verminderte stimulation der glycosaminoglycansynthese von kultivierten humanen hautfibroblasten im...

E. BieckerD. O. Schachtschabel

Verminderte Stimulation derGlycosaminoglycansynthese von kultiviertenhumanen Hautfibroblasten im Rahmender In-vitro-Alterung durch Interleukin-1

ORIGINALARBEITZ Gerontol Geriat 32:124–130 (1999)© Steinkopff Verlag 1999

Diminished stimulation ofglycosaminoglycan synthesis ofcultured human skin fibroblastsduring in vitro aging by interleukin-1

Zusammenfassung Zusatz von hu-manem rekombinantem Interleukin-1(IL-1a oder IL-1b) zum Kulturmedium(supplementiertes MEM ohne bzw. mit1%, 10 % oder 20 % fetalem Kälberse-rum (FCS)) von humanen Hautfibro-blasten zeigte einen dosisabhängigenstimulierenden Effekt auf die Glyco-saminoglycan(GAG)-synthese, ein-schließlich der Hyaluronsäuresynthese,von jungen (sog. Phase-II-)Hautfibro-blasten in Konzentrationen von 4, 20bzw. 100 pg/ml. Diese Stimulationbetraf die Gesamt-GAGs, d. h. die insMedium sezernierten, extrazellulärenund zellgebundenen (perizellulären)GAGs. Der prozentuale Anteil an Hya-luronsäure stieg nach Stimulation mit100–200 pg/ml IL-1b von ca. 49 % auf64 % (-FCS) bzw. von 79 % auf 92 %

(+10 % FCS). Der Anstieg der Gesamt-GAG-Synthese war in erster Linie aufdie gesteigerte Hyaluronsäuresynthesezurückzuführen. Die maximale Stimu-lation, sowohl ohne als auch in Kombi-nation mit Serum, wurde mit 100 pg/mlIL-1b erreicht. Im Vergleich zu jungenZellen (Phase II) zeigten seneszente(Phase III) eine signifikant verminderteStimulation der Hyaluronsäuresynthesedurch IL-1b. Die DNA-Synthesewurde durch IL-1a und IL-1b nichtbeeinflußt.

Die gewonnenen Resultate weisendarauf hin, daß IL-1b und IL-1 dieGAG- und insbesondere die Hyaluron-säuresynthese, nicht aber die DNA-Syn-these in vitro steigern. Das verminderteAnsprechen der GAG- und Hya-luronsäuresynthese in der Alterungs-phase dieser in vitro kultivierten Fibrob-lasten gibt zu der Hypothese Anlaß, daßähnliche Vorgänge auch während derAlterung im Organismus stattfinden.

Schlüsselwörter In-vitro-Alterung –Hautfibroblasten – Glycosamino-glycansynthese – Interleukin-1

Summary Addition of human recom-binant interleukin-1 (IL-1a or IL-1b)to culture medium (supplementedMEM without or with 1%, 10 %, or20 % fetal calf serum (FCS)) of humanskin fibroblasts exerted a stimulatingeffect in a dose-dependent manner on

glycosaminoglycan (GAG) synthesis,including hyaluronic acid synthesis, ofyoung (Phase II) skin fibroblasts inconcentrations of 4, 20, or 100 pg/ml.Stimulation was due to increase in totalGAGs, namely extracellular (secretedinto culture medium) and cell-bound(pericellular) GAGs. Stimulation with 100 or 200 pg/ml IL-1b led to arelative increase (total GAGs: 100 %) in hyaluronic acid from 49 % to 64 (-FCS) and from 79 % to 92 % (+10 %FCS), respectively. The increase intotal GAG synthesis was mainly due toincreased synthesis of hyaluronic acid.Maximum stimulation, with and with-out FCS, was reached by 100 pg/ml IL-1b. Compared to young (Phase II)cells senescent (Phase III) cells showedsignificantly diminished stimulation ofhyaluronic acid synthesis by IL-1b.Both, IL-1a and IL-1b, showed noinflucence on DNA synthesis.

