vasculopathie de transplantation modèles expérimentaux...
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THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par
l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Physiologie, Physiopathologie
JURY
Mme Anne Nègre-Salvayre - Directeur de recherche CNRS - Toulouse. Mr Gilles Blancho - Professeur des Universités / Praticien Hospitalier - Nantes Mr Yvon Lebranchu - Professeur des Universités / Praticien Hospitalier - Tours.
Mr Lionel Rostaing - Professeur des Universités / Praticien Hospitalier - Toulouse (Président du Jury). Mr Nassim Kamar - Maître de conférence universitaire / Praticien Hospitalier - Toulouse
(Membre invité). Mr Mogens Thomsen - Directeur de Recherche INSERM - Toulouse (Membre invité).
Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologie
Unité de recherche : INSERM U858 - équipe 10 - Athérosclérose et artériosclérose de greffe. Directeur(s) de Thèse : Anne Nègre-Salvayre - Mogens Thomsen.
Rapporteurs : Yvon Lebranchu - Gilles Blancho.
Présentée et soutenue par Sylvain GALVANI Le 10 février 2010
Titre : Vasculopathie de transplantation
Modèles expérimentaux, étude du rôle des alloanticorps anti-HLA et implication de la voie MMP/sphingomyéline-Céramide
A ma famille
RemerciementsJ’adressemessincèresremerciementsauxProfesseursGillesBlanchoetYvonLebranchu
quiontacceptéd’êtrelesrapporteursdecemanuscrit.Jesuistrèshonorédel’interêtque
vous avez porté à mon travail et je vous remercie d’avoir participé à cette journée
importantepourtoutétudiant.
JetienségalementàremercierleProfesseurRobertSalvayreetleDrAnneNègre-
Salvayre.Mercidem’avoirpermisderéalisercetravailauseindevotreéquipe,dem’avoir
faitpartagévotrepassionpourlarechercheetlascience.Jetiensplusparticulièrementà
vousremercierpourvotregrandehumanité,votrepatience. Ilestrare detrouverdes
directeurs de laboratoire avec qui l’on est capable de discuter de tout, que ce soit de
science, demusique, de culture,mais aussi despetits tracasquotidiens.Vous êtes ces
personnesavenantes,auregardprotecteuretàl’oreilleattentive,ayanttoujoursunmot
gentil,capabledenousréconforterentoutesconditions.C’estunequalitéquifaitquece
laboratoireestunegrande familledontvousenêtes lesprotecteurs.Merciaussipour
toute l’attentionquevousm’avezportédurant toutes ces années jusqu’à l’écrituredu
manuscrit, les soirées dans le bureau de Robert à travailler sur les photos
d’immunohistologie, à retravailler les figures des publications pour atteindre la
perfection et bien d’autres choses qui font que je quitte ce laboratoire avec un fort
pincementaucœurmaisavecledésirfortdereveniraprèsmonpost-docafindecontinuer
àtravailleretapprendreàvoscotés.
JetiensàremercierleDrMogensThomsenpourm’avoirpermisdetravaillersurunsujet
aussipassionnantquelespathologiesdelatransplantation,enmelaissantbeaucoupde
libertédansmontravailetdanslesaxesderecherchesquenousavonsabordés.Jevous
remercie pour la confiance que vous m’avez accordé dès le départ de ce projet, en
espérantquej’aipurelevercefabuleuxdéfidecomprendreunpeumieuxlavasculopathie
detransplantation.
Jeremercieégalementlescliniciensquiontacceptédecollaboreravecnous:
-LeProfesseurLionelRostaingd’unepartd’avoiracceptédefairepartidemonjuryde
thèse et d’avoir accepté d’en être le président, d’avoir toujours cru en ce projet, me
permettant de vivre en n’ayant qu’à me soucier de faire avancer mes recherches, de
m’avoirpermisdefairepartidediversclubsderéflexions,participeràdescongrèsde
transplantations.Merciaussipourvotregénérositétoutaulongdecettethèse.Jevousen
suistrèsreconnaissant.
-LedocteurNassimKamar,poursonimplicationdansleprojet,lesnombreusesfoisouje
suisvenutevoirpourparlerdetoutsaufdescience,tonapportcliniquenonnégligeable,
monpremiercongrèsàTunisoùtum’asprissoustonailelorsquejetremblaispourma
présentation,ettoutcelamalgréunemploidutempsdefounetelaissantpasdemoment
libre.Mercibeaucoup.
Jeremercieaussil’équipeauseindelaquellej’aipasséquatreannéesetdespoussières
formidablesàfairedelasciencedanslabonnehumeur.
Résumé
RÉSUMÉ
Les progrès récents en transplantation sont le résultat de nouvelles techniques de conservation des organes, d'une meilleure évaluation de la compatibilité entre donneur et receveur et de nouvelles thérapies immunosuppressives, associées à un suivi pharmacologique plus précis des patients transplantés. Ces progrès ont considérablement diminué le risque de rejet à court et moyen terme des organes transplantés, mais le rejet chronique, et plus particulièrement la vasculopathie de transplantation (ou vasculopathie de greffe) reste une cause importante de perte de greffon à long terme. Cette vasculopathie se développe chez environ 50% des patients transplantés cardiaques dans les 5 ans qui suivent la transplantation.
La vasculopathie de greffe, aussi nommée artériosclérose de greffe, se caractérise par un épaississement concentrique des artères du greffon, conduisant à une sténose artérielle diffuse qui induit une ischémie progressive de l’organe transplanté et peut aboutir à la perte du greffon. La pathogénèse de la vasculopathie de greffe n’est pas clairement établie, mais semble impliquer des mécanismes immunitaires et non immunitaires, comme l’ischémie-reperfusion, l’inflammation, les infections virales, l’hypertension… Des études cliniques suggèrent l’importance des anticorps dirigés contre les molécules HLA de classe I dans le développement des lésions, mais le rôle et le mécanisme d'action de ces anticorps restent encore débattus.
L’objectif de cette thèse était de mettre au point un modèle expérimental permettant de reproduire in vivo les lésions de vasculopathie de transplantation et d’évaluer le rôle des anticorps anti-HLA dans la pathogénie de cette vasculopathie.
L’utilisation d’un modèle animal de souris immunodéficientes greffées avec des artères mésentériques humaines et injectées hebdomadairement avec des anticorps anti-HLA nous a permis de démontrer qu’in vivo, les anticorps anti-HLA, en l’absence de système immunitaire fonctionnel, sont mitogènes sur les cellules musculaires lisses vasculaires, entraînant la formation d’une néointima caractéristique de la vasculopathie de transplantation.
Nous avons ensuite étudié la signalisation impliquée dans l'effet mitogène de ces anticorps anti-HLA. Nous avons ainsi pu montrer que les anticorps anti-HLA activent une voie de signalisation mitogène de stress, passant par l’activation de métalloprotéases (MT1-MMP et MMP-2) et de la sphingomyélinase neutre de type 2 (nSMase2). L’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique spécifique de MMP-2 et MMP-9, le Ro28-2653, inhibe non seulement MMP-2, mais aussi la nSMase2 in vitro et ex vivo et permet une réduction de l’épaississement néointimal in vivo. Ces données mettent en avant le rôle de MMP-2, de la nSMase2 et de la sphingosine kinase dans le signal mitogène induit par les anticorps anti-HLA, proposant ainsi de nouvelles cibles thérapeutiques.
En conclusion, nos résultats apportent des données nouvelles sur l’implication des anticorps anti-HLA dans la vasculopathie de transplantation, via l’activation d’une voie mitogène de stress impliquant les métalloprotéases et des médiateurs sphingolipidiques.
Summary
SUMMARY
Recent advances in transplantation by the use of new immunosuppressive drugs, progress
in organ preservation, and better monitoring of transplanted patients have considerably
improved the short and medium term outcomes of organ allograft. However, chronic rejection
also termed allograft arteriosclerosis associated with transplant vasculopathy remains a major
concern leading to the loss of graft in 50% of heart-transplanted patients by 5 years after
transplantation.
Transplant vasculopathy is characterized by diffuse and concentric intimal hyperplasia
leading to arterial stenosis, chronic ischemia, and functional loss of transplanted organ.
Pathogenesis involves immunological events and non-immunological mechanisms, including
ischemia-reperfusion, inflammation, viral infection, or hypertension. Immunological
mechanisms are thought to implicate both cellular and humoral immunity, but the relative
importance of cellular versus humoral alloreactivity for TA is still disputed. Increasing numbers
of clinical studies underline the importance of antibodies against HLA class I in the
development of graft arteriosclerosis.
This work aims to decipher the precise role of HLA antibodies in the pathogenesis of
transplant vaculopathy and how do they provoke smooth muscle cells proliferation. Our studies
were done in a model of human arteries grafted in immunodeficient SCID/beige mice injected
with anti-HLA antibodies and also on explanted human mesenteries arteries rings and on
smooth muscle cell line.
Our results have shown that HLA antibodies are mitogenic on smooth muscle cells through
the activation of MMP-2 and neutral SMase-2 signalling pathway. The MMP inhibitor Ro28-
2653 blocked these activations and the mitogenic effect of anti-HLA antibodies in vitro on
cultured cells and ex vivo in human arterial sections. Moreover the same activations can be
observed on human grafted mesenteric arteries in immunodeficient SCID/beige mice. This
neointimal thickening can be reversed by oral gavage of mice by Ro28-2653, highlighting the
crucial role for HLA, MMP-2 and the nSMase 2 in transplant vasculopathy.
Our works open new perspectives about transplant vasculopathy and lead to a better
knowledge of this pathology.
Liste des abréviations
LISTE DES ABRÉVIATIONS
ADN : Acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire Ag : Antigène ALG : Anti Lymphocyte Globulin AP-1: Activator Protein 1 ARN: Acide ribonucléique ARNm: ARN messager ATG: Anti-Thymocyte Globulin ATP: Adénosine Tri Phosphate ß2m: ß2 microglobuline CCR: C-C Chemokine Receptor CD : Cluster de différenciation CMH: Complexe Majeur d’Histocompatibilité CML: Cellule Musculaire Lisse CMV: Cytomégalovirus COX: Cyclo-oxygénase CPA: Cellule Présentatrice de l’Antigène CTL: Cytotoxic T Lymphocytes DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium 4E-BP1: Facteur 4E-Binding Protein ERK: Extracellular signal Regulated Kinase eNOS: Endothelial NO synthase EROs: Espèces Réactives de l’Oxygène FAK: Focal Adhesion Kinase FGF: Fibroblast Growth Factor FGFr: FGF receptor FKBP: FK 506 Binding Protein HLA: Human Leukocyte Antigen HMG-coA: Hydroxy-méthyl-glutaryl-coenzyme A H2O2: Peroxide d’hydrogène HRP: Horse Raddish Peroxydase Hsp: Heat Shock Protein ICAM: Inter Cellular Adhesion Molecule IFNg: Interféron g Ig: Immunoglobuline IL: Interleukine LDL: Low Density Lipoprotein MAPK: Mitogen Activated Protein Kinase MCP: Macrophage Chemoattractant protein MIC-A: MHC Class I related chain A MMF: Mycophénolate Mofétil MMP: Matrix MetalloProteinase
MT-MMP: Membrane Type Matrix MetalloProteinase mTOR: Mammalian Target of Rapamycine mTORC: mTOR complex NFAT: Nuclear Factor of Activated T cell NFkB: Nuclear Factor kB NK: Natural Killer NO: Monoxyde d’azote NOD: Non obese diabetic nSMase: Sphingomyélinase neutre PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell PCNA: Proliferating Cell Nuclear Antigen PDGF: Platelet-Derived Growth Factor PI3K: Phosphatidylinositol-3-kinase RCV: Rejet chronique vasculaire RLO: Radicaux libres oxygénés RPMI: Roswell Park Memorial Institute Medium RT PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SCID: Severe Combined Immunodeficiency siRNA: small interfering ribonucleic acid SK: Sphingosine Kinase S6K: p70 S-6-Ribosomal Kinase SM: Sphingomyéline S1P: Sphingosine-1-Phosphate S1P1-5 R: Sphingosine-1-Phosphate receptor 1-5 S6RP: S6 Ribosomal Protein SVF: Sérum de Veau Fœtal TGFb: Transforming Growth Factor b Th: Lymphocytes T helper TIMP: Tissue Inhibitor of MMP TNFa: Tumor Necrosis Factor a VAP: Vascular Adhesion Protein VCAM: Vascular Cell Adhesion Molecule VT: Vasculopathie de Transplantation XID: X-linked ImmunoDeficiency
Liste des figures et tableaux
LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX
Figure 1 : Carte physique de la région chromosomique HLA p.13
Figure 2 : Structure des molécules HLA de classe I et II p.14
Figure 3 : Organisation de la paroi artérielle p.24
Figure 4 : Coupe histologique d’artère saine et d’artère pathologique p.25
Figure 5 : Les différents types de remodelage vasculaire p.26
Figure 6 : Macrophages et cellules T dans la vasculopathie de transplantation. p.30
Figure 7 : Schéma des différentes étapes conduisant à la VT p.30
Figure 8 : Effets des chémokines sur le développement de la VT p.32
Figure 9 : Effet de la liaison anticorps anti-HLA/ HLA et voies de signalisation p.36
Figure 10 : Collaborations et interactions des différents facteurs dans la VT p.37
Figure 11 : Voies de signalisation mitogène induite par les LDL oxydées sur CMLs p.41
Figure 12 : Procédure de greffe d’artère mésentérique p.56
Figure 13 : Structure des différentes MMPs p.77
Figure 14 : Schéma d’activation de MMP-2 par le complexe MT1-MMP/ TIMP p.78
Figure 15 : Métabolisme sphingolipidique p.119
Figure 16 : Récepteurs à la S1P et signalisation cellulaire p.122
Figure 17 : Effet des anticorps anti-HLA sur l’activité SK et la prolifération p.123
Figure 18 : Analyse de l’activité SK1 sur segment d’artère mésentérique p.124
Figure 19 : S1P/S1PR sous l’effet des anticorps anti-HLA p.124
Figure 20 : HLA, ERK1/2, et inhibiteurs de la S1P p.125
Figure 21 : Dosage S1P et effet du KRP in vivo p.126
Figure 22 : Schéma récapitulatif de la voie de signalisation médiée par les anti-HLA p.131
Tableau 1 : Quelques dates historiques de la transplantation p.11
Tableau 2 : Les différents immunosuppresseurs p.21
Tableau 3 : Traitements possibles en cas de vasculopathie de transplantation p.42
Tableau 4 : Modèles murins mutants p.46
Tableau 5 : Modèles animaux issus de mutations combinées p.46
Tableau 6 : Liste des MMPs et noms usuels p.77
Tableau 7 : Les différents inhibiteurs pharmacologiques des MMPs p.80
Tableau 8 : Les différents récepteurs à la S1P p.121
Tableau 9 : Effet de la S1P sur divers types cellulaires p.128
Sommaire
SOMMAIRE I. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1. La Transplantation 9
1.1 Définition de la transplantation 1.2 Historique de la transplantation 1.3 Les différents types de greffe
2. Rejet de Greffe 12
2.1 Les différents antigènes impliqués dans le rejet 2.1.1 Le système ABO 2.1.2 Molécules du CMH humain et antigènes HLA 13
2.1.2.1 Les molécules HLA de classe I classiques et non classiques 14 2.1.2.2 Les molécules HLA de classe II classiques et non classiques 16
2.1.3 Les antigènes mineurs 17
2.2 Les divers types de rejet de greffe 17 2.2.1 Le rejet hyperaigu 2.2.2 Le rejet aigu 18
2.2.2.1 Le rejet aigu cellulaire 2.2.2.2 Le rejet aigu humoral 19 2.2.2.3 Traitements immunosuppresseurs en prévention du rejet aigu
2.2.3 Le rejet chronique : rejet parenchymateux et vasculaire 21
3. Vasculopathie de Transplantation 23
3.1 Généralités
3.2 Histologie 3.2.1 Structure histologique de la paroi artérielle normale 3.2.2 Altérations histologiques au cours de la VT
24 3.3 Mécanismes physiopathologiques 26
3.3.1 Les agents agresseurs des artères du greffon 3.3.1.1 Facteurs non immunitaires 3.3.1.2 Facteurs immunitaires 28
3.3.1.2.1 Immunité cellulaire, cytokines et chimiokines 3.3.1.2.2 Immunité humorale 32
3.3.2 La réponse des cellules vasculaires aux agents de stress 38 3.3.3 Approches thérapeutiques
42 3.4 Modèles d’étude de la VT 44
3.4.1 Historique 3.4.2 Modèles animaux mutants 45
II. HYPOTHÈSES DE TRAVAIL ET OBJECTIFS 49
III. MATÉRIEL ET MÉTHODES 52
1. Produits et réactifs 53 2. Lignées et culture cellulaire 53 3. Animaux et sélection des animaux « non leaky » 54 4. Obtention des artères humaines et protocole chirurgical de transplantation 55 5. Analyse morphométrique des greffons 56 6. Mesure des activités enzymatiques 57
6.1 MT1-MMP et MMP-2 6.2 Sphingomyélinase neutre 58 6.3 Sphingosine Kinase 1
7. Évaluation de la prolifération cellulaire 59 8. Western blot 59
8.1 A partir de cellules en culture 8.2 A partir d’artères humaines 60
9. Évaluation de la toxicité 60 9.1 Test MTT 9.2 Microscopie à fluorescence après marquage par Syto 13/IP 61
10. Transfection par siRNAs 61 11. RT-PCR Quantitative 61 12. Dosage des protéines 62 13. Immunohistochimie, Immunofluorescence et Immunocytochimie 62 14. Analyses statistiques 63
IV. RESULTATS 64
1. HLA Class I antibodies provoke graft arteriosclerosis in human arteries transplanted into SCID/ Beige mice. 1.1. Introduction 65 1.2. Article 66 1.3. Discussion 74
2. A key role for matrix metalloproteinases and neutral sphingomyelinase-2 in transplant
vasculopathy triggered by anti-HLA antibody. Protection by MMP inhibitors. 2.1 Introduction 76 2.2 Article 81 2.3 Discussion 116
3. Sphingosine kinase, sphingosine-1-P et vasculopathie de transplantation.
a. Introduction 119 b. Résultats 123 c. Discussion 127
V. CONCLUSIONS GÉNÉRALES 130 VI. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 135 VII. ANNEXES 156
Revue Générale
Revue Générale, Chapitre 1 : La transplantation
1
1. LA TRANSPLANTATION.
1.1. Définition de la transplantation.
La transplantation (trans = au-delà de, plantare = planter) est un geste chirurgical
permettant de remplacer un organe défaillant par un organe sain afin de suppléer à un déficit
fonctionnel et systémique de l’organe malade. A noter que le terme transplantation désigne le
transfert d’un organe entier avec anastomoses vasculaires chirurgicales, tandis que le terme
greffe s’applique au transfert de cellules, d’un tissu ou d’une partie d’un organe sans
anastomoses vasculaires chirurgicales (par exemple greffe de moelle osseuse, d’îlots de
Langerhans, cornée). Dans le langage courant, les deux termes, greffe et transplantation, sont
souvent utilisés indifféremment.
La transplantation se heurte à diverses difficultés, conservation et ischémie du greffon,
anastomose entre le réseau vasculaire de l’organe greffé et le système vasculaire du receveur,
rejet de l'organe greffé par l’organisme receveur qui reconnaît le greffon comme étranger,
traitement immunosuppresseur avec ses difficultés liées à l'efficacité incomplète et aux
complications.
1.2. Historique de la transplantation.
Le terme de transplantation apparaît dès le IIIème siècle. Une fresque peinte au XVème siècle
sur le mur du couvent San Marco à Florence représente la transplantation d’une jambe par Saint
Côme et Saint Damien (devenant les pionniers de la transplantation et les saints patrons des
médecins et chirurgiens). Il faudra attendre la fin du XIXème et le XXème siècle pour voir
apparaître les premiers essais cliniques de transplantation et de greffes chez l’homme.
Un bref historique est présenté dans le tableau 1 qui résume l’amélioration des
techniques et problèmes liés à la transplantation chez l’Homme. Notons que de nombreuses
avancées sont liées à des expérimentations réalisées au préalable sur des modèles animaux (non
présentées dans le tableau).
1.3. Les différents types de greffe.
La nature de la relation génétique reliant donneur et receveur permet de classer les
greffes en différents groupes.
Revue Générale, Chapitre 1 : La transplantation
2
v L’autogreffe se définit comme le transfert d’un organe ou d’un tissu, d’un site vers un autre
site au sein d’un même individu. Il s’agit d’une greffe au cours de laquelle le greffon est
prélevé sur le sujet lui-même. Elle est généralement pratiquée sur des personnes souffrant
de maladies sanguines, dans le cadre de certains cancers ou lors de pertes cutanées
importantes (grands brûlés) où des explants sont prélevés sur l’individu pour « couvrir » les
zones brûlées. Dans le cadre des maladies sanguines, avant traitement, des cellules
sanguines sont prélevées, purifiées, congelées, et réinjectées une fois les différents
traitements effectués.
v L’isogreffe concerne la transplantation d’organes ou de tissus entre individus
génétiquement identiques. C’est par exemple le cas de la greffe de rein à partir d’un donneur
vivant, jumeau homozygote du receveur mais aussi lors de greffes entre animaux
syngéniques.
v L’allogreffe représente la majorité des greffes d’organes réalisées actuellement. Il s’agit
d’une transplantation entre les membres d’une même espèce, mais génétiquement
différents. C’est le cas habituel des transplantations d’organes.
v La xénogreffe concerne la greffe entre membres d’espèces différentes. Classiquement on
considère comme xénogreffe, ou hétérogreffe, la transplantation de tissus, d’organes ou
cellules d’un animal (singe ou porc) chez l’homme. De telles transplantations restent rares
(une vingtaine réalisée à ce jour). Elles sont très étudiées car elles permettraient de disposer
d’un « réservoir » d’organe conséquent. Elles suscitent toutefois de nombreuses
interrogations sur la faisabilité, sur l’impact des manipulations génétiques des animaux
donneurs (nécessaires pour obtenir une compatibilité acceptable), sur la transmission
possible de virus entre animaux et humains et posent des questions éthiques.
Enfin, en fonction de la position de la transplantation on distingue les transplantations
orthotopiques (dans le cas où l’organe est transplanté en lieu et place de l’organe à remplacer,
comme par exemple lors de transplantation cardiaque), et les transplantations hétérotopiques
au cours desquelles, l’organe est implanté dans une zone anatomique distincte de la zone
naturelle de l’organe (par exemple dans lors de transplantation rénale).
Revue Générale, Chapitre 1 : La transplantation
3
Tableau 1 : Évolution des connaissances sur la transplantation entre le XIXe et le XXIe siècle
Année Essais Avancées réalisées Auteurs
1869 1ère greffe cutanée, réalisée à partir d’autogreffes de peau 1ère greffe de l’ère moderne J. Reverdin
1906
Xénogreffe rénale chez l’Homme. Transplantation d’un rein de porc sur le bras d’une femme à Décès
de la patiente
Spécificité liée à l’espèce. Les receveurs ne tolèrent pas
des organes provenant d’organismes étrangers
M. Jaboulay
1933
1ère transplantation de rein prélevé sur un cadavre à Rejet et décès
de la patiente 4 jours après la greffe.
Le rejet est un phénomène immunologique S. Voronoy
1949 Découverte d’anticorps dirigés
contre les globules blancs dans le sang de patients polytransfusés
Premières bases de l’immunologie J. Dausset
1952
1ère transplantation rénale avec donneur vivant (mère du
patient) à Décès 21 jours plus tard
Mise en évidence du rôle majeur des critères de compatibilité tissulaire
J. Hamburger
1954
Apparition des premiers immunosuppresseurs
Laboratoires Wellcome
1957
Découverte du Système HLA Prix Nobel de médecine 1980 J. Dausset
1967 1ère transplantation cardiaque réalisée en Afrique du Sud
C. Barnard
1968 1ère transplantation cardiaque en France
C. Cabrol
1969 1ère transplantation pulmonaire sur
un condamné à mort atteint de cancer du poumon
J. Hardy
1969 1ère transplantation hépatique à Décès du patient 1 mois plus tard
P.J. Kestens J.B. Otte
1998 Transplantation de main
JM. Dubernard
2005 1ère transplantation de visage Récupération de la sensibilité du greffon et d’une motricité
JM. Dubernard
2008 1ère transplantation des deux bras
sur une personne amputée à Munich
C. Höhnke
Revue Générale, Chapitre 2 : Le rejet de greffe
5
2. REJET DE GREFFE.
Le rejet de greffe se définit comme l’ensemble des événements physiopathologiques
développés par le receveur contre le greffon, conduisant à la destruction de l’organe greffé. En
l’absence de traitement, la greffe allogénique d’un organe provoque, de manière inéluctable une
réponse immunitaire conduisant au développement d’un rejet et à la perte de l’organe greffé
reconnu par le système immunitaire comme étranger à l’organisme receveur.
2.1. Les différents antigènes impliqués dans le rejet.
Au sein d'une espèce, les individus présentent un polymorphisme de leurs constituants
tissulaires (se traduisant par des différences de structure moléculaire). Une molécule (d’un
greffon) peut devenir antigénique chez des sujets receveurs du greffon qui ne possèdent pas la
même structure moléculaire. Ces antigènes tissulaires (potentiels) codés par des gènes
alléliques, et exprimés à la surface des membranes cellulaires, définissent les systèmes
d’histocompatibilité. Les antigènes du greffon peuvent donc être la cible du système
immunitaire du receveur et sont à l’origine du rejet de greffe.
Les principaux antigènes tissulaires sont les antigènes du groupe sanguin ABO, les
antigènes mineurs et les antigènes du système HLA (Human Leukocyte Antigen).
2.1.1. Le système ABO.
Ces antigènes sont présents sur les cellules hématopoïétiques mais aussi sur les cellules
endothéliales ainsi que sur les cellules épithéliales. La transplantation d’un organe ABO
incompatible entraîne un sévère rejet hyperaigu, dû à la présence d’anticorps ABO chez le
donneur, causant des dommages sur les cellules endothéliales du greffon. Ces dommages vont
par la suite entraîner la production de diverses substances, comme des cytokines, des facteurs
chimiotactiques ainsi que des radicaux libres oxygénés accompagnés de l’activation du
complément (Haga et al., 2006), la formation d’un thrombus, ainsi que la migration des
granulocytes et des macrophages et l’activation de la phagocytose (Kawagishi and Satomi,
2008). Différentes stratégies permettent de diminuer les titres en anticorps préformés chez le
receveur. L’aphérèse est couramment utilisée avant la transplantation dans le cadre de
transplantations ABO incompatible et représente une stratégie de choix afin de diminuer le taux
en anticorps anti ABO. De plus des splénectomies peuvent être réalisées durant la
transplantation, afin de diminuer la source de production des anticorps. Plus récemment de
nouvelles approches, en cours d’étude, mettent en jeu dans le cadre de la transplantation
Revue Générale, Chapitre 2 : Le rejet de greffe
6
hépatique la perfusion via la veine porte et l’artère hépatique de molécules telles que les
prostaglandines E1, la méthylprednisolone afin de contrôler la coagulation dans le greffon
(Kawachi et al., 1997; Kawagishi and Satomi, 2008; Tanabe et al., 2002).
2.1.2. Molécules du CMH humain et antigènes HLA
Découverte en 1958 par Jean Dausset (Dausset, 1958), cette famille d’antigène représente
une carte d’identité tissulaire, propre à chaque individu. Ces antigènes HLA permettent de
comprendre la distinction entre le « soi » et le « non-soi », qui constitue un mécanisme essentiel
des défenses immunitaires. Ils sont à l’origine des bases de la transplantation moderne, rendant
possible la compréhension des rejets observés au cours des premiers essais historiques de
transplantation. Les molécules HLA sont présentes à la surface de cellules et jouent un rôle
essentiel dans la réponse immunitaire en présentant les antigènes aux récepteurs des
lymphocytes T cytotoxiques (CD8+) et helper (CD4+). Le système HLA est un système
génétique polymorphique situé sur le bras court du chromosome 6 (cf. Figure 1). Ces gènes
sont localisés au sein du complexe majeur d’histocompatibilité et codent pour diverses
structures (cf. Figure 2).
Figure 1 : Carte physique de la région chromosomique HLA.
Revue Générale, Chapitre 2 : Le rejet de greffe
7
Figure 2 : Structure des molécules HLA de classe I (à gauche) et II (à droite).
2.1.2.1. Les molécules HLA de classe I
Les molécules HLA de classe I sont exprimées à la surface de toutes les cellules nucléées
et servent à présenter des peptides d’origine endogène clivés au niveau du cytosol par le
protéasome en fragments peptidiques qui s’associent aux molécules HLA de classe I dans le
réticulum endoplasmique. Ils se fixent alors dans la poche à peptide de la chaine a des antigènes
de classe I. La molécule HLA de classe I, associée au peptide destiné à être présenté migre alors
à la membrane plasmique.
Au cours de leur surveillance immunitaire, les lymphocytes T CD8+ interagissent par leurs
récepteurs avec ces complexes HLA classe I/peptide porté par la surface de la cellule qui
devient une cible de la fonction cytotoxique de ces lymphocytes, lors d’exposition de peptides
pathogènes ou étrangers par les molécules HLA de classe I.
- Les molécules HLA de classe I classiques.
Les molécules de classe I dites classiques sont codées par les loci A, B, et C. Ces loci
codent pour la chaîne lourde dite α de la structure de la molécule (44 kDa) associée de manière
non covalente, à la surface de la quasi-totalité des cellules, à la β2 microglobuline (β2 m), chaîne
légère non codée par les gènes du CMH. La chaîne lourde α comporte une partie
intracytoplasmique, une partie transmembranaire et une partie extracellulaire composée de trois
domaines α1, α2, α3 (cf. Figure 2). Le rôle fonctionnel majeur de ces molécules est la
présentation de peptides aux lymphocytes T. Ces molécules ont pour fonction la présentation
de protéines intracellulaires aux récepteurs des lymphocytes T cytotoxiques.
