp subterranea Tomlinson en raiacuteces y
tubeacuterculos de Diacol Capiro y Parda Pastusa en tres eacutepocas de siembra en el departamento
32
de Narintildeo y su efecto en los rendimientos (Tesis de maestriacutea) Bogotaacute Colombia Facultad
de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid diagnostic
test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European Journal of Plant
Pathology 131 (2) 277-287
Budziszewska M Wieczorek P Nowaczyk K Borodynko N Pospieszny H Obrecircplaska-
Stecircplowska A 2010 First report of potato mop-top virus on potato in Poland Plant
Disease 94 (7) 920
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47759-766
Campell RN 1996 Fungal transmission of plant viruses Annuals Review of
Phytopathology 3487-108
Carnegie SF Cameron AM McCreath M 2010 Foliar symptoms caused by Potato mop-
top virus on potato plants during vegetative propagation in Scotland and their association
with tuber yield spraing and tuber infection Potato Research 53 83-93
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia (Tesis de Maestriacutea) Bogotaacute
Colombia Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Colombia
Cerovska N Pecenkeva T Filigarovaacute M Dedic P 2007 Sequences analysis of the Czech
Potato Mop-Top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica 52(1) 61-
64
Cotes J Jaramillo S Gonzaacutelez L 2006 Evaluacioacuten de la incidencia de sarna polvosa en
tres variedades de papas colombianas Congreso Internacional de papa John S
Niederhauser Meacutexicop O-7 ISBN 968-02-0270-4
33
Crosslin JM 2011 First report of potato mop-top virus on potatoes in Washington State
Plant Disease 95 (11)1483
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
David N Mallik I Crosslin JM Gudmestad NC 2010 Firt report of Potato mop-top virus
in North Dakota Plant Disease 94 (12)1506
Dick MW 2001 Straminipilous fungi systematic of the Peronosporomycetes including
accounts of the marine straminipilous protist the plasmodiophorids and similar organisms
Kluwer Dordrecht
Dijkstra J Khan JA 2006 Handbook of Plant Virology Haworth Press Inc New York
US Jawaid A Khan Jeanne Dijkstra editors P 452
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC Scott CL 2010 Elevated zinc and manganese
levels give moderate reductions in Spongospora subterranea infection of potato roots In
Proceedings 6th Australasian Soilborne Diseases Symposium Twin Waters Queensland 9-
10 August 2010 P 46
Falloon RE Russell AG Wallace AR Butler RC 2003 Susceptibility of potato (Solanum
tuberosum) cultivars to powdery scab (caused by Spongospora subterranea) and
relationships between tuber and root infection Australasian Plant Pathology 32377-385
FAO 2008 Antildeo internacional de la papa (Citado 14 enero 2011) Disponible en
httpwwwpotato2008orgesmundoamerica_latinahtml
FAO 2009 Sustainable potato production Guidelines for developing countries (Citado 14
enero 2011) Disponible en ftpftpfaoorgdocrepfao012i1127ei1127epdf
34
Gallo GYM 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea Facultad de Medicina Universidad Nacional de Colombia
Bogotaacute Colombia
Garciacutea C Navia E 2002 Evaluacioacuten de estrateacutegias de manejo de la rontildea polvosa
(Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en Colombia
(Citado 14 Ene 2011) Disponible en
httpwwwredepapaorgpracticasculturalesred3html
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Gil RJF Mariacuten M 2010 Diagnoacutestico y caracterizacioacuten molecular de virus asociados al
cultivo de la papa en Colombia con eacutenfasis en el virus Mop Top (PMTV Pomovirus)
(Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia
Gilchrist RE 2009 Alternativas para el manejo integrado de la sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) (Tesis de Doctorado) Medelliacuten Colombia
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia
Gilchrist E Jaramillo S Reynaldi S 2009 Efecto sobre la sarna polvosa de cuatro
aislamientos del hongo Trichoderma asperellum en tres tipos de suelo Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 624783ndash4792
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
35
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tuber by enzyme-linked immunosorbent assay Plant pathology
42181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato-a review
Plant pathology 461-25
Hoyos L Peacuterez JC Jaramillo S Orduz S Ntildeustez C 2002 Evaluacioacuten del efecto de
Trichoderma spp sobre Spongospora subterranea en papa variedad Diacol Capiro bajo
condiciones de invernadero Subproyecto 4 de Evaluacioacuten de las estrategias de manejo de la
rontildea polvosa (Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en
Colombia 2002 Disponible en wwwcevipapaorgco
Hoyos CL Villegas OM Gonzalez JEP 2009 Observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Spongospora subterranea f sp subterranea en papa Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 62(2) 5039-5045
Houser AJ Davidson RD 2010 Development a greenhouse assay to evaluate potato
germplasm for susceptibility to powdery scab American Journal of Potato Research 87
285-298
ICTVdB 2006 Management Potato mop-top virus The Universal Virus Database version
4 Buumlchen-Osmond C (Ed) Columbia University New York USA (Citado 20 Dic 2010)
Disponible en httpwwwncbinlmnihgovICTVdbICTVdB00086001001htm
Jaramillo S Calderoacuten H Narvaacuteez C Machuca A Afanador L Hincapieacute L Correa G 2003
Caracterizacioacuten de la variabilidad patogeacutenica y molecular de Spongospora subterranea
Informe final fase 2 Convenio Universidad Nacional Sede Medelliacuten y CEVIPAPA
Medelliacuten p 80
Jaramillo S Gonzaacutelez L Cotes J 2006 Efecto del tipo de suelo sobre la sarna polvosa
causada por Spongospora subterranea f sp subterranea (Wall) Lagerheim en papa
36
Congreso Internacional de papa John S Niederhauser Meacutexico p O-6ISBN 968-02-0270-
4
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos cultivares de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista de la Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 60(2)
3859-3876
Jaramillo VS Peacuterez AGA Hoyos CLM 2008 Variacioacuten morfoloacutegica de quistosoros de
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh fsp subterranea Revista Facultad de
Agronomiacutea ndash Medelliacuten 61(2)4511-4517
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Jones RAC Harrison BD 1969 The behaviour of Potato mop top virus in soil and
evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wall) Lagerh Annals Applied
Biology 63 1-17
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 71 47-57
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003 First
Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease 87872
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99(5)519-531
Lees AK 2000 Summary of the session on past and present research on powdery scab
Past and present Research Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery
scab Workshop Aberdeen Scottland July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) P 55-57
37
Lees AK van de Graaf P Cullen DW Duncan JM 2002 The development of a
quantitative real-time PCR assay for Spongospora subterranea f sp subterranea and its
use in epidemiological studies In Proceedings of the 5th
symposium of the international
working group on plant viruses with fungal vectors Institute of Plant Science Swiss
Federal Institute of Technology (ETH) Zurich Switzerland July 22-25 2002 P31
Lees AK van de Graaf P Wale S 2008 The identification and detection of Spongospora
subterranea and factors affecting infection and disease American Journal of Potato
Research 85 247-252
Lister RA Falloon RE Curtin D Butler C 2004 Spongospora subterranea reduces host
(Solanum tuberosum) growth Proceedings of 3rd
Australasian Soilborne Diseases
Symposium Barossa Valley South Australia 9-11 February 2004
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization and
effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal of
General Virology 862879-2889
Lyman GR Rogers JT 1915 The native habitat of Spongospora subterranea Science
42940-2
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2005 La cadena de la papa en
Colombia Una mirada a su estructura y dinaacutemica 1991-2005 Documento de trabajo Ndeg 54
(Citado 13 Ene 2011) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet2005112163731_caracterizacion_papapdf
MADR (Ministerio de agricultura y desarrollo rural) 2006 Observatorio agrocadenas
Colombia Documento de trabajo No 100 La cadena de la papa en Colombia Una mirada
global de su estructura y dinamica 1991-2005 (Citado 20 Dic de 2011) Disponible en
httpwwwagrocadenasgovco
38
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009a Memorias 2008- 2009
(Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwminagriculturagovcoarchivosmemorias_minagricultura_2009_completopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009b Anuario estadiacutestico del
sector agropecuario y pesquero Direccioacuten de poliacutetica sectorial Grupo sistemas de
informacioacuten Bogotaacute DC (Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwhtm3bpublicanuarioanuariopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural)ndashENA (Encuesta Nacional
Agropecuaria) 2009 Oferta Agropecuaria cifras 2009 (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet201046112648_RESULTADOS_ENA_200
9pdf
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C Salazar
LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top virus
from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
McDonald BA Martinez JP 1990 Restriction fragment length polymorphisms in Septoria
tritici occur at a high frequency Current Genetics 17133-138
McGeachy KD Barker H 2000 Potato mop-top virus RNA can move long distance in the
absence of coat protein Evidence from resistant transgenic plants Molecular Plant
Microbe Interactions 13125-128
Melander M Lee M Sandgren M 2001 Reduction in Potato mop-top virus accumulation
and incidence in tubers of potato transformed with a modified triple gene block gene of
PMTV Molecular Breeding 8197-206
Merz U 1989 Infectivity inoculum density and germination of Spongospora subterranea
resting spores a solution culture test system Bulletin OEPP 19 585-592
39
Merz U 2000 Powdery scab Research in Switzerland Past and present Research
Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery scab Workshop Scottland
July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) 2000 p 67-71
Merz U 2008 Powdery Scab of PotatomdashOccurrence Life Cycle and Epidemiology
American Journal of Potato Reserch 85241ndash246
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar
x environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Merz U Martiacutenez V Schwaumlrzel R 2004 The potencial for the rapid screening of potato
cultivars (Solanum tuberosum) for resistance to powdery scab (Spongospora subterranea)
using a laboratory bioassay European Journal of Plant Pathology 110 71-77
Merz U Walsh JA Bouchek-Mechiche K Oberhaumlnsli TH Bitterlin W 2005 Improved
immunological detection of Spongospora subterranea European Journal of Plant
Pathology 111371ndash379
Merz U Falloon RE 2009 Review Powdery scab of potato-increased knowledge of
pathogen biology and disease epidemiology for effective disease management Potato
Research 5217-37
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert HR 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar x
environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Montero-Astua M Vasquez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
40
Murakami H Tsushima S Akimoto T Murakami K Goto I Shishido Y 2000 Effects of
growing leafy daikon (Raphanus sativus) on populations of Plasmidiophora brassicae
(clubroot) Plant Pathology 49584-589
Mutasa ES Ward E Adams MJ Collier CR Chwarszcynska D Asher MJC 1993 A
sensitive DNA probe for the detection of Polymyxa betae in sugar beet roots Physiological
and Molecular Plant Pathology 43 379-390
Mutasa-Gottgens ES Chwarszczynska Halsey H Asher MJC 2000 Specific polyclonal
antibodies for the obligate plant parasite Polymyxa a targeted recombinant DNA approach
Plant Pathology 49276-87
Nakayama T Maoka T Hataya T Motoshige S Fuwa S Mori M 2010 Diagnosis of
Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-285
Nicolaisen M 2011 An oligonucleotide-based microarray for detection of plant RNA
viruses Journal of Virological Methods 173 137-143
Nielsen SL Moslashlgaard JP 1997 Incidence appearance and development of potato mop-top
furovirus-induced sprain in potato cultivars and the influence on yield distribution in
Denmark and detection of the virus in tubers by ELISA Potato Research 40101-110
Nielsen S Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups within
Potato mop-top virus Archives of Virology 148381ndash388
Nitzan N Boydston R Batchelor D Crosslin J Brown C 2009 Hairy nightshade is an
alternative host of Spongospora subterranea the potato powdery sacab pathogen
American Journal of Potato Research 86 297-303
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
41
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006a The host range of Spongospora subterranea f sp subterranea in
the United States American Journal of Potato Research 83343-347
Qu XS Christ BJ 2006b Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea fsp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Ramiacuterez GJG 2010 Variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp subterranea
en suelos del municipio de unioacuten cultivados con la coleccioacuten Central colombiana de
Solanum phureja (Tesis de Pregrado) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias
Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia 2010
Restrepo DAF Jaramillo VS Cotes TJM 2009 Efecto de dos microorganismos y un
consorcio de micorrizas en combinacioacuten con viruta de pino sobre el control de sarna
polvosa (Spongospora subterranea) en papa Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea
Medelliacuten 62(2) 5047-5054
Rodriacuteguez K Maldonado Y Murcia L Huertas W Vaacutesquez M Zambrano A Rivero R
Garciacutea C 2002 Evaluacioacuten de protocolos para la deteccioacuten de patoacutegenos del suelo en Papa
(Rhizoctonia Rosellinia y Spongospora) (Citado 15 Ene 2011) Disponible en
httpwwwtodopapacomarpdfprotocolospdf
42
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista Facultad Agronomiacutea 26 (4) Caracas
Ryazantsev DYu Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato plant pathogens Applied Molecular Biology 43(3) 515-523
Saavedra SCO Goacutemez GST Aacutengel DJE 2004 Deteccioacuten de secuencias especiacuteficas de
ADN de Spongospora subterranea en suelo y tubeacuterculos de papa Revista Colombiana de
Biotecnologiacutea 714-23
Salazar LF1995 Los virus de la papa y su control Centro Internacional de la Papa CIP
(Peruacute) Publicado por el Centro Internacional de la Papa P 226
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 49 43-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M Wieczorek
P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-Wiśniewska J Yin Z
Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E Taluntytė L Pūpola N
Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E Sozonov A Tikhonovich I
Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam G Valkonen JPT 2010 Detection
distribution and control of Potato mop-top virus a soil-borne virus in northern Europe
Annals of Applied Biology 157163-178
43
Savenkov EI Sandgren M Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003 Potato
mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich protein are
dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of General
Virology 841001-1005
Shah FA Falloon RE Bulman SR 2010 Nightshade weeds (Solanum spp) confirmed as
hosts of the potato pathogens Meloidogyne falax and Spongospora subterranea f sp
subterranea Australasian Plant Pathology 39 492-498
Shah FA Falloon RE Lister RA Butler RC McKay A Ophel-Keller K Khan I 2009
Relationships between Spongospora subterranea DNA in field soil and powdery scab in
harvested potatoes Conference Handbook 17th
Australasian Plant Pathology Society
Conference (APPS) 29 September-1 October 2009 P 148
Shemyakina EA Sclovyev AG Leonova OG Popenko VI Schiemann J Morozov SY
2011 The role of microtubule association in plasmodesmal targeting of potato mop-top
virus movement protein TGBp1 The Open Virology Journal 51-11
SINAIPA (Sistema nacional de informacioacuten de papa) 2002 La rontildea de la papa p 8-9 El
Correo de la Papa Boletiacuten mensual No 07 Colombia (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en wwwcevipapaorgcopublicacionespublicacionesphp
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Reserch 83423-31
Torres H Pacheco MA French ER 1995 Resistance of potato to powdery scab
(Spongospora subterranea) under Andean field conditions American Potato Journal
10355-363
44
van de Graff PV Lees AK Cullen DW Duncan JM 2003 Detection and quantification of
Spongospora subterranea soil water and tissue samples using real-time PCR European
Journal of Plant Pathology 109 589-597
van de Graff P Wale SJ Lees AK 2007 Factors affecting the incidence and severity of
Spongospora subterranea infection and galling in potato roots Plant Pathology 56 1005-
1013
Veacutelez B 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato mop- top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia (Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Nacional de Colombia
Villareal HJ Porras PD Santa A Lagoeyte J Muntildeoz D 2007 Costos de produccioacuten de
papa en las principales zonas productoras de Colombia Federacioacuten Colombiana de
productores de papa FEDEPAPA
Wale SJ Burgess PJ Burnett F 1993 Bioassay for Spongospora subterranea detection in
soil and its potential use in predicting scab in the field Abstract 1642 Sixth International
Congress of Plant Pathology Quebec Canada
Wallroth FW 1842 Der Knollenbrand der Kartoffel Linnaea 16 332
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea using monoclonal antibodies Plant pathology 44335-365
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2004 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165 875-85
Ward LI Beales PA Barnes AV Lane CR 2005 A Real-time PCR assay based method for
routine diagnosis of Spongospora subterranea on Potato tubers Journal Phytopathology
152 633-638
45
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI Torrance
L 2010 The N- terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required for the
nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant Microbe Interaction 23(1) 1486-1497
Wuumlrzer B 1964 Ergaumlzende Untersuchungen uumlber den Pulverschorf der Kartoffel und
dessen Erreger Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh diss Landwirtschaftliche
Hochschule Hohenheim Germany 1964
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top virus
in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
Zamyatnin JrAA Solovyev AG Savenkov EI Germundsson A Sandgren M Valkonen
JPT Morozov SY 2004 Transient coexpression of individual genes encoded by the triple
gene block of Potato mop-top virus reveals requirements for TGBp1 trafficking Molecular
Plant-Microbe Interactions 17(8) 921-930
Zhang N McCarthy ML Smart CD 2008 A macroarray system for the detection of fungal
and oomycete pathogens of solanaceous crops Plant Disease 92(6) 953-960
Zolan ME Pukilla PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinerus
Molecular and cellular Biology 6(1)195-200
46
RESULTADOS
4 ARTICULO 1
VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora subterranea f sp subterranea EN
COLOMBIA
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea IN
COLOMBIA
Ineacutes Osorio Giraldo1 Marcela Orozco Valencia
1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
1 Elena Paola
Gonzaacutelez Jaimes2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
Formato de la Revista Actualidades Bioloacutegicas ISSN 0304-3584
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
La Sarna polvosa de la papa (Spongospora subterranea fsp subterranea - Sss) es una de
las enfermedades re-emergentes maacutes importantes de este cultivo en Colombia El efecto
deleteacutereo de Sss no soacutelo se debe al dantildeo directo sobre el sistema radicular y la calidad de
los tubeacuterculos sino tambieacuten a que sus zoosporas transmiten el Potato mop-top virus
(PMTV Pomovirus) Sss genera quistosoros que actuacutean como estructuras de resistencia del
patoacutegeno en el suelo pudiendo permanecer viables por varias deacutecadas Por esto su manejo
debe fundamentarse en el uso de variedades tolerantes a la enfermedad y en el empleo de
tubeacuterculo-semilla certificado En esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variacioacuten de
127 aislamientos de Sss obtenidos en los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo con el fin de apoyar la seleccioacuten de aislamientos de Sss a evaluar
47
en programas de mejoramiento geneacutetico de papa y en el disentildeo de pruebas de deteccioacuten
asintomaacutetica del patoacutegeno Para esto se secuenciaron regiones ITS del ADN ribosomal y se
condujeron anaacutelisis filogeneacuteticos encontraacutendose la presencia de tres variantes principales
de Sss dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum
Abstract
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum
INTRODUCCIOacuteN
El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L) se ve afectado por diversos microorganismos
fitopatoacutegenos e insectos plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la re-emergencia de la
48
enfermedad denominada Sarna polvosa causada por el plasmodiofoacuterido Spongospora
subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp subterranea Tomlinson (Sss) Su efecto no solo se
debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten al deterioro en la calidad y apariencia
cosmeacutetica de los tubeacuterculos que reduce draacutesticamente su valor en el mercado (Merz y
Fallon 2009) Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop top virus (PMTV) uno de
los problemas virales de la papa que tiene caraacutecter cuarenteneario para diferentes paiacuteses del
mundo (Salazar 2006 Gil et al 2011)
Sss es originario de los Andes Surameacutericanos desde donde se dispersoacute gracias al mercado
mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber transcurrido maacutes de 150 antildeos desde su
primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado importancia en las uacuteltimas deacutecadas como
resultado de la siembra generalizada de materiales altamente susceptibles al patoacutegeno la
utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los cambios de eacutepocas de siembra hacia
periacuteodo huacutemedos las deficiencias en los sistemas de rotacioacuten de cultivos la falta de
programas de exclusioacuten y los altos estaacutendares exigidos por el mercado en la calidad
cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
Sss es un patoacutegeno obligado plasmodial que taxonoacutemicamente se ubica en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos son importantes patoacutegenos de vegetales
Spongospora subterranea fsp subterraena y f sp nasturtii Estos taxa fueron definidos
inicialmente como forma especialis (Merz y Falloon 2009) sin embargo con base en la
morfologiacutea de los zoosporangios rango de hospedantes y anaacutelisis filogeneacuteticos de regiones
ribosomales actualmente se acepta que representan dos especies diferentes (Qu y Christ
2004)
Los siacutentomas de la Sarna polvosa incluyen la induccioacuten en los tubeacuterculos de lesiones
pustulosas corchosas con centros pulverulentos formados a partir de la agregacioacuten de los
quistosoros del patoacutegeno (Figura 41) Con el avance de estas lesiones es frecuente la
49
ruptura del peridermo aunque el nivel de penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente
superficial (Carrentildeo 2009) Bajo condiciones oacuteptimas para el desarrollo de la enfermedad
es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten de los tejidos y la formacioacuten
de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la enfermedad ademaacutes de causar
los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular de las plantas al inducir la
formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas que causan la disminucioacuten de la
superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo marchitez y finalmente la muerte de las
plantas (Gilchrist 2009) La infeccioacuten en las raiacuteces especialmente cuando se forman
agallas puede causar una reduccioacuten en la toma de agua y de nutrientes por parte de las
plantas (Falloon et al 2005)
En los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Sss afecta
severamente las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y papa criolla (S phureja) Los
siacutentomas se observan en raiacuteces y tubeacuterculos pero hay variacioacuten entre las zonas paperas en
cuanto a la distribucioacuten de los siacutentomas en los diferentes oacuterganos de la planta En
Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre
los tubeacuterculos de las variedades Parda Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el
departamento de Narintildeo y el Oriente de Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces
Hasta ahora no se conoce si estas diferencias se deben a variaciones en las condiciones
ambientales de las regiones o a la ocurrencia de variantes geneacuteticas del patoacutegeno (Jaramillo
y Botero 2007 Carrentildeo 2009)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 en las cosechas de las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y Criolla Colombia
(Rodriacuteguez et al 2009 Gilchrist 2009) Adicionalmente a esta problemaacutetica la
diseminacioacuten del patoacutegeno se viene incrementando dramaacuteticamente en el paiacutes como
resultado de la baja calidad del tubeacuterculo-semilla utilizado por la mayoriacutea de los
agricultores la ausencia de variedades tolerantes al patoacutegeno y la deficiencia en la
asistencia teacutecnica que no cuenta con herramientas apropiadas para el diagnoacutestico
asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011) Su
manejo debe estar enmarcado bajo un esquema integrado del cultivo en el que se incluyan
50
aspectos como la rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del
tubeacuterculo-semilla utilizacioacuten de organismos antagonistas (ej Trichoderma spp) el empleo
de cultivos trampa la desinfeccioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten
que restrinja el movimiento de material contaminado y supervise maacutes detalladamente los
procesos de certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas
son utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado
del manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o
de Rhizoctoniasis (Carrentildeo 2009)
La problemaacutetica causada por esta enfermedad en las regiones cultivadoras de papa hace
necesario que se intensifiquen los esfuerzos por desarrollar metodologiacuteas de diagnoacutestico de
suelos y material vegetal que eviten la diseminacioacuten generalizada del plasmodiofoacuterido y de
su virus asociado PMTV entre regiones infectadas y libres de enfermedad siendo
especialmente importante el desarrollo de procedimientos que garanticen la sanidad de los
lotes dedicados a la produccioacuten de semilla Entre las diversas metodologiacuteas desarrolladas en
el mundo para el diagnoacutestico de este patoacutegeno se destacan la teacutecnica de ELISA con
anticuerpos policlonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Qu et al 2011) y pruebas de
flujo lateral (Bouchek-Mechiche et al 2011) Sin embargo estas teacutecnicas son de aplicacioacuten
limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas con base en los genotipos locales de los
patoacutegenos presentes en las regiones paperas del paiacutes Con el fin de suplir dicha carencia de
informacioacuten en esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss procedentes de las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia
mediante el anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr)
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Para la coleccioacuten de muestras de quistosoros de Sss proveniente de suelo raiacuteces y
tubeacuterculos se seleccionaron lotes en fincas con antecedentes de infeccioacuten seguacuten el registro
51
histoacuterico de los agricultores siguiendo la metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la
cual se utiliza un juego de tamices de 100 y 25 microm para la obtencioacuten de los quistosoros Por
cada lote se tomaron raiacuteces de plantas o tubeacuterculos sintomaacuteticos y una muestra de suelo de
500 gr Los sitios de coleccioacuten incluyeron las regiones cultivadoras de papa de los
municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio Subachoque y
Villa Pinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute Oicataacute (Boyacaacute) y Pasto e Ipiales
(Narintildeo) La investigacioacuten se propuso obtener un miacutenimo de 30 muestras de Sss por
departamento
Los quistosoros obtenidos a partir de muestras de suelos fueron inoculados en plantas de
Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo o plantas
trampa para incrementar el inoacuteculo siguiendo la metodologiacutea de Veacutelez (2007)
mantenieacutendose en casa de malla en el Centro Experimental Paysanduacute ubicado en el
corregimiento Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB 2550 msnm temperatura
media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) (Figura 42) Todas las muestras
fueron procesadas en los laboratorios de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad
Nacional de Colombia sede Medelliacuten y Sanidad Vegetal del Politeacutecnico Colombiano Jaime
Isaza Cadavid
Extraccioacuten de ADN
Para la obtencioacuten del ADN se empleoacute una modificacioacuten de la metodologiacutea de Doyle y
Doyle (1987) a partir de quistosoros extraiacutedos y de tejidos afectados de las plantas de papa
y plantas sentildeuelo En este procedimiento es necesaria la maceracioacuten con nitroacutegeno liacutequido
de los tejidos y se emplea como buffer de extraccioacuten una solucioacuten CTAB y 1
mercaptoetanol El lavado de la fase orgaacutenica se realiza con fenolcloroformo-alcohol
isoamiacutelico y la precipitacioacuten de los aacutecidos nucleicos con 1 voluacutemen de etanol absoluto y 01
voluacutemen de acetato de sodio 3M Finalmente el pellet generado es disuelto en agua
destilada esteacuteril y es sometido a digestioacuten de ARN mediante la adicioacuten de ribonucleasa A
(10 mgmL) (Ver protocolo 62) Cuando la presencia de inhibidores afectaba la eficiencia
52
de la PCR la extraccioacuten de ADN se realizoacute utilizando el kit DNeasy Plant (Qiagen
EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante con una ligera modificacioacuten en el paso
de elucioacuten de ADN que se realizoacute en dos etapas con 70 microL de agua destilada esteacuteril Para
determinar la concentracioacuten del ADN extraiacutedo se utilizoacute la lectura de absorbancia en las
longitudes de onda de 260 y 280 nm mediante un Nanodrop 2000C (Thermo EEUU)
obtenieacutendose un rango entre 10 y 112 ng de ADNμL con una relacioacuten 260280 de 15 a 19
(Tabla 41) La integridad del ADN se determinoacute realizando electroforesis en gel de agarosa
al 08 en buffer TBE 1X (TBE 5X 54 gL Tris 275 gL de aacutecido boacuterico 20 mLL de
EDTA 05M pH 80) suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) La visualizacioacuten de
las bandas se realizoacute utilizando el sistema digital de anaacutelisis Bio Doc Analyze (Biometra
Alemania) (Figura 43)
PCR de ITS del ADNr
Para la evaluacioacuten de los niveles de variacioacuten geneacutetica de Sss se realizaron PCR empleando
los cebadores especiacuteficos Spo8 (5 CTG GGT GCG ATT GTC TGT TG 3) y Spo9 (5 CAC
GCC AAT GGT TAG AGA CG 3) disentildeados por Bulman y Marshall (1998) asiacute como los
cebadores SsF (5acute GTC GGT TCT ACC GGC AGA CC 3acute) y SsR (5acute GCA CGC CAA
TGG TTA GAG ACG 3acute) reportados por Qu et al (2006) que amplifican productos de
391 y 434 pb de la regioacuten ITS del ADNr respectivamente Las reacciones de PCR
incluyeron 01 microM de cada cebador 1 U de Taq ADN polimerasa recombinante
(Fermentas Lithuania) 02 mM de cada dNTP 1X de buffer de enzima (100 mM Tris-HCl
(NH4)2SO2 pH 88) 2 mM MgCl2 1 microL de una dilucioacuten 50 ngmicroL de ADN y un volumen
total de 25 microL Las amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra) y
consistieron de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 35 ciclos de
94degC por 30 s 55degC por 30 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10
min Luego de la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se
separaron por electroforesis en gel de agarosa al 15 tal como se indicoacute anteriormente
53
Secuenciacioacuten
De ser necesario los amplicones obtenidos fueron purificados mediante los kits QIAquick
PCR Purification y QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para proceder a su secuenciacioacuten
directa en ambas direcciones utilizando los cebadores empleados en la PCR y el kit Big
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied Biosystems EEUU) Su
corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied
Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur) (Figura 44)
Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit
606 y Chromas 145 construyeacutendose secuencias consenso y confirmaacutendose su validez por
comparacioacuten con las bases de datos moleculares con el programa BLASTn
(httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) (Figura 45) Paralelamente se obtuvieron
del GenBank secuencias de Sss de las regiones estudiadas para su alineacioacuten con las
generadas en este trabajo mediante el software Clustal W Ademaacutes se utilizaron las
secuencias de los Plasmodiofoacuteridos Plasmodiophora brassicae Polymyxa graminis
Polymyxa betae S nasturtii y Sorosphaera viticola como grupos externos de anaacutelisis
(outgroups) Los alineamientos fueron utilizados en la construccioacuten de una matriz Nexus y
el anaacutelisis filogeneacutetico se realizoacute mediante un algoritmo de Maacutexima Parsimonia utilizando
el software PAUP 40b Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute
un anaacutelisis de Bootstrap con 500 iteraciones
RFLPs
Con el fin de proponer una prueba de diagnoacutestico molecular de las variantes de Sss se
realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs a partir de las secuencias de Sss generadas en esta
investigacioacuten y otras depositadas en el GenBank Para esto se utilizoacute el software webcutter
20 (httprnalundberggusecutter2) con las enzimas EcoRV EcoRI Bsp143I Hin6I
MspI Tru1I y TaqI seleccionadas por ser de faacutecil acceso para laboratorios de diagnoacutestico
molecular y utilizadas en la primera parte de exploracioacuten La validez de la prueba fue
54
confirmada mediante PCR-RFLPs con las enzimas Bsp143I y Hin6I y aislamientos
representativos de los grupos geneacuteticos principales detectados en el trabajo Las reacciones
consistieron de 15 microL conteniendo 15 microL de buffer 10X 2 microL de enzima y 115 microL de
producto de PCR Las reacciones fueron incubadas al bantildeo Mariacutea a 37degC durante 24 h La
separacioacuten de los fragmentos de restriccioacuten se efectuoacute por electroforesis en gel de agarosa
al 25 Se evaluaron los patrones electroforeacuteticos obtenidos para cada enzima de
restriccioacuten y se determinoacute el nuacutemero de bandas generadas y su tamantildeo aproximado por
comparacioacuten con el marcador de peso molecular GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus
(Fermentas)
RESULTADOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Se obtuvieron 210 muestras de tubeacuterculos y raiacuteces de papa con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos con historia de la presencia del patoacutegeno en los departamentos de Antioquia
Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Se realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos con las secuencias
que presentaron tamantildeos superiores a 390 pb lograacutendose el objetivo de contar con al
menos 30 secuencias por cada departamento bajo anaacutelisis
Anaacutelisis filogeneacutetico de regiones ITS del ADNr
Las reacciones de PCR produjeron amplicones del tamantildeo esperado de ~390 pb con los
cebadores Spo8-9 (Figura 46) y de ~430 pb cuando se usaron los cebadores SsF-SsR en
79 y 48 muestras respectivamente Para el anaacutelisis filogeneacutetico soacutelo se incluyeron los
consensos que resultaron de la secuenciacioacuten en ambos sentidos De esta forma se
obtuvieron 33 secuencias de Antioquia 30 secuencias de Boyacaacute 33 secuencias de
Cundinamarca y 31 secuencias de Narintildeo para un total de 127 secuencias completas (Tabla
42) El alineamiento final de las secuencias alcanzoacute 445 sitios de los cuales 156 caracteres
eran constantes 55 variables pero no informativos y 236 informativos La longitud del
aacuterbol filogeneacutetico con maacutexima parsimonia fue de 707 con iacutendices de consistencia (IC) y
retencioacuten (IR) de 078 y 088 respectivamente Dado el alto nuacutemero de muestras
55
secuenciadas se presenta un dendrograma resultado del anaacutelisis de redundancia mediante el
programa Decrease redundancy (httpwebexpasyorgdecrease_redundancy) (Figura
47) Se presentaron dos grandes clados (A y B) soportados por valores de bootstrap de
100 el primer clado corresponde a los aislamientos de Sss mientras que el otro grupo
incluyoacute las demaacutes especies de plasmodiofoacuteridos (S nasturtii P graminis P betae y Pl
brassicae) que presentaron un alto nuacutemero de cambios entre ellas El clado A se subdividioacute
a su vez en tres grupos (A1 A2 y A3) dos de los cuales corresponden a los Tipos I (A2) y
II (A1) definidos por Qu y Christ (2004) En teacuterminos porcentuales ambos Tipos
representan el 157 (Tipo I) y 189 (Tipo II) de los aislamientos de Sss obtenidos en
Colombia ademaacutes se incluyeron secuencias del patoacutegeno provenientes de Estados Unidos
Irlanda y Escocia para el Tipo I y de Suiza Nueva Zelanda y de Reino Unido para el Tipo
II El subgrupo que representa el Tipo I de Sss soacutelo presentoacute aislamientos obtenidos de
tubeacuterculos o de suelos pero no de raiacutez mientras que el subgrupo representando el Tipo II
incluyoacute indistintamente aislamientos de raiacutez tubeacuterculos y suelos
Por otra parte el tercer subgrupo (A3) incluyoacute el mayor nuacutemero de aislamientos
Colombianos de Sss (654) con algunos de sus miembros presentando hasta 10 cambios
entre ellos En este subgrupo se encontraron indistintamente aislamientos de los cuatro
departamentos diferentes fuentes de muestreo (raiacutez tubeacuterculo o suelo) y hospedantes
(diferentes variedades de S tuberosum y de S phureja var Criolla Colombia) Dadas las
diferencias en secuencias de estos aislamientos proponemos nombrar a este grupo como el
Tipo III de Sss
El anaacutelisis de redundancia permitioacute tambieacuten identificar 12 genotipos (Figura 48) entre los
127 aislamientos de Sss de Colombia cinco de los cuales estuvieron conformados por un
soacutelo aislamiento tres por dos aislamientos y cuatro presentaron maacutes de diez miembros
siendo el genotipo 11 representante del Tipo I el 12 del Tipo II y el 7 y 10 del genotipo III
(Tabla 43) porque los demaacutes genotipos al ser uacutenicos o con tener como maacuteximo dos
representantes no fueron definidos a nivel de Tipos Los niveles de identidad para la regioacuten
56
ribosomal secuenciada entre estos genotipos fueron superiores al 95 en todos los casos
con una divergencia de 33 entre los Tipos I y II del 5 entre los Tipos I y III y del 2
entre el II y III La divergencia entre secuencias de Sss y otras especies de plasmodiofoacuteridos
fue mayor al 44 lo que demuestra la utilidad taxonoacutemica de las regiones ITS para
establecer relaciones filogeneacuteticas en este grupo de protozoos (Tabla 44)
RFLPs
Los anaacutelisis de restriccioacuten indicaron la existencia de polimorfismos en los sitios de corte de
algunas de las enzimas empleadas entre los grupos principales sentildealados en el anaacutelisis
filogeneacutetico Lo anterior puede ser utilizado con fines praacutecticos cuando se requiera evaluar
el genotipo o la mezcla de genotipos asociados a un lote de cultivo plantas sintomaacuteticas o
de tubeacuterculo-semilla con siacutentomas de Sarna polvosa Por ejemplo los aislamientos
representativos del Tipo II de Sss presentan un sitio de corte para Bsp143I (p 92) mientras
que para los del Tipo I se presentan dos sitios (p 97 340) Los aislamientos del Tipo III
tienen tres sitios de corte para la enzima Hin6I (p 222 283 352) en contraste con dos sitios
en los del Tipo I y II (p226-355 221-350) (Figura 49) Por esto proponemos la realizacioacuten
de una prueba simple de PCR-RFLPs a partir de la amplificacioacuten de las regiones ITS con
cebadores especiacuteficos para Sss y su posterior digestioacuten con las enzimas Bsp143I y Hin6I
con el fin de identificar los tres Tipos de Sss Al evaluar la digestioacuten de amplicones
representantes de los tres Tipos de Sss detectados en el estudio se validoacute la utilidad de la
teacutecnica en geles de agarosa al 25 ya que los perfiles de restriccioacuten obtenidos con la
enzima Hin6I permiten diferenciar a los aislamientos de los Tipos I y II (fragmentos
visibles de 221 y 129 pb) del Tipo III (fragmentos visibles de 221 67 y 62 pb) (Figura
410A) mientras que los representantes de los Tipos I y II se diferencian por la digestioacuten
con la enzima Bsp143I al generar fragmentos visibles de 243 pb (Tipo I) y de 294 pb (Tipo
II) (Figura 410B) Es importante indicar que los fragmentos inferiores a 50 pb no se tienen
en cuenta en este anaacutelisis ya que salen del rango de resolucioacuten de la electroforesis en geles
de agarosa Fragmentos de este tamantildeo pueden ser visualizados en geles de poliacrilamida
que ofrecen una mayor resolucioacuten
57
DISCUSIOacuteN
La disponibilidad de cultivares de papa resistentes a Sss es una prioridad para el disentildeo de
estrategias de manejo de la Sarna polvosa en diferentes paiacuteses cultivadores de este
tubeacuterculo en el mundo (Nitzan et al 2010) Sin embargo las deficiencias en el
conocimiento que se tiene de los niveles de variacioacuten de Sss y de su ciclo de vida
representan un obstaacuteculo para el establecimiento de los programas de mejoramiento
geneacutetico contra este fitopatoacutegeno (Merz y Falloon 2009) Los estudios geneacuteticos de Sss han
sido difiacuteciles de aplicar debido a su naturaleza de patoacutegeno obligado que impide su
aislamiento en medios axeacutenicos afectando los procesos de extraccioacuten de ADN la
utilizacioacuten de marcadores moleculares convencionales como AFLPs SSR y RAPDs y el
empleo de cebadores universales comuacutenmente usados para estudios taxonoacutemicos y
poblacionales en diferentes microorganismos eucarioacuteticos Adicionalmente la
caracterizacioacuten patoacutegenica de Sss resulta compleja ya que el desarrollo de la expresioacuten de
la Sarna polvosa estaacute fuertemente influenciada por las condiciones ambientales las
metodologiacuteas de inoculacioacuten y los cultivares del hospedante (Qu y Christ 2006 Jaramillo y
Botero 2007)
Afortunadamente la existencia de cebadores especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del
ADNr como los desarrollados por Bulman y Marshall (1998) y Qu et al (2006) para
amplificar la regioacuten ITS1 58S e ITS2 han permitido la obtencioacuten de secuencias que entre
otras aplicaciones permitieron definir la afinidad filogeneacutetica de Sss con respecto a otros
miembros del orden Plasmodiophoridae y demostrar los bajos niveles de identidad de esta
especie con respecto a la formae specialis nasturtii Esta misma situacioacuten se encontroacute en
este estudio obtenieacutendose identidades entre Sss y S nasturtii cercanas al 56 Los anaacutelisis
intraespeciacuteficos utilizando dichas secuencias han permitido detectar dos ribotipos
principales de Sss en el mundo denominados como I y II Ambos Tipos han sido
encontrados en poblaciones de Sss de Australia y Europa (Bulman y Marshall 1998)
mientras que en Norte Ameacuterica los aislamientos corresponden exclusivamente al Tipo II
58
(Qu y Christ 2006) En dicho estudio se encontroacute que las secuencias del Tipo I diferiacutean con
respecto a las del Tipo II en tres nucleoacutetidos (p 60 127 157) y una insercioacuten de cinco
nucleoacutetidos (p 129 a 133) en el ITS1 mientras que para la regioacuten ITS2 se presentan seis
mutaciones puntuales (p 348 367 399 402 461 475) y dos deleciones (p 356 y 474) lo
que en su conjunto equivale a un 29 de divergencia entre ambos ribotipos Estas
diferencias fueron igualmente encontradas entre los aislamientos colombianos
representando ambos Tipos aunque algunos de ellos presentaron mutaciones adicionales
por ejemplo el genotipo 12 (conformado por 21 aislamientos) presentoacute dos cambios con
respecto al Tipo II reportado en GenBank (Accesioacuten AY604172) mientras que el genotipo
11 (conformado por 17 aislamientos) tuvo tres cambios con respecto al Tipo I (Accesioacuten
AY604171)
En Colombia hasta el presente estudio se habiacutean realizado dos estudios de variabilidad
geneacutetica de Sss con base en anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr En el primero de ellos
Hincapieacute (2006) encontroacute altos niveles de identidad geneacutetica entre los aislamientos de Sss
secuenciados y analizados mediante PCR-RFLP lo que condujo al autor a plantear la
posible ocurrencia de una estructura poblacional clonal para este patoacutegeno en el paiacutes En un
estudio maacutes reciente Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS y SSCP
(Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) que incluyoacute un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones establecioacute la presencia de subpoblaciones del patoacutegeno
relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Asiacute aislamientos con secuencias ITS del Tipo
I se asociaron exclusivamente con infecciones de tubeacuterculo mientras que aquellos del Tipo
II lo hicieron con siacutentomas de agallas en raiacutez En dicha investigacioacuten se descartoacute ademaacutes la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar del hospedero o la zona
geograacutefica de origen de los aislamientos Asiacute mismo se comproboacute que en el paiacutes existen
variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la
presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno dos de los cuales corresponden a los Tipos I y
II mientras que los tres restantes correspondiacutean a nuevas variantes no reportadas en otros
59
lugares del mundo (Carrentildeo 2009) desafortunadamente las secuencias resultantes de dicho
trabajo no fueron publicadas en GenBank y por tanto no pudieron ser incluidas en los
anaacutelisis filogeneacuteticos aquiacute presentados
El presente estudio amplia auacuten maacutes la base de conocimiento de los niveles de variacioacuten de
Sss en Colombia al detectar 12 genotipos a partir de 127 secuencias de igual nuacutemero de
aislamientos del patoacutegeno obtenidos en cultivos de los cuatro principales departamentos
productores de papa del paiacutes El anaacutelisis filogeneacutetico basado en dichas secuencias definioacute
la presencia de un clado que representa a Sss e incluye los dos Tipos mundialmente
conocidos para este patoacutegeno (Qu y Christ 2004) ademaacutes de un tercer subgrupo (III) que
presenta un 5 y 2 de divergencia con respecto a los Tipo I y II respectivamente Este
Tipo III contiene la mayor proporcioacuten de aislamientos del estudio e integroacute indistintamente
cepas de diferentes oriacutegenes geograacuteficos hospedantes tejidos sintomaacuteticos y suelo De gran
intereacutes resultoacute el hecho que los aislamientos asociados con el Tipo I procediacutean de puacutestulas
en tubeacuterculos o de suelos pero no de agallas de raiacutez lo cual confirma la asociacioacuten
realizada por Carrentildeo (2009) para esta variante de Sss Sin embargo los aislamientos
asociados al Tipo II proveniacutean indistintamente de raiacutez tubeacuterculos o suelos A partir de estos
resultados es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa del paiacutes Asiacute por ejemplo
es de intereacutes estudiar las reacciones de las variedades colombianas de papa a dichos
ribotipos asiacute como su capacidad de transmisioacuten de PMTV En este sentido Ward et al
(2005) evaluando el efecto de dos ribotipos de Polymyxa graminis un plasmodiofoacuterido que
afecta gramiacuteneas en la zona templada encontraron que los aislamientos del Tipo II fueron
detectados principalmente en plantas de trigo y estaban asociados a la transmisioacuten del Soil-
borne cereal mosaic virus (SBCMV) mientras que aquellos del Tipo I afectaban cebada y
su capacidad de transmisioacuten de SBCMV era muy baja
60
Los niveles de variacioacuten encontrados en esta investigacioacuten para el agente causal de la Sarna
polvosa de la papa en Colombia condujeron a plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y de certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla Para esto se realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs de regiones ITS del
ADNr con siete enzimas de restriccioacuten de uso frecuente en laboratorios de deteccioacuten
molecular de microorganismos Los resultados demostraron polimorfismos en los sitios de
corte de algunas de las enzimas utilizadas dos de las cuales permiten distinguir los tres
principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico De esta forma se confirmoacute que la
digestioacuten con la enzima Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos
del Tipo III mientras que el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los
Tipos I y II La prueba realizada en este estudio puede ser implementada con variaciones
como el uso de digestiones dobles y la utilizacioacuten de geles de poliacrilamida que generen
mayor resolucioacuten de los fragmentos de restriccioacuten de bajo peso molecular sin embargo el
esquema aquiacute presentado ofrece simplicidad y eficiencia en la separacioacuten de los tres Tipos
sin la necesidad de contemplar todos los productos de la digestioacuten Adicionalmente a esta
prueba y con base en los resultados de las secuencias obtenidas en esta investigacioacuten y en
aquella de Gil et al (2011) nuestro grupo se encuentra disentildeando y evaluando pruebas de
PCR y RT-PCR en tiempo real para la deteccioacuten asintomaacutetica de Sss y de su virus asociado
PMTV Se espera que los resultados generados en estas investigaciones sean incorporados
raacutepidamente en los programas de manejo integrado de la Sarna polvosa en Colombia y
otros paiacuteses latinoamericanos afectados por esta enfermedad como Venezuela (Rodriacuteguez et
al 2009) y Costa Rica (Montero-Astua et al 2008)
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten el Politeacutecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid
Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo
por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el Departamento de Narintildeo
61
REFERENCIAS
Bell KS Roberts J Verrall S Cullen DW Williams NA Harrison JG Toth IK Cooke D
Duncan JM Claxton JR 1999 Detection and quantification of Spongospora subterranea
fsp subterranea in soils and on tubers using specific PCR primers European Journal of
Plant Pathology 105 905-915
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid
diagnostic test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European
Journal of Plant Pathology 131 277-287
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47 759-766
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33 69-84
62
Gilchrist E 2009 Alternativas para el manejo integrado de la Sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) Tesis de Doctorado en Ciencias Agrarias
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia sede Medelliacuten
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tubers by enzyme-linked immunosorbent assay Plant Pathology 42
181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato - A review
Plant Pathology 461-25
Hincapieacute LA 2006 Evaluacioacuten de la variabilidad molecular de Spongospora subterranea
(Wallroth) Lagerheim f sp subterranea en las principales zonas paperas de Colombia
Tesis de Maestriacutea en Biotecnologiacutea Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia sede Medelliacuten Colombia
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Merz U Fallon RE 2009 Powdery scab of potato-increased knowledge of pathogen
biology and disease epidemiology for effective disease management Potato Research
5217-37
Montero-Astua M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
63
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006 Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea f sp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la Sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista de la Facultad de Agronomiacutea Universidad del Zulia 26 508-531
Salazar LF 2006 Emerging and Re-emerging Potato Diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop - top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia Sede Bogotaacute
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea and quantification in soil Plant Pathology 45 884-895
64
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2005 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165875-885
Zolan ME Pukkila PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinereus
Molecular and Cellular Biology 6 195-200
65
41 Anexos
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp subterranea
en plantas de papa de Colombia a Quistosoros obtenidos de suelo b Plasmodios
formados en raiacutez de tomate (Solanum esculentum) c Lesiones tempranas producidas por
Sarna polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro d Lesiones tardiacuteas producidas por Sarna
polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro e f Agallas formadas en raiacuteces de S phureja
var Criolla Colombia
d
e f
c
a b
66
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja var Criolla
Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos infestados con Spongospora
subterranea f sp subterranea
67
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o raiacuteces de
plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea
MUESTRA A260 A280 RELACIOacuteN
260280
CONCENTRACIOacuteN
de ADN ng microl
AB1 0806 0465 173 403
AB2 0421 0244 172 21
Se7 0276 0149 184 138
Se8 0743 0415 179 371
MA11 2244 1366 164 1122
MA61 0277 0158 176 139
MA39 2135 1512 141 1067
MA56 0823 0361 228 412
MA60 021 0101 208 105
68
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos agallas o raiacuteces
de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana Carril 1 Marcador de peso 100 pb carril 2-
4 muestras MA16 MA17 MA18 MA11 MA39
500 pb
1 2 3 4 5 6
69
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora
subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8
70
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la regioacuten ITS del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp subterranea de Colombia
71
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb) a partir de ADN
de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum tuberosum S phureja y Nicotiana
benthamiana con presencia de quistosoros de Spongospora subterranea fsp subterranea
de cultivos de papa de los departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1
Marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas) carriles 2 a 6 muestras SE10 SE11
SE13 SE18 carril 7 control negativo
500 pb
100 pb
390 pb
1 2 3 4 5 6 7
72
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia
ANTIOQUIA CUNDINAMARCA
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE13 Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro SE8 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE18 La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro SE81 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
32UN La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE9 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
33UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE91 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34UN La Unioacuten Raiacutez accesioacuten C131-R2 SE12 Zipaquiraacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
35UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE14 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
80C La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE15 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Pastusa
Suprema
79C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE16 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
78C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE17 Villapinzoacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro
35 COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE19 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34COL La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE20 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
32COL La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum SE21 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
30COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 4fb Ventaquemada Raiacutez S tuberosum
29COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 5fb Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum
12fb La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 9fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
11fb La Unioacuten Raiacutez S tuberosum 10fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
1MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
ICA Nevada MA20 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
7MR Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro MA21 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
8MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA22 Villapinzoacuten
Raiacutez S tuberosum var ICA Pastusa Suprema
9MR La Unioacuten Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA23 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
11MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA24 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
12MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA25 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
13MR Santa Rosa Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA50 Desconocido Tubeacuterculo S tuberosum
14MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA51 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB2 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C87SJ MA52 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
73
AB3 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C81SJ MA53 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB4 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3SJ MA54 Tabio Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB6 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C8C MA55 Tabio Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB7 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3C MA56 Zipaquiraacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia
AB8 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA57 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA1 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA58 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA2 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA59 Villapinzoacuten
Tubeacuterculo S tuberosum var Diacol Capiro
MA41 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA60 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
BOYACAacute NARINtildeO
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE10 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE7 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE101 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
SE11 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 37COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE22 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 36COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
SE23 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA27 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE24 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA28 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
3fb Tunja Raiacutez S tuberosum MA31 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB1 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA32 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB9 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA33 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB10 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA34 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA35 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA3 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA36 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA4 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA37 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA5 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA38 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA7 Siachoque Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA39 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA9 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA40 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA11 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA61 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA62 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA14 Tunja Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA64 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA15 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA65 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA16 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA66 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA17 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA67 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
74
benthamiana
MA18 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA68 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA19 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA69 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA42 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA70 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA43 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA44 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA72 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA45 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA73 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA46 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA75 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA49 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA76 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA77 Ipiales Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
75
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) de cultivos de papa de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Como grupos externos de anaacutelisis se presentan
secuencias de otras especies de plasmodiofoacuteridos Meacutetodo de maacutexima parsimonia
utilizando la opcioacuten Heuristic search del programa PAUP 40b Los valores de Bootstrap (gt
80) se indican en la parte inferior de las ramas En letras mayuacutesculas se presentan las
denominaciones de los clados y subclados Adicionalmente se indican los grupos que
representan los Tipos de Sss
76
Sss TIPO I
395 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
MspI TaqI
cccgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgttttcgg base
pairs
gggcccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcaaaagcc 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
atactgaacttactaaagtggatcatttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgat base
pairs
tatgacttgaatgatttcacctagtaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgcta 76 to
150
EcoRI
gaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagtt base
pairs
cttcttgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaa 151
to 225
Hin6I TaqI EcoRV MspI
gcgctttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccgtgtgcgtg base
pairs
cgcgaaagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcggcacacgcac 226
to 300
Bsp143I MspI Hin6I
aaggggactctgagctctggtcggtccatggcttgaaagatcatgcaacccggtgcgcgtctctggcttctgatt base
pairs
ttcccctgagactcgagaccagccaggtaccgaactttctagtacgttgggccacgcgcagagaccgaagactaa 301
to 375
cgtctctaaccattggcgtg base pairs
gcagagattggtaaccgcac 376 to 395
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 2 97 340 gatc More info
EcoRI 1 190 gaattc More info
EcoRV 2 130 238 gatatc More info
Hin6I 2 226 355 gcgc More info
MspI 3 2 281 350 ccgg More info
TaqI 2 49 232 tcga More info
Tru1I 2 102 119 ttaa More info
77
Sss TIPO II
390 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
TaqI
cctgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgtattact base
pairs
ggacccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcataatga 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
gaacttactaaagtggatcgtttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgatgaaga base
pairs
cttgaatgatttcacctagcaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgctacttct 76 to
150
EcoRI Hin6I
acgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagttgcgct base
pairs
tgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaacgcga 151
to 225
TaqI EcoRV MspI
ttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccctgtgcgtggaagg base
pairs
aagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcgggacacgcaccttcc 226
to 300
MspI Hin6I
ggactatgagctctggtcggtccatggcttgaaagattatccaaccggtgcgcgtctctggcttctgattcgtct base
pairs
cctgatactcgagaccagccaggtaccgaactttctaataggttggccacgcgcagagaccgaagactaagcaga 301
to 375
ctanccattggcgtg base pairs
gatnggtaaccgcac 376 to 390
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 1 92 gatc More info
EcoRI 1 185 gaattc More info
EcoRV 2 125 233 gatatc More info
Hin6I 2 221 350 gcgc More info
MspI 2 276 345 ccgg More info
TaqI 2 49 227 tcga More info
Tru1I 2 97 114 ttaa More info
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos de S
subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I MspI TaqI y
Tru1I mediante el programa Web-cutter
78
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de aislamientos
de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en Colombia a partir de
anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal
GENOTIPO RFLPacutes MUESTRAS PROPORCIOacuteN
()
1
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185 EcoRV 2 125 233
Hind6I 2 221 351
MspI 2 276 346 TaqI 2 227 Tru1I
2 97 114
AB12 34UN 16
2
Bsp143I 1 93 EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277 347 TaqI 1 49 228
Tru1I 2 98 115
32UN 78C 16
3
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
11MR 08
4
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
9MR 08
5
Bsp143I 2 96 339 EcoRI 1 189
EcoRV 2 129 237
Hind6I 2 225 354
MspI 2 280 349 TaqI 1 231 Tru1I
2 101 118
8MR 13MR 16
79
6
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190
EcoRV 2 130 238 Hind6I 2 226 355
MspI 2 281 350
TaqI 1 232 Tru1I
2 102 119
MA12 08
7
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
MA37 SE7 SE8 SE9 SE10
SE11 SE12 SE13 SE14 SE15 SE16 80C 79C 37COL 36COL
35COL 34COL 32COL 30COL
12FB 10FB 11FB 9FB 1MR
SE71 SE81 SE91 SE101 AB2 AB3 AB4 AB6 AB7 MA1 MA7
MA9 MA14 MA20 MA21 MA22
MA23 MA24 MA25 MA28 MA31 MA32 MA33 MA34
MA35 MA36
393
8
Bsp143I 2 92 309 EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 289 351 MspI 2 276
346 TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
MA40 08
9
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 282 351 MspI 3 2 276
346 TaqI 1 227
Tru1I 2 97 114
MA43 08
10
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 3 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
29COL 33UN MA4 MA41
MA42 MA51 MA52 MA55
MA56 MA57 MA58 MA59 MA60 MA62 MA64 MA65
MA68 MA69 MA71 MA72
MA76 SE19 SE20 SE21 SE22 3FB 4FB 14MR
22
11
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190 EcoRV 2 130 238
Hind6I 2 226 355
MspI 3 2 281 350 TaqI 2 49 232
Tru1I 2 102 119
SE17 12MR AB1 AB8 MA2
MA15 MA16 MA17 MA18 MA19 MA45 MA46 MA49
MA50 MA53 SE23 SE24
134
80
12
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233 Hind6I 2 221 350
MspI 2 276 345
TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
SE18 35UN 7MR AB9 AB10
MA3 MA4 MA5 MA11 MA27 MA38 MA39 MA44 MA61
MA66 MA67 MA70 MA73
MA75 MA77 5FB
165
81
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluyen a S nasturtii y Plasmodiophora brassicae
como especies externas de anaacutelisis
SECUENCIA SE17 SE18 MA37 29COL AY604172 AY604171 AF310907 EF593112 AF102820 AF102819 EF195335 AF104308
SE17 Sss
Colombia
Tipo I
ID 0962 0957 0952 0964 0992 0564 0959 0992 0964 0586 0959
SE18 Sss
Colombia
Tipo II
0962 ID 0979 0974 0992 0959 0574 0987 0959 0992 0584 0987
MA37 Sss
Colombia
Tipo III
0957 0979 ID 0984 0982 0954 0579 0977 0954 0982 0598 0977
29COL Sss
Colombia
Tipo III
0952 0974 0984 ID 0982 0959 0579 0977 0959 0982 06 0977
AY604172
Sss EEUU
TipoII
0964 0992 0982 0982 ID 0967 0577 0994 0967 1 0589 0994
AY604171
Sss EEUU
Tipo I
0992 0959 0954 0959 0967 ID 0564 0962 1 0967 059 0962
AF310907 S
nasturtii 0564 0574 0579 0579 0577 0564 ID 0579 0564 0577 0566 0574
EF593112 Sss
Suiza 0959 0987 0977 0977 0994 0962 0579 ID 0962 0994 0589 0989
AF102820
Sss Escocia 0992 0959 0954 0959 0967 1 0564 0962 ID 0967 059 0962
AF102819
Sss Nueva
Zelanda
0964 0992 0982 0982 1 0967 0577 0994 0967 ID 0589 0994
EF195335 P
brassicae 0586 0584 0598 06 0589 059 0566 0589 059 0589 ID 0589
AF104308
Sss Reino
Unido
0959 0987 0977 0977 0994 0962 0574 0989 0962 0994 0589 ID
82
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las enzimas de restriccioacuten Bsp143I y
Hin6I que permiten determinar los tres Tipos de Sss identificados en este trabajo En la
izquierda se indican los genotipos representativos de cada Tipo (ver Tabla 3) y entre
pareacutentesis los sitios de corte referidos al Tipo I
83
Figura 410 (A) Gel de RFLPs con la enzima Hind6I con tres muestras de los Tipos I II y
III de Sss detectados en el estudio 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir Tipo
I 3-5 Digestioacuten de muestras Tipo I 6 Producto sin digerir Tipo II 7-9 Digestioacuten de
muestras Tipo II 10 Producto sin digerir Tipo III 11-13 Digestioacuten de muestras Tipo III
14 Marcador de peso 100 pb (B) Gel de RFLPs con la enzima Bsp143I con una muestra
del Tipo I y II de Sss 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir del Tipo II 3 Sin
muestra 4 Digestioacuten de muestra Tipo I 5 Digestioacuten de muestra Tipo II 6 Marcador de
peso 100 pb Con flechas se marcan los productos digeridos que presentan resolucioacuten
apropiada en geles de agarosa al 25
A B
84
5 Artiacuteculo 2 Variabilidad geneacutetica de los ARN 2 y 3 de aislamientos
Colombianos de PMTV
Genetic variability of RNA 2 and 3 in Colombian isolates of PMTV
Ineacutes Osorio Giraldo1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
1 Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Facultad de Ciencias Universidad Nacional
de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia 2
Laboratorio de Microbiologiacutea Industrial
Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia
Formato de la Revista Agronomiacutea Mesoamericana ISSN 1021-7444
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
El PMTV es un virus prevalente en los cultivos de papa de los Andes Sin embargo en esta
regioacuten es muy bajo el conocimiento de su biologiacutea patogenicidad y diversidad Con el fin
de suplir la falta de informacioacuten sobre este uacuteltimo aspecto en esta investigacioacuten se
obtuvieron secuencias de los genes de la caacutepside viral (CP) y del TGB2 de cepas de PMTV
de los cuatro principales departamentos cultivadores de papa en Colombia Adicionalmente
dos de los aislamientos fueron secuenciados en gt83 de sus ARN 2 y 3 Los anaacutelisis
filogeneacuteticos basados en CP indicaron la presencia de dos clados El primero contiene cepas
de referencia mundial de PMTV en conjunto con 19 de las cepas de este estudio mientras
que el segundo clado soacutelo agrupoacute cepas de Colombia las que compartieron menos de 76
de identidad con el primer grupo Esto posiblemente indica la ocurrencia de una nueva
especie de pomovirus aunque se requiere la secuenciacioacuten de todo el genoma para
confirmar dicha hipoacutetesis taxonoacutemica El anaacutelisis del TGB2 generoacute un solo clado
agrupando indistintamente las cepas colombianas de PMTV con las de otros paiacuteses El
anaacutelisis de los segmentos 2 y 3 del genoma viral indicoacute que los aislamientos colombianos
compartiacutean gt94 de identidad con las secuencias de cepas de Repuacuteblica Checa y Suecia
85
Se espera que estos hallazgos sean utilizados para el disentildeo de herramientas de diagnoacutestico
del PMTV en los Andes que apoyen los programas de certificacioacuten de tubeacuterculo-semilla y
mejoramiento geneacutetico de papa
Palabras clave Potato mop-top virus RT-PCR Secuenciacioacuten Solanum tuberosum
Abstract
PMTV is a prevalent virus in potato crops in the Andes However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words Potato mop-top virus RT-PCR Sequencing Solanum tuberosum
86
INTRODUCCIOacuteN
El Potato mop-top virus (PMTV) es la especie tipo del geacutenero Pomovirus y recientemente
se ha clasificado en la nueva familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Su rango de
hospedantes incluye un nuacutemero limitado de especies vegetales de las familias Solanaceae y
Chenopodiaceae siendo la papa (Solanum tuberosum L) su principal hospedante desde el
punto de vista econoacutemico (Kirk 2008) Es transmitido por tubeacuterculo semilla infectado y
por zoosporas del plasmodiofoacuterido Spongospora subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp
subterranea Tomlinson (Sss) agente causal de la sarna polvosa de la papa (Harrison y
Jones 1970) Su presencia se ha registrado principalmente en regiones con climas huacutemedos
y friacuteos como el Norte de Europa (Noruega Suecia Dinamarca y Finlandia) las islas
Britaacutenicas (Irlanda Inglaterra Escocia) Norte Ameacuterica (EEUU y Canadaacute) Japoacuten las zonas
montantildeosas de Costa Rica y los Andes Surameacutericanos (Peruacute Colombia Bolivia) (Xu et al
2004 Salazar 2006 Montero-Astuacutea et al 2008 Nakayama et al 2010 Santala et al
2010) A pesar de que se considera que el PMTV es originario de los Andes su presencia
en Colombia soacutelo fue detectada en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) y reconfirmada con base en
anaacutelisis de secuencias de la caacutepside viral (CP) y el segundo gen del triple bloque (TGB2) en
2011 (Gil et al 2011) Este virus puede causar peacuterdidas de hasta 26 en el rendimiento del
cultivo de la papa lo que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera
ascender a rangos de 50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 2000) Sin
embargo dichos niveles de peacuterdidas dependen de la susceptibilidad de las variedades
cultivadas (Xu et al 2004 Santala et al 2010) las variantes del patoacutegeno (Harrison y
Jones 1970 Nielsen y Nicolaisen 2003) y fundamentalmente de las condiciones
medioambientales prevalentes durante su infeccioacuten (Davey 2009 Latvala-Kilby et al
2009 Roos et al 2011)
El PMTV es un virus tripartita con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20 nm en diaacutemetro y
longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm Cada partiacutecula contiene una moleacutecula
de ARN de cadena sencilla con polaridad positiva (ARNss+) con tamantildeos de 6043 nt (ARN
1) 3134 nt (ARN 2) y 2964 nt (ARN 3) El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene
motivos de metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del
codoacuten de finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999 2003) El
87
ARN 2 contiene un ORF para la proteiacutena de la caacutepside de 20 kDa Tambieacuten codifica para
una proteiacutena de 90 kDa generada por lectura continua (readthrough CP-RT) gracias a la
presencia de un codoacuten de finalizacioacuten amber en el gen CP Diversos estudios han indicado
que esta proteiacutena RT esta involucrada en la transmisioacuten por Sss del PMTV siendo incluso
posible su localizacioacuten asociada con los extremos de las partiacuteculas virales mediante
anaacutelisis de inmuno-marcaje (Cowan et al 1997) En este sentido Torrance et al (1999)
demostraron que una delecioacuten de 109 nt en el extremo 3acute de las secuencias del dominio CP-
RT de aislamientos de PMTV de Escocia estaban asociadas con su imposibilidad de
transmisioacuten por Sss
El ARN 3 codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Los
primeros tres presentan secuencias similares a proteiacutenas del triple bloque de genes (TGB)
involucradas en el movimiento de ceacutelula a ceacutelula de algunos virus de plantas Las TGBs de
los pomovirus hacen parte de la clase 1 o grupo hordei de estas proteiacutenas en conjunto con
las codificadas por otros geacuteneros de la familia Virgaviridae y del geacutenero Hordeivirus Se
cree que TGB2 y TGB3 asisten a TGB1 en su funcioacuten de trasportar el genoma viral a traveacutes
de los plasmodesmos de las ceacutelulas vegetales (Lim et al 2008 2009) Recientemente se
encontroacute mediante fusioacuten de la regioacuten N-terminal de TGB1 con la proteiacutena verde
fluorescente (GFP por sus siglas en ingleacutes) que TGB1 se localizaba en la regioacuten nucleolar
y de microtuacutebulos infirieacutendose ademaacutes que aparentemente esta proteiacutena interactuacutea con los
factores de transcripcioacuten del hospedante (Wright et al 2010)
La cuarta proteiacutena (8 kDa) es rica en cisteiacutena (CRP) y aparentemente esta involucrada en el
movimiento sisteacutemico del PMTV en las plantas y en la expresioacuten de siacutentomas necroacuteticos en
hospedantes experimentales Interesantemente otros pomovirus no codifican para una
proteiacutena 8 kDa como la presente en PMTV y sus niveles de identidad con CRPs presentes
en otros geacuteneros como Hordeivirus Tobravirus y Furovirus son muy bajos (Lukhovitskaya
et al 2005)
Los siacutentomas que causa PMTV en papa se manifiestan por agrietamientos en la superficie
de los tubeacuterculos pudiendo estar acompantildeados por la presencia de anillos necroacuteticos en la
88
corteza o incluso la parte interna del mismo siacutentoma conocido como umlSprainguml (Calvert y
Harrison 1966) En las hojas de las plantas infectadas se puede observar un moteado en
forma de V tipo ldquoaucubardquo ademaacutes de la distorsioacuten del follaje y el acortamiento de los
entrenudos (umlmop-topuml) (Carnegie et al 2009) En la regioacuten Andina no es frecuente
observar la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos ni los moteados tipo umlaucubauml lo que no
permite asociar siacutentomas especiacuteficos con la presencia de PMTV situacioacuten que explica en
buena parte el porqueacute del desconocimiento de su efecto sobre las variedades sembradas en
esta regioacuten suramericana (Tenorio et al 2006 Gil et al 2011) Sin embargo seguacuten Salazar
(2006) el PMTV es uno de los virus prevalentes en el cultivo de la papa en los Andes
Adicionalmente a las caracteriacutesticas criacutepticas del PMTV existen dificultades teacutecnicas para
el diagnoacutestico de este virus debido a su distribucioacuten erraacutetica en las plantas que incluso
puede diferir entre yemas y brotes del mismo tubeacuterculo infectado y a los bajos tiacutetulos
virales que se encuentran en el tejido foliar Esto conduce a la generacioacuten de falsos
negativos por diferentes teacutecnicas de diagnoacutestico (Cerovska et al 2003 Kirk 2008) Dichas
teacutecnicas incluyen la observacioacuten visual de siacutentomas bioensayos con plantas indicadoras
como Chenopodium amaranticolor Nicotiana benthamiana N debneyi y N tabacum
(Jeffries 1998) que requieren largos periodos de tiempo para su lectura pruebas de ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay) con anticuerpos mono y policlonales (Torrance et
al 1993 Cerovska et al 2003) RT-PCR IC RT-PCR y qRT-PCR con cebadores
especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del genoma viral (Arif et al 1995 Mumford et
al 2000 Latvala-Kilby et al 2009 Davey 2009) Asiacute mismo se han empleado otras
teacutecnicas basadas en hibridizacioacuten especiacutefica (Ryazantsev y Zavriev 2009) y microplacas de
hibridizacioacuten con RT-PCR (Nakayama et al 2010) para la deteccioacuten de PMTV
En Colombia Gil et al (2011) utilizaron la teacutecnica de RT-PCR con los cebadores
PMTVF4-PMTVR4 y H360-C819 dirigidos a los genes TGB2 y CP respectivamente para
la deteccioacuten del virus en los principales departamentos productores de papa del paiacutes sin
embargo utilizaron un muy bajo nuacutemero de aislamientos virales Maacutes recientemente Gallo
(2012) obtuvo anticuerpos policlonales dirigidos a peacuteptidos sinteacuteticos con alta capacidad
89
inmunogeacutenica identificados a partir de la modelacioacuten de la caacutepside viral de aislamientos
colombianos de PMTV probando su efectividad en pruebas de ELISA y Dot-blot
A pesar de que aparentemente existe una amplia gama de teacutecnicas para la deteccioacuten del
PMTV eacutestas presentan la limitacioacuten de estar basadas en un bajo nuacutemero de aislamientos
virales especialmente del Norte de Europa (Latvala-Kilby et al 2009) siendo auacuten menor el
nuacutemero de cepas andinas para las que existen secuencias disponibles en las bases de datos
moleculares o cuyos viriones han sido purificados para la generacioacuten de pruebas
seroloacutegicas (Gil et al 2011)
A nivel mundial se ha reportado la presencia de bajos niveles de variacioacuten entre genotipos
de PMTV (Mayo et al 1996 Santala et al 2010) Latvala-Kilby et al (2009) comparando
secuencias de CP de 23 aislamientos de Finlandia y Letonia con respecto a secuencias
disponibles en GenBank para cepas de Escocia Dinamarca Suecia y Repuacuteblica Checa
encontraron identidades superiores al 98 entre eacutestas con soacutelo siete diferencias a nivel de
aminoaacutecidos (aa) entre todas las comparaciones Las evaluaciones de secuencias de CP-RT
tambieacuten presentaron altos niveles de identidad (98 a 100) aunque en este caso 24
posiciones en las secuencias de aa fueron variables Resultados similares reportaron Mayo
et al (1996) cuando compararon las secuencias de CP de tres aislamientos de Escocia y
ocho de Peruacute mientras que Xu et al (2004) encontraron que seis de las secuencias de CP
de aislamientos de PMTV de Norteameacuterica presentaron identidades superiores al 97 con
respecto a secuencias de aislamientos de diferentes paiacuteses de Europa A pesar de estos bajos
niveles de variacioacuten cuando se realizan anaacutelisis filogeneacuteticos con dichas secuencias se han
encontrado dos clados que dividen los aislamientos de PMTV y que pueden ser
identificados por anaacutelisis de RFLPs (Nielsen y Nicolaisen 2003) Sin embargo dichos
grupos aparentemente no estaacuten relacionados con diferencias en sus niveles de
patogenicidad sobre variedades de papa (Latvala-Kilby et al 2009)
En Colombia Veacutelez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo que presentaba altos niveles de identidad con
respecto a aislamientos de Europa y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por
90
aislamientos colombianos Esta situacioacuten fue confirmada posteriormente por Gil et al
(2011) quienes encontraron que las variantes de PMTV tan soacutelo presentaban un 76 y
86 de identidad para CP y TGB2 respectivamente con respecto a los aislamientos
mundialmente reportados de PMTV Sin embargo dichos anaacutelisis fueron conducidos con un
bajo nuacutemero de secuencias (cuatro para CP y tres para TGB2) debido a las dificultades
experimentales que representa el trabajo con este virus (bajo tiacutetulo en plantas de papa
distribucioacuten erraacutetica ausencia de cebadores especiacuteficos para cepas andinas etc)
Por lo anterior esta investigacioacuten se planteoacute con el propoacutesito de ampliar el nuacutemero de
secuencias de CP y TGB2 de aislamientos de PMTV obtenidos en diferentes regiones
cultivadoras de papa de Colombia de manera que fuera posible determinar si la presencia de
las variantes de este virus corresponde a una situacioacuten generalizada o por el contrario responde
al efecto de muestra dado el bajo nuacutemero de cepas analizadas por Veacutelez (2007) y Gil et al
(2011) Adicionalmente se realizoacute la secuenciacioacuten de una gran parte del ARN 2 y ARN 3 de
una cepa obtenida en el Departamento de Antioquia y otra en el Departamento de Boyacaacute
(Colombia) realizaacutendose un anaacutelisis de variacioacuten con respecto a las secuencias de referencia de
genomas completos disponibles en las bases de datos moleculares
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y preparacioacuten de muestras
Se obtuvieron muestras de raiacuteces y tubeacuterculos de papa con siacutentomas de sarna polvosa asiacute
como de suelos de lotes con reportes de la presencia de Sss en las zonas productoras de
papa de los municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio
Subachoque y Villapinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute y Oicataacute (Boyacaacute) y
Pasto e Ipiales (Narintildeo) Para la separacioacuten de los quistosoros del suelo se siguioacute la
metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la cual las muestras de suelo (500g) son
pasadas por un juego de tamices de 100 y 25 microm Los quistosoros obtenidos fueron
inoculados en Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo
para incrementar el inoacuteculo de PMTV a partir de la infeccioacuten de su vector Sss (Veacutelez
2007) El material vegetal fue mantenido en casa de malla en el Centro Experimental
91
Paysanduacute ubicado en el corregimiento de Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB
2550 msnm temperatura media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) Tres
meses despueacutes de la siembra se recolectaron las hojas y las raiacuteces de las plantas sentildeuelo
para su procesamiento en el laboratorio
Secuenciacioacuten de CP y TGB2
Se obtuvo el ARN total de plantas de N benthamiana y S phureja mediante el kit RNeasy
plant mini (Qiagen EEUU) a partir de 100 mg de tejido utilizando 450 μL de buffer RLT
para tejido foliar o RLC para raiacuteces y 45 μL de β-mercaptoetanol y siguiendo las
instrucciones del fabricante Al finalizar el procedimiento el ARN obtenido se eluyoacute en 40
μL de agua destilada esteacuteril tratada con DEPC
Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos En las reacciones de
retrotranscripcioacuten se utilizoacute un volumen final de 20 microL incluyendo 05 microL de agua
destilada esteacuteril 15 microL de PBST (05) 4 microL de buffer RT (5X) 4 microL de MgCl2 (25
mM) 2 microL de dNTPs (10 mM) 2 microL de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de
ARNasas (40UmicroL) 05 microL de enzima M-MuLV Transcriptasa Reversa (20 UmicroL)
(Fermentas Lituania) y 5 microL de ARN o alternativamente una dilucioacuten 15 El programa de
RT fue de 37degC por 60 min seguido de 70degC por 10 min para inactivar la enzima Las
muestras se almacenaron a 4degC hasta su uso posterior
Para las reacciones de PCR se emplearon los cebadores especiacuteficos H360 (5rsquo CAT GAA
GGC TGC CGT GAG GAA GT 3rsquo) y C819 (5rsquo CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA
CC-3rsquo) (MacKenzie 1996) para amplificar una regioacuten de 459 pb del gen CP entre las
posiciones 385 y 844 del genoma viral (Figura 51) y PMTVF4 (5rsquo CAG CAA CCA CAA
ACA GAC AGG 3rsquo) y PMTVR4 (5rsquo AGC CAC TAA CAA AAC ATACTGC 3rsquo) para
obtener amplicones de 415 pb del TGB2 entre las posiciones 1726 y 2141 del ARN 2 (Xu
et al 2004) (Figura 52) Para algunos aislamientos en los que se dificultaba la
amplificacioacuten del TGB2 se utilizaron los cebadores PMTV5 (5 GGT GAA CAC GAG
GAC AAG GT 3) y PMTV7 (5 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 3) (Lambert et al
2003) que amplifican un fragmento de 646 pb y se extienden entre las posiciones del
92
genoma 1417 a 2063 Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 microL
incluyendo 158 microL de agua destilada esteacuteril 25 microL de buffer de enzima (10X) 18 microL de
MgCl2 (25 mM) 05 microL de dNTPs (10 mM) 05 microL de cada cebador (10 microM) 02 microL de
Albuacutemina de suero bovino (20 mgml) (Fermentas) 02 microL de Taq ADN polimerasa (5
UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ADNc aunque en algunas ocasiones dada la falta de
amplicones fue necesario preparar diluciones de 15 110 o 125 de ADNc Las
amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra Alemania) y consistieron
de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 40 ciclos de 94degC por 30 s
53degC por 45 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10 min Luego de
la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se separaron por
electroforesis en gel de agarosa al 15 suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) y
su tamantildeo se verificoacute por comparacioacuten con el marcador de peso molecular Generuler 100
pb DNA ladder (Fermentas)
Los amplicones del tamantildeo esperado correspondientes al menos a cuatro aislamientos
representativos de cultivos de papa de cada uno de los cuatro departamentos bajo estudio
fueron purificados del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para realizar
su secuenciacioacuten directa en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores empleados en
la PCR y el kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied
Biosystems EEUU) Su corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism
3730xl (PE Applied Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur)
A partir de las secuencias obtenidas con cada cebador se construyeron las secuencias
consenso mediante el software BioEdit 606 (Hall 1999) y Chromas Lite (Technelysium
2009) Posteriormente se confirmoacute su origen viral por comparacioacuten con las bases de datos
moleculares con el programa BLASTn (httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) y
se obtuvieron secuencias de PMTV del GenBank de otras regiones del mundo para realizar
un anaacutelisis filogeneacutetico Para esto se generoacute un alineamiento mediante Clustal W (Larkin et
al 2007) del Software Bioedit 606 Los alineamientos fueron utilizados para construir una
una matriz de distancia geneacutetica utilizando el meacutetodo de Maacutexima verosimilitud basado en
el modelo de Tamura-Nei (1993) implementado en el software MEGA v40 (Tamura et al
93
2007) Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute un anaacutelisis de
Bootstrap con 1000 remuestreos (Felsenstein 1985)
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Con el fin de obtener un mayor nivel de informacioacuten sobre las caracteriacutesticas de los
segmentos ARN 2 y ARN 3 del genoma de aislamientos Colombianos de PMTV se realizoacute
un proceso de secuenciacioacuten con minado de cebadores previamente reportados para la
amplificacioacuten de diferentes regiones de cada uno de dichos segmentos (Tabla 51 Figura
53) y buscando que generaran traslape de secuencias de manera que fuera posible la
construccioacuten de un contig general para cada segmento Para esto se seleccionaron cuatro
cepas de PMTV representativas de cada uno de los departamentos bajo anaacutelisis Con cada
cepa se realizaron por lo menos dos amplificaciones con cada cebador de manera que las
secuencias reportadas correspondieran al consenso para cada amplicoacuten Los procedimientos
de extraccioacuten de ARN PCR y secuenciacioacuten fueron similares a los descritos anteriormente
aunque las RT se realizaron con la enzima Transcriptasa Reversa Maximareg (Fermentas)
que ofrece mayores niveles de estabilidad teacutermica (hasta 65degC) y eficiencia que las
transcriptasas reversas convencionales En este caso las reacciones de RT consistieron de
95 microL de agua libre de nucleasas 4 microL de buffer RT (5X) 1 microL de dNTPs (10 mM) 1 microL
de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de ARNasas (40UmicroL) 1 microL de enzima
Transcriptasa Reversa Maximareg (200 UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ARN para un volumen
final de 20 microL La incubacioacuten se realizoacute a 50degC por 30 min y la enzima se inactivoacute a 85degC
por 5 min
Las secuencias se editaron mediante el software Chromas Lite generaacutendose los consensos
con ambos cebadores usando el programa Bioedit 606 y se procedioacute al ensamblaje de los
contigs resultantes utilizando el programa CAP3 (Huang y Madan 1999) Posteriormente
se verificoacute el marco de lectura correcto utilizando el servidor de Expasy (Expasy Proteomic
Server httpwwwexpasychtoolsdnahtml) y se realizoacute su alineamiento con respecto a
los dos segmentos genoacutemicos de aislamientos cuyas secuencias completas se encontraban
disponibles en GenBank (DQ102381 DQ144451 AJ243719 AJ277556) (Sandgren et al
2001 Cerovska et al 2007)
94
Finalmente las secuencias de nt fueron traducidas a aa realizaacutendose comparaciones de
porcentajes de identidad y nuacutemero de posiciones variables a lo largo de las regiones bajo
estudio y generaacutendose aacuterboles filogeneacuteticos basados en los contigs obtenidos en la
investigacioacuten mediante el programa Mega v 40 bajo los paraacutemetros antes descritos
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Variabilidad geneacutetica de PMTV de Colombia
En total se obtuvieron 25 secuencias para la regioacuten amplificada de CP y 38 secuencias para
TGB2 Estas secuencias correspondieron a por lo menos cuatro aislamientos por cada
departamento bajo anaacutelisis (Tabla 52) De esta forma se aumentaron las secuencias
parciales de los genes CP y TGB2 de PMTV con respecto al trabajo reciente realizado por
nuestro grupo (Gil et al 2011) en donde soacutelo se obtuvieron cuatro y tres secuencias para
CP y TGB2 lo cual implica que las diferentes modificaciones realizadas a los
procedimientos necesarios para el estudio de este virus desde la forma de obtencioacuten de las
muestras hasta la purificacioacuten de los amplicones pasando por la eliminacioacuten de inhibidores
de las polimerasas resultaron altamente eficientes Esta situacioacuten abre la posibilidad de
plantear en el futuro proacuteximo un estudio de incidencia de PMTV basado en la deteccioacuten del
virus mediante RT-PCR con un muestreo estratificado en los diferentes pisos teacutermicos
donde se cultiva la papa en Colombia y realizando comparaciones con respecto a los
niveles de incidencia de Sss de manera que sea posible determinar la dimensioacuten de los
niveles de dispersioacuten de este virus en este paiacutes suramericano Un trabajo similar fue
realizado por Montero-Astuacutea et al (2008) en Costa Rica pero utilizando pruebas de ELISA
tanto para la deteccioacuten de Sss como de PMTV En este caso se encontroacute que el virus era
maacutes frecuentemente detectado en las regiones con mayores altitudes donde las condiciones
de alta humedad y bajas temperaturas aparentemente favorecen su infeccioacuten Sin embargo
es probable que la utilizacioacuten de pruebas de ELISA para la deteccioacuten del virus haya
conducido a una subestimacioacuten de los niveles de incidencia detectados en dicho trabajo
pues la distribucioacuten erraacutetica del virus su capacidad de movimiento ceacutelula-ceacutelula con ayuda
de proteiacutenas de movimiento codificadas por el TGB y no necesariamente en su forma
95
encapsidada y la utilizacioacuten de anticuerpos disentildeados a partir de cepas del norte de Europa
pueden influir negativamente en la deteccioacuten seroloacutegica del PMTV (Gallo et al 2012)
El anaacutelisis filogeneacutetico para CP incluyoacute 404 posiciones a partir de 46 secuencias 15 de las
cuales corresponden a aislamientos de referencia de Europa Asia y Norte Ameacuterica y las 4
previamente reportadas de aislamientos Colombianos por Gil et al (2011) El dendrograma
presentoacute dos grupos soportados por valores de bootstrap del 100 (Figura 54) El primer
clado agrupoacute todas las secuencias de referencia con 19 de los aislamientos Colombianos
obtenidos en este estudio y presentaron niveles de identidad superiores al 99 en todos los
casos (Tabla 53) Por otra parte el segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo seis de las aquiacute obtenidas y dos de las reportadas por Gil et
al (2011) Al interior de este clado se presentaron mayores niveles de variacioacuten (11 a
13) y su identidad con respecto a los miembros del primer clado fue de tan solo 76 La
secuencia de Beet Soil-Borne Virus de China utilizada como grupo externo de anaacutelisis se
ubicoacute en posicioacuten externa a los dos clados y compartioacute niveles de identidad inferiores al
59 con respecto a los aislamientos de PMTV
Estos resultados confirman los hallazgos de Veacutelez (2007) y Gil et al (2011) en referencia a
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que incluso bajo los paraacutemetros
definidos por Adams et al (2009) para la definicioacuten de especies al interior de la familia
Virgaviridae (ej cepas con identidades superiores a 80 y 90 a nivel de secuencias de CP
y del genoma completo respectivamente) podriacutea representar una nueva especie del geacutenero
Pomovirus (Familia Virgaviridae) hasta ahora no registrada en otros lugares del mundo Si
se considera que seis de las 25 secuencias de CP obtenidas en este trabajo correspondieron
a dicha variante es evidente que su presencia no es marginal en los cultivos de papa de
Colombia ya que para la muestra obtenida aunque evidentemente sesgada por la coleccioacuten
de suelos y tejidos con presencia de estructuras de Sss su proporcioacuten es del 23 La
diversidad entre aislamientos podriacutea deberse a que la regioacuten andina ha sido propuesta como
el centro de origen del PMTV (Mayo et al 1996)
96
Estos resultados representan un viraje con respecto a lo encontrado en los estudios de
variabilidad de PMTV con base en secuencias de CP de diferentes oriacutegenes geograacuteficos
por cuanto indistintamente se habiacutea encontrado que los niveles de identidad presentes en
este gen superaban el 98 en todas las comparaciones establecidas Asiacute por ejemplo
Latvala-Kirby et al (2009) al comparar 28 secuencias de Finlandia Letonia Escocia
Dinamarca Repuacuteblica Checa y Suecia encontraron que casi todas eran ideacutenticas siendo tan
soacutelo detectado un 2 de variacioacuten entre las maacutes distantes lo cual representa cambios en tan
soacutelo siete posiciones a nivel de la secuencia de aa de la proteiacutena resultante Similarmente
Xu et al (2004) reportaron que aislamientos de PMTV de Estados Unidos y Canadaacute eran
ideacutenticos y que eacutestos a su vez tan soacutelo diferiacutean en maacuteximo 3 de sus secuencias de CP con
respecto a cepas de Peruacute (Mayo et al 1996) Escocia y Escandinavia (Reavy et al 1997)
De esta forma de gran intereacutes resultaraacute emprender estudios que permitan evaluar las
diferencias bioloacutegicas de dichas variantes de PMTV sobre distintas variedades de papa e
incluso sobre hospedantes experimentales debido a que siacute existen diferencias de
patogenicidad entre aislamientos de PMTV que presentan tan bajos niveles de variacioacuten
(Nielsen y Nicolaisen 2003) es posible que dicho efecto sea auacuten mayor cuando se evaluacuteen
las variantes aquiacute reportadas
Con respecto al anaacutelisis filogeneacutetico basado en las secuencias de TGB2 se incluyeron 330
posiciones de 49 secuencias siete de las cuales fueron de aislamientos de referencia de
diferentes paiacuteses y tres de Colombia previamente analizadas por Gil et al (2011) El
dendrograma generado presentoacute un solo clado que incluyoacute todas las secuencias (Figura
55) las que compartieron niveles de identidad superiores a 98 (Tabla 54) Estos
resultados son un indicativo de que la variacioacuten encontrada entre aislamientos Colombianos
con respecto a CP no necesariamente se presentan a lo largo de los diferentes segmentos
genoacutemicos de PMTV y especiacuteficamente no se ven reflejadas en las secuencias de TGB2
que en los pocos estudios donde se ha secuenciado presenta niveles de identidad superiores
a 948 e incluso se ha encontrado que aislamientos de oriacutegenes geograacuteficos diferentes
pueden compartir hasta el 100 de identidad en la secuencia de aa para este gen (ej
aislamiento Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa y aislamientos 54-15 y 54-19 de
Dinamarca) (Cerovska et al 2007) Los altos niveles de conservacioacuten de este gen entre
97
aislamientos de PMTV que presentan diferencias en otras regiones del genoma como las
aquiacute encontradas para CP posibilitan que los cebadores utilizados para su amplificacioacuten
sean una herramienta uacutetil para el diagnoacutestico de este virus Asiacute por ejemplo Lambert et al
(2003) disentildearon los cebadores PMTV5 y PMTV7 dirigidos a amplificar una regioacuten de 646
pb comprendida entre TGB1 y TGB2 cuando reportaron por primera vez la presencia del
PMTV en EEUU Posteriormente Xu et al (2004) utilizaron la regioacuten que codifica para
TGB2 para el disentildeo de los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 en su estudio de evaluacioacuten de
distribucioacuten de PMTV en EEUU y Canadaacute
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Todos los cebadores utilizados en las reacciones de RT-PCR para amplificar diferentes
regiones de los ARN 2 y 3 del genoma de PMTV generaron los amplicones del fragmento
esperado en al menos un aislamiento evaluado Sin embargo en los aislamientos de Narintildeo
y Cundinamarca no fue posible la obtencioacuten de un contig completo para toda la regioacuten
secuenciada de ambos segmentos auacuten luego de diferentes intentos y modificaciones de los
paraacutemetros de la RT-PCR De esta forma para el caso de los aislamientos de Narintildeo no se
lograron amplicones del ARN2 con los cebadores PMTV759 ndash PMTV1552R PMTV759F
ndash 2017R y 1948F ndash 123end para el ARN 3 no fue posible obtener fragmentos con
RNA3F1ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end y F388 ndash PMTV7 Para el caso de
Cundinamarca no se lograron amplicones para el ARN 2 con PMTV759 ndash PMTV1552R y
PMTV759F ndash 2017R y para ARN 3 con RNA3F1 ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end
F388-PMTV7 Considerando que las variantes detectadas mediante la secuenciacioacuten de una
porcioacuten de CP presentaron bajos niveles de identidad con respecto a los genotipos
globalmente distribuidos de PMTV es posible que la ausencia de amplificacioacuten se deba a
diferencias en los sitios de reconocimiento de uno o ambos cebadores situacioacuten que impide
la amplificacioacuten de los fragmentos respectivos y por tanto su secuenciacioacuten posterior De
gran intereacutes seraacute continuar el proceso de secuenciacioacuten de dichas variantes para lo cual es
necesario la clonacioacuten de los respectivos cDNAs de cada segmento y el disentildeo de nuevos
cebadores especiacuteficos que permitan completar los vaciacuteos (gaps)
98
Por las razones antes expuestas para los anaacutelisis de secuencias de ARN2 y 3 soacutelo se
incluyeron los aislamientos representativos de Antioquia (Ant) y Boyacaacute (Boy) (Tabla
55) Para el ARN 2 se obtuvieron contigs de 2577 nt y 2584 para los aislamientos
Antioquia y Boyacaacute mientras que para el ARN 3 los contigs tuvieron una extensioacuten de
2617 y 2360 nt respectivamente Esto implica que para el ARN 2 se obtuvo un porcentaje
de cobertura del 83 de este segmento genoacutemico y del 87 para el ARN 3 en
comparacioacuten con el aislamiento Sw de PMTV (AJ243719 y AJ277556) (Sandgren et al
2001) En teacuterminos de aa los contigs del ARN2 incluyeron 150 de los aa de CP (posiciones
26 a 176) y 799 de CP-RT (posiciones 26 a 825) Para el ARN 3 se obtuvo la secuencia
completa de aa de TGB1 (463 aa) y TGB2 (119 aa) asiacute como 146 de 190 aa de TGB3
(posiciones 1 a 146) para el aislamiento de Boyacaacute y la totalidad de dicha proteiacutena para la
cepa de Antioquia Las demaacutes secuencias obtenidas corresponden a regiones UTR de los
extremos 3acute para el ARN 2 y 5acute para el ARN 3
Con el fin de realizar un anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las dos cepas obtenidas
con respecto al genoma de la cepa de PMTV de Suecia ndash Sw cuyo genoma completo estaacute
depositado en GenBank bajo el coacutedigo PRJNA14789 (Savenkov et al 1999 Sandgren et
al 2001) se incluyeron 1956 nt (651 aa) para CP-RT 531 nt (176 aa) para CP y 1392 (463
aa) para las tres regiones del TGB En teacuterminos generales se encontraron muy altos niveles
de identidad en las tres regiones analizadas siendo la CP la maacutes uniforme con 99 en la
secuencia de nt y 100 en aa para las tres cepas CP-RT presentoacute un nivel de identidad
para nt de 994 entre las cepas de Antioquia y Boyacaacute y del 975 - 976 con respecto a
la secuencia de referencia mientras que estos valores fueron superiores al 982 cuando se
comparoacute la secuencia de aa Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos compartieron
un 999 de identidad en nt y aa (Figura 56) Las pocas diferencias a nivel de aa
encontradas en este estudio correspondieron a cambios en 15 posiciones para el producto
del ARN 2 siendo la maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la posicioacuten 81
de CP Para el caso de TGB se encontraron 10 cambios a lo largo de las tres proteiacutenas
analizadas con la presencia de una delecioacuten en la posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
99
Por otra parte el anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2569 nt para ARN 2 con
secuencias de referencia de los aislamientos Corneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia (Figura 57) arrojoacute un dendrograma con dos
clados soportados por 100 de bootstrap separaacutendose los aislamientos de Colombia de los
de Europa sin embargo los niveles de identidad entre ambos grupos fueron muy altos
(gt975) (Tabla 56) Al calcular los niveles de diversidad (promedio del nuacutemero de
sustituciones de nucleoacutetidos por cada sitio) para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos
(dNS) se encontroacute una diversidad muy baja con tan soacutelo 0017 (SE= 0003) para dNS y
0009 (SE=0002) para dS La relacioacuten promedia entre dNSdS fue de 18 lo cual indica
que las cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten positiva para este componente del
genoma Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 3 mientras que para las
europeas fue de 12 La distancia geneacutetica o nuacutemero de sustituciones promedio por sitio
basada en el meacutetodo de Kimura-2 paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0015
El anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de
referencia de los aislamientos Korneta-Nemilkov (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia generoacute
un dendrograma con dos clados de aislamientos europeos mientras que los aislamientos
Colombianos se presentaron en forma individual sobre ramas soportadas por 100 de
bootstrap (Figura 58) A pesar de dichas agrupaciones los niveles de identidad entre todos
los aislamientos fueron superiores a 967 (Tabla 57) Al calcular los niveles de
diversidad para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos (dNS) se encontroacute una diversidad
muy baja para todos los aislamientos con tan soacutelo 0011 (SE= 0002) para dNS y 0044
(SE=0006) para dNS La relacioacuten media entre dNSdS fue de 025 lo cual indica que las
cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten estabilizadora en dicho segmento de ARN
Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 019 mientras que para los
aislamientos europeos fue de 039 La distancia geneacutetica basada en el meacutetodo de Kimura -2
paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0020 (SE 0002)
Los bajos niveles de variacioacuten encontrados en los anaacutelisis de genomas de PMTV (Savenkov
et al 1999 Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) y que nuevamente fueron inferidos
100
en el presente estudio para las cepas del clado que representa PMTV sensu stricto indican
que este virus se encuentra bajo fuertes presiones de seleccioacuten determinadas
presumiblemente por las propias caracteriacutesticas de su genoma el estrecho rango de
hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica por parte de su vector Sss (Kirk
2008 Santala et al 2010)
Para el primer caso la restriccioacuten selectiva se manifiesta por los bajos valores de dNSdS
calculados para dicho segmento y ocurre fundamentalmente al presentarse traslape de genes
en el ARN 3 Sin embargo para el ARN 2 dicha relacioacuten fue gt1 lo cual sugiere una
seleccioacuten positiva que puede explicarse por el hecho que este segmento presenta la
estrategia de supresioacuten del codoacuten de parada tipo amber para la traduccioacuten de las dos
proteiacutenas codificantes (CP y CP-RT) lo cual supone menos restricciones para la fijacioacuten de
mutaciones De otra parte la presencia de un estrecho rango de hospedantes para el virus
que se restringe a algunas especies de las familias Solanaceae y Chenopodiaceae (Kirk
2008) aunada a su transmisioacuten por Sss supone fuertes restricciones sobre los cambios en
las diferentes proteiacutenas del virus que interactuacutean con sus hospedantes y vectores lo cual
impide altas tasas de variacioacuten tales como las que presentan otros virus de ARNss(+) como
los potyvirus que en general tienen amplios rangos de hospedantes y cuya transmisioacuten por
aacutefidos poliacutefagos es del tipo no persistente (Hu et al 2009)
A pesar de los altos valores de uniformidad general encontrados de gran intereacutes resultoacute la
presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los aislamientos
colombianos de PMTV Por esto es necesario en el futuro evaluar el significado bioloacutegico
de dichos cambios por ejemplo si estan relacionadas con el efecto de las variedades nativas
de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas que las poblaciones de Sss
tienen en las regiones Andinas donde se presentan mayores niveles de variacioacuten que en
aquellas encontradas en las regiones cultivadoras de papa del hemisferio norte tal como lo
planteoacute Carrentildeo (2009) El efecto de estas inserciones y de diferentes sustituciones
detectadas en este trabajo sobre diferentes regiones de los segmentos de ARN 2 y 3
requiere un tratamiento futuro detallado a partir de anaacutelisis de mutantes y de sus efectos
sobre el ciclo infectivo viral
101
Esta investigacioacuten representa un avance importante en la caracterizacioacuten geneacutetica del
PMTV en las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia Sus resultados
confirman la presencia de dos genotipos principales de este virus en el paiacutes uno que
representa al PMTV sensu stricto destacado por presentar muy bajos niveles de variacioacuten
entre sus cepas y otro que representa una variante hasta ahora soacutelo identificada en
Colombia y que por presentar porcentajes de identidad inferiores al 80 con respecto al
grupo principal podriacutea representar una nueva especie de pomovirus que requiere ser
evaluada bioloacutegica patogeacutenica y molecularmente Finalmente es imperativo estudiar el
efecto de ambos genotipos virales sobre la produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de
papa en Colombia de manera que los organismos de sanidad vegetal estatales gremios de
productores y agroindustrias puedan valorar la necesidad de incluir la deteccioacuten del PMTV
en los programas de certificacioacuten de semilla y de mejoramiento geneacutetico de papa que se
adelantan en el paiacutes
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz
Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el
Departamento de Narintildeo
102
BIBLIOGRAFIacuteA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Arif M Torrance L Reavy B 1995 Acquisition and transmission of Potato mop-top
furovirus by a culture of Spongospora subterranea f sp subterranea derived from a single
cystosorus Annals of Applied Biology 126493-503
Calvert E Harrison BD 1966 Potato mop-top a soil-borne virus Plant Pathology
15134ndash139
Carnegie SF Saddler GS Peters JC 2009 Cultivar susceptibility to Potato mop-top virus
(PMTV) infection and symptom expression Aspects of Applied Biology 94 (Potatoes
Viruses and their Vectors) 51ndash54
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea
fsp subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Cerovska N Moravec T Rosecka P Filigarova M Pecenkova T 2003 Nucleotide
sequences of coat protein coding regions of six potato mop-top virus isolates Acta
Virologica 4737-40
Cerovska N Pecenkova M Foligarova M Dedic P 2007 Sequence analysis of the
Czech Potato mop-top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica
5261-64
103
Cowan GH Torrance L Reavy B1997 Detection of Potato mop-top virus capsid
readthrough protein in virus particles Journal of General Virology 781779-1783
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
Scotland
Felsenstein J 1985 Confidence limits on phylogenies an approach using the bootstrap
Evolution 39(4)783-791
Gallo Y 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea en Bioquiacutemica Facultad de Medicina Universidad Nacional
de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Gil JF Gutieacuterrez P Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
Hall TA 1999 BioEdit a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis
program for Windows 9598NT Nucleic Acids Symposium Series 4195-98
Harrison BD Jones RAC 1970 Host range and some properties of Potato mop-
top virus Annals Applied Biology 65393-402
104
Hu X Karasev AV Brown CJ Lorenzen JH 2009 Sequence characteristics of potato
virus Y recombinants Journal of General Virology 903033ndash3041
Huang X Madan A 1999 CAP3 A DNA sequence assembly program Genome
Research 9868-877
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 7147-57
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Kirk HG 2008 Mop-top virus relationship to its vector American Journal of Potato
Research 85 261-265
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003
First Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease
87872
Larkin M Blackshields G Brown NP Chenna R McGettigan PA McWilliam H
Valentin F Wallace IM Wilm A Loacutepez R Thompson JD Gibson TJ Higgins DG
2007 Clustal W and Clustal X version 20 Bioinformatics 23(21)2947-2948
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99519-531
105
Lim HS Bragg J N Ganesan U Lawrence DM Yu J L Isogai M Hammond J
Jackson AO 2008 Triple gene block protein interactions involved in movement of Barley
stripe mosaic virus Journal Virology 824991-5006
Lim HS Bragg J N Ganesan U Ruzin S Schichnes D Lee MY Vaira AM Ryu KH
Hammond J Jackson AO 2009 Subcellular localization of the Barley stripe mosaic virus
triple gene block proteins Journal Virology 839432-9448
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization
and effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal
of General Virology 862879-2889
MacKenzie DJ 1996 Detection of potato mop-top virus in leaf or tuber tissue by reverse
transcription-polymerase chain reaction Document CPHBT96K03 Centre for Plant Health
Agriculture and Agri-Food Canada Sidney BC Canada
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C
Salazar LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top
virus from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
Montero-Astuacutea M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U and Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Mumford RA Walsh K Barker I Boonham N 2000 Detection of Potato mop top virus
and Tobacco rattle virus using a multiplex real-time fluorescent reverse transcription
polymerase chain reaction assay Phytopathology 90448-453
106
Nakayama T Maoka T Hataya T Shimizu M Fuwa H Tsuda S Motoyuki M 2010
Diagnosis of Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-225
Nielsen SL Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups
within Potato mop-top virus Archives of Virology 148 381-388
Reavy B Sandgren M Barker H Heino P Oxelfelt P 1997 A coat protein transgene
from a Scottish isolate of Potato mop-top virus mediates strong resistance against
Scandinavian isolates which have similar coat protein genes European Journal of Plant
Pathology 103829-834
Roos J Hopkins R Kvarnheden A Dixelius C 2011 The impact of global warming on
plant diseases and insect vectors in Sweden European Journal of Plant Pathology 1299-19
Ryazantsev DY Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato viral pathogens Molecular Biology 43515-523
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M
Wieczorek P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-
Wiśniewska J Yin Z Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E
Taluntytė L Pūpola N Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E
107
Sozonov A Tikhonovich I Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam
G Valkonen JPT 2010 Detection distribution and control of Potato mop-top virus a soil-
borne virus in northern Europe Annals of Applied Biology 157163-178
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003
Potato mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich
protein are dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of
General Virology 841001-1005
Savenkov EI Sandgren MY Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Tamura K Dudley J Nei M Kumar S 2007 MEGA4 Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) software version 40 Molecular Biology and Evolution 241596-1599
Tamura K Nei M 1993 Estimation of the number of nucleotide substitutions in the
control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Molecular Biology and
Evolution 10512-526
Technelysium 2009 Chromas 20 Consultado el 15 de Febrero de 2009 Disponible en
httpwwwtechnelysiumcomauchromas_litehtml
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Research 83423-31
Torrance L Cowan GH Pereira LG 1993 Monoclonal antibodies specicreg for Potato
mop-top virus and some properties of the coat protein Annals of Applied Biology 122311-
322
108
Torrance L Cowan GH Sokmen M A Reavy B 1999 A naturally occurring deleted
form of RNA 2 of Potato mop-top virus Journal of General Virology 802211-2215
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop-top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI
Torrance L 2010 The N-Terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required
for nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant-Microbe Interaction 23(11)1486-1497
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top
virus in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
109
51 Anexos
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb) dirigidos al
gen de la caacutepside viral de PMTV a partir de muestras de tejido de raiacutez de plantas de N
benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea del
Departamento de Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador 100 pb Carril 2 BS8T Carril 3
BS9T Carril 4 BS4T Carril 5 BS11P Carril 6BS4T Carril 7 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7
500 pb
110
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb)
dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) de PMTV a partir de muestras de tejido de
raiacutez de plantas de N benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S
subterranea de los Departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador
100 pb Carril 2-4 Control positivo (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 5-7
SRL5 (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 8-10 SRL7 (ADN directo
110150 respectivamente) Carril 11-13 BS8T (ADN directo 110150
respectivamente) Carril 1415 BS4T1 (ADN directo y 110) Carril 16 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
500 pb
111
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten de los
segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV)
Cebador Secuencia 5acute- 3 Posicioacuten en el
genoma (nt) Referencia
RNA3 F1 CGCTCGAGTTTAGGTGACACTATAGGTATTTCA
ACTCTACCTAG 1 a 388
Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003 PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
PMTVF4 CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG 1726 a 1746 Xu et al
2004
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
F388
CGGGATCCGAAGTAGACCACACAGAGTG
1 a 388 Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011 PMTV1552R GCC AAT TGT CTC AAT CAT ACA CTG 1865 a 1888
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011
2017R CCA CTG CAA AAG AAC CGA TTT C Mumford
et al 2000
1948F GTG ATC AGA TCC GCG TCC TT Mumford et al 2000
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
112
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7 (2063 pb)
PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al ARN3 del genoma
del Potato mop-top virus (PMTV) a partir de tejido de raiacutez de plantas de N benthamiana y
S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea de cuatro departamentos de
Colombia Carril 1 Marcador 100 pb plus carriles 2-5 con cebadores RNA3F1-PMTV7
SRL5 SRL6 BS9T1 BS9T2 carril 6-12 con cebadores PMTV5-PMTV7 23T 24T
SRL5 SRL6 BS4T BS8T BS9T carril 13-20 con cebadores PMTVF4-123 end Villa1
NS19P1 23T 24T SRL4 SRL5 SRL6 BS4T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1000 pb 500 pb
113
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos cultivadores de papa de
Colombia
Gen CP Gen TGB2
ANTIOQUIA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
25 La Unioacuten Suelo S tuberosum 25(1) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL4 Santa Rosa S tuberosum var Diacol Capiro 25(2) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL4 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle La Unioacuten Suelo S tuberosum SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle1 La Unioacuten Suelo S tuberosum
Valle2 La Unioacuten Suelo S tuberosum
BOYACAacute
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
BS2T Oicataacute Suelo S tuberosum BS1P1 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4P Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS1P2 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4T Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS4T1 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS8T Soracaacute Suelo S tuberosum BS4T2 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS9T Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum BS8T1 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11P Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS8T2 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11T Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS9T1 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS12P Tunja Suelo con Pennisetum clandestinum BS9T2 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS9T3 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS11T1 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS11T2 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS13P Tunja Suelo S tuberosum
CUNDINAMARCA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
CS1T Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa CS1P1 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2P Subachoque Suelo S tuberosum CS1P2 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2T Subachoque Suelo S tuberosum CS2P Subachoque Suelo S tuberosum
CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Mad Madrid Suelo S tuberosum Villa1 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
114
Villa2 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
NARINtildeO
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
NS1P Pasto Suelo S tuberosum NS3P1 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS2T Pasto Suelo S tuberosum NS3P2 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro NS3P3 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8P Pasto Suelo S tuberosum NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8PF Pasto Suelo S tuberosum
NS10T Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS19P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS19P2 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P2 Ipiales Suelo S tuberosum
115
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de Potato
mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo
Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus (China)
Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte inferior de
las ramas
116
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
BS4T
Boyacaacute
Colombia
CS1T
Cundinamarca
Colmbia
NS2T
Narintildeo
Colombia
NS6P
Narintildeo
Colombia
71MY
Cundinamarca
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AJ243719
PMTV
Suecia
EF545141
Beet Soil-
Borne
Virus
China
BS4T Boyacaacute
Colombia ID 0997 0764 0752 0762 0995 0995 0599
CS1T
Cundinamarca
Colombia
0997 ID 0764 0752 0762 0992 0992 0599
NS2T Narintildeo
Colombia 0764 0764 ID 0891 0876 0769 0769 0571
NS6P Narintildeo
Colombia 0752 0752 0891 ID 0967 0752 0752 0596
71MY
Cundinamarca
Colombia
0762 0762 0876 0967 ID 0762 0762 0599
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0995 0992 0769 0752 0762 ID 1 0594
AJ243719
PMTV Suecia 0995 0992 0769 0752 0762 1 ID 0594
EF545141 Beet
Soil-Borne
Virus China
0599 0599 0571 0596 0599 0594 0594 ID
117
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del
mundo Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus
(China) Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte
inferior de las ramas
118
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
23T
Antioquia
Colombia
NS22P1
Narintildeo
Colombia
Villa2
Cundinamarca
Colombia
DQ144451
Repuacuteblica
Checa
NC_003725
Suecia
EF545142 Beet
Soil-Borne Virus
China
23T Antioquia
Colombia ID 0981 0981 0984 0981 0699
NS22P1 Narintildeo
Colombia 0981 ID 099 0984 0981 0708
Villa2 Cundinamarca
Colombia 0981 099 ID 0987 0984 0708
DQ144451 Repuacuteblica
Checa 0984 0984 0987 ID 099 0714
NC_003725 Suecia 0981 0981 0984 099 ID 0711
EF545142 Beet Soil-
Borne Virus China 0699 0708 0708 0714 0711 ID
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato mop-top virus en cuatro
Departamentos cultivadores de papa de Colombia
Muestra Hospedante Municipio Planta sentildeuelo
Ant (23T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
La Unioacuten (Antioquia)
N benthamiana
Boy (BS4T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Siachoque
(Boyacaacute) N benthamiana
Cund(CS1T) Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
Subachoque (Cundinamarca)
N benthamiana
Nar (NS6P) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro Pasto (Narintildeo) S phureja
119
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia y Boyacaacute
(Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw Suecia A Niveles de
identidad de nucleoacutetidos y aminoaacutecidos (entre pareacutentesis) de las regiones CP CP-RT y
TGB analizadas y la cepa NC_003724 B Regioacuten CP-RT se incluyeron 1956 nt (651 aa)
para CP-RT y 531 nt (176 aa) para CP Se presentaron cambios en 15 posiciones para el
producto del ARN 2 siendo lo maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la
posicioacuten 81 de CP C Regioacuten TGB se incluyeron 1392 nt (463 aa) Se presentan 10
cambios a lo largo de las tres proteiacutenas analizadas con la presencia de una delecioacuten en la
posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
120
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con secuencias de
referencia de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia y secuencias Colombianas de PMTV
procedentes de Antioquia y Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de
Bootstrap (100 ) se indican sobre las ramas La escala representa las sustituciones
promedio por sitio
121
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica Checa
AJ243719
PMTV Suecia
Antioquia
Colombia ID 0994 0979 0976
Boyacaacute
Colombia 0994 ID 0978 0975
DQ102381 PMTV
Repuacuteblica Checa 0979 0978 ID 0995
AJ243719 PMTV
Suecia 0976 0975 0995 ID
122
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de referencia
de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19
(AY353719) y 54-10 (AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd
(D30753) de Escocia y secuencias Colombianas de PMTV procedentes de Antioquia y
Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de Bootstrap (100 ) se indican
sobre las ramas La escala representa las sustituciones promedio por sitio
123
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AY426745
PMTV
Dinamarca
AY353719
Dinamarca
AJ277556
PMTV
Suecia
D30753
PMTV
Escocia
Antioquia
Colombia ID 0979 0988 0987 0986 0973 0967
Boyacaacute
Colombia 0979 ID 0980 0980 0979 0980 0969
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0988 0980 ID 0998 0997 0979 0971
AY426745
PMTV
Dinamarca
0987 0980 0998 ID 0997 0979 0970
AY353719
PMTV
Dinamarca
0986 0979 0997 0997 ID 0978 0969
AJ277556
PMTV Suecia 0973 0980 0979 0979 0978 ID 0986
D30753 PMTV
Escocia 0967 0969 0971 0970 0969 0986 ID
124
6 ANEXOS GENERALES
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen)
1 Homogenizar 100 mg de tejido de planta en nitroacutegeno liacutequido utilizando un mortero
Adicionar 400 microL de buffer AP1 y 4 microL de la solucioacuten de ARNase A (100mgmL) a
un maacuteximo de 100 mg (peso huacutemedo) o 20 mg (peso seco) de tejido de planta
homogenizado y agitar vigorosamente
2 Incubar la mezcla por 10 min a 65degC Mezclar por inversioacuten 2 oacute 3 veces durante la
incubacioacuten
3 Agregar 130 microL de buffer AP2 al lisado mezclar e incubar por 5 min en hielo
4 Recomendado Centrifugar el lisado por 5 min a 20000 x g (14000 rpm)
5 Pipetear el lisado en la columna QIAshredder Mini spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a 20000 x g (14000 rpm)
6 Transferir la fraccioacuten que pasoacute por la columna del paso 5 en un nuevo tubo sin
disturbar el sedimento de restos celulares
7 Agregar 15 voluacutemenes de buffer AP3E al lisado aclarado y mezclar por pipeteo
8 Pipetear 650 microL de la mezcla de paso 7 incluyendo cualquier precipitado que se
pueda haber formado en la columna DNeasy Mini spin column colocando en un
tubo de coleccioacuten de 2 ml Centrifugar por 1 min a 6000 x g (corresponde a 8000
rpm para la mayoriacutea de las microcentrifugas) y descartar el liacutequido Reutilizar el
tubo de coleccioacuten en el paso 9
9 Repetir el paso 8 con la muestra restante Desechar el liacutequido que atraviesa la
membrana y el tubo de coleccioacuten
10 Colocar la columna DNeasy Mini spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2 ml
agregar 500 microL de buffer AW y centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rpm)
Descartar el liacutequido que atraviesa la membrana y reutilizar el tubo de coleccioacuten en
el paso 12
11 Adicionar 500 microL de buffer AW a la columna DNeasy Mini spin y centrifugar por 2
min a 20000 x g (14000 rpm) para secar la membrana
12 Transferir la columna DNeasy Mini spin a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL y
pipetear 40 microL de Agua bi-destilada directamente en la membrana de DNeasy
Incubar por 5 min a temperatura ambiente (15-25degC) y luego centrifugar por 1 min
a 6000 x g (8000 rpm) para eluir
13 Repetir el paso 12 una vez
125
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo (Doyle y Doyle 1987)
Previo a dar inicio a al procedimiento se debe asegurar de contar con
Nitroacutegeno liacutequido
Bantildeo Mariacutea a 65degC
Enfriar morteros a -20degC
Preparar solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2
Preparar el volumen de buffer CTAB+ β-Mercaptoetanol correspondiente al
nuacutemero de muestras
Desinfestar las muestras con hipoclorito y agua destilada durante 1 min
1 Tomar la raiacutez previamente desinfestada macerarla en nitroacutegeno liacutequido y pasarla a
un tubo eppendorf de 2 mL hasta completar un volumen de 400-500 microL
2 Adicionar 500 microL de buffer de extraccioacuten (CTAB) y 1 de β-Mercaptoetanol (5
microL) previamente preparado
Mezclar por inversioacuten
3 Incubar los tubos a 65degC por 30 min Durante este tiempo hacer inversioacuten de los
tubos cada 5 min
4 Adicionar 250 microL de fenol y 250 microL de cloroformo alcohol isoamiacutelico (241)
Mezclar por inversioacuten
5 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 10 min
6 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL
7 Adicionar un volumen de cloroformo alcohol isoamiacutelico (respecto al sobrenadante)
Mezclar por inversioacuten y centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 5 min
8 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL y repetir
el paso 7
9 Adicionar un volumen de isopropanol friacuteo y 01 voluacutemenes de acetato de sodio 3M
invertir varias veces para precipitar el ADN Llevar las muestras a -20degC por 60 min
como miacutenimo o durante toda la noche Periodos maacutes largos pueden aumentar la
produccioacuten
10 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 15 min a temperatura ambiente
11 Descartar el sobrenadante invirtiendo raacutepida y suavemente los tubos y adicionar 200
microL de etanol friacuteo al 70 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 2 min
12 Descartar el sobrenadante por inversioacuten y secar el pellet a temperatura ambiente
invirtiendo los tubos sobre papel absorbente
13 Resuspender el pellet en 50 microL de agua ultrapura esteacuteril
14 Adicionar 4 microL de ARNasa a cada muestra e incubar en el bantildeo Mariacutea a 37degC
durante miacutenimo 2 horas o durante toda la noche
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
126
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y
hongos filamentosos (Qiagen)
1 Determinar la cantidad de material de planta No usar maacutes de 100 mg
2 Colocar inmediatamente el tejido pesado en nitroacutegeno liacutequido Macerar bien en
un mortero Pasar el tejido en polvo a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL
manteniendo los tubos en nitroacutegeno liacutequido Eacuteste se puede evaporar pero no se
debe permitir que el tejido se descongele Proceder inmediatamente al paso 3
3 Adicionar 450 microL de buffer RLC a un maacuteximo de 100 mg de tejido en polvo
Hacer vortex vigorosamente Nota Asegurar que el B-mercaptoetanol (β-ME)
haya sido agregado al buffer RLC antes de su uso (10 microL de β-ME1 mL de
buffer RLC)
4 Transferir el lisado a la columna QIAshredder spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a maacutexima velocidad (13000 rpm
oacute 18500 x g) Transferir cuidadosamente el sobrenadante que pasoacute por la
columna a un nuevo tubo de microcentriacutefuga sin disturbar el sedimento de
restos celulares en el tubo de coleccioacuten Usar soacutelo el sobrenadante en los pasos
siguientes
5 Adicionar 05 voluacutemenes de etanol (96-100) al lisado aclarado y mezclar
por pipeteo inmediatamente No centrifugar Proceder inmediatamente al paso 6
6 Transferir la muestra (usualmente 650 microL) incluyendo cualquier precipitado
que se haya formado a una columna RNeasy spin (rosada) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL (suministrado) Cerrar suavemente la tapa y centrifugar
por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que pasoacute por la
membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 7
7 Adicionar 700 microL de buffer RW1 a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 8
8 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo en el paso 8 Nota Asegurar que el
buffer RPE tenga adicionado el etanol antes de su uso
9 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 2 min a 8000 x g (10000 rpm) para lavar la membrana
de la columna
10 Opcional Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2
mL (suministrado) y descartar el tubo anterior con el liacutequido Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar a velocidad maacutexima por 1 min (13000 rpm oacute 18500 x g)
11 Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 15 mL
(suministrado) Adicionar 20 microL de agua tratada con DEPC (Dietil
pirocarbonato Qiagen) directamente a la membrana de la columna Cerrar
suavemente la tapa y centrifugar por 1 min a 8000 x g (10000 rpm) para eluir
el ARN
12 Repetir el paso 11
127
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Volumen del componente
para 15 microL de mezcla
Producto de PCR 8 μl
Buffer de la enzima 1 (1X) 1 5 μl
Buffer de la enzima 2 (1X) 1 5 μl
Enzima de restriccioacuten 1 2 μl
Enzima de restriccioacuten 2 2 μl
Volumen total 15 μl
2 Incubar las muestras al bantildeo Mariacutea a 37degC por 12 h-24 h
3 Ralizar el anaacutelisis en gel de agarosa al 25
128
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa RT M-
MuLV para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del componente
para 20 microL de mezcla
Agua bi-destilada 05 microL
PBST (05) 004 15 microL
Buffer RT M-MuLV 5X 1X 4 microL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 microL
dNTPs 10 mM 1 mM 2 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 1 microM 2 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa M-MuLV 20 UmicroL 05 microL
ARN 5 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
129
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 20 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 95 microL
Buffer RT Maacutexima 5X 1X 4 microL
dNTPs 10 mM 05 mM 1 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 05 microM 1 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa Maximareg 200 UmicroL 1 microL
ARN 3 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
130
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes de
descongelar
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 146 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 25 mM 02 mM 2 microL
Primer F 10 microM 05 microM 125 microL
Primer R 10 microM 5 microM 125 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 04 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN Molde 1microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Condiciones del ciclo de la PCR para Sss
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 55 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
131
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes del
descongelamiento
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25
microL de mezcla
Agua bi-destilada 158 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 10 mM 02 mM 05 microL
Primer F 10 microM 2 microM 05 microL
Primer R 10 microM 2 microM 05 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 02 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN copia 3 microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 53 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
134
7 CONCLUSIONES GENERALES
En este estudio se encontroacute que las poblaciones Colombianas de Spongospora subterranea
f sp subterranea (Sss) presentan una estructura baacutesica consistente en tres tipos geneacuteticos
(I II y III) El subgrupo III difiere de los reportados mundialmente como Tipo I y Tipo II
en 5 y 2 respectivamente El Tipo III presentoacute la mayor proporcioacuten de aislamientos de
Sss en este estudio con cepas de diferentes departamentos hospedantes y tejidos
sintomaacuteticos mientras que el Tipo I no fue encontrado en muestras procedentes de agallas
de raiacutez Es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa en Colombia asiacute como su
epidemiologiacutea y capacidad para la transmisioacuten de PMTV
Los anaacutelisis de RFLPs de regiones ITS del ADNr de Sss demostraron polimorfismos en los
sitios de corte de las enzimas Hin6I y Bsp143I Se confirmoacute que la digestioacuten con la enzima
Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos del Tipo III mientras que
el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los Tipos I y II permitiendo
separar los tres principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico de Sss Los
resultados obtenidos sugieren la viabilidad de plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla
El anaacutelisis filogeneacutetico para el gen CP de PMTV permitioacute separar dos grupos de
aislamientos del virus El primer clado agrupoacute todas las secuencias de referencia mundial
con 19 de los aislamientos Colombianos obtenidos en este estudio que presentaron niveles
de identidad superiores al 99 El segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo dos de las reportadas en investigaciones previas y seis
obtenidas en el presente estudio con niveles de variacioacuten del 11 al 13 y con una identidad
de tan solo 76 con respecto a los miembros del primer clado Estos resultados confirman
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que no ha sido registrada en otros
Osorio 2012
135
135
lugares del mundo Es necesario estudiar el efecto de ambos genotipos virales sobre la
produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de papa en Colombia de manera que se generen
tecnologiacuteas para la deteccioacuten de PMTV en los programas de certificacioacuten de semilla y de
mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en el paiacutes
En el anaacutelisis de las regiones parciales de CP y CP-RT del ARN2 y TGB del ARN3 de
PMTV sensu stricto se encontraron niveles muy altos de identidad en las tres regiones
estudiadas siendo la CP la maacutes uniforme Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos
compartieron un 999 de identidad en nt y aa Asiacute mismo los anaacutelisis filogeneacuteticos para el
ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Europeos y Colombianos demostraron que los niveles de
identidad entre ambos grupos fueron muy altos gt975 para ARN 2 y gt967 para el
ARN 3 Estos bajos niveles de variacioacuten permiten inferir que este virus se encuentra bajo
fuertes presiones de seleccioacuten determinadas presumiblemente por las propias caracteriacutesticas
de su genoma el estrecho rango de hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica
por parte de su vector Sss Sin embargo a pesar de los altos valores de uniformidad general
encontrados la presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los
aislamientos colombianos de PMTV resulta interesante para el desarrollo de
investigaciones que permitan determinar si se trata de adaptaciones del genoma viral a las
variedades nativas de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas propias de
las poblaciones de Sss en las regiones Andinas
NS1P Pasto (Nar) Suelo S tuberosum
iv
TABLA DE CONTENIDO
Pag
RESUMEN XI
ABSTRACT XII
1 INTRODUCCIOacuteN 1
2 OBJETIVOS 4
21 Objetivo general 4
22 Objetivos especiacuteficos 4
3 MARCO TEOacuteRICO 5
31 Generalidades del cultivo de la papa 5
32 Generalidades sobre Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) 7
321 Taxonomiacutea de Sss 7
322 Ciclo de vida Sss 8
323 Rango de hospedantes de Sss 10
324 Siacutentomas causados por Sss 11
325 Control de Sss 12
33 Deteccioacuten de Sss 16
34 Variabilidad geneacutetica de Sss 19
35 Generalidades del Potato mop-top virus (PMTV) 22
351 Taxonomiacutea de PMTV 23
352 Ciclo de la infeccioacuten por PMTV 24
353 Rango de hospederos de PMTV 25
354 Siacutentomas causados por PMTV 26
36 Deteccioacuten de PMTV 27
37 Variabilidad geneacutetica de PMTV 29
BIBLIOGRAFIA 31
v
Pag
RESULTADOS 46
4 ARTIacuteCULO 1- VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora
subterranea f sp subterranea EN COLOMBIA 46
41 Anexos-Artiacuteculo 1 65
5 ARTIacuteCULO 2 ndash VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE LOS ARN 2 Y 3
DE AISLAMIENTOS COLOMBIANOS DE PMTV 84
51 Anexos-Artiacuteculo 2 109
6 ANEXOS GENERALES 124
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen) 124
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo 125
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y hongos
filamentosos (Qiagen) 126
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs 127
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
RT M-MuLV para muestras de ARN 128
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN 129
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa 130
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa 131
7 CONCLUSIONES GENERALES 132
vi
INDICE DE FIGURAS
Pag
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV 24
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp
subterranea en plantas de papa de Colombia 65
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja
var Criolla Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos
infestados con Spongospora subterranea f sp subterranea 66
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos
agallas o raiacuteces de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana 68
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8 69
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la
regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp
subterranea de Colombia 70
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb)
a partir de ADN de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum
tuberosum S phureja y Nicotiana benthamiana 71
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e
ITS2 del ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss)
de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo 75
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos
de S subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I
MspI TaqI y Tru1I mediante el programa Web-cutter 77
vii
Pag
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN
ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las
enzimas de restriccioacuten Bsp143I y Hin6I que permiten determinar los tres
Tipos de Sss identificados en este trabajo 82
Figura 410 Gel de RFLPs con la enzima Hind6I y Bsp143I con muestras de los
Tipos I II y III de Sss detectados en el estudio 83
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb)
dirigidos al gen de la caacutepside viral del Potato mop-top virus PMTV 109
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4
(417 pb) dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) del Potato
mop-top virus (PMTV) 110
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7
(2063 pb) PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al
ARN3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 112
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses
del mundo 115
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del
genoma de Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia
y otros paiacuteses del mundo 117
viii
Pag
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia
y Boyacaacute (Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw
Suecia 119
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con
secuencias de referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del
Potato mop-top virus (PMTV) 120
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias
De referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del Potato
mop-top virus (PMTV) 122
ix
INDICE DE TABLAS
Pag
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o
raiacuteces de plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea 67
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna
polvosa y de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad 72
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de
aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en
Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2
del ADN ribosomal 78
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S
E ITS2 del ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp
subterranea de Colombia y otros paiacuteses del mundo 81
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten
de los segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 111
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia 113
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 116
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 118
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato
mop-top virus en cuatro Departamentos cultivadores de papa de Colombia 118
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 118
x
Pag
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 123
xi
RESUMEN
El cultivo de papa es uno de los renglones agriacutecolas de mayor importancia en Colombia se
extiende a 128701 ha y genera una produccioacuten anual de 23 millones de ton antildeo-1
Desde el
punto vista fitosanitario la papa se ve afectada por diversos problemas destacaacutendose en los
uacuteltimos antildeos la reemergencia de la Sarna polvosa causada por el protozoario del suelo
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) El efecto de esta enfermedad se refleja en
el deterioro de la calidad del tubeacuterculo y en la reduccioacuten de la produccioacuten al afectar el
sistema radicular de las plantas Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus
(PMTV) uno de los virus prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarenteneario en diferentes paiacuteses del mundo En este trabajo se evaluaron los niveles de
variabilidad geneacutetica de aislamientos Sss y PMTV obtenidos en cultivos de papa de los
departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo En el caso de Sss se
estudiaron los niveles de variacioacuten de 127 aislamientos a partir de la secuenciaciacioacuten de
las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr) encontraacutendose la presencia de tres variantes
principales dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada Para PMTV se
evaluaron los niveles de identidad de 38 aislamientos de los cuatro departamentos bajo
estudio a partir de la secuenciacioacuten de los genes de la caacutepside viral (CP) y del segundo gen
del triple bloque de genes (TGB2) encontraacutendose la presencia de dos variantes del virus
una que representa el genotipo mundialmente reportado para este virus y la otra que hasta
ahora soacutelo se ha encontrado en Colombia y que dado el bajo nivel de identidad (76) con
respecto al primer grupo posiblemente representa una nueva especie de pomovirus
Finalmente dos de las cepas de PMTV de Antioquia y Boyacaacute fueron secuenciadas para
sus ARN 2 y 3 lograacutendose un 83 del segmento genoacutemico de ARN 2 y 87 para el ARN
3 y encontraacutendose que comparten niveles de identidad superiores al 97 con respecto a
otros aislamientos previamente caracterizados en el Norte de Europa Se espera que los
resultados de esta investigacioacuten sean utilizados para el disentildeo de herramientas de
xii
diagnoacutestico que apoyen los esquemas de certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas
de mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en Colombia
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum Potato mop-top
virus secuenciacioacuten
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea AND ITS
ASSOCIATED PMTV VIRUS IN COLOMBIA
ABSTRACT
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
The other hand Sss is a vector for Potato mop-top virus (PMTV) a prevalent virus in the
Andean region and quarentenary in several countries However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
xiii
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum Potato mop-top virus
RT-PCR Sequencing
1
1 INTRODUCCIOacuteN
En Colombia el cultivo de la papa ocupa cerca de 128701 ha distribuidas en 14
departamentos de los cuales Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo son responsables
del 80 de la produccioacuten que asciende a cerca de 23 millones de ton antildeo-1
y de la cual
dependen maacutes de 69000 familias del sector rural del paiacutes La cadena de la papa en
Colombia enfrenta un gran nuacutemero de desafiacuteos endoacutegenos y exoacutegenos que disminuyen su
competitividad respecto a los demaacutes paiacuteses del mundo y en especial con relacioacuten a los otros
miembros de la Comunidad Andina de Naciones Entre otros factores los maacutes limitantes
son aquellos relacionados con la carencia de tecnologiacutea en los sistemas de produccioacuten y de
post-cosecha la alta dependencia de insumos agriacutecolas y el bajo nivel de acople entre el
sector primario y el de procesamiento industrial (MADR 2006) Desde el punto vista
fitosanitario el cultivo de la papa se ve afectado por diversos fitopatoacutegenos e insectos
plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la reemergencia de la enfermedad denominada
Sarna polvosa de la papa causada por el protozoario Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) Su efecto no solo se debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten
al deterioro en la calidad y apariencia cosmeacutetica de los tubeacuterculos que afecta draacutesticamente
su valor en el mercado Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus (PMTV)
uno de los problemas virales prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarentenario para diferentes paiacuteses del mundo (Santala et al 2010)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 de las cosechas en las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro (Solanum tuberosum) y
papa criolla (S phureja) (SINAIPA 2002) Por otra parte se estima que el PMTV puede
causar peacuterdidas hasta del 25 en este cultivo lo cual adicionado al dantildeo causado por Sss
pudiera generar disminuciones de 50-80 en la produccioacuten (Jones y Harrison 1972
Guerrero 1997 2000) Aunque se cree que este virus tiene como centro de origen los
Andes suramericanos no se ha establecido con certeza su efecto sobre el rendimiento de las
variedades alliacute cultivadas ni determinado claramente los siacutentomas que causa en sus
hospedantes (Salazar 1995) De esta forma no es frecuente encontrar la sintomatologiacutea
asociada a este virus reportada para la regioacuten templada que incluye amarillamiento foliar
2
anillos necroacuteticos y cuarteamiento o agrietamiento de tubeacuterculos y moteados foliares tipo
ldquoAucubardquo (Salazar 1995 Xu et al 2004)
Adicionalmente a esta problemaacutetica la diseminacioacuten de Sss se viene incrementando
dramaacuteticamente en el paiacutes como resultado de la deficiente calidad de la semilla utilizada
por la mayoriacutea de los agricultores la ausencia de variedades tolerantes a dicho patoacutegeno y
la carenciadeficiencia de asistencia teacutecnica estatal o gremial que no cuenta con
herramientas apropiadas para el diagnoacutestico asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla
libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011)
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la ausencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos o bioloacutegicos efectivos por lo
tanto requiere de un manejo fitosanitario especial al afectar directamente la semilla
inhabilitar los suelos dedicados al cultivo afectar la calidad cosmeacutetica del producto fresco y
ser transmisor del PMTV lo que genera una barrera cuarentenaria para la apertura de
nuevos mercados Por lo anterior el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado bajo
un esquema de manejo integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como
rotacioacuten de cultivos manejo adecuado del riego y drenaje sanidad del tubeacuterculo semilla
utilizacioacuten de organismos antagonistas (pe Trichoderma spp) utilizacioacuten de cultivos
trampa desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos estrictos de
certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas son
utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado del
manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o de
Rhizoctoniasis
El desarrollo de metodologiacuteas seroloacutegicas y moleculares pueden ser una importante
herramienta para el monitoreo y deteccioacuten de estos patoacutegenos en el paiacutes Se destacan para
Sss la teacutecnica de ELISA (Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas) con anticuerpos
policlonales y monoclonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
3
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Ward et al 2004 Qu et al
2011) Para el caso de PMTV tambieacuten se han utilizado teacutecnicas de deteccioacuten utilizando
plantas trampa ELISA RT-PCR (Retrotranscripcioacuten - Reaccioacuten en cadena de la
polimerasa) qPCR (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa en tiempo real) y microplatos de
hibridizacioacuten y microarreglos (Arif et al 1994 Nielsen y Moslashlgaard 1997 Jeffries 1998