These results suggest that both, IL-1b and IL-1a, stimulate GAG and espe-cially hyaluronic acid synthesis, but notDNA synthesis, in vitro. The diminishedresponse of GAG and hyaluronic acidsynthesis during ageing of these in vitrocultured fibroblasts gives support to thehypothesis that similar processes mightoccur during ageing in organisms.

Key words In vitro ageing – skin fibroblasts – glycosaminoglycansynthesis – interleukin-1

ZG

G 8

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Eingegangen: 3. Juni 1998Akzeptiert: 30. Juli 1998

E. Biecker · D.O. Schachtschabel (✉) Institut für Physiologische ChemiePhilipps-UniversitätKarl-von-Frisch-Str. 1D-35033 Marburg

Einleitung

Nach dem „Hayflick-Modell“ (11) wird der In-vitro-Alte-rungsprozeß in drei Phasen eingeteilt: Phase I beschreibt diePrimärkultur. In Phase II zeigen die Zellen ein exponentiellesWachstum und erreichen nach einer von verschiedenen Para-metern abhängigen Zahl von Populationsverdopplungenschließlich Phase III („Alterungsphase“). Diese ist gekenn-zeichnet durch einen hohen Anteil nichtproliferativer Zellenund eine Abnahme der Proliferationsgeschwindigkeit, bis eszum Sistieren der Zellvermehrung und schließlich zum all-mählichen (im Verlauf mehrerer Monate) Tod der Zellenkommt.

Gut untersucht ist das unterschiedliche Syntheseverhaltenvon Glycosaminoglycanen im Zuge der In-vitro-Alterung. Sonimmt die Syntheserate der Gesamt-Glycosaminoglycane beiPhase-III-Zellen ab; jedoch kommt es zu einer Veränderungdes Glycosaminoglycanmusters mit relativer Zunahme vonHeparansulfat und Abnahme von Hyaluronsäure (26, 27).Auch für Fibronectin und eine Vielzahl anderer Ober-flächenglycoproteine sind altersabhängige Veränderungenbeschrieben worden (14).

Interessant ist das veränderte Verhalten, das Phase-III-Zel-len nach Zusatz von Wachstumsfaktoren zum Kulturmediumzeigen. Für seneszente WI-38-Zellen wurde die verminderteStimulierbarkeit der Zellproliferation unter anderem fürPDGF, EGF, Insulin, Transferrin und Dexamethason gezeigt(19). Auch Phase-III-Hautfibroblasten weisen eine geringereStimulierung der Glycosaminoglycan- und Hyaluronsäure-synthese gegenüber Serum, PDGF und IGF auf (31, 32).

Wenig ist über den Einfluß von Zytokinen auf die Zell-alterung bekannt. Zytokine sind – im Gegensatz zu den „Drü-senhormonen“ – regulatorisch wirkende Gewebshormone(Peptide, deren Wirkung nach Bindung an spezifische Mem-branrezeptoren erfolgt), die vorwiegend als parakrin wir-kende Substanzen Differenzierung und Proliferation von Zel-len steuern und für viele Effektorfunktionen dieser Zellen ver-antwortlich sind. Die Grenze zwischen Zytokinen und Wachs-tumsfaktoren ist unscharf, sie überschneiden sich häufig inihren biologischen Wirkungen (33). Von den momentan ca. 45bekannten Zytokinen bilden die Interleukine (IL) eine Haupt-gruppe.

Vom IL-1 existieren zwei verschiedene Polypeptide, IL-1a und IL-1b, die Produkte verschiedener Gene sind, aber andenselben Rezeptor binden (16) und sich kaum in ihrer biolo-gischen Aktivität unterscheiden. Die aktive Form von IL-1 istein 17-kDa-Protein und besteht aus 117 Aminosäuren (9).Produziert wird IL-1 in erster Linie von neutrophilen Granu-lozyten und Mikrogliazellen, aber auch von Fibroblasten undanderen Zellen (8).

