Aus dem Tierarztlichen Institut der Universitat Gottingen Direktor: Professor Dr. Mitscherlich

dem Staatlichen Veterinaruntersucbungsamt ArnsberglWestf. Direktor: 0b.-Reg.-Vet.-Rat Dr. Schaal

und dem Staatlicben Tierseucbenbekamp fungsdienst Niedersacbsen Leiter: Dr. H.-D. Jahnke

Vergleichende Untersuchungen iiber die Differenzierung von nach Pappenheim und Wright gefarbten Blutausstrichen

im Rahmen der Leukose-Diagnostik

Von

A. TOLLE, E. SCHAAL und H. D. JAHNKE

Mit einer Abbildung

(Eingcgangrn am 20. Oktobrr 1965)

Bei hamatologischen Reihenuntersuchungen auf Rinderleukose werden die Untersuchungsinstitute vor erhebliche arbeitsmafiige und organisatorische Pro- bleme gestellt. Wenn auch der Einsatz elektronischer Partikelzahlgerate bei der Bestimmung der Leukozytenzahl eine weitgehende Automation ermoglicht (4), so fordern besonders die von einem bestimmten Grenzwert ab anzufertigenden Blutausstriche, ihre Anfarbung und mikroskopische Differenzierung hochsten personellen Einsatz. Es liegt daher im Sinne eines reibungslosen Untersuchungs- ablaufs, die Methodik bei aller erforderlichen Sicherheit und Genauigkeit mog- lichst einfach zu gestalten.

Die vom Bundesminister fur Ernahrung, LandwirtschaR und Forsten her- ausgegebenen Richtlinien ( 5 , 3 ) legen der hamatologischen Untersuchung in den tierarztlichen Instituten die Anfertigung des Diff erentialblutbildes unter Ver- wendung der Farbung nach PAPPENHEIM (1 ) und die Differenzierung von 100 Leukozyten zugrunde. Die klassische Farbemethode nach PAPDENHEIM gibt auch bei den gerinnungsgehemmten und formalinstabilisierten Blutproben gute Farberesultate; die Blutbilder sind pragnant und die Unterscheidung der Blut- zellen ist optimal moglich. Die Farbung dauert allerdings 20 Minuten und er- fordert 2 Farblosungen. Demgegenuber hat sich in Amerika seit langem eine Schnellfarbemethode mit Eosin-Methylenblau-Losung nach WRIGHT (6) durch- gesetzt, die sich bei gleichem Farbeeff ekt schneller und einfacher durchfuhren 1afit.

Als besondere Vorziige der hamatologischen Schnellfarbung nach WRIGHT werden im einzelnen angefuhrt:

Vergleichende Untersuchungen im Rahmen der Leukose-Diagnostik 63

I. Die Farbung dauert nur 2-3 Minuten und ist damit als Schnellfarbung

2. Es wird nur eine Farblosung benotigt, die verschlossen unbegrenzt halt-

3. Trotz ,der kurzen Farbezeit wird eine optimale Differenzierung der

Zur Vermeidung von Fehlerquellen sind auch bei der WRIGHT-Farbung, wie bei allen Farbemethoden, nur sorgfaltig gereinigte und entfettete Objekt- trager und annahernd neutrales Wasser ( p H 7,2) zu verwenden. Um die etwas umstandliche Einstellung des pH-Wertes mit 1 O/oiger Natriumcarbonatlosung zu vermeiden, liefert die Firma Merck mit der Farblosung zugleich Puffer- substanzen zur Herstellung nach WEISE gepuff erten Wassers. Fur die Pufferung werden fur 5 Liter Wasser 5,7 g Dinatriumhydrogenphosphat und 2,45 g Kaliumdihydrogenphosphat nach Sorensen in ausgekochtem dest. Wasser auf- gelost.