Davey 2009 Latvala-Kilby et al 2009 Nakayama et al 2009) Sin embargo estas
teacutecnicas son de aplicacioacuten limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas o validadas con
base en los genotipos locales de ambos patoacutegenos presentes en las regiones cultivadoras de
nuestro paiacutes motivo por el cual es fundamental emprender un estudio amplio de los niveles
de variabilidad geneacutetica de Sss y PMTV en Colombia
Este trabajo responde a dicha necesidad En eacutel se realizaron colecciones de material vegetal
y suelo de cuatro zonas productoras de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo (Colombia) y se realizaron extracciones de ADN o ARN seguacuten el
caso para mediante teacutecnicas moleculares determinar las secuencias de diferentes regiones
informativas del genoma de cada patoacutegeno Una vez obtenidas y editadas las secuencias se
realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos para comparar y agrupar aislamientos colombianos con
respecto a los reportados para Sss y PMTV en el mundo y determinar sus niveles de
identidad geneacutetica
Este estudio pretende apoyar el desarrollo de programas de diagnoacutestico de Sss y PMTV
tanto en Colombia como en la regioacuten Andina La informacioacuten generada es importante para
desarrollar programas de deteccioacuten asintomaacutetica y temprana de ambos patoacutegenos como una
herramienta fundamental para implementar una base tecnoloacutegica que apoye los esquemas
cuarentenarios dirigidos a evitar la diseminacioacuten de los patoacutegenos hacia zonas libres de la
enfermedad la certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas de mejoramiento geneacutetico
que conduzcan a generar variedades resistentes a este patosistema
4
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GENERAL
Evaluar los niveles de variacioacuten geneacutetica de Spongospora subterranea y de su virus asociado
PMTV en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y
Narintildeo
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de S subterranea de cultivos de
papa de cuatro departamentos de Colombia a partir de secuenciacioacuten de las
regiones ITS del ADN ribosomal
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de PMTV de cultivos de papa de cuatro
departamentos de Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de la caacutepside y TGB2 del
genoma viral
Definir las afinidades filogeneacuteticas entre las variantes de S subterranea y PMTV
detectadas en Colombia con aislamientos de dichos patoacutegenos de diferentes paiacuteses
que presenten secuencias disponibles en las bases de datos moleculares
Ampliar el nivel de informacioacuten disponible sobre las secuencias de los segmentos
del genoma de aislamientos de PMTV en Colombia
5
3 MARCO TEOacuteRICO
31 Generalidades del cultivo de la papa
La papa es el tubeacuterculo maacutes importante que se produce en el mundo Se cultiva en maacutes de
125 paiacuteses y es consumido diariamente por maacutes de mil millones de personas En los paiacuteses
en desarrollo es un cultivo de fuerte expansioacuten con cientos de millones de personas que
dependen de eacutel para su supervivencia Los paiacuteses en desarrollo son los maacutes grandes
productores (e importadores) de papa y de sus productos derivados (FAO 2009) China se
ha convertido recientemente en el primer productor mundial de papa y junto a India
responden por la tercera parte de la produccioacuten global de este tubeacuterculo En Ameacuterica Latina
y Aacutefrica las cosechas presentaron un menor volumen pero el rendimiento se incrementoacute
significativamente Ameacuterica del Norte fue el mayor productor del continente con un
rendimiento de maacutes de 40 ton ha-1
(FAO 2008)
Ameacuterica del Sur es la cuna de la papa pero esta regioacuten presenta los niveles maacutes bajos de
produccioacuten con menos de 16 millones de toneladas para el antildeo 2007 En la regioacuten Andina
la mayoriacutea de los pequentildeos campesinos manejan el cultivo de forma tradicional y se
siembran variedades de papa que son poco comerciales y desconocidas para el resto del
mundo sin embargo en paiacuteses como Argentina Brasil Colombia y Meacutexico la produccioacuten
comercial de papa estaacute aumentando paulatinamente (FAO 2008)
En Colombia el cultivo de la papa participa con el 71 de la superficie sembrada en
cultivos transitorios y aporta cerca de 78 de la produccioacuten agriacutecola generando alrededor
de 69000 empleos directos principalmente en los departamentos de Cundinamarca
Boyacaacute Narintildeo y Antioquia (MADR 2009a) En el 2009 el aacuterea sembrada de papa fue de
128701 ha con una produccioacuten de 2272772 ton y un rendimiento de 184 ton ha-1
(MADR-ENA 2009) La participacioacuten departamental en la produccioacuten nacional se
encuentra distribuida de la siguiente manera Cundinamarca 378 Boyacaacute 263 Narintildeo
6
164 Antioquia 65 Santander 56 y otros departamentos participan con el 64
(MADR 2009b)
La papa es el producto de origen agriacutecola que tiene la mayor demanda en Colombia por
fungicidas e insecticidas y la segunda en demanda de fertilizantes despueacutes del cafeacute Es la
actividad que maacutes utiliza los servicios de transporte terrestre con maacutes de 2 millones de
toneladas al antildeo sin incluir la movilizacioacuten de los insumos requeridos para su produccioacuten
(MADR 2005)
Los cultivos de papa se encuentran distribuidos en climas friacuteos con temperaturas de 13ordmC y
alturas de 2000 msnm hasta alcanzar zonas de paacuteramo con alturas cercanas a los 3500
msnm y temperaturas de 8ordmC Geograacuteficamente las unidades de produccioacuten estaacuten
dispersas principalmente en las regiones friacuteas de la zona Andina bajo una variada gama de
condiciones biofiacutesicas econoacutemicas y sociales En teacuterminos generales alrededor del 75
del aacuterea cultivada con papa en el paiacutes se encuentra en zonas de topografiacutea quebrada y
ondulada (MADR 2005)
Seguacuten Villareal et al (2007) en el paiacutes existen alrededor de 30 variedades de papa
cultivada pero soacutelo 10 de eacutestas tienen importancia comercial La Parda pastusa es la
variedad maacutes cultivada y consumida en fresco le siguen la variedad Diacol Capiro
utilizada para consumo en fresco exportacioacuten y por la industria de alimentos como materia
prima La variedad ICA-Puraceacute es utilizada en algunas regiones de clima templado del paiacutes
para consumo en fresco la Tuquerrentildea o Sabanera que se consume principalmente en
Bogotaacute y la Criolla que se cultiva principalmente en los departamentos de Antioquia y
Cundinamarca En el paiacutes se han desarrollado nuevas variedades que han ingresado al
mercado como las variedades Esmeralda Rubi UNICA e ICA Morita que tienen altas
posibilidades comerciales en el corto plazo
Una de las principales limitantes teacutecnicas del cultivo de la papa corresponde a las plagas y
enfermedades Dentro de las enfermedades el tizoacuten tardiacuteo o gota causado por
Phytophthora infestans es la amenaza maacutes seria del cultivo Ademaacutes tambieacuten se presentan
el tizoacuten temprano (Alternaria solani) la rontildea (Rhizoctonia solani) la sarna comuacuten
7
(Streptomyces scabies) la palomilla o mortaja blanca (Rosellinia sp) las virosis (PVY
PVX PLRV PYVV PVS PMTV) y la sarna polvosa Esta uacuteltima enfermedad se ha
convertido en una de las principales problemaacuteticas de cultivo a nivel mundial (Harrison et
al 1997 Merz y Falloon 2009) Es causada por el protozoo Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) paraacutesito obligado de plantas superiores Esta enfermedad causa dantildeos
directos sobre las raiacuteces y tubeacuterculos y ademaacutes es vector del PMTV (Jones y Harrison
1969 Harrison et al 1997 Andersen et al 2002 Merz y Fallon 2009) enfermedad viral
que afecta este cultivo en varias regiones productoras de papa en el mundo
En Colombia el manejo de la enfermedad se basa en el uso de semilla certificada por el
Instituto Colombiano Agropecuario ICA la utilizacioacuten de variedades medianamente
tolerantes y la rotacioacuten entre estas variedades con cultivos no hospedantes del patoacutegeno
(Jaramillo y Botero 2007)
32 Generalidades de Spongospora subterranea fsp subterranea
321 Taxonomiacutea
Sss es el agente causal de la enfermedad denominada Sarna polvosa de la papa El primer
reporte de esta enfermedad data de 1841 en Alemania (Wallroth 1842) y a partir de esta
fecha su registro incluye todos los continentes (Harrison et al 1997 Merz 2008) Seguacuten
Lyman y Rogers (1915) el patoacutegeno es originario de los Andes Suramericanos desde donde
se dispersoacute gracias al mercado mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber
transcurrido mas de 150 antildeos desde su primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado
importancia en las uacuteltimas deacutecadas como resultado de la siembra generalizada de materiales
altamente susceptibles al patoacutegeno la utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los
cambios de eacutepocas de siembra hacia periacuteodos huacutemedos las deficiencias en los sistemas de
rotacioacuten de cultivos la falta de programas cuarentenarios y los altos estaacutendares exigidos por
el mercado en la calidad cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
8
Sss es un pseudohongo plasmodial que taxonoacutemicamente se ha ubicado en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos Spongospora subterranea f sp
subterranea y Spongospora subterranea f sp nasturtii definidos como forma especialis
son importantes patoacutegenos de vegetales (Merz y Falloon 2009) Dick (2001) propone que
dichos microorganismos corresponden a especies diferentes
322 Ciclo de vida Sss
Sss y otros plasmodiophorales se caracterizan por presentar zoosporas biflageladas (3-4 microm
diaacutemetro) de desigual tamantildeo con mastigonemes y posicioacuten opuesta que se liberan a partir
de las estructuras de resistencia (quistes) Los quistes (4 microm diaacutemetro) pueden sobrevivir en
el suelo por largos periacuteodos de tiempo y generalmente se encuentran agregados formando
estructuras denominadas quistosoros (hasta 85 microm diaacutemetro) CITA los cuales son esfeacutericos
u ovoides y presentan un centro vaciacuteo En Colombia observaciones realizadas por
Jaramillo y Peacuterez (2008) han determinado que los quistosoros de aislamientos procedentes
de suelos del municipio de La Unioacuten (Antioquia) oscilaron entre 50 y 120 microm Bajo
condiciones de humedad es frecuente la liberacioacuten de una zoospora uninucleada aunque se
cree que la germinacioacuten de los quistes responde a un patroacuten escalonado que garantiza la
generacioacuten de inoacuteculo infectivo por largos periodos de tiempo Una vez en el suelo las
zooporas se desplazan varios centiacutemetros y son atraiacutedas por los exhudados de las raiacuteces de
sus plantas hospedantes adherieacutendose enquistando y formando un tubo germinativo que
ejerce fuerza mecaacutenica para su penetracioacuten directa en la planta Posteriormente el patoacutegeno
desarrolla un plasmodio multinucleado con membrana simple y ausencia de pared celular
Eventualmente el plasmodio se cliva dando lugar a muacuteltiples zooesporangios cada uno de
los cuales puede generar hasta 8 zoosporas que son liberadas por un poro germinativo y
continuacutean con la infeccioacuten de otras ceacutelulas radiculares Estas zoosporas denominadas
secundarias son indistinguibles de las que inician la infeccioacuten (primarias) y ambas pueden
infectar lenticelas no suberizadas de tubeacuterculos comenzando a inducir el siacutentoma tiacutepico de
9
la sarna que toma apariencia corchosa a partir del desarrollo de una capa de proteccioacuten a
nivel del peridermo del tubeacuterculo Es frecuente ademaacutes que el patoacutegeno induzca hipertrofia
e hiperplasia en los tejidos afectados dando origen a las agallas y a las deformaciones
caracteriacutesticas de la enfermedad Al final del ciclo en los plasmodios se reorganiza su
contenido protoplasmaacutetico rodeaacutendo los nuacutecleos presentes de pared celular y generaacutendose
quistes que serviraacuten de inoacuteculo para sucesivas infecciones (Harrison et al 1997)
El ciclo de vida de Spongospora es diferenciado por Merz (2008) de acuerdo a la
ocurrencia de dos fases una fase esporogeacutenica y una segunda fase esporangial cada una
iniciada por la infeccioacuten de la ceacutelula hueacutesped a traveacutes de un plasmodio individual En la
fase esporangial numerosas zoosporas secundarias son formadas en el esporangio de
paredes delgadas en las ceacutelulas epidermales de la raiacutez y los pelos radicales del hueacutesped en
las cuales las zoosporas son formadas desde un plasmodio esporangiogeacutenico Las zoosporas
secundarias tambieacuten biflageladas pueden salir del hueacutesped e iniciar otro ciclo de infeccioacuten
La fase esporogeacutenica se presenta despueacutes de la divisioacuten nuclear dentro del plasmodio
esporogeacutenico El patoacutegeno produce esporas de reposo de pared gruesa las que son
altamente persistentes Cada espora de reposo libera una sola zoospora primaria
biflagelada
En Colombia Hoyos et al (2009) realizaron observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Sss encontrando plasmodios plasmodios enquistados plasmodios en
estado de divisioacuten ceacutelulas uacutenicas y quistosoros en raiacuteces de plantas de S tuberosum
asintomaacuteticas indicando que la infeccioacuten puede estar presente sin desarrollo evidente de
siacutentomas y que los quistosoros no son solamente las estructuras maacutes frecuentes en los
tejidos de los hospedantes afectados
10
323 Rango de hospedantes de Sss
Diversas investigaciones han encontrado la presencia de zoosporangios de Sss en plantas de
otras familias diferentes a la Solanaceae como Alzoaceae Apiaceae Asteraceae
Boraginaceae Brassicaceae Caryophyllaceae Chenopodiaceae Fabaceae Geraniaceae
Lamiaceae Plantaginaceae Papaveraceae Poaceae Polygonaceae Ranunculaceae
Rubiaceae Resedaceae Solanaceae y Urticaceae (Jones y Harrison 1969 Andersen et al
2002) Andersen et al (2002) encontraron diferentes tasas de infeccioacuten desarrolladas por el
patoacutegeno en especies como Artemisia vulgaris Cirsium arvense Chamomilla suaveolens
Chenopodium album Galium aparine Geranium pusillum Lapsana communis Matricaria
inodora Poa annua Polygonum avicular P convolvulus Rumex acetosa R acetosella
Solanum nigrum Sonchus arvensis Urtica urens y Viola tricolor lo que permitioacute
confirmar estas 17 especies como hospedantes de Sss
Aunque aparentemente Sss tiene un amplio rango de hospedantes el desarrollo de los
quistosoros nunca habiacutea sido observado en otros hospederos diferentes a S tubersosum Sin
embargo Qu y Christ (2006a) encontraron formacioacuten de quistosoros en seis especies de
plantas Solanum plycantum Dun Datura stramonium L Avena sativa L Dactylis
conglomerado L Solanum esculentum Mill y Brassica campestris L Esto indicoacute que el
patoacutegeno tiene la capacidad de completar su ciclo de vida en hospedantes alternos a las
plantas de papa lo que representa un aspecto epidemioloacutegico importante Asiacute mismo se
encontroacute que las siguientes especies tambieacuten son hospedantes del patoacutegeno Fagopyrum
esculentum Moench Phleum pratense L Raphanus sativus L Brassica napus L
Trifolium pratense L Secale cereale L Ambrosia artemisiifolia L Chenopodium album
L Amaranthus retroflexus L y Cyperus esculentus L Recientemente se ha encontrado
que el patoacutegeno puede producir agallas en S physalifolium y S nigrum y su patogenicidad
fue confirmada por inoculacioacuten a plantas de tomate (S esculentum) y de papa bajo
condiciones de invernadero (Shah et al 2010) Estos resultados tienen consecuencias para
el manejo de la enfermedad enfocado en cultivos de rotacioacuten porque se debe tener en
cuenta que existen especies cultivables y malezas que pueden albergar estructuras del
patoacutegeno y que el reporte de nuevas especies hospederas continua por ejemplo Sss causa
11
agallas en las raices de Solanum sarrachoide en donde puede completar su ciclo de vida y
producir nuevas generaciones de quistosoros que son infectivos a papa (Nitzan et al 2009)
324 Siacutentomas causados por Sss
Los siacutentomas de la enfermedad incluyen la induccioacuten de lesiones pustulosas corchosas con
centros polvosos formados a partir de la agregacioacuten de los quistosoros del patoacutegeno Con el
avance de estas lesiones es frecuente la ruptura del peridermo aunque el nivel de
penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente superficial Bajo condiciones oacuteptimas para el
desarrollo de la enfermedad es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten
de los tejidos y la formacioacuten de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la
enfermedad ademaacutes de causar los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular
de las plantas al inducir la formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas (Cotes et al
2006) que causan la disminucioacuten de la superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo a la
marchitez y finalmente a la muerte de las plantas Durante el almacenamiento la sarna
polvosa puede ocasionar pudriciones secas que sirven de entrada a otros patoacutegenos y
saproacutefitos que deterioran auacuten maacutes el producto (Agrios 1996) La infeccioacuten en las raiacuteces
especialmente cuando se forman agallas pueden causar una reduccioacuten en el funcionamiento
de la raiacutez por la interrupcioacuten de la toma de agua y de nutrientes (Lister et al 2004 Falloon
et al 2005)
En Colombia en los departamentos de Cundinamarca Boyacaacute Narintildeo y Antioquia Sss
afecta severamente las variedades de papa (Solanum tuberosum) Parda Pastusa y Diacol
Capiro y a la papa criolla (Solanum phureja) Los siacutentomas se observan en raiacuteces y
tubeacuterculos pero hay variacioacuten en las zonas paperas en cuanto a la distribucioacuten de los
siacutentomas entre los diferentes oacuterganos de la planta En Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de
Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre los tubeacuterculos de las variedades Parda
Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el departamento de Narintildeo y en el Oriente de
Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces Hasta ahora no se sabe si estas diferencias
se deben a variaciones en las condiciones ambientales de una regioacuten a otra o quizaacutes se
12
deban a la distribucioacuten regional de diferentes razas del patoacutegeno yo a su interaccioacuten con el
ambiente (Jaramillo y Botero 2007)
En el Oriente Antioquentildeo se determinoacute la incidencia y el grado de severidad de 23
poblaciones de Sss bajo el sistema de rotacioacuten entre ICA Puraceacute-Diacol Capiro y viceversa
en tres cosechas sucesivas en condiciones de casa de malla Se observoacute que las poblaciones
del patoacutegeno no afectaron el peso ni causaron siacutentomas de sarna polvosa en los tubeacuterculos
pero si en las raiacuteces con diferentes grados de severidad en las dos variedades siendo maacutes
susceptible la variedad Diacol Capiro que al parecer favorecioacute el incremento del inoacuteculo
mientras que la ICA Puraceacute fue levemente afectada y posiblemente presentoacute efecto
supresivo sobre los quistosoros en el suelo (Jaramillo y Botero 2007)
Estudios realizados en el departamento de Narintildeo presentaron diferencias en el grado de
desarrollo de la enfermedad en raiacuteces La variedad Parda Pastusa fue la maacutes susceptible a
Sss con desarrollo de agallas desde el momento de la emergencia de las plantas La
enfermedad alcanzoacute valores de susceptibilidad del 100 en dicha variedad mientras que en
Diacol Capiro fue de 48 En los tubeacuterculos la enfermedad se manisfestoacute por la formacioacuten
de escasas y pequentildeas puacutestulas de color castantildeo con poca presencia de masas pulverulentas
de esporas de resistencia del patoacutegeno lo que contrasta con la regioacuten Cundiboyacense en
donde estas variedades se caracterizan por presentar una alta susceptibilidad a la rontildea en
tubeacuterculos ocasionando lesiones severas en las que resulta faacutecil encontrar esporas de
resistencia (Benavides 2006)
325 Control de Sss
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la carencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos efectivos (Qu y Christ
2006a) Seguacuten Harrison et al (1997) el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado
bajo un esquema integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como la
rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del tubeacuterculo semilla la
utilizacioacuten de organismos antagonistas (ie Trichoderma spp) la utilizacioacuten de cultivos
trampa la desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
13
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos de certificacioacuten de
semilla Dos estrategias que en la actualidad se consideran fundamentales para apoyar los
programas MIC en papa incluyen el mejoramiento geneacutetico por resistencia al pseudohongo
y la utilizacioacuten de cultivos trampa (Merz et al 2004)
Para el caso del mejoramiento los primeros reportes en la regioacuten Andina fueron
presentados por Torres et al (1995) quienes evaluaron 467 accesiones encontrando la
existencia de 17 genotipos resistentes y 33 moderadamente resistentes Por otra parte Lees
(2000) en Escocia evaluoacute los niveles de resistencia a Sss de una serie de clones de S
phureja encontrando que algunos de eacutestos presentaron un adecuado nivel de resistencia
por lo que esta especie fue propuesta como fuente de genes de resistencia Merz (2000) al
evaluar la reaccioacuten de 11 cultivares determinoacute que existe correlacioacuten entre las pruebas de
invernadero utilizando plaacutentulas provenientes de cultivo de tejidos y la resistencia
presentada en campo
Fallon et al (2003) realizaron un estudio en Australia con 99 cultivares de papa y 13
liacuteneas de mejoramiento durante 11 antildeos Sus resultados indicaron que el 21 de los
materiales evaluados eran resistentes mientras que el 28 presentoacute una resistencia
moderada Estos autores tambieacuten reportaron que la expresioacuten de la resistencia variacutea entre
antildeos y que los bioensayos realizados en invernadero no siempre se correlacionan con la
respuesta presentada en campo sugiriendo una fuerte interaccioacuten genotipo-ambiente para
esta caracteriacutestica
Nitzan et al (2010) evaluaron la estabilidad de la resistencia geneacutetica de 24 genotipos de
papa a Sss en los estados de Washington e Idaho en Estados Unidos Se identificoacute que la
resistencia era estable a la formacioacuten de agallas en las raiacuteces causada por Sss y se determinoacute
que una gran proporcioacuten de la variacioacuten fue geneacutetica lo que permite a los mejoradores usar
genotipos resistentes y estables de papa como progenitores en el desarrollo de cultivares
comerciales con resistencia a este patoacutegeno debido a que contar con materiales geneacuteticos
resistentes es una de las principales estrategias de manejo de la enfermedad (Rodriacuteguez et
al 2009 Houser y Davidson 2010)
14
Seguacuten Merz et al (2012) no existen meacutetodos de control eficientes y econoacutemicos que se
encuentren disponibles actualmente y la resistencia del hospedero es clave para el manejo
integrado de la enfermedad debido a esto se evaluaron 10 cultivares con diferentes rangos
de susceptibilidad a Sss y a PMTV en diferentes paiacuteses de Europa Para evitar discrepancias
en los criterios de evaluacioacuten se utilizoacute una escala estaacutendar para los niveles de la sarna
polvosa determinaacutendose que los cultivares se comportaron como estaba establecido en su
caracterizacioacuten inicial (a excepcioacuten de uno de ellos) Los resultados del ensayo de campo
indicaron que los diferentes meacutetodos de valoracioacuten son el principal factor de discrepancia
en las calificaciones de la resistencia y que las condiciones ambientales yo el nivel de
inoacuteculo del suelo juegan un papel menor
Otra estrategia con alto potencial para el manejo de la enfermedad es la rotacioacuten del cultivo
con plantas trampa que reducen el nivel de estructuras de resistencia de
plasmodiophoromycetes Por ejemplo es ampliamente conocido que la siembra de
Raphanus sativus reduce la cantidad de quistes de Plasmodiophora brassicae en el suelo
(Murakami et al 2000) mientras que la planta Datura stramonium redujo el nivel de Sss en
un 79 en cultivos de papa de Australia
En Colombia la buacutesqueda de herramientas para el manejo de la enfermedad bajo las
condiciones regionales de las zonas productoras de papa se enfoca en la evaluacioacuten de
sistemas de rotacioacuten de variedades comerciales que tradicionalmente se han considerado
altamente susceptibles a la enfermedad (ie Diacol Capiro) con variedades maacutes tolerantes al
ataque del patoacutegeno (ie ICA Puraceacute) encontraacutendose que efectivamente esta uacuteltima
variedad presenta un menor nivel de susceptibilidad a la sarna polvosa (Jaramillo et al
2003 Jaramillo y Botero 2007)
En cuanto al control bioloacutegico de Sss Gilchrist (2009) evaluoacute una cepa de Trichoderma
previamente considerada por Hoyos et al (2002) como potencialmente uacutetil para el control
bioloacutegico de Sss en la variedad Diacol Capiro Las pruebas fueron realizadas en campo
utilizando tres dosis de aplicacioacuten del biocontrolador Se encontroacute que la aplicacioacuten de T
asperellum T109 redujo un 64 y 54 los efectos de la sarna polvosa en el crecimiento y
15
en la produccioacuten de las variedades respectivamente De esta forma se resalta el potencial
de la cepa como biocontroladora contra Sss teniendo en cuenta que se debe ampliar el
conocimiento acerca de los factores que limitan la accioacuten de T asperellum T109 en el
campo y coacutemo compensarlo aumentando la frecuencia de aplicacioacuten En un trabajo similar
se investigoacute la influencia de cuatro aislamientos de T asperellum sobre la sarna polvosa en
tres tipos de suelo Andisol Entisol e Inceptisol No se encontraron diferencias
significativas entre las plantas de papa tratadas y no tratadas con T asperellum pero siacute se
encontroacute que la reduccioacuten del crecimiento y la produccioacuten estuvieron inversamente
asociadas con el contenido de Al2+
en los suelos sugiriendo que los efectos de la sarna
polvosa estaacuten fuertemente relacionados con las condiciones del suelo (Gilchrist et al 2009)
Estudios sobre la evaluacioacuten de estrategias de manejo de la rontildea polvosa en tres regiones
productoras de papa en Colombia han incluido resultados sobre la biologiacutea y patologiacutea de
Sss en la Sabana de Bogotaacute y sus hallazgos maacutes importantes consisten en la puesta en
marcha de un sistema de bioensayos en los cuales ha sido posible inducir la liberacioacuten de
zoosporas bajo condiciones de laboratorio Otros estudios incluyen la evaluacioacuten del efecto
de fungicidas aplicados al suelo para el manejo de Sss Sin embargo se determinoacute que
ninguno de los fungicidas evaluados (Tiabendazol Tolclofos metil Benomyl Carbendazin
Clorotalonil y Mancozeb) contribuyeron con el control del patoacutegeno en raiacuteces y tubeacuterculos
bajo las dosis y condiciones de tres localidades productoras de papa (Subachoque Medelliacuten
(Corregimiento Santa Elena) y Pasto) (Garciacutea y Navia 2002) En contraste Falloon et al
(2010) realizaron aplicaciones en campo del fungicida Mancozeb el cual contiene Zn y
Mn Las dosis estuvieron determinadas como baja similar y alta con respecto al contenido
de estos elementos en el suelo cultivado con papa cv Iwa (considerado muy susceptible a
Sss) Se encontroacute que niveles elevados de Zn y Mn generan infecciones moderadas de Sss
en las raiacuteces del cultivar evaluado de S tuberosum
Otras investigaciones para el manejo de Sss han incluiacutedo la evaluacioacuten de potenciales
biocontroladores (Trichoderma harzianum y Pseudomonas fluorescens) un consorcio de
micorrizas y viruta de pino como tratamientos Se encontraron diferencias estadiacutesticamente
significativas entre el testigo y P fluorescens y los tratamientos con T harzianum
16
micorrizas y viruta presentando una incidencia en raiacuteces de 32 21 y 5 3 y 1
respectivamente Los tratamientos con T harzianum micorriza y viruta tuvieron los
porcentajes de incidencia maacutes altos pero contrastaron con niveles muy bajos de severidad
de la enfermendad (022 0088 y 0019 respectivamente) Sin embargo no se
obtuvieron incrementos en peso seco de raiacuteces peso de tubeacuterculos y peso seco de la parte
aeacuterea cuando se realizaron las inoculaciones de los diferentes agentes de control y las
aplicaciones de la viruta de pino (Restrepo et al 2009)
Arias (2011) realizoacute un anaacutelisis y comparacioacuten de glucosinolatos presentes en diferentes
accesiones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control de
Sss Se estandarizaron los procedimientos de extraccioacuten del compuesto y las diferentes
formulaciones fueron probadas como biofumigante en el suelo donde posteriormente se
sembraron tubeacuterculos de papa criolla Sin embargo los resultados obtenidos no permitieron
establecer un posible potencial biofumigante de las accesiones evaluadas y es necesario
profundizar en los estudios que permitan determinar el efecto de los glucosinolatos y de
otros compuestos sobre el patoacutegeno
33 Deteccioacuten de Sss
La deteccioacuten del inoacuteculo a nivel del suelo es compleja y es evaluada precariamente a partir
de sistemas de trampeo que utilizan plaacutentulas de tomate (Merz 1989) o de papa (Wale et al
1993) Estas evaluaciones son criacuteticas para definir relaciones entre el grado de infestacioacuten
de los suelos y los niveles de enfermedad observados en el campo requisito fundamental
para la implementacioacuten de cualquier medida de control (Merz et al 2005)
Con el objetivo de buscar alternativas para alcanzar mayores rangos de sensibilidad en la
deteccioacuten de Sss se han explorado diversas metodologiacuteas basadas en teacutecnicas seroloacutegicas y
moleculares Entre las primeras se destacan la generacioacuten de anticuerpos policlonales que
detectan quistosoros del protozoo bajo un sistema ELISA (Harrison et al 1993 Walsh et
al 1996) Sin embargo la utilidad de estos anticuerpos es reducida debido a que no detecta
el estado plasmodial (Ward et al 2004) Maacutes recientemente Merz et al (2005)
desarrollaron una prueba para la evaluacioacuten rutinaria de la presencia del patoacutegeno basada
17
en anticuerpos monoclonales derivados de quistosoros como antiacutegenos alcanzando niveles
de sensibilidad de menos de un quistosoro por tubeacuterculo A partir de esto se generoacute la
herramienta ldquoSss AgriStriprdquo una prueba basada en un inmunoensayo de flujo lateral cuya
precisioacuten y sensibilidad fue evaluada por Bouchek-Mechiche et al (2011) para la
deteccioacuten de Sss Se comparoacute con teacutecnicas de microscopiacutea ELISA PCR y qPCR que
detectaron Sss en lesiones tiacutepicas de sarna polvosa Asiacute mismo se realizaron pruebas en los
lotes que presentaban lesiones tiacutepicas y atiacutepicas causadas por el patoacutegeno y se confirmoacute la
presencia de Sss en todas las lesiones con todos los meacutetodos probados Se concluyoacute que el
Sss AgriStrip es una prueba tan sensible como DAS- ELISA con un liacutemite de deteccioacuten de 1
a 10 quistosoros por mL de buffer
Con respecto a las metodologiacuteas moleculares se ha utilizado PCR convencional a partir de
los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 (Bulman y Marshall 1998) Sps1Sps2 (Bell et al
1999) y SsFSsR (Qu et al 2006) que amplifican las regiones ITS del ADNr
Los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 disentildeados por Bulman y Marshall (1998) detectaron
Sss en las muestras evaluadas y no presentaron reaccioacuten cruzada con otros
plasmodiophoridos como Spongospora subterranea f sp nasturtii Plasmodiophora
brassicae Sorosphaera veronicae y Polymyxa graminis asiacute como con el causante de la
sarna comuacuten Streptomyces scabies demostrando la utilidad de estos cebadores en la
deteccioacuten de Sss realizada por estos investigadores
Bell et al (1999) obtuvieron secuencias parciales del ITS de 391pb con los cebadores Sps
1 y Sps 2 para la deteccioacuten y cuantificacioacuten de Sss en la corteza tubeacuterculos lavados y
suelos cultivados con papa Las pruebas desarrolladas mostraron ser maacutes sensibles que los
inmunoensayos previamente reportados y fueron maacutes raacutepidas y sencillas que los ensayos
convencionales con plantas trampa
Qu et al (2006) utilizaron la teacutecnica de PCR para la identificacioacuten especiacutefica y
cuantificacioacuten de Sss Los cebadores SsF y SsR amplificaron un producto de 434 pb
proveniente de masas de esporas de Sss pero no se obtuvo el amplicoacuten cuando el ADN era
de papa sana de tubeacuterculos con sarna comuacuten o de otros plasmodiophoridos relacionados
18
Asiacute mismo se detectoacute Sss en otros hospederos infectados que no presentaban siacutentomas y se
concluyoacute que la prueba es tan sensible que puede detectar 1 quiste g-1
Adicionalmente con
esta teacutecnica se logroacute la cuantificacioacuten de Sss en el suelo logrando identificar valores de 1 a
104 quistosoros por 025 g de suelo
La implementacioacuten de meacutetodos para la deteccioacuten de Sss ha permitido el desarrollo de
procedimientos que permiten una raacutepida y automatizada extraccioacuten de ADN combinada
con PCR en tiempo real utilizando sondas Taqmanreg para avanzar en el diagnoacutestico
rutinario de la sarna polvosa (Lees et al 2002 van de Graff et al 2003 Ward et al 2004
Qu et al 2011) o PCR competitivo o cuantitativo (Qu et al 2006 Shah et al 2009) En esta
prueba se utiliza un control interno de ADN de papa (citocromo oxidasa) para hacerla maacutes
confiable y evitar falsos negativos La validacioacuten de dicha metodologiacutea se realizoacute a partir
de la evaluacioacuten de 37 muestras de tubeacuterculos de varios cultivares procedentes de diversas
localidades del Reino Unido La prueba detectoacute el patoacutegeno en todas las muestras que eran
sospechosas de tenerlo asiacute como en tubeacuterculos que no presentaban quistosoros observables
La prueba con la sonda Taqman demostroacute ser 100 veces maacutes sensible que la PCR
convencional (Ward et al 2005) y la ELISA (Ward et al 2004) Estas pruebas han
permitido determinar el efecto del nivel de inoacuteculo en el suelo y de algunos factores
ambientales en la infeccioacuten y desarrollo de agallas en raiacuteces de papa causadas por Sss (van
de Graaf et al 2007) En Gran Bretantildea la teacutecnica de PCR en tiempo real permitioacute detectar
confiablemente y establecer la cantidad de ADN de los quistorosos zoosporas y
plasmodiozoosporangios del patoacutegeno asiacute mismo se determinoacute la viabilidad de los quistes
en el suelo y en combinacioacuten con el uso de plantas trampa se estudioacute la liberacioacuten de
zoosporas y los niveles de infeccioacuten en papa bajo diferentes condiciones ambientales
permitiendo conocer con maacutes detalle varios aspectos de la epidemiologiacutea de la enfermedad
(Lees et al 2008)
Otras variaciones de estas teacutecnicas como la muacuteltiple qPCR utilizando sondas TaqManreg ha
permitido la deteccioacuten y diferenciacioacuten simultaacutenea de la sarna polvosa y la sarna comuacuten
dos enfermedades del tubeacuterculo que causan siacutentomas similares pero que son ocasionadas
por patoacutegenos diferentes (Sss vs Streptomyces spp) (Qu et al 2011) Finalmente como una
19
teacutecnica de diagnoacutestico simultaacuteneo de diferentes patoacutegenos de papa se ha desarrollado un
chip para su anaacutelisis en microarreglos siendo incorporada la deteccioacuten de Sss (Zhang et al
2008)
En Colombia la utilizacioacuten de meacutetodos de deteccioacuten de Sss en tubeacuterculos y suelos ha
estado dada por la evaluacioacuten visual de sintomatologiacuteas en raiacuteces y tubeacuterculos la
evaluacioacuten de bioensayos (Rodriacuteguez et al 2002) y la utilizacioacuten de PCR convencional
utilizando cebadores especiacuteficos (Jaramillo et al 2003 Carrentildeo 2009) Se han utilizado
combinaciones de diversos cebadores que permiten la amplificacioacuten de la regioacuten ITS del
ADNr del patoacutegeno (Spo1-Spo2 Spo8-Spo9 y Sps1- Sps2) los cuales permiten obtener
productos de 372 390 y 391 pb respectivamente (Saavedra et al 2004) Ramiacuterez (2010)
obtuvo amplificacioacuten de los fragmentos del tamantildeo esperado utilizando los cebadores
Spo8Spo9 y SsFSsR para analizar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de Sss
provenientes de La Unioacuten (Antioquia) encontrando una estructura clonal de los
aislamientos evaluados mientras que Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS
y SSCP (Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) con un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones del paiacutes establecioacute la presencia de subpoblaciones del
patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado
34 Variabilidad geneacutetica de Sss
La disponibilidad de cultivares resistentes a Sss debe ser una prioridad en el disentildeo de
futuras estrategias de manejo de la enfermedad Los mejoradores tratan de incluir
resistencia en los nuevos cultivares seleccionando liacuteneas contra un rango de patoacutegenos que
representan la diversidad geneacutetica conocida con el fin de seleccionar la resistencia maacutes
durable Sin embargo poco es conocido acerca de la variacioacuten geneacutetica de Sss o del papel
de la recombinacioacuten sexual en su ciclo de vida (Merz y Falloon 2009)
Los estudios geneacuteticos de Sss han sido difiacuteciles de aplicar debido a razones como las
siguientes obtener y mantener el patoacutegeno es complicado por su naturaleza de paraacutesito
obligado no han existido meacutetodos disponibles para el aislamiento de quistosoros
individuales el desarrollo de la sarna polvosa estaacute influenciado por condiciones
20
ambientales y los estaacutendares de inoculacioacuten y los cultivares de referencia no han sido bien
establecidos (Qu y Christ 2006b)
Los sistemas de deteccioacuten basados en aacutecidos nucleicos ofrecen sensibilidad y especificidad
para la cuantificacioacuten de inoacuteculo (Mutasa et al 1993) En estudios previos amplificando
regiones del ITS del ADNr fueron identificados dos agrupaciones de Sss en Australia y
Europa (tipo I y II) (Bulman y Marshall 1998) Posteriormente se realizoacute una
investigacioacuten sobre la variabilidad geneacutetica de 52 aislamientos de Islas Britaacutenicas y
Norteameacuterica que fueron amplificados por PCR Se identificaron dos grupos geneacuteticamente
diferentes (I y II) que representaron el 346 y el 654 de los aislamientos
respectivamente Sin embargo en Norteameacuterica los aislamientos soacutelo perteneciacutean al grupo
II (Qu y Christ 2004) Debido a que el anaacutelisis de secuencia de ITS se basa en un solo
locus para la deteccioacuten de la variacioacuten geneacutetica los anaacutelisis con marcadores moleculares
que comprendan diferentes partes del genoma del patoacutegeno son necesarios para obtener una
imagen amplia de la variacioacuten geneacutetica y estructura poblacional de Sss
El uso de marcadores moleculares tales como RAPDs (ADN polimoacuterfico amplificado al
azar) y AFLPs (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados) han sido
usados para estudiar la diversidad geneacutetica en muchos patoacutegenos de plantas sin embargo
tales marcadores no estaacuten disponibles para Sss Es complejo obtener estructuras
individuales del patoacutegeno y la uacutenica forma es la obtencioacuten de quistosoros que pueden traer
contaminantes secundarios o contener tejido de la planta Por lo tanto es difiacutecil obtener
ADN puro del patoacutegeno un paso indispensable para llevar a cabo la PCR basada en
marcadores moleculares (Qu y Christ 2006b)
Wuumlerzer (1964) caracterizoacute 17 colecciones de Sss de Europa y Ameacuterica seguacuten el tamantildeo
del quistosoro pero no encontroacute evidencia bioloacutegica significativa de este agrupamiento
Posteriormente se detectoacute variacioacuten geneacutetica (divergencia 51) en secuencias de ADN de
los ITS1 e ITS2 de colecciones de Sss originarias de diferentes continentes (Bulman y
Marshall 1998) Las colecciones de Australasia y Europa incluidas en el grupo II diferiacutean
de otra coleccioacuten de Escocia que fueacute ideacutentica a dos colecciones de Sur Ameacuterica agrupadas
21
en el tipo I La existencia de estos grupos fue confirmada por Qu y Christ (2004) quienes
tambieacuten identificaron ambos grupos en colecciones de Escocia pero demostraron que soacutelo
la secuencia de tipo II es de ocurrencia en colecciones de Canadaacute y Estados Unidos
Los marcadores RFLPs (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccioacuten) son
codominantes y locus especiacutefico (McDonald y Martiacutenez 1990) Han sido utilizados
ampliamente para evaluar diversos genomas de patoacutegenos de plantas A pesar de que
consumen maacutes tiempo que los meacutetodos basados en PCR los RFLPs son maacutes reproducibles
y menos sensibles a contaminacioacuten de ADN que las pruebas basadas en PCR Qu y Christ
(2006b) realizaron un estudio maacutes detallado de colecciones de quistosoros obtenidas de
Estados Unidos y Canadaacute empleando marcadores RFLPs Encontraron variacioacuten geneacutetica
entre las localidades geograacuteficas pero no entre los individuos de una misma localidad lo
que sugirioacute que las poblaciones del campo son clones y no estaban sometidas a
recombinacioacuten sexual El anaacutelisis de agrupamiento permitioacute separar los aislamientos en
dos grupos el grupo I que incluyoacute aislmientos del oeste de Norte Ameacuterica (exceptuando
aislamientos de Colorado) y el grupo II incluyoacute aislamientos originarios del este de Norte
Ameacuterica y de Colorado Este estudio muestra que el uso de marcadores moleculares para
diferenciar aislamientos de quistosoros individuales facilitaraacute investigaciones adicionales
para determinar la estructura geneacutetica de poblaciones de Sss
En Colombia Ramiacuterez (2010) realizoacute un estudio sobre la variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss de La Unioacuten Antioquia Encontroacute que los anaacutelisis de secuencias de la
regioacuten ITS del ADNr presentaron altos niveles de similitud con cepas obtenidas del
Departamento de Narintildeo asiacute como con secuencias de referencia de cepas del tipo II de Sss
Este resultado permitioacute plantear que el patoacutegeno presenta un comportamiento clonal
aunque es necesario obtener informacioacuten de otras regiones del genoma que permitan
realizar anaacutelisis de muacuteltiples loci que conduzcan a una mayor aproximacioacuten sobre las
condiciones de variacioacuten de este patoacutegeno en el paiacutes
Otro estudio realizado por Carrentildeo (2009) sobre la variabilidad geneacutetica de Sss en
Colombia mediante el anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr permitioacute establecer la
22
presencia de subpoblaciones del patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Se
encontroacute una asociacioacuten directa entre las secuencias ITS del patoacutegeno y el oacutergano de la
planta infectado El tipo de ITS I se asocia aparentemente con infecciones de tubeacuterculo y el
tipo de ITS II lo hace con infecciones de raiacutez Esta investigacioacuten permitioacute descartar la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar hospedero o zona
geograacutefica Sin embargo de acuerdo con esta investigacioacuten es necesario realizar pruebas
que aborden otras aacutereas del genoma para corroborar los resultados encontrados Asiacute mismo
se comproboacute que en el paiacutes existen variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las
reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno Tres
variantes geneacuteticas de las cinco encontradas en este estudio difieren de las reportadas en la
literatura mundial
35 Generalidades del Potato mop-top virus (PMTV)
El PMTV es el agente causal de una importante enfermedad viral del cultivo de la papa
cuya distribucioacuten se encuentra registrada en diferentes lugares productores de este
tubeacuterculo como Irlanda Inglaterra Escocia Republica Checa Suiza Noruega Suecia
Dinamarca y Finlandia (Santala et al 2010) asiacute como en Japoacuten (Nakayama et al 2010) En
Ameacuterica ha sido registrado en Canadaacute y Estados Unidos (Xu et al 2004) En eacuteste uacuteltimo
paiacutes se reportoacute recientemente en los estados de North Dakota (David et al 2010) y en
Washington (Crosslin 2011) Nuevos reportes de este virus se continuan presentado en
otros paiacuteses del mundo como Polonia (Budziszewska et al 2010)
En Ameacuterica Central se ha encontrado en Costa Rica (Montero-Astua 2008) y aunque se
considera que es originario de la regioacuten de los Andes (Surameacuterica) soacutelo fue detectado en
Colombia en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) con la reconfirmacioacuten de su presencia en el antildeo
2010 (Gil et al 2011) El PMTV puede causar peacuterdidas de hasta 26 en rendimiento lo
que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera ascender a valores de
50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 Guerrero 2000) Seguacuten Salazar (2006)
el PMTV es uno de los virus que ha sido prevalente en el cultivo de la papa en los Andes
23
suramericanos pero su efecto sobre las variedades cultivadas en esta regioacuten no se ha
cuantificado claramente
351 Taxonomiacutea de PMTV
El PMTV pertenece al geacutenero Pomovirus virus con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20
nm en diaacutemetro y tres partiacuteculas con longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm
El geacutenero Pomovirus deriva su nombre de la especie tipo Potato mop-top virus y
actualmente se ubica en el la familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Los anaacutelisis
filogeneacuteticos de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRps) indican que el PMTV
estaacute relacionado maacutes estrechamente con el Beet soil-borne virus (Pomovirus) Broad bean
necrosis virus (Pomovirus) y Soil-borne Wheat mosaic virus (Furovirus) (Savenkov et al
1999)
Contiene tres moleacuteculas de ARNss con tamantildeos de 64 kb 3 kb y 25 kb con caperuzas
hacia el extremo 5rsquo y una estructura tipo ARNt hacia el extremo 3rsquo (Savenkov et al 1999
2003) El coeficiente de sedimentacioacuten de las partiacuteculas es de 230 170 y 125S
respectivamente El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene motivos de
metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del codoacuten de
finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999) Cerca del extremo
3acutedel ARN 2 se presenta una proteiacutena asociada a la transmisioacuten por el vector y generada a
partir de la supresioacuten del codoacuten de terminacioacuten del ORF que codifica para la caacutepside (CP)
Esta proteiacutena parece ser la responsable de la peacuterdida de la estructura helicoidal en los
extremos del ARN durante el proceso de desensamblaje (Sandgren et al 2001) El ARN 3
codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Tres de las
proteiacutenas producidas (TGB1 TGB2 y TGB3) estaacuten involucradas en el movimiento ceacutelula a
ceacutelula (Zamyatnin et al 2004) La funcioacuten de la cuarta proteiacutena una proteiacutena rica en
cisteiacutena parece ser la de actuar en el incremento de la virulencia sin embargo no es
indispensable para el proceso infectivo (Lukhovitskaya et al 2005) (Figura 1)
24
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV En las cajas se observan las proteiacutenas
para las que codifica el genoma Las flechas indican las proteiacutenas originadas y los ARN
subgenoacutemicos (ARNsg) Fuente httpwwwexpasychviralzoneall_by_species643html
Modificado por Gallo (2012)
352 Ciclo de la infeccioacuten de PMTV
La especie PMTV es transmitida por zoosporas de Sss que afecta los sistemas radiculares
de sus hospedantes Este virus tambieacuten puede ser transmitido por semilla asexual El virus
puede permanecer en las estructuras de resistencia de sus vectores por varios antildeos en el
suelo (Astier et al 2007 Dijkstra y Khan 2006) En los ensayos de transmisioacuten del virus se
ha observado que eacuteste es transmitido eficientemente a plantas indicadoras (ej N tabacum y
N benthamiana) a partir de muestras de suelo infestadas con quistes del patoacutegeno
(Campbell 1996 Veacutelez 2007)
25
El PMTV constituye un pequentildeo grupo de virus que para su movimiento sisteacutemico en la
planta hospedante no requiere de la expresioacuten de CP ni de la formacioacuten del virioacuten
(McGeachy y Barker 2000) debido a que el TGB le ofrece la posibilidad de mover el ARN
infeccioso a traveacutes de largas distancias en la planta (Melander et al 2001) Actualmente se
generan nuevas teoriacuteas acerca del movimiento de TGB en la planta y de la funcioacuten de cada
una de las proteiacutenas TGBp1 TGBp2 y TGBp3 en el movimiento ceacutelula a ceacutelula de PMTV
Shemyakina et al (2011) analizaron la localizacioacuten subcelular y el transporte de TGBp1
de acuerdo con los resultados obtenidos propusieron que la asociacioacuten de TGBp1 con los
microtuacutebulos puede ser importante para la formacioacuten de cuerpos de complejos de ribo-
nuacutecleo-proteiacutena viral destinada para el transporte a traveacutes de los plasmodesmos Estudios
similares han sido realizados por Wright et al (2010) cuyos resultados sugieren que TGB1
en PMTV requiere interaccioacuten con componentes nucleolares y posiblemente con
microtuacutebulos para el movimiento viral de ARN de larga distancia
El ARN desnudo se puede encontrar en tubeacuterculos asintomaacuteticos y causar una infeccioacuten
secundaria para la siguiente temporada de siembra (McGeachy y Barker 2000) La
manifestacioacuten de los siacutentomas caracteriacutesticos de la enfermedad depende de la presencia de
los tres ARN en el tejido (Savenkov et al 2003)
353 Rango de hospederos de PMTV
En condiciones experimentales el virus puede infectar plantas de las familias
Chenopodiaceae Solanaceae y Tetragoniaceae Dentro de estas se encuentran las plantas
que se usan para su diagnoacutestico las cuales corresponden a Nicotiana debneyi y
Chenopodium amaranticolor en las que se produce necrosis sisteacutemica y lesiones locales
conceacutentricas cafeacutes respectivamente Nicotiana benthamiana N debneyi N clevelandii y
N tabacum son las especies maacutes apropiadas para el mantenimiento y propagacioacuten del virus
bajo condiciones experimentales (ICTVdB 2006 Veacutelez 2007)
26
354 Siacutentomas causados por PMTV
La enfermedad inducida por PMTV presenta una amplia gama de siacutentomas dependiendo de
la variedad y de las condiciones ambientales siendo frecuente la presencia de anillos y
arcos de colores oscuros sobre la superficie de los tubeacuterculos mientras que internamente se
presentan arcos necrosados En infecciones secundarias los tubeacuterculos pueden mostrar
agrietamientos reticulados y profundos Adicionalmente los foliacuteolos de las plantas
afectadas pueden presentar moteados cloroacuteticos y liacuteneas con formas de V En la regioacuten
Andina la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos no es frecuente de observar pudiendo ser
igualmente inducidas por cepas necroacuteticas de PVY oacute por Streptomyces spp y Rhizoctonia
solani (Tenorio et al 2006) A nivel aeacutereo el virus tambieacuten puede inducir amarillamientos
enanismos y acortamiento de entrenudos (Salazar 1995)
En Escocia se estudioacute el efecto de los siacutentomas foliares causados por PMTV sobre el
rendimiento del cultivo los siacutentomas foliares y en el tubeacuterculo de varias generaciones de
siembra para la propagacioacuten de semilla de papa Se encontroacute que en los tubeacuterculos de
plantas sin siacutentomas rara vez se observan los siacutentomas foliares en la siguiente generacioacuten
Las plantas asintomaacuteticas produjeron maacutes tubeacuterculos infectados cuando eran derivadas de
plantas que presentaron siacutentomas foliares el antildeo anterior Adicionalmente la proporcioacuten de
plantas hijas con siacutentomas foliares provenientes de tubeacuterculos con siacutentomas foliares
tuvieron un rango de 19-41 en el antildeo y parecioacute estar asociado con la severidad de dichos
siacutentomas Asiacute mismo el siacutentoma de ldquospraingrdquo en los tubeacuterculos tendioacute a ser mayor en
plantas que presentaban siacutentomas foliares comparados con aquellas asintomaacuteticas Estos
resultados mostraron que la erradicacioacuten de plantas con siacutentomas foliares podriacutea mejorar la
fitosanidad del cultivo pero resulta impraacutectico cuando las plantas enfermas son muy
frecuentes (Carnegie et al 2010) Sin embargo los siacutentomas foliares son raramente
observados en variedades cultivadas actualmente en los paiacuteses noacuterdicos con excepcioacuten de
Noruega La razoacuten para estas diferencias de la etiologiacutea de la enfermedad no son
comprendidas pero puede ser que el clima marino maacutes huacutemedo en Noruega y Escocia
afecta la fisiologiacutea de la planta de papa e incrementa la infeccioacuten sisteacutemica por PMTV
(Santala et al 2010)
27
36 Deteccioacuten de PMTV
Para la deteccioacuten de PMTV se han utilizado diversas teacutecnicas de laboratorio Las primeras
pruebas incluyeron bioensayos con plantas indicadoras como Chenopodium amaranticolor
las cuales desarrollan los siacutentomas cuando son infectadas por PMTV Esta teacutecnica resulta
informativa pero tarda alrededor de 14 diacuteas para la expresioacuten de siacutentomas que en
ocasiones no son completamente confiables (Jeffries 1998)
Con el desarrollo de las pruebas ELISA se hizo posible la deteccioacuten de PMTV en dos diacuteas
sin embargo la generacioacuten de falsos negativos debido a la distribucioacuten erraacutetica del virus en
la planta ha hecho que se cuestione dicha teacutecnica Arif y Torrance (1996) realizaron
estudios de deteccioacuten de PMTV en muestras de tubeacuterculos de tres cultivares de papa
concluyendo que la combinacioacuten de tejidos de tubeacuterculos en la muestra incrementa la
probabilidad de deteccioacuten del virus En Dinamarca la utilizacioacuten de la teacutecnica DAS -
ELISA (Sandwich de anticuerpos doble - Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas)
tuvo alta confiabilidad para el seguimiento de la presencia de PMTV en 23 cultivares de
papa sembrados en campo (Nielsen y Moslashlgaard 1997)
La utilizacioacuten de teacutecnicas basadas en aacutecidos nucleicos ha llevado al desarrollo de meacutetodos
de deteccioacuten de alta sensibilidad La RT-PCR es uno de estos meacutetodos de deteccioacuten maacutes
sensible Arif et al (1994) compararon la confiabilidad de ELISA y RT-PCR en la
deteccioacuten de PMTV de raiacuteces y hojas de plantas trampa de Nicotiana debneyi Luego de
tres semanas de siembra la RT-PCR detectoacute el virus en ambos tejidos mientras que con
ELISA se obtuvo la deteccioacuten del virus soacutelo despueacutes de cinco semanas de la siembra A
pesar de que la teacutecnica RT-PCR es maacutes sensible la preparacioacuten de las muestras para este
meacutetodo lleva maacutes tiempo por lo tanto ELISA es considerada por algunos investigadores
como la teacutecnica maacutes econoacutemica y conveniente para el anaacutelisis rutinario de grandes
cantidades de muestras (Davey 2009)
Davey (2009) realizoacute estudios de deteccioacuten y cuantificacioacuten de PMTV utilizando qRT-
PCR y disentildeando un par de cebadores y una sonda para cada ARN del genoma del virus El
bioensayo desarrollado para las muestras de suelo fue muy efectivo en la deteccioacuten de
28
PMTV utilizando Solanum esculentum cv Monkeymaker como planta trampa y cuando se
usoacute en conjunto con qRT-PCR los resultados se obtuvieron maacutes raacutepidamente que los de
otros bioensayos previamente descritos por Arif et al (1994) quienes utilizaron
Chenopodium quinoa como planta trampa
Otros meacutetodos basados en RT-PCR han sido empleados en Japoacuten por Nakayama et al
(2010) mediante microplacas de hibridizacioacuten RT-PCR (RT-PCR-MPH) para la deteccioacuten
de PMTV con cebadores especiacuteficos y una sonda marcada en muestras provenientes de
raiacuteces de plantas de tomate Asiacute mismo el diagnoacutestico en muestras de suelo utilizando este
meacutetodo determinoacute que el 612 de los lotes muestreados estaban infectados con PMTV
La hibridizacioacuten especiacutefica basada en amplificacioacuten con cebadores con marcadores
fluorescentes (Flash-PCR) tambieacuten ha sido una teacutecnica basada en PCR que ha permitido la
deteccioacuten raacutepida y precisa de diferentes virus de la papa como el PMTV (Ryazantsev y
Zavriev 2009) De otro lado los microarreglos con sondas especiacutefica para virus pueden
detectar un nuacutemero casi ilimitado de especies de virus en un solo ensayo Nicolaisen
(2011) realizoacute un estudio de microarreglos con la utilizacioacuten de 152 sondas potencialmente
capaces de detectar 52 virus en papa (incluyendo PMTV) Las hibridizaciones del ADNc de
plantas infectadas mostraron que 49 de los 52 virus fueron positivos e identificados
correctamente a nivel de especie demostrando que esta teacutecnica puede contribuir a la
construccioacuten de microarreglos geneacutericos capaces de detectar la mayoriacutea sino todos los
virus de ARN de plantas
En Colombia la deteccioacuten de PMTV fue reportada por primera vez por Veacutelez (2007) Los
ensayos de RT-PCR permitieron determinar que el 81 de los suelos muestreados en el
estudio presentaron infeccioacuten por PMTV Este meacutetodo utilizando los cebadores H360
C819 fue maacutes sensible para la deteccioacuten de PMTV que la induccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras En estos bioensayos se encontroacute que las plantas de N tabacum fueron mejores
indicadoras de la expresioacuten de siacutentomas que las de N debneyi pero estas uacuteltimas son maacutes
sensibles para la deteccioacuten de PMTV por RT-PCR
29
Gil (2010) realizoacute la evaluacioacuten de la presencia del virus PMTV a partir de plantas de N
benthamiana inoculadas con quistosoros de Sss mediante pruebas de deteccioacuten seroloacutegica y
molecular Un total de 18 muestras de raiacuteces infectadas con Sss fueron evaluadas
encontraacutendose que cinco muestras de Antioquia y una de Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo
arrojaron resultados positivos en las pruebas de ELISA Al comparar estos resultados con
los obtenidos con qRT-PCR se encontroacute que la prueba de qRT-PCR determinoacute la presencia
del virus en el 45 de las muestras analizadas mientras que mediante ELISA y RT-PCR
convencional se diagnosticaron 25 y 28 de las muestras como positivas Sin embargo el
anaacutelisis estadiacutestico no indicoacute diferencias significativas al nivel del 95 entre las tres
pruebas analizadas Al observar individualmente la capacidad de las pruebas para detectar
PMTV resultoacute llamativo el hecho que algunas muestras fueran positivas para dos de las
tres pruebas e incluso se presentaron casos en los que la prueba de ELISA detectoacute el virus
pero no las pruebas basadas en RT-PCR lo cual sugirioacute problemas con la inhibicioacuten de las
reacciones enzimaacuteticas o con los cebadores empleados
37 Variabilidad geneacutetica de PMTV
A nivel mundial se han desarrollado investigaciones que reportan la presencia de bajos
niveles de variacioacuten entre genotipos de PMTV (Mayo et al 1996) Latvala-Kilby et al
(2009) caracterizaron el gen de la CP y un dominio de lectura continua del ARN 2 asiacute
como el gen 8K y la regioacuten no traducida 3acutedel ARN 3 (UTR) de 37 aislamientos de
Finlandia y Letonia Fueron encontrados dos tipos diferenciables de ARN 2 y ARN 3 La
secuenciacioacuten y los anaacutelisis de RFLP de los productos de PCR de dichas regiones
indicaron que la mayoriacutea de los aislamientos de PMTV que infectaron tubeacuterculos en estos
paiacuteses europeos comprenden los restrictotipos ARN 2-II y ARN 3-B
En estudios previos en los cuales las secuencias CP de tres aislamientos de Escocia y ocho
de Peruacute fueron analizadas por Mayo et al (1996) las cepas bajo anaacutelisis mostraron poca
variabilidad De forma similar las secuencias CP de seis aislamientos de Norteameacuterica
presentaron una identidad mayor al 97 con respecto a algunas secuencias de aislamientos
de PMTV de Europa (Xu et al 2004) En Dinamarca se reportoacute la presencia de dos grupos
30
de PMTV basado en anaacutelisis de las secuencias de CP encontrando que eacutestos comparten
98 de identidad pero con posibles diferencias en la reproduccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras (Nielsen y Nicolaisen 2003) Al parecer la variabilidad geneacutetica de los genes
de la CP en aislamientos de PMTV del norte de Europa y Norte Ameacuterica es limitada y
permite la deteccioacuten confiable del virus con los anticuerpos monoclonales y los cebadores
de la PCR usados actualmente (Santala et al 2010)
En Colombia Velez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo con alta identidad con aislamientos de Europa
y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por aislamientos colombianos Una
situacioacuten similar encontroacute Gil (2010) con aislamientos Colombianos de PMTV que
presentaron una estructura poblacional con bajos niveles de variabilidad pero con algunas
variantes divergentes con respecto a los genotipos de referencia mundial Dichas variantes
presentaron diferencias en sus secuencias de CP hasta del 24 con respecto al grupo
principal La contextualizacioacuten en el genoma viral de dos secuencias obtenidas por dicho
autor en cepas de PMTV del departamento de Antioquia indicoacute que se tratan de
aislamientos representativos del genoma ordinario de PMTV y no de las variantes
encontradas en el anaacutelisis filogeneacutetico Sus identidades para las porciones del ARN 2 y
ARN 3 secuenciadas fueron altas (gt97) con respecto a los genomas reportados en
trabajos anteriores (Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) por lo que se plantea la
necesidad de secuenciar dichas regiones en al menos un aislamiento de las variantes
referidas
Los resultados encontrados en esta investigacioacuten permiten plantear que el caso de PMTV
en Colombia es aparentemente singular dada la presencia de dos variantes geneacuteticas de los
altos niveles de infeccioacuten que genera Sss en cultivos de papa de diferentes departamentos y
de las diferencias notables en la manifestacioacuten de siacutentomas de la sarna polvosa entre
variedades locales (Carrentildeo 2009 Gilchrist et al 2009 Gil 2010) situacioacuten que amerita
continuar con los estudios de variabilidad geneacutetica y fenotiacutepica en dichos patosistemas
31
BIBLIOGRAFIA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Agrios GN 1996 Fitopatologiacutea Editorial Limusa Meacutexico
Andersen BAB Nicolaisen M Nielsen SL 2002 Alternative hosts for Potato mop-top
virus genus Pomovirus and its vector Spongospora subterranea Potato Research 45 37-
43
Arias CMM 2011 Anaacutelisis y comparacioacuten de los glucosinolatos presentes en diferentes
acceciones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control
del patoacutegeno de la papa Spongospora subterranea Tesis de Maestriacutea en Ciencias Quiacutemicas
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Departamento de quiacutemica
Bogataacute Colombia
Arif M Torrance L Reavy B 1994 Improved efficiency of detection of potato mop- top
furovirus in potato tubers and in the roots and leaves of soil-bait plants Potato Research
37 373-381
Arif M Torrance L 1996 Detection of Potato mop-top virus in potato tubers Proceedings
Crop Protection in Northern Britain 325-330
Astier S Albouy J Maury Y Robaglia C Lecoq H 2007 Principles of plant virology
genome pathogenicity virus ecology Science Publishers Enfield NH USA P 112
Bell KS Roberts J Verral S Cullen DW Williams NA Harison JG 1999 Detection and
quantification of Spongospora subterranea fsp subterranea in soils and on tubers using
specific primers PCR primers European Journal of Plant Pathology 105905-915
Benavides PJA 2006 Incidencia y severidad de la rontildea de la papa causada por
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh f sp subterranea Tomlinson en raiacuteces y
tubeacuterculos de Diacol Capiro y Parda Pastusa en tres eacutepocas de siembra en el departamento
32
de Narintildeo y su efecto en los rendimientos (Tesis de maestriacutea) Bogotaacute Colombia Facultad
de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid diagnostic
test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European Journal of Plant
Pathology 131 (2) 277-287
Budziszewska M Wieczorek P Nowaczyk K Borodynko N Pospieszny H Obrecircplaska-
Stecircplowska A 2010 First report of potato mop-top virus on potato in Poland Plant
Disease 94 (7) 920
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47759-766
Campell RN 1996 Fungal transmission of plant viruses Annuals Review of
Phytopathology 3487-108
Carnegie SF Cameron AM McCreath M 2010 Foliar symptoms caused by Potato mop-
top virus on potato plants during vegetative propagation in Scotland and their association
with tuber yield spraing and tuber infection Potato Research 53 83-93
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia (Tesis de Maestriacutea) Bogotaacute
Colombia Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Colombia
Cerovska N Pecenkeva T Filigarovaacute M Dedic P 2007 Sequences analysis of the Czech
Potato Mop-Top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica 52(1) 61-
64
Cotes J Jaramillo S Gonzaacutelez L 2006 Evaluacioacuten de la incidencia de sarna polvosa en
tres variedades de papas colombianas Congreso Internacional de papa John S
Niederhauser Meacutexicop O-7 ISBN 968-02-0270-4
33
Crosslin JM 2011 First report of potato mop-top virus on potatoes in Washington State
Plant Disease 95 (11)1483
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
David N Mallik I Crosslin JM Gudmestad NC 2010 Firt report of Potato mop-top virus
in North Dakota Plant Disease 94 (12)1506
Dick MW 2001 Straminipilous fungi systematic of the Peronosporomycetes including
accounts of the marine straminipilous protist the plasmodiophorids and similar organisms
Kluwer Dordrecht
Dijkstra J Khan JA 2006 Handbook of Plant Virology Haworth Press Inc New York
US Jawaid A Khan Jeanne Dijkstra editors P 452
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC Scott CL 2010 Elevated zinc and manganese
levels give moderate reductions in Spongospora subterranea infection of potato roots In
Proceedings 6th Australasian Soilborne Diseases Symposium Twin Waters Queensland 9-
10 August 2010 P 46
Falloon RE Russell AG Wallace AR Butler RC 2003 Susceptibility of potato (Solanum
tuberosum) cultivars to powdery scab (caused by Spongospora subterranea) and
relationships between tuber and root infection Australasian Plant Pathology 32377-385
FAO 2008 Antildeo internacional de la papa (Citado 14 enero 2011) Disponible en
httpwwwpotato2008orgesmundoamerica_latinahtml
FAO 2009 Sustainable potato production Guidelines for developing countries (Citado 14
enero 2011) Disponible en ftpftpfaoorgdocrepfao012i1127ei1127epdf
34
Gallo GYM 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea Facultad de Medicina Universidad Nacional de Colombia
Bogotaacute Colombia
Garciacutea C Navia E 2002 Evaluacioacuten de estrateacutegias de manejo de la rontildea polvosa
(Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en Colombia
(Citado 14 Ene 2011) Disponible en
httpwwwredepapaorgpracticasculturalesred3html
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Gil RJF Mariacuten M 2010 Diagnoacutestico y caracterizacioacuten molecular de virus asociados al
cultivo de la papa en Colombia con eacutenfasis en el virus Mop Top (PMTV Pomovirus)
(Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia
Gilchrist RE 2009 Alternativas para el manejo integrado de la sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) (Tesis de Doctorado) Medelliacuten Colombia
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia
Gilchrist E Jaramillo S Reynaldi S 2009 Efecto sobre la sarna polvosa de cuatro
aislamientos del hongo Trichoderma asperellum en tres tipos de suelo Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 624783ndash4792
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
35
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tuber by enzyme-linked immunosorbent assay Plant pathology
42181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato-a review
Plant pathology 461-25
Hoyos L Peacuterez JC Jaramillo S Orduz S Ntildeustez C 2002 Evaluacioacuten del efecto de
Trichoderma spp sobre Spongospora subterranea en papa variedad Diacol Capiro bajo
condiciones de invernadero Subproyecto 4 de Evaluacioacuten de las estrategias de manejo de la
rontildea polvosa (Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en
Colombia 2002 Disponible en wwwcevipapaorgco
Hoyos CL Villegas OM Gonzalez JEP 2009 Observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Spongospora subterranea f sp subterranea en papa Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 62(2) 5039-5045
Houser AJ Davidson RD 2010 Development a greenhouse assay to evaluate potato
germplasm for susceptibility to powdery scab American Journal of Potato Research 87
285-298
ICTVdB 2006 Management Potato mop-top virus The Universal Virus Database version
4 Buumlchen-Osmond C (Ed) Columbia University New York USA (Citado 20 Dic 2010)
Disponible en httpwwwncbinlmnihgovICTVdbICTVdB00086001001htm
Jaramillo S Calderoacuten H Narvaacuteez C Machuca A Afanador L Hincapieacute L Correa G 2003
Caracterizacioacuten de la variabilidad patogeacutenica y molecular de Spongospora subterranea
Informe final fase 2 Convenio Universidad Nacional Sede Medelliacuten y CEVIPAPA
Medelliacuten p 80
Jaramillo S Gonzaacutelez L Cotes J 2006 Efecto del tipo de suelo sobre la sarna polvosa
causada por Spongospora subterranea f sp subterranea (Wall) Lagerheim en papa
36
Congreso Internacional de papa John S Niederhauser Meacutexico p O-6ISBN 968-02-0270-
4
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos cultivares de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista de la Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 60(2)
3859-3876
Jaramillo VS Peacuterez AGA Hoyos CLM 2008 Variacioacuten morfoloacutegica de quistosoros de
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh fsp subterranea Revista Facultad de
Agronomiacutea ndash Medelliacuten 61(2)4511-4517
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Jones RAC Harrison BD 1969 The behaviour of Potato mop top virus in soil and
evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wall) Lagerh Annals Applied
Biology 63 1-17
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 71 47-57
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003 First
Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease 87872
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99(5)519-531
Lees AK 2000 Summary of the session on past and present research on powdery scab
Past and present Research Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery
scab Workshop Aberdeen Scottland July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) P 55-57
37
Lees AK van de Graaf P Cullen DW Duncan JM 2002 The development of a
quantitative real-time PCR assay for Spongospora subterranea f sp subterranea and its
use in epidemiological studies In Proceedings of the 5th
symposium of the international
working group on plant viruses with fungal vectors Institute of Plant Science Swiss
Federal Institute of Technology (ETH) Zurich Switzerland July 22-25 2002 P31
Lees AK van de Graaf P Wale S 2008 The identification and detection of Spongospora
subterranea and factors affecting infection and disease American Journal of Potato
Research 85 247-252
Lister RA Falloon RE Curtin D Butler C 2004 Spongospora subterranea reduces host
(Solanum tuberosum) growth Proceedings of 3rd
Australasian Soilborne Diseases
Symposium Barossa Valley South Australia 9-11 February 2004
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization and
effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal of
General Virology 862879-2889
Lyman GR Rogers JT 1915 The native habitat of Spongospora subterranea Science
42940-2
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2005 La cadena de la papa en
Colombia Una mirada a su estructura y dinaacutemica 1991-2005 Documento de trabajo Ndeg 54
(Citado 13 Ene 2011) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet2005112163731_caracterizacion_papapdf
MADR (Ministerio de agricultura y desarrollo rural) 2006 Observatorio agrocadenas
Colombia Documento de trabajo No 100 La cadena de la papa en Colombia Una mirada
global de su estructura y dinamica 1991-2005 (Citado 20 Dic de 2011) Disponible en
httpwwwagrocadenasgovco
38
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009a Memorias 2008- 2009
(Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwminagriculturagovcoarchivosmemorias_minagricultura_2009_completopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009b Anuario estadiacutestico del
sector agropecuario y pesquero Direccioacuten de poliacutetica sectorial Grupo sistemas de
informacioacuten Bogotaacute DC (Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwhtm3bpublicanuarioanuariopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural)ndashENA (Encuesta Nacional
Agropecuaria) 2009 Oferta Agropecuaria cifras 2009 (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet201046112648_RESULTADOS_ENA_200
9pdf
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C Salazar
LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top virus
from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
McDonald BA Martinez JP 1990 Restriction fragment length polymorphisms in Septoria
tritici occur at a high frequency Current Genetics 17133-138
McGeachy KD Barker H 2000 Potato mop-top virus RNA can move long distance in the
absence of coat protein Evidence from resistant transgenic plants Molecular Plant
Microbe Interactions 13125-128
Melander M Lee M Sandgren M 2001 Reduction in Potato mop-top virus accumulation
and incidence in tubers of potato transformed with a modified triple gene block gene of
PMTV Molecular Breeding 8197-206
Merz U 1989 Infectivity inoculum density and germination of Spongospora subterranea
resting spores a solution culture test system Bulletin OEPP 19 585-592
39
Merz U 2000 Powdery scab Research in Switzerland Past and present Research
Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery scab Workshop Scottland
July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) 2000 p 67-71
Merz U 2008 Powdery Scab of PotatomdashOccurrence Life Cycle and Epidemiology
American Journal of Potato Reserch 85241ndash246
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar
x environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Merz U Martiacutenez V Schwaumlrzel R 2004 The potencial for the rapid screening of potato
cultivars (Solanum tuberosum) for resistance to powdery scab (Spongospora subterranea)
using a laboratory bioassay European Journal of Plant Pathology 110 71-77
Merz U Walsh JA Bouchek-Mechiche K Oberhaumlnsli TH Bitterlin W 2005 Improved
immunological detection of Spongospora subterranea European Journal of Plant
Pathology 111371ndash379
Merz U Falloon RE 2009 Review Powdery scab of potato-increased knowledge of
pathogen biology and disease epidemiology for effective disease management Potato
Research 5217-37
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert HR 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar x
environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Montero-Astua M Vasquez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
40
Murakami H Tsushima S Akimoto T Murakami K Goto I Shishido Y 2000 Effects of
growing leafy daikon (Raphanus sativus) on populations of Plasmidiophora brassicae
(clubroot) Plant Pathology 49584-589
Mutasa ES Ward E Adams MJ Collier CR Chwarszcynska D Asher MJC 1993 A
sensitive DNA probe for the detection of Polymyxa betae in sugar beet roots Physiological
and Molecular Plant Pathology 43 379-390
Mutasa-Gottgens ES Chwarszczynska Halsey H Asher MJC 2000 Specific polyclonal
antibodies for the obligate plant parasite Polymyxa a targeted recombinant DNA approach
Plant Pathology 49276-87
Nakayama T Maoka T Hataya T Motoshige S Fuwa S Mori M 2010 Diagnosis of
Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-285
Nicolaisen M 2011 An oligonucleotide-based microarray for detection of plant RNA
viruses Journal of Virological Methods 173 137-143
Nielsen SL Moslashlgaard JP 1997 Incidence appearance and development of potato mop-top
furovirus-induced sprain in potato cultivars and the influence on yield distribution in
Denmark and detection of the virus in tubers by ELISA Potato Research 40101-110
Nielsen S Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups within
Potato mop-top virus Archives of Virology 148381ndash388
Nitzan N Boydston R Batchelor D Crosslin J Brown C 2009 Hairy nightshade is an
alternative host of Spongospora subterranea the potato powdery sacab pathogen
American Journal of Potato Research 86 297-303
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
41
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006a The host range of Spongospora subterranea f sp subterranea in
the United States American Journal of Potato Research 83343-347
Qu XS Christ BJ 2006b Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea fsp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Ramiacuterez GJG 2010 Variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp subterranea
en suelos del municipio de unioacuten cultivados con la coleccioacuten Central colombiana de
Solanum phureja (Tesis de Pregrado) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias
Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia 2010
Restrepo DAF Jaramillo VS Cotes TJM 2009 Efecto de dos microorganismos y un
consorcio de micorrizas en combinacioacuten con viruta de pino sobre el control de sarna
polvosa (Spongospora subterranea) en papa Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea
Medelliacuten 62(2) 5047-5054
Rodriacuteguez K Maldonado Y Murcia L Huertas W Vaacutesquez M Zambrano A Rivero R
Garciacutea C 2002 Evaluacioacuten de protocolos para la deteccioacuten de patoacutegenos del suelo en Papa
(Rhizoctonia Rosellinia y Spongospora) (Citado 15 Ene 2011) Disponible en
httpwwwtodopapacomarpdfprotocolospdf
42
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista Facultad Agronomiacutea 26 (4) Caracas
Ryazantsev DYu Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato plant pathogens Applied Molecular Biology 43(3) 515-523
Saavedra SCO Goacutemez GST Aacutengel DJE 2004 Deteccioacuten de secuencias especiacuteficas de
ADN de Spongospora subterranea en suelo y tubeacuterculos de papa Revista Colombiana de
Biotecnologiacutea 714-23
Salazar LF1995 Los virus de la papa y su control Centro Internacional de la Papa CIP
(Peruacute) Publicado por el Centro Internacional de la Papa P 226
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 49 43-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M Wieczorek
P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-Wiśniewska J Yin Z
Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E Taluntytė L Pūpola N
Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E Sozonov A Tikhonovich I
Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam G Valkonen JPT 2010 Detection
distribution and control of Potato mop-top virus a soil-borne virus in northern Europe
Annals of Applied Biology 157163-178
43
Savenkov EI Sandgren M Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003 Potato
mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich protein are
dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of General
Virology 841001-1005
Shah FA Falloon RE Bulman SR 2010 Nightshade weeds (Solanum spp) confirmed as
hosts of the potato pathogens Meloidogyne falax and Spongospora subterranea f sp
subterranea Australasian Plant Pathology 39 492-498
Shah FA Falloon RE Lister RA Butler RC McKay A Ophel-Keller K Khan I 2009
Relationships between Spongospora subterranea DNA in field soil and powdery scab in
harvested potatoes Conference Handbook 17th
Australasian Plant Pathology Society
Conference (APPS) 29 September-1 October 2009 P 148
Shemyakina EA Sclovyev AG Leonova OG Popenko VI Schiemann J Morozov SY
2011 The role of microtubule association in plasmodesmal targeting of potato mop-top
virus movement protein TGBp1 The Open Virology Journal 51-11
SINAIPA (Sistema nacional de informacioacuten de papa) 2002 La rontildea de la papa p 8-9 El
Correo de la Papa Boletiacuten mensual No 07 Colombia (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en wwwcevipapaorgcopublicacionespublicacionesphp
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Reserch 83423-31
Torres H Pacheco MA French ER 1995 Resistance of potato to powdery scab
(Spongospora subterranea) under Andean field conditions American Potato Journal
10355-363
44
van de Graff PV Lees AK Cullen DW Duncan JM 2003 Detection and quantification of
Spongospora subterranea soil water and tissue samples using real-time PCR European
Journal of Plant Pathology 109 589-597
van de Graff P Wale SJ Lees AK 2007 Factors affecting the incidence and severity of
Spongospora subterranea infection and galling in potato roots Plant Pathology 56 1005-
1013
Veacutelez B 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato mop- top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia (Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Nacional de Colombia
Villareal HJ Porras PD Santa A Lagoeyte J Muntildeoz D 2007 Costos de produccioacuten de
papa en las principales zonas productoras de Colombia Federacioacuten Colombiana de
productores de papa FEDEPAPA
Wale SJ Burgess PJ Burnett F 1993 Bioassay for Spongospora subterranea detection in
soil and its potential use in predicting scab in the field Abstract 1642 Sixth International
Congress of Plant Pathology Quebec Canada
Wallroth FW 1842 Der Knollenbrand der Kartoffel Linnaea 16 332
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea using monoclonal antibodies Plant pathology 44335-365
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2004 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165 875-85
Ward LI Beales PA Barnes AV Lane CR 2005 A Real-time PCR assay based method for
routine diagnosis of Spongospora subterranea on Potato tubers Journal Phytopathology
152 633-638
45
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI Torrance
L 2010 The N- terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required for the
nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant Microbe Interaction 23(1) 1486-1497
Wuumlrzer B 1964 Ergaumlzende Untersuchungen uumlber den Pulverschorf der Kartoffel und
dessen Erreger Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh diss Landwirtschaftliche
Hochschule Hohenheim Germany 1964
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top virus
in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
Zamyatnin JrAA Solovyev AG Savenkov EI Germundsson A Sandgren M Valkonen
JPT Morozov SY 2004 Transient coexpression of individual genes encoded by the triple
gene block of Potato mop-top virus reveals requirements for TGBp1 trafficking Molecular
Plant-Microbe Interactions 17(8) 921-930
Zhang N McCarthy ML Smart CD 2008 A macroarray system for the detection of fungal
and oomycete pathogens of solanaceous crops Plant Disease 92(6) 953-960
Zolan ME Pukilla PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinerus
Molecular and cellular Biology 6(1)195-200
46
RESULTADOS
4 ARTICULO 1
VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora subterranea f sp subterranea EN
COLOMBIA
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea IN
COLOMBIA
Ineacutes Osorio Giraldo1 Marcela Orozco Valencia
1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
1 Elena Paola
Gonzaacutelez Jaimes2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
Formato de la Revista Actualidades Bioloacutegicas ISSN 0304-3584
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
La Sarna polvosa de la papa (Spongospora subterranea fsp subterranea - Sss) es una de
las enfermedades re-emergentes maacutes importantes de este cultivo en Colombia El efecto
deleteacutereo de Sss no soacutelo se debe al dantildeo directo sobre el sistema radicular y la calidad de
los tubeacuterculos sino tambieacuten a que sus zoosporas transmiten el Potato mop-top virus
(PMTV Pomovirus) Sss genera quistosoros que actuacutean como estructuras de resistencia del
patoacutegeno en el suelo pudiendo permanecer viables por varias deacutecadas Por esto su manejo
debe fundamentarse en el uso de variedades tolerantes a la enfermedad y en el empleo de
tubeacuterculo-semilla certificado En esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variacioacuten de
127 aislamientos de Sss obtenidos en los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo con el fin de apoyar la seleccioacuten de aislamientos de Sss a evaluar
47
en programas de mejoramiento geneacutetico de papa y en el disentildeo de pruebas de deteccioacuten
asintomaacutetica del patoacutegeno Para esto se secuenciaron regiones ITS del ADN ribosomal y se
condujeron anaacutelisis filogeneacuteticos encontraacutendose la presencia de tres variantes principales
de Sss dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum
Abstract
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum
INTRODUCCIOacuteN
El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L) se ve afectado por diversos microorganismos
fitopatoacutegenos e insectos plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la re-emergencia de la
48
enfermedad denominada Sarna polvosa causada por el plasmodiofoacuterido Spongospora
subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp subterranea Tomlinson (Sss) Su efecto no solo se
debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten al deterioro en la calidad y apariencia
cosmeacutetica de los tubeacuterculos que reduce draacutesticamente su valor en el mercado (Merz y
Fallon 2009) Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop top virus (PMTV) uno de
los problemas virales de la papa que tiene caraacutecter cuarenteneario para diferentes paiacuteses del
mundo (Salazar 2006 Gil et al 2011)
Sss es originario de los Andes Surameacutericanos desde donde se dispersoacute gracias al mercado
mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber transcurrido maacutes de 150 antildeos desde su
primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado importancia en las uacuteltimas deacutecadas como
resultado de la siembra generalizada de materiales altamente susceptibles al patoacutegeno la
utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los cambios de eacutepocas de siembra hacia
periacuteodo huacutemedos las deficiencias en los sistemas de rotacioacuten de cultivos la falta de
programas de exclusioacuten y los altos estaacutendares exigidos por el mercado en la calidad
cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
Sss es un patoacutegeno obligado plasmodial que taxonoacutemicamente se ubica en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos son importantes patoacutegenos de vegetales
Spongospora subterranea fsp subterraena y f sp nasturtii Estos taxa fueron definidos
inicialmente como forma especialis (Merz y Falloon 2009) sin embargo con base en la
morfologiacutea de los zoosporangios rango de hospedantes y anaacutelisis filogeneacuteticos de regiones
ribosomales actualmente se acepta que representan dos especies diferentes (Qu y Christ
2004)
Los siacutentomas de la Sarna polvosa incluyen la induccioacuten en los tubeacuterculos de lesiones
pustulosas corchosas con centros pulverulentos formados a partir de la agregacioacuten de los
quistosoros del patoacutegeno (Figura 41) Con el avance de estas lesiones es frecuente la
49
ruptura del peridermo aunque el nivel de penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente
superficial (Carrentildeo 2009) Bajo condiciones oacuteptimas para el desarrollo de la enfermedad
es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten de los tejidos y la formacioacuten
de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la enfermedad ademaacutes de causar
los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular de las plantas al inducir la
formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas que causan la disminucioacuten de la
superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo marchitez y finalmente la muerte de las
plantas (Gilchrist 2009) La infeccioacuten en las raiacuteces especialmente cuando se forman
agallas puede causar una reduccioacuten en la toma de agua y de nutrientes por parte de las
plantas (Falloon et al 2005)
En los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Sss afecta
severamente las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y papa criolla (S phureja) Los
siacutentomas se observan en raiacuteces y tubeacuterculos pero hay variacioacuten entre las zonas paperas en
cuanto a la distribucioacuten de los siacutentomas en los diferentes oacuterganos de la planta En
Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre
los tubeacuterculos de las variedades Parda Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el
departamento de Narintildeo y el Oriente de Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces
Hasta ahora no se conoce si estas diferencias se deben a variaciones en las condiciones
ambientales de las regiones o a la ocurrencia de variantes geneacuteticas del patoacutegeno (Jaramillo
y Botero 2007 Carrentildeo 2009)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 en las cosechas de las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y Criolla Colombia
(Rodriacuteguez et al 2009 Gilchrist 2009) Adicionalmente a esta problemaacutetica la
diseminacioacuten del patoacutegeno se viene incrementando dramaacuteticamente en el paiacutes como
resultado de la baja calidad del tubeacuterculo-semilla utilizado por la mayoriacutea de los
agricultores la ausencia de variedades tolerantes al patoacutegeno y la deficiencia en la
asistencia teacutecnica que no cuenta con herramientas apropiadas para el diagnoacutestico
asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011) Su
manejo debe estar enmarcado bajo un esquema integrado del cultivo en el que se incluyan
50
aspectos como la rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del
tubeacuterculo-semilla utilizacioacuten de organismos antagonistas (ej Trichoderma spp) el empleo
de cultivos trampa la desinfeccioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten
que restrinja el movimiento de material contaminado y supervise maacutes detalladamente los
procesos de certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas
son utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado
del manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o
de Rhizoctoniasis (Carrentildeo 2009)
La problemaacutetica causada por esta enfermedad en las regiones cultivadoras de papa hace
necesario que se intensifiquen los esfuerzos por desarrollar metodologiacuteas de diagnoacutestico de
suelos y material vegetal que eviten la diseminacioacuten generalizada del plasmodiofoacuterido y de
su virus asociado PMTV entre regiones infectadas y libres de enfermedad siendo
especialmente importante el desarrollo de procedimientos que garanticen la sanidad de los
lotes dedicados a la produccioacuten de semilla Entre las diversas metodologiacuteas desarrolladas en
el mundo para el diagnoacutestico de este patoacutegeno se destacan la teacutecnica de ELISA con
anticuerpos policlonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Qu et al 2011) y pruebas de
flujo lateral (Bouchek-Mechiche et al 2011) Sin embargo estas teacutecnicas son de aplicacioacuten
limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas con base en los genotipos locales de los
patoacutegenos presentes en las regiones paperas del paiacutes Con el fin de suplir dicha carencia de
informacioacuten en esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss procedentes de las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia
mediante el anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr)
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Para la coleccioacuten de muestras de quistosoros de Sss proveniente de suelo raiacuteces y
tubeacuterculos se seleccionaron lotes en fincas con antecedentes de infeccioacuten seguacuten el registro
51
histoacuterico de los agricultores siguiendo la metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la
cual se utiliza un juego de tamices de 100 y 25 microm para la obtencioacuten de los quistosoros Por
cada lote se tomaron raiacuteces de plantas o tubeacuterculos sintomaacuteticos y una muestra de suelo de
500 gr Los sitios de coleccioacuten incluyeron las regiones cultivadoras de papa de los
municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio Subachoque y
Villa Pinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute Oicataacute (Boyacaacute) y Pasto e Ipiales
(Narintildeo) La investigacioacuten se propuso obtener un miacutenimo de 30 muestras de Sss por
departamento
Los quistosoros obtenidos a partir de muestras de suelos fueron inoculados en plantas de
Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo o plantas
trampa para incrementar el inoacuteculo siguiendo la metodologiacutea de Veacutelez (2007)
mantenieacutendose en casa de malla en el Centro Experimental Paysanduacute ubicado en el
corregimiento Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB 2550 msnm temperatura
media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) (Figura 42) Todas las muestras
fueron procesadas en los laboratorios de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad
Nacional de Colombia sede Medelliacuten y Sanidad Vegetal del Politeacutecnico Colombiano Jaime
Isaza Cadavid
Extraccioacuten de ADN
Para la obtencioacuten del ADN se empleoacute una modificacioacuten de la metodologiacutea de Doyle y
Doyle (1987) a partir de quistosoros extraiacutedos y de tejidos afectados de las plantas de papa
y plantas sentildeuelo En este procedimiento es necesaria la maceracioacuten con nitroacutegeno liacutequido
de los tejidos y se emplea como buffer de extraccioacuten una solucioacuten CTAB y 1
mercaptoetanol El lavado de la fase orgaacutenica se realiza con fenolcloroformo-alcohol
isoamiacutelico y la precipitacioacuten de los aacutecidos nucleicos con 1 voluacutemen de etanol absoluto y 01
voluacutemen de acetato de sodio 3M Finalmente el pellet generado es disuelto en agua
destilada esteacuteril y es sometido a digestioacuten de ARN mediante la adicioacuten de ribonucleasa A
(10 mgmL) (Ver protocolo 62) Cuando la presencia de inhibidores afectaba la eficiencia
52
de la PCR la extraccioacuten de ADN se realizoacute utilizando el kit DNeasy Plant (Qiagen
EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante con una ligera modificacioacuten en el paso
de elucioacuten de ADN que se realizoacute en dos etapas con 70 microL de agua destilada esteacuteril Para
determinar la concentracioacuten del ADN extraiacutedo se utilizoacute la lectura de absorbancia en las
longitudes de onda de 260 y 280 nm mediante un Nanodrop 2000C (Thermo EEUU)
obtenieacutendose un rango entre 10 y 112 ng de ADNμL con una relacioacuten 260280 de 15 a 19
(Tabla 41) La integridad del ADN se determinoacute realizando electroforesis en gel de agarosa
al 08 en buffer TBE 1X (TBE 5X 54 gL Tris 275 gL de aacutecido boacuterico 20 mLL de
EDTA 05M pH 80) suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) La visualizacioacuten de
las bandas se realizoacute utilizando el sistema digital de anaacutelisis Bio Doc Analyze (Biometra
Alemania) (Figura 43)
PCR de ITS del ADNr
Para la evaluacioacuten de los niveles de variacioacuten geneacutetica de Sss se realizaron PCR empleando
los cebadores especiacuteficos Spo8 (5 CTG GGT GCG ATT GTC TGT TG 3) y Spo9 (5 CAC
GCC AAT GGT TAG AGA CG 3) disentildeados por Bulman y Marshall (1998) asiacute como los
cebadores SsF (5acute GTC GGT TCT ACC GGC AGA CC 3acute) y SsR (5acute GCA CGC CAA
TGG TTA GAG ACG 3acute) reportados por Qu et al (2006) que amplifican productos de
391 y 434 pb de la regioacuten ITS del ADNr respectivamente Las reacciones de PCR
incluyeron 01 microM de cada cebador 1 U de Taq ADN polimerasa recombinante
(Fermentas Lithuania) 02 mM de cada dNTP 1X de buffer de enzima (100 mM Tris-HCl
(NH4)2SO2 pH 88) 2 mM MgCl2 1 microL de una dilucioacuten 50 ngmicroL de ADN y un volumen
total de 25 microL Las amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra) y
consistieron de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 35 ciclos de
94degC por 30 s 55degC por 30 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10
min Luego de la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se
separaron por electroforesis en gel de agarosa al 15 tal como se indicoacute anteriormente
53
Secuenciacioacuten
De ser necesario los amplicones obtenidos fueron purificados mediante los kits QIAquick
PCR Purification y QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para proceder a su secuenciacioacuten
directa en ambas direcciones utilizando los cebadores empleados en la PCR y el kit Big
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied Biosystems EEUU) Su
corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied
Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur) (Figura 44)
Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit
606 y Chromas 145 construyeacutendose secuencias consenso y confirmaacutendose su validez por
comparacioacuten con las bases de datos moleculares con el programa BLASTn
(httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) (Figura 45) Paralelamente se obtuvieron
del GenBank secuencias de Sss de las regiones estudiadas para su alineacioacuten con las
generadas en este trabajo mediante el software Clustal W Ademaacutes se utilizaron las
secuencias de los Plasmodiofoacuteridos Plasmodiophora brassicae Polymyxa graminis
Polymyxa betae S nasturtii y Sorosphaera viticola como grupos externos de anaacutelisis
(outgroups) Los alineamientos fueron utilizados en la construccioacuten de una matriz Nexus y
el anaacutelisis filogeneacutetico se realizoacute mediante un algoritmo de Maacutexima Parsimonia utilizando
el software PAUP 40b Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute
un anaacutelisis de Bootstrap con 500 iteraciones
RFLPs
Con el fin de proponer una prueba de diagnoacutestico molecular de las variantes de Sss se
realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs a partir de las secuencias de Sss generadas en esta
investigacioacuten y otras depositadas en el GenBank Para esto se utilizoacute el software webcutter
20 (httprnalundberggusecutter2) con las enzimas EcoRV EcoRI Bsp143I Hin6I
MspI Tru1I y TaqI seleccionadas por ser de faacutecil acceso para laboratorios de diagnoacutestico
molecular y utilizadas en la primera parte de exploracioacuten La validez de la prueba fue
54
confirmada mediante PCR-RFLPs con las enzimas Bsp143I y Hin6I y aislamientos
representativos de los grupos geneacuteticos principales detectados en el trabajo Las reacciones
consistieron de 15 microL conteniendo 15 microL de buffer 10X 2 microL de enzima y 115 microL de
producto de PCR Las reacciones fueron incubadas al bantildeo Mariacutea a 37degC durante 24 h La
separacioacuten de los fragmentos de restriccioacuten se efectuoacute por electroforesis en gel de agarosa
al 25 Se evaluaron los patrones electroforeacuteticos obtenidos para cada enzima de
restriccioacuten y se determinoacute el nuacutemero de bandas generadas y su tamantildeo aproximado por
comparacioacuten con el marcador de peso molecular GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus
(Fermentas)
RESULTADOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Se obtuvieron 210 muestras de tubeacuterculos y raiacuteces de papa con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos con historia de la presencia del patoacutegeno en los departamentos de Antioquia
Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Se realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos con las secuencias
que presentaron tamantildeos superiores a 390 pb lograacutendose el objetivo de contar con al
menos 30 secuencias por cada departamento bajo anaacutelisis
Anaacutelisis filogeneacutetico de regiones ITS del ADNr
Las reacciones de PCR produjeron amplicones del tamantildeo esperado de ~390 pb con los
cebadores Spo8-9 (Figura 46) y de ~430 pb cuando se usaron los cebadores SsF-SsR en
79 y 48 muestras respectivamente Para el anaacutelisis filogeneacutetico soacutelo se incluyeron los
consensos que resultaron de la secuenciacioacuten en ambos sentidos De esta forma se
obtuvieron 33 secuencias de Antioquia 30 secuencias de Boyacaacute 33 secuencias de
Cundinamarca y 31 secuencias de Narintildeo para un total de 127 secuencias completas (Tabla
42) El alineamiento final de las secuencias alcanzoacute 445 sitios de los cuales 156 caracteres
eran constantes 55 variables pero no informativos y 236 informativos La longitud del
aacuterbol filogeneacutetico con maacutexima parsimonia fue de 707 con iacutendices de consistencia (IC) y
retencioacuten (IR) de 078 y 088 respectivamente Dado el alto nuacutemero de muestras
55
secuenciadas se presenta un dendrograma resultado del anaacutelisis de redundancia mediante el
programa Decrease redundancy (httpwebexpasyorgdecrease_redundancy) (Figura
47) Se presentaron dos grandes clados (A y B) soportados por valores de bootstrap de
100 el primer clado corresponde a los aislamientos de Sss mientras que el otro grupo
incluyoacute las demaacutes especies de plasmodiofoacuteridos (S nasturtii P graminis P betae y Pl
brassicae) que presentaron un alto nuacutemero de cambios entre ellas El clado A se subdividioacute
a su vez en tres grupos (A1 A2 y A3) dos de los cuales corresponden a los Tipos I (A2) y
II (A1) definidos por Qu y Christ (2004) En teacuterminos porcentuales ambos Tipos
representan el 157 (Tipo I) y 189 (Tipo II) de los aislamientos de Sss obtenidos en
Colombia ademaacutes se incluyeron secuencias del patoacutegeno provenientes de Estados Unidos
Irlanda y Escocia para el Tipo I y de Suiza Nueva Zelanda y de Reino Unido para el Tipo
II El subgrupo que representa el Tipo I de Sss soacutelo presentoacute aislamientos obtenidos de
tubeacuterculos o de suelos pero no de raiacutez mientras que el subgrupo representando el Tipo II
incluyoacute indistintamente aislamientos de raiacutez tubeacuterculos y suelos
Por otra parte el tercer subgrupo (A3) incluyoacute el mayor nuacutemero de aislamientos
Colombianos de Sss (654) con algunos de sus miembros presentando hasta 10 cambios
entre ellos En este subgrupo se encontraron indistintamente aislamientos de los cuatro
departamentos diferentes fuentes de muestreo (raiacutez tubeacuterculo o suelo) y hospedantes
(diferentes variedades de S tuberosum y de S phureja var Criolla Colombia) Dadas las
diferencias en secuencias de estos aislamientos proponemos nombrar a este grupo como el
Tipo III de Sss
El anaacutelisis de redundancia permitioacute tambieacuten identificar 12 genotipos (Figura 48) entre los
127 aislamientos de Sss de Colombia cinco de los cuales estuvieron conformados por un
soacutelo aislamiento tres por dos aislamientos y cuatro presentaron maacutes de diez miembros
siendo el genotipo 11 representante del Tipo I el 12 del Tipo II y el 7 y 10 del genotipo III
(Tabla 43) porque los demaacutes genotipos al ser uacutenicos o con tener como maacuteximo dos
representantes no fueron definidos a nivel de Tipos Los niveles de identidad para la regioacuten
56
ribosomal secuenciada entre estos genotipos fueron superiores al 95 en todos los casos
con una divergencia de 33 entre los Tipos I y II del 5 entre los Tipos I y III y del 2
entre el II y III La divergencia entre secuencias de Sss y otras especies de plasmodiofoacuteridos
fue mayor al 44 lo que demuestra la utilidad taxonoacutemica de las regiones ITS para
establecer relaciones filogeneacuteticas en este grupo de protozoos (Tabla 44)
RFLPs
Los anaacutelisis de restriccioacuten indicaron la existencia de polimorfismos en los sitios de corte de
algunas de las enzimas empleadas entre los grupos principales sentildealados en el anaacutelisis
filogeneacutetico Lo anterior puede ser utilizado con fines praacutecticos cuando se requiera evaluar
el genotipo o la mezcla de genotipos asociados a un lote de cultivo plantas sintomaacuteticas o
de tubeacuterculo-semilla con siacutentomas de Sarna polvosa Por ejemplo los aislamientos
representativos del Tipo II de Sss presentan un sitio de corte para Bsp143I (p 92) mientras
que para los del Tipo I se presentan dos sitios (p 97 340) Los aislamientos del Tipo III
tienen tres sitios de corte para la enzima Hin6I (p 222 283 352) en contraste con dos sitios
en los del Tipo I y II (p226-355 221-350) (Figura 49) Por esto proponemos la realizacioacuten
de una prueba simple de PCR-RFLPs a partir de la amplificacioacuten de las regiones ITS con
cebadores especiacuteficos para Sss y su posterior digestioacuten con las enzimas Bsp143I y Hin6I
con el fin de identificar los tres Tipos de Sss Al evaluar la digestioacuten de amplicones
representantes de los tres Tipos de Sss detectados en el estudio se validoacute la utilidad de la
teacutecnica en geles de agarosa al 25 ya que los perfiles de restriccioacuten obtenidos con la
enzima Hin6I permiten diferenciar a los aislamientos de los Tipos I y II (fragmentos
visibles de 221 y 129 pb) del Tipo III (fragmentos visibles de 221 67 y 62 pb) (Figura
410A) mientras que los representantes de los Tipos I y II se diferencian por la digestioacuten
con la enzima Bsp143I al generar fragmentos visibles de 243 pb (Tipo I) y de 294 pb (Tipo
II) (Figura 410B) Es importante indicar que los fragmentos inferiores a 50 pb no se tienen
en cuenta en este anaacutelisis ya que salen del rango de resolucioacuten de la electroforesis en geles
de agarosa Fragmentos de este tamantildeo pueden ser visualizados en geles de poliacrilamida
que ofrecen una mayor resolucioacuten
57
DISCUSIOacuteN
La disponibilidad de cultivares de papa resistentes a Sss es una prioridad para el disentildeo de
estrategias de manejo de la Sarna polvosa en diferentes paiacuteses cultivadores de este
tubeacuterculo en el mundo (Nitzan et al 2010) Sin embargo las deficiencias en el
conocimiento que se tiene de los niveles de variacioacuten de Sss y de su ciclo de vida
representan un obstaacuteculo para el establecimiento de los programas de mejoramiento
geneacutetico contra este fitopatoacutegeno (Merz y Falloon 2009) Los estudios geneacuteticos de Sss han
sido difiacuteciles de aplicar debido a su naturaleza de patoacutegeno obligado que impide su
aislamiento en medios axeacutenicos afectando los procesos de extraccioacuten de ADN la
utilizacioacuten de marcadores moleculares convencionales como AFLPs SSR y RAPDs y el
empleo de cebadores universales comuacutenmente usados para estudios taxonoacutemicos y
poblacionales en diferentes microorganismos eucarioacuteticos Adicionalmente la
caracterizacioacuten patoacutegenica de Sss resulta compleja ya que el desarrollo de la expresioacuten de
la Sarna polvosa estaacute fuertemente influenciada por las condiciones ambientales las
metodologiacuteas de inoculacioacuten y los cultivares del hospedante (Qu y Christ 2006 Jaramillo y
Botero 2007)
Afortunadamente la existencia de cebadores especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del
ADNr como los desarrollados por Bulman y Marshall (1998) y Qu et al (2006) para
amplificar la regioacuten ITS1 58S e ITS2 han permitido la obtencioacuten de secuencias que entre
otras aplicaciones permitieron definir la afinidad filogeneacutetica de Sss con respecto a otros
miembros del orden Plasmodiophoridae y demostrar los bajos niveles de identidad de esta
especie con respecto a la formae specialis nasturtii Esta misma situacioacuten se encontroacute en
este estudio obtenieacutendose identidades entre Sss y S nasturtii cercanas al 56 Los anaacutelisis
intraespeciacuteficos utilizando dichas secuencias han permitido detectar dos ribotipos
principales de Sss en el mundo denominados como I y II Ambos Tipos han sido
encontrados en poblaciones de Sss de Australia y Europa (Bulman y Marshall 1998)
mientras que en Norte Ameacuterica los aislamientos corresponden exclusivamente al Tipo II
58
(Qu y Christ 2006) En dicho estudio se encontroacute que las secuencias del Tipo I diferiacutean con
respecto a las del Tipo II en tres nucleoacutetidos (p 60 127 157) y una insercioacuten de cinco
nucleoacutetidos (p 129 a 133) en el ITS1 mientras que para la regioacuten ITS2 se presentan seis
mutaciones puntuales (p 348 367 399 402 461 475) y dos deleciones (p 356 y 474) lo
que en su conjunto equivale a un 29 de divergencia entre ambos ribotipos Estas
diferencias fueron igualmente encontradas entre los aislamientos colombianos
representando ambos Tipos aunque algunos de ellos presentaron mutaciones adicionales
por ejemplo el genotipo 12 (conformado por 21 aislamientos) presentoacute dos cambios con
respecto al Tipo II reportado en GenBank (Accesioacuten AY604172) mientras que el genotipo
11 (conformado por 17 aislamientos) tuvo tres cambios con respecto al Tipo I (Accesioacuten
AY604171)
En Colombia hasta el presente estudio se habiacutean realizado dos estudios de variabilidad
geneacutetica de Sss con base en anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr En el primero de ellos
Hincapieacute (2006) encontroacute altos niveles de identidad geneacutetica entre los aislamientos de Sss
secuenciados y analizados mediante PCR-RFLP lo que condujo al autor a plantear la
posible ocurrencia de una estructura poblacional clonal para este patoacutegeno en el paiacutes En un
estudio maacutes reciente Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS y SSCP
(Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) que incluyoacute un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones establecioacute la presencia de subpoblaciones del patoacutegeno
relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Asiacute aislamientos con secuencias ITS del Tipo
I se asociaron exclusivamente con infecciones de tubeacuterculo mientras que aquellos del Tipo
II lo hicieron con siacutentomas de agallas en raiacutez En dicha investigacioacuten se descartoacute ademaacutes la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar del hospedero o la zona
geograacutefica de origen de los aislamientos Asiacute mismo se comproboacute que en el paiacutes existen
variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la
presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno dos de los cuales corresponden a los Tipos I y
II mientras que los tres restantes correspondiacutean a nuevas variantes no reportadas en otros
59
lugares del mundo (Carrentildeo 2009) desafortunadamente las secuencias resultantes de dicho
trabajo no fueron publicadas en GenBank y por tanto no pudieron ser incluidas en los
anaacutelisis filogeneacuteticos aquiacute presentados
El presente estudio amplia auacuten maacutes la base de conocimiento de los niveles de variacioacuten de
Sss en Colombia al detectar 12 genotipos a partir de 127 secuencias de igual nuacutemero de
aislamientos del patoacutegeno obtenidos en cultivos de los cuatro principales departamentos
productores de papa del paiacutes El anaacutelisis filogeneacutetico basado en dichas secuencias definioacute
la presencia de un clado que representa a Sss e incluye los dos Tipos mundialmente
conocidos para este patoacutegeno (Qu y Christ 2004) ademaacutes de un tercer subgrupo (III) que
presenta un 5 y 2 de divergencia con respecto a los Tipo I y II respectivamente Este
Tipo III contiene la mayor proporcioacuten de aislamientos del estudio e integroacute indistintamente
cepas de diferentes oriacutegenes geograacuteficos hospedantes tejidos sintomaacuteticos y suelo De gran
intereacutes resultoacute el hecho que los aislamientos asociados con el Tipo I procediacutean de puacutestulas
en tubeacuterculos o de suelos pero no de agallas de raiacutez lo cual confirma la asociacioacuten
realizada por Carrentildeo (2009) para esta variante de Sss Sin embargo los aislamientos
asociados al Tipo II proveniacutean indistintamente de raiacutez tubeacuterculos o suelos A partir de estos
resultados es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa del paiacutes Asiacute por ejemplo
es de intereacutes estudiar las reacciones de las variedades colombianas de papa a dichos
ribotipos asiacute como su capacidad de transmisioacuten de PMTV En este sentido Ward et al
(2005) evaluando el efecto de dos ribotipos de Polymyxa graminis un plasmodiofoacuterido que
afecta gramiacuteneas en la zona templada encontraron que los aislamientos del Tipo II fueron
detectados principalmente en plantas de trigo y estaban asociados a la transmisioacuten del Soil-
borne cereal mosaic virus (SBCMV) mientras que aquellos del Tipo I afectaban cebada y
su capacidad de transmisioacuten de SBCMV era muy baja
60
Los niveles de variacioacuten encontrados en esta investigacioacuten para el agente causal de la Sarna
polvosa de la papa en Colombia condujeron a plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y de certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla Para esto se realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs de regiones ITS del
ADNr con siete enzimas de restriccioacuten de uso frecuente en laboratorios de deteccioacuten
molecular de microorganismos Los resultados demostraron polimorfismos en los sitios de
corte de algunas de las enzimas utilizadas dos de las cuales permiten distinguir los tres
principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico De esta forma se confirmoacute que la
digestioacuten con la enzima Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos
del Tipo III mientras que el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los
Tipos I y II La prueba realizada en este estudio puede ser implementada con variaciones
como el uso de digestiones dobles y la utilizacioacuten de geles de poliacrilamida que generen
mayor resolucioacuten de los fragmentos de restriccioacuten de bajo peso molecular sin embargo el
esquema aquiacute presentado ofrece simplicidad y eficiencia en la separacioacuten de los tres Tipos
sin la necesidad de contemplar todos los productos de la digestioacuten Adicionalmente a esta
prueba y con base en los resultados de las secuencias obtenidas en esta investigacioacuten y en
aquella de Gil et al (2011) nuestro grupo se encuentra disentildeando y evaluando pruebas de
PCR y RT-PCR en tiempo real para la deteccioacuten asintomaacutetica de Sss y de su virus asociado
PMTV Se espera que los resultados generados en estas investigaciones sean incorporados
raacutepidamente en los programas de manejo integrado de la Sarna polvosa en Colombia y
otros paiacuteses latinoamericanos afectados por esta enfermedad como Venezuela (Rodriacuteguez et
al 2009) y Costa Rica (Montero-Astua et al 2008)
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten el Politeacutecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid
Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo
por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el Departamento de Narintildeo
61
REFERENCIAS
Bell KS Roberts J Verrall S Cullen DW Williams NA Harrison JG Toth IK Cooke D
Duncan JM Claxton JR 1999 Detection and quantification of Spongospora subterranea
fsp subterranea in soils and on tubers using specific PCR primers European Journal of
Plant Pathology 105 905-915
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid
diagnostic test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European
Journal of Plant Pathology 131 277-287
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47 759-766
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33 69-84
62
Gilchrist E 2009 Alternativas para el manejo integrado de la Sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) Tesis de Doctorado en Ciencias Agrarias
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia sede Medelliacuten
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tubers by enzyme-linked immunosorbent assay Plant Pathology 42
181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato - A review
Plant Pathology 461-25
Hincapieacute LA 2006 Evaluacioacuten de la variabilidad molecular de Spongospora subterranea
(Wallroth) Lagerheim f sp subterranea en las principales zonas paperas de Colombia
Tesis de Maestriacutea en Biotecnologiacutea Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia sede Medelliacuten Colombia
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Merz U Fallon RE 2009 Powdery scab of potato-increased knowledge of pathogen
biology and disease epidemiology for effective disease management Potato Research
5217-37
Montero-Astua M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
63
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006 Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea f sp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la Sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista de la Facultad de Agronomiacutea Universidad del Zulia 26 508-531
Salazar LF 2006 Emerging and Re-emerging Potato Diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop - top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia Sede Bogotaacute
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea and quantification in soil Plant Pathology 45 884-895
64
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2005 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165875-885
Zolan ME Pukkila PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinereus
Molecular and Cellular Biology 6 195-200
65
41 Anexos
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp subterranea
en plantas de papa de Colombia a Quistosoros obtenidos de suelo b Plasmodios
formados en raiacutez de tomate (Solanum esculentum) c Lesiones tempranas producidas por
Sarna polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro d Lesiones tardiacuteas producidas por Sarna
polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro e f Agallas formadas en raiacuteces de S phureja
var Criolla Colombia
d
e f
c
a b
66
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja var Criolla
Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos infestados con Spongospora
subterranea f sp subterranea
67
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o raiacuteces de
plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea
MUESTRA A260 A280 RELACIOacuteN
260280
CONCENTRACIOacuteN
de ADN ng microl
AB1 0806 0465 173 403
AB2 0421 0244 172 21
Se7 0276 0149 184 138
Se8 0743 0415 179 371
MA11 2244 1366 164 1122
MA61 0277 0158 176 139
MA39 2135 1512 141 1067
MA56 0823 0361 228 412
MA60 021 0101 208 105
68
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos agallas o raiacuteces
de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana Carril 1 Marcador de peso 100 pb carril 2-
4 muestras MA16 MA17 MA18 MA11 MA39
500 pb
1 2 3 4 5 6
69
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora
subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8
70
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la regioacuten ITS del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp subterranea de Colombia
71
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb) a partir de ADN
de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum tuberosum S phureja y Nicotiana
benthamiana con presencia de quistosoros de Spongospora subterranea fsp subterranea
de cultivos de papa de los departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1
Marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas) carriles 2 a 6 muestras SE10 SE11
SE13 SE18 carril 7 control negativo
500 pb
100 pb
390 pb
1 2 3 4 5 6 7
72
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia
ANTIOQUIA CUNDINAMARCA
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE13 Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro SE8 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE18 La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro SE81 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
32UN La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE9 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
33UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE91 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34UN La Unioacuten Raiacutez accesioacuten C131-R2 SE12 Zipaquiraacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
35UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE14 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
80C La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE15 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Pastusa
Suprema
79C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE16 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
78C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE17 Villapinzoacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro
35 COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE19 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34COL La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE20 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
32COL La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum SE21 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
30COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 4fb Ventaquemada Raiacutez S tuberosum
29COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 5fb Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum
12fb La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 9fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
11fb La Unioacuten Raiacutez S tuberosum 10fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
1MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
ICA Nevada MA20 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
7MR Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro MA21 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
8MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA22 Villapinzoacuten
Raiacutez S tuberosum var ICA Pastusa Suprema
9MR La Unioacuten Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA23 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
11MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA24 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
12MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA25 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
13MR Santa Rosa Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA50 Desconocido Tubeacuterculo S tuberosum
14MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA51 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB2 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C87SJ MA52 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
73
AB3 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C81SJ MA53 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB4 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3SJ MA54 Tabio Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB6 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C8C MA55 Tabio Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB7 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3C MA56 Zipaquiraacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia
AB8 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA57 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA1 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA58 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA2 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA59 Villapinzoacuten
Tubeacuterculo S tuberosum var Diacol Capiro
MA41 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA60 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
BOYACAacute NARINtildeO
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE10 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE7 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE101 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
SE11 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 37COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE22 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 36COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
SE23 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA27 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE24 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA28 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
3fb Tunja Raiacutez S tuberosum MA31 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB1 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA32 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB9 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA33 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB10 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA34 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA35 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA3 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA36 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA4 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA37 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA5 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA38 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA7 Siachoque Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA39 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA9 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA40 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA11 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA61 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA62 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA14 Tunja Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA64 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA15 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA65 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA16 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA66 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA17 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA67 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
74
benthamiana
MA18 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA68 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA19 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA69 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA42 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA70 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA43 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA44 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA72 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA45 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA73 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA46 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA75 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA49 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA76 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA77 Ipiales Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
75
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) de cultivos de papa de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Como grupos externos de anaacutelisis se presentan
secuencias de otras especies de plasmodiofoacuteridos Meacutetodo de maacutexima parsimonia
utilizando la opcioacuten Heuristic search del programa PAUP 40b Los valores de Bootstrap (gt
80) se indican en la parte inferior de las ramas En letras mayuacutesculas se presentan las
denominaciones de los clados y subclados Adicionalmente se indican los grupos que
representan los Tipos de Sss
76
Sss TIPO I
395 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
MspI TaqI
cccgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgttttcgg base
pairs
gggcccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcaaaagcc 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
atactgaacttactaaagtggatcatttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgat base
pairs
tatgacttgaatgatttcacctagtaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgcta 76 to
150
EcoRI
gaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagtt base
pairs
cttcttgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaa 151
to 225
Hin6I TaqI EcoRV MspI
gcgctttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccgtgtgcgtg base
pairs
cgcgaaagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcggcacacgcac 226
to 300
Bsp143I MspI Hin6I
aaggggactctgagctctggtcggtccatggcttgaaagatcatgcaacccggtgcgcgtctctggcttctgatt base
pairs
ttcccctgagactcgagaccagccaggtaccgaactttctagtacgttgggccacgcgcagagaccgaagactaa 301
to 375
cgtctctaaccattggcgtg base pairs
gcagagattggtaaccgcac 376 to 395
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 2 97 340 gatc More info
EcoRI 1 190 gaattc More info
EcoRV 2 130 238 gatatc More info
Hin6I 2 226 355 gcgc More info
MspI 3 2 281 350 ccgg More info
TaqI 2 49 232 tcga More info
Tru1I 2 102 119 ttaa More info
77
Sss TIPO II
390 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
TaqI
cctgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgtattact base
pairs
ggacccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcataatga 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
gaacttactaaagtggatcgtttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgatgaaga base
pairs
cttgaatgatttcacctagcaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgctacttct 76 to
150
EcoRI Hin6I
acgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagttgcgct base
pairs
tgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaacgcga 151
to 225
TaqI EcoRV MspI
ttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccctgtgcgtggaagg base
pairs
aagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcgggacacgcaccttcc 226
to 300
MspI Hin6I
ggactatgagctctggtcggtccatggcttgaaagattatccaaccggtgcgcgtctctggcttctgattcgtct base
pairs
cctgatactcgagaccagccaggtaccgaactttctaataggttggccacgcgcagagaccgaagactaagcaga 301
to 375
ctanccattggcgtg base pairs
gatnggtaaccgcac 376 to 390
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 1 92 gatc More info
EcoRI 1 185 gaattc More info
EcoRV 2 125 233 gatatc More info
Hin6I 2 221 350 gcgc More info
MspI 2 276 345 ccgg More info
TaqI 2 49 227 tcga More info
Tru1I 2 97 114 ttaa More info
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos de S
subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I MspI TaqI y
Tru1I mediante el programa Web-cutter
78
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de aislamientos
de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en Colombia a partir de
anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal
GENOTIPO RFLPacutes MUESTRAS PROPORCIOacuteN
()
1
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185 EcoRV 2 125 233
Hind6I 2 221 351
MspI 2 276 346 TaqI 2 227 Tru1I
2 97 114
AB12 34UN 16
2
Bsp143I 1 93 EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277 347 TaqI 1 49 228
Tru1I 2 98 115
32UN 78C 16
3
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
11MR 08
4
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
9MR 08
5
Bsp143I 2 96 339 EcoRI 1 189
EcoRV 2 129 237
Hind6I 2 225 354
MspI 2 280 349 TaqI 1 231 Tru1I
2 101 118
8MR 13MR 16
79
6
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190
EcoRV 2 130 238 Hind6I 2 226 355
MspI 2 281 350
TaqI 1 232 Tru1I
2 102 119
MA12 08
7
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
MA37 SE7 SE8 SE9 SE10
SE11 SE12 SE13 SE14 SE15 SE16 80C 79C 37COL 36COL
35COL 34COL 32COL 30COL
12FB 10FB 11FB 9FB 1MR
SE71 SE81 SE91 SE101 AB2 AB3 AB4 AB6 AB7 MA1 MA7
MA9 MA14 MA20 MA21 MA22
MA23 MA24 MA25 MA28 MA31 MA32 MA33 MA34
MA35 MA36
393
8
Bsp143I 2 92 309 EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 289 351 MspI 2 276
346 TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
MA40 08
9
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 282 351 MspI 3 2 276
346 TaqI 1 227
Tru1I 2 97 114
MA43 08
10
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 3 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
29COL 33UN MA4 MA41
MA42 MA51 MA52 MA55
MA56 MA57 MA58 MA59 MA60 MA62 MA64 MA65
MA68 MA69 MA71 MA72
MA76 SE19 SE20 SE21 SE22 3FB 4FB 14MR
22
11
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190 EcoRV 2 130 238
Hind6I 2 226 355
MspI 3 2 281 350 TaqI 2 49 232
Tru1I 2 102 119
SE17 12MR AB1 AB8 MA2
MA15 MA16 MA17 MA18 MA19 MA45 MA46 MA49
MA50 MA53 SE23 SE24
134
80
12
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233 Hind6I 2 221 350
MspI 2 276 345
TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
SE18 35UN 7MR AB9 AB10
MA3 MA4 MA5 MA11 MA27 MA38 MA39 MA44 MA61
MA66 MA67 MA70 MA73
MA75 MA77 5FB
165
81
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluyen a S nasturtii y Plasmodiophora brassicae
como especies externas de anaacutelisis
SECUENCIA SE17 SE18 MA37 29COL AY604172 AY604171 AF310907 EF593112 AF102820 AF102819 EF195335 AF104308
SE17 Sss
Colombia
Tipo I
ID 0962 0957 0952 0964 0992 0564 0959 0992 0964 0586 0959
SE18 Sss
Colombia
Tipo II
0962 ID 0979 0974 0992 0959 0574 0987 0959 0992 0584 0987
MA37 Sss
Colombia
Tipo III
0957 0979 ID 0984 0982 0954 0579 0977 0954 0982 0598 0977
29COL Sss
Colombia
Tipo III
0952 0974 0984 ID 0982 0959 0579 0977 0959 0982 06 0977
AY604172
Sss EEUU
TipoII
0964 0992 0982 0982 ID 0967 0577 0994 0967 1 0589 0994
AY604171
Sss EEUU
Tipo I
0992 0959 0954 0959 0967 ID 0564 0962 1 0967 059 0962
AF310907 S
nasturtii 0564 0574 0579 0579 0577 0564 ID 0579 0564 0577 0566 0574
EF593112 Sss
Suiza 0959 0987 0977 0977 0994 0962 0579 ID 0962 0994 0589 0989
AF102820
Sss Escocia 0992 0959 0954 0959 0967 1 0564 0962 ID 0967 059 0962
AF102819
Sss Nueva
Zelanda
0964 0992 0982 0982 1 0967 0577 0994 0967 ID 0589 0994
EF195335 P
brassicae 0586 0584 0598 06 0589 059 0566 0589 059 0589 ID 0589
AF104308
Sss Reino
Unido
0959 0987 0977 0977 0994 0962 0574 0989 0962 0994 0589 ID
82
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las enzimas de restriccioacuten Bsp143I y
Hin6I que permiten determinar los tres Tipos de Sss identificados en este trabajo En la
izquierda se indican los genotipos representativos de cada Tipo (ver Tabla 3) y entre
pareacutentesis los sitios de corte referidos al Tipo I
83
Figura 410 (A) Gel de RFLPs con la enzima Hind6I con tres muestras de los Tipos I II y
III de Sss detectados en el estudio 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir Tipo
I 3-5 Digestioacuten de muestras Tipo I 6 Producto sin digerir Tipo II 7-9 Digestioacuten de
muestras Tipo II 10 Producto sin digerir Tipo III 11-13 Digestioacuten de muestras Tipo III
14 Marcador de peso 100 pb (B) Gel de RFLPs con la enzima Bsp143I con una muestra
del Tipo I y II de Sss 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir del Tipo II 3 Sin
muestra 4 Digestioacuten de muestra Tipo I 5 Digestioacuten de muestra Tipo II 6 Marcador de
peso 100 pb Con flechas se marcan los productos digeridos que presentan resolucioacuten
apropiada en geles de agarosa al 25
A B
84
5 Artiacuteculo 2 Variabilidad geneacutetica de los ARN 2 y 3 de aislamientos
Colombianos de PMTV
Genetic variability of RNA 2 and 3 in Colombian isolates of PMTV
Ineacutes Osorio Giraldo1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
1 Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Facultad de Ciencias Universidad Nacional
de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia 2
Laboratorio de Microbiologiacutea Industrial
Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia
Formato de la Revista Agronomiacutea Mesoamericana ISSN 1021-7444
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
El PMTV es un virus prevalente en los cultivos de papa de los Andes Sin embargo en esta
regioacuten es muy bajo el conocimiento de su biologiacutea patogenicidad y diversidad Con el fin
de suplir la falta de informacioacuten sobre este uacuteltimo aspecto en esta investigacioacuten se
obtuvieron secuencias de los genes de la caacutepside viral (CP) y del TGB2 de cepas de PMTV
de los cuatro principales departamentos cultivadores de papa en Colombia Adicionalmente
dos de los aislamientos fueron secuenciados en gt83 de sus ARN 2 y 3 Los anaacutelisis
filogeneacuteticos basados en CP indicaron la presencia de dos clados El primero contiene cepas
de referencia mundial de PMTV en conjunto con 19 de las cepas de este estudio mientras
que el segundo clado soacutelo agrupoacute cepas de Colombia las que compartieron menos de 76
de identidad con el primer grupo Esto posiblemente indica la ocurrencia de una nueva
especie de pomovirus aunque se requiere la secuenciacioacuten de todo el genoma para
confirmar dicha hipoacutetesis taxonoacutemica El anaacutelisis del TGB2 generoacute un solo clado
agrupando indistintamente las cepas colombianas de PMTV con las de otros paiacuteses El
anaacutelisis de los segmentos 2 y 3 del genoma viral indicoacute que los aislamientos colombianos
compartiacutean gt94 de identidad con las secuencias de cepas de Repuacuteblica Checa y Suecia
85
Se espera que estos hallazgos sean utilizados para el disentildeo de herramientas de diagnoacutestico
del PMTV en los Andes que apoyen los programas de certificacioacuten de tubeacuterculo-semilla y
mejoramiento geneacutetico de papa
Palabras clave Potato mop-top virus RT-PCR Secuenciacioacuten Solanum tuberosum
Abstract
PMTV is a prevalent virus in potato crops in the Andes However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words Potato mop-top virus RT-PCR Sequencing Solanum tuberosum
86
INTRODUCCIOacuteN
El Potato mop-top virus (PMTV) es la especie tipo del geacutenero Pomovirus y recientemente
se ha clasificado en la nueva familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Su rango de
hospedantes incluye un nuacutemero limitado de especies vegetales de las familias Solanaceae y
Chenopodiaceae siendo la papa (Solanum tuberosum L) su principal hospedante desde el
punto de vista econoacutemico (Kirk 2008) Es transmitido por tubeacuterculo semilla infectado y
por zoosporas del plasmodiofoacuterido Spongospora subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp
subterranea Tomlinson (Sss) agente causal de la sarna polvosa de la papa (Harrison y
Jones 1970) Su presencia se ha registrado principalmente en regiones con climas huacutemedos
y friacuteos como el Norte de Europa (Noruega Suecia Dinamarca y Finlandia) las islas
Britaacutenicas (Irlanda Inglaterra Escocia) Norte Ameacuterica (EEUU y Canadaacute) Japoacuten las zonas
montantildeosas de Costa Rica y los Andes Surameacutericanos (Peruacute Colombia Bolivia) (Xu et al
2004 Salazar 2006 Montero-Astuacutea et al 2008 Nakayama et al 2010 Santala et al
2010) A pesar de que se considera que el PMTV es originario de los Andes su presencia
en Colombia soacutelo fue detectada en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) y reconfirmada con base en
anaacutelisis de secuencias de la caacutepside viral (CP) y el segundo gen del triple bloque (TGB2) en
2011 (Gil et al 2011) Este virus puede causar peacuterdidas de hasta 26 en el rendimiento del
cultivo de la papa lo que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera
ascender a rangos de 50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 2000) Sin
embargo dichos niveles de peacuterdidas dependen de la susceptibilidad de las variedades
cultivadas (Xu et al 2004 Santala et al 2010) las variantes del patoacutegeno (Harrison y
Jones 1970 Nielsen y Nicolaisen 2003) y fundamentalmente de las condiciones
medioambientales prevalentes durante su infeccioacuten (Davey 2009 Latvala-Kilby et al
2009 Roos et al 2011)
El PMTV es un virus tripartita con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20 nm en diaacutemetro y
longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm Cada partiacutecula contiene una moleacutecula
de ARN de cadena sencilla con polaridad positiva (ARNss+) con tamantildeos de 6043 nt (ARN
1) 3134 nt (ARN 2) y 2964 nt (ARN 3) El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene
motivos de metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del
codoacuten de finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999 2003) El
87
ARN 2 contiene un ORF para la proteiacutena de la caacutepside de 20 kDa Tambieacuten codifica para
una proteiacutena de 90 kDa generada por lectura continua (readthrough CP-RT) gracias a la
presencia de un codoacuten de finalizacioacuten amber en el gen CP Diversos estudios han indicado
que esta proteiacutena RT esta involucrada en la transmisioacuten por Sss del PMTV siendo incluso
posible su localizacioacuten asociada con los extremos de las partiacuteculas virales mediante
anaacutelisis de inmuno-marcaje (Cowan et al 1997) En este sentido Torrance et al (1999)
demostraron que una delecioacuten de 109 nt en el extremo 3acute de las secuencias del dominio CP-
RT de aislamientos de PMTV de Escocia estaban asociadas con su imposibilidad de
transmisioacuten por Sss
El ARN 3 codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Los
primeros tres presentan secuencias similares a proteiacutenas del triple bloque de genes (TGB)
involucradas en el movimiento de ceacutelula a ceacutelula de algunos virus de plantas Las TGBs de
los pomovirus hacen parte de la clase 1 o grupo hordei de estas proteiacutenas en conjunto con
las codificadas por otros geacuteneros de la familia Virgaviridae y del geacutenero Hordeivirus Se
cree que TGB2 y TGB3 asisten a TGB1 en su funcioacuten de trasportar el genoma viral a traveacutes
de los plasmodesmos de las ceacutelulas vegetales (Lim et al 2008 2009) Recientemente se
encontroacute mediante fusioacuten de la regioacuten N-terminal de TGB1 con la proteiacutena verde
fluorescente (GFP por sus siglas en ingleacutes) que TGB1 se localizaba en la regioacuten nucleolar
y de microtuacutebulos infirieacutendose ademaacutes que aparentemente esta proteiacutena interactuacutea con los
factores de transcripcioacuten del hospedante (Wright et al 2010)
La cuarta proteiacutena (8 kDa) es rica en cisteiacutena (CRP) y aparentemente esta involucrada en el
movimiento sisteacutemico del PMTV en las plantas y en la expresioacuten de siacutentomas necroacuteticos en
hospedantes experimentales Interesantemente otros pomovirus no codifican para una
proteiacutena 8 kDa como la presente en PMTV y sus niveles de identidad con CRPs presentes
en otros geacuteneros como Hordeivirus Tobravirus y Furovirus son muy bajos (Lukhovitskaya
et al 2005)
Los siacutentomas que causa PMTV en papa se manifiestan por agrietamientos en la superficie
de los tubeacuterculos pudiendo estar acompantildeados por la presencia de anillos necroacuteticos en la
88
corteza o incluso la parte interna del mismo siacutentoma conocido como umlSprainguml (Calvert y
Harrison 1966) En las hojas de las plantas infectadas se puede observar un moteado en
forma de V tipo ldquoaucubardquo ademaacutes de la distorsioacuten del follaje y el acortamiento de los
entrenudos (umlmop-topuml) (Carnegie et al 2009) En la regioacuten Andina no es frecuente
observar la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos ni los moteados tipo umlaucubauml lo que no
permite asociar siacutentomas especiacuteficos con la presencia de PMTV situacioacuten que explica en
buena parte el porqueacute del desconocimiento de su efecto sobre las variedades sembradas en
esta regioacuten suramericana (Tenorio et al 2006 Gil et al 2011) Sin embargo seguacuten Salazar
(2006) el PMTV es uno de los virus prevalentes en el cultivo de la papa en los Andes
Adicionalmente a las caracteriacutesticas criacutepticas del PMTV existen dificultades teacutecnicas para
el diagnoacutestico de este virus debido a su distribucioacuten erraacutetica en las plantas que incluso
puede diferir entre yemas y brotes del mismo tubeacuterculo infectado y a los bajos tiacutetulos
virales que se encuentran en el tejido foliar Esto conduce a la generacioacuten de falsos
negativos por diferentes teacutecnicas de diagnoacutestico (Cerovska et al 2003 Kirk 2008) Dichas
teacutecnicas incluyen la observacioacuten visual de siacutentomas bioensayos con plantas indicadoras
como Chenopodium amaranticolor Nicotiana benthamiana N debneyi y N tabacum
(Jeffries 1998) que requieren largos periodos de tiempo para su lectura pruebas de ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay) con anticuerpos mono y policlonales (Torrance et
al 1993 Cerovska et al 2003) RT-PCR IC RT-PCR y qRT-PCR con cebadores
especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del genoma viral (Arif et al 1995 Mumford et
al 2000 Latvala-Kilby et al 2009 Davey 2009) Asiacute mismo se han empleado otras
teacutecnicas basadas en hibridizacioacuten especiacutefica (Ryazantsev y Zavriev 2009) y microplacas de
hibridizacioacuten con RT-PCR (Nakayama et al 2010) para la deteccioacuten de PMTV
En Colombia Gil et al (2011) utilizaron la teacutecnica de RT-PCR con los cebadores
PMTVF4-PMTVR4 y H360-C819 dirigidos a los genes TGB2 y CP respectivamente para
la deteccioacuten del virus en los principales departamentos productores de papa del paiacutes sin
embargo utilizaron un muy bajo nuacutemero de aislamientos virales Maacutes recientemente Gallo
(2012) obtuvo anticuerpos policlonales dirigidos a peacuteptidos sinteacuteticos con alta capacidad
89
inmunogeacutenica identificados a partir de la modelacioacuten de la caacutepside viral de aislamientos
colombianos de PMTV probando su efectividad en pruebas de ELISA y Dot-blot
A pesar de que aparentemente existe una amplia gama de teacutecnicas para la deteccioacuten del
PMTV eacutestas presentan la limitacioacuten de estar basadas en un bajo nuacutemero de aislamientos
virales especialmente del Norte de Europa (Latvala-Kilby et al 2009) siendo auacuten menor el
nuacutemero de cepas andinas para las que existen secuencias disponibles en las bases de datos
moleculares o cuyos viriones han sido purificados para la generacioacuten de pruebas
seroloacutegicas (Gil et al 2011)
A nivel mundial se ha reportado la presencia de bajos niveles de variacioacuten entre genotipos
de PMTV (Mayo et al 1996 Santala et al 2010) Latvala-Kilby et al (2009) comparando
secuencias de CP de 23 aislamientos de Finlandia y Letonia con respecto a secuencias
disponibles en GenBank para cepas de Escocia Dinamarca Suecia y Repuacuteblica Checa
encontraron identidades superiores al 98 entre eacutestas con soacutelo siete diferencias a nivel de
aminoaacutecidos (aa) entre todas las comparaciones Las evaluaciones de secuencias de CP-RT
tambieacuten presentaron altos niveles de identidad (98 a 100) aunque en este caso 24
posiciones en las secuencias de aa fueron variables Resultados similares reportaron Mayo
et al (1996) cuando compararon las secuencias de CP de tres aislamientos de Escocia y
ocho de Peruacute mientras que Xu et al (2004) encontraron que seis de las secuencias de CP
de aislamientos de PMTV de Norteameacuterica presentaron identidades superiores al 97 con
respecto a secuencias de aislamientos de diferentes paiacuteses de Europa A pesar de estos bajos
niveles de variacioacuten cuando se realizan anaacutelisis filogeneacuteticos con dichas secuencias se han
encontrado dos clados que dividen los aislamientos de PMTV y que pueden ser
identificados por anaacutelisis de RFLPs (Nielsen y Nicolaisen 2003) Sin embargo dichos
grupos aparentemente no estaacuten relacionados con diferencias en sus niveles de
patogenicidad sobre variedades de papa (Latvala-Kilby et al 2009)
En Colombia Veacutelez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo que presentaba altos niveles de identidad con
respecto a aislamientos de Europa y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por
90
aislamientos colombianos Esta situacioacuten fue confirmada posteriormente por Gil et al
(2011) quienes encontraron que las variantes de PMTV tan soacutelo presentaban un 76 y
86 de identidad para CP y TGB2 respectivamente con respecto a los aislamientos
mundialmente reportados de PMTV Sin embargo dichos anaacutelisis fueron conducidos con un
bajo nuacutemero de secuencias (cuatro para CP y tres para TGB2) debido a las dificultades
experimentales que representa el trabajo con este virus (bajo tiacutetulo en plantas de papa
distribucioacuten erraacutetica ausencia de cebadores especiacuteficos para cepas andinas etc)
Por lo anterior esta investigacioacuten se planteoacute con el propoacutesito de ampliar el nuacutemero de
secuencias de CP y TGB2 de aislamientos de PMTV obtenidos en diferentes regiones
cultivadoras de papa de Colombia de manera que fuera posible determinar si la presencia de
las variantes de este virus corresponde a una situacioacuten generalizada o por el contrario responde
al efecto de muestra dado el bajo nuacutemero de cepas analizadas por Veacutelez (2007) y Gil et al
(2011) Adicionalmente se realizoacute la secuenciacioacuten de una gran parte del ARN 2 y ARN 3 de
una cepa obtenida en el Departamento de Antioquia y otra en el Departamento de Boyacaacute
(Colombia) realizaacutendose un anaacutelisis de variacioacuten con respecto a las secuencias de referencia de
genomas completos disponibles en las bases de datos moleculares
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y preparacioacuten de muestras
Se obtuvieron muestras de raiacuteces y tubeacuterculos de papa con siacutentomas de sarna polvosa asiacute
como de suelos de lotes con reportes de la presencia de Sss en las zonas productoras de
papa de los municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio
Subachoque y Villapinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute y Oicataacute (Boyacaacute) y
Pasto e Ipiales (Narintildeo) Para la separacioacuten de los quistosoros del suelo se siguioacute la
metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la cual las muestras de suelo (500g) son
pasadas por un juego de tamices de 100 y 25 microm Los quistosoros obtenidos fueron
inoculados en Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo
para incrementar el inoacuteculo de PMTV a partir de la infeccioacuten de su vector Sss (Veacutelez
2007) El material vegetal fue mantenido en casa de malla en el Centro Experimental
91
Paysanduacute ubicado en el corregimiento de Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB
2550 msnm temperatura media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) Tres
meses despueacutes de la siembra se recolectaron las hojas y las raiacuteces de las plantas sentildeuelo
para su procesamiento en el laboratorio
Secuenciacioacuten de CP y TGB2
Se obtuvo el ARN total de plantas de N benthamiana y S phureja mediante el kit RNeasy
plant mini (Qiagen EEUU) a partir de 100 mg de tejido utilizando 450 μL de buffer RLT
para tejido foliar o RLC para raiacuteces y 45 μL de β-mercaptoetanol y siguiendo las
instrucciones del fabricante Al finalizar el procedimiento el ARN obtenido se eluyoacute en 40
μL de agua destilada esteacuteril tratada con DEPC
Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos En las reacciones de
retrotranscripcioacuten se utilizoacute un volumen final de 20 microL incluyendo 05 microL de agua
destilada esteacuteril 15 microL de PBST (05) 4 microL de buffer RT (5X) 4 microL de MgCl2 (25
mM) 2 microL de dNTPs (10 mM) 2 microL de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de
ARNasas (40UmicroL) 05 microL de enzima M-MuLV Transcriptasa Reversa (20 UmicroL)
(Fermentas Lituania) y 5 microL de ARN o alternativamente una dilucioacuten 15 El programa de
RT fue de 37degC por 60 min seguido de 70degC por 10 min para inactivar la enzima Las
muestras se almacenaron a 4degC hasta su uso posterior
Para las reacciones de PCR se emplearon los cebadores especiacuteficos H360 (5rsquo CAT GAA
GGC TGC CGT GAG GAA GT 3rsquo) y C819 (5rsquo CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA
CC-3rsquo) (MacKenzie 1996) para amplificar una regioacuten de 459 pb del gen CP entre las
posiciones 385 y 844 del genoma viral (Figura 51) y PMTVF4 (5rsquo CAG CAA CCA CAA
ACA GAC AGG 3rsquo) y PMTVR4 (5rsquo AGC CAC TAA CAA AAC ATACTGC 3rsquo) para
obtener amplicones de 415 pb del TGB2 entre las posiciones 1726 y 2141 del ARN 2 (Xu
et al 2004) (Figura 52) Para algunos aislamientos en los que se dificultaba la
amplificacioacuten del TGB2 se utilizaron los cebadores PMTV5 (5 GGT GAA CAC GAG
GAC AAG GT 3) y PMTV7 (5 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 3) (Lambert et al
2003) que amplifican un fragmento de 646 pb y se extienden entre las posiciones del
92
genoma 1417 a 2063 Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 microL
incluyendo 158 microL de agua destilada esteacuteril 25 microL de buffer de enzima (10X) 18 microL de
MgCl2 (25 mM) 05 microL de dNTPs (10 mM) 05 microL de cada cebador (10 microM) 02 microL de
Albuacutemina de suero bovino (20 mgml) (Fermentas) 02 microL de Taq ADN polimerasa (5
UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ADNc aunque en algunas ocasiones dada la falta de
amplicones fue necesario preparar diluciones de 15 110 o 125 de ADNc Las
amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra Alemania) y consistieron
de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 40 ciclos de 94degC por 30 s
53degC por 45 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10 min Luego de
la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se separaron por
electroforesis en gel de agarosa al 15 suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) y
su tamantildeo se verificoacute por comparacioacuten con el marcador de peso molecular Generuler 100
pb DNA ladder (Fermentas)
Los amplicones del tamantildeo esperado correspondientes al menos a cuatro aislamientos
representativos de cultivos de papa de cada uno de los cuatro departamentos bajo estudio
fueron purificados del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para realizar
su secuenciacioacuten directa en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores empleados en
la PCR y el kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied
Biosystems EEUU) Su corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism
3730xl (PE Applied Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur)
A partir de las secuencias obtenidas con cada cebador se construyeron las secuencias
consenso mediante el software BioEdit 606 (Hall 1999) y Chromas Lite (Technelysium
2009) Posteriormente se confirmoacute su origen viral por comparacioacuten con las bases de datos
moleculares con el programa BLASTn (httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) y
se obtuvieron secuencias de PMTV del GenBank de otras regiones del mundo para realizar
un anaacutelisis filogeneacutetico Para esto se generoacute un alineamiento mediante Clustal W (Larkin et
al 2007) del Software Bioedit 606 Los alineamientos fueron utilizados para construir una
una matriz de distancia geneacutetica utilizando el meacutetodo de Maacutexima verosimilitud basado en
el modelo de Tamura-Nei (1993) implementado en el software MEGA v40 (Tamura et al
93
2007) Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute un anaacutelisis de
Bootstrap con 1000 remuestreos (Felsenstein 1985)
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Con el fin de obtener un mayor nivel de informacioacuten sobre las caracteriacutesticas de los
segmentos ARN 2 y ARN 3 del genoma de aislamientos Colombianos de PMTV se realizoacute
un proceso de secuenciacioacuten con minado de cebadores previamente reportados para la
amplificacioacuten de diferentes regiones de cada uno de dichos segmentos (Tabla 51 Figura
53) y buscando que generaran traslape de secuencias de manera que fuera posible la
construccioacuten de un contig general para cada segmento Para esto se seleccionaron cuatro
cepas de PMTV representativas de cada uno de los departamentos bajo anaacutelisis Con cada
cepa se realizaron por lo menos dos amplificaciones con cada cebador de manera que las
secuencias reportadas correspondieran al consenso para cada amplicoacuten Los procedimientos
de extraccioacuten de ARN PCR y secuenciacioacuten fueron similares a los descritos anteriormente
aunque las RT se realizaron con la enzima Transcriptasa Reversa Maximareg (Fermentas)