Es ist das Ziel der vorliegenden Arbeit, am Modell von invitro kultivierten „jungen“ (sog. Phase-II-) und „alten“ (sog.Phase-III-)Hautfibroblasten zu analysieren, ob IL-1 einen

Einfluß auf die Synthese von Glycosaminoglycanen und ins-besondere Hyaluronsäure hat. Bisher liegen keine Resultatebezüglich altersabhängiger Veränderungen der IL-1-Wirkungvor.

Material und Methoden

Zellen: Die verwendeten FLOW-1000-Zellen sind embryo-nale, humane Hautfibroblasten, die ursprünglich von derFirma Flow/Meckenheim erhalten wurden. Die maximalePopulationsverdopplungszahl (PD: population doublings;PDmax: maximale Populationsverdopplungszahl) beträgt45 ± 2. Die in den Versuchen eingesetzten Phase-II-Kulturenbefanden sich 10–14 PD, die seneszenten Phase-III-Kulturen1–3 PD vor der letztmöglichen (finalen) Subkultur (PDmax).Als finale Kulturen wurden solche bezeichnet, die nach derletzten 1:2-Subkultivierung innerhalb von vier Wochen keineKonfluenz erreichten.Kulturbedingungen: Die Routinekultivierung der Hautfibro-blasten in Plastikflaschen (Greiner, 75 cm2 Wachstumsfläche)ist in früheren Arbeiten beschrieben worden (26, 27). AlsNährmedium wurde Eagle’s Medium (MEM) mit Earle’s Sal-zen (Gibco, Karlsruhe), Antibiotika (128 mg/l Streptomycin-sulfat und 100 000 I. E./l Penicillin-G-Natrium (Grünenthal,Stolberg)) und 10 % fetalem Kälberserum (Gibco) verwendet.Die Subkultivierung der Zellen erfolgte durch Trypsinieren(0,25 % Trypsin in phosphatgepufferter Salzlösung, Gibco)der Stammkulturen. Phase-II-Zellen wurden bei Erreichen derKonfluenz im Verhältnis 1:4, Phase-III-Zellen im Verhältnis1:2 subkultiviert. Nach 24 Stunden erfolgte der erste Medi-umwechsel.

Für die Interleukinexperimente wurde ein definiertes se-rumfreies Medium (MEM-suppl) verwendet, das durch Zu-satz von Albumin (500 µg/ml, globulinfrei, Sigma), Transfer-rin, Putrescin, Linolsäure, Vitamin B12, Spurenelementen u. a.zum MEM-Medium hergestellt wurde (30). In einem solchendefinierten serumfreien Medium können die Fibroblastenmehrere Monate in einem nichtproliferativen Zustand („Ru-hephase“) am Leben gehalten werden.

Zur Inkubation der Zellen mit den Interleukinen erfolgteeine Subkultivierung in 25-cm2-Kulturflaschen im Verhältnisvon etwa 1:8 bei Phase-II-Zellen bzw. 1:4 bei Phase-III-Zel-len, so daß sich eine Zellzahl von ca. 105 Zellen pro Kultur-flasche nach Subkultivierung ergab. Die Zellen wurden initialin mit 10 % FCS supplementiertem MEM subkultiviert, nach48 Stunden erfolgte dann ein Mediumwechsel mit MEMsuppl. ohne FCS. Vorher wurden die Zellen, um alle Serum-reste zu entfernen, dreimal mit MEM suppl. ohne Serum ge-waschen. Nach weiteren 24 Stunden erfolgte dann, nach ei-nem erneuten Mediumwechsel mit 4,5 ml MEM suppl. (ohneFCS bzw. je nach Kultur mit 1%, 10 % oder 20 % FCS), dieZugabe von rekombinantem, humanem IL-1β bzw. IL-1α

125E. Biecker und D. O. SchachtschabelVerminderte Stimulation der Glycosaminoglycansynthese von Fibroblasten