Revue Générale, Chapitre 2 : Le rejet de greffe
8
- Les molécules HLA de classe I non classiques.
Les gènes HLA-E, F et G codent pour des structures moléculaires très proches des
molécules HLA de classe I classiques. Elles ont, néanmoins, une distribution tissulaire plus
restreinte, une régulation d’expression différente ainsi qu’un polymorphisme plus limité que
les molécules HLA de classe I classiques. La fonction et le rôle biologique de la plupart de ces
molécules restent mal définis. Contrairement aux molécules de classe I classiques, les
molécules non classiques ne forment pas un groupe structurellement et fonctionnellement
homogène, regroupant des familles de protéines de surfaces découvertes dans différents
contextes et présentant des degrés variables d’homologie de séquences avec les molécules HLA
classiques. Les molécules HLA classe I non classiques ont des modifications de structures
pouvant résulter d’une stabilisation par la ß2-microglobuline, d'une fixation à la membrane par
une ancre glycosylphosphatidyl-inositol (au lieu de segments transmembranaires) ou de
l’absence de cavité de liaison du peptide. Certaines de ces molécules n’ont pas de fonctions
immunitaires mais la plupart sont impliquées dans la présentation d’antigènes non peptidiques
à des classes spécialisées de cellules T ou dans la signalisation de dégâts et anomalies
cellulaires. La molécule de classe I non classique la plus connue est la molécule HLA-G, qui
interviendrait dans la tolérance fœto-maternelle et dans certains cancers (Carosella et al., 2008).
- Les molécules MIC.
MIC-A (MHC class I related Chain A), est un antigène de surface codé par un gène localisé
à proximité du locus HLA-B. Cette glycoprotéine de 62 kDa, joue un rôle dans l’immunité
innée (activation des cellules NK) et présente des homologies avec la molécule HLA sans être
lié à la β2 microglobuline (Bahram et al., 1994). MIC-A est présent sur les cellules
endothéliales, dendritiques, épithéliales et sur les fibroblastes, mais absent de la surface des
lymphocytes du sang périphérique (Zwirner et al., 1999). L’exposition, après transplantation, à
des antigènes MIC allogéniques entraîne la formation d’anticorps spécifiques (Zwirner et al.,
2000) qui peuvent jouer un rôle dans le rejet à long terme de rein transplanté (malgré un cross-
match HLA correct) (Zou et al., 2007). Ces résultats ont été confirmés pour des transplantés
rénaux, pancréatiques et cardiaques (Baid-Agrawal and Frei, 2008; Hankey et al., 2002; Suarez-
Alvarez et al., 2007). La transplantation hépatique s’avère être une exception (Uzunel et al.,
2008).
2.1.2.2. Les molécules HLA de classe II.
Revue Générale, Chapitre 2 : Le rejet de greffe
9
Les molécules HLA de classe II sont localisées de façon constitutive à la surface des
cellules présentatrice de l'antigène professionnelles (cellules dendritiques, lymphocytes B...) et
après activation par l’IFNg à la surface de cellules présentatrices de l’antigène semi-
professionnelles comme les monocytes/macrophages et les cellules endothéliales. Elles
présentent les antigènes extracellulaires qui ont été phagocytés par les cellules présentatrices
de l'antigène et dégradés en peptides et qui se sont associés avec des molécules HLA de classe
II au niveau des endosomes précoces. Les complexes HLA de classe II/peptide migrent à la
surface des cellules présentatrices de l'antigène et interagissent avec les récepteurs des
lymphocytes T auxiliaires (lymphocytes T CD4+) qui sont activés et stimulent la réponse
immunitaire.
D’un point de vue structural, les molécules HLA de classe II sont des hétérodimères
constitués de deux chaînes protéiques distinctes α et β (cf. Figure 3). Ces deux chaînes sont
codées par deux gènes A et B situés dans la région dite de classe II. Les deux chaînes α et β
sont organisées en deux domaines en boucle, connectées par une courte séquence peptidique à
une région transmembranaire et une queue intracytoplasmique. De même que pour les
molécules HLA de classe I on distingue les molécules HLA de classe II dites classiques et les
HLA de classe II non classiques.
- Les molécules HLA de classe II classiques.
Une des particularités des molécules HLA de classe II est leur grand polymorphisme. Trois
isotypes sont représentés chez l’humain, HLA-DR, -DQ et –DP. Ce sont des hétérodimères liés
de manière non covalente, constitués d’une chaîne α de 31 à 34 kDa et d’une chaîne β de 26 à
29 kDa. Les domaines α1 et β1 forment la niche peptidique, ouverte à ces deux extrémités
permettant la présentation de peptides plus longs par rapport aux molécules HLA de classe I.
- Les molécules HLA de classe II non classiques.
Il existe deux types de molécules HLA de classe II non classiques, HLA-DO, et HLA-DM.
Elles sont codées par des gènes HLA de classe II, respectivement DOA et DOB d’une part et
DMA et DMB d’autre part. Les molécules HLA-DM sont faiblement polymorphiques, ne
peuvent pas lier les peptides dans leurs poches de présentation et ne sont pas retrouvées à la
surface des cellules, contrairement aux molécules classiques. Elles sont exprimées dans toutes
les cellules présentatrices d’antigènes et servent à la mise en place du peptide dans la niche
peptidique, et favorisent la fixation de peptides de hautes affinités. Les molécules HLA-DO
sont des protéines non polymorphes, incapables de lier les peptides et non retrouvées à la
Revue Générale, Chapitre 2 : Le rejet de greffe
10
surface des cellules. Elles sont présentes dans les cellules B, les cellules épithéliales thymiques
et dans certaines sous populations de cellules dendritiques. Les molécules HLA-DO fixent et
empêchent l’action de DM en créant un complexe stable DO-DM rendant impossible l’aide à
la fixation de peptides de hautes affinités sur les molécules HLA de classe II classiques.
2.1.3. Les antigènes mineurs.
Dans le cadre de transplantation où le donneur et le receveur ont un HLA identique, mais
diffèrent par d’autres locus génétiques, le rejet de greffe n’est pas aussi rapide. Les antigènes
polymorphes responsables des rejets dans ce type de transplantation sont nommés antigènes
mineurs d’histocompatibilité. Les réponses à ces antigènes sont moins fortes que les réponses
lors d’incompatibilité HLA car la fréquence des lymphocytes T qui les reconnaissent est plus
faible. Les cellules répondant à ces antigènes sont généralement les cellules T CD8+, indiquant
que la plupart des antigènes mineurs sont des complexes de peptides du donneur et de molécules
HLA de classe I. Cependant, des peptides liés aux molécules HLA de classe II peuvent
également provoquer le rejet de greffons compatibles HLA.
Ces antigènes mineurs sont des peptides dérivés de protéines polymorphes. Les molécules
HLA de classe I reconnaissent et présentent une sélection de peptides dérivés de protéines
fabriquées dans la cellule. Si le polymorphisme de ces protéines aboutit à la production de
différents peptides par divers membres d’une même espèce, ils peuvent être considérés comme
antigènes mineurs. De nombreuses protéines se comportant comme des antigènes mineurs sont
codées par le chromosome Y. La nature de la majorité des antigènes mineurs n’est pas connue.
2.2. Les divers types de rejet de greffe.
Il existe trois types de rejet de greffe (rejet hyperaigu, aigu et chronique) qui se distinguent
par l’évolution plus ou moins rapide des phénomènes immunitaires de rejet, et par les
mécanismes physiopathologiques mis en jeu.
2.2.1. Le rejet hyperaigu.
Le rejet hyperaigu survient dans les heures qui suivent la greffe et se caractérise par une
thrombose des vaisseaux du greffon et une nécrose ischémique de l’organe. Il est lié à
l’existence d’anticorps préformés chez le receveur (HLA, ABO). Ces anticorps sont
Revue Générale, Chapitre 2 : Le rejet de greffe
11
majoritairement des anticorps anti-HLA, apparus dans trois circonstances physiologiques ou
pathologiques : grossesse, transfusions ou transplantation antérieure. Après rétablissement de
la vascularisation du greffon, ces anticorps se fixent sur l’endothélium, et entraînent la fixation
et l’activation du complément. Ces anticorps activent également l’endothélium conduisant à
l’expression de molécules d’adhésion et de molécules pro coagulantes (Tilney and Kupiec-
Weglinski, 1991) à l’origine de thrombose et déclenchant ainsi le rejet hyperaigu. Ce rejet
nécessite l’ablation du greffon (transplantectomie) en urgence. Il n’existe pas de traitement
curatif de ce type de rejet.
À l’heure actuelle, son incidence a fortement diminué, (moins de 1% des rejets de greffe),
en raison de sa prévention par cross match qui recherche les anticorps anti-HLA préexistants et
dirigés contre les antigènes du greffon dans le sérum du receveur. Le cross match lymphocytaire
consiste à évaluer la cytotoxicité du sérum du receveur (dépendante du complément) sur des
lymphocytes du donneur. Ce test détecte la présence d'anticorps, IgM ou d'IgG, dirigés contre
les antigènes HLA du donneur. Si le crossmatch est positif, la transplantation ne pourra pas être
réalisée car les anticorps HLA du receveur reconnaissent les antigènes du greffon.
2.2.2. Le rejet aigu.
Le rejet aigu nécessite un temps de mise en place (plus de 5 jours) du système immunitaire
contre les antigènes présents à la surface du greffon. Il se traduit par des symptômes généraux
(fièvre, malaise), fonctionnels et biologiques, et des symptômes dépendant de l’organe greffé
(par exemple, hypertension artérielle, oligurie, diminution de la natriurèse dans le cas de
transplantation rénale). Son diagnostic est réalisé par ponction de l’organe transplanté, et
l’observation des lésions en histologie (Classification de Banff pour la transplantation rénale)
(Solez et al., 2008). Les mécanismes effecteurs responsables du rejet aigu peuvent être de deux
types, cellulaire ou humoral.
Actuellement grâce aux traitements immunosuppresseurs, les épisodes de rejet aigus
surviennent dans moins de 20% des greffes.
2.2.2.1 . Le rejet aigu cellulaire.
Le rejet aigu cellulaire est dû à la reconnaissance par les lymphocytes T du receveur des
antigènes allogéniques du greffon. Il implique les lymphocytes T helper de type 1 (Th1) (CD4+),
les lymphocytes T helper 2 (Th2) et les lymphocytes CTL (CD8+, cytotoxiques) qui
reconnaissent les épitopes HLA présents à la surface des cellules du donneur comme étant du
Revue Générale, Chapitre 2 : Le rejet de greffe
12
non soi. Les tissus transplantés contiennent des populations leucocytaires pouvant jouer le rôle
de cellules présentatrices d’antigènes (CPA), exprimant le type HLA du donneur. Après la
transplantation de l’organe, ces cellules gagnent les ganglions lymphatiques et stimulent les
lymphocytes T et B circulants. Après prolifération et différenciation, les cellules T effectrices
migrent dans l’organe transplanté et attaquent les cellules allogéniques. Ce type de
reconnaissance est capable d’activer fortement et en grand nombre les lymphocytes T, et
entraine un fort rejet aigu (Liu et al., 1993), représentant 90% de l’intensité de la réaction
allogénique. Progressivement les cellules dendritiques du donneur disparaissent, et sont
remplacées par les cellules dendritiques du receveur qui captent au niveau de l’organe greffé
les protéines du donneur et présentent via leurs molécules HLA de classe II des peptides
antigéniques issus du donneur. Cette présentation est la présentation indirecte.
2.2.2.2 . Le rejet aigu humoral.
L’absence d’anticorps anti-HLA spécifique du greffon avant la transplantation chez le
receveur est importante pour le succès de la transplantation car le risque de rejet hyperaigu est
considérablement réduit. Cependant, les anticorps allospécifiques formés après la greffe
peuvent jouer un rôle dans le rejet aigu.
Les premières observations, concernant le rôle des anticorps anti-HLA dans le rejet aigu,
rapportées en 1990 (Halloran et al., 1990), montrent que la synthèse de novo d’anticorps dirigés
contre les antigènes du greffon est associée à un rejet aigu de mauvais pronostic. Le rejet est
suspecté lors de la présence d’anticorps anti-HLA anti-donneur chez le receveur et est confirmé
histologiquement par la présence des dépôts de C4d dans les capillaires du greffon associée à
une forte infiltration de cellules immunitaires T et de macrophages (Collins et al., 1999).
L’activation du complément, associée à un recrutement des neutrophiles in situ, semble jouer
un rôle majeur dans le développement des lésions médiées par ces anticorps et dans la
physiopathologie du rejet (Feucht et al., 1993; Trpkov et al., 1996).
2.2.2.3 . Les traitements immunosuppresseurs en prévention du rejet aigu
Destinées à prévenir ou à réduire le rejet en inhibant la réponse immune, ces différentes
molécules agissent en induisant la déplétion des lymphocytes, inhibant leur activation, ou
bloquant leur prolifération. A l’heure actuelle, il existe trois grandes familles
d’immunosuppresseurs utilisées après transplantation.
Revue Générale, Chapitre 2 : Le rejet de greffe
13
- Les glucocorticoïdes, utilisés depuis les années 60, sont des anti-inflammatoires et des
immunosuppresseurs généraux (qui ne sont pas spécifiques d’un type cellulaire particulier). Ils
inhibent la production de cytokines par les cellules T et les macrophages, bloquant ainsi
l’activation des lymphocytes T ainsi que les dommages tissulaires provoqués par les
macrophages. Cet effet inhibiteur est dû au blocage de l’activation des facteurs nucléaires NF-
kB (Scheinman et al., 1995) et à la fixation des récepteurs des glucocorticoïdes sur les éléments
de réponse aux glucocorticoïdes situés dans la région promotrice des gènes codant pour les
cytokines.
Les corticoïdes sont actuellement moins utilisés dans le suivi thérapeutique des patients
transplantés à cause de leurs effets secondaires induisant entre autre un risque important
d’atteintes cardiovasculaires (Denton et al., 1999) (cf. Tableau 2).
- Les anticalcineurines sont des inhibiteurs de la calcineurine, qui est un médiateur des
signaux d’activation issus des récepteurs des cellules T. Son activité phosphatase est impliquée
dans l’activation de NFAT (facteur nucléaire des lymphocytes T activés), à l’origine de
l’activation de la transcription de nombreux gènes dont ceux codant pour l’IL-2, et l’activation
de voie pro-proliférative, via l’activation du complexe AP-1. De ce fait, les anticalcineurines
(cyclosporine et tacromimus/FK-506) sont des éléments importants dans le maintien de
l’immunosuppression chez les patients transplantés, malgré leurs nombreux effets secondaires
(cf. Tableau 2).
- Les agents antiprolifératifs : acide mycophénolique, et inhibiteurs de mTOR.
L’acide mycophénolique, utilisé depuis les années 1990, agit comme un inhibiteur réversible,
non compétitif de l’inosine monophosphate déshydrogénase (IMPDH), enzyme clé dans la
synthèse de novo de la désoxyguanosine qui est nécessaire pour la synthèse de l'ADN et à la
prolifération des lymphocytes. Il est souvent utilisé en combinaison avec les anticalcineurines.
La Rapamycine/Sirolimus et son dérivé, Everolimus, sont des inhibiteurs de mTOR
(Mammalian Target Of Rapamycin), une sérine thréonine kinase impliquée dans la
signalisation de la voie phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/Akt, qui active la S6-Ribosomal
kinase qui est nécessaire à la progression du cycle cellulaire (Okkenhaug and Vanhaesebroeck,
2003) et la production des cytokines par les lymphocytes T.
Revue Générale, Chapitre 2 : Le rejet de greffe
14
Tableau 2 : Les différents immunosuppresseurs, leurs cibles, actions et effets indésirables.
Molécule Cible moléculaire Effet Effet secondaire
Corticoïdes Récepteurs
cytosoliques et Hsp (Heat Shock Protein)
Bloquent la transcription des gènes
de IL-1, 2, 3,5 et du TNFa
Hypertension, intolérance au
glucose, hyperlipémie.
Cyclosporine
Se lie aux cyclophylines,
inhibe la calcineurine
Inhibe la synthèse d’IL-2, stimule la
production de TGFß.
Hypertension, intolérance au
glucose, hyperlipémie, néphrotoxicité.
Tacrolimus Se lie à FKBP-12,
inhibe la calcineurine
Inhibe la synthèse d’IL-2, et antagonise
le TGFß.
Similaire à la cyclosporine
Acide mycophénolique
Inhibe l’inosine monophosphate déshydrogénase
Bloque la synthèse de novo des bases
purines, sélectivement dans les lymphocytes.
Désordres intestinaux, infection facilités par les CMV.
Sirolimus Lie FKBP-12 mais
pas d’inhibition de la calcineurine
Bloque la synthèse de l’IL-2 induite
Hyperlipémie, toxicité
hématologique
Everolimus Bloque la p70S6 kinase
Inhibe la progression du cycle cellulaire
Idem que le Sirolimus.
2.2.3. Le rejet chronique : rejets parenchymateux et vasculaire.
Le rejet chronique est d’apparition lente et progressive, son incidence étant d’environ 5%
par année suivant la transplantation. Malgré l’identification de facteurs de risques, la
physiopathologie du rejet chronique reste méconnue, mettant en jeu des acteurs
immunologiques et non immunologiques, dont la contribution relative dans le développement
des lésions pathologiques est encore mal définie. On peut distinguer deux types de mécanismes
physiopathologiques du rejet chronique qui concourent à la perte du greffon, caractérisée par
une défaillance fonctionnelle et des altérations histologiques sévères de l’organe greffé : le rejet
chronique parenchymateux, caractérisé par une fibrose du parenchyme de l’organe greffé
déclenchée par le système immunitaire du receveur. Le rejet chronique vasculaire (nommé
actuellement vasculopathie de transplantation, vasculopathie de greffe ou artériosclérose de
greffe) induit une sténose progressive des vaisseaux de l’organe greffé, aboutissant à une
ischémie chronique sévère.
Revue Générale, Chapitre 2 : Le rejet de greffe
15
De très rares cas de rejet chronique parenchymateux isolé (sans vasculopathie) de rein
greffé ont montré des lésions parenchymateuses sans atteinte vasculaire, ce qui suggère que les
deux types d'atteintes (parenchymateuse et vasculaire) sont dus à des mécanismes différents,
au moins en partie. La plupart du temps les lésions parenchymateuses observées découlent de
la combinaison des rejets aigus médiés par les cellules immunitaires et des conséquences
ischémiques de la vasculopathie de transplantation (Mitchell, 2009). De ce fait, le rejet
chronique est plutôt décrit comme vasculaire et non parenchymateux (Libby and Pober, 2001).
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
17
3. VASCULOPATHIE DE TRANSPLANTATION (VT)
3.1 Généralités
Plusieurs termes différents sont utilisés pour désigner cette pathologie : vasculopathie de
greffe ou vasculopathie de transplantation, rejet chronique vasculaire, artériosclérose de
greffe... Dans un souci de clarté nous utiliserons le terme de vasculopathie de transplantation
(VT).
L'atteinte artérielle de la VT survient progressivement au cours du temps dans les greffons,
mais son intensité et ses conséquences fonctionnelles varient beaucoup selon les organes
greffés, la vasculopathie des transplantations cardiaques étant la plus évolutive et la plus grave
sur le plan pronostique, tandis que les transplantations hépatiques semblent peu touchées par la
vasculopathie (Mitchell, 2009).
3.2 Histologie
3.2.1 Structure histologique de la paroi artérielle normale (Figure 3).
La paroi artérielle est constituée de 3 couches cellulaires organisées concentriquement,
l’intima, la média, et l’adventice.
L’intima (ou endartère) est la première couche (en partant de la lumière du vaisseau). Elle
est constituée d’une monocouche de cellules endothéliales reposant sur une membrane basale,
et une mince couche de tissu conjonctif sous-endothélial. Cette première couche cellulaire est
séparée de la média par la limitante élastique interne (constituée de fibres élastiques).
La média représente la couche la plus épaisse des artères musculaires (artères de moyen
calibre). Elle est encadrée par les limitantes élastiques internes (qui sépare la média de l’intima)
et externes (qui sépare la média de l’adventice), épaisses, constituées d’élastine, percées de
fenestrations permettant le passage bidirectionnel de molécules et de cellules d’une couche à
l’autre. La média est constitué d’empilements concentriques lamellaires de cellules musculaires
lisses et d’une matrice conjonctive (contenant de l’élastine, du collagène ainsi que des
mucopolysaccharides). Selon la composition de la média, on distingue deux types artériels :
- Les artères élastiques, constituées majoritairement de fibres élastiques dont le rôle
majeur est d’assurer la compliance artérielle, sont des artères de gros calibres, proches du cœur
(aorte, artères pulmonaires, artères supra-aortiques, artères iliaques)
- Les artères musculaires, dont la média est majoritairement constituée de cellules
musculaires lisses, sont des artères de petit et moyen calibre (entre 2 et 5 mm de diamètre),
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
18
situées généralement loin du cœur (artères fémorales, spléniques, rénales). La pauvreté en fibres
élastiques associées aux cellules musculaires lisses est une composante importante permettant
d’assurer les propriétés vasomotrices de ce type artériel.
L’adventice, troisième couche de la paroi artérielle, est composée d’une couche
conjonctive. Elle contient des fibroblastes, des adipocytes, ainsi que des vasa vasorum jouant
un rôle nutritif.
Figure 3 : Structure de la paroi artérielle. Ici sont représentées les 3 tuniques composant la paroi des artères (illustration obtenue sur le site de l’université de Jussieu www.ann.jussieu.fr)
3.2.2 Altérations histologiques au cours de la vasculopathie de transplantation.
La vasculopathie de transplantation se manifeste par un épaississement de l’intima des
artères (Libby and Pober, 2001). Cette pathologie affecte majoritairement les artères des
greffons mais des lésions similaires peuvent être observées dans les veines.
L’explication de cette tendance à affecter plus facilement les artères pourrait être reliée à
la plus grande quantité de cellules musculaires lisses dans les artères, mais aussi la plus grande
susceptibilité des artères aux lésions causées par les agressions mécaniques (Mitchell, 2009).
Les lésions observées sont caractérisées par une accumulation concentrique de cellules
musculaires lisses et de matrice extracellulaire (cf. Figure 4). Ces lésions sont diffuses sur
l’intégralité du réseau artériel de l’organe transplanté, à l’inverse des lésions d'athérosclérose
qui sont plus localisées (Mitchell and Libby, 2007; Weis and von Scheidt, 2000).
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
19
La structure de la paroi artérielle peut être modifiée lors du développement de l’hyperplasie
néointimale. En effet, bien que les lames élastiques internes et externes restent relativement
intactes, la média peut être complètement remplacée par un tissu fibreux à la suite de l’apoptose
des cellules musculaires lisses (Rahmani et al., 2006).
L’épaississement néointimal peut avoir plusieurs origines : la migration de cellules
musculaires lisses de la média vers l’intima, la prolifération de cellules musculaires lisses
présentes dans l’artère ou provenant de la circulation (Libby and Pober, 2001). Cet
épaississement peut être accompagné d’une infiltration des vaisseaux par des macrophages
(Matheson et al., 2005), des lymphocytes T et B, et de cellules NK (Thaunat et al., 2005;
Thaunat and Nicoletti, 2008).
Figure 4 : Coupe histologique d’artère saine et d’artère présentant des lésions de vasculopathie de transplantation. A : Artère saine ; 1 : Intima, 2 : Média, 3 : Adventice (d’après Atlas d’histologie humaine et animale. B : Artère pathologique ; 1 : Néointima, 2 : Média, 3 : Adventice, d’après (Libby and Pober, 2001). Le marquage réalisé est un marquage Hémalun-Eosine ne permettant pas de mettre en évidence la présence des cellules immunitaires infiltrées.
Parallèlement à cette hyperplasie néointimale, deux autres phénomènes peuvent concourir
à la réduction de la taille de la lumière vasculaire (cf. Figure 5). D’une part, le remodelage
constrictif, rarement retrouvé au cours de la vasculopathie (Schwarzacher et al., 2000), entraîne
un rétrécissement de la lumière à cause d’une inflammation excessive de l’adventice (Lim et
al., 1997) conduisant à une contraction de l’artère et une diminution de la lumière. D’autre part,
la vasoconstriction artérielle (phénomène lié à la dysfonction endothéliale observée lors de la
transplantation) entraine une diminution de la production de monoxyde d’azote (NO) (molécule
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
20
à l’action vasodilatatrice), altérant ainsi l’activité vasomotrice de l’artère (Libby and Pober,
2001).
Figure 5 : Les différents types de remodelages vasculaires conduisant à la diminution de la lumière artérielle lors de la vasculopathie de transplantation. D’après (Mitchell, 2009).
3.3 Mécanismes physiopathologiques
La vasculopathie de transplantation est une pathologie multifactorielle dont les
mécanismes ne sont que partiellement connus et dont la survenue implique de nombreux
facteurs pouvant être classés en facteurs non immunitaires et immunitaires.
3.3.1 Les agents agresseurs des artères du greffon
3.3.1.1 Facteurs non immunitaires
L’hyperlipidémie, et plus particulièrement l’hypercholestérolémie, représente un facteur
aggravant des lésions (Alonso et al., 1977). Fréquente chez les patients transplantés, elle a des
causes multiples, associant aux facteurs génétiques, des facteurs nutritionnels et
pharmacologiques (immunosuppresseurs, en particulier anticalcineurines et glucocorticoïdes)
indépendamment de la nature de l’organe transplanté (rein, cœur, foie… ) (Bellinghieri et al.,
2009; Bianchi et al., 2008; Grady et al., 1991; Taylor et al., 2007). L’hypercholestérolémie
provoque des lésions d'athérosclérose (macrophages spumeux et lésions plus complexes) qui se
surajoutent aux lésions de la vasculopathie de transplantation. Walker (Walker et al., 2009)
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
21
montre que la diminution de dose d’anticalcineurines, associée à une absence de prise de
corticostéroïdes entraine une moindre hypercholestérolémie et diminue l’apparition d’une
vasculopathie de transplantation. Par ailleurs les statines ont un effet hypocholestérolémiant qui
limiterait le développement de rejet à long terme (Aliabadi et al., 2008).
L'ischémie-reperfusion (survenant entre le moment du prélèvement de l'organe et la
transplantation) induit des lésions qui ont été observées chez l’homme lors de transplantations
syngéniques (transplantation entre jumeaux vrais) qui ne subissent pas d'agression immunitaire.
L’interruption de la circulation sanguine lors du prélèvement d’organe entraine l’apparition
d’un métabolisme anaérobie, une forte déplétion en ATP, l’apparition de troubles au niveau des
pompes ATP dépendantes, entrainant de ce fait une entrée de calcium et de sodium à l’intérieur
de la cellule. Cette entrée massive de calcium conduit à une désorganisation du cytosquelette
des cellules aboutissant à leur apoptose. (Allen and Xiao, 2003). Certains facteurs de
transcription nucléaire tels que NFkB sont également induits provoquant une augmentation de
l’expression de gènes pro-inflammatoires. Par ailleurs, l’ischémie du greffon entraine une
activation de l’endothélium suivie par une augmentation de la perméabilité et une expression
accrue de molécules d’adhésion.
Lors de la reperfusion de l’organe, on observe une forte augmentation de la production des
radicaux libres oxygénés et hydroxylés. Ces radicaux peuvent stimuler des molécules de la
famille des sélectines, et induisent des dommages sur les structures intracellulaires tels que les
compartiments membranaires, et les protéines et l’ADN via notamment une hypométhylation
des îlots CpG en particulier au niveau du promoteur des gènes régulant le complément (Parker
et al., 2008).
La dysfonction endothéliale, qui peut survenir lors d'une transplantation, est considérée
comme un facteur aggravant des lésions de vasculopathie de greffe. En effet, la monocouche
endothéliale présente à la surface des vaisseaux intervient dans la régulation du tonus
vasomoteur, le contrôle de la perméabilité, l’extravasation de cellules présentes dans le sang,
ainsi que des fonctions anti-thrombogènes. Sa présence en bordure interne des vaisseaux limite
la prolifération des cellules musculaires lisses sous jacentes (Cines et al., 1998). De ce fait la
dysfonction endothéliale peut entrainer des dérégulations allant de l’altération des fonctions de
vasoconstriction, de vasorégulation, à la régulation de l’inflammation, de l’angiogénèse ainsi
qu’à la régulation de la coagulation (Al-Lamki et al., 2008).
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
22
Des épisodes de rejet aigu durant la première année post-transplantation sont souvent
associés à un développement accéléré d’une de vasculopathie de greffe à plus long terme
(Stoica et al., 2006).
Les infections à cytomégalovirus (CMV) représentent une complication infectieuse
fréquente chez les patients transplantés immunodéprimés. Une infection à CMV peut stimuler
la prolifération des cellules musculaires lisses et la production de facteurs de croissance par les
cellules endothéliales (Kloppenburg et al., 2005; Valantine, 2004; Westphal et al., 2006). Un
des mécanismes impliqués est la production de radicaux oxygénés et le stress oxydant associé
qui activent NFkB (Speir et al., 1996), et stimulent l'expression de COX2 et d’autres gènes pro-
inflammatoires, notamment les molécules d’adhésions, tels que ICAM-1, VCAM-1, VAP1 et
E-sélectine (Kloover et al., 2000; Martelius et al., 2000). Par ailleurs, l’effet mitogène du CMV
sur les cellules musculaires lisses pourrait être lié à la surexpression du récepteur du PDGF-ß
dans les zones infectées par le CMV (Zhou et al., 1999).
L’âge avancé du donneur (de Fijter, 2005) est également un facteur de risque
supplémentaire, les organes prélevés sur des patients âgés (principalement les reins) présentent
plus de risques de rejet aigus et une plus faible capacité de réparation tissulaire.