que ofrece mayores niveles de estabilidad teacutermica (hasta 65degC) y eficiencia que las
transcriptasas reversas convencionales En este caso las reacciones de RT consistieron de
95 microL de agua libre de nucleasas 4 microL de buffer RT (5X) 1 microL de dNTPs (10 mM) 1 microL
de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de ARNasas (40UmicroL) 1 microL de enzima
Transcriptasa Reversa Maximareg (200 UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ARN para un volumen
final de 20 microL La incubacioacuten se realizoacute a 50degC por 30 min y la enzima se inactivoacute a 85degC
por 5 min
Las secuencias se editaron mediante el software Chromas Lite generaacutendose los consensos
con ambos cebadores usando el programa Bioedit 606 y se procedioacute al ensamblaje de los
contigs resultantes utilizando el programa CAP3 (Huang y Madan 1999) Posteriormente
se verificoacute el marco de lectura correcto utilizando el servidor de Expasy (Expasy Proteomic
Server httpwwwexpasychtoolsdnahtml) y se realizoacute su alineamiento con respecto a
los dos segmentos genoacutemicos de aislamientos cuyas secuencias completas se encontraban
disponibles en GenBank (DQ102381 DQ144451 AJ243719 AJ277556) (Sandgren et al
2001 Cerovska et al 2007)
94
Finalmente las secuencias de nt fueron traducidas a aa realizaacutendose comparaciones de
porcentajes de identidad y nuacutemero de posiciones variables a lo largo de las regiones bajo
estudio y generaacutendose aacuterboles filogeneacuteticos basados en los contigs obtenidos en la
investigacioacuten mediante el programa Mega v 40 bajo los paraacutemetros antes descritos
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Variabilidad geneacutetica de PMTV de Colombia
En total se obtuvieron 25 secuencias para la regioacuten amplificada de CP y 38 secuencias para
TGB2 Estas secuencias correspondieron a por lo menos cuatro aislamientos por cada
departamento bajo anaacutelisis (Tabla 52) De esta forma se aumentaron las secuencias
parciales de los genes CP y TGB2 de PMTV con respecto al trabajo reciente realizado por
nuestro grupo (Gil et al 2011) en donde soacutelo se obtuvieron cuatro y tres secuencias para
CP y TGB2 lo cual implica que las diferentes modificaciones realizadas a los
procedimientos necesarios para el estudio de este virus desde la forma de obtencioacuten de las
muestras hasta la purificacioacuten de los amplicones pasando por la eliminacioacuten de inhibidores
de las polimerasas resultaron altamente eficientes Esta situacioacuten abre la posibilidad de
plantear en el futuro proacuteximo un estudio de incidencia de PMTV basado en la deteccioacuten del
virus mediante RT-PCR con un muestreo estratificado en los diferentes pisos teacutermicos
donde se cultiva la papa en Colombia y realizando comparaciones con respecto a los
niveles de incidencia de Sss de manera que sea posible determinar la dimensioacuten de los
niveles de dispersioacuten de este virus en este paiacutes suramericano Un trabajo similar fue
realizado por Montero-Astuacutea et al (2008) en Costa Rica pero utilizando pruebas de ELISA
tanto para la deteccioacuten de Sss como de PMTV En este caso se encontroacute que el virus era
maacutes frecuentemente detectado en las regiones con mayores altitudes donde las condiciones
de alta humedad y bajas temperaturas aparentemente favorecen su infeccioacuten Sin embargo
es probable que la utilizacioacuten de pruebas de ELISA para la deteccioacuten del virus haya
conducido a una subestimacioacuten de los niveles de incidencia detectados en dicho trabajo
pues la distribucioacuten erraacutetica del virus su capacidad de movimiento ceacutelula-ceacutelula con ayuda
de proteiacutenas de movimiento codificadas por el TGB y no necesariamente en su forma
95
encapsidada y la utilizacioacuten de anticuerpos disentildeados a partir de cepas del norte de Europa
pueden influir negativamente en la deteccioacuten seroloacutegica del PMTV (Gallo et al 2012)
El anaacutelisis filogeneacutetico para CP incluyoacute 404 posiciones a partir de 46 secuencias 15 de las
cuales corresponden a aislamientos de referencia de Europa Asia y Norte Ameacuterica y las 4
previamente reportadas de aislamientos Colombianos por Gil et al (2011) El dendrograma
presentoacute dos grupos soportados por valores de bootstrap del 100 (Figura 54) El primer
clado agrupoacute todas las secuencias de referencia con 19 de los aislamientos Colombianos
obtenidos en este estudio y presentaron niveles de identidad superiores al 99 en todos los
casos (Tabla 53) Por otra parte el segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo seis de las aquiacute obtenidas y dos de las reportadas por Gil et
al (2011) Al interior de este clado se presentaron mayores niveles de variacioacuten (11 a
13) y su identidad con respecto a los miembros del primer clado fue de tan solo 76 La
secuencia de Beet Soil-Borne Virus de China utilizada como grupo externo de anaacutelisis se
ubicoacute en posicioacuten externa a los dos clados y compartioacute niveles de identidad inferiores al
59 con respecto a los aislamientos de PMTV
Estos resultados confirman los hallazgos de Veacutelez (2007) y Gil et al (2011) en referencia a
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que incluso bajo los paraacutemetros
definidos por Adams et al (2009) para la definicioacuten de especies al interior de la familia
Virgaviridae (ej cepas con identidades superiores a 80 y 90 a nivel de secuencias de CP
y del genoma completo respectivamente) podriacutea representar una nueva especie del geacutenero
Pomovirus (Familia Virgaviridae) hasta ahora no registrada en otros lugares del mundo Si
se considera que seis de las 25 secuencias de CP obtenidas en este trabajo correspondieron
a dicha variante es evidente que su presencia no es marginal en los cultivos de papa de
Colombia ya que para la muestra obtenida aunque evidentemente sesgada por la coleccioacuten
de suelos y tejidos con presencia de estructuras de Sss su proporcioacuten es del 23 La
diversidad entre aislamientos podriacutea deberse a que la regioacuten andina ha sido propuesta como
el centro de origen del PMTV (Mayo et al 1996)
96
Estos resultados representan un viraje con respecto a lo encontrado en los estudios de
variabilidad de PMTV con base en secuencias de CP de diferentes oriacutegenes geograacuteficos
por cuanto indistintamente se habiacutea encontrado que los niveles de identidad presentes en
este gen superaban el 98 en todas las comparaciones establecidas Asiacute por ejemplo
Latvala-Kirby et al (2009) al comparar 28 secuencias de Finlandia Letonia Escocia
Dinamarca Repuacuteblica Checa y Suecia encontraron que casi todas eran ideacutenticas siendo tan
soacutelo detectado un 2 de variacioacuten entre las maacutes distantes lo cual representa cambios en tan
soacutelo siete posiciones a nivel de la secuencia de aa de la proteiacutena resultante Similarmente
Xu et al (2004) reportaron que aislamientos de PMTV de Estados Unidos y Canadaacute eran
ideacutenticos y que eacutestos a su vez tan soacutelo diferiacutean en maacuteximo 3 de sus secuencias de CP con
respecto a cepas de Peruacute (Mayo et al 1996) Escocia y Escandinavia (Reavy et al 1997)
De esta forma de gran intereacutes resultaraacute emprender estudios que permitan evaluar las
diferencias bioloacutegicas de dichas variantes de PMTV sobre distintas variedades de papa e
incluso sobre hospedantes experimentales debido a que siacute existen diferencias de
patogenicidad entre aislamientos de PMTV que presentan tan bajos niveles de variacioacuten
(Nielsen y Nicolaisen 2003) es posible que dicho efecto sea auacuten mayor cuando se evaluacuteen
las variantes aquiacute reportadas
Con respecto al anaacutelisis filogeneacutetico basado en las secuencias de TGB2 se incluyeron 330
posiciones de 49 secuencias siete de las cuales fueron de aislamientos de referencia de
diferentes paiacuteses y tres de Colombia previamente analizadas por Gil et al (2011) El
dendrograma generado presentoacute un solo clado que incluyoacute todas las secuencias (Figura
55) las que compartieron niveles de identidad superiores a 98 (Tabla 54) Estos
resultados son un indicativo de que la variacioacuten encontrada entre aislamientos Colombianos
con respecto a CP no necesariamente se presentan a lo largo de los diferentes segmentos
genoacutemicos de PMTV y especiacuteficamente no se ven reflejadas en las secuencias de TGB2
que en los pocos estudios donde se ha secuenciado presenta niveles de identidad superiores
a 948 e incluso se ha encontrado que aislamientos de oriacutegenes geograacuteficos diferentes
pueden compartir hasta el 100 de identidad en la secuencia de aa para este gen (ej
aislamiento Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa y aislamientos 54-15 y 54-19 de
Dinamarca) (Cerovska et al 2007) Los altos niveles de conservacioacuten de este gen entre
97
aislamientos de PMTV que presentan diferencias en otras regiones del genoma como las
aquiacute encontradas para CP posibilitan que los cebadores utilizados para su amplificacioacuten
sean una herramienta uacutetil para el diagnoacutestico de este virus Asiacute por ejemplo Lambert et al
(2003) disentildearon los cebadores PMTV5 y PMTV7 dirigidos a amplificar una regioacuten de 646
pb comprendida entre TGB1 y TGB2 cuando reportaron por primera vez la presencia del
PMTV en EEUU Posteriormente Xu et al (2004) utilizaron la regioacuten que codifica para
TGB2 para el disentildeo de los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 en su estudio de evaluacioacuten de
distribucioacuten de PMTV en EEUU y Canadaacute
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Todos los cebadores utilizados en las reacciones de RT-PCR para amplificar diferentes
regiones de los ARN 2 y 3 del genoma de PMTV generaron los amplicones del fragmento
esperado en al menos un aislamiento evaluado Sin embargo en los aislamientos de Narintildeo
y Cundinamarca no fue posible la obtencioacuten de un contig completo para toda la regioacuten
secuenciada de ambos segmentos auacuten luego de diferentes intentos y modificaciones de los
paraacutemetros de la RT-PCR De esta forma para el caso de los aislamientos de Narintildeo no se
lograron amplicones del ARN2 con los cebadores PMTV759 ndash PMTV1552R PMTV759F
ndash 2017R y 1948F ndash 123end para el ARN 3 no fue posible obtener fragmentos con
RNA3F1ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end y F388 ndash PMTV7 Para el caso de
Cundinamarca no se lograron amplicones para el ARN 2 con PMTV759 ndash PMTV1552R y
PMTV759F ndash 2017R y para ARN 3 con RNA3F1 ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end
F388-PMTV7 Considerando que las variantes detectadas mediante la secuenciacioacuten de una
porcioacuten de CP presentaron bajos niveles de identidad con respecto a los genotipos
globalmente distribuidos de PMTV es posible que la ausencia de amplificacioacuten se deba a
diferencias en los sitios de reconocimiento de uno o ambos cebadores situacioacuten que impide
la amplificacioacuten de los fragmentos respectivos y por tanto su secuenciacioacuten posterior De
gran intereacutes seraacute continuar el proceso de secuenciacioacuten de dichas variantes para lo cual es
necesario la clonacioacuten de los respectivos cDNAs de cada segmento y el disentildeo de nuevos
cebadores especiacuteficos que permitan completar los vaciacuteos (gaps)
98
Por las razones antes expuestas para los anaacutelisis de secuencias de ARN2 y 3 soacutelo se
incluyeron los aislamientos representativos de Antioquia (Ant) y Boyacaacute (Boy) (Tabla
55) Para el ARN 2 se obtuvieron contigs de 2577 nt y 2584 para los aislamientos
Antioquia y Boyacaacute mientras que para el ARN 3 los contigs tuvieron una extensioacuten de
2617 y 2360 nt respectivamente Esto implica que para el ARN 2 se obtuvo un porcentaje
de cobertura del 83 de este segmento genoacutemico y del 87 para el ARN 3 en
comparacioacuten con el aislamiento Sw de PMTV (AJ243719 y AJ277556) (Sandgren et al
2001) En teacuterminos de aa los contigs del ARN2 incluyeron 150 de los aa de CP (posiciones
26 a 176) y 799 de CP-RT (posiciones 26 a 825) Para el ARN 3 se obtuvo la secuencia
completa de aa de TGB1 (463 aa) y TGB2 (119 aa) asiacute como 146 de 190 aa de TGB3
(posiciones 1 a 146) para el aislamiento de Boyacaacute y la totalidad de dicha proteiacutena para la
cepa de Antioquia Las demaacutes secuencias obtenidas corresponden a regiones UTR de los
extremos 3acute para el ARN 2 y 5acute para el ARN 3
Con el fin de realizar un anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las dos cepas obtenidas
con respecto al genoma de la cepa de PMTV de Suecia ndash Sw cuyo genoma completo estaacute
depositado en GenBank bajo el coacutedigo PRJNA14789 (Savenkov et al 1999 Sandgren et
al 2001) se incluyeron 1956 nt (651 aa) para CP-RT 531 nt (176 aa) para CP y 1392 (463
aa) para las tres regiones del TGB En teacuterminos generales se encontraron muy altos niveles
de identidad en las tres regiones analizadas siendo la CP la maacutes uniforme con 99 en la
secuencia de nt y 100 en aa para las tres cepas CP-RT presentoacute un nivel de identidad
para nt de 994 entre las cepas de Antioquia y Boyacaacute y del 975 - 976 con respecto a
la secuencia de referencia mientras que estos valores fueron superiores al 982 cuando se
comparoacute la secuencia de aa Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos compartieron
un 999 de identidad en nt y aa (Figura 56) Las pocas diferencias a nivel de aa
encontradas en este estudio correspondieron a cambios en 15 posiciones para el producto
del ARN 2 siendo la maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la posicioacuten 81
de CP Para el caso de TGB se encontraron 10 cambios a lo largo de las tres proteiacutenas
analizadas con la presencia de una delecioacuten en la posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
99
Por otra parte el anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2569 nt para ARN 2 con
secuencias de referencia de los aislamientos Corneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia (Figura 57) arrojoacute un dendrograma con dos
clados soportados por 100 de bootstrap separaacutendose los aislamientos de Colombia de los
de Europa sin embargo los niveles de identidad entre ambos grupos fueron muy altos
(gt975) (Tabla 56) Al calcular los niveles de diversidad (promedio del nuacutemero de
sustituciones de nucleoacutetidos por cada sitio) para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos
(dNS) se encontroacute una diversidad muy baja con tan soacutelo 0017 (SE= 0003) para dNS y
0009 (SE=0002) para dS La relacioacuten promedia entre dNSdS fue de 18 lo cual indica
que las cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten positiva para este componente del
genoma Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 3 mientras que para las
europeas fue de 12 La distancia geneacutetica o nuacutemero de sustituciones promedio por sitio
basada en el meacutetodo de Kimura-2 paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0015
El anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de
referencia de los aislamientos Korneta-Nemilkov (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia generoacute
un dendrograma con dos clados de aislamientos europeos mientras que los aislamientos
Colombianos se presentaron en forma individual sobre ramas soportadas por 100 de
bootstrap (Figura 58) A pesar de dichas agrupaciones los niveles de identidad entre todos
los aislamientos fueron superiores a 967 (Tabla 57) Al calcular los niveles de
diversidad para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos (dNS) se encontroacute una diversidad
muy baja para todos los aislamientos con tan soacutelo 0011 (SE= 0002) para dNS y 0044
(SE=0006) para dNS La relacioacuten media entre dNSdS fue de 025 lo cual indica que las
cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten estabilizadora en dicho segmento de ARN
Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 019 mientras que para los
aislamientos europeos fue de 039 La distancia geneacutetica basada en el meacutetodo de Kimura -2
paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0020 (SE 0002)
Los bajos niveles de variacioacuten encontrados en los anaacutelisis de genomas de PMTV (Savenkov
et al 1999 Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) y que nuevamente fueron inferidos
100
en el presente estudio para las cepas del clado que representa PMTV sensu stricto indican
que este virus se encuentra bajo fuertes presiones de seleccioacuten determinadas
presumiblemente por las propias caracteriacutesticas de su genoma el estrecho rango de
hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica por parte de su vector Sss (Kirk
2008 Santala et al 2010)
Para el primer caso la restriccioacuten selectiva se manifiesta por los bajos valores de dNSdS
calculados para dicho segmento y ocurre fundamentalmente al presentarse traslape de genes
en el ARN 3 Sin embargo para el ARN 2 dicha relacioacuten fue gt1 lo cual sugiere una
seleccioacuten positiva que puede explicarse por el hecho que este segmento presenta la
estrategia de supresioacuten del codoacuten de parada tipo amber para la traduccioacuten de las dos
proteiacutenas codificantes (CP y CP-RT) lo cual supone menos restricciones para la fijacioacuten de
mutaciones De otra parte la presencia de un estrecho rango de hospedantes para el virus
que se restringe a algunas especies de las familias Solanaceae y Chenopodiaceae (Kirk
2008) aunada a su transmisioacuten por Sss supone fuertes restricciones sobre los cambios en
las diferentes proteiacutenas del virus que interactuacutean con sus hospedantes y vectores lo cual
impide altas tasas de variacioacuten tales como las que presentan otros virus de ARNss(+) como
los potyvirus que en general tienen amplios rangos de hospedantes y cuya transmisioacuten por
aacutefidos poliacutefagos es del tipo no persistente (Hu et al 2009)
A pesar de los altos valores de uniformidad general encontrados de gran intereacutes resultoacute la
presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los aislamientos
colombianos de PMTV Por esto es necesario en el futuro evaluar el significado bioloacutegico
de dichos cambios por ejemplo si estan relacionadas con el efecto de las variedades nativas
de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas que las poblaciones de Sss
tienen en las regiones Andinas donde se presentan mayores niveles de variacioacuten que en
aquellas encontradas en las regiones cultivadoras de papa del hemisferio norte tal como lo
planteoacute Carrentildeo (2009) El efecto de estas inserciones y de diferentes sustituciones
detectadas en este trabajo sobre diferentes regiones de los segmentos de ARN 2 y 3
requiere un tratamiento futuro detallado a partir de anaacutelisis de mutantes y de sus efectos
sobre el ciclo infectivo viral
101
Esta investigacioacuten representa un avance importante en la caracterizacioacuten geneacutetica del
PMTV en las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia Sus resultados
confirman la presencia de dos genotipos principales de este virus en el paiacutes uno que
representa al PMTV sensu stricto destacado por presentar muy bajos niveles de variacioacuten
entre sus cepas y otro que representa una variante hasta ahora soacutelo identificada en
Colombia y que por presentar porcentajes de identidad inferiores al 80 con respecto al
grupo principal podriacutea representar una nueva especie de pomovirus que requiere ser
evaluada bioloacutegica patogeacutenica y molecularmente Finalmente es imperativo estudiar el
efecto de ambos genotipos virales sobre la produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de
papa en Colombia de manera que los organismos de sanidad vegetal estatales gremios de
productores y agroindustrias puedan valorar la necesidad de incluir la deteccioacuten del PMTV
en los programas de certificacioacuten de semilla y de mejoramiento geneacutetico de papa que se
adelantan en el paiacutes
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz
Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el
Departamento de Narintildeo
102
BIBLIOGRAFIacuteA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Arif M Torrance L Reavy B 1995 Acquisition and transmission of Potato mop-top
furovirus by a culture of Spongospora subterranea f sp subterranea derived from a single
cystosorus Annals of Applied Biology 126493-503
Calvert E Harrison BD 1966 Potato mop-top a soil-borne virus Plant Pathology
15134ndash139
Carnegie SF Saddler GS Peters JC 2009 Cultivar susceptibility to Potato mop-top virus
(PMTV) infection and symptom expression Aspects of Applied Biology 94 (Potatoes
Viruses and their Vectors) 51ndash54
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea
fsp subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Cerovska N Moravec T Rosecka P Filigarova M Pecenkova T 2003 Nucleotide
sequences of coat protein coding regions of six potato mop-top virus isolates Acta
Virologica 4737-40
Cerovska N Pecenkova M Foligarova M Dedic P 2007 Sequence analysis of the
Czech Potato mop-top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica
5261-64
103
Cowan GH Torrance L Reavy B1997 Detection of Potato mop-top virus capsid
readthrough protein in virus particles Journal of General Virology 781779-1783
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
Scotland
Felsenstein J 1985 Confidence limits on phylogenies an approach using the bootstrap
Evolution 39(4)783-791
Gallo Y 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea en Bioquiacutemica Facultad de Medicina Universidad Nacional
de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Gil JF Gutieacuterrez P Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
Hall TA 1999 BioEdit a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis
program for Windows 9598NT Nucleic Acids Symposium Series 4195-98
Harrison BD Jones RAC 1970 Host range and some properties of Potato mop-
top virus Annals Applied Biology 65393-402
104
Hu X Karasev AV Brown CJ Lorenzen JH 2009 Sequence characteristics of potato
virus Y recombinants Journal of General Virology 903033ndash3041
Huang X Madan A 1999 CAP3 A DNA sequence assembly program Genome
Research 9868-877
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 7147-57
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Kirk HG 2008 Mop-top virus relationship to its vector American Journal of Potato
Research 85 261-265
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003
First Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease
87872
Larkin M Blackshields G Brown NP Chenna R McGettigan PA McWilliam H
Valentin F Wallace IM Wilm A Loacutepez R Thompson JD Gibson TJ Higgins DG
2007 Clustal W and Clustal X version 20 Bioinformatics 23(21)2947-2948
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99519-531
105
Lim HS Bragg J N Ganesan U Lawrence DM Yu J L Isogai M Hammond J
Jackson AO 2008 Triple gene block protein interactions involved in movement of Barley
stripe mosaic virus Journal Virology 824991-5006
Lim HS Bragg J N Ganesan U Ruzin S Schichnes D Lee MY Vaira AM Ryu KH
Hammond J Jackson AO 2009 Subcellular localization of the Barley stripe mosaic virus
triple gene block proteins Journal Virology 839432-9448
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization
and effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal
of General Virology 862879-2889
MacKenzie DJ 1996 Detection of potato mop-top virus in leaf or tuber tissue by reverse
transcription-polymerase chain reaction Document CPHBT96K03 Centre for Plant Health
Agriculture and Agri-Food Canada Sidney BC Canada
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C
Salazar LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top
virus from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
Montero-Astuacutea M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U and Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Mumford RA Walsh K Barker I Boonham N 2000 Detection of Potato mop top virus
and Tobacco rattle virus using a multiplex real-time fluorescent reverse transcription
polymerase chain reaction assay Phytopathology 90448-453
106
Nakayama T Maoka T Hataya T Shimizu M Fuwa H Tsuda S Motoyuki M 2010
Diagnosis of Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-225
Nielsen SL Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups
within Potato mop-top virus Archives of Virology 148 381-388
Reavy B Sandgren M Barker H Heino P Oxelfelt P 1997 A coat protein transgene
from a Scottish isolate of Potato mop-top virus mediates strong resistance against
Scandinavian isolates which have similar coat protein genes European Journal of Plant
Pathology 103829-834
Roos J Hopkins R Kvarnheden A Dixelius C 2011 The impact of global warming on
plant diseases and insect vectors in Sweden European Journal of Plant Pathology 1299-19
Ryazantsev DY Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato viral pathogens Molecular Biology 43515-523
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M
Wieczorek P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-
Wiśniewska J Yin Z Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E
Taluntytė L Pūpola N Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E
107
Sozonov A Tikhonovich I Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam
G Valkonen JPT 2010 Detection distribution and control of Potato mop-top virus a soil-
borne virus in northern Europe Annals of Applied Biology 157163-178
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003
Potato mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich
protein are dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of
General Virology 841001-1005
Savenkov EI Sandgren MY Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Tamura K Dudley J Nei M Kumar S 2007 MEGA4 Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) software version 40 Molecular Biology and Evolution 241596-1599
Tamura K Nei M 1993 Estimation of the number of nucleotide substitutions in the
control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Molecular Biology and
Evolution 10512-526
Technelysium 2009 Chromas 20 Consultado el 15 de Febrero de 2009 Disponible en
httpwwwtechnelysiumcomauchromas_litehtml
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Research 83423-31
Torrance L Cowan GH Pereira LG 1993 Monoclonal antibodies specicreg for Potato
mop-top virus and some properties of the coat protein Annals of Applied Biology 122311-
322
108
Torrance L Cowan GH Sokmen M A Reavy B 1999 A naturally occurring deleted
form of RNA 2 of Potato mop-top virus Journal of General Virology 802211-2215
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop-top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI
Torrance L 2010 The N-Terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required
for nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant-Microbe Interaction 23(11)1486-1497
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top
virus in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
109
51 Anexos
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb) dirigidos al
gen de la caacutepside viral de PMTV a partir de muestras de tejido de raiacutez de plantas de N
benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea del
Departamento de Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador 100 pb Carril 2 BS8T Carril 3
BS9T Carril 4 BS4T Carril 5 BS11P Carril 6BS4T Carril 7 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7
500 pb
110
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb)
dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) de PMTV a partir de muestras de tejido de
raiacutez de plantas de N benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S
subterranea de los Departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador
100 pb Carril 2-4 Control positivo (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 5-7
SRL5 (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 8-10 SRL7 (ADN directo
110150 respectivamente) Carril 11-13 BS8T (ADN directo 110150
respectivamente) Carril 1415 BS4T1 (ADN directo y 110) Carril 16 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
500 pb
111
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten de los
segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV)
Cebador Secuencia 5acute- 3 Posicioacuten en el
genoma (nt) Referencia
RNA3 F1 CGCTCGAGTTTAGGTGACACTATAGGTATTTCA
ACTCTACCTAG 1 a 388
Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003 PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
PMTVF4 CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG 1726 a 1746 Xu et al
2004
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
F388
CGGGATCCGAAGTAGACCACACAGAGTG
1 a 388 Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011 PMTV1552R GCC AAT TGT CTC AAT CAT ACA CTG 1865 a 1888
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011
2017R CCA CTG CAA AAG AAC CGA TTT C Mumford
et al 2000
1948F GTG ATC AGA TCC GCG TCC TT Mumford et al 2000
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
112
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7 (2063 pb)
PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al ARN3 del genoma
del Potato mop-top virus (PMTV) a partir de tejido de raiacutez de plantas de N benthamiana y
S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea de cuatro departamentos de
Colombia Carril 1 Marcador 100 pb plus carriles 2-5 con cebadores RNA3F1-PMTV7
SRL5 SRL6 BS9T1 BS9T2 carril 6-12 con cebadores PMTV5-PMTV7 23T 24T
SRL5 SRL6 BS4T BS8T BS9T carril 13-20 con cebadores PMTVF4-123 end Villa1
NS19P1 23T 24T SRL4 SRL5 SRL6 BS4T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1000 pb 500 pb
113
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos cultivadores de papa de
Colombia
Gen CP Gen TGB2
ANTIOQUIA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
25 La Unioacuten Suelo S tuberosum 25(1) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL4 Santa Rosa S tuberosum var Diacol Capiro 25(2) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL4 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle La Unioacuten Suelo S tuberosum SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle1 La Unioacuten Suelo S tuberosum
Valle2 La Unioacuten Suelo S tuberosum
BOYACAacute
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
BS2T Oicataacute Suelo S tuberosum BS1P1 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4P Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS1P2 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4T Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS4T1 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS8T Soracaacute Suelo S tuberosum BS4T2 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS9T Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum BS8T1 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11P Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS8T2 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11T Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS9T1 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS12P Tunja Suelo con Pennisetum clandestinum BS9T2 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS9T3 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS11T1 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS11T2 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS13P Tunja Suelo S tuberosum
CUNDINAMARCA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
CS1T Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa CS1P1 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2P Subachoque Suelo S tuberosum CS1P2 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2T Subachoque Suelo S tuberosum CS2P Subachoque Suelo S tuberosum
CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Mad Madrid Suelo S tuberosum Villa1 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
114
Villa2 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
NARINtildeO
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
NS1P Pasto Suelo S tuberosum NS3P1 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS2T Pasto Suelo S tuberosum NS3P2 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro NS3P3 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8P Pasto Suelo S tuberosum NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8PF Pasto Suelo S tuberosum
NS10T Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS19P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS19P2 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P2 Ipiales Suelo S tuberosum
115
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de Potato
mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo
Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus (China)
Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte inferior de
las ramas
116
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
BS4T
Boyacaacute
Colombia
CS1T
Cundinamarca
Colmbia
NS2T
Narintildeo
Colombia
NS6P
Narintildeo
Colombia
71MY
Cundinamarca
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AJ243719
PMTV
Suecia
EF545141
Beet Soil-
Borne
Virus
China
BS4T Boyacaacute
Colombia ID 0997 0764 0752 0762 0995 0995 0599
CS1T
Cundinamarca
Colombia
0997 ID 0764 0752 0762 0992 0992 0599
NS2T Narintildeo
Colombia 0764 0764 ID 0891 0876 0769 0769 0571
NS6P Narintildeo
Colombia 0752 0752 0891 ID 0967 0752 0752 0596
71MY
Cundinamarca
Colombia
0762 0762 0876 0967 ID 0762 0762 0599
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0995 0992 0769 0752 0762 ID 1 0594
AJ243719
PMTV Suecia 0995 0992 0769 0752 0762 1 ID 0594
EF545141 Beet
Soil-Borne
Virus China
0599 0599 0571 0596 0599 0594 0594 ID
117
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del
mundo Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus
(China) Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte
inferior de las ramas
118
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
23T
Antioquia
Colombia
NS22P1
Narintildeo
Colombia
Villa2
Cundinamarca
Colombia
DQ144451
Repuacuteblica
Checa
NC_003725
Suecia
EF545142 Beet
Soil-Borne Virus
China
23T Antioquia
Colombia ID 0981 0981 0984 0981 0699
NS22P1 Narintildeo
Colombia 0981 ID 099 0984 0981 0708
Villa2 Cundinamarca
Colombia 0981 099 ID 0987 0984 0708
DQ144451 Repuacuteblica
Checa 0984 0984 0987 ID 099 0714
NC_003725 Suecia 0981 0981 0984 099 ID 0711
EF545142 Beet Soil-
Borne Virus China 0699 0708 0708 0714 0711 ID
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato mop-top virus en cuatro
Departamentos cultivadores de papa de Colombia
Muestra Hospedante Municipio Planta sentildeuelo
Ant (23T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
La Unioacuten (Antioquia)
N benthamiana
Boy (BS4T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Siachoque
(Boyacaacute) N benthamiana
Cund(CS1T) Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
Subachoque (Cundinamarca)
N benthamiana
Nar (NS6P) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro Pasto (Narintildeo) S phureja
119
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia y Boyacaacute
(Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw Suecia A Niveles de
identidad de nucleoacutetidos y aminoaacutecidos (entre pareacutentesis) de las regiones CP CP-RT y
TGB analizadas y la cepa NC_003724 B Regioacuten CP-RT se incluyeron 1956 nt (651 aa)
para CP-RT y 531 nt (176 aa) para CP Se presentaron cambios en 15 posiciones para el
producto del ARN 2 siendo lo maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la
posicioacuten 81 de CP C Regioacuten TGB se incluyeron 1392 nt (463 aa) Se presentan 10
cambios a lo largo de las tres proteiacutenas analizadas con la presencia de una delecioacuten en la
posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
120
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con secuencias de
referencia de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia y secuencias Colombianas de PMTV
procedentes de Antioquia y Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de
Bootstrap (100 ) se indican sobre las ramas La escala representa las sustituciones
promedio por sitio
121
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica Checa
AJ243719
PMTV Suecia
Antioquia
Colombia ID 0994 0979 0976
Boyacaacute
Colombia 0994 ID 0978 0975
DQ102381 PMTV
Repuacuteblica Checa 0979 0978 ID 0995
AJ243719 PMTV
Suecia 0976 0975 0995 ID
122
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de referencia
de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19
(AY353719) y 54-10 (AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd
(D30753) de Escocia y secuencias Colombianas de PMTV procedentes de Antioquia y
Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de Bootstrap (100 ) se indican
sobre las ramas La escala representa las sustituciones promedio por sitio
123
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AY426745
PMTV
Dinamarca
AY353719
Dinamarca
AJ277556
PMTV
Suecia
D30753
PMTV
Escocia
Antioquia
Colombia ID 0979 0988 0987 0986 0973 0967
Boyacaacute
Colombia 0979 ID 0980 0980 0979 0980 0969
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0988 0980 ID 0998 0997 0979 0971
AY426745
PMTV
Dinamarca
0987 0980 0998 ID 0997 0979 0970
AY353719
PMTV
Dinamarca
0986 0979 0997 0997 ID 0978 0969
AJ277556
PMTV Suecia 0973 0980 0979 0979 0978 ID 0986
D30753 PMTV
Escocia 0967 0969 0971 0970 0969 0986 ID
124
6 ANEXOS GENERALES
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen)
1 Homogenizar 100 mg de tejido de planta en nitroacutegeno liacutequido utilizando un mortero
Adicionar 400 microL de buffer AP1 y 4 microL de la solucioacuten de ARNase A (100mgmL) a
un maacuteximo de 100 mg (peso huacutemedo) o 20 mg (peso seco) de tejido de planta
homogenizado y agitar vigorosamente
2 Incubar la mezcla por 10 min a 65degC Mezclar por inversioacuten 2 oacute 3 veces durante la
incubacioacuten
3 Agregar 130 microL de buffer AP2 al lisado mezclar e incubar por 5 min en hielo
4 Recomendado Centrifugar el lisado por 5 min a 20000 x g (14000 rpm)
5 Pipetear el lisado en la columna QIAshredder Mini spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a 20000 x g (14000 rpm)
6 Transferir la fraccioacuten que pasoacute por la columna del paso 5 en un nuevo tubo sin
disturbar el sedimento de restos celulares
7 Agregar 15 voluacutemenes de buffer AP3E al lisado aclarado y mezclar por pipeteo
8 Pipetear 650 microL de la mezcla de paso 7 incluyendo cualquier precipitado que se
pueda haber formado en la columna DNeasy Mini spin column colocando en un
tubo de coleccioacuten de 2 ml Centrifugar por 1 min a 6000 x g (corresponde a 8000
rpm para la mayoriacutea de las microcentrifugas) y descartar el liacutequido Reutilizar el
tubo de coleccioacuten en el paso 9
9 Repetir el paso 8 con la muestra restante Desechar el liacutequido que atraviesa la
membrana y el tubo de coleccioacuten
10 Colocar la columna DNeasy Mini spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2 ml
agregar 500 microL de buffer AW y centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rpm)
Descartar el liacutequido que atraviesa la membrana y reutilizar el tubo de coleccioacuten en
el paso 12
11 Adicionar 500 microL de buffer AW a la columna DNeasy Mini spin y centrifugar por 2
min a 20000 x g (14000 rpm) para secar la membrana
12 Transferir la columna DNeasy Mini spin a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL y
pipetear 40 microL de Agua bi-destilada directamente en la membrana de DNeasy
Incubar por 5 min a temperatura ambiente (15-25degC) y luego centrifugar por 1 min
a 6000 x g (8000 rpm) para eluir
13 Repetir el paso 12 una vez
125
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo (Doyle y Doyle 1987)
Previo a dar inicio a al procedimiento se debe asegurar de contar con
Nitroacutegeno liacutequido
Bantildeo Mariacutea a 65degC
Enfriar morteros a -20degC
Preparar solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2
Preparar el volumen de buffer CTAB+ β-Mercaptoetanol correspondiente al
nuacutemero de muestras
Desinfestar las muestras con hipoclorito y agua destilada durante 1 min
1 Tomar la raiacutez previamente desinfestada macerarla en nitroacutegeno liacutequido y pasarla a
un tubo eppendorf de 2 mL hasta completar un volumen de 400-500 microL
2 Adicionar 500 microL de buffer de extraccioacuten (CTAB) y 1 de β-Mercaptoetanol (5
microL) previamente preparado
Mezclar por inversioacuten
3 Incubar los tubos a 65degC por 30 min Durante este tiempo hacer inversioacuten de los
tubos cada 5 min
4 Adicionar 250 microL de fenol y 250 microL de cloroformo alcohol isoamiacutelico (241)
Mezclar por inversioacuten
5 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 10 min
6 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL
7 Adicionar un volumen de cloroformo alcohol isoamiacutelico (respecto al sobrenadante)
Mezclar por inversioacuten y centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 5 min
8 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL y repetir
el paso 7
9 Adicionar un volumen de isopropanol friacuteo y 01 voluacutemenes de acetato de sodio 3M
invertir varias veces para precipitar el ADN Llevar las muestras a -20degC por 60 min
como miacutenimo o durante toda la noche Periodos maacutes largos pueden aumentar la
produccioacuten
10 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 15 min a temperatura ambiente
11 Descartar el sobrenadante invirtiendo raacutepida y suavemente los tubos y adicionar 200
microL de etanol friacuteo al 70 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 2 min
12 Descartar el sobrenadante por inversioacuten y secar el pellet a temperatura ambiente
invirtiendo los tubos sobre papel absorbente
13 Resuspender el pellet en 50 microL de agua ultrapura esteacuteril
14 Adicionar 4 microL de ARNasa a cada muestra e incubar en el bantildeo Mariacutea a 37degC
durante miacutenimo 2 horas o durante toda la noche
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
126
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y
hongos filamentosos (Qiagen)
1 Determinar la cantidad de material de planta No usar maacutes de 100 mg
2 Colocar inmediatamente el tejido pesado en nitroacutegeno liacutequido Macerar bien en
un mortero Pasar el tejido en polvo a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL
manteniendo los tubos en nitroacutegeno liacutequido Eacuteste se puede evaporar pero no se
debe permitir que el tejido se descongele Proceder inmediatamente al paso 3
3 Adicionar 450 microL de buffer RLC a un maacuteximo de 100 mg de tejido en polvo
Hacer vortex vigorosamente Nota Asegurar que el B-mercaptoetanol (β-ME)
haya sido agregado al buffer RLC antes de su uso (10 microL de β-ME1 mL de
buffer RLC)
4 Transferir el lisado a la columna QIAshredder spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a maacutexima velocidad (13000 rpm
oacute 18500 x g) Transferir cuidadosamente el sobrenadante que pasoacute por la
columna a un nuevo tubo de microcentriacutefuga sin disturbar el sedimento de
restos celulares en el tubo de coleccioacuten Usar soacutelo el sobrenadante en los pasos
siguientes
5 Adicionar 05 voluacutemenes de etanol (96-100) al lisado aclarado y mezclar
por pipeteo inmediatamente No centrifugar Proceder inmediatamente al paso 6
6 Transferir la muestra (usualmente 650 microL) incluyendo cualquier precipitado
que se haya formado a una columna RNeasy spin (rosada) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL (suministrado) Cerrar suavemente la tapa y centrifugar
por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que pasoacute por la
membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 7
7 Adicionar 700 microL de buffer RW1 a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 8
8 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo en el paso 8 Nota Asegurar que el
buffer RPE tenga adicionado el etanol antes de su uso
9 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 2 min a 8000 x g (10000 rpm) para lavar la membrana
de la columna
10 Opcional Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2
mL (suministrado) y descartar el tubo anterior con el liacutequido Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar a velocidad maacutexima por 1 min (13000 rpm oacute 18500 x g)
11 Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 15 mL
(suministrado) Adicionar 20 microL de agua tratada con DEPC (Dietil
pirocarbonato Qiagen) directamente a la membrana de la columna Cerrar
suavemente la tapa y centrifugar por 1 min a 8000 x g (10000 rpm) para eluir
el ARN
12 Repetir el paso 11
127
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Volumen del componente
para 15 microL de mezcla
Producto de PCR 8 μl
Buffer de la enzima 1 (1X) 1 5 μl
Buffer de la enzima 2 (1X) 1 5 μl
Enzima de restriccioacuten 1 2 μl
Enzima de restriccioacuten 2 2 μl
Volumen total 15 μl
2 Incubar las muestras al bantildeo Mariacutea a 37degC por 12 h-24 h
3 Ralizar el anaacutelisis en gel de agarosa al 25
128
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa RT M-
MuLV para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del componente
para 20 microL de mezcla
Agua bi-destilada 05 microL
PBST (05) 004 15 microL
Buffer RT M-MuLV 5X 1X 4 microL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 microL
dNTPs 10 mM 1 mM 2 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 1 microM 2 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa M-MuLV 20 UmicroL 05 microL
ARN 5 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
129
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 20 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 95 microL
Buffer RT Maacutexima 5X 1X 4 microL
dNTPs 10 mM 05 mM 1 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 05 microM 1 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa Maximareg 200 UmicroL 1 microL
ARN 3 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
130
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes de
descongelar
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 146 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 25 mM 02 mM 2 microL
Primer F 10 microM 05 microM 125 microL
Primer R 10 microM 5 microM 125 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 04 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN Molde 1microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Condiciones del ciclo de la PCR para Sss
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 55 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
131
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes del
descongelamiento
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25
microL de mezcla
Agua bi-destilada 158 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 10 mM 02 mM 05 microL
Primer F 10 microM 2 microM 05 microL
Primer R 10 microM 2 microM 05 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 02 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN copia 3 microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 53 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
134
7 CONCLUSIONES GENERALES
En este estudio se encontroacute que las poblaciones Colombianas de Spongospora subterranea
f sp subterranea (Sss) presentan una estructura baacutesica consistente en tres tipos geneacuteticos
(I II y III) El subgrupo III difiere de los reportados mundialmente como Tipo I y Tipo II
en 5 y 2 respectivamente El Tipo III presentoacute la mayor proporcioacuten de aislamientos de
Sss en este estudio con cepas de diferentes departamentos hospedantes y tejidos
sintomaacuteticos mientras que el Tipo I no fue encontrado en muestras procedentes de agallas
de raiacutez Es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa en Colombia asiacute como su
epidemiologiacutea y capacidad para la transmisioacuten de PMTV
Los anaacutelisis de RFLPs de regiones ITS del ADNr de Sss demostraron polimorfismos en los
sitios de corte de las enzimas Hin6I y Bsp143I Se confirmoacute que la digestioacuten con la enzima
Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos del Tipo III mientras que
el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los Tipos I y II permitiendo
separar los tres principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico de Sss Los
resultados obtenidos sugieren la viabilidad de plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla
El anaacutelisis filogeneacutetico para el gen CP de PMTV permitioacute separar dos grupos de
aislamientos del virus El primer clado agrupoacute todas las secuencias de referencia mundial
con 19 de los aislamientos Colombianos obtenidos en este estudio que presentaron niveles
de identidad superiores al 99 El segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo dos de las reportadas en investigaciones previas y seis
obtenidas en el presente estudio con niveles de variacioacuten del 11 al 13 y con una identidad
de tan solo 76 con respecto a los miembros del primer clado Estos resultados confirman
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que no ha sido registrada en otros
Osorio 2012
135
135
lugares del mundo Es necesario estudiar el efecto de ambos genotipos virales sobre la
produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de papa en Colombia de manera que se generen
tecnologiacuteas para la deteccioacuten de PMTV en los programas de certificacioacuten de semilla y de
mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en el paiacutes
En el anaacutelisis de las regiones parciales de CP y CP-RT del ARN2 y TGB del ARN3 de
PMTV sensu stricto se encontraron niveles muy altos de identidad en las tres regiones
estudiadas siendo la CP la maacutes uniforme Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos
compartieron un 999 de identidad en nt y aa Asiacute mismo los anaacutelisis filogeneacuteticos para el
ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Europeos y Colombianos demostraron que los niveles de
identidad entre ambos grupos fueron muy altos gt975 para ARN 2 y gt967 para el
ARN 3 Estos bajos niveles de variacioacuten permiten inferir que este virus se encuentra bajo
fuertes presiones de seleccioacuten determinadas presumiblemente por las propias caracteriacutesticas
de su genoma el estrecho rango de hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica
por parte de su vector Sss Sin embargo a pesar de los altos valores de uniformidad general
encontrados la presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los
aislamientos colombianos de PMTV resulta interesante para el desarrollo de
investigaciones que permitan determinar si se trata de adaptaciones del genoma viral a las
variedades nativas de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas propias de
las poblaciones de Sss en las regiones Andinas
NS1P Pasto (Nar) Suelo S tuberosum
v
Pag
RESULTADOS 46
4 ARTIacuteCULO 1- VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora
subterranea f sp subterranea EN COLOMBIA 46
41 Anexos-Artiacuteculo 1 65
5 ARTIacuteCULO 2 ndash VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE LOS ARN 2 Y 3
DE AISLAMIENTOS COLOMBIANOS DE PMTV 84
51 Anexos-Artiacuteculo 2 109
6 ANEXOS GENERALES 124
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen) 124
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo 125
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y hongos
filamentosos (Qiagen) 126
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs 127
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
RT M-MuLV para muestras de ARN 128
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN 129
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa 130
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa 131
7 CONCLUSIONES GENERALES 132
vi
INDICE DE FIGURAS
Pag
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV 24
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp
subterranea en plantas de papa de Colombia 65
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja
var Criolla Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos
infestados con Spongospora subterranea f sp subterranea 66
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos
agallas o raiacuteces de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana 68
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8 69
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la
regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp
subterranea de Colombia 70
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb)
a partir de ADN de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum
tuberosum S phureja y Nicotiana benthamiana 71
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e
ITS2 del ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss)
de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo 75
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos
de S subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I
MspI TaqI y Tru1I mediante el programa Web-cutter 77
vii
Pag
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN
ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las
enzimas de restriccioacuten Bsp143I y Hin6I que permiten determinar los tres
Tipos de Sss identificados en este trabajo 82
Figura 410 Gel de RFLPs con la enzima Hind6I y Bsp143I con muestras de los
Tipos I II y III de Sss detectados en el estudio 83
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb)
dirigidos al gen de la caacutepside viral del Potato mop-top virus PMTV 109
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4
(417 pb) dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) del Potato
mop-top virus (PMTV) 110
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7
(2063 pb) PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al
ARN3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 112
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses
del mundo 115
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del
genoma de Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia
y otros paiacuteses del mundo 117
viii
Pag
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia
y Boyacaacute (Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw
Suecia 119
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con
secuencias de referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del
Potato mop-top virus (PMTV) 120
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias
De referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del Potato
mop-top virus (PMTV) 122
ix
INDICE DE TABLAS
Pag
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o
raiacuteces de plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea 67
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna
polvosa y de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad 72
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de
aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en
Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2
del ADN ribosomal 78
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S
E ITS2 del ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp
subterranea de Colombia y otros paiacuteses del mundo 81
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten
de los segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 111
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia 113
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 116
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 118
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato
mop-top virus en cuatro Departamentos cultivadores de papa de Colombia 118
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 118
x
Pag
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 123
xi
RESUMEN
El cultivo de papa es uno de los renglones agriacutecolas de mayor importancia en Colombia se
extiende a 128701 ha y genera una produccioacuten anual de 23 millones de ton antildeo-1
Desde el
punto vista fitosanitario la papa se ve afectada por diversos problemas destacaacutendose en los
uacuteltimos antildeos la reemergencia de la Sarna polvosa causada por el protozoario del suelo
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) El efecto de esta enfermedad se refleja en
el deterioro de la calidad del tubeacuterculo y en la reduccioacuten de la produccioacuten al afectar el
sistema radicular de las plantas Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus
(PMTV) uno de los virus prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarenteneario en diferentes paiacuteses del mundo En este trabajo se evaluaron los niveles de
variabilidad geneacutetica de aislamientos Sss y PMTV obtenidos en cultivos de papa de los
departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo En el caso de Sss se
estudiaron los niveles de variacioacuten de 127 aislamientos a partir de la secuenciaciacioacuten de
las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr) encontraacutendose la presencia de tres variantes
principales dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada Para PMTV se
evaluaron los niveles de identidad de 38 aislamientos de los cuatro departamentos bajo
estudio a partir de la secuenciacioacuten de los genes de la caacutepside viral (CP) y del segundo gen
del triple bloque de genes (TGB2) encontraacutendose la presencia de dos variantes del virus
una que representa el genotipo mundialmente reportado para este virus y la otra que hasta
ahora soacutelo se ha encontrado en Colombia y que dado el bajo nivel de identidad (76) con
respecto al primer grupo posiblemente representa una nueva especie de pomovirus
Finalmente dos de las cepas de PMTV de Antioquia y Boyacaacute fueron secuenciadas para
sus ARN 2 y 3 lograacutendose un 83 del segmento genoacutemico de ARN 2 y 87 para el ARN
3 y encontraacutendose que comparten niveles de identidad superiores al 97 con respecto a
otros aislamientos previamente caracterizados en el Norte de Europa Se espera que los
resultados de esta investigacioacuten sean utilizados para el disentildeo de herramientas de
xii
diagnoacutestico que apoyen los esquemas de certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas
de mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en Colombia
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum Potato mop-top
virus secuenciacioacuten
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea AND ITS
ASSOCIATED PMTV VIRUS IN COLOMBIA
ABSTRACT
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
The other hand Sss is a vector for Potato mop-top virus (PMTV) a prevalent virus in the
Andean region and quarentenary in several countries However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
xiii
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum Potato mop-top virus
RT-PCR Sequencing
1
1 INTRODUCCIOacuteN
En Colombia el cultivo de la papa ocupa cerca de 128701 ha distribuidas en 14
departamentos de los cuales Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo son responsables
del 80 de la produccioacuten que asciende a cerca de 23 millones de ton antildeo-1
y de la cual
dependen maacutes de 69000 familias del sector rural del paiacutes La cadena de la papa en
Colombia enfrenta un gran nuacutemero de desafiacuteos endoacutegenos y exoacutegenos que disminuyen su
competitividad respecto a los demaacutes paiacuteses del mundo y en especial con relacioacuten a los otros
miembros de la Comunidad Andina de Naciones Entre otros factores los maacutes limitantes
son aquellos relacionados con la carencia de tecnologiacutea en los sistemas de produccioacuten y de
post-cosecha la alta dependencia de insumos agriacutecolas y el bajo nivel de acople entre el
sector primario y el de procesamiento industrial (MADR 2006) Desde el punto vista
fitosanitario el cultivo de la papa se ve afectado por diversos fitopatoacutegenos e insectos
plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la reemergencia de la enfermedad denominada
Sarna polvosa de la papa causada por el protozoario Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) Su efecto no solo se debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten
al deterioro en la calidad y apariencia cosmeacutetica de los tubeacuterculos que afecta draacutesticamente
su valor en el mercado Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus (PMTV)
uno de los problemas virales prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarentenario para diferentes paiacuteses del mundo (Santala et al 2010)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 de las cosechas en las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro (Solanum tuberosum) y
papa criolla (S phureja) (SINAIPA 2002) Por otra parte se estima que el PMTV puede
causar peacuterdidas hasta del 25 en este cultivo lo cual adicionado al dantildeo causado por Sss
pudiera generar disminuciones de 50-80 en la produccioacuten (Jones y Harrison 1972
Guerrero 1997 2000) Aunque se cree que este virus tiene como centro de origen los
Andes suramericanos no se ha establecido con certeza su efecto sobre el rendimiento de las
variedades alliacute cultivadas ni determinado claramente los siacutentomas que causa en sus
hospedantes (Salazar 1995) De esta forma no es frecuente encontrar la sintomatologiacutea
asociada a este virus reportada para la regioacuten templada que incluye amarillamiento foliar
2
anillos necroacuteticos y cuarteamiento o agrietamiento de tubeacuterculos y moteados foliares tipo
ldquoAucubardquo (Salazar 1995 Xu et al 2004)
Adicionalmente a esta problemaacutetica la diseminacioacuten de Sss se viene incrementando
dramaacuteticamente en el paiacutes como resultado de la deficiente calidad de la semilla utilizada
por la mayoriacutea de los agricultores la ausencia de variedades tolerantes a dicho patoacutegeno y
la carenciadeficiencia de asistencia teacutecnica estatal o gremial que no cuenta con
herramientas apropiadas para el diagnoacutestico asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla
libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011)
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la ausencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos o bioloacutegicos efectivos por lo
tanto requiere de un manejo fitosanitario especial al afectar directamente la semilla
inhabilitar los suelos dedicados al cultivo afectar la calidad cosmeacutetica del producto fresco y
ser transmisor del PMTV lo que genera una barrera cuarentenaria para la apertura de
nuevos mercados Por lo anterior el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado bajo
un esquema de manejo integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como
rotacioacuten de cultivos manejo adecuado del riego y drenaje sanidad del tubeacuterculo semilla
utilizacioacuten de organismos antagonistas (pe Trichoderma spp) utilizacioacuten de cultivos
trampa desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos estrictos de
certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas son
utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado del
manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o de
Rhizoctoniasis
El desarrollo de metodologiacuteas seroloacutegicas y moleculares pueden ser una importante
herramienta para el monitoreo y deteccioacuten de estos patoacutegenos en el paiacutes Se destacan para
Sss la teacutecnica de ELISA (Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas) con anticuerpos
policlonales y monoclonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
3
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Ward et al 2004 Qu et al
2011) Para el caso de PMTV tambieacuten se han utilizado teacutecnicas de deteccioacuten utilizando
plantas trampa ELISA RT-PCR (Retrotranscripcioacuten - Reaccioacuten en cadena de la
polimerasa) qPCR (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa en tiempo real) y microplatos de
hibridizacioacuten y microarreglos (Arif et al 1994 Nielsen y Moslashlgaard 1997 Jeffries 1998
Davey 2009 Latvala-Kilby et al 2009 Nakayama et al 2009) Sin embargo estas
teacutecnicas son de aplicacioacuten limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas o validadas con
base en los genotipos locales de ambos patoacutegenos presentes en las regiones cultivadoras de
nuestro paiacutes motivo por el cual es fundamental emprender un estudio amplio de los niveles
de variabilidad geneacutetica de Sss y PMTV en Colombia
Este trabajo responde a dicha necesidad En eacutel se realizaron colecciones de material vegetal
y suelo de cuatro zonas productoras de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo (Colombia) y se realizaron extracciones de ADN o ARN seguacuten el
caso para mediante teacutecnicas moleculares determinar las secuencias de diferentes regiones
informativas del genoma de cada patoacutegeno Una vez obtenidas y editadas las secuencias se
realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos para comparar y agrupar aislamientos colombianos con
respecto a los reportados para Sss y PMTV en el mundo y determinar sus niveles de
identidad geneacutetica
Este estudio pretende apoyar el desarrollo de programas de diagnoacutestico de Sss y PMTV
tanto en Colombia como en la regioacuten Andina La informacioacuten generada es importante para
desarrollar programas de deteccioacuten asintomaacutetica y temprana de ambos patoacutegenos como una
herramienta fundamental para implementar una base tecnoloacutegica que apoye los esquemas
cuarentenarios dirigidos a evitar la diseminacioacuten de los patoacutegenos hacia zonas libres de la
enfermedad la certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas de mejoramiento geneacutetico
que conduzcan a generar variedades resistentes a este patosistema
4
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GENERAL
Evaluar los niveles de variacioacuten geneacutetica de Spongospora subterranea y de su virus asociado
PMTV en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y
Narintildeo
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de S subterranea de cultivos de
papa de cuatro departamentos de Colombia a partir de secuenciacioacuten de las
regiones ITS del ADN ribosomal
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de PMTV de cultivos de papa de cuatro
departamentos de Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de la caacutepside y TGB2 del
genoma viral
Definir las afinidades filogeneacuteticas entre las variantes de S subterranea y PMTV
detectadas en Colombia con aislamientos de dichos patoacutegenos de diferentes paiacuteses
que presenten secuencias disponibles en las bases de datos moleculares
Ampliar el nivel de informacioacuten disponible sobre las secuencias de los segmentos
del genoma de aislamientos de PMTV en Colombia
5
3 MARCO TEOacuteRICO
31 Generalidades del cultivo de la papa
La papa es el tubeacuterculo maacutes importante que se produce en el mundo Se cultiva en maacutes de
125 paiacuteses y es consumido diariamente por maacutes de mil millones de personas En los paiacuteses
en desarrollo es un cultivo de fuerte expansioacuten con cientos de millones de personas que
dependen de eacutel para su supervivencia Los paiacuteses en desarrollo son los maacutes grandes
productores (e importadores) de papa y de sus productos derivados (FAO 2009) China se
ha convertido recientemente en el primer productor mundial de papa y junto a India
responden por la tercera parte de la produccioacuten global de este tubeacuterculo En Ameacuterica Latina
y Aacutefrica las cosechas presentaron un menor volumen pero el rendimiento se incrementoacute
significativamente Ameacuterica del Norte fue el mayor productor del continente con un
rendimiento de maacutes de 40 ton ha-1
(FAO 2008)
Ameacuterica del Sur es la cuna de la papa pero esta regioacuten presenta los niveles maacutes bajos de
produccioacuten con menos de 16 millones de toneladas para el antildeo 2007 En la regioacuten Andina
la mayoriacutea de los pequentildeos campesinos manejan el cultivo de forma tradicional y se
siembran variedades de papa que son poco comerciales y desconocidas para el resto del
mundo sin embargo en paiacuteses como Argentina Brasil Colombia y Meacutexico la produccioacuten
comercial de papa estaacute aumentando paulatinamente (FAO 2008)
En Colombia el cultivo de la papa participa con el 71 de la superficie sembrada en
cultivos transitorios y aporta cerca de 78 de la produccioacuten agriacutecola generando alrededor
de 69000 empleos directos principalmente en los departamentos de Cundinamarca
Boyacaacute Narintildeo y Antioquia (MADR 2009a) En el 2009 el aacuterea sembrada de papa fue de
128701 ha con una produccioacuten de 2272772 ton y un rendimiento de 184 ton ha-1
(MADR-ENA 2009) La participacioacuten departamental en la produccioacuten nacional se
encuentra distribuida de la siguiente manera Cundinamarca 378 Boyacaacute 263 Narintildeo
6
164 Antioquia 65 Santander 56 y otros departamentos participan con el 64
(MADR 2009b)
La papa es el producto de origen agriacutecola que tiene la mayor demanda en Colombia por
fungicidas e insecticidas y la segunda en demanda de fertilizantes despueacutes del cafeacute Es la
actividad que maacutes utiliza los servicios de transporte terrestre con maacutes de 2 millones de
toneladas al antildeo sin incluir la movilizacioacuten de los insumos requeridos para su produccioacuten
(MADR 2005)
Los cultivos de papa se encuentran distribuidos en climas friacuteos con temperaturas de 13ordmC y
alturas de 2000 msnm hasta alcanzar zonas de paacuteramo con alturas cercanas a los 3500
msnm y temperaturas de 8ordmC Geograacuteficamente las unidades de produccioacuten estaacuten
dispersas principalmente en las regiones friacuteas de la zona Andina bajo una variada gama de
condiciones biofiacutesicas econoacutemicas y sociales En teacuterminos generales alrededor del 75
del aacuterea cultivada con papa en el paiacutes se encuentra en zonas de topografiacutea quebrada y
ondulada (MADR 2005)
Seguacuten Villareal et al (2007) en el paiacutes existen alrededor de 30 variedades de papa
cultivada pero soacutelo 10 de eacutestas tienen importancia comercial La Parda pastusa es la
variedad maacutes cultivada y consumida en fresco le siguen la variedad Diacol Capiro
utilizada para consumo en fresco exportacioacuten y por la industria de alimentos como materia
prima La variedad ICA-Puraceacute es utilizada en algunas regiones de clima templado del paiacutes
para consumo en fresco la Tuquerrentildea o Sabanera que se consume principalmente en
Bogotaacute y la Criolla que se cultiva principalmente en los departamentos de Antioquia y
Cundinamarca En el paiacutes se han desarrollado nuevas variedades que han ingresado al
mercado como las variedades Esmeralda Rubi UNICA e ICA Morita que tienen altas
posibilidades comerciales en el corto plazo
Una de las principales limitantes teacutecnicas del cultivo de la papa corresponde a las plagas y
enfermedades Dentro de las enfermedades el tizoacuten tardiacuteo o gota causado por
Phytophthora infestans es la amenaza maacutes seria del cultivo Ademaacutes tambieacuten se presentan
el tizoacuten temprano (Alternaria solani) la rontildea (Rhizoctonia solani) la sarna comuacuten
7
(Streptomyces scabies) la palomilla o mortaja blanca (Rosellinia sp) las virosis (PVY
PVX PLRV PYVV PVS PMTV) y la sarna polvosa Esta uacuteltima enfermedad se ha
convertido en una de las principales problemaacuteticas de cultivo a nivel mundial (Harrison et
al 1997 Merz y Falloon 2009) Es causada por el protozoo Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) paraacutesito obligado de plantas superiores Esta enfermedad causa dantildeos
directos sobre las raiacuteces y tubeacuterculos y ademaacutes es vector del PMTV (Jones y Harrison
1969 Harrison et al 1997 Andersen et al 2002 Merz y Fallon 2009) enfermedad viral
que afecta este cultivo en varias regiones productoras de papa en el mundo
En Colombia el manejo de la enfermedad se basa en el uso de semilla certificada por el
Instituto Colombiano Agropecuario ICA la utilizacioacuten de variedades medianamente
tolerantes y la rotacioacuten entre estas variedades con cultivos no hospedantes del patoacutegeno
(Jaramillo y Botero 2007)
32 Generalidades de Spongospora subterranea fsp subterranea
321 Taxonomiacutea
Sss es el agente causal de la enfermedad denominada Sarna polvosa de la papa El primer
reporte de esta enfermedad data de 1841 en Alemania (Wallroth 1842) y a partir de esta
fecha su registro incluye todos los continentes (Harrison et al 1997 Merz 2008) Seguacuten
Lyman y Rogers (1915) el patoacutegeno es originario de los Andes Suramericanos desde donde
se dispersoacute gracias al mercado mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber
transcurrido mas de 150 antildeos desde su primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado
importancia en las uacuteltimas deacutecadas como resultado de la siembra generalizada de materiales
altamente susceptibles al patoacutegeno la utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los
cambios de eacutepocas de siembra hacia periacuteodos huacutemedos las deficiencias en los sistemas de
rotacioacuten de cultivos la falta de programas cuarentenarios y los altos estaacutendares exigidos por
el mercado en la calidad cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
8
Sss es un pseudohongo plasmodial que taxonoacutemicamente se ha ubicado en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos Spongospora subterranea f sp
subterranea y Spongospora subterranea f sp nasturtii definidos como forma especialis
son importantes patoacutegenos de vegetales (Merz y Falloon 2009) Dick (2001) propone que
dichos microorganismos corresponden a especies diferentes
322 Ciclo de vida Sss
Sss y otros plasmodiophorales se caracterizan por presentar zoosporas biflageladas (3-4 microm
diaacutemetro) de desigual tamantildeo con mastigonemes y posicioacuten opuesta que se liberan a partir
de las estructuras de resistencia (quistes) Los quistes (4 microm diaacutemetro) pueden sobrevivir en
el suelo por largos periacuteodos de tiempo y generalmente se encuentran agregados formando
estructuras denominadas quistosoros (hasta 85 microm diaacutemetro) CITA los cuales son esfeacutericos
u ovoides y presentan un centro vaciacuteo En Colombia observaciones realizadas por
Jaramillo y Peacuterez (2008) han determinado que los quistosoros de aislamientos procedentes
de suelos del municipio de La Unioacuten (Antioquia) oscilaron entre 50 y 120 microm Bajo
condiciones de humedad es frecuente la liberacioacuten de una zoospora uninucleada aunque se
cree que la germinacioacuten de los quistes responde a un patroacuten escalonado que garantiza la
generacioacuten de inoacuteculo infectivo por largos periodos de tiempo Una vez en el suelo las
zooporas se desplazan varios centiacutemetros y son atraiacutedas por los exhudados de las raiacuteces de
sus plantas hospedantes adherieacutendose enquistando y formando un tubo germinativo que
ejerce fuerza mecaacutenica para su penetracioacuten directa en la planta Posteriormente el patoacutegeno
desarrolla un plasmodio multinucleado con membrana simple y ausencia de pared celular
Eventualmente el plasmodio se cliva dando lugar a muacuteltiples zooesporangios cada uno de
los cuales puede generar hasta 8 zoosporas que son liberadas por un poro germinativo y
continuacutean con la infeccioacuten de otras ceacutelulas radiculares Estas zoosporas denominadas
secundarias son indistinguibles de las que inician la infeccioacuten (primarias) y ambas pueden
infectar lenticelas no suberizadas de tubeacuterculos comenzando a inducir el siacutentoma tiacutepico de
9
la sarna que toma apariencia corchosa a partir del desarrollo de una capa de proteccioacuten a
nivel del peridermo del tubeacuterculo Es frecuente ademaacutes que el patoacutegeno induzca hipertrofia
e hiperplasia en los tejidos afectados dando origen a las agallas y a las deformaciones
caracteriacutesticas de la enfermedad Al final del ciclo en los plasmodios se reorganiza su
contenido protoplasmaacutetico rodeaacutendo los nuacutecleos presentes de pared celular y generaacutendose
quistes que serviraacuten de inoacuteculo para sucesivas infecciones (Harrison et al 1997)
El ciclo de vida de Spongospora es diferenciado por Merz (2008) de acuerdo a la
ocurrencia de dos fases una fase esporogeacutenica y una segunda fase esporangial cada una
iniciada por la infeccioacuten de la ceacutelula hueacutesped a traveacutes de un plasmodio individual En la
fase esporangial numerosas zoosporas secundarias son formadas en el esporangio de
paredes delgadas en las ceacutelulas epidermales de la raiacutez y los pelos radicales del hueacutesped en
las cuales las zoosporas son formadas desde un plasmodio esporangiogeacutenico Las zoosporas
secundarias tambieacuten biflageladas pueden salir del hueacutesped e iniciar otro ciclo de infeccioacuten
La fase esporogeacutenica se presenta despueacutes de la divisioacuten nuclear dentro del plasmodio
esporogeacutenico El patoacutegeno produce esporas de reposo de pared gruesa las que son
altamente persistentes Cada espora de reposo libera una sola zoospora primaria
biflagelada
En Colombia Hoyos et al (2009) realizaron observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Sss encontrando plasmodios plasmodios enquistados plasmodios en
estado de divisioacuten ceacutelulas uacutenicas y quistosoros en raiacuteces de plantas de S tuberosum
asintomaacuteticas indicando que la infeccioacuten puede estar presente sin desarrollo evidente de
siacutentomas y que los quistosoros no son solamente las estructuras maacutes frecuentes en los
tejidos de los hospedantes afectados
10
323 Rango de hospedantes de Sss
Diversas investigaciones han encontrado la presencia de zoosporangios de Sss en plantas de
otras familias diferentes a la Solanaceae como Alzoaceae Apiaceae Asteraceae
Boraginaceae Brassicaceae Caryophyllaceae Chenopodiaceae Fabaceae Geraniaceae
Lamiaceae Plantaginaceae Papaveraceae Poaceae Polygonaceae Ranunculaceae
Rubiaceae Resedaceae Solanaceae y Urticaceae (Jones y Harrison 1969 Andersen et al
2002) Andersen et al (2002) encontraron diferentes tasas de infeccioacuten desarrolladas por el
patoacutegeno en especies como Artemisia vulgaris Cirsium arvense Chamomilla suaveolens
Chenopodium album Galium aparine Geranium pusillum Lapsana communis Matricaria
inodora Poa annua Polygonum avicular P convolvulus Rumex acetosa R acetosella
Solanum nigrum Sonchus arvensis Urtica urens y Viola tricolor lo que permitioacute
confirmar estas 17 especies como hospedantes de Sss
Aunque aparentemente Sss tiene un amplio rango de hospedantes el desarrollo de los
quistosoros nunca habiacutea sido observado en otros hospederos diferentes a S tubersosum Sin
embargo Qu y Christ (2006a) encontraron formacioacuten de quistosoros en seis especies de
plantas Solanum plycantum Dun Datura stramonium L Avena sativa L Dactylis
conglomerado L Solanum esculentum Mill y Brassica campestris L Esto indicoacute que el
patoacutegeno tiene la capacidad de completar su ciclo de vida en hospedantes alternos a las
plantas de papa lo que representa un aspecto epidemioloacutegico importante Asiacute mismo se
encontroacute que las siguientes especies tambieacuten son hospedantes del patoacutegeno Fagopyrum
esculentum Moench Phleum pratense L Raphanus sativus L Brassica napus L
Trifolium pratense L Secale cereale L Ambrosia artemisiifolia L Chenopodium album
L Amaranthus retroflexus L y Cyperus esculentus L Recientemente se ha encontrado
que el patoacutegeno puede producir agallas en S physalifolium y S nigrum y su patogenicidad
fue confirmada por inoculacioacuten a plantas de tomate (S esculentum) y de papa bajo
condiciones de invernadero (Shah et al 2010) Estos resultados tienen consecuencias para
el manejo de la enfermedad enfocado en cultivos de rotacioacuten porque se debe tener en
cuenta que existen especies cultivables y malezas que pueden albergar estructuras del
patoacutegeno y que el reporte de nuevas especies hospederas continua por ejemplo Sss causa
11
agallas en las raices de Solanum sarrachoide en donde puede completar su ciclo de vida y
producir nuevas generaciones de quistosoros que son infectivos a papa (Nitzan et al 2009)
324 Siacutentomas causados por Sss
Los siacutentomas de la enfermedad incluyen la induccioacuten de lesiones pustulosas corchosas con
centros polvosos formados a partir de la agregacioacuten de los quistosoros del patoacutegeno Con el
avance de estas lesiones es frecuente la ruptura del peridermo aunque el nivel de
penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente superficial Bajo condiciones oacuteptimas para el
desarrollo de la enfermedad es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten
de los tejidos y la formacioacuten de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la
enfermedad ademaacutes de causar los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular
de las plantas al inducir la formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas (Cotes et al
2006) que causan la disminucioacuten de la superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo a la
marchitez y finalmente a la muerte de las plantas Durante el almacenamiento la sarna
polvosa puede ocasionar pudriciones secas que sirven de entrada a otros patoacutegenos y
saproacutefitos que deterioran auacuten maacutes el producto (Agrios 1996) La infeccioacuten en las raiacuteces
especialmente cuando se forman agallas pueden causar una reduccioacuten en el funcionamiento
de la raiacutez por la interrupcioacuten de la toma de agua y de nutrientes (Lister et al 2004 Falloon
et al 2005)
En Colombia en los departamentos de Cundinamarca Boyacaacute Narintildeo y Antioquia Sss
afecta severamente las variedades de papa (Solanum tuberosum) Parda Pastusa y Diacol
Capiro y a la papa criolla (Solanum phureja) Los siacutentomas se observan en raiacuteces y
tubeacuterculos pero hay variacioacuten en las zonas paperas en cuanto a la distribucioacuten de los
siacutentomas entre los diferentes oacuterganos de la planta En Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de
Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre los tubeacuterculos de las variedades Parda
Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el departamento de Narintildeo y en el Oriente de
Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces Hasta ahora no se sabe si estas diferencias
se deben a variaciones en las condiciones ambientales de una regioacuten a otra o quizaacutes se
12
deban a la distribucioacuten regional de diferentes razas del patoacutegeno yo a su interaccioacuten con el
ambiente (Jaramillo y Botero 2007)
En el Oriente Antioquentildeo se determinoacute la incidencia y el grado de severidad de 23
poblaciones de Sss bajo el sistema de rotacioacuten entre ICA Puraceacute-Diacol Capiro y viceversa
en tres cosechas sucesivas en condiciones de casa de malla Se observoacute que las poblaciones
del patoacutegeno no afectaron el peso ni causaron siacutentomas de sarna polvosa en los tubeacuterculos
pero si en las raiacuteces con diferentes grados de severidad en las dos variedades siendo maacutes
susceptible la variedad Diacol Capiro que al parecer favorecioacute el incremento del inoacuteculo
mientras que la ICA Puraceacute fue levemente afectada y posiblemente presentoacute efecto
supresivo sobre los quistosoros en el suelo (Jaramillo y Botero 2007)
Estudios realizados en el departamento de Narintildeo presentaron diferencias en el grado de
desarrollo de la enfermedad en raiacuteces La variedad Parda Pastusa fue la maacutes susceptible a
Sss con desarrollo de agallas desde el momento de la emergencia de las plantas La
enfermedad alcanzoacute valores de susceptibilidad del 100 en dicha variedad mientras que en
Diacol Capiro fue de 48 En los tubeacuterculos la enfermedad se manisfestoacute por la formacioacuten
de escasas y pequentildeas puacutestulas de color castantildeo con poca presencia de masas pulverulentas
de esporas de resistencia del patoacutegeno lo que contrasta con la regioacuten Cundiboyacense en
donde estas variedades se caracterizan por presentar una alta susceptibilidad a la rontildea en
tubeacuterculos ocasionando lesiones severas en las que resulta faacutecil encontrar esporas de
resistencia (Benavides 2006)
325 Control de Sss
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la carencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos efectivos (Qu y Christ
2006a) Seguacuten Harrison et al (1997) el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado
bajo un esquema integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como la
rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del tubeacuterculo semilla la
utilizacioacuten de organismos antagonistas (ie Trichoderma spp) la utilizacioacuten de cultivos
trampa la desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
13
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos de certificacioacuten de
semilla Dos estrategias que en la actualidad se consideran fundamentales para apoyar los
programas MIC en papa incluyen el mejoramiento geneacutetico por resistencia al pseudohongo
y la utilizacioacuten de cultivos trampa (Merz et al 2004)
Para el caso del mejoramiento los primeros reportes en la regioacuten Andina fueron
presentados por Torres et al (1995) quienes evaluaron 467 accesiones encontrando la
existencia de 17 genotipos resistentes y 33 moderadamente resistentes Por otra parte Lees
(2000) en Escocia evaluoacute los niveles de resistencia a Sss de una serie de clones de S
phureja encontrando que algunos de eacutestos presentaron un adecuado nivel de resistencia
por lo que esta especie fue propuesta como fuente de genes de resistencia Merz (2000) al
evaluar la reaccioacuten de 11 cultivares determinoacute que existe correlacioacuten entre las pruebas de
invernadero utilizando plaacutentulas provenientes de cultivo de tejidos y la resistencia
presentada en campo
Fallon et al (2003) realizaron un estudio en Australia con 99 cultivares de papa y 13
liacuteneas de mejoramiento durante 11 antildeos Sus resultados indicaron que el 21 de los
materiales evaluados eran resistentes mientras que el 28 presentoacute una resistencia
moderada Estos autores tambieacuten reportaron que la expresioacuten de la resistencia variacutea entre
antildeos y que los bioensayos realizados en invernadero no siempre se correlacionan con la
respuesta presentada en campo sugiriendo una fuerte interaccioacuten genotipo-ambiente para
esta caracteriacutestica
Nitzan et al (2010) evaluaron la estabilidad de la resistencia geneacutetica de 24 genotipos de
papa a Sss en los estados de Washington e Idaho en Estados Unidos Se identificoacute que la
resistencia era estable a la formacioacuten de agallas en las raiacuteces causada por Sss y se determinoacute
que una gran proporcioacuten de la variacioacuten fue geneacutetica lo que permite a los mejoradores usar
genotipos resistentes y estables de papa como progenitores en el desarrollo de cultivares
comerciales con resistencia a este patoacutegeno debido a que contar con materiales geneacuteticos
resistentes es una de las principales estrategias de manejo de la enfermedad (Rodriacuteguez et
al 2009 Houser y Davidson 2010)
14
Seguacuten Merz et al (2012) no existen meacutetodos de control eficientes y econoacutemicos que se
encuentren disponibles actualmente y la resistencia del hospedero es clave para el manejo
integrado de la enfermedad debido a esto se evaluaron 10 cultivares con diferentes rangos
de susceptibilidad a Sss y a PMTV en diferentes paiacuteses de Europa Para evitar discrepancias
en los criterios de evaluacioacuten se utilizoacute una escala estaacutendar para los niveles de la sarna
polvosa determinaacutendose que los cultivares se comportaron como estaba establecido en su
caracterizacioacuten inicial (a excepcioacuten de uno de ellos) Los resultados del ensayo de campo
indicaron que los diferentes meacutetodos de valoracioacuten son el principal factor de discrepancia
en las calificaciones de la resistencia y que las condiciones ambientales yo el nivel de
inoacuteculo del suelo juegan un papel menor
Otra estrategia con alto potencial para el manejo de la enfermedad es la rotacioacuten del cultivo
con plantas trampa que reducen el nivel de estructuras de resistencia de
plasmodiophoromycetes Por ejemplo es ampliamente conocido que la siembra de
Raphanus sativus reduce la cantidad de quistes de Plasmodiophora brassicae en el suelo
(Murakami et al 2000) mientras que la planta Datura stramonium redujo el nivel de Sss en
un 79 en cultivos de papa de Australia
En Colombia la buacutesqueda de herramientas para el manejo de la enfermedad bajo las
condiciones regionales de las zonas productoras de papa se enfoca en la evaluacioacuten de
sistemas de rotacioacuten de variedades comerciales que tradicionalmente se han considerado
altamente susceptibles a la enfermedad (ie Diacol Capiro) con variedades maacutes tolerantes al
ataque del patoacutegeno (ie ICA Puraceacute) encontraacutendose que efectivamente esta uacuteltima
variedad presenta un menor nivel de susceptibilidad a la sarna polvosa (Jaramillo et al
2003 Jaramillo y Botero 2007)
En cuanto al control bioloacutegico de Sss Gilchrist (2009) evaluoacute una cepa de Trichoderma
previamente considerada por Hoyos et al (2002) como potencialmente uacutetil para el control
bioloacutegico de Sss en la variedad Diacol Capiro Las pruebas fueron realizadas en campo
utilizando tres dosis de aplicacioacuten del biocontrolador Se encontroacute que la aplicacioacuten de T
asperellum T109 redujo un 64 y 54 los efectos de la sarna polvosa en el crecimiento y
15
en la produccioacuten de las variedades respectivamente De esta forma se resalta el potencial
de la cepa como biocontroladora contra Sss teniendo en cuenta que se debe ampliar el
conocimiento acerca de los factores que limitan la accioacuten de T asperellum T109 en el
campo y coacutemo compensarlo aumentando la frecuencia de aplicacioacuten En un trabajo similar
se investigoacute la influencia de cuatro aislamientos de T asperellum sobre la sarna polvosa en
tres tipos de suelo Andisol Entisol e Inceptisol No se encontraron diferencias
significativas entre las plantas de papa tratadas y no tratadas con T asperellum pero siacute se
encontroacute que la reduccioacuten del crecimiento y la produccioacuten estuvieron inversamente
asociadas con el contenido de Al2+
en los suelos sugiriendo que los efectos de la sarna
polvosa estaacuten fuertemente relacionados con las condiciones del suelo (Gilchrist et al 2009)
Estudios sobre la evaluacioacuten de estrategias de manejo de la rontildea polvosa en tres regiones
productoras de papa en Colombia han incluido resultados sobre la biologiacutea y patologiacutea de
Sss en la Sabana de Bogotaacute y sus hallazgos maacutes importantes consisten en la puesta en
marcha de un sistema de bioensayos en los cuales ha sido posible inducir la liberacioacuten de
zoosporas bajo condiciones de laboratorio Otros estudios incluyen la evaluacioacuten del efecto
de fungicidas aplicados al suelo para el manejo de Sss Sin embargo se determinoacute que
ninguno de los fungicidas evaluados (Tiabendazol Tolclofos metil Benomyl Carbendazin
Clorotalonil y Mancozeb) contribuyeron con el control del patoacutegeno en raiacuteces y tubeacuterculos
bajo las dosis y condiciones de tres localidades productoras de papa (Subachoque Medelliacuten
(Corregimiento Santa Elena) y Pasto) (Garciacutea y Navia 2002) En contraste Falloon et al
(2010) realizaron aplicaciones en campo del fungicida Mancozeb el cual contiene Zn y
Mn Las dosis estuvieron determinadas como baja similar y alta con respecto al contenido
de estos elementos en el suelo cultivado con papa cv Iwa (considerado muy susceptible a
Sss) Se encontroacute que niveles elevados de Zn y Mn generan infecciones moderadas de Sss
en las raiacuteces del cultivar evaluado de S tuberosum
Otras investigaciones para el manejo de Sss han incluiacutedo la evaluacioacuten de potenciales
biocontroladores (Trichoderma harzianum y Pseudomonas fluorescens) un consorcio de
micorrizas y viruta de pino como tratamientos Se encontraron diferencias estadiacutesticamente
significativas entre el testigo y P fluorescens y los tratamientos con T harzianum
16
micorrizas y viruta presentando una incidencia en raiacuteces de 32 21 y 5 3 y 1
respectivamente Los tratamientos con T harzianum micorriza y viruta tuvieron los
porcentajes de incidencia maacutes altos pero contrastaron con niveles muy bajos de severidad
de la enfermendad (022 0088 y 0019 respectivamente) Sin embargo no se
obtuvieron incrementos en peso seco de raiacuteces peso de tubeacuterculos y peso seco de la parte
aeacuterea cuando se realizaron las inoculaciones de los diferentes agentes de control y las
aplicaciones de la viruta de pino (Restrepo et al 2009)
Arias (2011) realizoacute un anaacutelisis y comparacioacuten de glucosinolatos presentes en diferentes
accesiones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control de
Sss Se estandarizaron los procedimientos de extraccioacuten del compuesto y las diferentes
formulaciones fueron probadas como biofumigante en el suelo donde posteriormente se
sembraron tubeacuterculos de papa criolla Sin embargo los resultados obtenidos no permitieron
establecer un posible potencial biofumigante de las accesiones evaluadas y es necesario
profundizar en los estudios que permitan determinar el efecto de los glucosinolatos y de
otros compuestos sobre el patoacutegeno
33 Deteccioacuten de Sss
La deteccioacuten del inoacuteculo a nivel del suelo es compleja y es evaluada precariamente a partir
de sistemas de trampeo que utilizan plaacutentulas de tomate (Merz 1989) o de papa (Wale et al
1993) Estas evaluaciones son criacuteticas para definir relaciones entre el grado de infestacioacuten
de los suelos y los niveles de enfermedad observados en el campo requisito fundamental
para la implementacioacuten de cualquier medida de control (Merz et al 2005)
Con el objetivo de buscar alternativas para alcanzar mayores rangos de sensibilidad en la
deteccioacuten de Sss se han explorado diversas metodologiacuteas basadas en teacutecnicas seroloacutegicas y
moleculares Entre las primeras se destacan la generacioacuten de anticuerpos policlonales que
detectan quistosoros del protozoo bajo un sistema ELISA (Harrison et al 1993 Walsh et
al 1996) Sin embargo la utilidad de estos anticuerpos es reducida debido a que no detecta
el estado plasmodial (Ward et al 2004) Maacutes recientemente Merz et al (2005)
desarrollaron una prueba para la evaluacioacuten rutinaria de la presencia del patoacutegeno basada
17
en anticuerpos monoclonales derivados de quistosoros como antiacutegenos alcanzando niveles
de sensibilidad de menos de un quistosoro por tubeacuterculo A partir de esto se generoacute la
herramienta ldquoSss AgriStriprdquo una prueba basada en un inmunoensayo de flujo lateral cuya
precisioacuten y sensibilidad fue evaluada por Bouchek-Mechiche et al (2011) para la
deteccioacuten de Sss Se comparoacute con teacutecnicas de microscopiacutea ELISA PCR y qPCR que
detectaron Sss en lesiones tiacutepicas de sarna polvosa Asiacute mismo se realizaron pruebas en los
lotes que presentaban lesiones tiacutepicas y atiacutepicas causadas por el patoacutegeno y se confirmoacute la
presencia de Sss en todas las lesiones con todos los meacutetodos probados Se concluyoacute que el
Sss AgriStrip es una prueba tan sensible como DAS- ELISA con un liacutemite de deteccioacuten de 1
a 10 quistosoros por mL de buffer
Con respecto a las metodologiacuteas moleculares se ha utilizado PCR convencional a partir de
los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 (Bulman y Marshall 1998) Sps1Sps2 (Bell et al
1999) y SsFSsR (Qu et al 2006) que amplifican las regiones ITS del ADNr
Los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 disentildeados por Bulman y Marshall (1998) detectaron
Sss en las muestras evaluadas y no presentaron reaccioacuten cruzada con otros
plasmodiophoridos como Spongospora subterranea f sp nasturtii Plasmodiophora
brassicae Sorosphaera veronicae y Polymyxa graminis asiacute como con el causante de la
sarna comuacuten Streptomyces scabies demostrando la utilidad de estos cebadores en la
deteccioacuten de Sss realizada por estos investigadores
Bell et al (1999) obtuvieron secuencias parciales del ITS de 391pb con los cebadores Sps
1 y Sps 2 para la deteccioacuten y cuantificacioacuten de Sss en la corteza tubeacuterculos lavados y
suelos cultivados con papa Las pruebas desarrolladas mostraron ser maacutes sensibles que los
inmunoensayos previamente reportados y fueron maacutes raacutepidas y sencillas que los ensayos
convencionales con plantas trampa
Qu et al (2006) utilizaron la teacutecnica de PCR para la identificacioacuten especiacutefica y
cuantificacioacuten de Sss Los cebadores SsF y SsR amplificaron un producto de 434 pb
proveniente de masas de esporas de Sss pero no se obtuvo el amplicoacuten cuando el ADN era
de papa sana de tubeacuterculos con sarna comuacuten o de otros plasmodiophoridos relacionados
18
Asiacute mismo se detectoacute Sss en otros hospederos infectados que no presentaban siacutentomas y se
concluyoacute que la prueba es tan sensible que puede detectar 1 quiste g-1
Adicionalmente con
esta teacutecnica se logroacute la cuantificacioacuten de Sss en el suelo logrando identificar valores de 1 a
104 quistosoros por 025 g de suelo
La implementacioacuten de meacutetodos para la deteccioacuten de Sss ha permitido el desarrollo de
procedimientos que permiten una raacutepida y automatizada extraccioacuten de ADN combinada
con PCR en tiempo real utilizando sondas Taqmanreg para avanzar en el diagnoacutestico
rutinario de la sarna polvosa (Lees et al 2002 van de Graff et al 2003 Ward et al 2004
Qu et al 2011) o PCR competitivo o cuantitativo (Qu et al 2006 Shah et al 2009) En esta
prueba se utiliza un control interno de ADN de papa (citocromo oxidasa) para hacerla maacutes
confiable y evitar falsos negativos La validacioacuten de dicha metodologiacutea se realizoacute a partir
de la evaluacioacuten de 37 muestras de tubeacuterculos de varios cultivares procedentes de diversas
localidades del Reino Unido La prueba detectoacute el patoacutegeno en todas las muestras que eran
sospechosas de tenerlo asiacute como en tubeacuterculos que no presentaban quistosoros observables
La prueba con la sonda Taqman demostroacute ser 100 veces maacutes sensible que la PCR
convencional (Ward et al 2005) y la ELISA (Ward et al 2004) Estas pruebas han
permitido determinar el efecto del nivel de inoacuteculo en el suelo y de algunos factores
ambientales en la infeccioacuten y desarrollo de agallas en raiacuteces de papa causadas por Sss (van
de Graaf et al 2007) En Gran Bretantildea la teacutecnica de PCR en tiempo real permitioacute detectar
confiablemente y establecer la cantidad de ADN de los quistorosos zoosporas y
plasmodiozoosporangios del patoacutegeno asiacute mismo se determinoacute la viabilidad de los quistes
en el suelo y en combinacioacuten con el uso de plantas trampa se estudioacute la liberacioacuten de
zoosporas y los niveles de infeccioacuten en papa bajo diferentes condiciones ambientales
permitiendo conocer con maacutes detalle varios aspectos de la epidemiologiacutea de la enfermedad
(Lees et al 2008)
Otras variaciones de estas teacutecnicas como la muacuteltiple qPCR utilizando sondas TaqManreg ha
permitido la deteccioacuten y diferenciacioacuten simultaacutenea de la sarna polvosa y la sarna comuacuten
dos enfermedades del tubeacuterculo que causan siacutentomas similares pero que son ocasionadas
por patoacutegenos diferentes (Sss vs Streptomyces spp) (Qu et al 2011) Finalmente como una
19
teacutecnica de diagnoacutestico simultaacuteneo de diferentes patoacutegenos de papa se ha desarrollado un
chip para su anaacutelisis en microarreglos siendo incorporada la deteccioacuten de Sss (Zhang et al
2008)
En Colombia la utilizacioacuten de meacutetodos de deteccioacuten de Sss en tubeacuterculos y suelos ha
estado dada por la evaluacioacuten visual de sintomatologiacuteas en raiacuteces y tubeacuterculos la
evaluacioacuten de bioensayos (Rodriacuteguez et al 2002) y la utilizacioacuten de PCR convencional
utilizando cebadores especiacuteficos (Jaramillo et al 2003 Carrentildeo 2009) Se han utilizado
combinaciones de diversos cebadores que permiten la amplificacioacuten de la regioacuten ITS del
ADNr del patoacutegeno (Spo1-Spo2 Spo8-Spo9 y Sps1- Sps2) los cuales permiten obtener
productos de 372 390 y 391 pb respectivamente (Saavedra et al 2004) Ramiacuterez (2010)
obtuvo amplificacioacuten de los fragmentos del tamantildeo esperado utilizando los cebadores
Spo8Spo9 y SsFSsR para analizar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de Sss
provenientes de La Unioacuten (Antioquia) encontrando una estructura clonal de los
aislamientos evaluados mientras que Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS
y SSCP (Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) con un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones del paiacutes establecioacute la presencia de subpoblaciones del
patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado
34 Variabilidad geneacutetica de Sss
La disponibilidad de cultivares resistentes a Sss debe ser una prioridad en el disentildeo de
futuras estrategias de manejo de la enfermedad Los mejoradores tratan de incluir
resistencia en los nuevos cultivares seleccionando liacuteneas contra un rango de patoacutegenos que
representan la diversidad geneacutetica conocida con el fin de seleccionar la resistencia maacutes
durable Sin embargo poco es conocido acerca de la variacioacuten geneacutetica de Sss o del papel
de la recombinacioacuten sexual en su ciclo de vida (Merz y Falloon 2009)
Los estudios geneacuteticos de Sss han sido difiacuteciles de aplicar debido a razones como las
siguientes obtener y mantener el patoacutegeno es complicado por su naturaleza de paraacutesito
obligado no han existido meacutetodos disponibles para el aislamiento de quistosoros
individuales el desarrollo de la sarna polvosa estaacute influenciado por condiciones
20
ambientales y los estaacutendares de inoculacioacuten y los cultivares de referencia no han sido bien
establecidos (Qu y Christ 2006b)
Los sistemas de deteccioacuten basados en aacutecidos nucleicos ofrecen sensibilidad y especificidad
para la cuantificacioacuten de inoacuteculo (Mutasa et al 1993) En estudios previos amplificando
regiones del ITS del ADNr fueron identificados dos agrupaciones de Sss en Australia y
Europa (tipo I y II) (Bulman y Marshall 1998) Posteriormente se realizoacute una
investigacioacuten sobre la variabilidad geneacutetica de 52 aislamientos de Islas Britaacutenicas y
Norteameacuterica que fueron amplificados por PCR Se identificaron dos grupos geneacuteticamente
diferentes (I y II) que representaron el 346 y el 654 de los aislamientos
respectivamente Sin embargo en Norteameacuterica los aislamientos soacutelo perteneciacutean al grupo
II (Qu y Christ 2004) Debido a que el anaacutelisis de secuencia de ITS se basa en un solo
locus para la deteccioacuten de la variacioacuten geneacutetica los anaacutelisis con marcadores moleculares
que comprendan diferentes partes del genoma del patoacutegeno son necesarios para obtener una
imagen amplia de la variacioacuten geneacutetica y estructura poblacional de Sss
El uso de marcadores moleculares tales como RAPDs (ADN polimoacuterfico amplificado al
azar) y AFLPs (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados) han sido
usados para estudiar la diversidad geneacutetica en muchos patoacutegenos de plantas sin embargo
tales marcadores no estaacuten disponibles para Sss Es complejo obtener estructuras
individuales del patoacutegeno y la uacutenica forma es la obtencioacuten de quistosoros que pueden traer
contaminantes secundarios o contener tejido de la planta Por lo tanto es difiacutecil obtener
ADN puro del patoacutegeno un paso indispensable para llevar a cabo la PCR basada en
marcadores moleculares (Qu y Christ 2006b)
Wuumlerzer (1964) caracterizoacute 17 colecciones de Sss de Europa y Ameacuterica seguacuten el tamantildeo
del quistosoro pero no encontroacute evidencia bioloacutegica significativa de este agrupamiento
Posteriormente se detectoacute variacioacuten geneacutetica (divergencia 51) en secuencias de ADN de
los ITS1 e ITS2 de colecciones de Sss originarias de diferentes continentes (Bulman y
Marshall 1998) Las colecciones de Australasia y Europa incluidas en el grupo II diferiacutean
de otra coleccioacuten de Escocia que fueacute ideacutentica a dos colecciones de Sur Ameacuterica agrupadas
21
en el tipo I La existencia de estos grupos fue confirmada por Qu y Christ (2004) quienes
tambieacuten identificaron ambos grupos en colecciones de Escocia pero demostraron que soacutelo
la secuencia de tipo II es de ocurrencia en colecciones de Canadaacute y Estados Unidos
Los marcadores RFLPs (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccioacuten) son
codominantes y locus especiacutefico (McDonald y Martiacutenez 1990) Han sido utilizados
ampliamente para evaluar diversos genomas de patoacutegenos de plantas A pesar de que
consumen maacutes tiempo que los meacutetodos basados en PCR los RFLPs son maacutes reproducibles
y menos sensibles a contaminacioacuten de ADN que las pruebas basadas en PCR Qu y Christ
(2006b) realizaron un estudio maacutes detallado de colecciones de quistosoros obtenidas de
Estados Unidos y Canadaacute empleando marcadores RFLPs Encontraron variacioacuten geneacutetica
entre las localidades geograacuteficas pero no entre los individuos de una misma localidad lo
que sugirioacute que las poblaciones del campo son clones y no estaban sometidas a
recombinacioacuten sexual El anaacutelisis de agrupamiento permitioacute separar los aislamientos en
dos grupos el grupo I que incluyoacute aislmientos del oeste de Norte Ameacuterica (exceptuando
aislamientos de Colorado) y el grupo II incluyoacute aislamientos originarios del este de Norte
Ameacuterica y de Colorado Este estudio muestra que el uso de marcadores moleculares para
diferenciar aislamientos de quistosoros individuales facilitaraacute investigaciones adicionales
para determinar la estructura geneacutetica de poblaciones de Sss
En Colombia Ramiacuterez (2010) realizoacute un estudio sobre la variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss de La Unioacuten Antioquia Encontroacute que los anaacutelisis de secuencias de la
regioacuten ITS del ADNr presentaron altos niveles de similitud con cepas obtenidas del
Departamento de Narintildeo asiacute como con secuencias de referencia de cepas del tipo II de Sss
Este resultado permitioacute plantear que el patoacutegeno presenta un comportamiento clonal
aunque es necesario obtener informacioacuten de otras regiones del genoma que permitan
realizar anaacutelisis de muacuteltiples loci que conduzcan a una mayor aproximacioacuten sobre las
condiciones de variacioacuten de este patoacutegeno en el paiacutes
Otro estudio realizado por Carrentildeo (2009) sobre la variabilidad geneacutetica de Sss en
Colombia mediante el anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr permitioacute establecer la
22
presencia de subpoblaciones del patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Se
encontroacute una asociacioacuten directa entre las secuencias ITS del patoacutegeno y el oacutergano de la
planta infectado El tipo de ITS I se asocia aparentemente con infecciones de tubeacuterculo y el
tipo de ITS II lo hace con infecciones de raiacutez Esta investigacioacuten permitioacute descartar la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar hospedero o zona
geograacutefica Sin embargo de acuerdo con esta investigacioacuten es necesario realizar pruebas
que aborden otras aacutereas del genoma para corroborar los resultados encontrados Asiacute mismo
se comproboacute que en el paiacutes existen variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las
reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno Tres
variantes geneacuteticas de las cinco encontradas en este estudio difieren de las reportadas en la
literatura mundial
35 Generalidades del Potato mop-top virus (PMTV)
El PMTV es el agente causal de una importante enfermedad viral del cultivo de la papa
cuya distribucioacuten se encuentra registrada en diferentes lugares productores de este
tubeacuterculo como Irlanda Inglaterra Escocia Republica Checa Suiza Noruega Suecia
Dinamarca y Finlandia (Santala et al 2010) asiacute como en Japoacuten (Nakayama et al 2010) En
Ameacuterica ha sido registrado en Canadaacute y Estados Unidos (Xu et al 2004) En eacuteste uacuteltimo
paiacutes se reportoacute recientemente en los estados de North Dakota (David et al 2010) y en
Washington (Crosslin 2011) Nuevos reportes de este virus se continuan presentado en
otros paiacuteses del mundo como Polonia (Budziszewska et al 2010)
En Ameacuterica Central se ha encontrado en Costa Rica (Montero-Astua 2008) y aunque se
considera que es originario de la regioacuten de los Andes (Surameacuterica) soacutelo fue detectado en
Colombia en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) con la reconfirmacioacuten de su presencia en el antildeo
2010 (Gil et al 2011) El PMTV puede causar peacuterdidas de hasta 26 en rendimiento lo
que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera ascender a valores de
50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 Guerrero 2000) Seguacuten Salazar (2006)
el PMTV es uno de los virus que ha sido prevalente en el cultivo de la papa en los Andes
23
suramericanos pero su efecto sobre las variedades cultivadas en esta regioacuten no se ha
cuantificado claramente
351 Taxonomiacutea de PMTV
El PMTV pertenece al geacutenero Pomovirus virus con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20
nm en diaacutemetro y tres partiacuteculas con longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm
El geacutenero Pomovirus deriva su nombre de la especie tipo Potato mop-top virus y
actualmente se ubica en el la familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Los anaacutelisis
filogeneacuteticos de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRps) indican que el PMTV
estaacute relacionado maacutes estrechamente con el Beet soil-borne virus (Pomovirus) Broad bean
necrosis virus (Pomovirus) y Soil-borne Wheat mosaic virus (Furovirus) (Savenkov et al
1999)
Contiene tres moleacuteculas de ARNss con tamantildeos de 64 kb 3 kb y 25 kb con caperuzas
hacia el extremo 5rsquo y una estructura tipo ARNt hacia el extremo 3rsquo (Savenkov et al 1999
2003) El coeficiente de sedimentacioacuten de las partiacuteculas es de 230 170 y 125S
respectivamente El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene motivos de
metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del codoacuten de
finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999) Cerca del extremo
3acutedel ARN 2 se presenta una proteiacutena asociada a la transmisioacuten por el vector y generada a
partir de la supresioacuten del codoacuten de terminacioacuten del ORF que codifica para la caacutepside (CP)
Esta proteiacutena parece ser la responsable de la peacuterdida de la estructura helicoidal en los
extremos del ARN durante el proceso de desensamblaje (Sandgren et al 2001) El ARN 3
codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Tres de las
proteiacutenas producidas (TGB1 TGB2 y TGB3) estaacuten involucradas en el movimiento ceacutelula a
ceacutelula (Zamyatnin et al 2004) La funcioacuten de la cuarta proteiacutena una proteiacutena rica en
cisteiacutena parece ser la de actuar en el incremento de la virulencia sin embargo no es
indispensable para el proceso infectivo (Lukhovitskaya et al 2005) (Figura 1)
24
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV En las cajas se observan las proteiacutenas
para las que codifica el genoma Las flechas indican las proteiacutenas originadas y los ARN
subgenoacutemicos (ARNsg) Fuente httpwwwexpasychviralzoneall_by_species643html
Modificado por Gallo (2012)
352 Ciclo de la infeccioacuten de PMTV
La especie PMTV es transmitida por zoosporas de Sss que afecta los sistemas radiculares
de sus hospedantes Este virus tambieacuten puede ser transmitido por semilla asexual El virus
puede permanecer en las estructuras de resistencia de sus vectores por varios antildeos en el
suelo (Astier et al 2007 Dijkstra y Khan 2006) En los ensayos de transmisioacuten del virus se
ha observado que eacuteste es transmitido eficientemente a plantas indicadoras (ej N tabacum y
N benthamiana) a partir de muestras de suelo infestadas con quistes del patoacutegeno
(Campbell 1996 Veacutelez 2007)
25
El PMTV constituye un pequentildeo grupo de virus que para su movimiento sisteacutemico en la
planta hospedante no requiere de la expresioacuten de CP ni de la formacioacuten del virioacuten
(McGeachy y Barker 2000) debido a que el TGB le ofrece la posibilidad de mover el ARN
infeccioso a traveacutes de largas distancias en la planta (Melander et al 2001) Actualmente se
generan nuevas teoriacuteas acerca del movimiento de TGB en la planta y de la funcioacuten de cada
una de las proteiacutenas TGBp1 TGBp2 y TGBp3 en el movimiento ceacutelula a ceacutelula de PMTV
Shemyakina et al (2011) analizaron la localizacioacuten subcelular y el transporte de TGBp1
de acuerdo con los resultados obtenidos propusieron que la asociacioacuten de TGBp1 con los
microtuacutebulos puede ser importante para la formacioacuten de cuerpos de complejos de ribo-
nuacutecleo-proteiacutena viral destinada para el transporte a traveacutes de los plasmodesmos Estudios
similares han sido realizados por Wright et al (2010) cuyos resultados sugieren que TGB1
en PMTV requiere interaccioacuten con componentes nucleolares y posiblemente con
microtuacutebulos para el movimiento viral de ARN de larga distancia
El ARN desnudo se puede encontrar en tubeacuterculos asintomaacuteticos y causar una infeccioacuten
secundaria para la siguiente temporada de siembra (McGeachy y Barker 2000) La
manifestacioacuten de los siacutentomas caracteriacutesticos de la enfermedad depende de la presencia de
los tres ARN en el tejido (Savenkov et al 2003)
353 Rango de hospederos de PMTV
En condiciones experimentales el virus puede infectar plantas de las familias
Chenopodiaceae Solanaceae y Tetragoniaceae Dentro de estas se encuentran las plantas
que se usan para su diagnoacutestico las cuales corresponden a Nicotiana debneyi y
Chenopodium amaranticolor en las que se produce necrosis sisteacutemica y lesiones locales
conceacutentricas cafeacutes respectivamente Nicotiana benthamiana N debneyi N clevelandii y
N tabacum son las especies maacutes apropiadas para el mantenimiento y propagacioacuten del virus
bajo condiciones experimentales (ICTVdB 2006 Veacutelez 2007)
26
354 Siacutentomas causados por PMTV
La enfermedad inducida por PMTV presenta una amplia gama de siacutentomas dependiendo de
la variedad y de las condiciones ambientales siendo frecuente la presencia de anillos y
arcos de colores oscuros sobre la superficie de los tubeacuterculos mientras que internamente se
presentan arcos necrosados En infecciones secundarias los tubeacuterculos pueden mostrar
agrietamientos reticulados y profundos Adicionalmente los foliacuteolos de las plantas
afectadas pueden presentar moteados cloroacuteticos y liacuteneas con formas de V En la regioacuten
Andina la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos no es frecuente de observar pudiendo ser
igualmente inducidas por cepas necroacuteticas de PVY oacute por Streptomyces spp y Rhizoctonia
solani (Tenorio et al 2006) A nivel aeacutereo el virus tambieacuten puede inducir amarillamientos
enanismos y acortamiento de entrenudos (Salazar 1995)
En Escocia se estudioacute el efecto de los siacutentomas foliares causados por PMTV sobre el
rendimiento del cultivo los siacutentomas foliares y en el tubeacuterculo de varias generaciones de
siembra para la propagacioacuten de semilla de papa Se encontroacute que en los tubeacuterculos de
plantas sin siacutentomas rara vez se observan los siacutentomas foliares en la siguiente generacioacuten
Las plantas asintomaacuteticas produjeron maacutes tubeacuterculos infectados cuando eran derivadas de
plantas que presentaron siacutentomas foliares el antildeo anterior Adicionalmente la proporcioacuten de
plantas hijas con siacutentomas foliares provenientes de tubeacuterculos con siacutentomas foliares
tuvieron un rango de 19-41 en el antildeo y parecioacute estar asociado con la severidad de dichos
siacutentomas Asiacute mismo el siacutentoma de ldquospraingrdquo en los tubeacuterculos tendioacute a ser mayor en
plantas que presentaban siacutentomas foliares comparados con aquellas asintomaacuteticas Estos
resultados mostraron que la erradicacioacuten de plantas con siacutentomas foliares podriacutea mejorar la
fitosanidad del cultivo pero resulta impraacutectico cuando las plantas enfermas son muy
frecuentes (Carnegie et al 2010) Sin embargo los siacutentomas foliares son raramente
observados en variedades cultivadas actualmente en los paiacuteses noacuterdicos con excepcioacuten de
Noruega La razoacuten para estas diferencias de la etiologiacutea de la enfermedad no son
comprendidas pero puede ser que el clima marino maacutes huacutemedo en Noruega y Escocia
afecta la fisiologiacutea de la planta de papa e incrementa la infeccioacuten sisteacutemica por PMTV
(Santala et al 2010)
27
36 Deteccioacuten de PMTV
Para la deteccioacuten de PMTV se han utilizado diversas teacutecnicas de laboratorio Las primeras
pruebas incluyeron bioensayos con plantas indicadoras como Chenopodium amaranticolor
las cuales desarrollan los siacutentomas cuando son infectadas por PMTV Esta teacutecnica resulta
informativa pero tarda alrededor de 14 diacuteas para la expresioacuten de siacutentomas que en
ocasiones no son completamente confiables (Jeffries 1998)
Con el desarrollo de las pruebas ELISA se hizo posible la deteccioacuten de PMTV en dos diacuteas
sin embargo la generacioacuten de falsos negativos debido a la distribucioacuten erraacutetica del virus en
la planta ha hecho que se cuestione dicha teacutecnica Arif y Torrance (1996) realizaron
estudios de deteccioacuten de PMTV en muestras de tubeacuterculos de tres cultivares de papa
concluyendo que la combinacioacuten de tejidos de tubeacuterculos en la muestra incrementa la
probabilidad de deteccioacuten del virus En Dinamarca la utilizacioacuten de la teacutecnica DAS -
ELISA (Sandwich de anticuerpos doble - Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas)
tuvo alta confiabilidad para el seguimiento de la presencia de PMTV en 23 cultivares de
papa sembrados en campo (Nielsen y Moslashlgaard 1997)
La utilizacioacuten de teacutecnicas basadas en aacutecidos nucleicos ha llevado al desarrollo de meacutetodos
de deteccioacuten de alta sensibilidad La RT-PCR es uno de estos meacutetodos de deteccioacuten maacutes
sensible Arif et al (1994) compararon la confiabilidad de ELISA y RT-PCR en la
deteccioacuten de PMTV de raiacuteces y hojas de plantas trampa de Nicotiana debneyi Luego de
tres semanas de siembra la RT-PCR detectoacute el virus en ambos tejidos mientras que con
ELISA se obtuvo la deteccioacuten del virus soacutelo despueacutes de cinco semanas de la siembra A
pesar de que la teacutecnica RT-PCR es maacutes sensible la preparacioacuten de las muestras para este
meacutetodo lleva maacutes tiempo por lo tanto ELISA es considerada por algunos investigadores
como la teacutecnica maacutes econoacutemica y conveniente para el anaacutelisis rutinario de grandes
cantidades de muestras (Davey 2009)
Davey (2009) realizoacute estudios de deteccioacuten y cuantificacioacuten de PMTV utilizando qRT-
PCR y disentildeando un par de cebadores y una sonda para cada ARN del genoma del virus El
bioensayo desarrollado para las muestras de suelo fue muy efectivo en la deteccioacuten de
28
PMTV utilizando Solanum esculentum cv Monkeymaker como planta trampa y cuando se
usoacute en conjunto con qRT-PCR los resultados se obtuvieron maacutes raacutepidamente que los de
otros bioensayos previamente descritos por Arif et al (1994) quienes utilizaron
Chenopodium quinoa como planta trampa
Otros meacutetodos basados en RT-PCR han sido empleados en Japoacuten por Nakayama et al
(2010) mediante microplacas de hibridizacioacuten RT-PCR (RT-PCR-MPH) para la deteccioacuten
de PMTV con cebadores especiacuteficos y una sonda marcada en muestras provenientes de
raiacuteces de plantas de tomate Asiacute mismo el diagnoacutestico en muestras de suelo utilizando este
meacutetodo determinoacute que el 612 de los lotes muestreados estaban infectados con PMTV
La hibridizacioacuten especiacutefica basada en amplificacioacuten con cebadores con marcadores
fluorescentes (Flash-PCR) tambieacuten ha sido una teacutecnica basada en PCR que ha permitido la
deteccioacuten raacutepida y precisa de diferentes virus de la papa como el PMTV (Ryazantsev y
Zavriev 2009) De otro lado los microarreglos con sondas especiacutefica para virus pueden
detectar un nuacutemero casi ilimitado de especies de virus en un solo ensayo Nicolaisen
(2011) realizoacute un estudio de microarreglos con la utilizacioacuten de 152 sondas potencialmente
capaces de detectar 52 virus en papa (incluyendo PMTV) Las hibridizaciones del ADNc de
plantas infectadas mostraron que 49 de los 52 virus fueron positivos e identificados
correctamente a nivel de especie demostrando que esta teacutecnica puede contribuir a la
construccioacuten de microarreglos geneacutericos capaces de detectar la mayoriacutea sino todos los
virus de ARN de plantas
En Colombia la deteccioacuten de PMTV fue reportada por primera vez por Veacutelez (2007) Los
ensayos de RT-PCR permitieron determinar que el 81 de los suelos muestreados en el
estudio presentaron infeccioacuten por PMTV Este meacutetodo utilizando los cebadores H360
C819 fue maacutes sensible para la deteccioacuten de PMTV que la induccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras En estos bioensayos se encontroacute que las plantas de N tabacum fueron mejores
indicadoras de la expresioacuten de siacutentomas que las de N debneyi pero estas uacuteltimas son maacutes
sensibles para la deteccioacuten de PMTV por RT-PCR
29
Gil (2010) realizoacute la evaluacioacuten de la presencia del virus PMTV a partir de plantas de N
benthamiana inoculadas con quistosoros de Sss mediante pruebas de deteccioacuten seroloacutegica y
molecular Un total de 18 muestras de raiacuteces infectadas con Sss fueron evaluadas
encontraacutendose que cinco muestras de Antioquia y una de Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo
arrojaron resultados positivos en las pruebas de ELISA Al comparar estos resultados con
los obtenidos con qRT-PCR se encontroacute que la prueba de qRT-PCR determinoacute la presencia
del virus en el 45 de las muestras analizadas mientras que mediante ELISA y RT-PCR
convencional se diagnosticaron 25 y 28 de las muestras como positivas Sin embargo el
anaacutelisis estadiacutestico no indicoacute diferencias significativas al nivel del 95 entre las tres
pruebas analizadas Al observar individualmente la capacidad de las pruebas para detectar
PMTV resultoacute llamativo el hecho que algunas muestras fueran positivas para dos de las
tres pruebas e incluso se presentaron casos en los que la prueba de ELISA detectoacute el virus
pero no las pruebas basadas en RT-PCR lo cual sugirioacute problemas con la inhibicioacuten de las
reacciones enzimaacuteticas o con los cebadores empleados
37 Variabilidad geneacutetica de PMTV
A nivel mundial se han desarrollado investigaciones que reportan la presencia de bajos
niveles de variacioacuten entre genotipos de PMTV (Mayo et al 1996) Latvala-Kilby et al
(2009) caracterizaron el gen de la CP y un dominio de lectura continua del ARN 2 asiacute
como el gen 8K y la regioacuten no traducida 3acutedel ARN 3 (UTR) de 37 aislamientos de
Finlandia y Letonia Fueron encontrados dos tipos diferenciables de ARN 2 y ARN 3 La
secuenciacioacuten y los anaacutelisis de RFLP de los productos de PCR de dichas regiones
indicaron que la mayoriacutea de los aislamientos de PMTV que infectaron tubeacuterculos en estos
paiacuteses europeos comprenden los restrictotipos ARN 2-II y ARN 3-B
En estudios previos en los cuales las secuencias CP de tres aislamientos de Escocia y ocho
de Peruacute fueron analizadas por Mayo et al (1996) las cepas bajo anaacutelisis mostraron poca
variabilidad De forma similar las secuencias CP de seis aislamientos de Norteameacuterica
presentaron una identidad mayor al 97 con respecto a algunas secuencias de aislamientos
de PMTV de Europa (Xu et al 2004) En Dinamarca se reportoacute la presencia de dos grupos
30
de PMTV basado en anaacutelisis de las secuencias de CP encontrando que eacutestos comparten
98 de identidad pero con posibles diferencias en la reproduccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras (Nielsen y Nicolaisen 2003) Al parecer la variabilidad geneacutetica de los genes
de la CP en aislamientos de PMTV del norte de Europa y Norte Ameacuterica es limitada y
permite la deteccioacuten confiable del virus con los anticuerpos monoclonales y los cebadores
de la PCR usados actualmente (Santala et al 2010)
En Colombia Velez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo con alta identidad con aislamientos de Europa
y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por aislamientos colombianos Una
situacioacuten similar encontroacute Gil (2010) con aislamientos Colombianos de PMTV que
presentaron una estructura poblacional con bajos niveles de variabilidad pero con algunas
variantes divergentes con respecto a los genotipos de referencia mundial Dichas variantes
presentaron diferencias en sus secuencias de CP hasta del 24 con respecto al grupo
principal La contextualizacioacuten en el genoma viral de dos secuencias obtenidas por dicho
autor en cepas de PMTV del departamento de Antioquia indicoacute que se tratan de
aislamientos representativos del genoma ordinario de PMTV y no de las variantes
encontradas en el anaacutelisis filogeneacutetico Sus identidades para las porciones del ARN 2 y
ARN 3 secuenciadas fueron altas (gt97) con respecto a los genomas reportados en
trabajos anteriores (Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) por lo que se plantea la
necesidad de secuenciar dichas regiones en al menos un aislamiento de las variantes
referidas
Los resultados encontrados en esta investigacioacuten permiten plantear que el caso de PMTV
en Colombia es aparentemente singular dada la presencia de dos variantes geneacuteticas de los
altos niveles de infeccioacuten que genera Sss en cultivos de papa de diferentes departamentos y
de las diferencias notables en la manifestacioacuten de siacutentomas de la sarna polvosa entre
variedades locales (Carrentildeo 2009 Gilchrist et al 2009 Gil 2010) situacioacuten que amerita
continuar con los estudios de variabilidad geneacutetica y fenotiacutepica en dichos patosistemas
31
BIBLIOGRAFIA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Agrios GN 1996 Fitopatologiacutea Editorial Limusa Meacutexico
Andersen BAB Nicolaisen M Nielsen SL 2002 Alternative hosts for Potato mop-top
virus genus Pomovirus and its vector Spongospora subterranea Potato Research 45 37-
43
Arias CMM 2011 Anaacutelisis y comparacioacuten de los glucosinolatos presentes en diferentes
acceciones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control
del patoacutegeno de la papa Spongospora subterranea Tesis de Maestriacutea en Ciencias Quiacutemicas
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Departamento de quiacutemica
Bogataacute Colombia
Arif M Torrance L Reavy B 1994 Improved efficiency of detection of potato mop- top
furovirus in potato tubers and in the roots and leaves of soil-bait plants Potato Research
37 373-381
Arif M Torrance L 1996 Detection of Potato mop-top virus in potato tubers Proceedings
Crop Protection in Northern Britain 325-330
Astier S Albouy J Maury Y Robaglia C Lecoq H 2007 Principles of plant virology
genome pathogenicity virus ecology Science Publishers Enfield NH USA P 112
Bell KS Roberts J Verral S Cullen DW Williams NA Harison JG 1999 Detection and
quantification of Spongospora subterranea fsp subterranea in soils and on tubers using
specific primers PCR primers European Journal of Plant Pathology 105905-915
Benavides PJA 2006 Incidencia y severidad de la rontildea de la papa causada por
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh f sp subterranea Tomlinson en raiacuteces y
tubeacuterculos de Diacol Capiro y Parda Pastusa en tres eacutepocas de siembra en el departamento
32
de Narintildeo y su efecto en los rendimientos (Tesis de maestriacutea) Bogotaacute Colombia Facultad
de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid diagnostic
test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European Journal of Plant
Pathology 131 (2) 277-287
Budziszewska M Wieczorek P Nowaczyk K Borodynko N Pospieszny H Obrecircplaska-
Stecircplowska A 2010 First report of potato mop-top virus on potato in Poland Plant
Disease 94 (7) 920
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47759-766
Campell RN 1996 Fungal transmission of plant viruses Annuals Review of
Phytopathology 3487-108
Carnegie SF Cameron AM McCreath M 2010 Foliar symptoms caused by Potato mop-
top virus on potato plants during vegetative propagation in Scotland and their association
with tuber yield spraing and tuber infection Potato Research 53 83-93
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia (Tesis de Maestriacutea) Bogotaacute
Colombia Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Colombia
Cerovska N Pecenkeva T Filigarovaacute M Dedic P 2007 Sequences analysis of the Czech
Potato Mop-Top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica 52(1) 61-
64
Cotes J Jaramillo S Gonzaacutelez L 2006 Evaluacioacuten de la incidencia de sarna polvosa en
tres variedades de papas colombianas Congreso Internacional de papa John S
Niederhauser Meacutexicop O-7 ISBN 968-02-0270-4
33
Crosslin JM 2011 First report of potato mop-top virus on potatoes in Washington State
Plant Disease 95 (11)1483
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
David N Mallik I Crosslin JM Gudmestad NC 2010 Firt report of Potato mop-top virus
in North Dakota Plant Disease 94 (12)1506
Dick MW 2001 Straminipilous fungi systematic of the Peronosporomycetes including
accounts of the marine straminipilous protist the plasmodiophorids and similar organisms
Kluwer Dordrecht
Dijkstra J Khan JA 2006 Handbook of Plant Virology Haworth Press Inc New York
US Jawaid A Khan Jeanne Dijkstra editors P 452
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC Scott CL 2010 Elevated zinc and manganese
levels give moderate reductions in Spongospora subterranea infection of potato roots In
Proceedings 6th Australasian Soilborne Diseases Symposium Twin Waters Queensland 9-
10 August 2010 P 46
Falloon RE Russell AG Wallace AR Butler RC 2003 Susceptibility of potato (Solanum
tuberosum) cultivars to powdery scab (caused by Spongospora subterranea) and
relationships between tuber and root infection Australasian Plant Pathology 32377-385
FAO 2008 Antildeo internacional de la papa (Citado 14 enero 2011) Disponible en
httpwwwpotato2008orgesmundoamerica_latinahtml
FAO 2009 Sustainable potato production Guidelines for developing countries (Citado 14
enero 2011) Disponible en ftpftpfaoorgdocrepfao012i1127ei1127epdf
34
Gallo GYM 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea Facultad de Medicina Universidad Nacional de Colombia
Bogotaacute Colombia
Garciacutea C Navia E 2002 Evaluacioacuten de estrateacutegias de manejo de la rontildea polvosa
(Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en Colombia
(Citado 14 Ene 2011) Disponible en
httpwwwredepapaorgpracticasculturalesred3html
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Gil RJF Mariacuten M 2010 Diagnoacutestico y caracterizacioacuten molecular de virus asociados al
cultivo de la papa en Colombia con eacutenfasis en el virus Mop Top (PMTV Pomovirus)
(Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia
Gilchrist RE 2009 Alternativas para el manejo integrado de la sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) (Tesis de Doctorado) Medelliacuten Colombia
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia
Gilchrist E Jaramillo S Reynaldi S 2009 Efecto sobre la sarna polvosa de cuatro
aislamientos del hongo Trichoderma asperellum en tres tipos de suelo Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 624783ndash4792
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
35
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tuber by enzyme-linked immunosorbent assay Plant pathology
42181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato-a review
Plant pathology 461-25
Hoyos L Peacuterez JC Jaramillo S Orduz S Ntildeustez C 2002 Evaluacioacuten del efecto de
Trichoderma spp sobre Spongospora subterranea en papa variedad Diacol Capiro bajo
condiciones de invernadero Subproyecto 4 de Evaluacioacuten de las estrategias de manejo de la
rontildea polvosa (Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en
Colombia 2002 Disponible en wwwcevipapaorgco
Hoyos CL Villegas OM Gonzalez JEP 2009 Observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Spongospora subterranea f sp subterranea en papa Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 62(2) 5039-5045
Houser AJ Davidson RD 2010 Development a greenhouse assay to evaluate potato
germplasm for susceptibility to powdery scab American Journal of Potato Research 87
285-298
ICTVdB 2006 Management Potato mop-top virus The Universal Virus Database version
4 Buumlchen-Osmond C (Ed) Columbia University New York USA (Citado 20 Dic 2010)
Disponible en httpwwwncbinlmnihgovICTVdbICTVdB00086001001htm
Jaramillo S Calderoacuten H Narvaacuteez C Machuca A Afanador L Hincapieacute L Correa G 2003
Caracterizacioacuten de la variabilidad patogeacutenica y molecular de Spongospora subterranea
Informe final fase 2 Convenio Universidad Nacional Sede Medelliacuten y CEVIPAPA
Medelliacuten p 80
Jaramillo S Gonzaacutelez L Cotes J 2006 Efecto del tipo de suelo sobre la sarna polvosa
causada por Spongospora subterranea f sp subterranea (Wall) Lagerheim en papa
36
Congreso Internacional de papa John S Niederhauser Meacutexico p O-6ISBN 968-02-0270-
4
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos cultivares de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista de la Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 60(2)
3859-3876
Jaramillo VS Peacuterez AGA Hoyos CLM 2008 Variacioacuten morfoloacutegica de quistosoros de
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh fsp subterranea Revista Facultad de
Agronomiacutea ndash Medelliacuten 61(2)4511-4517
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Jones RAC Harrison BD 1969 The behaviour of Potato mop top virus in soil and
evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wall) Lagerh Annals Applied
Biology 63 1-17
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 71 47-57
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003 First
Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease 87872
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99(5)519-531
Lees AK 2000 Summary of the session on past and present research on powdery scab
Past and present Research Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery
scab Workshop Aberdeen Scottland July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) P 55-57
37
Lees AK van de Graaf P Cullen DW Duncan JM 2002 The development of a
quantitative real-time PCR assay for Spongospora subterranea f sp subterranea and its
use in epidemiological studies In Proceedings of the 5th
symposium of the international
working group on plant viruses with fungal vectors Institute of Plant Science Swiss
Federal Institute of Technology (ETH) Zurich Switzerland July 22-25 2002 P31
Lees AK van de Graaf P Wale S 2008 The identification and detection of Spongospora
subterranea and factors affecting infection and disease American Journal of Potato
Research 85 247-252
Lister RA Falloon RE Curtin D Butler C 2004 Spongospora subterranea reduces host
(Solanum tuberosum) growth Proceedings of 3rd
Australasian Soilborne Diseases
Symposium Barossa Valley South Australia 9-11 February 2004
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization and
effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal of
General Virology 862879-2889
Lyman GR Rogers JT 1915 The native habitat of Spongospora subterranea Science
42940-2
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2005 La cadena de la papa en
Colombia Una mirada a su estructura y dinaacutemica 1991-2005 Documento de trabajo Ndeg 54
(Citado 13 Ene 2011) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet2005112163731_caracterizacion_papapdf
MADR (Ministerio de agricultura y desarrollo rural) 2006 Observatorio agrocadenas
Colombia Documento de trabajo No 100 La cadena de la papa en Colombia Una mirada
global de su estructura y dinamica 1991-2005 (Citado 20 Dic de 2011) Disponible en
httpwwwagrocadenasgovco
38
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009a Memorias 2008- 2009
(Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwminagriculturagovcoarchivosmemorias_minagricultura_2009_completopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009b Anuario estadiacutestico del
sector agropecuario y pesquero Direccioacuten de poliacutetica sectorial Grupo sistemas de
informacioacuten Bogotaacute DC (Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwhtm3bpublicanuarioanuariopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural)ndashENA (Encuesta Nacional
Agropecuaria) 2009 Oferta Agropecuaria cifras 2009 (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet201046112648_RESULTADOS_ENA_200
9pdf
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C Salazar
LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top virus
from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
McDonald BA Martinez JP 1990 Restriction fragment length polymorphisms in Septoria
tritici occur at a high frequency Current Genetics 17133-138
McGeachy KD Barker H 2000 Potato mop-top virus RNA can move long distance in the
absence of coat protein Evidence from resistant transgenic plants Molecular Plant
Microbe Interactions 13125-128
Melander M Lee M Sandgren M 2001 Reduction in Potato mop-top virus accumulation
and incidence in tubers of potato transformed with a modified triple gene block gene of
PMTV Molecular Breeding 8197-206
Merz U 1989 Infectivity inoculum density and germination of Spongospora subterranea
resting spores a solution culture test system Bulletin OEPP 19 585-592
39
Merz U 2000 Powdery scab Research in Switzerland Past and present Research
Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery scab Workshop Scottland
July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) 2000 p 67-71
Merz U 2008 Powdery Scab of PotatomdashOccurrence Life Cycle and Epidemiology
American Journal of Potato Reserch 85241ndash246
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar
x environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Merz U Martiacutenez V Schwaumlrzel R 2004 The potencial for the rapid screening of potato
cultivars (Solanum tuberosum) for resistance to powdery scab (Spongospora subterranea)
using a laboratory bioassay European Journal of Plant Pathology 110 71-77
Merz U Walsh JA Bouchek-Mechiche K Oberhaumlnsli TH Bitterlin W 2005 Improved
immunological detection of Spongospora subterranea European Journal of Plant
Pathology 111371ndash379
Merz U Falloon RE 2009 Review Powdery scab of potato-increased knowledge of
pathogen biology and disease epidemiology for effective disease management Potato
Research 5217-37
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert HR 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar x
environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Montero-Astua M Vasquez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
40
Murakami H Tsushima S Akimoto T Murakami K Goto I Shishido Y 2000 Effects of
growing leafy daikon (Raphanus sativus) on populations of Plasmidiophora brassicae
(clubroot) Plant Pathology 49584-589
Mutasa ES Ward E Adams MJ Collier CR Chwarszcynska D Asher MJC 1993 A
sensitive DNA probe for the detection of Polymyxa betae in sugar beet roots Physiological
and Molecular Plant Pathology 43 379-390
Mutasa-Gottgens ES Chwarszczynska Halsey H Asher MJC 2000 Specific polyclonal
antibodies for the obligate plant parasite Polymyxa a targeted recombinant DNA approach
Plant Pathology 49276-87
Nakayama T Maoka T Hataya T Motoshige S Fuwa S Mori M 2010 Diagnosis of
Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-285
Nicolaisen M 2011 An oligonucleotide-based microarray for detection of plant RNA
viruses Journal of Virological Methods 173 137-143
Nielsen SL Moslashlgaard JP 1997 Incidence appearance and development of potato mop-top
furovirus-induced sprain in potato cultivars and the influence on yield distribution in
Denmark and detection of the virus in tubers by ELISA Potato Research 40101-110
Nielsen S Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups within
Potato mop-top virus Archives of Virology 148381ndash388
Nitzan N Boydston R Batchelor D Crosslin J Brown C 2009 Hairy nightshade is an
alternative host of Spongospora subterranea the potato powdery sacab pathogen
American Journal of Potato Research 86 297-303
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
41
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006a The host range of Spongospora subterranea f sp subterranea in
the United States American Journal of Potato Research 83343-347
Qu XS Christ BJ 2006b Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea fsp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Ramiacuterez GJG 2010 Variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp subterranea
en suelos del municipio de unioacuten cultivados con la coleccioacuten Central colombiana de
Solanum phureja (Tesis de Pregrado) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias
Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia 2010
Restrepo DAF Jaramillo VS Cotes TJM 2009 Efecto de dos microorganismos y un
consorcio de micorrizas en combinacioacuten con viruta de pino sobre el control de sarna
polvosa (Spongospora subterranea) en papa Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea
Medelliacuten 62(2) 5047-5054
Rodriacuteguez K Maldonado Y Murcia L Huertas W Vaacutesquez M Zambrano A Rivero R
Garciacutea C 2002 Evaluacioacuten de protocolos para la deteccioacuten de patoacutegenos del suelo en Papa
(Rhizoctonia Rosellinia y Spongospora) (Citado 15 Ene 2011) Disponible en
httpwwwtodopapacomarpdfprotocolospdf
42
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista Facultad Agronomiacutea 26 (4) Caracas
Ryazantsev DYu Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato plant pathogens Applied Molecular Biology 43(3) 515-523
Saavedra SCO Goacutemez GST Aacutengel DJE 2004 Deteccioacuten de secuencias especiacuteficas de
ADN de Spongospora subterranea en suelo y tubeacuterculos de papa Revista Colombiana de
Biotecnologiacutea 714-23
Salazar LF1995 Los virus de la papa y su control Centro Internacional de la Papa CIP
(Peruacute) Publicado por el Centro Internacional de la Papa P 226
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 49 43-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M Wieczorek
P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-Wiśniewska J Yin Z
Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E Taluntytė L Pūpola N
Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E Sozonov A Tikhonovich I
Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam G Valkonen JPT 2010 Detection
distribution and control of Potato mop-top virus a soil-borne virus in northern Europe
Annals of Applied Biology 157163-178
43
Savenkov EI Sandgren M Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003 Potato
mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich protein are
dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of General
Virology 841001-1005
Shah FA Falloon RE Bulman SR 2010 Nightshade weeds (Solanum spp) confirmed as
hosts of the potato pathogens Meloidogyne falax and Spongospora subterranea f sp
subterranea Australasian Plant Pathology 39 492-498
Shah FA Falloon RE Lister RA Butler RC McKay A Ophel-Keller K Khan I 2009
Relationships between Spongospora subterranea DNA in field soil and powdery scab in
harvested potatoes Conference Handbook 17th
Australasian Plant Pathology Society
Conference (APPS) 29 September-1 October 2009 P 148
Shemyakina EA Sclovyev AG Leonova OG Popenko VI Schiemann J Morozov SY
2011 The role of microtubule association in plasmodesmal targeting of potato mop-top
virus movement protein TGBp1 The Open Virology Journal 51-11
SINAIPA (Sistema nacional de informacioacuten de papa) 2002 La rontildea de la papa p 8-9 El
Correo de la Papa Boletiacuten mensual No 07 Colombia (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en wwwcevipapaorgcopublicacionespublicacionesphp
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Reserch 83423-31
Torres H Pacheco MA French ER 1995 Resistance of potato to powdery scab
(Spongospora subterranea) under Andean field conditions American Potato Journal
10355-363
44
van de Graff PV Lees AK Cullen DW Duncan JM 2003 Detection and quantification of
Spongospora subterranea soil water and tissue samples using real-time PCR European
Journal of Plant Pathology 109 589-597
van de Graff P Wale SJ Lees AK 2007 Factors affecting the incidence and severity of
Spongospora subterranea infection and galling in potato roots Plant Pathology 56 1005-
1013
Veacutelez B 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato mop- top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia (Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Nacional de Colombia
Villareal HJ Porras PD Santa A Lagoeyte J Muntildeoz D 2007 Costos de produccioacuten de
papa en las principales zonas productoras de Colombia Federacioacuten Colombiana de
productores de papa FEDEPAPA
Wale SJ Burgess PJ Burnett F 1993 Bioassay for Spongospora subterranea detection in
soil and its potential use in predicting scab in the field Abstract 1642 Sixth International
Congress of Plant Pathology Quebec Canada
Wallroth FW 1842 Der Knollenbrand der Kartoffel Linnaea 16 332
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea using monoclonal antibodies Plant pathology 44335-365
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2004 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165 875-85
Ward LI Beales PA Barnes AV Lane CR 2005 A Real-time PCR assay based method for
routine diagnosis of Spongospora subterranea on Potato tubers Journal Phytopathology
152 633-638
45
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI Torrance
L 2010 The N- terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required for the
nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant Microbe Interaction 23(1) 1486-1497
Wuumlrzer B 1964 Ergaumlzende Untersuchungen uumlber den Pulverschorf der Kartoffel und
dessen Erreger Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh diss Landwirtschaftliche
Hochschule Hohenheim Germany 1964
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top virus
in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
Zamyatnin JrAA Solovyev AG Savenkov EI Germundsson A Sandgren M Valkonen
JPT Morozov SY 2004 Transient coexpression of individual genes encoded by the triple
gene block of Potato mop-top virus reveals requirements for TGBp1 trafficking Molecular
Plant-Microbe Interactions 17(8) 921-930
Zhang N McCarthy ML Smart CD 2008 A macroarray system for the detection of fungal
and oomycete pathogens of solanaceous crops Plant Disease 92(6) 953-960
Zolan ME Pukilla PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinerus
Molecular and cellular Biology 6(1)195-200
46
RESULTADOS
4 ARTICULO 1
VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora subterranea f sp subterranea EN
COLOMBIA
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea IN
COLOMBIA
Ineacutes Osorio Giraldo1 Marcela Orozco Valencia
1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
1 Elena Paola
Gonzaacutelez Jaimes2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
Formato de la Revista Actualidades Bioloacutegicas ISSN 0304-3584
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
La Sarna polvosa de la papa (Spongospora subterranea fsp subterranea - Sss) es una de
las enfermedades re-emergentes maacutes importantes de este cultivo en Colombia El efecto
deleteacutereo de Sss no soacutelo se debe al dantildeo directo sobre el sistema radicular y la calidad de
los tubeacuterculos sino tambieacuten a que sus zoosporas transmiten el Potato mop-top virus
(PMTV Pomovirus) Sss genera quistosoros que actuacutean como estructuras de resistencia del
patoacutegeno en el suelo pudiendo permanecer viables por varias deacutecadas Por esto su manejo
debe fundamentarse en el uso de variedades tolerantes a la enfermedad y en el empleo de
tubeacuterculo-semilla certificado En esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variacioacuten de
127 aislamientos de Sss obtenidos en los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo con el fin de apoyar la seleccioacuten de aislamientos de Sss a evaluar
47
en programas de mejoramiento geneacutetico de papa y en el disentildeo de pruebas de deteccioacuten
asintomaacutetica del patoacutegeno Para esto se secuenciaron regiones ITS del ADN ribosomal y se
condujeron anaacutelisis filogeneacuteticos encontraacutendose la presencia de tres variantes principales
de Sss dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum
Abstract
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum
INTRODUCCIOacuteN
El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L) se ve afectado por diversos microorganismos
fitopatoacutegenos e insectos plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la re-emergencia de la
48
enfermedad denominada Sarna polvosa causada por el plasmodiofoacuterido Spongospora
subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp subterranea Tomlinson (Sss) Su efecto no solo se
debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten al deterioro en la calidad y apariencia
cosmeacutetica de los tubeacuterculos que reduce draacutesticamente su valor en el mercado (Merz y
Fallon 2009) Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop top virus (PMTV) uno de
los problemas virales de la papa que tiene caraacutecter cuarenteneario para diferentes paiacuteses del
mundo (Salazar 2006 Gil et al 2011)
Sss es originario de los Andes Surameacutericanos desde donde se dispersoacute gracias al mercado
mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber transcurrido maacutes de 150 antildeos desde su
primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado importancia en las uacuteltimas deacutecadas como
resultado de la siembra generalizada de materiales altamente susceptibles al patoacutegeno la
utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los cambios de eacutepocas de siembra hacia
periacuteodo huacutemedos las deficiencias en los sistemas de rotacioacuten de cultivos la falta de
programas de exclusioacuten y los altos estaacutendares exigidos por el mercado en la calidad
cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
Sss es un patoacutegeno obligado plasmodial que taxonoacutemicamente se ubica en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos son importantes patoacutegenos de vegetales
Spongospora subterranea fsp subterraena y f sp nasturtii Estos taxa fueron definidos
inicialmente como forma especialis (Merz y Falloon 2009) sin embargo con base en la
morfologiacutea de los zoosporangios rango de hospedantes y anaacutelisis filogeneacuteticos de regiones
ribosomales actualmente se acepta que representan dos especies diferentes (Qu y Christ
2004)
Los siacutentomas de la Sarna polvosa incluyen la induccioacuten en los tubeacuterculos de lesiones
pustulosas corchosas con centros pulverulentos formados a partir de la agregacioacuten de los
quistosoros del patoacutegeno (Figura 41) Con el avance de estas lesiones es frecuente la
49
ruptura del peridermo aunque el nivel de penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente
superficial (Carrentildeo 2009) Bajo condiciones oacuteptimas para el desarrollo de la enfermedad
es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten de los tejidos y la formacioacuten
de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la enfermedad ademaacutes de causar
los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular de las plantas al inducir la
formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas que causan la disminucioacuten de la
superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo marchitez y finalmente la muerte de las
plantas (Gilchrist 2009) La infeccioacuten en las raiacuteces especialmente cuando se forman
agallas puede causar una reduccioacuten en la toma de agua y de nutrientes por parte de las
plantas (Falloon et al 2005)
En los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Sss afecta
severamente las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y papa criolla (S phureja) Los
siacutentomas se observan en raiacuteces y tubeacuterculos pero hay variacioacuten entre las zonas paperas en
cuanto a la distribucioacuten de los siacutentomas en los diferentes oacuterganos de la planta En
Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre
los tubeacuterculos de las variedades Parda Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el
departamento de Narintildeo y el Oriente de Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces
Hasta ahora no se conoce si estas diferencias se deben a variaciones en las condiciones
ambientales de las regiones o a la ocurrencia de variantes geneacuteticas del patoacutegeno (Jaramillo
y Botero 2007 Carrentildeo 2009)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 en las cosechas de las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y Criolla Colombia
(Rodriacuteguez et al 2009 Gilchrist 2009) Adicionalmente a esta problemaacutetica la
diseminacioacuten del patoacutegeno se viene incrementando dramaacuteticamente en el paiacutes como
resultado de la baja calidad del tubeacuterculo-semilla utilizado por la mayoriacutea de los
agricultores la ausencia de variedades tolerantes al patoacutegeno y la deficiencia en la
asistencia teacutecnica que no cuenta con herramientas apropiadas para el diagnoacutestico
asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011) Su
manejo debe estar enmarcado bajo un esquema integrado del cultivo en el que se incluyan
50
aspectos como la rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del
tubeacuterculo-semilla utilizacioacuten de organismos antagonistas (ej Trichoderma spp) el empleo
de cultivos trampa la desinfeccioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten
que restrinja el movimiento de material contaminado y supervise maacutes detalladamente los
procesos de certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas
son utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado
del manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o
de Rhizoctoniasis (Carrentildeo 2009)
La problemaacutetica causada por esta enfermedad en las regiones cultivadoras de papa hace
necesario que se intensifiquen los esfuerzos por desarrollar metodologiacuteas de diagnoacutestico de
suelos y material vegetal que eviten la diseminacioacuten generalizada del plasmodiofoacuterido y de
su virus asociado PMTV entre regiones infectadas y libres de enfermedad siendo
especialmente importante el desarrollo de procedimientos que garanticen la sanidad de los
lotes dedicados a la produccioacuten de semilla Entre las diversas metodologiacuteas desarrolladas en
el mundo para el diagnoacutestico de este patoacutegeno se destacan la teacutecnica de ELISA con
anticuerpos policlonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Qu et al 2011) y pruebas de
flujo lateral (Bouchek-Mechiche et al 2011) Sin embargo estas teacutecnicas son de aplicacioacuten
limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas con base en los genotipos locales de los
patoacutegenos presentes en las regiones paperas del paiacutes Con el fin de suplir dicha carencia de
informacioacuten en esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss procedentes de las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia
mediante el anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr)
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Para la coleccioacuten de muestras de quistosoros de Sss proveniente de suelo raiacuteces y
