versuch von beadle und tatum verändertes gen...
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1
Versuch vonBeadle und Tatum
Verändertes Gen-> veränderter Phänotyp Neurospora crassa
Purves et al. 12.1
Ein-Gen-ein-Polypeptid-Hypothese
Ein-Gen-ein-Enzym Hypothese
Ein-Gen-ein-Genprodukt-Hypothese
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2
Das zentral Dogma: Von der DNA zum Protein
Transkription
Replikation
Translation
Purves et al. 12.2
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3
Genexpression:
• Fluss von der genetischen Information (DNA) zum Genprodukt• beteiligte Vorgänge sind:
Transkription (DNA in RNA)Translation (RNA in Protein)
• findet in allen lebenden Zellen statt
Expression
Gen
Abschnitt auf der DNA, der für ein Genprodukt kodiert, inkl. Kontrollregionen
RNA
Protein
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4
Bei Prokaryoten in einem Kompartiment
Purves et al. 12.3 Purves et al. 14.1
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5
DNA
RNA
Protein
Transkription des Matrizenstranges
Translation
Nicht-Matrizenstrang (+)
Matrizenstrang, codogen (-)
Pro- und eukaryotische Genexpression
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6Purves et al. 12.4
Transkription
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7
Die chemische Struktur der RNA
RNA DNA
•RNA enthält den Zucker Ribose•RNA enthält Uracil anstelle von Thymin
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8
RNA-Polymerase aus E. coli
α
α
β
β‘
Minimal (Core) Enzym, 4 UE: α2,β,β‘
α: Struktur des Enzymsβ: RNA-Syntheseβ‘: Bindung an DNA
DNA-abhängige RNA-Polymerase
Die RNA-Polymerase transkribiert DNA
•Katalyse von Phosphatdiesterbindungen•Verlängerung der wachsenden RNA Kette in 5‘->3‘Richtung•Substrat: Ribonukleosidtriphosphate, kein Primer
α
α
β
β‘
σ
Holoenzym, 5 UE: α2,β,β‘,σ
σ: Erkennung des Transkriptionsstarts
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9
Konsensussequenzen prokaryotischer Promotoren-10-Region = Pribnow-Box-35-Region
Promotor: Erkennungs- und Startpunkt für die RNA-Polymerase
nicht-transkribierte DNA transkribierte DNA
ATG
+1 Start der Transkription
Start der Translation
-35 -10
- 35-Region
-10-Region
„upstream“-Bereich
-35 -10 +1 lac ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAtrp AAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCApL TCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATKons.-S ----------TTGACA---17+/-1 bp-----TATAAT--------
-1 keine „0“
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10
Transkriptionszyklus einer bakteriellen RNA-Polymerase
Promotor
DNA
σ-Faktor
RNARNA
RNA
RNA-Polymerase
1. Bindung des RNA-Pol-Holoenzymsan den Promotor (geschlossener Komplex)
2. Aufwinden der DNA(offener Komplex)
3. Anfängliche Transkription (10 nt)
4. Ablösung des σ-Faktors
5. Elongationsphase mit hoher Prozessivität (50 nt/s)
6. Termination
7. Freisetzung des Transkripts
Haar-nadel
Ribonukleosid-triphosphate
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11
Alternative Sigmafaktoren: Regulation der Genexpression bei E. coli
Sigmafaktor Größe (kDA) Funktion
σ70 70 Standard-SigmafaktorσS 38 Hunger, Stressσ32 32 Hitzeschock
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12
Transkriptionstermination bei E. coli
Rho-unabhängige Termination
Haarnadelförmige Sekundärstruktur im 3‘ Nichtkodierungsbereich einer mRNA
Rho-abhängige Termination
Rho-Protein (Hexamer) lagert sich an mRNAspaltet ATP
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13
Kodierende RegionDNA
+1 Ende
RNA-Transkript5‘ 3‘
Leadersequenz5‘ untranslatierterBereich
Trailer-Abschnitt3‘ untranslatierterBereich
Transkripte sind länger als die kodierende Region
Promotor Terminator
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14
Prokaryot Eukaryot
RNA-Polymerase
polycistronischemRNA
Translation noch während der Transkription
RNA-PolymerasemonocistronischemRNACap-Struktur
Poly(A)-Schwanz
mRNA muss aus dem Kern ausgeschleustwerden
Kernpore
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15
Die drei durch die Transkription erzeugten Haupttypen von RNA-Molekülen
Brown 6.1
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16
RNA-Polymerase Produkt Lokalisierung
RNA-Pol I: rRNA (28S, 18S, 5,8S) Nukleolus
RNA-Pol II: mRNA (Protein-kodierende Gene) NukleoplasmasnoRNAs, einige snRNAs
RNA-Pol III: 5S rRNA, tRNAs, viele snRNAs Nukleoplasmainterne Promotoren !