Es lag auf der Hand, die Brauchbarkeit dieser Methode im Routinebetrieb der Leukose-Diagnostik zu iiberprufen. Auf Vorschlag des Unterausschusses ,,Leukose-Bekampfung" beim Bundesminister fur Ernahrung, Landwirtschafi und Forsten wurden unsere beiden Institute mit der Durchfuhrung von Ver- gleichsuntersuchungen betraut. Gleichzeitig sollte bei diesem Untersuchungs- vorhaben auch geklart werden, ob die Anzahl der zu differenzierenden Zellen von 100 auf 50 Leukozyten je Blutausstrich und Tier reduziert werden kann.

zu bezeichnen.

bar ist.

Leukozyten in den gewohnten Farbtonen ermoglicht.

1 - 100 101 - 200 201 - 300 301 - LOO

Material und Methodik Versuchsanordnung:

Zwischen dem Staatlichen Veterinaruntersuchungsamt in Arnsberg (A) und dem Tierarztlichen Institut in Gottingen (G) wurden wochentlich uber 8 Wochen je 50 Blutausstriche aus den laufenden Leukoseuntersuchungen ausgetauscht. Die Ausstriche wurden dabei doppelt angefertigt und von jedem Institut mit einer der beiden Farbungen ausgewertet. Das Schema der Versuchsanordnung ergibt sich aus T a b e l l e 1. Auf diese Weise wurden insgesamt von 400 Tieren 800 Blutausstriche uberpriifi.

T a b e l l e I S c h e m a d e r V e r s u c h s a n o r d n u n g

A Wright - Fbg. G Pappenheim - Fbg. A Pappenheim - Fbg. G Wright - Fbg. G Pappenheim - Fbg. A Wright - Fbg. G Wright - Fbg. A Pappenheim - Fbg.

I Lfd. Nr. der Blutausstr. I lnstitut I Farbung I lnstitut 1 Farbung I

Farbemethoden: Anfertigung der Ausstriche rnit geschliff enem Deckglas per Hand.

Farbung nach WRIGHT: Lufitrockenen Ausstrich mit 1 ml konz. Eosin-Methylenblau-Farblosung

(fertige Losung der Firma Merck) bedecken. 1 Minute einwirken lassen. Danach Zugabe von 1 ml gepuffertem Wasser (mit Stammlosung nach

SORENSEN auf pH 6,s-7,0 eingestellt). 2 Minuten einwirken lassen. Mit ge- puffertem Wasser (s. 0.) abspulen.

Lufitrocknen lassen.

64 TOLLE, SCHAAL und JAHNKE

Anzahl der differenz. Farbernethode I Leukozyten

Farbung nach PAPPENHEIM: Anfertigung eines Ausstrichs wie oben. Lufttrockenen Ausstrich mit 1 ml May-Grunwald-Losung (Fa. Merck) be-

3 Minuten einwirken lassen. Danach Zugabe von 1 ml gepuffertem Wasser (s. 0.). 1 Minute einwirken lassen. Danach Farblosung abgiei3en. Ohne Spulung mit frischhergestellter

15 Minuten einwirken lassen. Mit gepuffertem Wasser (s. 0.) abspulen. Von jedem Ausstrich wurden je Farbemethode 4 X 50 Leukozyten ausge-

zahlt. Die Ergebnisse sind auf IBM-Karten nach statistischen Gesichtspunkten ausgewertet worden.

decken.

Giemsa-Losung (10 Tropfen auf 10 ml Wasser) bedecken.

S V

I Pappenheim 5 0 I Wriaht

57.L0 4.60 7.65

57.50 436 7.50

Pappenheim 57.9

Bei der Differenzierung von 50 Leukozyten sind die Ergebnisse auf 100 bezogen worden, da gemeinhin das Diff erenzierungsergebnis prozentual aus- gedruckt wird. Damit ist ein unmittelbarer Vergleich dieser Kategorie mit dem unteren Teil der Tabelle moglich, der die Differenzierungsergebnisse von 100 Leukozyten berucksichtigt.

Aus der Tabelle geht hervor, dai3 innerhalb der Auszahlung der beiden Gruppen (50 und 100Leukozyten) sowohl bei der PAPPENHEIM- als auch bei der WRIGHT-Farbung Mittelwerte, Standardabweichung und Variationskoeffi- zient gut ubereinstimmen.