De plus, l’apparition d’un diabète post-transplantation représente une complication
importante dans la transplantation d’organe. Dépendant du traitement immunosuppresseur
(Johnston et al., 2008), il serait prédictif du rejet, associé aux risques propres du diabète (Miles
et al., 1998; Mollar-Puchades et al., 2009).
3.3.1.2 . Facteurs immunitaires
Le fait que la vasculopathie de transplantation n’affecte que le système vasculaire de
l’organe transplanté et pas celui du receveur indique que la réponse alloimmune (dirigée contre
des antigènes du greffon) joue un rôle prédominant dans la pathogénèse de la vasculopathie.
Pober (Salomon et al., 1991) a émis l’hypothèse que des lésions de faibles intensités au niveau
des cellules endothéliales seraient à l’origine de dommages vasculaires permanents mais pas
assez important pour entrainer un rejet aigu. Les deux versants, cellulaire et humoral de
l’immunité sont impliqués dans cette réponse.
3.3.1.2.1 Immunité cellulaire, cytokines, chémokines
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
23
L’implication de l’immunité cellulaire dans la vasculopathie de transplantation peut être
divisée en 3 phases : Une phase d’activation des lymphocytes T contre les antigènes du donneur,
une phase de recrutement et migration des cellules immunitaires, et une phase effectrice
combinant mort cellulaire et remodelage de la paroi vasculaire. Les principales cellules
impliquées sont :
- Les cellules présentatrices de l’antigène : Elles sont capables de présenter les antigènes aux
lymphocytes T. Plusieurs types cellulaires peuvent assurer cette fonction comme les cellules
dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B. Les cellules endothéliales sont aussi
capables de présenter des antigènes. Dans ce cas, l’absence de molécules de costimulation à la
surface de ces cellules permettant d’activer les cellules immunitaires conduit à des réponses
immunitaires incomplètes mais capables d’induire une vasculopathie de transplantation (Raisky
et al., 2003; Shimizu et al., 2000).
- Les lymphocytes T CD4+, ou T helper participent à la différenciation des cellules T
cytotoxiques, à la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes producteurs d’anticorps.
Les deux sous types, Th1 et Th2, diffèrent selon leur profil de sécrétion de cytokines. Les Th1
sécrétant IFNg, IL2 alors que les Th2 sécrètent l’IL4, IL5 et l’IL13. Les lymphocytes Th1 via
la sécrétion d’IFNg sont responsables de l’activation des macrophages et entrent en jeu dans
l’hypersensibilité retardée (cf. Figure 6). Cette hypersensibilité se développe lentement et
entraine des dommages aux tissus transplantés sans pour autant déclencher un rejet aigu
(Krieger et al., 1996; Shi et al., 1996).
- Les lymphocytes T CD8+ ou T cytotoxiques ou CTLs sont des effecteurs important dans la
vasculopathie de transplantation (Krieger et al., 1996; Libby and Pober, 2001; Shi et al., 1996).
Une fois activées, elles adoptent des propriétés cytotoxiques, devenant capable de lyser les
cellules allogéniques via leur système perforine-granzyme.
Les différentes sous populations lymphocytaires peuvent être stimulées par les antigènes
du greffon selon deux voies (Jiang et al., 2004) :
i/ La reconnaissance indirecte (liaison des récepteurs des cellules T à des fragments
polymorphes des molécules HLA allogéniques présentées par des CPA (cellules présentatrices
de l’antigène) du receveur. Il s’agit d’une conséquence des dommages de l’organe greffé
(découlant, par exemple, de l’ischémie-reperfusion) dont les cellules lésées libèrent des
constituants (incluant les molécules HLA du greffon) qui sont endocytées par les CPA du
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
24
receveur qui les présentent ensuite et interagissent avec des cellules T CD4+ qui produisent
alors des cytokines.
ii/ La reconnaissance semi-directe. Des complexes HLA-I et HLA-II du donneur portant
des peptide allogéniques du donneur et présentés par des CPA (ou des cellules endothéliales)
du donneur sont transférés sur des CPA du receveur (par contact entre des CPA du donneur et
CPA du receveur). Ces complexes transférés vont ensuite interagir et stimuler des T CD8 ou de
T CD4 du receveur. Dans ce cas, les lymphocytes T CD8+ du receveur peuvent être activés
directement par reconnaissance de la molécule HLA du greffon sous sa forme native ou être
stimulés par les T CD4+ activés.
- Les macrophages ont plusieurs fonctions. Capables de présenter l’antigène aux cellules T et
B, ils sont aussi d’importantes sources de cytokines pro-inflammatoires (IL-1, IL-6, TNFa, IL-
12) une fois activés par l’IFNg et favorisent l’activation des cellules T, B et NKs. En outre, par
la production d’EROs et de NO, ils sont capables de créer des lésions tissulaires. Ils peuvent
aussi produire divers facteurs de croissances tels que le PDGF, le TGFß, et des facteurs
chémoattractants tels que MCP-1.
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
25
Figure 6 : Implication des macrophages et des cellules T dans la vasculopathie de transplantation. Les lymphocytes T sont activés par les CPA. Elles produisent alors de l’IFNγ (entre autres) qui peut stimuler les macrophages, activant ainsi leur capacité de présentation de l’antigène permettant la différenciation des lymphocytes en Th1 via la production d’IL-12 et l’augmentation du signal de costimulation. Les macrophages activés ont des effets délétères sur le réseau vasculaire en produisant notamment des protéases, des RLO, de l’IL-1 et du TNFα (augmentant le recrutement des leucocytes et créant un environnement pro-thrombotique), du PDGF et du TGFβ (induisant la prolifération des cellules musculaires lisses et des fibroblastes). Modifié d’après (Mitchell, 2009).
Figure 7 : Schéma des différentes étapes potentiellement impliquées dans le développement de la vasculopathie de transplantation. Dans cette illustration ne sont pas représentées les réponses alloimmunes humorales. Modifié d’après (Mitchell, 2009).
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
26
Les cytokines sont des médiateurs orchestrant les réponses immunes. Parmi les cytokines
produites par les lymphocytes T lors de la vasculopathie de transplantation, l’IFNg est le plus
important, car entrainant un grand nombre de réponses cellulaires (Nagano et al., 1997).
Produit par la sous population Th1, il active les macrophages (qui en réponse produisent de
l’IL-12 stimulant ainsi le recrutement et l’activation des lymphocyte Th1), augmente le
recrutement des cellules immunitaires en activant l’expression de molécules d’adhésion sur les
cellules endothéliales et l’expression de chémokines, et amplifie les réponses immunitaires en
augmentant l’expression des HLA-I et HLA-II à la surface des CPA et des cellules endothéliales
(Tellides and Pober, 2007).
L’IFNg peut être également produit par les macrophages, créant ainsi une boucle autocrine
d’activation des macrophages sans intervention des lymphocytes (pour revue (Mitchell, 2009).
Il est aussi capable d’induire le développement de la vasculopathie de transplantation en
l’absence de cellules immunitaires (Tellides et al., 2000).
Une autre cytokine importante dans la vasculopathie de transplantation est le TNFa (Wollin
et al., 2009). Cette cytokine pro-inflammatoire est capable d’augmenter la production d’IL-12
en activant les macrophages, participant à la boucle autocrine d’activation des macrophages.
La déficience des deux récepteurs TNFR1 et TNFR2 dans l’organe transplanté empêche la
formation de la VT, malgré la présence de cellules immunitaires (Suzuki et al., 2003) (voir
revue (Mitchell, 2009)).
Appartenant à la famille des cytokines, les chimiokines exercent des fonctions importantes
de communications intercellulaires. Leurs propriétés chémoattractantes constituent leurs points
communs majeurs et sont à l’origine de leur dénomination (chemoattractant cytokines). Elles
régulent de nombreux processus biologiques tels que la prolifération, l’apoptose mais leur rôle
principal est d’activer et de contrôler la migration leucocytaire. Ce sont des protéines solubles
de faible poids moléculaire, produites par les cellules endothéliales, les CMLs, ou les cellules
immunitaires (lymphocytes, macrophages, NKs) capables de recruter et activer une grande
variété de cellules inflammatoires et non inflammatoires au sein des sites lésés. Il en existe plus
de 50, leurs effets allant du recrutement leucocytaire à l’activation de l’angiogénèse et le
remodelage vasculaire. Elles sont regroupées en 4 sous-familles sur la base de la position des
acides aminés cystéines (C) et non cystéines (X) à proximité de l’extrémité N terminale de
chaque molécule (C, CC, CXC, CX3C) (voir revue (Shimizu and Mitchell, 2008).
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
27
Les chimiokines médient leurs effets par des récepteurs à 7 domaines transmembranaires,
associés aux protéines Gi. La nomenclature des récepteurs est basée sur le groupe de
chimiokines auquel son ligand appartient.
Elles jouent un rôle dans les différentes phases conduisant à la vasculopathie de
transplantation (cf. Figure 8). Par exemple, les chimiokines CXCL1, CXCL2, CXCL5 et
CXCL8 participent au développement des lésions d’ischémie-reperfusion en recrutant et
activant les neutrophiles et les monocytes. Les chimiokines CCL3, CXCL9-11, et CXC3CL1
médient la réponse allogénique dirigée contre les antigènes du greffon en entrainant le
recrutement de lymphocytes T CD4+, CD8+, NKs et macrophages dans les lésions. Dans les
phases plus tardives les taux élevés de CCL2, CCL5 et CXCL8-11 contribuent au
développement de la vasculopathie, par leurs effets sur les cellules T, les macrophages, les
CMLs. Le blocage des certains récepteurs des chimiokines (CCR1, CCR5 ayant pour ligand
CCL3, CCL5 entres autres) dans des modèles animaux permet d’inhiber partiellement
l’apparition de la vasculopathie de transplantation (voir revues (Nelson and Krensky, 2001;
Shimizu and Mitchell, 2008) ).
Figure 8 : Effet des chimiokines sur le développement de la vasculopathie de transplantation. Ne sont représentées que les chimiokines les plus influentes à chaque étape du développement de la VT. Les sources majeures des chimiokines sont indiquées entre parenthèse. D’après (Mitchell and Libby, 2007).
3.3.1.2.2 Immunité humorale
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
28
Le rôle des alloanticorps dirigés contre le greffon dans les lésions retrouvées dans la VT
est évoqué depuis les années 70 (Rossen et al., 1971; Tilney et al., 1979) Cette alloréaction
humorale est le sujet de nombreuses études démontrant un rôle prépondérant des lymphocytes
B et des alloanticorps produits dans le développement des lésions (Alkhatib et al., 2007; Fukami
et al., 2009; Russell et al., 1997; Thaunat et al., 2005; Thaunat et al., 2006a).
En clinique, diverses études montrent une corrélation claire entre production d’anticorps
anti-HLA dirigé contre le greffon et vasculopathie de transplantation (Abe et al., 1997;
Christiaans et al., 1998) quelque soit le type de transplantation cardiaques (Kaczmarek et al.,
2008; McCarthy et al., 1998), pulmonaires (Girnita et al., 2008; Girnita et al., 2007), rénales
(Abe et al., 1997; Lee et al., 2009; McKenna et al., 2000; Mizutani et al., 2005). Ces données
sont à l’origine de la « théorie humorale de la vasculopathie de transplantation » (Terasaki,
2003; Terasaki and Cai, 2008) postulant que cette pathologie est induite principalement par les
anticorps anti-HLA plutôt que par l’action des cellules cytotoxiques (Lee et al., 2002).
Les anticorps spécifiques des antigènes HLA du greffon peuvent se fixer à la surface des
cellules endothéliales du greffon, activer la cascade du complément, menant à la lyse des
cellules cible. Ils peuvent aussi activer certaines cellules cytotoxiques (NK, macrophages,
neutrophiles, éosinophiles) via leur récepteur au fragment Fc des immunoglobulines. La lyse
des cellules cibles par les cellules cytotoxique est alors la conséquence d’une production
d’enzymes cytolytiques et de TNF (Voir revue de (Tinckam and Chandraker, 2006)).
Cependant, tous les patients transplantés développant des anticorps anti-HLA ne développent
pas pour autant de vasculopathie de transplantation. Ceci peut être dû, comme le suggère le
travail de Lee en 2002 (Lee et al., 2002), à des différences dans la capacité du tissu greffé à la
réparation des lésions provoquées par les anticorps. En effet, lorsque le système est dépassé
(c’est-à-dire que les dommages tissulaires ne peuvent plus être réparés), les lésions typiques de
VT pourraient apparaître entrainant à terme la perte de l’organe. Ce type de processus,
« dommage tissulaire/ réparation/ dommage tissulaire », pourrait ainsi se développer sur de
nombreuses années expliquant la disparité de réponse entre l’apparition des anticorps et
l’apparition de la VT.
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
29
La modélisation in vitro de la VT de l’atteinte des cellules vasculaires (CMLs et cellules
endothéliales) a permis d’étudier le rôle joué par les anticorps anti-HLA sur ces cellules en
l’absence de cellules immunitaires.
Ces anticorps ont des effets multiples (Colvin, 2007). Par exemple, ils induisent la
production de facteurs de croissance (Bieri et al., 2009), de cytokines et l’augmentation des
molécules d’adhésions par les cellules endothéliales. Depuis 1997, les différents travaux de
l’équipe de Reed ont montré que les anticorps anti-HLA ont aussi un effet mitogène sur les
cellules vasculaires démontrant ainsi l’importance de ces molécules dans l’hyperprolifération
cellulaire. Elle a montré que les anticorps anti-HLA peuvent se lier aux cellules vasculaires
(endothéliales et cellules musculaires lisses sous-jacentes) via une liaison de l’anticorps sur la
molécule HLA de classe I, suivie d’une transduction d’un signal pouvant entraîner la
prolifération cellulaire (Harris et al., 1997).
Pour étudier cette hypothèse, l’anticorps anti-HLA (clone w6/32) utilisé est un anticorps
spécifique des HLA-A, B, et C qui reconnaît un épitope conformationnel, impliquant à la fois
la chaîne lourde du HLA de classe I et la ß2 microglobuline associée (Barnstable et al., 1978;
Kahn-Perles et al., 1987). Cet anticorps a la spécificité de lier tous les HLA humains de classe
I.
Les études de Reed démontrent que le signal prolifératif est spécifique de la liaison des
anticorps à la molécule HLA de classe I nécessitant la formation d’un regroupement anticorps
anti-HLA/molécules HLA à la surface de la cellule afin de permettre la transmission du signal
mitogène comme le suggère l’effet d’une digestion préalable par la papaïne ou pepsine des
anticorps sur l’activation du signal mitogène (Bian et al., 1998; Bian and Reed, 1999).
Ces travaux montrent également qu’il existe une transmission du signal des cellules
endothéliales vers les CMLs sous jacentes accompagnée d’une augmentation du récepteur au
FGF, ainsi qu’une augmentation de la réponse au signal mitogène médié par le bFGF, par
cellules endothéliales (Bian et al., 1998; Bian and Reed, 1999).
La stimulation par les anticorps anti-HLA conduit à l’activation dans les cellules
endothéliales d’une cascade de signalisation passant par la phosphorylation d’acteurs de la voie
PI3K/ Akt (Jin et al., 2004), cascade de signalisation nécessitant la phosphorylation préalable
de FAK (Jin et al., 2007), paxilline et les Scr kinases (composants majeur de la signalisation
cellulaire médié par les intégrines (Jin et al., 2002)), associées au sein d’un complexe. Des
molécules anti-apoptotiques de la famille des Bcl, à savoir Bcl-2 et Bcl-xl sont en parallèle up-
régulées tandis que des molécules pro-apoptotiques telles que Bad sont inhibées, entrainant une
augmentation de la survie cellulaire.
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
30
Cette activation est dépendante de la dose d'anticorps utilisé :
i/ de faibles doses d'anticorps entraînent les effets biologiques les plus importants, mettant
en avant l’importance que peuvent jouer les anticorps anti-HLA lors des épisodes de rejet
chronique (Jindra et al., 2006).
ii/ les fortes concentrations en anticorps anti-HLA n’activent plus la voie FAK-paxilline-
PI3K Akt mais la voie médiée par le récepteur au FGF. De plus, ces effets sont renforcés par
l’IFNg et le TNFa (Bian and Reed, 1999) dont le rôle potentialisateur en synergie avec une
stimulation des cellules par les anti-HLA pourraient augmenter l’expression de la quantité de
récepteur HLA à la surface des cellules.
En parallèle, les anticorps anti-HLA, induisent la translocation à la membrane
cytoplasmique de RhoA, une GTPase de la famille de Ras, se liant aux filaments d’actines et
permettant la formation de fibres de stress, suivie d’une réorganisation du cytosquelette (Coupel
et al., 2004; Lepin et al., 2004). L’inhibition de cette translocation entraine une diminution de
la phosphorylation d’Akt liée à une réduction de l’activation de la PI3K, indiquant qu’il
existerait plusieurs voies de signalisations médiées par les anticorps anti-HLA aboutissant à la
phosphorylation d’Akt.
Plus récemment, cette équipe a montré que l’activation de PI3K par les anti-HLA conduit
à l’activation de mTOR (Jindra et al., 2008b). mTOR est une sérine thréonine kinase, jouant un
rôle dans la prolifération cellulaire et la synthèse protéique par l’activation de la p70 S6
ribosomal kinase (S6K) et 4E-BP1. Il existe deux complexes moléculaires distincts liant
mTOR. mTORC1, est composé de mTOR, la protéine associée « raptor » ainsi que GßL
(protéine de 36kDa se liant sur le domaine kinase de mTOR, qui régule positivement la voie de
signalisation de mTOR (Kim et al., 2003)). Le rôle de mTORC1 est d’activer la S6K et 4E-
BP1 entrainant l’augmentation de la biosynthèse et la transcription d’ARNms de protéines
nécessaires à la transition G1-S. Le second complexe appelé mTORC2 est constitué de mTOR,
associé à une protéine insensible à la rapamycine, « rictor », et GßL. Ce complexe est capable
de phosphoryler Akt sur la Sérine473 et est impliqué dans le réarrangement du cytosquelette via
l’activation des GTPases Rho. Les deux complexes mTORC1 et mTORC2 formés lors de la
stimulation des cellules endothéliale par les anti-HLA ont deux actions distinctes. mTORC1
entraîne l’activation de la p70S6K permettant la phosphorylation de S6RP et la phosphorylation
de 4E-BP-1, engageant les cellules ainsi stimulées dans la voie de prolifération. mTORC2 induit
la phosphorylation d’Akt sur la Ser473, conduisant à la phosphorylation de Bcl-2 et engage les
cellules dans les voies de survie cellulaire. Les travaux de Reed démontrent que la stimulation
de cellules endothéliales par les anticorps anti-HLA à faible concentration entraîne
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
31
préférentiellement l’activation du complexe mTORC2 (Jindra et al., 2008a; Jindra et al., 2008b)
reliant par ailleurs mTORC2 et régulation de la prolifération via la phosphorylation de ERK.
Les différents résultats observés sont retrouvé dans le schéma récapitulatif suivant (Figure
9, d’après (Zhang and Reed, 2009)).
Figure 9 : Cascade de signalisation cellulaire induite par les anticorps anti-HLA. A - La liaison des anticorps anti-HLA (à faible concentration) sur les molécules HLA de classe I active Rho et Rho kinase, et stimule la phosphorylation de Src et FAK. Cette phosphorylation est suivie de l’activation du complexe mTORC2 aboutissant à l’augmentation de l’expression de protéines de survie. B - De fortes concentrations en anticorps anti-HLA entraînent la prolifération des cellules endothéliales en augmentant l’expression du FGFR et la liaison du FGF et en activant les MAPK. La liaison des anticorps sur les molécules HLA de classe I active, en parallèle, la formation du complexe mTORC1, aboutissant à la phosphorylation de S6K et S6RP, conduisant à la synthèse protéique et à la prolifération. D’après (Zhang and Reed, 2009).
Un résumé des interactions qu’il existe entre les différents effecteurs immunitaire et non
immunitaire est présenté dans la figure 10. Ce schéma met en avant les différentes agressions
et réponses tissulaire et immunitaire conduisant au développement de la vasculopathie de
transplantation.
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
32
Figure 10 : Collaboration et interactions des différents facteurs immunitaires et non
immunitaires dans le développement de la vasculopathie de transplantation. D’après
(Schmauss and Weis, 2008).
3.3.2 . Les réponses des cellules vasculaires au stress
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
33
Les réponses immunitaires liées à la reconnaissance des antigènes allogéniques portés par
le greffon, associées aux facteurs de risques non immunitaires précédemment cités sont à
l’origine d’un environnement pro-inflammatoire (cytokines, chémokines, lésions et
recrutement leucocytaire) dans les vaisseaux de l’organe greffé. Les cellules vasculaires
(cellules endothéliales, CMLs) sont donc soumises à une multitude de signaux de stress qu’elles
doivent intégrer pour régler de façon adaptée la réponse immuno-inflammatoire à travers
l’expression de molécules d’adhésion, la production de cytokines pro et anti-inflammatoires,
des chimiokines, et des facteurs de croissances. La réponse cellulaire à ces différents signaux
peut être de trois types : entrer en apoptose, proliférer ou modifier leur phénotype.
Les cellules endothéliales, situées à l’interface entre le sang et les tissus joue un rôle majeur
lors de la réponse inflammatoire.
De nombreuses études mettent en avant le rôle central de l’apoptose de ces cellules dans
l’initiation et l’installation de la vasculopathie de transplantation (Pour revue (Cailhier et al.,
2006)). Cette apoptose peut avoir plusieurs origines. Les cellules immunitaires (cellules T,
NK) mais aussi la lyse des cellules par le complément, dépendante des anticorps, entraine
l’apoptose des cellules endothéliales médiée par la voie des caspases (voie mitochondriale,
intrinsèque ou voie Fas-FasL, extrinsèque). Dans l’évolution de la pathologie, cette mort
cellulaire se produirait avant la prolifération néointimale, induisant la production de molécules
d’adhésions par les cellules endothéliales voisines, et permettant ainsi le recrutement des
monocytes et donc la production de nombreuses chémokines et cytokines notamment PDGF et
TGFb.
La prolifération des cellules endothéliales par les anticorps anti-HLA a largement été
étudiée par l’équipe d’EF Reed (Voir chapitre 3.3.1.2.2 Immunité humorale).
En réponse aux lésions provoquées par l’ischémie-reperfusion, la production de EROs…
elles sont capables de sécréter des facteurs de croissance et des chémokines entraînant le
recrutement des leucocytes. Par exemple, l’IFNg augmente la capacité des cellules
endothéliales à présenter l’Ag aux cellules T, en augmentant l’expression des molécules HLA
de classe I et II à la surface membranaire, les molécules impliquées dans la préparation et le
chargement du peptide dans la poche de présentation des molécules HLA (TAP-1) augmente
les molécules d’adhésions ICAM-1 et VCAM-1 (Tellides and Pober, 2007) et donc favorise un
phénotype pro-inflammatoire.
L’importance des cellules musculaires lisses de la média dans le développement des lésions
de rejet chronique ne doit pas être sous-évaluée car elles représentent une cible de
l’alloimmunité préférentielle par rapport aux cellules endothéliales (Currie et al., 2008). La
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
34
possibilité que les CMLs soient une cible majoritaire des différentes agressions est appuyé par
la possibilité de diffusion des anticorps anti-HLA, des chémokines et cytokines produites par
les cellules immunitaires, du sang périphérique vers la média des vaisseaux lié à une
désorganisation et une atteinte de l’intégrité et de la perméabilité de la monocouche endothéliale
(Aliev et al., 2005; Gourdin et al., 2009; Laskowski et al., 2000)) ou comme le suggère les
travaux de Thaunat, à la formation d’organes lymphoïdes secondaires au sein de l’adventice
des vaisseaux, libérant des doses d’anticorps anti-HLA directement sur les cellules musculaires
sous-jacentes (Thaunat et al., 2005; Thaunat et al., 2006a; Thaunat and Nicoletti, 2008; Thaunat
et al., 2006b).
En réponse à l’environnement inflammatoire provoqué par les acteurs du système
immunitaire, les CMLs de la média sont capable de se transformer, passant d’un phénotype
contractile à un phénotype dédifférencié capable de migrer, proliférer et synthétiser de
nombreuses cytokines et de la matrice extracellulaire (Nagai et al., 2001). Les CMLs retrouvées
dans l’intima (CML like ou CMLl) sont similaires en apparence aux CMLs de la média
(Cellules allongées, cytosquelette très développé, présence des marqueurs de surface a actine,
calponine). Toutefois alors que les CML de la média présentent des fonctions contractiles liées
aux myofilaments permettant de réguler le tonus vasculaire, les CMLl ont un phénotype tourné
vers la synthèse avec un appareil de Golgi et un réticulum endoplasmique très développé.
La matrice extracellulaire joue un rôle majeur dans le contrôle de la prolifération des
cellules musculaires lisses. Elle permet d’ancrer les cellules, de leur fournir un réservoir des
molécules pro-prolifératives, facilitant ainsi la progression dans le cycle cellulaire et la
prolifération. Pour proliférer les cellules doivent dégrader localement cette matrice via l’action
de protéases particulières, les MMPs. Cette famille d’endopeptidase à doigt de zinc est
impliquée physiologiquement dans le développement, le remodelage et la réparation tissulaire
(Visse and Nagase, 2003) grâce à leur capacité de dégradation des composant de la matrice
extracellulaire. Elles jouent un rôle clé dans la balance entre prolifération, migration et
dégradation tissulaire (Galis and Khatri, 2002).
Beaucoup d’études démontrent une participation des ces enzymes et en particulier MMP-
2, et 9 entre autre dans le développement de pathologies vasculaires diverses telles que
l’athérosclérose (Auge et al., 2004; Galis and Khatri, 2002; Hobeika et al., 2007; Raffetto and
Khalil, 2008), la resténose (Hobeika et al., 2007; Raffetto and Khalil, 2008), l’hypertension
(Raffetto and Khalil, 2008), l’anévrysme abdominal (Hobeika et al., 2007; Raffetto and Khalil,
2008), étant des médiateurs pro-inflammatoires (Leppert et al., 2001).
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
35
Durant la vasculopathie de transplantation, des études rapportent leurs activations quelque
soit l’organe transplanté mettant en évidence notamment une augmentation des niveaux de
MMP-2 après ischémie–reperfusion rénale (Forbes et al., 2000; Jain et al., 2000). Pour valider
l’implication des MMPs dans la VT, divers modèles animaux ont été utilisés. En 2002,
Tsukioka utilise un modèle de souris transplantée cardiaque (cœur transplanté
hétérotopiquement) (Tsukioka et al., 2002). Cette étude démontre qu’en condition allogénique
les greffons cardiaques développent dès 15 jours des lésions d’artériosclérose de greffe.
L’inhibition de MMP-2 dans les cœurs transplantés par l’utilisation de ribozymes (ARN ayant
la propriété de catalyser des réactions chimiques spécifiques, dans le cadre de cette étude
dégrader spécifiquement MMP-2) permet de prévenir la prolifération néointimale et
l’accumulation de matrice extracellulaire démontrant l’importance de MMP-2 dans la
pathogénèse de la VT. Cette étude indique également une régulation inverse de MMP-9 qui
disparait au cours du développement néointimal.
Plus récemment sur un modèle de transplantation rénale orthotopique réalisée chez le rat,
l’équipe de Lutz démontre qu’une inhibition précoce des MMPs permet de protéger la fonction
du greffon, de limiter la progression de la néphropathie chronique et de la glomérulopathie,
ainsi que le développement de la fibrose néointimale. Toutefois cette étude montre qu’une
inhibition tardive des MMPs (MMP-2, 3, et MMP-9) a un effet délétère sur l’organe greffé,
indiquant un potentiel effet biphasique de ces MMPs (Lutz et al., 2005). Une étude similaire
conduite sur des transplantations cardiaques chez le rat, confirme l’implication des MMPs dans
le rejet, en démontrant que l’utilisation d’un inhibiteur de MMP prévient le développement
néointimal (Hariya et al., 2004).
Lors d’épisodes de vasculopathies de transplantation provoqués chez le rat, le taux de
d’ARN messagers des MMPs notamment MMP-2 et MT1-MMP augmente de manière
significative alors que le taux d’ARN messagers de MMP-9 semble diminuer (Berthier and
Marti, 2006). À l’inverse, des travaux récents ont montré une augmentation de MMP-9 dans les
pathologies chroniques du greffon (Ogawa et al., 2008) mettant ainsi en balance l’implication
de cette MMP dans la VT. Ces résultats obtenus dans les différents modèles animaux pourraient
être transposés à la pathologie humaine, au cours de laquelle, une augmentation des ARNms
des MMPs est rencontrée lors des épisodes de pathologies chroniques du greffon (Berthier and
Marti, 2006) avec notamment une augmentation de la forme active circulante de MMP-2
(Rodrigo et al., 2000) ainsi qu’une augmentation de l’expression de MMP-9. De plus, des
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
36
greffons cardiaques provenant de patients décédés d'hémorragies cérébrales non traumatiques,
ont une activation précoce de MMP-2 et MMP-9 associées à des lésions précoces de VT (Tsai
et al., 2002).
Les travaux précédents de l’équipe ont montré, dans l’étude de l’athérosclérose, l’induction
de la prolifération des cellules musculaires lisses humaines par des agents tels que les LDLs
oxydées (Auge et al., 2004), le TNFa (Tellier et al., 2007) et l’H2O2 (Coatrieux et al., 2007)
faisait intervenir l’activation séquentielle des métalloprotéases MT1-MMP et MMP-2 (Figure
11) suivie de l’activation d’une cascade sphingolipidique conduisant à la dégradation de la
sphingomyéline, et in fine la production de S1P et la phosphorylation des MAPkinases,
entrainant la prolifération des CMLs.
Figure 11 : Voie de signalisation mitogène induite par les LDL oxydées sur CMLs. (S1P : Sphingosine-1-Phosphate, ERK, Extracellular signal regulated kinase, Sm : Sphingomyeline, Cer : Céramide, LDLox : Low density Lipoprotein oxidated) D’après (Auge et al., 2004).