Zusätzlich RNA-Polymerasen in Mitochondrien und Chloroplasten
mt-RNA-Pol mitochondriale Transkripte Mitochondrien(nur eine UE) (kernkodiert)
pt-RNA-Pol (PEP) plastidäre Transkripte Plastiden(E.coli-ähnlich) (plastidenkodiert)
pt-RNA-Pol (NEP) plastidäre Transkripte Plastiden(nur eine UE) (kernkodiert)
Eukaryoten: drei DNA-abhängige RNA-Polymerasen im Kern
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17
Eukaryotische Promotoren sind weniger konserviert
prokaryotischerPromotor
eukaryotischerRNA-Pol IIPromotor
Jannig & Knust 14.3
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18
Struktur und Transkription eines eukaryotischen Gens
Purves et al. 14.4
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19
Transkription eukaryotischer DNA durch die RNA-Polymerase II benötigt viele allgemeine Transkriptionsfaktoren (TF)
TFIIH
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20
Eukaryotische Gene enthalten kodierende Exon- und nicht-kodierende Intron-Bereiche,eukaryotische RNA-Pol II-Transkripte werden prozessiert
1. Anfügen des Cap am 5‘ Ende2. Polyadenylierung am 3‘ Ende3. Spleißen
Alle drei Prozesse finden im Zellkern statt !
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21
„Capping“ des Transkriptes am 5‘ Ende: Anfügen eines modifizierten Guaninnukleotids
• 5‘ Cap signalisiert 5‘ Ende eukaroytischer mRNAs•Wird während der Transkription angehängt• 5‘ Cap wichtig für Export der mRNA ins Cytosol und die Translation
Methylgruppe
5‘-5--Bindung
7-Methyl-Guanosintriphosphat
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22
Polyadenylierung am 3‘-Ende
10- 20 Nukleotide < 30 Nukleotide
Spaltung durch Endonukleasekomplex
Poly(A)-Anheftung durch Poly(A)-Polymerase
wird abgebaut
• 3‘-Poly(A)-Schwanz signalisiert 3‘-Ende eukaroytischer mRNAs• Poly(A)-Polymerase (Polymerisation ohne Matrize !)• 200-250 A-Nukleotide werden angehängt• 3‘-Poly(A)-Schwanz wichtig für Export der mRNA ins Cytosol, für die Stabilität und die Translation
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23
Spleißen des Transkripts
Intron wird entfernt
Teil der mRNA
• Nukleotidsequenzen markieren die Spleißstellen
• Spleißen wird durch Spleißosomenausgeführt
• Spleißosomen sind aus Proteinen und snRNAs zusammengesetzt
Spleißen = Entfernen der Intronsequenzen aus dem Primärtranskript, Verknüpfung der Exons
Janning & Knust 14.9
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24
Das Spleißosom,eine Spleißmaschine
Purves et al. 14.10
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25
Eukaryoten: Kontrolle der Transkription durch die Chromatinstruktur
Modifikation (z. B. Acetylierung) der Chromatinproteine (Histone) reguliert die Transkription
offenes Chromatin -> transkriptionsaktiv
kondensiertes Chromatin -> transkriptionsinaktiv
Histon-AcetylierungHiston-Acetyltransferase(HAT)
Histon-DeacetylierungHiston-Deacetylase(HDAC)
DNA
Nukleosom
30 nm
Histon-oktamer
10 nm
Janning & Knust 17.16
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26
Histon-Acetyltransferase (HAT)
Reguliert Zugänglichkeit der DNA für Proteine der TranskriptionsmaschinerieHiston-Acetyltransferase (HAT) acetyliert Histone in der Nähe der TATA-Box
Histone
Nukleosom
DNA
Transkriptionsfaktor
Ac
RNA-Polymerase II
Transkription
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27
Histon-Deacetylierung
Histon-Acetylierung
Histon-MethylierungDNA-Methylierung
Histon-DemethylierungDNA-Demethylierung
Modifikation des Chromatins
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28
Prokaryoten Eukaryoten
RNA-Polymerase eine RNA-Polymerase, drei RNA-Polymerasen,einige Sigma-Faktoren viele allgemeine
TranskriptionsfaktorenregulatorischeTranskriptions- ja ja; zahlreichfaktoren
Transkript meist polycistronisch, monocistronisch,keine Modifikation Modifikation am 5‘- u. 3‘-Ende
Introns i.d.R. nicht vorhanden, meist vorhanden,kein Spleißen Spleißen
Trennung von Transkription u. nein ja (Kern/Cytoplasma)Translation
Einfluss derChromatinstruktur kein Chromatin! ja
Initiation der Genexpression:Unterschiede zwischen Pro- und Eukaryoten
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29
Die drei durch die Transkription erzeugten Haupttypen von RNA-Molekülen
Brown 6.1
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30
Ribosomale RNA
Ribosomen bestehen aus RNA (rRNA) und Proteinen und sind aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt
Purves et al. 12.9