126 Zeitschrift für Gerontologie und Geriatrie, Band 32, Heft 2 (1999)© Steinkopff Verlag 1999

(Boehringer Mannheim) in der jeweiligen Konzentration.Hierbei wurde die Stammlösung vorher durch Verdünnungs-reihen mit MEM suppl. hergestellt. Gleichzeitig erfolgte auchder Zusatz der radioaktiven Vorstufen. Die Inkubation er-folgte entweder mit D-[1-14C]-Glucosamin (Amersham,Braunschweig, spez. Akt. 59 mCi/mmol, 0,3 µCi und 9 µgnichtmarkiertes Glucosamin pro ml Medium) zur Ermittlungder Glycosaminoglycan- (inkl. Hyaluronsäure-)Synthese. ZurBestimmung der DNA-Synthese wurden die Kulturen 48Stunden mit [Methyl-3H]-Thymidin (Amersham, Braun-schweig, spez. Akt. 2 Ci/mmol; Konzentration im Experi-ment: 0,2 µCi/ml Medium plus 2,4 µg/ml zugesetztes [1H]-Thymidin) markiert. Aufarbeitung der Zellen und Bestim-mung der Radioaktivität wurden früher beschrieben (27).Glycosaminoglycan-(GAG-)Analyse: Die Ermittlung des Ein-baus von [14C]-Glucosamin in die ins Medium sezernierten

GAGs einschließlich der Hyaluronsäure erfolgte nach Ent-nahme von 1 ml Kulturmedium. Der Anteil der peri- (an dieZelloberfläche gebundenen GAGs) bzw. der intrazellulärenGAGs wurde bestimmt, indem das überschüssige Kulturme-dium dekantiert und die Zellen dreimal mit jeweils 3 mlEarle’s Salzlösung gewaschen wurden. Die Zellen wurdendann mit Trypsinlösung (1 mg/ml in Hank’s Balanced Salt So-lution (HBSS)) von der Unterlage abgelöst und nach Zentri-fugation mehrfach mit Trypsin-HBSS-Lösung gespült. Umdie Bindung der GAGs an ihr Core-Protein aufzuheben, er-folgte dann ein Pronaseverdau (Calbiochem-Behring, Frank-furt, 1 mg/ml, 2 h bei 37 °C in Gegenwart von 2 µg/ml Thio-mersal) und anschließendem Erhitzen auf 95 °C zur Pronas-einaktivierung. Die Proben wurden dann in 50 mM Tris × HCl(pH = 7,5) überführt und zur Präzipitation der GAGs mit 1%Cetylpyridiniumchlorid (CPC, in 0,1 M NaCl) auf Whatman-

Tab. 1 Einfluß von Interleukin-1β auf Glycosaminoglycan-(GAG-) und Hyaluronsäure-Syn-these von Phase-II-Hautfibro-blasten gemessen anhand der Inkorporation von [14C]-Glucos-amin (14C-Glc-NH2) in die Ge-samt-GAGs und in den Hya-luronsäureanteil. Resultate: Mittel± SD, jeweils n = 6 Kulturen

Synthese (cpm 14C-Glc-NH2/mg Protein/48 h

Il-1β Serum (FCS) Gesamt-GAGs Hyaluronsäure % Hyaluronsäure(pg/ml) (Gesamt-GAGs =100 %)

– – 30 986 ± 4 807 15 251 ± 4 348 494 – 63 471 ± 2 076 36 440 ± 1161 57

20 – 65 034 ± 1 538 42 261 ± 513 65100 – 61 051 ± 8 456 39 240 ± 8 474 64

– 1% 42 141 ± 8 005 25 178 ± 5 306 60100 1% 80 937 ± 5 544 64 515 ± 9 807 80

– 10 % 91 667 ± 9 684 72 563 ± 10 994 794 10 % 107 599 ± 10 209 98 520 ± 9 632 92

20 10 % 133 452 ± 7 859 119 221 ± 5 448 89100 10 % 151 498 ± 20 969 134 754 ± 13 288 89200 10 % 153 503 ± 4 848 140 646 ± 4 917 92

– 20 % 88 881 ± 17 955 71 823 ± 7 806 81100 20 % 138 631 ± 5 912 124 878 ± 7 936 90