tubeacuterculos se seleccionaron lotes en fincas con antecedentes de infeccioacuten seguacuten el registro
51
histoacuterico de los agricultores siguiendo la metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la
cual se utiliza un juego de tamices de 100 y 25 microm para la obtencioacuten de los quistosoros Por
cada lote se tomaron raiacuteces de plantas o tubeacuterculos sintomaacuteticos y una muestra de suelo de
500 gr Los sitios de coleccioacuten incluyeron las regiones cultivadoras de papa de los
municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio Subachoque y
Villa Pinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute Oicataacute (Boyacaacute) y Pasto e Ipiales
(Narintildeo) La investigacioacuten se propuso obtener un miacutenimo de 30 muestras de Sss por
departamento
Los quistosoros obtenidos a partir de muestras de suelos fueron inoculados en plantas de
Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo o plantas
trampa para incrementar el inoacuteculo siguiendo la metodologiacutea de Veacutelez (2007)
mantenieacutendose en casa de malla en el Centro Experimental Paysanduacute ubicado en el
corregimiento Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB 2550 msnm temperatura
media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) (Figura 42) Todas las muestras
fueron procesadas en los laboratorios de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad
Nacional de Colombia sede Medelliacuten y Sanidad Vegetal del Politeacutecnico Colombiano Jaime
Isaza Cadavid
Extraccioacuten de ADN
Para la obtencioacuten del ADN se empleoacute una modificacioacuten de la metodologiacutea de Doyle y
Doyle (1987) a partir de quistosoros extraiacutedos y de tejidos afectados de las plantas de papa
y plantas sentildeuelo En este procedimiento es necesaria la maceracioacuten con nitroacutegeno liacutequido
de los tejidos y se emplea como buffer de extraccioacuten una solucioacuten CTAB y 1
mercaptoetanol El lavado de la fase orgaacutenica se realiza con fenolcloroformo-alcohol
isoamiacutelico y la precipitacioacuten de los aacutecidos nucleicos con 1 voluacutemen de etanol absoluto y 01
voluacutemen de acetato de sodio 3M Finalmente el pellet generado es disuelto en agua
destilada esteacuteril y es sometido a digestioacuten de ARN mediante la adicioacuten de ribonucleasa A
(10 mgmL) (Ver protocolo 62) Cuando la presencia de inhibidores afectaba la eficiencia
52
de la PCR la extraccioacuten de ADN se realizoacute utilizando el kit DNeasy Plant (Qiagen
EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante con una ligera modificacioacuten en el paso
de elucioacuten de ADN que se realizoacute en dos etapas con 70 microL de agua destilada esteacuteril Para
determinar la concentracioacuten del ADN extraiacutedo se utilizoacute la lectura de absorbancia en las
longitudes de onda de 260 y 280 nm mediante un Nanodrop 2000C (Thermo EEUU)
obtenieacutendose un rango entre 10 y 112 ng de ADNμL con una relacioacuten 260280 de 15 a 19
(Tabla 41) La integridad del ADN se determinoacute realizando electroforesis en gel de agarosa
al 08 en buffer TBE 1X (TBE 5X 54 gL Tris 275 gL de aacutecido boacuterico 20 mLL de
EDTA 05M pH 80) suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) La visualizacioacuten de
las bandas se realizoacute utilizando el sistema digital de anaacutelisis Bio Doc Analyze (Biometra
Alemania) (Figura 43)
PCR de ITS del ADNr
Para la evaluacioacuten de los niveles de variacioacuten geneacutetica de Sss se realizaron PCR empleando
los cebadores especiacuteficos Spo8 (5 CTG GGT GCG ATT GTC TGT TG 3) y Spo9 (5 CAC
GCC AAT GGT TAG AGA CG 3) disentildeados por Bulman y Marshall (1998) asiacute como los
cebadores SsF (5acute GTC GGT TCT ACC GGC AGA CC 3acute) y SsR (5acute GCA CGC CAA
TGG TTA GAG ACG 3acute) reportados por Qu et al (2006) que amplifican productos de
391 y 434 pb de la regioacuten ITS del ADNr respectivamente Las reacciones de PCR
incluyeron 01 microM de cada cebador 1 U de Taq ADN polimerasa recombinante
(Fermentas Lithuania) 02 mM de cada dNTP 1X de buffer de enzima (100 mM Tris-HCl
(NH4)2SO2 pH 88) 2 mM MgCl2 1 microL de una dilucioacuten 50 ngmicroL de ADN y un volumen
total de 25 microL Las amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra) y
consistieron de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 35 ciclos de
94degC por 30 s 55degC por 30 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10
min Luego de la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se
separaron por electroforesis en gel de agarosa al 15 tal como se indicoacute anteriormente
53
Secuenciacioacuten
De ser necesario los amplicones obtenidos fueron purificados mediante los kits QIAquick
PCR Purification y QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para proceder a su secuenciacioacuten
directa en ambas direcciones utilizando los cebadores empleados en la PCR y el kit Big
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied Biosystems EEUU) Su
corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied
Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur) (Figura 44)
Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit
606 y Chromas 145 construyeacutendose secuencias consenso y confirmaacutendose su validez por
comparacioacuten con las bases de datos moleculares con el programa BLASTn
(httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) (Figura 45) Paralelamente se obtuvieron
del GenBank secuencias de Sss de las regiones estudiadas para su alineacioacuten con las
generadas en este trabajo mediante el software Clustal W Ademaacutes se utilizaron las
secuencias de los Plasmodiofoacuteridos Plasmodiophora brassicae Polymyxa graminis
Polymyxa betae S nasturtii y Sorosphaera viticola como grupos externos de anaacutelisis
(outgroups) Los alineamientos fueron utilizados en la construccioacuten de una matriz Nexus y
el anaacutelisis filogeneacutetico se realizoacute mediante un algoritmo de Maacutexima Parsimonia utilizando
el software PAUP 40b Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute
un anaacutelisis de Bootstrap con 500 iteraciones
RFLPs
Con el fin de proponer una prueba de diagnoacutestico molecular de las variantes de Sss se
realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs a partir de las secuencias de Sss generadas en esta
investigacioacuten y otras depositadas en el GenBank Para esto se utilizoacute el software webcutter
20 (httprnalundberggusecutter2) con las enzimas EcoRV EcoRI Bsp143I Hin6I
MspI Tru1I y TaqI seleccionadas por ser de faacutecil acceso para laboratorios de diagnoacutestico
molecular y utilizadas en la primera parte de exploracioacuten La validez de la prueba fue
54
confirmada mediante PCR-RFLPs con las enzimas Bsp143I y Hin6I y aislamientos
representativos de los grupos geneacuteticos principales detectados en el trabajo Las reacciones
consistieron de 15 microL conteniendo 15 microL de buffer 10X 2 microL de enzima y 115 microL de
producto de PCR Las reacciones fueron incubadas al bantildeo Mariacutea a 37degC durante 24 h La
separacioacuten de los fragmentos de restriccioacuten se efectuoacute por electroforesis en gel de agarosa
al 25 Se evaluaron los patrones electroforeacuteticos obtenidos para cada enzima de
restriccioacuten y se determinoacute el nuacutemero de bandas generadas y su tamantildeo aproximado por
comparacioacuten con el marcador de peso molecular GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus
(Fermentas)
RESULTADOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Se obtuvieron 210 muestras de tubeacuterculos y raiacuteces de papa con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos con historia de la presencia del patoacutegeno en los departamentos de Antioquia
Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Se realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos con las secuencias
que presentaron tamantildeos superiores a 390 pb lograacutendose el objetivo de contar con al
menos 30 secuencias por cada departamento bajo anaacutelisis
Anaacutelisis filogeneacutetico de regiones ITS del ADNr
Las reacciones de PCR produjeron amplicones del tamantildeo esperado de ~390 pb con los
cebadores Spo8-9 (Figura 46) y de ~430 pb cuando se usaron los cebadores SsF-SsR en
79 y 48 muestras respectivamente Para el anaacutelisis filogeneacutetico soacutelo se incluyeron los
consensos que resultaron de la secuenciacioacuten en ambos sentidos De esta forma se
obtuvieron 33 secuencias de Antioquia 30 secuencias de Boyacaacute 33 secuencias de
Cundinamarca y 31 secuencias de Narintildeo para un total de 127 secuencias completas (Tabla
42) El alineamiento final de las secuencias alcanzoacute 445 sitios de los cuales 156 caracteres
eran constantes 55 variables pero no informativos y 236 informativos La longitud del
aacuterbol filogeneacutetico con maacutexima parsimonia fue de 707 con iacutendices de consistencia (IC) y
retencioacuten (IR) de 078 y 088 respectivamente Dado el alto nuacutemero de muestras
55
secuenciadas se presenta un dendrograma resultado del anaacutelisis de redundancia mediante el
programa Decrease redundancy (httpwebexpasyorgdecrease_redundancy) (Figura
47) Se presentaron dos grandes clados (A y B) soportados por valores de bootstrap de
100 el primer clado corresponde a los aislamientos de Sss mientras que el otro grupo
incluyoacute las demaacutes especies de plasmodiofoacuteridos (S nasturtii P graminis P betae y Pl
brassicae) que presentaron un alto nuacutemero de cambios entre ellas El clado A se subdividioacute
a su vez en tres grupos (A1 A2 y A3) dos de los cuales corresponden a los Tipos I (A2) y
II (A1) definidos por Qu y Christ (2004) En teacuterminos porcentuales ambos Tipos
representan el 157 (Tipo I) y 189 (Tipo II) de los aislamientos de Sss obtenidos en
Colombia ademaacutes se incluyeron secuencias del patoacutegeno provenientes de Estados Unidos
Irlanda y Escocia para el Tipo I y de Suiza Nueva Zelanda y de Reino Unido para el Tipo
II El subgrupo que representa el Tipo I de Sss soacutelo presentoacute aislamientos obtenidos de
tubeacuterculos o de suelos pero no de raiacutez mientras que el subgrupo representando el Tipo II
incluyoacute indistintamente aislamientos de raiacutez tubeacuterculos y suelos
Por otra parte el tercer subgrupo (A3) incluyoacute el mayor nuacutemero de aislamientos
Colombianos de Sss (654) con algunos de sus miembros presentando hasta 10 cambios
entre ellos En este subgrupo se encontraron indistintamente aislamientos de los cuatro
departamentos diferentes fuentes de muestreo (raiacutez tubeacuterculo o suelo) y hospedantes
(diferentes variedades de S tuberosum y de S phureja var Criolla Colombia) Dadas las
diferencias en secuencias de estos aislamientos proponemos nombrar a este grupo como el
Tipo III de Sss
El anaacutelisis de redundancia permitioacute tambieacuten identificar 12 genotipos (Figura 48) entre los
127 aislamientos de Sss de Colombia cinco de los cuales estuvieron conformados por un
soacutelo aislamiento tres por dos aislamientos y cuatro presentaron maacutes de diez miembros
siendo el genotipo 11 representante del Tipo I el 12 del Tipo II y el 7 y 10 del genotipo III
(Tabla 43) porque los demaacutes genotipos al ser uacutenicos o con tener como maacuteximo dos
representantes no fueron definidos a nivel de Tipos Los niveles de identidad para la regioacuten
56
ribosomal secuenciada entre estos genotipos fueron superiores al 95 en todos los casos
con una divergencia de 33 entre los Tipos I y II del 5 entre los Tipos I y III y del 2
entre el II y III La divergencia entre secuencias de Sss y otras especies de plasmodiofoacuteridos
fue mayor al 44 lo que demuestra la utilidad taxonoacutemica de las regiones ITS para
establecer relaciones filogeneacuteticas en este grupo de protozoos (Tabla 44)
RFLPs
Los anaacutelisis de restriccioacuten indicaron la existencia de polimorfismos en los sitios de corte de
algunas de las enzimas empleadas entre los grupos principales sentildealados en el anaacutelisis
filogeneacutetico Lo anterior puede ser utilizado con fines praacutecticos cuando se requiera evaluar
el genotipo o la mezcla de genotipos asociados a un lote de cultivo plantas sintomaacuteticas o
de tubeacuterculo-semilla con siacutentomas de Sarna polvosa Por ejemplo los aislamientos
representativos del Tipo II de Sss presentan un sitio de corte para Bsp143I (p 92) mientras
que para los del Tipo I se presentan dos sitios (p 97 340) Los aislamientos del Tipo III
tienen tres sitios de corte para la enzima Hin6I (p 222 283 352) en contraste con dos sitios
en los del Tipo I y II (p226-355 221-350) (Figura 49) Por esto proponemos la realizacioacuten
de una prueba simple de PCR-RFLPs a partir de la amplificacioacuten de las regiones ITS con
cebadores especiacuteficos para Sss y su posterior digestioacuten con las enzimas Bsp143I y Hin6I
con el fin de identificar los tres Tipos de Sss Al evaluar la digestioacuten de amplicones
representantes de los tres Tipos de Sss detectados en el estudio se validoacute la utilidad de la
teacutecnica en geles de agarosa al 25 ya que los perfiles de restriccioacuten obtenidos con la
enzima Hin6I permiten diferenciar a los aislamientos de los Tipos I y II (fragmentos
visibles de 221 y 129 pb) del Tipo III (fragmentos visibles de 221 67 y 62 pb) (Figura
410A) mientras que los representantes de los Tipos I y II se diferencian por la digestioacuten
con la enzima Bsp143I al generar fragmentos visibles de 243 pb (Tipo I) y de 294 pb (Tipo
II) (Figura 410B) Es importante indicar que los fragmentos inferiores a 50 pb no se tienen
en cuenta en este anaacutelisis ya que salen del rango de resolucioacuten de la electroforesis en geles
de agarosa Fragmentos de este tamantildeo pueden ser visualizados en geles de poliacrilamida
que ofrecen una mayor resolucioacuten
57
DISCUSIOacuteN
La disponibilidad de cultivares de papa resistentes a Sss es una prioridad para el disentildeo de
estrategias de manejo de la Sarna polvosa en diferentes paiacuteses cultivadores de este
tubeacuterculo en el mundo (Nitzan et al 2010) Sin embargo las deficiencias en el
conocimiento que se tiene de los niveles de variacioacuten de Sss y de su ciclo de vida
representan un obstaacuteculo para el establecimiento de los programas de mejoramiento
geneacutetico contra este fitopatoacutegeno (Merz y Falloon 2009) Los estudios geneacuteticos de Sss han
sido difiacuteciles de aplicar debido a su naturaleza de patoacutegeno obligado que impide su
aislamiento en medios axeacutenicos afectando los procesos de extraccioacuten de ADN la
utilizacioacuten de marcadores moleculares convencionales como AFLPs SSR y RAPDs y el
empleo de cebadores universales comuacutenmente usados para estudios taxonoacutemicos y
poblacionales en diferentes microorganismos eucarioacuteticos Adicionalmente la
caracterizacioacuten patoacutegenica de Sss resulta compleja ya que el desarrollo de la expresioacuten de
la Sarna polvosa estaacute fuertemente influenciada por las condiciones ambientales las
metodologiacuteas de inoculacioacuten y los cultivares del hospedante (Qu y Christ 2006 Jaramillo y
Botero 2007)
Afortunadamente la existencia de cebadores especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del
ADNr como los desarrollados por Bulman y Marshall (1998) y Qu et al (2006) para
amplificar la regioacuten ITS1 58S e ITS2 han permitido la obtencioacuten de secuencias que entre
otras aplicaciones permitieron definir la afinidad filogeneacutetica de Sss con respecto a otros
miembros del orden Plasmodiophoridae y demostrar los bajos niveles de identidad de esta
especie con respecto a la formae specialis nasturtii Esta misma situacioacuten se encontroacute en
este estudio obtenieacutendose identidades entre Sss y S nasturtii cercanas al 56 Los anaacutelisis
intraespeciacuteficos utilizando dichas secuencias han permitido detectar dos ribotipos
principales de Sss en el mundo denominados como I y II Ambos Tipos han sido
encontrados en poblaciones de Sss de Australia y Europa (Bulman y Marshall 1998)
mientras que en Norte Ameacuterica los aislamientos corresponden exclusivamente al Tipo II
58
(Qu y Christ 2006) En dicho estudio se encontroacute que las secuencias del Tipo I diferiacutean con
respecto a las del Tipo II en tres nucleoacutetidos (p 60 127 157) y una insercioacuten de cinco
nucleoacutetidos (p 129 a 133) en el ITS1 mientras que para la regioacuten ITS2 se presentan seis
mutaciones puntuales (p 348 367 399 402 461 475) y dos deleciones (p 356 y 474) lo
que en su conjunto equivale a un 29 de divergencia entre ambos ribotipos Estas
diferencias fueron igualmente encontradas entre los aislamientos colombianos
representando ambos Tipos aunque algunos de ellos presentaron mutaciones adicionales
por ejemplo el genotipo 12 (conformado por 21 aislamientos) presentoacute dos cambios con
respecto al Tipo II reportado en GenBank (Accesioacuten AY604172) mientras que el genotipo
11 (conformado por 17 aislamientos) tuvo tres cambios con respecto al Tipo I (Accesioacuten
AY604171)
En Colombia hasta el presente estudio se habiacutean realizado dos estudios de variabilidad
geneacutetica de Sss con base en anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr En el primero de ellos
Hincapieacute (2006) encontroacute altos niveles de identidad geneacutetica entre los aislamientos de Sss
secuenciados y analizados mediante PCR-RFLP lo que condujo al autor a plantear la
posible ocurrencia de una estructura poblacional clonal para este patoacutegeno en el paiacutes En un
estudio maacutes reciente Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS y SSCP
(Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) que incluyoacute un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones establecioacute la presencia de subpoblaciones del patoacutegeno
relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Asiacute aislamientos con secuencias ITS del Tipo
I se asociaron exclusivamente con infecciones de tubeacuterculo mientras que aquellos del Tipo
II lo hicieron con siacutentomas de agallas en raiacutez En dicha investigacioacuten se descartoacute ademaacutes la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar del hospedero o la zona
geograacutefica de origen de los aislamientos Asiacute mismo se comproboacute que en el paiacutes existen
variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la
presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno dos de los cuales corresponden a los Tipos I y
II mientras que los tres restantes correspondiacutean a nuevas variantes no reportadas en otros
59
lugares del mundo (Carrentildeo 2009) desafortunadamente las secuencias resultantes de dicho
trabajo no fueron publicadas en GenBank y por tanto no pudieron ser incluidas en los
anaacutelisis filogeneacuteticos aquiacute presentados
El presente estudio amplia auacuten maacutes la base de conocimiento de los niveles de variacioacuten de
Sss en Colombia al detectar 12 genotipos a partir de 127 secuencias de igual nuacutemero de
aislamientos del patoacutegeno obtenidos en cultivos de los cuatro principales departamentos
productores de papa del paiacutes El anaacutelisis filogeneacutetico basado en dichas secuencias definioacute
la presencia de un clado que representa a Sss e incluye los dos Tipos mundialmente
conocidos para este patoacutegeno (Qu y Christ 2004) ademaacutes de un tercer subgrupo (III) que
presenta un 5 y 2 de divergencia con respecto a los Tipo I y II respectivamente Este
Tipo III contiene la mayor proporcioacuten de aislamientos del estudio e integroacute indistintamente
cepas de diferentes oriacutegenes geograacuteficos hospedantes tejidos sintomaacuteticos y suelo De gran
intereacutes resultoacute el hecho que los aislamientos asociados con el Tipo I procediacutean de puacutestulas
en tubeacuterculos o de suelos pero no de agallas de raiacutez lo cual confirma la asociacioacuten
realizada por Carrentildeo (2009) para esta variante de Sss Sin embargo los aislamientos
asociados al Tipo II proveniacutean indistintamente de raiacutez tubeacuterculos o suelos A partir de estos
resultados es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa del paiacutes Asiacute por ejemplo
es de intereacutes estudiar las reacciones de las variedades colombianas de papa a dichos
ribotipos asiacute como su capacidad de transmisioacuten de PMTV En este sentido Ward et al
(2005) evaluando el efecto de dos ribotipos de Polymyxa graminis un plasmodiofoacuterido que
afecta gramiacuteneas en la zona templada encontraron que los aislamientos del Tipo II fueron
detectados principalmente en plantas de trigo y estaban asociados a la transmisioacuten del Soil-
borne cereal mosaic virus (SBCMV) mientras que aquellos del Tipo I afectaban cebada y
su capacidad de transmisioacuten de SBCMV era muy baja
60
Los niveles de variacioacuten encontrados en esta investigacioacuten para el agente causal de la Sarna
polvosa de la papa en Colombia condujeron a plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y de certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla Para esto se realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs de regiones ITS del
ADNr con siete enzimas de restriccioacuten de uso frecuente en laboratorios de deteccioacuten
molecular de microorganismos Los resultados demostraron polimorfismos en los sitios de
corte de algunas de las enzimas utilizadas dos de las cuales permiten distinguir los tres
principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico De esta forma se confirmoacute que la
digestioacuten con la enzima Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos
del Tipo III mientras que el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los
Tipos I y II La prueba realizada en este estudio puede ser implementada con variaciones
como el uso de digestiones dobles y la utilizacioacuten de geles de poliacrilamida que generen
mayor resolucioacuten de los fragmentos de restriccioacuten de bajo peso molecular sin embargo el
esquema aquiacute presentado ofrece simplicidad y eficiencia en la separacioacuten de los tres Tipos
sin la necesidad de contemplar todos los productos de la digestioacuten Adicionalmente a esta
prueba y con base en los resultados de las secuencias obtenidas en esta investigacioacuten y en
aquella de Gil et al (2011) nuestro grupo se encuentra disentildeando y evaluando pruebas de
PCR y RT-PCR en tiempo real para la deteccioacuten asintomaacutetica de Sss y de su virus asociado
PMTV Se espera que los resultados generados en estas investigaciones sean incorporados
raacutepidamente en los programas de manejo integrado de la Sarna polvosa en Colombia y
otros paiacuteses latinoamericanos afectados por esta enfermedad como Venezuela (Rodriacuteguez et
al 2009) y Costa Rica (Montero-Astua et al 2008)
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten el Politeacutecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid
Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo
por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el Departamento de Narintildeo
61
REFERENCIAS
Bell KS Roberts J Verrall S Cullen DW Williams NA Harrison JG Toth IK Cooke D
Duncan JM Claxton JR 1999 Detection and quantification of Spongospora subterranea
fsp subterranea in soils and on tubers using specific PCR primers European Journal of
Plant Pathology 105 905-915
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid
diagnostic test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European
Journal of Plant Pathology 131 277-287
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47 759-766
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33 69-84
62
Gilchrist E 2009 Alternativas para el manejo integrado de la Sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) Tesis de Doctorado en Ciencias Agrarias
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia sede Medelliacuten
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tubers by enzyme-linked immunosorbent assay Plant Pathology 42
181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato - A review
Plant Pathology 461-25
Hincapieacute LA 2006 Evaluacioacuten de la variabilidad molecular de Spongospora subterranea
(Wallroth) Lagerheim f sp subterranea en las principales zonas paperas de Colombia
Tesis de Maestriacutea en Biotecnologiacutea Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia sede Medelliacuten Colombia
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Merz U Fallon RE 2009 Powdery scab of potato-increased knowledge of pathogen
biology and disease epidemiology for effective disease management Potato Research
5217-37
Montero-Astua M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
63
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006 Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea f sp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la Sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista de la Facultad de Agronomiacutea Universidad del Zulia 26 508-531
Salazar LF 2006 Emerging and Re-emerging Potato Diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop - top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia Sede Bogotaacute
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea and quantification in soil Plant Pathology 45 884-895
64
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2005 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165875-885
Zolan ME Pukkila PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinereus
Molecular and Cellular Biology 6 195-200
65
41 Anexos
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp subterranea
en plantas de papa de Colombia a Quistosoros obtenidos de suelo b Plasmodios
formados en raiacutez de tomate (Solanum esculentum) c Lesiones tempranas producidas por
Sarna polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro d Lesiones tardiacuteas producidas por Sarna
polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro e f Agallas formadas en raiacuteces de S phureja
var Criolla Colombia
d
e f
c
a b
66
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja var Criolla
Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos infestados con Spongospora
subterranea f sp subterranea
67
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o raiacuteces de
plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea
MUESTRA A260 A280 RELACIOacuteN
260280
CONCENTRACIOacuteN
de ADN ng microl
AB1 0806 0465 173 403
AB2 0421 0244 172 21
Se7 0276 0149 184 138
Se8 0743 0415 179 371
MA11 2244 1366 164 1122
MA61 0277 0158 176 139
MA39 2135 1512 141 1067
MA56 0823 0361 228 412
MA60 021 0101 208 105
68
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos agallas o raiacuteces
de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana Carril 1 Marcador de peso 100 pb carril 2-
4 muestras MA16 MA17 MA18 MA11 MA39
500 pb
1 2 3 4 5 6
69
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora
subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8
70
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la regioacuten ITS del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp subterranea de Colombia
71
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb) a partir de ADN
de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum tuberosum S phureja y Nicotiana
benthamiana con presencia de quistosoros de Spongospora subterranea fsp subterranea
de cultivos de papa de los departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1
Marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas) carriles 2 a 6 muestras SE10 SE11
SE13 SE18 carril 7 control negativo
500 pb
100 pb
390 pb
1 2 3 4 5 6 7
72
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia
ANTIOQUIA CUNDINAMARCA
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE13 Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro SE8 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE18 La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro SE81 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
32UN La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE9 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
33UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE91 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34UN La Unioacuten Raiacutez accesioacuten C131-R2 SE12 Zipaquiraacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
35UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE14 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
80C La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE15 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Pastusa
Suprema
79C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE16 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
78C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE17 Villapinzoacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro
35 COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE19 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34COL La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE20 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
32COL La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum SE21 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
30COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 4fb Ventaquemada Raiacutez S tuberosum
29COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 5fb Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum
12fb La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 9fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
11fb La Unioacuten Raiacutez S tuberosum 10fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
1MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
ICA Nevada MA20 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
7MR Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro MA21 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
8MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA22 Villapinzoacuten
Raiacutez S tuberosum var ICA Pastusa Suprema
9MR La Unioacuten Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA23 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
11MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA24 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
12MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA25 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
13MR Santa Rosa Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA50 Desconocido Tubeacuterculo S tuberosum
14MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA51 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB2 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C87SJ MA52 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
73
AB3 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C81SJ MA53 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB4 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3SJ MA54 Tabio Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB6 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C8C MA55 Tabio Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB7 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3C MA56 Zipaquiraacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia
AB8 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA57 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA1 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA58 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA2 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA59 Villapinzoacuten
Tubeacuterculo S tuberosum var Diacol Capiro
MA41 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA60 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
BOYACAacute NARINtildeO
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE10 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE7 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE101 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
SE11 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 37COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE22 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 36COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
SE23 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA27 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE24 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA28 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
3fb Tunja Raiacutez S tuberosum MA31 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB1 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA32 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB9 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA33 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB10 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA34 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA35 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA3 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA36 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA4 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA37 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA5 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA38 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA7 Siachoque Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA39 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA9 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA40 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA11 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA61 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA62 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA14 Tunja Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA64 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA15 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA65 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA16 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA66 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA17 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA67 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
74
benthamiana
MA18 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA68 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA19 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA69 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA42 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA70 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA43 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA44 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA72 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA45 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA73 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA46 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA75 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA49 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA76 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA77 Ipiales Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
75
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) de cultivos de papa de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Como grupos externos de anaacutelisis se presentan
secuencias de otras especies de plasmodiofoacuteridos Meacutetodo de maacutexima parsimonia
utilizando la opcioacuten Heuristic search del programa PAUP 40b Los valores de Bootstrap (gt
80) se indican en la parte inferior de las ramas En letras mayuacutesculas se presentan las
denominaciones de los clados y subclados Adicionalmente se indican los grupos que
representan los Tipos de Sss
76
Sss TIPO I
395 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
MspI TaqI
cccgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgttttcgg base
pairs
gggcccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcaaaagcc 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
atactgaacttactaaagtggatcatttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgat base
pairs
tatgacttgaatgatttcacctagtaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgcta 76 to
150
EcoRI
gaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagtt base
pairs
cttcttgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaa 151
to 225
Hin6I TaqI EcoRV MspI
gcgctttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccgtgtgcgtg base
pairs
cgcgaaagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcggcacacgcac 226
to 300
Bsp143I MspI Hin6I
aaggggactctgagctctggtcggtccatggcttgaaagatcatgcaacccggtgcgcgtctctggcttctgatt base
pairs
ttcccctgagactcgagaccagccaggtaccgaactttctagtacgttgggccacgcgcagagaccgaagactaa 301
to 375
cgtctctaaccattggcgtg base pairs
gcagagattggtaaccgcac 376 to 395
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 2 97 340 gatc More info
EcoRI 1 190 gaattc More info
EcoRV 2 130 238 gatatc More info
Hin6I 2 226 355 gcgc More info
MspI 3 2 281 350 ccgg More info
TaqI 2 49 232 tcga More info
Tru1I 2 102 119 ttaa More info
77
Sss TIPO II
390 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
TaqI
cctgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgtattact base
pairs
ggacccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcataatga 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
gaacttactaaagtggatcgtttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgatgaaga base
pairs
cttgaatgatttcacctagcaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgctacttct 76 to
150
EcoRI Hin6I
acgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagttgcgct base
pairs
tgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaacgcga 151
to 225
TaqI EcoRV MspI
ttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccctgtgcgtggaagg base
pairs
aagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcgggacacgcaccttcc 226
to 300
MspI Hin6I
ggactatgagctctggtcggtccatggcttgaaagattatccaaccggtgcgcgtctctggcttctgattcgtct base
pairs
cctgatactcgagaccagccaggtaccgaactttctaataggttggccacgcgcagagaccgaagactaagcaga 301
to 375
ctanccattggcgtg base pairs
gatnggtaaccgcac 376 to 390
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 1 92 gatc More info
EcoRI 1 185 gaattc More info
EcoRV 2 125 233 gatatc More info
Hin6I 2 221 350 gcgc More info
MspI 2 276 345 ccgg More info
TaqI 2 49 227 tcga More info
Tru1I 2 97 114 ttaa More info
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos de S
subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I MspI TaqI y
Tru1I mediante el programa Web-cutter
78
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de aislamientos
de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en Colombia a partir de
anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal
GENOTIPO RFLPacutes MUESTRAS PROPORCIOacuteN
()
1
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185 EcoRV 2 125 233
Hind6I 2 221 351
MspI 2 276 346 TaqI 2 227 Tru1I
2 97 114
AB12 34UN 16
2
Bsp143I 1 93 EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277 347 TaqI 1 49 228
Tru1I 2 98 115
32UN 78C 16
3
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
11MR 08
4
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
9MR 08
5
Bsp143I 2 96 339 EcoRI 1 189
EcoRV 2 129 237
Hind6I 2 225 354
MspI 2 280 349 TaqI 1 231 Tru1I
2 101 118
8MR 13MR 16
79
6
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190
EcoRV 2 130 238 Hind6I 2 226 355
MspI 2 281 350
TaqI 1 232 Tru1I
2 102 119
MA12 08
7
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
MA37 SE7 SE8 SE9 SE10
SE11 SE12 SE13 SE14 SE15 SE16 80C 79C 37COL 36COL
35COL 34COL 32COL 30COL
12FB 10FB 11FB 9FB 1MR
SE71 SE81 SE91 SE101 AB2 AB3 AB4 AB6 AB7 MA1 MA7
MA9 MA14 MA20 MA21 MA22
MA23 MA24 MA25 MA28 MA31 MA32 MA33 MA34
MA35 MA36
393
8
Bsp143I 2 92 309 EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 289 351 MspI 2 276
346 TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
MA40 08
9
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 282 351 MspI 3 2 276
346 TaqI 1 227
Tru1I 2 97 114
MA43 08
10
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 3 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
29COL 33UN MA4 MA41
MA42 MA51 MA52 MA55
MA56 MA57 MA58 MA59 MA60 MA62 MA64 MA65
MA68 MA69 MA71 MA72
MA76 SE19 SE20 SE21 SE22 3FB 4FB 14MR
22
11
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190 EcoRV 2 130 238
Hind6I 2 226 355
MspI 3 2 281 350 TaqI 2 49 232
Tru1I 2 102 119
SE17 12MR AB1 AB8 MA2
MA15 MA16 MA17 MA18 MA19 MA45 MA46 MA49
MA50 MA53 SE23 SE24
134
80
12
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233 Hind6I 2 221 350
MspI 2 276 345
TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
SE18 35UN 7MR AB9 AB10
MA3 MA4 MA5 MA11 MA27 MA38 MA39 MA44 MA61
MA66 MA67 MA70 MA73
MA75 MA77 5FB
165
81
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluyen a S nasturtii y Plasmodiophora brassicae
como especies externas de anaacutelisis
SECUENCIA SE17 SE18 MA37 29COL AY604172 AY604171 AF310907 EF593112 AF102820 AF102819 EF195335 AF104308
SE17 Sss
Colombia
Tipo I
ID 0962 0957 0952 0964 0992 0564 0959 0992 0964 0586 0959
SE18 Sss
Colombia
Tipo II
0962 ID 0979 0974 0992 0959 0574 0987 0959 0992 0584 0987
MA37 Sss
Colombia
Tipo III
0957 0979 ID 0984 0982 0954 0579 0977 0954 0982 0598 0977
29COL Sss
Colombia
Tipo III
0952 0974 0984 ID 0982 0959 0579 0977 0959 0982 06 0977
AY604172
Sss EEUU
TipoII
0964 0992 0982 0982 ID 0967 0577 0994 0967 1 0589 0994
AY604171
Sss EEUU
Tipo I
0992 0959 0954 0959 0967 ID 0564 0962 1 0967 059 0962
AF310907 S
nasturtii 0564 0574 0579 0579 0577 0564 ID 0579 0564 0577 0566 0574
EF593112 Sss
Suiza 0959 0987 0977 0977 0994 0962 0579 ID 0962 0994 0589 0989
AF102820
Sss Escocia 0992 0959 0954 0959 0967 1 0564 0962 ID 0967 059 0962
AF102819
Sss Nueva
Zelanda
0964 0992 0982 0982 1 0967 0577 0994 0967 ID 0589 0994
EF195335 P
brassicae 0586 0584 0598 06 0589 059 0566 0589 059 0589 ID 0589
AF104308
Sss Reino
Unido
0959 0987 0977 0977 0994 0962 0574 0989 0962 0994 0589 ID
82
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las enzimas de restriccioacuten Bsp143I y
Hin6I que permiten determinar los tres Tipos de Sss identificados en este trabajo En la
izquierda se indican los genotipos representativos de cada Tipo (ver Tabla 3) y entre
pareacutentesis los sitios de corte referidos al Tipo I
83
Figura 410 (A) Gel de RFLPs con la enzima Hind6I con tres muestras de los Tipos I II y
III de Sss detectados en el estudio 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir Tipo
I 3-5 Digestioacuten de muestras Tipo I 6 Producto sin digerir Tipo II 7-9 Digestioacuten de
muestras Tipo II 10 Producto sin digerir Tipo III 11-13 Digestioacuten de muestras Tipo III
14 Marcador de peso 100 pb (B) Gel de RFLPs con la enzima Bsp143I con una muestra
del Tipo I y II de Sss 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir del Tipo II 3 Sin
muestra 4 Digestioacuten de muestra Tipo I 5 Digestioacuten de muestra Tipo II 6 Marcador de
peso 100 pb Con flechas se marcan los productos digeridos que presentan resolucioacuten
apropiada en geles de agarosa al 25
A B
84
5 Artiacuteculo 2 Variabilidad geneacutetica de los ARN 2 y 3 de aislamientos
Colombianos de PMTV
Genetic variability of RNA 2 and 3 in Colombian isolates of PMTV
Ineacutes Osorio Giraldo1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
1 Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Facultad de Ciencias Universidad Nacional
de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia 2
Laboratorio de Microbiologiacutea Industrial
Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia
Formato de la Revista Agronomiacutea Mesoamericana ISSN 1021-7444
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
El PMTV es un virus prevalente en los cultivos de papa de los Andes Sin embargo en esta
regioacuten es muy bajo el conocimiento de su biologiacutea patogenicidad y diversidad Con el fin
de suplir la falta de informacioacuten sobre este uacuteltimo aspecto en esta investigacioacuten se
obtuvieron secuencias de los genes de la caacutepside viral (CP) y del TGB2 de cepas de PMTV
de los cuatro principales departamentos cultivadores de papa en Colombia Adicionalmente
dos de los aislamientos fueron secuenciados en gt83 de sus ARN 2 y 3 Los anaacutelisis
filogeneacuteticos basados en CP indicaron la presencia de dos clados El primero contiene cepas
de referencia mundial de PMTV en conjunto con 19 de las cepas de este estudio mientras
que el segundo clado soacutelo agrupoacute cepas de Colombia las que compartieron menos de 76
de identidad con el primer grupo Esto posiblemente indica la ocurrencia de una nueva
especie de pomovirus aunque se requiere la secuenciacioacuten de todo el genoma para
confirmar dicha hipoacutetesis taxonoacutemica El anaacutelisis del TGB2 generoacute un solo clado
agrupando indistintamente las cepas colombianas de PMTV con las de otros paiacuteses El
anaacutelisis de los segmentos 2 y 3 del genoma viral indicoacute que los aislamientos colombianos
compartiacutean gt94 de identidad con las secuencias de cepas de Repuacuteblica Checa y Suecia
85
Se espera que estos hallazgos sean utilizados para el disentildeo de herramientas de diagnoacutestico
del PMTV en los Andes que apoyen los programas de certificacioacuten de tubeacuterculo-semilla y
mejoramiento geneacutetico de papa
Palabras clave Potato mop-top virus RT-PCR Secuenciacioacuten Solanum tuberosum
Abstract
PMTV is a prevalent virus in potato crops in the Andes However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words Potato mop-top virus RT-PCR Sequencing Solanum tuberosum
86
INTRODUCCIOacuteN
El Potato mop-top virus (PMTV) es la especie tipo del geacutenero Pomovirus y recientemente
se ha clasificado en la nueva familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Su rango de
hospedantes incluye un nuacutemero limitado de especies vegetales de las familias Solanaceae y
Chenopodiaceae siendo la papa (Solanum tuberosum L) su principal hospedante desde el
punto de vista econoacutemico (Kirk 2008) Es transmitido por tubeacuterculo semilla infectado y
por zoosporas del plasmodiofoacuterido Spongospora subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp
subterranea Tomlinson (Sss) agente causal de la sarna polvosa de la papa (Harrison y
Jones 1970) Su presencia se ha registrado principalmente en regiones con climas huacutemedos
y friacuteos como el Norte de Europa (Noruega Suecia Dinamarca y Finlandia) las islas
Britaacutenicas (Irlanda Inglaterra Escocia) Norte Ameacuterica (EEUU y Canadaacute) Japoacuten las zonas
montantildeosas de Costa Rica y los Andes Surameacutericanos (Peruacute Colombia Bolivia) (Xu et al
2004 Salazar 2006 Montero-Astuacutea et al 2008 Nakayama et al 2010 Santala et al
2010) A pesar de que se considera que el PMTV es originario de los Andes su presencia
en Colombia soacutelo fue detectada en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) y reconfirmada con base en
anaacutelisis de secuencias de la caacutepside viral (CP) y el segundo gen del triple bloque (TGB2) en
2011 (Gil et al 2011) Este virus puede causar peacuterdidas de hasta 26 en el rendimiento del
cultivo de la papa lo que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera
ascender a rangos de 50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 2000) Sin
embargo dichos niveles de peacuterdidas dependen de la susceptibilidad de las variedades
cultivadas (Xu et al 2004 Santala et al 2010) las variantes del patoacutegeno (Harrison y
Jones 1970 Nielsen y Nicolaisen 2003) y fundamentalmente de las condiciones
medioambientales prevalentes durante su infeccioacuten (Davey 2009 Latvala-Kilby et al
2009 Roos et al 2011)
El PMTV es un virus tripartita con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20 nm en diaacutemetro y
longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm Cada partiacutecula contiene una moleacutecula
de ARN de cadena sencilla con polaridad positiva (ARNss+) con tamantildeos de 6043 nt (ARN
1) 3134 nt (ARN 2) y 2964 nt (ARN 3) El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene
motivos de metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del
codoacuten de finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999 2003) El
87
ARN 2 contiene un ORF para la proteiacutena de la caacutepside de 20 kDa Tambieacuten codifica para
una proteiacutena de 90 kDa generada por lectura continua (readthrough CP-RT) gracias a la
presencia de un codoacuten de finalizacioacuten amber en el gen CP Diversos estudios han indicado
que esta proteiacutena RT esta involucrada en la transmisioacuten por Sss del PMTV siendo incluso
posible su localizacioacuten asociada con los extremos de las partiacuteculas virales mediante
anaacutelisis de inmuno-marcaje (Cowan et al 1997) En este sentido Torrance et al (1999)
demostraron que una delecioacuten de 109 nt en el extremo 3acute de las secuencias del dominio CP-
RT de aislamientos de PMTV de Escocia estaban asociadas con su imposibilidad de
transmisioacuten por Sss
El ARN 3 codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Los
primeros tres presentan secuencias similares a proteiacutenas del triple bloque de genes (TGB)
involucradas en el movimiento de ceacutelula a ceacutelula de algunos virus de plantas Las TGBs de
los pomovirus hacen parte de la clase 1 o grupo hordei de estas proteiacutenas en conjunto con
las codificadas por otros geacuteneros de la familia Virgaviridae y del geacutenero Hordeivirus Se
cree que TGB2 y TGB3 asisten a TGB1 en su funcioacuten de trasportar el genoma viral a traveacutes
de los plasmodesmos de las ceacutelulas vegetales (Lim et al 2008 2009) Recientemente se
encontroacute mediante fusioacuten de la regioacuten N-terminal de TGB1 con la proteiacutena verde
fluorescente (GFP por sus siglas en ingleacutes) que TGB1 se localizaba en la regioacuten nucleolar
y de microtuacutebulos infirieacutendose ademaacutes que aparentemente esta proteiacutena interactuacutea con los
factores de transcripcioacuten del hospedante (Wright et al 2010)
La cuarta proteiacutena (8 kDa) es rica en cisteiacutena (CRP) y aparentemente esta involucrada en el
movimiento sisteacutemico del PMTV en las plantas y en la expresioacuten de siacutentomas necroacuteticos en
hospedantes experimentales Interesantemente otros pomovirus no codifican para una
proteiacutena 8 kDa como la presente en PMTV y sus niveles de identidad con CRPs presentes
en otros geacuteneros como Hordeivirus Tobravirus y Furovirus son muy bajos (Lukhovitskaya
et al 2005)
Los siacutentomas que causa PMTV en papa se manifiestan por agrietamientos en la superficie
de los tubeacuterculos pudiendo estar acompantildeados por la presencia de anillos necroacuteticos en la
88
corteza o incluso la parte interna del mismo siacutentoma conocido como umlSprainguml (Calvert y
Harrison 1966) En las hojas de las plantas infectadas se puede observar un moteado en
forma de V tipo ldquoaucubardquo ademaacutes de la distorsioacuten del follaje y el acortamiento de los
entrenudos (umlmop-topuml) (Carnegie et al 2009) En la regioacuten Andina no es frecuente
observar la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos ni los moteados tipo umlaucubauml lo que no
permite asociar siacutentomas especiacuteficos con la presencia de PMTV situacioacuten que explica en
buena parte el porqueacute del desconocimiento de su efecto sobre las variedades sembradas en
esta regioacuten suramericana (Tenorio et al 2006 Gil et al 2011) Sin embargo seguacuten Salazar
(2006) el PMTV es uno de los virus prevalentes en el cultivo de la papa en los Andes
Adicionalmente a las caracteriacutesticas criacutepticas del PMTV existen dificultades teacutecnicas para
el diagnoacutestico de este virus debido a su distribucioacuten erraacutetica en las plantas que incluso
puede diferir entre yemas y brotes del mismo tubeacuterculo infectado y a los bajos tiacutetulos
virales que se encuentran en el tejido foliar Esto conduce a la generacioacuten de falsos
negativos por diferentes teacutecnicas de diagnoacutestico (Cerovska et al 2003 Kirk 2008) Dichas
teacutecnicas incluyen la observacioacuten visual de siacutentomas bioensayos con plantas indicadoras
como Chenopodium amaranticolor Nicotiana benthamiana N debneyi y N tabacum
(Jeffries 1998) que requieren largos periodos de tiempo para su lectura pruebas de ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay) con anticuerpos mono y policlonales (Torrance et
al 1993 Cerovska et al 2003) RT-PCR IC RT-PCR y qRT-PCR con cebadores
especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del genoma viral (Arif et al 1995 Mumford et
al 2000 Latvala-Kilby et al 2009 Davey 2009) Asiacute mismo se han empleado otras
teacutecnicas basadas en hibridizacioacuten especiacutefica (Ryazantsev y Zavriev 2009) y microplacas de
hibridizacioacuten con RT-PCR (Nakayama et al 2010) para la deteccioacuten de PMTV
En Colombia Gil et al (2011) utilizaron la teacutecnica de RT-PCR con los cebadores
PMTVF4-PMTVR4 y H360-C819 dirigidos a los genes TGB2 y CP respectivamente para
la deteccioacuten del virus en los principales departamentos productores de papa del paiacutes sin
embargo utilizaron un muy bajo nuacutemero de aislamientos virales Maacutes recientemente Gallo
(2012) obtuvo anticuerpos policlonales dirigidos a peacuteptidos sinteacuteticos con alta capacidad
89
inmunogeacutenica identificados a partir de la modelacioacuten de la caacutepside viral de aislamientos
colombianos de PMTV probando su efectividad en pruebas de ELISA y Dot-blot
A pesar de que aparentemente existe una amplia gama de teacutecnicas para la deteccioacuten del
PMTV eacutestas presentan la limitacioacuten de estar basadas en un bajo nuacutemero de aislamientos
virales especialmente del Norte de Europa (Latvala-Kilby et al 2009) siendo auacuten menor el
nuacutemero de cepas andinas para las que existen secuencias disponibles en las bases de datos
moleculares o cuyos viriones han sido purificados para la generacioacuten de pruebas
seroloacutegicas (Gil et al 2011)
A nivel mundial se ha reportado la presencia de bajos niveles de variacioacuten entre genotipos
de PMTV (Mayo et al 1996 Santala et al 2010) Latvala-Kilby et al (2009) comparando
secuencias de CP de 23 aislamientos de Finlandia y Letonia con respecto a secuencias
disponibles en GenBank para cepas de Escocia Dinamarca Suecia y Repuacuteblica Checa
encontraron identidades superiores al 98 entre eacutestas con soacutelo siete diferencias a nivel de
aminoaacutecidos (aa) entre todas las comparaciones Las evaluaciones de secuencias de CP-RT
tambieacuten presentaron altos niveles de identidad (98 a 100) aunque en este caso 24
posiciones en las secuencias de aa fueron variables Resultados similares reportaron Mayo
et al (1996) cuando compararon las secuencias de CP de tres aislamientos de Escocia y
ocho de Peruacute mientras que Xu et al (2004) encontraron que seis de las secuencias de CP
de aislamientos de PMTV de Norteameacuterica presentaron identidades superiores al 97 con
respecto a secuencias de aislamientos de diferentes paiacuteses de Europa A pesar de estos bajos
niveles de variacioacuten cuando se realizan anaacutelisis filogeneacuteticos con dichas secuencias se han
encontrado dos clados que dividen los aislamientos de PMTV y que pueden ser
identificados por anaacutelisis de RFLPs (Nielsen y Nicolaisen 2003) Sin embargo dichos
grupos aparentemente no estaacuten relacionados con diferencias en sus niveles de
patogenicidad sobre variedades de papa (Latvala-Kilby et al 2009)
En Colombia Veacutelez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo que presentaba altos niveles de identidad con
respecto a aislamientos de Europa y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por
90
aislamientos colombianos Esta situacioacuten fue confirmada posteriormente por Gil et al
(2011) quienes encontraron que las variantes de PMTV tan soacutelo presentaban un 76 y
86 de identidad para CP y TGB2 respectivamente con respecto a los aislamientos
mundialmente reportados de PMTV Sin embargo dichos anaacutelisis fueron conducidos con un
bajo nuacutemero de secuencias (cuatro para CP y tres para TGB2) debido a las dificultades
experimentales que representa el trabajo con este virus (bajo tiacutetulo en plantas de papa
distribucioacuten erraacutetica ausencia de cebadores especiacuteficos para cepas andinas etc)
Por lo anterior esta investigacioacuten se planteoacute con el propoacutesito de ampliar el nuacutemero de
secuencias de CP y TGB2 de aislamientos de PMTV obtenidos en diferentes regiones
cultivadoras de papa de Colombia de manera que fuera posible determinar si la presencia de
las variantes de este virus corresponde a una situacioacuten generalizada o por el contrario responde
al efecto de muestra dado el bajo nuacutemero de cepas analizadas por Veacutelez (2007) y Gil et al
(2011) Adicionalmente se realizoacute la secuenciacioacuten de una gran parte del ARN 2 y ARN 3 de
una cepa obtenida en el Departamento de Antioquia y otra en el Departamento de Boyacaacute
(Colombia) realizaacutendose un anaacutelisis de variacioacuten con respecto a las secuencias de referencia de
genomas completos disponibles en las bases de datos moleculares
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y preparacioacuten de muestras
Se obtuvieron muestras de raiacuteces y tubeacuterculos de papa con siacutentomas de sarna polvosa asiacute
como de suelos de lotes con reportes de la presencia de Sss en las zonas productoras de
papa de los municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio
Subachoque y Villapinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute y Oicataacute (Boyacaacute) y
Pasto e Ipiales (Narintildeo) Para la separacioacuten de los quistosoros del suelo se siguioacute la
metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la cual las muestras de suelo (500g) son
pasadas por un juego de tamices de 100 y 25 microm Los quistosoros obtenidos fueron
inoculados en Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo
para incrementar el inoacuteculo de PMTV a partir de la infeccioacuten de su vector Sss (Veacutelez
2007) El material vegetal fue mantenido en casa de malla en el Centro Experimental
91
Paysanduacute ubicado en el corregimiento de Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB
2550 msnm temperatura media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) Tres
meses despueacutes de la siembra se recolectaron las hojas y las raiacuteces de las plantas sentildeuelo
para su procesamiento en el laboratorio
Secuenciacioacuten de CP y TGB2
Se obtuvo el ARN total de plantas de N benthamiana y S phureja mediante el kit RNeasy
plant mini (Qiagen EEUU) a partir de 100 mg de tejido utilizando 450 μL de buffer RLT
para tejido foliar o RLC para raiacuteces y 45 μL de β-mercaptoetanol y siguiendo las
instrucciones del fabricante Al finalizar el procedimiento el ARN obtenido se eluyoacute en 40
μL de agua destilada esteacuteril tratada con DEPC
Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos En las reacciones de
retrotranscripcioacuten se utilizoacute un volumen final de 20 microL incluyendo 05 microL de agua
destilada esteacuteril 15 microL de PBST (05) 4 microL de buffer RT (5X) 4 microL de MgCl2 (25
mM) 2 microL de dNTPs (10 mM) 2 microL de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de
ARNasas (40UmicroL) 05 microL de enzima M-MuLV Transcriptasa Reversa (20 UmicroL)
(Fermentas Lituania) y 5 microL de ARN o alternativamente una dilucioacuten 15 El programa de
RT fue de 37degC por 60 min seguido de 70degC por 10 min para inactivar la enzima Las
muestras se almacenaron a 4degC hasta su uso posterior
Para las reacciones de PCR se emplearon los cebadores especiacuteficos H360 (5rsquo CAT GAA
GGC TGC CGT GAG GAA GT 3rsquo) y C819 (5rsquo CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA
CC-3rsquo) (MacKenzie 1996) para amplificar una regioacuten de 459 pb del gen CP entre las
posiciones 385 y 844 del genoma viral (Figura 51) y PMTVF4 (5rsquo CAG CAA CCA CAA
ACA GAC AGG 3rsquo) y PMTVR4 (5rsquo AGC CAC TAA CAA AAC ATACTGC 3rsquo) para
obtener amplicones de 415 pb del TGB2 entre las posiciones 1726 y 2141 del ARN 2 (Xu
et al 2004) (Figura 52) Para algunos aislamientos en los que se dificultaba la
amplificacioacuten del TGB2 se utilizaron los cebadores PMTV5 (5 GGT GAA CAC GAG
GAC AAG GT 3) y PMTV7 (5 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 3) (Lambert et al
2003) que amplifican un fragmento de 646 pb y se extienden entre las posiciones del
92
genoma 1417 a 2063 Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 microL
incluyendo 158 microL de agua destilada esteacuteril 25 microL de buffer de enzima (10X) 18 microL de
MgCl2 (25 mM) 05 microL de dNTPs (10 mM) 05 microL de cada cebador (10 microM) 02 microL de
Albuacutemina de suero bovino (20 mgml) (Fermentas) 02 microL de Taq ADN polimerasa (5
UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ADNc aunque en algunas ocasiones dada la falta de
amplicones fue necesario preparar diluciones de 15 110 o 125 de ADNc Las
amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra Alemania) y consistieron
de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 40 ciclos de 94degC por 30 s
53degC por 45 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10 min Luego de
la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se separaron por
electroforesis en gel de agarosa al 15 suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) y
su tamantildeo se verificoacute por comparacioacuten con el marcador de peso molecular Generuler 100
pb DNA ladder (Fermentas)
Los amplicones del tamantildeo esperado correspondientes al menos a cuatro aislamientos
representativos de cultivos de papa de cada uno de los cuatro departamentos bajo estudio
fueron purificados del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para realizar
su secuenciacioacuten directa en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores empleados en
la PCR y el kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied
Biosystems EEUU) Su corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism
3730xl (PE Applied Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur)
A partir de las secuencias obtenidas con cada cebador se construyeron las secuencias
consenso mediante el software BioEdit 606 (Hall 1999) y Chromas Lite (Technelysium
2009) Posteriormente se confirmoacute su origen viral por comparacioacuten con las bases de datos
moleculares con el programa BLASTn (httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) y
se obtuvieron secuencias de PMTV del GenBank de otras regiones del mundo para realizar
un anaacutelisis filogeneacutetico Para esto se generoacute un alineamiento mediante Clustal W (Larkin et
al 2007) del Software Bioedit 606 Los alineamientos fueron utilizados para construir una
una matriz de distancia geneacutetica utilizando el meacutetodo de Maacutexima verosimilitud basado en
el modelo de Tamura-Nei (1993) implementado en el software MEGA v40 (Tamura et al
93
2007) Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute un anaacutelisis de
Bootstrap con 1000 remuestreos (Felsenstein 1985)
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Con el fin de obtener un mayor nivel de informacioacuten sobre las caracteriacutesticas de los
segmentos ARN 2 y ARN 3 del genoma de aislamientos Colombianos de PMTV se realizoacute
un proceso de secuenciacioacuten con minado de cebadores previamente reportados para la
amplificacioacuten de diferentes regiones de cada uno de dichos segmentos (Tabla 51 Figura
53) y buscando que generaran traslape de secuencias de manera que fuera posible la
construccioacuten de un contig general para cada segmento Para esto se seleccionaron cuatro
cepas de PMTV representativas de cada uno de los departamentos bajo anaacutelisis Con cada
cepa se realizaron por lo menos dos amplificaciones con cada cebador de manera que las
secuencias reportadas correspondieran al consenso para cada amplicoacuten Los procedimientos
de extraccioacuten de ARN PCR y secuenciacioacuten fueron similares a los descritos anteriormente
aunque las RT se realizaron con la enzima Transcriptasa Reversa Maximareg (Fermentas)
que ofrece mayores niveles de estabilidad teacutermica (hasta 65degC) y eficiencia que las
transcriptasas reversas convencionales En este caso las reacciones de RT consistieron de
95 microL de agua libre de nucleasas 4 microL de buffer RT (5X) 1 microL de dNTPs (10 mM) 1 microL
de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de ARNasas (40UmicroL) 1 microL de enzima
Transcriptasa Reversa Maximareg (200 UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ARN para un volumen
final de 20 microL La incubacioacuten se realizoacute a 50degC por 30 min y la enzima se inactivoacute a 85degC
por 5 min
Las secuencias se editaron mediante el software Chromas Lite generaacutendose los consensos
con ambos cebadores usando el programa Bioedit 606 y se procedioacute al ensamblaje de los
contigs resultantes utilizando el programa CAP3 (Huang y Madan 1999) Posteriormente
se verificoacute el marco de lectura correcto utilizando el servidor de Expasy (Expasy Proteomic
Server httpwwwexpasychtoolsdnahtml) y se realizoacute su alineamiento con respecto a
los dos segmentos genoacutemicos de aislamientos cuyas secuencias completas se encontraban
disponibles en GenBank (DQ102381 DQ144451 AJ243719 AJ277556) (Sandgren et al
2001 Cerovska et al 2007)
94
Finalmente las secuencias de nt fueron traducidas a aa realizaacutendose comparaciones de
porcentajes de identidad y nuacutemero de posiciones variables a lo largo de las regiones bajo
estudio y generaacutendose aacuterboles filogeneacuteticos basados en los contigs obtenidos en la
investigacioacuten mediante el programa Mega v 40 bajo los paraacutemetros antes descritos
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Variabilidad geneacutetica de PMTV de Colombia
En total se obtuvieron 25 secuencias para la regioacuten amplificada de CP y 38 secuencias para
TGB2 Estas secuencias correspondieron a por lo menos cuatro aislamientos por cada
departamento bajo anaacutelisis (Tabla 52) De esta forma se aumentaron las secuencias
parciales de los genes CP y TGB2 de PMTV con respecto al trabajo reciente realizado por
nuestro grupo (Gil et al 2011) en donde soacutelo se obtuvieron cuatro y tres secuencias para
CP y TGB2 lo cual implica que las diferentes modificaciones realizadas a los
procedimientos necesarios para el estudio de este virus desde la forma de obtencioacuten de las
muestras hasta la purificacioacuten de los amplicones pasando por la eliminacioacuten de inhibidores
de las polimerasas resultaron altamente eficientes Esta situacioacuten abre la posibilidad de
plantear en el futuro proacuteximo un estudio de incidencia de PMTV basado en la deteccioacuten del
virus mediante RT-PCR con un muestreo estratificado en los diferentes pisos teacutermicos
donde se cultiva la papa en Colombia y realizando comparaciones con respecto a los
niveles de incidencia de Sss de manera que sea posible determinar la dimensioacuten de los
niveles de dispersioacuten de este virus en este paiacutes suramericano Un trabajo similar fue
realizado por Montero-Astuacutea et al (2008) en Costa Rica pero utilizando pruebas de ELISA
tanto para la deteccioacuten de Sss como de PMTV En este caso se encontroacute que el virus era
maacutes frecuentemente detectado en las regiones con mayores altitudes donde las condiciones
de alta humedad y bajas temperaturas aparentemente favorecen su infeccioacuten Sin embargo
es probable que la utilizacioacuten de pruebas de ELISA para la deteccioacuten del virus haya
conducido a una subestimacioacuten de los niveles de incidencia detectados en dicho trabajo
pues la distribucioacuten erraacutetica del virus su capacidad de movimiento ceacutelula-ceacutelula con ayuda
de proteiacutenas de movimiento codificadas por el TGB y no necesariamente en su forma
95
encapsidada y la utilizacioacuten de anticuerpos disentildeados a partir de cepas del norte de Europa
pueden influir negativamente en la deteccioacuten seroloacutegica del PMTV (Gallo et al 2012)
El anaacutelisis filogeneacutetico para CP incluyoacute 404 posiciones a partir de 46 secuencias 15 de las
cuales corresponden a aislamientos de referencia de Europa Asia y Norte Ameacuterica y las 4
previamente reportadas de aislamientos Colombianos por Gil et al (2011) El dendrograma
presentoacute dos grupos soportados por valores de bootstrap del 100 (Figura 54) El primer
clado agrupoacute todas las secuencias de referencia con 19 de los aislamientos Colombianos
obtenidos en este estudio y presentaron niveles de identidad superiores al 99 en todos los
casos (Tabla 53) Por otra parte el segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo seis de las aquiacute obtenidas y dos de las reportadas por Gil et
al (2011) Al interior de este clado se presentaron mayores niveles de variacioacuten (11 a
13) y su identidad con respecto a los miembros del primer clado fue de tan solo 76 La
secuencia de Beet Soil-Borne Virus de China utilizada como grupo externo de anaacutelisis se
ubicoacute en posicioacuten externa a los dos clados y compartioacute niveles de identidad inferiores al
59 con respecto a los aislamientos de PMTV
Estos resultados confirman los hallazgos de Veacutelez (2007) y Gil et al (2011) en referencia a
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que incluso bajo los paraacutemetros
definidos por Adams et al (2009) para la definicioacuten de especies al interior de la familia
Virgaviridae (ej cepas con identidades superiores a 80 y 90 a nivel de secuencias de CP
y del genoma completo respectivamente) podriacutea representar una nueva especie del geacutenero
Pomovirus (Familia Virgaviridae) hasta ahora no registrada en otros lugares del mundo Si
se considera que seis de las 25 secuencias de CP obtenidas en este trabajo correspondieron
a dicha variante es evidente que su presencia no es marginal en los cultivos de papa de
Colombia ya que para la muestra obtenida aunque evidentemente sesgada por la coleccioacuten
de suelos y tejidos con presencia de estructuras de Sss su proporcioacuten es del 23 La
diversidad entre aislamientos podriacutea deberse a que la regioacuten andina ha sido propuesta como
el centro de origen del PMTV (Mayo et al 1996)
96
Estos resultados representan un viraje con respecto a lo encontrado en los estudios de
variabilidad de PMTV con base en secuencias de CP de diferentes oriacutegenes geograacuteficos
por cuanto indistintamente se habiacutea encontrado que los niveles de identidad presentes en
este gen superaban el 98 en todas las comparaciones establecidas Asiacute por ejemplo
Latvala-Kirby et al (2009) al comparar 28 secuencias de Finlandia Letonia Escocia
Dinamarca Repuacuteblica Checa y Suecia encontraron que casi todas eran ideacutenticas siendo tan
soacutelo detectado un 2 de variacioacuten entre las maacutes distantes lo cual representa cambios en tan
soacutelo siete posiciones a nivel de la secuencia de aa de la proteiacutena resultante Similarmente
Xu et al (2004) reportaron que aislamientos de PMTV de Estados Unidos y Canadaacute eran
ideacutenticos y que eacutestos a su vez tan soacutelo diferiacutean en maacuteximo 3 de sus secuencias de CP con
respecto a cepas de Peruacute (Mayo et al 1996) Escocia y Escandinavia (Reavy et al 1997)
De esta forma de gran intereacutes resultaraacute emprender estudios que permitan evaluar las
diferencias bioloacutegicas de dichas variantes de PMTV sobre distintas variedades de papa e
incluso sobre hospedantes experimentales debido a que siacute existen diferencias de
patogenicidad entre aislamientos de PMTV que presentan tan bajos niveles de variacioacuten
(Nielsen y Nicolaisen 2003) es posible que dicho efecto sea auacuten mayor cuando se evaluacuteen
las variantes aquiacute reportadas
Con respecto al anaacutelisis filogeneacutetico basado en las secuencias de TGB2 se incluyeron 330
posiciones de 49 secuencias siete de las cuales fueron de aislamientos de referencia de
diferentes paiacuteses y tres de Colombia previamente analizadas por Gil et al (2011) El
dendrograma generado presentoacute un solo clado que incluyoacute todas las secuencias (Figura
55) las que compartieron niveles de identidad superiores a 98 (Tabla 54) Estos
resultados son un indicativo de que la variacioacuten encontrada entre aislamientos Colombianos
con respecto a CP no necesariamente se presentan a lo largo de los diferentes segmentos
genoacutemicos de PMTV y especiacuteficamente no se ven reflejadas en las secuencias de TGB2
que en los pocos estudios donde se ha secuenciado presenta niveles de identidad superiores
a 948 e incluso se ha encontrado que aislamientos de oriacutegenes geograacuteficos diferentes
pueden compartir hasta el 100 de identidad en la secuencia de aa para este gen (ej
aislamiento Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa y aislamientos 54-15 y 54-19 de
Dinamarca) (Cerovska et al 2007) Los altos niveles de conservacioacuten de este gen entre
97
aislamientos de PMTV que presentan diferencias en otras regiones del genoma como las
aquiacute encontradas para CP posibilitan que los cebadores utilizados para su amplificacioacuten
sean una herramienta uacutetil para el diagnoacutestico de este virus Asiacute por ejemplo Lambert et al
(2003) disentildearon los cebadores PMTV5 y PMTV7 dirigidos a amplificar una regioacuten de 646
pb comprendida entre TGB1 y TGB2 cuando reportaron por primera vez la presencia del
PMTV en EEUU Posteriormente Xu et al (2004) utilizaron la regioacuten que codifica para
TGB2 para el disentildeo de los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 en su estudio de evaluacioacuten de
distribucioacuten de PMTV en EEUU y Canadaacute
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Todos los cebadores utilizados en las reacciones de RT-PCR para amplificar diferentes
regiones de los ARN 2 y 3 del genoma de PMTV generaron los amplicones del fragmento
esperado en al menos un aislamiento evaluado Sin embargo en los aislamientos de Narintildeo
y Cundinamarca no fue posible la obtencioacuten de un contig completo para toda la regioacuten
secuenciada de ambos segmentos auacuten luego de diferentes intentos y modificaciones de los
paraacutemetros de la RT-PCR De esta forma para el caso de los aislamientos de Narintildeo no se
lograron amplicones del ARN2 con los cebadores PMTV759 ndash PMTV1552R PMTV759F
ndash 2017R y 1948F ndash 123end para el ARN 3 no fue posible obtener fragmentos con
RNA3F1ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end y F388 ndash PMTV7 Para el caso de
Cundinamarca no se lograron amplicones para el ARN 2 con PMTV759 ndash PMTV1552R y
PMTV759F ndash 2017R y para ARN 3 con RNA3F1 ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end
F388-PMTV7 Considerando que las variantes detectadas mediante la secuenciacioacuten de una
porcioacuten de CP presentaron bajos niveles de identidad con respecto a los genotipos
globalmente distribuidos de PMTV es posible que la ausencia de amplificacioacuten se deba a
diferencias en los sitios de reconocimiento de uno o ambos cebadores situacioacuten que impide
la amplificacioacuten de los fragmentos respectivos y por tanto su secuenciacioacuten posterior De
gran intereacutes seraacute continuar el proceso de secuenciacioacuten de dichas variantes para lo cual es
necesario la clonacioacuten de los respectivos cDNAs de cada segmento y el disentildeo de nuevos
cebadores especiacuteficos que permitan completar los vaciacuteos (gaps)
98
Por las razones antes expuestas para los anaacutelisis de secuencias de ARN2 y 3 soacutelo se
incluyeron los aislamientos representativos de Antioquia (Ant) y Boyacaacute (Boy) (Tabla
55) Para el ARN 2 se obtuvieron contigs de 2577 nt y 2584 para los aislamientos
Antioquia y Boyacaacute mientras que para el ARN 3 los contigs tuvieron una extensioacuten de
2617 y 2360 nt respectivamente Esto implica que para el ARN 2 se obtuvo un porcentaje
de cobertura del 83 de este segmento genoacutemico y del 87 para el ARN 3 en
comparacioacuten con el aislamiento Sw de PMTV (AJ243719 y AJ277556) (Sandgren et al
2001) En teacuterminos de aa los contigs del ARN2 incluyeron 150 de los aa de CP (posiciones
26 a 176) y 799 de CP-RT (posiciones 26 a 825) Para el ARN 3 se obtuvo la secuencia
completa de aa de TGB1 (463 aa) y TGB2 (119 aa) asiacute como 146 de 190 aa de TGB3
(posiciones 1 a 146) para el aislamiento de Boyacaacute y la totalidad de dicha proteiacutena para la
cepa de Antioquia Las demaacutes secuencias obtenidas corresponden a regiones UTR de los
extremos 3acute para el ARN 2 y 5acute para el ARN 3
Con el fin de realizar un anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las dos cepas obtenidas
con respecto al genoma de la cepa de PMTV de Suecia ndash Sw cuyo genoma completo estaacute
depositado en GenBank bajo el coacutedigo PRJNA14789 (Savenkov et al 1999 Sandgren et
al 2001) se incluyeron 1956 nt (651 aa) para CP-RT 531 nt (176 aa) para CP y 1392 (463
aa) para las tres regiones del TGB En teacuterminos generales se encontraron muy altos niveles
de identidad en las tres regiones analizadas siendo la CP la maacutes uniforme con 99 en la
secuencia de nt y 100 en aa para las tres cepas CP-RT presentoacute un nivel de identidad
para nt de 994 entre las cepas de Antioquia y Boyacaacute y del 975 - 976 con respecto a
la secuencia de referencia mientras que estos valores fueron superiores al 982 cuando se
comparoacute la secuencia de aa Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos compartieron
un 999 de identidad en nt y aa (Figura 56) Las pocas diferencias a nivel de aa
encontradas en este estudio correspondieron a cambios en 15 posiciones para el producto
del ARN 2 siendo la maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la posicioacuten 81
de CP Para el caso de TGB se encontraron 10 cambios a lo largo de las tres proteiacutenas
analizadas con la presencia de una delecioacuten en la posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
99
Por otra parte el anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2569 nt para ARN 2 con
secuencias de referencia de los aislamientos Corneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia (Figura 57) arrojoacute un dendrograma con dos
clados soportados por 100 de bootstrap separaacutendose los aislamientos de Colombia de los
de Europa sin embargo los niveles de identidad entre ambos grupos fueron muy altos
(gt975) (Tabla 56) Al calcular los niveles de diversidad (promedio del nuacutemero de
sustituciones de nucleoacutetidos por cada sitio) para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos
(dNS) se encontroacute una diversidad muy baja con tan soacutelo 0017 (SE= 0003) para dNS y
0009 (SE=0002) para dS La relacioacuten promedia entre dNSdS fue de 18 lo cual indica
que las cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten positiva para este componente del
genoma Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 3 mientras que para las
europeas fue de 12 La distancia geneacutetica o nuacutemero de sustituciones promedio por sitio
basada en el meacutetodo de Kimura-2 paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0015
El anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de
referencia de los aislamientos Korneta-Nemilkov (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia generoacute
un dendrograma con dos clados de aislamientos europeos mientras que los aislamientos
Colombianos se presentaron en forma individual sobre ramas soportadas por 100 de
bootstrap (Figura 58) A pesar de dichas agrupaciones los niveles de identidad entre todos
los aislamientos fueron superiores a 967 (Tabla 57) Al calcular los niveles de
diversidad para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos (dNS) se encontroacute una diversidad
muy baja para todos los aislamientos con tan soacutelo 0011 (SE= 0002) para dNS y 0044
(SE=0006) para dNS La relacioacuten media entre dNSdS fue de 025 lo cual indica que las
cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten estabilizadora en dicho segmento de ARN
Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 019 mientras que para los
aislamientos europeos fue de 039 La distancia geneacutetica basada en el meacutetodo de Kimura -2
paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0020 (SE 0002)
Los bajos niveles de variacioacuten encontrados en los anaacutelisis de genomas de PMTV (Savenkov
et al 1999 Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) y que nuevamente fueron inferidos
100
en el presente estudio para las cepas del clado que representa PMTV sensu stricto indican
que este virus se encuentra bajo fuertes presiones de seleccioacuten determinadas
presumiblemente por las propias caracteriacutesticas de su genoma el estrecho rango de
hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica por parte de su vector Sss (Kirk
2008 Santala et al 2010)
Para el primer caso la restriccioacuten selectiva se manifiesta por los bajos valores de dNSdS
calculados para dicho segmento y ocurre fundamentalmente al presentarse traslape de genes
en el ARN 3 Sin embargo para el ARN 2 dicha relacioacuten fue gt1 lo cual sugiere una
seleccioacuten positiva que puede explicarse por el hecho que este segmento presenta la
estrategia de supresioacuten del codoacuten de parada tipo amber para la traduccioacuten de las dos
proteiacutenas codificantes (CP y CP-RT) lo cual supone menos restricciones para la fijacioacuten de
mutaciones De otra parte la presencia de un estrecho rango de hospedantes para el virus
que se restringe a algunas especies de las familias Solanaceae y Chenopodiaceae (Kirk
2008) aunada a su transmisioacuten por Sss supone fuertes restricciones sobre los cambios en
las diferentes proteiacutenas del virus que interactuacutean con sus hospedantes y vectores lo cual
impide altas tasas de variacioacuten tales como las que presentan otros virus de ARNss(+) como
los potyvirus que en general tienen amplios rangos de hospedantes y cuya transmisioacuten por
aacutefidos poliacutefagos es del tipo no persistente (Hu et al 2009)
A pesar de los altos valores de uniformidad general encontrados de gran intereacutes resultoacute la
presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los aislamientos
colombianos de PMTV Por esto es necesario en el futuro evaluar el significado bioloacutegico
de dichos cambios por ejemplo si estan relacionadas con el efecto de las variedades nativas
de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas que las poblaciones de Sss
tienen en las regiones Andinas donde se presentan mayores niveles de variacioacuten que en
aquellas encontradas en las regiones cultivadoras de papa del hemisferio norte tal como lo
planteoacute Carrentildeo (2009) El efecto de estas inserciones y de diferentes sustituciones
detectadas en este trabajo sobre diferentes regiones de los segmentos de ARN 2 y 3
requiere un tratamiento futuro detallado a partir de anaacutelisis de mutantes y de sus efectos
sobre el ciclo infectivo viral
101
Esta investigacioacuten representa un avance importante en la caracterizacioacuten geneacutetica del
PMTV en las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia Sus resultados
confirman la presencia de dos genotipos principales de este virus en el paiacutes uno que
representa al PMTV sensu stricto destacado por presentar muy bajos niveles de variacioacuten
entre sus cepas y otro que representa una variante hasta ahora soacutelo identificada en
Colombia y que por presentar porcentajes de identidad inferiores al 80 con respecto al
grupo principal podriacutea representar una nueva especie de pomovirus que requiere ser
evaluada bioloacutegica patogeacutenica y molecularmente Finalmente es imperativo estudiar el
efecto de ambos genotipos virales sobre la produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de
papa en Colombia de manera que los organismos de sanidad vegetal estatales gremios de
productores y agroindustrias puedan valorar la necesidad de incluir la deteccioacuten del PMTV
en los programas de certificacioacuten de semilla y de mejoramiento geneacutetico de papa que se
adelantan en el paiacutes
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz
Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el
Departamento de Narintildeo
102
BIBLIOGRAFIacuteA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Arif M Torrance L Reavy B 1995 Acquisition and transmission of Potato mop-top
furovirus by a culture of Spongospora subterranea f sp subterranea derived from a single
cystosorus Annals of Applied Biology 126493-503
Calvert E Harrison BD 1966 Potato mop-top a soil-borne virus Plant Pathology
15134ndash139
Carnegie SF Saddler GS Peters JC 2009 Cultivar susceptibility to Potato mop-top virus
(PMTV) infection and symptom expression Aspects of Applied Biology 94 (Potatoes
Viruses and their Vectors) 51ndash54
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea
fsp subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Cerovska N Moravec T Rosecka P Filigarova M Pecenkova T 2003 Nucleotide
sequences of coat protein coding regions of six potato mop-top virus isolates Acta
Virologica 4737-40
Cerovska N Pecenkova M Foligarova M Dedic P 2007 Sequence analysis of the
Czech Potato mop-top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica
5261-64
103
Cowan GH Torrance L Reavy B1997 Detection of Potato mop-top virus capsid
readthrough protein in virus particles Journal of General Virology 781779-1783
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
Scotland
Felsenstein J 1985 Confidence limits on phylogenies an approach using the bootstrap
Evolution 39(4)783-791
Gallo Y 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea en Bioquiacutemica Facultad de Medicina Universidad Nacional
de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Gil JF Gutieacuterrez P Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
Hall TA 1999 BioEdit a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis
program for Windows 9598NT Nucleic Acids Symposium Series 4195-98
Harrison BD Jones RAC 1970 Host range and some properties of Potato mop-
top virus Annals Applied Biology 65393-402
104
Hu X Karasev AV Brown CJ Lorenzen JH 2009 Sequence characteristics of potato
virus Y recombinants Journal of General Virology 903033ndash3041
Huang X Madan A 1999 CAP3 A DNA sequence assembly program Genome
Research 9868-877
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 7147-57
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Kirk HG 2008 Mop-top virus relationship to its vector American Journal of Potato
Research 85 261-265
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003
First Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease
87872
Larkin M Blackshields G Brown NP Chenna R McGettigan PA McWilliam H
Valentin F Wallace IM Wilm A Loacutepez R Thompson JD Gibson TJ Higgins DG
2007 Clustal W and Clustal X version 20 Bioinformatics 23(21)2947-2948
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99519-531
105
Lim HS Bragg J N Ganesan U Lawrence DM Yu J L Isogai M Hammond J
Jackson AO 2008 Triple gene block protein interactions involved in movement of Barley
stripe mosaic virus Journal Virology 824991-5006
Lim HS Bragg J N Ganesan U Ruzin S Schichnes D Lee MY Vaira AM Ryu KH
Hammond J Jackson AO 2009 Subcellular localization of the Barley stripe mosaic virus
triple gene block proteins Journal Virology 839432-9448
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization
and effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal
of General Virology 862879-2889
MacKenzie DJ 1996 Detection of potato mop-top virus in leaf or tuber tissue by reverse
transcription-polymerase chain reaction Document CPHBT96K03 Centre for Plant Health
Agriculture and Agri-Food Canada Sidney BC Canada
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C
Salazar LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top
virus from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
Montero-Astuacutea M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U and Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Mumford RA Walsh K Barker I Boonham N 2000 Detection of Potato mop top virus
and Tobacco rattle virus using a multiplex real-time fluorescent reverse transcription
polymerase chain reaction assay Phytopathology 90448-453
106
Nakayama T Maoka T Hataya T Shimizu M Fuwa H Tsuda S Motoyuki M 2010
Diagnosis of Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-225
Nielsen SL Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups
within Potato mop-top virus Archives of Virology 148 381-388
Reavy B Sandgren M Barker H Heino P Oxelfelt P 1997 A coat protein transgene
from a Scottish isolate of Potato mop-top virus mediates strong resistance against
Scandinavian isolates which have similar coat protein genes European Journal of Plant
Pathology 103829-834
Roos J Hopkins R Kvarnheden A Dixelius C 2011 The impact of global warming on
plant diseases and insect vectors in Sweden European Journal of Plant Pathology 1299-19
Ryazantsev DY Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato viral pathogens Molecular Biology 43515-523
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M
Wieczorek P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-
Wiśniewska J Yin Z Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E
Taluntytė L Pūpola N Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E
107
Sozonov A Tikhonovich I Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam
G Valkonen JPT 2010 Detection distribution and control of Potato mop-top virus a soil-
borne virus in northern Europe Annals of Applied Biology 157163-178
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003
Potato mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich
protein are dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of
General Virology 841001-1005
Savenkov EI Sandgren MY Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Tamura K Dudley J Nei M Kumar S 2007 MEGA4 Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) software version 40 Molecular Biology and Evolution 241596-1599
Tamura K Nei M 1993 Estimation of the number of nucleotide substitutions in the
control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Molecular Biology and
Evolution 10512-526
Technelysium 2009 Chromas 20 Consultado el 15 de Febrero de 2009 Disponible en
httpwwwtechnelysiumcomauchromas_litehtml
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Research 83423-31
Torrance L Cowan GH Pereira LG 1993 Monoclonal antibodies specicreg for Potato
mop-top virus and some properties of the coat protein Annals of Applied Biology 122311-
322
108
Torrance L Cowan GH Sokmen M A Reavy B 1999 A naturally occurring deleted
form of RNA 2 of Potato mop-top virus Journal of General Virology 802211-2215
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop-top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI
Torrance L 2010 The N-Terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required
for nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant-Microbe Interaction 23(11)1486-1497
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top
virus in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
109
51 Anexos
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb) dirigidos al
gen de la caacutepside viral de PMTV a partir de muestras de tejido de raiacutez de plantas de N
benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea del
Departamento de Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador 100 pb Carril 2 BS8T Carril 3
BS9T Carril 4 BS4T Carril 5 BS11P Carril 6BS4T Carril 7 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7
500 pb
110
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb)
dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) de PMTV a partir de muestras de tejido de
raiacutez de plantas de N benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S
subterranea de los Departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador
100 pb Carril 2-4 Control positivo (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 5-7
SRL5 (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 8-10 SRL7 (ADN directo
110150 respectivamente) Carril 11-13 BS8T (ADN directo 110150
respectivamente) Carril 1415 BS4T1 (ADN directo y 110) Carril 16 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
500 pb
111
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten de los
segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV)
Cebador Secuencia 5acute- 3 Posicioacuten en el
genoma (nt) Referencia
RNA3 F1 CGCTCGAGTTTAGGTGACACTATAGGTATTTCA
ACTCTACCTAG 1 a 388
Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003 PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
PMTVF4 CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG 1726 a 1746 Xu et al
2004
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
F388
CGGGATCCGAAGTAGACCACACAGAGTG
1 a 388 Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011 PMTV1552R GCC AAT TGT CTC AAT CAT ACA CTG 1865 a 1888
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011
2017R CCA CTG CAA AAG AAC CGA TTT C Mumford
et al 2000
1948F GTG ATC AGA TCC GCG TCC TT Mumford et al 2000
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
112
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7 (2063 pb)
PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al ARN3 del genoma
del Potato mop-top virus (PMTV) a partir de tejido de raiacutez de plantas de N benthamiana y
S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea de cuatro departamentos de
Colombia Carril 1 Marcador 100 pb plus carriles 2-5 con cebadores RNA3F1-PMTV7
SRL5 SRL6 BS9T1 BS9T2 carril 6-12 con cebadores PMTV5-PMTV7 23T 24T
SRL5 SRL6 BS4T BS8T BS9T carril 13-20 con cebadores PMTVF4-123 end Villa1
NS19P1 23T 24T SRL4 SRL5 SRL6 BS4T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1000 pb 500 pb
113
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos cultivadores de papa de
Colombia
Gen CP Gen TGB2
ANTIOQUIA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
25 La Unioacuten Suelo S tuberosum 25(1) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL4 Santa Rosa S tuberosum var Diacol Capiro 25(2) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL4 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle La Unioacuten Suelo S tuberosum SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle1 La Unioacuten Suelo S tuberosum
Valle2 La Unioacuten Suelo S tuberosum
BOYACAacute
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
BS2T Oicataacute Suelo S tuberosum BS1P1 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4P Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS1P2 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4T Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS4T1 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS8T Soracaacute Suelo S tuberosum BS4T2 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS9T Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum BS8T1 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11P Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS8T2 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11T Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS9T1 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS12P Tunja Suelo con Pennisetum clandestinum BS9T2 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS9T3 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS11T1 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS11T2 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS13P Tunja Suelo S tuberosum
CUNDINAMARCA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
CS1T Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa CS1P1 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2P Subachoque Suelo S tuberosum CS1P2 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2T Subachoque Suelo S tuberosum CS2P Subachoque Suelo S tuberosum
CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Mad Madrid Suelo S tuberosum Villa1 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
114
Villa2 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
NARINtildeO
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
NS1P Pasto Suelo S tuberosum NS3P1 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS2T Pasto Suelo S tuberosum NS3P2 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro NS3P3 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8P Pasto Suelo S tuberosum NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8PF Pasto Suelo S tuberosum
NS10T Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS19P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS19P2 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P2 Ipiales Suelo S tuberosum
115
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de Potato
mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo
Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus (China)
Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte inferior de
las ramas
116
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
BS4T
Boyacaacute
Colombia
CS1T
Cundinamarca
Colmbia
NS2T
Narintildeo
Colombia
NS6P
Narintildeo
Colombia
71MY
Cundinamarca
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AJ243719
PMTV
Suecia
EF545141
Beet Soil-
Borne
Virus
China
BS4T Boyacaacute
Colombia ID 0997 0764 0752 0762 0995 0995 0599
CS1T
Cundinamarca
Colombia
0997 ID 0764 0752 0762 0992 0992 0599
NS2T Narintildeo
Colombia 0764 0764 ID 0891 0876 0769 0769 0571
NS6P Narintildeo
Colombia 0752 0752 0891 ID 0967 0752 0752 0596
71MY
Cundinamarca
Colombia
0762 0762 0876 0967 ID 0762 0762 0599
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0995 0992 0769 0752 0762 ID 1 0594
AJ243719
PMTV Suecia 0995 0992 0769 0752 0762 1 ID 0594
EF545141 Beet
Soil-Borne
Virus China
0599 0599 0571 0596 0599 0594 0594 ID
117
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del
mundo Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus
(China) Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte
inferior de las ramas
118
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
23T
Antioquia
Colombia
NS22P1
Narintildeo
Colombia
Villa2
Cundinamarca
Colombia
DQ144451
Repuacuteblica
Checa
NC_003725
Suecia
EF545142 Beet
Soil-Borne Virus
China
23T Antioquia
Colombia ID 0981 0981 0984 0981 0699
NS22P1 Narintildeo
Colombia 0981 ID 099 0984 0981 0708
Villa2 Cundinamarca
Colombia 0981 099 ID 0987 0984 0708
DQ144451 Repuacuteblica
Checa 0984 0984 0987 ID 099 0714
NC_003725 Suecia 0981 0981 0984 099 ID 0711
EF545142 Beet Soil-
Borne Virus China 0699 0708 0708 0714 0711 ID
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato mop-top virus en cuatro
Departamentos cultivadores de papa de Colombia
Muestra Hospedante Municipio Planta sentildeuelo
Ant (23T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
La Unioacuten (Antioquia)
N benthamiana
Boy (BS4T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Siachoque
(Boyacaacute) N benthamiana
Cund(CS1T) Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
Subachoque (Cundinamarca)
N benthamiana
Nar (NS6P) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro Pasto (Narintildeo) S phureja
119
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia y Boyacaacute
(Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw Suecia A Niveles de
identidad de nucleoacutetidos y aminoaacutecidos (entre pareacutentesis) de las regiones CP CP-RT y
TGB analizadas y la cepa NC_003724 B Regioacuten CP-RT se incluyeron 1956 nt (651 aa)
para CP-RT y 531 nt (176 aa) para CP Se presentaron cambios en 15 posiciones para el
producto del ARN 2 siendo lo maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la
posicioacuten 81 de CP C Regioacuten TGB se incluyeron 1392 nt (463 aa) Se presentan 10
cambios a lo largo de las tres proteiacutenas analizadas con la presencia de una delecioacuten en la
posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
120
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con secuencias de
referencia de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia y secuencias Colombianas de PMTV
procedentes de Antioquia y Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de
Bootstrap (100 ) se indican sobre las ramas La escala representa las sustituciones
promedio por sitio
121
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica Checa
AJ243719
PMTV Suecia
Antioquia
Colombia ID 0994 0979 0976
Boyacaacute
Colombia 0994 ID 0978 0975
DQ102381 PMTV
Repuacuteblica Checa 0979 0978 ID 0995
AJ243719 PMTV
Suecia 0976 0975 0995 ID
122
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de referencia
de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19
(AY353719) y 54-10 (AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd
(D30753) de Escocia y secuencias Colombianas de PMTV procedentes de Antioquia y
Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de Bootstrap (100 ) se indican
sobre las ramas La escala representa las sustituciones promedio por sitio
123
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AY426745
PMTV
Dinamarca
AY353719
Dinamarca
AJ277556
PMTV
Suecia
D30753
PMTV
Escocia
Antioquia
Colombia ID 0979 0988 0987 0986 0973 0967
Boyacaacute
Colombia 0979 ID 0980 0980 0979 0980 0969
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0988 0980 ID 0998 0997 0979 0971
AY426745
PMTV
Dinamarca
0987 0980 0998 ID 0997 0979 0970
AY353719
PMTV
Dinamarca
0986 0979 0997 0997 ID 0978 0969
AJ277556
PMTV Suecia 0973 0980 0979 0979 0978 ID 0986
D30753 PMTV
Escocia 0967 0969 0971 0970 0969 0986 ID
124
6 ANEXOS GENERALES
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen)
1 Homogenizar 100 mg de tejido de planta en nitroacutegeno liacutequido utilizando un mortero
Adicionar 400 microL de buffer AP1 y 4 microL de la solucioacuten de ARNase A (100mgmL) a
un maacuteximo de 100 mg (peso huacutemedo) o 20 mg (peso seco) de tejido de planta
homogenizado y agitar vigorosamente
2 Incubar la mezcla por 10 min a 65degC Mezclar por inversioacuten 2 oacute 3 veces durante la
incubacioacuten
3 Agregar 130 microL de buffer AP2 al lisado mezclar e incubar por 5 min en hielo
4 Recomendado Centrifugar el lisado por 5 min a 20000 x g (14000 rpm)
5 Pipetear el lisado en la columna QIAshredder Mini spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a 20000 x g (14000 rpm)
6 Transferir la fraccioacuten que pasoacute por la columna del paso 5 en un nuevo tubo sin
disturbar el sedimento de restos celulares
7 Agregar 15 voluacutemenes de buffer AP3E al lisado aclarado y mezclar por pipeteo
8 Pipetear 650 microL de la mezcla de paso 7 incluyendo cualquier precipitado que se
pueda haber formado en la columna DNeasy Mini spin column colocando en un
tubo de coleccioacuten de 2 ml Centrifugar por 1 min a 6000 x g (corresponde a 8000
rpm para la mayoriacutea de las microcentrifugas) y descartar el liacutequido Reutilizar el
tubo de coleccioacuten en el paso 9
9 Repetir el paso 8 con la muestra restante Desechar el liacutequido que atraviesa la
membrana y el tubo de coleccioacuten
10 Colocar la columna DNeasy Mini spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2 ml
agregar 500 microL de buffer AW y centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rpm)
Descartar el liacutequido que atraviesa la membrana y reutilizar el tubo de coleccioacuten en
el paso 12
11 Adicionar 500 microL de buffer AW a la columna DNeasy Mini spin y centrifugar por 2
min a 20000 x g (14000 rpm) para secar la membrana
12 Transferir la columna DNeasy Mini spin a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL y
pipetear 40 microL de Agua bi-destilada directamente en la membrana de DNeasy
Incubar por 5 min a temperatura ambiente (15-25degC) y luego centrifugar por 1 min
a 6000 x g (8000 rpm) para eluir
13 Repetir el paso 12 una vez
125
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo (Doyle y Doyle 1987)
Previo a dar inicio a al procedimiento se debe asegurar de contar con
Nitroacutegeno liacutequido
Bantildeo Mariacutea a 65degC
Enfriar morteros a -20degC
Preparar solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2
Preparar el volumen de buffer CTAB+ β-Mercaptoetanol correspondiente al
nuacutemero de muestras
Desinfestar las muestras con hipoclorito y agua destilada durante 1 min
1 Tomar la raiacutez previamente desinfestada macerarla en nitroacutegeno liacutequido y pasarla a
un tubo eppendorf de 2 mL hasta completar un volumen de 400-500 microL
2 Adicionar 500 microL de buffer de extraccioacuten (CTAB) y 1 de β-Mercaptoetanol (5
microL) previamente preparado
Mezclar por inversioacuten
3 Incubar los tubos a 65degC por 30 min Durante este tiempo hacer inversioacuten de los
tubos cada 5 min
4 Adicionar 250 microL de fenol y 250 microL de cloroformo alcohol isoamiacutelico (241)
Mezclar por inversioacuten
5 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 10 min
6 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL
7 Adicionar un volumen de cloroformo alcohol isoamiacutelico (respecto al sobrenadante)
Mezclar por inversioacuten y centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 5 min
8 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL y repetir
el paso 7
9 Adicionar un volumen de isopropanol friacuteo y 01 voluacutemenes de acetato de sodio 3M
invertir varias veces para precipitar el ADN Llevar las muestras a -20degC por 60 min
como miacutenimo o durante toda la noche Periodos maacutes largos pueden aumentar la
produccioacuten
10 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 15 min a temperatura ambiente
11 Descartar el sobrenadante invirtiendo raacutepida y suavemente los tubos y adicionar 200
microL de etanol friacuteo al 70 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 2 min
12 Descartar el sobrenadante por inversioacuten y secar el pellet a temperatura ambiente
invirtiendo los tubos sobre papel absorbente
13 Resuspender el pellet en 50 microL de agua ultrapura esteacuteril
14 Adicionar 4 microL de ARNasa a cada muestra e incubar en el bantildeo Mariacutea a 37degC
durante miacutenimo 2 horas o durante toda la noche
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
126
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y
hongos filamentosos (Qiagen)
1 Determinar la cantidad de material de planta No usar maacutes de 100 mg
2 Colocar inmediatamente el tejido pesado en nitroacutegeno liacutequido Macerar bien en
un mortero Pasar el tejido en polvo a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL
manteniendo los tubos en nitroacutegeno liacutequido Eacuteste se puede evaporar pero no se
debe permitir que el tejido se descongele Proceder inmediatamente al paso 3
3 Adicionar 450 microL de buffer RLC a un maacuteximo de 100 mg de tejido en polvo
Hacer vortex vigorosamente Nota Asegurar que el B-mercaptoetanol (β-ME)
haya sido agregado al buffer RLC antes de su uso (10 microL de β-ME1 mL de
buffer RLC)
4 Transferir el lisado a la columna QIAshredder spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a maacutexima velocidad (13000 rpm
oacute 18500 x g) Transferir cuidadosamente el sobrenadante que pasoacute por la
columna a un nuevo tubo de microcentriacutefuga sin disturbar el sedimento de
restos celulares en el tubo de coleccioacuten Usar soacutelo el sobrenadante en los pasos
siguientes
5 Adicionar 05 voluacutemenes de etanol (96-100) al lisado aclarado y mezclar
por pipeteo inmediatamente No centrifugar Proceder inmediatamente al paso 6
6 Transferir la muestra (usualmente 650 microL) incluyendo cualquier precipitado
que se haya formado a una columna RNeasy spin (rosada) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL (suministrado) Cerrar suavemente la tapa y centrifugar
por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que pasoacute por la
membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 7
7 Adicionar 700 microL de buffer RW1 a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 8
8 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo en el paso 8 Nota Asegurar que el
buffer RPE tenga adicionado el etanol antes de su uso
9 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 2 min a 8000 x g (10000 rpm) para lavar la membrana
de la columna
10 Opcional Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2
mL (suministrado) y descartar el tubo anterior con el liacutequido Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar a velocidad maacutexima por 1 min (13000 rpm oacute 18500 x g)
11 Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 15 mL
(suministrado) Adicionar 20 microL de agua tratada con DEPC (Dietil
pirocarbonato Qiagen) directamente a la membrana de la columna Cerrar
suavemente la tapa y centrifugar por 1 min a 8000 x g (10000 rpm) para eluir
el ARN
12 Repetir el paso 11
127
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Volumen del componente
para 15 microL de mezcla
Producto de PCR 8 μl
Buffer de la enzima 1 (1X) 1 5 μl
Buffer de la enzima 2 (1X) 1 5 μl
Enzima de restriccioacuten 1 2 μl
Enzima de restriccioacuten 2 2 μl
Volumen total 15 μl
2 Incubar las muestras al bantildeo Mariacutea a 37degC por 12 h-24 h
3 Ralizar el anaacutelisis en gel de agarosa al 25
128
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa RT M-
MuLV para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del componente
para 20 microL de mezcla
Agua bi-destilada 05 microL
PBST (05) 004 15 microL
Buffer RT M-MuLV 5X 1X 4 microL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 microL
dNTPs 10 mM 1 mM 2 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 1 microM 2 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa M-MuLV 20 UmicroL 05 microL
ARN 5 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
129
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 20 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 95 microL
Buffer RT Maacutexima 5X 1X 4 microL
dNTPs 10 mM 05 mM 1 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 05 microM 1 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa Maximareg 200 UmicroL 1 microL
ARN 3 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
130
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes de
descongelar
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 146 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 25 mM 02 mM 2 microL
Primer F 10 microM 05 microM 125 microL
Primer R 10 microM 5 microM 125 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 04 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN Molde 1microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Condiciones del ciclo de la PCR para Sss
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 55 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
131
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes del
descongelamiento
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25
microL de mezcla
Agua bi-destilada 158 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 10 mM 02 mM 05 microL
Primer F 10 microM 2 microM 05 microL
Primer R 10 microM 2 microM 05 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 02 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN copia 3 microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 53 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
134
7 CONCLUSIONES GENERALES
En este estudio se encontroacute que las poblaciones Colombianas de Spongospora subterranea
f sp subterranea (Sss) presentan una estructura baacutesica consistente en tres tipos geneacuteticos
(I II y III) El subgrupo III difiere de los reportados mundialmente como Tipo I y Tipo II
en 5 y 2 respectivamente El Tipo III presentoacute la mayor proporcioacuten de aislamientos de
Sss en este estudio con cepas de diferentes departamentos hospedantes y tejidos
sintomaacuteticos mientras que el Tipo I no fue encontrado en muestras procedentes de agallas
de raiacutez Es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa en Colombia asiacute como su
epidemiologiacutea y capacidad para la transmisioacuten de PMTV
Los anaacutelisis de RFLPs de regiones ITS del ADNr de Sss demostraron polimorfismos en los
sitios de corte de las enzimas Hin6I y Bsp143I Se confirmoacute que la digestioacuten con la enzima
Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos del Tipo III mientras que
el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los Tipos I y II permitiendo
separar los tres principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico de Sss Los
resultados obtenidos sugieren la viabilidad de plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla
El anaacutelisis filogeneacutetico para el gen CP de PMTV permitioacute separar dos grupos de
aislamientos del virus El primer clado agrupoacute todas las secuencias de referencia mundial
con 19 de los aislamientos Colombianos obtenidos en este estudio que presentaron niveles
de identidad superiores al 99 El segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo dos de las reportadas en investigaciones previas y seis
obtenidas en el presente estudio con niveles de variacioacuten del 11 al 13 y con una identidad
de tan solo 76 con respecto a los miembros del primer clado Estos resultados confirman
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que no ha sido registrada en otros
Osorio 2012
135
135
lugares del mundo Es necesario estudiar el efecto de ambos genotipos virales sobre la
produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de papa en Colombia de manera que se generen
tecnologiacuteas para la deteccioacuten de PMTV en los programas de certificacioacuten de semilla y de
mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en el paiacutes
En el anaacutelisis de las regiones parciales de CP y CP-RT del ARN2 y TGB del ARN3 de
PMTV sensu stricto se encontraron niveles muy altos de identidad en las tres regiones
estudiadas siendo la CP la maacutes uniforme Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos
compartieron un 999 de identidad en nt y aa Asiacute mismo los anaacutelisis filogeneacuteticos para el
ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Europeos y Colombianos demostraron que los niveles de
identidad entre ambos grupos fueron muy altos gt975 para ARN 2 y gt967 para el
ARN 3 Estos bajos niveles de variacioacuten permiten inferir que este virus se encuentra bajo
fuertes presiones de seleccioacuten determinadas presumiblemente por las propias caracteriacutesticas
de su genoma el estrecho rango de hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica
por parte de su vector Sss Sin embargo a pesar de los altos valores de uniformidad general
encontrados la presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los
aislamientos colombianos de PMTV resulta interesante para el desarrollo de
investigaciones que permitan determinar si se trata de adaptaciones del genoma viral a las
variedades nativas de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas propias de
las poblaciones de Sss en las regiones Andinas
NS1P Pasto (Nar) Suelo S tuberosum
vi
INDICE DE FIGURAS
Pag
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV 24
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp
subterranea en plantas de papa de Colombia 65
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja
var Criolla Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos
infestados con Spongospora subterranea f sp subterranea 66
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos
agallas o raiacuteces de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana 68
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8 69
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la
regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp
subterranea de Colombia 70
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb)
a partir de ADN de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum
tuberosum S phureja y Nicotiana benthamiana 71
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e
ITS2 del ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss)
de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo 75
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos
de S subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I
MspI TaqI y Tru1I mediante el programa Web-cutter 77
vii
Pag
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN
ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las
enzimas de restriccioacuten Bsp143I y Hin6I que permiten determinar los tres
Tipos de Sss identificados en este trabajo 82
Figura 410 Gel de RFLPs con la enzima Hind6I y Bsp143I con muestras de los
Tipos I II y III de Sss detectados en el estudio 83
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb)
dirigidos al gen de la caacutepside viral del Potato mop-top virus PMTV 109
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4
(417 pb) dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) del Potato
mop-top virus (PMTV) 110
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7
(2063 pb) PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al
ARN3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 112
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses
del mundo 115
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del
genoma de Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia
y otros paiacuteses del mundo 117
viii
Pag
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia
y Boyacaacute (Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw
Suecia 119
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con
secuencias de referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del
Potato mop-top virus (PMTV) 120
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias
De referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del Potato
mop-top virus (PMTV) 122
ix
INDICE DE TABLAS
Pag
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o
raiacuteces de plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea 67
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna
polvosa y de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad 72
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de
aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en
Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2
del ADN ribosomal 78
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S
E ITS2 del ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp
subterranea de Colombia y otros paiacuteses del mundo 81
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten
de los segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 111
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia 113
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 116
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 118
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato
mop-top virus en cuatro Departamentos cultivadores de papa de Colombia 118
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 118
x
Pag
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 123
xi
RESUMEN
El cultivo de papa es uno de los renglones agriacutecolas de mayor importancia en Colombia se
extiende a 128701 ha y genera una produccioacuten anual de 23 millones de ton antildeo-1
Desde el
punto vista fitosanitario la papa se ve afectada por diversos problemas destacaacutendose en los
uacuteltimos antildeos la reemergencia de la Sarna polvosa causada por el protozoario del suelo
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) El efecto de esta enfermedad se refleja en
el deterioro de la calidad del tubeacuterculo y en la reduccioacuten de la produccioacuten al afectar el
sistema radicular de las plantas Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus
(PMTV) uno de los virus prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarenteneario en diferentes paiacuteses del mundo En este trabajo se evaluaron los niveles de
variabilidad geneacutetica de aislamientos Sss y PMTV obtenidos en cultivos de papa de los
departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo En el caso de Sss se
estudiaron los niveles de variacioacuten de 127 aislamientos a partir de la secuenciaciacioacuten de
las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr) encontraacutendose la presencia de tres variantes
principales dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada Para PMTV se
evaluaron los niveles de identidad de 38 aislamientos de los cuatro departamentos bajo
estudio a partir de la secuenciacioacuten de los genes de la caacutepside viral (CP) y del segundo gen
del triple bloque de genes (TGB2) encontraacutendose la presencia de dos variantes del virus
una que representa el genotipo mundialmente reportado para este virus y la otra que hasta
ahora soacutelo se ha encontrado en Colombia y que dado el bajo nivel de identidad (76) con
respecto al primer grupo posiblemente representa una nueva especie de pomovirus
Finalmente dos de las cepas de PMTV de Antioquia y Boyacaacute fueron secuenciadas para
sus ARN 2 y 3 lograacutendose un 83 del segmento genoacutemico de ARN 2 y 87 para el ARN
3 y encontraacutendose que comparten niveles de identidad superiores al 97 con respecto a
otros aislamientos previamente caracterizados en el Norte de Europa Se espera que los
resultados de esta investigacioacuten sean utilizados para el disentildeo de herramientas de
xii
diagnoacutestico que apoyen los esquemas de certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas
de mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en Colombia
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum Potato mop-top
virus secuenciacioacuten
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea AND ITS
ASSOCIATED PMTV VIRUS IN COLOMBIA
ABSTRACT
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
The other hand Sss is a vector for Potato mop-top virus (PMTV) a prevalent virus in the
Andean region and quarentenary in several countries However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
xiii
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum Potato mop-top virus
RT-PCR Sequencing
1
1 INTRODUCCIOacuteN
En Colombia el cultivo de la papa ocupa cerca de 128701 ha distribuidas en 14
departamentos de los cuales Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo son responsables
del 80 de la produccioacuten que asciende a cerca de 23 millones de ton antildeo-1
y de la cual
dependen maacutes de 69000 familias del sector rural del paiacutes La cadena de la papa en
Colombia enfrenta un gran nuacutemero de desafiacuteos endoacutegenos y exoacutegenos que disminuyen su
competitividad respecto a los demaacutes paiacuteses del mundo y en especial con relacioacuten a los otros
miembros de la Comunidad Andina de Naciones Entre otros factores los maacutes limitantes
son aquellos relacionados con la carencia de tecnologiacutea en los sistemas de produccioacuten y de
post-cosecha la alta dependencia de insumos agriacutecolas y el bajo nivel de acople entre el
sector primario y el de procesamiento industrial (MADR 2006) Desde el punto vista
fitosanitario el cultivo de la papa se ve afectado por diversos fitopatoacutegenos e insectos
plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la reemergencia de la enfermedad denominada
Sarna polvosa de la papa causada por el protozoario Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) Su efecto no solo se debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten
al deterioro en la calidad y apariencia cosmeacutetica de los tubeacuterculos que afecta draacutesticamente
su valor en el mercado Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus (PMTV)
uno de los problemas virales prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarentenario para diferentes paiacuteses del mundo (Santala et al 2010)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 de las cosechas en las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro (Solanum tuberosum) y
papa criolla (S phureja) (SINAIPA 2002) Por otra parte se estima que el PMTV puede
causar peacuterdidas hasta del 25 en este cultivo lo cual adicionado al dantildeo causado por Sss
pudiera generar disminuciones de 50-80 en la produccioacuten (Jones y Harrison 1972
Guerrero 1997 2000) Aunque se cree que este virus tiene como centro de origen los
Andes suramericanos no se ha establecido con certeza su efecto sobre el rendimiento de las
variedades alliacute cultivadas ni determinado claramente los siacutentomas que causa en sus
hospedantes (Salazar 1995) De esta forma no es frecuente encontrar la sintomatologiacutea
asociada a este virus reportada para la regioacuten templada que incluye amarillamiento foliar
2
anillos necroacuteticos y cuarteamiento o agrietamiento de tubeacuterculos y moteados foliares tipo
ldquoAucubardquo (Salazar 1995 Xu et al 2004)
Adicionalmente a esta problemaacutetica la diseminacioacuten de Sss se viene incrementando
dramaacuteticamente en el paiacutes como resultado de la deficiente calidad de la semilla utilizada
por la mayoriacutea de los agricultores la ausencia de variedades tolerantes a dicho patoacutegeno y
la carenciadeficiencia de asistencia teacutecnica estatal o gremial que no cuenta con
herramientas apropiadas para el diagnoacutestico asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla
libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011)
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la ausencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos o bioloacutegicos efectivos por lo
tanto requiere de un manejo fitosanitario especial al afectar directamente la semilla
inhabilitar los suelos dedicados al cultivo afectar la calidad cosmeacutetica del producto fresco y
ser transmisor del PMTV lo que genera una barrera cuarentenaria para la apertura de
nuevos mercados Por lo anterior el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado bajo
un esquema de manejo integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como
rotacioacuten de cultivos manejo adecuado del riego y drenaje sanidad del tubeacuterculo semilla
utilizacioacuten de organismos antagonistas (pe Trichoderma spp) utilizacioacuten de cultivos
trampa desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos estrictos de
certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas son
utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado del
manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o de
Rhizoctoniasis
El desarrollo de metodologiacuteas seroloacutegicas y moleculares pueden ser una importante
herramienta para el monitoreo y deteccioacuten de estos patoacutegenos en el paiacutes Se destacan para
Sss la teacutecnica de ELISA (Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas) con anticuerpos
policlonales y monoclonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
3
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Ward et al 2004 Qu et al
2011) Para el caso de PMTV tambieacuten se han utilizado teacutecnicas de deteccioacuten utilizando
plantas trampa ELISA RT-PCR (Retrotranscripcioacuten - Reaccioacuten en cadena de la
polimerasa) qPCR (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa en tiempo real) y microplatos de
hibridizacioacuten y microarreglos (Arif et al 1994 Nielsen y Moslashlgaard 1997 Jeffries 1998
Davey 2009 Latvala-Kilby et al 2009 Nakayama et al 2009) Sin embargo estas
teacutecnicas son de aplicacioacuten limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas o validadas con
base en los genotipos locales de ambos patoacutegenos presentes en las regiones cultivadoras de
nuestro paiacutes motivo por el cual es fundamental emprender un estudio amplio de los niveles
de variabilidad geneacutetica de Sss y PMTV en Colombia
Este trabajo responde a dicha necesidad En eacutel se realizaron colecciones de material vegetal
y suelo de cuatro zonas productoras de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo (Colombia) y se realizaron extracciones de ADN o ARN seguacuten el
caso para mediante teacutecnicas moleculares determinar las secuencias de diferentes regiones
informativas del genoma de cada patoacutegeno Una vez obtenidas y editadas las secuencias se
realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos para comparar y agrupar aislamientos colombianos con
respecto a los reportados para Sss y PMTV en el mundo y determinar sus niveles de
identidad geneacutetica
Este estudio pretende apoyar el desarrollo de programas de diagnoacutestico de Sss y PMTV
tanto en Colombia como en la regioacuten Andina La informacioacuten generada es importante para
desarrollar programas de deteccioacuten asintomaacutetica y temprana de ambos patoacutegenos como una
herramienta fundamental para implementar una base tecnoloacutegica que apoye los esquemas
cuarentenarios dirigidos a evitar la diseminacioacuten de los patoacutegenos hacia zonas libres de la
enfermedad la certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas de mejoramiento geneacutetico
que conduzcan a generar variedades resistentes a este patosistema
4
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GENERAL
Evaluar los niveles de variacioacuten geneacutetica de Spongospora subterranea y de su virus asociado
PMTV en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y
Narintildeo
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de S subterranea de cultivos de
papa de cuatro departamentos de Colombia a partir de secuenciacioacuten de las
regiones ITS del ADN ribosomal
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de PMTV de cultivos de papa de cuatro
departamentos de Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de la caacutepside y TGB2 del
genoma viral
Definir las afinidades filogeneacuteticas entre las variantes de S subterranea y PMTV
detectadas en Colombia con aislamientos de dichos patoacutegenos de diferentes paiacuteses
que presenten secuencias disponibles en las bases de datos moleculares
Ampliar el nivel de informacioacuten disponible sobre las secuencias de los segmentos
del genoma de aislamientos de PMTV en Colombia
5
3 MARCO TEOacuteRICO
31 Generalidades del cultivo de la papa
La papa es el tubeacuterculo maacutes importante que se produce en el mundo Se cultiva en maacutes de
125 paiacuteses y es consumido diariamente por maacutes de mil millones de personas En los paiacuteses
en desarrollo es un cultivo de fuerte expansioacuten con cientos de millones de personas que
dependen de eacutel para su supervivencia Los paiacuteses en desarrollo son los maacutes grandes
productores (e importadores) de papa y de sus productos derivados (FAO 2009) China se
ha convertido recientemente en el primer productor mundial de papa y junto a India
responden por la tercera parte de la produccioacuten global de este tubeacuterculo En Ameacuterica Latina
y Aacutefrica las cosechas presentaron un menor volumen pero el rendimiento se incrementoacute
significativamente Ameacuterica del Norte fue el mayor productor del continente con un
rendimiento de maacutes de 40 ton ha-1
(FAO 2008)
Ameacuterica del Sur es la cuna de la papa pero esta regioacuten presenta los niveles maacutes bajos de
produccioacuten con menos de 16 millones de toneladas para el antildeo 2007 En la regioacuten Andina
la mayoriacutea de los pequentildeos campesinos manejan el cultivo de forma tradicional y se
siembran variedades de papa que son poco comerciales y desconocidas para el resto del
mundo sin embargo en paiacuteses como Argentina Brasil Colombia y Meacutexico la produccioacuten
comercial de papa estaacute aumentando paulatinamente (FAO 2008)
En Colombia el cultivo de la papa participa con el 71 de la superficie sembrada en
cultivos transitorios y aporta cerca de 78 de la produccioacuten agriacutecola generando alrededor
de 69000 empleos directos principalmente en los departamentos de Cundinamarca
Boyacaacute Narintildeo y Antioquia (MADR 2009a) En el 2009 el aacuterea sembrada de papa fue de
128701 ha con una produccioacuten de 2272772 ton y un rendimiento de 184 ton ha-1
(MADR-ENA 2009) La participacioacuten departamental en la produccioacuten nacional se
encuentra distribuida de la siguiente manera Cundinamarca 378 Boyacaacute 263 Narintildeo
6
164 Antioquia 65 Santander 56 y otros departamentos participan con el 64
(MADR 2009b)
La papa es el producto de origen agriacutecola que tiene la mayor demanda en Colombia por
fungicidas e insecticidas y la segunda en demanda de fertilizantes despueacutes del cafeacute Es la
actividad que maacutes utiliza los servicios de transporte terrestre con maacutes de 2 millones de
toneladas al antildeo sin incluir la movilizacioacuten de los insumos requeridos para su produccioacuten
(MADR 2005)
Los cultivos de papa se encuentran distribuidos en climas friacuteos con temperaturas de 13ordmC y
alturas de 2000 msnm hasta alcanzar zonas de paacuteramo con alturas cercanas a los 3500
msnm y temperaturas de 8ordmC Geograacuteficamente las unidades de produccioacuten estaacuten
dispersas principalmente en las regiones friacuteas de la zona Andina bajo una variada gama de
condiciones biofiacutesicas econoacutemicas y sociales En teacuterminos generales alrededor del 75
del aacuterea cultivada con papa en el paiacutes se encuentra en zonas de topografiacutea quebrada y
ondulada (MADR 2005)
Seguacuten Villareal et al (2007) en el paiacutes existen alrededor de 30 variedades de papa
cultivada pero soacutelo 10 de eacutestas tienen importancia comercial La Parda pastusa es la
variedad maacutes cultivada y consumida en fresco le siguen la variedad Diacol Capiro
utilizada para consumo en fresco exportacioacuten y por la industria de alimentos como materia
prima La variedad ICA-Puraceacute es utilizada en algunas regiones de clima templado del paiacutes
para consumo en fresco la Tuquerrentildea o Sabanera que se consume principalmente en
Bogotaacute y la Criolla que se cultiva principalmente en los departamentos de Antioquia y
Cundinamarca En el paiacutes se han desarrollado nuevas variedades que han ingresado al
mercado como las variedades Esmeralda Rubi UNICA e ICA Morita que tienen altas
posibilidades comerciales en el corto plazo
Una de las principales limitantes teacutecnicas del cultivo de la papa corresponde a las plagas y
enfermedades Dentro de las enfermedades el tizoacuten tardiacuteo o gota causado por
Phytophthora infestans es la amenaza maacutes seria del cultivo Ademaacutes tambieacuten se presentan
el tizoacuten temprano (Alternaria solani) la rontildea (Rhizoctonia solani) la sarna comuacuten
7
(Streptomyces scabies) la palomilla o mortaja blanca (Rosellinia sp) las virosis (PVY
PVX PLRV PYVV PVS PMTV) y la sarna polvosa Esta uacuteltima enfermedad se ha
convertido en una de las principales problemaacuteticas de cultivo a nivel mundial (Harrison et
al 1997 Merz y Falloon 2009) Es causada por el protozoo Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) paraacutesito obligado de plantas superiores Esta enfermedad causa dantildeos
directos sobre las raiacuteces y tubeacuterculos y ademaacutes es vector del PMTV (Jones y Harrison
1969 Harrison et al 1997 Andersen et al 2002 Merz y Fallon 2009) enfermedad viral
que afecta este cultivo en varias regiones productoras de papa en el mundo
En Colombia el manejo de la enfermedad se basa en el uso de semilla certificada por el
Instituto Colombiano Agropecuario ICA la utilizacioacuten de variedades medianamente
tolerantes y la rotacioacuten entre estas variedades con cultivos no hospedantes del patoacutegeno
(Jaramillo y Botero 2007)
32 Generalidades de Spongospora subterranea fsp subterranea
321 Taxonomiacutea
Sss es el agente causal de la enfermedad denominada Sarna polvosa de la papa El primer
reporte de esta enfermedad data de 1841 en Alemania (Wallroth 1842) y a partir de esta
fecha su registro incluye todos los continentes (Harrison et al 1997 Merz 2008) Seguacuten
Lyman y Rogers (1915) el patoacutegeno es originario de los Andes Suramericanos desde donde
se dispersoacute gracias al mercado mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber
transcurrido mas de 150 antildeos desde su primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado
importancia en las uacuteltimas deacutecadas como resultado de la siembra generalizada de materiales
altamente susceptibles al patoacutegeno la utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los
cambios de eacutepocas de siembra hacia periacuteodos huacutemedos las deficiencias en los sistemas de
rotacioacuten de cultivos la falta de programas cuarentenarios y los altos estaacutendares exigidos por
el mercado en la calidad cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
8
Sss es un pseudohongo plasmodial que taxonoacutemicamente se ha ubicado en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos Spongospora subterranea f sp
subterranea y Spongospora subterranea f sp nasturtii definidos como forma especialis
son importantes patoacutegenos de vegetales (Merz y Falloon 2009) Dick (2001) propone que
dichos microorganismos corresponden a especies diferentes
322 Ciclo de vida Sss
Sss y otros plasmodiophorales se caracterizan por presentar zoosporas biflageladas (3-4 microm
diaacutemetro) de desigual tamantildeo con mastigonemes y posicioacuten opuesta que se liberan a partir
de las estructuras de resistencia (quistes) Los quistes (4 microm diaacutemetro) pueden sobrevivir en
el suelo por largos periacuteodos de tiempo y generalmente se encuentran agregados formando
estructuras denominadas quistosoros (hasta 85 microm diaacutemetro) CITA los cuales son esfeacutericos
u ovoides y presentan un centro vaciacuteo En Colombia observaciones realizadas por
Jaramillo y Peacuterez (2008) han determinado que los quistosoros de aislamientos procedentes
de suelos del municipio de La Unioacuten (Antioquia) oscilaron entre 50 y 120 microm Bajo
condiciones de humedad es frecuente la liberacioacuten de una zoospora uninucleada aunque se
cree que la germinacioacuten de los quistes responde a un patroacuten escalonado que garantiza la
generacioacuten de inoacuteculo infectivo por largos periodos de tiempo Una vez en el suelo las
zooporas se desplazan varios centiacutemetros y son atraiacutedas por los exhudados de las raiacuteces de
sus plantas hospedantes adherieacutendose enquistando y formando un tubo germinativo que
ejerce fuerza mecaacutenica para su penetracioacuten directa en la planta Posteriormente el patoacutegeno
desarrolla un plasmodio multinucleado con membrana simple y ausencia de pared celular
Eventualmente el plasmodio se cliva dando lugar a muacuteltiples zooesporangios cada uno de
los cuales puede generar hasta 8 zoosporas que son liberadas por un poro germinativo y
continuacutean con la infeccioacuten de otras ceacutelulas radiculares Estas zoosporas denominadas
secundarias son indistinguibles de las que inician la infeccioacuten (primarias) y ambas pueden
infectar lenticelas no suberizadas de tubeacuterculos comenzando a inducir el siacutentoma tiacutepico de
9
la sarna que toma apariencia corchosa a partir del desarrollo de una capa de proteccioacuten a
nivel del peridermo del tubeacuterculo Es frecuente ademaacutes que el patoacutegeno induzca hipertrofia
e hiperplasia en los tejidos afectados dando origen a las agallas y a las deformaciones
caracteriacutesticas de la enfermedad Al final del ciclo en los plasmodios se reorganiza su
contenido protoplasmaacutetico rodeaacutendo los nuacutecleos presentes de pared celular y generaacutendose
quistes que serviraacuten de inoacuteculo para sucesivas infecciones (Harrison et al 1997)
El ciclo de vida de Spongospora es diferenciado por Merz (2008) de acuerdo a la
ocurrencia de dos fases una fase esporogeacutenica y una segunda fase esporangial cada una
iniciada por la infeccioacuten de la ceacutelula hueacutesped a traveacutes de un plasmodio individual En la
fase esporangial numerosas zoosporas secundarias son formadas en el esporangio de
paredes delgadas en las ceacutelulas epidermales de la raiacutez y los pelos radicales del hueacutesped en
las cuales las zoosporas son formadas desde un plasmodio esporangiogeacutenico Las zoosporas
secundarias tambieacuten biflageladas pueden salir del hueacutesped e iniciar otro ciclo de infeccioacuten
La fase esporogeacutenica se presenta despueacutes de la divisioacuten nuclear dentro del plasmodio
esporogeacutenico El patoacutegeno produce esporas de reposo de pared gruesa las que son
altamente persistentes Cada espora de reposo libera una sola zoospora primaria
biflagelada
En Colombia Hoyos et al (2009) realizaron observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Sss encontrando plasmodios plasmodios enquistados plasmodios en
estado de divisioacuten ceacutelulas uacutenicas y quistosoros en raiacuteces de plantas de S tuberosum
asintomaacuteticas indicando que la infeccioacuten puede estar presente sin desarrollo evidente de
siacutentomas y que los quistosoros no son solamente las estructuras maacutes frecuentes en los
tejidos de los hospedantes afectados
10
323 Rango de hospedantes de Sss
Diversas investigaciones han encontrado la presencia de zoosporangios de Sss en plantas de
otras familias diferentes a la Solanaceae como Alzoaceae Apiaceae Asteraceae
Boraginaceae Brassicaceae Caryophyllaceae Chenopodiaceae Fabaceae Geraniaceae
Lamiaceae Plantaginaceae Papaveraceae Poaceae Polygonaceae Ranunculaceae
Rubiaceae Resedaceae Solanaceae y Urticaceae (Jones y Harrison 1969 Andersen et al
2002) Andersen et al (2002) encontraron diferentes tasas de infeccioacuten desarrolladas por el
patoacutegeno en especies como Artemisia vulgaris Cirsium arvense Chamomilla suaveolens
Chenopodium album Galium aparine Geranium pusillum Lapsana communis Matricaria
inodora Poa annua Polygonum avicular P convolvulus Rumex acetosa R acetosella
Solanum nigrum Sonchus arvensis Urtica urens y Viola tricolor lo que permitioacute
confirmar estas 17 especies como hospedantes de Sss
Aunque aparentemente Sss tiene un amplio rango de hospedantes el desarrollo de los
quistosoros nunca habiacutea sido observado en otros hospederos diferentes a S tubersosum Sin
embargo Qu y Christ (2006a) encontraron formacioacuten de quistosoros en seis especies de
plantas Solanum plycantum Dun Datura stramonium L Avena sativa L Dactylis
conglomerado L Solanum esculentum Mill y Brassica campestris L Esto indicoacute que el
patoacutegeno tiene la capacidad de completar su ciclo de vida en hospedantes alternos a las
plantas de papa lo que representa un aspecto epidemioloacutegico importante Asiacute mismo se
encontroacute que las siguientes especies tambieacuten son hospedantes del patoacutegeno Fagopyrum
esculentum Moench Phleum pratense L Raphanus sativus L Brassica napus L
Trifolium pratense L Secale cereale L Ambrosia artemisiifolia L Chenopodium album
L Amaranthus retroflexus L y Cyperus esculentus L Recientemente se ha encontrado
que el patoacutegeno puede producir agallas en S physalifolium y S nigrum y su patogenicidad
fue confirmada por inoculacioacuten a plantas de tomate (S esculentum) y de papa bajo
condiciones de invernadero (Shah et al 2010) Estos resultados tienen consecuencias para
el manejo de la enfermedad enfocado en cultivos de rotacioacuten porque se debe tener en
cuenta que existen especies cultivables y malezas que pueden albergar estructuras del
patoacutegeno y que el reporte de nuevas especies hospederas continua por ejemplo Sss causa
11
agallas en las raices de Solanum sarrachoide en donde puede completar su ciclo de vida y
producir nuevas generaciones de quistosoros que son infectivos a papa (Nitzan et al 2009)
324 Siacutentomas causados por Sss
Los siacutentomas de la enfermedad incluyen la induccioacuten de lesiones pustulosas corchosas con
centros polvosos formados a partir de la agregacioacuten de los quistosoros del patoacutegeno Con el
avance de estas lesiones es frecuente la ruptura del peridermo aunque el nivel de
penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente superficial Bajo condiciones oacuteptimas para el
desarrollo de la enfermedad es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten
de los tejidos y la formacioacuten de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la
enfermedad ademaacutes de causar los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular
de las plantas al inducir la formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas (Cotes et al
2006) que causan la disminucioacuten de la superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo a la
marchitez y finalmente a la muerte de las plantas Durante el almacenamiento la sarna
polvosa puede ocasionar pudriciones secas que sirven de entrada a otros patoacutegenos y
saproacutefitos que deterioran auacuten maacutes el producto (Agrios 1996) La infeccioacuten en las raiacuteces
especialmente cuando se forman agallas pueden causar una reduccioacuten en el funcionamiento
de la raiacutez por la interrupcioacuten de la toma de agua y de nutrientes (Lister et al 2004 Falloon
et al 2005)
En Colombia en los departamentos de Cundinamarca Boyacaacute Narintildeo y Antioquia Sss
afecta severamente las variedades de papa (Solanum tuberosum) Parda Pastusa y Diacol
Capiro y a la papa criolla (Solanum phureja) Los siacutentomas se observan en raiacuteces y
tubeacuterculos pero hay variacioacuten en las zonas paperas en cuanto a la distribucioacuten de los
siacutentomas entre los diferentes oacuterganos de la planta En Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de
Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre los tubeacuterculos de las variedades Parda
Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el departamento de Narintildeo y en el Oriente de
Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces Hasta ahora no se sabe si estas diferencias
se deben a variaciones en las condiciones ambientales de una regioacuten a otra o quizaacutes se
12
deban a la distribucioacuten regional de diferentes razas del patoacutegeno yo a su interaccioacuten con el
ambiente (Jaramillo y Botero 2007)
En el Oriente Antioquentildeo se determinoacute la incidencia y el grado de severidad de 23
poblaciones de Sss bajo el sistema de rotacioacuten entre ICA Puraceacute-Diacol Capiro y viceversa
en tres cosechas sucesivas en condiciones de casa de malla Se observoacute que las poblaciones
del patoacutegeno no afectaron el peso ni causaron siacutentomas de sarna polvosa en los tubeacuterculos
pero si en las raiacuteces con diferentes grados de severidad en las dos variedades siendo maacutes
susceptible la variedad Diacol Capiro que al parecer favorecioacute el incremento del inoacuteculo
mientras que la ICA Puraceacute fue levemente afectada y posiblemente presentoacute efecto
supresivo sobre los quistosoros en el suelo (Jaramillo y Botero 2007)
Estudios realizados en el departamento de Narintildeo presentaron diferencias en el grado de
desarrollo de la enfermedad en raiacuteces La variedad Parda Pastusa fue la maacutes susceptible a
Sss con desarrollo de agallas desde el momento de la emergencia de las plantas La
enfermedad alcanzoacute valores de susceptibilidad del 100 en dicha variedad mientras que en
Diacol Capiro fue de 48 En los tubeacuterculos la enfermedad se manisfestoacute por la formacioacuten
de escasas y pequentildeas puacutestulas de color castantildeo con poca presencia de masas pulverulentas
de esporas de resistencia del patoacutegeno lo que contrasta con la regioacuten Cundiboyacense en
donde estas variedades se caracterizan por presentar una alta susceptibilidad a la rontildea en
tubeacuterculos ocasionando lesiones severas en las que resulta faacutecil encontrar esporas de
resistencia (Benavides 2006)
325 Control de Sss
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la carencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos efectivos (Qu y Christ
2006a) Seguacuten Harrison et al (1997) el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado
bajo un esquema integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como la
rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del tubeacuterculo semilla la
utilizacioacuten de organismos antagonistas (ie Trichoderma spp) la utilizacioacuten de cultivos
trampa la desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
13
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos de certificacioacuten de
semilla Dos estrategias que en la actualidad se consideran fundamentales para apoyar los
programas MIC en papa incluyen el mejoramiento geneacutetico por resistencia al pseudohongo
y la utilizacioacuten de cultivos trampa (Merz et al 2004)
Para el caso del mejoramiento los primeros reportes en la regioacuten Andina fueron
presentados por Torres et al (1995) quienes evaluaron 467 accesiones encontrando la
existencia de 17 genotipos resistentes y 33 moderadamente resistentes Por otra parte Lees
(2000) en Escocia evaluoacute los niveles de resistencia a Sss de una serie de clones de S
phureja encontrando que algunos de eacutestos presentaron un adecuado nivel de resistencia
por lo que esta especie fue propuesta como fuente de genes de resistencia Merz (2000) al
evaluar la reaccioacuten de 11 cultivares determinoacute que existe correlacioacuten entre las pruebas de
invernadero utilizando plaacutentulas provenientes de cultivo de tejidos y la resistencia
presentada en campo
Fallon et al (2003) realizaron un estudio en Australia con 99 cultivares de papa y 13
liacuteneas de mejoramiento durante 11 antildeos Sus resultados indicaron que el 21 de los
materiales evaluados eran resistentes mientras que el 28 presentoacute una resistencia
moderada Estos autores tambieacuten reportaron que la expresioacuten de la resistencia variacutea entre
antildeos y que los bioensayos realizados en invernadero no siempre se correlacionan con la
respuesta presentada en campo sugiriendo una fuerte interaccioacuten genotipo-ambiente para
esta caracteriacutestica
Nitzan et al (2010) evaluaron la estabilidad de la resistencia geneacutetica de 24 genotipos de
papa a Sss en los estados de Washington e Idaho en Estados Unidos Se identificoacute que la
resistencia era estable a la formacioacuten de agallas en las raiacuteces causada por Sss y se determinoacute
que una gran proporcioacuten de la variacioacuten fue geneacutetica lo que permite a los mejoradores usar
genotipos resistentes y estables de papa como progenitores en el desarrollo de cultivares
comerciales con resistencia a este patoacutegeno debido a que contar con materiales geneacuteticos
resistentes es una de las principales estrategias de manejo de la enfermedad (Rodriacuteguez et
al 2009 Houser y Davidson 2010)
14
Seguacuten Merz et al (2012) no existen meacutetodos de control eficientes y econoacutemicos que se
encuentren disponibles actualmente y la resistencia del hospedero es clave para el manejo
integrado de la enfermedad debido a esto se evaluaron 10 cultivares con diferentes rangos
de susceptibilidad a Sss y a PMTV en diferentes paiacuteses de Europa Para evitar discrepancias
en los criterios de evaluacioacuten se utilizoacute una escala estaacutendar para los niveles de la sarna
polvosa determinaacutendose que los cultivares se comportaron como estaba establecido en su
caracterizacioacuten inicial (a excepcioacuten de uno de ellos) Los resultados del ensayo de campo
indicaron que los diferentes meacutetodos de valoracioacuten son el principal factor de discrepancia
en las calificaciones de la resistencia y que las condiciones ambientales yo el nivel de
inoacuteculo del suelo juegan un papel menor
Otra estrategia con alto potencial para el manejo de la enfermedad es la rotacioacuten del cultivo
con plantas trampa que reducen el nivel de estructuras de resistencia de
plasmodiophoromycetes Por ejemplo es ampliamente conocido que la siembra de
Raphanus sativus reduce la cantidad de quistes de Plasmodiophora brassicae en el suelo
(Murakami et al 2000) mientras que la planta Datura stramonium redujo el nivel de Sss en
un 79 en cultivos de papa de Australia
En Colombia la buacutesqueda de herramientas para el manejo de la enfermedad bajo las
condiciones regionales de las zonas productoras de papa se enfoca en la evaluacioacuten de
sistemas de rotacioacuten de variedades comerciales que tradicionalmente se han considerado
altamente susceptibles a la enfermedad (ie Diacol Capiro) con variedades maacutes tolerantes al
ataque del patoacutegeno (ie ICA Puraceacute) encontraacutendose que efectivamente esta uacuteltima
variedad presenta un menor nivel de susceptibilidad a la sarna polvosa (Jaramillo et al
2003 Jaramillo y Botero 2007)
En cuanto al control bioloacutegico de Sss Gilchrist (2009) evaluoacute una cepa de Trichoderma
previamente considerada por Hoyos et al (2002) como potencialmente uacutetil para el control
bioloacutegico de Sss en la variedad Diacol Capiro Las pruebas fueron realizadas en campo
utilizando tres dosis de aplicacioacuten del biocontrolador Se encontroacute que la aplicacioacuten de T
asperellum T109 redujo un 64 y 54 los efectos de la sarna polvosa en el crecimiento y
15
en la produccioacuten de las variedades respectivamente De esta forma se resalta el potencial
de la cepa como biocontroladora contra Sss teniendo en cuenta que se debe ampliar el
conocimiento acerca de los factores que limitan la accioacuten de T asperellum T109 en el
campo y coacutemo compensarlo aumentando la frecuencia de aplicacioacuten En un trabajo similar
se investigoacute la influencia de cuatro aislamientos de T asperellum sobre la sarna polvosa en
tres tipos de suelo Andisol Entisol e Inceptisol No se encontraron diferencias
significativas entre las plantas de papa tratadas y no tratadas con T asperellum pero siacute se
encontroacute que la reduccioacuten del crecimiento y la produccioacuten estuvieron inversamente
asociadas con el contenido de Al2+
en los suelos sugiriendo que los efectos de la sarna
polvosa estaacuten fuertemente relacionados con las condiciones del suelo (Gilchrist et al 2009)
Estudios sobre la evaluacioacuten de estrategias de manejo de la rontildea polvosa en tres regiones
productoras de papa en Colombia han incluido resultados sobre la biologiacutea y patologiacutea de
Sss en la Sabana de Bogotaacute y sus hallazgos maacutes importantes consisten en la puesta en
marcha de un sistema de bioensayos en los cuales ha sido posible inducir la liberacioacuten de
zoosporas bajo condiciones de laboratorio Otros estudios incluyen la evaluacioacuten del efecto
de fungicidas aplicados al suelo para el manejo de Sss Sin embargo se determinoacute que
ninguno de los fungicidas evaluados (Tiabendazol Tolclofos metil Benomyl Carbendazin
Clorotalonil y Mancozeb) contribuyeron con el control del patoacutegeno en raiacuteces y tubeacuterculos
bajo las dosis y condiciones de tres localidades productoras de papa (Subachoque Medelliacuten
(Corregimiento Santa Elena) y Pasto) (Garciacutea y Navia 2002) En contraste Falloon et al
(2010) realizaron aplicaciones en campo del fungicida Mancozeb el cual contiene Zn y
Mn Las dosis estuvieron determinadas como baja similar y alta con respecto al contenido
de estos elementos en el suelo cultivado con papa cv Iwa (considerado muy susceptible a
Sss) Se encontroacute que niveles elevados de Zn y Mn generan infecciones moderadas de Sss
en las raiacuteces del cultivar evaluado de S tuberosum
Otras investigaciones para el manejo de Sss han incluiacutedo la evaluacioacuten de potenciales
biocontroladores (Trichoderma harzianum y Pseudomonas fluorescens) un consorcio de
micorrizas y viruta de pino como tratamientos Se encontraron diferencias estadiacutesticamente
significativas entre el testigo y P fluorescens y los tratamientos con T harzianum
16
micorrizas y viruta presentando una incidencia en raiacuteces de 32 21 y 5 3 y 1
respectivamente Los tratamientos con T harzianum micorriza y viruta tuvieron los
porcentajes de incidencia maacutes altos pero contrastaron con niveles muy bajos de severidad
de la enfermendad (022 0088 y 0019 respectivamente) Sin embargo no se
obtuvieron incrementos en peso seco de raiacuteces peso de tubeacuterculos y peso seco de la parte
aeacuterea cuando se realizaron las inoculaciones de los diferentes agentes de control y las
aplicaciones de la viruta de pino (Restrepo et al 2009)
Arias (2011) realizoacute un anaacutelisis y comparacioacuten de glucosinolatos presentes en diferentes
accesiones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control de
Sss Se estandarizaron los procedimientos de extraccioacuten del compuesto y las diferentes
formulaciones fueron probadas como biofumigante en el suelo donde posteriormente se
sembraron tubeacuterculos de papa criolla Sin embargo los resultados obtenidos no permitieron
establecer un posible potencial biofumigante de las accesiones evaluadas y es necesario
profundizar en los estudios que permitan determinar el efecto de los glucosinolatos y de
otros compuestos sobre el patoacutegeno
33 Deteccioacuten de Sss
La deteccioacuten del inoacuteculo a nivel del suelo es compleja y es evaluada precariamente a partir
de sistemas de trampeo que utilizan plaacutentulas de tomate (Merz 1989) o de papa (Wale et al
1993) Estas evaluaciones son criacuteticas para definir relaciones entre el grado de infestacioacuten
de los suelos y los niveles de enfermedad observados en el campo requisito fundamental
para la implementacioacuten de cualquier medida de control (Merz et al 2005)