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31
Ribosomen
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32
Svedbergeinheit S
•Maß für Sedimentationsgeschwindigkeit bei Zentrifugation in einem Dichtegradienten•S-Wert abhängig von Größe, Form, Volumen und Dichte des Partikels/Moleküls•je größer und kompakter, desto größer ist Wanderungsgeschwindigkeit
Zellfraktionierung durch differentielle Zentrifigation, Sedimentationsanalyse oder Dichtegradientenzentrifugation(Saccharose)
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33
Dichten und S-Werte von Zellmaterial
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34
Zusammensetzung der Ribosomen bei Pro- und Eukaryoten
Prokaryoten Eukaryoten
S1, S2, S3, etc.Ges.: ca. 35
18S rRNA(1874)
40SS1, S2, S3, etc.Ges.: >20
16S rRNA(1542)
30Skleine UE
L1, L2, L3, etc.Ges.: ca. 50
28S rRNA(4818)5,8S rRNA(160)5S rRNA(120)
60SL1, L2, L3, etc.Ges.: >30
23S rRNA(2904)5S rRNA(120)
50Sgroße UE
ProteinerRNA (Nukleotide)
GrößeProteinerRNA (Nukleotide)
Größe
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35
Molekulare Feinstruktur eines 70S Ribosoms
Purves et al. 12.9 b
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36
Sekundärstruktur der 16 S rRNA von E. coli
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37
Prozessierung der eukaryotischen rRNA
Janning & Knust 15.1e
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38
DNA, die rRNA kodiert ist repetitiv
Purves et al. 14.2
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39
•Kernkompartiment•Ort der rRNA Synthese•Nukleolus besteht aus DNA, RNA und Proteinen•Prozessierung der prä-rRNA, Zusammensetzung präribosomaler Partikel
Nukleolus-Organisator (NO) besteht aus rDNA, die von mehreren Chromosomenstammen kann und tandemartig abgeordnete rDNA enthält
Nukleolus
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40
tRNAs fungieren als Adapter(400 000 tRNA Moleküle pro Bakterien-Zelle)
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41
•tRNAs bestehen aus 74 – 95 Nukleotiden•Kleeblattstruktur•Akzeptorarm bindet Aminosäure; 3‘ Ende endet immer auf -CCA•DHU-Arm enthält ungewöhnliches Pyrimidin Dihydrouracil•Anticodonarm erkennt mRNA•Variabler Arm enthält variable Anzahl an Nukleotiden•TψC enthält die Abfolge T, Pseudouracil und C
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42
Tertiärstruktur der tRNA
jede tRNA hat individuelle 3D-Struktur
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43
Uridin
Zucker
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44
Der genetische Code
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45
Die 20 in Proteinen vorkommenden Aminosäuren
Janning & Knust 15.3
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46
Problem: 4 Buchstaben A,T,G,C -> aber 20 Aminosäuren
Singulet-Code: 4 CodonsDuplett-Code: 42 = 16 Codons
Triplett-Code: 43 = 64 Codons
Purves et al. 12.5
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47
Frage: Welches Triplett codiert für welche Aminosäure?
Versuch von Nirenberg und Matthaei
Purves et al. 12.6
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48
Der Code ist degeneriert, d.h. mehrere Triplettscodieren eine Aminosäure(Ausnahme: Tryptophan und Methionin)
Synonyme Codons sind sich meist ähnlich, so dass die ersten beiden Basen eines Tripletts oft schon die Aminosäure spezifizieren (Ausnahmen: Leucin und Arginin)
Leucin
Leucin
Arginin
Arginin
Purves et al. 12.5
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49
Die "Wobble"-Hypothese (F. Crick 1965)
"wobble" = "Schwanken, Wackeln"Eine einzelne z. B. mit Glycin beladene tRNA kann drei verschiedene Codons auf der mRNA erkennen
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50
"Wobble" Abweichungen bei der Bindung des Anticodons an das Codon
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Der genetische Code ist fast universellund gilt für alle Organismen
Es gibt wenige Ausnahmen(insbesondere in Mitochondrien-Genomen) z.B. UGA (normalerweise Stop) in Mitochondrien Tryptophan und AUA (normalerweise Isoleucin) in Mitochondrien Methionin
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52
Verwendung von Code-Wörtern (Codon usage)
Ein Beispiel: 6 Arginin Codons
CGT 43%
CGC 32%
CGA 7%
CGG 8%
AGA 9%
AGG 1%
korrespondiert mit Vorkommen synonymer tRNAs d.h. es gibt seltene Codons (Spezies-spezifisch)
Regulation von Genaktivität, da seltene Codons zu schwächerer Expression führen