vereinfachung der dinitrophenylhydrazin-methode zur photometrischen bestimmung von ascorbinsäure...
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Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 157, 217--220 (1975) © by J. F. Bergmann, Mfinchen 1975
Vereinfachung der Dinitrophenylhydrazin-Methode zur photometrischen Bestimmung yon Ascorbins/iure
und Dehydroascorbins~iure in Fruchts/iften I . A n w e n d u n g be i s c h w a r z e m J o h a n u i s b e e r s t i B m o s t
K l a u s S c h m i d t u n d E l i s ~ b e t h H o l f e l d e r
Insti tut fiir Obst- und Gemiiseverarbeitung an der Fachhoehsehule Weihenstephan (BRD)
Eingegangen am 9. August 1974
S impl i f i ca t ion of t h e D i n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e M e t h o d for t h e P h o t o m e t r i c De te r - m i n ~ t i o n of Ascorb ic A c i d a n d D e h y d r o a s c o r b i e Ac id in F r u i t Ju ices . I . A p p l i c a t i o n
to J u i c e of B l a c k C u r r e n t
Summary. The photometric determination of ascorbic acid and dehydroascorbie acid by preparing the 2,4-dinitrophenylhydrazone derivative of dehydroascorbie acid ~nd purifying it by thinlayerchromatography was simplified snd adapted to the mieroliter system of Eppendorf Ger/itebau, Hamburg, Germany. Using this method with juice of black current, quite reproducible results for vitamin C contents were obtained. Compared with the method of the International Federation of Fruit Juice Producers (titration with 2,6-dichlorphenolindophenol) the contents of vitamin C found with nine different commercial juices of black current were lower from 13 to 300/0.
Zusammen]assung. Die 2,4-Dinitrophenylhydrazinmethode (DNPH-Methode) in Verbindung mit der dfinnsehichtehromatographisehen Reinigung des Bis-2,4-dinitrophenylhydrazons der Dehydroascorbins~ure zur photometrisehen Bestimmung der Ascorbins/~ure und der Dehydroas- corbins/£ure wird methodisch vereinfacht und an die Arbeitsweise des Mikrolitersystems der Firma Eppendorf angepa~t. Eine Anwendung der Methode bei sehwarzem JohannisbeersiiSmost (Johannisbeersaft, trinkfertig eingestellt) ergab gut reproduzierbare Werte. Verglichen mit der Methode der Internationalen Fruchsaftunion (Titration mit 2,6-Dichlorphenolindophenol) wurden in neun verschiedenen k~uflichen Siil~mosten aus schwarzen Johannisbeeren Vitamin C-Werte gefunden, die um 13--30 ° /n iedr iger lagen.
Einleitung Die photometrische Bestimmung des Bis-2,4-dinitrophenylhydrazinderivates der Dehydroas-
corbins~ure (DAS) zur Ermitt lung yon Vitamin C-Gehalten wurde erstmats yon Roe u. Kuether [1] f/ir Blutplasma und Urin, und yon Roe u. Oesterling [2] ffir Extrakte verschiedener Gemfise und Friichte angewandt. Eine Verbesserung der Spezifit~t der Methode erreichten SzSne [3] dureh Anwendung der Papierchromatographie und Stroheeker [4] durch Anwendung der Dfinn- schiehtehromatographie zur I~einigung des Bis-2,4-dinitrophenylhydrazinderivates der DAS. Eine Zusammenfassung der ganzen Anzahl yon Modifikationen dieser Methode mit kritischen Betrachtungen hinsichtlieh einer Anwendba.rkeit in derNahrungsmittelpraxis finder man in ,,Vit- mine, Chemie und Biochemie" v. Fragner [5]. Eine Anwendung der Methode fiir Vitamin C in Bier wurde kfirzlieh yon Postel [6] ver5ffentlicht.
Die im folgenden beschriebene modifizierte 3iethode stellt eine Vereinfaehung und Ratio- nalisierung mit Hilfe des Mikrolitersystems der Firma Eppendorf dar und wurde ~iir die AS- und DAS-Bestimmung in schwarzem JohannisbeersiiBmost angew~ndt. Ffir s~mtlieh Arbeitsschritte werden einheitliche Reaktionsgef~$e aus Kunststoff mit angesetzter VerschluSkappe beniitzt (Inhalt 1,5 ml).