Par ailleurs, les similitudes entre athérosclérose et vasculopathie de transplantation
(Rahmani et al., 2006) laissent à penser que des voies de signalisations activées sur les CMLs
dans l’athérosclérose pourraient aussi être impliquées dans la prolifération néointimale.
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
37
3.3.3 Approche thérapeutique de la vasculopathie de greffe
Différentes stratégies tentent de prévenir et traiter la vasculopathie de transplantation et se
basent sur l’inhibition et la déplétion des cellules immunitaires, et en particulier les cellules
productrices des anticorps, la clairance ou le blocage des anticorps présents dans l’organisme
ou néoformés. Les différents traitements sont présentés dans le tableau suivant.
La plupart de ces stratégies thérapeutiques n’ont pas fait l’objet à ce jour d’études
multicentriques, randomisées, et ciblées sur l’effet propre de ces molécules sur l’activation de
la prolifération néointimale. De ce fait, leur utilisation reste empirique (Singh et al., 2009) et
l’effet bénéfique de ces traitements reste à démontrer dans le cadre du rejet chronique (Schwarz
et al., 2006; Theruvath et al., 2001).
Tableau 3 : Tableau récapitulatif des traitements proposés à l’heure actuelle en cas de suspicion de rejet chronique. Les catégories correspondent à : I, inhibition et déplétions des cellules productrices en anticorps, II, clairance et blocage des anticorps préformés ou néoformés, III, limitation des dégâts provoqués aux tissus. D’après (Cai and Terasaki, 2005).
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
38
Catégorie Traitement Mécanisme d’action
I Cyclosporine A î production de cytokines par les LT, et donc indirectement î la prolifération des cellules B
I Tacrolimus (FK506) Idem que pour la Cyclosporine A
I Rapamycine Idem que pour la Cyclosporine A
I Azathioprine Inhibe la synthèse d’ADN dans les cellules en divisions (T, B en particulier)
I Cyclophosphamide Idem que l’azathioprine
I Mycophénolate mofétil (MMF) Idem que l’azathioprine
I Rituximab Anticorps Anti-CD20 (marqueur de surface des
lymphocytes B) qui déplète l’organisme en lymphocytes B
I OKT3 Anticorps anti CD3 (marqueur de surface des
lymphocytes T). Indirectement inhibe la prolifération des lymphocytes B
I
Anti-thymocyte globulin (ATG)
Anti-lymphocyte globulin (ALG)
Déplétion directe ou inhibe les cellules B indirectement
I Campath-1H Anticorps anti CD52 (marqueur ubiquitaire retrouvé sur les thymocytes, cell. T et B…)
Déplétion de l’organisme en LB
I Splénectomie Ablation de l’organe producteur des lymphocytes T et B
II Immuno-adsorption Déplétion du sang périphérique en anticorps par l’utilisation de colonnes
II Plasmaphérèse Déplétion des anticorps et autres facteurs humoraux du plasma
II Injection intra veineuse d’immunoglobulines
Effets anti-idiotypiques entrainant une déplétion des anticorps anti-HLA
III Thérapie anticoagulante Permet d’inhiber la formation du caillot
I et III Corticoïdes, glucocorticoïdes
Propriétés anti-inflammatoires, Entraine l’apoptose des cellules B
La rapamycine est un immunosuppresseur connu pour son action inhibitrice sur mTOR. En
effet, en liant FKBP12, elle génère un complexe drogue-récepteur inhibiteur de l’activité kinase
du complexe mTORC1, qui active p27kipl (Luo et al., 1996) un inhibiteur de kinase cycline
dépendantes et donc empêche la prolifération cellulaire induite par ce complexe. De plus une
exposition des cellules de manière prolongée et chronique à la rapamycine entrainerait une
inhibition de la fonction du mTORC2, en empêchant sa formation (Sarbassov et al., 2006). En
adéquation avec les résultats de Reed (Zhang and Reed, 2009) la rapamycine pourrait prévenir
la vasculopathie de transplantation (Mancini et al., 2003) mais peu d’études cliniques ont été
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
39
réalisées afin de connaître le bénéfice d’un traitement chronique à la rapamycine chez les
patients transplantés. Son utilisation n’indique toutefois pas d’inhibition totale de la
prolifération néointimale (Alamo et al., 2009) laissant présager l’activation de voies de
signalisations parallèles.
FTY-720 (Fingomolid) et KRP-203 font partie d’une nouvelle classe pharmacologique en
cours d’étude dans la prévention de la vasculopathie de transplantation.
FTY-720, dérivé de la myriocine, est un analogue de la sphingosine-1-phosphate (S1P).
Phosphorylé par la SK-2 (Allende et al., 2004; Zemann et al., 2006), il se lie et active
spécifiquement les récepteurs S1P1R et S1P3R mais pas S1P2R. In vivo, il entraine
l’internalisation et la dégradation des récepteurs S1P1R sur les lymphocytes (Brinkmann, 2007)
et induit rapidement une lymphopénie par la séquestration dans les organes lymphoïdes
secondaires des lymphocytes ainsi que par le blocage de la sortie des lymphocytes matures
contenus dans le thymus (Zhang and Schluesener, 2007). A l’inverse d’un immunosuppresseur
conventionnel, le FTY720 n’empêche pas l’activation, la prolifération, et les fonctions
effectrices des lymphocytes T et B. Il est actuellement en essais cliniques de phase II pour le
traitement de scléroses multiples, des neuropathies et des rejets aigus (Brinkmann, 2009;
Mansoor and Melendez, 2008). De nombreuses études précliniques ont montrées un effet
bénéfique du FTY720 dans la survie des organes transplantés (transplantation d’organes solides
et d’îlots pancréatiques) (Brinkmann and Lynch, 2002; Brinkmann et al., 2001) en évitant les
rejets aigus (Kimura et al., 2003; Pan et al., 2006; Wang et al., 2003). A concentration sub-
thérapeutique, en association avec la cyclosporine, le FTY 720 permet de limiter l’apparition
de lésions de vasculopathie de transplantation (Nikolova et al., 2000) mais cet effet semble lié
à la réduction de l’infiltration des cellules immunitaires au sein du greffon (Wang et al., 2004)
.
Le KRP203, agoniste des récepteurs S1P1, 4, 5 (Fujishiro et al., 2006a; Fujishiro et al.,
2006b) a démontré des effets similaires au FTY720 (Wenderfer et al., 2008). Quelques études
indiquent que l’utilisation de cette molécule permet d’éviter la survenue de vasculopathie de
transplantation dans un modèle de transplantation aortique chez le rat (Fujishiro et al., 2006a;
Fujishiro et al., 2006b) et prolonge la survie de transplants cardiaques chez le rat (Shimizu et
al., 2005).
En parallèle, des essais thérapeutiques dirigés contre les facteurs (autre
qu’immunologique) potentiellement impliqués dans la pathogénie de la vasculopathie de
transplantation ont été réalisés. L’utilisation d’inhibiteurs d’HMG-coA réductase permet de
limiter l’hyperlipémie induite par les immunosuppresseurs, et réduit l’apparition de la VT
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
40
(Shimizu et al., 2003; Yi et al., 2008) en agissant notamment sur le système immunitaire
(Kobashigawa, 2004). De même la prise d’antioxydants tels que la vitamine C et E réduisent la
VT (Behrendt et al., 2006). D’autres approches thérapeutiques concernent les conséquences de
l’activation du système immunitaire, notamment la production d’IFNg et de chémokines.
L’utilisation d’anticorps dirigés contre l’IFNg permet de prévenir l’apparition de la VT dans
des modèles animaux (Nagano et al., 1997). De même l’utilisation d’antagonistes des récepteurs
aux chémokines (CCR1) pourrait représenter une alternative thérapeutique intéressante, le
défaut de CCR1 dans un modèle de transplantation cardiaque murin conduisant à la suppression
de l’apparition de la VT (Gao et al., 2000).
En résumé la VT est la complication majeure à l’heure actuelle liée à la transplantation
d’organe à long terme. L’ensemble des données épidémiologiques montre le rôle important
joué par les anticorps anti-HLA. Les stratégies thérapeutiques actuelles sont essentiellement
orientées vers la diminution du taux en anticorps anti-HLA dans le sérum des patients.
3.4 Modèles d’étude de la VT.
3.4.1 Historique
Les modèles animaux visent à recréer des conditions physiopathologiques aboutissant à la
formation de lésions caractéristiques de la VT, comparables à celles observées lors d’allogreffes
humaines, dans une échelle de temps plus réduite (quelques semaines au lieu de plusieurs
années) et permettent l’étude des facteurs potentiellement impliqués dans ce rejet.
Les premières lésions vasculaires ont été décrites sur des transplantations réalisées chez le
chien en 1968 (Kosek et al., 1968), chez le lapin (Alonso et al., 1977), et chez le rat à partir des
années 80 (Cramer et al., 1989; Lurie et al., 1981). Par la suite, cette pathologie a été étudiée
sur des modèles de greffes aortiques allogéniques chez le rat (Plissonnier et al., 1991) puis chez
la souris (Koulack et al., 1995).
Dans un premier temps, le modèle le plus couramment utilisé a été le modèle de VT rénale
chez le rat réalisé par White (White et al., 1969). Il a permis de mettre en évidence quelques
mécanismes impliquées dans le développement de la vasculopathie de transplantation,
notamment la possibilité d’un processus triphasique, avec une phase impliquant les allo-
anticorps, une phase cellulaire responsable de la production de cytokines, et une dernière phase,
conduisant à l’augmentation des molécules d’adhésions induisant le processus de fibrose (pour
revue (Marco, 2006)). Ce modèle a par la suite été utilisé afin d’expérimenter différentes
molécules et stratégies immunosuppressives et étudier le rôle de facteurs non immunologiques
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
41
tels que l’hypertension, des agents infectieux tels que le CMV, l’ischémie-reperfusion dans
l’apparition des lésions de la VT. Toutefois ce modèle ne permet pas d’isoler les différents
facteurs immunologiques pour étudier plus précisément leur mécanisme et leur rôle dans le
développement des lésions. Pour cela d’autres modèles KO sont nécessaires.
3.4.2 Modèles animaux mutants
Les souches murines mutantes représentent des nouveaux modèles utilisables pour des
études de la vasculopathie de transplantation. En particulier, les mutations entrainant un défaut
dans la fonction du système immunitaire permettent d'étudier le rôle de divers facteurs
immunitaires dans la physiopathologie de la VT. Les principales souches de souris
génétiquement immunodéficientes sont répertoriées dans le tableau 4.
Tableau 4 : Les différents modèles murins mutants utilisable dans l’étude des mécanismes du rejet (pour revue (Thomsen et al., 2008)).
Souche Mécanismes d’action Déficience immunitaire
Nude Défaut génétique dans la transcription du facteur Foxn1 Cellule T
XID Défaut dans la signalisation des cellules B. Production d’anticorps limitée
Beige Défaut du gène régulant le trafic lysosomal Défaut de la phagocytose et de la cytotoxicité
NOD Interaction entre 3 gènes régulateurs des
cellules T ainsi que de la présentation des antigènes.
Diabète auto-immun
SCID Défaut de la réparation de l’ADN et défaut des recombinaisons V(D)J dû à une déficience de la
DNA pk350
Déficience en immunité cellulaire T et B
ß2Mnull Pas d’expression des CMH de classe I dû au manque de ß2-microglobuline
Défaut de la production de cellules T CD8, diminution de la
cytotoxicité.
Pfpnull Pas de production de perforine dans les granules lytiques
Pas de cytolyse réalisée par les cellules T et NK.
gcnull Défaut des récepteurs pour l’IL-2,-4,-7,-9,-15 Défaut sévère des fonctions T et NKs.
Rag1null Incapacité de réaliser les recombinaisons VDJ, pas de TCR ni BCR Pas cellules T et B matures.
À partir des modèles mutants porteurs d'une seule mutation, des modèles animaux
présentant des déficits immunitaires plus complexes et plus complets, mieux ciblés et plus
stables, ont été obtenus par des croisements entre différentes souches mutées. Les modèles
animaux issus de croisements des souches immunodéficientes les plus utilisées dans les études
en transplantation sont répertoriés dans le tableau 5.
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
42
Tableau 5 : Modèles animaux de mutations combinées. D’après (Thomsen et al., 2008).
Une des limitations de l’étude des rejets de greffe dans des modèles animaux reste
néanmoins la difficulté de transposition des résultats obtenus à la pathologie humaine. Bien que
de nombreux mécanismes biologiques et cellulaires soient communs entre la souris et l’homme,
il existe toutefois des différences structurelles et fonctionnelles significatives. A titre
d’exemple, si les molécules CD40 et CMH de classe II sont exprimées par les cellules
endothéliales humaines, elles ne le sont pas chez la souris (Ensminger et al., 2003; Ferry et al.,
1987).
Pour faciliter la transposition des résultats expérimentaux aux données observées en
clinique, le recours à un modèle d’étude de la VT humaine a été indispensable. En 1999,
l’équipe de Lorber a mis au point un modèle d’étude consistant en la transplantation d’un
segment artériel humain sur des souris SCID. Une semaine après la transplantation, ces animaux
recevaient une injections de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) humains.
Quatre semaines après l’injection de PBMC, des lésions typiques de vasculopathie de
transplantation étaient observées au niveau du greffon artériel humain (Lorber et al., 1999).
Malgré quelques limites, notamment liée à l’absence de possibilité de réalisation de contrôles
isogreffes, le caractère peu reproductible des greffes, l’utilisation de greffons de qualité variable
car prélevés sur des malades (artères bien souvent pathologiques), ce modèle a toutefois permis
de démontrer l’importance de la réponse cellulaire T au niveau des lésions.
Au sein de notre équipe nous avons tenté d’améliorer ce modèle d’étude, en utilisant des
cellules et artères humaines prélevées chez des donneurs d’organes et en mettant en œuvre une
technique rapide de transplantation basée sur l’utilisation des « sleeve anastomosis ». Ce
Souches Phénotypes des animaux
SCID/beige Effet combiné des deux mutations et diminution de la proportion de souris présentant une production résiduelle d’Ig .
NOD/SCID Association des défauts de recombinaison V(D)J et défaut de la présentation de l’antigène et la fonction des cellules T.
NOD/SCID/b2mnull Pas de CMH de classe I, associé aux mutations NOD et SCID
NOD/Rag1null Pas de recombinaison VDJ plus défaut de la présentation de l’antigène et la fonction des cellules T
NOD/SCID/gcnull Effets de la mutation SCID, de la mutation gc
null et du fond génétique NOD
NOD/Rag1null-Pfpnull
Pas de recombinaison VDJ, pas de production de perforine (Inhibition de l’activité lytique des cellules NKs, associés au défaut
lié à la mutation NOD.
Revue Générale Chapitre 3 : La vasculopathie de transplantation
43
nouveau modèle consiste à transplanter un segment de collatérale d’artère mésentérique
humaine prélevé sur un donneur d’organe post-mortem (Yacoub-Youssef et al., 2005a) suivi
d’une « humanisation » du système immunitaire par injection intrapéritonéale de splénocytes
allogéniques, ou isogéniques (par rapport au segment d’artère greffé) (Marcheix et al., 2005).
En utilisant ce modèle notre laboratoire a démontré que la reconstitution d’un système
allogénique par rapport au segment artériel, entraine l’apparition d’une hyperplasie néointimale
dans le greffon, lié à une prolifération des cellules musculaires lisses (Marcheix et al., 2006;
Yacoub-Youssef et al., 2005b). L’avantage de ce nouveau modèle est d’une part la vitesse de
réalisation de la transplantation artérielle liée à l’utilisation des anastomoses par la technique
sleeve, et d’autre part, la réalisation de plusieurs greffes à partir d’un même donneur permettant
ainsi de réaliser les contrôles nécessaires à une bonne interprétation des résultats, la possibilité
de réaliser des contrôles isogéniques et pouvoir connaître le typage HLA afin d’étudier le rôle
du niveau d’incompatibilité HLA en fonction des splénocytes injectés.
Dans le cadre de l’étude de la VT et plus particulièrement dans l’étude du rôle de
l’alloréaction humorale, l’injection des splénocytes rend impossible la distinction entre les
effets de l’immunité humorale de ceux de l’immunité cellulaire. Comme les animaux n’ont pas
de système immunitaire nous avons utilisé ce modèle afin d’étudier le rôle des anticorps anti-
HLA dans le développement de la VT en injectant des anticorps anti-HLA dirigés contre les
molécules HLA humaines présentes sur le greffon artériel.
Hypothèses de
Travail
Hypothèses de travail.
47
Le rejet chronique vasculaire est une pathologie multifactorielle au cours de laquelle divers
acteurs, dont les anticorps anti-HLA spécifiques des épitopes HLA du greffon vont entrainer
l’apparition d’une hyperplasie néointimale conduisant à la perte du greffon par ischémie
progressive dans les cas les plus extrêmes. Afin de décrypter les mécanismes par lesquels les
anticorps anti-HLA peuvent agir sur les cellules musculaires lisses, nous avons simplifié les
différents modèles utilisables en réalisant nos études dans des systèmes dépourvus de cellules
immunitaires (in vivo et in vitro) et en complément (in vitro et ex vivo).
Le but de mon travail de thèse a été d’apporter certains éléments à la compréhension de la
signalisation mitogène médiée par les anticorps anti-HLA, en l’absence de cellules
immunitaires.
I. Modèle animal pour l’étude de la vasculopathie de transplantation.
A l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle animal permettant l’étude isolée des anticorps
anti-HLA sur des greffons humains. Nous avons donc mis au point un modèle qui permet
d’observer l’effet de ces anticorps sur un segment d’artère mésentérique humaine en utilisant
la souche murine immunodéprimée SCID/beige.
Nous avons émis l’hypothèse qu’en l’absence de système immunitaire fonctionnel,
l’injection d’anticorps anti-HLA pouvait induire un épaississement néointimal sur un segment
d’artère humaine. Cette hypothèse a été bâtie d’une part, sur les résultats expérimentaux de
Reed (Zhang and Reed, 2009) et d’autre part, sur diverses publications démontrant le rôle
potentiel des anticorps anti-HLA dans l’apparition de la vasculopathie de transplantation en
clinique (Terasaki, 2003; Terasaki and Cai, 2008).
Les résultats de cette étude nous ont amené à explorer les voies de signalisations pouvant
être impliquées dans le signal mitogène médié par les anticorps anti-HLA.
II. Implication de la voie MMP-2/ Sphingolipides dans le signal mitogène médié par les
anticorps anti-HLA.
Comme souligné précédemment, les MMPs semblent jouer un rôle dans l’épaississement
néointimal observé au cours de la vasculopathie de transplantation. Les travaux menés par EF
Reed suggèrent qu’il y aurait d’autres voies de signalisation impliquées dans le signal mitogène
médié par les anticorps anti-HLA.
Par ailleurs, les similitudes entre vasculopathie de transplantation et athérosclérose nous
ont conduit à faire l'hypothèse que les anticorps anti-HLA pourraient se comporter comme des
Hypothèses de travail.
48
agents de stress vis à vis des cellules vasculaires et activer une voie de signalisation dite « de
stress », qui implique les métalloprotéases MT1-MMP, MMP-2 et la sphingomyélinase neutre
de type 2, et qui induit une réponse mitogène des cellules musculaires lisses. De ce fait,
l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des MMPs et notamment MMP-2 et MT1-MMP pourrait
avoir un effet bénéfique sur le développement de l’hyperplasie néointimale et donc sur la survie
des greffons.
Afin d’avoir une vision précise des mécanismes impliqués nous avons réalisé ces études
d’une part in vitro sur cellules musculaires lisses humaines (nous permettant de définir les
acteurs potentiels de la voie de signalisation) et ex vivo/in vivo en utilisant des inhibiteurs de
MMPs afin de définir l’impact possible de ces thérapeutiques sur l’initiation du signal mitogène
(ex vivo) et sur la formation de la néointima (in vivo), dans un tissu organisé en condition
physiologique.
Matériel et
Méthodes
Matériel et Méthodes
51
1. Produits et réactifs
La [3H] thymidine et le [g-33P] ATP sont obtenus chez Perkin Elmer. Le D-MEM +
Glutamax, le sérum de veau fœtal, ainsi que la Trypsine-EDTA 1X proviennent de Gibco
(Invitrogen, France). Le Batimastat et le Ro 28-2654 nous ont été gracieusement donnés par
H.W. Krell (Roche Diagnostics, Penzberg, Allemagne). Les substrats MMPs (MCA-Pro-Leu-
Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-NH2 pour MMP-2, et dansyl-Pro-Leu-Ala-Cys(p-OMeBZ)-Trp-Ala-
Arg-NH2 pour MT1-MMP) sont de chez VWR.
L’anticorps anti-HLA (clone w6/32) et l’anticorps irrelevant (IgG2a) proviennent de chez
Diaclone. L’anticorps anti-MICA nous a été gracieusement donné par P. Stastny (Southwestern
medical Center, Dallas, Texas USA).
Les kits de détection immunohistochimiques, ainsi que l’anticorps anti-PCNA proviennent
de Dako.
2. Lignées et culture cellulaire
Les cellules musculaires lisses humaines issues d’aortes (lignée CRL1999) proviennent de
l’American Type Culture Collection. (Rockville, Maryland, USA). Elles sont cultivées en
milieu D-MEM supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal plus pénicilline et streptomycine.
Afin d’obtenir des primo-cultures de cellules musculaires lisses, nous avons mis un point
une technique d’extraction cellulaire à partir d’artères ombilicales. Les deux artères ombilicales
sont disséquées sous microscope, en condition stérile. Une fois dégagée de la gelée de Wharton,
les artères sont découpées en cubes fins et déposés dans une boîte de pétri de diamètre 60 mm
contenant 2 ml de milieu D-MEM contenant 20% SVF, et le cocktail d’antibiotiques
pénicilline/streptomycine. Les explants d’artères ombilicales sont alors incubées à 37°C sous
5% CO2 pendant 8 jours. Le lendemain de la mise en culture, 4 ml de milieu sont rajoutés. Les
explants sont ôtés du milieu de culture après 8 jours lorsque les cellules musculaires lisses des
explants commencent à coloniser la boite de culture. Les cellules sont alors trypsinisées et mises
en culture dans des flasques contenant 12 ml de milieu. Lorsque elles atteignent 80% de
confluence, les cellules sont utilisées pour les différentes expériences.
Matériel et Méthodes
52
3. Animaux et sélection des animaux « non leaky »
Pour nos études nous avons utilisé une souche murine immunodéficiente, la souche
SCID/beige. Les animaux sont hébergés en portoir ventilé et reçoivent nourriture et eau ad
libitum au sein du service de zootechnie de notre institut.
La mutation SCID entraine une lymphopénie, une hypogammaglobulinémie, et une
dysfonction des réactions immunes cellulaires T et B. Cette dysfonction est liée à une mutation
du gène Prkdc, requis pour effectuer les recombinaisons V(D)J lors du développement des
lymphocytes (Bosma et al., 1983; Bosma and Carroll, 1991).
Le phénotype beige provient de mutations homozygotes du gène chs1/lyst/beige entrainant un
défaut lysosomal, conduisant à une sévère déficience de l’activité des cellules NK (Kaplan et
al., 2008). De ce fait, les animaux SCID/beige présentent une importante déficience de
l’immunité cellulaire et humorale facilitant ainsi l’acceptation de xénogreffes (Shibata et al.,
1997). Le fait que la mutation SCID soit une mutation spontanée, il est possible que des
animaux développent un phénotype « leaky » caractérisé par une production résiduelle
d’immunoglobulines et une présence de lymphocytes. Afin de limiter les interférences possibles
dues au système immunitaire adaptatif résiduel du phénotype leaky, nous avons utilisés des
animaux jeunes (8-12 semaines). Le test de dosage des Immunoglobulines résiduelles dans les
souris est réalisé par test ELISA permettant de révéler la présence d’IgM (Yacoub-Youssef et
al., 2005b).
Un prélèvement sanguin rétro-orbital est réalisé. Le plasma est isolé après centrifugation
(6000 rpm, 10 minutes à 4°C). Après coating de la plaque ELISA avec l’anticorps primaire
anti-Ig de souris à 4°C durant la nuit, la plaque est saturée pendant une heure dans une solution
de PBS-10% SVF. Les plasmas sont dilués au 100ème dans du PBS-10% SVF et mis à incuber
pendant 1 heure à température ambiante. Après incubation, la plaque est lavée par du PBS 0,1%
Tween 20 (5 lavages). La plaque est ensuite incubée pendant 1 heure à 37°C avec l’anticorps
secondaire permettant de révéler le sandwich anticorps primaire/ Ig couplé à la horse-raddish-
peroxydase (HRP).
Après incubation et lavage au PBS 0,1%Tween 20 (7 lavages), la révélation est réalisée
par un mélange volume à volume de TMB. La réaction est stoppée par l’ajout de 50µL d’H2SO4
2N. La lecture est alors réalisée à 450nm.
Les souris présentant un taux résiduel d’Ig supérieur à 0,5µg/ml de plasmas sont alors
exclues du protocole et sacrifiées par intoxication au CO2.
Matériel et Méthodes
53
4. Obtention des artères humaines et protocole chirurgical de transplantation dans les
animaux
Depuis décembre 2003, après autorisation de l’Etablissement Français de Greffes et avis
favorable du Comité d’Ethique des Hôpitaux de Toulouse, nous avons accès aux procédures
de prélèvement à visée scientifique chez les donneurs d’organes, et ce, sous réserve d’une non
inscription du défunt au Registre National des Refus pour les prélèvements à visée scientifique
et du recueil d’un consentement « explicite ».
La technique de prélèvement multi organe n’est pas modifiée par le prélèvement à visée
scientifique. La seule contrainte est de ne pas lier les artères mésentériques supérieures et
spléniques avant clampage et perfusion du donneur. Le mésentère et la rate sont prélevés après
explantation des différents greffons. Ils sont conservés dans un emballage stérile contenant une
solution de conservation identique à celle utilisée pour la perfusion. Les prélèvements sont
acheminés dans une glacière, dès la fin du prélèvement. Notre équipe a accès à l’ensemble des
documents relatifs aux donneurs sous couvert du secret médical (Sérologies virales, examens
microbiologiques, typage HLA, dossier clinique).
Les collatérales distales de l’artère mésentérique sont disséquées sous microscope
opératoire, en conditions stériles au sein de l’unité de microchirurgie de notre centre. Des
artères de calibres comparable au calibre de l’aorte infra-rénale murine (environ 2 mm de
diamètre) en vue des transplantations dans les animaux (méthode in vivo) sont isolées. Des
transplantations termino-terminales (suture classique en position distale, et anastomose par la
technique « sleeve » en proximal) en position aortique sous rénale de la souris sont réalisées au
service de microchirurgie de notre centre. Les souris sont anesthésiées par injection intra
péritonéale d’un cocktail Kétamine/Xylazine/Atropine, complété par une anesthésie gazeuse
par gaz halogéné (Isoflurane). La voie d’abord est une laparotomie médiane xypho-pubienne.
L’aorte est disséquée des artères rénales à l’artère mésentérique inférieure, puis clampée et
sectionnée dans sa portion médiane. La greffe consiste à la mise en place d’un fragment d’une
collatérale d’artère mésentérique supérieure (Figure 12). Après vérification de l’hémostase, la
fermeture s’effectue en deux plans. La souris opérée est placée au calme, sous lampe chauffante
jusqu’à son réveil complet. Les souris sont ensuite placées en portoir ventilé et laissées au calme
pendant une semaine avant le début des expérimentations. Ce délai d’une semaine nous permet
de vérifier la qualité de la transplantation, d’éliminer les animaux présentant des paralysies du
train arrière, signe d’une thrombose éventuelle du vaisseau greffé.
Matériel et Méthodes
54
Figure 12 : Procédure de greffe d’artères mésentérique depuis le prélèvement de mésentère jusqu’à la greffe artérielle chez la souris. A : Illustration de la zone mésentérique d’intérêt (Gray’s anatomy), B : Mésentère lors du prélèvement. C : Aspect du mésentère avant dissection des artères. D : Artère mésentérique prélevée. E : Transplantation de l’artère mésentérique humaine. L’artère est positionnée au niveau de l’aorte infra-rénale murine. Pour aider lors des sutures, un guide est inséré dans l’artère humaine. F : Artère mésentérique humaine après réalisation des anastomoses sur l’artère infra-rénale murine, avant déclampage. G : Après déclampage et reprise de la circulation sanguine.
Pour les études ex vivo, l’arbre artériel mésentérique est disséqué et des artères de différents
calibres (de 3mm à 5 mm) sont isolées coupées en anneaux de 0,3 à 0,5 cm de longueur, et
mises en culture dans du RPMI sans sérum dans des plaques 96 puits (200 µL par puits). Le
temps de conservation de l’échantillon mésentérique est inférieur à 24h entre le prélèvement et
son utilisation.
5. Analyse morphométrique des greffons
Six semaines après la transplantation, les artères sont explantées, et fixées sur des supports
en polystyrène, enrobées de Tissue Tek (Sakura Finetek, Pays Bas) puis plongées dans de
l’azote liquide afin de solidifier le Tissue Tek. Elles sont alors découpées au cryostat. L’analyse
morphométrique de l’artère est alors réalisée. Les coupes sériées de 5µm sont colorées à
l’hémalun/éosine afin de mettre en évidence l’architecture de la paroi artérielle. Une coupe sur
10 réalisée est étudiée pour la morphométrie. Le concept de cet analyse se base sur la
délimitation manuelle de la circonférence de chaque couche de l’artère en se basant sur les
Matériel et Méthodes
55
lames élastiques interne et externe permettant d’étudier séparément le lumen, intima et la média
(Armstrong et al., 1997). L’aire de la lumière est définie comme l’aire interne délimitée par les
cellules de l’endothélium. L’aire intimale correspond à la région contenue entre la lumière et la
partie externe de la lame élastique interne. Cette couche néointimale est normalement virtuelle,
et ne peux être mesurée que dans le cas d’épaississement. Le degré de formation de cette
néointima dans les vaisseaux permet de définir deux valeurs, l’index néointimal et le
pourcentage d’occlusion de l’artère. L’index néointimal est défini par la formule suivante : NI
= Aire Néointimale / (Aire de la lumière+ Aire néointimale) x 100.