3.26 5,63

Vergleichende Untersuchungen im Rahmen der Leukose-Diagnostik 65

Farbernethode Anzahl der differenz. Leukorylen Korrelationskoeff izienl des Lyrnphozytenprorentsatzes

50 : 50 0.87 50 : 100 0.97

50 : 50 0.88 0.97 50 : 100

Pappenheirn

_p_ - Wright

Die Sicherheit der Differenzierung kann auf Grund der vorliegenden Daten bei beiden Farbemethoden als gleich gut angesehen werden. Wegen der gunstigeren Farbetechnik, insbesondere unter Berucksichtigung der Zeiterspar- nis, durfte bei Reihenuntersuchungen im Rahmen der Leukose-Diagnostik der WRIGHT-Farbung der Vorzug gegeben werden.

Jedenfalls kann nach diesen Ergebnissen mit Sicherheit gesagt werden, dai3 die WRIGHT-Farbung bei einwandfreier Durchfuhrung der Blutbildtechnik keine schlechteren Diff erenzierungsergebnisse als die bisher vorgeschriebene PAPPENHEIM-Farbung erwarten lafit. Dem hat der Bundesminister fur Ernah- rung, Landwirtschafk und Forsten zwischenzeitlich Rechnung getragen, wenn er auf dem Erlaflwege neben der in seinen Richtlinien vom 8. 2. 1965 emp- fohlenen Farbung nach PAPPENHEIM nunmehr auch die Farbung nach WRIGHT in der von uns naher beschriebenen technischen Durchfuhrung zugelassen hat.

Bei der Uberprufung der notwendigen Anzahl der zu diff erenzierenden Leukozyten verringerte sich das arithmetische Mittel der Standardabweichung bei beiden Farbemethoden durch die Auszahlung von 100 gegenuber derjenigen von 50 Leukozyten von etwa 4,4 auf 3,3.

In der Tabelle 3 sind die Korrelationen der Diff erenzierungsergebnisse von 50 : 50 und 50 : 100 Leukozyten in bezug auf den Lymphozytenprozentsatz dar- gestellt. Bei der Differenzierung von 100 gegenuber 50 Leukozyten erhoht sich der Korrelationskoeffizient um etwa 0,l auf 0,97.

Die Steigerung der diagnostischen Sicherheit bei der Differenzierung von 100 gegenuber 50 Leukozyten ist in unserem Material so deutlich, dai3 wir uns der Empfehlung von KLEIN (1965) nicht anschlieflen mochten, generell nur 50 Leukozyten pro Probe auszuzahlen. Bei der Umrechnung der ermittelten prozentualen Lymphozytenzahl auf die absolute Lymphozytenzahl ist zu be- denken, dai3 schon ein geringer Unterschied des Differenzierungsergebnisses sich deutlich bemerkbar macht und gegebenenfalls eine andere Beurteilung des Tieres nach sich ziehen kann. Bei der subjektiven Beeinfldbarkeit des Auszahlungs- vorganges sollten mo lichst alle sich negativ auswirkenden technischen Einfliisse

die Aussage um so genauer wird, je mehr Leukozyten differenziert werden. Nach Tabelle 3 bietet die Differenzierung von 100 Leukozyten je Blutprobe hinreichende Sicherheit.

Abschlieaend mochten wir erwahnen, daf3 die Projektion der Blutbilder auf einen Wandschirm mit Hilfe eines Okularprismas und der Quecksilber- hochstdrucklampe HBO 200 bei Reihenuntersuchungen eine wesentliche Er- leichterung fur den Untersucher darstellt.

gering gehalten wer d en. Es liegt mathematisch-statistisch auf der Hand, dai3

Zbl. Vet. Med., Reihe B, Heft 1 5

66 TOLLE, SCHAAL und JAHNKE

Wir haben die in Abbildung 1 dargestellte Einrichtung der Firma Zeiss, Oberkochen, verwendet. Die Projektion gestattet daruber hinaus eine Kontrolle der Diff erenzierungsergebnisse durch den Laborleiter.