Tab. 2 Vergleich der Wirkungvon IL-1α und IL-1β auf dieSynthese von ins Kulturmediumsezernierten und perizellulärenGlycosaminoglycanen (Gesamt-GAGs) bzw. die Synthese vonHyaluronsäure. Resultate: Mittel± SD von jeweils n = 4 Kulturen

Synthese (cpm 14C-Glc-NH2/mg Protein/48 h

Lokalisation der Interleukin (IL) Serum Gesamt-GAGs Hyaluron- % HyaluronsäureGesamt-GAGs bzw. (100 pg/ml) (FCS) säure (Gesamt-GAGsHyaluronsäure = 100 %)

Extrazellulär – – 29 611 ± 3452 14 935 ± 2441 50(„Medium“) IL-1α – 58 793 ± 4382 36 442 ± 1280 61

IL-1β – 61 888 ± 6016 39 665 ± 6783 61– 1% 43 489 ± 3872 24 481 ± 3156 56IL-1α 1% 77 539 ± 9865 62 686 ± 8815 80IL-1β 1% 80 270 ± 4702 64 614 ± 3947 80– 10 % 81155 ± 4036 65 327 ± 8709 79IL-1α 10 % 148 469 ± 7693 132 766 ± 14234 89IL-1β 10 % 150 625 ± 9910 134 548 ± 9095 89

Perizellulär – – 3 423 ± 248 1 224 ± 255 35IL-1α – 4 170 ± 168 2 476 ± 237 59IL-1β – 4 290 ± 239 2 261 ± 99 52– 1% 3 974 ± 287 1 313 ± 111 33IL-1α 1% 4 485 ± 511 2 268 ± 309 50IL-1β 1% 4 329 ± 428 2 125 ± 121 49– 10 % 4 774 ± 617 2 460 ± 191 51IL-1α 10 % 6 813 ± 514 4 053 ± 325 59IL-1β 10 % 6 620 ± 711 3 963 ± 590 59


No3-Papierstreifen aufgetragen, während der Hyaluronsäure-anteil durch Verdau mit Streptomyces-Hyaluronidase (Sigma,München) ermittelt wurde (27). Die Einzelheiten der Me-thode und das Zählen der Radioaktivität wurden bereits be-schrieben (27).

Die Proteinbestimmung (nach Bradford) erfolgte an Kul-turen, die parallel zu den radioaktiv markierten gehalten wur-den. Nach 48 Stunden Inkubation mit IL-1 wurde das Mediumdekantiert, dreimal mit gekühlter Earle’s Salzlösung gewa-schen und mit Ethanol fixiert. Der Zellrasen wurde an-schließend getrocknet und mit 1,5 ml 1 N-NaOH-Lösunghydrolysiert.

Ergebnisse

Zunächst wurde der dosisabhängige Einfluß von IL-1β aufden [14C]-Glucosamineinbau in die Gesamt-GAGs (peri- undextrazellulär) und die Hyaluronsäure untersucht. Wie aus Ta-belle 1 hervorgeht, wurde eine dosisabhängige Stimulation er-zielt, wobei das Maximum des Einbaus im Konzentrationsbe-reich von 20–100 pg/ml erreicht wurde. IL-1α und IL-1β un-terscheiden sich nicht signifikant hinsichtlich ihres Stimula-tionseffekts (Tab. 2).

Der Einfluß von IL-1β wurde entweder ohne Zusatz vonFCS oder in Kombination mit 1%, 10 % oder 20 % FCS zumMedium (ohne IL-Zusatz) untersucht. Die Erhöhung desFCS-Anteils im Medium führt bis zu einer Konzentration von10 % zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung des[14C]-Glucosamineinbaus. Eine Steigerung auf 20 % FCS er-höht den [14C]-Glucosamineinbau nicht weiter. In erster Liniewar Hyaluronsäure für die Steigerung des Einbaus der radio-aktiven Vorstufen verantwortlich (vgl. die absolute Zunahmeder Hyaluronsäuremarkierung und des relativen Hya-luronsäureanteils nach Zusatz von Serum in Tabelle 1 und Ta-belle 2). Zusatz von IL zu den serumhaltigen Kulturen be-wirkte eine stärkere Stimulation der Hyaluronsäuresynthese