Methodik ~ Notwendige t~eagentien und Lgsungen
2 g 2A-Dinitrophenylhydrazin/100 ml 45% ig H2 S Q (0,1 tool), Lsg. I. - - 125 mg 2,6-Dieh- lorphenolindoph.enol/50 ml H20 (7,7 mmol), Lsg. I I immer friseh berciten. - - 10 g Thioharnstoff/ 100 ml 50°/oig. Athanol (1,3 tool), Lsg. I I I . - - 8 g Triehloressigs~ure/100 mt H~O (0,5 tool), Lsg. IV. - - 100 mg Ascorbinsgure/11 2°/oige Oxalsgure (0.568 retool), Lsg. V. - - 0xalsgure 2°/oig, Lsg. VI. - - Chloroform, VII. - - Essigsguregthylester, VIII .
1 Herrn Prof. Dr. H. Simon danken wir fiir die leihweise Uberlassung eines K/ivettenwechsel- automaten und eines Schreibers zum Filterphotometer der Firma Eppendorf. ~rgulein R. Wester- meier danken wir ffir die sorgfgltige Ausfiihrung der Analysen.
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Analysenvorschri]t Schwarzen Johannisbeersuft mit 2%iger Oxals~ure so verdfinnen, dab eine AS 4- DAS-Kon-
zentmtion yon rd. 50--150 mg pro 1 erreicht wird. Reaktionsprodukte gbzentrifugierten (12000 × g, 4 rain). Den Uberstand fiber ein, zwischen
Gef~B und einer siebartig durchlScherten VerschluBk~ppe eingeklemmtes kleines Rundfilterp~pier mit einer Wasserstr~hlpumpe absaugen. Danach das Filterpapier vorsichtig in das Gef~B stoBen. Auf den noch feuchten ~'iederschlag 1 ml Essigs~ure~thylester pipettieren, mit der Originalver- schluBkappe verschlieBen und das rote 2,4-Dinitrophenylhydr~zon der DAS dutch Schfitteln im t~otationsmischer ca. 1 Std extrahieren. Von dieser Essigs~ure~thylesterlSsung mit einer Mikro- capillare 50 ~l auf eine DC-Alufolie Kieselget 60 auftragen und mit Chloroform/Essigsgure~thyl- ester (1 4- 1) 1 Std lang entwickeln.
In das Reaktionsgef~B pipettieren Konzentration im Test in mmol
Probe (wenn notwendig verdfinnen) 0,5 ml 0,1--0,3 2,6-DichlorphenolindophenollSsung (II) 0,5 ml 2,7
t~eaktionsgef~B verschlieBen und ira Rotationsmischer ~ 10 rain schfitteln, danach zupipettieren
ThioharnstofflSsung (III) 0,05 ml 46 Trichloressigs~ure (IV) 0,05 ml 18 2,4-DinitrophenylhydrazinlSsung (I) 0,30 ml 21
~eaktionsgef~B verschlieBen, im Rotationsmischer 1 min schfitteln and dann im Thermostst ~ bei 25 ° C fiber Nacht oder ca. 15--16 Std incubieren.
Platz ffir insgesamt 24 Reaktionsgef~Be.
Die ziegelrote Bsnde abschuben und in einem t~eaktionsgef~13 aus Plastik mit 1 ml H 2 S04 (12 mol) 1/2 Std im l~otstionsmischer extrahieren und yore unlSslichen Kieselgel abzentrifu- gieren. Die klare rStlich gef~rbte fiberstehende LSsung in Halbmikrokiivetten oder in einer Halb- mikrodurchlsufkfivette bei einer Wellenl~nge yon 546 nm in einem geeigneten Photometer gegen einen gleich behandelten Blindwert messen.
Beredmung der Ergebnisse Ep x F x St
Est -- mg DAS 4- AS pro 1 der unverdfinnten Probe. Ep = Extinktion der Proben-
15sung, Es~ = Extinktion der AS-StsndardlSsung, St = rag/1 AS der StandardlSsung, F = Ver- dfinnungsfaktor der ProbenlSsung.
Diese Arbeitsvorschrift erfaBt die AS und die DAS gemeinsam. Will man die DAS ~llein be- stimmen, so ersetzt man in der Arbeitsvorsehrift die 0,5 ml 2,6-Dichlorphenolindophenoll6sung durch 0,5 ml H20. Die Berechnung ist die gleiche. Die AS allein erh~lt man dsnn sus der Differenz.