Un index néointimal élevé traduit une aire néointimale plus importante et de ce fait, une
obstruction artérielle plus conséquente. L’utilisation d’un programme (de calcul des aires
médiales, intimales par mesure des périmètres des différentes couches délimitées par les lames
élastiques internes et externes et de la lumière du vaisseau) mis au point dans l’équipe
(Cyberview) permet le calcul des aires de chacune des sous-couches de la paroi ainsi que la
reconstruction schématique de l’artère dans sa longueur.
6. Mesure des activités enzymatiques
6.1 MT1-MMP et MMP-2.
L’activité de MT1-MMP est déterminée sur des extraits cellulaires, en utilisant le substrat
fluorogénique dansyl-Pro-Leu-Ala-Cys(pOMeBz)-Trp-Ala-Arg-NH2 (Calbiochem, VWR)
comme décrit précédemment (Auge et al., 2004). Après 3h d’incubation à 37°C, la fluorescence
est lue (longueur d’onde d’excitation et d’émission de 260 et 340 nm respectivement).
L’activité de MMP-2 est déterminée sur les surnageants de cellules, d’artères lors des
expériences ex vivo ou sur les plasmas issus des souris transplantées selon 3
méthodes différentes:
- en utilisant un substrat fluorogénique MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-NH2
(Calbiochem, VWR) selon le protocole décrit précédemment (Auge et al., 2004). Après 2h
d’incubation, la fluorescence est lue. (Longueur d’onde d’excitation et d’émission 325 et 395
nm respectivement).
- Par zymographie, notamment pour les plasmas des animaux transplantés. La zymographie
permet de mettre en évidence l’activité gélatinase des plasmas. Les plasmas sont déposés sur
un gel SDS-PAGE contenant 10% de polyacrylamide, et 1mg/ml de gélatine en condition
non dénaturante. Après migration des échantillons, le gel est lavé deux fois dans une solution
de Triton X-100 à 2,5% pendant 30 minutes, suivi de 5 lavages de 10 minutes à l’eau distillée.
Le gel est alors incubé 15 heures à 37°C dans un tampon permettant l’activation des
Matériel et Méthodes
56
gélatinases (Tris-HCl 50mmol/l, pH 7.4, CaCl2 10mmol/L, ZnCl2 5 mmol/L et 0,05% Brij-
35). Une fois l’incubation terminée le gel est coloré avec du bleu de Coomassie à 0,5% puis
décoloré dans une solution 30 % méthanol/ 10% acide acétique. Les zones ne présentant pas
de colorations sont les zones de dégradation de la gélatine donc les zones d’activité
gélatinase. Selon le poids moléculaire il est donc facile de discriminer MMP-9 et MMP-2.
- Par dosage immunoenzymatique ELISA en utilisant le kit MMP-2 Biotrak Activity Assay
System. (Amersham). Ce kit permet une détection précise de la forme humaine de MMP-2
libre ou totale. Ce kit a été utilisé pour le dosage de MMP-2 dans les surnageants cellulaires
et les surnageants d’artères après mise en culture.
6.2 SMase neutre.
La mesure de l’activité SMase neutre est réalisée selon la méthode publiée par
Wiegmann et Krönke (Wiegmann et al., 1994). Après stimulation par les différents agents, les
cellules sont lavées au PBS froid (4°C), récupérées puis homogénéisées par sonication dans
0,5ml de tampon contenant 20mM d’Hepes pH 7.4, 10mM de MgCl2, 2mM d’EDTA, 10mM
de ßglycérophosphate, 0,1% de triton X-100, 0,1mM de Na3VO4, 0,1mM de Na2MoO4, 5mM
de Dithiotréitrol (DTT), 750µM d’ATP, 1mM de phénylméthylsulfonyl fluoride (PMSF),
10µM de leupeptine et 10µM de pepstatine. L’essai enzymatique est réalisé par le mélange de
100µL d’homogénat cellulaire à 100µL de substrat constitué de [choline-methyl-14C]
sphingomyéline (100 000 dpm par essai) dans une solution contenant 0,1%Triton X-100, 20mM
Hepes pH 7.4, 1mM MgCl2.
Après deux heures d’incubation à 37°C 300µl dH2Od sont ajoutés et une extraction
chloroforme/méthanol est réalisée afin de récupérer la [methyl-14C] choline. La radioactivité
est alors mesurée par scintillation après ajout de solution de scintillation.
6.3 SK-1.
Les cellules sont lavées au PBS froid, grattées puis récupérées par centrifugation. Le culot
cellulaire est solubilisé dans un tampon kinase constitué de 20mM Tris pH 7.4, 20% glycérol,
1 mM ß-mercaptoéthanol, 1 mM d’EDTA, 1 mM de NaVO4, 15 mM de NaF, 10µg/ml de
leupeptine et aprotinine, 1 mM de Phénylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 40mM ß-
glycérophosphate. L’essai enzymatique est réalisé par l’ajout de 50µM de sphingosine et de
0,25% de triton X-100, de [33P] ATP (0,5µCi, 20mM), d’ATP non marqué (1mM), et 10mM
de MgCl2 dans un volume final de 200µL. Après incubation 30 minutes à 37°C, la réaction est
Matériel et Méthodes
57
stoppée par addition de 20µL de HCl 1N, la sphingosine 1-P produite marquée au [33P] ATP
est extraite par un mélange chloroforme/méthanol/HCl, puis isolée par chromatographie sur
couche mince (solution de migration : Butanol/Méthanol/Acide acétique/H2O (80/20/10/20)).
Après récupération de la sphingosine radiomarquée, la quantification de la radioactivité est
réalisée selon le protocole publié (Auge et al., 1999).
7. Évaluation de la prolifération cellulaire
La synthèse d’ADN est évaluée par la mesure de l’incorporation de [3H] Thymidine après
48 h de stimulation. Les cellules sont marquées pendant 16h à la thymidine radioactive
(0,5µCi/mL) à 37°C. Une fois l’incubation terminée, les cellules sont lavées 2 fois au PBS froid.
Après précipitation à l’Acide TrichloroAcétique 5%, pendant 30 minutes 4°, une solubilisation
du précipité est réalisée par l’ajout de NaOH 1N pendant 2h à température ambiante. La
radioactivité de la solution est alors mesurée par scintillation.
8. Western blot
8.1. A partir de cellules en culture.
8.1.1. Préparation des échantillons
Les cellules sont lavées deux fois avec du PBS, récupérées par grattage dans du tampon de
phosphorylation contenant 1mM de NaVO4, 2µg/mL de leupeptine, 1mM de PMSF et 10µg/mL
d’aprotinine. Après une courte centrifugation (1minute à 1500rpm), le culot cellulaire est repris
dans 100µL de tampon d’extraction constitué de 50mM de Tris-HCl, pH 7.4, 250 mM de NaCl,
5mM d’EDTA, 1% de Triton X100, 0,5% DOC, 10% glycérol, 1mM NaVO4, 10mM de ß-
glycérophosphate, 50mM de NaF, 1mM de PMSF, 10µg/ml de leupeptine, et 10µg/ml de
pepstatine, puis lysé dans la glace pendant 30 minutes. Les homogénats sont ensuite centrifugés
(13 000 rpm/minutes pendant 10 minutes à 4°C). Le surnageant est prélevé, un dosage protéique
réalisé. Pour chaque échantillon 40µg de protéines sont déposés.
Avant le dépôt sur gel, la quantité de surnageant nécessaire pour le dépôt de 40µg de
protéine est repris dans du tampon de dénaturation (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% de SDS,
10% de glycérol, 0,04% de bleu de Bromophénol et 4% de ß-mercaptoéthanol) puis chauffés 5
minutes à 95°C.
Matériel et Méthodes
58
8.1.2. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et Western blot.
L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide permet la séparation des protéines en fonctions
de leur taille des échantillons, donc en fonction de leur masse moléculaire. Nous avons utilisé
des gels contenant 10 ou 12% de polyacrylamide en fonction de la taille des protéines à séparer.
Une fois la migration de l’échantillon dans le gel réalisée, les protéines sont électro transférées
sur membrane de PVDF (au préalable humidifiée par un bain de méthanol (5 minutes) en milieu
liquide pendant 2h sous 220mA. Une saturation des sites non spécifique est réalisée par
incubation de la membrane dans du PBS contenant 5% de BSA et 0,1% Tween 20 (pH 7,4)
pendant deux heures sous agitation. La membrane est ensuite incubée sous agitation à 4°C avec
l’anticorps primaire (les dilutions de l’anticorps primaire dépendant des données du fournisseur
(habituellement 1/2000ème) dilué dans du PBS, 0,1% Tween 20. Après 5 lavages de 10 minutes
dans du PBS, 0,1% Tween 20 à température ambiante, la membrane est incubée 1heure à
température ambiante avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (dilué au 1/5000ème
dans du PBS, 0,1% Tween 20) puis lavée 5 fois avec du PBS, 0,1% Tween 20 à température
ambiante.
8.1.3. Révélation.
La fixation protéine - anticorps primaire - anticorps secondaire couplé à la peroxydase est
révélée par chimiluminescence (ECL, Pierce) en mélangeant volume à volume la solution de
peroxyde et la solution Luminol/Enhancer.
8.2. A partir d’artères humaines après transplantation ou après expériences ex vivo.
Les différences entre le protocole appliqué pour les cellules en culture et le protocole utilisé
dans le cadre des tissus tiennent à l’extraction des protéines. Après stimulation les tissus sont
conservés à -80° dans le milieu d’extraction des protéines utilisé précédemment jusqu’à
utilisation. Le broyage est réalisé à l’aide de la technologie Precellys, par un système de billes
céramiques (CK 14). Les tissus sont broyés dans 300µL de milieu de broyage plus inhibiteur
de protéases (5400 rpm, trois fois 30 secondes, avec une pause de 30 secondes entre chaque
broyage, à température maintenue entre 0 et 4°C par vaporisation d’azote liquide).
9. Évaluation de la toxicité
9.1. Test MTT
Matériel et Méthodes
59
Le MTT (Bromure de 3-[4, 5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium) est un sel de
tétralozium (jaune, soluble) transformé en formazan (bleu, insoluble) après réduction par les
enzymes de la chaine respiratoire mitochondriale dans les cellules vivantes. Après mise en
culture en plaques 12 puits, les cellules sont stimulées lors de l’atteinte d’environ 70-80% de
confluence, par l’anticorps anti-HLA, avec ou sans les différents agents thérapeutiques. Elles
sont ensuite incubées en présence de MTT (250µg/ml final) pendant 2h à 37°C. Le milieu est
ensuite éliminé et les cristaux de formazan dissous dans 1ml de diméthyl sulfoxyde (DMSO).
La densité optique est mesurée par lecture au spectrophotomètre à 590nm.
9.2. Syto 13/ Iodure de Propidium (IP)
Le Syto 13 et l’iodure de propidium sont deux agents intercalant de l’ADN. Le Syto 13 est
un agent perméant qui permet de marquer les noyaux cellulaires. La discrimination entre cellule
viable et cellule en apoptose primaire étant la condensation nucléaire des cellules en apoptose.
L’iodure de propidium est une sonde non perméante qui colore en rouge les noyaux des cellules
nécrotiques ou en nécrose post apoptotique. En effet, dans ces cellules, les membranes
cellulaires et nucléaires étant altérées, la sonde peut donc aisément se fixer à l’ADN. Le Syto
13 est utilisé à la concentration finale de 0,6µM, l’iodure de propidium à la concentration final
de 15µM.
Après stimulation et/ou traitement, les cellules sont incubées 30 minutes avec le mélange
Syto13/IP, lavées au PBS, puis une observation au microscope à fluorescence est réalisée.
10. Transfection par SiRNAs
La technique de transfection utilisé dans notre modèle cellulaire est une transfection au
phosphate calcique. Les cellules, une fois ensemencées, sont transfectées dans du DMEM 10%
SVF, à l’aide d’un mix de transfection contenant 20µmol/L de Si RNA, 2.5 mM de Ca Cl2, 2
mM d’HEPES pH 7.05, 11,5mM de NaCl, 60 µM de Na2HPO4, 490 µM de glucose et 400µM
de KCl.
Les SiRNA dirigés contre MT1-MMP et MMP-2 proviennent de Dharmacon (Lafayette,
CO) (SMART Pool MT1-MMP, SMART Pool MMP-2).
Après transfection par ces SiRNA les cellules sont incubées 48h à 37°C puis cultivées pendant
12h dans un milieu DMEM dépourvu en sérum, avant stimulation.
Les siRNA dirigés contre la sphingomyélinase neutre Smpd3 humaine proviennent
d’Invitrogen (AATGCTACTGGCTGGTGGACC). Les siRNAs dirigés contre la Sphingosine
Kinase-1 (GGGCAAGGCCUUGCAGCUCd(TT) et GAGCUGCAAGGCUUGCCCd(TT)
Matériel et Méthodes
60
proviennent de Qiagen. Après transfection, les SiRNA sont laissés trois jours puis les cellules
sont passées en milieu dépourvu en sérum pendant 12h avant stimulation.
11. RT-PCR quantitative.
Les ARNs totaux sont extraits à partir de culots de CMLs ou d’homogénats d’artères
humaines à l’aide de Trizol (Invitrogen) selon les indications du fabricant. La concentration en
ARN est mesurée par lecture de la DO à 260nm au nanodrop. La reverse transcription est
réalisée sur 1µg d’ARN totaux avec un kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit
(Applied Biosystems). Une PCR Quantitative est réalisée à l’aide du StepOne (Applied
Biosystems). 20ng d’ADNc de chaque échantillon sont mis en présence de 10µl de 2X Fast
SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) et de 0,6µL de chaque amorce à 10µM pour
un volume final de 20µL. Les amorces utilisées sont (sens à gauche; anti-sens à droite)
EDG1: 5’ACTATATCCTCTTCTGCACCA3’; 5’CTGACCAAGGAGTAGATTCTG3’.
ß-actine: 5’AAATCTGGCACCACACCTTC3’; 5’AGCACTGTGGTTGGCGTACAG3’.
HPRT: 5’TTGCTCGAGATGTGATGAAGGA3’; 5’CCAGCAGGTCAGCAAAGAATT3’
ß2-microglobuline : 5’TCTCGCTCCGTGCCTTA3’,
5’CGTGAGTAAACCTGAATCTTTGGA3’.
GAPDH : 5’CCTCCCGCTTCGCTCTCT3’, 5’GCTGGCGACGCAAAAGA3’
12. Dosage des protéines
La quantité de protéines est quantifiée en utilisant soit le réactif de Bradford (Biorad), soit
en utilisant un dosage au BCA (Acide bicinchoninique).
Ce dernier met en jeu une réaction d’oxydoréduction en présence de CuSO4295. Dans les
deux cas, la concentration en protéine est déterminée à partir d’une gamme de protéines à
concentration connue. La quantification se fait par lecture au spectrophotomètre à 562nm pour
le BCA et 595 nm pour le réactif de Bradford.
13. Immunohistochimie, immunofluorescence, immunocytochimie
13.1. Immunohistochimie
Les artères prélevées sont fixées dans 4 ml de PFA 5%, puis inclues en paraffine.
Des lames de 4µm d’épaisseurs sont réalisées au microtome. Avant utilisation, les lames
sont déparaffinées par bains successifs de toluène, puis réhydraté par bains successifs
décroissant en éthanol (100°, 90, 80, 70) puis un dernier bain dans de l’eau distillé est réalisé.
Un démasquage des anticorps est ensuite effectué par une étape de chauffage de l’échantillon
Matériel et Méthodes
61
soit dans un tampon Tris-HCl, pH 9, soit un tampon citrate pH 6, pendant 15 minutes à 95°C.
Les échantillons sont ensuite mis en présence d’inhibiteur de peroxydases endogènes lorsque
la révélation met en jeu un secondaire couplé à la HRP pendant 20 minutes, et saturées pendant
20 minutes dans une solution de PBS, 5% lait.
L’incubation avec l’anticorps primaire est réalisée pendant 1 heure, à température ambiante.
Les dilutions sont adaptées selon les anticorps utilisés. Les lames sont ensuite lavées par 3 bains
de PBS 0,5% lait, de 20 minutes chacun, puis incubées en présence de l’anticorps secondaire,
couplé à la HRP pendant 1 heure à température ambiante. Trois lavages de 20 minutes sont
réalisés. Après une révélation au DAB (3,3’-diaminobenzidine dans une solution chromogène)
pendant 5 minutes, les lames sont contre-colorées à l’hémalun (permettant de mettre en
évidence les noyaux cellulaires) puis déshydratées par passages successifs dans des bains
d’alcool de degré croissant (80° puis 90°, et un bain final à 100°) suivis de deux bains de toluène
puis montées à l’aide d’Eukit.
13.2. Immunofluorescence
Après déparaffinage, réhydratation , démasquage des sites épitopiques, et saturation de
l’échantillon au PBS 5% lait, et incubation avec l’anticorps primaire, l’échantillon est incubé
pendant 1 heure à température ambiante avec l’anticorps secondaire couplé à un fluorochrome
(Molecular Probes, Alexa Fluor). Les lames sont ensuite lavées 3 fois 20 minutes dans du PBS,
et incubées dans une solution de DAPI permettant une contre coloration fluorescente des
noyaux, puis sont montées au fluoprep.
13.3. Immunocytochimie
Les cellules sont cultivées jusqu’à 80% de confluence sur des lamelles de verre. Après
stimulation, les cellules sont fixées au méthanol (-20°C) pendant 20 minutes à 4°C, rincées
deux fois au PBS froid, puis perméabilisées à l’aide d’une solution de triton 0,1%. Une
saturation est ensuite réalisée par incubation des lamelles dans une solution de PBS 5% Lait,
puis l’incubation avec l’anticorps primaire est réalisée pendant 1h heure à température ambiante
et 3 lavages de 20 minutes sont ensuite réalisés. L’anticorps secondaire fluorescent est alors
déposé pendant 1h à température ambiante. Après 3 lavages de 20 minutes au PBS, les lamelles
sont montées sur lames avec une goutte de Fluoprep et visualisées au microscope à
fluorescence.
Matériel et Méthodes
62
14. Analyses statistiques
Toutes les données sont exprimées en moyenne +/- SD. La moyenne est réalisée sur au moins
quatre expériences différentes. Les points stimulés sont comparés aux points contrôles
respectifs, et les calculs statistiques des différences de moyennes sont réalisés par l’utilisation
du Test ANOVA, ou du test de Student t. Une valeur de p<0,05 est considérée comme
statistiquement significative.
Résultats
Résultats <Article I >
65
1. HLA Class I Antibodies Provoke Graft Arteriosclerosis in Human Arteries
Transplanted into SCID/beige Mice.
Galvani S, Augé N, Calise D, Thiers JC, Canivet C, Kamar N, Rostaing L, Abbal M, Sallusto F, Salvayre
R, Böhler T, Zou Y, Stastny P, Nègre-Salvayre A, Thomsen M. Am J Transplant. 2009 Nov;9(11):2607-
14.
1.1. Introduction
Les travaux antérieurs menés dans l’équipe ont permis la mise en point d’un modèle
d’étude de la vasculopathie de transplantation sur souris immunodéprimées. Dans le modèle
initial, un tronçon d’artère mésentérique humaine obtenue à partir de donneurs d’organes est
greffé en position d’aorte infra-rénale de souris SCID/beige. Le rejet est obtenu par
humanisation des souris après transplantation, par injection de splénocytes syngéniques ou
allogéniques par rapport à l’artère transplantée. Des lésions typiques de vasculopathie sont
observées au niveau de l’artère humaine transplantée uniquement, l’arbre artériel murin ne
présentant pas de lésions par utilisation de splénocytes allogéniques par rapport à l’artère
humaine transplantée (Marcheix et al., 2006; Yacoub-Youssef et al., 2005a; Yacoub-Youssef
et al., 2005b). Pour nos travaux, nous avons utilisé ce modèle animal, et nous avons remplacé
l’humanisation par les splénocytes par l’injection d’anticorps anti-HLA de classe I ou anti-MIC
afin d’observer l’effet des anticorps anti-HLA de classe I ainsi que les anticorps anti-MIC sur
l’apparition de lésions associées à la VT.
En effet, les anticorps dirigés contre les molécules HLA de classe I et les anticorps anti-
MIC sont couramment observé dans les patients transplantés souffrant de vasculopathie de
transplantation (Terasaki et al., 2007). Les participations de l’immunité humorale et cellulaire
dans le développement du rejet sont soumises à discussion.
Pour cette étude notre modèle animal a été injecté de façon hebdomadaires avec des anticorps
anti-HLA (clone w6/32 reconnaissant tout les épitopes HLA de classe I) ou des anticorps anti-
MICA afin d’observer le rôle précis de l’alloréaction humorale sur le développement des
lésions de vasculopathie de transplantation.
1.2. Article
Résultats <Article I >
66
Résultats <Article I >
67
Résultats <Article I >
68
Résultats <Article I >
69
Résultats <Article I >
70
Résultats <Article I >
71
Résultats <Article I >
72
Résultats <Article I >
73
Résultats <Article I >
75
1.3. Discussion
Dans cette étude, nous nous sommes intéressé au rôle joué par deux classes d’anticorps
apparaissant chez l’Homme à la suite d’une transplantation, les anticorps anti-HLA de classe I
(Lee et al., 2009) et les anticorps MICA (Sumitran-Holgersson, 2008). Nous avons démontré
pour la première fois l’implication des anticorps anti-HLA dans le développement néointimal,
dans un modèle de transplantation d’artères mésentériques humaines sur des souris
immunodéficientes. Les souris SCID/beige présentent des caractéristiques d’immunodéficience
sévère, avec notamment une inactivation des lymphocytes T et B ainsi qu’un défaut de
l’immunité innée NK et des problèmes de phagocytose.
La transplantation d’un segment d’artère mésentérique humaine dans ces animaux n’est
pas suivie de rejet en l’absence de traitement. L’injection hebdomadaire d’anticorps anti-HLA
(100µg/kg) entraine le développement d’un épaississement néointimal, alors que l’injection
d’anticorps anti-MIC dans les mêmes conditions n’a aucun effet bien que les antigènes MIC
puissent être retrouvé in vitro sur les cellules musculaires lisses. De nombreux travaux
démontrent une possible implication des anticorps anti-MIC dans la vasculopathie de
transplantation (Kauke et al., 2009; Mizutani et al., 2005; Terasaki et al., 2007; Zafar et al.,
2006). Cette étude montre qu’en l’absence de système immunitaire, les anticorps anti-MIC
seuls, ne peuvent pas induire la prolifération des cellules musculaires lisses.
La stimulation de la prolifération des cellules musculaires lisses induite par les anticorps
anti-HLA, observée dans ce travail est indépendante de tout autre acteur du système
immunitaire, notamment le complément et se visualise in situ par une augmentation de
l’activation du marqueur nucléaire de prolifération PCNA sur des coupes de segments d’artères
humaines transplantées ainsi que sur des coupes d’artères ex vivo. Les cellules retrouvées dans
la néointima ont les caractéristiques de cellules musculaires lisses comme le montre le
marquage SMa-actine. Dans notre modèle, nous n’observons toutefois pas de destruction de la
média comme précédemment montré par l’équipe de JB Michel (Thaunat et al., 2006a).
Les cellules musculaires lisses présentes dans la néointima, peuvent avoir comme origine
le donneur (humain) ou le receveur (murin). Elles peuvent en effet, dériver soit de CMLs
préexistantes dans l’intima et la média du donneur (Atkinson et al., 2004), soit provenir de
cellules progénitrices circulantes du receveur, dans le cas où les CMLs du donneur sont
détruites (Hillebrands et al., 2000). Le débat sur l’origine des cellules reste ouvert (Rienstra et
al., 2009). Nous n’avons pas pu identifier l’origine des CMLs. Une des perspective envisagée
afin de répondre à cette question serait la transplantation d’un segment d’artère mésentérique
Résultats <Article I >
76
humaine d’un donneur féminin dans une souris SCID/beige mâle puis une recherche des
chromosomes Y par FISH dans la néointima de l’artère. Il existe d’autres marqueurs spécifiques
qui diffèrent entre l’homme et la souris, notamment les systèmes d’histocompatibilité (HLA
pour l’homme et CMH pour la souris). La présence de l’un ou l’autre à la surface des cellules
de la néointima pourrait nous renseigner sur l’origine des cellules.
En conclusion , ce modèle animal inspiré des travaux de Lorber (Lorber et al., 1999) permet
la dissection des événements conduisant à la vasculopathie de transplantation ainsi que la
validation de l’implication de l’alloréaction humorale dans un système facilement transposable
à la pathologie humaine.
En conclusion de cet article, nous avons donc montré que :
- Les anticorps anti-HLA de classe I sont suffisants pour provoquer des lésions de vasculopathie
de transplantation.
- Ces anticorps ont un effet direct sur les cellules musculaires lisses.
- Les anticorps anti-MICA n’ont pas d’effets dans notre système.
A l’aide des techniques utilisées dans cette première publication, nous nous sommes
intéressés à l’effet des anticorps anti-HLA sur l’activation de voies de signalisation de stress
conduisant à la prolifération des cellules musculaires lisses. Nous nous sommes basés sur des
résultats précédemment obtenus au sein du laboratoire (Auge et al., 1998; Auge et al., 2004;
Coatrieux et al., 2007; Tellier et al., 2007) concernant le développement des lésions
d’athéroscléroses conventionnelles dans le but de déterminer le lien observé entre augmentation
de l’activité métalloprotéase dans les vaisseaux des greffons en clinique et la prolifération
cellulaire conduisant à la formation de la néointima dans les vaisseaux.
Résultats < Article II >
77
2. A Key Role for Matrix Metalloproteinases and Neutral Sphingomyelinase-2 in
Transplant Vasculopathy triggered by anti-HLA antibody. Protection by MMP
inhibitors.
Galvani S, Augé N, Trayssac M, Thiers JC, Calise D, Krell HW, Kamar N, Rostaing L, Thomsen M,
Nègre-Salvayre A, Salvayre R. En révision, Circulation, 2009.
2.1 Introduction
La transplantation est une discipline en constante évolution, du fait d’avances
considérables dans les techniques de conservation des organes, un meilleur suivi des patients
transplantés, l’apparition de nouveaux immunosuppresseurs…
Ceci entraine une diminution des rejets aigus. Toutefois, le rejet à long terme et la
vasculopathie de transplantation associée représentent toujours une cause importante de perte
d’organe. Les anticorps anti-HLA sont impliqués dans le développement de la vasculopathie
(voir section 3.3 de la revue bibliographique) induisant la production de facteurs de croissance,
de cytokines pro-inflammatoires (IFNg, TNFa), l’activation de voies de signalisation
mitogènes et l’expression de molécules anti-apoptotique de la famille de Bcl-2. En réponse à
un stimulus tel que le TNFa, le stress oxydant, notre équipe a montré que les cellules
musculaires pouvaient proliférer suite à l’activation d’une voie de signalisation impliquant la
cascade sphingomyéline-Céramide. L’activation de cette voie de signalisation, et notamment
l’activation de la sphingomyélinase neutre de type 2, est liée à l’activation de métalloprotéases
particulières, MT1-MMP et MMP-2 (Auge et al., 2004).
2.1.1 Généralités sur les métalloprotéases.
Les métalloprotéases sont retrouvées à tous les stades de l’évolution et représentent les
enzymes majeures dans les processus de dégradation de la matrice extracellulaire. Ces enzymes
constituent une famille d’endopeptidases à doigt de zinc comprenant chez l’Homme 24 gènes
codant pour 23 transcrits différents (Visse and Nagase, 2003) (cf. Tableau 6 et Figure 13). Ces
enzymes sont régulées au niveau de l’expression des gènes, au niveau transcriptionnel, post
transcriptionnel, au niveau de la sécrétion et par l’activation de la proenzyme par clivage de
leur propeptide situé en N-terminal (Chang and Werb, 2001; Galis and Khatri, 2002; Page-
McCaw et al., 2007; Visse and Nagase, 2003). Cette activation met en jeu des sérines protéases
telles que la plasmine (Carmeliet et al., 1997) ou la thrombine (Galis and Khatri, 2002). Les
Résultats < Article II >
78
MMPs peuvent aussi être, une fois activée, activatrice d’autres MMP (Ikeda and Shimada,
2003).
Figure 13 : Structure générale des différentes métalloprotéases. S : Peptide signal, Pro : Propeptide, Cat : Domaine catalytique, Zn : Site actif Zn dépendant, Hpx : Domaine Hemopexine. Fn : Domaine Fibronectine, V : Insert Vitronectine, I : Domaine transmembranaire de type I, II : Domaine transmembranaire de type II, G : Ancre GPI, Cp : Domaine cytoplasmique, Ig : Domaine IgG-Like. D’après (Visse and Nagase, 2003)
Tableau 6 : Liste des MMPs et de leurs noms usuels.
Enzyme Nom commun MMPs Collagénases 1
2 3 4
1 8
13 18
Gélatinases A B
2 9
Matrilysines 1 2
7 26
Stromélysines 1 2 3
3 10 11
MT-MMPs 1 2 3 4 5 6
14 15 16 17 24 25
Autres MMPs Métalloélastase RASI
Enamélysine XMMP CMMP
Epilysine
12 19 20 21 22 23 28
Résultats < Article II >
79
Deux types d’inhibiteurs permettent de réguler l’activité de MMPs : des inhibiteurs
endogènes représentés par l’a-macroglobuline (Strickland et al., 1990) et les TIMPs (Tissue
Inhibitor of MetalloProteases) (Stetler-Stevenson, 2008) ou des inhibiteurs de synthèse tels que
le Batimastat, le Ro28-2653...