als unter serumfreien Bedingungen (Tab. 1 und Tab. 2). Sowar auffällig, daß der IL-Zusatz sowohl bei den 10% oder20% FCS-haltigen Kulturen noch zu einer weiteren Stimula-tion der GAG-Synthese, d. h. insbesondere der Hyaluronsäu-resynthese führte, so daß auch der relative Anteil an Hya-luronsäure (Gesamt-GAGs = 100 %) von ca. 80 % (10–20 %FCS) auf ca. 90 % (10 %–20 % FCS + 100 pg/ml IL-1β) an-stieg (Tab. 1). Die IL-Stimulation betraf sowohl die extra-zelluläre GAG-Fraktion (inkl. Hyaluronsäure), die denHauptanteil der synthetisierten zellulären GAGs darstellt, alsauch die perizellulär lokalisierten GAGs (inkl. Hya-luronsäure) (Tab. 2).

Tabelle 3 zeigt den Vergleich von Phase-II- und Phase-III-(seneszenten) Hautfibroblasten. Bei der extrazellulären Frak-tion wird der [14C]-Glucosamineinbau in die Hyaluronsäurevon seneszenten Phase-III-Zellen durch IL-1β in deutlich ge-ringerem Ausmaß stimuliert als bei Phase-II-Zellen. Bei denKulturen ohne FCS ist sowohl bei jungen als auch bei altenZellen mit 20 pg/ml IL-1β die maximale Stimulation erreicht.Erhöhen von IL-1β auf 200 pg/ml bringt keinen wesentlichenzusätzlichen Effekt (siehe auch Resultate in Tab. 1). Kulturenmit 10 % FCS zeigen demgegenüber ein etwas anderes Ver-halten: hier führt das Erhöhen von IL-1 auf 200 pg/ml noch zueinem weiteren Anstieg des [14C]-Glucosamineinbaus in dieHyaluronsäure, bei Phase-III-Zellen signifikant vermindertim Vergleich mit Phase-II-Zellen.

Der Einbau in die perizelluläre Fraktion von Phase-II-Zel-len wird durch IL-1β dosisabhängig gesteigert, bei Phase-III-Zellen ist dieser Effekt dagegen nur noch schwach nachweis-bar. Ein ähnliches Verhalten zeigt sich auch bei der intrazel-lulären Fraktion: Phase-II-Zellen sprechen auf den Inter-leukinstimulus an, Phase-III-Zellen dagegen nicht mehr (Re-sultate nicht in Abb. gezeigt).

Die DNA-Synthese von Phase-II- und Phase-III-Zellen,gemessen anhand des [3H]-Thymidin-Einbaus in die DNA,wurde durch IL-1α oder IL-1β nicht stimuliert (Resultatenicht in Abb. gezeigt).

Tab. 3 Vergleich der Stimula-tionswirkung von IL-1β (20 bzw.200 pg/ml) auf die Hyaluron-säuresynthese von jungen (Phase-II-) und alten (Phase-III-)Haut-fibroblasten. Resultate: Mittel ±SD von jeweils n = 4 Kulturen

Stimulation der Hyaluronsäuresynthese durch IL-1β (∆cpm 14C-Glc-NH2/mg Protein/48 h nach IL-Zusatz)

Lokalisation von IL-1β Serum Phase II Phase III Phase IIIHyaluronsäure (pg/ml) (10 % FCS) („Seneszenz“) (in % von

Phase II = 100 %)