Con el objetivo de buscar alternativas para alcanzar mayores rangos de sensibilidad en la
deteccioacuten de Sss se han explorado diversas metodologiacuteas basadas en teacutecnicas seroloacutegicas y
moleculares Entre las primeras se destacan la generacioacuten de anticuerpos policlonales que
detectan quistosoros del protozoo bajo un sistema ELISA (Harrison et al 1993 Walsh et
al 1996) Sin embargo la utilidad de estos anticuerpos es reducida debido a que no detecta
el estado plasmodial (Ward et al 2004) Maacutes recientemente Merz et al (2005)
desarrollaron una prueba para la evaluacioacuten rutinaria de la presencia del patoacutegeno basada
17
en anticuerpos monoclonales derivados de quistosoros como antiacutegenos alcanzando niveles
de sensibilidad de menos de un quistosoro por tubeacuterculo A partir de esto se generoacute la
herramienta ldquoSss AgriStriprdquo una prueba basada en un inmunoensayo de flujo lateral cuya
precisioacuten y sensibilidad fue evaluada por Bouchek-Mechiche et al (2011) para la
deteccioacuten de Sss Se comparoacute con teacutecnicas de microscopiacutea ELISA PCR y qPCR que
detectaron Sss en lesiones tiacutepicas de sarna polvosa Asiacute mismo se realizaron pruebas en los
lotes que presentaban lesiones tiacutepicas y atiacutepicas causadas por el patoacutegeno y se confirmoacute la
presencia de Sss en todas las lesiones con todos los meacutetodos probados Se concluyoacute que el
Sss AgriStrip es una prueba tan sensible como DAS- ELISA con un liacutemite de deteccioacuten de 1
a 10 quistosoros por mL de buffer
Con respecto a las metodologiacuteas moleculares se ha utilizado PCR convencional a partir de
los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 (Bulman y Marshall 1998) Sps1Sps2 (Bell et al
1999) y SsFSsR (Qu et al 2006) que amplifican las regiones ITS del ADNr
Los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 disentildeados por Bulman y Marshall (1998) detectaron
Sss en las muestras evaluadas y no presentaron reaccioacuten cruzada con otros
plasmodiophoridos como Spongospora subterranea f sp nasturtii Plasmodiophora
brassicae Sorosphaera veronicae y Polymyxa graminis asiacute como con el causante de la
sarna comuacuten Streptomyces scabies demostrando la utilidad de estos cebadores en la
deteccioacuten de Sss realizada por estos investigadores
Bell et al (1999) obtuvieron secuencias parciales del ITS de 391pb con los cebadores Sps
1 y Sps 2 para la deteccioacuten y cuantificacioacuten de Sss en la corteza tubeacuterculos lavados y
suelos cultivados con papa Las pruebas desarrolladas mostraron ser maacutes sensibles que los
inmunoensayos previamente reportados y fueron maacutes raacutepidas y sencillas que los ensayos
convencionales con plantas trampa
Qu et al (2006) utilizaron la teacutecnica de PCR para la identificacioacuten especiacutefica y
cuantificacioacuten de Sss Los cebadores SsF y SsR amplificaron un producto de 434 pb
proveniente de masas de esporas de Sss pero no se obtuvo el amplicoacuten cuando el ADN era
de papa sana de tubeacuterculos con sarna comuacuten o de otros plasmodiophoridos relacionados
18
Asiacute mismo se detectoacute Sss en otros hospederos infectados que no presentaban siacutentomas y se
concluyoacute que la prueba es tan sensible que puede detectar 1 quiste g-1
Adicionalmente con
esta teacutecnica se logroacute la cuantificacioacuten de Sss en el suelo logrando identificar valores de 1 a
104 quistosoros por 025 g de suelo
La implementacioacuten de meacutetodos para la deteccioacuten de Sss ha permitido el desarrollo de
procedimientos que permiten una raacutepida y automatizada extraccioacuten de ADN combinada
con PCR en tiempo real utilizando sondas Taqmanreg para avanzar en el diagnoacutestico
rutinario de la sarna polvosa (Lees et al 2002 van de Graff et al 2003 Ward et al 2004
Qu et al 2011) o PCR competitivo o cuantitativo (Qu et al 2006 Shah et al 2009) En esta
prueba se utiliza un control interno de ADN de papa (citocromo oxidasa) para hacerla maacutes
confiable y evitar falsos negativos La validacioacuten de dicha metodologiacutea se realizoacute a partir
de la evaluacioacuten de 37 muestras de tubeacuterculos de varios cultivares procedentes de diversas
localidades del Reino Unido La prueba detectoacute el patoacutegeno en todas las muestras que eran
sospechosas de tenerlo asiacute como en tubeacuterculos que no presentaban quistosoros observables
La prueba con la sonda Taqman demostroacute ser 100 veces maacutes sensible que la PCR
convencional (Ward et al 2005) y la ELISA (Ward et al 2004) Estas pruebas han
permitido determinar el efecto del nivel de inoacuteculo en el suelo y de algunos factores
ambientales en la infeccioacuten y desarrollo de agallas en raiacuteces de papa causadas por Sss (van
de Graaf et al 2007) En Gran Bretantildea la teacutecnica de PCR en tiempo real permitioacute detectar
confiablemente y establecer la cantidad de ADN de los quistorosos zoosporas y
plasmodiozoosporangios del patoacutegeno asiacute mismo se determinoacute la viabilidad de los quistes
en el suelo y en combinacioacuten con el uso de plantas trampa se estudioacute la liberacioacuten de
zoosporas y los niveles de infeccioacuten en papa bajo diferentes condiciones ambientales
permitiendo conocer con maacutes detalle varios aspectos de la epidemiologiacutea de la enfermedad
(Lees et al 2008)
Otras variaciones de estas teacutecnicas como la muacuteltiple qPCR utilizando sondas TaqManreg ha
permitido la deteccioacuten y diferenciacioacuten simultaacutenea de la sarna polvosa y la sarna comuacuten
dos enfermedades del tubeacuterculo que causan siacutentomas similares pero que son ocasionadas
por patoacutegenos diferentes (Sss vs Streptomyces spp) (Qu et al 2011) Finalmente como una
19
teacutecnica de diagnoacutestico simultaacuteneo de diferentes patoacutegenos de papa se ha desarrollado un
chip para su anaacutelisis en microarreglos siendo incorporada la deteccioacuten de Sss (Zhang et al
2008)
En Colombia la utilizacioacuten de meacutetodos de deteccioacuten de Sss en tubeacuterculos y suelos ha
estado dada por la evaluacioacuten visual de sintomatologiacuteas en raiacuteces y tubeacuterculos la
evaluacioacuten de bioensayos (Rodriacuteguez et al 2002) y la utilizacioacuten de PCR convencional
utilizando cebadores especiacuteficos (Jaramillo et al 2003 Carrentildeo 2009) Se han utilizado
combinaciones de diversos cebadores que permiten la amplificacioacuten de la regioacuten ITS del
ADNr del patoacutegeno (Spo1-Spo2 Spo8-Spo9 y Sps1- Sps2) los cuales permiten obtener
productos de 372 390 y 391 pb respectivamente (Saavedra et al 2004) Ramiacuterez (2010)
obtuvo amplificacioacuten de los fragmentos del tamantildeo esperado utilizando los cebadores
Spo8Spo9 y SsFSsR para analizar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de Sss
provenientes de La Unioacuten (Antioquia) encontrando una estructura clonal de los
aislamientos evaluados mientras que Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS
y SSCP (Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) con un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones del paiacutes establecioacute la presencia de subpoblaciones del
patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado
34 Variabilidad geneacutetica de Sss
La disponibilidad de cultivares resistentes a Sss debe ser una prioridad en el disentildeo de
futuras estrategias de manejo de la enfermedad Los mejoradores tratan de incluir
resistencia en los nuevos cultivares seleccionando liacuteneas contra un rango de patoacutegenos que
representan la diversidad geneacutetica conocida con el fin de seleccionar la resistencia maacutes
durable Sin embargo poco es conocido acerca de la variacioacuten geneacutetica de Sss o del papel
de la recombinacioacuten sexual en su ciclo de vida (Merz y Falloon 2009)
Los estudios geneacuteticos de Sss han sido difiacuteciles de aplicar debido a razones como las
siguientes obtener y mantener el patoacutegeno es complicado por su naturaleza de paraacutesito
obligado no han existido meacutetodos disponibles para el aislamiento de quistosoros
individuales el desarrollo de la sarna polvosa estaacute influenciado por condiciones
20
ambientales y los estaacutendares de inoculacioacuten y los cultivares de referencia no han sido bien
establecidos (Qu y Christ 2006b)
Los sistemas de deteccioacuten basados en aacutecidos nucleicos ofrecen sensibilidad y especificidad
para la cuantificacioacuten de inoacuteculo (Mutasa et al 1993) En estudios previos amplificando
regiones del ITS del ADNr fueron identificados dos agrupaciones de Sss en Australia y
Europa (tipo I y II) (Bulman y Marshall 1998) Posteriormente se realizoacute una
investigacioacuten sobre la variabilidad geneacutetica de 52 aislamientos de Islas Britaacutenicas y
Norteameacuterica que fueron amplificados por PCR Se identificaron dos grupos geneacuteticamente
diferentes (I y II) que representaron el 346 y el 654 de los aislamientos
respectivamente Sin embargo en Norteameacuterica los aislamientos soacutelo perteneciacutean al grupo
II (Qu y Christ 2004) Debido a que el anaacutelisis de secuencia de ITS se basa en un solo
locus para la deteccioacuten de la variacioacuten geneacutetica los anaacutelisis con marcadores moleculares
que comprendan diferentes partes del genoma del patoacutegeno son necesarios para obtener una
imagen amplia de la variacioacuten geneacutetica y estructura poblacional de Sss
El uso de marcadores moleculares tales como RAPDs (ADN polimoacuterfico amplificado al
azar) y AFLPs (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados) han sido
usados para estudiar la diversidad geneacutetica en muchos patoacutegenos de plantas sin embargo
tales marcadores no estaacuten disponibles para Sss Es complejo obtener estructuras
individuales del patoacutegeno y la uacutenica forma es la obtencioacuten de quistosoros que pueden traer
contaminantes secundarios o contener tejido de la planta Por lo tanto es difiacutecil obtener
ADN puro del patoacutegeno un paso indispensable para llevar a cabo la PCR basada en
marcadores moleculares (Qu y Christ 2006b)
Wuumlerzer (1964) caracterizoacute 17 colecciones de Sss de Europa y Ameacuterica seguacuten el tamantildeo
del quistosoro pero no encontroacute evidencia bioloacutegica significativa de este agrupamiento
Posteriormente se detectoacute variacioacuten geneacutetica (divergencia 51) en secuencias de ADN de
los ITS1 e ITS2 de colecciones de Sss originarias de diferentes continentes (Bulman y
Marshall 1998) Las colecciones de Australasia y Europa incluidas en el grupo II diferiacutean
de otra coleccioacuten de Escocia que fueacute ideacutentica a dos colecciones de Sur Ameacuterica agrupadas
21
en el tipo I La existencia de estos grupos fue confirmada por Qu y Christ (2004) quienes
tambieacuten identificaron ambos grupos en colecciones de Escocia pero demostraron que soacutelo
la secuencia de tipo II es de ocurrencia en colecciones de Canadaacute y Estados Unidos
Los marcadores RFLPs (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccioacuten) son
codominantes y locus especiacutefico (McDonald y Martiacutenez 1990) Han sido utilizados
ampliamente para evaluar diversos genomas de patoacutegenos de plantas A pesar de que
consumen maacutes tiempo que los meacutetodos basados en PCR los RFLPs son maacutes reproducibles
y menos sensibles a contaminacioacuten de ADN que las pruebas basadas en PCR Qu y Christ
(2006b) realizaron un estudio maacutes detallado de colecciones de quistosoros obtenidas de
Estados Unidos y Canadaacute empleando marcadores RFLPs Encontraron variacioacuten geneacutetica
entre las localidades geograacuteficas pero no entre los individuos de una misma localidad lo
que sugirioacute que las poblaciones del campo son clones y no estaban sometidas a
recombinacioacuten sexual El anaacutelisis de agrupamiento permitioacute separar los aislamientos en
dos grupos el grupo I que incluyoacute aislmientos del oeste de Norte Ameacuterica (exceptuando
aislamientos de Colorado) y el grupo II incluyoacute aislamientos originarios del este de Norte
Ameacuterica y de Colorado Este estudio muestra que el uso de marcadores moleculares para
diferenciar aislamientos de quistosoros individuales facilitaraacute investigaciones adicionales
para determinar la estructura geneacutetica de poblaciones de Sss
En Colombia Ramiacuterez (2010) realizoacute un estudio sobre la variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss de La Unioacuten Antioquia Encontroacute que los anaacutelisis de secuencias de la
regioacuten ITS del ADNr presentaron altos niveles de similitud con cepas obtenidas del
Departamento de Narintildeo asiacute como con secuencias de referencia de cepas del tipo II de Sss
Este resultado permitioacute plantear que el patoacutegeno presenta un comportamiento clonal
aunque es necesario obtener informacioacuten de otras regiones del genoma que permitan
realizar anaacutelisis de muacuteltiples loci que conduzcan a una mayor aproximacioacuten sobre las
condiciones de variacioacuten de este patoacutegeno en el paiacutes
Otro estudio realizado por Carrentildeo (2009) sobre la variabilidad geneacutetica de Sss en
Colombia mediante el anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr permitioacute establecer la
22
presencia de subpoblaciones del patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Se
encontroacute una asociacioacuten directa entre las secuencias ITS del patoacutegeno y el oacutergano de la
planta infectado El tipo de ITS I se asocia aparentemente con infecciones de tubeacuterculo y el
tipo de ITS II lo hace con infecciones de raiacutez Esta investigacioacuten permitioacute descartar la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar hospedero o zona
geograacutefica Sin embargo de acuerdo con esta investigacioacuten es necesario realizar pruebas
que aborden otras aacutereas del genoma para corroborar los resultados encontrados Asiacute mismo
se comproboacute que en el paiacutes existen variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las
reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno Tres
variantes geneacuteticas de las cinco encontradas en este estudio difieren de las reportadas en la
literatura mundial
35 Generalidades del Potato mop-top virus (PMTV)
El PMTV es el agente causal de una importante enfermedad viral del cultivo de la papa
cuya distribucioacuten se encuentra registrada en diferentes lugares productores de este
tubeacuterculo como Irlanda Inglaterra Escocia Republica Checa Suiza Noruega Suecia
Dinamarca y Finlandia (Santala et al 2010) asiacute como en Japoacuten (Nakayama et al 2010) En
Ameacuterica ha sido registrado en Canadaacute y Estados Unidos (Xu et al 2004) En eacuteste uacuteltimo
paiacutes se reportoacute recientemente en los estados de North Dakota (David et al 2010) y en
Washington (Crosslin 2011) Nuevos reportes de este virus se continuan presentado en
otros paiacuteses del mundo como Polonia (Budziszewska et al 2010)
En Ameacuterica Central se ha encontrado en Costa Rica (Montero-Astua 2008) y aunque se
considera que es originario de la regioacuten de los Andes (Surameacuterica) soacutelo fue detectado en
Colombia en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) con la reconfirmacioacuten de su presencia en el antildeo
2010 (Gil et al 2011) El PMTV puede causar peacuterdidas de hasta 26 en rendimiento lo
que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera ascender a valores de
50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 Guerrero 2000) Seguacuten Salazar (2006)
el PMTV es uno de los virus que ha sido prevalente en el cultivo de la papa en los Andes
23
suramericanos pero su efecto sobre las variedades cultivadas en esta regioacuten no se ha
cuantificado claramente
351 Taxonomiacutea de PMTV
El PMTV pertenece al geacutenero Pomovirus virus con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20
nm en diaacutemetro y tres partiacuteculas con longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm
El geacutenero Pomovirus deriva su nombre de la especie tipo Potato mop-top virus y
actualmente se ubica en el la familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Los anaacutelisis
filogeneacuteticos de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRps) indican que el PMTV
estaacute relacionado maacutes estrechamente con el Beet soil-borne virus (Pomovirus) Broad bean
necrosis virus (Pomovirus) y Soil-borne Wheat mosaic virus (Furovirus) (Savenkov et al
1999)
Contiene tres moleacuteculas de ARNss con tamantildeos de 64 kb 3 kb y 25 kb con caperuzas
hacia el extremo 5rsquo y una estructura tipo ARNt hacia el extremo 3rsquo (Savenkov et al 1999
2003) El coeficiente de sedimentacioacuten de las partiacuteculas es de 230 170 y 125S
respectivamente El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene motivos de
metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del codoacuten de
finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999) Cerca del extremo
3acutedel ARN 2 se presenta una proteiacutena asociada a la transmisioacuten por el vector y generada a
partir de la supresioacuten del codoacuten de terminacioacuten del ORF que codifica para la caacutepside (CP)
Esta proteiacutena parece ser la responsable de la peacuterdida de la estructura helicoidal en los
extremos del ARN durante el proceso de desensamblaje (Sandgren et al 2001) El ARN 3
codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Tres de las
proteiacutenas producidas (TGB1 TGB2 y TGB3) estaacuten involucradas en el movimiento ceacutelula a
ceacutelula (Zamyatnin et al 2004) La funcioacuten de la cuarta proteiacutena una proteiacutena rica en
cisteiacutena parece ser la de actuar en el incremento de la virulencia sin embargo no es
indispensable para el proceso infectivo (Lukhovitskaya et al 2005) (Figura 1)
24
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV En las cajas se observan las proteiacutenas
para las que codifica el genoma Las flechas indican las proteiacutenas originadas y los ARN
subgenoacutemicos (ARNsg) Fuente httpwwwexpasychviralzoneall_by_species643html
Modificado por Gallo (2012)
352 Ciclo de la infeccioacuten de PMTV
La especie PMTV es transmitida por zoosporas de Sss que afecta los sistemas radiculares
de sus hospedantes Este virus tambieacuten puede ser transmitido por semilla asexual El virus
puede permanecer en las estructuras de resistencia de sus vectores por varios antildeos en el
suelo (Astier et al 2007 Dijkstra y Khan 2006) En los ensayos de transmisioacuten del virus se
ha observado que eacuteste es transmitido eficientemente a plantas indicadoras (ej N tabacum y
N benthamiana) a partir de muestras de suelo infestadas con quistes del patoacutegeno
(Campbell 1996 Veacutelez 2007)
25
El PMTV constituye un pequentildeo grupo de virus que para su movimiento sisteacutemico en la
planta hospedante no requiere de la expresioacuten de CP ni de la formacioacuten del virioacuten
(McGeachy y Barker 2000) debido a que el TGB le ofrece la posibilidad de mover el ARN
infeccioso a traveacutes de largas distancias en la planta (Melander et al 2001) Actualmente se
generan nuevas teoriacuteas acerca del movimiento de TGB en la planta y de la funcioacuten de cada
una de las proteiacutenas TGBp1 TGBp2 y TGBp3 en el movimiento ceacutelula a ceacutelula de PMTV
Shemyakina et al (2011) analizaron la localizacioacuten subcelular y el transporte de TGBp1
de acuerdo con los resultados obtenidos propusieron que la asociacioacuten de TGBp1 con los
microtuacutebulos puede ser importante para la formacioacuten de cuerpos de complejos de ribo-
nuacutecleo-proteiacutena viral destinada para el transporte a traveacutes de los plasmodesmos Estudios
similares han sido realizados por Wright et al (2010) cuyos resultados sugieren que TGB1
en PMTV requiere interaccioacuten con componentes nucleolares y posiblemente con
microtuacutebulos para el movimiento viral de ARN de larga distancia
El ARN desnudo se puede encontrar en tubeacuterculos asintomaacuteticos y causar una infeccioacuten
secundaria para la siguiente temporada de siembra (McGeachy y Barker 2000) La
manifestacioacuten de los siacutentomas caracteriacutesticos de la enfermedad depende de la presencia de
los tres ARN en el tejido (Savenkov et al 2003)
353 Rango de hospederos de PMTV
En condiciones experimentales el virus puede infectar plantas de las familias
Chenopodiaceae Solanaceae y Tetragoniaceae Dentro de estas se encuentran las plantas
que se usan para su diagnoacutestico las cuales corresponden a Nicotiana debneyi y
Chenopodium amaranticolor en las que se produce necrosis sisteacutemica y lesiones locales
conceacutentricas cafeacutes respectivamente Nicotiana benthamiana N debneyi N clevelandii y
N tabacum son las especies maacutes apropiadas para el mantenimiento y propagacioacuten del virus
bajo condiciones experimentales (ICTVdB 2006 Veacutelez 2007)
26
354 Siacutentomas causados por PMTV
La enfermedad inducida por PMTV presenta una amplia gama de siacutentomas dependiendo de
la variedad y de las condiciones ambientales siendo frecuente la presencia de anillos y
arcos de colores oscuros sobre la superficie de los tubeacuterculos mientras que internamente se
presentan arcos necrosados En infecciones secundarias los tubeacuterculos pueden mostrar
agrietamientos reticulados y profundos Adicionalmente los foliacuteolos de las plantas
afectadas pueden presentar moteados cloroacuteticos y liacuteneas con formas de V En la regioacuten
Andina la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos no es frecuente de observar pudiendo ser
igualmente inducidas por cepas necroacuteticas de PVY oacute por Streptomyces spp y Rhizoctonia
solani (Tenorio et al 2006) A nivel aeacutereo el virus tambieacuten puede inducir amarillamientos
enanismos y acortamiento de entrenudos (Salazar 1995)
En Escocia se estudioacute el efecto de los siacutentomas foliares causados por PMTV sobre el
rendimiento del cultivo los siacutentomas foliares y en el tubeacuterculo de varias generaciones de
siembra para la propagacioacuten de semilla de papa Se encontroacute que en los tubeacuterculos de
plantas sin siacutentomas rara vez se observan los siacutentomas foliares en la siguiente generacioacuten
Las plantas asintomaacuteticas produjeron maacutes tubeacuterculos infectados cuando eran derivadas de
plantas que presentaron siacutentomas foliares el antildeo anterior Adicionalmente la proporcioacuten de
plantas hijas con siacutentomas foliares provenientes de tubeacuterculos con siacutentomas foliares
tuvieron un rango de 19-41 en el antildeo y parecioacute estar asociado con la severidad de dichos
siacutentomas Asiacute mismo el siacutentoma de ldquospraingrdquo en los tubeacuterculos tendioacute a ser mayor en
plantas que presentaban siacutentomas foliares comparados con aquellas asintomaacuteticas Estos
resultados mostraron que la erradicacioacuten de plantas con siacutentomas foliares podriacutea mejorar la
fitosanidad del cultivo pero resulta impraacutectico cuando las plantas enfermas son muy
frecuentes (Carnegie et al 2010) Sin embargo los siacutentomas foliares son raramente
observados en variedades cultivadas actualmente en los paiacuteses noacuterdicos con excepcioacuten de
Noruega La razoacuten para estas diferencias de la etiologiacutea de la enfermedad no son
comprendidas pero puede ser que el clima marino maacutes huacutemedo en Noruega y Escocia
afecta la fisiologiacutea de la planta de papa e incrementa la infeccioacuten sisteacutemica por PMTV
(Santala et al 2010)
27
36 Deteccioacuten de PMTV
Para la deteccioacuten de PMTV se han utilizado diversas teacutecnicas de laboratorio Las primeras
pruebas incluyeron bioensayos con plantas indicadoras como Chenopodium amaranticolor
las cuales desarrollan los siacutentomas cuando son infectadas por PMTV Esta teacutecnica resulta
informativa pero tarda alrededor de 14 diacuteas para la expresioacuten de siacutentomas que en
ocasiones no son completamente confiables (Jeffries 1998)
Con el desarrollo de las pruebas ELISA se hizo posible la deteccioacuten de PMTV en dos diacuteas
sin embargo la generacioacuten de falsos negativos debido a la distribucioacuten erraacutetica del virus en
la planta ha hecho que se cuestione dicha teacutecnica Arif y Torrance (1996) realizaron
estudios de deteccioacuten de PMTV en muestras de tubeacuterculos de tres cultivares de papa
concluyendo que la combinacioacuten de tejidos de tubeacuterculos en la muestra incrementa la
probabilidad de deteccioacuten del virus En Dinamarca la utilizacioacuten de la teacutecnica DAS -
ELISA (Sandwich de anticuerpos doble - Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas)
tuvo alta confiabilidad para el seguimiento de la presencia de PMTV en 23 cultivares de
papa sembrados en campo (Nielsen y Moslashlgaard 1997)
La utilizacioacuten de teacutecnicas basadas en aacutecidos nucleicos ha llevado al desarrollo de meacutetodos
de deteccioacuten de alta sensibilidad La RT-PCR es uno de estos meacutetodos de deteccioacuten maacutes
sensible Arif et al (1994) compararon la confiabilidad de ELISA y RT-PCR en la
deteccioacuten de PMTV de raiacuteces y hojas de plantas trampa de Nicotiana debneyi Luego de
tres semanas de siembra la RT-PCR detectoacute el virus en ambos tejidos mientras que con
ELISA se obtuvo la deteccioacuten del virus soacutelo despueacutes de cinco semanas de la siembra A
pesar de que la teacutecnica RT-PCR es maacutes sensible la preparacioacuten de las muestras para este
meacutetodo lleva maacutes tiempo por lo tanto ELISA es considerada por algunos investigadores
como la teacutecnica maacutes econoacutemica y conveniente para el anaacutelisis rutinario de grandes
cantidades de muestras (Davey 2009)
Davey (2009) realizoacute estudios de deteccioacuten y cuantificacioacuten de PMTV utilizando qRT-
PCR y disentildeando un par de cebadores y una sonda para cada ARN del genoma del virus El
bioensayo desarrollado para las muestras de suelo fue muy efectivo en la deteccioacuten de
28
PMTV utilizando Solanum esculentum cv Monkeymaker como planta trampa y cuando se
usoacute en conjunto con qRT-PCR los resultados se obtuvieron maacutes raacutepidamente que los de
otros bioensayos previamente descritos por Arif et al (1994) quienes utilizaron
Chenopodium quinoa como planta trampa
Otros meacutetodos basados en RT-PCR han sido empleados en Japoacuten por Nakayama et al
(2010) mediante microplacas de hibridizacioacuten RT-PCR (RT-PCR-MPH) para la deteccioacuten
de PMTV con cebadores especiacuteficos y una sonda marcada en muestras provenientes de
raiacuteces de plantas de tomate Asiacute mismo el diagnoacutestico en muestras de suelo utilizando este
meacutetodo determinoacute que el 612 de los lotes muestreados estaban infectados con PMTV
La hibridizacioacuten especiacutefica basada en amplificacioacuten con cebadores con marcadores
fluorescentes (Flash-PCR) tambieacuten ha sido una teacutecnica basada en PCR que ha permitido la
deteccioacuten raacutepida y precisa de diferentes virus de la papa como el PMTV (Ryazantsev y
Zavriev 2009) De otro lado los microarreglos con sondas especiacutefica para virus pueden
detectar un nuacutemero casi ilimitado de especies de virus en un solo ensayo Nicolaisen
(2011) realizoacute un estudio de microarreglos con la utilizacioacuten de 152 sondas potencialmente
capaces de detectar 52 virus en papa (incluyendo PMTV) Las hibridizaciones del ADNc de
plantas infectadas mostraron que 49 de los 52 virus fueron positivos e identificados
correctamente a nivel de especie demostrando que esta teacutecnica puede contribuir a la
construccioacuten de microarreglos geneacutericos capaces de detectar la mayoriacutea sino todos los
virus de ARN de plantas
En Colombia la deteccioacuten de PMTV fue reportada por primera vez por Veacutelez (2007) Los
ensayos de RT-PCR permitieron determinar que el 81 de los suelos muestreados en el
estudio presentaron infeccioacuten por PMTV Este meacutetodo utilizando los cebadores H360
C819 fue maacutes sensible para la deteccioacuten de PMTV que la induccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras En estos bioensayos se encontroacute que las plantas de N tabacum fueron mejores
indicadoras de la expresioacuten de siacutentomas que las de N debneyi pero estas uacuteltimas son maacutes
sensibles para la deteccioacuten de PMTV por RT-PCR
29
Gil (2010) realizoacute la evaluacioacuten de la presencia del virus PMTV a partir de plantas de N
benthamiana inoculadas con quistosoros de Sss mediante pruebas de deteccioacuten seroloacutegica y
molecular Un total de 18 muestras de raiacuteces infectadas con Sss fueron evaluadas
encontraacutendose que cinco muestras de Antioquia y una de Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo
arrojaron resultados positivos en las pruebas de ELISA Al comparar estos resultados con
los obtenidos con qRT-PCR se encontroacute que la prueba de qRT-PCR determinoacute la presencia
del virus en el 45 de las muestras analizadas mientras que mediante ELISA y RT-PCR
convencional se diagnosticaron 25 y 28 de las muestras como positivas Sin embargo el
anaacutelisis estadiacutestico no indicoacute diferencias significativas al nivel del 95 entre las tres
pruebas analizadas Al observar individualmente la capacidad de las pruebas para detectar
PMTV resultoacute llamativo el hecho que algunas muestras fueran positivas para dos de las
tres pruebas e incluso se presentaron casos en los que la prueba de ELISA detectoacute el virus
pero no las pruebas basadas en RT-PCR lo cual sugirioacute problemas con la inhibicioacuten de las
reacciones enzimaacuteticas o con los cebadores empleados
37 Variabilidad geneacutetica de PMTV
A nivel mundial se han desarrollado investigaciones que reportan la presencia de bajos
niveles de variacioacuten entre genotipos de PMTV (Mayo et al 1996) Latvala-Kilby et al
(2009) caracterizaron el gen de la CP y un dominio de lectura continua del ARN 2 asiacute
como el gen 8K y la regioacuten no traducida 3acutedel ARN 3 (UTR) de 37 aislamientos de
Finlandia y Letonia Fueron encontrados dos tipos diferenciables de ARN 2 y ARN 3 La
secuenciacioacuten y los anaacutelisis de RFLP de los productos de PCR de dichas regiones
indicaron que la mayoriacutea de los aislamientos de PMTV que infectaron tubeacuterculos en estos
paiacuteses europeos comprenden los restrictotipos ARN 2-II y ARN 3-B
En estudios previos en los cuales las secuencias CP de tres aislamientos de Escocia y ocho
de Peruacute fueron analizadas por Mayo et al (1996) las cepas bajo anaacutelisis mostraron poca
variabilidad De forma similar las secuencias CP de seis aislamientos de Norteameacuterica
presentaron una identidad mayor al 97 con respecto a algunas secuencias de aislamientos
de PMTV de Europa (Xu et al 2004) En Dinamarca se reportoacute la presencia de dos grupos
30
de PMTV basado en anaacutelisis de las secuencias de CP encontrando que eacutestos comparten
98 de identidad pero con posibles diferencias en la reproduccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras (Nielsen y Nicolaisen 2003) Al parecer la variabilidad geneacutetica de los genes
de la CP en aislamientos de PMTV del norte de Europa y Norte Ameacuterica es limitada y
permite la deteccioacuten confiable del virus con los anticuerpos monoclonales y los cebadores
de la PCR usados actualmente (Santala et al 2010)
En Colombia Velez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo con alta identidad con aislamientos de Europa
y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por aislamientos colombianos Una
situacioacuten similar encontroacute Gil (2010) con aislamientos Colombianos de PMTV que
presentaron una estructura poblacional con bajos niveles de variabilidad pero con algunas
variantes divergentes con respecto a los genotipos de referencia mundial Dichas variantes
presentaron diferencias en sus secuencias de CP hasta del 24 con respecto al grupo
principal La contextualizacioacuten en el genoma viral de dos secuencias obtenidas por dicho
autor en cepas de PMTV del departamento de Antioquia indicoacute que se tratan de
aislamientos representativos del genoma ordinario de PMTV y no de las variantes
encontradas en el anaacutelisis filogeneacutetico Sus identidades para las porciones del ARN 2 y
ARN 3 secuenciadas fueron altas (gt97) con respecto a los genomas reportados en
trabajos anteriores (Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) por lo que se plantea la
necesidad de secuenciar dichas regiones en al menos un aislamiento de las variantes
referidas
Los resultados encontrados en esta investigacioacuten permiten plantear que el caso de PMTV
en Colombia es aparentemente singular dada la presencia de dos variantes geneacuteticas de los
altos niveles de infeccioacuten que genera Sss en cultivos de papa de diferentes departamentos y
de las diferencias notables en la manifestacioacuten de siacutentomas de la sarna polvosa entre
variedades locales (Carrentildeo 2009 Gilchrist et al 2009 Gil 2010) situacioacuten que amerita
continuar con los estudios de variabilidad geneacutetica y fenotiacutepica en dichos patosistemas
31
BIBLIOGRAFIA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Agrios GN 1996 Fitopatologiacutea Editorial Limusa Meacutexico
Andersen BAB Nicolaisen M Nielsen SL 2002 Alternative hosts for Potato mop-top
virus genus Pomovirus and its vector Spongospora subterranea Potato Research 45 37-
43
Arias CMM 2011 Anaacutelisis y comparacioacuten de los glucosinolatos presentes en diferentes
acceciones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control
del patoacutegeno de la papa Spongospora subterranea Tesis de Maestriacutea en Ciencias Quiacutemicas
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Departamento de quiacutemica
Bogataacute Colombia
Arif M Torrance L Reavy B 1994 Improved efficiency of detection of potato mop- top
furovirus in potato tubers and in the roots and leaves of soil-bait plants Potato Research
37 373-381
Arif M Torrance L 1996 Detection of Potato mop-top virus in potato tubers Proceedings
Crop Protection in Northern Britain 325-330
Astier S Albouy J Maury Y Robaglia C Lecoq H 2007 Principles of plant virology
genome pathogenicity virus ecology Science Publishers Enfield NH USA P 112
Bell KS Roberts J Verral S Cullen DW Williams NA Harison JG 1999 Detection and
quantification of Spongospora subterranea fsp subterranea in soils and on tubers using
specific primers PCR primers European Journal of Plant Pathology 105905-915
Benavides PJA 2006 Incidencia y severidad de la rontildea de la papa causada por
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh f sp subterranea Tomlinson en raiacuteces y
tubeacuterculos de Diacol Capiro y Parda Pastusa en tres eacutepocas de siembra en el departamento
32
de Narintildeo y su efecto en los rendimientos (Tesis de maestriacutea) Bogotaacute Colombia Facultad
de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid diagnostic
test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European Journal of Plant
Pathology 131 (2) 277-287
Budziszewska M Wieczorek P Nowaczyk K Borodynko N Pospieszny H Obrecircplaska-
Stecircplowska A 2010 First report of potato mop-top virus on potato in Poland Plant
Disease 94 (7) 920
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47759-766
Campell RN 1996 Fungal transmission of plant viruses Annuals Review of
Phytopathology 3487-108
Carnegie SF Cameron AM McCreath M 2010 Foliar symptoms caused by Potato mop-
top virus on potato plants during vegetative propagation in Scotland and their association
with tuber yield spraing and tuber infection Potato Research 53 83-93
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia (Tesis de Maestriacutea) Bogotaacute
Colombia Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Colombia
Cerovska N Pecenkeva T Filigarovaacute M Dedic P 2007 Sequences analysis of the Czech
Potato Mop-Top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica 52(1) 61-
64
Cotes J Jaramillo S Gonzaacutelez L 2006 Evaluacioacuten de la incidencia de sarna polvosa en
tres variedades de papas colombianas Congreso Internacional de papa John S
Niederhauser Meacutexicop O-7 ISBN 968-02-0270-4
33
Crosslin JM 2011 First report of potato mop-top virus on potatoes in Washington State
Plant Disease 95 (11)1483
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
David N Mallik I Crosslin JM Gudmestad NC 2010 Firt report of Potato mop-top virus
in North Dakota Plant Disease 94 (12)1506
Dick MW 2001 Straminipilous fungi systematic of the Peronosporomycetes including
accounts of the marine straminipilous protist the plasmodiophorids and similar organisms
Kluwer Dordrecht
Dijkstra J Khan JA 2006 Handbook of Plant Virology Haworth Press Inc New York
US Jawaid A Khan Jeanne Dijkstra editors P 452
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC Scott CL 2010 Elevated zinc and manganese
levels give moderate reductions in Spongospora subterranea infection of potato roots In
Proceedings 6th Australasian Soilborne Diseases Symposium Twin Waters Queensland 9-
10 August 2010 P 46
Falloon RE Russell AG Wallace AR Butler RC 2003 Susceptibility of potato (Solanum
tuberosum) cultivars to powdery scab (caused by Spongospora subterranea) and
relationships between tuber and root infection Australasian Plant Pathology 32377-385
FAO 2008 Antildeo internacional de la papa (Citado 14 enero 2011) Disponible en
httpwwwpotato2008orgesmundoamerica_latinahtml
FAO 2009 Sustainable potato production Guidelines for developing countries (Citado 14
enero 2011) Disponible en ftpftpfaoorgdocrepfao012i1127ei1127epdf
34
Gallo GYM 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea Facultad de Medicina Universidad Nacional de Colombia
Bogotaacute Colombia
Garciacutea C Navia E 2002 Evaluacioacuten de estrateacutegias de manejo de la rontildea polvosa
(Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en Colombia
(Citado 14 Ene 2011) Disponible en
httpwwwredepapaorgpracticasculturalesred3html
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Gil RJF Mariacuten M 2010 Diagnoacutestico y caracterizacioacuten molecular de virus asociados al
cultivo de la papa en Colombia con eacutenfasis en el virus Mop Top (PMTV Pomovirus)
(Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia
Gilchrist RE 2009 Alternativas para el manejo integrado de la sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) (Tesis de Doctorado) Medelliacuten Colombia
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia
Gilchrist E Jaramillo S Reynaldi S 2009 Efecto sobre la sarna polvosa de cuatro
aislamientos del hongo Trichoderma asperellum en tres tipos de suelo Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 624783ndash4792
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
35
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tuber by enzyme-linked immunosorbent assay Plant pathology
42181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato-a review
Plant pathology 461-25
Hoyos L Peacuterez JC Jaramillo S Orduz S Ntildeustez C 2002 Evaluacioacuten del efecto de
Trichoderma spp sobre Spongospora subterranea en papa variedad Diacol Capiro bajo
condiciones de invernadero Subproyecto 4 de Evaluacioacuten de las estrategias de manejo de la
rontildea polvosa (Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en
Colombia 2002 Disponible en wwwcevipapaorgco
Hoyos CL Villegas OM Gonzalez JEP 2009 Observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Spongospora subterranea f sp subterranea en papa Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 62(2) 5039-5045
Houser AJ Davidson RD 2010 Development a greenhouse assay to evaluate potato
germplasm for susceptibility to powdery scab American Journal of Potato Research 87
285-298
ICTVdB 2006 Management Potato mop-top virus The Universal Virus Database version
4 Buumlchen-Osmond C (Ed) Columbia University New York USA (Citado 20 Dic 2010)
Disponible en httpwwwncbinlmnihgovICTVdbICTVdB00086001001htm
Jaramillo S Calderoacuten H Narvaacuteez C Machuca A Afanador L Hincapieacute L Correa G 2003
Caracterizacioacuten de la variabilidad patogeacutenica y molecular de Spongospora subterranea
Informe final fase 2 Convenio Universidad Nacional Sede Medelliacuten y CEVIPAPA
Medelliacuten p 80
Jaramillo S Gonzaacutelez L Cotes J 2006 Efecto del tipo de suelo sobre la sarna polvosa
causada por Spongospora subterranea f sp subterranea (Wall) Lagerheim en papa
36
Congreso Internacional de papa John S Niederhauser Meacutexico p O-6ISBN 968-02-0270-
4
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos cultivares de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista de la Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 60(2)
3859-3876
Jaramillo VS Peacuterez AGA Hoyos CLM 2008 Variacioacuten morfoloacutegica de quistosoros de
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh fsp subterranea Revista Facultad de
Agronomiacutea ndash Medelliacuten 61(2)4511-4517
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Jones RAC Harrison BD 1969 The behaviour of Potato mop top virus in soil and
evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wall) Lagerh Annals Applied
Biology 63 1-17
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 71 47-57
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003 First
Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease 87872
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99(5)519-531
Lees AK 2000 Summary of the session on past and present research on powdery scab
Past and present Research Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery
scab Workshop Aberdeen Scottland July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) P 55-57
37
Lees AK van de Graaf P Cullen DW Duncan JM 2002 The development of a
quantitative real-time PCR assay for Spongospora subterranea f sp subterranea and its
use in epidemiological studies In Proceedings of the 5th
symposium of the international
working group on plant viruses with fungal vectors Institute of Plant Science Swiss
Federal Institute of Technology (ETH) Zurich Switzerland July 22-25 2002 P31
Lees AK van de Graaf P Wale S 2008 The identification and detection of Spongospora
subterranea and factors affecting infection and disease American Journal of Potato
Research 85 247-252
Lister RA Falloon RE Curtin D Butler C 2004 Spongospora subterranea reduces host
(Solanum tuberosum) growth Proceedings of 3rd
Australasian Soilborne Diseases
Symposium Barossa Valley South Australia 9-11 February 2004
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization and
effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal of
General Virology 862879-2889
Lyman GR Rogers JT 1915 The native habitat of Spongospora subterranea Science
42940-2
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2005 La cadena de la papa en
Colombia Una mirada a su estructura y dinaacutemica 1991-2005 Documento de trabajo Ndeg 54
(Citado 13 Ene 2011) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet2005112163731_caracterizacion_papapdf
MADR (Ministerio de agricultura y desarrollo rural) 2006 Observatorio agrocadenas
Colombia Documento de trabajo No 100 La cadena de la papa en Colombia Una mirada
global de su estructura y dinamica 1991-2005 (Citado 20 Dic de 2011) Disponible en
httpwwwagrocadenasgovco
38
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009a Memorias 2008- 2009
(Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwminagriculturagovcoarchivosmemorias_minagricultura_2009_completopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009b Anuario estadiacutestico del
sector agropecuario y pesquero Direccioacuten de poliacutetica sectorial Grupo sistemas de
informacioacuten Bogotaacute DC (Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwhtm3bpublicanuarioanuariopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural)ndashENA (Encuesta Nacional
Agropecuaria) 2009 Oferta Agropecuaria cifras 2009 (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet201046112648_RESULTADOS_ENA_200
9pdf
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C Salazar
LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top virus
from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
McDonald BA Martinez JP 1990 Restriction fragment length polymorphisms in Septoria
tritici occur at a high frequency Current Genetics 17133-138
McGeachy KD Barker H 2000 Potato mop-top virus RNA can move long distance in the
absence of coat protein Evidence from resistant transgenic plants Molecular Plant
Microbe Interactions 13125-128
Melander M Lee M Sandgren M 2001 Reduction in Potato mop-top virus accumulation
and incidence in tubers of potato transformed with a modified triple gene block gene of
PMTV Molecular Breeding 8197-206
Merz U 1989 Infectivity inoculum density and germination of Spongospora subterranea
resting spores a solution culture test system Bulletin OEPP 19 585-592
39
Merz U 2000 Powdery scab Research in Switzerland Past and present Research
Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery scab Workshop Scottland
July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) 2000 p 67-71
Merz U 2008 Powdery Scab of PotatomdashOccurrence Life Cycle and Epidemiology
American Journal of Potato Reserch 85241ndash246
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar
x environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Merz U Martiacutenez V Schwaumlrzel R 2004 The potencial for the rapid screening of potato
cultivars (Solanum tuberosum) for resistance to powdery scab (Spongospora subterranea)
using a laboratory bioassay European Journal of Plant Pathology 110 71-77
Merz U Walsh JA Bouchek-Mechiche K Oberhaumlnsli TH Bitterlin W 2005 Improved
immunological detection of Spongospora subterranea European Journal of Plant
Pathology 111371ndash379
Merz U Falloon RE 2009 Review Powdery scab of potato-increased knowledge of
pathogen biology and disease epidemiology for effective disease management Potato
Research 5217-37
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert HR 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar x
environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Montero-Astua M Vasquez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
40
Murakami H Tsushima S Akimoto T Murakami K Goto I Shishido Y 2000 Effects of
growing leafy daikon (Raphanus sativus) on populations of Plasmidiophora brassicae
(clubroot) Plant Pathology 49584-589
Mutasa ES Ward E Adams MJ Collier CR Chwarszcynska D Asher MJC 1993 A
sensitive DNA probe for the detection of Polymyxa betae in sugar beet roots Physiological
and Molecular Plant Pathology 43 379-390
Mutasa-Gottgens ES Chwarszczynska Halsey H Asher MJC 2000 Specific polyclonal
antibodies for the obligate plant parasite Polymyxa a targeted recombinant DNA approach
Plant Pathology 49276-87
Nakayama T Maoka T Hataya T Motoshige S Fuwa S Mori M 2010 Diagnosis of
Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-285
Nicolaisen M 2011 An oligonucleotide-based microarray for detection of plant RNA
viruses Journal of Virological Methods 173 137-143
Nielsen SL Moslashlgaard JP 1997 Incidence appearance and development of potato mop-top
furovirus-induced sprain in potato cultivars and the influence on yield distribution in
Denmark and detection of the virus in tubers by ELISA Potato Research 40101-110
Nielsen S Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups within
Potato mop-top virus Archives of Virology 148381ndash388
Nitzan N Boydston R Batchelor D Crosslin J Brown C 2009 Hairy nightshade is an
alternative host of Spongospora subterranea the potato powdery sacab pathogen
American Journal of Potato Research 86 297-303
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
41
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006a The host range of Spongospora subterranea f sp subterranea in
the United States American Journal of Potato Research 83343-347
Qu XS Christ BJ 2006b Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea fsp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Ramiacuterez GJG 2010 Variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp subterranea
en suelos del municipio de unioacuten cultivados con la coleccioacuten Central colombiana de
Solanum phureja (Tesis de Pregrado) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias
Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia 2010
Restrepo DAF Jaramillo VS Cotes TJM 2009 Efecto de dos microorganismos y un
consorcio de micorrizas en combinacioacuten con viruta de pino sobre el control de sarna
polvosa (Spongospora subterranea) en papa Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea
Medelliacuten 62(2) 5047-5054
Rodriacuteguez K Maldonado Y Murcia L Huertas W Vaacutesquez M Zambrano A Rivero R
Garciacutea C 2002 Evaluacioacuten de protocolos para la deteccioacuten de patoacutegenos del suelo en Papa
(Rhizoctonia Rosellinia y Spongospora) (Citado 15 Ene 2011) Disponible en
httpwwwtodopapacomarpdfprotocolospdf
42
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista Facultad Agronomiacutea 26 (4) Caracas
Ryazantsev DYu Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato plant pathogens Applied Molecular Biology 43(3) 515-523
Saavedra SCO Goacutemez GST Aacutengel DJE 2004 Deteccioacuten de secuencias especiacuteficas de
ADN de Spongospora subterranea en suelo y tubeacuterculos de papa Revista Colombiana de
Biotecnologiacutea 714-23
Salazar LF1995 Los virus de la papa y su control Centro Internacional de la Papa CIP
(Peruacute) Publicado por el Centro Internacional de la Papa P 226
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 49 43-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M Wieczorek
P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-Wiśniewska J Yin Z
Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E Taluntytė L Pūpola N
Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E Sozonov A Tikhonovich I
Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam G Valkonen JPT 2010 Detection
distribution and control of Potato mop-top virus a soil-borne virus in northern Europe
Annals of Applied Biology 157163-178
43
Savenkov EI Sandgren M Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003 Potato
mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich protein are
dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of General
Virology 841001-1005
Shah FA Falloon RE Bulman SR 2010 Nightshade weeds (Solanum spp) confirmed as
hosts of the potato pathogens Meloidogyne falax and Spongospora subterranea f sp
subterranea Australasian Plant Pathology 39 492-498
Shah FA Falloon RE Lister RA Butler RC McKay A Ophel-Keller K Khan I 2009
Relationships between Spongospora subterranea DNA in field soil and powdery scab in
harvested potatoes Conference Handbook 17th
Australasian Plant Pathology Society
Conference (APPS) 29 September-1 October 2009 P 148
Shemyakina EA Sclovyev AG Leonova OG Popenko VI Schiemann J Morozov SY
2011 The role of microtubule association in plasmodesmal targeting of potato mop-top
virus movement protein TGBp1 The Open Virology Journal 51-11
SINAIPA (Sistema nacional de informacioacuten de papa) 2002 La rontildea de la papa p 8-9 El
Correo de la Papa Boletiacuten mensual No 07 Colombia (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en wwwcevipapaorgcopublicacionespublicacionesphp
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Reserch 83423-31
Torres H Pacheco MA French ER 1995 Resistance of potato to powdery scab
(Spongospora subterranea) under Andean field conditions American Potato Journal
10355-363
44
van de Graff PV Lees AK Cullen DW Duncan JM 2003 Detection and quantification of
Spongospora subterranea soil water and tissue samples using real-time PCR European
Journal of Plant Pathology 109 589-597
van de Graff P Wale SJ Lees AK 2007 Factors affecting the incidence and severity of
Spongospora subterranea infection and galling in potato roots Plant Pathology 56 1005-
1013
Veacutelez B 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato mop- top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia (Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Nacional de Colombia
Villareal HJ Porras PD Santa A Lagoeyte J Muntildeoz D 2007 Costos de produccioacuten de
papa en las principales zonas productoras de Colombia Federacioacuten Colombiana de
productores de papa FEDEPAPA
Wale SJ Burgess PJ Burnett F 1993 Bioassay for Spongospora subterranea detection in
soil and its potential use in predicting scab in the field Abstract 1642 Sixth International
Congress of Plant Pathology Quebec Canada
Wallroth FW 1842 Der Knollenbrand der Kartoffel Linnaea 16 332
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea using monoclonal antibodies Plant pathology 44335-365
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2004 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165 875-85
Ward LI Beales PA Barnes AV Lane CR 2005 A Real-time PCR assay based method for
routine diagnosis of Spongospora subterranea on Potato tubers Journal Phytopathology
152 633-638
45
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI Torrance
L 2010 The N- terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required for the
nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant Microbe Interaction 23(1) 1486-1497
Wuumlrzer B 1964 Ergaumlzende Untersuchungen uumlber den Pulverschorf der Kartoffel und
dessen Erreger Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh diss Landwirtschaftliche
Hochschule Hohenheim Germany 1964
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top virus
in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
Zamyatnin JrAA Solovyev AG Savenkov EI Germundsson A Sandgren M Valkonen
JPT Morozov SY 2004 Transient coexpression of individual genes encoded by the triple
gene block of Potato mop-top virus reveals requirements for TGBp1 trafficking Molecular
Plant-Microbe Interactions 17(8) 921-930
Zhang N McCarthy ML Smart CD 2008 A macroarray system for the detection of fungal
and oomycete pathogens of solanaceous crops Plant Disease 92(6) 953-960
Zolan ME Pukilla PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinerus
Molecular and cellular Biology 6(1)195-200
46
RESULTADOS
4 ARTICULO 1
VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora subterranea f sp subterranea EN
COLOMBIA
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea IN
COLOMBIA
Ineacutes Osorio Giraldo1 Marcela Orozco Valencia
1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
1 Elena Paola
Gonzaacutelez Jaimes2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
Formato de la Revista Actualidades Bioloacutegicas ISSN 0304-3584
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
La Sarna polvosa de la papa (Spongospora subterranea fsp subterranea - Sss) es una de
las enfermedades re-emergentes maacutes importantes de este cultivo en Colombia El efecto
deleteacutereo de Sss no soacutelo se debe al dantildeo directo sobre el sistema radicular y la calidad de
los tubeacuterculos sino tambieacuten a que sus zoosporas transmiten el Potato mop-top virus
(PMTV Pomovirus) Sss genera quistosoros que actuacutean como estructuras de resistencia del
patoacutegeno en el suelo pudiendo permanecer viables por varias deacutecadas Por esto su manejo
debe fundamentarse en el uso de variedades tolerantes a la enfermedad y en el empleo de
tubeacuterculo-semilla certificado En esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variacioacuten de
127 aislamientos de Sss obtenidos en los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo con el fin de apoyar la seleccioacuten de aislamientos de Sss a evaluar
47
en programas de mejoramiento geneacutetico de papa y en el disentildeo de pruebas de deteccioacuten
asintomaacutetica del patoacutegeno Para esto se secuenciaron regiones ITS del ADN ribosomal y se
condujeron anaacutelisis filogeneacuteticos encontraacutendose la presencia de tres variantes principales
de Sss dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum
Abstract
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum
INTRODUCCIOacuteN
El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L) se ve afectado por diversos microorganismos
fitopatoacutegenos e insectos plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la re-emergencia de la
48
enfermedad denominada Sarna polvosa causada por el plasmodiofoacuterido Spongospora
subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp subterranea Tomlinson (Sss) Su efecto no solo se
debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten al deterioro en la calidad y apariencia
cosmeacutetica de los tubeacuterculos que reduce draacutesticamente su valor en el mercado (Merz y
Fallon 2009) Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop top virus (PMTV) uno de
los problemas virales de la papa que tiene caraacutecter cuarenteneario para diferentes paiacuteses del
mundo (Salazar 2006 Gil et al 2011)
Sss es originario de los Andes Surameacutericanos desde donde se dispersoacute gracias al mercado
mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber transcurrido maacutes de 150 antildeos desde su
primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado importancia en las uacuteltimas deacutecadas como
resultado de la siembra generalizada de materiales altamente susceptibles al patoacutegeno la
utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los cambios de eacutepocas de siembra hacia
periacuteodo huacutemedos las deficiencias en los sistemas de rotacioacuten de cultivos la falta de
programas de exclusioacuten y los altos estaacutendares exigidos por el mercado en la calidad
cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
Sss es un patoacutegeno obligado plasmodial que taxonoacutemicamente se ubica en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos son importantes patoacutegenos de vegetales
Spongospora subterranea fsp subterraena y f sp nasturtii Estos taxa fueron definidos
inicialmente como forma especialis (Merz y Falloon 2009) sin embargo con base en la
morfologiacutea de los zoosporangios rango de hospedantes y anaacutelisis filogeneacuteticos de regiones
ribosomales actualmente se acepta que representan dos especies diferentes (Qu y Christ
2004)
Los siacutentomas de la Sarna polvosa incluyen la induccioacuten en los tubeacuterculos de lesiones
pustulosas corchosas con centros pulverulentos formados a partir de la agregacioacuten de los
quistosoros del patoacutegeno (Figura 41) Con el avance de estas lesiones es frecuente la
49
ruptura del peridermo aunque el nivel de penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente
superficial (Carrentildeo 2009) Bajo condiciones oacuteptimas para el desarrollo de la enfermedad
es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten de los tejidos y la formacioacuten
de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la enfermedad ademaacutes de causar
los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular de las plantas al inducir la
formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas que causan la disminucioacuten de la
superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo marchitez y finalmente la muerte de las
plantas (Gilchrist 2009) La infeccioacuten en las raiacuteces especialmente cuando se forman
agallas puede causar una reduccioacuten en la toma de agua y de nutrientes por parte de las
plantas (Falloon et al 2005)
En los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Sss afecta
severamente las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y papa criolla (S phureja) Los
siacutentomas se observan en raiacuteces y tubeacuterculos pero hay variacioacuten entre las zonas paperas en
cuanto a la distribucioacuten de los siacutentomas en los diferentes oacuterganos de la planta En
Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre
los tubeacuterculos de las variedades Parda Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el
departamento de Narintildeo y el Oriente de Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces
Hasta ahora no se conoce si estas diferencias se deben a variaciones en las condiciones
ambientales de las regiones o a la ocurrencia de variantes geneacuteticas del patoacutegeno (Jaramillo
y Botero 2007 Carrentildeo 2009)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 en las cosechas de las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y Criolla Colombia
(Rodriacuteguez et al 2009 Gilchrist 2009) Adicionalmente a esta problemaacutetica la
diseminacioacuten del patoacutegeno se viene incrementando dramaacuteticamente en el paiacutes como
resultado de la baja calidad del tubeacuterculo-semilla utilizado por la mayoriacutea de los
agricultores la ausencia de variedades tolerantes al patoacutegeno y la deficiencia en la
asistencia teacutecnica que no cuenta con herramientas apropiadas para el diagnoacutestico
asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011) Su
manejo debe estar enmarcado bajo un esquema integrado del cultivo en el que se incluyan
50
aspectos como la rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del
tubeacuterculo-semilla utilizacioacuten de organismos antagonistas (ej Trichoderma spp) el empleo
de cultivos trampa la desinfeccioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten
que restrinja el movimiento de material contaminado y supervise maacutes detalladamente los
procesos de certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas
son utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado
del manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o
de Rhizoctoniasis (Carrentildeo 2009)
La problemaacutetica causada por esta enfermedad en las regiones cultivadoras de papa hace
necesario que se intensifiquen los esfuerzos por desarrollar metodologiacuteas de diagnoacutestico de
suelos y material vegetal que eviten la diseminacioacuten generalizada del plasmodiofoacuterido y de
su virus asociado PMTV entre regiones infectadas y libres de enfermedad siendo
especialmente importante el desarrollo de procedimientos que garanticen la sanidad de los
lotes dedicados a la produccioacuten de semilla Entre las diversas metodologiacuteas desarrolladas en
el mundo para el diagnoacutestico de este patoacutegeno se destacan la teacutecnica de ELISA con
anticuerpos policlonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Qu et al 2011) y pruebas de
flujo lateral (Bouchek-Mechiche et al 2011) Sin embargo estas teacutecnicas son de aplicacioacuten
limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas con base en los genotipos locales de los
patoacutegenos presentes en las regiones paperas del paiacutes Con el fin de suplir dicha carencia de
informacioacuten en esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss procedentes de las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia
mediante el anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr)
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Para la coleccioacuten de muestras de quistosoros de Sss proveniente de suelo raiacuteces y
tubeacuterculos se seleccionaron lotes en fincas con antecedentes de infeccioacuten seguacuten el registro
51
histoacuterico de los agricultores siguiendo la metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la
cual se utiliza un juego de tamices de 100 y 25 microm para la obtencioacuten de los quistosoros Por
cada lote se tomaron raiacuteces de plantas o tubeacuterculos sintomaacuteticos y una muestra de suelo de
500 gr Los sitios de coleccioacuten incluyeron las regiones cultivadoras de papa de los
municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio Subachoque y
Villa Pinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute Oicataacute (Boyacaacute) y Pasto e Ipiales
(Narintildeo) La investigacioacuten se propuso obtener un miacutenimo de 30 muestras de Sss por
departamento
Los quistosoros obtenidos a partir de muestras de suelos fueron inoculados en plantas de
Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo o plantas
trampa para incrementar el inoacuteculo siguiendo la metodologiacutea de Veacutelez (2007)
mantenieacutendose en casa de malla en el Centro Experimental Paysanduacute ubicado en el
corregimiento Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB 2550 msnm temperatura
media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) (Figura 42) Todas las muestras
fueron procesadas en los laboratorios de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad
Nacional de Colombia sede Medelliacuten y Sanidad Vegetal del Politeacutecnico Colombiano Jaime
Isaza Cadavid
Extraccioacuten de ADN
Para la obtencioacuten del ADN se empleoacute una modificacioacuten de la metodologiacutea de Doyle y
Doyle (1987) a partir de quistosoros extraiacutedos y de tejidos afectados de las plantas de papa
y plantas sentildeuelo En este procedimiento es necesaria la maceracioacuten con nitroacutegeno liacutequido
de los tejidos y se emplea como buffer de extraccioacuten una solucioacuten CTAB y 1
mercaptoetanol El lavado de la fase orgaacutenica se realiza con fenolcloroformo-alcohol
isoamiacutelico y la precipitacioacuten de los aacutecidos nucleicos con 1 voluacutemen de etanol absoluto y 01
voluacutemen de acetato de sodio 3M Finalmente el pellet generado es disuelto en agua
destilada esteacuteril y es sometido a digestioacuten de ARN mediante la adicioacuten de ribonucleasa A
(10 mgmL) (Ver protocolo 62) Cuando la presencia de inhibidores afectaba la eficiencia
52
de la PCR la extraccioacuten de ADN se realizoacute utilizando el kit DNeasy Plant (Qiagen
EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante con una ligera modificacioacuten en el paso
de elucioacuten de ADN que se realizoacute en dos etapas con 70 microL de agua destilada esteacuteril Para
determinar la concentracioacuten del ADN extraiacutedo se utilizoacute la lectura de absorbancia en las
longitudes de onda de 260 y 280 nm mediante un Nanodrop 2000C (Thermo EEUU)
obtenieacutendose un rango entre 10 y 112 ng de ADNμL con una relacioacuten 260280 de 15 a 19
(Tabla 41) La integridad del ADN se determinoacute realizando electroforesis en gel de agarosa
al 08 en buffer TBE 1X (TBE 5X 54 gL Tris 275 gL de aacutecido boacuterico 20 mLL de
EDTA 05M pH 80) suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) La visualizacioacuten de
las bandas se realizoacute utilizando el sistema digital de anaacutelisis Bio Doc Analyze (Biometra
Alemania) (Figura 43)
PCR de ITS del ADNr
Para la evaluacioacuten de los niveles de variacioacuten geneacutetica de Sss se realizaron PCR empleando
los cebadores especiacuteficos Spo8 (5 CTG GGT GCG ATT GTC TGT TG 3) y Spo9 (5 CAC
GCC AAT GGT TAG AGA CG 3) disentildeados por Bulman y Marshall (1998) asiacute como los
cebadores SsF (5acute GTC GGT TCT ACC GGC AGA CC 3acute) y SsR (5acute GCA CGC CAA
TGG TTA GAG ACG 3acute) reportados por Qu et al (2006) que amplifican productos de
391 y 434 pb de la regioacuten ITS del ADNr respectivamente Las reacciones de PCR
incluyeron 01 microM de cada cebador 1 U de Taq ADN polimerasa recombinante
(Fermentas Lithuania) 02 mM de cada dNTP 1X de buffer de enzima (100 mM Tris-HCl
(NH4)2SO2 pH 88) 2 mM MgCl2 1 microL de una dilucioacuten 50 ngmicroL de ADN y un volumen
total de 25 microL Las amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra) y
consistieron de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 35 ciclos de
94degC por 30 s 55degC por 30 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10
min Luego de la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se
separaron por electroforesis en gel de agarosa al 15 tal como se indicoacute anteriormente
53
Secuenciacioacuten
De ser necesario los amplicones obtenidos fueron purificados mediante los kits QIAquick
PCR Purification y QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para proceder a su secuenciacioacuten
directa en ambas direcciones utilizando los cebadores empleados en la PCR y el kit Big
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied Biosystems EEUU) Su
corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied
Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur) (Figura 44)
Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit
606 y Chromas 145 construyeacutendose secuencias consenso y confirmaacutendose su validez por
comparacioacuten con las bases de datos moleculares con el programa BLASTn
(httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) (Figura 45) Paralelamente se obtuvieron
del GenBank secuencias de Sss de las regiones estudiadas para su alineacioacuten con las
generadas en este trabajo mediante el software Clustal W Ademaacutes se utilizaron las
secuencias de los Plasmodiofoacuteridos Plasmodiophora brassicae Polymyxa graminis
Polymyxa betae S nasturtii y Sorosphaera viticola como grupos externos de anaacutelisis
(outgroups) Los alineamientos fueron utilizados en la construccioacuten de una matriz Nexus y
el anaacutelisis filogeneacutetico se realizoacute mediante un algoritmo de Maacutexima Parsimonia utilizando
el software PAUP 40b Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute
un anaacutelisis de Bootstrap con 500 iteraciones
RFLPs
Con el fin de proponer una prueba de diagnoacutestico molecular de las variantes de Sss se
realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs a partir de las secuencias de Sss generadas en esta
investigacioacuten y otras depositadas en el GenBank Para esto se utilizoacute el software webcutter
20 (httprnalundberggusecutter2) con las enzimas EcoRV EcoRI Bsp143I Hin6I
MspI Tru1I y TaqI seleccionadas por ser de faacutecil acceso para laboratorios de diagnoacutestico
molecular y utilizadas en la primera parte de exploracioacuten La validez de la prueba fue
54
confirmada mediante PCR-RFLPs con las enzimas Bsp143I y Hin6I y aislamientos
representativos de los grupos geneacuteticos principales detectados en el trabajo Las reacciones
consistieron de 15 microL conteniendo 15 microL de buffer 10X 2 microL de enzima y 115 microL de
producto de PCR Las reacciones fueron incubadas al bantildeo Mariacutea a 37degC durante 24 h La
separacioacuten de los fragmentos de restriccioacuten se efectuoacute por electroforesis en gel de agarosa
al 25 Se evaluaron los patrones electroforeacuteticos obtenidos para cada enzima de
restriccioacuten y se determinoacute el nuacutemero de bandas generadas y su tamantildeo aproximado por
comparacioacuten con el marcador de peso molecular GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus
(Fermentas)
RESULTADOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Se obtuvieron 210 muestras de tubeacuterculos y raiacuteces de papa con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos con historia de la presencia del patoacutegeno en los departamentos de Antioquia
Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Se realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos con las secuencias
que presentaron tamantildeos superiores a 390 pb lograacutendose el objetivo de contar con al
menos 30 secuencias por cada departamento bajo anaacutelisis
Anaacutelisis filogeneacutetico de regiones ITS del ADNr
Las reacciones de PCR produjeron amplicones del tamantildeo esperado de ~390 pb con los
cebadores Spo8-9 (Figura 46) y de ~430 pb cuando se usaron los cebadores SsF-SsR en
79 y 48 muestras respectivamente Para el anaacutelisis filogeneacutetico soacutelo se incluyeron los
consensos que resultaron de la secuenciacioacuten en ambos sentidos De esta forma se
obtuvieron 33 secuencias de Antioquia 30 secuencias de Boyacaacute 33 secuencias de
Cundinamarca y 31 secuencias de Narintildeo para un total de 127 secuencias completas (Tabla
42) El alineamiento final de las secuencias alcanzoacute 445 sitios de los cuales 156 caracteres
eran constantes 55 variables pero no informativos y 236 informativos La longitud del
aacuterbol filogeneacutetico con maacutexima parsimonia fue de 707 con iacutendices de consistencia (IC) y
retencioacuten (IR) de 078 y 088 respectivamente Dado el alto nuacutemero de muestras
55
secuenciadas se presenta un dendrograma resultado del anaacutelisis de redundancia mediante el
programa Decrease redundancy (httpwebexpasyorgdecrease_redundancy) (Figura
47) Se presentaron dos grandes clados (A y B) soportados por valores de bootstrap de
100 el primer clado corresponde a los aislamientos de Sss mientras que el otro grupo
incluyoacute las demaacutes especies de plasmodiofoacuteridos (S nasturtii P graminis P betae y Pl
brassicae) que presentaron un alto nuacutemero de cambios entre ellas El clado A se subdividioacute
a su vez en tres grupos (A1 A2 y A3) dos de los cuales corresponden a los Tipos I (A2) y
II (A1) definidos por Qu y Christ (2004) En teacuterminos porcentuales ambos Tipos
representan el 157 (Tipo I) y 189 (Tipo II) de los aislamientos de Sss obtenidos en
Colombia ademaacutes se incluyeron secuencias del patoacutegeno provenientes de Estados Unidos
Irlanda y Escocia para el Tipo I y de Suiza Nueva Zelanda y de Reino Unido para el Tipo
II El subgrupo que representa el Tipo I de Sss soacutelo presentoacute aislamientos obtenidos de
tubeacuterculos o de suelos pero no de raiacutez mientras que el subgrupo representando el Tipo II
incluyoacute indistintamente aislamientos de raiacutez tubeacuterculos y suelos
Por otra parte el tercer subgrupo (A3) incluyoacute el mayor nuacutemero de aislamientos
Colombianos de Sss (654) con algunos de sus miembros presentando hasta 10 cambios
entre ellos En este subgrupo se encontraron indistintamente aislamientos de los cuatro
departamentos diferentes fuentes de muestreo (raiacutez tubeacuterculo o suelo) y hospedantes
(diferentes variedades de S tuberosum y de S phureja var Criolla Colombia) Dadas las
diferencias en secuencias de estos aislamientos proponemos nombrar a este grupo como el
Tipo III de Sss
El anaacutelisis de redundancia permitioacute tambieacuten identificar 12 genotipos (Figura 48) entre los
127 aislamientos de Sss de Colombia cinco de los cuales estuvieron conformados por un
soacutelo aislamiento tres por dos aislamientos y cuatro presentaron maacutes de diez miembros
siendo el genotipo 11 representante del Tipo I el 12 del Tipo II y el 7 y 10 del genotipo III
(Tabla 43) porque los demaacutes genotipos al ser uacutenicos o con tener como maacuteximo dos
representantes no fueron definidos a nivel de Tipos Los niveles de identidad para la regioacuten
56
ribosomal secuenciada entre estos genotipos fueron superiores al 95 en todos los casos
con una divergencia de 33 entre los Tipos I y II del 5 entre los Tipos I y III y del 2
entre el II y III La divergencia entre secuencias de Sss y otras especies de plasmodiofoacuteridos
fue mayor al 44 lo que demuestra la utilidad taxonoacutemica de las regiones ITS para
establecer relaciones filogeneacuteticas en este grupo de protozoos (Tabla 44)
RFLPs
Los anaacutelisis de restriccioacuten indicaron la existencia de polimorfismos en los sitios de corte de
algunas de las enzimas empleadas entre los grupos principales sentildealados en el anaacutelisis
filogeneacutetico Lo anterior puede ser utilizado con fines praacutecticos cuando se requiera evaluar
el genotipo o la mezcla de genotipos asociados a un lote de cultivo plantas sintomaacuteticas o
de tubeacuterculo-semilla con siacutentomas de Sarna polvosa Por ejemplo los aislamientos
representativos del Tipo II de Sss presentan un sitio de corte para Bsp143I (p 92) mientras
que para los del Tipo I se presentan dos sitios (p 97 340) Los aislamientos del Tipo III
tienen tres sitios de corte para la enzima Hin6I (p 222 283 352) en contraste con dos sitios
en los del Tipo I y II (p226-355 221-350) (Figura 49) Por esto proponemos la realizacioacuten
de una prueba simple de PCR-RFLPs a partir de la amplificacioacuten de las regiones ITS con
cebadores especiacuteficos para Sss y su posterior digestioacuten con las enzimas Bsp143I y Hin6I
con el fin de identificar los tres Tipos de Sss Al evaluar la digestioacuten de amplicones
representantes de los tres Tipos de Sss detectados en el estudio se validoacute la utilidad de la
teacutecnica en geles de agarosa al 25 ya que los perfiles de restriccioacuten obtenidos con la
enzima Hin6I permiten diferenciar a los aislamientos de los Tipos I y II (fragmentos
visibles de 221 y 129 pb) del Tipo III (fragmentos visibles de 221 67 y 62 pb) (Figura
410A) mientras que los representantes de los Tipos I y II se diferencian por la digestioacuten
con la enzima Bsp143I al generar fragmentos visibles de 243 pb (Tipo I) y de 294 pb (Tipo
II) (Figura 410B) Es importante indicar que los fragmentos inferiores a 50 pb no se tienen
en cuenta en este anaacutelisis ya que salen del rango de resolucioacuten de la electroforesis en geles
de agarosa Fragmentos de este tamantildeo pueden ser visualizados en geles de poliacrilamida
que ofrecen una mayor resolucioacuten
57
DISCUSIOacuteN
La disponibilidad de cultivares de papa resistentes a Sss es una prioridad para el disentildeo de
estrategias de manejo de la Sarna polvosa en diferentes paiacuteses cultivadores de este
tubeacuterculo en el mundo (Nitzan et al 2010) Sin embargo las deficiencias en el
conocimiento que se tiene de los niveles de variacioacuten de Sss y de su ciclo de vida
representan un obstaacuteculo para el establecimiento de los programas de mejoramiento
geneacutetico contra este fitopatoacutegeno (Merz y Falloon 2009) Los estudios geneacuteticos de Sss han
sido difiacuteciles de aplicar debido a su naturaleza de patoacutegeno obligado que impide su
aislamiento en medios axeacutenicos afectando los procesos de extraccioacuten de ADN la
utilizacioacuten de marcadores moleculares convencionales como AFLPs SSR y RAPDs y el
empleo de cebadores universales comuacutenmente usados para estudios taxonoacutemicos y
poblacionales en diferentes microorganismos eucarioacuteticos Adicionalmente la
caracterizacioacuten patoacutegenica de Sss resulta compleja ya que el desarrollo de la expresioacuten de
la Sarna polvosa estaacute fuertemente influenciada por las condiciones ambientales las
metodologiacuteas de inoculacioacuten y los cultivares del hospedante (Qu y Christ 2006 Jaramillo y
Botero 2007)
Afortunadamente la existencia de cebadores especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del
ADNr como los desarrollados por Bulman y Marshall (1998) y Qu et al (2006) para
amplificar la regioacuten ITS1 58S e ITS2 han permitido la obtencioacuten de secuencias que entre
otras aplicaciones permitieron definir la afinidad filogeneacutetica de Sss con respecto a otros
miembros del orden Plasmodiophoridae y demostrar los bajos niveles de identidad de esta
especie con respecto a la formae specialis nasturtii Esta misma situacioacuten se encontroacute en
este estudio obtenieacutendose identidades entre Sss y S nasturtii cercanas al 56 Los anaacutelisis
intraespeciacuteficos utilizando dichas secuencias han permitido detectar dos ribotipos
principales de Sss en el mundo denominados como I y II Ambos Tipos han sido
encontrados en poblaciones de Sss de Australia y Europa (Bulman y Marshall 1998)
mientras que en Norte Ameacuterica los aislamientos corresponden exclusivamente al Tipo II
58
(Qu y Christ 2006) En dicho estudio se encontroacute que las secuencias del Tipo I diferiacutean con
respecto a las del Tipo II en tres nucleoacutetidos (p 60 127 157) y una insercioacuten de cinco
nucleoacutetidos (p 129 a 133) en el ITS1 mientras que para la regioacuten ITS2 se presentan seis
mutaciones puntuales (p 348 367 399 402 461 475) y dos deleciones (p 356 y 474) lo
que en su conjunto equivale a un 29 de divergencia entre ambos ribotipos Estas
diferencias fueron igualmente encontradas entre los aislamientos colombianos
representando ambos Tipos aunque algunos de ellos presentaron mutaciones adicionales
por ejemplo el genotipo 12 (conformado por 21 aislamientos) presentoacute dos cambios con
respecto al Tipo II reportado en GenBank (Accesioacuten AY604172) mientras que el genotipo
11 (conformado por 17 aislamientos) tuvo tres cambios con respecto al Tipo I (Accesioacuten
AY604171)
En Colombia hasta el presente estudio se habiacutean realizado dos estudios de variabilidad
geneacutetica de Sss con base en anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr En el primero de ellos
Hincapieacute (2006) encontroacute altos niveles de identidad geneacutetica entre los aislamientos de Sss
secuenciados y analizados mediante PCR-RFLP lo que condujo al autor a plantear la
posible ocurrencia de una estructura poblacional clonal para este patoacutegeno en el paiacutes En un
estudio maacutes reciente Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS y SSCP
(Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) que incluyoacute un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones establecioacute la presencia de subpoblaciones del patoacutegeno
relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Asiacute aislamientos con secuencias ITS del Tipo
I se asociaron exclusivamente con infecciones de tubeacuterculo mientras que aquellos del Tipo
II lo hicieron con siacutentomas de agallas en raiacutez En dicha investigacioacuten se descartoacute ademaacutes la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar del hospedero o la zona
geograacutefica de origen de los aislamientos Asiacute mismo se comproboacute que en el paiacutes existen
variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la
presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno dos de los cuales corresponden a los Tipos I y
II mientras que los tres restantes correspondiacutean a nuevas variantes no reportadas en otros
59
lugares del mundo (Carrentildeo 2009) desafortunadamente las secuencias resultantes de dicho
trabajo no fueron publicadas en GenBank y por tanto no pudieron ser incluidas en los
anaacutelisis filogeneacuteticos aquiacute presentados
El presente estudio amplia auacuten maacutes la base de conocimiento de los niveles de variacioacuten de
Sss en Colombia al detectar 12 genotipos a partir de 127 secuencias de igual nuacutemero de
aislamientos del patoacutegeno obtenidos en cultivos de los cuatro principales departamentos
productores de papa del paiacutes El anaacutelisis filogeneacutetico basado en dichas secuencias definioacute
la presencia de un clado que representa a Sss e incluye los dos Tipos mundialmente
conocidos para este patoacutegeno (Qu y Christ 2004) ademaacutes de un tercer subgrupo (III) que
presenta un 5 y 2 de divergencia con respecto a los Tipo I y II respectivamente Este
Tipo III contiene la mayor proporcioacuten de aislamientos del estudio e integroacute indistintamente
cepas de diferentes oriacutegenes geograacuteficos hospedantes tejidos sintomaacuteticos y suelo De gran
intereacutes resultoacute el hecho que los aislamientos asociados con el Tipo I procediacutean de puacutestulas
en tubeacuterculos o de suelos pero no de agallas de raiacutez lo cual confirma la asociacioacuten
realizada por Carrentildeo (2009) para esta variante de Sss Sin embargo los aislamientos
asociados al Tipo II proveniacutean indistintamente de raiacutez tubeacuterculos o suelos A partir de estos
resultados es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa del paiacutes Asiacute por ejemplo
es de intereacutes estudiar las reacciones de las variedades colombianas de papa a dichos
ribotipos asiacute como su capacidad de transmisioacuten de PMTV En este sentido Ward et al
(2005) evaluando el efecto de dos ribotipos de Polymyxa graminis un plasmodiofoacuterido que
afecta gramiacuteneas en la zona templada encontraron que los aislamientos del Tipo II fueron
detectados principalmente en plantas de trigo y estaban asociados a la transmisioacuten del Soil-
borne cereal mosaic virus (SBCMV) mientras que aquellos del Tipo I afectaban cebada y
su capacidad de transmisioacuten de SBCMV era muy baja
60
Los niveles de variacioacuten encontrados en esta investigacioacuten para el agente causal de la Sarna
polvosa de la papa en Colombia condujeron a plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y de certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla Para esto se realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs de regiones ITS del
ADNr con siete enzimas de restriccioacuten de uso frecuente en laboratorios de deteccioacuten
molecular de microorganismos Los resultados demostraron polimorfismos en los sitios de
corte de algunas de las enzimas utilizadas dos de las cuales permiten distinguir los tres
principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico De esta forma se confirmoacute que la
digestioacuten con la enzima Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos
del Tipo III mientras que el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los
Tipos I y II La prueba realizada en este estudio puede ser implementada con variaciones
como el uso de digestiones dobles y la utilizacioacuten de geles de poliacrilamida que generen
mayor resolucioacuten de los fragmentos de restriccioacuten de bajo peso molecular sin embargo el
esquema aquiacute presentado ofrece simplicidad y eficiencia en la separacioacuten de los tres Tipos
sin la necesidad de contemplar todos los productos de la digestioacuten Adicionalmente a esta
prueba y con base en los resultados de las secuencias obtenidas en esta investigacioacuten y en
aquella de Gil et al (2011) nuestro grupo se encuentra disentildeando y evaluando pruebas de
PCR y RT-PCR en tiempo real para la deteccioacuten asintomaacutetica de Sss y de su virus asociado
PMTV Se espera que los resultados generados en estas investigaciones sean incorporados
raacutepidamente en los programas de manejo integrado de la Sarna polvosa en Colombia y
otros paiacuteses latinoamericanos afectados por esta enfermedad como Venezuela (Rodriacuteguez et
al 2009) y Costa Rica (Montero-Astua et al 2008)
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten el Politeacutecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid
Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo
por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el Departamento de Narintildeo
61
REFERENCIAS
Bell KS Roberts J Verrall S Cullen DW Williams NA Harrison JG Toth IK Cooke D
Duncan JM Claxton JR 1999 Detection and quantification of Spongospora subterranea
fsp subterranea in soils and on tubers using specific PCR primers European Journal of
Plant Pathology 105 905-915
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid
diagnostic test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European
Journal of Plant Pathology 131 277-287
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47 759-766
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33 69-84
62
Gilchrist E 2009 Alternativas para el manejo integrado de la Sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) Tesis de Doctorado en Ciencias Agrarias
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia sede Medelliacuten
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tubers by enzyme-linked immunosorbent assay Plant Pathology 42
181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato - A review
Plant Pathology 461-25
Hincapieacute LA 2006 Evaluacioacuten de la variabilidad molecular de Spongospora subterranea
(Wallroth) Lagerheim f sp subterranea en las principales zonas paperas de Colombia
Tesis de Maestriacutea en Biotecnologiacutea Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia sede Medelliacuten Colombia
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Merz U Fallon RE 2009 Powdery scab of potato-increased knowledge of pathogen
biology and disease epidemiology for effective disease management Potato Research
5217-37
Montero-Astua M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
63
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006 Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea f sp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la Sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista de la Facultad de Agronomiacutea Universidad del Zulia 26 508-531
Salazar LF 2006 Emerging and Re-emerging Potato Diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop - top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia Sede Bogotaacute
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea and quantification in soil Plant Pathology 45 884-895
64
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2005 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165875-885
Zolan ME Pukkila PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinereus
Molecular and Cellular Biology 6 195-200
65
41 Anexos
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp subterranea
en plantas de papa de Colombia a Quistosoros obtenidos de suelo b Plasmodios
formados en raiacutez de tomate (Solanum esculentum) c Lesiones tempranas producidas por
Sarna polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro d Lesiones tardiacuteas producidas por Sarna
polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro e f Agallas formadas en raiacuteces de S phureja
var Criolla Colombia
d
e f
c
a b
66
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja var Criolla
Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos infestados con Spongospora
subterranea f sp subterranea
67
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o raiacuteces de
plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea
MUESTRA A260 A280 RELACIOacuteN
260280
CONCENTRACIOacuteN
de ADN ng microl
AB1 0806 0465 173 403
AB2 0421 0244 172 21
Se7 0276 0149 184 138
Se8 0743 0415 179 371
MA11 2244 1366 164 1122
MA61 0277 0158 176 139
MA39 2135 1512 141 1067
MA56 0823 0361 228 412
MA60 021 0101 208 105
68
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos agallas o raiacuteces
de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana Carril 1 Marcador de peso 100 pb carril 2-
4 muestras MA16 MA17 MA18 MA11 MA39
500 pb
1 2 3 4 5 6
69
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora
subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8
70
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la regioacuten ITS del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp subterranea de Colombia
71
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb) a partir de ADN
de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum tuberosum S phureja y Nicotiana
benthamiana con presencia de quistosoros de Spongospora subterranea fsp subterranea
de cultivos de papa de los departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1
Marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas) carriles 2 a 6 muestras SE10 SE11
SE13 SE18 carril 7 control negativo
500 pb
100 pb
390 pb
1 2 3 4 5 6 7
72
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia
ANTIOQUIA CUNDINAMARCA
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE13 Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro SE8 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE18 La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro SE81 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
32UN La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE9 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
33UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE91 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34UN La Unioacuten Raiacutez accesioacuten C131-R2 SE12 Zipaquiraacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
35UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE14 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
80C La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE15 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Pastusa
Suprema
79C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE16 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
78C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE17 Villapinzoacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro
35 COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE19 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34COL La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE20 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
32COL La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum SE21 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
30COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 4fb Ventaquemada Raiacutez S tuberosum
29COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 5fb Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum
12fb La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 9fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
11fb La Unioacuten Raiacutez S tuberosum 10fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
1MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
ICA Nevada MA20 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
7MR Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro MA21 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
8MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA22 Villapinzoacuten
Raiacutez S tuberosum var ICA Pastusa Suprema
9MR La Unioacuten Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA23 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
11MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA24 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
12MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA25 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
13MR Santa Rosa Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA50 Desconocido Tubeacuterculo S tuberosum
14MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA51 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB2 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C87SJ MA52 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
73
AB3 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C81SJ MA53 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB4 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3SJ MA54 Tabio Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB6 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C8C MA55 Tabio Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB7 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3C MA56 Zipaquiraacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia
AB8 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA57 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA1 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA58 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA2 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA59 Villapinzoacuten
Tubeacuterculo S tuberosum var Diacol Capiro
MA41 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA60 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
BOYACAacute NARINtildeO
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE10 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE7 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE101 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
SE11 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 37COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE22 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 36COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
SE23 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA27 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE24 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA28 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
3fb Tunja Raiacutez S tuberosum MA31 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB1 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA32 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB9 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA33 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB10 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA34 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA35 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA3 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA36 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA4 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA37 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA5 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA38 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA7 Siachoque Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA39 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA9 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA40 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA11 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA61 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA62 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA14 Tunja Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA64 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA15 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA65 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA16 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA66 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA17 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA67 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
74
benthamiana
MA18 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA68 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA19 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA69 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA42 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA70 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA43 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA44 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA72 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA45 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA73 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA46 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA75 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA49 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA76 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA77 Ipiales Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
75
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) de cultivos de papa de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Como grupos externos de anaacutelisis se presentan
secuencias de otras especies de plasmodiofoacuteridos Meacutetodo de maacutexima parsimonia
utilizando la opcioacuten Heuristic search del programa PAUP 40b Los valores de Bootstrap (gt
80) se indican en la parte inferior de las ramas En letras mayuacutesculas se presentan las
denominaciones de los clados y subclados Adicionalmente se indican los grupos que
representan los Tipos de Sss
76
Sss TIPO I
395 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
MspI TaqI
cccgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgttttcgg base
pairs
gggcccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcaaaagcc 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
atactgaacttactaaagtggatcatttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgat base
pairs
tatgacttgaatgatttcacctagtaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgcta 76 to
150
EcoRI
gaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagtt base
pairs
cttcttgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaa 151
to 225
Hin6I TaqI EcoRV MspI
gcgctttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccgtgtgcgtg base
pairs
cgcgaaagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcggcacacgcac 226
to 300
Bsp143I MspI Hin6I
aaggggactctgagctctggtcggtccatggcttgaaagatcatgcaacccggtgcgcgtctctggcttctgatt base
pairs
ttcccctgagactcgagaccagccaggtaccgaactttctagtacgttgggccacgcgcagagaccgaagactaa 301
to 375
cgtctctaaccattggcgtg base pairs
gcagagattggtaaccgcac 376 to 395
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 2 97 340 gatc More info
EcoRI 1 190 gaattc More info
EcoRV 2 130 238 gatatc More info
Hin6I 2 226 355 gcgc More info
MspI 3 2 281 350 ccgg More info
TaqI 2 49 232 tcga More info
Tru1I 2 102 119 ttaa More info
77
Sss TIPO II
390 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
TaqI
cctgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgtattact base
pairs
ggacccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcataatga 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
gaacttactaaagtggatcgtttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgatgaaga base
pairs
cttgaatgatttcacctagcaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgctacttct 76 to
150
EcoRI Hin6I
acgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagttgcgct base
pairs
tgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaacgcga 151
to 225
TaqI EcoRV MspI
ttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccctgtgcgtggaagg base
pairs
aagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcgggacacgcaccttcc 226
to 300
MspI Hin6I
ggactatgagctctggtcggtccatggcttgaaagattatccaaccggtgcgcgtctctggcttctgattcgtct base
pairs
cctgatactcgagaccagccaggtaccgaactttctaataggttggccacgcgcagagaccgaagactaagcaga 301
to 375
ctanccattggcgtg base pairs
gatnggtaaccgcac 376 to 390
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 1 92 gatc More info
EcoRI 1 185 gaattc More info
EcoRV 2 125 233 gatatc More info
Hin6I 2 221 350 gcgc More info
MspI 2 276 345 ccgg More info
TaqI 2 49 227 tcga More info
Tru1I 2 97 114 ttaa More info
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos de S
subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I MspI TaqI y
Tru1I mediante el programa Web-cutter
78
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de aislamientos
de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en Colombia a partir de
anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal
GENOTIPO RFLPacutes MUESTRAS PROPORCIOacuteN
()
1
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185 EcoRV 2 125 233
Hind6I 2 221 351
MspI 2 276 346 TaqI 2 227 Tru1I
2 97 114
AB12 34UN 16
2
Bsp143I 1 93 EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277 347 TaqI 1 49 228
Tru1I 2 98 115
32UN 78C 16
3
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
11MR 08
4
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
9MR 08
5
Bsp143I 2 96 339 EcoRI 1 189
EcoRV 2 129 237
Hind6I 2 225 354
MspI 2 280 349 TaqI 1 231 Tru1I
2 101 118
8MR 13MR 16
79
6
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190
EcoRV 2 130 238 Hind6I 2 226 355
MspI 2 281 350
TaqI 1 232 Tru1I
2 102 119
MA12 08
7
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
MA37 SE7 SE8 SE9 SE10
SE11 SE12 SE13 SE14 SE15 SE16 80C 79C 37COL 36COL
35COL 34COL 32COL 30COL
12FB 10FB 11FB 9FB 1MR
SE71 SE81 SE91 SE101 AB2 AB3 AB4 AB6 AB7 MA1 MA7
MA9 MA14 MA20 MA21 MA22
MA23 MA24 MA25 MA28 MA31 MA32 MA33 MA34
MA35 MA36
393
8
Bsp143I 2 92 309 EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 289 351 MspI 2 276
346 TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
MA40 08
9
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 282 351 MspI 3 2 276
346 TaqI 1 227
Tru1I 2 97 114
MA43 08
10
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 3 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
29COL 33UN MA4 MA41
MA42 MA51 MA52 MA55
MA56 MA57 MA58 MA59 MA60 MA62 MA64 MA65
MA68 MA69 MA71 MA72
MA76 SE19 SE20 SE21 SE22 3FB 4FB 14MR
22
11
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190 EcoRV 2 130 238
Hind6I 2 226 355
MspI 3 2 281 350 TaqI 2 49 232
Tru1I 2 102 119
SE17 12MR AB1 AB8 MA2
MA15 MA16 MA17 MA18 MA19 MA45 MA46 MA49
MA50 MA53 SE23 SE24
134
80
12
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233 Hind6I 2 221 350
MspI 2 276 345
TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
SE18 35UN 7MR AB9 AB10
MA3 MA4 MA5 MA11 MA27 MA38 MA39 MA44 MA61
MA66 MA67 MA70 MA73
MA75 MA77 5FB
165
81
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluyen a S nasturtii y Plasmodiophora brassicae
como especies externas de anaacutelisis
SECUENCIA SE17 SE18 MA37 29COL AY604172 AY604171 AF310907 EF593112 AF102820 AF102819 EF195335 AF104308
SE17 Sss
Colombia
Tipo I
ID 0962 0957 0952 0964 0992 0564 0959 0992 0964 0586 0959
SE18 Sss
Colombia
Tipo II
0962 ID 0979 0974 0992 0959 0574 0987 0959 0992 0584 0987
MA37 Sss
Colombia
Tipo III
0957 0979 ID 0984 0982 0954 0579 0977 0954 0982 0598 0977
29COL Sss
Colombia
Tipo III
0952 0974 0984 ID 0982 0959 0579 0977 0959 0982 06 0977
AY604172
Sss EEUU
TipoII
0964 0992 0982 0982 ID 0967 0577 0994 0967 1 0589 0994
AY604171
Sss EEUU
Tipo I
0992 0959 0954 0959 0967 ID 0564 0962 1 0967 059 0962
AF310907 S
nasturtii 0564 0574 0579 0579 0577 0564 ID 0579 0564 0577 0566 0574
EF593112 Sss
Suiza 0959 0987 0977 0977 0994 0962 0579 ID 0962 0994 0589 0989
AF102820
Sss Escocia 0992 0959 0954 0959 0967 1 0564 0962 ID 0967 059 0962
AF102819
Sss Nueva
Zelanda
0964 0992 0982 0982 1 0967 0577 0994 0967 ID 0589 0994
EF195335 P
brassicae 0586 0584 0598 06 0589 059 0566 0589 059 0589 ID 0589
AF104308
Sss Reino
Unido
0959 0987 0977 0977 0994 0962 0574 0989 0962 0994 0589 ID
82
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las enzimas de restriccioacuten Bsp143I y
Hin6I que permiten determinar los tres Tipos de Sss identificados en este trabajo En la
izquierda se indican los genotipos representativos de cada Tipo (ver Tabla 3) y entre
pareacutentesis los sitios de corte referidos al Tipo I
83
Figura 410 (A) Gel de RFLPs con la enzima Hind6I con tres muestras de los Tipos I II y
III de Sss detectados en el estudio 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir Tipo
I 3-5 Digestioacuten de muestras Tipo I 6 Producto sin digerir Tipo II 7-9 Digestioacuten de
muestras Tipo II 10 Producto sin digerir Tipo III 11-13 Digestioacuten de muestras Tipo III
14 Marcador de peso 100 pb (B) Gel de RFLPs con la enzima Bsp143I con una muestra
del Tipo I y II de Sss 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir del Tipo II 3 Sin
muestra 4 Digestioacuten de muestra Tipo I 5 Digestioacuten de muestra Tipo II 6 Marcador de
peso 100 pb Con flechas se marcan los productos digeridos que presentan resolucioacuten
apropiada en geles de agarosa al 25
A B
84
5 Artiacuteculo 2 Variabilidad geneacutetica de los ARN 2 y 3 de aislamientos
Colombianos de PMTV
Genetic variability of RNA 2 and 3 in Colombian isolates of PMTV
Ineacutes Osorio Giraldo1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
1 Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Facultad de Ciencias Universidad Nacional
de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia 2
Laboratorio de Microbiologiacutea Industrial
Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia
Formato de la Revista Agronomiacutea Mesoamericana ISSN 1021-7444
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
El PMTV es un virus prevalente en los cultivos de papa de los Andes Sin embargo en esta
regioacuten es muy bajo el conocimiento de su biologiacutea patogenicidad y diversidad Con el fin
de suplir la falta de informacioacuten sobre este uacuteltimo aspecto en esta investigacioacuten se
obtuvieron secuencias de los genes de la caacutepside viral (CP) y del TGB2 de cepas de PMTV
de los cuatro principales departamentos cultivadores de papa en Colombia Adicionalmente
dos de los aislamientos fueron secuenciados en gt83 de sus ARN 2 y 3 Los anaacutelisis
filogeneacuteticos basados en CP indicaron la presencia de dos clados El primero contiene cepas
de referencia mundial de PMTV en conjunto con 19 de las cepas de este estudio mientras
que el segundo clado soacutelo agrupoacute cepas de Colombia las que compartieron menos de 76
de identidad con el primer grupo Esto posiblemente indica la ocurrencia de una nueva
especie de pomovirus aunque se requiere la secuenciacioacuten de todo el genoma para
confirmar dicha hipoacutetesis taxonoacutemica El anaacutelisis del TGB2 generoacute un solo clado
agrupando indistintamente las cepas colombianas de PMTV con las de otros paiacuteses El
anaacutelisis de los segmentos 2 y 3 del genoma viral indicoacute que los aislamientos colombianos
compartiacutean gt94 de identidad con las secuencias de cepas de Repuacuteblica Checa y Suecia
85
Se espera que estos hallazgos sean utilizados para el disentildeo de herramientas de diagnoacutestico
del PMTV en los Andes que apoyen los programas de certificacioacuten de tubeacuterculo-semilla y
mejoramiento geneacutetico de papa
Palabras clave Potato mop-top virus RT-PCR Secuenciacioacuten Solanum tuberosum
Abstract
PMTV is a prevalent virus in potato crops in the Andes However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words Potato mop-top virus RT-PCR Sequencing Solanum tuberosum
86
INTRODUCCIOacuteN
El Potato mop-top virus (PMTV) es la especie tipo del geacutenero Pomovirus y recientemente
se ha clasificado en la nueva familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Su rango de
hospedantes incluye un nuacutemero limitado de especies vegetales de las familias Solanaceae y
Chenopodiaceae siendo la papa (Solanum tuberosum L) su principal hospedante desde el
punto de vista econoacutemico (Kirk 2008) Es transmitido por tubeacuterculo semilla infectado y
por zoosporas del plasmodiofoacuterido Spongospora subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp
subterranea Tomlinson (Sss) agente causal de la sarna polvosa de la papa (Harrison y
Jones 1970) Su presencia se ha registrado principalmente en regiones con climas huacutemedos
y friacuteos como el Norte de Europa (Noruega Suecia Dinamarca y Finlandia) las islas
Britaacutenicas (Irlanda Inglaterra Escocia) Norte Ameacuterica (EEUU y Canadaacute) Japoacuten las zonas
montantildeosas de Costa Rica y los Andes Surameacutericanos (Peruacute Colombia Bolivia) (Xu et al
2004 Salazar 2006 Montero-Astuacutea et al 2008 Nakayama et al 2010 Santala et al
2010) A pesar de que se considera que el PMTV es originario de los Andes su presencia
en Colombia soacutelo fue detectada en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) y reconfirmada con base en
anaacutelisis de secuencias de la caacutepside viral (CP) y el segundo gen del triple bloque (TGB2) en
2011 (Gil et al 2011) Este virus puede causar peacuterdidas de hasta 26 en el rendimiento del
cultivo de la papa lo que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera
ascender a rangos de 50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 2000) Sin
embargo dichos niveles de peacuterdidas dependen de la susceptibilidad de las variedades
cultivadas (Xu et al 2004 Santala et al 2010) las variantes del patoacutegeno (Harrison y
Jones 1970 Nielsen y Nicolaisen 2003) y fundamentalmente de las condiciones
medioambientales prevalentes durante su infeccioacuten (Davey 2009 Latvala-Kilby et al
2009 Roos et al 2011)
El PMTV es un virus tripartita con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20 nm en diaacutemetro y
longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm Cada partiacutecula contiene una moleacutecula
de ARN de cadena sencilla con polaridad positiva (ARNss+) con tamantildeos de 6043 nt (ARN
1) 3134 nt (ARN 2) y 2964 nt (ARN 3) El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene
motivos de metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del
codoacuten de finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999 2003) El
87
ARN 2 contiene un ORF para la proteiacutena de la caacutepside de 20 kDa Tambieacuten codifica para
una proteiacutena de 90 kDa generada por lectura continua (readthrough CP-RT) gracias a la
presencia de un codoacuten de finalizacioacuten amber en el gen CP Diversos estudios han indicado
que esta proteiacutena RT esta involucrada en la transmisioacuten por Sss del PMTV siendo incluso
posible su localizacioacuten asociada con los extremos de las partiacuteculas virales mediante
anaacutelisis de inmuno-marcaje (Cowan et al 1997) En este sentido Torrance et al (1999)
demostraron que una delecioacuten de 109 nt en el extremo 3acute de las secuencias del dominio CP-
RT de aislamientos de PMTV de Escocia estaban asociadas con su imposibilidad de
transmisioacuten por Sss
El ARN 3 codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Los
primeros tres presentan secuencias similares a proteiacutenas del triple bloque de genes (TGB)
involucradas en el movimiento de ceacutelula a ceacutelula de algunos virus de plantas Las TGBs de
los pomovirus hacen parte de la clase 1 o grupo hordei de estas proteiacutenas en conjunto con
las codificadas por otros geacuteneros de la familia Virgaviridae y del geacutenero Hordeivirus Se
cree que TGB2 y TGB3 asisten a TGB1 en su funcioacuten de trasportar el genoma viral a traveacutes
de los plasmodesmos de las ceacutelulas vegetales (Lim et al 2008 2009) Recientemente se
encontroacute mediante fusioacuten de la regioacuten N-terminal de TGB1 con la proteiacutena verde
fluorescente (GFP por sus siglas en ingleacutes) que TGB1 se localizaba en la regioacuten nucleolar
y de microtuacutebulos infirieacutendose ademaacutes que aparentemente esta proteiacutena interactuacutea con los
factores de transcripcioacuten del hospedante (Wright et al 2010)
La cuarta proteiacutena (8 kDa) es rica en cisteiacutena (CRP) y aparentemente esta involucrada en el
movimiento sisteacutemico del PMTV en las plantas y en la expresioacuten de siacutentomas necroacuteticos en
hospedantes experimentales Interesantemente otros pomovirus no codifican para una
proteiacutena 8 kDa como la presente en PMTV y sus niveles de identidad con CRPs presentes
en otros geacuteneros como Hordeivirus Tobravirus y Furovirus son muy bajos (Lukhovitskaya
et al 2005)
Los siacutentomas que causa PMTV en papa se manifiestan por agrietamientos en la superficie
de los tubeacuterculos pudiendo estar acompantildeados por la presencia de anillos necroacuteticos en la
88
corteza o incluso la parte interna del mismo siacutentoma conocido como umlSprainguml (Calvert y
Harrison 1966) En las hojas de las plantas infectadas se puede observar un moteado en
forma de V tipo ldquoaucubardquo ademaacutes de la distorsioacuten del follaje y el acortamiento de los
entrenudos (umlmop-topuml) (Carnegie et al 2009) En la regioacuten Andina no es frecuente
observar la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos ni los moteados tipo umlaucubauml lo que no
permite asociar siacutentomas especiacuteficos con la presencia de PMTV situacioacuten que explica en
buena parte el porqueacute del desconocimiento de su efecto sobre las variedades sembradas en
esta regioacuten suramericana (Tenorio et al 2006 Gil et al 2011) Sin embargo seguacuten Salazar
(2006) el PMTV es uno de los virus prevalentes en el cultivo de la papa en los Andes
Adicionalmente a las caracteriacutesticas criacutepticas del PMTV existen dificultades teacutecnicas para
el diagnoacutestico de este virus debido a su distribucioacuten erraacutetica en las plantas que incluso
puede diferir entre yemas y brotes del mismo tubeacuterculo infectado y a los bajos tiacutetulos
virales que se encuentran en el tejido foliar Esto conduce a la generacioacuten de falsos
negativos por diferentes teacutecnicas de diagnoacutestico (Cerovska et al 2003 Kirk 2008) Dichas
teacutecnicas incluyen la observacioacuten visual de siacutentomas bioensayos con plantas indicadoras
como Chenopodium amaranticolor Nicotiana benthamiana N debneyi y N tabacum
(Jeffries 1998) que requieren largos periodos de tiempo para su lectura pruebas de ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay) con anticuerpos mono y policlonales (Torrance et
al 1993 Cerovska et al 2003) RT-PCR IC RT-PCR y qRT-PCR con cebadores
especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del genoma viral (Arif et al 1995 Mumford et
al 2000 Latvala-Kilby et al 2009 Davey 2009) Asiacute mismo se han empleado otras
teacutecnicas basadas en hibridizacioacuten especiacutefica (Ryazantsev y Zavriev 2009) y microplacas de
hibridizacioacuten con RT-PCR (Nakayama et al 2010) para la deteccioacuten de PMTV
En Colombia Gil et al (2011) utilizaron la teacutecnica de RT-PCR con los cebadores
PMTVF4-PMTVR4 y H360-C819 dirigidos a los genes TGB2 y CP respectivamente para
la deteccioacuten del virus en los principales departamentos productores de papa del paiacutes sin
embargo utilizaron un muy bajo nuacutemero de aislamientos virales Maacutes recientemente Gallo
(2012) obtuvo anticuerpos policlonales dirigidos a peacuteptidos sinteacuteticos con alta capacidad
89
inmunogeacutenica identificados a partir de la modelacioacuten de la caacutepside viral de aislamientos
colombianos de PMTV probando su efectividad en pruebas de ELISA y Dot-blot
A pesar de que aparentemente existe una amplia gama de teacutecnicas para la deteccioacuten del
PMTV eacutestas presentan la limitacioacuten de estar basadas en un bajo nuacutemero de aislamientos
virales especialmente del Norte de Europa (Latvala-Kilby et al 2009) siendo auacuten menor el
nuacutemero de cepas andinas para las que existen secuencias disponibles en las bases de datos
moleculares o cuyos viriones han sido purificados para la generacioacuten de pruebas
seroloacutegicas (Gil et al 2011)
A nivel mundial se ha reportado la presencia de bajos niveles de variacioacuten entre genotipos
de PMTV (Mayo et al 1996 Santala et al 2010) Latvala-Kilby et al (2009) comparando
secuencias de CP de 23 aislamientos de Finlandia y Letonia con respecto a secuencias
disponibles en GenBank para cepas de Escocia Dinamarca Suecia y Repuacuteblica Checa
encontraron identidades superiores al 98 entre eacutestas con soacutelo siete diferencias a nivel de
aminoaacutecidos (aa) entre todas las comparaciones Las evaluaciones de secuencias de CP-RT
tambieacuten presentaron altos niveles de identidad (98 a 100) aunque en este caso 24
posiciones en las secuencias de aa fueron variables Resultados similares reportaron Mayo
et al (1996) cuando compararon las secuencias de CP de tres aislamientos de Escocia y
ocho de Peruacute mientras que Xu et al (2004) encontraron que seis de las secuencias de CP
de aislamientos de PMTV de Norteameacuterica presentaron identidades superiores al 97 con
respecto a secuencias de aislamientos de diferentes paiacuteses de Europa A pesar de estos bajos
niveles de variacioacuten cuando se realizan anaacutelisis filogeneacuteticos con dichas secuencias se han
encontrado dos clados que dividen los aislamientos de PMTV y que pueden ser
identificados por anaacutelisis de RFLPs (Nielsen y Nicolaisen 2003) Sin embargo dichos
grupos aparentemente no estaacuten relacionados con diferencias en sus niveles de
patogenicidad sobre variedades de papa (Latvala-Kilby et al 2009)
En Colombia Veacutelez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo que presentaba altos niveles de identidad con
respecto a aislamientos de Europa y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por
90
aislamientos colombianos Esta situacioacuten fue confirmada posteriormente por Gil et al
(2011) quienes encontraron que las variantes de PMTV tan soacutelo presentaban un 76 y
86 de identidad para CP y TGB2 respectivamente con respecto a los aislamientos
mundialmente reportados de PMTV Sin embargo dichos anaacutelisis fueron conducidos con un
bajo nuacutemero de secuencias (cuatro para CP y tres para TGB2) debido a las dificultades
experimentales que representa el trabajo con este virus (bajo tiacutetulo en plantas de papa
distribucioacuten erraacutetica ausencia de cebadores especiacuteficos para cepas andinas etc)
Por lo anterior esta investigacioacuten se planteoacute con el propoacutesito de ampliar el nuacutemero de
secuencias de CP y TGB2 de aislamientos de PMTV obtenidos en diferentes regiones
cultivadoras de papa de Colombia de manera que fuera posible determinar si la presencia de
las variantes de este virus corresponde a una situacioacuten generalizada o por el contrario responde
al efecto de muestra dado el bajo nuacutemero de cepas analizadas por Veacutelez (2007) y Gil et al
(2011) Adicionalmente se realizoacute la secuenciacioacuten de una gran parte del ARN 2 y ARN 3 de
una cepa obtenida en el Departamento de Antioquia y otra en el Departamento de Boyacaacute
(Colombia) realizaacutendose un anaacutelisis de variacioacuten con respecto a las secuencias de referencia de
genomas completos disponibles en las bases de datos moleculares
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y preparacioacuten de muestras
Se obtuvieron muestras de raiacuteces y tubeacuterculos de papa con siacutentomas de sarna polvosa asiacute
como de suelos de lotes con reportes de la presencia de Sss en las zonas productoras de
papa de los municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio
Subachoque y Villapinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute y Oicataacute (Boyacaacute) y
Pasto e Ipiales (Narintildeo) Para la separacioacuten de los quistosoros del suelo se siguioacute la
metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la cual las muestras de suelo (500g) son
pasadas por un juego de tamices de 100 y 25 microm Los quistosoros obtenidos fueron
inoculados en Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo
para incrementar el inoacuteculo de PMTV a partir de la infeccioacuten de su vector Sss (Veacutelez
2007) El material vegetal fue mantenido en casa de malla en el Centro Experimental
91
Paysanduacute ubicado en el corregimiento de Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB
2550 msnm temperatura media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) Tres
meses despueacutes de la siembra se recolectaron las hojas y las raiacuteces de las plantas sentildeuelo
para su procesamiento en el laboratorio
Secuenciacioacuten de CP y TGB2
Se obtuvo el ARN total de plantas de N benthamiana y S phureja mediante el kit RNeasy
plant mini (Qiagen EEUU) a partir de 100 mg de tejido utilizando 450 μL de buffer RLT
para tejido foliar o RLC para raiacuteces y 45 μL de β-mercaptoetanol y siguiendo las
instrucciones del fabricante Al finalizar el procedimiento el ARN obtenido se eluyoacute en 40
μL de agua destilada esteacuteril tratada con DEPC
Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos En las reacciones de
retrotranscripcioacuten se utilizoacute un volumen final de 20 microL incluyendo 05 microL de agua
destilada esteacuteril 15 microL de PBST (05) 4 microL de buffer RT (5X) 4 microL de MgCl2 (25
mM) 2 microL de dNTPs (10 mM) 2 microL de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de
ARNasas (40UmicroL) 05 microL de enzima M-MuLV Transcriptasa Reversa (20 UmicroL)
(Fermentas Lituania) y 5 microL de ARN o alternativamente una dilucioacuten 15 El programa de
RT fue de 37degC por 60 min seguido de 70degC por 10 min para inactivar la enzima Las
muestras se almacenaron a 4degC hasta su uso posterior
Para las reacciones de PCR se emplearon los cebadores especiacuteficos H360 (5rsquo CAT GAA
GGC TGC CGT GAG GAA GT 3rsquo) y C819 (5rsquo CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA
CC-3rsquo) (MacKenzie 1996) para amplificar una regioacuten de 459 pb del gen CP entre las
posiciones 385 y 844 del genoma viral (Figura 51) y PMTVF4 (5rsquo CAG CAA CCA CAA
ACA GAC AGG 3rsquo) y PMTVR4 (5rsquo AGC CAC TAA CAA AAC ATACTGC 3rsquo) para
obtener amplicones de 415 pb del TGB2 entre las posiciones 1726 y 2141 del ARN 2 (Xu
et al 2004) (Figura 52) Para algunos aislamientos en los que se dificultaba la
amplificacioacuten del TGB2 se utilizaron los cebadores PMTV5 (5 GGT GAA CAC GAG
GAC AAG GT 3) y PMTV7 (5 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 3) (Lambert et al
2003) que amplifican un fragmento de 646 pb y se extienden entre las posiciones del
92
genoma 1417 a 2063 Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 microL
incluyendo 158 microL de agua destilada esteacuteril 25 microL de buffer de enzima (10X) 18 microL de
MgCl2 (25 mM) 05 microL de dNTPs (10 mM) 05 microL de cada cebador (10 microM) 02 microL de
Albuacutemina de suero bovino (20 mgml) (Fermentas) 02 microL de Taq ADN polimerasa (5
UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ADNc aunque en algunas ocasiones dada la falta de
amplicones fue necesario preparar diluciones de 15 110 o 125 de ADNc Las
amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra Alemania) y consistieron
de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 40 ciclos de 94degC por 30 s
53degC por 45 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10 min Luego de
la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se separaron por
electroforesis en gel de agarosa al 15 suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) y
su tamantildeo se verificoacute por comparacioacuten con el marcador de peso molecular Generuler 100
pb DNA ladder (Fermentas)
Los amplicones del tamantildeo esperado correspondientes al menos a cuatro aislamientos
representativos de cultivos de papa de cada uno de los cuatro departamentos bajo estudio
fueron purificados del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para realizar
su secuenciacioacuten directa en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores empleados en
la PCR y el kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied
Biosystems EEUU) Su corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism
3730xl (PE Applied Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur)
A partir de las secuencias obtenidas con cada cebador se construyeron las secuencias
consenso mediante el software BioEdit 606 (Hall 1999) y Chromas Lite (Technelysium
2009) Posteriormente se confirmoacute su origen viral por comparacioacuten con las bases de datos
moleculares con el programa BLASTn (httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) y
se obtuvieron secuencias de PMTV del GenBank de otras regiones del mundo para realizar
un anaacutelisis filogeneacutetico Para esto se generoacute un alineamiento mediante Clustal W (Larkin et
al 2007) del Software Bioedit 606 Los alineamientos fueron utilizados para construir una
una matriz de distancia geneacutetica utilizando el meacutetodo de Maacutexima verosimilitud basado en
el modelo de Tamura-Nei (1993) implementado en el software MEGA v40 (Tamura et al
93
2007) Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute un anaacutelisis de
Bootstrap con 1000 remuestreos (Felsenstein 1985)
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Con el fin de obtener un mayor nivel de informacioacuten sobre las caracteriacutesticas de los
segmentos ARN 2 y ARN 3 del genoma de aislamientos Colombianos de PMTV se realizoacute
un proceso de secuenciacioacuten con minado de cebadores previamente reportados para la
amplificacioacuten de diferentes regiones de cada uno de dichos segmentos (Tabla 51 Figura
53) y buscando que generaran traslape de secuencias de manera que fuera posible la
construccioacuten de un contig general para cada segmento Para esto se seleccionaron cuatro
cepas de PMTV representativas de cada uno de los departamentos bajo anaacutelisis Con cada
cepa se realizaron por lo menos dos amplificaciones con cada cebador de manera que las
secuencias reportadas correspondieran al consenso para cada amplicoacuten Los procedimientos
de extraccioacuten de ARN PCR y secuenciacioacuten fueron similares a los descritos anteriormente
aunque las RT se realizaron con la enzima Transcriptasa Reversa Maximareg (Fermentas)
que ofrece mayores niveles de estabilidad teacutermica (hasta 65degC) y eficiencia que las
transcriptasas reversas convencionales En este caso las reacciones de RT consistieron de
95 microL de agua libre de nucleasas 4 microL de buffer RT (5X) 1 microL de dNTPs (10 mM) 1 microL
de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de ARNasas (40UmicroL) 1 microL de enzima
Transcriptasa Reversa Maximareg (200 UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ARN para un volumen
final de 20 microL La incubacioacuten se realizoacute a 50degC por 30 min y la enzima se inactivoacute a 85degC
por 5 min
Las secuencias se editaron mediante el software Chromas Lite generaacutendose los consensos
con ambos cebadores usando el programa Bioedit 606 y se procedioacute al ensamblaje de los
contigs resultantes utilizando el programa CAP3 (Huang y Madan 1999) Posteriormente
se verificoacute el marco de lectura correcto utilizando el servidor de Expasy (Expasy Proteomic
Server httpwwwexpasychtoolsdnahtml) y se realizoacute su alineamiento con respecto a
los dos segmentos genoacutemicos de aislamientos cuyas secuencias completas se encontraban
disponibles en GenBank (DQ102381 DQ144451 AJ243719 AJ277556) (Sandgren et al
2001 Cerovska et al 2007)
94
Finalmente las secuencias de nt fueron traducidas a aa realizaacutendose comparaciones de
porcentajes de identidad y nuacutemero de posiciones variables a lo largo de las regiones bajo
estudio y generaacutendose aacuterboles filogeneacuteticos basados en los contigs obtenidos en la
investigacioacuten mediante el programa Mega v 40 bajo los paraacutemetros antes descritos
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Variabilidad geneacutetica de PMTV de Colombia
En total se obtuvieron 25 secuencias para la regioacuten amplificada de CP y 38 secuencias para
TGB2 Estas secuencias correspondieron a por lo menos cuatro aislamientos por cada
departamento bajo anaacutelisis (Tabla 52) De esta forma se aumentaron las secuencias
parciales de los genes CP y TGB2 de PMTV con respecto al trabajo reciente realizado por
nuestro grupo (Gil et al 2011) en donde soacutelo se obtuvieron cuatro y tres secuencias para
CP y TGB2 lo cual implica que las diferentes modificaciones realizadas a los
procedimientos necesarios para el estudio de este virus desde la forma de obtencioacuten de las
muestras hasta la purificacioacuten de los amplicones pasando por la eliminacioacuten de inhibidores
de las polimerasas resultaron altamente eficientes Esta situacioacuten abre la posibilidad de
plantear en el futuro proacuteximo un estudio de incidencia de PMTV basado en la deteccioacuten del
virus mediante RT-PCR con un muestreo estratificado en los diferentes pisos teacutermicos
donde se cultiva la papa en Colombia y realizando comparaciones con respecto a los
niveles de incidencia de Sss de manera que sea posible determinar la dimensioacuten de los
niveles de dispersioacuten de este virus en este paiacutes suramericano Un trabajo similar fue
realizado por Montero-Astuacutea et al (2008) en Costa Rica pero utilizando pruebas de ELISA
tanto para la deteccioacuten de Sss como de PMTV En este caso se encontroacute que el virus era
maacutes frecuentemente detectado en las regiones con mayores altitudes donde las condiciones
de alta humedad y bajas temperaturas aparentemente favorecen su infeccioacuten Sin embargo
es probable que la utilizacioacuten de pruebas de ELISA para la deteccioacuten del virus haya
conducido a una subestimacioacuten de los niveles de incidencia detectados en dicho trabajo
pues la distribucioacuten erraacutetica del virus su capacidad de movimiento ceacutelula-ceacutelula con ayuda
de proteiacutenas de movimiento codificadas por el TGB y no necesariamente en su forma
95
encapsidada y la utilizacioacuten de anticuerpos disentildeados a partir de cepas del norte de Europa
pueden influir negativamente en la deteccioacuten seroloacutegica del PMTV (Gallo et al 2012)
El anaacutelisis filogeneacutetico para CP incluyoacute 404 posiciones a partir de 46 secuencias 15 de las
cuales corresponden a aislamientos de referencia de Europa Asia y Norte Ameacuterica y las 4
previamente reportadas de aislamientos Colombianos por Gil et al (2011) El dendrograma
presentoacute dos grupos soportados por valores de bootstrap del 100 (Figura 54) El primer
clado agrupoacute todas las secuencias de referencia con 19 de los aislamientos Colombianos
obtenidos en este estudio y presentaron niveles de identidad superiores al 99 en todos los
casos (Tabla 53) Por otra parte el segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo seis de las aquiacute obtenidas y dos de las reportadas por Gil et
al (2011) Al interior de este clado se presentaron mayores niveles de variacioacuten (11 a
13) y su identidad con respecto a los miembros del primer clado fue de tan solo 76 La
secuencia de Beet Soil-Borne Virus de China utilizada como grupo externo de anaacutelisis se
ubicoacute en posicioacuten externa a los dos clados y compartioacute niveles de identidad inferiores al
59 con respecto a los aislamientos de PMTV
Estos resultados confirman los hallazgos de Veacutelez (2007) y Gil et al (2011) en referencia a
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que incluso bajo los paraacutemetros
definidos por Adams et al (2009) para la definicioacuten de especies al interior de la familia
Virgaviridae (ej cepas con identidades superiores a 80 y 90 a nivel de secuencias de CP
y del genoma completo respectivamente) podriacutea representar una nueva especie del geacutenero
Pomovirus (Familia Virgaviridae) hasta ahora no registrada en otros lugares del mundo Si
se considera que seis de las 25 secuencias de CP obtenidas en este trabajo correspondieron
a dicha variante es evidente que su presencia no es marginal en los cultivos de papa de
Colombia ya que para la muestra obtenida aunque evidentemente sesgada por la coleccioacuten
de suelos y tejidos con presencia de estructuras de Sss su proporcioacuten es del 23 La
diversidad entre aislamientos podriacutea deberse a que la regioacuten andina ha sido propuesta como
el centro de origen del PMTV (Mayo et al 1996)
96
Estos resultados representan un viraje con respecto a lo encontrado en los estudios de
variabilidad de PMTV con base en secuencias de CP de diferentes oriacutegenes geograacuteficos
por cuanto indistintamente se habiacutea encontrado que los niveles de identidad presentes en
este gen superaban el 98 en todas las comparaciones establecidas Asiacute por ejemplo
Latvala-Kirby et al (2009) al comparar 28 secuencias de Finlandia Letonia Escocia
Dinamarca Repuacuteblica Checa y Suecia encontraron que casi todas eran ideacutenticas siendo tan
soacutelo detectado un 2 de variacioacuten entre las maacutes distantes lo cual representa cambios en tan
soacutelo siete posiciones a nivel de la secuencia de aa de la proteiacutena resultante Similarmente
Xu et al (2004) reportaron que aislamientos de PMTV de Estados Unidos y Canadaacute eran
ideacutenticos y que eacutestos a su vez tan soacutelo diferiacutean en maacuteximo 3 de sus secuencias de CP con
respecto a cepas de Peruacute (Mayo et al 1996) Escocia y Escandinavia (Reavy et al 1997)
De esta forma de gran intereacutes resultaraacute emprender estudios que permitan evaluar las
diferencias bioloacutegicas de dichas variantes de PMTV sobre distintas variedades de papa e
incluso sobre hospedantes experimentales debido a que siacute existen diferencias de
patogenicidad entre aislamientos de PMTV que presentan tan bajos niveles de variacioacuten
(Nielsen y Nicolaisen 2003) es posible que dicho efecto sea auacuten mayor cuando se evaluacuteen
las variantes aquiacute reportadas
Con respecto al anaacutelisis filogeneacutetico basado en las secuencias de TGB2 se incluyeron 330
posiciones de 49 secuencias siete de las cuales fueron de aislamientos de referencia de
diferentes paiacuteses y tres de Colombia previamente analizadas por Gil et al (2011) El
dendrograma generado presentoacute un solo clado que incluyoacute todas las secuencias (Figura
55) las que compartieron niveles de identidad superiores a 98 (Tabla 54) Estos
resultados son un indicativo de que la variacioacuten encontrada entre aislamientos Colombianos
con respecto a CP no necesariamente se presentan a lo largo de los diferentes segmentos
genoacutemicos de PMTV y especiacuteficamente no se ven reflejadas en las secuencias de TGB2
que en los pocos estudios donde se ha secuenciado presenta niveles de identidad superiores
a 948 e incluso se ha encontrado que aislamientos de oriacutegenes geograacuteficos diferentes
pueden compartir hasta el 100 de identidad en la secuencia de aa para este gen (ej
aislamiento Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa y aislamientos 54-15 y 54-19 de
Dinamarca) (Cerovska et al 2007) Los altos niveles de conservacioacuten de este gen entre
97
aislamientos de PMTV que presentan diferencias en otras regiones del genoma como las
aquiacute encontradas para CP posibilitan que los cebadores utilizados para su amplificacioacuten
sean una herramienta uacutetil para el diagnoacutestico de este virus Asiacute por ejemplo Lambert et al
(2003) disentildearon los cebadores PMTV5 y PMTV7 dirigidos a amplificar una regioacuten de 646
pb comprendida entre TGB1 y TGB2 cuando reportaron por primera vez la presencia del
PMTV en EEUU Posteriormente Xu et al (2004) utilizaron la regioacuten que codifica para
TGB2 para el disentildeo de los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 en su estudio de evaluacioacuten de
distribucioacuten de PMTV en EEUU y Canadaacute
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Todos los cebadores utilizados en las reacciones de RT-PCR para amplificar diferentes
regiones de los ARN 2 y 3 del genoma de PMTV generaron los amplicones del fragmento
esperado en al menos un aislamiento evaluado Sin embargo en los aislamientos de Narintildeo
y Cundinamarca no fue posible la obtencioacuten de un contig completo para toda la regioacuten
secuenciada de ambos segmentos auacuten luego de diferentes intentos y modificaciones de los
paraacutemetros de la RT-PCR De esta forma para el caso de los aislamientos de Narintildeo no se
lograron amplicones del ARN2 con los cebadores PMTV759 ndash PMTV1552R PMTV759F
ndash 2017R y 1948F ndash 123end para el ARN 3 no fue posible obtener fragmentos con
RNA3F1ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end y F388 ndash PMTV7 Para el caso de
Cundinamarca no se lograron amplicones para el ARN 2 con PMTV759 ndash PMTV1552R y
PMTV759F ndash 2017R y para ARN 3 con RNA3F1 ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end
F388-PMTV7 Considerando que las variantes detectadas mediante la secuenciacioacuten de una
porcioacuten de CP presentaron bajos niveles de identidad con respecto a los genotipos
globalmente distribuidos de PMTV es posible que la ausencia de amplificacioacuten se deba a
diferencias en los sitios de reconocimiento de uno o ambos cebadores situacioacuten que impide
la amplificacioacuten de los fragmentos respectivos y por tanto su secuenciacioacuten posterior De
gran intereacutes seraacute continuar el proceso de secuenciacioacuten de dichas variantes para lo cual es
necesario la clonacioacuten de los respectivos cDNAs de cada segmento y el disentildeo de nuevos
cebadores especiacuteficos que permitan completar los vaciacuteos (gaps)
98
Por las razones antes expuestas para los anaacutelisis de secuencias de ARN2 y 3 soacutelo se
incluyeron los aislamientos representativos de Antioquia (Ant) y Boyacaacute (Boy) (Tabla
55) Para el ARN 2 se obtuvieron contigs de 2577 nt y 2584 para los aislamientos
Antioquia y Boyacaacute mientras que para el ARN 3 los contigs tuvieron una extensioacuten de
2617 y 2360 nt respectivamente Esto implica que para el ARN 2 se obtuvo un porcentaje
de cobertura del 83 de este segmento genoacutemico y del 87 para el ARN 3 en
comparacioacuten con el aislamiento Sw de PMTV (AJ243719 y AJ277556) (Sandgren et al
2001) En teacuterminos de aa los contigs del ARN2 incluyeron 150 de los aa de CP (posiciones
26 a 176) y 799 de CP-RT (posiciones 26 a 825) Para el ARN 3 se obtuvo la secuencia
completa de aa de TGB1 (463 aa) y TGB2 (119 aa) asiacute como 146 de 190 aa de TGB3
(posiciones 1 a 146) para el aislamiento de Boyacaacute y la totalidad de dicha proteiacutena para la
cepa de Antioquia Las demaacutes secuencias obtenidas corresponden a regiones UTR de los
extremos 3acute para el ARN 2 y 5acute para el ARN 3
Con el fin de realizar un anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las dos cepas obtenidas
con respecto al genoma de la cepa de PMTV de Suecia ndash Sw cuyo genoma completo estaacute
depositado en GenBank bajo el coacutedigo PRJNA14789 (Savenkov et al 1999 Sandgren et
al 2001) se incluyeron 1956 nt (651 aa) para CP-RT 531 nt (176 aa) para CP y 1392 (463
aa) para las tres regiones del TGB En teacuterminos generales se encontraron muy altos niveles
de identidad en las tres regiones analizadas siendo la CP la maacutes uniforme con 99 en la
secuencia de nt y 100 en aa para las tres cepas CP-RT presentoacute un nivel de identidad
para nt de 994 entre las cepas de Antioquia y Boyacaacute y del 975 - 976 con respecto a
la secuencia de referencia mientras que estos valores fueron superiores al 982 cuando se
comparoacute la secuencia de aa Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos compartieron
un 999 de identidad en nt y aa (Figura 56) Las pocas diferencias a nivel de aa
encontradas en este estudio correspondieron a cambios en 15 posiciones para el producto
del ARN 2 siendo la maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la posicioacuten 81
de CP Para el caso de TGB se encontraron 10 cambios a lo largo de las tres proteiacutenas
analizadas con la presencia de una delecioacuten en la posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
99
Por otra parte el anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2569 nt para ARN 2 con
secuencias de referencia de los aislamientos Corneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia (Figura 57) arrojoacute un dendrograma con dos
clados soportados por 100 de bootstrap separaacutendose los aislamientos de Colombia de los
de Europa sin embargo los niveles de identidad entre ambos grupos fueron muy altos
(gt975) (Tabla 56) Al calcular los niveles de diversidad (promedio del nuacutemero de
sustituciones de nucleoacutetidos por cada sitio) para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos
(dNS) se encontroacute una diversidad muy baja con tan soacutelo 0017 (SE= 0003) para dNS y
0009 (SE=0002) para dS La relacioacuten promedia entre dNSdS fue de 18 lo cual indica
que las cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten positiva para este componente del
genoma Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 3 mientras que para las
europeas fue de 12 La distancia geneacutetica o nuacutemero de sustituciones promedio por sitio
basada en el meacutetodo de Kimura-2 paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0015
El anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de
referencia de los aislamientos Korneta-Nemilkov (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia generoacute
un dendrograma con dos clados de aislamientos europeos mientras que los aislamientos
Colombianos se presentaron en forma individual sobre ramas soportadas por 100 de
bootstrap (Figura 58) A pesar de dichas agrupaciones los niveles de identidad entre todos
los aislamientos fueron superiores a 967 (Tabla 57) Al calcular los niveles de
diversidad para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos (dNS) se encontroacute una diversidad
muy baja para todos los aislamientos con tan soacutelo 0011 (SE= 0002) para dNS y 0044
(SE=0006) para dNS La relacioacuten media entre dNSdS fue de 025 lo cual indica que las
cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten estabilizadora en dicho segmento de ARN
Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 019 mientras que para los
aislamientos europeos fue de 039 La distancia geneacutetica basada en el meacutetodo de Kimura -2
paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0020 (SE 0002)
Los bajos niveles de variacioacuten encontrados en los anaacutelisis de genomas de PMTV (Savenkov
et al 1999 Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) y que nuevamente fueron inferidos
100
en el presente estudio para las cepas del clado que representa PMTV sensu stricto indican
que este virus se encuentra bajo fuertes presiones de seleccioacuten determinadas
presumiblemente por las propias caracteriacutesticas de su genoma el estrecho rango de
hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica por parte de su vector Sss (Kirk
2008 Santala et al 2010)
Para el primer caso la restriccioacuten selectiva se manifiesta por los bajos valores de dNSdS
calculados para dicho segmento y ocurre fundamentalmente al presentarse traslape de genes
en el ARN 3 Sin embargo para el ARN 2 dicha relacioacuten fue gt1 lo cual sugiere una
seleccioacuten positiva que puede explicarse por el hecho que este segmento presenta la
estrategia de supresioacuten del codoacuten de parada tipo amber para la traduccioacuten de las dos
proteiacutenas codificantes (CP y CP-RT) lo cual supone menos restricciones para la fijacioacuten de
mutaciones De otra parte la presencia de un estrecho rango de hospedantes para el virus
que se restringe a algunas especies de las familias Solanaceae y Chenopodiaceae (Kirk
2008) aunada a su transmisioacuten por Sss supone fuertes restricciones sobre los cambios en
las diferentes proteiacutenas del virus que interactuacutean con sus hospedantes y vectores lo cual
impide altas tasas de variacioacuten tales como las que presentan otros virus de ARNss(+) como
los potyvirus que en general tienen amplios rangos de hospedantes y cuya transmisioacuten por
aacutefidos poliacutefagos es del tipo no persistente (Hu et al 2009)
A pesar de los altos valores de uniformidad general encontrados de gran intereacutes resultoacute la
presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los aislamientos
colombianos de PMTV Por esto es necesario en el futuro evaluar el significado bioloacutegico
de dichos cambios por ejemplo si estan relacionadas con el efecto de las variedades nativas
de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas que las poblaciones de Sss
tienen en las regiones Andinas donde se presentan mayores niveles de variacioacuten que en
aquellas encontradas en las regiones cultivadoras de papa del hemisferio norte tal como lo
planteoacute Carrentildeo (2009) El efecto de estas inserciones y de diferentes sustituciones
detectadas en este trabajo sobre diferentes regiones de los segmentos de ARN 2 y 3
requiere un tratamiento futuro detallado a partir de anaacutelisis de mutantes y de sus efectos
sobre el ciclo infectivo viral
101
Esta investigacioacuten representa un avance importante en la caracterizacioacuten geneacutetica del
PMTV en las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia Sus resultados
confirman la presencia de dos genotipos principales de este virus en el paiacutes uno que
representa al PMTV sensu stricto destacado por presentar muy bajos niveles de variacioacuten
entre sus cepas y otro que representa una variante hasta ahora soacutelo identificada en
Colombia y que por presentar porcentajes de identidad inferiores al 80 con respecto al
grupo principal podriacutea representar una nueva especie de pomovirus que requiere ser
evaluada bioloacutegica patogeacutenica y molecularmente Finalmente es imperativo estudiar el
efecto de ambos genotipos virales sobre la produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de
papa en Colombia de manera que los organismos de sanidad vegetal estatales gremios de
productores y agroindustrias puedan valorar la necesidad de incluir la deteccioacuten del PMTV
en los programas de certificacioacuten de semilla y de mejoramiento geneacutetico de papa que se
adelantan en el paiacutes
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz
Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el
Departamento de Narintildeo
102
BIBLIOGRAFIacuteA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Arif M Torrance L Reavy B 1995 Acquisition and transmission of Potato mop-top
furovirus by a culture of Spongospora subterranea f sp subterranea derived from a single
cystosorus Annals of Applied Biology 126493-503
Calvert E Harrison BD 1966 Potato mop-top a soil-borne virus Plant Pathology
15134ndash139
Carnegie SF Saddler GS Peters JC 2009 Cultivar susceptibility to Potato mop-top virus
(PMTV) infection and symptom expression Aspects of Applied Biology 94 (Potatoes
Viruses and their Vectors) 51ndash54
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea
fsp subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Cerovska N Moravec T Rosecka P Filigarova M Pecenkova T 2003 Nucleotide
sequences of coat protein coding regions of six potato mop-top virus isolates Acta
Virologica 4737-40
Cerovska N Pecenkova M Foligarova M Dedic P 2007 Sequence analysis of the
Czech Potato mop-top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica
5261-64
103
Cowan GH Torrance L Reavy B1997 Detection of Potato mop-top virus capsid
readthrough protein in virus particles Journal of General Virology 781779-1783
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
Scotland
Felsenstein J 1985 Confidence limits on phylogenies an approach using the bootstrap
Evolution 39(4)783-791
Gallo Y 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea en Bioquiacutemica Facultad de Medicina Universidad Nacional
de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Gil JF Gutieacuterrez P Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
Hall TA 1999 BioEdit a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis
program for Windows 9598NT Nucleic Acids Symposium Series 4195-98
Harrison BD Jones RAC 1970 Host range and some properties of Potato mop-
top virus Annals Applied Biology 65393-402
104
Hu X Karasev AV Brown CJ Lorenzen JH 2009 Sequence characteristics of potato
virus Y recombinants Journal of General Virology 903033ndash3041
Huang X Madan A 1999 CAP3 A DNA sequence assembly program Genome
Research 9868-877
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 7147-57
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Kirk HG 2008 Mop-top virus relationship to its vector American Journal of Potato
Research 85 261-265
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003
First Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease
87872
Larkin M Blackshields G Brown NP Chenna R McGettigan PA McWilliam H
Valentin F Wallace IM Wilm A Loacutepez R Thompson JD Gibson TJ Higgins DG
2007 Clustal W and Clustal X version 20 Bioinformatics 23(21)2947-2948
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99519-531
105
Lim HS Bragg J N Ganesan U Lawrence DM Yu J L Isogai M Hammond J
Jackson AO 2008 Triple gene block protein interactions involved in movement of Barley
stripe mosaic virus Journal Virology 824991-5006
Lim HS Bragg J N Ganesan U Ruzin S Schichnes D Lee MY Vaira AM Ryu KH
Hammond J Jackson AO 2009 Subcellular localization of the Barley stripe mosaic virus
triple gene block proteins Journal Virology 839432-9448
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization
and effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal
of General Virology 862879-2889
MacKenzie DJ 1996 Detection of potato mop-top virus in leaf or tuber tissue by reverse
transcription-polymerase chain reaction Document CPHBT96K03 Centre for Plant Health
Agriculture and Agri-Food Canada Sidney BC Canada
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C
Salazar LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top
virus from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
Montero-Astuacutea M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U and Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Mumford RA Walsh K Barker I Boonham N 2000 Detection of Potato mop top virus
and Tobacco rattle virus using a multiplex real-time fluorescent reverse transcription
polymerase chain reaction assay Phytopathology 90448-453
106
Nakayama T Maoka T Hataya T Shimizu M Fuwa H Tsuda S Motoyuki M 2010
Diagnosis of Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-225
Nielsen SL Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups
within Potato mop-top virus Archives of Virology 148 381-388
Reavy B Sandgren M Barker H Heino P Oxelfelt P 1997 A coat protein transgene
from a Scottish isolate of Potato mop-top virus mediates strong resistance against
Scandinavian isolates which have similar coat protein genes European Journal of Plant
Pathology 103829-834
Roos J Hopkins R Kvarnheden A Dixelius C 2011 The impact of global warming on
plant diseases and insect vectors in Sweden European Journal of Plant Pathology 1299-19
Ryazantsev DY Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato viral pathogens Molecular Biology 43515-523
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M
Wieczorek P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-
Wiśniewska J Yin Z Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E
Taluntytė L Pūpola N Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E
107
Sozonov A Tikhonovich I Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam
G Valkonen JPT 2010 Detection distribution and control of Potato mop-top virus a soil-
borne virus in northern Europe Annals of Applied Biology 157163-178
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003
Potato mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich
protein are dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of
General Virology 841001-1005
Savenkov EI Sandgren MY Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Tamura K Dudley J Nei M Kumar S 2007 MEGA4 Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) software version 40 Molecular Biology and Evolution 241596-1599
Tamura K Nei M 1993 Estimation of the number of nucleotide substitutions in the
control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Molecular Biology and
Evolution 10512-526
Technelysium 2009 Chromas 20 Consultado el 15 de Febrero de 2009 Disponible en
httpwwwtechnelysiumcomauchromas_litehtml
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Research 83423-31
Torrance L Cowan GH Pereira LG 1993 Monoclonal antibodies specicreg for Potato
mop-top virus and some properties of the coat protein Annals of Applied Biology 122311-
322
108
Torrance L Cowan GH Sokmen M A Reavy B 1999 A naturally occurring deleted
form of RNA 2 of Potato mop-top virus Journal of General Virology 802211-2215
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop-top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI
Torrance L 2010 The N-Terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required
for nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant-Microbe Interaction 23(11)1486-1497
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top
virus in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
109
51 Anexos
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb) dirigidos al
gen de la caacutepside viral de PMTV a partir de muestras de tejido de raiacutez de plantas de N
benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea del
Departamento de Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador 100 pb Carril 2 BS8T Carril 3
BS9T Carril 4 BS4T Carril 5 BS11P Carril 6BS4T Carril 7 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7
500 pb
110
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb)
dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) de PMTV a partir de muestras de tejido de
raiacutez de plantas de N benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S
subterranea de los Departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador
100 pb Carril 2-4 Control positivo (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 5-7
SRL5 (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 8-10 SRL7 (ADN directo
110150 respectivamente) Carril 11-13 BS8T (ADN directo 110150
respectivamente) Carril 1415 BS4T1 (ADN directo y 110) Carril 16 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
500 pb
111
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten de los
segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV)
Cebador Secuencia 5acute- 3 Posicioacuten en el
genoma (nt) Referencia
RNA3 F1 CGCTCGAGTTTAGGTGACACTATAGGTATTTCA
ACTCTACCTAG 1 a 388
Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003 PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
PMTVF4 CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG 1726 a 1746 Xu et al
2004
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
F388
CGGGATCCGAAGTAGACCACACAGAGTG
1 a 388 Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011 PMTV1552R GCC AAT TGT CTC AAT CAT ACA CTG 1865 a 1888
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011
2017R CCA CTG CAA AAG AAC CGA TTT C Mumford
et al 2000
1948F GTG ATC AGA TCC GCG TCC TT Mumford et al 2000
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
112
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7 (2063 pb)
PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al ARN3 del genoma
del Potato mop-top virus (PMTV) a partir de tejido de raiacutez de plantas de N benthamiana y
S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea de cuatro departamentos de
Colombia Carril 1 Marcador 100 pb plus carriles 2-5 con cebadores RNA3F1-PMTV7
SRL5 SRL6 BS9T1 BS9T2 carril 6-12 con cebadores PMTV5-PMTV7 23T 24T
SRL5 SRL6 BS4T BS8T BS9T carril 13-20 con cebadores PMTVF4-123 end Villa1
NS19P1 23T 24T SRL4 SRL5 SRL6 BS4T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1000 pb 500 pb
113
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos cultivadores de papa de
Colombia
Gen CP Gen TGB2
ANTIOQUIA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