Ergebnisse und Diskussion
~/berpri~/ung der Methode 1 Tell Schwarzer Johannisbeersi iBmost (n~tfirHcher Gehalt an AS ÷ DAS 212
rag/l) wurde mi t 1 Tefl 2 °/oiger Oxals~ure und jeweils zwei Teilen eines AS-Standards 50 rag/l, eines AS-Standards 125 rag/1 und eines AS-Standards 200 rag/1 gemischt und gemessen. Wie aus Tab. 1 hervorgeht, wurde die dem schwarzen JohannisbeersiiB- most zugesetzte Menge AS zu 98- - 110 % wieder gefunden.
I n einem weiteren Versuch wnrde die Reproduzierbarkei t der Werte mi t 5 ver- schiedenen AS-Standards 33,5; 50; 100; 125 und 200 mg/] getestet. Die in Tab. 2 zusammengefaBten Ergebnisse l~ssen es vortei lhaft erscheinen, die Best immnngs- proben mi t 2 %iger Oxalsaure so zn verdfinnen, dab ein AS 4. DAS-Gehal t yon ca. 100 mg/l erhal ten wird. Die mitt]ere Abweichung der Einze lbes t immung bei den 100, 125 u n d 200 rag/1 AS-Standards bet ragt 6--.7 rag.
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Ergebnisse mit schwarzem Johannisbeersiiflmost Neun schwarze Johannisbeers£fte verschiedener t terstel lerf irmen, wurden mi t der
Methode der In t e rna t iona l en F ruch t sMtun ion (Titrat ion mit 2,6-Dichlorphenolin- dophenol) [7] und mi t der modifizierten 2 ,4-Dini t rophenylhydrazinmethode auf ihre
Tabelle 1. Bestimmung yon Ascorbins~ure und Dehydroascorbinsgure in schwarzem Johannis- beersiiBmost nach Zusatz versehiedener AS-Standards
Mischung (1 + 1 + 2) aus Extinktion schwarzem Johannisbeer- bei siiBmost (212 rag/1 546 nm AS -~ DAS), Oxalsiiure 2°/oig und drei AS-Standards
Ascorbins£ure -~ Dehydroas- eorbins£ure Gehalt der Mischungen rag/1
Ascorbins~uregehalt der zugegebenen Aseorbins/iure- standards wieder gefunden
mg/1 %
AS-Standard 50 rag/1 0,175 77,5 49 98 AS-Standard 125 mg/1 0,275 122 138 110 AS-Standard 200 rag/1 0,360 159 212 106
Tabelle 2. Der mittlere und wahrscheinliche Fehler des Mittelwertes der Ascorbins~urebestimmung naeh der modifizierten 2,4-Dinitrophenylhydrazinmethode, gemessen mit versehiedenen Aseor-
binsi~urestandards (Mittelwerte aus 4 Bestimmungen)
Ascorbinsiiure Extinktion bei Mittlerer Fehler Wahrscheinlicher Standardl6sungen 546 nm Fehler rag/1 % %
33,3 0,064 ~ 9,5 ± 6 , 4 50 0,113 ±11,0 ~:7,4
100 0,227 :J: 2,8 ± 1 , 9 125 0,277 ± 3,8 ±2 ,5 200 0,453 -4- 3,5 ± 2 , 4
AS bzw. AS- und DAS-Gehalte nntersucht . Vergleicht m a n die Ergebnisse der beiden Methoden in Tab. 3, so f indet m a n mit der IFU-Methode bei einzelnen S/iften bis zu 30 % h6here AS-Gehalte. Zweifelsohne ist die DNPI t -Methode in Verb indung mi t der Dfinnsehiehtehromatograptfie der Ti t ra t ion mit 2,6-Diehlorphenolindophenol in ge- f/ irbten SMten und Sfil3mosten an Genauigkei t u nd Spezif i tgt / iberlegen.