Les MMPs telles que MMP2, sont sécrétées le plus souvent sous forme inactive (forme
zymogène) (Visse and Nagase, 2003). Le mécanisme d’activation de MMP-2 nécessite un
assemblage MMP-Intégrine au sein duquel MT1-MMP joue le rôle d’adaptateur. Cet
assemblage est crucial et nécessaire pour une dégradation matricielle focalisée et est soumis à
un cross talk entre MMPs et intégrines (cf. Figure 14).
Sur un plan moléculaire, MT1-MMP s’associe avec les intégrines avb3, ainsi qu’avec le
cytosquelette sous jacent. TIMP-2, un des inhibiteurs physiologiques des MMPs se lie alors à
MT1-MMP. Cette association permet de recruter une molécule de MMP-2 sécrétée sous forme
de proenzyme. La seconde molécule de MT1-MMP joue alors le rôle d’activateur, libre
d’association avec TIMP-2 et active l’intégrine avb3 par protéolyse de la sous unité b3 du
complexe d’intégrine. Ceci va alors initier l’activation de pro-MMP-2 par clivage de la portion
N-terminale de la forme zymogène de 68 kDa.
La molécule intermédiaire de MMP-2 ainsi formée (64kDa) s’associe avec l’intégrine avb3
via son domaine C-terminal. La maturation auto-catalytique permettant le passage de la forme
64 kDa à la forme 62 kDa ne peut se faire que lorsque MMP-2 est complexé à l’intégrine.
Figure 14 : Schéma d’activation de MMP-2 par le complexe MT1-MMP-TIMP (D’après www.burnham.org/default.asp?contentID=202)
Résultats < Article II >
80
La forme mature de MMP-2 est alors transitoirement associée au complexe intégrine avb3
et permet d’augmenter la capacité de dégradation matricielle. En effet, une fois libérée de
l’intégrine, MMP-2 sous forme soluble est alors rapidement pris en charge par TIMP-2 et
TIMP-1 inhibant ainsi son action protéolytique (Deryugina et al., 2001).
Ce type d’activation est très dépendant de la quantité de TIMP-2. À faible concentration
de TIMP-2, MT1-MMP est libre et non lié à TIMP-2. De ce fait son action protéolytique est
concentrée sur ces propres substrats tels que le syndecan-1 et le testican-1, mais ne peut pas
activer pro-MMP-2. Quand la concentration en TIMP-2 est appropriée, la liaison TIMP-2/
MT1-MMP protège l’autodégradation de MT1-MMP, le complexe servant de récepteur pour
pro-MMP2, permettant ainsi l’activation de MMP-2 par le processus de clivage décrit plus haut.
Du fait de la liaison MT1-MMP / TIMP-2, l’activité protéolytique de MT1-MMP vis à vis de
son substrat est moins effectif.
Quand MT1-MMP est saturé par TIMP-2, pro-MMP-2 peux transitoirement remplacer
TIMP-2 afin de générer du MT1-MMP libre pouvant ainsi cliver pro-MMP-2 afin de libérer
MMP-2 activé. Ce MMP-2 activé est toutefois rapidement pris en charge dans le milieu
extracellulaire par TIMP-2 bloquant ainsi son activité protéolytique (Kudo et al., 2007).
A côté des inhibiteurs physiologiques, un certain nombre d’inhibiteurs pharmacologiques
de MMPs ont été développés (cf. tableau 7). Ces inhibiteurs ont en commun une séquence
peptidique spécifique qui interagit avec la les MMPs en inhibant leur activité catalytique. Cette
séquence peptidique contient une molécule chélatrice permettant d’interagir avec les ions Zn2+
du site actif de la protéase. Cette approche bien qu’intéressante d’un point de vue théorique a
comme défaut majeur le manque de spécificité vis à vis des métalloprotéases à inhiber. D’autres
approches thérapeutiques sont à ce jour en cours de développement et se basent sur l’utilisation
d’anticorps permettant un meilleur adressage de la drogue ainsi qu’une plus grande spécificité
vis à vis de MMPs particulières. (Murphy and Nagase, 2008)).
Résultats < Article II >
81
Tableau 7 : Les différents inhibiteurs des MMPs : Modifié d’après (Hidalgo and Eckhardt, 2001; Raffetto and Khalil, 2008).
Nature de la molécule Inhibiteur Spécificité
Dérivés de l’acide hydroxamique. Inhibiteurs
peptidiques
Batimastat (BB-94), Marimastat (BB-2516), Solimastat (BB-3643).
Inhibiteur compétitif à large spectre, chélateur d’ion Zn2+
Inhibiteurs non peptidiques
Ro 28-2653
Ro 32-3555
Prinomastat (AG3340)
Tanomastat (BAY-12-9566)
Inhibiteur spécifique de MMP-2, MMP-9 et MT1-MMP
Inhibiteur spécifique de MMP-1. Inhibiteurs de MMP-2,-9,-3, 13.
Inhibiteurs de MMP-2, -3, -9
Dérivés des tétracyclines
Doxycycline
Col-3 (Metastat)
Inhibiteur de sécrétion de MMP-2,-9.
Réduit la concentration plasmatique de MMP-2 et -9. Diminue la
production de MMP-9 Bisphosphonates Clodronate, Alendronate Inhibition de MMP-2 et MT1-MMP
2.1.2 Métalloprotéases et vasculopathie de transplantation.
L’implication des MMPs dans le rejet à long terme est bien décrite, notamment par l’étude
de Susa, démontrant que l’utilisation d’une stratégie immunosuppressive chez le donneur à base
de tacrolimus ou rapamycine entraine une diminution de l’activation de MMP-2 / MMP-9
associée à une meilleure survie du greffon et un retard dans la survenue des lésions de
vasculopathie de transplantation (Susa et al., 2009). Dans la revue bibliographique ont été
présentées d’autres études mettant en évidence le rôle potentiel des MMPs dans la vasculopathie
de transplantation (Voir Chapitre 3.3.2 : Les réponses vasculaires au stress).
2.1.3 Hypothèse de l’étude.
Nous avons mis en évidence dans notre travail précédent que l’alloréaction humorale et, plus
particulièrement, les anticorps anti-HLA induisent une prolifération néointimale sur des artères
humaines transplantées dans des souris immunodéficientes.
Ce travail a pour objectif d’expliquer comment ces anticorps anti-HLA conduisent à la
prolifération des cellules musculaires lisses in vitro et in vivo.
Nous nous sommes intéressés à une voie de signalisation mitogène activée lors d’un stress
cellulaire (stimulation par le TNFa, LDLoxydées…) (Auge et al., 2004; Coatrieux et al., 2007;
Tellier et al., 2007) Cette voie implique les métalloprotéases MT1-MMP et MMP-2, et conduit
à la prolifération des cellules musculaires lisses (voir revue bibliographique chapitre 3.3.2.).
Résultats <Article II >
83
2.2 Article
A key role for Matrix Metalloproteinases and Neutral Sphingomyelinase-2 in Transplant
Vasculopathy triggered by anti-HLA antibody. Inhibition by MMP inhibitors.
Sylvain Galvani 1,2 (MSc), Nathalie Augé 1 (PhD), Magali Trayssac 1,2 (MSc), Jean-Claude
Thiers 1,2 (MSc), Denis Calise 1 (MSc), Hans-Willi Krell 3 (PhD), Nassim Kamar 1,4
(MD,PhD), Lionel Rostaing 4 (MD,PhD), Mogens Thomsen 1, Anne Nègre-Salvayre1 (PhD,
PharmD), Robert Salvayre 1,2 (MD,PhD).
1 Inserm UMR-858, University Toulouse-3, France 2 University of Toulouse, Biochemistry Dept, Toulouse, France 3 Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany 4 Department of Nephrology, CHU Rangueil, University Toulouse-3, France
Running title: MMP2 and nSMase2 in transplant vasculopathy
Abbreviations: mAb, monoclonal antibodies; nSMase-2, neutral sphingomyelinase-2;
Total word count: 5997
Correspondence to: Dr A. Negre-Salvayre or Pr R. Salvayre
Inserm UMR-858 - CHU Rangueil - BP 84225
31432 Toulouse Cedex 4 - France
Tel. (33) 561-32-27-05 - Fax (33) 561-32-20-84
e-mail: [email protected]
Résultats <Article II >
84
Abstract
Background and rationale - Organ transplantation is constantly evolving as a result of
advances in organ preservation, immune monitoring, progress in surgical technique and
immunosuppressive treatment preventing acute transplant rejection. However, chronic rejection
and transplant vasculopathy remains the main cause of late death of organ transplant recipients.
Transplant vasculopathy is characterized by progressive neointimal proliferation and arterial
stenosis leading to ischemic failure of the allograft.
This work aims to decipher whether and how the humoral immune response induces
proliferation of smooth muscle cells (SMC) and transplant vasculopathy, investigated in a
model of human arteries grafted in immunodeficient SCID-Beige mice injected with anti-HLA
antibodies.
Methods and Results - We report that anti-HLA antibodies trigger human SMC proliferation
through the activation of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and neutral sphingomyelinase-
2 (nSMase-2) signaling pathway. The MMP inhibitor Ro28-2653 blocked MMP-2/nSMase-2
activation and the mitogenic effect of anti-HLA antibodies, in vitro in cultured SMC, and ex
vivo in human arterial sections, and reduced in vivo intimal thickening.
Conclusions - These data highlight a crucial role for MMP-2 and nSMase-2 in vasculopathy
triggered by humoral immune response, and open new perspectives for MMP inhibitors, in
addition to conventional immunosuppression, to prevent transplant vasculopathy.
Key-words: Smooth muscle cells; metalloproteinase-2; neutral sphingomyelinase-2; anti-HLA
antibody; allograft arteriosclerosis; transplant vasculopathy.
Résultats <Article II >
85
Introduction
Advances in transplantation resulting from progress in surgical techniques, organ
preservation, and immunosuppressive drugs have considerably improved the short and medium
term outcomes of organ allografts (Hunt and Haddad, 2008). However, chronic rejection
associated with transplant vasculopathy remains a major concern (Mitchell and Libby, 2007).
Transplant vasculopathy (or allograft arteriosclerosis) occurs in approximately 50% of patients
by 5 years after transplantation (Mitchell and Libby, 2007; Weis and von Scheidt, 2000) and is
responsible for late graft failure in solid organ allografts.
Transplant vasculopathy is characterized by diffuse and concentric intimal hyperplasia
leading to arterial stenosis, chronic ischemia and functional loss of the grafted organ (Lechler et
al., 2005; Mitchell and Libby, 2007). The pathogenesis involves immunological events and non-
immune mechanisms, including ischemia-reperfusion, inflammation, viral infection, and
hypertension (Schmauss and Weis, 2008). Immunological mechanisms of allograft
arteriosclerosis are thought to implicate both cell-mediated and humoral components of the
innate and adaptive immune systems (Schmauss and Weis, 2008).
Donor-specific HLA alloantibodies are major players in hyperacute rejection, and are also
implicated in chronic allograft rejection and transplant vasculopathy, which compromise long-
term allograft survival (Russell et al., 1997; Soleimani et al., 2006; Wehner et al., 2007).
Experimental animal models have shown that B cells and donor-specific antibodies are required
for the intimal proliferation of SMC, a key event in the genesis of transplant vasculopathy (Jin
et al., 2005; Russell et al., 1997; Soleimani et al., 2006; Wehner et al., 2007).
Anti-HLA antibody treatment of cultured cells triggers the production of growth factors and
inflammatory cytokines (FGF, interferon, TNF-alpha), the activation of mitogenic signaling and
the expression of anti-apoptotic members of the Bcl-2 family (Bian et al., 1998; Bian and Reed,
1999; Jin et al., 2004). Previous studies have shown that the stress-induced sphingomyelin-
ceramide pathway (Auge et al., 2004; Hannun, 1996) is involved in the mitogenic response of
vascular SMC to TNF-alpha, oxidized LDL and H2O2 (Auge et al., 2004; Coatrieux et al., 2007; Tellier et al., 2007).
We recently reported that the neutral sphingomyelinase-2, which plays a critical role in this
pathway, is activated through a mechanism dependent on matrix metalloproteinases (MMPs)
MT1-MMP and MMP-2 (Auge et al., 2004; Tellier et al., 2007). MMPs are involved in
extracellular matrix degradation, cell migration, proliferation and tissue-remodeling, which
occur in growth and development, angiogenesis, tumor invasion, and atherosclerosis (Chang and
Werb, 2001; Galis and Khatri, 2002), and have been implicated in cardiac transplant
Résultats <Article II >
86
vasculopathy and chronic allograft nephropathy (Lutz et al., 2005; Tsukioka et al., 2002). As the
precise mechanism of action of MMPs remains elusive, we hypothesized that MMPs and the
sphingomyelin-ceramide pathway could be activated by alloantibodies, thereby triggering
mitogenic signaling potentially implicated in alloantibody-induced intimal hyperplasia and
vascular wall remodeling of grafted human arteries. This led us to investigate whether MMP
inhibitors may prevent alloantibody-induced SMC proliferation and transplant vasculopathy.
This study was conducted in vitro in human cell cultures, ex vivo on human arterial segments
incubated with anti-HLA antibodies, and in vivo, into immune deficient SCID/beige mice grafted
with human arteries and treated with anti-HLA antibodies in order to mimick a humoral
alloimmune response directed towards human artery.
The data reported demonstrate the crucial role of MMP-2 and nSMase-2 in anti-HLA
antibody-induced vasculopathy and the dramatic efficiency of MMP inhibitors in preventing
concentric intimal thickening and transplant vasculopathy.
Résultats <Article II >
87
Methods.
An expanded Materials and Methods section is available in the online "Supplemental
Material"
Cell Culture.
Human aortic SMC were grown in DMEM containing glutamax and supplemented with 10%
FCS. Cells were in starved in serum-free DMEM for 24h, before experiments.
Evaluation of live and dead cells.
Viable, apoptotic and necrotic cells were counted after fluorescent staining of DNA by SYTO-
13/PI (0.6 µM SYTO-13, permeant DNA intercalating green colored probe, and 15 µM
propidium iodide, a non permeant intercalating red probe), as described previously (Vieira et al.,
2000).
DNA synthesis.
DNA synthesis was evaluated by [3H]thymidine incorporation, under previously described
conditions (Auge et al., 1998).
SiRNA targeting.
SMC were transfected with double stranded by Calcium phosphate transfection method.
Determination of MMP, nSMase-2 and gelatinase activity.
MMP2 activity was determined in the culture media of SMC and in the plasma from transplanted
mice using the fluorogenic substrate for MMP2 (MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-NH2),
as previously described (Netzel-Arnett et al., 1991). nSMase-2 activity was determined in SMC
extracts using radiolabeled sphingomyelin as substrate and gelatinase activity was assayed by
zymography, under the previously used conditions (Auge et al., 2004).
Western blots.
Western blots were performed as described previously (Auge et al., 1998; Suc et al., 1998).
Protein concentration was determined using the Bradford reagent (Biorad).
Résultats <Article II >
88
Human mesenteric artery harvesting and transplantation in SCID/beige mice.
During multiple organs harvesting for transplantation, a piece of mesentery was removed from
the donor. Segments of terminal collaterals of mesenteric artery (similar in diameter to the
mouse infrarenal aorta) were grafted into SCID/beige mice in the infrarenal aortic position, as
previously reported (Marcheix et al., 2006)
The procedures utilizing human cadaveric tissues were approved by the French “Agence de
Biomédecine” and the "Ethics Committee" of the University Hospital of Toulouse (France).
Experimental protocols on animals were approved by the "Inserm Institutional Committee for
animal experiments".
Depletion of complement by Cobra venom factor.
Cobra venom factor (CVF) was utilized in mice to depletes C3, a key component for
complement activation (Alper and Balavitch, 1976).
Histological analysis and histomorphometric reconstitution of arteries.
Six weeks after transplantation, the mice were sacrificed and the grafted human arterial
segments were removed, fixed and embedded either in paraffin for histological analysis or in
Tissue-Tek and snap-frozen in liquid nitrogen for morphometric analysis (Marcheix et al.,
2006).
Statistical analyses.
Data are presented as mean ± SEM. Estimates of statistical significance were performed by
analysis of variance (one way ANOVA).
Résultats <Article II >
89
Results
Anti-HLA mAb trigger the activation of MMP-2 and nSMase2-mediated mitogenic signaling
in cultured human SMC. Inhibition by Batimastat and Ro28-2653.
Incubation of SMC with anti-HLA class I mAb w6/32 (1 µg/ml) elicited DNA synthesis
both in primary human SMC (pSMC) and immortalized SMC (Fig.1A). Moreover, anti-HLA
mAb did not induce apoptotic effects (Fig.1B,C), in agreement with (Reed, 2003). Note that
the used experimental conditions allowed excluding a role for complement in mitogenic
signaling, and cell proliferation induced by anti-HLA mAb, since fetal calf serum was
decomplemented (heat-inactivated at 56°C) and cell proliferation experiments were performed
in serum-free medium.
Because various stress-inducing agents trigger SMC proliferation via a signaling pathway
involving the metalloproteinases MT1-MMP and MMP-2, and the sphingolipid pathway (Auge
et al., 2004; Coatrieux et al., 2007; Tellier et al., 2007), we investigated whether MMPs are also
required for the anti-HLA mAb-induced mitogenic effect. As shown in Fig.1D,E, anti-HLA
mAb triggered the activation of MMP-2 and nSMase (both peaking at 30 min) in SMC. In
contrast, the acid SMase was not activated (data not shown). MMP-2-specific siRNA, used
under conditions depleting MMP-2 (Fig.1F), abrogated the activation of MMP-2 (Fig.1D) and
nSMase-2 (Fig.1E), as well as the mitogenic ERK1/2 signaling (Fig.1G) and DNA synthesis
(Fig.1H). Conversely, nSMase-2-specific siRNA had no effect on MMP-2 activation (Fig.1D),
but blocked nSMase-2 activation (Fig.1E) and DNA synthesis (Fig.1H).
Finally, in contrast to human SMC and as expected, the anti-HLA mAb did not induce
proliferation of murine SMC (grown in serum-free medium) (Fig.1I).
These data strongly suggest that anti-HLA mAb trigger both DNA synthesis and
proliferation of human SMC, and that MMP-2-dependent nSMase-2 activation is required to
transduce the mitogenic signal triggered by anti-HLA mAb in human vascular SMC.
This led us to hypothesize that pharmacological MMP inhibitors could inhibit the MMP-
2- and nSMase-2-dependent mitogenic effect of anti-HLA mAb. As expected, the broad-
spectrum MMP inhibitor Batimastat and the more specific inhibitor Ro28-2653 inhibited
MMP-2 and, subsequently, the activation nSMase-2 (Fig.2A,B), ERK1/2 mitogenic signaling
and DNA synthesis elicited by anti-HLA mAb (Fig.2C,D), without any apoptotic effect
(Fig.2E,F).
Résultats <Article II >
90
Altogether, the data suggest that MMP-2 and nSMase-2 play a crucial role in mitogenic
signaling triggered by anti-HLA mAb, and that MMP inhibitors can modulate SMC
proliferation induced by anti-HLA mAb.
Anti-HLA mAb induce MMP-mediated mitogenic signaling ex vivo in human arterial
sections. Inhibition by Ro28-2653.
Then, we investigated whether anti-HLA mAb can also trigger mitogenic signaling in
arterial walls ex vivo, by using human arterial rings incubated with anti-HLA mAb.
Like in cultured cells, incubation of arterial slices with anti-HLA mAb (1 µg/ml) triggered
mitogenic signaling, i.e. ERK1/2 signaling and PCNA expression, that were blocked by Ro28-
2653 (Fig.3A-C).
Anti-HLA mAb induced i/ increased expression of MMP-2 in arterial slices, as shown by
western blots and immunohistochemistry (Fig.4A,B), ii/ MMP-2 activation and release in the
culture medium, as shown by MMP-2 activity determination using the fluorogenic substrate
and zymography (Fig.4C,D). Interestingly, Ro28-2653 inhibited the rise of MMP-2 expression
(Fig.4A) and MMP-2 activation (Fig.4C,D).
These data strongly suggest that anti-HLA mAb trigger MMP-2-dependent mitogenic
signaling in arterial sections ex vivo like in cultured SMC. In addition, the MMP inhibitor Ro28-
2653 blocked the mitogenic signaling triggered by anti-HLA mAb.
Anti-HLA mAb induce MMP-2 expression, mitogenic signaling and intimal thickening in
human arterial segments transplanted into SCID/beige mice. Prevention by the MMP
inhibitor Ro28-2653.
To evaluate whether MMP-2 inhibitors are efficient in vivo, we utilized a new experimental
model consisting of human mesenteric arteries grafted into immunodeficient SCID/beige mice
treated with anti-HLA mAb (1 µg mAb/10 g body weight, weekly for 5 weeks)(Marcheix et al.,
2006). Histological studies showed that the human mesenteric artery segment grafted into
control SCID/beige mice (i.e., injected with PBS only) did not undergo any histological
alteration or thrombosis (Fig.5A, left panel; supplemental Fig.IA). This indicates that, as
expected, transplantation procedures do not induce any major intimal hyperplasia and that the
immune response to the xenograft is deficient in SCID/beige mice. It may be noted that some
mesenteric arteries from aged donors exhibit atherosclerotic lesions characterized by non-
symmetrical intimal thickening and lipid deposition.
Résultats <Article II >
91
Anti-HLA mAb elicited intimal hyperplasia of the grafted human arteries (Fig.5A and
supplemental Fig.IA) containing a-actin-positive SMC and a collagen-rich extracellular matrix
(supplemental Fig.IC,D), similar to that observed in transplant vasculopathy. The tunica media
of the grafted artery (treated or not with anti-HLA mAb) was apparently not altered (Fig.5 and
supplemental Fig.I). Some rare T cells infiltrated the adventitia, independent of anti-HLA mAb
treatment, and murine immune cells do not infiltrate human grafted arterial segments, consistent
with the SCID phenotype (supplemental Fig.II).
Anti-HLA mAb treatment induced increased MMP-2 expression in the neointima of
grafted human arterial segments (Fig.5A,B; supplemental Fig.IA), in agreement with the data
in vitro and ex vivo, and with the observation of Tsukioka in a model of cardiac transplantation
(Tsukioka et al., 2002). Moreover, MMP-2 expression in grafted arterial segments was
associated with increased MMP-2 activity within the plasma (Fig.5C). These data suggest that
anti-HLA mAb enhance MMP-2 expression in grafted arterial segments and induce MMP-2
activation and release into the plasma, similar to MMP-2 release ex vivo (Fig.3A,B).
The mitogenic marker PCNA was significantly increased in the intima and in the media of
grafted human arterial segments treated with anti-HLA mAb (Fig.6A,B), consistent with cell
proliferation leading to neointimal thickening, and indicating that some SMC are activated in
the tunica media.
Morphometric analyses of serial histological sections allowed us to reconstruct the 3D
detail of the arterial wall (Fig.6C). This shows dramatic neointimal thickening of the human
grafted artery in anti-HLA mAb-treated animals, whereas controls (treated with irrelevant
antibody) showed no appreciable intimal thickening (Fig.6D). It may be noted that murine aorta
segments close to the graft were not altered in mice treated with anti-HLA mAb (supplemental
Fig.IB). This is consistent with the specificity of w6-32 anti-HLA mAb for human, but not
murine, MHC antigen (Jefferies and MacPherson, 1987; Kahn-Perles et al., 1987) and is in
agreement with the in vitro data on murine SMC treated with anti-HLA mAb (Fig.1J).
Since complement, particularly C5b-9, may activate IGF-1 and inhibit apoptosis of SMC
(Zwaka et al., 2003), and stimulate mitogenesis (Badea et al., 2002; Halperin et al., 1993), we
investigated whether in vivo depletion of complement by cobra venom factor (Alper and
Balavitch, 1976; Pagano et al., 2009) reduced intimal hyperplasia induced by anti-HLA mAb.
As reported in Fig.6D, pretreatment with cobra venom factor did not prevent the formation of
the anti-HLA-induced intimal hyperplasia.
Interestingly, the MMP inhibitor Ro28-2653 inhibited the effect of anti-HLA mAb
treatment by preventing the rise of MMP-2 expression in grafted human mesenteric segments,
Résultats <Article II >
92
the release of MMP-2 into plasma (Fig.6A), the increased PCNA expression (Fig.6A,B) and
neointimal thickening of the grafted arterial segments (Fig.6C,D).
Altogether these data show that, in this experimental model system, the MMP inhibitor
Ro28-2653 prevented neointimal thickening occurring in vivo in grafted human arterial
segments treated with anti-HLA mAb. These data support a role for MMP-2 in the pathogenesis
of transplant vasculopathy and demonstrate the efficacy of pharmacological MMP inhibitors to
prevent this devastating complication.
Résultats <Article II >
93
Discussion.
The innate and adaptive immune systems are thought to play a role in transplant
vasculopathy, but the pathophysiological mechanism of arterial-wall alteration remains partly
understood and conventional immunosuppression is poorly effective to prevent the vasculopathy
(Russell et al., 1997; Soleimani et al., 2006; Wehner et al., 2007). HLA alloantibodies have been
implicated in chronic allograft rejection and transplant vasculopathy, but their mechanism of
action is only partly understood (Bian et al., 1998; Bian and Reed, 1999; Jin et al., 2004). In our
model system, anti-HLA antibodies induce dramatic SMC proliferation and intimal hyperplasia
through a mechanism involving the recently described MMP-2- and nSMase-2-dependent
pathway (Auge et al., 2004; Coatrieux et al., 2007; Tellier et al., 2007). The MMP inhibitor
Ro28-2653 prevents neointimal thickening by blocking MMP-2 and subsequent nSMase-2
signaling.
The first striking result is that anti-HLA humoral immunity (mimicked by) is sufficient to
induce neointimal hyperplasia, as assessed by w6/32 anti-HLA mAb-induced proliferation of
cultured SMC in agreement with (Bian and Reed, 1999; Jin et al., 2005; Jindra et al., 2006), and
by in vivo on human arterial segments transplanted into SCID/beige mice. Interestingly, the
mitogenic of the anti-HLA mAb is independent in vitro of cytokines, growth factors, or other
mediators released by immune cells (SMC were cultured in the absence of immune cells), and
since immune cells are severely defective in vivo in the SCID/beige model. This is consistent
with recent observational studies that suggest a strong association between the humoral immune
response of the recipient and the severity of transplant vasculopathy (Cai and Terasaki, 2005;
Soleimani et al., 2006; Terasaki and Cai, 2005). However, it is not excluded that T cells may
participate in the genesis of allograft vasculopathy in immunocompetent organisms.
Mouse w6/32 mAb is a pan-HLA-A, -B, -C specific IgG2a antibody that recognizes a
conformational epitope involving both the heavy chain of class I MHC and the associated β2-
microglobulin (Barnstable et al., 1978; Kahn-Perles et al., 1987). In our chimerical model
system, this mAb reacts only with HLA antigens/β2-microglobulin of human grafted arteries,
but not with the murine MHC molecules and the murine β2-microglobulin (Jefferies and
MacPherson, 1987; Kahn-Perles et al., 1987; Parham et al., 1979). This is consistent with the
lack of alteration of the mouse aorta, whereas the human grafted arteries exhibit a dramatic
neointimal hyperplasia. This also suggests that the effect of w6/32 anti-HLA class I mAb is a
local phenomenon, involving possible local mediators, but not long-lived circulating growth
factors (that are often inter-specific and could act remotely on blood vessels of the recipient
Résultats <Article II >
94
mice). Finally, it should be noted that anti-HLA class II alloantibodies have been shown to play
a prominent role in transplant vasculopathy (Kaczmarek et al., 2008; Vasilescu et al., 2004).
A second set of results points out the crucial role of MMP-2 and nSMase-2 in the mitogenic
effect of anti-HLA mAb. The rationale for our study came from our previous work on the stress-
induced sphingomyelin-ceramide pathway (Hannun, 1996), which demonstrate that nSMase-2
is involved in SMC proliferation, and is activated by the metalloproteinases MT1-MMP and
MMP-2 (Auge et al., 2004; Tellier et al., 2007). We hypothesized that anti-HLA mAb could
behave as a stress-inducing agent and trigger SMC proliferation and vasculopathy through a
MMP/sphingolipid-dependent mechanism. This hypothesis was supported by in vitro and in
vivo experiments. Interestingly, the data reported here, and those of Reed's group (Reed, 2003)
suggest that multiple signaling pathways acting in concert are involved in the mitogenic effect
triggered by w6/32 mAb.
A third major outcome from these data is the efficacy of MMP inhibitors in the experimental
models used here, and the lack of toxicity of MMP inhibitors, under the conditions used here.
The requirement for MMP inhibitors to reduce neointimal thickening induced by anti-HLA mAb
suggest that MMP-2 (and possibly other MMP targeted by Ro28-2653) play a crucial role not
only in cultured SMC in the presence of various stress agonists (Auge et al., 2004; Coatrieux et
al., 2007; Tellier et al., 2007), but also in vivo in the progression of transplant vasculopathy.
In addition to the direct effect of anti-HLA antibodies on vascular SMC, TNF-alpha and
possibly interferon-gamma, two inflammatory cytokines that activate the MMP/sphingolipid
pathway, are mitogenic to SMC and play a role in transplant vasculopathy (Mitchell and Libby,
2007). Interestingly, MMP inhibitors also abrogate the TNF-alpha-induced activation of the
MMP/sphingolipid pathway and its mitogenic effect on vascular SMC.