25 La Unioacuten Suelo S tuberosum 25(1) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL4 Santa Rosa S tuberosum var Diacol Capiro 25(2) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL4 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle La Unioacuten Suelo S tuberosum SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle1 La Unioacuten Suelo S tuberosum
Valle2 La Unioacuten Suelo S tuberosum
BOYACAacute
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
BS2T Oicataacute Suelo S tuberosum BS1P1 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4P Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS1P2 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4T Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS4T1 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS8T Soracaacute Suelo S tuberosum BS4T2 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS9T Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum BS8T1 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11P Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS8T2 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11T Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS9T1 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS12P Tunja Suelo con Pennisetum clandestinum BS9T2 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS9T3 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS11T1 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS11T2 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS13P Tunja Suelo S tuberosum
CUNDINAMARCA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
CS1T Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa CS1P1 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2P Subachoque Suelo S tuberosum CS1P2 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2T Subachoque Suelo S tuberosum CS2P Subachoque Suelo S tuberosum
CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Mad Madrid Suelo S tuberosum Villa1 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
114
Villa2 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
NARINtildeO
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
NS1P Pasto Suelo S tuberosum NS3P1 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS2T Pasto Suelo S tuberosum NS3P2 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro NS3P3 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8P Pasto Suelo S tuberosum NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8PF Pasto Suelo S tuberosum
NS10T Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS19P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS19P2 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P2 Ipiales Suelo S tuberosum
115
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de Potato
mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo
Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus (China)
Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte inferior de
las ramas
116
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
BS4T
Boyacaacute
Colombia
CS1T
Cundinamarca
Colmbia
NS2T
Narintildeo
Colombia
NS6P
Narintildeo
Colombia
71MY
Cundinamarca
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AJ243719
PMTV
Suecia
EF545141
Beet Soil-
Borne
Virus
China
BS4T Boyacaacute
Colombia ID 0997 0764 0752 0762 0995 0995 0599
CS1T
Cundinamarca
Colombia
0997 ID 0764 0752 0762 0992 0992 0599
NS2T Narintildeo
Colombia 0764 0764 ID 0891 0876 0769 0769 0571
NS6P Narintildeo
Colombia 0752 0752 0891 ID 0967 0752 0752 0596
71MY
Cundinamarca
Colombia
0762 0762 0876 0967 ID 0762 0762 0599
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0995 0992 0769 0752 0762 ID 1 0594
AJ243719
PMTV Suecia 0995 0992 0769 0752 0762 1 ID 0594
EF545141 Beet
Soil-Borne
Virus China
0599 0599 0571 0596 0599 0594 0594 ID
117
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del
mundo Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus
(China) Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte
inferior de las ramas
118
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
23T
Antioquia
Colombia
NS22P1
Narintildeo
Colombia
Villa2
Cundinamarca
Colombia
DQ144451
Repuacuteblica
Checa
NC_003725
Suecia
EF545142 Beet
Soil-Borne Virus
China
23T Antioquia
Colombia ID 0981 0981 0984 0981 0699
NS22P1 Narintildeo
Colombia 0981 ID 099 0984 0981 0708
Villa2 Cundinamarca
Colombia 0981 099 ID 0987 0984 0708
DQ144451 Repuacuteblica
Checa 0984 0984 0987 ID 099 0714
NC_003725 Suecia 0981 0981 0984 099 ID 0711
EF545142 Beet Soil-
Borne Virus China 0699 0708 0708 0714 0711 ID
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato mop-top virus en cuatro
Departamentos cultivadores de papa de Colombia
Muestra Hospedante Municipio Planta sentildeuelo
Ant (23T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
La Unioacuten (Antioquia)
N benthamiana
Boy (BS4T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Siachoque
(Boyacaacute) N benthamiana
Cund(CS1T) Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
Subachoque (Cundinamarca)
N benthamiana
Nar (NS6P) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro Pasto (Narintildeo) S phureja
119
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia y Boyacaacute
(Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw Suecia A Niveles de
identidad de nucleoacutetidos y aminoaacutecidos (entre pareacutentesis) de las regiones CP CP-RT y
TGB analizadas y la cepa NC_003724 B Regioacuten CP-RT se incluyeron 1956 nt (651 aa)
para CP-RT y 531 nt (176 aa) para CP Se presentaron cambios en 15 posiciones para el
producto del ARN 2 siendo lo maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la
posicioacuten 81 de CP C Regioacuten TGB se incluyeron 1392 nt (463 aa) Se presentan 10
cambios a lo largo de las tres proteiacutenas analizadas con la presencia de una delecioacuten en la
posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
120
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con secuencias de
referencia de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia y secuencias Colombianas de PMTV
procedentes de Antioquia y Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de
Bootstrap (100 ) se indican sobre las ramas La escala representa las sustituciones
promedio por sitio
121
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica Checa
AJ243719
PMTV Suecia
Antioquia
Colombia ID 0994 0979 0976
Boyacaacute
Colombia 0994 ID 0978 0975
DQ102381 PMTV
Repuacuteblica Checa 0979 0978 ID 0995
AJ243719 PMTV
Suecia 0976 0975 0995 ID
122
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de referencia
de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19
(AY353719) y 54-10 (AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd
(D30753) de Escocia y secuencias Colombianas de PMTV procedentes de Antioquia y
Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de Bootstrap (100 ) se indican
sobre las ramas La escala representa las sustituciones promedio por sitio
123
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AY426745
PMTV
Dinamarca
AY353719
Dinamarca
AJ277556
PMTV
Suecia
D30753
PMTV
Escocia
Antioquia
Colombia ID 0979 0988 0987 0986 0973 0967
Boyacaacute
Colombia 0979 ID 0980 0980 0979 0980 0969
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0988 0980 ID 0998 0997 0979 0971
AY426745
PMTV
Dinamarca
0987 0980 0998 ID 0997 0979 0970
AY353719
PMTV
Dinamarca
0986 0979 0997 0997 ID 0978 0969
AJ277556
PMTV Suecia 0973 0980 0979 0979 0978 ID 0986
D30753 PMTV
Escocia 0967 0969 0971 0970 0969 0986 ID
124
6 ANEXOS GENERALES
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen)
1 Homogenizar 100 mg de tejido de planta en nitroacutegeno liacutequido utilizando un mortero
Adicionar 400 microL de buffer AP1 y 4 microL de la solucioacuten de ARNase A (100mgmL) a
un maacuteximo de 100 mg (peso huacutemedo) o 20 mg (peso seco) de tejido de planta
homogenizado y agitar vigorosamente
2 Incubar la mezcla por 10 min a 65degC Mezclar por inversioacuten 2 oacute 3 veces durante la
incubacioacuten
3 Agregar 130 microL de buffer AP2 al lisado mezclar e incubar por 5 min en hielo
4 Recomendado Centrifugar el lisado por 5 min a 20000 x g (14000 rpm)
5 Pipetear el lisado en la columna QIAshredder Mini spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a 20000 x g (14000 rpm)
6 Transferir la fraccioacuten que pasoacute por la columna del paso 5 en un nuevo tubo sin
disturbar el sedimento de restos celulares
7 Agregar 15 voluacutemenes de buffer AP3E al lisado aclarado y mezclar por pipeteo
8 Pipetear 650 microL de la mezcla de paso 7 incluyendo cualquier precipitado que se
pueda haber formado en la columna DNeasy Mini spin column colocando en un
tubo de coleccioacuten de 2 ml Centrifugar por 1 min a 6000 x g (corresponde a 8000
rpm para la mayoriacutea de las microcentrifugas) y descartar el liacutequido Reutilizar el
tubo de coleccioacuten en el paso 9
9 Repetir el paso 8 con la muestra restante Desechar el liacutequido que atraviesa la
membrana y el tubo de coleccioacuten
10 Colocar la columna DNeasy Mini spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2 ml
agregar 500 microL de buffer AW y centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rpm)
Descartar el liacutequido que atraviesa la membrana y reutilizar el tubo de coleccioacuten en
el paso 12
11 Adicionar 500 microL de buffer AW a la columna DNeasy Mini spin y centrifugar por 2
min a 20000 x g (14000 rpm) para secar la membrana
12 Transferir la columna DNeasy Mini spin a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL y
pipetear 40 microL de Agua bi-destilada directamente en la membrana de DNeasy
Incubar por 5 min a temperatura ambiente (15-25degC) y luego centrifugar por 1 min
a 6000 x g (8000 rpm) para eluir
13 Repetir el paso 12 una vez
125
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo (Doyle y Doyle 1987)
Previo a dar inicio a al procedimiento se debe asegurar de contar con
Nitroacutegeno liacutequido
Bantildeo Mariacutea a 65degC
Enfriar morteros a -20degC
Preparar solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2
Preparar el volumen de buffer CTAB+ β-Mercaptoetanol correspondiente al
nuacutemero de muestras
Desinfestar las muestras con hipoclorito y agua destilada durante 1 min
1 Tomar la raiacutez previamente desinfestada macerarla en nitroacutegeno liacutequido y pasarla a
un tubo eppendorf de 2 mL hasta completar un volumen de 400-500 microL
2 Adicionar 500 microL de buffer de extraccioacuten (CTAB) y 1 de β-Mercaptoetanol (5
microL) previamente preparado
Mezclar por inversioacuten
3 Incubar los tubos a 65degC por 30 min Durante este tiempo hacer inversioacuten de los
tubos cada 5 min
4 Adicionar 250 microL de fenol y 250 microL de cloroformo alcohol isoamiacutelico (241)
Mezclar por inversioacuten
5 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 10 min
6 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL
7 Adicionar un volumen de cloroformo alcohol isoamiacutelico (respecto al sobrenadante)
Mezclar por inversioacuten y centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 5 min
8 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL y repetir
el paso 7
9 Adicionar un volumen de isopropanol friacuteo y 01 voluacutemenes de acetato de sodio 3M
invertir varias veces para precipitar el ADN Llevar las muestras a -20degC por 60 min
como miacutenimo o durante toda la noche Periodos maacutes largos pueden aumentar la
produccioacuten
10 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 15 min a temperatura ambiente
11 Descartar el sobrenadante invirtiendo raacutepida y suavemente los tubos y adicionar 200
microL de etanol friacuteo al 70 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 2 min
12 Descartar el sobrenadante por inversioacuten y secar el pellet a temperatura ambiente
invirtiendo los tubos sobre papel absorbente
13 Resuspender el pellet en 50 microL de agua ultrapura esteacuteril
14 Adicionar 4 microL de ARNasa a cada muestra e incubar en el bantildeo Mariacutea a 37degC
durante miacutenimo 2 horas o durante toda la noche
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
126
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y
hongos filamentosos (Qiagen)
1 Determinar la cantidad de material de planta No usar maacutes de 100 mg
2 Colocar inmediatamente el tejido pesado en nitroacutegeno liacutequido Macerar bien en
un mortero Pasar el tejido en polvo a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL
manteniendo los tubos en nitroacutegeno liacutequido Eacuteste se puede evaporar pero no se
debe permitir que el tejido se descongele Proceder inmediatamente al paso 3
3 Adicionar 450 microL de buffer RLC a un maacuteximo de 100 mg de tejido en polvo
Hacer vortex vigorosamente Nota Asegurar que el B-mercaptoetanol (β-ME)
haya sido agregado al buffer RLC antes de su uso (10 microL de β-ME1 mL de
buffer RLC)
4 Transferir el lisado a la columna QIAshredder spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a maacutexima velocidad (13000 rpm
oacute 18500 x g) Transferir cuidadosamente el sobrenadante que pasoacute por la
columna a un nuevo tubo de microcentriacutefuga sin disturbar el sedimento de
restos celulares en el tubo de coleccioacuten Usar soacutelo el sobrenadante en los pasos
siguientes
5 Adicionar 05 voluacutemenes de etanol (96-100) al lisado aclarado y mezclar
por pipeteo inmediatamente No centrifugar Proceder inmediatamente al paso 6
6 Transferir la muestra (usualmente 650 microL) incluyendo cualquier precipitado
que se haya formado a una columna RNeasy spin (rosada) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL (suministrado) Cerrar suavemente la tapa y centrifugar
por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que pasoacute por la
membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 7
7 Adicionar 700 microL de buffer RW1 a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 8
8 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo en el paso 8 Nota Asegurar que el
buffer RPE tenga adicionado el etanol antes de su uso
9 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 2 min a 8000 x g (10000 rpm) para lavar la membrana
de la columna
10 Opcional Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2
mL (suministrado) y descartar el tubo anterior con el liacutequido Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar a velocidad maacutexima por 1 min (13000 rpm oacute 18500 x g)
11 Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 15 mL
(suministrado) Adicionar 20 microL de agua tratada con DEPC (Dietil
pirocarbonato Qiagen) directamente a la membrana de la columna Cerrar
suavemente la tapa y centrifugar por 1 min a 8000 x g (10000 rpm) para eluir
el ARN
12 Repetir el paso 11
127
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Volumen del componente
para 15 microL de mezcla
Producto de PCR 8 μl
Buffer de la enzima 1 (1X) 1 5 μl
Buffer de la enzima 2 (1X) 1 5 μl
Enzima de restriccioacuten 1 2 μl
Enzima de restriccioacuten 2 2 μl
Volumen total 15 μl
2 Incubar las muestras al bantildeo Mariacutea a 37degC por 12 h-24 h
3 Ralizar el anaacutelisis en gel de agarosa al 25
128
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa RT M-
MuLV para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del componente
para 20 microL de mezcla
Agua bi-destilada 05 microL
PBST (05) 004 15 microL
Buffer RT M-MuLV 5X 1X 4 microL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 microL
dNTPs 10 mM 1 mM 2 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 1 microM 2 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa M-MuLV 20 UmicroL 05 microL
ARN 5 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
129
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 20 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 95 microL
Buffer RT Maacutexima 5X 1X 4 microL
dNTPs 10 mM 05 mM 1 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 05 microM 1 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa Maximareg 200 UmicroL 1 microL
ARN 3 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
130
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes de
descongelar
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 146 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 25 mM 02 mM 2 microL
Primer F 10 microM 05 microM 125 microL
Primer R 10 microM 5 microM 125 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 04 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN Molde 1microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Condiciones del ciclo de la PCR para Sss
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 55 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
131
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes del
descongelamiento
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25
microL de mezcla
Agua bi-destilada 158 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 10 mM 02 mM 05 microL
Primer F 10 microM 2 microM 05 microL
Primer R 10 microM 2 microM 05 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 02 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN copia 3 microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 53 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
134
7 CONCLUSIONES GENERALES
En este estudio se encontroacute que las poblaciones Colombianas de Spongospora subterranea
f sp subterranea (Sss) presentan una estructura baacutesica consistente en tres tipos geneacuteticos
(I II y III) El subgrupo III difiere de los reportados mundialmente como Tipo I y Tipo II
en 5 y 2 respectivamente El Tipo III presentoacute la mayor proporcioacuten de aislamientos de
Sss en este estudio con cepas de diferentes departamentos hospedantes y tejidos
sintomaacuteticos mientras que el Tipo I no fue encontrado en muestras procedentes de agallas
de raiacutez Es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa en Colombia asiacute como su
epidemiologiacutea y capacidad para la transmisioacuten de PMTV
Los anaacutelisis de RFLPs de regiones ITS del ADNr de Sss demostraron polimorfismos en los
sitios de corte de las enzimas Hin6I y Bsp143I Se confirmoacute que la digestioacuten con la enzima
Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos del Tipo III mientras que
el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los Tipos I y II permitiendo
separar los tres principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico de Sss Los
resultados obtenidos sugieren la viabilidad de plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla
El anaacutelisis filogeneacutetico para el gen CP de PMTV permitioacute separar dos grupos de
aislamientos del virus El primer clado agrupoacute todas las secuencias de referencia mundial
con 19 de los aislamientos Colombianos obtenidos en este estudio que presentaron niveles
de identidad superiores al 99 El segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo dos de las reportadas en investigaciones previas y seis
obtenidas en el presente estudio con niveles de variacioacuten del 11 al 13 y con una identidad
de tan solo 76 con respecto a los miembros del primer clado Estos resultados confirman
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que no ha sido registrada en otros
Osorio 2012
135
135
lugares del mundo Es necesario estudiar el efecto de ambos genotipos virales sobre la
produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de papa en Colombia de manera que se generen
tecnologiacuteas para la deteccioacuten de PMTV en los programas de certificacioacuten de semilla y de
mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en el paiacutes
En el anaacutelisis de las regiones parciales de CP y CP-RT del ARN2 y TGB del ARN3 de
PMTV sensu stricto se encontraron niveles muy altos de identidad en las tres regiones
estudiadas siendo la CP la maacutes uniforme Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos
compartieron un 999 de identidad en nt y aa Asiacute mismo los anaacutelisis filogeneacuteticos para el
ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Europeos y Colombianos demostraron que los niveles de
identidad entre ambos grupos fueron muy altos gt975 para ARN 2 y gt967 para el
ARN 3 Estos bajos niveles de variacioacuten permiten inferir que este virus se encuentra bajo
fuertes presiones de seleccioacuten determinadas presumiblemente por las propias caracteriacutesticas
de su genoma el estrecho rango de hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica
por parte de su vector Sss Sin embargo a pesar de los altos valores de uniformidad general
encontrados la presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los
aislamientos colombianos de PMTV resulta interesante para el desarrollo de
investigaciones que permitan determinar si se trata de adaptaciones del genoma viral a las
variedades nativas de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas propias de
las poblaciones de Sss en las regiones Andinas
NS1P Pasto (Nar) Suelo S tuberosum
vii
Pag
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN
ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las
enzimas de restriccioacuten Bsp143I y Hin6I que permiten determinar los tres
Tipos de Sss identificados en este trabajo 82
Figura 410 Gel de RFLPs con la enzima Hind6I y Bsp143I con muestras de los
Tipos I II y III de Sss detectados en el estudio 83
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb)
dirigidos al gen de la caacutepside viral del Potato mop-top virus PMTV 109
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4
(417 pb) dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) del Potato
mop-top virus (PMTV) 110
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7
(2063 pb) PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al
ARN3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 112
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses
del mundo 115
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del
genoma de Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia
y otros paiacuteses del mundo 117
viii
Pag
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia
y Boyacaacute (Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw
Suecia 119
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con
secuencias de referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del
Potato mop-top virus (PMTV) 120
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias
De referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del Potato
mop-top virus (PMTV) 122
ix
INDICE DE TABLAS
Pag
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o
raiacuteces de plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea 67
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna
polvosa y de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad 72
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de
aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en
Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2
del ADN ribosomal 78
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S
E ITS2 del ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp
subterranea de Colombia y otros paiacuteses del mundo 81
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten
de los segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 111
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia 113
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 116
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 118
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato
mop-top virus en cuatro Departamentos cultivadores de papa de Colombia 118
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 118
x
Pag
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 123
xi
RESUMEN
El cultivo de papa es uno de los renglones agriacutecolas de mayor importancia en Colombia se
extiende a 128701 ha y genera una produccioacuten anual de 23 millones de ton antildeo-1
Desde el
punto vista fitosanitario la papa se ve afectada por diversos problemas destacaacutendose en los
uacuteltimos antildeos la reemergencia de la Sarna polvosa causada por el protozoario del suelo
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) El efecto de esta enfermedad se refleja en
el deterioro de la calidad del tubeacuterculo y en la reduccioacuten de la produccioacuten al afectar el
sistema radicular de las plantas Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus
(PMTV) uno de los virus prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarenteneario en diferentes paiacuteses del mundo En este trabajo se evaluaron los niveles de
variabilidad geneacutetica de aislamientos Sss y PMTV obtenidos en cultivos de papa de los
departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo En el caso de Sss se
estudiaron los niveles de variacioacuten de 127 aislamientos a partir de la secuenciaciacioacuten de
las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr) encontraacutendose la presencia de tres variantes
principales dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada Para PMTV se
evaluaron los niveles de identidad de 38 aislamientos de los cuatro departamentos bajo
estudio a partir de la secuenciacioacuten de los genes de la caacutepside viral (CP) y del segundo gen
del triple bloque de genes (TGB2) encontraacutendose la presencia de dos variantes del virus
una que representa el genotipo mundialmente reportado para este virus y la otra que hasta
ahora soacutelo se ha encontrado en Colombia y que dado el bajo nivel de identidad (76) con
respecto al primer grupo posiblemente representa una nueva especie de pomovirus
Finalmente dos de las cepas de PMTV de Antioquia y Boyacaacute fueron secuenciadas para
sus ARN 2 y 3 lograacutendose un 83 del segmento genoacutemico de ARN 2 y 87 para el ARN
3 y encontraacutendose que comparten niveles de identidad superiores al 97 con respecto a
otros aislamientos previamente caracterizados en el Norte de Europa Se espera que los
resultados de esta investigacioacuten sean utilizados para el disentildeo de herramientas de
xii
diagnoacutestico que apoyen los esquemas de certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas
de mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en Colombia
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum Potato mop-top
virus secuenciacioacuten
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea AND ITS
ASSOCIATED PMTV VIRUS IN COLOMBIA
ABSTRACT
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
The other hand Sss is a vector for Potato mop-top virus (PMTV) a prevalent virus in the
Andean region and quarentenary in several countries However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
xiii
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum Potato mop-top virus
RT-PCR Sequencing
1
1 INTRODUCCIOacuteN
En Colombia el cultivo de la papa ocupa cerca de 128701 ha distribuidas en 14
departamentos de los cuales Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo son responsables
del 80 de la produccioacuten que asciende a cerca de 23 millones de ton antildeo-1
y de la cual
dependen maacutes de 69000 familias del sector rural del paiacutes La cadena de la papa en
Colombia enfrenta un gran nuacutemero de desafiacuteos endoacutegenos y exoacutegenos que disminuyen su
competitividad respecto a los demaacutes paiacuteses del mundo y en especial con relacioacuten a los otros
miembros de la Comunidad Andina de Naciones Entre otros factores los maacutes limitantes
son aquellos relacionados con la carencia de tecnologiacutea en los sistemas de produccioacuten y de
post-cosecha la alta dependencia de insumos agriacutecolas y el bajo nivel de acople entre el
sector primario y el de procesamiento industrial (MADR 2006) Desde el punto vista
fitosanitario el cultivo de la papa se ve afectado por diversos fitopatoacutegenos e insectos
plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la reemergencia de la enfermedad denominada
Sarna polvosa de la papa causada por el protozoario Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) Su efecto no solo se debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten
al deterioro en la calidad y apariencia cosmeacutetica de los tubeacuterculos que afecta draacutesticamente
su valor en el mercado Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus (PMTV)
uno de los problemas virales prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarentenario para diferentes paiacuteses del mundo (Santala et al 2010)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 de las cosechas en las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro (Solanum tuberosum) y
papa criolla (S phureja) (SINAIPA 2002) Por otra parte se estima que el PMTV puede
causar peacuterdidas hasta del 25 en este cultivo lo cual adicionado al dantildeo causado por Sss
pudiera generar disminuciones de 50-80 en la produccioacuten (Jones y Harrison 1972
Guerrero 1997 2000) Aunque se cree que este virus tiene como centro de origen los
Andes suramericanos no se ha establecido con certeza su efecto sobre el rendimiento de las
variedades alliacute cultivadas ni determinado claramente los siacutentomas que causa en sus
hospedantes (Salazar 1995) De esta forma no es frecuente encontrar la sintomatologiacutea
asociada a este virus reportada para la regioacuten templada que incluye amarillamiento foliar
2
anillos necroacuteticos y cuarteamiento o agrietamiento de tubeacuterculos y moteados foliares tipo
ldquoAucubardquo (Salazar 1995 Xu et al 2004)
Adicionalmente a esta problemaacutetica la diseminacioacuten de Sss se viene incrementando
dramaacuteticamente en el paiacutes como resultado de la deficiente calidad de la semilla utilizada
por la mayoriacutea de los agricultores la ausencia de variedades tolerantes a dicho patoacutegeno y
la carenciadeficiencia de asistencia teacutecnica estatal o gremial que no cuenta con
herramientas apropiadas para el diagnoacutestico asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla
libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011)
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la ausencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos o bioloacutegicos efectivos por lo
tanto requiere de un manejo fitosanitario especial al afectar directamente la semilla
inhabilitar los suelos dedicados al cultivo afectar la calidad cosmeacutetica del producto fresco y
ser transmisor del PMTV lo que genera una barrera cuarentenaria para la apertura de
nuevos mercados Por lo anterior el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado bajo
un esquema de manejo integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como
rotacioacuten de cultivos manejo adecuado del riego y drenaje sanidad del tubeacuterculo semilla
utilizacioacuten de organismos antagonistas (pe Trichoderma spp) utilizacioacuten de cultivos
trampa desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos estrictos de
certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas son
utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado del
manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o de
Rhizoctoniasis
El desarrollo de metodologiacuteas seroloacutegicas y moleculares pueden ser una importante
herramienta para el monitoreo y deteccioacuten de estos patoacutegenos en el paiacutes Se destacan para
Sss la teacutecnica de ELISA (Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas) con anticuerpos
policlonales y monoclonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
3
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Ward et al 2004 Qu et al
2011) Para el caso de PMTV tambieacuten se han utilizado teacutecnicas de deteccioacuten utilizando
plantas trampa ELISA RT-PCR (Retrotranscripcioacuten - Reaccioacuten en cadena de la
polimerasa) qPCR (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa en tiempo real) y microplatos de
hibridizacioacuten y microarreglos (Arif et al 1994 Nielsen y Moslashlgaard 1997 Jeffries 1998
Davey 2009 Latvala-Kilby et al 2009 Nakayama et al 2009) Sin embargo estas
teacutecnicas son de aplicacioacuten limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas o validadas con
base en los genotipos locales de ambos patoacutegenos presentes en las regiones cultivadoras de
nuestro paiacutes motivo por el cual es fundamental emprender un estudio amplio de los niveles
de variabilidad geneacutetica de Sss y PMTV en Colombia
Este trabajo responde a dicha necesidad En eacutel se realizaron colecciones de material vegetal
y suelo de cuatro zonas productoras de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo (Colombia) y se realizaron extracciones de ADN o ARN seguacuten el
caso para mediante teacutecnicas moleculares determinar las secuencias de diferentes regiones
informativas del genoma de cada patoacutegeno Una vez obtenidas y editadas las secuencias se
realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos para comparar y agrupar aislamientos colombianos con
respecto a los reportados para Sss y PMTV en el mundo y determinar sus niveles de
identidad geneacutetica
Este estudio pretende apoyar el desarrollo de programas de diagnoacutestico de Sss y PMTV
tanto en Colombia como en la regioacuten Andina La informacioacuten generada es importante para
desarrollar programas de deteccioacuten asintomaacutetica y temprana de ambos patoacutegenos como una
herramienta fundamental para implementar una base tecnoloacutegica que apoye los esquemas
cuarentenarios dirigidos a evitar la diseminacioacuten de los patoacutegenos hacia zonas libres de la
enfermedad la certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas de mejoramiento geneacutetico
que conduzcan a generar variedades resistentes a este patosistema
4
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GENERAL
Evaluar los niveles de variacioacuten geneacutetica de Spongospora subterranea y de su virus asociado
PMTV en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y
Narintildeo
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de S subterranea de cultivos de
papa de cuatro departamentos de Colombia a partir de secuenciacioacuten de las
regiones ITS del ADN ribosomal
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de PMTV de cultivos de papa de cuatro
departamentos de Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de la caacutepside y TGB2 del
genoma viral
Definir las afinidades filogeneacuteticas entre las variantes de S subterranea y PMTV
detectadas en Colombia con aislamientos de dichos patoacutegenos de diferentes paiacuteses
que presenten secuencias disponibles en las bases de datos moleculares
Ampliar el nivel de informacioacuten disponible sobre las secuencias de los segmentos
del genoma de aislamientos de PMTV en Colombia
5
3 MARCO TEOacuteRICO
31 Generalidades del cultivo de la papa
La papa es el tubeacuterculo maacutes importante que se produce en el mundo Se cultiva en maacutes de
125 paiacuteses y es consumido diariamente por maacutes de mil millones de personas En los paiacuteses
en desarrollo es un cultivo de fuerte expansioacuten con cientos de millones de personas que
dependen de eacutel para su supervivencia Los paiacuteses en desarrollo son los maacutes grandes
productores (e importadores) de papa y de sus productos derivados (FAO 2009) China se
ha convertido recientemente en el primer productor mundial de papa y junto a India
responden por la tercera parte de la produccioacuten global de este tubeacuterculo En Ameacuterica Latina
y Aacutefrica las cosechas presentaron un menor volumen pero el rendimiento se incrementoacute
significativamente Ameacuterica del Norte fue el mayor productor del continente con un
rendimiento de maacutes de 40 ton ha-1
(FAO 2008)
Ameacuterica del Sur es la cuna de la papa pero esta regioacuten presenta los niveles maacutes bajos de
produccioacuten con menos de 16 millones de toneladas para el antildeo 2007 En la regioacuten Andina
la mayoriacutea de los pequentildeos campesinos manejan el cultivo de forma tradicional y se
siembran variedades de papa que son poco comerciales y desconocidas para el resto del
mundo sin embargo en paiacuteses como Argentina Brasil Colombia y Meacutexico la produccioacuten
comercial de papa estaacute aumentando paulatinamente (FAO 2008)
En Colombia el cultivo de la papa participa con el 71 de la superficie sembrada en
cultivos transitorios y aporta cerca de 78 de la produccioacuten agriacutecola generando alrededor
de 69000 empleos directos principalmente en los departamentos de Cundinamarca
Boyacaacute Narintildeo y Antioquia (MADR 2009a) En el 2009 el aacuterea sembrada de papa fue de
128701 ha con una produccioacuten de 2272772 ton y un rendimiento de 184 ton ha-1
(MADR-ENA 2009) La participacioacuten departamental en la produccioacuten nacional se
encuentra distribuida de la siguiente manera Cundinamarca 378 Boyacaacute 263 Narintildeo
6
164 Antioquia 65 Santander 56 y otros departamentos participan con el 64
(MADR 2009b)
La papa es el producto de origen agriacutecola que tiene la mayor demanda en Colombia por
fungicidas e insecticidas y la segunda en demanda de fertilizantes despueacutes del cafeacute Es la
actividad que maacutes utiliza los servicios de transporte terrestre con maacutes de 2 millones de
toneladas al antildeo sin incluir la movilizacioacuten de los insumos requeridos para su produccioacuten
(MADR 2005)
Los cultivos de papa se encuentran distribuidos en climas friacuteos con temperaturas de 13ordmC y
alturas de 2000 msnm hasta alcanzar zonas de paacuteramo con alturas cercanas a los 3500
msnm y temperaturas de 8ordmC Geograacuteficamente las unidades de produccioacuten estaacuten
dispersas principalmente en las regiones friacuteas de la zona Andina bajo una variada gama de
condiciones biofiacutesicas econoacutemicas y sociales En teacuterminos generales alrededor del 75
del aacuterea cultivada con papa en el paiacutes se encuentra en zonas de topografiacutea quebrada y
ondulada (MADR 2005)
Seguacuten Villareal et al (2007) en el paiacutes existen alrededor de 30 variedades de papa
cultivada pero soacutelo 10 de eacutestas tienen importancia comercial La Parda pastusa es la
variedad maacutes cultivada y consumida en fresco le siguen la variedad Diacol Capiro
utilizada para consumo en fresco exportacioacuten y por la industria de alimentos como materia
prima La variedad ICA-Puraceacute es utilizada en algunas regiones de clima templado del paiacutes
para consumo en fresco la Tuquerrentildea o Sabanera que se consume principalmente en
Bogotaacute y la Criolla que se cultiva principalmente en los departamentos de Antioquia y
Cundinamarca En el paiacutes se han desarrollado nuevas variedades que han ingresado al
mercado como las variedades Esmeralda Rubi UNICA e ICA Morita que tienen altas
posibilidades comerciales en el corto plazo
Una de las principales limitantes teacutecnicas del cultivo de la papa corresponde a las plagas y
enfermedades Dentro de las enfermedades el tizoacuten tardiacuteo o gota causado por
Phytophthora infestans es la amenaza maacutes seria del cultivo Ademaacutes tambieacuten se presentan
el tizoacuten temprano (Alternaria solani) la rontildea (Rhizoctonia solani) la sarna comuacuten
7
(Streptomyces scabies) la palomilla o mortaja blanca (Rosellinia sp) las virosis (PVY
PVX PLRV PYVV PVS PMTV) y la sarna polvosa Esta uacuteltima enfermedad se ha
convertido en una de las principales problemaacuteticas de cultivo a nivel mundial (Harrison et
al 1997 Merz y Falloon 2009) Es causada por el protozoo Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) paraacutesito obligado de plantas superiores Esta enfermedad causa dantildeos
directos sobre las raiacuteces y tubeacuterculos y ademaacutes es vector del PMTV (Jones y Harrison
1969 Harrison et al 1997 Andersen et al 2002 Merz y Fallon 2009) enfermedad viral
que afecta este cultivo en varias regiones productoras de papa en el mundo
En Colombia el manejo de la enfermedad se basa en el uso de semilla certificada por el
Instituto Colombiano Agropecuario ICA la utilizacioacuten de variedades medianamente
tolerantes y la rotacioacuten entre estas variedades con cultivos no hospedantes del patoacutegeno
(Jaramillo y Botero 2007)
32 Generalidades de Spongospora subterranea fsp subterranea
321 Taxonomiacutea
Sss es el agente causal de la enfermedad denominada Sarna polvosa de la papa El primer
reporte de esta enfermedad data de 1841 en Alemania (Wallroth 1842) y a partir de esta
fecha su registro incluye todos los continentes (Harrison et al 1997 Merz 2008) Seguacuten
Lyman y Rogers (1915) el patoacutegeno es originario de los Andes Suramericanos desde donde
se dispersoacute gracias al mercado mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber
transcurrido mas de 150 antildeos desde su primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado
importancia en las uacuteltimas deacutecadas como resultado de la siembra generalizada de materiales
altamente susceptibles al patoacutegeno la utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los
cambios de eacutepocas de siembra hacia periacuteodos huacutemedos las deficiencias en los sistemas de
rotacioacuten de cultivos la falta de programas cuarentenarios y los altos estaacutendares exigidos por
el mercado en la calidad cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
8
Sss es un pseudohongo plasmodial que taxonoacutemicamente se ha ubicado en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos Spongospora subterranea f sp
subterranea y Spongospora subterranea f sp nasturtii definidos como forma especialis
son importantes patoacutegenos de vegetales (Merz y Falloon 2009) Dick (2001) propone que
dichos microorganismos corresponden a especies diferentes
322 Ciclo de vida Sss
Sss y otros plasmodiophorales se caracterizan por presentar zoosporas biflageladas (3-4 microm
diaacutemetro) de desigual tamantildeo con mastigonemes y posicioacuten opuesta que se liberan a partir
de las estructuras de resistencia (quistes) Los quistes (4 microm diaacutemetro) pueden sobrevivir en
el suelo por largos periacuteodos de tiempo y generalmente se encuentran agregados formando
estructuras denominadas quistosoros (hasta 85 microm diaacutemetro) CITA los cuales son esfeacutericos
u ovoides y presentan un centro vaciacuteo En Colombia observaciones realizadas por
Jaramillo y Peacuterez (2008) han determinado que los quistosoros de aislamientos procedentes
de suelos del municipio de La Unioacuten (Antioquia) oscilaron entre 50 y 120 microm Bajo
condiciones de humedad es frecuente la liberacioacuten de una zoospora uninucleada aunque se
cree que la germinacioacuten de los quistes responde a un patroacuten escalonado que garantiza la
generacioacuten de inoacuteculo infectivo por largos periodos de tiempo Una vez en el suelo las
zooporas se desplazan varios centiacutemetros y son atraiacutedas por los exhudados de las raiacuteces de
sus plantas hospedantes adherieacutendose enquistando y formando un tubo germinativo que
ejerce fuerza mecaacutenica para su penetracioacuten directa en la planta Posteriormente el patoacutegeno
desarrolla un plasmodio multinucleado con membrana simple y ausencia de pared celular
Eventualmente el plasmodio se cliva dando lugar a muacuteltiples zooesporangios cada uno de
los cuales puede generar hasta 8 zoosporas que son liberadas por un poro germinativo y
continuacutean con la infeccioacuten de otras ceacutelulas radiculares Estas zoosporas denominadas
secundarias son indistinguibles de las que inician la infeccioacuten (primarias) y ambas pueden
infectar lenticelas no suberizadas de tubeacuterculos comenzando a inducir el siacutentoma tiacutepico de
9
la sarna que toma apariencia corchosa a partir del desarrollo de una capa de proteccioacuten a
nivel del peridermo del tubeacuterculo Es frecuente ademaacutes que el patoacutegeno induzca hipertrofia
e hiperplasia en los tejidos afectados dando origen a las agallas y a las deformaciones
caracteriacutesticas de la enfermedad Al final del ciclo en los plasmodios se reorganiza su
contenido protoplasmaacutetico rodeaacutendo los nuacutecleos presentes de pared celular y generaacutendose
quistes que serviraacuten de inoacuteculo para sucesivas infecciones (Harrison et al 1997)
El ciclo de vida de Spongospora es diferenciado por Merz (2008) de acuerdo a la
ocurrencia de dos fases una fase esporogeacutenica y una segunda fase esporangial cada una
iniciada por la infeccioacuten de la ceacutelula hueacutesped a traveacutes de un plasmodio individual En la
fase esporangial numerosas zoosporas secundarias son formadas en el esporangio de
paredes delgadas en las ceacutelulas epidermales de la raiacutez y los pelos radicales del hueacutesped en
las cuales las zoosporas son formadas desde un plasmodio esporangiogeacutenico Las zoosporas
secundarias tambieacuten biflageladas pueden salir del hueacutesped e iniciar otro ciclo de infeccioacuten
La fase esporogeacutenica se presenta despueacutes de la divisioacuten nuclear dentro del plasmodio
esporogeacutenico El patoacutegeno produce esporas de reposo de pared gruesa las que son
altamente persistentes Cada espora de reposo libera una sola zoospora primaria
biflagelada
En Colombia Hoyos et al (2009) realizaron observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Sss encontrando plasmodios plasmodios enquistados plasmodios en
estado de divisioacuten ceacutelulas uacutenicas y quistosoros en raiacuteces de plantas de S tuberosum
asintomaacuteticas indicando que la infeccioacuten puede estar presente sin desarrollo evidente de
siacutentomas y que los quistosoros no son solamente las estructuras maacutes frecuentes en los
tejidos de los hospedantes afectados
10
323 Rango de hospedantes de Sss
Diversas investigaciones han encontrado la presencia de zoosporangios de Sss en plantas de
otras familias diferentes a la Solanaceae como Alzoaceae Apiaceae Asteraceae
Boraginaceae Brassicaceae Caryophyllaceae Chenopodiaceae Fabaceae Geraniaceae
Lamiaceae Plantaginaceae Papaveraceae Poaceae Polygonaceae Ranunculaceae
Rubiaceae Resedaceae Solanaceae y Urticaceae (Jones y Harrison 1969 Andersen et al
2002) Andersen et al (2002) encontraron diferentes tasas de infeccioacuten desarrolladas por el
patoacutegeno en especies como Artemisia vulgaris Cirsium arvense Chamomilla suaveolens
Chenopodium album Galium aparine Geranium pusillum Lapsana communis Matricaria
inodora Poa annua Polygonum avicular P convolvulus Rumex acetosa R acetosella
Solanum nigrum Sonchus arvensis Urtica urens y Viola tricolor lo que permitioacute
confirmar estas 17 especies como hospedantes de Sss
Aunque aparentemente Sss tiene un amplio rango de hospedantes el desarrollo de los
quistosoros nunca habiacutea sido observado en otros hospederos diferentes a S tubersosum Sin
embargo Qu y Christ (2006a) encontraron formacioacuten de quistosoros en seis especies de
plantas Solanum plycantum Dun Datura stramonium L Avena sativa L Dactylis
conglomerado L Solanum esculentum Mill y Brassica campestris L Esto indicoacute que el
patoacutegeno tiene la capacidad de completar su ciclo de vida en hospedantes alternos a las
plantas de papa lo que representa un aspecto epidemioloacutegico importante Asiacute mismo se
encontroacute que las siguientes especies tambieacuten son hospedantes del patoacutegeno Fagopyrum
esculentum Moench Phleum pratense L Raphanus sativus L Brassica napus L
Trifolium pratense L Secale cereale L Ambrosia artemisiifolia L Chenopodium album
L Amaranthus retroflexus L y Cyperus esculentus L Recientemente se ha encontrado
que el patoacutegeno puede producir agallas en S physalifolium y S nigrum y su patogenicidad
fue confirmada por inoculacioacuten a plantas de tomate (S esculentum) y de papa bajo
condiciones de invernadero (Shah et al 2010) Estos resultados tienen consecuencias para
el manejo de la enfermedad enfocado en cultivos de rotacioacuten porque se debe tener en
cuenta que existen especies cultivables y malezas que pueden albergar estructuras del
patoacutegeno y que el reporte de nuevas especies hospederas continua por ejemplo Sss causa
11
agallas en las raices de Solanum sarrachoide en donde puede completar su ciclo de vida y
producir nuevas generaciones de quistosoros que son infectivos a papa (Nitzan et al 2009)
324 Siacutentomas causados por Sss
Los siacutentomas de la enfermedad incluyen la induccioacuten de lesiones pustulosas corchosas con
centros polvosos formados a partir de la agregacioacuten de los quistosoros del patoacutegeno Con el
avance de estas lesiones es frecuente la ruptura del peridermo aunque el nivel de
penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente superficial Bajo condiciones oacuteptimas para el
desarrollo de la enfermedad es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten
de los tejidos y la formacioacuten de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la
enfermedad ademaacutes de causar los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular
de las plantas al inducir la formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas (Cotes et al
2006) que causan la disminucioacuten de la superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo a la
marchitez y finalmente a la muerte de las plantas Durante el almacenamiento la sarna
polvosa puede ocasionar pudriciones secas que sirven de entrada a otros patoacutegenos y
saproacutefitos que deterioran auacuten maacutes el producto (Agrios 1996) La infeccioacuten en las raiacuteces
especialmente cuando se forman agallas pueden causar una reduccioacuten en el funcionamiento
de la raiacutez por la interrupcioacuten de la toma de agua y de nutrientes (Lister et al 2004 Falloon
et al 2005)
En Colombia en los departamentos de Cundinamarca Boyacaacute Narintildeo y Antioquia Sss
afecta severamente las variedades de papa (Solanum tuberosum) Parda Pastusa y Diacol
Capiro y a la papa criolla (Solanum phureja) Los siacutentomas se observan en raiacuteces y
tubeacuterculos pero hay variacioacuten en las zonas paperas en cuanto a la distribucioacuten de los
siacutentomas entre los diferentes oacuterganos de la planta En Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de
Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre los tubeacuterculos de las variedades Parda
Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el departamento de Narintildeo y en el Oriente de
Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces Hasta ahora no se sabe si estas diferencias
se deben a variaciones en las condiciones ambientales de una regioacuten a otra o quizaacutes se
12
deban a la distribucioacuten regional de diferentes razas del patoacutegeno yo a su interaccioacuten con el
ambiente (Jaramillo y Botero 2007)
En el Oriente Antioquentildeo se determinoacute la incidencia y el grado de severidad de 23
poblaciones de Sss bajo el sistema de rotacioacuten entre ICA Puraceacute-Diacol Capiro y viceversa
en tres cosechas sucesivas en condiciones de casa de malla Se observoacute que las poblaciones
del patoacutegeno no afectaron el peso ni causaron siacutentomas de sarna polvosa en los tubeacuterculos
pero si en las raiacuteces con diferentes grados de severidad en las dos variedades siendo maacutes
susceptible la variedad Diacol Capiro que al parecer favorecioacute el incremento del inoacuteculo
mientras que la ICA Puraceacute fue levemente afectada y posiblemente presentoacute efecto
supresivo sobre los quistosoros en el suelo (Jaramillo y Botero 2007)
Estudios realizados en el departamento de Narintildeo presentaron diferencias en el grado de
desarrollo de la enfermedad en raiacuteces La variedad Parda Pastusa fue la maacutes susceptible a
Sss con desarrollo de agallas desde el momento de la emergencia de las plantas La
enfermedad alcanzoacute valores de susceptibilidad del 100 en dicha variedad mientras que en
Diacol Capiro fue de 48 En los tubeacuterculos la enfermedad se manisfestoacute por la formacioacuten
de escasas y pequentildeas puacutestulas de color castantildeo con poca presencia de masas pulverulentas
de esporas de resistencia del patoacutegeno lo que contrasta con la regioacuten Cundiboyacense en
donde estas variedades se caracterizan por presentar una alta susceptibilidad a la rontildea en
tubeacuterculos ocasionando lesiones severas en las que resulta faacutecil encontrar esporas de
resistencia (Benavides 2006)
325 Control de Sss
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la carencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos efectivos (Qu y Christ
2006a) Seguacuten Harrison et al (1997) el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado
bajo un esquema integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como la
rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del tubeacuterculo semilla la
utilizacioacuten de organismos antagonistas (ie Trichoderma spp) la utilizacioacuten de cultivos
trampa la desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
13
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos de certificacioacuten de
semilla Dos estrategias que en la actualidad se consideran fundamentales para apoyar los
programas MIC en papa incluyen el mejoramiento geneacutetico por resistencia al pseudohongo
y la utilizacioacuten de cultivos trampa (Merz et al 2004)
Para el caso del mejoramiento los primeros reportes en la regioacuten Andina fueron
presentados por Torres et al (1995) quienes evaluaron 467 accesiones encontrando la
existencia de 17 genotipos resistentes y 33 moderadamente resistentes Por otra parte Lees
(2000) en Escocia evaluoacute los niveles de resistencia a Sss de una serie de clones de S
phureja encontrando que algunos de eacutestos presentaron un adecuado nivel de resistencia
por lo que esta especie fue propuesta como fuente de genes de resistencia Merz (2000) al
evaluar la reaccioacuten de 11 cultivares determinoacute que existe correlacioacuten entre las pruebas de
invernadero utilizando plaacutentulas provenientes de cultivo de tejidos y la resistencia
presentada en campo
Fallon et al (2003) realizaron un estudio en Australia con 99 cultivares de papa y 13
liacuteneas de mejoramiento durante 11 antildeos Sus resultados indicaron que el 21 de los
materiales evaluados eran resistentes mientras que el 28 presentoacute una resistencia
moderada Estos autores tambieacuten reportaron que la expresioacuten de la resistencia variacutea entre
antildeos y que los bioensayos realizados en invernadero no siempre se correlacionan con la
respuesta presentada en campo sugiriendo una fuerte interaccioacuten genotipo-ambiente para
esta caracteriacutestica
Nitzan et al (2010) evaluaron la estabilidad de la resistencia geneacutetica de 24 genotipos de
papa a Sss en los estados de Washington e Idaho en Estados Unidos Se identificoacute que la
resistencia era estable a la formacioacuten de agallas en las raiacuteces causada por Sss y se determinoacute
que una gran proporcioacuten de la variacioacuten fue geneacutetica lo que permite a los mejoradores usar
genotipos resistentes y estables de papa como progenitores en el desarrollo de cultivares
comerciales con resistencia a este patoacutegeno debido a que contar con materiales geneacuteticos
resistentes es una de las principales estrategias de manejo de la enfermedad (Rodriacuteguez et
al 2009 Houser y Davidson 2010)
14
Seguacuten Merz et al (2012) no existen meacutetodos de control eficientes y econoacutemicos que se
encuentren disponibles actualmente y la resistencia del hospedero es clave para el manejo
integrado de la enfermedad debido a esto se evaluaron 10 cultivares con diferentes rangos
de susceptibilidad a Sss y a PMTV en diferentes paiacuteses de Europa Para evitar discrepancias
en los criterios de evaluacioacuten se utilizoacute una escala estaacutendar para los niveles de la sarna
polvosa determinaacutendose que los cultivares se comportaron como estaba establecido en su
caracterizacioacuten inicial (a excepcioacuten de uno de ellos) Los resultados del ensayo de campo
indicaron que los diferentes meacutetodos de valoracioacuten son el principal factor de discrepancia
en las calificaciones de la resistencia y que las condiciones ambientales yo el nivel de
inoacuteculo del suelo juegan un papel menor
Otra estrategia con alto potencial para el manejo de la enfermedad es la rotacioacuten del cultivo
con plantas trampa que reducen el nivel de estructuras de resistencia de
plasmodiophoromycetes Por ejemplo es ampliamente conocido que la siembra de
Raphanus sativus reduce la cantidad de quistes de Plasmodiophora brassicae en el suelo
(Murakami et al 2000) mientras que la planta Datura stramonium redujo el nivel de Sss en
un 79 en cultivos de papa de Australia
En Colombia la buacutesqueda de herramientas para el manejo de la enfermedad bajo las
condiciones regionales de las zonas productoras de papa se enfoca en la evaluacioacuten de
sistemas de rotacioacuten de variedades comerciales que tradicionalmente se han considerado
altamente susceptibles a la enfermedad (ie Diacol Capiro) con variedades maacutes tolerantes al
ataque del patoacutegeno (ie ICA Puraceacute) encontraacutendose que efectivamente esta uacuteltima
variedad presenta un menor nivel de susceptibilidad a la sarna polvosa (Jaramillo et al
2003 Jaramillo y Botero 2007)
En cuanto al control bioloacutegico de Sss Gilchrist (2009) evaluoacute una cepa de Trichoderma
previamente considerada por Hoyos et al (2002) como potencialmente uacutetil para el control
bioloacutegico de Sss en la variedad Diacol Capiro Las pruebas fueron realizadas en campo
utilizando tres dosis de aplicacioacuten del biocontrolador Se encontroacute que la aplicacioacuten de T
asperellum T109 redujo un 64 y 54 los efectos de la sarna polvosa en el crecimiento y
15
en la produccioacuten de las variedades respectivamente De esta forma se resalta el potencial
de la cepa como biocontroladora contra Sss teniendo en cuenta que se debe ampliar el
conocimiento acerca de los factores que limitan la accioacuten de T asperellum T109 en el
campo y coacutemo compensarlo aumentando la frecuencia de aplicacioacuten En un trabajo similar
se investigoacute la influencia de cuatro aislamientos de T asperellum sobre la sarna polvosa en
tres tipos de suelo Andisol Entisol e Inceptisol No se encontraron diferencias
significativas entre las plantas de papa tratadas y no tratadas con T asperellum pero siacute se
encontroacute que la reduccioacuten del crecimiento y la produccioacuten estuvieron inversamente
asociadas con el contenido de Al2+
en los suelos sugiriendo que los efectos de la sarna
polvosa estaacuten fuertemente relacionados con las condiciones del suelo (Gilchrist et al 2009)
Estudios sobre la evaluacioacuten de estrategias de manejo de la rontildea polvosa en tres regiones
productoras de papa en Colombia han incluido resultados sobre la biologiacutea y patologiacutea de
Sss en la Sabana de Bogotaacute y sus hallazgos maacutes importantes consisten en la puesta en
marcha de un sistema de bioensayos en los cuales ha sido posible inducir la liberacioacuten de
zoosporas bajo condiciones de laboratorio Otros estudios incluyen la evaluacioacuten del efecto
de fungicidas aplicados al suelo para el manejo de Sss Sin embargo se determinoacute que
ninguno de los fungicidas evaluados (Tiabendazol Tolclofos metil Benomyl Carbendazin
Clorotalonil y Mancozeb) contribuyeron con el control del patoacutegeno en raiacuteces y tubeacuterculos
bajo las dosis y condiciones de tres localidades productoras de papa (Subachoque Medelliacuten
(Corregimiento Santa Elena) y Pasto) (Garciacutea y Navia 2002) En contraste Falloon et al
(2010) realizaron aplicaciones en campo del fungicida Mancozeb el cual contiene Zn y
Mn Las dosis estuvieron determinadas como baja similar y alta con respecto al contenido
de estos elementos en el suelo cultivado con papa cv Iwa (considerado muy susceptible a
Sss) Se encontroacute que niveles elevados de Zn y Mn generan infecciones moderadas de Sss
en las raiacuteces del cultivar evaluado de S tuberosum
Otras investigaciones para el manejo de Sss han incluiacutedo la evaluacioacuten de potenciales
biocontroladores (Trichoderma harzianum y Pseudomonas fluorescens) un consorcio de
micorrizas y viruta de pino como tratamientos Se encontraron diferencias estadiacutesticamente
significativas entre el testigo y P fluorescens y los tratamientos con T harzianum
16
micorrizas y viruta presentando una incidencia en raiacuteces de 32 21 y 5 3 y 1
respectivamente Los tratamientos con T harzianum micorriza y viruta tuvieron los
porcentajes de incidencia maacutes altos pero contrastaron con niveles muy bajos de severidad
de la enfermendad (022 0088 y 0019 respectivamente) Sin embargo no se
obtuvieron incrementos en peso seco de raiacuteces peso de tubeacuterculos y peso seco de la parte
aeacuterea cuando se realizaron las inoculaciones de los diferentes agentes de control y las
aplicaciones de la viruta de pino (Restrepo et al 2009)
Arias (2011) realizoacute un anaacutelisis y comparacioacuten de glucosinolatos presentes en diferentes
accesiones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control de
Sss Se estandarizaron los procedimientos de extraccioacuten del compuesto y las diferentes
formulaciones fueron probadas como biofumigante en el suelo donde posteriormente se
sembraron tubeacuterculos de papa criolla Sin embargo los resultados obtenidos no permitieron
establecer un posible potencial biofumigante de las accesiones evaluadas y es necesario
profundizar en los estudios que permitan determinar el efecto de los glucosinolatos y de
otros compuestos sobre el patoacutegeno
33 Deteccioacuten de Sss
La deteccioacuten del inoacuteculo a nivel del suelo es compleja y es evaluada precariamente a partir
de sistemas de trampeo que utilizan plaacutentulas de tomate (Merz 1989) o de papa (Wale et al
1993) Estas evaluaciones son criacuteticas para definir relaciones entre el grado de infestacioacuten
de los suelos y los niveles de enfermedad observados en el campo requisito fundamental
para la implementacioacuten de cualquier medida de control (Merz et al 2005)
Con el objetivo de buscar alternativas para alcanzar mayores rangos de sensibilidad en la
deteccioacuten de Sss se han explorado diversas metodologiacuteas basadas en teacutecnicas seroloacutegicas y
moleculares Entre las primeras se destacan la generacioacuten de anticuerpos policlonales que
detectan quistosoros del protozoo bajo un sistema ELISA (Harrison et al 1993 Walsh et
al 1996) Sin embargo la utilidad de estos anticuerpos es reducida debido a que no detecta
el estado plasmodial (Ward et al 2004) Maacutes recientemente Merz et al (2005)
desarrollaron una prueba para la evaluacioacuten rutinaria de la presencia del patoacutegeno basada
17
en anticuerpos monoclonales derivados de quistosoros como antiacutegenos alcanzando niveles
de sensibilidad de menos de un quistosoro por tubeacuterculo A partir de esto se generoacute la
herramienta ldquoSss AgriStriprdquo una prueba basada en un inmunoensayo de flujo lateral cuya
precisioacuten y sensibilidad fue evaluada por Bouchek-Mechiche et al (2011) para la
deteccioacuten de Sss Se comparoacute con teacutecnicas de microscopiacutea ELISA PCR y qPCR que
detectaron Sss en lesiones tiacutepicas de sarna polvosa Asiacute mismo se realizaron pruebas en los
lotes que presentaban lesiones tiacutepicas y atiacutepicas causadas por el patoacutegeno y se confirmoacute la
presencia de Sss en todas las lesiones con todos los meacutetodos probados Se concluyoacute que el
Sss AgriStrip es una prueba tan sensible como DAS- ELISA con un liacutemite de deteccioacuten de 1
a 10 quistosoros por mL de buffer
Con respecto a las metodologiacuteas moleculares se ha utilizado PCR convencional a partir de
los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 (Bulman y Marshall 1998) Sps1Sps2 (Bell et al
1999) y SsFSsR (Qu et al 2006) que amplifican las regiones ITS del ADNr
Los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 disentildeados por Bulman y Marshall (1998) detectaron
Sss en las muestras evaluadas y no presentaron reaccioacuten cruzada con otros
plasmodiophoridos como Spongospora subterranea f sp nasturtii Plasmodiophora
brassicae Sorosphaera veronicae y Polymyxa graminis asiacute como con el causante de la
sarna comuacuten Streptomyces scabies demostrando la utilidad de estos cebadores en la
deteccioacuten de Sss realizada por estos investigadores
Bell et al (1999) obtuvieron secuencias parciales del ITS de 391pb con los cebadores Sps
1 y Sps 2 para la deteccioacuten y cuantificacioacuten de Sss en la corteza tubeacuterculos lavados y
suelos cultivados con papa Las pruebas desarrolladas mostraron ser maacutes sensibles que los
inmunoensayos previamente reportados y fueron maacutes raacutepidas y sencillas que los ensayos
convencionales con plantas trampa
Qu et al (2006) utilizaron la teacutecnica de PCR para la identificacioacuten especiacutefica y
cuantificacioacuten de Sss Los cebadores SsF y SsR amplificaron un producto de 434 pb
proveniente de masas de esporas de Sss pero no se obtuvo el amplicoacuten cuando el ADN era
de papa sana de tubeacuterculos con sarna comuacuten o de otros plasmodiophoridos relacionados
18
Asiacute mismo se detectoacute Sss en otros hospederos infectados que no presentaban siacutentomas y se
concluyoacute que la prueba es tan sensible que puede detectar 1 quiste g-1
Adicionalmente con
esta teacutecnica se logroacute la cuantificacioacuten de Sss en el suelo logrando identificar valores de 1 a
104 quistosoros por 025 g de suelo
La implementacioacuten de meacutetodos para la deteccioacuten de Sss ha permitido el desarrollo de
procedimientos que permiten una raacutepida y automatizada extraccioacuten de ADN combinada
con PCR en tiempo real utilizando sondas Taqmanreg para avanzar en el diagnoacutestico
rutinario de la sarna polvosa (Lees et al 2002 van de Graff et al 2003 Ward et al 2004
Qu et al 2011) o PCR competitivo o cuantitativo (Qu et al 2006 Shah et al 2009) En esta
prueba se utiliza un control interno de ADN de papa (citocromo oxidasa) para hacerla maacutes
confiable y evitar falsos negativos La validacioacuten de dicha metodologiacutea se realizoacute a partir
de la evaluacioacuten de 37 muestras de tubeacuterculos de varios cultivares procedentes de diversas
localidades del Reino Unido La prueba detectoacute el patoacutegeno en todas las muestras que eran
sospechosas de tenerlo asiacute como en tubeacuterculos que no presentaban quistosoros observables
La prueba con la sonda Taqman demostroacute ser 100 veces maacutes sensible que la PCR
convencional (Ward et al 2005) y la ELISA (Ward et al 2004) Estas pruebas han
permitido determinar el efecto del nivel de inoacuteculo en el suelo y de algunos factores
ambientales en la infeccioacuten y desarrollo de agallas en raiacuteces de papa causadas por Sss (van
de Graaf et al 2007) En Gran Bretantildea la teacutecnica de PCR en tiempo real permitioacute detectar
confiablemente y establecer la cantidad de ADN de los quistorosos zoosporas y
plasmodiozoosporangios del patoacutegeno asiacute mismo se determinoacute la viabilidad de los quistes
en el suelo y en combinacioacuten con el uso de plantas trampa se estudioacute la liberacioacuten de
zoosporas y los niveles de infeccioacuten en papa bajo diferentes condiciones ambientales
permitiendo conocer con maacutes detalle varios aspectos de la epidemiologiacutea de la enfermedad
(Lees et al 2008)
Otras variaciones de estas teacutecnicas como la muacuteltiple qPCR utilizando sondas TaqManreg ha
permitido la deteccioacuten y diferenciacioacuten simultaacutenea de la sarna polvosa y la sarna comuacuten
dos enfermedades del tubeacuterculo que causan siacutentomas similares pero que son ocasionadas
por patoacutegenos diferentes (Sss vs Streptomyces spp) (Qu et al 2011) Finalmente como una
19
teacutecnica de diagnoacutestico simultaacuteneo de diferentes patoacutegenos de papa se ha desarrollado un
chip para su anaacutelisis en microarreglos siendo incorporada la deteccioacuten de Sss (Zhang et al
2008)
En Colombia la utilizacioacuten de meacutetodos de deteccioacuten de Sss en tubeacuterculos y suelos ha
estado dada por la evaluacioacuten visual de sintomatologiacuteas en raiacuteces y tubeacuterculos la
evaluacioacuten de bioensayos (Rodriacuteguez et al 2002) y la utilizacioacuten de PCR convencional
utilizando cebadores especiacuteficos (Jaramillo et al 2003 Carrentildeo 2009) Se han utilizado
combinaciones de diversos cebadores que permiten la amplificacioacuten de la regioacuten ITS del
ADNr del patoacutegeno (Spo1-Spo2 Spo8-Spo9 y Sps1- Sps2) los cuales permiten obtener
productos de 372 390 y 391 pb respectivamente (Saavedra et al 2004) Ramiacuterez (2010)
obtuvo amplificacioacuten de los fragmentos del tamantildeo esperado utilizando los cebadores
Spo8Spo9 y SsFSsR para analizar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de Sss
provenientes de La Unioacuten (Antioquia) encontrando una estructura clonal de los
aislamientos evaluados mientras que Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS
y SSCP (Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) con un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones del paiacutes establecioacute la presencia de subpoblaciones del
patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado
34 Variabilidad geneacutetica de Sss
La disponibilidad de cultivares resistentes a Sss debe ser una prioridad en el disentildeo de
futuras estrategias de manejo de la enfermedad Los mejoradores tratan de incluir
resistencia en los nuevos cultivares seleccionando liacuteneas contra un rango de patoacutegenos que
representan la diversidad geneacutetica conocida con el fin de seleccionar la resistencia maacutes
durable Sin embargo poco es conocido acerca de la variacioacuten geneacutetica de Sss o del papel
de la recombinacioacuten sexual en su ciclo de vida (Merz y Falloon 2009)
Los estudios geneacuteticos de Sss han sido difiacuteciles de aplicar debido a razones como las
siguientes obtener y mantener el patoacutegeno es complicado por su naturaleza de paraacutesito
obligado no han existido meacutetodos disponibles para el aislamiento de quistosoros
individuales el desarrollo de la sarna polvosa estaacute influenciado por condiciones
20
ambientales y los estaacutendares de inoculacioacuten y los cultivares de referencia no han sido bien
establecidos (Qu y Christ 2006b)
Los sistemas de deteccioacuten basados en aacutecidos nucleicos ofrecen sensibilidad y especificidad
para la cuantificacioacuten de inoacuteculo (Mutasa et al 1993) En estudios previos amplificando
regiones del ITS del ADNr fueron identificados dos agrupaciones de Sss en Australia y
Europa (tipo I y II) (Bulman y Marshall 1998) Posteriormente se realizoacute una
investigacioacuten sobre la variabilidad geneacutetica de 52 aislamientos de Islas Britaacutenicas y
Norteameacuterica que fueron amplificados por PCR Se identificaron dos grupos geneacuteticamente
diferentes (I y II) que representaron el 346 y el 654 de los aislamientos
respectivamente Sin embargo en Norteameacuterica los aislamientos soacutelo perteneciacutean al grupo
II (Qu y Christ 2004) Debido a que el anaacutelisis de secuencia de ITS se basa en un solo
locus para la deteccioacuten de la variacioacuten geneacutetica los anaacutelisis con marcadores moleculares
que comprendan diferentes partes del genoma del patoacutegeno son necesarios para obtener una
imagen amplia de la variacioacuten geneacutetica y estructura poblacional de Sss
El uso de marcadores moleculares tales como RAPDs (ADN polimoacuterfico amplificado al
azar) y AFLPs (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados) han sido
usados para estudiar la diversidad geneacutetica en muchos patoacutegenos de plantas sin embargo
tales marcadores no estaacuten disponibles para Sss Es complejo obtener estructuras
individuales del patoacutegeno y la uacutenica forma es la obtencioacuten de quistosoros que pueden traer
contaminantes secundarios o contener tejido de la planta Por lo tanto es difiacutecil obtener
ADN puro del patoacutegeno un paso indispensable para llevar a cabo la PCR basada en
marcadores moleculares (Qu y Christ 2006b)
Wuumlerzer (1964) caracterizoacute 17 colecciones de Sss de Europa y Ameacuterica seguacuten el tamantildeo
del quistosoro pero no encontroacute evidencia bioloacutegica significativa de este agrupamiento
Posteriormente se detectoacute variacioacuten geneacutetica (divergencia 51) en secuencias de ADN de
los ITS1 e ITS2 de colecciones de Sss originarias de diferentes continentes (Bulman y
Marshall 1998) Las colecciones de Australasia y Europa incluidas en el grupo II diferiacutean
de otra coleccioacuten de Escocia que fueacute ideacutentica a dos colecciones de Sur Ameacuterica agrupadas
21
en el tipo I La existencia de estos grupos fue confirmada por Qu y Christ (2004) quienes
tambieacuten identificaron ambos grupos en colecciones de Escocia pero demostraron que soacutelo
la secuencia de tipo II es de ocurrencia en colecciones de Canadaacute y Estados Unidos
Los marcadores RFLPs (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccioacuten) son
codominantes y locus especiacutefico (McDonald y Martiacutenez 1990) Han sido utilizados
ampliamente para evaluar diversos genomas de patoacutegenos de plantas A pesar de que
consumen maacutes tiempo que los meacutetodos basados en PCR los RFLPs son maacutes reproducibles
y menos sensibles a contaminacioacuten de ADN que las pruebas basadas en PCR Qu y Christ
(2006b) realizaron un estudio maacutes detallado de colecciones de quistosoros obtenidas de
Estados Unidos y Canadaacute empleando marcadores RFLPs Encontraron variacioacuten geneacutetica
entre las localidades geograacuteficas pero no entre los individuos de una misma localidad lo
que sugirioacute que las poblaciones del campo son clones y no estaban sometidas a
recombinacioacuten sexual El anaacutelisis de agrupamiento permitioacute separar los aislamientos en
dos grupos el grupo I que incluyoacute aislmientos del oeste de Norte Ameacuterica (exceptuando
aislamientos de Colorado) y el grupo II incluyoacute aislamientos originarios del este de Norte
Ameacuterica y de Colorado Este estudio muestra que el uso de marcadores moleculares para
diferenciar aislamientos de quistosoros individuales facilitaraacute investigaciones adicionales
para determinar la estructura geneacutetica de poblaciones de Sss
En Colombia Ramiacuterez (2010) realizoacute un estudio sobre la variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss de La Unioacuten Antioquia Encontroacute que los anaacutelisis de secuencias de la
regioacuten ITS del ADNr presentaron altos niveles de similitud con cepas obtenidas del
Departamento de Narintildeo asiacute como con secuencias de referencia de cepas del tipo II de Sss
Este resultado permitioacute plantear que el patoacutegeno presenta un comportamiento clonal
aunque es necesario obtener informacioacuten de otras regiones del genoma que permitan
realizar anaacutelisis de muacuteltiples loci que conduzcan a una mayor aproximacioacuten sobre las
condiciones de variacioacuten de este patoacutegeno en el paiacutes
Otro estudio realizado por Carrentildeo (2009) sobre la variabilidad geneacutetica de Sss en
Colombia mediante el anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr permitioacute establecer la
22
presencia de subpoblaciones del patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Se
encontroacute una asociacioacuten directa entre las secuencias ITS del patoacutegeno y el oacutergano de la
planta infectado El tipo de ITS I se asocia aparentemente con infecciones de tubeacuterculo y el
tipo de ITS II lo hace con infecciones de raiacutez Esta investigacioacuten permitioacute descartar la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar hospedero o zona
geograacutefica Sin embargo de acuerdo con esta investigacioacuten es necesario realizar pruebas
que aborden otras aacutereas del genoma para corroborar los resultados encontrados Asiacute mismo
se comproboacute que en el paiacutes existen variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las
reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno Tres
variantes geneacuteticas de las cinco encontradas en este estudio difieren de las reportadas en la
literatura mundial
35 Generalidades del Potato mop-top virus (PMTV)
El PMTV es el agente causal de una importante enfermedad viral del cultivo de la papa
cuya distribucioacuten se encuentra registrada en diferentes lugares productores de este
tubeacuterculo como Irlanda Inglaterra Escocia Republica Checa Suiza Noruega Suecia
Dinamarca y Finlandia (Santala et al 2010) asiacute como en Japoacuten (Nakayama et al 2010) En
Ameacuterica ha sido registrado en Canadaacute y Estados Unidos (Xu et al 2004) En eacuteste uacuteltimo
paiacutes se reportoacute recientemente en los estados de North Dakota (David et al 2010) y en
Washington (Crosslin 2011) Nuevos reportes de este virus se continuan presentado en
otros paiacuteses del mundo como Polonia (Budziszewska et al 2010)
En Ameacuterica Central se ha encontrado en Costa Rica (Montero-Astua 2008) y aunque se
considera que es originario de la regioacuten de los Andes (Surameacuterica) soacutelo fue detectado en
Colombia en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) con la reconfirmacioacuten de su presencia en el antildeo
2010 (Gil et al 2011) El PMTV puede causar peacuterdidas de hasta 26 en rendimiento lo
que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera ascender a valores de
50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 Guerrero 2000) Seguacuten Salazar (2006)
el PMTV es uno de los virus que ha sido prevalente en el cultivo de la papa en los Andes
23
suramericanos pero su efecto sobre las variedades cultivadas en esta regioacuten no se ha
cuantificado claramente
351 Taxonomiacutea de PMTV
El PMTV pertenece al geacutenero Pomovirus virus con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20
nm en diaacutemetro y tres partiacuteculas con longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm
El geacutenero Pomovirus deriva su nombre de la especie tipo Potato mop-top virus y
actualmente se ubica en el la familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Los anaacutelisis
filogeneacuteticos de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRps) indican que el PMTV
estaacute relacionado maacutes estrechamente con el Beet soil-borne virus (Pomovirus) Broad bean
necrosis virus (Pomovirus) y Soil-borne Wheat mosaic virus (Furovirus) (Savenkov et al
1999)
Contiene tres moleacuteculas de ARNss con tamantildeos de 64 kb 3 kb y 25 kb con caperuzas
hacia el extremo 5rsquo y una estructura tipo ARNt hacia el extremo 3rsquo (Savenkov et al 1999
2003) El coeficiente de sedimentacioacuten de las partiacuteculas es de 230 170 y 125S
respectivamente El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene motivos de
metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del codoacuten de
finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999) Cerca del extremo
3acutedel ARN 2 se presenta una proteiacutena asociada a la transmisioacuten por el vector y generada a
partir de la supresioacuten del codoacuten de terminacioacuten del ORF que codifica para la caacutepside (CP)
Esta proteiacutena parece ser la responsable de la peacuterdida de la estructura helicoidal en los
extremos del ARN durante el proceso de desensamblaje (Sandgren et al 2001) El ARN 3
codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Tres de las
proteiacutenas producidas (TGB1 TGB2 y TGB3) estaacuten involucradas en el movimiento ceacutelula a
ceacutelula (Zamyatnin et al 2004) La funcioacuten de la cuarta proteiacutena una proteiacutena rica en
cisteiacutena parece ser la de actuar en el incremento de la virulencia sin embargo no es
indispensable para el proceso infectivo (Lukhovitskaya et al 2005) (Figura 1)
24
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV En las cajas se observan las proteiacutenas
para las que codifica el genoma Las flechas indican las proteiacutenas originadas y los ARN
subgenoacutemicos (ARNsg) Fuente httpwwwexpasychviralzoneall_by_species643html
Modificado por Gallo (2012)
352 Ciclo de la infeccioacuten de PMTV
La especie PMTV es transmitida por zoosporas de Sss que afecta los sistemas radiculares
de sus hospedantes Este virus tambieacuten puede ser transmitido por semilla asexual El virus
puede permanecer en las estructuras de resistencia de sus vectores por varios antildeos en el
suelo (Astier et al 2007 Dijkstra y Khan 2006) En los ensayos de transmisioacuten del virus se
ha observado que eacuteste es transmitido eficientemente a plantas indicadoras (ej N tabacum y
N benthamiana) a partir de muestras de suelo infestadas con quistes del patoacutegeno
(Campbell 1996 Veacutelez 2007)
25
El PMTV constituye un pequentildeo grupo de virus que para su movimiento sisteacutemico en la
planta hospedante no requiere de la expresioacuten de CP ni de la formacioacuten del virioacuten
(McGeachy y Barker 2000) debido a que el TGB le ofrece la posibilidad de mover el ARN
infeccioso a traveacutes de largas distancias en la planta (Melander et al 2001) Actualmente se
generan nuevas teoriacuteas acerca del movimiento de TGB en la planta y de la funcioacuten de cada
una de las proteiacutenas TGBp1 TGBp2 y TGBp3 en el movimiento ceacutelula a ceacutelula de PMTV
Shemyakina et al (2011) analizaron la localizacioacuten subcelular y el transporte de TGBp1
de acuerdo con los resultados obtenidos propusieron que la asociacioacuten de TGBp1 con los
microtuacutebulos puede ser importante para la formacioacuten de cuerpos de complejos de ribo-
nuacutecleo-proteiacutena viral destinada para el transporte a traveacutes de los plasmodesmos Estudios
similares han sido realizados por Wright et al (2010) cuyos resultados sugieren que TGB1
en PMTV requiere interaccioacuten con componentes nucleolares y posiblemente con
microtuacutebulos para el movimiento viral de ARN de larga distancia
El ARN desnudo se puede encontrar en tubeacuterculos asintomaacuteticos y causar una infeccioacuten
secundaria para la siguiente temporada de siembra (McGeachy y Barker 2000) La
manifestacioacuten de los siacutentomas caracteriacutesticos de la enfermedad depende de la presencia de
los tres ARN en el tejido (Savenkov et al 2003)
353 Rango de hospederos de PMTV
En condiciones experimentales el virus puede infectar plantas de las familias
Chenopodiaceae Solanaceae y Tetragoniaceae Dentro de estas se encuentran las plantas
que se usan para su diagnoacutestico las cuales corresponden a Nicotiana debneyi y
Chenopodium amaranticolor en las que se produce necrosis sisteacutemica y lesiones locales
conceacutentricas cafeacutes respectivamente Nicotiana benthamiana N debneyi N clevelandii y
N tabacum son las especies maacutes apropiadas para el mantenimiento y propagacioacuten del virus
bajo condiciones experimentales (ICTVdB 2006 Veacutelez 2007)
26
354 Siacutentomas causados por PMTV
La enfermedad inducida por PMTV presenta una amplia gama de siacutentomas dependiendo de
la variedad y de las condiciones ambientales siendo frecuente la presencia de anillos y
arcos de colores oscuros sobre la superficie de los tubeacuterculos mientras que internamente se
presentan arcos necrosados En infecciones secundarias los tubeacuterculos pueden mostrar
agrietamientos reticulados y profundos Adicionalmente los foliacuteolos de las plantas
afectadas pueden presentar moteados cloroacuteticos y liacuteneas con formas de V En la regioacuten
Andina la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos no es frecuente de observar pudiendo ser
igualmente inducidas por cepas necroacuteticas de PVY oacute por Streptomyces spp y Rhizoctonia
solani (Tenorio et al 2006) A nivel aeacutereo el virus tambieacuten puede inducir amarillamientos
enanismos y acortamiento de entrenudos (Salazar 1995)
En Escocia se estudioacute el efecto de los siacutentomas foliares causados por PMTV sobre el
rendimiento del cultivo los siacutentomas foliares y en el tubeacuterculo de varias generaciones de
siembra para la propagacioacuten de semilla de papa Se encontroacute que en los tubeacuterculos de
plantas sin siacutentomas rara vez se observan los siacutentomas foliares en la siguiente generacioacuten
Las plantas asintomaacuteticas produjeron maacutes tubeacuterculos infectados cuando eran derivadas de
plantas que presentaron siacutentomas foliares el antildeo anterior Adicionalmente la proporcioacuten de
plantas hijas con siacutentomas foliares provenientes de tubeacuterculos con siacutentomas foliares
tuvieron un rango de 19-41 en el antildeo y parecioacute estar asociado con la severidad de dichos
siacutentomas Asiacute mismo el siacutentoma de ldquospraingrdquo en los tubeacuterculos tendioacute a ser mayor en
plantas que presentaban siacutentomas foliares comparados con aquellas asintomaacuteticas Estos
resultados mostraron que la erradicacioacuten de plantas con siacutentomas foliares podriacutea mejorar la
fitosanidad del cultivo pero resulta impraacutectico cuando las plantas enfermas son muy
frecuentes (Carnegie et al 2010) Sin embargo los siacutentomas foliares son raramente
observados en variedades cultivadas actualmente en los paiacuteses noacuterdicos con excepcioacuten de
Noruega La razoacuten para estas diferencias de la etiologiacutea de la enfermedad no son
comprendidas pero puede ser que el clima marino maacutes huacutemedo en Noruega y Escocia
afecta la fisiologiacutea de la planta de papa e incrementa la infeccioacuten sisteacutemica por PMTV
(Santala et al 2010)
27
36 Deteccioacuten de PMTV
Para la deteccioacuten de PMTV se han utilizado diversas teacutecnicas de laboratorio Las primeras
pruebas incluyeron bioensayos con plantas indicadoras como Chenopodium amaranticolor
las cuales desarrollan los siacutentomas cuando son infectadas por PMTV Esta teacutecnica resulta
informativa pero tarda alrededor de 14 diacuteas para la expresioacuten de siacutentomas que en
ocasiones no son completamente confiables (Jeffries 1998)
Con el desarrollo de las pruebas ELISA se hizo posible la deteccioacuten de PMTV en dos diacuteas
sin embargo la generacioacuten de falsos negativos debido a la distribucioacuten erraacutetica del virus en
la planta ha hecho que se cuestione dicha teacutecnica Arif y Torrance (1996) realizaron
estudios de deteccioacuten de PMTV en muestras de tubeacuterculos de tres cultivares de papa
concluyendo que la combinacioacuten de tejidos de tubeacuterculos en la muestra incrementa la
probabilidad de deteccioacuten del virus En Dinamarca la utilizacioacuten de la teacutecnica DAS -
ELISA (Sandwich de anticuerpos doble - Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas)
tuvo alta confiabilidad para el seguimiento de la presencia de PMTV en 23 cultivares de
papa sembrados en campo (Nielsen y Moslashlgaard 1997)
La utilizacioacuten de teacutecnicas basadas en aacutecidos nucleicos ha llevado al desarrollo de meacutetodos
de deteccioacuten de alta sensibilidad La RT-PCR es uno de estos meacutetodos de deteccioacuten maacutes
sensible Arif et al (1994) compararon la confiabilidad de ELISA y RT-PCR en la
deteccioacuten de PMTV de raiacuteces y hojas de plantas trampa de Nicotiana debneyi Luego de
tres semanas de siembra la RT-PCR detectoacute el virus en ambos tejidos mientras que con
ELISA se obtuvo la deteccioacuten del virus soacutelo despueacutes de cinco semanas de la siembra A
pesar de que la teacutecnica RT-PCR es maacutes sensible la preparacioacuten de las muestras para este
meacutetodo lleva maacutes tiempo por lo tanto ELISA es considerada por algunos investigadores
como la teacutecnica maacutes econoacutemica y conveniente para el anaacutelisis rutinario de grandes
cantidades de muestras (Davey 2009)
Davey (2009) realizoacute estudios de deteccioacuten y cuantificacioacuten de PMTV utilizando qRT-
PCR y disentildeando un par de cebadores y una sonda para cada ARN del genoma del virus El
bioensayo desarrollado para las muestras de suelo fue muy efectivo en la deteccioacuten de
28
PMTV utilizando Solanum esculentum cv Monkeymaker como planta trampa y cuando se
usoacute en conjunto con qRT-PCR los resultados se obtuvieron maacutes raacutepidamente que los de
otros bioensayos previamente descritos por Arif et al (1994) quienes utilizaron
Chenopodium quinoa como planta trampa
Otros meacutetodos basados en RT-PCR han sido empleados en Japoacuten por Nakayama et al
(2010) mediante microplacas de hibridizacioacuten RT-PCR (RT-PCR-MPH) para la deteccioacuten
de PMTV con cebadores especiacuteficos y una sonda marcada en muestras provenientes de
raiacuteces de plantas de tomate Asiacute mismo el diagnoacutestico en muestras de suelo utilizando este
meacutetodo determinoacute que el 612 de los lotes muestreados estaban infectados con PMTV
La hibridizacioacuten especiacutefica basada en amplificacioacuten con cebadores con marcadores
fluorescentes (Flash-PCR) tambieacuten ha sido una teacutecnica basada en PCR que ha permitido la
deteccioacuten raacutepida y precisa de diferentes virus de la papa como el PMTV (Ryazantsev y
Zavriev 2009) De otro lado los microarreglos con sondas especiacutefica para virus pueden
detectar un nuacutemero casi ilimitado de especies de virus en un solo ensayo Nicolaisen
(2011) realizoacute un estudio de microarreglos con la utilizacioacuten de 152 sondas potencialmente
capaces de detectar 52 virus en papa (incluyendo PMTV) Las hibridizaciones del ADNc de
plantas infectadas mostraron que 49 de los 52 virus fueron positivos e identificados
correctamente a nivel de especie demostrando que esta teacutecnica puede contribuir a la
construccioacuten de microarreglos geneacutericos capaces de detectar la mayoriacutea sino todos los
virus de ARN de plantas
En Colombia la deteccioacuten de PMTV fue reportada por primera vez por Veacutelez (2007) Los
ensayos de RT-PCR permitieron determinar que el 81 de los suelos muestreados en el
estudio presentaron infeccioacuten por PMTV Este meacutetodo utilizando los cebadores H360
C819 fue maacutes sensible para la deteccioacuten de PMTV que la induccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras En estos bioensayos se encontroacute que las plantas de N tabacum fueron mejores
indicadoras de la expresioacuten de siacutentomas que las de N debneyi pero estas uacuteltimas son maacutes
sensibles para la deteccioacuten de PMTV por RT-PCR
29
Gil (2010) realizoacute la evaluacioacuten de la presencia del virus PMTV a partir de plantas de N
benthamiana inoculadas con quistosoros de Sss mediante pruebas de deteccioacuten seroloacutegica y
molecular Un total de 18 muestras de raiacuteces infectadas con Sss fueron evaluadas
encontraacutendose que cinco muestras de Antioquia y una de Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo
arrojaron resultados positivos en las pruebas de ELISA Al comparar estos resultados con
los obtenidos con qRT-PCR se encontroacute que la prueba de qRT-PCR determinoacute la presencia
del virus en el 45 de las muestras analizadas mientras que mediante ELISA y RT-PCR
convencional se diagnosticaron 25 y 28 de las muestras como positivas Sin embargo el
anaacutelisis estadiacutestico no indicoacute diferencias significativas al nivel del 95 entre las tres
pruebas analizadas Al observar individualmente la capacidad de las pruebas para detectar
PMTV resultoacute llamativo el hecho que algunas muestras fueran positivas para dos de las
tres pruebas e incluso se presentaron casos en los que la prueba de ELISA detectoacute el virus
pero no las pruebas basadas en RT-PCR lo cual sugirioacute problemas con la inhibicioacuten de las
reacciones enzimaacuteticas o con los cebadores empleados
37 Variabilidad geneacutetica de PMTV
A nivel mundial se han desarrollado investigaciones que reportan la presencia de bajos
niveles de variacioacuten entre genotipos de PMTV (Mayo et al 1996) Latvala-Kilby et al
(2009) caracterizaron el gen de la CP y un dominio de lectura continua del ARN 2 asiacute
como el gen 8K y la regioacuten no traducida 3acutedel ARN 3 (UTR) de 37 aislamientos de
Finlandia y Letonia Fueron encontrados dos tipos diferenciables de ARN 2 y ARN 3 La
secuenciacioacuten y los anaacutelisis de RFLP de los productos de PCR de dichas regiones
indicaron que la mayoriacutea de los aislamientos de PMTV que infectaron tubeacuterculos en estos
paiacuteses europeos comprenden los restrictotipos ARN 2-II y ARN 3-B
En estudios previos en los cuales las secuencias CP de tres aislamientos de Escocia y ocho
de Peruacute fueron analizadas por Mayo et al (1996) las cepas bajo anaacutelisis mostraron poca
variabilidad De forma similar las secuencias CP de seis aislamientos de Norteameacuterica
presentaron una identidad mayor al 97 con respecto a algunas secuencias de aislamientos
de PMTV de Europa (Xu et al 2004) En Dinamarca se reportoacute la presencia de dos grupos
30
de PMTV basado en anaacutelisis de las secuencias de CP encontrando que eacutestos comparten
98 de identidad pero con posibles diferencias en la reproduccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras (Nielsen y Nicolaisen 2003) Al parecer la variabilidad geneacutetica de los genes
de la CP en aislamientos de PMTV del norte de Europa y Norte Ameacuterica es limitada y
permite la deteccioacuten confiable del virus con los anticuerpos monoclonales y los cebadores
de la PCR usados actualmente (Santala et al 2010)
En Colombia Velez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo con alta identidad con aislamientos de Europa
y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por aislamientos colombianos Una
situacioacuten similar encontroacute Gil (2010) con aislamientos Colombianos de PMTV que
presentaron una estructura poblacional con bajos niveles de variabilidad pero con algunas
variantes divergentes con respecto a los genotipos de referencia mundial Dichas variantes
presentaron diferencias en sus secuencias de CP hasta del 24 con respecto al grupo
principal La contextualizacioacuten en el genoma viral de dos secuencias obtenidas por dicho
autor en cepas de PMTV del departamento de Antioquia indicoacute que se tratan de
aislamientos representativos del genoma ordinario de PMTV y no de las variantes
encontradas en el anaacutelisis filogeneacutetico Sus identidades para las porciones del ARN 2 y
ARN 3 secuenciadas fueron altas (gt97) con respecto a los genomas reportados en
trabajos anteriores (Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) por lo que se plantea la
necesidad de secuenciar dichas regiones en al menos un aislamiento de las variantes
referidas
Los resultados encontrados en esta investigacioacuten permiten plantear que el caso de PMTV
en Colombia es aparentemente singular dada la presencia de dos variantes geneacuteticas de los
altos niveles de infeccioacuten que genera Sss en cultivos de papa de diferentes departamentos y
de las diferencias notables en la manifestacioacuten de siacutentomas de la sarna polvosa entre
variedades locales (Carrentildeo 2009 Gilchrist et al 2009 Gil 2010) situacioacuten que amerita
continuar con los estudios de variabilidad geneacutetica y fenotiacutepica en dichos patosistemas
31
BIBLIOGRAFIA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Agrios GN 1996 Fitopatologiacutea Editorial Limusa Meacutexico
Andersen BAB Nicolaisen M Nielsen SL 2002 Alternative hosts for Potato mop-top
virus genus Pomovirus and its vector Spongospora subterranea Potato Research 45 37-
43
Arias CMM 2011 Anaacutelisis y comparacioacuten de los glucosinolatos presentes en diferentes
acceciones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control
del patoacutegeno de la papa Spongospora subterranea Tesis de Maestriacutea en Ciencias Quiacutemicas
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Departamento de quiacutemica
Bogataacute Colombia
Arif M Torrance L Reavy B 1994 Improved efficiency of detection of potato mop- top
furovirus in potato tubers and in the roots and leaves of soil-bait plants Potato Research
37 373-381
Arif M Torrance L 1996 Detection of Potato mop-top virus in potato tubers Proceedings
Crop Protection in Northern Britain 325-330
Astier S Albouy J Maury Y Robaglia C Lecoq H 2007 Principles of plant virology
genome pathogenicity virus ecology Science Publishers Enfield NH USA P 112
Bell KS Roberts J Verral S Cullen DW Williams NA Harison JG 1999 Detection and
quantification of Spongospora subterranea fsp subterranea in soils and on tubers using
specific primers PCR primers European Journal of Plant Pathology 105905-915
Benavides PJA 2006 Incidencia y severidad de la rontildea de la papa causada por
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh f sp subterranea Tomlinson en raiacuteces y
tubeacuterculos de Diacol Capiro y Parda Pastusa en tres eacutepocas de siembra en el departamento
32
de Narintildeo y su efecto en los rendimientos (Tesis de maestriacutea) Bogotaacute Colombia Facultad
de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid diagnostic
test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European Journal of Plant
Pathology 131 (2) 277-287
Budziszewska M Wieczorek P Nowaczyk K Borodynko N Pospieszny H Obrecircplaska-
Stecircplowska A 2010 First report of potato mop-top virus on potato in Poland Plant
Disease 94 (7) 920
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47759-766
Campell RN 1996 Fungal transmission of plant viruses Annuals Review of
Phytopathology 3487-108
Carnegie SF Cameron AM McCreath M 2010 Foliar symptoms caused by Potato mop-
top virus on potato plants during vegetative propagation in Scotland and their association
with tuber yield spraing and tuber infection Potato Research 53 83-93
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia (Tesis de Maestriacutea) Bogotaacute
Colombia Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Colombia
Cerovska N Pecenkeva T Filigarovaacute M Dedic P 2007 Sequences analysis of the Czech
Potato Mop-Top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica 52(1) 61-
64
Cotes J Jaramillo S Gonzaacutelez L 2006 Evaluacioacuten de la incidencia de sarna polvosa en
tres variedades de papas colombianas Congreso Internacional de papa John S
Niederhauser Meacutexicop O-7 ISBN 968-02-0270-4
33
Crosslin JM 2011 First report of potato mop-top virus on potatoes in Washington State
Plant Disease 95 (11)1483
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
David N Mallik I Crosslin JM Gudmestad NC 2010 Firt report of Potato mop-top virus
in North Dakota Plant Disease 94 (12)1506
Dick MW 2001 Straminipilous fungi systematic of the Peronosporomycetes including
accounts of the marine straminipilous protist the plasmodiophorids and similar organisms
Kluwer Dordrecht
Dijkstra J Khan JA 2006 Handbook of Plant Virology Haworth Press Inc New York
US Jawaid A Khan Jeanne Dijkstra editors P 452
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC Scott CL 2010 Elevated zinc and manganese
levels give moderate reductions in Spongospora subterranea infection of potato roots In
Proceedings 6th Australasian Soilborne Diseases Symposium Twin Waters Queensland 9-
10 August 2010 P 46
Falloon RE Russell AG Wallace AR Butler RC 2003 Susceptibility of potato (Solanum
tuberosum) cultivars to powdery scab (caused by Spongospora subterranea) and
relationships between tuber and root infection Australasian Plant Pathology 32377-385
FAO 2008 Antildeo internacional de la papa (Citado 14 enero 2011) Disponible en
httpwwwpotato2008orgesmundoamerica_latinahtml
FAO 2009 Sustainable potato production Guidelines for developing countries (Citado 14
enero 2011) Disponible en ftpftpfaoorgdocrepfao012i1127ei1127epdf
34
Gallo GYM 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea Facultad de Medicina Universidad Nacional de Colombia
Bogotaacute Colombia
Garciacutea C Navia E 2002 Evaluacioacuten de estrateacutegias de manejo de la rontildea polvosa
(Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en Colombia
(Citado 14 Ene 2011) Disponible en
httpwwwredepapaorgpracticasculturalesred3html
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Gil RJF Mariacuten M 2010 Diagnoacutestico y caracterizacioacuten molecular de virus asociados al
cultivo de la papa en Colombia con eacutenfasis en el virus Mop Top (PMTV Pomovirus)
(Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia
Gilchrist RE 2009 Alternativas para el manejo integrado de la sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) (Tesis de Doctorado) Medelliacuten Colombia
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia
Gilchrist E Jaramillo S Reynaldi S 2009 Efecto sobre la sarna polvosa de cuatro
aislamientos del hongo Trichoderma asperellum en tres tipos de suelo Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 624783ndash4792
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
35
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tuber by enzyme-linked immunosorbent assay Plant pathology
42181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato-a review
Plant pathology 461-25
Hoyos L Peacuterez JC Jaramillo S Orduz S Ntildeustez C 2002 Evaluacioacuten del efecto de
Trichoderma spp sobre Spongospora subterranea en papa variedad Diacol Capiro bajo
condiciones de invernadero Subproyecto 4 de Evaluacioacuten de las estrategias de manejo de la
rontildea polvosa (Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en
Colombia 2002 Disponible en wwwcevipapaorgco
Hoyos CL Villegas OM Gonzalez JEP 2009 Observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Spongospora subterranea f sp subterranea en papa Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 62(2) 5039-5045
Houser AJ Davidson RD 2010 Development a greenhouse assay to evaluate potato
germplasm for susceptibility to powdery scab American Journal of Potato Research 87
285-298
ICTVdB 2006 Management Potato mop-top virus The Universal Virus Database version
4 Buumlchen-Osmond C (Ed) Columbia University New York USA (Citado 20 Dic 2010)
Disponible en httpwwwncbinlmnihgovICTVdbICTVdB00086001001htm
Jaramillo S Calderoacuten H Narvaacuteez C Machuca A Afanador L Hincapieacute L Correa G 2003
Caracterizacioacuten de la variabilidad patogeacutenica y molecular de Spongospora subterranea
Informe final fase 2 Convenio Universidad Nacional Sede Medelliacuten y CEVIPAPA
Medelliacuten p 80
Jaramillo S Gonzaacutelez L Cotes J 2006 Efecto del tipo de suelo sobre la sarna polvosa
causada por Spongospora subterranea f sp subterranea (Wall) Lagerheim en papa
36
Congreso Internacional de papa John S Niederhauser Meacutexico p O-6ISBN 968-02-0270-
4
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos cultivares de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista de la Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 60(2)
3859-3876
Jaramillo VS Peacuterez AGA Hoyos CLM 2008 Variacioacuten morfoloacutegica de quistosoros de
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh fsp subterranea Revista Facultad de
Agronomiacutea ndash Medelliacuten 61(2)4511-4517
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Jones RAC Harrison BD 1969 The behaviour of Potato mop top virus in soil and
evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wall) Lagerh Annals Applied
Biology 63 1-17
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 71 47-57
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003 First
Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease 87872
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99(5)519-531
Lees AK 2000 Summary of the session on past and present research on powdery scab
Past and present Research Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery
scab Workshop Aberdeen Scottland July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) P 55-57
37
Lees AK van de Graaf P Cullen DW Duncan JM 2002 The development of a
quantitative real-time PCR assay for Spongospora subterranea f sp subterranea and its
use in epidemiological studies In Proceedings of the 5th
symposium of the international
working group on plant viruses with fungal vectors Institute of Plant Science Swiss
Federal Institute of Technology (ETH) Zurich Switzerland July 22-25 2002 P31
Lees AK van de Graaf P Wale S 2008 The identification and detection of Spongospora
subterranea and factors affecting infection and disease American Journal of Potato
Research 85 247-252
Lister RA Falloon RE Curtin D Butler C 2004 Spongospora subterranea reduces host
(Solanum tuberosum) growth Proceedings of 3rd
Australasian Soilborne Diseases
Symposium Barossa Valley South Australia 9-11 February 2004
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization and
effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal of
General Virology 862879-2889
Lyman GR Rogers JT 1915 The native habitat of Spongospora subterranea Science
42940-2
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2005 La cadena de la papa en
Colombia Una mirada a su estructura y dinaacutemica 1991-2005 Documento de trabajo Ndeg 54
(Citado 13 Ene 2011) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet2005112163731_caracterizacion_papapdf
MADR (Ministerio de agricultura y desarrollo rural) 2006 Observatorio agrocadenas
Colombia Documento de trabajo No 100 La cadena de la papa en Colombia Una mirada
global de su estructura y dinamica 1991-2005 (Citado 20 Dic de 2011) Disponible en
httpwwwagrocadenasgovco
38
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009a Memorias 2008- 2009
(Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwminagriculturagovcoarchivosmemorias_minagricultura_2009_completopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009b Anuario estadiacutestico del
sector agropecuario y pesquero Direccioacuten de poliacutetica sectorial Grupo sistemas de
informacioacuten Bogotaacute DC (Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwhtm3bpublicanuarioanuariopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural)ndashENA (Encuesta Nacional
Agropecuaria) 2009 Oferta Agropecuaria cifras 2009 (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet201046112648_RESULTADOS_ENA_200
9pdf
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C Salazar
LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top virus
from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
McDonald BA Martinez JP 1990 Restriction fragment length polymorphisms in Septoria
tritici occur at a high frequency Current Genetics 17133-138
McGeachy KD Barker H 2000 Potato mop-top virus RNA can move long distance in the
absence of coat protein Evidence from resistant transgenic plants Molecular Plant
Microbe Interactions 13125-128
Melander M Lee M Sandgren M 2001 Reduction in Potato mop-top virus accumulation
and incidence in tubers of potato transformed with a modified triple gene block gene of
PMTV Molecular Breeding 8197-206
Merz U 1989 Infectivity inoculum density and germination of Spongospora subterranea
resting spores a solution culture test system Bulletin OEPP 19 585-592
39
Merz U 2000 Powdery scab Research in Switzerland Past and present Research
Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery scab Workshop Scottland
July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) 2000 p 67-71
Merz U 2008 Powdery Scab of PotatomdashOccurrence Life Cycle and Epidemiology
American Journal of Potato Reserch 85241ndash246
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar
x environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Merz U Martiacutenez V Schwaumlrzel R 2004 The potencial for the rapid screening of potato
cultivars (Solanum tuberosum) for resistance to powdery scab (Spongospora subterranea)
using a laboratory bioassay European Journal of Plant Pathology 110 71-77
Merz U Walsh JA Bouchek-Mechiche K Oberhaumlnsli TH Bitterlin W 2005 Improved
immunological detection of Spongospora subterranea European Journal of Plant
Pathology 111371ndash379
Merz U Falloon RE 2009 Review Powdery scab of potato-increased knowledge of
pathogen biology and disease epidemiology for effective disease management Potato
Research 5217-37
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert HR 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar x
environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Montero-Astua M Vasquez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
40
Murakami H Tsushima S Akimoto T Murakami K Goto I Shishido Y 2000 Effects of
growing leafy daikon (Raphanus sativus) on populations of Plasmidiophora brassicae
(clubroot) Plant Pathology 49584-589
Mutasa ES Ward E Adams MJ Collier CR Chwarszcynska D Asher MJC 1993 A
sensitive DNA probe for the detection of Polymyxa betae in sugar beet roots Physiological
and Molecular Plant Pathology 43 379-390
Mutasa-Gottgens ES Chwarszczynska Halsey H Asher MJC 2000 Specific polyclonal
antibodies for the obligate plant parasite Polymyxa a targeted recombinant DNA approach
Plant Pathology 49276-87
Nakayama T Maoka T Hataya T Motoshige S Fuwa S Mori M 2010 Diagnosis of
Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-285
Nicolaisen M 2011 An oligonucleotide-based microarray for detection of plant RNA
viruses Journal of Virological Methods 173 137-143
Nielsen SL Moslashlgaard JP 1997 Incidence appearance and development of potato mop-top
furovirus-induced sprain in potato cultivars and the influence on yield distribution in
Denmark and detection of the virus in tubers by ELISA Potato Research 40101-110
Nielsen S Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups within
Potato mop-top virus Archives of Virology 148381ndash388
Nitzan N Boydston R Batchelor D Crosslin J Brown C 2009 Hairy nightshade is an
alternative host of Spongospora subterranea the potato powdery sacab pathogen
American Journal of Potato Research 86 297-303
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
41
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006a The host range of Spongospora subterranea f sp subterranea in
the United States American Journal of Potato Research 83343-347
Qu XS Christ BJ 2006b Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea fsp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Ramiacuterez GJG 2010 Variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp subterranea
en suelos del municipio de unioacuten cultivados con la coleccioacuten Central colombiana de
Solanum phureja (Tesis de Pregrado) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias
Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia 2010
Restrepo DAF Jaramillo VS Cotes TJM 2009 Efecto de dos microorganismos y un
consorcio de micorrizas en combinacioacuten con viruta de pino sobre el control de sarna
polvosa (Spongospora subterranea) en papa Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea
Medelliacuten 62(2) 5047-5054
Rodriacuteguez K Maldonado Y Murcia L Huertas W Vaacutesquez M Zambrano A Rivero R
Garciacutea C 2002 Evaluacioacuten de protocolos para la deteccioacuten de patoacutegenos del suelo en Papa
(Rhizoctonia Rosellinia y Spongospora) (Citado 15 Ene 2011) Disponible en
httpwwwtodopapacomarpdfprotocolospdf
42
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista Facultad Agronomiacutea 26 (4) Caracas
Ryazantsev DYu Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato plant pathogens Applied Molecular Biology 43(3) 515-523
Saavedra SCO Goacutemez GST Aacutengel DJE 2004 Deteccioacuten de secuencias especiacuteficas de
ADN de Spongospora subterranea en suelo y tubeacuterculos de papa Revista Colombiana de
Biotecnologiacutea 714-23
Salazar LF1995 Los virus de la papa y su control Centro Internacional de la Papa CIP
(Peruacute) Publicado por el Centro Internacional de la Papa P 226
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 49 43-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M Wieczorek
P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-Wiśniewska J Yin Z
Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E Taluntytė L Pūpola N
Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E Sozonov A Tikhonovich I
Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam G Valkonen JPT 2010 Detection
distribution and control of Potato mop-top virus a soil-borne virus in northern Europe
Annals of Applied Biology 157163-178
43
Savenkov EI Sandgren M Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003 Potato
mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich protein are
dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of General
Virology 841001-1005
Shah FA Falloon RE Bulman SR 2010 Nightshade weeds (Solanum spp) confirmed as
hosts of the potato pathogens Meloidogyne falax and Spongospora subterranea f sp
subterranea Australasian Plant Pathology 39 492-498
Shah FA Falloon RE Lister RA Butler RC McKay A Ophel-Keller K Khan I 2009
Relationships between Spongospora subterranea DNA in field soil and powdery scab in
harvested potatoes Conference Handbook 17th
Australasian Plant Pathology Society
Conference (APPS) 29 September-1 October 2009 P 148
Shemyakina EA Sclovyev AG Leonova OG Popenko VI Schiemann J Morozov SY
2011 The role of microtubule association in plasmodesmal targeting of potato mop-top
virus movement protein TGBp1 The Open Virology Journal 51-11
SINAIPA (Sistema nacional de informacioacuten de papa) 2002 La rontildea de la papa p 8-9 El
Correo de la Papa Boletiacuten mensual No 07 Colombia (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en wwwcevipapaorgcopublicacionespublicacionesphp
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Reserch 83423-31
Torres H Pacheco MA French ER 1995 Resistance of potato to powdery scab
(Spongospora subterranea) under Andean field conditions American Potato Journal
10355-363
44
van de Graff PV Lees AK Cullen DW Duncan JM 2003 Detection and quantification of
Spongospora subterranea soil water and tissue samples using real-time PCR European
Journal of Plant Pathology 109 589-597
van de Graff P Wale SJ Lees AK 2007 Factors affecting the incidence and severity of
Spongospora subterranea infection and galling in potato roots Plant Pathology 56 1005-
1013
Veacutelez B 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato mop- top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia (Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Nacional de Colombia
Villareal HJ Porras PD Santa A Lagoeyte J Muntildeoz D 2007 Costos de produccioacuten de
papa en las principales zonas productoras de Colombia Federacioacuten Colombiana de
productores de papa FEDEPAPA
Wale SJ Burgess PJ Burnett F 1993 Bioassay for Spongospora subterranea detection in
soil and its potential use in predicting scab in the field Abstract 1642 Sixth International
Congress of Plant Pathology Quebec Canada
Wallroth FW 1842 Der Knollenbrand der Kartoffel Linnaea 16 332
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea using monoclonal antibodies Plant pathology 44335-365
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2004 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165 875-85
Ward LI Beales PA Barnes AV Lane CR 2005 A Real-time PCR assay based method for
routine diagnosis of Spongospora subterranea on Potato tubers Journal Phytopathology
152 633-638
45
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI Torrance
L 2010 The N- terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required for the
nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant Microbe Interaction 23(1) 1486-1497
Wuumlrzer B 1964 Ergaumlzende Untersuchungen uumlber den Pulverschorf der Kartoffel und
dessen Erreger Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh diss Landwirtschaftliche
Hochschule Hohenheim Germany 1964
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top virus
in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
Zamyatnin JrAA Solovyev AG Savenkov EI Germundsson A Sandgren M Valkonen
JPT Morozov SY 2004 Transient coexpression of individual genes encoded by the triple
gene block of Potato mop-top virus reveals requirements for TGBp1 trafficking Molecular
Plant-Microbe Interactions 17(8) 921-930
Zhang N McCarthy ML Smart CD 2008 A macroarray system for the detection of fungal
and oomycete pathogens of solanaceous crops Plant Disease 92(6) 953-960
Zolan ME Pukilla PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinerus
Molecular and cellular Biology 6(1)195-200
46
RESULTADOS
4 ARTICULO 1
VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora subterranea f sp subterranea EN
COLOMBIA
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea IN
COLOMBIA
Ineacutes Osorio Giraldo1 Marcela Orozco Valencia
1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
1 Elena Paola
Gonzaacutelez Jaimes2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
Formato de la Revista Actualidades Bioloacutegicas ISSN 0304-3584
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
La Sarna polvosa de la papa (Spongospora subterranea fsp subterranea - Sss) es una de
las enfermedades re-emergentes maacutes importantes de este cultivo en Colombia El efecto
deleteacutereo de Sss no soacutelo se debe al dantildeo directo sobre el sistema radicular y la calidad de
los tubeacuterculos sino tambieacuten a que sus zoosporas transmiten el Potato mop-top virus
(PMTV Pomovirus) Sss genera quistosoros que actuacutean como estructuras de resistencia del
patoacutegeno en el suelo pudiendo permanecer viables por varias deacutecadas Por esto su manejo
debe fundamentarse en el uso de variedades tolerantes a la enfermedad y en el empleo de
tubeacuterculo-semilla certificado En esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variacioacuten de
127 aislamientos de Sss obtenidos en los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo con el fin de apoyar la seleccioacuten de aislamientos de Sss a evaluar
47
en programas de mejoramiento geneacutetico de papa y en el disentildeo de pruebas de deteccioacuten
asintomaacutetica del patoacutegeno Para esto se secuenciaron regiones ITS del ADN ribosomal y se
condujeron anaacutelisis filogeneacuteticos encontraacutendose la presencia de tres variantes principales
de Sss dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum
Abstract
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum
INTRODUCCIOacuteN
El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L) se ve afectado por diversos microorganismos
fitopatoacutegenos e insectos plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la re-emergencia de la
48
enfermedad denominada Sarna polvosa causada por el plasmodiofoacuterido Spongospora
subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp subterranea Tomlinson (Sss) Su efecto no solo se
debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten al deterioro en la calidad y apariencia
cosmeacutetica de los tubeacuterculos que reduce draacutesticamente su valor en el mercado (Merz y
Fallon 2009) Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop top virus (PMTV) uno de
los problemas virales de la papa que tiene caraacutecter cuarenteneario para diferentes paiacuteses del
mundo (Salazar 2006 Gil et al 2011)
Sss es originario de los Andes Surameacutericanos desde donde se dispersoacute gracias al mercado
mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber transcurrido maacutes de 150 antildeos desde su
primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado importancia en las uacuteltimas deacutecadas como
resultado de la siembra generalizada de materiales altamente susceptibles al patoacutegeno la
utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los cambios de eacutepocas de siembra hacia
periacuteodo huacutemedos las deficiencias en los sistemas de rotacioacuten de cultivos la falta de
programas de exclusioacuten y los altos estaacutendares exigidos por el mercado en la calidad
cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
Sss es un patoacutegeno obligado plasmodial que taxonoacutemicamente se ubica en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos son importantes patoacutegenos de vegetales
Spongospora subterranea fsp subterraena y f sp nasturtii Estos taxa fueron definidos
inicialmente como forma especialis (Merz y Falloon 2009) sin embargo con base en la
morfologiacutea de los zoosporangios rango de hospedantes y anaacutelisis filogeneacuteticos de regiones
ribosomales actualmente se acepta que representan dos especies diferentes (Qu y Christ
2004)
Los siacutentomas de la Sarna polvosa incluyen la induccioacuten en los tubeacuterculos de lesiones
pustulosas corchosas con centros pulverulentos formados a partir de la agregacioacuten de los
quistosoros del patoacutegeno (Figura 41) Con el avance de estas lesiones es frecuente la
49
ruptura del peridermo aunque el nivel de penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente
superficial (Carrentildeo 2009) Bajo condiciones oacuteptimas para el desarrollo de la enfermedad
es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten de los tejidos y la formacioacuten
de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la enfermedad ademaacutes de causar
los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular de las plantas al inducir la
formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas que causan la disminucioacuten de la
superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo marchitez y finalmente la muerte de las
plantas (Gilchrist 2009) La infeccioacuten en las raiacuteces especialmente cuando se forman
agallas puede causar una reduccioacuten en la toma de agua y de nutrientes por parte de las
plantas (Falloon et al 2005)
En los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Sss afecta
severamente las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y papa criolla (S phureja) Los
siacutentomas se observan en raiacuteces y tubeacuterculos pero hay variacioacuten entre las zonas paperas en
cuanto a la distribucioacuten de los siacutentomas en los diferentes oacuterganos de la planta En
Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre
los tubeacuterculos de las variedades Parda Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el
departamento de Narintildeo y el Oriente de Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces
Hasta ahora no se conoce si estas diferencias se deben a variaciones en las condiciones
ambientales de las regiones o a la ocurrencia de variantes geneacuteticas del patoacutegeno (Jaramillo
y Botero 2007 Carrentildeo 2009)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 en las cosechas de las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y Criolla Colombia
(Rodriacuteguez et al 2009 Gilchrist 2009) Adicionalmente a esta problemaacutetica la
diseminacioacuten del patoacutegeno se viene incrementando dramaacuteticamente en el paiacutes como
resultado de la baja calidad del tubeacuterculo-semilla utilizado por la mayoriacutea de los
agricultores la ausencia de variedades tolerantes al patoacutegeno y la deficiencia en la
asistencia teacutecnica que no cuenta con herramientas apropiadas para el diagnoacutestico
asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011) Su
manejo debe estar enmarcado bajo un esquema integrado del cultivo en el que se incluyan
50
aspectos como la rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del
tubeacuterculo-semilla utilizacioacuten de organismos antagonistas (ej Trichoderma spp) el empleo
de cultivos trampa la desinfeccioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten
que restrinja el movimiento de material contaminado y supervise maacutes detalladamente los
procesos de certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas
son utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado
del manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o
de Rhizoctoniasis (Carrentildeo 2009)
La problemaacutetica causada por esta enfermedad en las regiones cultivadoras de papa hace
necesario que se intensifiquen los esfuerzos por desarrollar metodologiacuteas de diagnoacutestico de
suelos y material vegetal que eviten la diseminacioacuten generalizada del plasmodiofoacuterido y de
su virus asociado PMTV entre regiones infectadas y libres de enfermedad siendo
especialmente importante el desarrollo de procedimientos que garanticen la sanidad de los
lotes dedicados a la produccioacuten de semilla Entre las diversas metodologiacuteas desarrolladas en
el mundo para el diagnoacutestico de este patoacutegeno se destacan la teacutecnica de ELISA con
anticuerpos policlonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Qu et al 2011) y pruebas de
flujo lateral (Bouchek-Mechiche et al 2011) Sin embargo estas teacutecnicas son de aplicacioacuten
limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas con base en los genotipos locales de los
patoacutegenos presentes en las regiones paperas del paiacutes Con el fin de suplir dicha carencia de
informacioacuten en esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss procedentes de las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia
mediante el anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr)
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Para la coleccioacuten de muestras de quistosoros de Sss proveniente de suelo raiacuteces y
tubeacuterculos se seleccionaron lotes en fincas con antecedentes de infeccioacuten seguacuten el registro
51
histoacuterico de los agricultores siguiendo la metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la
cual se utiliza un juego de tamices de 100 y 25 microm para la obtencioacuten de los quistosoros Por
cada lote se tomaron raiacuteces de plantas o tubeacuterculos sintomaacuteticos y una muestra de suelo de
500 gr Los sitios de coleccioacuten incluyeron las regiones cultivadoras de papa de los
municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio Subachoque y
Villa Pinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute Oicataacute (Boyacaacute) y Pasto e Ipiales
(Narintildeo) La investigacioacuten se propuso obtener un miacutenimo de 30 muestras de Sss por
departamento
Los quistosoros obtenidos a partir de muestras de suelos fueron inoculados en plantas de
Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo o plantas
trampa para incrementar el inoacuteculo siguiendo la metodologiacutea de Veacutelez (2007)
mantenieacutendose en casa de malla en el Centro Experimental Paysanduacute ubicado en el
corregimiento Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB 2550 msnm temperatura
media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) (Figura 42) Todas las muestras
fueron procesadas en los laboratorios de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad
Nacional de Colombia sede Medelliacuten y Sanidad Vegetal del Politeacutecnico Colombiano Jaime
Isaza Cadavid
Extraccioacuten de ADN
Para la obtencioacuten del ADN se empleoacute una modificacioacuten de la metodologiacutea de Doyle y
Doyle (1987) a partir de quistosoros extraiacutedos y de tejidos afectados de las plantas de papa
y plantas sentildeuelo En este procedimiento es necesaria la maceracioacuten con nitroacutegeno liacutequido
de los tejidos y se emplea como buffer de extraccioacuten una solucioacuten CTAB y 1
mercaptoetanol El lavado de la fase orgaacutenica se realiza con fenolcloroformo-alcohol
isoamiacutelico y la precipitacioacuten de los aacutecidos nucleicos con 1 voluacutemen de etanol absoluto y 01
voluacutemen de acetato de sodio 3M Finalmente el pellet generado es disuelto en agua
destilada esteacuteril y es sometido a digestioacuten de ARN mediante la adicioacuten de ribonucleasa A
(10 mgmL) (Ver protocolo 62) Cuando la presencia de inhibidores afectaba la eficiencia
52
de la PCR la extraccioacuten de ADN se realizoacute utilizando el kit DNeasy Plant (Qiagen
EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante con una ligera modificacioacuten en el paso
de elucioacuten de ADN que se realizoacute en dos etapas con 70 microL de agua destilada esteacuteril Para
determinar la concentracioacuten del ADN extraiacutedo se utilizoacute la lectura de absorbancia en las
longitudes de onda de 260 y 280 nm mediante un Nanodrop 2000C (Thermo EEUU)
obtenieacutendose un rango entre 10 y 112 ng de ADNμL con una relacioacuten 260280 de 15 a 19
(Tabla 41) La integridad del ADN se determinoacute realizando electroforesis en gel de agarosa
al 08 en buffer TBE 1X (TBE 5X 54 gL Tris 275 gL de aacutecido boacuterico 20 mLL de
EDTA 05M pH 80) suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) La visualizacioacuten de
las bandas se realizoacute utilizando el sistema digital de anaacutelisis Bio Doc Analyze (Biometra
Alemania) (Figura 43)
PCR de ITS del ADNr
Para la evaluacioacuten de los niveles de variacioacuten geneacutetica de Sss se realizaron PCR empleando
los cebadores especiacuteficos Spo8 (5 CTG GGT GCG ATT GTC TGT TG 3) y Spo9 (5 CAC
GCC AAT GGT TAG AGA CG 3) disentildeados por Bulman y Marshall (1998) asiacute como los
cebadores SsF (5acute GTC GGT TCT ACC GGC AGA CC 3acute) y SsR (5acute GCA CGC CAA
TGG TTA GAG ACG 3acute) reportados por Qu et al (2006) que amplifican productos de
391 y 434 pb de la regioacuten ITS del ADNr respectivamente Las reacciones de PCR
incluyeron 01 microM de cada cebador 1 U de Taq ADN polimerasa recombinante
(Fermentas Lithuania) 02 mM de cada dNTP 1X de buffer de enzima (100 mM Tris-HCl
(NH4)2SO2 pH 88) 2 mM MgCl2 1 microL de una dilucioacuten 50 ngmicroL de ADN y un volumen
total de 25 microL Las amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra) y
consistieron de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 35 ciclos de
94degC por 30 s 55degC por 30 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10
min Luego de la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se
separaron por electroforesis en gel de agarosa al 15 tal como se indicoacute anteriormente
53
Secuenciacioacuten
De ser necesario los amplicones obtenidos fueron purificados mediante los kits QIAquick
PCR Purification y QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para proceder a su secuenciacioacuten
directa en ambas direcciones utilizando los cebadores empleados en la PCR y el kit Big
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied Biosystems EEUU) Su
corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied
Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur) (Figura 44)
Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit
606 y Chromas 145 construyeacutendose secuencias consenso y confirmaacutendose su validez por
comparacioacuten con las bases de datos moleculares con el programa BLASTn
(httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) (Figura 45) Paralelamente se obtuvieron
del GenBank secuencias de Sss de las regiones estudiadas para su alineacioacuten con las
generadas en este trabajo mediante el software Clustal W Ademaacutes se utilizaron las
secuencias de los Plasmodiofoacuteridos Plasmodiophora brassicae Polymyxa graminis
Polymyxa betae S nasturtii y Sorosphaera viticola como grupos externos de anaacutelisis
(outgroups) Los alineamientos fueron utilizados en la construccioacuten de una matriz Nexus y
el anaacutelisis filogeneacutetico se realizoacute mediante un algoritmo de Maacutexima Parsimonia utilizando
el software PAUP 40b Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute
un anaacutelisis de Bootstrap con 500 iteraciones
RFLPs
Con el fin de proponer una prueba de diagnoacutestico molecular de las variantes de Sss se
realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs a partir de las secuencias de Sss generadas en esta
investigacioacuten y otras depositadas en el GenBank Para esto se utilizoacute el software webcutter
20 (httprnalundberggusecutter2) con las enzimas EcoRV EcoRI Bsp143I Hin6I
MspI Tru1I y TaqI seleccionadas por ser de faacutecil acceso para laboratorios de diagnoacutestico
molecular y utilizadas en la primera parte de exploracioacuten La validez de la prueba fue
54
confirmada mediante PCR-RFLPs con las enzimas Bsp143I y Hin6I y aislamientos
representativos de los grupos geneacuteticos principales detectados en el trabajo Las reacciones
consistieron de 15 microL conteniendo 15 microL de buffer 10X 2 microL de enzima y 115 microL de
producto de PCR Las reacciones fueron incubadas al bantildeo Mariacutea a 37degC durante 24 h La
separacioacuten de los fragmentos de restriccioacuten se efectuoacute por electroforesis en gel de agarosa
al 25 Se evaluaron los patrones electroforeacuteticos obtenidos para cada enzima de
restriccioacuten y se determinoacute el nuacutemero de bandas generadas y su tamantildeo aproximado por
comparacioacuten con el marcador de peso molecular GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus
(Fermentas)
RESULTADOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Se obtuvieron 210 muestras de tubeacuterculos y raiacuteces de papa con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos con historia de la presencia del patoacutegeno en los departamentos de Antioquia
Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Se realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos con las secuencias
que presentaron tamantildeos superiores a 390 pb lograacutendose el objetivo de contar con al
menos 30 secuencias por cada departamento bajo anaacutelisis
Anaacutelisis filogeneacutetico de regiones ITS del ADNr
Las reacciones de PCR produjeron amplicones del tamantildeo esperado de ~390 pb con los
cebadores Spo8-9 (Figura 46) y de ~430 pb cuando se usaron los cebadores SsF-SsR en
79 y 48 muestras respectivamente Para el anaacutelisis filogeneacutetico soacutelo se incluyeron los
consensos que resultaron de la secuenciacioacuten en ambos sentidos De esta forma se
obtuvieron 33 secuencias de Antioquia 30 secuencias de Boyacaacute 33 secuencias de
Cundinamarca y 31 secuencias de Narintildeo para un total de 127 secuencias completas (Tabla
42) El alineamiento final de las secuencias alcanzoacute 445 sitios de los cuales 156 caracteres
eran constantes 55 variables pero no informativos y 236 informativos La longitud del
aacuterbol filogeneacutetico con maacutexima parsimonia fue de 707 con iacutendices de consistencia (IC) y
retencioacuten (IR) de 078 y 088 respectivamente Dado el alto nuacutemero de muestras
55
secuenciadas se presenta un dendrograma resultado del anaacutelisis de redundancia mediante el
programa Decrease redundancy (httpwebexpasyorgdecrease_redundancy) (Figura
47) Se presentaron dos grandes clados (A y B) soportados por valores de bootstrap de
100 el primer clado corresponde a los aislamientos de Sss mientras que el otro grupo
incluyoacute las demaacutes especies de plasmodiofoacuteridos (S nasturtii P graminis P betae y Pl
brassicae) que presentaron un alto nuacutemero de cambios entre ellas El clado A se subdividioacute
a su vez en tres grupos (A1 A2 y A3) dos de los cuales corresponden a los Tipos I (A2) y
II (A1) definidos por Qu y Christ (2004) En teacuterminos porcentuales ambos Tipos
representan el 157 (Tipo I) y 189 (Tipo II) de los aislamientos de Sss obtenidos en
Colombia ademaacutes se incluyeron secuencias del patoacutegeno provenientes de Estados Unidos
Irlanda y Escocia para el Tipo I y de Suiza Nueva Zelanda y de Reino Unido para el Tipo
II El subgrupo que representa el Tipo I de Sss soacutelo presentoacute aislamientos obtenidos de
tubeacuterculos o de suelos pero no de raiacutez mientras que el subgrupo representando el Tipo II
incluyoacute indistintamente aislamientos de raiacutez tubeacuterculos y suelos
Por otra parte el tercer subgrupo (A3) incluyoacute el mayor nuacutemero de aislamientos
Colombianos de Sss (654) con algunos de sus miembros presentando hasta 10 cambios
entre ellos En este subgrupo se encontraron indistintamente aislamientos de los cuatro
departamentos diferentes fuentes de muestreo (raiacutez tubeacuterculo o suelo) y hospedantes
(diferentes variedades de S tuberosum y de S phureja var Criolla Colombia) Dadas las
diferencias en secuencias de estos aislamientos proponemos nombrar a este grupo como el
Tipo III de Sss
El anaacutelisis de redundancia permitioacute tambieacuten identificar 12 genotipos (Figura 48) entre los
127 aislamientos de Sss de Colombia cinco de los cuales estuvieron conformados por un
soacutelo aislamiento tres por dos aislamientos y cuatro presentaron maacutes de diez miembros
siendo el genotipo 11 representante del Tipo I el 12 del Tipo II y el 7 y 10 del genotipo III
(Tabla 43) porque los demaacutes genotipos al ser uacutenicos o con tener como maacuteximo dos
representantes no fueron definidos a nivel de Tipos Los niveles de identidad para la regioacuten
56
ribosomal secuenciada entre estos genotipos fueron superiores al 95 en todos los casos
con una divergencia de 33 entre los Tipos I y II del 5 entre los Tipos I y III y del 2
entre el II y III La divergencia entre secuencias de Sss y otras especies de plasmodiofoacuteridos
fue mayor al 44 lo que demuestra la utilidad taxonoacutemica de las regiones ITS para
establecer relaciones filogeneacuteticas en este grupo de protozoos (Tabla 44)
RFLPs
Los anaacutelisis de restriccioacuten indicaron la existencia de polimorfismos en los sitios de corte de
algunas de las enzimas empleadas entre los grupos principales sentildealados en el anaacutelisis
filogeneacutetico Lo anterior puede ser utilizado con fines praacutecticos cuando se requiera evaluar
el genotipo o la mezcla de genotipos asociados a un lote de cultivo plantas sintomaacuteticas o
de tubeacuterculo-semilla con siacutentomas de Sarna polvosa Por ejemplo los aislamientos
representativos del Tipo II de Sss presentan un sitio de corte para Bsp143I (p 92) mientras
que para los del Tipo I se presentan dos sitios (p 97 340) Los aislamientos del Tipo III
tienen tres sitios de corte para la enzima Hin6I (p 222 283 352) en contraste con dos sitios
en los del Tipo I y II (p226-355 221-350) (Figura 49) Por esto proponemos la realizacioacuten
de una prueba simple de PCR-RFLPs a partir de la amplificacioacuten de las regiones ITS con
cebadores especiacuteficos para Sss y su posterior digestioacuten con las enzimas Bsp143I y Hin6I
con el fin de identificar los tres Tipos de Sss Al evaluar la digestioacuten de amplicones
representantes de los tres Tipos de Sss detectados en el estudio se validoacute la utilidad de la
teacutecnica en geles de agarosa al 25 ya que los perfiles de restriccioacuten obtenidos con la
enzima Hin6I permiten diferenciar a los aislamientos de los Tipos I y II (fragmentos
visibles de 221 y 129 pb) del Tipo III (fragmentos visibles de 221 67 y 62 pb) (Figura
410A) mientras que los representantes de los Tipos I y II se diferencian por la digestioacuten
con la enzima Bsp143I al generar fragmentos visibles de 243 pb (Tipo I) y de 294 pb (Tipo
II) (Figura 410B) Es importante indicar que los fragmentos inferiores a 50 pb no se tienen
en cuenta en este anaacutelisis ya que salen del rango de resolucioacuten de la electroforesis en geles
de agarosa Fragmentos de este tamantildeo pueden ser visualizados en geles de poliacrilamida
que ofrecen una mayor resolucioacuten
57
DISCUSIOacuteN
La disponibilidad de cultivares de papa resistentes a Sss es una prioridad para el disentildeo de
estrategias de manejo de la Sarna polvosa en diferentes paiacuteses cultivadores de este
tubeacuterculo en el mundo (Nitzan et al 2010) Sin embargo las deficiencias en el
conocimiento que se tiene de los niveles de variacioacuten de Sss y de su ciclo de vida
representan un obstaacuteculo para el establecimiento de los programas de mejoramiento
geneacutetico contra este fitopatoacutegeno (Merz y Falloon 2009) Los estudios geneacuteticos de Sss han
sido difiacuteciles de aplicar debido a su naturaleza de patoacutegeno obligado que impide su
aislamiento en medios axeacutenicos afectando los procesos de extraccioacuten de ADN la
utilizacioacuten de marcadores moleculares convencionales como AFLPs SSR y RAPDs y el
empleo de cebadores universales comuacutenmente usados para estudios taxonoacutemicos y
poblacionales en diferentes microorganismos eucarioacuteticos Adicionalmente la
caracterizacioacuten patoacutegenica de Sss resulta compleja ya que el desarrollo de la expresioacuten de
la Sarna polvosa estaacute fuertemente influenciada por las condiciones ambientales las
metodologiacuteas de inoculacioacuten y los cultivares del hospedante (Qu y Christ 2006 Jaramillo y
Botero 2007)
Afortunadamente la existencia de cebadores especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del
ADNr como los desarrollados por Bulman y Marshall (1998) y Qu et al (2006) para
amplificar la regioacuten ITS1 58S e ITS2 han permitido la obtencioacuten de secuencias que entre
otras aplicaciones permitieron definir la afinidad filogeneacutetica de Sss con respecto a otros
miembros del orden Plasmodiophoridae y demostrar los bajos niveles de identidad de esta
especie con respecto a la formae specialis nasturtii Esta misma situacioacuten se encontroacute en
este estudio obtenieacutendose identidades entre Sss y S nasturtii cercanas al 56 Los anaacutelisis
intraespeciacuteficos utilizando dichas secuencias han permitido detectar dos ribotipos
principales de Sss en el mundo denominados como I y II Ambos Tipos han sido
encontrados en poblaciones de Sss de Australia y Europa (Bulman y Marshall 1998)
mientras que en Norte Ameacuterica los aislamientos corresponden exclusivamente al Tipo II
58
(Qu y Christ 2006) En dicho estudio se encontroacute que las secuencias del Tipo I diferiacutean con
respecto a las del Tipo II en tres nucleoacutetidos (p 60 127 157) y una insercioacuten de cinco
nucleoacutetidos (p 129 a 133) en el ITS1 mientras que para la regioacuten ITS2 se presentan seis
mutaciones puntuales (p 348 367 399 402 461 475) y dos deleciones (p 356 y 474) lo
que en su conjunto equivale a un 29 de divergencia entre ambos ribotipos Estas
diferencias fueron igualmente encontradas entre los aislamientos colombianos
representando ambos Tipos aunque algunos de ellos presentaron mutaciones adicionales
por ejemplo el genotipo 12 (conformado por 21 aislamientos) presentoacute dos cambios con
respecto al Tipo II reportado en GenBank (Accesioacuten AY604172) mientras que el genotipo
11 (conformado por 17 aislamientos) tuvo tres cambios con respecto al Tipo I (Accesioacuten
AY604171)
En Colombia hasta el presente estudio se habiacutean realizado dos estudios de variabilidad
geneacutetica de Sss con base en anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr En el primero de ellos
Hincapieacute (2006) encontroacute altos niveles de identidad geneacutetica entre los aislamientos de Sss
secuenciados y analizados mediante PCR-RFLP lo que condujo al autor a plantear la
posible ocurrencia de una estructura poblacional clonal para este patoacutegeno en el paiacutes En un
estudio maacutes reciente Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS y SSCP
(Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) que incluyoacute un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones establecioacute la presencia de subpoblaciones del patoacutegeno
relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Asiacute aislamientos con secuencias ITS del Tipo
I se asociaron exclusivamente con infecciones de tubeacuterculo mientras que aquellos del Tipo
II lo hicieron con siacutentomas de agallas en raiacutez En dicha investigacioacuten se descartoacute ademaacutes la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar del hospedero o la zona
geograacutefica de origen de los aislamientos Asiacute mismo se comproboacute que en el paiacutes existen
variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la
presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno dos de los cuales corresponden a los Tipos I y
II mientras que los tres restantes correspondiacutean a nuevas variantes no reportadas en otros
59
lugares del mundo (Carrentildeo 2009) desafortunadamente las secuencias resultantes de dicho
trabajo no fueron publicadas en GenBank y por tanto no pudieron ser incluidas en los
anaacutelisis filogeneacuteticos aquiacute presentados
El presente estudio amplia auacuten maacutes la base de conocimiento de los niveles de variacioacuten de
Sss en Colombia al detectar 12 genotipos a partir de 127 secuencias de igual nuacutemero de
aislamientos del patoacutegeno obtenidos en cultivos de los cuatro principales departamentos
productores de papa del paiacutes El anaacutelisis filogeneacutetico basado en dichas secuencias definioacute
la presencia de un clado que representa a Sss e incluye los dos Tipos mundialmente
conocidos para este patoacutegeno (Qu y Christ 2004) ademaacutes de un tercer subgrupo (III) que
presenta un 5 y 2 de divergencia con respecto a los Tipo I y II respectivamente Este
Tipo III contiene la mayor proporcioacuten de aislamientos del estudio e integroacute indistintamente
cepas de diferentes oriacutegenes geograacuteficos hospedantes tejidos sintomaacuteticos y suelo De gran
intereacutes resultoacute el hecho que los aislamientos asociados con el Tipo I procediacutean de puacutestulas
en tubeacuterculos o de suelos pero no de agallas de raiacutez lo cual confirma la asociacioacuten
realizada por Carrentildeo (2009) para esta variante de Sss Sin embargo los aislamientos
asociados al Tipo II proveniacutean indistintamente de raiacutez tubeacuterculos o suelos A partir de estos
resultados es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa del paiacutes Asiacute por ejemplo
es de intereacutes estudiar las reacciones de las variedades colombianas de papa a dichos
ribotipos asiacute como su capacidad de transmisioacuten de PMTV En este sentido Ward et al
(2005) evaluando el efecto de dos ribotipos de Polymyxa graminis un plasmodiofoacuterido que
afecta gramiacuteneas en la zona templada encontraron que los aislamientos del Tipo II fueron
detectados principalmente en plantas de trigo y estaban asociados a la transmisioacuten del Soil-
borne cereal mosaic virus (SBCMV) mientras que aquellos del Tipo I afectaban cebada y
su capacidad de transmisioacuten de SBCMV era muy baja
60
Los niveles de variacioacuten encontrados en esta investigacioacuten para el agente causal de la Sarna
polvosa de la papa en Colombia condujeron a plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y de certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla Para esto se realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs de regiones ITS del
ADNr con siete enzimas de restriccioacuten de uso frecuente en laboratorios de deteccioacuten
molecular de microorganismos Los resultados demostraron polimorfismos en los sitios de
corte de algunas de las enzimas utilizadas dos de las cuales permiten distinguir los tres
principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico De esta forma se confirmoacute que la
digestioacuten con la enzima Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos
del Tipo III mientras que el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los
Tipos I y II La prueba realizada en este estudio puede ser implementada con variaciones
como el uso de digestiones dobles y la utilizacioacuten de geles de poliacrilamida que generen
mayor resolucioacuten de los fragmentos de restriccioacuten de bajo peso molecular sin embargo el
esquema aquiacute presentado ofrece simplicidad y eficiencia en la separacioacuten de los tres Tipos
sin la necesidad de contemplar todos los productos de la digestioacuten Adicionalmente a esta
prueba y con base en los resultados de las secuencias obtenidas en esta investigacioacuten y en
aquella de Gil et al (2011) nuestro grupo se encuentra disentildeando y evaluando pruebas de
PCR y RT-PCR en tiempo real para la deteccioacuten asintomaacutetica de Sss y de su virus asociado
PMTV Se espera que los resultados generados en estas investigaciones sean incorporados
raacutepidamente en los programas de manejo integrado de la Sarna polvosa en Colombia y
otros paiacuteses latinoamericanos afectados por esta enfermedad como Venezuela (Rodriacuteguez et
al 2009) y Costa Rica (Montero-Astua et al 2008)
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten el Politeacutecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid
Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo
por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el Departamento de Narintildeo
61
REFERENCIAS
Bell KS Roberts J Verrall S Cullen DW Williams NA Harrison JG Toth IK Cooke D
Duncan JM Claxton JR 1999 Detection and quantification of Spongospora subterranea
fsp subterranea in soils and on tubers using specific PCR primers European Journal of
Plant Pathology 105 905-915
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid
diagnostic test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European
Journal of Plant Pathology 131 277-287
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47 759-766
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33 69-84
62
Gilchrist E 2009 Alternativas para el manejo integrado de la Sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) Tesis de Doctorado en Ciencias Agrarias
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia sede Medelliacuten
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tubers by enzyme-linked immunosorbent assay Plant Pathology 42
181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato - A review
Plant Pathology 461-25
Hincapieacute LA 2006 Evaluacioacuten de la variabilidad molecular de Spongospora subterranea
(Wallroth) Lagerheim f sp subterranea en las principales zonas paperas de Colombia
Tesis de Maestriacutea en Biotecnologiacutea Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia sede Medelliacuten Colombia
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Merz U Fallon RE 2009 Powdery scab of potato-increased knowledge of pathogen
biology and disease epidemiology for effective disease management Potato Research
5217-37
Montero-Astua M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
63
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006 Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea f sp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la Sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista de la Facultad de Agronomiacutea Universidad del Zulia 26 508-531
Salazar LF 2006 Emerging and Re-emerging Potato Diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop - top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia Sede Bogotaacute
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea and quantification in soil Plant Pathology 45 884-895
64
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2005 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165875-885
Zolan ME Pukkila PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinereus
Molecular and Cellular Biology 6 195-200
65
41 Anexos
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp subterranea
en plantas de papa de Colombia a Quistosoros obtenidos de suelo b Plasmodios
formados en raiacutez de tomate (Solanum esculentum) c Lesiones tempranas producidas por
Sarna polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro d Lesiones tardiacuteas producidas por Sarna
polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro e f Agallas formadas en raiacuteces de S phureja
var Criolla Colombia
d
e f
c
a b
66
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja var Criolla
Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos infestados con Spongospora
subterranea f sp subterranea
67
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o raiacuteces de
plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea
MUESTRA A260 A280 RELACIOacuteN
260280
CONCENTRACIOacuteN
de ADN ng microl
AB1 0806 0465 173 403
AB2 0421 0244 172 21
Se7 0276 0149 184 138
Se8 0743 0415 179 371
MA11 2244 1366 164 1122
MA61 0277 0158 176 139
MA39 2135 1512 141 1067
MA56 0823 0361 228 412
MA60 021 0101 208 105
68
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos agallas o raiacuteces
de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana Carril 1 Marcador de peso 100 pb carril 2-
4 muestras MA16 MA17 MA18 MA11 MA39
500 pb
1 2 3 4 5 6
69
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora
subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8
70
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la regioacuten ITS del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp subterranea de Colombia
71
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb) a partir de ADN
de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum tuberosum S phureja y Nicotiana
benthamiana con presencia de quistosoros de Spongospora subterranea fsp subterranea
de cultivos de papa de los departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1
Marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas) carriles 2 a 6 muestras SE10 SE11
SE13 SE18 carril 7 control negativo
500 pb
100 pb
390 pb
1 2 3 4 5 6 7
72
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia
ANTIOQUIA CUNDINAMARCA
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE13 Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro SE8 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE18 La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro SE81 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
32UN La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE9 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
33UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE91 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34UN La Unioacuten Raiacutez accesioacuten C131-R2 SE12 Zipaquiraacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
35UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE14 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
80C La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE15 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Pastusa
Suprema
79C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE16 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
78C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE17 Villapinzoacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro
35 COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE19 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34COL La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE20 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
32COL La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum SE21 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
30COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 4fb Ventaquemada Raiacutez S tuberosum
29COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 5fb Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum
12fb La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 9fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
11fb La Unioacuten Raiacutez S tuberosum 10fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
1MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
ICA Nevada MA20 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
7MR Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro MA21 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
8MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA22 Villapinzoacuten
Raiacutez S tuberosum var ICA Pastusa Suprema
9MR La Unioacuten Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA23 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
11MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA24 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
12MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA25 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
13MR Santa Rosa Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA50 Desconocido Tubeacuterculo S tuberosum
14MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA51 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB2 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C87SJ MA52 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
73
AB3 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C81SJ MA53 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB4 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3SJ MA54 Tabio Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB6 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C8C MA55 Tabio Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB7 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3C MA56 Zipaquiraacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia
AB8 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA57 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA1 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA58 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA2 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA59 Villapinzoacuten
Tubeacuterculo S tuberosum var Diacol Capiro
MA41 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA60 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
BOYACAacute NARINtildeO
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE10 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE7 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE101 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
SE11 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 37COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE22 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 36COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
SE23 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA27 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE24 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA28 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