Extrazellulär – – 0 0(„Medium“) 20 – 27 010 ± 4010 11 681 ± 3558 43

200 – 30 692 ± 6770 12 694 ± 2344 41– + 0 0

20 + 46 658 ± 4622 9 374 ± 803 20200 + 68 083 ± 6335 23 940 ± 34 35

Perizellulär – – 0 020 – 982 ± 200 243 25

200 – 1 621 ± 207 0– + 0 0

20 + 825 ± 748 0200 + 2 479 ± 361 1 056 ± 8 43

Diskussion

Zunächst wurde untersucht, inwieweit sich IL-1α und IL-1βin ihrer Beeinflussung der Glycosaminoglycansynthese an-hand des [14C]-Glucosamineinbaus in GAGs und Hya-luronsäure unterscheiden. Tabelle 1 zeigt, daß keine signifi-kanten Unterschiede bestehen. Bei IL-1α und IL-1β handeltes sich zwar um die Produkte verschiedener Gene, die nur einePeptidhomologie von 26 % aufweisen (16), aber an denselbenRezeptor binden (4, 12) und sich in ihrer biologischen Funk-tion daher kaum unterscheiden (24). Bei IL-1β handelt es sichum die beim Menschen überwiegende Form (9). In (21) wur-den zwölf verschiedene Fibroblastenzellinien im Hinblick aufdie Beeinflussung der Hyaluronsäuresynthese durch IL-1αund IL-1β untersucht. Die Autoren kamen zu dem Ergebnis,daß sich neun der untersuchten Zellinien in ihrem Ansprech-verhalten nicht unterscheiden, zwei Zellinien besser auf IL-1α und eine Zellinie besser auf IL-1β ansprachen. Yaron et al.(36) zeigten, daß IL-1β die GAG-Synthese schon bei niedri-geren Konzentrationen als IL-1α stimulierte. Bei höherenKonzentrationen glichen sich IL-1β und IL-1α in ihrer Wir-kung aber immer mehr aneinander an; allerdings konnten wirdiesen Befund nicht bestätigen.

Verschiedene Arbeiten belegen, daß IL-1 einen stimulie-renden Effekt auf die GAG-Synthese hat (2, 3, 7, 10, 13, 20,21, 25, 35, 36). Zwei Arbeitsgruppen benutzten Medium + 1%FCS, die restlichen supplementierten ihr Medium mit 10 %FCS oder mit 10 % hitzeinaktiviertem, humanem Serum. Diedaraus resultierenden Ergebnisse sind unbefriedigend, da sienicht die isolierte IL-1-Wirkung, sondern nur die Wirkungvon IL-1 in Kombination mit Serum und den darin enthalte-nen Wachstumsfaktoren zeigen. In der vorliegenden Arbeitwurden deshalb auch Untersuchungen in einem definiertenMedium ohne Zusatz von FCS durchgeführt. Unter diesen Be-dingungen können die Fibroblasten in einem nichtproliferati-ven Ruhezustand über einen längeren Zeitraum (Wochen) amLeben gehalten werden. Dabei zeigte sich, daß IL-1 zwar einesignifikante Stimulation der Hyaluronsäuresynthese be-wirkte, allerdings war dieser Effekt deutlich stärker in Ge-genwart von Serum ausgeprägt (Tab. 1 und Tab. 2). Da Serumgleichzeitig einen proliferativen Effekt hat, könnten diese Re-sultate darauf hinweisen, daß die Ansprechbarkeit auf IL-1 inder Proliferationsphase von Phase-II-Zellen erhöht ist. Aller-dings besteht auch die Möglichkeit, daß Serumfaktoren dieIL-Wirkung auf die GAG-Synthese von Fibroblasten verstär-ken. Hervorzuheben ist auch die durch IL-1-Zusatz zu serum-haltigen (10 % oder 20 % FCS) Kulturen deutlich erhöhteGAG- und Hyaluronsäureaktivität dieser Hautfibroblasten.Dies weist darauf hin, daß die GAG-Synthesekapazität vonFibroblasten durch „optimale“ Serumkonzentration im Kul-turmedium (10 % bzw. 20 %) nicht ausgeschöpft wird.