Tabelle 3. Ascorbins~ure- und Dehydroascorbins~ure-Bestimmungen naeh der modifizierten 2,4-Dinitrophenylhydrazinmethode und nach der Methode der Internationalen Fruchtsaftunion
(IFU) in sehwarzen JohannisbeersiiBmosten verschiedener Herstellerfirmen
Schwarzer ~Best immung nach der modifizierten Bestimmung nach der Johannisbeersfifi- 2,4-Dinitrophenylhydrazinmethode 3{ethode der IFU most Aseorbins~ure + Aseorbinsgure Aseorbinsgure
I)ehydroaseorbin- s~ure rag/1 mg/1 Nr. rag/1
1 403 375 505 2 189 176 242 3 138 132 162 4 161 153 222 5 157 148 141 6 594 583 687 7 260 234 293 8 183 176 202 9 163 156 2O2
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Anmerkung zur Spezi/it~it der DN PH-Methode Die D-Araboascorbinsgure (Isoascorbins~ure) wiirde, wenn vorhanden, bei der DNPH-Methode
miterfaBt werden. Zur Niterfassung der 2,3-Diketogulons~ure wgre folgendes zu sagen: Naeh Arbeiten yon E1 Khadem et al. [8] bildet die DAS in saurer LSsung mit 2,4-Dinitrophenylhydra- zin das Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazon) der DAS, das dunkelrot gef~rbt ist. Nur unter alkali- sehen Bedingungen wird diese Verbindung in das Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazon) der 2,3-Diketo- gulons~ure umgewandelt, das dann seinerseits unter sauren Bedingungen zum 1-(2,4-dinitro- phenyl) -3- (trihydroxypropyl) -4,5- (pyrazoldion)-4- (2,4- dinitrophenylhydrazon) weiterreagieren kann. Letztere Verbindung ist or~ngegelb gefgrbt und kann unter sauren Bedingungen auch direkt aus der 2,3-Diketogulonsgure und 2,4-Dinitrophenylhydrazin gebildet werden. Die oben genannten Autoren zeigen auch, dag dutch Jod das Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazon) der DAS bei 85 ° C in 5--10 rain zu einem Azohydrazon oxidiert werden kann. Da bei einer chromatographi- schen Trennung der 2,4-Dinitrophenylhydrazone die rot gefArbte Bande zur Bestimmung herange- zogen wird, mul~ diese Bande das Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazon) der DAS enthalten. Ob das 2,4-Dinitrophenylhydrazonprodukt der 2,3-Diketogulonsgure das orangegelb gef~rbt sein soll, die gleichen chromatographischen Eigenschaften hat, wurde yon uns nicht nachgeprfift.
Vorteile der modi/izierten D:VPH.Methode im Vergleich zu /ri~heren A~'beitsweisen (z. B. [4]j: 1. Die Extraktion fiberschiissigen 2,6-Dichlorphenolindophenols mit Di~thyl~ither nach Oxida-
tion yon AS zu DAS entfallt. 2. Abfiltrieren des I~iederschlages und Extrahieren des Bis-phenylhydrazons mit Essigsaure-
athylester linden im gleichen Reaktionsgefi~l~ start. Dabei entfallt das Filtrieren mit Glas- filtertiegeln, Sauberwaschen des l~iederschlages, Aufnehmen des Niederschlages in Essigs~ure- ~thylester, Einengen der Essigs~iure~thylesterl5sung bis zur Trockene und Aufnehmen des l~iickstandes in einem bestimmten Aliquot Essigs~ureathylester.
3. Die auf die DC-Platten aufzutragende Menge an LSsung ist stark reduziert worden (Einsp~ren yon DC-Platten).
4. Die zu m~nipulierenden Flfissigkeitsmengen liegen zwischen 0,05 und 1 ml und sind mit Hilfe yon Eppendorfpipetten und Mikrok~pillaren leicht, schnell und genau zu handhaben.
5. Die klcinste mit einer Genauigkeit yon ± 20/0 Fehler (mitt]ere Abweiehung vom Mittelwert) bestimmbare Ascorbinsi~uremenge ist 50 ~g unter den angegebenen Bedingungen. (Diese Menge liel~e sich dureh iimderung der Bedingungen etwa um den Faktor 10 verringern.)
Literatur
1. l~oe, J.H., Kuether, C.A.: J. Biol. Chem. 147, 399 (1943) 2. Roe, J.H., 0esterling, M.J.: J. Biol. Chem. 152, 511 (1944) 3. Sz6ne, K.: Nahrung 4, 825 (1960) 4. Strohecker, R., jr., Pies, H.: Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 118, 394 (1962) 5. Fragner, J.: Vitamine, Chemie und Biochemie, Bd. I, S. 427. Jena: Gustav Fischer VerIag
VEB 1964 6. Postel,W.: Brauwissenschaft 25, 354 (1972) 7. Analysen der Internationalen Fruchtsaftunion, Analyse Nr. 17. W~denswil/Schweiz: Eidgen.
Forschungsanstalt 1964 8. E1 Khadem, H., Meshreki, M. I-I., E1 Ashry, H. S., E1 Sekeili, M. : Carbohydr. Res. 21, 430 (1972)
Dr. K. Schmidt E. ttolfelder Institut fiir 0bst- und Gemfiseverarbeitung an der Fachhochschule Weihenstephan D-8050 Freising-Weihenstephan Bundesrepublik Deutschland