Abb. 1. Mikroprojektionseinrichtung der Firma Zeiss

Zusammenfassung Es wird uber den Vergleich der PAPPENHEIM- und WRIGHT-Farbung zur

Diff erenzierung von Leukozyten berichtet. Beide Farbemethoden sind in der diagnostischen Sicherheit a h gleichwertig anzusehen. Die WRIGHT-Methode hat den Vorteil einer wesentlichen Arbeitserleichterung durch verkurzte Farbezeit und einfachere Farbetechnik. Um die Fehlerbreite des Auszahlverfahrens mog- lichst gering zu halten, sollte die Auszahlung von 100 Leukozyten je Blut- ausstrich beibehalten werden.

Summary Comparative studies of the blood films stained with Pappenheim and Wright stains

for diagnosis of leucosis Both these staining methods are equally of value for the differentiation of

leucocytes. WRIGHT’S method is less laborious because of the shorter staining time and the simpler technique. To reduce the counting error, 100 leucocytes should be counted in each film rather than 50. Projection onto a wall screen by an eye-piece prism makes counting easier and enables the person in charge of the laboratory to check the correctness of the staining.

Resume Recherches comparees concernant 1’Ctude de lames de sang colorees selon les

mkthodes de Pappenheim et de Wright dans le cadre du diagnostic de la leucose Les auteurs ont coinpark les colorations de PAPPENHEIM et de WRIGHT

pour la diffkrenciation leucocytaire. Les deux methodes peuvent &tre con-

Vergleichende Untersuchungen im Rahrnen der Leukose-Diagnostik 67

cerne la precision du diagnostic. La mkthode de WRIGHT possirde l'avantage d'une simplification du travail par suite d'un temps de coloration plus court et d'une technique plus simple. Pour maintenir l'erreur des numkrations dans les limites les plus faibles possibles, il est recommandk de diffkrencier 100 leuco- cytes par lame.

Resumen Estudios comparativos sobre la diferenciacibn de extensiones sanguineas coloreadas

seghn Pappenheim y Wright en el marco del diagn6stico de la leucosis Inf6rmase sobre la comparaci6n de las coloraciones segdn PAPPENHEIM y

WRIGHT para diferenciar 10s leucocitos. Ambas tkcnicas de tinci6n deben con- siderarse como equivalentes en su seguridad diagn6stica. El mktodo de WRIGHT ofrece la ventaja de una facilidad laboral esencial debido a que el tiempo de coloraci6n es mis abreviado y la tkcnica de tinci6n resulta mLs simple. Para mantener la amplitud de error del procedimiento de recuento lo mis bajo posible, deberia conservarse el recuento de 100 leucocitos por cada frotis sanguineo.

Literaturverzeichnis 1. HALLMANN, L., 1961: Bakteriologie und Serologie. 3. Aufl. Verlag Thierne, Stutt-

gart. 2. KLEIN, H., 1965: Dt. Tierarztl. Wschr. 72, 244-246. 3. ROJAHN, A., 1965: Dt. Tierarzteblatt 13, 7. 4. TOLLE, A., und H. D. JAHNKE, 1965: Zbl. Vet. Med. Reihe B, 12, 3. 5. Richtlinien des Bundesministers fur Ernahrung, LandwirtschaR und Forsten vom 8 . 2 . 1965 zur Durchfuhrung der hamatologischen Untersuchung und Ermittlung der Rinder- leukose. 0 6. Hamatologische Farbung mit Eosin-Methylenblau-Losung nach WRIGHT, Firma Merdc, Darmstadt.

Anshrift der Verfasser: Prof. Dr. Tolle, Bundesforschungsanstalt fur Milchwirtschafi, Kiel; Postf. Dr. Schaal, Staatl. Veterinaruntersuchungsarnt ArnsberglWestf., Zur Tauben- ei&e 10112. Dr. H.-D. Jahnke, Braunschweig, An der Martinikirche 7, Regierung.

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