Während Yaron et al. (36) eine maximale Stimulation sy-novialer Fibroblasten bei 10–100 pg/ml, das entspricht unse-

ren Ergebnissen, beobachteten, berichteten Sampson et al.(25) von einer Maximalstimulation der von ihnen verwen-deten humanen Lungenfibroblasten bei 2,5 ng/ml. Die er-reichte maximale Stimulation des [14C]-Glucosamineinbausschwankte zwischen einer Steigerung um ca. 190 % (25, Lun-genfibroblasten) bis zu ca. 800 % (21, Hautfibroblasten auskindlicher Vorhaut).

Bezüglich der funktionellen Bedeutung einer Hya-luronsäurestimulation durch IL-1 könnte daran gedacht wer-den, daß eine verstärkte Hyaluronsäureproduktion die Ablö-sung von Zellen aus der umgebenden Matrix erleichtert, wasmöglicherweise in vivo (für Migration von Fibroblasten bei z. B. Wundheilungsprozessen) wichtig sein kann. Eine er-höhte Hyaluronsäuresyntheserate ist insbesondere im Zusam-menhang mit erhöhter Proliferationsgeschwindigkeit be-schrieben worden (15).

Hinsichtlich der Funktion von perizellulären Proteoglyca-nen sei erwähnt, daß sie in der Lage sind, Wachstumsfaktorenund Zytokine zu binden (23). Auf diese Weise werden ge-websgebundene Reservoirs an Wachstumsfaktoren zur Verfü-gung gestellt, die so bei Bedarf, z. B. nach Verletzungen,schnell bereitstehen.

Während die Wirkungen von IL-1 auf junge (Phase-II-)Zellen gut untersucht sind, gibt es keine Untersuchun-gen, die sich mit der Wirkung von IL-1 auf alte (Phase-III-)Zellen beschäftigen. Mit den vorliegenden Ergebnissen(Tab. 3) wird gezeigt, daß alte Hautfibroblasten nur nochschwach auf den Interleukinstimulus ansprechen, der Anteilan Hyaluronsäure lag deutlich unter den Werten für jungeZellen.

Veränderungen im Verteilungsmuster der Glycosamino-glycane alter Fibroblasten wurden bereits mehrfach beschrie-ben (17, 26, 27, 28, 29, 31, 34). Es ist fraglich, ob diese Ver-änderungen auf einer Kopplung der Hyaluronsäuresynthesemit der Zellproliferation beruhen, es also zu einem Abfall derHyaluronsäuresynthese kommt, da die Zellen kaum noch odernicht mehr proliferieren, oder ob es sich um einen eigenstän-digen, alterungsbedingten Prozeß handelt. Für diese Annahmespricht die Tatsache, daß auch in vivo altersabhängige Verän-derungen des Glycosaminoglycanmusters auftreten. Sonimmt der Hyaluronsäuregehalt der Haut im Alter ab (18).Ähnliche Beobachtungen wurden auch in der Synovialflüs-sigkeit und in der Aorta gemacht (22).

Nicht geklärt ist, warum Phase-III-Zellen nur noch ver-mindert auf den IL-1-Stimulus reagieren. Eine Möglichkeitwäre ein vermindertes Ansprechen der Rezeptoren. Aller-dings verändert sich die Zahl der Rezeptoren für mehrereWachstumsfaktoren pro µm2 Zelloberfläche nicht (5, 6). Hin-sichtlich der verminderten TNF-Ansprechbarkeit der Prolife-ration von seneszenten humanen Fibroblasten wurde wederein Unterschied in der Affinität des Rezeptors zu seinem Li-ganden noch eine Veränderung in der nachfolgenden Signal-transduktion nachgewiesen (1).



Insgesamt sollten die in der vorliegenden Studie gewon-nenen Ergebnisse Anlaß zu Untersuchungen über eine ver-minderte Ansprechbarkeit von alten Fibroblasten auf IL-1(und anderen Interleukinen) hinsichtlich der Synthese von an-deren bindegewebszellspezifischen Syntheseprodukten (Kol-

lagen u. a.) sein. Sofern solche Ergebnisse auf die In-vivo-Si-tuation übertragen werden können, sollten solche Fragestel-lungen auch im Rahmen von z. B. altersbedingten, verzöger-ten Wundheilungsprozessen erhoben werden.

Literatur

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