3fb Tunja Raiacutez S tuberosum MA31 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB1 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA32 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB9 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA33 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB10 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA34 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA35 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA3 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA36 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA4 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA37 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA5 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA38 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA7 Siachoque Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA39 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA9 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA40 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA11 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA61 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA62 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA14 Tunja Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA64 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA15 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA65 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA16 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA66 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA17 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA67 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
74
benthamiana
MA18 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA68 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA19 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA69 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA42 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA70 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA43 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA44 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA72 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA45 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA73 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA46 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA75 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA49 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA76 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA77 Ipiales Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
75
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) de cultivos de papa de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Como grupos externos de anaacutelisis se presentan
secuencias de otras especies de plasmodiofoacuteridos Meacutetodo de maacutexima parsimonia
utilizando la opcioacuten Heuristic search del programa PAUP 40b Los valores de Bootstrap (gt
80) se indican en la parte inferior de las ramas En letras mayuacutesculas se presentan las
denominaciones de los clados y subclados Adicionalmente se indican los grupos que
representan los Tipos de Sss
76
Sss TIPO I
395 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
MspI TaqI
cccgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgttttcgg base
pairs
gggcccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcaaaagcc 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
atactgaacttactaaagtggatcatttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgat base
pairs
tatgacttgaatgatttcacctagtaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgcta 76 to
150
EcoRI
gaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagtt base
pairs
cttcttgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaa 151
to 225
Hin6I TaqI EcoRV MspI
gcgctttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccgtgtgcgtg base
pairs
cgcgaaagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcggcacacgcac 226
to 300
Bsp143I MspI Hin6I
aaggggactctgagctctggtcggtccatggcttgaaagatcatgcaacccggtgcgcgtctctggcttctgatt base
pairs
ttcccctgagactcgagaccagccaggtaccgaactttctagtacgttgggccacgcgcagagaccgaagactaa 301
to 375
cgtctctaaccattggcgtg base pairs
gcagagattggtaaccgcac 376 to 395
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 2 97 340 gatc More info
EcoRI 1 190 gaattc More info
EcoRV 2 130 238 gatatc More info
Hin6I 2 226 355 gcgc More info
MspI 3 2 281 350 ccgg More info
TaqI 2 49 232 tcga More info
Tru1I 2 102 119 ttaa More info
77
Sss TIPO II
390 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
TaqI
cctgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgtattact base
pairs
ggacccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcataatga 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
gaacttactaaagtggatcgtttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgatgaaga base
pairs
cttgaatgatttcacctagcaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgctacttct 76 to
150
EcoRI Hin6I
acgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagttgcgct base
pairs
tgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaacgcga 151
to 225
TaqI EcoRV MspI
ttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccctgtgcgtggaagg base
pairs
aagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcgggacacgcaccttcc 226
to 300
MspI Hin6I
ggactatgagctctggtcggtccatggcttgaaagattatccaaccggtgcgcgtctctggcttctgattcgtct base
pairs
cctgatactcgagaccagccaggtaccgaactttctaataggttggccacgcgcagagaccgaagactaagcaga 301
to 375
ctanccattggcgtg base pairs
gatnggtaaccgcac 376 to 390
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 1 92 gatc More info
EcoRI 1 185 gaattc More info
EcoRV 2 125 233 gatatc More info
Hin6I 2 221 350 gcgc More info
MspI 2 276 345 ccgg More info
TaqI 2 49 227 tcga More info
Tru1I 2 97 114 ttaa More info
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos de S
subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I MspI TaqI y
Tru1I mediante el programa Web-cutter
78
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de aislamientos
de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en Colombia a partir de
anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal
GENOTIPO RFLPacutes MUESTRAS PROPORCIOacuteN
()
1
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185 EcoRV 2 125 233
Hind6I 2 221 351
MspI 2 276 346 TaqI 2 227 Tru1I
2 97 114
AB12 34UN 16
2
Bsp143I 1 93 EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277 347 TaqI 1 49 228
Tru1I 2 98 115
32UN 78C 16
3
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
11MR 08
4
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
9MR 08
5
Bsp143I 2 96 339 EcoRI 1 189
EcoRV 2 129 237
Hind6I 2 225 354
MspI 2 280 349 TaqI 1 231 Tru1I
2 101 118
8MR 13MR 16
79
6
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190
EcoRV 2 130 238 Hind6I 2 226 355
MspI 2 281 350
TaqI 1 232 Tru1I
2 102 119
MA12 08
7
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
MA37 SE7 SE8 SE9 SE10
SE11 SE12 SE13 SE14 SE15 SE16 80C 79C 37COL 36COL
35COL 34COL 32COL 30COL
12FB 10FB 11FB 9FB 1MR
SE71 SE81 SE91 SE101 AB2 AB3 AB4 AB6 AB7 MA1 MA7
MA9 MA14 MA20 MA21 MA22
MA23 MA24 MA25 MA28 MA31 MA32 MA33 MA34
MA35 MA36
393
8
Bsp143I 2 92 309 EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 289 351 MspI 2 276
346 TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
MA40 08
9
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 282 351 MspI 3 2 276
346 TaqI 1 227
Tru1I 2 97 114
MA43 08
10
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 3 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
29COL 33UN MA4 MA41
MA42 MA51 MA52 MA55
MA56 MA57 MA58 MA59 MA60 MA62 MA64 MA65
MA68 MA69 MA71 MA72
MA76 SE19 SE20 SE21 SE22 3FB 4FB 14MR
22
11
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190 EcoRV 2 130 238
Hind6I 2 226 355
MspI 3 2 281 350 TaqI 2 49 232
Tru1I 2 102 119
SE17 12MR AB1 AB8 MA2
MA15 MA16 MA17 MA18 MA19 MA45 MA46 MA49
MA50 MA53 SE23 SE24
134
80
12
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233 Hind6I 2 221 350
MspI 2 276 345
TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
SE18 35UN 7MR AB9 AB10
MA3 MA4 MA5 MA11 MA27 MA38 MA39 MA44 MA61
MA66 MA67 MA70 MA73
MA75 MA77 5FB
165
81
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluyen a S nasturtii y Plasmodiophora brassicae
como especies externas de anaacutelisis
SECUENCIA SE17 SE18 MA37 29COL AY604172 AY604171 AF310907 EF593112 AF102820 AF102819 EF195335 AF104308
SE17 Sss
Colombia
Tipo I
ID 0962 0957 0952 0964 0992 0564 0959 0992 0964 0586 0959
SE18 Sss
Colombia
Tipo II
0962 ID 0979 0974 0992 0959 0574 0987 0959 0992 0584 0987
MA37 Sss
Colombia
Tipo III
0957 0979 ID 0984 0982 0954 0579 0977 0954 0982 0598 0977
29COL Sss
Colombia
Tipo III
0952 0974 0984 ID 0982 0959 0579 0977 0959 0982 06 0977
AY604172
Sss EEUU
TipoII
0964 0992 0982 0982 ID 0967 0577 0994 0967 1 0589 0994
AY604171
Sss EEUU
Tipo I
0992 0959 0954 0959 0967 ID 0564 0962 1 0967 059 0962
AF310907 S
nasturtii 0564 0574 0579 0579 0577 0564 ID 0579 0564 0577 0566 0574
EF593112 Sss
Suiza 0959 0987 0977 0977 0994 0962 0579 ID 0962 0994 0589 0989
AF102820
Sss Escocia 0992 0959 0954 0959 0967 1 0564 0962 ID 0967 059 0962
AF102819
Sss Nueva
Zelanda
0964 0992 0982 0982 1 0967 0577 0994 0967 ID 0589 0994
EF195335 P
brassicae 0586 0584 0598 06 0589 059 0566 0589 059 0589 ID 0589
AF104308
Sss Reino
Unido
0959 0987 0977 0977 0994 0962 0574 0989 0962 0994 0589 ID
82
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las enzimas de restriccioacuten Bsp143I y
Hin6I que permiten determinar los tres Tipos de Sss identificados en este trabajo En la
izquierda se indican los genotipos representativos de cada Tipo (ver Tabla 3) y entre
pareacutentesis los sitios de corte referidos al Tipo I
83
Figura 410 (A) Gel de RFLPs con la enzima Hind6I con tres muestras de los Tipos I II y
III de Sss detectados en el estudio 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir Tipo
I 3-5 Digestioacuten de muestras Tipo I 6 Producto sin digerir Tipo II 7-9 Digestioacuten de
muestras Tipo II 10 Producto sin digerir Tipo III 11-13 Digestioacuten de muestras Tipo III
14 Marcador de peso 100 pb (B) Gel de RFLPs con la enzima Bsp143I con una muestra
del Tipo I y II de Sss 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir del Tipo II 3 Sin
muestra 4 Digestioacuten de muestra Tipo I 5 Digestioacuten de muestra Tipo II 6 Marcador de
peso 100 pb Con flechas se marcan los productos digeridos que presentan resolucioacuten
apropiada en geles de agarosa al 25
A B
84
5 Artiacuteculo 2 Variabilidad geneacutetica de los ARN 2 y 3 de aislamientos
Colombianos de PMTV
Genetic variability of RNA 2 and 3 in Colombian isolates of PMTV
Ineacutes Osorio Giraldo1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
1 Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Facultad de Ciencias Universidad Nacional
de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia 2
Laboratorio de Microbiologiacutea Industrial
Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia
Formato de la Revista Agronomiacutea Mesoamericana ISSN 1021-7444
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
El PMTV es un virus prevalente en los cultivos de papa de los Andes Sin embargo en esta
regioacuten es muy bajo el conocimiento de su biologiacutea patogenicidad y diversidad Con el fin
de suplir la falta de informacioacuten sobre este uacuteltimo aspecto en esta investigacioacuten se
obtuvieron secuencias de los genes de la caacutepside viral (CP) y del TGB2 de cepas de PMTV
de los cuatro principales departamentos cultivadores de papa en Colombia Adicionalmente
dos de los aislamientos fueron secuenciados en gt83 de sus ARN 2 y 3 Los anaacutelisis
filogeneacuteticos basados en CP indicaron la presencia de dos clados El primero contiene cepas
de referencia mundial de PMTV en conjunto con 19 de las cepas de este estudio mientras
que el segundo clado soacutelo agrupoacute cepas de Colombia las que compartieron menos de 76
de identidad con el primer grupo Esto posiblemente indica la ocurrencia de una nueva
especie de pomovirus aunque se requiere la secuenciacioacuten de todo el genoma para
confirmar dicha hipoacutetesis taxonoacutemica El anaacutelisis del TGB2 generoacute un solo clado
agrupando indistintamente las cepas colombianas de PMTV con las de otros paiacuteses El
anaacutelisis de los segmentos 2 y 3 del genoma viral indicoacute que los aislamientos colombianos
compartiacutean gt94 de identidad con las secuencias de cepas de Repuacuteblica Checa y Suecia
85
Se espera que estos hallazgos sean utilizados para el disentildeo de herramientas de diagnoacutestico
del PMTV en los Andes que apoyen los programas de certificacioacuten de tubeacuterculo-semilla y
mejoramiento geneacutetico de papa
Palabras clave Potato mop-top virus RT-PCR Secuenciacioacuten Solanum tuberosum
Abstract
PMTV is a prevalent virus in potato crops in the Andes However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words Potato mop-top virus RT-PCR Sequencing Solanum tuberosum
86
INTRODUCCIOacuteN
El Potato mop-top virus (PMTV) es la especie tipo del geacutenero Pomovirus y recientemente
se ha clasificado en la nueva familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Su rango de
hospedantes incluye un nuacutemero limitado de especies vegetales de las familias Solanaceae y
Chenopodiaceae siendo la papa (Solanum tuberosum L) su principal hospedante desde el
punto de vista econoacutemico (Kirk 2008) Es transmitido por tubeacuterculo semilla infectado y
por zoosporas del plasmodiofoacuterido Spongospora subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp
subterranea Tomlinson (Sss) agente causal de la sarna polvosa de la papa (Harrison y
Jones 1970) Su presencia se ha registrado principalmente en regiones con climas huacutemedos
y friacuteos como el Norte de Europa (Noruega Suecia Dinamarca y Finlandia) las islas
Britaacutenicas (Irlanda Inglaterra Escocia) Norte Ameacuterica (EEUU y Canadaacute) Japoacuten las zonas
montantildeosas de Costa Rica y los Andes Surameacutericanos (Peruacute Colombia Bolivia) (Xu et al
2004 Salazar 2006 Montero-Astuacutea et al 2008 Nakayama et al 2010 Santala et al
2010) A pesar de que se considera que el PMTV es originario de los Andes su presencia
en Colombia soacutelo fue detectada en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) y reconfirmada con base en
anaacutelisis de secuencias de la caacutepside viral (CP) y el segundo gen del triple bloque (TGB2) en
2011 (Gil et al 2011) Este virus puede causar peacuterdidas de hasta 26 en el rendimiento del
cultivo de la papa lo que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera
ascender a rangos de 50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 2000) Sin
embargo dichos niveles de peacuterdidas dependen de la susceptibilidad de las variedades
cultivadas (Xu et al 2004 Santala et al 2010) las variantes del patoacutegeno (Harrison y
Jones 1970 Nielsen y Nicolaisen 2003) y fundamentalmente de las condiciones
medioambientales prevalentes durante su infeccioacuten (Davey 2009 Latvala-Kilby et al
2009 Roos et al 2011)
El PMTV es un virus tripartita con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20 nm en diaacutemetro y
longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm Cada partiacutecula contiene una moleacutecula
de ARN de cadena sencilla con polaridad positiva (ARNss+) con tamantildeos de 6043 nt (ARN
1) 3134 nt (ARN 2) y 2964 nt (ARN 3) El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene
motivos de metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del
codoacuten de finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999 2003) El
87
ARN 2 contiene un ORF para la proteiacutena de la caacutepside de 20 kDa Tambieacuten codifica para
una proteiacutena de 90 kDa generada por lectura continua (readthrough CP-RT) gracias a la
presencia de un codoacuten de finalizacioacuten amber en el gen CP Diversos estudios han indicado
que esta proteiacutena RT esta involucrada en la transmisioacuten por Sss del PMTV siendo incluso
posible su localizacioacuten asociada con los extremos de las partiacuteculas virales mediante
anaacutelisis de inmuno-marcaje (Cowan et al 1997) En este sentido Torrance et al (1999)
demostraron que una delecioacuten de 109 nt en el extremo 3acute de las secuencias del dominio CP-
RT de aislamientos de PMTV de Escocia estaban asociadas con su imposibilidad de
transmisioacuten por Sss
El ARN 3 codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Los
primeros tres presentan secuencias similares a proteiacutenas del triple bloque de genes (TGB)
involucradas en el movimiento de ceacutelula a ceacutelula de algunos virus de plantas Las TGBs de
los pomovirus hacen parte de la clase 1 o grupo hordei de estas proteiacutenas en conjunto con
las codificadas por otros geacuteneros de la familia Virgaviridae y del geacutenero Hordeivirus Se
cree que TGB2 y TGB3 asisten a TGB1 en su funcioacuten de trasportar el genoma viral a traveacutes
de los plasmodesmos de las ceacutelulas vegetales (Lim et al 2008 2009) Recientemente se
encontroacute mediante fusioacuten de la regioacuten N-terminal de TGB1 con la proteiacutena verde
fluorescente (GFP por sus siglas en ingleacutes) que TGB1 se localizaba en la regioacuten nucleolar
y de microtuacutebulos infirieacutendose ademaacutes que aparentemente esta proteiacutena interactuacutea con los
factores de transcripcioacuten del hospedante (Wright et al 2010)
La cuarta proteiacutena (8 kDa) es rica en cisteiacutena (CRP) y aparentemente esta involucrada en el
movimiento sisteacutemico del PMTV en las plantas y en la expresioacuten de siacutentomas necroacuteticos en
hospedantes experimentales Interesantemente otros pomovirus no codifican para una
proteiacutena 8 kDa como la presente en PMTV y sus niveles de identidad con CRPs presentes
en otros geacuteneros como Hordeivirus Tobravirus y Furovirus son muy bajos (Lukhovitskaya
et al 2005)
Los siacutentomas que causa PMTV en papa se manifiestan por agrietamientos en la superficie
de los tubeacuterculos pudiendo estar acompantildeados por la presencia de anillos necroacuteticos en la
88
corteza o incluso la parte interna del mismo siacutentoma conocido como umlSprainguml (Calvert y
Harrison 1966) En las hojas de las plantas infectadas se puede observar un moteado en
forma de V tipo ldquoaucubardquo ademaacutes de la distorsioacuten del follaje y el acortamiento de los
entrenudos (umlmop-topuml) (Carnegie et al 2009) En la regioacuten Andina no es frecuente
observar la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos ni los moteados tipo umlaucubauml lo que no
permite asociar siacutentomas especiacuteficos con la presencia de PMTV situacioacuten que explica en
buena parte el porqueacute del desconocimiento de su efecto sobre las variedades sembradas en
esta regioacuten suramericana (Tenorio et al 2006 Gil et al 2011) Sin embargo seguacuten Salazar
(2006) el PMTV es uno de los virus prevalentes en el cultivo de la papa en los Andes
Adicionalmente a las caracteriacutesticas criacutepticas del PMTV existen dificultades teacutecnicas para
el diagnoacutestico de este virus debido a su distribucioacuten erraacutetica en las plantas que incluso
puede diferir entre yemas y brotes del mismo tubeacuterculo infectado y a los bajos tiacutetulos
virales que se encuentran en el tejido foliar Esto conduce a la generacioacuten de falsos
negativos por diferentes teacutecnicas de diagnoacutestico (Cerovska et al 2003 Kirk 2008) Dichas
teacutecnicas incluyen la observacioacuten visual de siacutentomas bioensayos con plantas indicadoras
como Chenopodium amaranticolor Nicotiana benthamiana N debneyi y N tabacum
(Jeffries 1998) que requieren largos periodos de tiempo para su lectura pruebas de ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay) con anticuerpos mono y policlonales (Torrance et
al 1993 Cerovska et al 2003) RT-PCR IC RT-PCR y qRT-PCR con cebadores
especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del genoma viral (Arif et al 1995 Mumford et
al 2000 Latvala-Kilby et al 2009 Davey 2009) Asiacute mismo se han empleado otras
teacutecnicas basadas en hibridizacioacuten especiacutefica (Ryazantsev y Zavriev 2009) y microplacas de
hibridizacioacuten con RT-PCR (Nakayama et al 2010) para la deteccioacuten de PMTV
En Colombia Gil et al (2011) utilizaron la teacutecnica de RT-PCR con los cebadores
PMTVF4-PMTVR4 y H360-C819 dirigidos a los genes TGB2 y CP respectivamente para
la deteccioacuten del virus en los principales departamentos productores de papa del paiacutes sin
embargo utilizaron un muy bajo nuacutemero de aislamientos virales Maacutes recientemente Gallo
(2012) obtuvo anticuerpos policlonales dirigidos a peacuteptidos sinteacuteticos con alta capacidad
89
inmunogeacutenica identificados a partir de la modelacioacuten de la caacutepside viral de aislamientos
colombianos de PMTV probando su efectividad en pruebas de ELISA y Dot-blot
A pesar de que aparentemente existe una amplia gama de teacutecnicas para la deteccioacuten del
PMTV eacutestas presentan la limitacioacuten de estar basadas en un bajo nuacutemero de aislamientos
virales especialmente del Norte de Europa (Latvala-Kilby et al 2009) siendo auacuten menor el
nuacutemero de cepas andinas para las que existen secuencias disponibles en las bases de datos
moleculares o cuyos viriones han sido purificados para la generacioacuten de pruebas
seroloacutegicas (Gil et al 2011)
A nivel mundial se ha reportado la presencia de bajos niveles de variacioacuten entre genotipos
de PMTV (Mayo et al 1996 Santala et al 2010) Latvala-Kilby et al (2009) comparando
secuencias de CP de 23 aislamientos de Finlandia y Letonia con respecto a secuencias
disponibles en GenBank para cepas de Escocia Dinamarca Suecia y Repuacuteblica Checa
encontraron identidades superiores al 98 entre eacutestas con soacutelo siete diferencias a nivel de
aminoaacutecidos (aa) entre todas las comparaciones Las evaluaciones de secuencias de CP-RT
tambieacuten presentaron altos niveles de identidad (98 a 100) aunque en este caso 24
posiciones en las secuencias de aa fueron variables Resultados similares reportaron Mayo
et al (1996) cuando compararon las secuencias de CP de tres aislamientos de Escocia y
ocho de Peruacute mientras que Xu et al (2004) encontraron que seis de las secuencias de CP
de aislamientos de PMTV de Norteameacuterica presentaron identidades superiores al 97 con
respecto a secuencias de aislamientos de diferentes paiacuteses de Europa A pesar de estos bajos
niveles de variacioacuten cuando se realizan anaacutelisis filogeneacuteticos con dichas secuencias se han
encontrado dos clados que dividen los aislamientos de PMTV y que pueden ser
identificados por anaacutelisis de RFLPs (Nielsen y Nicolaisen 2003) Sin embargo dichos
grupos aparentemente no estaacuten relacionados con diferencias en sus niveles de
patogenicidad sobre variedades de papa (Latvala-Kilby et al 2009)
En Colombia Veacutelez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo que presentaba altos niveles de identidad con
respecto a aislamientos de Europa y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por
90
aislamientos colombianos Esta situacioacuten fue confirmada posteriormente por Gil et al
(2011) quienes encontraron que las variantes de PMTV tan soacutelo presentaban un 76 y
86 de identidad para CP y TGB2 respectivamente con respecto a los aislamientos
mundialmente reportados de PMTV Sin embargo dichos anaacutelisis fueron conducidos con un
bajo nuacutemero de secuencias (cuatro para CP y tres para TGB2) debido a las dificultades
experimentales que representa el trabajo con este virus (bajo tiacutetulo en plantas de papa
distribucioacuten erraacutetica ausencia de cebadores especiacuteficos para cepas andinas etc)
Por lo anterior esta investigacioacuten se planteoacute con el propoacutesito de ampliar el nuacutemero de
secuencias de CP y TGB2 de aislamientos de PMTV obtenidos en diferentes regiones
cultivadoras de papa de Colombia de manera que fuera posible determinar si la presencia de
las variantes de este virus corresponde a una situacioacuten generalizada o por el contrario responde
al efecto de muestra dado el bajo nuacutemero de cepas analizadas por Veacutelez (2007) y Gil et al
(2011) Adicionalmente se realizoacute la secuenciacioacuten de una gran parte del ARN 2 y ARN 3 de
una cepa obtenida en el Departamento de Antioquia y otra en el Departamento de Boyacaacute
(Colombia) realizaacutendose un anaacutelisis de variacioacuten con respecto a las secuencias de referencia de
genomas completos disponibles en las bases de datos moleculares
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y preparacioacuten de muestras
Se obtuvieron muestras de raiacuteces y tubeacuterculos de papa con siacutentomas de sarna polvosa asiacute
como de suelos de lotes con reportes de la presencia de Sss en las zonas productoras de
papa de los municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio
Subachoque y Villapinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute y Oicataacute (Boyacaacute) y
Pasto e Ipiales (Narintildeo) Para la separacioacuten de los quistosoros del suelo se siguioacute la
metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la cual las muestras de suelo (500g) son
pasadas por un juego de tamices de 100 y 25 microm Los quistosoros obtenidos fueron
inoculados en Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo
para incrementar el inoacuteculo de PMTV a partir de la infeccioacuten de su vector Sss (Veacutelez
2007) El material vegetal fue mantenido en casa de malla en el Centro Experimental
91
Paysanduacute ubicado en el corregimiento de Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB
2550 msnm temperatura media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) Tres
meses despueacutes de la siembra se recolectaron las hojas y las raiacuteces de las plantas sentildeuelo
para su procesamiento en el laboratorio
Secuenciacioacuten de CP y TGB2
Se obtuvo el ARN total de plantas de N benthamiana y S phureja mediante el kit RNeasy
plant mini (Qiagen EEUU) a partir de 100 mg de tejido utilizando 450 μL de buffer RLT
para tejido foliar o RLC para raiacuteces y 45 μL de β-mercaptoetanol y siguiendo las
instrucciones del fabricante Al finalizar el procedimiento el ARN obtenido se eluyoacute en 40
μL de agua destilada esteacuteril tratada con DEPC
Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos En las reacciones de
retrotranscripcioacuten se utilizoacute un volumen final de 20 microL incluyendo 05 microL de agua
destilada esteacuteril 15 microL de PBST (05) 4 microL de buffer RT (5X) 4 microL de MgCl2 (25
mM) 2 microL de dNTPs (10 mM) 2 microL de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de
ARNasas (40UmicroL) 05 microL de enzima M-MuLV Transcriptasa Reversa (20 UmicroL)
(Fermentas Lituania) y 5 microL de ARN o alternativamente una dilucioacuten 15 El programa de
RT fue de 37degC por 60 min seguido de 70degC por 10 min para inactivar la enzima Las
muestras se almacenaron a 4degC hasta su uso posterior
Para las reacciones de PCR se emplearon los cebadores especiacuteficos H360 (5rsquo CAT GAA
GGC TGC CGT GAG GAA GT 3rsquo) y C819 (5rsquo CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA
CC-3rsquo) (MacKenzie 1996) para amplificar una regioacuten de 459 pb del gen CP entre las
posiciones 385 y 844 del genoma viral (Figura 51) y PMTVF4 (5rsquo CAG CAA CCA CAA
ACA GAC AGG 3rsquo) y PMTVR4 (5rsquo AGC CAC TAA CAA AAC ATACTGC 3rsquo) para
obtener amplicones de 415 pb del TGB2 entre las posiciones 1726 y 2141 del ARN 2 (Xu
et al 2004) (Figura 52) Para algunos aislamientos en los que se dificultaba la
amplificacioacuten del TGB2 se utilizaron los cebadores PMTV5 (5 GGT GAA CAC GAG
GAC AAG GT 3) y PMTV7 (5 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 3) (Lambert et al
2003) que amplifican un fragmento de 646 pb y se extienden entre las posiciones del
92
genoma 1417 a 2063 Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 microL
incluyendo 158 microL de agua destilada esteacuteril 25 microL de buffer de enzima (10X) 18 microL de
MgCl2 (25 mM) 05 microL de dNTPs (10 mM) 05 microL de cada cebador (10 microM) 02 microL de
Albuacutemina de suero bovino (20 mgml) (Fermentas) 02 microL de Taq ADN polimerasa (5
UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ADNc aunque en algunas ocasiones dada la falta de
amplicones fue necesario preparar diluciones de 15 110 o 125 de ADNc Las
amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra Alemania) y consistieron
de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 40 ciclos de 94degC por 30 s
53degC por 45 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10 min Luego de
la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se separaron por
electroforesis en gel de agarosa al 15 suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) y
su tamantildeo se verificoacute por comparacioacuten con el marcador de peso molecular Generuler 100
pb DNA ladder (Fermentas)
Los amplicones del tamantildeo esperado correspondientes al menos a cuatro aislamientos
representativos de cultivos de papa de cada uno de los cuatro departamentos bajo estudio
fueron purificados del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para realizar
su secuenciacioacuten directa en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores empleados en
la PCR y el kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied
Biosystems EEUU) Su corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism
3730xl (PE Applied Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur)
A partir de las secuencias obtenidas con cada cebador se construyeron las secuencias
consenso mediante el software BioEdit 606 (Hall 1999) y Chromas Lite (Technelysium
2009) Posteriormente se confirmoacute su origen viral por comparacioacuten con las bases de datos
moleculares con el programa BLASTn (httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) y
se obtuvieron secuencias de PMTV del GenBank de otras regiones del mundo para realizar
un anaacutelisis filogeneacutetico Para esto se generoacute un alineamiento mediante Clustal W (Larkin et
al 2007) del Software Bioedit 606 Los alineamientos fueron utilizados para construir una
una matriz de distancia geneacutetica utilizando el meacutetodo de Maacutexima verosimilitud basado en
el modelo de Tamura-Nei (1993) implementado en el software MEGA v40 (Tamura et al
93
2007) Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute un anaacutelisis de
Bootstrap con 1000 remuestreos (Felsenstein 1985)
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Con el fin de obtener un mayor nivel de informacioacuten sobre las caracteriacutesticas de los
segmentos ARN 2 y ARN 3 del genoma de aislamientos Colombianos de PMTV se realizoacute
un proceso de secuenciacioacuten con minado de cebadores previamente reportados para la
amplificacioacuten de diferentes regiones de cada uno de dichos segmentos (Tabla 51 Figura
53) y buscando que generaran traslape de secuencias de manera que fuera posible la
construccioacuten de un contig general para cada segmento Para esto se seleccionaron cuatro
cepas de PMTV representativas de cada uno de los departamentos bajo anaacutelisis Con cada
cepa se realizaron por lo menos dos amplificaciones con cada cebador de manera que las
secuencias reportadas correspondieran al consenso para cada amplicoacuten Los procedimientos
de extraccioacuten de ARN PCR y secuenciacioacuten fueron similares a los descritos anteriormente
aunque las RT se realizaron con la enzima Transcriptasa Reversa Maximareg (Fermentas)
que ofrece mayores niveles de estabilidad teacutermica (hasta 65degC) y eficiencia que las
transcriptasas reversas convencionales En este caso las reacciones de RT consistieron de
95 microL de agua libre de nucleasas 4 microL de buffer RT (5X) 1 microL de dNTPs (10 mM) 1 microL
de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de ARNasas (40UmicroL) 1 microL de enzima
Transcriptasa Reversa Maximareg (200 UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ARN para un volumen
final de 20 microL La incubacioacuten se realizoacute a 50degC por 30 min y la enzima se inactivoacute a 85degC
por 5 min
Las secuencias se editaron mediante el software Chromas Lite generaacutendose los consensos
con ambos cebadores usando el programa Bioedit 606 y se procedioacute al ensamblaje de los
contigs resultantes utilizando el programa CAP3 (Huang y Madan 1999) Posteriormente
se verificoacute el marco de lectura correcto utilizando el servidor de Expasy (Expasy Proteomic
Server httpwwwexpasychtoolsdnahtml) y se realizoacute su alineamiento con respecto a
los dos segmentos genoacutemicos de aislamientos cuyas secuencias completas se encontraban
disponibles en GenBank (DQ102381 DQ144451 AJ243719 AJ277556) (Sandgren et al
2001 Cerovska et al 2007)
94
Finalmente las secuencias de nt fueron traducidas a aa realizaacutendose comparaciones de
porcentajes de identidad y nuacutemero de posiciones variables a lo largo de las regiones bajo
estudio y generaacutendose aacuterboles filogeneacuteticos basados en los contigs obtenidos en la
investigacioacuten mediante el programa Mega v 40 bajo los paraacutemetros antes descritos
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Variabilidad geneacutetica de PMTV de Colombia
En total se obtuvieron 25 secuencias para la regioacuten amplificada de CP y 38 secuencias para
TGB2 Estas secuencias correspondieron a por lo menos cuatro aislamientos por cada
departamento bajo anaacutelisis (Tabla 52) De esta forma se aumentaron las secuencias
parciales de los genes CP y TGB2 de PMTV con respecto al trabajo reciente realizado por
nuestro grupo (Gil et al 2011) en donde soacutelo se obtuvieron cuatro y tres secuencias para
CP y TGB2 lo cual implica que las diferentes modificaciones realizadas a los
procedimientos necesarios para el estudio de este virus desde la forma de obtencioacuten de las
muestras hasta la purificacioacuten de los amplicones pasando por la eliminacioacuten de inhibidores
de las polimerasas resultaron altamente eficientes Esta situacioacuten abre la posibilidad de
plantear en el futuro proacuteximo un estudio de incidencia de PMTV basado en la deteccioacuten del
virus mediante RT-PCR con un muestreo estratificado en los diferentes pisos teacutermicos
donde se cultiva la papa en Colombia y realizando comparaciones con respecto a los
niveles de incidencia de Sss de manera que sea posible determinar la dimensioacuten de los
niveles de dispersioacuten de este virus en este paiacutes suramericano Un trabajo similar fue
realizado por Montero-Astuacutea et al (2008) en Costa Rica pero utilizando pruebas de ELISA
tanto para la deteccioacuten de Sss como de PMTV En este caso se encontroacute que el virus era
maacutes frecuentemente detectado en las regiones con mayores altitudes donde las condiciones
de alta humedad y bajas temperaturas aparentemente favorecen su infeccioacuten Sin embargo
es probable que la utilizacioacuten de pruebas de ELISA para la deteccioacuten del virus haya
conducido a una subestimacioacuten de los niveles de incidencia detectados en dicho trabajo
pues la distribucioacuten erraacutetica del virus su capacidad de movimiento ceacutelula-ceacutelula con ayuda
de proteiacutenas de movimiento codificadas por el TGB y no necesariamente en su forma
95
encapsidada y la utilizacioacuten de anticuerpos disentildeados a partir de cepas del norte de Europa
pueden influir negativamente en la deteccioacuten seroloacutegica del PMTV (Gallo et al 2012)
El anaacutelisis filogeneacutetico para CP incluyoacute 404 posiciones a partir de 46 secuencias 15 de las
cuales corresponden a aislamientos de referencia de Europa Asia y Norte Ameacuterica y las 4
previamente reportadas de aislamientos Colombianos por Gil et al (2011) El dendrograma
presentoacute dos grupos soportados por valores de bootstrap del 100 (Figura 54) El primer
clado agrupoacute todas las secuencias de referencia con 19 de los aislamientos Colombianos
obtenidos en este estudio y presentaron niveles de identidad superiores al 99 en todos los
casos (Tabla 53) Por otra parte el segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo seis de las aquiacute obtenidas y dos de las reportadas por Gil et
al (2011) Al interior de este clado se presentaron mayores niveles de variacioacuten (11 a
13) y su identidad con respecto a los miembros del primer clado fue de tan solo 76 La
secuencia de Beet Soil-Borne Virus de China utilizada como grupo externo de anaacutelisis se
ubicoacute en posicioacuten externa a los dos clados y compartioacute niveles de identidad inferiores al
59 con respecto a los aislamientos de PMTV
Estos resultados confirman los hallazgos de Veacutelez (2007) y Gil et al (2011) en referencia a
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que incluso bajo los paraacutemetros
definidos por Adams et al (2009) para la definicioacuten de especies al interior de la familia
Virgaviridae (ej cepas con identidades superiores a 80 y 90 a nivel de secuencias de CP
y del genoma completo respectivamente) podriacutea representar una nueva especie del geacutenero
Pomovirus (Familia Virgaviridae) hasta ahora no registrada en otros lugares del mundo Si
se considera que seis de las 25 secuencias de CP obtenidas en este trabajo correspondieron
a dicha variante es evidente que su presencia no es marginal en los cultivos de papa de
Colombia ya que para la muestra obtenida aunque evidentemente sesgada por la coleccioacuten
de suelos y tejidos con presencia de estructuras de Sss su proporcioacuten es del 23 La
diversidad entre aislamientos podriacutea deberse a que la regioacuten andina ha sido propuesta como
el centro de origen del PMTV (Mayo et al 1996)
96
Estos resultados representan un viraje con respecto a lo encontrado en los estudios de
variabilidad de PMTV con base en secuencias de CP de diferentes oriacutegenes geograacuteficos
por cuanto indistintamente se habiacutea encontrado que los niveles de identidad presentes en
este gen superaban el 98 en todas las comparaciones establecidas Asiacute por ejemplo
Latvala-Kirby et al (2009) al comparar 28 secuencias de Finlandia Letonia Escocia
Dinamarca Repuacuteblica Checa y Suecia encontraron que casi todas eran ideacutenticas siendo tan
soacutelo detectado un 2 de variacioacuten entre las maacutes distantes lo cual representa cambios en tan
soacutelo siete posiciones a nivel de la secuencia de aa de la proteiacutena resultante Similarmente
Xu et al (2004) reportaron que aislamientos de PMTV de Estados Unidos y Canadaacute eran
ideacutenticos y que eacutestos a su vez tan soacutelo diferiacutean en maacuteximo 3 de sus secuencias de CP con
respecto a cepas de Peruacute (Mayo et al 1996) Escocia y Escandinavia (Reavy et al 1997)
De esta forma de gran intereacutes resultaraacute emprender estudios que permitan evaluar las
diferencias bioloacutegicas de dichas variantes de PMTV sobre distintas variedades de papa e
incluso sobre hospedantes experimentales debido a que siacute existen diferencias de
patogenicidad entre aislamientos de PMTV que presentan tan bajos niveles de variacioacuten
(Nielsen y Nicolaisen 2003) es posible que dicho efecto sea auacuten mayor cuando se evaluacuteen
las variantes aquiacute reportadas
Con respecto al anaacutelisis filogeneacutetico basado en las secuencias de TGB2 se incluyeron 330
posiciones de 49 secuencias siete de las cuales fueron de aislamientos de referencia de
diferentes paiacuteses y tres de Colombia previamente analizadas por Gil et al (2011) El
dendrograma generado presentoacute un solo clado que incluyoacute todas las secuencias (Figura
55) las que compartieron niveles de identidad superiores a 98 (Tabla 54) Estos
resultados son un indicativo de que la variacioacuten encontrada entre aislamientos Colombianos
con respecto a CP no necesariamente se presentan a lo largo de los diferentes segmentos
genoacutemicos de PMTV y especiacuteficamente no se ven reflejadas en las secuencias de TGB2
que en los pocos estudios donde se ha secuenciado presenta niveles de identidad superiores
a 948 e incluso se ha encontrado que aislamientos de oriacutegenes geograacuteficos diferentes
pueden compartir hasta el 100 de identidad en la secuencia de aa para este gen (ej
aislamiento Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa y aislamientos 54-15 y 54-19 de
Dinamarca) (Cerovska et al 2007) Los altos niveles de conservacioacuten de este gen entre
97
aislamientos de PMTV que presentan diferencias en otras regiones del genoma como las
aquiacute encontradas para CP posibilitan que los cebadores utilizados para su amplificacioacuten
sean una herramienta uacutetil para el diagnoacutestico de este virus Asiacute por ejemplo Lambert et al
(2003) disentildearon los cebadores PMTV5 y PMTV7 dirigidos a amplificar una regioacuten de 646
pb comprendida entre TGB1 y TGB2 cuando reportaron por primera vez la presencia del
PMTV en EEUU Posteriormente Xu et al (2004) utilizaron la regioacuten que codifica para
TGB2 para el disentildeo de los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 en su estudio de evaluacioacuten de
distribucioacuten de PMTV en EEUU y Canadaacute
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Todos los cebadores utilizados en las reacciones de RT-PCR para amplificar diferentes
regiones de los ARN 2 y 3 del genoma de PMTV generaron los amplicones del fragmento
esperado en al menos un aislamiento evaluado Sin embargo en los aislamientos de Narintildeo
y Cundinamarca no fue posible la obtencioacuten de un contig completo para toda la regioacuten
secuenciada de ambos segmentos auacuten luego de diferentes intentos y modificaciones de los
paraacutemetros de la RT-PCR De esta forma para el caso de los aislamientos de Narintildeo no se
lograron amplicones del ARN2 con los cebadores PMTV759 ndash PMTV1552R PMTV759F
ndash 2017R y 1948F ndash 123end para el ARN 3 no fue posible obtener fragmentos con
RNA3F1ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end y F388 ndash PMTV7 Para el caso de
Cundinamarca no se lograron amplicones para el ARN 2 con PMTV759 ndash PMTV1552R y
PMTV759F ndash 2017R y para ARN 3 con RNA3F1 ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end
F388-PMTV7 Considerando que las variantes detectadas mediante la secuenciacioacuten de una
porcioacuten de CP presentaron bajos niveles de identidad con respecto a los genotipos
globalmente distribuidos de PMTV es posible que la ausencia de amplificacioacuten se deba a
diferencias en los sitios de reconocimiento de uno o ambos cebadores situacioacuten que impide
la amplificacioacuten de los fragmentos respectivos y por tanto su secuenciacioacuten posterior De
gran intereacutes seraacute continuar el proceso de secuenciacioacuten de dichas variantes para lo cual es
necesario la clonacioacuten de los respectivos cDNAs de cada segmento y el disentildeo de nuevos
cebadores especiacuteficos que permitan completar los vaciacuteos (gaps)
98
Por las razones antes expuestas para los anaacutelisis de secuencias de ARN2 y 3 soacutelo se
incluyeron los aislamientos representativos de Antioquia (Ant) y Boyacaacute (Boy) (Tabla
55) Para el ARN 2 se obtuvieron contigs de 2577 nt y 2584 para los aislamientos
Antioquia y Boyacaacute mientras que para el ARN 3 los contigs tuvieron una extensioacuten de
2617 y 2360 nt respectivamente Esto implica que para el ARN 2 se obtuvo un porcentaje
de cobertura del 83 de este segmento genoacutemico y del 87 para el ARN 3 en
comparacioacuten con el aislamiento Sw de PMTV (AJ243719 y AJ277556) (Sandgren et al
2001) En teacuterminos de aa los contigs del ARN2 incluyeron 150 de los aa de CP (posiciones
26 a 176) y 799 de CP-RT (posiciones 26 a 825) Para el ARN 3 se obtuvo la secuencia
completa de aa de TGB1 (463 aa) y TGB2 (119 aa) asiacute como 146 de 190 aa de TGB3
(posiciones 1 a 146) para el aislamiento de Boyacaacute y la totalidad de dicha proteiacutena para la
cepa de Antioquia Las demaacutes secuencias obtenidas corresponden a regiones UTR de los
extremos 3acute para el ARN 2 y 5acute para el ARN 3
Con el fin de realizar un anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las dos cepas obtenidas
con respecto al genoma de la cepa de PMTV de Suecia ndash Sw cuyo genoma completo estaacute
depositado en GenBank bajo el coacutedigo PRJNA14789 (Savenkov et al 1999 Sandgren et
al 2001) se incluyeron 1956 nt (651 aa) para CP-RT 531 nt (176 aa) para CP y 1392 (463
aa) para las tres regiones del TGB En teacuterminos generales se encontraron muy altos niveles
de identidad en las tres regiones analizadas siendo la CP la maacutes uniforme con 99 en la
secuencia de nt y 100 en aa para las tres cepas CP-RT presentoacute un nivel de identidad
para nt de 994 entre las cepas de Antioquia y Boyacaacute y del 975 - 976 con respecto a
la secuencia de referencia mientras que estos valores fueron superiores al 982 cuando se
comparoacute la secuencia de aa Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos compartieron
un 999 de identidad en nt y aa (Figura 56) Las pocas diferencias a nivel de aa
encontradas en este estudio correspondieron a cambios en 15 posiciones para el producto
del ARN 2 siendo la maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la posicioacuten 81
de CP Para el caso de TGB se encontraron 10 cambios a lo largo de las tres proteiacutenas
analizadas con la presencia de una delecioacuten en la posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
99
Por otra parte el anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2569 nt para ARN 2 con
secuencias de referencia de los aislamientos Corneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia (Figura 57) arrojoacute un dendrograma con dos
clados soportados por 100 de bootstrap separaacutendose los aislamientos de Colombia de los
de Europa sin embargo los niveles de identidad entre ambos grupos fueron muy altos
(gt975) (Tabla 56) Al calcular los niveles de diversidad (promedio del nuacutemero de
sustituciones de nucleoacutetidos por cada sitio) para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos
(dNS) se encontroacute una diversidad muy baja con tan soacutelo 0017 (SE= 0003) para dNS y
0009 (SE=0002) para dS La relacioacuten promedia entre dNSdS fue de 18 lo cual indica
que las cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten positiva para este componente del
genoma Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 3 mientras que para las
europeas fue de 12 La distancia geneacutetica o nuacutemero de sustituciones promedio por sitio
basada en el meacutetodo de Kimura-2 paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0015
El anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de
referencia de los aislamientos Korneta-Nemilkov (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia generoacute
un dendrograma con dos clados de aislamientos europeos mientras que los aislamientos
Colombianos se presentaron en forma individual sobre ramas soportadas por 100 de
bootstrap (Figura 58) A pesar de dichas agrupaciones los niveles de identidad entre todos
los aislamientos fueron superiores a 967 (Tabla 57) Al calcular los niveles de
diversidad para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos (dNS) se encontroacute una diversidad
muy baja para todos los aislamientos con tan soacutelo 0011 (SE= 0002) para dNS y 0044
(SE=0006) para dNS La relacioacuten media entre dNSdS fue de 025 lo cual indica que las
cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten estabilizadora en dicho segmento de ARN
Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 019 mientras que para los
aislamientos europeos fue de 039 La distancia geneacutetica basada en el meacutetodo de Kimura -2
paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0020 (SE 0002)
Los bajos niveles de variacioacuten encontrados en los anaacutelisis de genomas de PMTV (Savenkov
et al 1999 Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) y que nuevamente fueron inferidos
100
en el presente estudio para las cepas del clado que representa PMTV sensu stricto indican
que este virus se encuentra bajo fuertes presiones de seleccioacuten determinadas
presumiblemente por las propias caracteriacutesticas de su genoma el estrecho rango de
hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica por parte de su vector Sss (Kirk
2008 Santala et al 2010)
Para el primer caso la restriccioacuten selectiva se manifiesta por los bajos valores de dNSdS
calculados para dicho segmento y ocurre fundamentalmente al presentarse traslape de genes
en el ARN 3 Sin embargo para el ARN 2 dicha relacioacuten fue gt1 lo cual sugiere una
seleccioacuten positiva que puede explicarse por el hecho que este segmento presenta la
estrategia de supresioacuten del codoacuten de parada tipo amber para la traduccioacuten de las dos
proteiacutenas codificantes (CP y CP-RT) lo cual supone menos restricciones para la fijacioacuten de
mutaciones De otra parte la presencia de un estrecho rango de hospedantes para el virus
que se restringe a algunas especies de las familias Solanaceae y Chenopodiaceae (Kirk
2008) aunada a su transmisioacuten por Sss supone fuertes restricciones sobre los cambios en
las diferentes proteiacutenas del virus que interactuacutean con sus hospedantes y vectores lo cual
impide altas tasas de variacioacuten tales como las que presentan otros virus de ARNss(+) como
los potyvirus que en general tienen amplios rangos de hospedantes y cuya transmisioacuten por
aacutefidos poliacutefagos es del tipo no persistente (Hu et al 2009)
A pesar de los altos valores de uniformidad general encontrados de gran intereacutes resultoacute la
presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los aislamientos
colombianos de PMTV Por esto es necesario en el futuro evaluar el significado bioloacutegico
de dichos cambios por ejemplo si estan relacionadas con el efecto de las variedades nativas
de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas que las poblaciones de Sss
tienen en las regiones Andinas donde se presentan mayores niveles de variacioacuten que en
aquellas encontradas en las regiones cultivadoras de papa del hemisferio norte tal como lo
planteoacute Carrentildeo (2009) El efecto de estas inserciones y de diferentes sustituciones
detectadas en este trabajo sobre diferentes regiones de los segmentos de ARN 2 y 3
requiere un tratamiento futuro detallado a partir de anaacutelisis de mutantes y de sus efectos
sobre el ciclo infectivo viral
101
Esta investigacioacuten representa un avance importante en la caracterizacioacuten geneacutetica del
PMTV en las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia Sus resultados
confirman la presencia de dos genotipos principales de este virus en el paiacutes uno que
representa al PMTV sensu stricto destacado por presentar muy bajos niveles de variacioacuten
entre sus cepas y otro que representa una variante hasta ahora soacutelo identificada en
Colombia y que por presentar porcentajes de identidad inferiores al 80 con respecto al
grupo principal podriacutea representar una nueva especie de pomovirus que requiere ser
evaluada bioloacutegica patogeacutenica y molecularmente Finalmente es imperativo estudiar el
efecto de ambos genotipos virales sobre la produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de
papa en Colombia de manera que los organismos de sanidad vegetal estatales gremios de
productores y agroindustrias puedan valorar la necesidad de incluir la deteccioacuten del PMTV
en los programas de certificacioacuten de semilla y de mejoramiento geneacutetico de papa que se
adelantan en el paiacutes
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz
Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el
Departamento de Narintildeo
102
BIBLIOGRAFIacuteA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Arif M Torrance L Reavy B 1995 Acquisition and transmission of Potato mop-top
furovirus by a culture of Spongospora subterranea f sp subterranea derived from a single
cystosorus Annals of Applied Biology 126493-503
Calvert E Harrison BD 1966 Potato mop-top a soil-borne virus Plant Pathology
15134ndash139
Carnegie SF Saddler GS Peters JC 2009 Cultivar susceptibility to Potato mop-top virus
(PMTV) infection and symptom expression Aspects of Applied Biology 94 (Potatoes
Viruses and their Vectors) 51ndash54
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea
fsp subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Cerovska N Moravec T Rosecka P Filigarova M Pecenkova T 2003 Nucleotide
sequences of coat protein coding regions of six potato mop-top virus isolates Acta
Virologica 4737-40
Cerovska N Pecenkova M Foligarova M Dedic P 2007 Sequence analysis of the
Czech Potato mop-top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica
5261-64
103
Cowan GH Torrance L Reavy B1997 Detection of Potato mop-top virus capsid
readthrough protein in virus particles Journal of General Virology 781779-1783
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
Scotland
Felsenstein J 1985 Confidence limits on phylogenies an approach using the bootstrap
Evolution 39(4)783-791
Gallo Y 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea en Bioquiacutemica Facultad de Medicina Universidad Nacional
de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Gil JF Gutieacuterrez P Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
Hall TA 1999 BioEdit a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis
program for Windows 9598NT Nucleic Acids Symposium Series 4195-98
Harrison BD Jones RAC 1970 Host range and some properties of Potato mop-
top virus Annals Applied Biology 65393-402
104
Hu X Karasev AV Brown CJ Lorenzen JH 2009 Sequence characteristics of potato
virus Y recombinants Journal of General Virology 903033ndash3041
Huang X Madan A 1999 CAP3 A DNA sequence assembly program Genome
Research 9868-877
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 7147-57
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Kirk HG 2008 Mop-top virus relationship to its vector American Journal of Potato
Research 85 261-265
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003
First Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease
87872
Larkin M Blackshields G Brown NP Chenna R McGettigan PA McWilliam H
Valentin F Wallace IM Wilm A Loacutepez R Thompson JD Gibson TJ Higgins DG
2007 Clustal W and Clustal X version 20 Bioinformatics 23(21)2947-2948
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99519-531
105
Lim HS Bragg J N Ganesan U Lawrence DM Yu J L Isogai M Hammond J
Jackson AO 2008 Triple gene block protein interactions involved in movement of Barley
stripe mosaic virus Journal Virology 824991-5006
Lim HS Bragg J N Ganesan U Ruzin S Schichnes D Lee MY Vaira AM Ryu KH
Hammond J Jackson AO 2009 Subcellular localization of the Barley stripe mosaic virus
triple gene block proteins Journal Virology 839432-9448
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization
and effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal
of General Virology 862879-2889
MacKenzie DJ 1996 Detection of potato mop-top virus in leaf or tuber tissue by reverse
transcription-polymerase chain reaction Document CPHBT96K03 Centre for Plant Health
Agriculture and Agri-Food Canada Sidney BC Canada
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C
Salazar LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top
virus from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
Montero-Astuacutea M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U and Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Mumford RA Walsh K Barker I Boonham N 2000 Detection of Potato mop top virus
and Tobacco rattle virus using a multiplex real-time fluorescent reverse transcription
polymerase chain reaction assay Phytopathology 90448-453
106
Nakayama T Maoka T Hataya T Shimizu M Fuwa H Tsuda S Motoyuki M 2010
Diagnosis of Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-225
Nielsen SL Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups
within Potato mop-top virus Archives of Virology 148 381-388
Reavy B Sandgren M Barker H Heino P Oxelfelt P 1997 A coat protein transgene
from a Scottish isolate of Potato mop-top virus mediates strong resistance against
Scandinavian isolates which have similar coat protein genes European Journal of Plant
Pathology 103829-834
Roos J Hopkins R Kvarnheden A Dixelius C 2011 The impact of global warming on
plant diseases and insect vectors in Sweden European Journal of Plant Pathology 1299-19
Ryazantsev DY Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato viral pathogens Molecular Biology 43515-523
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M
Wieczorek P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-
Wiśniewska J Yin Z Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E
Taluntytė L Pūpola N Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E
107
Sozonov A Tikhonovich I Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam
G Valkonen JPT 2010 Detection distribution and control of Potato mop-top virus a soil-
borne virus in northern Europe Annals of Applied Biology 157163-178
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003
Potato mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich
protein are dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of
General Virology 841001-1005
Savenkov EI Sandgren MY Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Tamura K Dudley J Nei M Kumar S 2007 MEGA4 Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) software version 40 Molecular Biology and Evolution 241596-1599
Tamura K Nei M 1993 Estimation of the number of nucleotide substitutions in the
control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Molecular Biology and
Evolution 10512-526
Technelysium 2009 Chromas 20 Consultado el 15 de Febrero de 2009 Disponible en
httpwwwtechnelysiumcomauchromas_litehtml
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Research 83423-31
Torrance L Cowan GH Pereira LG 1993 Monoclonal antibodies specicreg for Potato
mop-top virus and some properties of the coat protein Annals of Applied Biology 122311-
322
108
Torrance L Cowan GH Sokmen M A Reavy B 1999 A naturally occurring deleted
form of RNA 2 of Potato mop-top virus Journal of General Virology 802211-2215
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop-top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI
Torrance L 2010 The N-Terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required
for nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant-Microbe Interaction 23(11)1486-1497
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top
virus in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
109
51 Anexos
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb) dirigidos al
gen de la caacutepside viral de PMTV a partir de muestras de tejido de raiacutez de plantas de N
benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea del
Departamento de Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador 100 pb Carril 2 BS8T Carril 3
BS9T Carril 4 BS4T Carril 5 BS11P Carril 6BS4T Carril 7 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7
500 pb
110
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb)
dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) de PMTV a partir de muestras de tejido de
raiacutez de plantas de N benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S
subterranea de los Departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador
100 pb Carril 2-4 Control positivo (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 5-7
SRL5 (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 8-10 SRL7 (ADN directo
110150 respectivamente) Carril 11-13 BS8T (ADN directo 110150
respectivamente) Carril 1415 BS4T1 (ADN directo y 110) Carril 16 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
500 pb
111
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten de los
segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV)
Cebador Secuencia 5acute- 3 Posicioacuten en el
genoma (nt) Referencia
RNA3 F1 CGCTCGAGTTTAGGTGACACTATAGGTATTTCA
ACTCTACCTAG 1 a 388
Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003 PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
PMTVF4 CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG 1726 a 1746 Xu et al
2004
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
F388
CGGGATCCGAAGTAGACCACACAGAGTG
1 a 388 Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011 PMTV1552R GCC AAT TGT CTC AAT CAT ACA CTG 1865 a 1888
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011
2017R CCA CTG CAA AAG AAC CGA TTT C Mumford
et al 2000
1948F GTG ATC AGA TCC GCG TCC TT Mumford et al 2000
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
112
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7 (2063 pb)
PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al ARN3 del genoma
del Potato mop-top virus (PMTV) a partir de tejido de raiacutez de plantas de N benthamiana y
S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea de cuatro departamentos de
Colombia Carril 1 Marcador 100 pb plus carriles 2-5 con cebadores RNA3F1-PMTV7
SRL5 SRL6 BS9T1 BS9T2 carril 6-12 con cebadores PMTV5-PMTV7 23T 24T
SRL5 SRL6 BS4T BS8T BS9T carril 13-20 con cebadores PMTVF4-123 end Villa1
NS19P1 23T 24T SRL4 SRL5 SRL6 BS4T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1000 pb 500 pb
113
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos cultivadores de papa de
Colombia
Gen CP Gen TGB2
ANTIOQUIA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
25 La Unioacuten Suelo S tuberosum 25(1) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL4 Santa Rosa S tuberosum var Diacol Capiro 25(2) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL4 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle La Unioacuten Suelo S tuberosum SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle1 La Unioacuten Suelo S tuberosum
Valle2 La Unioacuten Suelo S tuberosum
BOYACAacute
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
BS2T Oicataacute Suelo S tuberosum BS1P1 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4P Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS1P2 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4T Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS4T1 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS8T Soracaacute Suelo S tuberosum BS4T2 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS9T Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum BS8T1 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11P Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS8T2 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11T Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS9T1 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS12P Tunja Suelo con Pennisetum clandestinum BS9T2 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS9T3 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS11T1 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS11T2 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS13P Tunja Suelo S tuberosum
CUNDINAMARCA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
CS1T Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa CS1P1 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2P Subachoque Suelo S tuberosum CS1P2 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2T Subachoque Suelo S tuberosum CS2P Subachoque Suelo S tuberosum
CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Mad Madrid Suelo S tuberosum Villa1 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
114
Villa2 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
NARINtildeO
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
NS1P Pasto Suelo S tuberosum NS3P1 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS2T Pasto Suelo S tuberosum NS3P2 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro NS3P3 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8P Pasto Suelo S tuberosum NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8PF Pasto Suelo S tuberosum
NS10T Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS19P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS19P2 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P2 Ipiales Suelo S tuberosum
115
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de Potato
mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo
Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus (China)
Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte inferior de
las ramas
116
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
BS4T
Boyacaacute
Colombia
CS1T
Cundinamarca
Colmbia
NS2T
Narintildeo
Colombia
NS6P
Narintildeo
Colombia
71MY
Cundinamarca
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AJ243719
PMTV
Suecia
EF545141
Beet Soil-
Borne
Virus
China
BS4T Boyacaacute
Colombia ID 0997 0764 0752 0762 0995 0995 0599
CS1T
Cundinamarca
Colombia
0997 ID 0764 0752 0762 0992 0992 0599
NS2T Narintildeo
Colombia 0764 0764 ID 0891 0876 0769 0769 0571
NS6P Narintildeo
Colombia 0752 0752 0891 ID 0967 0752 0752 0596
71MY
Cundinamarca
Colombia
0762 0762 0876 0967 ID 0762 0762 0599
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0995 0992 0769 0752 0762 ID 1 0594
AJ243719
PMTV Suecia 0995 0992 0769 0752 0762 1 ID 0594
EF545141 Beet
Soil-Borne
Virus China
0599 0599 0571 0596 0599 0594 0594 ID
117
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del
mundo Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus
(China) Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte
inferior de las ramas
118
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
23T
Antioquia
Colombia
NS22P1
Narintildeo
Colombia
Villa2
Cundinamarca
Colombia
DQ144451
Repuacuteblica
Checa
NC_003725
Suecia
EF545142 Beet
Soil-Borne Virus
China
23T Antioquia
Colombia ID 0981 0981 0984 0981 0699
NS22P1 Narintildeo
Colombia 0981 ID 099 0984 0981 0708
Villa2 Cundinamarca
Colombia 0981 099 ID 0987 0984 0708
DQ144451 Repuacuteblica
Checa 0984 0984 0987 ID 099 0714
NC_003725 Suecia 0981 0981 0984 099 ID 0711
EF545142 Beet Soil-
Borne Virus China 0699 0708 0708 0714 0711 ID
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato mop-top virus en cuatro
Departamentos cultivadores de papa de Colombia
Muestra Hospedante Municipio Planta sentildeuelo
Ant (23T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
La Unioacuten (Antioquia)
N benthamiana
Boy (BS4T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Siachoque
(Boyacaacute) N benthamiana
Cund(CS1T) Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
Subachoque (Cundinamarca)
N benthamiana
Nar (NS6P) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro Pasto (Narintildeo) S phureja
119
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia y Boyacaacute
(Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw Suecia A Niveles de
identidad de nucleoacutetidos y aminoaacutecidos (entre pareacutentesis) de las regiones CP CP-RT y
TGB analizadas y la cepa NC_003724 B Regioacuten CP-RT se incluyeron 1956 nt (651 aa)
para CP-RT y 531 nt (176 aa) para CP Se presentaron cambios en 15 posiciones para el
producto del ARN 2 siendo lo maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la
posicioacuten 81 de CP C Regioacuten TGB se incluyeron 1392 nt (463 aa) Se presentan 10
cambios a lo largo de las tres proteiacutenas analizadas con la presencia de una delecioacuten en la
posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
120
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con secuencias de
referencia de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia y secuencias Colombianas de PMTV
procedentes de Antioquia y Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de
Bootstrap (100 ) se indican sobre las ramas La escala representa las sustituciones
promedio por sitio
121
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica Checa
AJ243719
PMTV Suecia
Antioquia
Colombia ID 0994 0979 0976
Boyacaacute
Colombia 0994 ID 0978 0975
DQ102381 PMTV
Repuacuteblica Checa 0979 0978 ID 0995
AJ243719 PMTV
Suecia 0976 0975 0995 ID
122
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de referencia
de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19
(AY353719) y 54-10 (AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd
(D30753) de Escocia y secuencias Colombianas de PMTV procedentes de Antioquia y
Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de Bootstrap (100 ) se indican
sobre las ramas La escala representa las sustituciones promedio por sitio
123
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AY426745
PMTV
Dinamarca
AY353719
Dinamarca
AJ277556
PMTV
Suecia
D30753
PMTV
Escocia
Antioquia
Colombia ID 0979 0988 0987 0986 0973 0967
Boyacaacute
Colombia 0979 ID 0980 0980 0979 0980 0969
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0988 0980 ID 0998 0997 0979 0971
AY426745
PMTV
Dinamarca
0987 0980 0998 ID 0997 0979 0970
AY353719
PMTV
Dinamarca
0986 0979 0997 0997 ID 0978 0969
AJ277556
PMTV Suecia 0973 0980 0979 0979 0978 ID 0986
D30753 PMTV
Escocia 0967 0969 0971 0970 0969 0986 ID
124
6 ANEXOS GENERALES
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen)
1 Homogenizar 100 mg de tejido de planta en nitroacutegeno liacutequido utilizando un mortero
Adicionar 400 microL de buffer AP1 y 4 microL de la solucioacuten de ARNase A (100mgmL) a
un maacuteximo de 100 mg (peso huacutemedo) o 20 mg (peso seco) de tejido de planta
homogenizado y agitar vigorosamente
2 Incubar la mezcla por 10 min a 65degC Mezclar por inversioacuten 2 oacute 3 veces durante la
incubacioacuten
3 Agregar 130 microL de buffer AP2 al lisado mezclar e incubar por 5 min en hielo
4 Recomendado Centrifugar el lisado por 5 min a 20000 x g (14000 rpm)
5 Pipetear el lisado en la columna QIAshredder Mini spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a 20000 x g (14000 rpm)
6 Transferir la fraccioacuten que pasoacute por la columna del paso 5 en un nuevo tubo sin
disturbar el sedimento de restos celulares
7 Agregar 15 voluacutemenes de buffer AP3E al lisado aclarado y mezclar por pipeteo
8 Pipetear 650 microL de la mezcla de paso 7 incluyendo cualquier precipitado que se
pueda haber formado en la columna DNeasy Mini spin column colocando en un
tubo de coleccioacuten de 2 ml Centrifugar por 1 min a 6000 x g (corresponde a 8000
rpm para la mayoriacutea de las microcentrifugas) y descartar el liacutequido Reutilizar el
tubo de coleccioacuten en el paso 9
9 Repetir el paso 8 con la muestra restante Desechar el liacutequido que atraviesa la
membrana y el tubo de coleccioacuten
10 Colocar la columna DNeasy Mini spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2 ml
agregar 500 microL de buffer AW y centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rpm)
Descartar el liacutequido que atraviesa la membrana y reutilizar el tubo de coleccioacuten en
el paso 12
11 Adicionar 500 microL de buffer AW a la columna DNeasy Mini spin y centrifugar por 2
min a 20000 x g (14000 rpm) para secar la membrana
12 Transferir la columna DNeasy Mini spin a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL y
pipetear 40 microL de Agua bi-destilada directamente en la membrana de DNeasy
Incubar por 5 min a temperatura ambiente (15-25degC) y luego centrifugar por 1 min
a 6000 x g (8000 rpm) para eluir
13 Repetir el paso 12 una vez
125
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo (Doyle y Doyle 1987)
Previo a dar inicio a al procedimiento se debe asegurar de contar con
Nitroacutegeno liacutequido
Bantildeo Mariacutea a 65degC
Enfriar morteros a -20degC
Preparar solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2
Preparar el volumen de buffer CTAB+ β-Mercaptoetanol correspondiente al
nuacutemero de muestras
Desinfestar las muestras con hipoclorito y agua destilada durante 1 min
1 Tomar la raiacutez previamente desinfestada macerarla en nitroacutegeno liacutequido y pasarla a
un tubo eppendorf de 2 mL hasta completar un volumen de 400-500 microL
2 Adicionar 500 microL de buffer de extraccioacuten (CTAB) y 1 de β-Mercaptoetanol (5
microL) previamente preparado
Mezclar por inversioacuten
3 Incubar los tubos a 65degC por 30 min Durante este tiempo hacer inversioacuten de los
tubos cada 5 min
4 Adicionar 250 microL de fenol y 250 microL de cloroformo alcohol isoamiacutelico (241)
Mezclar por inversioacuten
5 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 10 min
6 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL
7 Adicionar un volumen de cloroformo alcohol isoamiacutelico (respecto al sobrenadante)
Mezclar por inversioacuten y centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 5 min
8 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL y repetir
el paso 7
9 Adicionar un volumen de isopropanol friacuteo y 01 voluacutemenes de acetato de sodio 3M
invertir varias veces para precipitar el ADN Llevar las muestras a -20degC por 60 min
como miacutenimo o durante toda la noche Periodos maacutes largos pueden aumentar la
produccioacuten
10 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 15 min a temperatura ambiente
11 Descartar el sobrenadante invirtiendo raacutepida y suavemente los tubos y adicionar 200
microL de etanol friacuteo al 70 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 2 min
12 Descartar el sobrenadante por inversioacuten y secar el pellet a temperatura ambiente
invirtiendo los tubos sobre papel absorbente
13 Resuspender el pellet en 50 microL de agua ultrapura esteacuteril
14 Adicionar 4 microL de ARNasa a cada muestra e incubar en el bantildeo Mariacutea a 37degC
durante miacutenimo 2 horas o durante toda la noche
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
126
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y
hongos filamentosos (Qiagen)
1 Determinar la cantidad de material de planta No usar maacutes de 100 mg
2 Colocar inmediatamente el tejido pesado en nitroacutegeno liacutequido Macerar bien en
un mortero Pasar el tejido en polvo a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL
manteniendo los tubos en nitroacutegeno liacutequido Eacuteste se puede evaporar pero no se
debe permitir que el tejido se descongele Proceder inmediatamente al paso 3
3 Adicionar 450 microL de buffer RLC a un maacuteximo de 100 mg de tejido en polvo
Hacer vortex vigorosamente Nota Asegurar que el B-mercaptoetanol (β-ME)
haya sido agregado al buffer RLC antes de su uso (10 microL de β-ME1 mL de
buffer RLC)
4 Transferir el lisado a la columna QIAshredder spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a maacutexima velocidad (13000 rpm
oacute 18500 x g) Transferir cuidadosamente el sobrenadante que pasoacute por la
columna a un nuevo tubo de microcentriacutefuga sin disturbar el sedimento de
restos celulares en el tubo de coleccioacuten Usar soacutelo el sobrenadante en los pasos
siguientes
5 Adicionar 05 voluacutemenes de etanol (96-100) al lisado aclarado y mezclar
por pipeteo inmediatamente No centrifugar Proceder inmediatamente al paso 6
6 Transferir la muestra (usualmente 650 microL) incluyendo cualquier precipitado
que se haya formado a una columna RNeasy spin (rosada) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL (suministrado) Cerrar suavemente la tapa y centrifugar
por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que pasoacute por la
membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 7
7 Adicionar 700 microL de buffer RW1 a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 8
8 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo en el paso 8 Nota Asegurar que el
buffer RPE tenga adicionado el etanol antes de su uso
9 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 2 min a 8000 x g (10000 rpm) para lavar la membrana
de la columna
10 Opcional Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2
mL (suministrado) y descartar el tubo anterior con el liacutequido Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar a velocidad maacutexima por 1 min (13000 rpm oacute 18500 x g)
11 Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 15 mL
(suministrado) Adicionar 20 microL de agua tratada con DEPC (Dietil
pirocarbonato Qiagen) directamente a la membrana de la columna Cerrar
suavemente la tapa y centrifugar por 1 min a 8000 x g (10000 rpm) para eluir
el ARN
12 Repetir el paso 11
127
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Volumen del componente
para 15 microL de mezcla
Producto de PCR 8 μl
Buffer de la enzima 1 (1X) 1 5 μl
Buffer de la enzima 2 (1X) 1 5 μl
Enzima de restriccioacuten 1 2 μl
Enzima de restriccioacuten 2 2 μl
Volumen total 15 μl
2 Incubar las muestras al bantildeo Mariacutea a 37degC por 12 h-24 h
3 Ralizar el anaacutelisis en gel de agarosa al 25
128
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa RT M-
MuLV para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del componente
para 20 microL de mezcla
Agua bi-destilada 05 microL
PBST (05) 004 15 microL
Buffer RT M-MuLV 5X 1X 4 microL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 microL
dNTPs 10 mM 1 mM 2 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 1 microM 2 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa M-MuLV 20 UmicroL 05 microL
ARN 5 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
129
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 20 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 95 microL
Buffer RT Maacutexima 5X 1X 4 microL
dNTPs 10 mM 05 mM 1 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 05 microM 1 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa Maximareg 200 UmicroL 1 microL
ARN 3 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
130
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes de
descongelar
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 146 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 25 mM 02 mM 2 microL
Primer F 10 microM 05 microM 125 microL
Primer R 10 microM 5 microM 125 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 04 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN Molde 1microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Condiciones del ciclo de la PCR para Sss
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 55 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
131
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes del
descongelamiento
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25
microL de mezcla
Agua bi-destilada 158 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 10 mM 02 mM 05 microL
Primer F 10 microM 2 microM 05 microL
Primer R 10 microM 2 microM 05 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 02 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN copia 3 microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 53 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
134
7 CONCLUSIONES GENERALES
En este estudio se encontroacute que las poblaciones Colombianas de Spongospora subterranea
f sp subterranea (Sss) presentan una estructura baacutesica consistente en tres tipos geneacuteticos
(I II y III) El subgrupo III difiere de los reportados mundialmente como Tipo I y Tipo II
en 5 y 2 respectivamente El Tipo III presentoacute la mayor proporcioacuten de aislamientos de
Sss en este estudio con cepas de diferentes departamentos hospedantes y tejidos
sintomaacuteticos mientras que el Tipo I no fue encontrado en muestras procedentes de agallas
de raiacutez Es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa en Colombia asiacute como su
epidemiologiacutea y capacidad para la transmisioacuten de PMTV
Los anaacutelisis de RFLPs de regiones ITS del ADNr de Sss demostraron polimorfismos en los
sitios de corte de las enzimas Hin6I y Bsp143I Se confirmoacute que la digestioacuten con la enzima
Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos del Tipo III mientras que
el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los Tipos I y II permitiendo
separar los tres principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico de Sss Los
resultados obtenidos sugieren la viabilidad de plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla
El anaacutelisis filogeneacutetico para el gen CP de PMTV permitioacute separar dos grupos de
aislamientos del virus El primer clado agrupoacute todas las secuencias de referencia mundial
con 19 de los aislamientos Colombianos obtenidos en este estudio que presentaron niveles
de identidad superiores al 99 El segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo dos de las reportadas en investigaciones previas y seis
obtenidas en el presente estudio con niveles de variacioacuten del 11 al 13 y con una identidad
de tan solo 76 con respecto a los miembros del primer clado Estos resultados confirman
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que no ha sido registrada en otros
Osorio 2012
135
135
lugares del mundo Es necesario estudiar el efecto de ambos genotipos virales sobre la
produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de papa en Colombia de manera que se generen
tecnologiacuteas para la deteccioacuten de PMTV en los programas de certificacioacuten de semilla y de
mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en el paiacutes
En el anaacutelisis de las regiones parciales de CP y CP-RT del ARN2 y TGB del ARN3 de
PMTV sensu stricto se encontraron niveles muy altos de identidad en las tres regiones
estudiadas siendo la CP la maacutes uniforme Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos
compartieron un 999 de identidad en nt y aa Asiacute mismo los anaacutelisis filogeneacuteticos para el
ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Europeos y Colombianos demostraron que los niveles de
identidad entre ambos grupos fueron muy altos gt975 para ARN 2 y gt967 para el
ARN 3 Estos bajos niveles de variacioacuten permiten inferir que este virus se encuentra bajo
fuertes presiones de seleccioacuten determinadas presumiblemente por las propias caracteriacutesticas
de su genoma el estrecho rango de hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica
por parte de su vector Sss Sin embargo a pesar de los altos valores de uniformidad general
encontrados la presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los
aislamientos colombianos de PMTV resulta interesante para el desarrollo de
investigaciones que permitan determinar si se trata de adaptaciones del genoma viral a las
variedades nativas de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas propias de
las poblaciones de Sss en las regiones Andinas
NS1P Pasto (Nar) Suelo S tuberosum
viii
Pag
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia
y Boyacaacute (Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw
Suecia 119
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con
secuencias de referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del
Potato mop-top virus (PMTV) 120
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias
De referencia de aislamientos Europeos y Colombianos del Potato
mop-top virus (PMTV) 122
ix
INDICE DE TABLAS
Pag
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o
raiacuteces de plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea 67
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna
polvosa y de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad 72
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de
aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en
Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2
del ADN ribosomal 78
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S
E ITS2 del ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp
subterranea de Colombia y otros paiacuteses del mundo 81
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten
de los segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV) 111
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia 113
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 116
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de
aislamientos de PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo 118
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la
obtencioacuten de aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato
mop-top virus en cuatro Departamentos cultivadores de papa de Colombia 118
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 118
x
Pag
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3
de aislamientos del Potato mop-top virus (PMTV) de Colombia y Europa 123
xi
RESUMEN
El cultivo de papa es uno de los renglones agriacutecolas de mayor importancia en Colombia se
extiende a 128701 ha y genera una produccioacuten anual de 23 millones de ton antildeo-1
Desde el
punto vista fitosanitario la papa se ve afectada por diversos problemas destacaacutendose en los
uacuteltimos antildeos la reemergencia de la Sarna polvosa causada por el protozoario del suelo
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) El efecto de esta enfermedad se refleja en
el deterioro de la calidad del tubeacuterculo y en la reduccioacuten de la produccioacuten al afectar el
sistema radicular de las plantas Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus
(PMTV) uno de los virus prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarenteneario en diferentes paiacuteses del mundo En este trabajo se evaluaron los niveles de
variabilidad geneacutetica de aislamientos Sss y PMTV obtenidos en cultivos de papa de los
departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo En el caso de Sss se
estudiaron los niveles de variacioacuten de 127 aislamientos a partir de la secuenciaciacioacuten de
las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr) encontraacutendose la presencia de tres variantes
principales dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada Para PMTV se
evaluaron los niveles de identidad de 38 aislamientos de los cuatro departamentos bajo
estudio a partir de la secuenciacioacuten de los genes de la caacutepside viral (CP) y del segundo gen
del triple bloque de genes (TGB2) encontraacutendose la presencia de dos variantes del virus
una que representa el genotipo mundialmente reportado para este virus y la otra que hasta
ahora soacutelo se ha encontrado en Colombia y que dado el bajo nivel de identidad (76) con
respecto al primer grupo posiblemente representa una nueva especie de pomovirus
Finalmente dos de las cepas de PMTV de Antioquia y Boyacaacute fueron secuenciadas para
sus ARN 2 y 3 lograacutendose un 83 del segmento genoacutemico de ARN 2 y 87 para el ARN
3 y encontraacutendose que comparten niveles de identidad superiores al 97 con respecto a
otros aislamientos previamente caracterizados en el Norte de Europa Se espera que los
resultados de esta investigacioacuten sean utilizados para el disentildeo de herramientas de
xii
diagnoacutestico que apoyen los esquemas de certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas
de mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en Colombia
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum Potato mop-top
virus secuenciacioacuten
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea AND ITS
ASSOCIATED PMTV VIRUS IN COLOMBIA
ABSTRACT
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
The other hand Sss is a vector for Potato mop-top virus (PMTV) a prevalent virus in the
Andean region and quarentenary in several countries However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
xiii
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum Potato mop-top virus
RT-PCR Sequencing
1
1 INTRODUCCIOacuteN
En Colombia el cultivo de la papa ocupa cerca de 128701 ha distribuidas en 14
departamentos de los cuales Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo son responsables
del 80 de la produccioacuten que asciende a cerca de 23 millones de ton antildeo-1
y de la cual
dependen maacutes de 69000 familias del sector rural del paiacutes La cadena de la papa en
Colombia enfrenta un gran nuacutemero de desafiacuteos endoacutegenos y exoacutegenos que disminuyen su
competitividad respecto a los demaacutes paiacuteses del mundo y en especial con relacioacuten a los otros
miembros de la Comunidad Andina de Naciones Entre otros factores los maacutes limitantes
son aquellos relacionados con la carencia de tecnologiacutea en los sistemas de produccioacuten y de
post-cosecha la alta dependencia de insumos agriacutecolas y el bajo nivel de acople entre el
sector primario y el de procesamiento industrial (MADR 2006) Desde el punto vista
fitosanitario el cultivo de la papa se ve afectado por diversos fitopatoacutegenos e insectos
plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la reemergencia de la enfermedad denominada
Sarna polvosa de la papa causada por el protozoario Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) Su efecto no solo se debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten
al deterioro en la calidad y apariencia cosmeacutetica de los tubeacuterculos que afecta draacutesticamente
su valor en el mercado Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop-top virus (PMTV)
uno de los problemas virales prevalentes en la regioacuten Andina y que presenta caraacutecter
cuarentenario para diferentes paiacuteses del mundo (Santala et al 2010)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 de las cosechas en las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro (Solanum tuberosum) y
papa criolla (S phureja) (SINAIPA 2002) Por otra parte se estima que el PMTV puede
causar peacuterdidas hasta del 25 en este cultivo lo cual adicionado al dantildeo causado por Sss
pudiera generar disminuciones de 50-80 en la produccioacuten (Jones y Harrison 1972
Guerrero 1997 2000) Aunque se cree que este virus tiene como centro de origen los
Andes suramericanos no se ha establecido con certeza su efecto sobre el rendimiento de las
variedades alliacute cultivadas ni determinado claramente los siacutentomas que causa en sus
hospedantes (Salazar 1995) De esta forma no es frecuente encontrar la sintomatologiacutea
asociada a este virus reportada para la regioacuten templada que incluye amarillamiento foliar
2
anillos necroacuteticos y cuarteamiento o agrietamiento de tubeacuterculos y moteados foliares tipo
ldquoAucubardquo (Salazar 1995 Xu et al 2004)
Adicionalmente a esta problemaacutetica la diseminacioacuten de Sss se viene incrementando
dramaacuteticamente en el paiacutes como resultado de la deficiente calidad de la semilla utilizada
por la mayoriacutea de los agricultores la ausencia de variedades tolerantes a dicho patoacutegeno y
la carenciadeficiencia de asistencia teacutecnica estatal o gremial que no cuenta con
herramientas apropiadas para el diagnoacutestico asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla
libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011)
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la ausencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos o bioloacutegicos efectivos por lo
tanto requiere de un manejo fitosanitario especial al afectar directamente la semilla
inhabilitar los suelos dedicados al cultivo afectar la calidad cosmeacutetica del producto fresco y
ser transmisor del PMTV lo que genera una barrera cuarentenaria para la apertura de
nuevos mercados Por lo anterior el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado bajo
un esquema de manejo integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como
rotacioacuten de cultivos manejo adecuado del riego y drenaje sanidad del tubeacuterculo semilla
utilizacioacuten de organismos antagonistas (pe Trichoderma spp) utilizacioacuten de cultivos
trampa desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos estrictos de
certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas son
utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado del
manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o de
Rhizoctoniasis
El desarrollo de metodologiacuteas seroloacutegicas y moleculares pueden ser una importante
herramienta para el monitoreo y deteccioacuten de estos patoacutegenos en el paiacutes Se destacan para
Sss la teacutecnica de ELISA (Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas) con anticuerpos
policlonales y monoclonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
3
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Ward et al 2004 Qu et al
2011) Para el caso de PMTV tambieacuten se han utilizado teacutecnicas de deteccioacuten utilizando
plantas trampa ELISA RT-PCR (Retrotranscripcioacuten - Reaccioacuten en cadena de la
polimerasa) qPCR (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa en tiempo real) y microplatos de
hibridizacioacuten y microarreglos (Arif et al 1994 Nielsen y Moslashlgaard 1997 Jeffries 1998
Davey 2009 Latvala-Kilby et al 2009 Nakayama et al 2009) Sin embargo estas
teacutecnicas son de aplicacioacuten limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas o validadas con
base en los genotipos locales de ambos patoacutegenos presentes en las regiones cultivadoras de
nuestro paiacutes motivo por el cual es fundamental emprender un estudio amplio de los niveles
de variabilidad geneacutetica de Sss y PMTV en Colombia
Este trabajo responde a dicha necesidad En eacutel se realizaron colecciones de material vegetal
y suelo de cuatro zonas productoras de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo (Colombia) y se realizaron extracciones de ADN o ARN seguacuten el
caso para mediante teacutecnicas moleculares determinar las secuencias de diferentes regiones
informativas del genoma de cada patoacutegeno Una vez obtenidas y editadas las secuencias se
realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos para comparar y agrupar aislamientos colombianos con
respecto a los reportados para Sss y PMTV en el mundo y determinar sus niveles de
identidad geneacutetica
Este estudio pretende apoyar el desarrollo de programas de diagnoacutestico de Sss y PMTV
tanto en Colombia como en la regioacuten Andina La informacioacuten generada es importante para
desarrollar programas de deteccioacuten asintomaacutetica y temprana de ambos patoacutegenos como una
herramienta fundamental para implementar una base tecnoloacutegica que apoye los esquemas
cuarentenarios dirigidos a evitar la diseminacioacuten de los patoacutegenos hacia zonas libres de la
enfermedad la certificacioacuten de tubeacuterculo semilla y los programas de mejoramiento geneacutetico
que conduzcan a generar variedades resistentes a este patosistema
4
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GENERAL
Evaluar los niveles de variacioacuten geneacutetica de Spongospora subterranea y de su virus asociado
PMTV en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y
Narintildeo
22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de S subterranea de cultivos de
papa de cuatro departamentos de Colombia a partir de secuenciacioacuten de las
regiones ITS del ADN ribosomal
Evaluar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de PMTV de cultivos de papa de cuatro
departamentos de Colombia a partir de anaacutelisis de secuencias de la caacutepside y TGB2 del
genoma viral
Definir las afinidades filogeneacuteticas entre las variantes de S subterranea y PMTV
detectadas en Colombia con aislamientos de dichos patoacutegenos de diferentes paiacuteses
que presenten secuencias disponibles en las bases de datos moleculares
Ampliar el nivel de informacioacuten disponible sobre las secuencias de los segmentos
del genoma de aislamientos de PMTV en Colombia
5
3 MARCO TEOacuteRICO
31 Generalidades del cultivo de la papa
La papa es el tubeacuterculo maacutes importante que se produce en el mundo Se cultiva en maacutes de
125 paiacuteses y es consumido diariamente por maacutes de mil millones de personas En los paiacuteses
en desarrollo es un cultivo de fuerte expansioacuten con cientos de millones de personas que
dependen de eacutel para su supervivencia Los paiacuteses en desarrollo son los maacutes grandes
productores (e importadores) de papa y de sus productos derivados (FAO 2009) China se
ha convertido recientemente en el primer productor mundial de papa y junto a India
responden por la tercera parte de la produccioacuten global de este tubeacuterculo En Ameacuterica Latina
y Aacutefrica las cosechas presentaron un menor volumen pero el rendimiento se incrementoacute
significativamente Ameacuterica del Norte fue el mayor productor del continente con un
rendimiento de maacutes de 40 ton ha-1
(FAO 2008)
Ameacuterica del Sur es la cuna de la papa pero esta regioacuten presenta los niveles maacutes bajos de
produccioacuten con menos de 16 millones de toneladas para el antildeo 2007 En la regioacuten Andina
la mayoriacutea de los pequentildeos campesinos manejan el cultivo de forma tradicional y se
siembran variedades de papa que son poco comerciales y desconocidas para el resto del
mundo sin embargo en paiacuteses como Argentina Brasil Colombia y Meacutexico la produccioacuten
comercial de papa estaacute aumentando paulatinamente (FAO 2008)
En Colombia el cultivo de la papa participa con el 71 de la superficie sembrada en
cultivos transitorios y aporta cerca de 78 de la produccioacuten agriacutecola generando alrededor
de 69000 empleos directos principalmente en los departamentos de Cundinamarca
Boyacaacute Narintildeo y Antioquia (MADR 2009a) En el 2009 el aacuterea sembrada de papa fue de
128701 ha con una produccioacuten de 2272772 ton y un rendimiento de 184 ton ha-1
(MADR-ENA 2009) La participacioacuten departamental en la produccioacuten nacional se
encuentra distribuida de la siguiente manera Cundinamarca 378 Boyacaacute 263 Narintildeo
6
164 Antioquia 65 Santander 56 y otros departamentos participan con el 64
(MADR 2009b)
La papa es el producto de origen agriacutecola que tiene la mayor demanda en Colombia por
fungicidas e insecticidas y la segunda en demanda de fertilizantes despueacutes del cafeacute Es la
actividad que maacutes utiliza los servicios de transporte terrestre con maacutes de 2 millones de
toneladas al antildeo sin incluir la movilizacioacuten de los insumos requeridos para su produccioacuten
(MADR 2005)
Los cultivos de papa se encuentran distribuidos en climas friacuteos con temperaturas de 13ordmC y
alturas de 2000 msnm hasta alcanzar zonas de paacuteramo con alturas cercanas a los 3500
msnm y temperaturas de 8ordmC Geograacuteficamente las unidades de produccioacuten estaacuten
dispersas principalmente en las regiones friacuteas de la zona Andina bajo una variada gama de
condiciones biofiacutesicas econoacutemicas y sociales En teacuterminos generales alrededor del 75
del aacuterea cultivada con papa en el paiacutes se encuentra en zonas de topografiacutea quebrada y
ondulada (MADR 2005)
Seguacuten Villareal et al (2007) en el paiacutes existen alrededor de 30 variedades de papa
cultivada pero soacutelo 10 de eacutestas tienen importancia comercial La Parda pastusa es la
variedad maacutes cultivada y consumida en fresco le siguen la variedad Diacol Capiro
utilizada para consumo en fresco exportacioacuten y por la industria de alimentos como materia
prima La variedad ICA-Puraceacute es utilizada en algunas regiones de clima templado del paiacutes
para consumo en fresco la Tuquerrentildea o Sabanera que se consume principalmente en
Bogotaacute y la Criolla que se cultiva principalmente en los departamentos de Antioquia y
Cundinamarca En el paiacutes se han desarrollado nuevas variedades que han ingresado al
mercado como las variedades Esmeralda Rubi UNICA e ICA Morita que tienen altas
posibilidades comerciales en el corto plazo
Una de las principales limitantes teacutecnicas del cultivo de la papa corresponde a las plagas y
enfermedades Dentro de las enfermedades el tizoacuten tardiacuteo o gota causado por
Phytophthora infestans es la amenaza maacutes seria del cultivo Ademaacutes tambieacuten se presentan
el tizoacuten temprano (Alternaria solani) la rontildea (Rhizoctonia solani) la sarna comuacuten
7
(Streptomyces scabies) la palomilla o mortaja blanca (Rosellinia sp) las virosis (PVY
PVX PLRV PYVV PVS PMTV) y la sarna polvosa Esta uacuteltima enfermedad se ha
convertido en una de las principales problemaacuteticas de cultivo a nivel mundial (Harrison et
al 1997 Merz y Falloon 2009) Es causada por el protozoo Spongospora subterranea fsp
subterranea (Sss) paraacutesito obligado de plantas superiores Esta enfermedad causa dantildeos
directos sobre las raiacuteces y tubeacuterculos y ademaacutes es vector del PMTV (Jones y Harrison
1969 Harrison et al 1997 Andersen et al 2002 Merz y Fallon 2009) enfermedad viral
que afecta este cultivo en varias regiones productoras de papa en el mundo
En Colombia el manejo de la enfermedad se basa en el uso de semilla certificada por el
Instituto Colombiano Agropecuario ICA la utilizacioacuten de variedades medianamente
tolerantes y la rotacioacuten entre estas variedades con cultivos no hospedantes del patoacutegeno
(Jaramillo y Botero 2007)
32 Generalidades de Spongospora subterranea fsp subterranea
321 Taxonomiacutea
Sss es el agente causal de la enfermedad denominada Sarna polvosa de la papa El primer
reporte de esta enfermedad data de 1841 en Alemania (Wallroth 1842) y a partir de esta
fecha su registro incluye todos los continentes (Harrison et al 1997 Merz 2008) Seguacuten
Lyman y Rogers (1915) el patoacutegeno es originario de los Andes Suramericanos desde donde
se dispersoacute gracias al mercado mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber
transcurrido mas de 150 antildeos desde su primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado
importancia en las uacuteltimas deacutecadas como resultado de la siembra generalizada de materiales
altamente susceptibles al patoacutegeno la utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los
cambios de eacutepocas de siembra hacia periacuteodos huacutemedos las deficiencias en los sistemas de
rotacioacuten de cultivos la falta de programas cuarentenarios y los altos estaacutendares exigidos por
el mercado en la calidad cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
8
Sss es un pseudohongo plasmodial que taxonoacutemicamente se ha ubicado en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos Spongospora subterranea f sp
subterranea y Spongospora subterranea f sp nasturtii definidos como forma especialis
son importantes patoacutegenos de vegetales (Merz y Falloon 2009) Dick (2001) propone que
dichos microorganismos corresponden a especies diferentes
322 Ciclo de vida Sss
Sss y otros plasmodiophorales se caracterizan por presentar zoosporas biflageladas (3-4 microm
diaacutemetro) de desigual tamantildeo con mastigonemes y posicioacuten opuesta que se liberan a partir
de las estructuras de resistencia (quistes) Los quistes (4 microm diaacutemetro) pueden sobrevivir en
el suelo por largos periacuteodos de tiempo y generalmente se encuentran agregados formando
estructuras denominadas quistosoros (hasta 85 microm diaacutemetro) CITA los cuales son esfeacutericos
u ovoides y presentan un centro vaciacuteo En Colombia observaciones realizadas por
Jaramillo y Peacuterez (2008) han determinado que los quistosoros de aislamientos procedentes
de suelos del municipio de La Unioacuten (Antioquia) oscilaron entre 50 y 120 microm Bajo
condiciones de humedad es frecuente la liberacioacuten de una zoospora uninucleada aunque se
cree que la germinacioacuten de los quistes responde a un patroacuten escalonado que garantiza la
generacioacuten de inoacuteculo infectivo por largos periodos de tiempo Una vez en el suelo las
zooporas se desplazan varios centiacutemetros y son atraiacutedas por los exhudados de las raiacuteces de
sus plantas hospedantes adherieacutendose enquistando y formando un tubo germinativo que
ejerce fuerza mecaacutenica para su penetracioacuten directa en la planta Posteriormente el patoacutegeno
desarrolla un plasmodio multinucleado con membrana simple y ausencia de pared celular
Eventualmente el plasmodio se cliva dando lugar a muacuteltiples zooesporangios cada uno de
los cuales puede generar hasta 8 zoosporas que son liberadas por un poro germinativo y
continuacutean con la infeccioacuten de otras ceacutelulas radiculares Estas zoosporas denominadas
secundarias son indistinguibles de las que inician la infeccioacuten (primarias) y ambas pueden
infectar lenticelas no suberizadas de tubeacuterculos comenzando a inducir el siacutentoma tiacutepico de
9
la sarna que toma apariencia corchosa a partir del desarrollo de una capa de proteccioacuten a
nivel del peridermo del tubeacuterculo Es frecuente ademaacutes que el patoacutegeno induzca hipertrofia
e hiperplasia en los tejidos afectados dando origen a las agallas y a las deformaciones
caracteriacutesticas de la enfermedad Al final del ciclo en los plasmodios se reorganiza su
contenido protoplasmaacutetico rodeaacutendo los nuacutecleos presentes de pared celular y generaacutendose
quistes que serviraacuten de inoacuteculo para sucesivas infecciones (Harrison et al 1997)
El ciclo de vida de Spongospora es diferenciado por Merz (2008) de acuerdo a la
ocurrencia de dos fases una fase esporogeacutenica y una segunda fase esporangial cada una
iniciada por la infeccioacuten de la ceacutelula hueacutesped a traveacutes de un plasmodio individual En la
fase esporangial numerosas zoosporas secundarias son formadas en el esporangio de
paredes delgadas en las ceacutelulas epidermales de la raiacutez y los pelos radicales del hueacutesped en
las cuales las zoosporas son formadas desde un plasmodio esporangiogeacutenico Las zoosporas
secundarias tambieacuten biflageladas pueden salir del hueacutesped e iniciar otro ciclo de infeccioacuten
La fase esporogeacutenica se presenta despueacutes de la divisioacuten nuclear dentro del plasmodio
esporogeacutenico El patoacutegeno produce esporas de reposo de pared gruesa las que son
altamente persistentes Cada espora de reposo libera una sola zoospora primaria
biflagelada
En Colombia Hoyos et al (2009) realizaron observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Sss encontrando plasmodios plasmodios enquistados plasmodios en
estado de divisioacuten ceacutelulas uacutenicas y quistosoros en raiacuteces de plantas de S tuberosum
asintomaacuteticas indicando que la infeccioacuten puede estar presente sin desarrollo evidente de
siacutentomas y que los quistosoros no son solamente las estructuras maacutes frecuentes en los
tejidos de los hospedantes afectados
10
323 Rango de hospedantes de Sss
Diversas investigaciones han encontrado la presencia de zoosporangios de Sss en plantas de
otras familias diferentes a la Solanaceae como Alzoaceae Apiaceae Asteraceae
Boraginaceae Brassicaceae Caryophyllaceae Chenopodiaceae Fabaceae Geraniaceae
Lamiaceae Plantaginaceae Papaveraceae Poaceae Polygonaceae Ranunculaceae
Rubiaceae Resedaceae Solanaceae y Urticaceae (Jones y Harrison 1969 Andersen et al
2002) Andersen et al (2002) encontraron diferentes tasas de infeccioacuten desarrolladas por el
patoacutegeno en especies como Artemisia vulgaris Cirsium arvense Chamomilla suaveolens
Chenopodium album Galium aparine Geranium pusillum Lapsana communis Matricaria
inodora Poa annua Polygonum avicular P convolvulus Rumex acetosa R acetosella
Solanum nigrum Sonchus arvensis Urtica urens y Viola tricolor lo que permitioacute
confirmar estas 17 especies como hospedantes de Sss
Aunque aparentemente Sss tiene un amplio rango de hospedantes el desarrollo de los
quistosoros nunca habiacutea sido observado en otros hospederos diferentes a S tubersosum Sin
embargo Qu y Christ (2006a) encontraron formacioacuten de quistosoros en seis especies de
plantas Solanum plycantum Dun Datura stramonium L Avena sativa L Dactylis
conglomerado L Solanum esculentum Mill y Brassica campestris L Esto indicoacute que el
patoacutegeno tiene la capacidad de completar su ciclo de vida en hospedantes alternos a las
plantas de papa lo que representa un aspecto epidemioloacutegico importante Asiacute mismo se
encontroacute que las siguientes especies tambieacuten son hospedantes del patoacutegeno Fagopyrum
esculentum Moench Phleum pratense L Raphanus sativus L Brassica napus L
Trifolium pratense L Secale cereale L Ambrosia artemisiifolia L Chenopodium album
L Amaranthus retroflexus L y Cyperus esculentus L Recientemente se ha encontrado
que el patoacutegeno puede producir agallas en S physalifolium y S nigrum y su patogenicidad
fue confirmada por inoculacioacuten a plantas de tomate (S esculentum) y de papa bajo
condiciones de invernadero (Shah et al 2010) Estos resultados tienen consecuencias para
el manejo de la enfermedad enfocado en cultivos de rotacioacuten porque se debe tener en
cuenta que existen especies cultivables y malezas que pueden albergar estructuras del
patoacutegeno y que el reporte de nuevas especies hospederas continua por ejemplo Sss causa
11
agallas en las raices de Solanum sarrachoide en donde puede completar su ciclo de vida y
producir nuevas generaciones de quistosoros que son infectivos a papa (Nitzan et al 2009)
324 Siacutentomas causados por Sss
Los siacutentomas de la enfermedad incluyen la induccioacuten de lesiones pustulosas corchosas con
centros polvosos formados a partir de la agregacioacuten de los quistosoros del patoacutegeno Con el
avance de estas lesiones es frecuente la ruptura del peridermo aunque el nivel de
penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente superficial Bajo condiciones oacuteptimas para el
desarrollo de la enfermedad es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten
de los tejidos y la formacioacuten de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la
enfermedad ademaacutes de causar los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular
de las plantas al inducir la formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas (Cotes et al
2006) que causan la disminucioacuten de la superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo a la
marchitez y finalmente a la muerte de las plantas Durante el almacenamiento la sarna
polvosa puede ocasionar pudriciones secas que sirven de entrada a otros patoacutegenos y
saproacutefitos que deterioran auacuten maacutes el producto (Agrios 1996) La infeccioacuten en las raiacuteces
especialmente cuando se forman agallas pueden causar una reduccioacuten en el funcionamiento
de la raiacutez por la interrupcioacuten de la toma de agua y de nutrientes (Lister et al 2004 Falloon
et al 2005)
En Colombia en los departamentos de Cundinamarca Boyacaacute Narintildeo y Antioquia Sss
afecta severamente las variedades de papa (Solanum tuberosum) Parda Pastusa y Diacol
Capiro y a la papa criolla (Solanum phureja) Los siacutentomas se observan en raiacuteces y
tubeacuterculos pero hay variacioacuten en las zonas paperas en cuanto a la distribucioacuten de los
siacutentomas entre los diferentes oacuterganos de la planta En Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de
Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre los tubeacuterculos de las variedades Parda
Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el departamento de Narintildeo y en el Oriente de
Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces Hasta ahora no se sabe si estas diferencias
se deben a variaciones en las condiciones ambientales de una regioacuten a otra o quizaacutes se
12
deban a la distribucioacuten regional de diferentes razas del patoacutegeno yo a su interaccioacuten con el
ambiente (Jaramillo y Botero 2007)
En el Oriente Antioquentildeo se determinoacute la incidencia y el grado de severidad de 23
poblaciones de Sss bajo el sistema de rotacioacuten entre ICA Puraceacute-Diacol Capiro y viceversa
en tres cosechas sucesivas en condiciones de casa de malla Se observoacute que las poblaciones
del patoacutegeno no afectaron el peso ni causaron siacutentomas de sarna polvosa en los tubeacuterculos
pero si en las raiacuteces con diferentes grados de severidad en las dos variedades siendo maacutes
susceptible la variedad Diacol Capiro que al parecer favorecioacute el incremento del inoacuteculo
mientras que la ICA Puraceacute fue levemente afectada y posiblemente presentoacute efecto
supresivo sobre los quistosoros en el suelo (Jaramillo y Botero 2007)
Estudios realizados en el departamento de Narintildeo presentaron diferencias en el grado de
desarrollo de la enfermedad en raiacuteces La variedad Parda Pastusa fue la maacutes susceptible a
Sss con desarrollo de agallas desde el momento de la emergencia de las plantas La
enfermedad alcanzoacute valores de susceptibilidad del 100 en dicha variedad mientras que en
Diacol Capiro fue de 48 En los tubeacuterculos la enfermedad se manisfestoacute por la formacioacuten
de escasas y pequentildeas puacutestulas de color castantildeo con poca presencia de masas pulverulentas
de esporas de resistencia del patoacutegeno lo que contrasta con la regioacuten Cundiboyacense en
donde estas variedades se caracterizan por presentar una alta susceptibilidad a la rontildea en
tubeacuterculos ocasionando lesiones severas en las que resulta faacutecil encontrar esporas de
resistencia (Benavides 2006)
325 Control de Sss
El control de la sarna polvosa de la papa es difiacutecil de lograr debido a la carencia de
variedades comerciales resistentes y de tratamientos quiacutemicos efectivos (Qu y Christ
2006a) Seguacuten Harrison et al (1997) el manejo de la enfermedad debe estar enmarcado
bajo un esquema integrado del cultivo (MIC) en el que se incluyan aspectos como la
rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del tubeacuterculo semilla la
utilizacioacuten de organismos antagonistas (ie Trichoderma spp) la utilizacioacuten de cultivos
trampa la desinfestacioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten que
13
restrinja el movimiento de material contaminado y genere procesos de certificacioacuten de
semilla Dos estrategias que en la actualidad se consideran fundamentales para apoyar los
programas MIC en papa incluyen el mejoramiento geneacutetico por resistencia al pseudohongo
y la utilizacioacuten de cultivos trampa (Merz et al 2004)
Para el caso del mejoramiento los primeros reportes en la regioacuten Andina fueron
presentados por Torres et al (1995) quienes evaluaron 467 accesiones encontrando la
existencia de 17 genotipos resistentes y 33 moderadamente resistentes Por otra parte Lees
(2000) en Escocia evaluoacute los niveles de resistencia a Sss de una serie de clones de S
phureja encontrando que algunos de eacutestos presentaron un adecuado nivel de resistencia
por lo que esta especie fue propuesta como fuente de genes de resistencia Merz (2000) al
evaluar la reaccioacuten de 11 cultivares determinoacute que existe correlacioacuten entre las pruebas de
invernadero utilizando plaacutentulas provenientes de cultivo de tejidos y la resistencia
presentada en campo
Fallon et al (2003) realizaron un estudio en Australia con 99 cultivares de papa y 13
liacuteneas de mejoramiento durante 11 antildeos Sus resultados indicaron que el 21 de los
materiales evaluados eran resistentes mientras que el 28 presentoacute una resistencia
moderada Estos autores tambieacuten reportaron que la expresioacuten de la resistencia variacutea entre
antildeos y que los bioensayos realizados en invernadero no siempre se correlacionan con la
respuesta presentada en campo sugiriendo una fuerte interaccioacuten genotipo-ambiente para
esta caracteriacutestica
Nitzan et al (2010) evaluaron la estabilidad de la resistencia geneacutetica de 24 genotipos de
papa a Sss en los estados de Washington e Idaho en Estados Unidos Se identificoacute que la
resistencia era estable a la formacioacuten de agallas en las raiacuteces causada por Sss y se determinoacute
que una gran proporcioacuten de la variacioacuten fue geneacutetica lo que permite a los mejoradores usar
genotipos resistentes y estables de papa como progenitores en el desarrollo de cultivares
comerciales con resistencia a este patoacutegeno debido a que contar con materiales geneacuteticos
resistentes es una de las principales estrategias de manejo de la enfermedad (Rodriacuteguez et
al 2009 Houser y Davidson 2010)
14
Seguacuten Merz et al (2012) no existen meacutetodos de control eficientes y econoacutemicos que se
encuentren disponibles actualmente y la resistencia del hospedero es clave para el manejo
integrado de la enfermedad debido a esto se evaluaron 10 cultivares con diferentes rangos
de susceptibilidad a Sss y a PMTV en diferentes paiacuteses de Europa Para evitar discrepancias
en los criterios de evaluacioacuten se utilizoacute una escala estaacutendar para los niveles de la sarna
polvosa determinaacutendose que los cultivares se comportaron como estaba establecido en su
caracterizacioacuten inicial (a excepcioacuten de uno de ellos) Los resultados del ensayo de campo
indicaron que los diferentes meacutetodos de valoracioacuten son el principal factor de discrepancia
en las calificaciones de la resistencia y que las condiciones ambientales yo el nivel de
inoacuteculo del suelo juegan un papel menor
Otra estrategia con alto potencial para el manejo de la enfermedad es la rotacioacuten del cultivo
con plantas trampa que reducen el nivel de estructuras de resistencia de
plasmodiophoromycetes Por ejemplo es ampliamente conocido que la siembra de
Raphanus sativus reduce la cantidad de quistes de Plasmodiophora brassicae en el suelo
(Murakami et al 2000) mientras que la planta Datura stramonium redujo el nivel de Sss en
un 79 en cultivos de papa de Australia
En Colombia la buacutesqueda de herramientas para el manejo de la enfermedad bajo las
condiciones regionales de las zonas productoras de papa se enfoca en la evaluacioacuten de
sistemas de rotacioacuten de variedades comerciales que tradicionalmente se han considerado
altamente susceptibles a la enfermedad (ie Diacol Capiro) con variedades maacutes tolerantes al
ataque del patoacutegeno (ie ICA Puraceacute) encontraacutendose que efectivamente esta uacuteltima
variedad presenta un menor nivel de susceptibilidad a la sarna polvosa (Jaramillo et al
2003 Jaramillo y Botero 2007)
En cuanto al control bioloacutegico de Sss Gilchrist (2009) evaluoacute una cepa de Trichoderma
previamente considerada por Hoyos et al (2002) como potencialmente uacutetil para el control
bioloacutegico de Sss en la variedad Diacol Capiro Las pruebas fueron realizadas en campo
utilizando tres dosis de aplicacioacuten del biocontrolador Se encontroacute que la aplicacioacuten de T
asperellum T109 redujo un 64 y 54 los efectos de la sarna polvosa en el crecimiento y
15
en la produccioacuten de las variedades respectivamente De esta forma se resalta el potencial
de la cepa como biocontroladora contra Sss teniendo en cuenta que se debe ampliar el
conocimiento acerca de los factores que limitan la accioacuten de T asperellum T109 en el
campo y coacutemo compensarlo aumentando la frecuencia de aplicacioacuten En un trabajo similar
se investigoacute la influencia de cuatro aislamientos de T asperellum sobre la sarna polvosa en
tres tipos de suelo Andisol Entisol e Inceptisol No se encontraron diferencias
significativas entre las plantas de papa tratadas y no tratadas con T asperellum pero siacute se
encontroacute que la reduccioacuten del crecimiento y la produccioacuten estuvieron inversamente
asociadas con el contenido de Al2+
en los suelos sugiriendo que los efectos de la sarna
polvosa estaacuten fuertemente relacionados con las condiciones del suelo (Gilchrist et al 2009)
Estudios sobre la evaluacioacuten de estrategias de manejo de la rontildea polvosa en tres regiones
productoras de papa en Colombia han incluido resultados sobre la biologiacutea y patologiacutea de
Sss en la Sabana de Bogotaacute y sus hallazgos maacutes importantes consisten en la puesta en
marcha de un sistema de bioensayos en los cuales ha sido posible inducir la liberacioacuten de
zoosporas bajo condiciones de laboratorio Otros estudios incluyen la evaluacioacuten del efecto
de fungicidas aplicados al suelo para el manejo de Sss Sin embargo se determinoacute que
ninguno de los fungicidas evaluados (Tiabendazol Tolclofos metil Benomyl Carbendazin
Clorotalonil y Mancozeb) contribuyeron con el control del patoacutegeno en raiacuteces y tubeacuterculos
bajo las dosis y condiciones de tres localidades productoras de papa (Subachoque Medelliacuten
(Corregimiento Santa Elena) y Pasto) (Garciacutea y Navia 2002) En contraste Falloon et al
(2010) realizaron aplicaciones en campo del fungicida Mancozeb el cual contiene Zn y
Mn Las dosis estuvieron determinadas como baja similar y alta con respecto al contenido
de estos elementos en el suelo cultivado con papa cv Iwa (considerado muy susceptible a
Sss) Se encontroacute que niveles elevados de Zn y Mn generan infecciones moderadas de Sss
en las raiacuteces del cultivar evaluado de S tuberosum
Otras investigaciones para el manejo de Sss han incluiacutedo la evaluacioacuten de potenciales
biocontroladores (Trichoderma harzianum y Pseudomonas fluorescens) un consorcio de
micorrizas y viruta de pino como tratamientos Se encontraron diferencias estadiacutesticamente
significativas entre el testigo y P fluorescens y los tratamientos con T harzianum
16
micorrizas y viruta presentando una incidencia en raiacuteces de 32 21 y 5 3 y 1
respectivamente Los tratamientos con T harzianum micorriza y viruta tuvieron los
porcentajes de incidencia maacutes altos pero contrastaron con niveles muy bajos de severidad
de la enfermendad (022 0088 y 0019 respectivamente) Sin embargo no se
obtuvieron incrementos en peso seco de raiacuteces peso de tubeacuterculos y peso seco de la parte
aeacuterea cuando se realizaron las inoculaciones de los diferentes agentes de control y las
aplicaciones de la viruta de pino (Restrepo et al 2009)
Arias (2011) realizoacute un anaacutelisis y comparacioacuten de glucosinolatos presentes en diferentes
accesiones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control de
Sss Se estandarizaron los procedimientos de extraccioacuten del compuesto y las diferentes
formulaciones fueron probadas como biofumigante en el suelo donde posteriormente se
sembraron tubeacuterculos de papa criolla Sin embargo los resultados obtenidos no permitieron
establecer un posible potencial biofumigante de las accesiones evaluadas y es necesario
profundizar en los estudios que permitan determinar el efecto de los glucosinolatos y de
otros compuestos sobre el patoacutegeno
33 Deteccioacuten de Sss
La deteccioacuten del inoacuteculo a nivel del suelo es compleja y es evaluada precariamente a partir
de sistemas de trampeo que utilizan plaacutentulas de tomate (Merz 1989) o de papa (Wale et al
1993) Estas evaluaciones son criacuteticas para definir relaciones entre el grado de infestacioacuten
de los suelos y los niveles de enfermedad observados en el campo requisito fundamental
para la implementacioacuten de cualquier medida de control (Merz et al 2005)
Con el objetivo de buscar alternativas para alcanzar mayores rangos de sensibilidad en la
deteccioacuten de Sss se han explorado diversas metodologiacuteas basadas en teacutecnicas seroloacutegicas y
moleculares Entre las primeras se destacan la generacioacuten de anticuerpos policlonales que
detectan quistosoros del protozoo bajo un sistema ELISA (Harrison et al 1993 Walsh et
al 1996) Sin embargo la utilidad de estos anticuerpos es reducida debido a que no detecta
el estado plasmodial (Ward et al 2004) Maacutes recientemente Merz et al (2005)
desarrollaron una prueba para la evaluacioacuten rutinaria de la presencia del patoacutegeno basada
17
en anticuerpos monoclonales derivados de quistosoros como antiacutegenos alcanzando niveles
de sensibilidad de menos de un quistosoro por tubeacuterculo A partir de esto se generoacute la
herramienta ldquoSss AgriStriprdquo una prueba basada en un inmunoensayo de flujo lateral cuya
precisioacuten y sensibilidad fue evaluada por Bouchek-Mechiche et al (2011) para la
deteccioacuten de Sss Se comparoacute con teacutecnicas de microscopiacutea ELISA PCR y qPCR que
detectaron Sss en lesiones tiacutepicas de sarna polvosa Asiacute mismo se realizaron pruebas en los
lotes que presentaban lesiones tiacutepicas y atiacutepicas causadas por el patoacutegeno y se confirmoacute la
presencia de Sss en todas las lesiones con todos los meacutetodos probados Se concluyoacute que el
Sss AgriStrip es una prueba tan sensible como DAS- ELISA con un liacutemite de deteccioacuten de 1
a 10 quistosoros por mL de buffer
Con respecto a las metodologiacuteas moleculares se ha utilizado PCR convencional a partir de
los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 (Bulman y Marshall 1998) Sps1Sps2 (Bell et al
1999) y SsFSsR (Qu et al 2006) que amplifican las regiones ITS del ADNr
Los cebadores especiacuteficos Spo8Spo9 disentildeados por Bulman y Marshall (1998) detectaron
Sss en las muestras evaluadas y no presentaron reaccioacuten cruzada con otros
plasmodiophoridos como Spongospora subterranea f sp nasturtii Plasmodiophora
brassicae Sorosphaera veronicae y Polymyxa graminis asiacute como con el causante de la
sarna comuacuten Streptomyces scabies demostrando la utilidad de estos cebadores en la
deteccioacuten de Sss realizada por estos investigadores
Bell et al (1999) obtuvieron secuencias parciales del ITS de 391pb con los cebadores Sps
1 y Sps 2 para la deteccioacuten y cuantificacioacuten de Sss en la corteza tubeacuterculos lavados y
suelos cultivados con papa Las pruebas desarrolladas mostraron ser maacutes sensibles que los
inmunoensayos previamente reportados y fueron maacutes raacutepidas y sencillas que los ensayos
convencionales con plantas trampa
Qu et al (2006) utilizaron la teacutecnica de PCR para la identificacioacuten especiacutefica y
cuantificacioacuten de Sss Los cebadores SsF y SsR amplificaron un producto de 434 pb
proveniente de masas de esporas de Sss pero no se obtuvo el amplicoacuten cuando el ADN era
de papa sana de tubeacuterculos con sarna comuacuten o de otros plasmodiophoridos relacionados
18
Asiacute mismo se detectoacute Sss en otros hospederos infectados que no presentaban siacutentomas y se
concluyoacute que la prueba es tan sensible que puede detectar 1 quiste g-1
Adicionalmente con
esta teacutecnica se logroacute la cuantificacioacuten de Sss en el suelo logrando identificar valores de 1 a
104 quistosoros por 025 g de suelo
La implementacioacuten de meacutetodos para la deteccioacuten de Sss ha permitido el desarrollo de
procedimientos que permiten una raacutepida y automatizada extraccioacuten de ADN combinada
con PCR en tiempo real utilizando sondas Taqmanreg para avanzar en el diagnoacutestico
rutinario de la sarna polvosa (Lees et al 2002 van de Graff et al 2003 Ward et al 2004
Qu et al 2011) o PCR competitivo o cuantitativo (Qu et al 2006 Shah et al 2009) En esta
prueba se utiliza un control interno de ADN de papa (citocromo oxidasa) para hacerla maacutes
confiable y evitar falsos negativos La validacioacuten de dicha metodologiacutea se realizoacute a partir
de la evaluacioacuten de 37 muestras de tubeacuterculos de varios cultivares procedentes de diversas
localidades del Reino Unido La prueba detectoacute el patoacutegeno en todas las muestras que eran
sospechosas de tenerlo asiacute como en tubeacuterculos que no presentaban quistosoros observables
La prueba con la sonda Taqman demostroacute ser 100 veces maacutes sensible que la PCR
convencional (Ward et al 2005) y la ELISA (Ward et al 2004) Estas pruebas han
permitido determinar el efecto del nivel de inoacuteculo en el suelo y de algunos factores
ambientales en la infeccioacuten y desarrollo de agallas en raiacuteces de papa causadas por Sss (van
de Graaf et al 2007) En Gran Bretantildea la teacutecnica de PCR en tiempo real permitioacute detectar
confiablemente y establecer la cantidad de ADN de los quistorosos zoosporas y
plasmodiozoosporangios del patoacutegeno asiacute mismo se determinoacute la viabilidad de los quistes
en el suelo y en combinacioacuten con el uso de plantas trampa se estudioacute la liberacioacuten de
zoosporas y los niveles de infeccioacuten en papa bajo diferentes condiciones ambientales
permitiendo conocer con maacutes detalle varios aspectos de la epidemiologiacutea de la enfermedad
(Lees et al 2008)
Otras variaciones de estas teacutecnicas como la muacuteltiple qPCR utilizando sondas TaqManreg ha
permitido la deteccioacuten y diferenciacioacuten simultaacutenea de la sarna polvosa y la sarna comuacuten
dos enfermedades del tubeacuterculo que causan siacutentomas similares pero que son ocasionadas
por patoacutegenos diferentes (Sss vs Streptomyces spp) (Qu et al 2011) Finalmente como una
19
teacutecnica de diagnoacutestico simultaacuteneo de diferentes patoacutegenos de papa se ha desarrollado un
chip para su anaacutelisis en microarreglos siendo incorporada la deteccioacuten de Sss (Zhang et al
2008)
En Colombia la utilizacioacuten de meacutetodos de deteccioacuten de Sss en tubeacuterculos y suelos ha
estado dada por la evaluacioacuten visual de sintomatologiacuteas en raiacuteces y tubeacuterculos la
evaluacioacuten de bioensayos (Rodriacuteguez et al 2002) y la utilizacioacuten de PCR convencional
utilizando cebadores especiacuteficos (Jaramillo et al 2003 Carrentildeo 2009) Se han utilizado
combinaciones de diversos cebadores que permiten la amplificacioacuten de la regioacuten ITS del
ADNr del patoacutegeno (Spo1-Spo2 Spo8-Spo9 y Sps1- Sps2) los cuales permiten obtener
productos de 372 390 y 391 pb respectivamente (Saavedra et al 2004) Ramiacuterez (2010)
obtuvo amplificacioacuten de los fragmentos del tamantildeo esperado utilizando los cebadores
Spo8Spo9 y SsFSsR para analizar la variabilidad geneacutetica de aislamientos de Sss
provenientes de La Unioacuten (Antioquia) encontrando una estructura clonal de los
aislamientos evaluados mientras que Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS
y SSCP (Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) con un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones del paiacutes establecioacute la presencia de subpoblaciones del
patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado
34 Variabilidad geneacutetica de Sss
La disponibilidad de cultivares resistentes a Sss debe ser una prioridad en el disentildeo de
futuras estrategias de manejo de la enfermedad Los mejoradores tratan de incluir
resistencia en los nuevos cultivares seleccionando liacuteneas contra un rango de patoacutegenos que
representan la diversidad geneacutetica conocida con el fin de seleccionar la resistencia maacutes
durable Sin embargo poco es conocido acerca de la variacioacuten geneacutetica de Sss o del papel
de la recombinacioacuten sexual en su ciclo de vida (Merz y Falloon 2009)
Los estudios geneacuteticos de Sss han sido difiacuteciles de aplicar debido a razones como las
siguientes obtener y mantener el patoacutegeno es complicado por su naturaleza de paraacutesito
obligado no han existido meacutetodos disponibles para el aislamiento de quistosoros
individuales el desarrollo de la sarna polvosa estaacute influenciado por condiciones
20
ambientales y los estaacutendares de inoculacioacuten y los cultivares de referencia no han sido bien
establecidos (Qu y Christ 2006b)
Los sistemas de deteccioacuten basados en aacutecidos nucleicos ofrecen sensibilidad y especificidad
para la cuantificacioacuten de inoacuteculo (Mutasa et al 1993) En estudios previos amplificando
regiones del ITS del ADNr fueron identificados dos agrupaciones de Sss en Australia y
Europa (tipo I y II) (Bulman y Marshall 1998) Posteriormente se realizoacute una
investigacioacuten sobre la variabilidad geneacutetica de 52 aislamientos de Islas Britaacutenicas y
Norteameacuterica que fueron amplificados por PCR Se identificaron dos grupos geneacuteticamente
diferentes (I y II) que representaron el 346 y el 654 de los aislamientos
respectivamente Sin embargo en Norteameacuterica los aislamientos soacutelo perteneciacutean al grupo
II (Qu y Christ 2004) Debido a que el anaacutelisis de secuencia de ITS se basa en un solo
locus para la deteccioacuten de la variacioacuten geneacutetica los anaacutelisis con marcadores moleculares
que comprendan diferentes partes del genoma del patoacutegeno son necesarios para obtener una
imagen amplia de la variacioacuten geneacutetica y estructura poblacional de Sss
El uso de marcadores moleculares tales como RAPDs (ADN polimoacuterfico amplificado al
azar) y AFLPs (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados) han sido
usados para estudiar la diversidad geneacutetica en muchos patoacutegenos de plantas sin embargo
tales marcadores no estaacuten disponibles para Sss Es complejo obtener estructuras
individuales del patoacutegeno y la uacutenica forma es la obtencioacuten de quistosoros que pueden traer
contaminantes secundarios o contener tejido de la planta Por lo tanto es difiacutecil obtener
ADN puro del patoacutegeno un paso indispensable para llevar a cabo la PCR basada en
marcadores moleculares (Qu y Christ 2006b)
Wuumlerzer (1964) caracterizoacute 17 colecciones de Sss de Europa y Ameacuterica seguacuten el tamantildeo
del quistosoro pero no encontroacute evidencia bioloacutegica significativa de este agrupamiento
Posteriormente se detectoacute variacioacuten geneacutetica (divergencia 51) en secuencias de ADN de
los ITS1 e ITS2 de colecciones de Sss originarias de diferentes continentes (Bulman y
Marshall 1998) Las colecciones de Australasia y Europa incluidas en el grupo II diferiacutean
de otra coleccioacuten de Escocia que fueacute ideacutentica a dos colecciones de Sur Ameacuterica agrupadas
21
en el tipo I La existencia de estos grupos fue confirmada por Qu y Christ (2004) quienes
tambieacuten identificaron ambos grupos en colecciones de Escocia pero demostraron que soacutelo
la secuencia de tipo II es de ocurrencia en colecciones de Canadaacute y Estados Unidos
Los marcadores RFLPs (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccioacuten) son
codominantes y locus especiacutefico (McDonald y Martiacutenez 1990) Han sido utilizados
ampliamente para evaluar diversos genomas de patoacutegenos de plantas A pesar de que
consumen maacutes tiempo que los meacutetodos basados en PCR los RFLPs son maacutes reproducibles
y menos sensibles a contaminacioacuten de ADN que las pruebas basadas en PCR Qu y Christ
(2006b) realizaron un estudio maacutes detallado de colecciones de quistosoros obtenidas de
Estados Unidos y Canadaacute empleando marcadores RFLPs Encontraron variacioacuten geneacutetica
entre las localidades geograacuteficas pero no entre los individuos de una misma localidad lo
que sugirioacute que las poblaciones del campo son clones y no estaban sometidas a
recombinacioacuten sexual El anaacutelisis de agrupamiento permitioacute separar los aislamientos en
dos grupos el grupo I que incluyoacute aislmientos del oeste de Norte Ameacuterica (exceptuando
aislamientos de Colorado) y el grupo II incluyoacute aislamientos originarios del este de Norte
Ameacuterica y de Colorado Este estudio muestra que el uso de marcadores moleculares para
diferenciar aislamientos de quistosoros individuales facilitaraacute investigaciones adicionales
para determinar la estructura geneacutetica de poblaciones de Sss
En Colombia Ramiacuterez (2010) realizoacute un estudio sobre la variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss de La Unioacuten Antioquia Encontroacute que los anaacutelisis de secuencias de la
regioacuten ITS del ADNr presentaron altos niveles de similitud con cepas obtenidas del
Departamento de Narintildeo asiacute como con secuencias de referencia de cepas del tipo II de Sss
Este resultado permitioacute plantear que el patoacutegeno presenta un comportamiento clonal
aunque es necesario obtener informacioacuten de otras regiones del genoma que permitan
realizar anaacutelisis de muacuteltiples loci que conduzcan a una mayor aproximacioacuten sobre las
condiciones de variacioacuten de este patoacutegeno en el paiacutes
Otro estudio realizado por Carrentildeo (2009) sobre la variabilidad geneacutetica de Sss en
Colombia mediante el anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr permitioacute establecer la
22
presencia de subpoblaciones del patoacutegeno relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Se
encontroacute una asociacioacuten directa entre las secuencias ITS del patoacutegeno y el oacutergano de la
planta infectado El tipo de ITS I se asocia aparentemente con infecciones de tubeacuterculo y el
tipo de ITS II lo hace con infecciones de raiacutez Esta investigacioacuten permitioacute descartar la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar hospedero o zona
geograacutefica Sin embargo de acuerdo con esta investigacioacuten es necesario realizar pruebas
que aborden otras aacutereas del genoma para corroborar los resultados encontrados Asiacute mismo
se comproboacute que en el paiacutes existen variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las
reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno Tres
variantes geneacuteticas de las cinco encontradas en este estudio difieren de las reportadas en la
literatura mundial
35 Generalidades del Potato mop-top virus (PMTV)
El PMTV es el agente causal de una importante enfermedad viral del cultivo de la papa
cuya distribucioacuten se encuentra registrada en diferentes lugares productores de este
tubeacuterculo como Irlanda Inglaterra Escocia Republica Checa Suiza Noruega Suecia
Dinamarca y Finlandia (Santala et al 2010) asiacute como en Japoacuten (Nakayama et al 2010) En
Ameacuterica ha sido registrado en Canadaacute y Estados Unidos (Xu et al 2004) En eacuteste uacuteltimo
paiacutes se reportoacute recientemente en los estados de North Dakota (David et al 2010) y en
Washington (Crosslin 2011) Nuevos reportes de este virus se continuan presentado en
otros paiacuteses del mundo como Polonia (Budziszewska et al 2010)
En Ameacuterica Central se ha encontrado en Costa Rica (Montero-Astua 2008) y aunque se
considera que es originario de la regioacuten de los Andes (Surameacuterica) soacutelo fue detectado en
Colombia en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) con la reconfirmacioacuten de su presencia en el antildeo
2010 (Gil et al 2011) El PMTV puede causar peacuterdidas de hasta 26 en rendimiento lo
que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera ascender a valores de
50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 Guerrero 2000) Seguacuten Salazar (2006)
el PMTV es uno de los virus que ha sido prevalente en el cultivo de la papa en los Andes
23
suramericanos pero su efecto sobre las variedades cultivadas en esta regioacuten no se ha
cuantificado claramente
351 Taxonomiacutea de PMTV
El PMTV pertenece al geacutenero Pomovirus virus con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20
nm en diaacutemetro y tres partiacuteculas con longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm
El geacutenero Pomovirus deriva su nombre de la especie tipo Potato mop-top virus y
actualmente se ubica en el la familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Los anaacutelisis
filogeneacuteticos de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRps) indican que el PMTV
estaacute relacionado maacutes estrechamente con el Beet soil-borne virus (Pomovirus) Broad bean
necrosis virus (Pomovirus) y Soil-borne Wheat mosaic virus (Furovirus) (Savenkov et al
1999)
Contiene tres moleacuteculas de ARNss con tamantildeos de 64 kb 3 kb y 25 kb con caperuzas
hacia el extremo 5rsquo y una estructura tipo ARNt hacia el extremo 3rsquo (Savenkov et al 1999
2003) El coeficiente de sedimentacioacuten de las partiacuteculas es de 230 170 y 125S
respectivamente El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene motivos de
metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del codoacuten de
finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999) Cerca del extremo
3acutedel ARN 2 se presenta una proteiacutena asociada a la transmisioacuten por el vector y generada a
partir de la supresioacuten del codoacuten de terminacioacuten del ORF que codifica para la caacutepside (CP)
Esta proteiacutena parece ser la responsable de la peacuterdida de la estructura helicoidal en los
extremos del ARN durante el proceso de desensamblaje (Sandgren et al 2001) El ARN 3
codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Tres de las
proteiacutenas producidas (TGB1 TGB2 y TGB3) estaacuten involucradas en el movimiento ceacutelula a
ceacutelula (Zamyatnin et al 2004) La funcioacuten de la cuarta proteiacutena una proteiacutena rica en
cisteiacutena parece ser la de actuar en el incremento de la virulencia sin embargo no es
indispensable para el proceso infectivo (Lukhovitskaya et al 2005) (Figura 1)
24
Figura 31 Representacioacuten del genoma de PMTV En las cajas se observan las proteiacutenas
para las que codifica el genoma Las flechas indican las proteiacutenas originadas y los ARN
subgenoacutemicos (ARNsg) Fuente httpwwwexpasychviralzoneall_by_species643html
Modificado por Gallo (2012)
352 Ciclo de la infeccioacuten de PMTV
La especie PMTV es transmitida por zoosporas de Sss que afecta los sistemas radiculares
de sus hospedantes Este virus tambieacuten puede ser transmitido por semilla asexual El virus
puede permanecer en las estructuras de resistencia de sus vectores por varios antildeos en el
suelo (Astier et al 2007 Dijkstra y Khan 2006) En los ensayos de transmisioacuten del virus se
ha observado que eacuteste es transmitido eficientemente a plantas indicadoras (ej N tabacum y
N benthamiana) a partir de muestras de suelo infestadas con quistes del patoacutegeno
(Campbell 1996 Veacutelez 2007)
25
El PMTV constituye un pequentildeo grupo de virus que para su movimiento sisteacutemico en la
planta hospedante no requiere de la expresioacuten de CP ni de la formacioacuten del virioacuten
(McGeachy y Barker 2000) debido a que el TGB le ofrece la posibilidad de mover el ARN
infeccioso a traveacutes de largas distancias en la planta (Melander et al 2001) Actualmente se
generan nuevas teoriacuteas acerca del movimiento de TGB en la planta y de la funcioacuten de cada
una de las proteiacutenas TGBp1 TGBp2 y TGBp3 en el movimiento ceacutelula a ceacutelula de PMTV
Shemyakina et al (2011) analizaron la localizacioacuten subcelular y el transporte de TGBp1
de acuerdo con los resultados obtenidos propusieron que la asociacioacuten de TGBp1 con los
microtuacutebulos puede ser importante para la formacioacuten de cuerpos de complejos de ribo-
nuacutecleo-proteiacutena viral destinada para el transporte a traveacutes de los plasmodesmos Estudios
similares han sido realizados por Wright et al (2010) cuyos resultados sugieren que TGB1
en PMTV requiere interaccioacuten con componentes nucleolares y posiblemente con
microtuacutebulos para el movimiento viral de ARN de larga distancia
El ARN desnudo se puede encontrar en tubeacuterculos asintomaacuteticos y causar una infeccioacuten
secundaria para la siguiente temporada de siembra (McGeachy y Barker 2000) La
manifestacioacuten de los siacutentomas caracteriacutesticos de la enfermedad depende de la presencia de
los tres ARN en el tejido (Savenkov et al 2003)
353 Rango de hospederos de PMTV
En condiciones experimentales el virus puede infectar plantas de las familias
Chenopodiaceae Solanaceae y Tetragoniaceae Dentro de estas se encuentran las plantas
que se usan para su diagnoacutestico las cuales corresponden a Nicotiana debneyi y
Chenopodium amaranticolor en las que se produce necrosis sisteacutemica y lesiones locales
conceacutentricas cafeacutes respectivamente Nicotiana benthamiana N debneyi N clevelandii y
N tabacum son las especies maacutes apropiadas para el mantenimiento y propagacioacuten del virus
bajo condiciones experimentales (ICTVdB 2006 Veacutelez 2007)
26
354 Siacutentomas causados por PMTV
La enfermedad inducida por PMTV presenta una amplia gama de siacutentomas dependiendo de
la variedad y de las condiciones ambientales siendo frecuente la presencia de anillos y
arcos de colores oscuros sobre la superficie de los tubeacuterculos mientras que internamente se
presentan arcos necrosados En infecciones secundarias los tubeacuterculos pueden mostrar
agrietamientos reticulados y profundos Adicionalmente los foliacuteolos de las plantas
afectadas pueden presentar moteados cloroacuteticos y liacuteneas con formas de V En la regioacuten
Andina la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos no es frecuente de observar pudiendo ser
igualmente inducidas por cepas necroacuteticas de PVY oacute por Streptomyces spp y Rhizoctonia
solani (Tenorio et al 2006) A nivel aeacutereo el virus tambieacuten puede inducir amarillamientos
enanismos y acortamiento de entrenudos (Salazar 1995)
En Escocia se estudioacute el efecto de los siacutentomas foliares causados por PMTV sobre el
rendimiento del cultivo los siacutentomas foliares y en el tubeacuterculo de varias generaciones de
siembra para la propagacioacuten de semilla de papa Se encontroacute que en los tubeacuterculos de
plantas sin siacutentomas rara vez se observan los siacutentomas foliares en la siguiente generacioacuten
Las plantas asintomaacuteticas produjeron maacutes tubeacuterculos infectados cuando eran derivadas de
plantas que presentaron siacutentomas foliares el antildeo anterior Adicionalmente la proporcioacuten de
plantas hijas con siacutentomas foliares provenientes de tubeacuterculos con siacutentomas foliares
tuvieron un rango de 19-41 en el antildeo y parecioacute estar asociado con la severidad de dichos
siacutentomas Asiacute mismo el siacutentoma de ldquospraingrdquo en los tubeacuterculos tendioacute a ser mayor en
plantas que presentaban siacutentomas foliares comparados con aquellas asintomaacuteticas Estos
resultados mostraron que la erradicacioacuten de plantas con siacutentomas foliares podriacutea mejorar la
fitosanidad del cultivo pero resulta impraacutectico cuando las plantas enfermas son muy
frecuentes (Carnegie et al 2010) Sin embargo los siacutentomas foliares son raramente
observados en variedades cultivadas actualmente en los paiacuteses noacuterdicos con excepcioacuten de
Noruega La razoacuten para estas diferencias de la etiologiacutea de la enfermedad no son
comprendidas pero puede ser que el clima marino maacutes huacutemedo en Noruega y Escocia
afecta la fisiologiacutea de la planta de papa e incrementa la infeccioacuten sisteacutemica por PMTV
(Santala et al 2010)
27
36 Deteccioacuten de PMTV
Para la deteccioacuten de PMTV se han utilizado diversas teacutecnicas de laboratorio Las primeras
pruebas incluyeron bioensayos con plantas indicadoras como Chenopodium amaranticolor
las cuales desarrollan los siacutentomas cuando son infectadas por PMTV Esta teacutecnica resulta
informativa pero tarda alrededor de 14 diacuteas para la expresioacuten de siacutentomas que en
ocasiones no son completamente confiables (Jeffries 1998)
Con el desarrollo de las pruebas ELISA se hizo posible la deteccioacuten de PMTV en dos diacuteas
sin embargo la generacioacuten de falsos negativos debido a la distribucioacuten erraacutetica del virus en
la planta ha hecho que se cuestione dicha teacutecnica Arif y Torrance (1996) realizaron
estudios de deteccioacuten de PMTV en muestras de tubeacuterculos de tres cultivares de papa
concluyendo que la combinacioacuten de tejidos de tubeacuterculos en la muestra incrementa la
probabilidad de deteccioacuten del virus En Dinamarca la utilizacioacuten de la teacutecnica DAS -
ELISA (Sandwich de anticuerpos doble - Ensayo por inmunoabsorcioacuten ligado a enzimas)
tuvo alta confiabilidad para el seguimiento de la presencia de PMTV en 23 cultivares de
papa sembrados en campo (Nielsen y Moslashlgaard 1997)
La utilizacioacuten de teacutecnicas basadas en aacutecidos nucleicos ha llevado al desarrollo de meacutetodos
de deteccioacuten de alta sensibilidad La RT-PCR es uno de estos meacutetodos de deteccioacuten maacutes
sensible Arif et al (1994) compararon la confiabilidad de ELISA y RT-PCR en la
deteccioacuten de PMTV de raiacuteces y hojas de plantas trampa de Nicotiana debneyi Luego de
tres semanas de siembra la RT-PCR detectoacute el virus en ambos tejidos mientras que con
ELISA se obtuvo la deteccioacuten del virus soacutelo despueacutes de cinco semanas de la siembra A
pesar de que la teacutecnica RT-PCR es maacutes sensible la preparacioacuten de las muestras para este
meacutetodo lleva maacutes tiempo por lo tanto ELISA es considerada por algunos investigadores
como la teacutecnica maacutes econoacutemica y conveniente para el anaacutelisis rutinario de grandes
cantidades de muestras (Davey 2009)
Davey (2009) realizoacute estudios de deteccioacuten y cuantificacioacuten de PMTV utilizando qRT-
PCR y disentildeando un par de cebadores y una sonda para cada ARN del genoma del virus El
bioensayo desarrollado para las muestras de suelo fue muy efectivo en la deteccioacuten de
28
PMTV utilizando Solanum esculentum cv Monkeymaker como planta trampa y cuando se
usoacute en conjunto con qRT-PCR los resultados se obtuvieron maacutes raacutepidamente que los de
otros bioensayos previamente descritos por Arif et al (1994) quienes utilizaron
Chenopodium quinoa como planta trampa
Otros meacutetodos basados en RT-PCR han sido empleados en Japoacuten por Nakayama et al
(2010) mediante microplacas de hibridizacioacuten RT-PCR (RT-PCR-MPH) para la deteccioacuten
de PMTV con cebadores especiacuteficos y una sonda marcada en muestras provenientes de
raiacuteces de plantas de tomate Asiacute mismo el diagnoacutestico en muestras de suelo utilizando este
meacutetodo determinoacute que el 612 de los lotes muestreados estaban infectados con PMTV
La hibridizacioacuten especiacutefica basada en amplificacioacuten con cebadores con marcadores
fluorescentes (Flash-PCR) tambieacuten ha sido una teacutecnica basada en PCR que ha permitido la
deteccioacuten raacutepida y precisa de diferentes virus de la papa como el PMTV (Ryazantsev y
Zavriev 2009) De otro lado los microarreglos con sondas especiacutefica para virus pueden
detectar un nuacutemero casi ilimitado de especies de virus en un solo ensayo Nicolaisen
(2011) realizoacute un estudio de microarreglos con la utilizacioacuten de 152 sondas potencialmente
capaces de detectar 52 virus en papa (incluyendo PMTV) Las hibridizaciones del ADNc de
plantas infectadas mostraron que 49 de los 52 virus fueron positivos e identificados
correctamente a nivel de especie demostrando que esta teacutecnica puede contribuir a la
construccioacuten de microarreglos geneacutericos capaces de detectar la mayoriacutea sino todos los
virus de ARN de plantas
En Colombia la deteccioacuten de PMTV fue reportada por primera vez por Veacutelez (2007) Los
ensayos de RT-PCR permitieron determinar que el 81 de los suelos muestreados en el
estudio presentaron infeccioacuten por PMTV Este meacutetodo utilizando los cebadores H360
C819 fue maacutes sensible para la deteccioacuten de PMTV que la induccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras En estos bioensayos se encontroacute que las plantas de N tabacum fueron mejores
indicadoras de la expresioacuten de siacutentomas que las de N debneyi pero estas uacuteltimas son maacutes
sensibles para la deteccioacuten de PMTV por RT-PCR
29
Gil (2010) realizoacute la evaluacioacuten de la presencia del virus PMTV a partir de plantas de N
benthamiana inoculadas con quistosoros de Sss mediante pruebas de deteccioacuten seroloacutegica y
molecular Un total de 18 muestras de raiacuteces infectadas con Sss fueron evaluadas
encontraacutendose que cinco muestras de Antioquia y una de Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo
arrojaron resultados positivos en las pruebas de ELISA Al comparar estos resultados con
los obtenidos con qRT-PCR se encontroacute que la prueba de qRT-PCR determinoacute la presencia
del virus en el 45 de las muestras analizadas mientras que mediante ELISA y RT-PCR
convencional se diagnosticaron 25 y 28 de las muestras como positivas Sin embargo el
anaacutelisis estadiacutestico no indicoacute diferencias significativas al nivel del 95 entre las tres
pruebas analizadas Al observar individualmente la capacidad de las pruebas para detectar
PMTV resultoacute llamativo el hecho que algunas muestras fueran positivas para dos de las
tres pruebas e incluso se presentaron casos en los que la prueba de ELISA detectoacute el virus
pero no las pruebas basadas en RT-PCR lo cual sugirioacute problemas con la inhibicioacuten de las
reacciones enzimaacuteticas o con los cebadores empleados
37 Variabilidad geneacutetica de PMTV
A nivel mundial se han desarrollado investigaciones que reportan la presencia de bajos
niveles de variacioacuten entre genotipos de PMTV (Mayo et al 1996) Latvala-Kilby et al
(2009) caracterizaron el gen de la CP y un dominio de lectura continua del ARN 2 asiacute
como el gen 8K y la regioacuten no traducida 3acutedel ARN 3 (UTR) de 37 aislamientos de
Finlandia y Letonia Fueron encontrados dos tipos diferenciables de ARN 2 y ARN 3 La
secuenciacioacuten y los anaacutelisis de RFLP de los productos de PCR de dichas regiones
indicaron que la mayoriacutea de los aislamientos de PMTV que infectaron tubeacuterculos en estos
paiacuteses europeos comprenden los restrictotipos ARN 2-II y ARN 3-B
En estudios previos en los cuales las secuencias CP de tres aislamientos de Escocia y ocho
de Peruacute fueron analizadas por Mayo et al (1996) las cepas bajo anaacutelisis mostraron poca
variabilidad De forma similar las secuencias CP de seis aislamientos de Norteameacuterica
presentaron una identidad mayor al 97 con respecto a algunas secuencias de aislamientos
de PMTV de Europa (Xu et al 2004) En Dinamarca se reportoacute la presencia de dos grupos
30
de PMTV basado en anaacutelisis de las secuencias de CP encontrando que eacutestos comparten
98 de identidad pero con posibles diferencias en la reproduccioacuten de siacutentomas en plantas
indicadoras (Nielsen y Nicolaisen 2003) Al parecer la variabilidad geneacutetica de los genes
de la CP en aislamientos de PMTV del norte de Europa y Norte Ameacuterica es limitada y
permite la deteccioacuten confiable del virus con los anticuerpos monoclonales y los cebadores
de la PCR usados actualmente (Santala et al 2010)
En Colombia Velez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo con alta identidad con aislamientos de Europa
y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por aislamientos colombianos Una
situacioacuten similar encontroacute Gil (2010) con aislamientos Colombianos de PMTV que
presentaron una estructura poblacional con bajos niveles de variabilidad pero con algunas
variantes divergentes con respecto a los genotipos de referencia mundial Dichas variantes
presentaron diferencias en sus secuencias de CP hasta del 24 con respecto al grupo
principal La contextualizacioacuten en el genoma viral de dos secuencias obtenidas por dicho
autor en cepas de PMTV del departamento de Antioquia indicoacute que se tratan de
aislamientos representativos del genoma ordinario de PMTV y no de las variantes
encontradas en el anaacutelisis filogeneacutetico Sus identidades para las porciones del ARN 2 y
ARN 3 secuenciadas fueron altas (gt97) con respecto a los genomas reportados en
trabajos anteriores (Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) por lo que se plantea la
necesidad de secuenciar dichas regiones en al menos un aislamiento de las variantes
referidas
Los resultados encontrados en esta investigacioacuten permiten plantear que el caso de PMTV
en Colombia es aparentemente singular dada la presencia de dos variantes geneacuteticas de los
altos niveles de infeccioacuten que genera Sss en cultivos de papa de diferentes departamentos y
de las diferencias notables en la manifestacioacuten de siacutentomas de la sarna polvosa entre
variedades locales (Carrentildeo 2009 Gilchrist et al 2009 Gil 2010) situacioacuten que amerita
continuar con los estudios de variabilidad geneacutetica y fenotiacutepica en dichos patosistemas
31
BIBLIOGRAFIA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Agrios GN 1996 Fitopatologiacutea Editorial Limusa Meacutexico
Andersen BAB Nicolaisen M Nielsen SL 2002 Alternative hosts for Potato mop-top
virus genus Pomovirus and its vector Spongospora subterranea Potato Research 45 37-
43
Arias CMM 2011 Anaacutelisis y comparacioacuten de los glucosinolatos presentes en diferentes
acceciones de cubio (Tropaeolum tuberosum) para evaluar su uso potencial en el control
del patoacutegeno de la papa Spongospora subterranea Tesis de Maestriacutea en Ciencias Quiacutemicas
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Departamento de quiacutemica
Bogataacute Colombia
Arif M Torrance L Reavy B 1994 Improved efficiency of detection of potato mop- top
furovirus in potato tubers and in the roots and leaves of soil-bait plants Potato Research
37 373-381
Arif M Torrance L 1996 Detection of Potato mop-top virus in potato tubers Proceedings
Crop Protection in Northern Britain 325-330
Astier S Albouy J Maury Y Robaglia C Lecoq H 2007 Principles of plant virology
genome pathogenicity virus ecology Science Publishers Enfield NH USA P 112