MMP inhibitors tested in clinical trials for cancer therapy exhibited non-negligible toxicity,
possibly due to the broad spectrum of these MMP inhibitors (Fingleton, 2008; Raffetto and
Khalil, 2008). However, the more specific MMP inhibitor Ro28-2653, which inhibits mainly
MMP-2, MMP-9, and MT1-MMP, fits well with the specificity required for inhibiting the
MMP/sphingolipid pathway and could be less toxic because of its relatively narrow specificity
(Fingleton, 2008). Moreover, it is of interest to inhibit both MMP-2 and MMP-9 that share
various biological properties and could play a role in transplant vasculopathy (Yamani et al.,
2003). Lastly, this compound was easily administered to mice, and was non-toxic over the
treatment period.
Finally, we must emphasize the originality of the experimental animal model system used
here. Xenografts in immune-deficient mice were primarily utilized in cancer research (Steel,
Résultats <Article II >
95
1978). We recently developed, in our laboratory, a model of xenograft of human mesenteric
arterial segments to replace an excised segment of the infrarenal aorta of SCID/beige mice
(Marcheix et al., 2006). SCID mice exhibit lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and
impaired immune functions of T and B lymphocytes, resulting from mutation of the Prkdc gene,
which is required for V(D)J recombination in developing lymphocytes (Bosma and Carroll,
1991). The "beige" phenotype results from homozygous mutation of the chs1/lyst/beige gene
that causes a general lysosomal defect, leading to major NK cell deficiency (Kaplan et al., 2008).
Homozygous SCID/beige mice exhibit a severe deficiency of the cellular and humoral immune
response, which facilitates the acceptance of xenografts (Shibata et al., 1997). Interestingly,
SCID/beige mice are less prone than SCID mice to develop a “leaky” phenotype, characterized
by residual immunoglobulins and occurring mainly in mice older than 10 months (Bosma and
Carroll, 1991; Mosier et al., 1993). In order to avoid the "leaky" phenotype, we used relatively
young SCID/beige mice (8-12 weeks old), and mice with immunoglobulin levels higher than
0.5 µg/ml were excluded. Under our experimental conditions, we observed neither infiltration
of the human grafted arterial segment by murine immune cells, nor major histological alteration
in untreated controls, thus demonstrating that the SCID/beige mice phenotype prevent both
acute and chronic rejection of arterial xenograft. This supports the idea that the proliferative
effect is only due to anti-HLA mAb and not due to any interaction of murine immune cell or
complement with human arterial segments (supplemental Fig.II). Moreover, we observed no
graft versus host disease over the time of the experiment (6 weeks). This animal model has
additional advantages for studying transplant vasculopathy, since it is relatively easy to conduct
and allows selection of the vascular origin (e.g. type of vessel, normal subjects or patients), and
evaluation of pharmacological drugs in preclinical studies.
In conclusion, we report that anti-HLA mAb trigger SMC proliferation, extracellular matrix
production, and neointimal hyperplasia, independent of any cellular immune response. This is in
agreement with clinical observations suggesting that that B cells and donor-specific antibodies
are able to induce neointimal hyperplasia and transplant vasculopathy in animal models
(Schmauss and Weis, 2008; Soleimani et al., 2006; Wehner et al., 2007), and compromise long-
term allograft survival (Reinsmoen et al., 2004). Our data show the critical role of the
MMP/sphingolipid pathway in transducing mitogenic signaling, and the efficacy of the MMP
inhibitor Ro28-2653, thus suggesting that, in addition to classical immunosuppression, MMP-2
inhibitors could constitute an additional treatment to prevent transplant vasculopathy by reducing
the response of vascular cells to alloantibody-induced stress.
Résultats <Article II >
96
Acknowledgments.
The authors thank C. Nevoit, S. Estasque and C. Bernis for the excellent technical
assistance.
Funding Sources
This work was supported by INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche
Médicale) and Paul Sabatier University.
S.G. is recipient of bursaries from the Société Francophone de Transplantation and
Association pour la Recherche en Néphrologie et Transplantation d’Organes.
Disclosures
Dr H.W. Krell is an employee of Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany.
No other conflict of interest.
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Résultats <Article II >
100
Figure legends.
Figure 1 - Mitogenic effect of w6/32 anti-HLA mAb to cultured SMC and inhibition by
siRNA specific for MMP-2.
A - DNA synthesis induced by anti-HLA mAb or irrelevant antibody (Irr) was evaluated by
[3H]thymidine incorporation (see Methods section). The human SMC line and primary SMC
(pSMC) were starved in serum-free DMEM for 24h, then stimulated by anti-HLA mAb or
irrelevant antibody (1 µg/ml) for 48 h.
B,C - Evaluation of living/dead SMC treated with anti-HLA mAb and irrelevant antibody under
conditions of Fig.1A, and stained by SYTO13 and propidium iodide (SYTO13/PI). Arrows show
apoptotic or post-apoptotic necrotic cells.
D - Time course of MMP-2 activity in SMC treated with anti-HLA mAb (1 µg/ml) or irrelevant
Ab. SMC were preincubated or not for 48 h with siRNA specific for MMP-2 or nSMase-2, or
with scrambled siRNA.
E - Enzymatic determination of nSMase activity in extracts from SMC pretreated or not with
siRNA specific to MMP-2 or to nSMase-2, then treated with anti-HLA mAb or irrelevant
antibody (1 µg/ml) for 30 min before nSMase determination.
F - Western-blots of MMP-2 in extracts from SMC transfected with MMP-2 and scrambled
siRNA (sc) for the indicated time.
G - Western blots of ERK1/2 kinase activation by anti-HLA mAb in the presence or absence of
siRNA targeting MMP-2. Analysis was done using anti-phospho ERK (upper panel) and total
anti-ERK antibodies (lower panel).
H - DNA synthesis, induced by anti-HLA mAb in SMC pretreated or not with siRNA specific
for MMP-2 and for nSMase-2 for 48h. DNA synthesis was evaluated by [3H]thymidine
incorporation as in Fig.1A.
I - DNA synthesis in human SMC and mouse fibroblasts treated with anti-HLA mAb or
irrelevant mAb. DNA synthesis was evaluated by [3H]thymidine incorporation as in Fig.1A.
In A,B,D,E,H, and I, data are expressed as mean ± SEM of three to five separate experiments.
*P < 0.05.
C, F, and G are representative of at least three experiments.
Résultats <Article II >
101
Figure 2 - Matrix metalloproteinase inhibitors Batimastat and Ro28-2653 (Ro) reduce
anti-HLA mAb-induced mitogenic signaling and SMC proliferation.
A,B - Batimastat and Ro28-2653 inhibit anti-HLA-induced activation of MMP-2 (A) and
nSMase-2 (B). Enzyme activities were measured in cell lysates (nSMase-2) or culture media
(MMP-2) from SMC treated with anti-HLA mAb (1 µg/ml) and with Batimastat (Ba 100 nM) or
Ro 28-2653 (Ro 10 nM), for the indicated time (MMP-2), or for 30 min (nSMase-2). Enzyme
activities are expressed as a percentage of basal activity (unstimulated control).
C - Western blots of ERK1/2 from cells treated by anti-HLA mAb in the presence or absence of
Batimastat and Ro28-2653, under the conditions of Fig.2A.
D - DNA synthesis (i.e. [3H]thymidine incorporation) induced by anti-HLA mAb with or without
Batimastat (100 nM) or Ro 28-2653 (10 nM).
E,F - Evaluation of living/dead cells by SYTO13/IP staining. SMC were treated with anti-HLA
mAb in the presence or absence of Ro 28-2653 (10 nM) for 48h.
A,B,D,F, the results are expressed as mean ± SEM of 3 to 5 separate experiments. * p < 0.05
Figure 3 - Anti-HLA mAb trigger mitogenic signaling in human mesenteric artery rings ex
vivo. Inhibition by Ro28-2653.
A - ERK1/2 activation triggered by anti-HLA mAb incubated with arterial rings for the indicated
time and the inhibitory effect of Ro28-2653. Western blots of ERK1/2 were performed under the
conditions of Fig.1G.
B,C - PCNA expression in arterial rings treated with anti-HLA mAb and Ro28-2653. Labeling
with mouse anti-PCNA antibody revealed with a goat anti-mouse secondary antibody conjugated
to streptavidin-HRP. Counterstaining by hematoxylin. Arrows show PCNA-positive nuclei. In
C, counts of PCNA-positive nuclei (%) expressed as mean ± SEM of three separate experiments.
*P < 0.05.
A and B are representative of at least three experiments.
Figure 4 - Anti-HLA mAb increase MMP-2 expression. Inhibition by Ro28-2653.
A - Western blot of pro-MMP-2 and MMP-2 in extracts from arterial rings treated ex vivo with
anti-HLA mAb and with Ro28-2653, for the indicated time and revealed by rabbit anti-MMP-2
antibodies. Representative of three experiments.
B - MMP-2 staining of arterial sections treated ex vivo with anti-HLA mAb for 24h. MMP-2
staining rabbit anti-MMP-2 primary antibody and anti-rabbit antibody secondary conjugated to
streptavidin-HRP.
Résultats <Article II >
102
C – MMP-2 activity released in the culture medium of cells incubated with anti-HLA mAb or
irrelevant mAb (Irr), and Ro28-2653. Enzyme activity was evaluated using the MMP-2
fluorogenic substrate and expressed as % of the basal level. Mean ± SEM of three separate
experiments. *P < 0.05.
D - Zymography of MMP-2 released in the culture medium during stimulation by anti-HLA
mAb and inhibition by Ro28-2653.
A,B, and D are representative of at least three separate experiments.
Figure 5 - MMP-2 expression in grafted mesenteric arteries and MMP-2 activity in the
plasma of mice treated with anti-HLA mAb. Inhibition by Ro28-2653.
A,B - Immunohistochemistry of MMP-2 in human arterial sections grafted into mice treated with
anti-HLA mAb and Ro28-2653. MMP-2 was revealed using rabbit anti-MMP-2 antibody and
goat anti-rabbit secondary antibody conjugated to streptavidin-HRP (colored red). Nuclear
counterstain by hematoxylin. In B, cell counts of MMP-2-positive cells, expressed as positive
cells per 1,000 µm2. Data are the mean ± SEM of four separate experiments. *P < 0.05.
C – MMP-2 activity of the plasma determined at 6 weeks after grafting mice treated (or not) by
anti-HLA mAb and Ro28-2653. Mean ± SEM of four separate experiments. *P < 0.05.
Figure 6 - PCNA expression and neointimal thickening in human mesenteric segments
grafted into SCID/beige mice treated by anti-HLA mAb. Inhibition by Ro28-2653.
A - PCNA expression in human mesenteric arterial segment grafted into SCID/beige mice treated
by anti-HLA mAb and with Ro28-2653. Immunohistochemistry staining was performed using
anti-PCNA antibody and revealed by anti-mouse streptavidin-HRP secondary antibody (positive
nuclei are colored pink-red). Blue hematoxylin counterstain of nuclei.
B - Count of PCNA positive nuclei (expressed as percentage of the total number). Arrows show
some PCNA positive cells.
C - Histological serial sections and schematic representation of the vascular wall of grafted
human mesenteric arteries, untreated (control), or treated with anti-HLA mAb and Ro28-2653.
Upper panel - S Three examples of serial transversal histological sections. Neointimal is colored
pink (false color), whereas media and adventitia are colored blue. Measurement of intimal
thickening were made every 200 µm along the length of the grafted artery (~ 8 mm long). Lower
panel - Schema of a virtual longitudinal reconstruction of the wall of grafted human arteries
showing intimal thickening (red) (mean values of five experiments).
Résultats <Article II >
103
D - Neointimal thickening of grafted arteries from control (untreated) mice (n=12), mice treated
with anti-HLA mAb (H, n=14), irrelevant antibodies (Ir, n=5), anti-HLA mAb plus Ro28-2653
(n= 7) and anti-HLA plus anti-complement cobra venom factor (CVF).
In B and D, mean ± SEM of at least five separate experiments. *P < 0.05.
Résultats <Article II >
104
Supplemental Methods.
Chemicals.
[3H]Thymidine (5 Ci/mmol) was from Perkin Elmer (Wellesley, MA). Anti-HLA monoclonal
(clone w6/32 mAb,) and irrelevant antibodies (Mouse IgG2a) were from Diaclone (Besançon,
France), PCNA antibody from DAKO (Trappes, France). Rabbit anti-MT1-MMP and goat anti-
MMP-2 were from Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA), rabbit anti-(activated)-
phospho-ERK1/2 was from Promega (Madison, WI), rabbit anti-mouse CD-19 (BD Biosciences,
France), rabbit anti-mouse CD3-e (Anaspec, CA, USA), mouse anti-mouse NK-1.1 (Biolegend,
CA, USA), rabbit anti-mouse F4/80 (Santa Cruz biotechnology, Germany), mouse anti-a smooth
muscle actin (Sigma, France).
Fluorogenic substrates for MT1-MMP (DANSYL-Pro-Leu-Ala-Cys(p-OMeBz)-Trp-Ala-Arg-
NH2) and MMP-2 (MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-NH2) were from Calbiochem
(Darmstadt, Germany). SYTO 13, propidium iodide (PI) were from Molecular
Probes/Invitrogen (Cergy Pontoise. France)
Batimastat and Ro 28-2653 were from H.W. Krell (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany).
Cell Culture.
Human aortic SMC (CRL1999) were obtained from ATCC. Human aortic primary culture SMC
(pSMC) was obtained from explanted culture of human aorta. Mouse fibroblasts were obtained
from skin explants.
Cells were seeded sparsely and grown in DMEM containing glutamax and supplemented with
10% FCS (Invitrogen, France). After starving the cells for 24h in serum-free DMEM, they were
stimulated by anti-HLA antibodies (1 µg/ml) or irrelevant antibodies (1 µg/ml) for the indicated
time.
Evaluation of live and dead cells.
Viable, apoptotic and necrotic cells were counted after fluorescent staining of DNA by SYTO-
13/PI (0,6 µM SYTO-13, permeant DNA intercalating green colored probe, and 15 µM
propidium iodide, a non permeant intercalating red probe), as described previously (Vieira et al.,
2000). Living cells exhibit green loose chromatin, apoptotic cells display green condensed
(pyknotic) or fragmented nucleus, post-apoptotic necrotic cells have red condensed nucleus, and
necrotic cells exhibit red loose chromatin.
DNA synthesis.
Résultats <Article II >
105
DNA synthesis was evaluated by [3H] thymidine incorporation, under previously described
conditions (Auge et al., 1998).
SiRNA targeting.
SiRNA targeting MT1-MMP (SMARTPool MT1-MMP, cat number L-062241), MMP2
(SMARTPool MMP2, cat number L-005959), and scrambled siRNA were purchased from
Dharmacon (Lafayette, CO). Human SMC were transfected with 20 µM double stranded siRNA
in DMEM medium containing 10% FCS. SMC were transfected with 20 µmol/L siRNA in
DMEM mixed with 2,5 mol/L CaCl2. After transfection, cells were incubated for 48h, and were
then incubated in serum-free DMEM for 12 h, before experiments.
Zymography.
Gelatinase activity of culture medium from small arteries and plasma from transplanted mice
were assayed by zymography. Briefly, culture media or plasma were run on a 10% SDS--PAGE
gel containing 1 mg/ml gelatin. The gel was then washed twice in 2.5% Triton X-100 solution
for 30 minutes and then five times with water and incubated overnight at 37°C in a developing
buffer (Tris-HCl 50 mmol/L, pH 7.4, CaCl2 10 mmol/L, ZnCl2 5 mmol/L, and 0.05% Brij-35).
The incubation gel was then stained with 0.5% Coomassie blue and destained in a 30 %
methanol / 10% acetic acid solution.
Determination of MMP and nSMase-2 activities.
MMP activity was determined in the media of cultured SMC and in the plasma from transplanted
mice using the fluorogenic substrate for MMP2 (MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-NH2) as
previously described (Netzel-Arnett et al., 1991) . After 2 hours of incubation (37°C), the
fluorescence was read (excitation and emission wavelengths, 325 nm and 393 nm, respectively).
The activity of nSMase-2 was determined in SMC extracts using [choline-methyl-14C]sphingomyelin (120 000 dpm/assay), in 0.1% Triton X-100, 20 mM HEPES buffer, pH 7.4,
containing 1 mM MgCl2 added to 100 µl of cell homogenate. After 2 h of incubation at 37°C,
the liberated [methyl-14C] choline was partitioned and quantified by liquid scintillation
counting as reported (Auge et al., 1998)
Résultats <Article II >
106
Western blots.
For cultured cells, western blots were performed as described previously (Auge et al., 1998; Suc
et al., 1998). For arteries, small rings were crushed and homogenized using a Precellys® system
(Bertin Technology, MI) in solubilizing buffer (50 mM Tris, pH 7.4, 250 mM NaCl, 5 mM
EDTA, 1 mM sodium vanadate, 10 mM sodium pyrophosphate, 160 mM sodium fluoride, 2.5
mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 µM leupeptin, 2 µM pepstatin A, 10 µg/ml aprotinin, 1%
triton X-100) at 4°C. The homogenates were then used as described previously (Auge et al.,
1998; Suc et al., 1998). Protein concentration was determined using the Bradford reagent
(Biorad).
Animals.
C.B-17 SCID/beige mice were obtained from the Bomholtgaard Breeding and Research center
(Ry, Denmark). Only males were used for the transplant experiments, and were 12 weeks of
age. Mice were kept in micro-isolator cages with sterilized water and mouse chow ad libitum.
Only mice with a residual immunoglobulin level lower than 0.5 µg/ml were used for the
experiments. All experimental protocols were approved by the Inserm Institutional Committee
for animal experiments.
Mesenteric artery harvesting.
All procedures concerning the use of human cadaveric tissues were approved by the French
“Agence de Biomédecine” and the Ethics Committee of the University Hospital of Toulouse
(France). Registry for refusal of organ donation was consulted and informed consent was
obtained from relatives for the use of human tissue for medical research. After multi-organ
harvesting for clinical transplantation, a piece of mesentery was removed from the donor. The
piece of mesentery was placed in sterile conservation solution (Celsior®) at 4°C and human
arteries were dissected under an operative microscope. Terminal collaterals of the superior
mesenteric artery were used in our experiments, because of the similarity in their diameter to
the mouse infrarenal aorta. These arteries either were used for mouse transplantation or were
seeded in tissue-culture dishes for ex vivo experiments.
Transplantation operative methods.
Briefly, mice were anesthetized by intraperitoneal injection of Ketamin/Xylazin/Atropin
solution, completed with gaseous anesthesia (Isofluran). Under an operative microscope, a mid-
line laparotomy approach was used as described (Marcheix et al., 2006). The abdominal aorta
Résultats <Article II >
107
was clamped between, proximally, the renal arteries, and distally, the iliac bifurcation. A human
mesenteric arterial segment (similar in diameter to the mouse aorta, i.e. around 0.8 mm of
internal diameter) was then inserted. The proximal anastomosis between the human arterial
segment and the cut mouse aorta was performed using the sleeve technique, as described
previously (Marcheix et al., 2006). For anatomical reasons, the distal anastomosis was done
using point-to-point sutures. After restoring vascular blood flow, hemostasis was verified and
the peritoneal cavity flooded with warm, sterile solution. After wound closure, animals were
kept under a heating lamp until complete recovery. Back leg activity and mobility was a reliable
indicator for early graft state. In cases of paralysis, the mice were excluded from the protocol.
Depletion of complement by Cobra venom factor.
Cobra venom factor (CVF), a functional analogue of C3b, forms a stable convertase that
depletes serum of C3, a key component for complement activation (Alper and Balavitch, 1976).
Mice were injected intraperitoneallly with 9 U.I. of cobra venom factor (CVF; Quidel Corp,
San Diego, USA) per mouse, in 2 boluses 4 h apart 1 day before the first anti-HLA injection
and every 5 days until the end of the protocol (Pagano et al., 2009).
HLA stimulation.
Cells were stimulated with 1 µg/ml of w6/32 anti-HLA mAb. The same concentration was used
for ex vivo stimulation of mesenteric artery sections. For in vivo stimulation, the mice received
weekly intravenous injection of anti-HLA mAb for five weeks (1 µg/10 g body weight),
beginning one week after transplantation.
Histological analysis and histomorphometric reconstitution of arteries.
Six weeks after transplantation, the mice were sacrificed and the grafted human arterial
segments were removed. One part was paraffin embedded for histological analysis. The other
part was embedded in Tissue-Tek and snap-frozen in liquid nitrogen. The morphometric
analysis was performed as described previously (Marcheix et al., 2006). A virtual longitudinal
section of the grafted artery was constructed using our own software. The mean percentage of
neointimal occlusions between the anastomoses was calculated according to a previously
described method (Marcheix et al., 2006). For histological studies, slides were labeled with
mouse anti-PCNA antibodies or rabbit anti-MMP-2 antibodies and were revealed by a
peroxidase-conjugated secondary antibody (immunoperoxidase kit, StrepABComplex/HRP
Résultats <Article II >
108
Duet, Dako). Controls were done by omitting the primary antibody to determine nonspecific
binding. Nuclei were counterstained with hematoxylin.
Statistical analyses.
Data are presented as mean ± SEM. Estimates of statistical significance were performed by by
analysis of variance (one way ANOVA, Tukey test, SigmaStat software). Values of P < 0.05
were considered significant.
Supplemental References
1. Vieira O, Escargueil-Blanc I, Jurgens G, Borner C, Almeida L, Salvayre R, Negre-Salvayre A. Oxidized LDLs alter the activity of the ubiquitin-proteasome pathway: potential role in oxidized LDL-induced apoptosis. FASEB J. 2000;14(3):532-542.
2. Auge N, Escargueil-Blanc I, Lajoie-Mazenc I, Suc I, Andrieu-Abadie N, Pieraggi MT, Chatelut M, Thiers JC, Jaffrezou JP, Laurent G, Levade T, Negre-Salvayre A, Salvayre R. Potential role for ceramide in mitogen-activated protein kinase activation and proliferation of vascular smooth muscle cells induced by oxidized low density lipoprotein. J Biol Chem. 1998;273(21):12893-12900.
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6. Alper CA, Balavitch D. Cobra venom factor: evidence for its being altered cobra C3 (the third component of complement). Science. 1976;191(4233):1275-1276.
7. Pagano MB, Zhou HF, Ennis TL, Wu X, Lambris JD, Atkinson JP, Thompson RW, Hourcade DE, Pham CT. Complement-dependent neutrophil recruitment is critical for the development of elastase-induced abdominal aortic aneurysm. Circulation. 2009;119(13):1805-1813.
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2.3 Discussion
L’objectif de cette étude a été d’étudier les voies de signalisations mitogènes induites
par les anticorps anti-HLA de classe I (clone w6/32). Les travaux menés par EF Reed
démontrent que la stimulation de cellules vasculaires et préférentiellement de cellules
endothéliales par ces anticorps entraine l’activation de la voie PI3K/Akt/mTor conduisant à la
prolifération (Li et al., 2009).
Nous montrons ici que les anticorps anti-HLA sont mitogènes sur les cellules
musculaires lisses in vitro, en l’absence de facteurs pro-prolifératifs tels que certaines
cytokines, hormones, ou cellules immunitaires. Nous confirmons de plus qu’en l’absence de
cellules immunitaires fonctionnelles, ces anticorps induisent un épaississement néointimal dans
les artères mésentériques humaines greffées. Le rôle des anticorps est très débattu à l’heure
actuelle (Gareau et al., 2009; Li et al., 2009; Terasaki, 2003). Diverses études ont tenté de mettre
en évidence les acteurs potentiels impliqués dans le développement des lésions (Sato et al.,
2009; Skaro et al., 2005; Suarez-Alvarez et al., 2009). Il apparaît que la vasculopathie de
transplantation n’est pas la cause d’un seul acteur du système immunitaire mais la conséquence
d’une multitude d’agressions causées par l’ensemble du système immunitaire.
La stimulation des cellules musculaires lisses par les anticorps anti-HLA activent des
métalloprotéases (MMP-2, MT1-MMP et probablement MMP-9).
L’utilisation d’inhibiteur de métalloprotéases à spectre restreint, spécifique de MMP-2 et
MMP-9, permet d’inhiber de manière significative le développement des lésions dans l’artère
humaine greffée, en inhibant la prolifération des cellules musculaires lisses. Ces résultats sont
en adéquation avec les travaux de Hariya (Hariya et al., 2004) montrant que l’inhibition de
MMP-2 par l’ONO-4817 entraine une diminution de la taille des lésions. Cette étude ne précise
toutefois pas si l’inhibition de la prolifération observée est due à la diminution de la dégradation
de la matrice extracellulaire ou si elle est due à l’inhibition du signal mitogène médié par les
anti-HLA.
Ces inhibiteurs ont en commun une séquence peptidique spécifique qui interagit avec la les
MMPs en inhibant leur activité catalytique. Cette séquence peptidique contient une molécule
chélatrice permettant d’interagir avec les ions Zn2+ du site actif de la protéase. Cette approche
bien qu’intéressante d’un point de vue théorique a comme défaut majeur le manque de
spécificité vis à vis des métalloprotéases à inhiber. D’autres approches thérapeutiques sont à ce
jour en cours de développement et se basent sur l’utilisation d’anticorps permettant un meilleur
Résultats <Article II>
121
adressage de la drogue ainsi qu’une plus grande spécificité vis à vis de MMPs particulières.
(Pour revue (Murphy and Nagase, 2008)).
Nos résultats montrent par ailleurs que les anticorps anti HLA activent la sphingomyélinase
neutre de type 2, via MT1-MMP et MMP2, en adéquation avec les résultats précédents observés
avec les agents de stress proathérogènes. Les sphingomyélinases (sphingomyéline – choline -
phosphohydrolases) sont des enzymes catalysant le clivage hydrolytique de la sphingomyéline
conduisant à la production de céramide et de phosphocholine. Le céramide ainsi produit a des
fonctions biologiques per se mais active aussi diverses cascades de signalisation par la
production d’autres lipides bioactifs. Trois catégories de sphingomyélinases sont actuellement
classées en fonction de leur pH optimum acide, neutre ou alcalin. La famille des
sphingomyélinase neutre est constituée de trois types d’enzyme. La nSMase 1 ne possède pas
d’activité sphingomyélinase mais agit en métabolisant le Lyso-PAF (Lyso- platelet activating
factor, ou encore 1-O-alkyl-lyso-phosphatidylcholine) en 1-O-alkylglycérol (pour revue
(Clarke et al., 2006; Marchesini and Hannun, 2004; Pavoine and Pecker, 2009)). La nSMase 2
utilise préférentiellement la sphingomyéline comme substrat et ne présente aucune activité sur
le lyso-PAF. La nSMase 3 dégraderait la sphingomyéline, mais sa fonction n’est pas connue.
Les travaux précédents de l’équipe ont mis en évidence l’implication de la nSMase2 dans la
voie mitogène de stress, ainsi que le rôle de MT1-MMP et MMP2 dans l’activation (indirecte)
de cette enzyme. Les résultats présentés dans cet article montrent que la nSMase2 est également
activée par les anticorps anti HLA. Nous avons par ailleurs étudié l’activation de la
sphingomyélinase acide qui joue un rôle important dans la signalisation en particulier de
l’apoptose. Nos résultats montrent que la sphingomyélinase acide n’est pas activée par les
anticorps anti-HLA.
L’activation de la sphingomyélinase neutre de type 2 permet d’envisager de nouvelles
alternatives thérapeutiques actuellement en cours d’études. Le GW4869 est un inhibiteur non
compétitif des nSMases. Les premiers résultats indiquent que le GW4869 inhibe l’activation de
la sphingomyélinase neutre de type 2 in vitro et ex vivo et la prolifération induite par les
anticorps anti-HLA. La prochaine étape de notre étude sera d’étudier l’effet de cet agent sur le
développement des lésions in vivo, dans le modèle animal de vasculopathie de transplantation.
Il faut noter qu’il n’existe pas actuellement de stratégies thérapeutiques permettant de
limiter efficacement le développement de la vasculopathie de transplantation. L’utilisation des
immunosuppresseurs a un effet limité sur la progression de la pathologie, car non ciblée sur
l’origine et sur l’inhibition de la prolifération des cellules musculaires lisses (Eisen et al., 2003;
Schwarze et al., 2005). L’utilisation d’inhibiteurs de MMPs ou de la nSMase 2 pourraient donc
Résultats <Article II>
122
représenter une alternative thérapeutique permettant de limiter le développement des lésions de
vasculopathie de transplantation en inhibant le signal mitogène médié par les anticorps anti-
HLA.
Résultats <Travaux en cours>
124
1. Sphingosine kinase, S1P et vasculopathie de transplantation
1.1 Introduction
Nous avons précédemment montré que les anticorps anti-HLA sont capable d’entrainer le
développement de lésions caractéristiques de la vasculopathie de transplantation in vivo, en
l’absence de système immunitaire fonctionnel, en induisant la prolifération des cellules
musculaires lisses. Cet effet est dû, au moins en partie, à l’activation d’une cascade de
signalisation impliquant les métalloprotéases MT1-MMP et MMP-2 et la nSMase 2, induisant
la phosphorylation des MAPkinases et à la prolifération des CMLs. Une hypothèse est que
l’activation des MAPkinases via la voie MMP-nSMase 2 est dûe à l’activation de la
sphingosine-kinase 1, qui génère la S1P en phosphorylant la sphingosine formée lors du
métabolisme du céramide (Auge et al., 2004; Coatrieux et al., 2007; Tellier et al., 2007). En
effet, l’activation de la nSMase conduit à l’hydrolyse de la sphingomyeline sur le feuillet interne
de la membrane plasmique, et la production de céramide. Le céramide est puissant second
messager impliqué dans des diverses réponses cellulaires, en particulier (Andrieu-Abadie et al.,
2001; Hannun and Obeid, 2008). Une fois formé, le céramide est métabolisé par les céramidases
ce qui génère la sphingosine. (cf. Figure 15).
Figure 15: Métabolisme sphingolipidique. CDase : Céramidase, CK : Céramide Kinase, DAG :Diacylglycérol, GCase :Glucosyl céramidase, GCS :Glucosyl Céramide synthase, PC :Phosphatidyl choline, SK :Sphingosine Kinase, SMase, Sphingomyélinase, SMS : Sphingomyéline synthase, SPPase : Sphingosine Phosphate phosphatase, SPT :Sérine palmitoyl transférase. D’après (Hannun and Obeid, 2008)
Résultats <Travaux en cours>
125
Ces différentes enzymes (nSMase, céramidases, SK) participent à la régulation de la
balance des médiateurs lipidiques céramide-sphingosine-sphingosine-1-P.
1.1.1 Les sphingosines kinases
Il existe chez l’Homme deux isoformes de la SK (Liu et al., 2000) ayant une certaine
redondance entre elles. En effet, les souris KO pour l’une ou l’autre des isoformes sont
phénotypiquement normales alors que l’inactivation des deux gènes est létale (Allende et al.,
2004; Mizugishi et al., 2005). Ces deux enzymes possèdent également des localisations
subcellulaires différentes ainsi que des rôles opposés : par exemple, la surexpression de SK-1
entraine la croissance cellulaire tandis que la surexpression de SK-2 conduit à l’apoptose
(Spiegel and Milstien, 2003). Au niveau biochimique, elles se différencient par leurs propriétés
et régulations. Le substrat préférentiel de la SK-1 étant la D-erythro-sphingosine et la D-
erythro-dihydrosphingosine, alors que SK-2 catalyse la phosphorylation de la
phytosphingosine, DL-thréo-dihydrosphingosine et le FTY720 (Taha et al., 2006). En condition
physiologique, la sphingosine est répartie à 70% dans les membranes, les 30% restant étant
solubles. SK-1 et SK-2 utilisant préférentiellement la S1P du compartiment membranaire, ceci
nécessite leur adressage au niveau des membranes. Il se produit donc une translocation des SKs
depuis leur compartiment cytosolique aux membranes (plasmiques et autres membranes) en se
liant aux lipides anioniques (Hannun and Obeid, 2008).
1.1.2 Sphingosine 1 Phosphate
C’est un phospholipide bioactif produit intracellulairement, par la dégradation du céramide
par la céramidase permettant la libération de la sphingosine (El Bawab et al., 2000), et sa
phosphorylation par la sphingosine kinase (Kohama et al., 1998; Olivera et al., 1998). Elle est
retrouvée dans toutes les cellules, majoritairement dans les plaquettes (Yatomi et al., 1997) (les
plaquettes n’ont pas d’activités S1P lyase donc sont incapable de dégrader la S1P). La S1P peut
être réversiblement déphosphorylée en sphingosine par la sphingosine phosphatase (Le Stunff
et al., 2002), dégradée irréversiblement par la S1P lyase (Saba and Hla, 2004) en
phosphatidyléthanolamine et hexadécénal, (cf. Figure 15), accumulée en intracellulaire ou
finalement sécrétée dans l’environnement extracellulaire. Par ailleurs, elle peut être produite
directement dans le plasma par l’hydrolyse de la sphingosyl-phosphorylcholine par l’autotaxine
(Clair et al., 2003). Ces différentes productions conduisent à des régulations autocrines et
paracrines des fonctions cellulaires.
Résultats <Travaux en cours>
126
La S1P possède des activités pro-prolifératives connues notamment au niveau vasculaire
où elle entraine prolifération des cellules musculaires lisses (Auge et al., 2004; Kluk and Hla,
2001), migration (Boguslawski et al., 2002; Hobson et al., 2001) et suppression de l’apoptose
(Spiegel et al., 1996).
Elle permet par ailleurs de réguler le tonus vasculaire en interagissant avec la NO synthase
endothéliale mais aussi, en entrainant la contraction des cellules musculaires lisses en fonction
des récepteurs présent à la surface des cellules (Pour revue (Igarashi and Michel, 2009)) et est
largement impliqué via ces récepteurs dans le développement du système vasculaire (Pour
revue (Allende and Proia, 2002)) et dans la perméabilité des vaisseaux (Wang and Dudek,
2009). Elle joue un rôle dans la prolifération cellulaire au cours de la maturation artérielle, dans
les régulations vasculaires et dans la réponse endothéliale à l’hypoxie, et phénomènes de
migration, invasion et angiogénèse (Hla, 2003; Spiegel and Milstien, 2003; Yonesu et al.,
2009).
Elle peut également interférer avec le système immunitaire, en agissant comme
chémoattractant des précurseurs hématopoïétiques (Yanai et al., 2000), des cellules
dendritiques immatures (Idzko et al., 2002), interagissant avec les mastocytes (Jolly et al., 2004)
et les éosinophiles (Roviezzo et al., 2004). De plus, de nombreuses études associent la S1P et
l’inflammation (Baumruker et al., 2005; Niessen et al., 2008).
Les effets de la S1P sont médiés par 5 types de récepteurs (S1P1-5) couplés aux protéines G (Tableau 8, Figure 16)
Tableau 8 : Récepteurs à la S1P, agonistes, inhibiteurs et protéines G couplées. D’après (Rosen et al., 2009; Watterson et al., 2005)
Récepteurs Agonistes Protéines G couplées
S1P1 S1P, Dihydro-S1P, FTY720-P, KRP-203 Gi/0
S1P2 S1P, Dihydro-S1P Gi/0, Gq, G12/13
S1P3 S1P, Dihydro-S1P, FTY-720 Gi/0, Gq, G12/13
S1P4 Phyto-S1P, S1P, Dihydro-S1P, FTY720 Gi/0
S1P5 S1P, Dihydro-S1P Gi/0
Résultats <Travaux en cours>
127
Figure 16 : Récepteurs S1P et signalisations cellulaires. L’activation de la SK peut être réalisée par de nombreux facteurs (cytokines et facteurs de croissance). Ceci entraine la translocation de la SK à la membrane en se fixant sur les PS (phosphatidyl-sérines) ou les PA (acides phosphatidiques) afin d’être physiquement proche de son substrat. La S1P produite peut agir intracellulairement sur des cibles non définies pour l’instant. Elle peut être relarguée en extracellulaire où elle agit sur ses récepteurs couplés aux protéines G., activant diverses voies de signalisations conduisant à la migration, la prolifération ou l’inhibition de la prolifération et l’activation de l’apoptose. D’après (Hannun and Obeid, 2008)
La localisation intracellulaire des différentes enzymes mises en jeu indique que la S1P est
formée au niveau du feuillet interne de la membrane plasmique, en réponse à un stimulus
extérieur (Pettus et al., 2003). La présence sur le feuillet externe de la membrane plasmique de
ses récepteurs indique que la S1P produite doit sortir de la cellule afin d’interagir avec ces
récepteurs. Deux transporteurs sont suggérés dans la régulation du transport de la S1P à travers
la membrane plasmique. Le premier transporteur (CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrane
Regulator) permet l’internalisation de la S1P depuis la membrane plasmique, tandis que le
transporteur ABC (ATP Binding Cassette) ABCC1 entraine l’efflux de S1P vers l’extérieur de
la cellule (Hannun and Obeid, 2008).
Nos travaux précédents indiquent que l’activation de la cascade MMP-nSMase 2 par les
anticorps anti-HLA conduit à la prolifération des cellules musculaires lisses. Nous nous
sommes intéressés au rôle joué par la sphingosine kinase et par la S1P dans l’activation de la
prolifération et le développement des lésions de VT.
Résultats <Travaux en cours>
128
3.2 Résultats
Nous avons dans un premier temps étudié l’implication de la SK-1 dans la prolifération des
CMLs induite par les anticorps anti-HLA. Pour cela nous avons transfecté transitoirement les
cellules avec des siRNA spécifique de la SK-1 pendant 48h avant stimulation.
Figure 17: Effet des anticorps anti-HLA sur l’activité SK et la prolifération cellulaire.
L’activité SK est déterminée par mesure de la formation de sphingosine-1-33P à partir de sphingosine et d’ATP-g33-P. La courbe bleue représente l’activité SK dans les cellules stimulées par les anticorps anti-HLA. La courbe rose représente l’activité SK dans les cellules prétraitées avec les SiRNA dirigés contre la SK-1 puis stimulées avec les anticorps anti-HLA. Les valeurs sont exprimées en pourcentage par rapport au contrôle non stimulé et représentent les moyennes +/- ESM de 4 expériences. (* p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001 par rapport au contrôle non stimulé. ° p <0,05 ; °° p < 0,01 par rapport à la condition HLA seul pour un temps donné). Pour mettre en évidence le rôle de la SK-1 dans la prolifération, les cellules sont cultivées pendant 72h avec les SiRNA dirigés contre la SK-1 puis stimulées avec les anticorps anti-HLA pendant 36h. La prolifération est mesurée par incorporation de [3H]-thymidine. Les valeurs sont exprimées en pourcentage par rapport au contrôle non stimulé et représente les moyennes +/- ESM de trois expériences. (° : p <0,05 (par rapport au point HLA seul) ;** : p <0,01 (par rapport au contrôle)).
Les résultats présentés en figure 17 indiquent que les anticorps anti-HLA induisent une
augmentation significative de l’activité SK dans les cellules musculaires lisses humaines en
culture, avec un maximum d’activation observé dans les 30 premières minutes de stimulation
suivi d’une diminution progressive pour revenir à un niveau basal après 2h de stimulation.
L’inhibition de l’expression de la SK-1 par siRNA bloque la prolifération induite par les
anticorps anti-HLA, ce qui relie le signal mitogène à l’activation de la SK-1.
Résultats <Travaux en cours>
129
Afin de confirmer le rôle de la SK-1 dans la prolifération observée au cours de la VT, nous
avons étudié l’activité de cette enzyme dans un modèle ex vivo, représenté par des segments
d’artères mésentériques humaines mis en culture.
Figure 18 : Analyse de l’activation de la SK-1 sur des segments d’artères mésentériques humaine cultivés dans un milieu dépourvu en sérum, et stimulés pendant les temps indiqués avec les anticorps anti-HLA (1µg/ml). Après broyage des artères, l’activité SK est dosée par mesure de la formation de Sphingosine-1-33P. Les valeurs sont exprimées en pourcentage par rapport au contrôle.
La stimulation des segments d’artères par les anticorps anti-HLA active la SK (Figure 18).
Les observations réalisées in vitro et ex vivo suggèrent que la S1P est impliquée dans la
prolifération des CMLs induites par les anticorps anti-HLA.
Afin de valider cette hypothèse, une analyse in vitro et ex vivo de l’effet des anticorps anti-HLA
sur l’expression d’un des récepteurs de la S1P, le récepteur S1P1 a été réalisée.
Résultats <Travaux en cours>
130
Figure 19 : Les CML (A) sont cultivées pendant 24h dans un milieu sans sérum puis stimulées
pendant 16h avec l’anticorps anti-HLA (1 µg/mL). Les segments d’artère mésentérique humaine (B et C) sont cultivés dans un milieu sans sérum puis sont stimulés pendant 24h avec l’anticorps anti-HLA (1 µg/mL). L’expression de l’ARNm de S1P1 (A) est déterminée par RT-PCR quantitative avec pour gènes de référence β-actine et HPRT. L’expression de l’ARNm de S1P1 (B) et de la protéine S1P1 (C) est déterminée par RT-PCR quantitative avec pour gène de référence GAPDH et β-microglobuline et par western blot après broyage respectivement.
Les résultats présentés en figure 19 indiquent que les anticorps anti-HLA induisent une
augmentation des ARNm du récepteur S1P1 dans les CMLs en culture (Figure 19-A). Ces
résultats sont également observés ex vivo où une augmentation des ARNm de S1P1 par RT-
PCR (Figure 19-B) ainsi qu’une augmentation de l’expression de la protéine S1P1 par western
blot (Figure 19-C) est mise en évidence.
Afin de confirmer le rôle de la S1P dans l’effet mitogène, deux inhibiteurs
pharmacologiques entrant en compétition avec la S1P : Le FTY720 et le KRP 203 ont été
utilisés. Le FTY720 antagonise 4 des 5 récepteurs de la S1P dont S1P1, alors que le KRP203
est spécifique du récepteur S1P1 (Takabe et al., 2008).
Résultats <Travaux en cours>
131
Figure 20 : Les CMLs sont cultivées pendant 24h dans un milieu sans sérum puis stimulées
avec l’anticorps anti-HLA (1 µg/mL) pendant les temps indiqués après avoir été prétraitées ou
non pendant 30 minutes avec du FTY720 (2 µM)(A). L’état d’activation de ERK1/2 est analysé
par western blot. Les segments d’artère mésentérique humaine sont cultivés dans un milieu sans
sérum puis sont stimulés pendant 180 minutes avec l’anticorps anti-HLA (1 µg/mL) après avoir
été prétraités ou non pendant 30 minutes avec du KRP-203 (2 µM)(B). L’état d’activation de
ERK1/2 est analysé par western blot après broyage.
La préincubation des CMLs avec le FTY-720 entraine une inhibition de la phosphorylation
de ERK1/2 induite par les anticorps anti-HLA (Figure 20-A). De même la préincubation des
segments d’artères mésentériques avec le KRP-203 montre une inhibition de la phosphorylation
de ERK1/2 (Figure 20-B)
L’ensemble de nos résultats démontre que la S1P ainsi que son récepteur S1P1 sont
impliqués dans l’effet mitogène induit par les anticorps anti-HLA.
Afin de confirmer ces données, nous avons étudié in vivo l’effet d’un traitement chronique avec
le KRP-203 sur le développement des lésions néointimales, sur notre modèle animal de
vasculopathie de transplantation induite par l’injection d’anticorps anti-HLA. Nous avons par
ailleurs réalisé un dosage de la S1P plasmatique avant et après 5 semaines de traitement par les
anticorps anti HLA.
Résultats <Travaux en cours>
132
Figure 21 : La S1P est dosée par ELISA dans le plasma des souris xénogreffées avant le début du traitement et après les 5 semaines de traitement. La concentration de la S1P dans le plasma avant le traitement est de 0.1135 µM. Après le traitement avec le PBS, la concentration de S1P est de 0.1298 µM. Après le traitement avec l’anticorps anti-HLA, la concentration en S1P est de 0.2236 µM (A). Après xénotransplantation et 5 semaines de traitement hebdomadaire avec 1 µg d’anticorps anti-HLA pour 10 g de souris et/ou de traitement quotidien de 0.1 mg/kg de KRP-203, les souris sont sacrifiées et le greffon humain est explanté. Une analyse histomorphométrique du greffon est réalisée en aveugle à l’aide du logiciel Cyberview pour déterminer le taux d’obstruction du greffon (B, C).
Les résultats présentés en figure 21 indiquent que le traitement des animaux par les
anticorps anti-HLA entraine une augmentation significative des taux plasmatiques de S1P
tandis que les animaux contrôles (transplantés et recevant des injections hebdomadaires de
PBS) ne présentent pas de variations significatives (Figure 21-A).
Résultats <Travaux en cours>
133
Le traitement quotidien des animaux, injectés avec les anticorps anti-HLA, par du KRP-203
(0,1mg/kg/jour) entraine une limitation de la prolifération néointimal induite par les anticorps
anti-HLA (Figure 21 B, C).
Ces résultats démontrent donc qu’il existerait une corrélation entre lésions de vasculopathie de
transplantation liée à l’injection des anticorps anti-HLA et taux de S1P plasmatique.
3.3 Discussion
Les résultats présentés démontrent que la S1P et son récepteur S1P1 sont impliqués dans
l’effet mitogène induit par les anticorps anti-HLA. Ces travaux mettent en évidence de
nouveaux acteurs cellulaires impliqués dans la prolifération des CML représentants de
nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement de la prolifération néointimale
liée à la vasculopathie de transplantation.
Nous montrons ici que la stimulation par les anticorps anti-HLA semble augmenter
l’expression du récepteur S1P1. Ce récepteur, couplé aux protéines Gi/o est exprimé de façon
ubiquitaire et régule notamment la réponse cellulaire liée à la production de S1P induite par des
facteurs de croissance. Ces résultats n’excluent cependant pas l’implication des autres
récepteurs dont le rôle potentiel sera étudié.
Au niveau vasculaire, la S1P ne signale qu’au travers des récepteurs S1P1,2,3 , les récepteurs
S1P4,5 n’étant pas représenté (Sanchez and Hla, 2004). La stimulation via S1P1 entraine
l’activation de PI3-K/Akt et ERK. La stimulation des récepteurs S1P2 conduit à l’activation de
RhoA stimulant la différenciation des CMLs (Grabski et al., 2009) et limitant la prolifération
in vitro et in vivo suite à une agression vasculaire, tandis que S1P3 entraine la libération du
calcium intracellulaire (Ishii et al., 2002). Une étude de Wamhoff (Wamhoff et al., 2008)
démontre que les récepteurs S1P1 et S1P3 ont un effet pro-prolifératif et régulent négativement
les gènes qui définissent le phénotype contractile des CMLs.
La S1P peut également augmenter l’expression de marqueurs de différenciation tels que
SM a-actine, SMMH (smooth muscle cell myosin heavy chain) et SM22a via la voie
RhoA/MRTF (Lockman et al., 2004).
Le rôle de S1P est par ailleurs validé de par l’effet inhibiteur d’agents tels que le KRP203
ou le FTY720 qui inhibent l’interaction S1P/S1P1, et bloquent la prolifération induite par les
anticorps anti-HLA. Le KRP203 est un inhibiteur pharmacologique récemment synthétisé, qui
présente moins d’effets indésirables que le FTY720, du fait de sa plus grande spécificité (il agit
uniquement sur le S1P1). En effet, la présence des récepteurs à la S1P sur de nombreux types
cellulaires peut être la cause des nombreux effets indésirables de ces molécules. Le tableau
Résultats <Travaux en cours>
134
suivant (Tableau 9) résume une partie des données de la littérature sur l’effet de la S1P sur les
différents types cellulaires.
Tableau 9 : Effet de la S1P sur différents types cellulaires. D’après (Brinkmann, 2007)
Cible cellulaire Activité induite Récepteur Nombreux types cellulaires Migration ì S1P1, S1P3
î S1P2 Nombreux types cellulaires Survie S1P1, S1P3
Thymocytes Libération du thymus S1P1 Cellules T et B Libération des nœuds lymphatiques S1P1
Leucocytes/ Monocytes cellules endothéliales
Diminution de l’adhésion à l’endothélium S1P1
Cellules dendritiques et endothéliales
î migration des cellules dendritiques dans les nœuds lymphatiques
S1P1
Mastocytes Migration, dégranulation S1P1, S1P2 Eosinophiles Migration S1P1, S1P3
Cellules endothéliales Angiogénèse, ì imperméabilité endothéliale î barrière endothéliale
Vasodilatation, activation de la eNOS
S1P1 S1P3, S1P2 S1P3, S1P1
Myocytes cardiaques î rythme cardiaque S1P3, S1P1 Cellules musculaires lisses Vasoconstriction, ì pression artérielle,
hyperréactivité des voies respiratoires S1P3, S1P2
(S1P1 ?) Neurones Neurogénèse embryonnaire
Rétractation des neurites S1P1
S1P1 ? Astrocytes et glie Activation et prolifération astrogliale S1P1 ? ,
S1P3 ? Astrocytes, neurones et cellules endothéliales
Inhibition de la communication intercellulaire, entre astrocytes, neurones et
la barrière hémato encéphalique
S1P1 ? , S1P3 ?
Oligodendrocytes Rétractation S1P5
Actuellement le KRP203 fait l’objet d’essais cliniques dont l’objectif est de montrer que
l’association de cette molécule à la cyclosporine à dose subthérapeutique est efficace et permet
de réduire les effets toxiques des traitements immunosuppresseurs conventionnels et donc est
susceptible d’augmenter la survie des greffons (Fujishiro et al., 2006a; Fujishiro et al., 2006b;
Shimizu et al., 2005). Le KRP203, comme le FTY720 a la capacité d’induire la séquestration
des lymphocytes au niveau des organes lymphoïdes secondaires (Wenderfer et al., 2008).
Toutefois nous avons démontré ici un effet protecteur du KRP-203 dans la formation de
l’hyperplasie néointimale induite par les anticorps anti-HLA indépendamment du système
immunitaire.
Résultats <Travaux en cours>
135
En conclusion, cette étude met en évidence un lien entre vasculopathie de transplantation
et cascade de signalisation sphingolipidique.
La stimulation des CMLs par les anticorps anti-HLA entraine une augmentation de l’état
d’activation des acteurs de la cascade sphingolipidique (SK-1, nSMase 2) puis une
augmentation de l’expression de protéines telles que S1P1 permettant l’augmentation de l’état
de phosphorylation de ERK1/2 et l’entrée en prolifération des cellules.
Conclusion
Générale
Perspectives
Conclusion Générale, Perspectives
138
Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent le rôle des anticorps anti-HLA
spécifiques des types HLA de classe I (clone w6/32) dans la prolifération des cellules
musculaires lisses humaines et le développement de lésions caractéristiques de la vasculopathie
de transplantation. Ce rôle a été montré dans un modèle animal de souris SCID/Beige
immunodéprimées, donc dépourvues de système immunitaire fonctionnel, et greffées avec des
artères mésentériques humaines. Les anticorps anti-HLA stimulent la prolifération des cellules
musculaires lisses via l’activation d’une voie de signalisation de stress impliquant les
métalloprotéases MT1-MMP et MMP-2, et la voie des sphingolipides avec l’activation de la
nSMase 2 et dans un second temps de la SK-1, qui génère la S1P et la phosphorylation de
ERK1/2 (cf. Figure 22)
Figure 22 : Schéma récapitulatif de la voie de signalisation mitogène médiée par les anticorps anti-HLA. Sm : sphingomyéline, Cer : Céramide, Sph : Sphingosine, S1P : Sphingosine-1-P, S1P1 : Récepteur 1 à la S1P, nSMase 2 : Sphingomyélinase neutre de type 2, SK-1 : Sphingosine kinase 1.
Conclusion Générale, Perspectives
139
Différentes approches expérimentales ont été utilisées pour étudier l’effet mitogène des
anticorps anti HLA, sur cellules musculaires lisses humaines en culture, sur fragments d’artères
mésentériques humaines stimulés ex vivo par les anticorps, et in vivo sur les souris SCID/Beige
greffées (avec les artères mésentériques humaines) et injectées avec les anticorps anti HLA.
Ces différents modèles ont permis de mettre en évidence les voies de signalisation impliquées
dans la prolifération des cellules musculaires lisses, et de tester l’effet d’inhibiteurs
pharmacologiques spécifiques de cette voie de signalisation.
Nous avons montré plus précisément que l’utilisation d’inhibiteurs de MMP au spectre
restreint à MT1-MMP, MMP-2 bloque la prolifération des cellules musculaires lisses in vitro
et ex vivo et limite la progression des lésions de vasculopathie de transplantation observées lors
de la stimulation des animaux par les anticorps anti-HLA durant 5 semaines.
Des études de biologie clinique sont actuellement réalisées sur des patients transplantés,
présentant ou non une augmentation du taux d’anticorps dirigés contre les épitopes HLA du
greffon. Ces travaux ont pour but de relier, chez le patient transplanté, l’augmentation du titre
en anticorps avec l’augmentation de l’activité MMP-2 et de la S1P plasmatique, et le
développement d’une vasculopathie de transplantation, afin de définir si ces deux molécules
pourraient constituer des marqueurs d’évolution d’une vasculopathie de transplantation et
validerait chez l’homme les résultats observés in vitro et in vivo.
Plusieurs questions restent non résolues et ouvrent diverses perspectives à ce travail.
Les résultats observés montrent que MT1-MMP est activée sous l’effet des anticorps anti-
HLA. Le mécanisme par lequel l’anticorps anti-HLA active MT1-MMP n’est pas actuellement
connu. MT1-MMP serait activée intracellulairement par la furine (Nagase and Woessner, 1999;
Strongin et al., 1995) du fait de la présence d’une séquence particulière RXK/RR, motif de
reconnaissance furine-like, entre le propeptide et les domaines catalytiques. Ce motif entraine
l’activation intracellulaire de MT1-MMP (Pei and Weiss, 1995; Rozanov et al., 2001; Yana and
Weiss, 2000).
La furine est une pro-protéine convertase appartenant à la famille des sérines protéases
transmembranaires (Creemers et al., 1995). Elle n’est pas spécifique d’un type cellulaire
particulier et active par clivage protéolytique des pro-protéines. Elle est localisée
majoritairement dans le réseau transgolgien mais elle peut être retrouvée au niveau du système
endosomal et à la surface cellulaire (Thomas, 2002). Synthétisée sous forme inactive, son
activation est régulée par 2 étapes autocatalytiques, réalisées dans le réticulum endoplasmique
et poursuivies dans le réseau transgolgien (Yana and Weiss, 2000).
Conclusion Générale, Perspectives
140
Des études préalables réalisées dans notre équipe ont montré une activation de cette
proprotéase en amont de la cascade de signalisation MMP-2/nSMase 2/S1P en réponse à une
stimulation des cellules par le TNFa (Tellier et al., 2007). Étudier l’implication de la furine
dans le signal mitogène médié par les anticorps anti-HLA semble donc nécessaire.
Les éléments impliqués dans la transduction du signal suite à la liaison de l’anticorps anti-
HLA sur la molécule HLA de classe I sont inconnus à ce jour. Le récepteur HLA possède une
queue intracytoplasmique courte qui ne permet pas de signalisation per se. Il est probable que
les anticorps anti-HLA induisent l’activation de MT1-MMP par des protéines intermédiaires.
Une de nos perspectives concerne la recherche de ces nouveaux acteurs protéiques impliqués
dans la cascade, notamment les molécules associées au récepteur HLA pouvant transduire le
signal mitogène.
Le stress oxydant pourrait également jouer un rôle dans l’activation de la cascade de
signalisation médiée par les anticorps anti-HLA. De nombreuses études rapportent un lien entre
stress oxydant et vasculopathie de transplantation (Hasegawa et al., 2009; Iwanaga et al., 2007;
Simic-Ogrizovic et al., 1998), notamment du fait de la production de radicaux libres oxygénés
(RLO) par les macrophages dans l’initiation des lésions. Des travaux réalisés au laboratoire ont
montré l’activation de la voie MMP-sphingolipides par les RLO (Coatrieux et al., 2007). Cette
hypothèse est corroborée par des travaux montrant une inhibition de la nSMase lors d’un
traitement à la N-acétylcystéine, l’ubiquinol ou le glutathion, trois composés anti-oxydant
(Adamy et al., 2007; Levy et al., 2009; Martin et al., 2002). De plus la littérature rapporte que
le stress oxydant induit une augmentation de l’expression du récepteur S1P1 dans les cellules
endothéliales (Igarashi et al., 2007). Ces différentes données bibliographiques suggèrent que
ces espèces réactives de l’oxygène pourraient être impliquées dans l’augmentation de
l’expression de S1P1 sous l’effet des anticorps anti-HLA.
Il semble également nécessaire d’étudier la nature de la sphingosine kinase impliquée dans
la génération de S1P sous l’effet des anticorps anti HLA, ainsi que les récepteurs de la S1P
engagés dans la transduction du signal mitogène. Nous avons étudié le rôle de la SK-1 du fait
des nombreuses données bibliographiques rapportant son effet pro-prolifératif et pro
angiogénique. Il existe chez l’Homme deux isoformes de la SK (Liu et al., 2000). La SK-1
contient des régions de très forte homologie avec la SK-2, et une certaine redondance entre les
deux isoformes est observable (Les animaux KO pour l’une ou pour l’autre des SK sont
phénotypiquement normaux alors que l’inactivation des deux gènes est létale)(Allende et al.,
2004; Mizugishi et al., 2005). Malgré que ces deux enzymes comportent de nombreuses
Conclusion Générale, Perspectives
141
homologies et aboutissent à la production de S1P (Taha et al., 2006), elles possèdent des
localisations subcellulaire différentes et des rôles opposés, la surexpression de la SK-1 induisant
la prolifération alors que la surexpression de la SK-2 conduit à l’apoptose (Spiegel and Milstien,
2003). Une perspective serait donc de regarder les conséquences de la stimulation par les
anticorps anti-HLA sur la SK-2, en particulier sa possible inhibition ce qui favoriserait la
surexpression de la SK-1 et donc la prolifération.
Les mécanismes cellulaires induits par la fixation de la S1P sur son récepteur, pourraient
impliquer, comme le démontre Waters (Waters et al., 2003), une transactivation de récepteurs
à activité tyrosine kinase en favorisant la phosphorylation de ces récepteurs, la sécrétion de
facteurs de croissances, ou bien la formation d’un complexe résultant de l’association et de
l’activation de plusieurs récepteurs. En effet, la liaison de la S1P sur son récepteur pourrait
entrainer la production de PDGF dont la liaison avec son récepteur le PDGFR est associé à une
augmentation de la transcription des ARNm de S1P1 (Landeen et al., 2007).
Il sera par ailleurs intéressant d’étudier les liens potentiels existants entre l’activation des
cellules endothéliales et celle des cellules musculaires lisses. En effet, les travaux du groupe de
Reed montrent que l’effet mitogène des anticorps anti HLA implique les voies de signalisation
PI3K-Akt-mTOR dans les cellules endothéliales. Une implication de cette voie pourrait
également être observée dans les cellules musculaires lisses.
Une des perspectives majeure de ce travail sera de développer de nouvelles approches
thérapeutiques permettant d’inhiber spécifiquement la prolifération néointimale dans la
vasculopathie de transplantation. Nous avons montré que l’utilisation d’inhibiteurs de MMPs
permet de réverser partiellement la prolifération des cellules musculaires induites par les
anticorps anti-HLA. D’autres inhibiteurs de cette voie de signalisation pourraient représenter
de nouvelles alternatives thérapeutiques, notamment des inhibiteurs de la nSMase neutre
comme le GW4869, ou le KRP203, inhibiteur de la sphingosine-1-P, associés ou non à d’autres
inhibiteurs (voie mTOR, anti oxydants), dans le but de limiter plus efficacement le
développement des lésions de vasculopathie chez les patients transplantés.
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Annexes
Annexes
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Liste des publications
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