Bell KS Roberts J Verral S Cullen DW Williams NA Harison JG 1999 Detection and
quantification of Spongospora subterranea fsp subterranea in soils and on tubers using
specific primers PCR primers European Journal of Plant Pathology 105905-915
Benavides PJA 2006 Incidencia y severidad de la rontildea de la papa causada por
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh f sp subterranea Tomlinson en raiacuteces y
tubeacuterculos de Diacol Capiro y Parda Pastusa en tres eacutepocas de siembra en el departamento
32
de Narintildeo y su efecto en los rendimientos (Tesis de maestriacutea) Bogotaacute Colombia Facultad
de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid diagnostic
test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European Journal of Plant
Pathology 131 (2) 277-287
Budziszewska M Wieczorek P Nowaczyk K Borodynko N Pospieszny H Obrecircplaska-
Stecircplowska A 2010 First report of potato mop-top virus on potato in Poland Plant
Disease 94 (7) 920
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47759-766
Campell RN 1996 Fungal transmission of plant viruses Annuals Review of
Phytopathology 3487-108
Carnegie SF Cameron AM McCreath M 2010 Foliar symptoms caused by Potato mop-
top virus on potato plants during vegetative propagation in Scotland and their association
with tuber yield spraing and tuber infection Potato Research 53 83-93
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia (Tesis de Maestriacutea) Bogotaacute
Colombia Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Colombia
Cerovska N Pecenkeva T Filigarovaacute M Dedic P 2007 Sequences analysis of the Czech
Potato Mop-Top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica 52(1) 61-
64
Cotes J Jaramillo S Gonzaacutelez L 2006 Evaluacioacuten de la incidencia de sarna polvosa en
tres variedades de papas colombianas Congreso Internacional de papa John S
Niederhauser Meacutexicop O-7 ISBN 968-02-0270-4
33
Crosslin JM 2011 First report of potato mop-top virus on potatoes in Washington State
Plant Disease 95 (11)1483
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
David N Mallik I Crosslin JM Gudmestad NC 2010 Firt report of Potato mop-top virus
in North Dakota Plant Disease 94 (12)1506
Dick MW 2001 Straminipilous fungi systematic of the Peronosporomycetes including
accounts of the marine straminipilous protist the plasmodiophorids and similar organisms
Kluwer Dordrecht
Dijkstra J Khan JA 2006 Handbook of Plant Virology Haworth Press Inc New York
US Jawaid A Khan Jeanne Dijkstra editors P 452
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC Scott CL 2010 Elevated zinc and manganese
levels give moderate reductions in Spongospora subterranea infection of potato roots In
Proceedings 6th Australasian Soilborne Diseases Symposium Twin Waters Queensland 9-
10 August 2010 P 46
Falloon RE Russell AG Wallace AR Butler RC 2003 Susceptibility of potato (Solanum
tuberosum) cultivars to powdery scab (caused by Spongospora subterranea) and
relationships between tuber and root infection Australasian Plant Pathology 32377-385
FAO 2008 Antildeo internacional de la papa (Citado 14 enero 2011) Disponible en
httpwwwpotato2008orgesmundoamerica_latinahtml
FAO 2009 Sustainable potato production Guidelines for developing countries (Citado 14
enero 2011) Disponible en ftpftpfaoorgdocrepfao012i1127ei1127epdf
34
Gallo GYM 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea Facultad de Medicina Universidad Nacional de Colombia
Bogotaacute Colombia
Garciacutea C Navia E 2002 Evaluacioacuten de estrateacutegias de manejo de la rontildea polvosa
(Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en Colombia
(Citado 14 Ene 2011) Disponible en
httpwwwredepapaorgpracticasculturalesred3html
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Gil RJF Mariacuten M 2010 Diagnoacutestico y caracterizacioacuten molecular de virus asociados al
cultivo de la papa en Colombia con eacutenfasis en el virus Mop Top (PMTV Pomovirus)
(Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia
Gilchrist RE 2009 Alternativas para el manejo integrado de la sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) (Tesis de Doctorado) Medelliacuten Colombia
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia
Gilchrist E Jaramillo S Reynaldi S 2009 Efecto sobre la sarna polvosa de cuatro
aislamientos del hongo Trichoderma asperellum en tres tipos de suelo Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 624783ndash4792
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
35
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tuber by enzyme-linked immunosorbent assay Plant pathology
42181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato-a review
Plant pathology 461-25
Hoyos L Peacuterez JC Jaramillo S Orduz S Ntildeustez C 2002 Evaluacioacuten del efecto de
Trichoderma spp sobre Spongospora subterranea en papa variedad Diacol Capiro bajo
condiciones de invernadero Subproyecto 4 de Evaluacioacuten de las estrategias de manejo de la
rontildea polvosa (Spongospora subterranea) en las tres regiones maacutes productoras de papa en
Colombia 2002 Disponible en wwwcevipapaorgco
Hoyos CL Villegas OM Gonzalez JEP 2009 Observaciones histoloacutegicas de estructuras
celulares asociadas a Spongospora subterranea f sp subterranea en papa Revista Facultad
Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 62(2) 5039-5045
Houser AJ Davidson RD 2010 Development a greenhouse assay to evaluate potato
germplasm for susceptibility to powdery scab American Journal of Potato Research 87
285-298
ICTVdB 2006 Management Potato mop-top virus The Universal Virus Database version
4 Buumlchen-Osmond C (Ed) Columbia University New York USA (Citado 20 Dic 2010)
Disponible en httpwwwncbinlmnihgovICTVdbICTVdB00086001001htm
Jaramillo S Calderoacuten H Narvaacuteez C Machuca A Afanador L Hincapieacute L Correa G 2003
Caracterizacioacuten de la variabilidad patogeacutenica y molecular de Spongospora subterranea
Informe final fase 2 Convenio Universidad Nacional Sede Medelliacuten y CEVIPAPA
Medelliacuten p 80
Jaramillo S Gonzaacutelez L Cotes J 2006 Efecto del tipo de suelo sobre la sarna polvosa
causada por Spongospora subterranea f sp subterranea (Wall) Lagerheim en papa
36
Congreso Internacional de papa John S Niederhauser Meacutexico p O-6ISBN 968-02-0270-
4
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos cultivares de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista de la Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 60(2)
3859-3876
Jaramillo VS Peacuterez AGA Hoyos CLM 2008 Variacioacuten morfoloacutegica de quistosoros de
Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh fsp subterranea Revista Facultad de
Agronomiacutea ndash Medelliacuten 61(2)4511-4517
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Jones RAC Harrison BD 1969 The behaviour of Potato mop top virus in soil and
evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wall) Lagerh Annals Applied
Biology 63 1-17
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 71 47-57
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003 First
Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease 87872
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99(5)519-531
Lees AK 2000 Summary of the session on past and present research on powdery scab
Past and present Research Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery
scab Workshop Aberdeen Scottland July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) P 55-57
37
Lees AK van de Graaf P Cullen DW Duncan JM 2002 The development of a
quantitative real-time PCR assay for Spongospora subterranea f sp subterranea and its
use in epidemiological studies In Proceedings of the 5th
symposium of the international
working group on plant viruses with fungal vectors Institute of Plant Science Swiss
Federal Institute of Technology (ETH) Zurich Switzerland July 22-25 2002 P31
Lees AK van de Graaf P Wale S 2008 The identification and detection of Spongospora
subterranea and factors affecting infection and disease American Journal of Potato
Research 85 247-252
Lister RA Falloon RE Curtin D Butler C 2004 Spongospora subterranea reduces host
(Solanum tuberosum) growth Proceedings of 3rd
Australasian Soilborne Diseases
Symposium Barossa Valley South Australia 9-11 February 2004
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization and
effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal of
General Virology 862879-2889
Lyman GR Rogers JT 1915 The native habitat of Spongospora subterranea Science
42940-2
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2005 La cadena de la papa en
Colombia Una mirada a su estructura y dinaacutemica 1991-2005 Documento de trabajo Ndeg 54
(Citado 13 Ene 2011) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet2005112163731_caracterizacion_papapdf
MADR (Ministerio de agricultura y desarrollo rural) 2006 Observatorio agrocadenas
Colombia Documento de trabajo No 100 La cadena de la papa en Colombia Una mirada
global de su estructura y dinamica 1991-2005 (Citado 20 Dic de 2011) Disponible en
httpwwwagrocadenasgovco
38
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009a Memorias 2008- 2009
(Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwminagriculturagovcoarchivosmemorias_minagricultura_2009_completopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural) 2009b Anuario estadiacutestico del
sector agropecuario y pesquero Direccioacuten de poliacutetica sectorial Grupo sistemas de
informacioacuten Bogotaacute DC (Citado 20 Dic 2010) Disponible en
httpwwwagronetgovcowwwhtm3bpublicanuarioanuariopdf
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural)ndashENA (Encuesta Nacional
Agropecuaria) 2009 Oferta Agropecuaria cifras 2009 (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en
httpwwwagronetgovcowwwdocs_agronet201046112648_RESULTADOS_ENA_200
9pdf
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C Salazar
LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top virus
from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
McDonald BA Martinez JP 1990 Restriction fragment length polymorphisms in Septoria
tritici occur at a high frequency Current Genetics 17133-138
McGeachy KD Barker H 2000 Potato mop-top virus RNA can move long distance in the
absence of coat protein Evidence from resistant transgenic plants Molecular Plant
Microbe Interactions 13125-128
Melander M Lee M Sandgren M 2001 Reduction in Potato mop-top virus accumulation
and incidence in tubers of potato transformed with a modified triple gene block gene of
PMTV Molecular Breeding 8197-206
Merz U 1989 Infectivity inoculum density and germination of Spongospora subterranea
resting spores a solution culture test system Bulletin OEPP 19 585-592
39
Merz U 2000 Powdery scab Research in Switzerland Past and present Research
Powdery SCAF En Proceedings of the First European Powdery scab Workshop Scottland
July 20-22 (Merz U Lees AK Eds) 2000 p 67-71
Merz U 2008 Powdery Scab of PotatomdashOccurrence Life Cycle and Epidemiology
American Journal of Potato Reserch 85241ndash246
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar
x environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Merz U Martiacutenez V Schwaumlrzel R 2004 The potencial for the rapid screening of potato
cultivars (Solanum tuberosum) for resistance to powdery scab (Spongospora subterranea)
using a laboratory bioassay European Journal of Plant Pathology 110 71-77
Merz U Walsh JA Bouchek-Mechiche K Oberhaumlnsli TH Bitterlin W 2005 Improved
immunological detection of Spongospora subterranea European Journal of Plant
Pathology 111371ndash379
Merz U Falloon RE 2009 Review Powdery scab of potato-increased knowledge of
pathogen biology and disease epidemiology for effective disease management Potato
Research 5217-37
Merz U Lees AK Sullivan L Schwaumlrzel R Hebeisen T Kirk HG Bouchek-Mechiche K
Hofferbert HR 2012 Powdery scab resistence in Solanum tuberosum an assessment of cultivar x
environmental effect Plant Pathology 61(1) 29-62
Montero-Astua M Vasquez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
40
Murakami H Tsushima S Akimoto T Murakami K Goto I Shishido Y 2000 Effects of
growing leafy daikon (Raphanus sativus) on populations of Plasmidiophora brassicae
(clubroot) Plant Pathology 49584-589
Mutasa ES Ward E Adams MJ Collier CR Chwarszcynska D Asher MJC 1993 A
sensitive DNA probe for the detection of Polymyxa betae in sugar beet roots Physiological
and Molecular Plant Pathology 43 379-390
Mutasa-Gottgens ES Chwarszczynska Halsey H Asher MJC 2000 Specific polyclonal
antibodies for the obligate plant parasite Polymyxa a targeted recombinant DNA approach
Plant Pathology 49276-87
Nakayama T Maoka T Hataya T Motoshige S Fuwa S Mori M 2010 Diagnosis of
Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-285
Nicolaisen M 2011 An oligonucleotide-based microarray for detection of plant RNA
viruses Journal of Virological Methods 173 137-143
Nielsen SL Moslashlgaard JP 1997 Incidence appearance and development of potato mop-top
furovirus-induced sprain in potato cultivars and the influence on yield distribution in
Denmark and detection of the virus in tubers by ELISA Potato Research 40101-110
Nielsen S Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups within
Potato mop-top virus Archives of Virology 148381ndash388
Nitzan N Boydston R Batchelor D Crosslin J Brown C 2009 Hairy nightshade is an
alternative host of Spongospora subterranea the potato powdery sacab pathogen
American Journal of Potato Research 86 297-303
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
41
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006a The host range of Spongospora subterranea f sp subterranea in
the United States American Journal of Potato Research 83343-347
Qu XS Christ BJ 2006b Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea fsp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Ramiacuterez GJG 2010 Variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp subterranea
en suelos del municipio de unioacuten cultivados con la coleccioacuten Central colombiana de
Solanum phureja (Tesis de Pregrado) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias
Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia 2010
Restrepo DAF Jaramillo VS Cotes TJM 2009 Efecto de dos microorganismos y un
consorcio de micorrizas en combinacioacuten con viruta de pino sobre el control de sarna
polvosa (Spongospora subterranea) en papa Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea
Medelliacuten 62(2) 5047-5054
Rodriacuteguez K Maldonado Y Murcia L Huertas W Vaacutesquez M Zambrano A Rivero R
Garciacutea C 2002 Evaluacioacuten de protocolos para la deteccioacuten de patoacutegenos del suelo en Papa
(Rhizoctonia Rosellinia y Spongospora) (Citado 15 Ene 2011) Disponible en
httpwwwtodopapacomarpdfprotocolospdf
42
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista Facultad Agronomiacutea 26 (4) Caracas
Ryazantsev DYu Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato plant pathogens Applied Molecular Biology 43(3) 515-523
Saavedra SCO Goacutemez GST Aacutengel DJE 2004 Deteccioacuten de secuencias especiacuteficas de
ADN de Spongospora subterranea en suelo y tubeacuterculos de papa Revista Colombiana de
Biotecnologiacutea 714-23
Salazar LF1995 Los virus de la papa y su control Centro Internacional de la Papa CIP
(Peruacute) Publicado por el Centro Internacional de la Papa P 226
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 49 43-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M Wieczorek
P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-Wiśniewska J Yin Z
Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E Taluntytė L Pūpola N
Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E Sozonov A Tikhonovich I
Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam G Valkonen JPT 2010 Detection
distribution and control of Potato mop-top virus a soil-borne virus in northern Europe
Annals of Applied Biology 157163-178
43
Savenkov EI Sandgren M Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003 Potato
mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich protein are
dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of General
Virology 841001-1005
Shah FA Falloon RE Bulman SR 2010 Nightshade weeds (Solanum spp) confirmed as
hosts of the potato pathogens Meloidogyne falax and Spongospora subterranea f sp
subterranea Australasian Plant Pathology 39 492-498
Shah FA Falloon RE Lister RA Butler RC McKay A Ophel-Keller K Khan I 2009
Relationships between Spongospora subterranea DNA in field soil and powdery scab in
harvested potatoes Conference Handbook 17th
Australasian Plant Pathology Society
Conference (APPS) 29 September-1 October 2009 P 148
Shemyakina EA Sclovyev AG Leonova OG Popenko VI Schiemann J Morozov SY
2011 The role of microtubule association in plasmodesmal targeting of potato mop-top
virus movement protein TGBp1 The Open Virology Journal 51-11
SINAIPA (Sistema nacional de informacioacuten de papa) 2002 La rontildea de la papa p 8-9 El
Correo de la Papa Boletiacuten mensual No 07 Colombia (Citado 20 Dic 2010) Disponible
en wwwcevipapaorgcopublicacionespublicacionesphp
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Reserch 83423-31
Torres H Pacheco MA French ER 1995 Resistance of potato to powdery scab
(Spongospora subterranea) under Andean field conditions American Potato Journal
10355-363
44
van de Graff PV Lees AK Cullen DW Duncan JM 2003 Detection and quantification of
Spongospora subterranea soil water and tissue samples using real-time PCR European
Journal of Plant Pathology 109 589-597
van de Graff P Wale SJ Lees AK 2007 Factors affecting the incidence and severity of
Spongospora subterranea infection and galling in potato roots Plant Pathology 56 1005-
1013
Veacutelez B 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato mop- top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia (Tesis de Maestriacutea) Medelliacuten Colombia Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad Nacional de Colombia
Villareal HJ Porras PD Santa A Lagoeyte J Muntildeoz D 2007 Costos de produccioacuten de
papa en las principales zonas productoras de Colombia Federacioacuten Colombiana de
productores de papa FEDEPAPA
Wale SJ Burgess PJ Burnett F 1993 Bioassay for Spongospora subterranea detection in
soil and its potential use in predicting scab in the field Abstract 1642 Sixth International
Congress of Plant Pathology Quebec Canada
Wallroth FW 1842 Der Knollenbrand der Kartoffel Linnaea 16 332
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea using monoclonal antibodies Plant pathology 44335-365
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2004 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165 875-85
Ward LI Beales PA Barnes AV Lane CR 2005 A Real-time PCR assay based method for
routine diagnosis of Spongospora subterranea on Potato tubers Journal Phytopathology
152 633-638
45
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI Torrance
L 2010 The N- terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required for the
nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant Microbe Interaction 23(1) 1486-1497
Wuumlrzer B 1964 Ergaumlzende Untersuchungen uumlber den Pulverschorf der Kartoffel und
dessen Erreger Spongospora subterranea (Wallr) Lagerh diss Landwirtschaftliche
Hochschule Hohenheim Germany 1964
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top virus
in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
Zamyatnin JrAA Solovyev AG Savenkov EI Germundsson A Sandgren M Valkonen
JPT Morozov SY 2004 Transient coexpression of individual genes encoded by the triple
gene block of Potato mop-top virus reveals requirements for TGBp1 trafficking Molecular
Plant-Microbe Interactions 17(8) 921-930
Zhang N McCarthy ML Smart CD 2008 A macroarray system for the detection of fungal
and oomycete pathogens of solanaceous crops Plant Disease 92(6) 953-960
Zolan ME Pukilla PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinerus
Molecular and cellular Biology 6(1)195-200
46
RESULTADOS
4 ARTICULO 1
VARIABILIDAD GENEacuteTICA DE Spongospora subterranea f sp subterranea EN
COLOMBIA
GENETIC VARIABILITY OF Spongospora subterranea f sp subterranea IN
COLOMBIA
Ineacutes Osorio Giraldo1 Marcela Orozco Valencia
1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
1 Elena Paola
Gonzaacutelez Jaimes2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
Formato de la Revista Actualidades Bioloacutegicas ISSN 0304-3584
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
La Sarna polvosa de la papa (Spongospora subterranea fsp subterranea - Sss) es una de
las enfermedades re-emergentes maacutes importantes de este cultivo en Colombia El efecto
deleteacutereo de Sss no soacutelo se debe al dantildeo directo sobre el sistema radicular y la calidad de
los tubeacuterculos sino tambieacuten a que sus zoosporas transmiten el Potato mop-top virus
(PMTV Pomovirus) Sss genera quistosoros que actuacutean como estructuras de resistencia del
patoacutegeno en el suelo pudiendo permanecer viables por varias deacutecadas Por esto su manejo
debe fundamentarse en el uso de variedades tolerantes a la enfermedad y en el empleo de
tubeacuterculo-semilla certificado En esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variacioacuten de
127 aislamientos de Sss obtenidos en los departamentos de Antioquia Boyacaacute
Cundinamarca y Narintildeo con el fin de apoyar la seleccioacuten de aislamientos de Sss a evaluar
47
en programas de mejoramiento geneacutetico de papa y en el disentildeo de pruebas de deteccioacuten
asintomaacutetica del patoacutegeno Para esto se secuenciaron regiones ITS del ADN ribosomal y se
condujeron anaacutelisis filogeneacuteticos encontraacutendose la presencia de tres variantes principales
de Sss dos de las cuales (Tipos I y II) han sido reportadas en otros paiacuteses del mundo
mientras que el Tipo III hasta ahora solo se ha encontrado en Colombia Con base en esta
informacioacuten se disentildeoacute una prueba de PCR-RFLPs que permite identificar los ribotipos del
patoacutegeno responsables de la Sarna polvosa en una regioacuten determinada
Palabras clave ADNr ITS PCR Sarna polvosa Solanum tuberosum
Abstract
Powdery scab (Spongospora subterranea fsp subterranea ndash Sss) is one of the most
important re-emerging diseases of potato crops in Colombia Sss can cause severe root
damage and compromise the quality of tubers Moreover Sss zoospores can also serve as
vector of Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Sss can survive in the soil for decades
due to the formation of resistance structures or cystosori For this reason the disease can
only be efficiently controlled by using resistant potato varieties and certified seed tubers In
this work the level of variation of 127 Sss isolates from the Colombian provinces of
Antioquia Boyacaacute Cundinamarca and Narintildeo was evaluated This information is of great
value for genetic improvement programs of potato and can also be used in the design of
asymptomatic detection tests Phylogenetic analysis of ITS rDNA sequences revealed the
existence of three Sss variants Types I and II have been reported in other countries while
type III has only been found in Colombia This information was used to design a PCR-
RLFP test to discriminate different powdery scab ribotypes
Key words rDNA ITS PCR Powdery scab Solanum tuberosum
INTRODUCCIOacuteN
El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L) se ve afectado por diversos microorganismos
fitopatoacutegenos e insectos plagas destacaacutendose en los uacuteltimos antildeos la re-emergencia de la
48
enfermedad denominada Sarna polvosa causada por el plasmodiofoacuterido Spongospora
subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp subterranea Tomlinson (Sss) Su efecto no solo se
debe a la reduccioacuten en la produccioacuten sino tambieacuten al deterioro en la calidad y apariencia
cosmeacutetica de los tubeacuterculos que reduce draacutesticamente su valor en el mercado (Merz y
Fallon 2009) Ademaacutes Sss es el vector natural del Potato mop top virus (PMTV) uno de
los problemas virales de la papa que tiene caraacutecter cuarenteneario para diferentes paiacuteses del
mundo (Salazar 2006 Gil et al 2011)
Sss es originario de los Andes Surameacutericanos desde donde se dispersoacute gracias al mercado
mundial de tubeacuterculos de papa A pesar de haber transcurrido maacutes de 150 antildeos desde su
primer registro la enfermedad soacutelo ha cobrado importancia en las uacuteltimas deacutecadas como
resultado de la siembra generalizada de materiales altamente susceptibles al patoacutegeno la
utilizacioacuten de sistemas de riego en los cultivos los cambios de eacutepocas de siembra hacia
periacuteodo huacutemedos las deficiencias en los sistemas de rotacioacuten de cultivos la falta de
programas de exclusioacuten y los altos estaacutendares exigidos por el mercado en la calidad
cosmeacutetica de los tubeacuterculos (Harrison et al 1997)
Sss es un patoacutegeno obligado plasmodial que taxonoacutemicamente se ubica en el Reino
Protozoa Divisioacuten Myxomycota Clase Plasmodiophoromycetes y en la Familia
Plasmodiophoraceae donde se encuentran otros ocho geacuteneros cuyas diferencias
morfoloacutegicas se basan en el arreglo de las estructuras de resistencia El geacutenero Spongospora
tiene cuatro miembros reconocidos dos de ellos son importantes patoacutegenos de vegetales
Spongospora subterranea fsp subterraena y f sp nasturtii Estos taxa fueron definidos
inicialmente como forma especialis (Merz y Falloon 2009) sin embargo con base en la
morfologiacutea de los zoosporangios rango de hospedantes y anaacutelisis filogeneacuteticos de regiones
ribosomales actualmente se acepta que representan dos especies diferentes (Qu y Christ
2004)
Los siacutentomas de la Sarna polvosa incluyen la induccioacuten en los tubeacuterculos de lesiones
pustulosas corchosas con centros pulverulentos formados a partir de la agregacioacuten de los
quistosoros del patoacutegeno (Figura 41) Con el avance de estas lesiones es frecuente la
49
ruptura del peridermo aunque el nivel de penetracioacuten en los tubeacuterculos es generalmente
superficial (Carrentildeo 2009) Bajo condiciones oacuteptimas para el desarrollo de la enfermedad
es frecuente la unioacuten de lesiones que generan la deformacioacuten de los tejidos y la formacioacuten
de caacutenceres o agallas (Harrison et al 1997) En Colombia la enfermedad ademaacutes de causar
los dantildeos descritos genera el deterioro del sistema radicular de las plantas al inducir la
formacioacuten de agallas muacuteltiples en forma de cuentas que causan la disminucioacuten de la
superficie de absorcioacuten de las raiacuteces induciendo marchitez y finalmente la muerte de las
plantas (Gilchrist 2009) La infeccioacuten en las raiacuteces especialmente cuando se forman
agallas puede causar una reduccioacuten en la toma de agua y de nutrientes por parte de las
plantas (Falloon et al 2005)
En los departamentos de Antioquia Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Sss afecta
severamente las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y papa criolla (S phureja) Los
siacutentomas se observan en raiacuteces y tubeacuterculos pero hay variacioacuten entre las zonas paperas en
cuanto a la distribucioacuten de los siacutentomas en los diferentes oacuterganos de la planta En
Cundinamarca Boyacaacute y el Norte de Antioquia es maacutes frecuente observar puacutestulas sobre
los tubeacuterculos de las variedades Parda Pastusa y Diacol Capiro mientras que en el
departamento de Narintildeo y el Oriente de Antioquia es comuacuten observar agallas en raiacuteces
Hasta ahora no se conoce si estas diferencias se deben a variaciones en las condiciones
ambientales de las regiones o a la ocurrencia de variantes geneacuteticas del patoacutegeno (Jaramillo
y Botero 2007 Carrentildeo 2009)
En Colombia la Sarna polvosa de la papa se ha reportando causando peacuterdidas de hasta el
50 en las cosechas de las variedades Parda Pastusa Diacol Capiro y Criolla Colombia
(Rodriacuteguez et al 2009 Gilchrist 2009) Adicionalmente a esta problemaacutetica la
diseminacioacuten del patoacutegeno se viene incrementando dramaacuteticamente en el paiacutes como
resultado de la baja calidad del tubeacuterculo-semilla utilizado por la mayoriacutea de los
agricultores la ausencia de variedades tolerantes al patoacutegeno y la deficiencia en la
asistencia teacutecnica que no cuenta con herramientas apropiadas para el diagnoacutestico
asintomaacutetico y para la certificacioacuten de semilla libre de Sss y PMTV (Gil et al 2011) Su
manejo debe estar enmarcado bajo un esquema integrado del cultivo en el que se incluyan
50
aspectos como la rotacioacuten el manejo adecuado del riego y el drenaje la sanidad del
tubeacuterculo-semilla utilizacioacuten de organismos antagonistas (ej Trichoderma spp) el empleo
de cultivos trampa la desinfeccioacuten de herramientas de trabajo y finalmente una legislacioacuten
que restrinja el movimiento de material contaminado y supervise maacutes detalladamente los
procesos de certificacioacuten de semilla Desafortunadamente en el paiacutes pocas de eacutestas praacutecticas
son utilizadas por los agricultores y por el contrario hay un desconocimiento generalizado
del manejo de la enfermedad llegaacutendose incluso a confundir con problemas bacteriales o
de Rhizoctoniasis (Carrentildeo 2009)
La problemaacutetica causada por esta enfermedad en las regiones cultivadoras de papa hace
necesario que se intensifiquen los esfuerzos por desarrollar metodologiacuteas de diagnoacutestico de
suelos y material vegetal que eviten la diseminacioacuten generalizada del plasmodiofoacuterido y de
su virus asociado PMTV entre regiones infectadas y libres de enfermedad siendo
especialmente importante el desarrollo de procedimientos que garanticen la sanidad de los
lotes dedicados a la produccioacuten de semilla Entre las diversas metodologiacuteas desarrolladas en
el mundo para el diagnoacutestico de este patoacutegeno se destacan la teacutecnica de ELISA con
anticuerpos policlonales (Harrison et al 1993 Walsh et al 1996) PCR convencional
usando cebadores especiacuteficos (Bulman y Marshall 1998 Bell et al 1999) y recientemente
PCR en tiempo real basado en el uso de sondas TaqManreg (Qu et al 2011) y pruebas de
flujo lateral (Bouchek-Mechiche et al 2011) Sin embargo estas teacutecnicas son de aplicacioacuten
limitada en nuestro medio al no estar disentildeadas con base en los genotipos locales de los
patoacutegenos presentes en las regiones paperas del paiacutes Con el fin de suplir dicha carencia de
informacioacuten en esta investigacioacuten se evaluaron los niveles de variabilidad geneacutetica de
aislamientos de Sss procedentes de las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia
mediante el anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS del ADN ribosomal (ADNr)
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Para la coleccioacuten de muestras de quistosoros de Sss proveniente de suelo raiacuteces y
tubeacuterculos se seleccionaron lotes en fincas con antecedentes de infeccioacuten seguacuten el registro
51
histoacuterico de los agricultores siguiendo la metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la
cual se utiliza un juego de tamices de 100 y 25 microm para la obtencioacuten de los quistosoros Por
cada lote se tomaron raiacuteces de plantas o tubeacuterculos sintomaacuteticos y una muestra de suelo de
500 gr Los sitios de coleccioacuten incluyeron las regiones cultivadoras de papa de los
municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio Subachoque y
Villa Pinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute Oicataacute (Boyacaacute) y Pasto e Ipiales
(Narintildeo) La investigacioacuten se propuso obtener un miacutenimo de 30 muestras de Sss por
departamento
Los quistosoros obtenidos a partir de muestras de suelos fueron inoculados en plantas de
Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo o plantas
trampa para incrementar el inoacuteculo siguiendo la metodologiacutea de Veacutelez (2007)
mantenieacutendose en casa de malla en el Centro Experimental Paysanduacute ubicado en el
corregimiento Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB 2550 msnm temperatura
media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) (Figura 42) Todas las muestras
fueron procesadas en los laboratorios de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad
Nacional de Colombia sede Medelliacuten y Sanidad Vegetal del Politeacutecnico Colombiano Jaime
Isaza Cadavid
Extraccioacuten de ADN
Para la obtencioacuten del ADN se empleoacute una modificacioacuten de la metodologiacutea de Doyle y
Doyle (1987) a partir de quistosoros extraiacutedos y de tejidos afectados de las plantas de papa
y plantas sentildeuelo En este procedimiento es necesaria la maceracioacuten con nitroacutegeno liacutequido
de los tejidos y se emplea como buffer de extraccioacuten una solucioacuten CTAB y 1
mercaptoetanol El lavado de la fase orgaacutenica se realiza con fenolcloroformo-alcohol
isoamiacutelico y la precipitacioacuten de los aacutecidos nucleicos con 1 voluacutemen de etanol absoluto y 01
voluacutemen de acetato de sodio 3M Finalmente el pellet generado es disuelto en agua
destilada esteacuteril y es sometido a digestioacuten de ARN mediante la adicioacuten de ribonucleasa A
(10 mgmL) (Ver protocolo 62) Cuando la presencia de inhibidores afectaba la eficiencia
52
de la PCR la extraccioacuten de ADN se realizoacute utilizando el kit DNeasy Plant (Qiagen
EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante con una ligera modificacioacuten en el paso
de elucioacuten de ADN que se realizoacute en dos etapas con 70 microL de agua destilada esteacuteril Para
determinar la concentracioacuten del ADN extraiacutedo se utilizoacute la lectura de absorbancia en las
longitudes de onda de 260 y 280 nm mediante un Nanodrop 2000C (Thermo EEUU)
obtenieacutendose un rango entre 10 y 112 ng de ADNμL con una relacioacuten 260280 de 15 a 19
(Tabla 41) La integridad del ADN se determinoacute realizando electroforesis en gel de agarosa
al 08 en buffer TBE 1X (TBE 5X 54 gL Tris 275 gL de aacutecido boacuterico 20 mLL de
EDTA 05M pH 80) suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) La visualizacioacuten de
las bandas se realizoacute utilizando el sistema digital de anaacutelisis Bio Doc Analyze (Biometra
Alemania) (Figura 43)
PCR de ITS del ADNr
Para la evaluacioacuten de los niveles de variacioacuten geneacutetica de Sss se realizaron PCR empleando
los cebadores especiacuteficos Spo8 (5 CTG GGT GCG ATT GTC TGT TG 3) y Spo9 (5 CAC
GCC AAT GGT TAG AGA CG 3) disentildeados por Bulman y Marshall (1998) asiacute como los
cebadores SsF (5acute GTC GGT TCT ACC GGC AGA CC 3acute) y SsR (5acute GCA CGC CAA
TGG TTA GAG ACG 3acute) reportados por Qu et al (2006) que amplifican productos de
391 y 434 pb de la regioacuten ITS del ADNr respectivamente Las reacciones de PCR
incluyeron 01 microM de cada cebador 1 U de Taq ADN polimerasa recombinante
(Fermentas Lithuania) 02 mM de cada dNTP 1X de buffer de enzima (100 mM Tris-HCl
(NH4)2SO2 pH 88) 2 mM MgCl2 1 microL de una dilucioacuten 50 ngmicroL de ADN y un volumen
total de 25 microL Las amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra) y
consistieron de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 35 ciclos de
94degC por 30 s 55degC por 30 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10
min Luego de la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se
separaron por electroforesis en gel de agarosa al 15 tal como se indicoacute anteriormente
53
Secuenciacioacuten
De ser necesario los amplicones obtenidos fueron purificados mediante los kits QIAquick
PCR Purification y QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para proceder a su secuenciacioacuten
directa en ambas direcciones utilizando los cebadores empleados en la PCR y el kit Big
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied Biosystems EEUU) Su
corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied
Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur) (Figura 44)
Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit
606 y Chromas 145 construyeacutendose secuencias consenso y confirmaacutendose su validez por
comparacioacuten con las bases de datos moleculares con el programa BLASTn
(httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) (Figura 45) Paralelamente se obtuvieron
del GenBank secuencias de Sss de las regiones estudiadas para su alineacioacuten con las
generadas en este trabajo mediante el software Clustal W Ademaacutes se utilizaron las
secuencias de los Plasmodiofoacuteridos Plasmodiophora brassicae Polymyxa graminis
Polymyxa betae S nasturtii y Sorosphaera viticola como grupos externos de anaacutelisis
(outgroups) Los alineamientos fueron utilizados en la construccioacuten de una matriz Nexus y
el anaacutelisis filogeneacutetico se realizoacute mediante un algoritmo de Maacutexima Parsimonia utilizando
el software PAUP 40b Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute
un anaacutelisis de Bootstrap con 500 iteraciones
RFLPs
Con el fin de proponer una prueba de diagnoacutestico molecular de las variantes de Sss se
realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs a partir de las secuencias de Sss generadas en esta
investigacioacuten y otras depositadas en el GenBank Para esto se utilizoacute el software webcutter
20 (httprnalundberggusecutter2) con las enzimas EcoRV EcoRI Bsp143I Hin6I
MspI Tru1I y TaqI seleccionadas por ser de faacutecil acceso para laboratorios de diagnoacutestico
molecular y utilizadas en la primera parte de exploracioacuten La validez de la prueba fue
54
confirmada mediante PCR-RFLPs con las enzimas Bsp143I y Hin6I y aislamientos
representativos de los grupos geneacuteticos principales detectados en el trabajo Las reacciones
consistieron de 15 microL conteniendo 15 microL de buffer 10X 2 microL de enzima y 115 microL de
producto de PCR Las reacciones fueron incubadas al bantildeo Mariacutea a 37degC durante 24 h La
separacioacuten de los fragmentos de restriccioacuten se efectuoacute por electroforesis en gel de agarosa
al 25 Se evaluaron los patrones electroforeacuteticos obtenidos para cada enzima de
restriccioacuten y se determinoacute el nuacutemero de bandas generadas y su tamantildeo aproximado por
comparacioacuten con el marcador de peso molecular GeneRuler 100pb DNA Ladder Plus
(Fermentas)
RESULTADOS
Coleccioacuten y procesamiento de muestras
Se obtuvieron 210 muestras de tubeacuterculos y raiacuteces de papa con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos con historia de la presencia del patoacutegeno en los departamentos de Antioquia
Boyacaacute Cundinamarca y Narintildeo Se realizaron anaacutelisis filogeneacuteticos con las secuencias
que presentaron tamantildeos superiores a 390 pb lograacutendose el objetivo de contar con al
menos 30 secuencias por cada departamento bajo anaacutelisis
Anaacutelisis filogeneacutetico de regiones ITS del ADNr
Las reacciones de PCR produjeron amplicones del tamantildeo esperado de ~390 pb con los
cebadores Spo8-9 (Figura 46) y de ~430 pb cuando se usaron los cebadores SsF-SsR en
79 y 48 muestras respectivamente Para el anaacutelisis filogeneacutetico soacutelo se incluyeron los
consensos que resultaron de la secuenciacioacuten en ambos sentidos De esta forma se
obtuvieron 33 secuencias de Antioquia 30 secuencias de Boyacaacute 33 secuencias de
Cundinamarca y 31 secuencias de Narintildeo para un total de 127 secuencias completas (Tabla
42) El alineamiento final de las secuencias alcanzoacute 445 sitios de los cuales 156 caracteres
eran constantes 55 variables pero no informativos y 236 informativos La longitud del
aacuterbol filogeneacutetico con maacutexima parsimonia fue de 707 con iacutendices de consistencia (IC) y
retencioacuten (IR) de 078 y 088 respectivamente Dado el alto nuacutemero de muestras
55
secuenciadas se presenta un dendrograma resultado del anaacutelisis de redundancia mediante el
programa Decrease redundancy (httpwebexpasyorgdecrease_redundancy) (Figura
47) Se presentaron dos grandes clados (A y B) soportados por valores de bootstrap de
100 el primer clado corresponde a los aislamientos de Sss mientras que el otro grupo
incluyoacute las demaacutes especies de plasmodiofoacuteridos (S nasturtii P graminis P betae y Pl
brassicae) que presentaron un alto nuacutemero de cambios entre ellas El clado A se subdividioacute
a su vez en tres grupos (A1 A2 y A3) dos de los cuales corresponden a los Tipos I (A2) y
II (A1) definidos por Qu y Christ (2004) En teacuterminos porcentuales ambos Tipos
representan el 157 (Tipo I) y 189 (Tipo II) de los aislamientos de Sss obtenidos en
Colombia ademaacutes se incluyeron secuencias del patoacutegeno provenientes de Estados Unidos
Irlanda y Escocia para el Tipo I y de Suiza Nueva Zelanda y de Reino Unido para el Tipo
II El subgrupo que representa el Tipo I de Sss soacutelo presentoacute aislamientos obtenidos de
tubeacuterculos o de suelos pero no de raiacutez mientras que el subgrupo representando el Tipo II
incluyoacute indistintamente aislamientos de raiacutez tubeacuterculos y suelos
Por otra parte el tercer subgrupo (A3) incluyoacute el mayor nuacutemero de aislamientos
Colombianos de Sss (654) con algunos de sus miembros presentando hasta 10 cambios
entre ellos En este subgrupo se encontraron indistintamente aislamientos de los cuatro
departamentos diferentes fuentes de muestreo (raiacutez tubeacuterculo o suelo) y hospedantes
(diferentes variedades de S tuberosum y de S phureja var Criolla Colombia) Dadas las
diferencias en secuencias de estos aislamientos proponemos nombrar a este grupo como el
Tipo III de Sss
El anaacutelisis de redundancia permitioacute tambieacuten identificar 12 genotipos (Figura 48) entre los
127 aislamientos de Sss de Colombia cinco de los cuales estuvieron conformados por un
soacutelo aislamiento tres por dos aislamientos y cuatro presentaron maacutes de diez miembros
siendo el genotipo 11 representante del Tipo I el 12 del Tipo II y el 7 y 10 del genotipo III
(Tabla 43) porque los demaacutes genotipos al ser uacutenicos o con tener como maacuteximo dos
representantes no fueron definidos a nivel de Tipos Los niveles de identidad para la regioacuten
56
ribosomal secuenciada entre estos genotipos fueron superiores al 95 en todos los casos
con una divergencia de 33 entre los Tipos I y II del 5 entre los Tipos I y III y del 2
entre el II y III La divergencia entre secuencias de Sss y otras especies de plasmodiofoacuteridos
fue mayor al 44 lo que demuestra la utilidad taxonoacutemica de las regiones ITS para
establecer relaciones filogeneacuteticas en este grupo de protozoos (Tabla 44)
RFLPs
Los anaacutelisis de restriccioacuten indicaron la existencia de polimorfismos en los sitios de corte de
algunas de las enzimas empleadas entre los grupos principales sentildealados en el anaacutelisis
filogeneacutetico Lo anterior puede ser utilizado con fines praacutecticos cuando se requiera evaluar
el genotipo o la mezcla de genotipos asociados a un lote de cultivo plantas sintomaacuteticas o
de tubeacuterculo-semilla con siacutentomas de Sarna polvosa Por ejemplo los aislamientos
representativos del Tipo II de Sss presentan un sitio de corte para Bsp143I (p 92) mientras
que para los del Tipo I se presentan dos sitios (p 97 340) Los aislamientos del Tipo III
tienen tres sitios de corte para la enzima Hin6I (p 222 283 352) en contraste con dos sitios
en los del Tipo I y II (p226-355 221-350) (Figura 49) Por esto proponemos la realizacioacuten
de una prueba simple de PCR-RFLPs a partir de la amplificacioacuten de las regiones ITS con
cebadores especiacuteficos para Sss y su posterior digestioacuten con las enzimas Bsp143I y Hin6I
con el fin de identificar los tres Tipos de Sss Al evaluar la digestioacuten de amplicones
representantes de los tres Tipos de Sss detectados en el estudio se validoacute la utilidad de la
teacutecnica en geles de agarosa al 25 ya que los perfiles de restriccioacuten obtenidos con la
enzima Hin6I permiten diferenciar a los aislamientos de los Tipos I y II (fragmentos
visibles de 221 y 129 pb) del Tipo III (fragmentos visibles de 221 67 y 62 pb) (Figura
410A) mientras que los representantes de los Tipos I y II se diferencian por la digestioacuten
con la enzima Bsp143I al generar fragmentos visibles de 243 pb (Tipo I) y de 294 pb (Tipo
II) (Figura 410B) Es importante indicar que los fragmentos inferiores a 50 pb no se tienen
en cuenta en este anaacutelisis ya que salen del rango de resolucioacuten de la electroforesis en geles
de agarosa Fragmentos de este tamantildeo pueden ser visualizados en geles de poliacrilamida
que ofrecen una mayor resolucioacuten
57
DISCUSIOacuteN
La disponibilidad de cultivares de papa resistentes a Sss es una prioridad para el disentildeo de
estrategias de manejo de la Sarna polvosa en diferentes paiacuteses cultivadores de este
tubeacuterculo en el mundo (Nitzan et al 2010) Sin embargo las deficiencias en el
conocimiento que se tiene de los niveles de variacioacuten de Sss y de su ciclo de vida
representan un obstaacuteculo para el establecimiento de los programas de mejoramiento
geneacutetico contra este fitopatoacutegeno (Merz y Falloon 2009) Los estudios geneacuteticos de Sss han
sido difiacuteciles de aplicar debido a su naturaleza de patoacutegeno obligado que impide su
aislamiento en medios axeacutenicos afectando los procesos de extraccioacuten de ADN la
utilizacioacuten de marcadores moleculares convencionales como AFLPs SSR y RAPDs y el
empleo de cebadores universales comuacutenmente usados para estudios taxonoacutemicos y
poblacionales en diferentes microorganismos eucarioacuteticos Adicionalmente la
caracterizacioacuten patoacutegenica de Sss resulta compleja ya que el desarrollo de la expresioacuten de
la Sarna polvosa estaacute fuertemente influenciada por las condiciones ambientales las
metodologiacuteas de inoculacioacuten y los cultivares del hospedante (Qu y Christ 2006 Jaramillo y
Botero 2007)
Afortunadamente la existencia de cebadores especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del
ADNr como los desarrollados por Bulman y Marshall (1998) y Qu et al (2006) para
amplificar la regioacuten ITS1 58S e ITS2 han permitido la obtencioacuten de secuencias que entre
otras aplicaciones permitieron definir la afinidad filogeneacutetica de Sss con respecto a otros
miembros del orden Plasmodiophoridae y demostrar los bajos niveles de identidad de esta
especie con respecto a la formae specialis nasturtii Esta misma situacioacuten se encontroacute en
este estudio obtenieacutendose identidades entre Sss y S nasturtii cercanas al 56 Los anaacutelisis
intraespeciacuteficos utilizando dichas secuencias han permitido detectar dos ribotipos
principales de Sss en el mundo denominados como I y II Ambos Tipos han sido
encontrados en poblaciones de Sss de Australia y Europa (Bulman y Marshall 1998)
mientras que en Norte Ameacuterica los aislamientos corresponden exclusivamente al Tipo II
58
(Qu y Christ 2006) En dicho estudio se encontroacute que las secuencias del Tipo I diferiacutean con
respecto a las del Tipo II en tres nucleoacutetidos (p 60 127 157) y una insercioacuten de cinco
nucleoacutetidos (p 129 a 133) en el ITS1 mientras que para la regioacuten ITS2 se presentan seis
mutaciones puntuales (p 348 367 399 402 461 475) y dos deleciones (p 356 y 474) lo
que en su conjunto equivale a un 29 de divergencia entre ambos ribotipos Estas
diferencias fueron igualmente encontradas entre los aislamientos colombianos
representando ambos Tipos aunque algunos de ellos presentaron mutaciones adicionales
por ejemplo el genotipo 12 (conformado por 21 aislamientos) presentoacute dos cambios con
respecto al Tipo II reportado en GenBank (Accesioacuten AY604172) mientras que el genotipo
11 (conformado por 17 aislamientos) tuvo tres cambios con respecto al Tipo I (Accesioacuten
AY604171)
En Colombia hasta el presente estudio se habiacutean realizado dos estudios de variabilidad
geneacutetica de Sss con base en anaacutelisis de las regiones ITS del ADNr En el primero de ellos
Hincapieacute (2006) encontroacute altos niveles de identidad geneacutetica entre los aislamientos de Sss
secuenciados y analizados mediante PCR-RFLP lo que condujo al autor a plantear la
posible ocurrencia de una estructura poblacional clonal para este patoacutegeno en el paiacutes En un
estudio maacutes reciente Carrentildeo (2009) utilizando anaacutelisis de secuencias ITS y SSCP
(Polimorfismo Conformacional de Banda Simple) que incluyoacute un alto nuacutemero de
aislamientos de diferentes regiones establecioacute la presencia de subpoblaciones del patoacutegeno
relacionadas con el tipo de oacutergano afectado Asiacute aislamientos con secuencias ITS del Tipo
I se asociaron exclusivamente con infecciones de tubeacuterculo mientras que aquellos del Tipo
II lo hicieron con siacutentomas de agallas en raiacutez En dicha investigacioacuten se descartoacute ademaacutes la
presencia de patotipos o ecotipos de Sss en Colombia puesto que en ninguno de los casos
se observoacute una asociacioacuten entre la variacioacuten geneacutetica y el cultivar del hospedero o la zona
geograacutefica de origen de los aislamientos Asiacute mismo se comproboacute que en el paiacutes existen
variantes geneacuteticas de Sss que difieren de las reportadas en otros paiacuteses registraacutendose la
presencia de cinco haplotipos del patoacutegeno dos de los cuales corresponden a los Tipos I y
II mientras que los tres restantes correspondiacutean a nuevas variantes no reportadas en otros
59
lugares del mundo (Carrentildeo 2009) desafortunadamente las secuencias resultantes de dicho
trabajo no fueron publicadas en GenBank y por tanto no pudieron ser incluidas en los
anaacutelisis filogeneacuteticos aquiacute presentados
El presente estudio amplia auacuten maacutes la base de conocimiento de los niveles de variacioacuten de
Sss en Colombia al detectar 12 genotipos a partir de 127 secuencias de igual nuacutemero de
aislamientos del patoacutegeno obtenidos en cultivos de los cuatro principales departamentos
productores de papa del paiacutes El anaacutelisis filogeneacutetico basado en dichas secuencias definioacute
la presencia de un clado que representa a Sss e incluye los dos Tipos mundialmente
conocidos para este patoacutegeno (Qu y Christ 2004) ademaacutes de un tercer subgrupo (III) que
presenta un 5 y 2 de divergencia con respecto a los Tipo I y II respectivamente Este
Tipo III contiene la mayor proporcioacuten de aislamientos del estudio e integroacute indistintamente
cepas de diferentes oriacutegenes geograacuteficos hospedantes tejidos sintomaacuteticos y suelo De gran
intereacutes resultoacute el hecho que los aislamientos asociados con el Tipo I procediacutean de puacutestulas
en tubeacuterculos o de suelos pero no de agallas de raiacutez lo cual confirma la asociacioacuten
realizada por Carrentildeo (2009) para esta variante de Sss Sin embargo los aislamientos
asociados al Tipo II proveniacutean indistintamente de raiacutez tubeacuterculos o suelos A partir de estos
resultados es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa del paiacutes Asiacute por ejemplo
es de intereacutes estudiar las reacciones de las variedades colombianas de papa a dichos
ribotipos asiacute como su capacidad de transmisioacuten de PMTV En este sentido Ward et al
(2005) evaluando el efecto de dos ribotipos de Polymyxa graminis un plasmodiofoacuterido que
afecta gramiacuteneas en la zona templada encontraron que los aislamientos del Tipo II fueron
detectados principalmente en plantas de trigo y estaban asociados a la transmisioacuten del Soil-
borne cereal mosaic virus (SBCMV) mientras que aquellos del Tipo I afectaban cebada y
su capacidad de transmisioacuten de SBCMV era muy baja
60
Los niveles de variacioacuten encontrados en esta investigacioacuten para el agente causal de la Sarna
polvosa de la papa en Colombia condujeron a plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y de certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla Para esto se realizoacute un anaacutelisis in silico de RFLPs de regiones ITS del
ADNr con siete enzimas de restriccioacuten de uso frecuente en laboratorios de deteccioacuten
molecular de microorganismos Los resultados demostraron polimorfismos en los sitios de
corte de algunas de las enzimas utilizadas dos de las cuales permiten distinguir los tres
principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico De esta forma se confirmoacute que la
digestioacuten con la enzima Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos
del Tipo III mientras que el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los
Tipos I y II La prueba realizada en este estudio puede ser implementada con variaciones
como el uso de digestiones dobles y la utilizacioacuten de geles de poliacrilamida que generen
mayor resolucioacuten de los fragmentos de restriccioacuten de bajo peso molecular sin embargo el
esquema aquiacute presentado ofrece simplicidad y eficiencia en la separacioacuten de los tres Tipos
sin la necesidad de contemplar todos los productos de la digestioacuten Adicionalmente a esta
prueba y con base en los resultados de las secuencias obtenidas en esta investigacioacuten y en
aquella de Gil et al (2011) nuestro grupo se encuentra disentildeando y evaluando pruebas de
PCR y RT-PCR en tiempo real para la deteccioacuten asintomaacutetica de Sss y de su virus asociado
PMTV Se espera que los resultados generados en estas investigaciones sean incorporados
raacutepidamente en los programas de manejo integrado de la Sarna polvosa en Colombia y
otros paiacuteses latinoamericanos afectados por esta enfermedad como Venezuela (Rodriacuteguez et
al 2009) y Costa Rica (Montero-Astua et al 2008)
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten el Politeacutecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid
Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo
por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el Departamento de Narintildeo
61
REFERENCIAS
Bell KS Roberts J Verrall S Cullen DW Williams NA Harrison JG Toth IK Cooke D
Duncan JM Claxton JR 1999 Detection and quantification of Spongospora subterranea
fsp subterranea in soils and on tubers using specific PCR primers European Journal of
Plant Pathology 105 905-915
Bouchek-Mechiche K Montfort F Merz U 2011 Evaluation of the Sss AgriStrip rapid
diagnostic test for the detection of Spongospora subterranea on potato tubers European
Journal of Plant Pathology 131 277-287
Bulman SR Marshall JW 1998 Detection of Spongospora subterranea in potato tuber
lesions using the polymerase chain reaction (PCR) Plant Pathology 47 759-766
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea fsp
subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
Falloon RE Curtin D Lister RA Butler RC 2005 Root function and growth of potato
plants reduced by Spongospora subterranea infection American Journal of Potato
Research 82 68
Gil JF Gutieacuterrez PA Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33 69-84
62
Gilchrist E 2009 Alternativas para el manejo integrado de la Sarna polvosa de la papa
(Spongospora subterranea fsp subterranea) Tesis de Doctorado en Ciencias Agrarias
Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia sede Medelliacuten
Harrison JG Rees EA Barker H Lowe R 1993 Detection of spore balls of Spongospora
subterranea on potato tubers by enzyme-linked immunosorbent assay Plant Pathology 42
181-186
Harrison JG Searle RJ Williams NA 1997 Powdery scab disease of potato - A review
Plant Pathology 461-25
Hincapieacute LA 2006 Evaluacioacuten de la variabilidad molecular de Spongospora subterranea
(Wallroth) Lagerheim f sp subterranea en las principales zonas paperas de Colombia
Tesis de Maestriacutea en Biotecnologiacutea Facultad de Ciencias Universidad Nacional de
Colombia sede Medelliacuten Colombia
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Merz U Fallon RE 2009 Powdery scab of potato-increased knowledge of pathogen
biology and disease epidemiology for effective disease management Potato Research
5217-37
Montero-Astua M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Nitzan N Haynes K Miller J Johnson D Cummings T Batchelor D Olsen C Brown C
2010 Genetic stability in potato germoplasm for resistance to root galling caused by the
pathogen Spongospora subterranea American Journal of Potato Research 87 497-501
63
Qu XS Christ BJ 2004 Genetic variation and phylogeny of Spongospora subterranea f
sp subterranea based on ribosomal DNA sequence analysis American Journal of Potato
Research 81385-394
Qu XS Christ BJ 2006 Single cystosorus isolate production and restriction fragment
length polymorphism characterization of the obligate biotroph Spongospora subterranea
fsp subterranea Phytophatology 96 1157-1163
Qu XS Kavanagh JA Egan D Christ BJ 2006 Detection and quantification of
Spongospora subterranea f sp subterranea by PCR in host tissue and naturally infested
soils American Journal of Potato Research 8321-30
Qu XS Wanner LA Christ BJ 2011 Multiplex real-time PCR (TaqMan) assay for the
simultaneous detection and discrimination of potato powdery and common scab diseases
and pathogens Journal of Applied Microbiology 110 769ndash777
Rodriacuteguez D Ojeda M Peacuterez de Camacaro M Gallardo M Valera R Bittara F 2009
Produccioacuten incidencia de la Sarna polvorienta y calidad de clones avanzados de papa
Revista de la Facultad de Agronomiacutea Universidad del Zulia 26 508-531
Salazar LF 2006 Emerging and Re-emerging Potato Diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop - top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia Sede Bogotaacute
Walsh JA Merz U Harrison JG 1996 Serological detection of spore balls of Spongospora
subterranea and quantification in soil Plant Pathology 45 884-895
64
Ward E Kanyuka K Motteram J Kornyukhin D Adams MJ 2005 The use of
conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host
plant resistance inoculum levels and intraspecific variation New Phytologist 165875-885
Zolan ME Pukkila PJ 1986 Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinereus
Molecular and Cellular Biology 6 195-200
65
41 Anexos
Figura 41 Siacutentomas y signos producidos por Spongospora subterranea f sp subterranea
en plantas de papa de Colombia a Quistosoros obtenidos de suelo b Plasmodios
formados en raiacutez de tomate (Solanum esculentum) c Lesiones tempranas producidas por
Sarna polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro d Lesiones tardiacuteas producidas por Sarna
polvosa en S tuberosum var Diacol Capiro e f Agallas formadas en raiacuteces de S phureja
var Criolla Colombia
d
e f
c
a b
66
Figura 42 Plantas sentildeuelo de Nicotiana benthamiana y Solanum phureja var Criolla
Colombia inoculadas con quistosoros provenientes de suelos infestados con Spongospora
subterranea f sp subterranea
67
Tabla 41 Concentracioacuten de ADN en muestras obtenidas de suelo agallas o raiacuteces de
plantas infectadas con Spongospora subterranea f sp subterranea
MUESTRA A260 A280 RELACIOacuteN
260280
CONCENTRACIOacuteN
de ADN ng microl
AB1 0806 0465 173 403
AB2 0421 0244 172 21
Se7 0276 0149 184 138
Se8 0743 0415 179 371
MA11 2244 1366 164 1122
MA61 0277 0158 176 139
MA39 2135 1512 141 1067
MA56 0823 0361 228 412
MA60 021 0101 208 105
68
Figura 43 Gel de extraccioacuten de ADN a partir de muestras de tubeacuterculos agallas o raiacuteces
de S tuberosum y de raiacuteces de N benthamiana Carril 1 Marcador de peso 100 pb carril 2-
4 muestras MA16 MA17 MA18 MA11 MA39
500 pb
1 2 3 4 5 6
69
Figura 44 Electroferograma de la regioacuten ITS del ADN ribosomal de Spongospora
subterranea f sp subterranea con el cebador Spo8
70
Figura 45 Resultados obtenidos a partir del BLAST de las secuencias de la regioacuten ITS del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea f sp subterranea de Colombia
71
Figura 46 Amplicones obtenidos con los cebadores Spo8-Spo9 (390 pb) a partir de ADN
de muestras de tejido de raiacutez y tubeacuterculos de Solanum tuberosum S phureja y Nicotiana
benthamiana con presencia de quistosoros de Spongospora subterranea fsp subterranea
de cultivos de papa de los departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1
Marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas) carriles 2 a 6 muestras SE10 SE11
SE13 SE18 carril 7 control negativo
500 pb
100 pb
390 pb
1 2 3 4 5 6 7
72
Tabla 42 Procedencia de muestras de raiacutez y tubeacuterculos con siacutentomas de Sarna polvosa y
de suelos de lotes con registro histoacuterico de la enfermedad en cuatro Departamentos
cultivadores de papa de Colombia
ANTIOQUIA CUNDINAMARCA
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE13 Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro SE8 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE18 La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro SE81 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
32UN La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE9 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
33UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE91 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34UN La Unioacuten Raiacutez accesioacuten C131-R2 SE12 Zipaquiraacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
35UN La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE14 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
80C La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE15 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Pastusa
Suprema
79C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE16 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
78C La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE17 Villapinzoacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro
35 COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum SE19 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
34COL La Unioacuten Raiacutez S tuberosum SE20 Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
32COL La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum SE21 Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
30COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 4fb Ventaquemada Raiacutez S tuberosum
29COL La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 5fb Villapinzoacuten Raiacutez S tuberosum
12fb La Unioacuten Suelo de lote con S tuberosum 9fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
11fb La Unioacuten Raiacutez S tuberosum 10fb Zipaquiraacute Raiacutez S tuberosum
1MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
ICA Nevada MA20 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
7MR Santa Rosa Raiacutez S tuberosum var Diacol
Capiro MA21 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
8MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA22 Villapinzoacuten
Raiacutez S tuberosum var ICA Pastusa Suprema
9MR La Unioacuten Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA23 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
11MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA24 Zipaquiraacute
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
12MR Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA25 Tabio
Raiacutez S phureja var Criolla Colombia
13MR Santa Rosa Tubeacuterculo S phureja var
Criolla Colombia MA50 Desconocido Tubeacuterculo S tuberosum
14MR La Unioacuten Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA51 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB2 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C87SJ MA52 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
73
AB3 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C81SJ MA53 Villapinzoacuten Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB4 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3SJ MA54 Tabio Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB6 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C8C MA55 Tabio Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB7 La Unioacuten Raiacutez S phureja accesioacuten C3C MA56 Zipaquiraacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia
AB8 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA57 Tabio
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA1 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA58 Subachoque
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
MA2 Santa Rosa Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA59 Villapinzoacuten
Tubeacuterculo S tuberosum var Diacol Capiro
MA41 La Unioacuten Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia MA60 Villapinzoacuten
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
BOYACAacute NARINtildeO
MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA MUESTRA MUNICIPIO PROCEDENCIA
SE10 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE7 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE101 Tunja Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia SE71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
SE11 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 37COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda Pastusa
SE22 Soracaacute Raiacutez S phureja var Criolla
Colombia 36COL Pasto
Raiacutez S tuberosum var Parda
Pastusa
SE23 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA27 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
SE24 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA28 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
3fb Tunja Raiacutez S tuberosum MA31 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
AB1 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA32 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB9 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA33 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
AB10 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA34 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
AB12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA35 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA3 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA36 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA4 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA37 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA5 Oicataacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA38 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA7 Siachoque Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA39 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA9 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA40 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA11 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA61 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA12 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA62 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA14 Tunja Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA64 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA15 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA65 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA16 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA66 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA17 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA67 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
74
benthamiana
MA18 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA68 Pasto Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA19 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA69 Pasto Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA42 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA70 Pasto
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA43 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de S
phureja var Criolla Colombia MA71 Pasto
Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
MA44 Soracaacute Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana MA72 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de N benthamiana
MA45 Siachoque Tubeacuterculo S tuberosum var
Diacol Capiro MA73 Ipiales
Suelo con sentildeuelo de S phureja var Criolla Colombia
MA46 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA75 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA49 Tunja Tubeacuterculo S tuberosum MA76 Ipiales Suelo con sentildeuelo de N
benthamiana
MA77 Ipiales Suelo con sentildeuelo de S phureja
var Criolla Colombia
75
Figura 47 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) de cultivos de papa de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Como grupos externos de anaacutelisis se presentan
secuencias de otras especies de plasmodiofoacuteridos Meacutetodo de maacutexima parsimonia
utilizando la opcioacuten Heuristic search del programa PAUP 40b Los valores de Bootstrap (gt
80) se indican en la parte inferior de las ramas En letras mayuacutesculas se presentan las
denominaciones de los clados y subclados Adicionalmente se indican los grupos que
representan los Tipos de Sss
76
Sss TIPO I
395 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
MspI TaqI
cccgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgttttcgg base
pairs
gggcccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcaaaagcc 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
atactgaacttactaaagtggatcatttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgat base
pairs
tatgacttgaatgatttcacctagtaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgcta 76 to
150
EcoRI
gaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagtt base
pairs
cttcttgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaa 151
to 225
Hin6I TaqI EcoRV MspI
gcgctttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccgtgtgcgtg base
pairs
cgcgaaagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcggcacacgcac 226
to 300
Bsp143I MspI Hin6I
aaggggactctgagctctggtcggtccatggcttgaaagatcatgcaacccggtgcgcgtctctggcttctgatt base
pairs
ttcccctgagactcgagaccagccaggtaccgaactttctagtacgttgggccacgcgcagagaccgaagactaa 301
to 375
cgtctctaaccattggcgtg base pairs
gcagagattggtaaccgcac 376 to 395
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 2 97 340 gatc More info
EcoRI 1 190 gaattc More info
EcoRV 2 130 238 gatatc More info
Hin6I 2 226 355 gcgc More info
MspI 3 2 281 350 ccgg More info
TaqI 2 49 232 tcga More info
Tru1I 2 102 119 ttaa More info
77
Sss TIPO II
390 base pairs
Graphic map | Table by enzyme name
TaqI
cctgggtgcgattgtctgttgaagggtgacgcccgctctggggctagctcgaaaccttatgcaaaccgtattact base
pairs
ggacccacgctaacagacaacttcccactgcgggcgagaccccgatcgagctttggaatacgtttggcataatga 1 to
75
Bsp143I Tru1I Tru1I EcoRV
gaacttactaaagtggatcgtttaactaaatacaactcttaacagtggatatcttggttcccacaacgatgaaga base
pairs
cttgaatgatttcacctagcaaattgatttatgttgagaattgtcacctatagaaccaagggtgttgctacttct 76 to
150
EcoRI Hin6I
acgcagcgaaatgcgatacgtaatgcgaattgcagaattcagtgaatcatcaaatctttgaacgcaagttgcgct base
pairs
tgcgtcgctttacgctatgcattacgcttaacgtcttaagtcacttagtagtttagaaacttgcgttcaacgcga 151
to 225
TaqI EcoRV MspI
ttcgagatatccttgaaagcatgcctctttgagtgtcggtttctattctcccggaaacgccctgtgcgtggaagg base
pairs
aagctctataggaactttcgtacggagaaactcacagccaaagataagagggcctttgcgggacacgcaccttcc 226
to 300
MspI Hin6I
ggactatgagctctggtcggtccatggcttgaaagattatccaaccggtgcgcgtctctggcttctgattcgtct base
pairs
cctgatactcgagaccagccaggtaccgaactttctaataggttggccacgcgcagagaccgaagactaagcaga 301
to 375
ctanccattggcgtg base pairs
gatnggtaaccgcac 376 to 390
Table by Enzyme Name
Enzyme No Positions Recognition
name cuts of sites sequence
Bsp143I 1 92 gatc More info
EcoRI 1 185 gaattc More info
EcoRV 2 125 233 gatatc More info
Hin6I 2 221 350 gcgc More info
MspI 2 276 345 ccgg More info
TaqI 2 49 227 tcga More info
Tru1I 2 97 114 ttaa More info
Figura 48 Anaacutelisis virtual de restriccioacuten de la regioacuten ITS del ADNr de ribotipos de S
subterranea de Colombia con las enzimas Bsp143I EcoRI EcoRV Hin6I MspI TaqI y
Tru1I mediante el programa Web-cutter
78
Tabla 43 Genotipos y anaacutelisis de RFLPs con siete enzimas de restriccioacuten de aislamientos
de Spongospora subterranea fsp subterranea identificados en Colombia a partir de
anaacutelisis de secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal
GENOTIPO RFLPacutes MUESTRAS PROPORCIOacuteN
()
1
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185 EcoRV 2 125 233
Hind6I 2 221 351
MspI 2 276 346 TaqI 2 227 Tru1I
2 97 114
AB12 34UN 16
2
Bsp143I 1 93 EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277 347 TaqI 1 49 228
Tru1I 2 98 115
32UN 78C 16
3
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
11MR 08
4
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
9MR 08
5
Bsp143I 2 96 339 EcoRI 1 189
EcoRV 2 129 237
Hind6I 2 225 354
MspI 2 280 349 TaqI 1 231 Tru1I
2 101 118
8MR 13MR 16
79
6
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190
EcoRV 2 130 238 Hind6I 2 226 355
MspI 2 281 350
TaqI 1 232 Tru1I
2 102 119
MA12 08
7
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234
Hind6I 3 222 283 352 MspI 2 277
347 TaqI 2 49 228
Tru1I 2 98 115
MA37 SE7 SE8 SE9 SE10
SE11 SE12 SE13 SE14 SE15 SE16 80C 79C 37COL 36COL
35COL 34COL 32COL 30COL
12FB 10FB 11FB 9FB 1MR
SE71 SE81 SE91 SE101 AB2 AB3 AB4 AB6 AB7 MA1 MA7
MA9 MA14 MA20 MA21 MA22
MA23 MA24 MA25 MA28 MA31 MA32 MA33 MA34
MA35 MA36
393
8
Bsp143I 2 92 309 EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 289 351 MspI 2 276
346 TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
MA40 08
9
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233
Hind6I 3 221 282 351 MspI 3 2 276
346 TaqI 1 227
Tru1I 2 97 114
MA43 08
10
Bsp143I 1 93
EcoRI 1 186
EcoRV 2 126 234 Hind6I 3 222 283
352 MspI 3 2 277
347 TaqI 2 49 228 Tru1I 2 98 115
29COL 33UN MA4 MA41
MA42 MA51 MA52 MA55
MA56 MA57 MA58 MA59 MA60 MA62 MA64 MA65
MA68 MA69 MA71 MA72
MA76 SE19 SE20 SE21 SE22 3FB 4FB 14MR
22
11
Bsp143I 2 97 340
EcoRI 1 190 EcoRV 2 130 238
Hind6I 2 226 355
MspI 3 2 281 350 TaqI 2 49 232
Tru1I 2 102 119
SE17 12MR AB1 AB8 MA2
MA15 MA16 MA17 MA18 MA19 MA45 MA46 MA49
MA50 MA53 SE23 SE24
134
80
12
Bsp143I 1 92
EcoRI 1 185
EcoRV 2 125 233 Hind6I 2 221 350
MspI 2 276 345
TaqI 2 49 227
Tru1I 2 97 114
SE18 35UN 7MR AB9 AB10
MA3 MA4 MA5 MA11 MA27 MA38 MA39 MA44 MA61
MA66 MA67 MA70 MA73
MA75 MA77 5FB
165
81
Tabla 44 Matriz de identidad basado en secuencias de las regiones ITS1 58S e ITS2 del
ADN ribosomal de aislamientos de Spongospora subterranea fsp subterranea de
Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluyen a S nasturtii y Plasmodiophora brassicae
como especies externas de anaacutelisis
SECUENCIA SE17 SE18 MA37 29COL AY604172 AY604171 AF310907 EF593112 AF102820 AF102819 EF195335 AF104308
SE17 Sss
Colombia
Tipo I
ID 0962 0957 0952 0964 0992 0564 0959 0992 0964 0586 0959
SE18 Sss
Colombia
Tipo II
0962 ID 0979 0974 0992 0959 0574 0987 0959 0992 0584 0987
MA37 Sss
Colombia
Tipo III
0957 0979 ID 0984 0982 0954 0579 0977 0954 0982 0598 0977
29COL Sss
Colombia
Tipo III
0952 0974 0984 ID 0982 0959 0579 0977 0959 0982 06 0977
AY604172
Sss EEUU
TipoII
0964 0992 0982 0982 ID 0967 0577 0994 0967 1 0589 0994
AY604171
Sss EEUU
Tipo I
0992 0959 0954 0959 0967 ID 0564 0962 1 0967 059 0962
AF310907 S
nasturtii 0564 0574 0579 0579 0577 0564 ID 0579 0564 0577 0566 0574
EF593112 Sss
Suiza 0959 0987 0977 0977 0994 0962 0579 ID 0962 0994 0589 0989
AF102820
Sss Escocia 0992 0959 0954 0959 0967 1 0564 0962 ID 0967 059 0962
AF102819
Sss Nueva
Zelanda
0964 0992 0982 0982 1 0967 0577 0994 0967 ID 0589 0994
EF195335 P
brassicae 0586 0584 0598 06 0589 059 0566 0589 059 0589 ID 0589
AF104308
Sss Reino
Unido
0959 0987 0977 0977 0994 0962 0574 0989 0962 0994 0589 ID
82
Figura 49 Diagrama de RFLPs de la regioacuten ITS1 58S e ITS2 del ADN ribosomal de
Spongospora subterranea fsp subterranea (Sss) con las enzimas de restriccioacuten Bsp143I y
Hin6I que permiten determinar los tres Tipos de Sss identificados en este trabajo En la
izquierda se indican los genotipos representativos de cada Tipo (ver Tabla 3) y entre
pareacutentesis los sitios de corte referidos al Tipo I
83
Figura 410 (A) Gel de RFLPs con la enzima Hind6I con tres muestras de los Tipos I II y
III de Sss detectados en el estudio 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir Tipo
I 3-5 Digestioacuten de muestras Tipo I 6 Producto sin digerir Tipo II 7-9 Digestioacuten de
muestras Tipo II 10 Producto sin digerir Tipo III 11-13 Digestioacuten de muestras Tipo III
14 Marcador de peso 100 pb (B) Gel de RFLPs con la enzima Bsp143I con una muestra
del Tipo I y II de Sss 1 Marcador de peso 100 pb 2 Producto sin digerir del Tipo II 3 Sin
muestra 4 Digestioacuten de muestra Tipo I 5 Digestioacuten de muestra Tipo II 6 Marcador de
peso 100 pb Con flechas se marcan los productos digeridos que presentan resolucioacuten
apropiada en geles de agarosa al 25
A B
84
5 Artiacuteculo 2 Variabilidad geneacutetica de los ARN 2 y 3 de aislamientos
Colombianos de PMTV
Genetic variability of RNA 2 and 3 in Colombian isolates of PMTV
Ineacutes Osorio Giraldo1 Pablo Gutieacuterrez Saacutenchez
2 y Mauricio Mariacuten Montoya
1
1 Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Facultad de Ciencias Universidad Nacional
de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia 2
Laboratorio de Microbiologiacutea Industrial
Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia - Sede Medelliacuten Colombia
Formato de la Revista Agronomiacutea Mesoamericana ISSN 1021-7444
Autor para correspondencia
Profesor Mauricio Mariacuten Montoya Universidad Nacional de Colombia Sede Medelliacuten
Escuela de Biociencias Bloque 11-113 Calle 59 A 63-20 Medelliacuten Colombia E-mail
mamarinmunaleduco Tel 4309805
Resumen
El PMTV es un virus prevalente en los cultivos de papa de los Andes Sin embargo en esta
regioacuten es muy bajo el conocimiento de su biologiacutea patogenicidad y diversidad Con el fin
de suplir la falta de informacioacuten sobre este uacuteltimo aspecto en esta investigacioacuten se
obtuvieron secuencias de los genes de la caacutepside viral (CP) y del TGB2 de cepas de PMTV
de los cuatro principales departamentos cultivadores de papa en Colombia Adicionalmente
dos de los aislamientos fueron secuenciados en gt83 de sus ARN 2 y 3 Los anaacutelisis
filogeneacuteticos basados en CP indicaron la presencia de dos clados El primero contiene cepas
de referencia mundial de PMTV en conjunto con 19 de las cepas de este estudio mientras
que el segundo clado soacutelo agrupoacute cepas de Colombia las que compartieron menos de 76
de identidad con el primer grupo Esto posiblemente indica la ocurrencia de una nueva
especie de pomovirus aunque se requiere la secuenciacioacuten de todo el genoma para
confirmar dicha hipoacutetesis taxonoacutemica El anaacutelisis del TGB2 generoacute un solo clado
agrupando indistintamente las cepas colombianas de PMTV con las de otros paiacuteses El
anaacutelisis de los segmentos 2 y 3 del genoma viral indicoacute que los aislamientos colombianos
compartiacutean gt94 de identidad con las secuencias de cepas de Repuacuteblica Checa y Suecia
85
Se espera que estos hallazgos sean utilizados para el disentildeo de herramientas de diagnoacutestico
del PMTV en los Andes que apoyen los programas de certificacioacuten de tubeacuterculo-semilla y
mejoramiento geneacutetico de papa
Palabras clave Potato mop-top virus RT-PCR Secuenciacioacuten Solanum tuberosum
Abstract
PMTV is a prevalent virus in potato crops in the Andes However little is known about its
biology pathogenicity and diversity In order to fill these gaps in knowledge genes
encoding for the viral coat protein (CP) and the triple gene block (TGB2) were sequenced
from PMTV isolates obtained in the top four potato-producing provinces in Colombia
Additionaly RNA2 and RNA3 from two isolates were almost sequenced to completion
(gt83) Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two
clades The first clade included reference strains from all over the world and 19 Colombian
PMTV isolates The second clade shared less than 76 identity with clade 1 suggesting a
new pomovirus species Complete genome sequencing is required to confirm this
hypothesis Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single
clade Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed gt94 sequence
identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden These findings will be
helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes and will support
tuber-seed certification and genetic improvement programs
Key words Potato mop-top virus RT-PCR Sequencing Solanum tuberosum
86
INTRODUCCIOacuteN
El Potato mop-top virus (PMTV) es la especie tipo del geacutenero Pomovirus y recientemente
se ha clasificado en la nueva familia Virgaviridae (Adams et al 2009) Su rango de
hospedantes incluye un nuacutemero limitado de especies vegetales de las familias Solanaceae y
Chenopodiaceae siendo la papa (Solanum tuberosum L) su principal hospedante desde el
punto de vista econoacutemico (Kirk 2008) Es transmitido por tubeacuterculo semilla infectado y
por zoosporas del plasmodiofoacuterido Spongospora subterranea (Wallroth) Lagerheim f sp
subterranea Tomlinson (Sss) agente causal de la sarna polvosa de la papa (Harrison y
Jones 1970) Su presencia se ha registrado principalmente en regiones con climas huacutemedos
y friacuteos como el Norte de Europa (Noruega Suecia Dinamarca y Finlandia) las islas
Britaacutenicas (Irlanda Inglaterra Escocia) Norte Ameacuterica (EEUU y Canadaacute) Japoacuten las zonas
montantildeosas de Costa Rica y los Andes Surameacutericanos (Peruacute Colombia Bolivia) (Xu et al
2004 Salazar 2006 Montero-Astuacutea et al 2008 Nakayama et al 2010 Santala et al
2010) A pesar de que se considera que el PMTV es originario de los Andes su presencia
en Colombia soacutelo fue detectada en el antildeo 2007 (Veacutelez 2007) y reconfirmada con base en
anaacutelisis de secuencias de la caacutepside viral (CP) y el segundo gen del triple bloque (TGB2) en
2011 (Gil et al 2011) Este virus puede causar peacuterdidas de hasta 26 en el rendimiento del
cultivo de la papa lo que sumado al efecto del dantildeo ocasionado por su vector Sss pudiera
ascender a rangos de 50 a 80 (Jones y Harrison 1972 Guerrero 1997 2000) Sin
embargo dichos niveles de peacuterdidas dependen de la susceptibilidad de las variedades
cultivadas (Xu et al 2004 Santala et al 2010) las variantes del patoacutegeno (Harrison y
Jones 1970 Nielsen y Nicolaisen 2003) y fundamentalmente de las condiciones
medioambientales prevalentes durante su infeccioacuten (Davey 2009 Latvala-Kilby et al
2009 Roos et al 2011)
El PMTV es un virus tripartita con morfologiacutea de varilla riacutegida de 18-20 nm en diaacutemetro y
longitudes de 290-310 nm 150-160 nm y 65-80 nm Cada partiacutecula contiene una moleacutecula
de ARN de cadena sencilla con polaridad positiva (ARNss+) con tamantildeos de 6043 nt (ARN
1) 3134 nt (ARN 2) y 2964 nt (ARN 3) El ARN 1 codifica para una proteiacutena que tiene
motivos de metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteiacutena generada por supresioacuten del
codoacuten de finalizacioacuten del ORF 1 con motivos de RdRp (Savenkov et al 1999 2003) El
87
ARN 2 contiene un ORF para la proteiacutena de la caacutepside de 20 kDa Tambieacuten codifica para
una proteiacutena de 90 kDa generada por lectura continua (readthrough CP-RT) gracias a la
presencia de un codoacuten de finalizacioacuten amber en el gen CP Diversos estudios han indicado
que esta proteiacutena RT esta involucrada en la transmisioacuten por Sss del PMTV siendo incluso
posible su localizacioacuten asociada con los extremos de las partiacuteculas virales mediante
anaacutelisis de inmuno-marcaje (Cowan et al 1997) En este sentido Torrance et al (1999)
demostraron que una delecioacuten de 109 nt en el extremo 3acute de las secuencias del dominio CP-
RT de aislamientos de PMTV de Escocia estaban asociadas con su imposibilidad de
transmisioacuten por Sss
El ARN 3 codifica para cuatro polipeacuteptidos de 51 21 13 y 8 kDa respectivamente Los
primeros tres presentan secuencias similares a proteiacutenas del triple bloque de genes (TGB)
involucradas en el movimiento de ceacutelula a ceacutelula de algunos virus de plantas Las TGBs de
los pomovirus hacen parte de la clase 1 o grupo hordei de estas proteiacutenas en conjunto con
las codificadas por otros geacuteneros de la familia Virgaviridae y del geacutenero Hordeivirus Se
cree que TGB2 y TGB3 asisten a TGB1 en su funcioacuten de trasportar el genoma viral a traveacutes
de los plasmodesmos de las ceacutelulas vegetales (Lim et al 2008 2009) Recientemente se
encontroacute mediante fusioacuten de la regioacuten N-terminal de TGB1 con la proteiacutena verde
fluorescente (GFP por sus siglas en ingleacutes) que TGB1 se localizaba en la regioacuten nucleolar
y de microtuacutebulos infirieacutendose ademaacutes que aparentemente esta proteiacutena interactuacutea con los
factores de transcripcioacuten del hospedante (Wright et al 2010)
La cuarta proteiacutena (8 kDa) es rica en cisteiacutena (CRP) y aparentemente esta involucrada en el
movimiento sisteacutemico del PMTV en las plantas y en la expresioacuten de siacutentomas necroacuteticos en
hospedantes experimentales Interesantemente otros pomovirus no codifican para una
proteiacutena 8 kDa como la presente en PMTV y sus niveles de identidad con CRPs presentes
en otros geacuteneros como Hordeivirus Tobravirus y Furovirus son muy bajos (Lukhovitskaya
et al 2005)
Los siacutentomas que causa PMTV en papa se manifiestan por agrietamientos en la superficie
de los tubeacuterculos pudiendo estar acompantildeados por la presencia de anillos necroacuteticos en la
88
corteza o incluso la parte interna del mismo siacutentoma conocido como umlSprainguml (Calvert y
Harrison 1966) En las hojas de las plantas infectadas se puede observar un moteado en
forma de V tipo ldquoaucubardquo ademaacutes de la distorsioacuten del follaje y el acortamiento de los
entrenudos (umlmop-topuml) (Carnegie et al 2009) En la regioacuten Andina no es frecuente
observar la sintomatologiacutea en los tubeacuterculos ni los moteados tipo umlaucubauml lo que no
permite asociar siacutentomas especiacuteficos con la presencia de PMTV situacioacuten que explica en
buena parte el porqueacute del desconocimiento de su efecto sobre las variedades sembradas en
esta regioacuten suramericana (Tenorio et al 2006 Gil et al 2011) Sin embargo seguacuten Salazar
(2006) el PMTV es uno de los virus prevalentes en el cultivo de la papa en los Andes
Adicionalmente a las caracteriacutesticas criacutepticas del PMTV existen dificultades teacutecnicas para
el diagnoacutestico de este virus debido a su distribucioacuten erraacutetica en las plantas que incluso
puede diferir entre yemas y brotes del mismo tubeacuterculo infectado y a los bajos tiacutetulos
virales que se encuentran en el tejido foliar Esto conduce a la generacioacuten de falsos
negativos por diferentes teacutecnicas de diagnoacutestico (Cerovska et al 2003 Kirk 2008) Dichas
teacutecnicas incluyen la observacioacuten visual de siacutentomas bioensayos con plantas indicadoras
como Chenopodium amaranticolor Nicotiana benthamiana N debneyi y N tabacum
(Jeffries 1998) que requieren largos periodos de tiempo para su lectura pruebas de ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay) con anticuerpos mono y policlonales (Torrance et
al 1993 Cerovska et al 2003) RT-PCR IC RT-PCR y qRT-PCR con cebadores
especiacuteficos dirigidos a diferentes regiones del genoma viral (Arif et al 1995 Mumford et
al 2000 Latvala-Kilby et al 2009 Davey 2009) Asiacute mismo se han empleado otras
teacutecnicas basadas en hibridizacioacuten especiacutefica (Ryazantsev y Zavriev 2009) y microplacas de
hibridizacioacuten con RT-PCR (Nakayama et al 2010) para la deteccioacuten de PMTV
En Colombia Gil et al (2011) utilizaron la teacutecnica de RT-PCR con los cebadores
PMTVF4-PMTVR4 y H360-C819 dirigidos a los genes TGB2 y CP respectivamente para
la deteccioacuten del virus en los principales departamentos productores de papa del paiacutes sin
embargo utilizaron un muy bajo nuacutemero de aislamientos virales Maacutes recientemente Gallo
(2012) obtuvo anticuerpos policlonales dirigidos a peacuteptidos sinteacuteticos con alta capacidad
89
inmunogeacutenica identificados a partir de la modelacioacuten de la caacutepside viral de aislamientos
colombianos de PMTV probando su efectividad en pruebas de ELISA y Dot-blot
A pesar de que aparentemente existe una amplia gama de teacutecnicas para la deteccioacuten del
PMTV eacutestas presentan la limitacioacuten de estar basadas en un bajo nuacutemero de aislamientos
virales especialmente del Norte de Europa (Latvala-Kilby et al 2009) siendo auacuten menor el
nuacutemero de cepas andinas para las que existen secuencias disponibles en las bases de datos
moleculares o cuyos viriones han sido purificados para la generacioacuten de pruebas
seroloacutegicas (Gil et al 2011)
A nivel mundial se ha reportado la presencia de bajos niveles de variacioacuten entre genotipos
de PMTV (Mayo et al 1996 Santala et al 2010) Latvala-Kilby et al (2009) comparando
secuencias de CP de 23 aislamientos de Finlandia y Letonia con respecto a secuencias
disponibles en GenBank para cepas de Escocia Dinamarca Suecia y Repuacuteblica Checa
encontraron identidades superiores al 98 entre eacutestas con soacutelo siete diferencias a nivel de
aminoaacutecidos (aa) entre todas las comparaciones Las evaluaciones de secuencias de CP-RT
tambieacuten presentaron altos niveles de identidad (98 a 100) aunque en este caso 24
posiciones en las secuencias de aa fueron variables Resultados similares reportaron Mayo
et al (1996) cuando compararon las secuencias de CP de tres aislamientos de Escocia y
ocho de Peruacute mientras que Xu et al (2004) encontraron que seis de las secuencias de CP
de aislamientos de PMTV de Norteameacuterica presentaron identidades superiores al 97 con
respecto a secuencias de aislamientos de diferentes paiacuteses de Europa A pesar de estos bajos
niveles de variacioacuten cuando se realizan anaacutelisis filogeneacuteticos con dichas secuencias se han
encontrado dos clados que dividen los aislamientos de PMTV y que pueden ser
identificados por anaacutelisis de RFLPs (Nielsen y Nicolaisen 2003) Sin embargo dichos
grupos aparentemente no estaacuten relacionados con diferencias en sus niveles de
patogenicidad sobre variedades de papa (Latvala-Kilby et al 2009)
En Colombia Veacutelez (2007) encontroacute por lo menos dos genotipos de PMTV definidos a
partir de la secuencias del gen CP un grupo que presentaba altos niveles de identidad con
respecto a aislamientos de Europa y Canadaacute y otro grupo constituido exclusivamente por
90
aislamientos colombianos Esta situacioacuten fue confirmada posteriormente por Gil et al
(2011) quienes encontraron que las variantes de PMTV tan soacutelo presentaban un 76 y
86 de identidad para CP y TGB2 respectivamente con respecto a los aislamientos
mundialmente reportados de PMTV Sin embargo dichos anaacutelisis fueron conducidos con un
bajo nuacutemero de secuencias (cuatro para CP y tres para TGB2) debido a las dificultades
experimentales que representa el trabajo con este virus (bajo tiacutetulo en plantas de papa
distribucioacuten erraacutetica ausencia de cebadores especiacuteficos para cepas andinas etc)
Por lo anterior esta investigacioacuten se planteoacute con el propoacutesito de ampliar el nuacutemero de
secuencias de CP y TGB2 de aislamientos de PMTV obtenidos en diferentes regiones
cultivadoras de papa de Colombia de manera que fuera posible determinar si la presencia de
las variantes de este virus corresponde a una situacioacuten generalizada o por el contrario responde
al efecto de muestra dado el bajo nuacutemero de cepas analizadas por Veacutelez (2007) y Gil et al
(2011) Adicionalmente se realizoacute la secuenciacioacuten de una gran parte del ARN 2 y ARN 3 de
una cepa obtenida en el Departamento de Antioquia y otra en el Departamento de Boyacaacute
(Colombia) realizaacutendose un anaacutelisis de variacioacuten con respecto a las secuencias de referencia de
genomas completos disponibles en las bases de datos moleculares
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Coleccioacuten y preparacioacuten de muestras
Se obtuvieron muestras de raiacuteces y tubeacuterculos de papa con siacutentomas de sarna polvosa asiacute
como de suelos de lotes con reportes de la presencia de Sss en las zonas productoras de
papa de los municipios de la Unioacuten y Santa Rosa de Osos (Antioquia) Zipaquiraacute Tabio
Subachoque y Villapinzoacuten (Cundinamarca) Tunja Siachoque Soracaacute y Oicataacute (Boyacaacute) y
Pasto e Ipiales (Narintildeo) Para la separacioacuten de los quistosoros del suelo se siguioacute la
metodologiacutea de Jaramillo y Botero (2007) en la cual las muestras de suelo (500g) son
pasadas por un juego de tamices de 100 y 25 microm Los quistosoros obtenidos fueron
inoculados en Nicotiana benthamiana y Solanum phureja utilizadas como plantas sentildeuelo
para incrementar el inoacuteculo de PMTV a partir de la infeccioacuten de su vector Sss (Veacutelez
2007) El material vegetal fue mantenido en casa de malla en el Centro Experimental
91
Paysanduacute ubicado en el corregimiento de Santa Elena municipio de Medelliacuten (bh-MB
2550 msnm temperatura media 14degC y precipitacioacuten promedio anual de 2000 mm) Tres
meses despueacutes de la siembra se recolectaron las hojas y las raiacuteces de las plantas sentildeuelo
para su procesamiento en el laboratorio
Secuenciacioacuten de CP y TGB2
Se obtuvo el ARN total de plantas de N benthamiana y S phureja mediante el kit RNeasy
plant mini (Qiagen EEUU) a partir de 100 mg de tejido utilizando 450 μL de buffer RLT
para tejido foliar o RLC para raiacuteces y 45 μL de β-mercaptoetanol y siguiendo las
instrucciones del fabricante Al finalizar el procedimiento el ARN obtenido se eluyoacute en 40
μL de agua destilada esteacuteril tratada con DEPC
Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos En las reacciones de
retrotranscripcioacuten se utilizoacute un volumen final de 20 microL incluyendo 05 microL de agua
destilada esteacuteril 15 microL de PBST (05) 4 microL de buffer RT (5X) 4 microL de MgCl2 (25
mM) 2 microL de dNTPs (10 mM) 2 microL de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de
ARNasas (40UmicroL) 05 microL de enzima M-MuLV Transcriptasa Reversa (20 UmicroL)
(Fermentas Lituania) y 5 microL de ARN o alternativamente una dilucioacuten 15 El programa de
RT fue de 37degC por 60 min seguido de 70degC por 10 min para inactivar la enzima Las
muestras se almacenaron a 4degC hasta su uso posterior
Para las reacciones de PCR se emplearon los cebadores especiacuteficos H360 (5rsquo CAT GAA
GGC TGC CGT GAG GAA GT 3rsquo) y C819 (5rsquo CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA
CC-3rsquo) (MacKenzie 1996) para amplificar una regioacuten de 459 pb del gen CP entre las
posiciones 385 y 844 del genoma viral (Figura 51) y PMTVF4 (5rsquo CAG CAA CCA CAA
ACA GAC AGG 3rsquo) y PMTVR4 (5rsquo AGC CAC TAA CAA AAC ATACTGC 3rsquo) para
obtener amplicones de 415 pb del TGB2 entre las posiciones 1726 y 2141 del ARN 2 (Xu
et al 2004) (Figura 52) Para algunos aislamientos en los que se dificultaba la
amplificacioacuten del TGB2 se utilizaron los cebadores PMTV5 (5 GGT GAA CAC GAG
GAC AAG GT 3) y PMTV7 (5 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 3) (Lambert et al
2003) que amplifican un fragmento de 646 pb y se extienden entre las posiciones del
92
genoma 1417 a 2063 Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 microL
incluyendo 158 microL de agua destilada esteacuteril 25 microL de buffer de enzima (10X) 18 microL de
MgCl2 (25 mM) 05 microL de dNTPs (10 mM) 05 microL de cada cebador (10 microM) 02 microL de
Albuacutemina de suero bovino (20 mgml) (Fermentas) 02 microL de Taq ADN polimerasa (5
UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ADNc aunque en algunas ocasiones dada la falta de
amplicones fue necesario preparar diluciones de 15 110 o 125 de ADNc Las
amplificaciones se realizaron en un termociclador T3 (Biometra Alemania) y consistieron
de una desnaturalizacioacuten inicial a 98degC por 3 min seguida por 40 ciclos de 94degC por 30 s
53degC por 45 s 72degC por 1 min y un periacuteodo final de extensioacuten a 72degC por 10 min Luego de
la amplificacioacuten se tomaron 5 microL de los productos de reaccioacuten y se separaron por
electroforesis en gel de agarosa al 15 suplementado con bromuro de etidio (10 mgmL) y
su tamantildeo se verificoacute por comparacioacuten con el marcador de peso molecular Generuler 100
pb DNA ladder (Fermentas)
Los amplicones del tamantildeo esperado correspondientes al menos a cuatro aislamientos
representativos de cultivos de papa de cada uno de los cuatro departamentos bajo estudio
fueron purificados del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) para realizar
su secuenciacioacuten directa en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores empleados en
la PCR y el kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied
Biosystems EEUU) Su corrido y separacioacuten se realizoacute en un secuenciador ABI Prism
3730xl (PE Applied Biosystems) de la compantildeiacutea Macrogen (Corea del Sur)
A partir de las secuencias obtenidas con cada cebador se construyeron las secuencias
consenso mediante el software BioEdit 606 (Hall 1999) y Chromas Lite (Technelysium
2009) Posteriormente se confirmoacute su origen viral por comparacioacuten con las bases de datos
moleculares con el programa BLASTn (httpwwwncbinlmnihgovBLASTBlastcgi) y
se obtuvieron secuencias de PMTV del GenBank de otras regiones del mundo para realizar
un anaacutelisis filogeneacutetico Para esto se generoacute un alineamiento mediante Clustal W (Larkin et
al 2007) del Software Bioedit 606 Los alineamientos fueron utilizados para construir una
una matriz de distancia geneacutetica utilizando el meacutetodo de Maacutexima verosimilitud basado en
el modelo de Tamura-Nei (1993) implementado en el software MEGA v40 (Tamura et al
93
2007) Para evaluar el soporte estadiacutestico de cada agrupacioacuten se realizoacute un anaacutelisis de
Bootstrap con 1000 remuestreos (Felsenstein 1985)
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Con el fin de obtener un mayor nivel de informacioacuten sobre las caracteriacutesticas de los
segmentos ARN 2 y ARN 3 del genoma de aislamientos Colombianos de PMTV se realizoacute
un proceso de secuenciacioacuten con minado de cebadores previamente reportados para la
amplificacioacuten de diferentes regiones de cada uno de dichos segmentos (Tabla 51 Figura
53) y buscando que generaran traslape de secuencias de manera que fuera posible la
construccioacuten de un contig general para cada segmento Para esto se seleccionaron cuatro
cepas de PMTV representativas de cada uno de los departamentos bajo anaacutelisis Con cada
cepa se realizaron por lo menos dos amplificaciones con cada cebador de manera que las
secuencias reportadas correspondieran al consenso para cada amplicoacuten Los procedimientos
de extraccioacuten de ARN PCR y secuenciacioacuten fueron similares a los descritos anteriormente
aunque las RT se realizaron con la enzima Transcriptasa Reversa Maximareg (Fermentas)
que ofrece mayores niveles de estabilidad teacutermica (hasta 65degC) y eficiencia que las
transcriptasas reversas convencionales En este caso las reacciones de RT consistieron de
95 microL de agua libre de nucleasas 4 microL de buffer RT (5X) 1 microL de dNTPs (10 mM) 1 microL
de cebador reverso (10 microM) 05 microL de inhibidor de ARNasas (40UmicroL) 1 microL de enzima
Transcriptasa Reversa Maximareg (200 UmicroL) (Fermentas) y 3 microL de ARN para un volumen
final de 20 microL La incubacioacuten se realizoacute a 50degC por 30 min y la enzima se inactivoacute a 85degC
por 5 min
Las secuencias se editaron mediante el software Chromas Lite generaacutendose los consensos
con ambos cebadores usando el programa Bioedit 606 y se procedioacute al ensamblaje de los
contigs resultantes utilizando el programa CAP3 (Huang y Madan 1999) Posteriormente
se verificoacute el marco de lectura correcto utilizando el servidor de Expasy (Expasy Proteomic
Server httpwwwexpasychtoolsdnahtml) y se realizoacute su alineamiento con respecto a
los dos segmentos genoacutemicos de aislamientos cuyas secuencias completas se encontraban
disponibles en GenBank (DQ102381 DQ144451 AJ243719 AJ277556) (Sandgren et al
2001 Cerovska et al 2007)
94
Finalmente las secuencias de nt fueron traducidas a aa realizaacutendose comparaciones de
porcentajes de identidad y nuacutemero de posiciones variables a lo largo de las regiones bajo
estudio y generaacutendose aacuterboles filogeneacuteticos basados en los contigs obtenidos en la
investigacioacuten mediante el programa Mega v 40 bajo los paraacutemetros antes descritos
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Variabilidad geneacutetica de PMTV de Colombia
En total se obtuvieron 25 secuencias para la regioacuten amplificada de CP y 38 secuencias para
TGB2 Estas secuencias correspondieron a por lo menos cuatro aislamientos por cada
departamento bajo anaacutelisis (Tabla 52) De esta forma se aumentaron las secuencias
parciales de los genes CP y TGB2 de PMTV con respecto al trabajo reciente realizado por
nuestro grupo (Gil et al 2011) en donde soacutelo se obtuvieron cuatro y tres secuencias para
CP y TGB2 lo cual implica que las diferentes modificaciones realizadas a los
procedimientos necesarios para el estudio de este virus desde la forma de obtencioacuten de las
muestras hasta la purificacioacuten de los amplicones pasando por la eliminacioacuten de inhibidores
de las polimerasas resultaron altamente eficientes Esta situacioacuten abre la posibilidad de
plantear en el futuro proacuteximo un estudio de incidencia de PMTV basado en la deteccioacuten del
virus mediante RT-PCR con un muestreo estratificado en los diferentes pisos teacutermicos
donde se cultiva la papa en Colombia y realizando comparaciones con respecto a los
niveles de incidencia de Sss de manera que sea posible determinar la dimensioacuten de los
niveles de dispersioacuten de este virus en este paiacutes suramericano Un trabajo similar fue
realizado por Montero-Astuacutea et al (2008) en Costa Rica pero utilizando pruebas de ELISA
tanto para la deteccioacuten de Sss como de PMTV En este caso se encontroacute que el virus era
maacutes frecuentemente detectado en las regiones con mayores altitudes donde las condiciones
de alta humedad y bajas temperaturas aparentemente favorecen su infeccioacuten Sin embargo
es probable que la utilizacioacuten de pruebas de ELISA para la deteccioacuten del virus haya
conducido a una subestimacioacuten de los niveles de incidencia detectados en dicho trabajo
pues la distribucioacuten erraacutetica del virus su capacidad de movimiento ceacutelula-ceacutelula con ayuda
de proteiacutenas de movimiento codificadas por el TGB y no necesariamente en su forma
95
encapsidada y la utilizacioacuten de anticuerpos disentildeados a partir de cepas del norte de Europa
pueden influir negativamente en la deteccioacuten seroloacutegica del PMTV (Gallo et al 2012)
El anaacutelisis filogeneacutetico para CP incluyoacute 404 posiciones a partir de 46 secuencias 15 de las
cuales corresponden a aislamientos de referencia de Europa Asia y Norte Ameacuterica y las 4
previamente reportadas de aislamientos Colombianos por Gil et al (2011) El dendrograma
presentoacute dos grupos soportados por valores de bootstrap del 100 (Figura 54) El primer
clado agrupoacute todas las secuencias de referencia con 19 de los aislamientos Colombianos
obtenidos en este estudio y presentaron niveles de identidad superiores al 99 en todos los
casos (Tabla 53) Por otra parte el segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo seis de las aquiacute obtenidas y dos de las reportadas por Gil et
al (2011) Al interior de este clado se presentaron mayores niveles de variacioacuten (11 a
13) y su identidad con respecto a los miembros del primer clado fue de tan solo 76 La
secuencia de Beet Soil-Borne Virus de China utilizada como grupo externo de anaacutelisis se
ubicoacute en posicioacuten externa a los dos clados y compartioacute niveles de identidad inferiores al
59 con respecto a los aislamientos de PMTV
Estos resultados confirman los hallazgos de Veacutelez (2007) y Gil et al (2011) en referencia a
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que incluso bajo los paraacutemetros
definidos por Adams et al (2009) para la definicioacuten de especies al interior de la familia
Virgaviridae (ej cepas con identidades superiores a 80 y 90 a nivel de secuencias de CP
y del genoma completo respectivamente) podriacutea representar una nueva especie del geacutenero
Pomovirus (Familia Virgaviridae) hasta ahora no registrada en otros lugares del mundo Si
se considera que seis de las 25 secuencias de CP obtenidas en este trabajo correspondieron
a dicha variante es evidente que su presencia no es marginal en los cultivos de papa de
Colombia ya que para la muestra obtenida aunque evidentemente sesgada por la coleccioacuten
de suelos y tejidos con presencia de estructuras de Sss su proporcioacuten es del 23 La
diversidad entre aislamientos podriacutea deberse a que la regioacuten andina ha sido propuesta como
el centro de origen del PMTV (Mayo et al 1996)
96
Estos resultados representan un viraje con respecto a lo encontrado en los estudios de
variabilidad de PMTV con base en secuencias de CP de diferentes oriacutegenes geograacuteficos
por cuanto indistintamente se habiacutea encontrado que los niveles de identidad presentes en
este gen superaban el 98 en todas las comparaciones establecidas Asiacute por ejemplo
Latvala-Kirby et al (2009) al comparar 28 secuencias de Finlandia Letonia Escocia
Dinamarca Repuacuteblica Checa y Suecia encontraron que casi todas eran ideacutenticas siendo tan
soacutelo detectado un 2 de variacioacuten entre las maacutes distantes lo cual representa cambios en tan
soacutelo siete posiciones a nivel de la secuencia de aa de la proteiacutena resultante Similarmente
Xu et al (2004) reportaron que aislamientos de PMTV de Estados Unidos y Canadaacute eran
ideacutenticos y que eacutestos a su vez tan soacutelo diferiacutean en maacuteximo 3 de sus secuencias de CP con
respecto a cepas de Peruacute (Mayo et al 1996) Escocia y Escandinavia (Reavy et al 1997)
De esta forma de gran intereacutes resultaraacute emprender estudios que permitan evaluar las
diferencias bioloacutegicas de dichas variantes de PMTV sobre distintas variedades de papa e
incluso sobre hospedantes experimentales debido a que siacute existen diferencias de
patogenicidad entre aislamientos de PMTV que presentan tan bajos niveles de variacioacuten
(Nielsen y Nicolaisen 2003) es posible que dicho efecto sea auacuten mayor cuando se evaluacuteen
las variantes aquiacute reportadas
Con respecto al anaacutelisis filogeneacutetico basado en las secuencias de TGB2 se incluyeron 330
posiciones de 49 secuencias siete de las cuales fueron de aislamientos de referencia de
diferentes paiacuteses y tres de Colombia previamente analizadas por Gil et al (2011) El
dendrograma generado presentoacute un solo clado que incluyoacute todas las secuencias (Figura
55) las que compartieron niveles de identidad superiores a 98 (Tabla 54) Estos
resultados son un indicativo de que la variacioacuten encontrada entre aislamientos Colombianos
con respecto a CP no necesariamente se presentan a lo largo de los diferentes segmentos
genoacutemicos de PMTV y especiacuteficamente no se ven reflejadas en las secuencias de TGB2
que en los pocos estudios donde se ha secuenciado presenta niveles de identidad superiores
a 948 e incluso se ha encontrado que aislamientos de oriacutegenes geograacuteficos diferentes
pueden compartir hasta el 100 de identidad en la secuencia de aa para este gen (ej
aislamiento Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa y aislamientos 54-15 y 54-19 de
Dinamarca) (Cerovska et al 2007) Los altos niveles de conservacioacuten de este gen entre
97
aislamientos de PMTV que presentan diferencias en otras regiones del genoma como las
aquiacute encontradas para CP posibilitan que los cebadores utilizados para su amplificacioacuten
sean una herramienta uacutetil para el diagnoacutestico de este virus Asiacute por ejemplo Lambert et al
(2003) disentildearon los cebadores PMTV5 y PMTV7 dirigidos a amplificar una regioacuten de 646
pb comprendida entre TGB1 y TGB2 cuando reportaron por primera vez la presencia del
PMTV en EEUU Posteriormente Xu et al (2004) utilizaron la regioacuten que codifica para
TGB2 para el disentildeo de los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 en su estudio de evaluacioacuten de
distribucioacuten de PMTV en EEUU y Canadaacute
Secuenciacioacuten del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Colombianos de PMTV
Todos los cebadores utilizados en las reacciones de RT-PCR para amplificar diferentes
regiones de los ARN 2 y 3 del genoma de PMTV generaron los amplicones del fragmento
esperado en al menos un aislamiento evaluado Sin embargo en los aislamientos de Narintildeo
y Cundinamarca no fue posible la obtencioacuten de un contig completo para toda la regioacuten
secuenciada de ambos segmentos auacuten luego de diferentes intentos y modificaciones de los
paraacutemetros de la RT-PCR De esta forma para el caso de los aislamientos de Narintildeo no se
lograron amplicones del ARN2 con los cebadores PMTV759 ndash PMTV1552R PMTV759F
ndash 2017R y 1948F ndash 123end para el ARN 3 no fue posible obtener fragmentos con
RNA3F1ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end y F388 ndash PMTV7 Para el caso de
Cundinamarca no se lograron amplicones para el ARN 2 con PMTV759 ndash PMTV1552R y
PMTV759F ndash 2017R y para ARN 3 con RNA3F1 ndash PMTV7_RNA3 PMTV5 ndash 123 end
F388-PMTV7 Considerando que las variantes detectadas mediante la secuenciacioacuten de una
porcioacuten de CP presentaron bajos niveles de identidad con respecto a los genotipos
globalmente distribuidos de PMTV es posible que la ausencia de amplificacioacuten se deba a
diferencias en los sitios de reconocimiento de uno o ambos cebadores situacioacuten que impide
la amplificacioacuten de los fragmentos respectivos y por tanto su secuenciacioacuten posterior De
gran intereacutes seraacute continuar el proceso de secuenciacioacuten de dichas variantes para lo cual es
necesario la clonacioacuten de los respectivos cDNAs de cada segmento y el disentildeo de nuevos
cebadores especiacuteficos que permitan completar los vaciacuteos (gaps)
98
Por las razones antes expuestas para los anaacutelisis de secuencias de ARN2 y 3 soacutelo se
incluyeron los aislamientos representativos de Antioquia (Ant) y Boyacaacute (Boy) (Tabla
55) Para el ARN 2 se obtuvieron contigs de 2577 nt y 2584 para los aislamientos
Antioquia y Boyacaacute mientras que para el ARN 3 los contigs tuvieron una extensioacuten de
2617 y 2360 nt respectivamente Esto implica que para el ARN 2 se obtuvo un porcentaje
de cobertura del 83 de este segmento genoacutemico y del 87 para el ARN 3 en
comparacioacuten con el aislamiento Sw de PMTV (AJ243719 y AJ277556) (Sandgren et al
2001) En teacuterminos de aa los contigs del ARN2 incluyeron 150 de los aa de CP (posiciones
26 a 176) y 799 de CP-RT (posiciones 26 a 825) Para el ARN 3 se obtuvo la secuencia
completa de aa de TGB1 (463 aa) y TGB2 (119 aa) asiacute como 146 de 190 aa de TGB3
(posiciones 1 a 146) para el aislamiento de Boyacaacute y la totalidad de dicha proteiacutena para la
cepa de Antioquia Las demaacutes secuencias obtenidas corresponden a regiones UTR de los
extremos 3acute para el ARN 2 y 5acute para el ARN 3
Con el fin de realizar un anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las dos cepas obtenidas
con respecto al genoma de la cepa de PMTV de Suecia ndash Sw cuyo genoma completo estaacute
depositado en GenBank bajo el coacutedigo PRJNA14789 (Savenkov et al 1999 Sandgren et
al 2001) se incluyeron 1956 nt (651 aa) para CP-RT 531 nt (176 aa) para CP y 1392 (463
aa) para las tres regiones del TGB En teacuterminos generales se encontraron muy altos niveles
de identidad en las tres regiones analizadas siendo la CP la maacutes uniforme con 99 en la
secuencia de nt y 100 en aa para las tres cepas CP-RT presentoacute un nivel de identidad
para nt de 994 entre las cepas de Antioquia y Boyacaacute y del 975 - 976 con respecto a
la secuencia de referencia mientras que estos valores fueron superiores al 982 cuando se
comparoacute la secuencia de aa Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos compartieron
un 999 de identidad en nt y aa (Figura 56) Las pocas diferencias a nivel de aa
encontradas en este estudio correspondieron a cambios en 15 posiciones para el producto
del ARN 2 siendo la maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la posicioacuten 81
de CP Para el caso de TGB se encontraron 10 cambios a lo largo de las tres proteiacutenas
analizadas con la presencia de una delecioacuten en la posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
99
Por otra parte el anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2569 nt para ARN 2 con
secuencias de referencia de los aislamientos Corneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia (Figura 57) arrojoacute un dendrograma con dos
clados soportados por 100 de bootstrap separaacutendose los aislamientos de Colombia de los
de Europa sin embargo los niveles de identidad entre ambos grupos fueron muy altos
(gt975) (Tabla 56) Al calcular los niveles de diversidad (promedio del nuacutemero de
sustituciones de nucleoacutetidos por cada sitio) para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos
(dNS) se encontroacute una diversidad muy baja con tan soacutelo 0017 (SE= 0003) para dNS y
0009 (SE=0002) para dS La relacioacuten promedia entre dNSdS fue de 18 lo cual indica
que las cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten positiva para este componente del
genoma Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 3 mientras que para las
europeas fue de 12 La distancia geneacutetica o nuacutemero de sustituciones promedio por sitio
basada en el meacutetodo de Kimura-2 paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0015
El anaacutelisis filogeneacutetico realizado con base en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de
referencia de los aislamientos Korneta-Nemilkov (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia generoacute
un dendrograma con dos clados de aislamientos europeos mientras que los aislamientos
Colombianos se presentaron en forma individual sobre ramas soportadas por 100 de
bootstrap (Figura 58) A pesar de dichas agrupaciones los niveles de identidad entre todos
los aislamientos fueron superiores a 967 (Tabla 57) Al calcular los niveles de
diversidad para sitios sinoacutenimos (dS) y no sinoacutenimos (dNS) se encontroacute una diversidad
muy baja para todos los aislamientos con tan soacutelo 0011 (SE= 0002) para dNS y 0044
(SE=0006) para dNS La relacioacuten media entre dNSdS fue de 025 lo cual indica que las
cepas de PMTV se encuentran bajo seleccioacuten estabilizadora en dicho segmento de ARN
Para las cepas Colombianas el valor de dNSdS fue de 019 mientras que para los
aislamientos europeos fue de 039 La distancia geneacutetica basada en el meacutetodo de Kimura -2
paraacutemetros para toda la poblacioacuten fue de 0020 (SE 0002)
Los bajos niveles de variacioacuten encontrados en los anaacutelisis de genomas de PMTV (Savenkov
et al 1999 Sandgren et al 2001 Cerovska et al 2007) y que nuevamente fueron inferidos
100
en el presente estudio para las cepas del clado que representa PMTV sensu stricto indican
que este virus se encuentra bajo fuertes presiones de seleccioacuten determinadas
presumiblemente por las propias caracteriacutesticas de su genoma el estrecho rango de
hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica por parte de su vector Sss (Kirk
2008 Santala et al 2010)
Para el primer caso la restriccioacuten selectiva se manifiesta por los bajos valores de dNSdS
calculados para dicho segmento y ocurre fundamentalmente al presentarse traslape de genes
en el ARN 3 Sin embargo para el ARN 2 dicha relacioacuten fue gt1 lo cual sugiere una
seleccioacuten positiva que puede explicarse por el hecho que este segmento presenta la
estrategia de supresioacuten del codoacuten de parada tipo amber para la traduccioacuten de las dos
proteiacutenas codificantes (CP y CP-RT) lo cual supone menos restricciones para la fijacioacuten de
mutaciones De otra parte la presencia de un estrecho rango de hospedantes para el virus
que se restringe a algunas especies de las familias Solanaceae y Chenopodiaceae (Kirk
2008) aunada a su transmisioacuten por Sss supone fuertes restricciones sobre los cambios en
las diferentes proteiacutenas del virus que interactuacutean con sus hospedantes y vectores lo cual
impide altas tasas de variacioacuten tales como las que presentan otros virus de ARNss(+) como
los potyvirus que en general tienen amplios rangos de hospedantes y cuya transmisioacuten por
aacutefidos poliacutefagos es del tipo no persistente (Hu et al 2009)
A pesar de los altos valores de uniformidad general encontrados de gran intereacutes resultoacute la
presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los aislamientos
colombianos de PMTV Por esto es necesario en el futuro evaluar el significado bioloacutegico
de dichos cambios por ejemplo si estan relacionadas con el efecto de las variedades nativas
de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas que las poblaciones de Sss
tienen en las regiones Andinas donde se presentan mayores niveles de variacioacuten que en
aquellas encontradas en las regiones cultivadoras de papa del hemisferio norte tal como lo
planteoacute Carrentildeo (2009) El efecto de estas inserciones y de diferentes sustituciones
detectadas en este trabajo sobre diferentes regiones de los segmentos de ARN 2 y 3
requiere un tratamiento futuro detallado a partir de anaacutelisis de mutantes y de sus efectos
sobre el ciclo infectivo viral
101
Esta investigacioacuten representa un avance importante en la caracterizacioacuten geneacutetica del
PMTV en las principales zonas cultivadoras de papa de Colombia Sus resultados
confirman la presencia de dos genotipos principales de este virus en el paiacutes uno que
representa al PMTV sensu stricto destacado por presentar muy bajos niveles de variacioacuten
entre sus cepas y otro que representa una variante hasta ahora soacutelo identificada en
Colombia y que por presentar porcentajes de identidad inferiores al 80 con respecto al
grupo principal podriacutea representar una nueva especie de pomovirus que requiere ser
evaluada bioloacutegica patogeacutenica y molecularmente Finalmente es imperativo estudiar el
efecto de ambos genotipos virales sobre la produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de
papa en Colombia de manera que los organismos de sanidad vegetal estatales gremios de
productores y agroindustrias puedan valorar la necesidad de incluir la deteccioacuten del PMTV
en los programas de certificacioacuten de semilla y de mejoramiento geneacutetico de papa que se
adelantan en el paiacutes
AGRADECIMIENTOS
Esta investigacioacuten se realizoacute gracias al apoyo econoacutemico y teacutecnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08) de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medelliacuten Fedepapa y Fritolay Se agradece a la Prof Luz
Estela Lagos de la Universidad de Narintildeo por su apoyo con la coleccioacuten de muestras en el
Departamento de Narintildeo
102
BIBLIOGRAFIacuteA
Adams MJ Antoniw JF Kreuze J 2009 Virgaviridae a new family of rod-shaped plant
viruses Archives of Virology 154 1967-1972
Arif M Torrance L Reavy B 1995 Acquisition and transmission of Potato mop-top
furovirus by a culture of Spongospora subterranea f sp subterranea derived from a single
cystosorus Annals of Applied Biology 126493-503
Calvert E Harrison BD 1966 Potato mop-top a soil-borne virus Plant Pathology
15134ndash139
Carnegie SF Saddler GS Peters JC 2009 Cultivar susceptibility to Potato mop-top virus
(PMTV) infection and symptom expression Aspects of Applied Biology 94 (Potatoes
Viruses and their Vectors) 51ndash54
Carrentildeo AJ 2009 Evaluacioacuten de la variabilidad geneacutetica de Spongospora subterranea
fsp subterranea mediante la comparacioacuten de regiones ITS del ADN ribosomal de cepas
procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia Tesis de Maestriacutea en
Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotaacute Colombia
Cerovska N Moravec T Rosecka P Filigarova M Pecenkova T 2003 Nucleotide
sequences of coat protein coding regions of six potato mop-top virus isolates Acta
Virologica 4737-40
Cerovska N Pecenkova M Foligarova M Dedic P 2007 Sequence analysis of the
Czech Potato mop-top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov Folia Microbiologica
5261-64
103
Cowan GH Torrance L Reavy B1997 Detection of Potato mop-top virus capsid
readthrough protein in virus particles Journal of General Virology 781779-1783
Davey T 2009 The importance of Potato mop-top virus (PMTV) in Scottish seed potatoes
(PhD Thesis) Heriot Watt University amp Science and Advice for Scottish Agriculture
Scotland
Felsenstein J 1985 Confidence limits on phylogenies an approach using the bootstrap
Evolution 39(4)783-791
Gallo Y 2012 Generacioacuten de antiacutegenos derivados de la proteiacutena de la caacutepside de PVY
TaLMV y PMTV para la produccioacuten de anticuerpos uacutetiles en el desarrollo de pruebas
seroloacutegicas Tesis de Maestriacutea en Bioquiacutemica Facultad de Medicina Universidad Nacional
de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Gil JF Gutieacuterrez P Cotes JM Gonzaacutelez EP Mariacuten M 2011 Caracterizacioacuten genotiacutepica
de aislamientos colombianos del Potato mop-top virus (PMTV Pomovirus) Actualidades
Bioloacutegicas 33(94)69-84
Guerrero O 1997 Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de la
rontildea de la papa en el Departamento de Narintildeo Curso de manejo sanitario del cultivo de la
papa Memorias Pasto Colombia
Guerrero O 2000 La rontildea o sarna polvosa en el Departamento de Narintildeo Papas
Colombianas con el Mejor Entorno Ambiental Segunda Edicioacuten Fedepapa 127-129
Hall TA 1999 BioEdit a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis
program for Windows 9598NT Nucleic Acids Symposium Series 4195-98
Harrison BD Jones RAC 1970 Host range and some properties of Potato mop-
top virus Annals Applied Biology 65393-402
104
Hu X Karasev AV Brown CJ Lorenzen JH 2009 Sequence characteristics of potato
virus Y recombinants Journal of General Virology 903033ndash3041
Huang X Madan A 1999 CAP3 A DNA sequence assembly program Genome
Research 9868-877
Jones RAC Harrison BD 1972 Ecological studies on Potato mop-top virus in Scotland
Annals Applied Biology 7147-57
Jaramillo S Botero JM 2007 Respuesta de diferentes poblaciones de Spongospora
subterranea f sp subterranea a la rotacioacuten entre dos variedades de papa (Solanum
tuberosum ssp andigena) Revista Facultad Nacional de Agronomiacutea Medelliacuten 603859-
3876
Jeffries CJ 1998 Potato FAOIPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm 19 62-63
Kirk HG 2008 Mop-top virus relationship to its vector American Journal of Potato
Research 85 261-265
Lambert DH Levy L Mavrodieva VA Johnson SB Babcock MJ Vayda ME 2003
First Report of Potato mop-top virus on Potato from the United States Plant Disease
87872
Larkin M Blackshields G Brown NP Chenna R McGettigan PA McWilliam H
Valentin F Wallace IM Wilm A Loacutepez R Thompson JD Gibson TJ Higgins DG
2007 Clustal W and Clustal X version 20 Bioinformatics 23(21)2947-2948
Latvala-Kilby S Aura JM Pupola N Hannukkala A Valkonen JPT 2009 Detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and sprouts combinations of RNA2 and RNA3
variants and incidence of symptomless infections Phytopathology 99519-531
105
Lim HS Bragg J N Ganesan U Lawrence DM Yu J L Isogai M Hammond J
Jackson AO 2008 Triple gene block protein interactions involved in movement of Barley
stripe mosaic virus Journal Virology 824991-5006
Lim HS Bragg J N Ganesan U Ruzin S Schichnes D Lee MY Vaira AM Ryu KH
Hammond J Jackson AO 2009 Subcellular localization of the Barley stripe mosaic virus
triple gene block proteins Journal Virology 839432-9448
Lukhovitskaya NI Yelina NE Zamyathin AA Schepetilnikov MV Solovyev AG
Sandgren M Morozov SY Valkonen JPT Savenkov EI 2005 Expression localization
and effects on virulence of the cysteine-rich 8 KDa protein of Potato mop-top virus Journal
of General Virology 862879-2889
MacKenzie DJ 1996 Detection of potato mop-top virus in leaf or tuber tissue by reverse
transcription-polymerase chain reaction Document CPHBT96K03 Centre for Plant Health
Agriculture and Agri-Food Canada Sidney BC Canada
Mayo MA Torrance L Cowan G Jolly CA Macintosh SM Orrego R Barrera C
Salazar LF 1996 Conservation of coat protein sequence among isolates of Potato mop-top
virus from Scotland and Peru Archives of Virology 1411115-1121
Montero-Astuacutea M Vasqueacutez V Turechek WW Merz U and Rivera C 2008 Incidence
distribution and association of Spongospora subterranea and Potato mop-top virus in
Costa Rica Plant Disease 921171-1176
Mumford RA Walsh K Barker I Boonham N 2000 Detection of Potato mop top virus
and Tobacco rattle virus using a multiplex real-time fluorescent reverse transcription
polymerase chain reaction assay Phytopathology 90448-453
106
Nakayama T Maoka T Hataya T Shimizu M Fuwa H Tsuda S Motoyuki M 2010
Diagnosis of Potato mop-top virus in soil using bait plant bioassay and RT-PCR-microplate
hybridization American Journal of Potato Research 87 218-225
Nielsen SL Nicolaisen M 2003 Identification of two nucleotide sequence sub-groups
within Potato mop-top virus Archives of Virology 148 381-388
Reavy B Sandgren M Barker H Heino P Oxelfelt P 1997 A coat protein transgene
from a Scottish isolate of Potato mop-top virus mediates strong resistance against
Scandinavian isolates which have similar coat protein genes European Journal of Plant
Pathology 103829-834
Roos J Hopkins R Kvarnheden A Dixelius C 2011 The impact of global warming on
plant diseases and insect vectors in Sweden European Journal of Plant Pathology 1299-19
Ryazantsev DY Zavriev SK 2009 An efficient diagnostic method for the identification
of potato viral pathogens Molecular Biology 43515-523
Salazar LF 2006 Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes Potato
Research 4943-47
Sandgren M Savenkov E Valkonen JP 2001 The readthrough region of Potato mop-top
virus (PMTV) coat protein enconding RNA the second largest RNA of PMTV genome
undergoes structural changes in naturally infected and experimentally inoculated plants
Archives of Virology 146467-477
Santala J Samuilova O Hannukkala A Latvala S Kortemaa H Beuch U Kvarnheden A
Persson P Topp K Oslashrstad K Spetz C Nielsen SL Kirk HG Budziszewska M
Wieczorek P Obrępalska-Stęplowska A Pospieszny H Kryszczuk A Sztangret-
Wiśniewska J Yin Z Chrzanowska M Zimnoch-Guzowska E Jackeviciene E
Taluntytė L Pūpola N Mihailova J Lielmane I Jaumlrvekuumllg L Kotkas K Rogozina E
107
Sozonov A Tikhonovich I Horn P Broer I Kuusiene S Staniulis J Uth JG Adam
G Valkonen JPT 2010 Detection distribution and control of Potato mop-top virus a soil-
borne virus in northern Europe Annals of Applied Biology 157163-178
Savenkov EI Germundsson A Zamyathin AA Sandgren M Valkonen JPT 2003
Potato mop-top virus The coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich
protein are dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana Journal of
General Virology 841001-1005
Savenkov EI Sandgren MY Valkonen JPT 1999 Complete sequence of RNA 1 and the
presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato mop-top virus genus Pomovirus
Journal of General Virology 802779-2784
Tamura K Dudley J Nei M Kumar S 2007 MEGA4 Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) software version 40 Molecular Biology and Evolution 241596-1599
Tamura K Nei M 1993 Estimation of the number of nucleotide substitutions in the
control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Molecular Biology and
Evolution 10512-526
Technelysium 2009 Chromas 20 Consultado el 15 de Febrero de 2009 Disponible en
httpwwwtechnelysiumcomauchromas_litehtml
Tenorio J Franco Y Chuquillanqui C Owens RA Salazar LF 2006 Reaction of potato
varieties to Potato mop-top virus infection in the Andes American Journal of Potato
Research 83423-31
Torrance L Cowan GH Pereira LG 1993 Monoclonal antibodies specicreg for Potato
mop-top virus and some properties of the coat protein Annals of Applied Biology 122311-
322
108
Torrance L Cowan GH Sokmen M A Reavy B 1999 A naturally occurring deleted
form of RNA 2 of Potato mop-top virus Journal of General Virology 802211-2215
Veacutelez PB 2007 Deteccioacuten e identificacioacuten del Potato Mop-top virus (PMTV) en aacutereas de
produccioacuten de papa donde se encuentra Spongospora subterranea en dos departamentos de
Colombia Tesis de Maestriacutea en Ciencias Agrarias Facultad de Agronomiacutea Universidad
Nacional de Colombia sede Bogotaacute Colombia
Wright KM Cowan GH Lukhovitskaya NI Tilsner J Roberts AG Savenkov EI
Torrance L 2010 The N-Terminal domain of PMTV TGB1 movement protein is required
for nucleolar localization microtubule association and long-distance movement Molecular
Plant-Microbe Interaction 23(11)1486-1497
Xu H Dehaan TL De Boer SH 2004 Detection and confirmation of Potato mop-top
virus in Potatoes produced in the United States and Canada Plant Disease 88 363-367
109
51 Anexos
Figura 51 Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (434 pb) dirigidos al
gen de la caacutepside viral de PMTV a partir de muestras de tejido de raiacutez de plantas de N
benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea del
Departamento de Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador 100 pb Carril 2 BS8T Carril 3
BS9T Carril 4 BS4T Carril 5 BS11P Carril 6BS4T Carril 7 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7
500 pb
110
Figura 52 Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb)
dirigidos al gen TGB2 (triple bloque de genes) de PMTV a partir de muestras de tejido de
raiacutez de plantas de N benthamiana y S phureja cultivadas en suelos infestados con S
subterranea de los Departamentos de Antioquia y Boyacaacute Colombia Carril 1 Marcador
100 pb Carril 2-4 Control positivo (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 5-7
SRL5 (ADN directo 110150 respectivamente) Carril 8-10 SRL7 (ADN directo
110150 respectivamente) Carril 11-13 BS8T (ADN directo 110150
respectivamente) Carril 1415 BS4T1 (ADN directo y 110) Carril 16 Control negativo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
500 pb
111
Tabla 51 Cebadores especiacuteficos utilizados en la RT-PCR para la amplificacioacuten de los
segmentos de ARN 2 y 3 del genoma del Potato mop-top virus (PMTV)
Cebador Secuencia 5acute- 3 Posicioacuten en el
genoma (nt) Referencia
RNA3 F1 CGCTCGAGTTTAGGTGACACTATAGGTATTTCA
ACTCTACCTAG 1 a 388
Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003 PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
PMTVF4 CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG 1726 a 1746 Xu et al
2004
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
PMTV5 USA
RNA3 GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT 1417 a 1436
Lambert
et al 2003
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
F388
CGGGATCCGAAGTAGACCACACAGAGTG
1 a 388 Gallo
2012
PMTV7 USA
RNA3 AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC 2044 a 2063
Lambert
et al 2003
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011 PMTV1552R GCC AAT TGT CTC AAT CAT ACA CTG 1865 a 1888
PMTV759F ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG 1072 a 1094 Gil et al
2011
2017R CCA CTG CAA AAG AAC CGA TTT C Mumford
et al 2000
1948F GTG ATC AGA TCC GCG TCC TT Mumford et al 2000
123 end GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC 5847 a 5872 Savenkov
et al 1999
112
Figura 53 Amplicones obtenidos con los cebadores RNA3F1-PMTV7 (2063 pb)
PMTV5-PMTV7 (646 pb) y PMTVF4-123 end (1067 pb) dirigidos al ARN3 del genoma
del Potato mop-top virus (PMTV) a partir de tejido de raiacutez de plantas de N benthamiana y
S phureja cultivadas en suelos infestados con S subterranea de cuatro departamentos de
Colombia Carril 1 Marcador 100 pb plus carriles 2-5 con cebadores RNA3F1-PMTV7
SRL5 SRL6 BS9T1 BS9T2 carril 6-12 con cebadores PMTV5-PMTV7 23T 24T
SRL5 SRL6 BS4T BS8T BS9T carril 13-20 con cebadores PMTVF4-123 end Villa1
NS19P1 23T 24T SRL4 SRL5 SRL6 BS4T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1000 pb 500 pb
113
Tabla 52 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de CP y TGB2 de PMTV en cuatro Departamentos cultivadores de papa de
Colombia
Gen CP Gen TGB2
ANTIOQUIA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 23T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro 24T La Unioacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
25 La Unioacuten Suelo S tuberosum 25(1) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL4 Santa Rosa S tuberosum var Diacol Capiro 25(2) La Unioacuten Suelo S tuberosum
SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL4 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL5 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro SRL6 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle La Unioacuten Suelo S tuberosum SRL7 Santa Rosa Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Valle1 La Unioacuten Suelo S tuberosum
Valle2 La Unioacuten Suelo S tuberosum
BOYACAacute
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
BS2T Oicataacute Suelo S tuberosum BS1P1 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4P Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS1P2 Oicataacute Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS4T Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro BS4T1 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS8T Soracaacute Suelo S tuberosum BS4T2 Siachoque Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
BS9T Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum BS8T1 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11P Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS8T2 Soracaacute Suelo S tuberosum
BS11T Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA BS9T1 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS12P Tunja Suelo con Pennisetum clandestinum BS9T2 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS9T3 Soracaacute Suelo con Pennisetum clandestinum
BS11T1 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS11T2 Tunja Suelo S tuberosum var ICA UNICA
BS13P Tunja Suelo S tuberosum
CUNDINAMARCA
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
CS1T Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa CS1P1 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2P Subachoque Suelo S tuberosum CS1P2 Subachoque Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
CS2T Subachoque Suelo S tuberosum CS2P Subachoque Suelo S tuberosum
CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro CS6P Villapinzoacuten Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Mad Madrid Suelo S tuberosum Villa1 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
114
Villa2 Villapinzoacuten Suelo S tuberosum
NARINtildeO
Muestra Municipio Procedencia Muestra Municipio Procedencia
NS1P Pasto Suelo S tuberosum NS3P1 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS2T Pasto Suelo S tuberosum NS3P2 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol
Capiro NS3P3 Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8P Pasto Suelo S tuberosum NS6P Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS8PF Pasto Suelo S tuberosum
NS10T Pasto Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
NS19P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS19P2 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P1 Ipiales Suelo S tuberosum
NS22P2 Ipiales Suelo S tuberosum
115
Figura 54 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten CP del genoma de Potato
mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del mundo
Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus (China)
Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte inferior de
las ramas
116
Tabla 53 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten CP de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
BS4T
Boyacaacute
Colombia
CS1T
Cundinamarca
Colmbia
NS2T
Narintildeo
Colombia
NS6P
Narintildeo
Colombia
71MY
Cundinamarca
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AJ243719
PMTV
Suecia
EF545141
Beet Soil-
Borne
Virus
China
BS4T Boyacaacute
Colombia ID 0997 0764 0752 0762 0995 0995 0599
CS1T
Cundinamarca
Colombia
0997 ID 0764 0752 0762 0992 0992 0599
NS2T Narintildeo
Colombia 0764 0764 ID 0891 0876 0769 0769 0571
NS6P Narintildeo
Colombia 0752 0752 0891 ID 0967 0752 0752 0596
71MY
Cundinamarca
Colombia
0762 0762 0876 0967 ID 0762 0762 0599
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0995 0992 0769 0752 0762 ID 1 0594
AJ243719
PMTV Suecia 0995 0992 0769 0752 0762 1 ID 0594
EF545141 Beet
Soil-Borne
Virus China
0599 0599 0571 0596 0599 0594 0594 ID
117
Figura 55 Aacuterbol filogeneacutetico basado en secuencias de la regioacuten TGB2 del genoma de
Potato mop-top virus provenientes de cultivos de papa de Colombia y otros paiacuteses del
mundo Como grupo externo de anaacutelisis se presenta la secuencia del Beet soil-borne virus
(China) Meacutetodo de Maacutexima verosimilitud con soporte de Bootstrap indicado en la parte
inferior de las ramas
118
Tabla 54 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten TGB2 de aislamientos de
PMTV de Colombia y otros paiacuteses del mundo Se incluye a Beet Soil-Borne Virus como
grupo externo de anaacutelisis
Muestras
23T
Antioquia
Colombia
NS22P1
Narintildeo
Colombia
Villa2
Cundinamarca
Colombia
DQ144451
Repuacuteblica
Checa
NC_003725
Suecia
EF545142 Beet
Soil-Borne Virus
China
23T Antioquia
Colombia ID 0981 0981 0984 0981 0699
NS22P1 Narintildeo
Colombia 0981 ID 099 0984 0981 0708
Villa2 Cundinamarca
Colombia 0981 099 ID 0987 0984 0708
DQ144451 Repuacuteblica
Checa 0984 0984 0987 ID 099 0714
NC_003725 Suecia 0981 0981 0984 099 ID 0711
EF545142 Beet Soil-
Borne Virus China 0699 0708 0708 0714 0711 ID
Tabla 55 Procedencia de muestras de suelos con antecedentes de Sss para la obtencioacuten de
aislamientos de regiones del genoma ARN 2 y ARN 3 del Potato mop-top virus en cuatro
Departamentos cultivadores de papa de Colombia
Muestra Hospedante Municipio Planta sentildeuelo
Ant (23T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
La Unioacuten (Antioquia)
N benthamiana
Boy (BS4T) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro
Siachoque
(Boyacaacute) N benthamiana
Cund(CS1T) Suelo S tuberosum var Parda Pastusa
Subachoque (Cundinamarca)
N benthamiana
Nar (NS6P) Suelo S tuberosum var Diacol Capiro Pasto (Narintildeo) S phureja
119
Figura 56 Anaacutelisis de variacioacuten de las secuencias de las cepas de Antioquia y Boyacaacute
(Colombia) con respecto al genoma de la cepa de PMTVndash Sw Suecia A Niveles de
identidad de nucleoacutetidos y aminoaacutecidos (entre pareacutentesis) de las regiones CP CP-RT y
TGB analizadas y la cepa NC_003724 B Regioacuten CP-RT se incluyeron 1956 nt (651 aa)
para CP-RT y 531 nt (176 aa) para CP Se presentaron cambios en 15 posiciones para el
producto del ARN 2 siendo lo maacutes relevante una insercioacuten de 4 aa (PEVR) a partir de la
posicioacuten 81 de CP C Regioacuten TGB se incluyeron 1392 nt (463 aa) Se presentan 10
cambios a lo largo de las tres proteiacutenas analizadas con la presencia de una delecioacuten en la
posicioacuten 361 en la cepa Boyacaacute
120
Figura 57 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2569 nt para el ARN 2 con secuencias de
referencia de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa
(DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia y secuencias Colombianas de PMTV
procedentes de Antioquia y Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de
Bootstrap (100 ) se indican sobre las ramas La escala representa las sustituciones
promedio por sitio
121
Tabla 56 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 2 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ102381
PMTV
Repuacuteblica Checa
AJ243719
PMTV Suecia
Antioquia
Colombia ID 0994 0979 0976
Boyacaacute
Colombia 0994 ID 0978 0975
DQ102381 PMTV
Repuacuteblica Checa 0979 0978 ID 0995
AJ243719 PMTV
Suecia 0976 0975 0995 ID
122
Figura 58 Aacuterbol filogeneacutetico basado en 2008 nt para ARN 3 con secuencias de referencia
de los aislamientos Europeos Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19
(AY353719) y 54-10 (AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd
(D30753) de Escocia y secuencias Colombianas de PMTV procedentes de Antioquia y
Boyacaacute Meacutetodo de maacutexima verosimilitud Los valores de Bootstrap (100 ) se indican
sobre las ramas La escala representa las sustituciones promedio por sitio
123
Tabla 57 Matriz de identidad basada en secuencias de la regioacuten del ARN 3 de
aislamientos de PMTV de Colombia (Antioquia Boyacaacute) y los aislamientos Europeos
Korneta-Nemilkov de Repuacuteblica Checa (DQ144451) 54-19 (AY353719) y 54-10
(AY426745) de Dinamarca Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia
Muestras Antioquia
Colombia
Boyacaacute
Colombia
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
AY426745
PMTV
Dinamarca
AY353719
Dinamarca
AJ277556
PMTV
Suecia
D30753
PMTV
Escocia
Antioquia
Colombia ID 0979 0988 0987 0986 0973 0967
Boyacaacute
Colombia 0979 ID 0980 0980 0979 0980 0969
DQ144451
PMTV
Repuacuteblica
Checa
0988 0980 ID 0998 0997 0979 0971
AY426745
PMTV
Dinamarca
0987 0980 0998 ID 0997 0979 0970
AY353719
PMTV
Dinamarca
0986 0979 0997 0997 ID 0978 0969
AJ277556
PMTV Suecia 0973 0980 0979 0979 0978 ID 0986
D30753 PMTV
Escocia 0967 0969 0971 0970 0969 0986 ID
124
6 ANEXOS GENERALES
61 Protocolo de purificacioacuten de ADN total de tejido de planta (Qiagen)
1 Homogenizar 100 mg de tejido de planta en nitroacutegeno liacutequido utilizando un mortero
Adicionar 400 microL de buffer AP1 y 4 microL de la solucioacuten de ARNase A (100mgmL) a
un maacuteximo de 100 mg (peso huacutemedo) o 20 mg (peso seco) de tejido de planta
homogenizado y agitar vigorosamente
2 Incubar la mezcla por 10 min a 65degC Mezclar por inversioacuten 2 oacute 3 veces durante la
incubacioacuten
3 Agregar 130 microL de buffer AP2 al lisado mezclar e incubar por 5 min en hielo
4 Recomendado Centrifugar el lisado por 5 min a 20000 x g (14000 rpm)
5 Pipetear el lisado en la columna QIAshredder Mini spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a 20000 x g (14000 rpm)
6 Transferir la fraccioacuten que pasoacute por la columna del paso 5 en un nuevo tubo sin
disturbar el sedimento de restos celulares
7 Agregar 15 voluacutemenes de buffer AP3E al lisado aclarado y mezclar por pipeteo
8 Pipetear 650 microL de la mezcla de paso 7 incluyendo cualquier precipitado que se
pueda haber formado en la columna DNeasy Mini spin column colocando en un
tubo de coleccioacuten de 2 ml Centrifugar por 1 min a 6000 x g (corresponde a 8000
rpm para la mayoriacutea de las microcentrifugas) y descartar el liacutequido Reutilizar el
tubo de coleccioacuten en el paso 9
9 Repetir el paso 8 con la muestra restante Desechar el liacutequido que atraviesa la
membrana y el tubo de coleccioacuten
10 Colocar la columna DNeasy Mini spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2 ml
agregar 500 microL de buffer AW y centrifugar por 1 min a 6000 x g (8000 rpm)
Descartar el liacutequido que atraviesa la membrana y reutilizar el tubo de coleccioacuten en
el paso 12
11 Adicionar 500 microL de buffer AW a la columna DNeasy Mini spin y centrifugar por 2
min a 20000 x g (14000 rpm) para secar la membrana
12 Transferir la columna DNeasy Mini spin a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL y
pipetear 40 microL de Agua bi-destilada directamente en la membrana de DNeasy
Incubar por 5 min a temperatura ambiente (15-25degC) y luego centrifugar por 1 min
a 6000 x g (8000 rpm) para eluir
13 Repetir el paso 12 una vez
125
62 Protocolo de extraccioacuten convencional de ADN de Spongospora subterranea
a partir de raiacutez (agallas) y tubeacuterculo (Doyle y Doyle 1987)
Previo a dar inicio a al procedimiento se debe asegurar de contar con
Nitroacutegeno liacutequido
Bantildeo Mariacutea a 65degC
Enfriar morteros a -20degC
Preparar solucioacuten de hipoclorito de sodio al 2
Preparar el volumen de buffer CTAB+ β-Mercaptoetanol correspondiente al
nuacutemero de muestras
Desinfestar las muestras con hipoclorito y agua destilada durante 1 min
1 Tomar la raiacutez previamente desinfestada macerarla en nitroacutegeno liacutequido y pasarla a
un tubo eppendorf de 2 mL hasta completar un volumen de 400-500 microL
2 Adicionar 500 microL de buffer de extraccioacuten (CTAB) y 1 de β-Mercaptoetanol (5
microL) previamente preparado
Mezclar por inversioacuten
3 Incubar los tubos a 65degC por 30 min Durante este tiempo hacer inversioacuten de los
tubos cada 5 min
4 Adicionar 250 microL de fenol y 250 microL de cloroformo alcohol isoamiacutelico (241)
Mezclar por inversioacuten
5 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 10 min
6 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL
7 Adicionar un volumen de cloroformo alcohol isoamiacutelico (respecto al sobrenadante)
Mezclar por inversioacuten y centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 5 min
8 Pasar el sobrenadante (aproximadamente 400 microL) a tubos nuevos de 2 mL y repetir
el paso 7
9 Adicionar un volumen de isopropanol friacuteo y 01 voluacutemenes de acetato de sodio 3M
invertir varias veces para precipitar el ADN Llevar las muestras a -20degC por 60 min
como miacutenimo o durante toda la noche Periodos maacutes largos pueden aumentar la
produccioacuten
10 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 15 min a temperatura ambiente
11 Descartar el sobrenadante invirtiendo raacutepida y suavemente los tubos y adicionar 200
microL de etanol friacuteo al 70 Centrifugar a 13000 rpm (18500 x g) por 2 min
12 Descartar el sobrenadante por inversioacuten y secar el pellet a temperatura ambiente
invirtiendo los tubos sobre papel absorbente
13 Resuspender el pellet en 50 microL de agua ultrapura esteacuteril
14 Adicionar 4 microL de ARNasa a cada muestra e incubar en el bantildeo Mariacutea a 37degC
durante miacutenimo 2 horas o durante toda la noche
Doyle JJ Doyle JL 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull 1911-15
126
63 Protocolo Purificacioacuten de ARN total de ceacutelulas y tejidos de plantas y
hongos filamentosos (Qiagen)
1 Determinar la cantidad de material de planta No usar maacutes de 100 mg
2 Colocar inmediatamente el tejido pesado en nitroacutegeno liacutequido Macerar bien en
un mortero Pasar el tejido en polvo a un tubo de microcentriacutefuga de 2 mL
manteniendo los tubos en nitroacutegeno liacutequido Eacuteste se puede evaporar pero no se
debe permitir que el tejido se descongele Proceder inmediatamente al paso 3
3 Adicionar 450 microL de buffer RLC a un maacuteximo de 100 mg de tejido en polvo
Hacer vortex vigorosamente Nota Asegurar que el B-mercaptoetanol (β-ME)
haya sido agregado al buffer RLC antes de su uso (10 microL de β-ME1 mL de
buffer RLC)
4 Transferir el lisado a la columna QIAshredder spin (lila) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL y centrifugar por 2 min a maacutexima velocidad (13000 rpm
oacute 18500 x g) Transferir cuidadosamente el sobrenadante que pasoacute por la
columna a un nuevo tubo de microcentriacutefuga sin disturbar el sedimento de
restos celulares en el tubo de coleccioacuten Usar soacutelo el sobrenadante en los pasos
siguientes
5 Adicionar 05 voluacutemenes de etanol (96-100) al lisado aclarado y mezclar
por pipeteo inmediatamente No centrifugar Proceder inmediatamente al paso 6
6 Transferir la muestra (usualmente 650 microL) incluyendo cualquier precipitado
que se haya formado a una columna RNeasy spin (rosada) colocada en un tubo
de coleccioacuten de 2 mL (suministrado) Cerrar suavemente la tapa y centrifugar
por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que pasoacute por la
membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 7
7 Adicionar 700 microL de buffer RW1 a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo de coleccioacuten en el paso 8
8 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 15s a 8000 x g (10000 rpm) Descartar el liacutequido que
pasoacute por la membrana Reutilizar el tubo en el paso 8 Nota Asegurar que el
buffer RPE tenga adicionado el etanol antes de su uso
9 Adicionar 500 microL de buffer RPE a la columna RNeasy spin Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar por 2 min a 8000 x g (10000 rpm) para lavar la membrana
de la columna
10 Opcional Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 2
mL (suministrado) y descartar el tubo anterior con el liacutequido Cerrar suavemente
la tapa y centrifugar a velocidad maacutexima por 1 min (13000 rpm oacute 18500 x g)
11 Colocar la columna RNeasy spin en un nuevo tubo de coleccioacuten de 15 mL
(suministrado) Adicionar 20 microL de agua tratada con DEPC (Dietil
pirocarbonato Qiagen) directamente a la membrana de la columna Cerrar
suavemente la tapa y centrifugar por 1 min a 8000 x g (10000 rpm) para eluir
el ARN
12 Repetir el paso 11
127
64 Protocolo de digestioacuten PCR-RFLPs
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Volumen del componente
para 15 microL de mezcla
Producto de PCR 8 μl
Buffer de la enzima 1 (1X) 1 5 μl
Buffer de la enzima 2 (1X) 1 5 μl
Enzima de restriccioacuten 1 2 μl
Enzima de restriccioacuten 2 2 μl
Volumen total 15 μl
2 Incubar las muestras al bantildeo Mariacutea a 37degC por 12 h-24 h
3 Ralizar el anaacutelisis en gel de agarosa al 25
128
65 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa RT M-
MuLV para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del componente
para 20 microL de mezcla
Agua bi-destilada 05 microL
PBST (05) 004 15 microL
Buffer RT M-MuLV 5X 1X 4 microL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 microL
dNTPs 10 mM 1 mM 2 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 1 microM 2 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa M-MuLV 20 UmicroL 05 microL
ARN 5 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
129
66 Protocolo de Retrotranscripcioacuten con la enzima Transcriptasa Reversa
Maximareg para muestras de ARN
1 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 20 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 95 microL
Buffer RT Maacutexima 5X 1X 4 microL
dNTPs 10 mM 05 mM 1 microL
Primer especiacutefico R 10 microM 05 microM 1 microL
Inhibidor de ARNasa 40 UmicroL 05 microL
Retro-transcriptasa Maximareg 200 UmicroL 1 microL
ARN 3 microL
Volumen total 20 microL
2 Mezclar y centrifugar suavemente
3 Incubar el tubo de PCR a 50degC por 30 min terminar la reaccioacuten por
calentamiento a 85degC durante 5 min en el termociclador
130
67 Protocolo para PCR de Sss con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes de
descongelar
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25 microL
de mezcla
Agua bi-destilada 146 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 25 mM 02 mM 2 microL
Primer F 10 microM 05 microM 125 microL
Primer R 10 microM 5 microM 125 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 04 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN Molde 1microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Condiciones del ciclo de la PCR para Sss
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 55 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
131
68 Protocolo para PCR de PMTV con la enzima Taq Polimerasa
1 Se mezcla suavemente y se centrifugan brevemente todas las soluciones despueacutes del
descongelamiento
2 Preparar la mezcla de la reaccioacuten
Componente Concentracioacuten
final
Volumen del
componente para 25
microL de mezcla
Agua bi-destilada 158 microL
Buffer Taq 10X (NH4)2 SO4 1X 25 microL
dNTPs 10 mM 02 mM 05 microL
Primer F 10 microM 2 microM 05 microL
Primer R 10 microM 2 microM 05 microL
BSA 20 mgmL 016 mgmL 02 microL
ADN Taq Polimerasa 5UmicroL 02 microL
MgCl2 25 mM 18 mM 18 microL
ADN copia 3 microL
Volumen total 25 microL
3 Realizar un vortex suave y centrifugar brevemente la muestra para colectar las gotas
de las paredes del tubo
4 Colocar las muestras en el termociclador e iniciar la PCR
Paso Temperatura
(degC) Tiempo Ciclos
1 Desnaturalizacioacuten
inicial 98 3 min
2 Desnaturalizacioacuten 94 30 s
3 Anillamiento 53 45 s
4 Extensioacuten 72 1 min
volver al
paso 3 40
veces
5 Extensioacuten final 72 10 min
134
7 CONCLUSIONES GENERALES
En este estudio se encontroacute que las poblaciones Colombianas de Spongospora subterranea
f sp subterranea (Sss) presentan una estructura baacutesica consistente en tres tipos geneacuteticos
(I II y III) El subgrupo III difiere de los reportados mundialmente como Tipo I y Tipo II
en 5 y 2 respectivamente El Tipo III presentoacute la mayor proporcioacuten de aislamientos de
Sss en este estudio con cepas de diferentes departamentos hospedantes y tejidos
sintomaacuteticos mientras que el Tipo I no fue encontrado en muestras procedentes de agallas
de raiacutez Es necesario evaluar el significado bioloacutegico de estas variantes de Sss bajo las
condiciones agroecoloacutegicas de las regiones cultivadoras de papa en Colombia asiacute como su
epidemiologiacutea y capacidad para la transmisioacuten de PMTV
Los anaacutelisis de RFLPs de regiones ITS del ADNr de Sss demostraron polimorfismos en los
sitios de corte de las enzimas Hin6I y Bsp143I Se confirmoacute que la digestioacuten con la enzima
Hin6I diferencioacute los aislamientos de los Tipos I y II de aquellos del Tipo III mientras que
el corte con la enzima Bsp143I separoacute a los miembros de los Tipos I y II permitiendo
separar los tres principales grupos definidos por el anaacutelisis filogeneacutetico de Sss Los
resultados obtenidos sugieren la viabilidad de plantear un meacutetodo de diagnoacutestico que
permita identificar los principales genotipos del patoacutegeno en el paiacutes y de esta forma apoyar
los programas de mejoramiento geneacutetico vigilancia cuarentenaria y certificacioacuten de
tubeacuterculo-semilla
El anaacutelisis filogeneacutetico para el gen CP de PMTV permitioacute separar dos grupos de
aislamientos del virus El primer clado agrupoacute todas las secuencias de referencia mundial
con 19 de los aislamientos Colombianos obtenidos en este estudio que presentaron niveles
de identidad superiores al 99 El segundo clado presentoacute exclusivamente secuencias de
cepas Colombianas incluyendo dos de las reportadas en investigaciones previas y seis
obtenidas en el presente estudio con niveles de variacioacuten del 11 al 13 y con una identidad
de tan solo 76 con respecto a los miembros del primer clado Estos resultados confirman
la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia que no ha sido registrada en otros
Osorio 2012
135
135
lugares del mundo Es necesario estudiar el efecto de ambos genotipos virales sobre la
produccioacuten y calidad del tubeacuterculo semilla de papa en Colombia de manera que se generen
tecnologiacuteas para la deteccioacuten de PMTV en los programas de certificacioacuten de semilla y de
mejoramiento geneacutetico de papa que se adelantan en el paiacutes
En el anaacutelisis de las regiones parciales de CP y CP-RT del ARN2 y TGB del ARN3 de
PMTV sensu stricto se encontraron niveles muy altos de identidad en las tres regiones
estudiadas siendo la CP la maacutes uniforme Para TGB se encontroacute que todos los aislamientos
compartieron un 999 de identidad en nt y aa Asiacute mismo los anaacutelisis filogeneacuteticos para el
ARN 2 y ARN 3 de aislamientos Europeos y Colombianos demostraron que los niveles de
identidad entre ambos grupos fueron muy altos gt975 para ARN 2 y gt967 para el
ARN 3 Estos bajos niveles de variacioacuten permiten inferir que este virus se encuentra bajo
fuertes presiones de seleccioacuten determinadas presumiblemente por las propias caracteriacutesticas
de su genoma el estrecho rango de hospedantes y su transmisioacuten persistente y especiacutefica
por parte de su vector Sss Sin embargo a pesar de los altos valores de uniformidad general
encontrados la presencia de inserciones de hasta 12 nt (4 aa) en las secuencias de CP de los
aislamientos colombianos de PMTV resulta interesante para el desarrollo de
investigaciones que permitan determinar si se trata de adaptaciones del genoma viral a las
variedades nativas de papa que se cultivan en nuestro paiacutes o a las caracteriacutesticas propias de
las poblaciones de Sss en las regiones Andinas
NS1P Pasto (Nar) Suelo S tuberosum
