vi sinh vật gay bệnh trong thực phẩm

M影C L影C M雲 Đ井U............................................................................................................................................... 1 I. TÌNH HÌNH NG浦 Đ浦C TH衛C PH域M TRÊN TH蔭 GI閏I VÀ VI烏T NAM................................... 2 II. M浦T S渦 VI SINH V一T CÓ TH韻 GÂY NG浦 Đ浦C TH衛C PH域M .............................................. 6

2.1 Salmonella ...................................................................................................................... 6 2.2 Campylobacter ............................................................................................................... 6 2.3 Clostridium perfringens ................................................................................................. 7 2.4 Clostridium ..................................................................................................................... 7 2.5 Staphylococcus ............................................................................................................... 8 2.6 Vibrio spp ....................................................................................................................... 9 2.7 Escherichia coli ............................................................................................................ 10 2.8 Shigella ......................................................................................................................... 10 2.9 Listeria monocytogenes ................................................................................................ 11 2.10 Các virus gây bệnh trong thực phẩm ......................................................................... 12 2.11 Coliforms .................................................................................................................... 13 2.12 N医m men và n医m m嘘c................................................................................................ 13

III. CÁC PH姶愛NG PHÁP Đ卯NH L姶営NG VI SINH V一T............................................................... 15 3.1 Đ鵜nh l逢嬰ng vi sinh v壱t bằng ph逢挨ng pháp đ院m tr詠c ti院p............................................. 15

3.1.1 Đ院m bằng buồng đ院m hồng c亥u ............................................................................ 15 3.1.2 Kỹ thu壱t đ院m Breed............................................................................................... 17 3.1.3 Đ院m bằng kính hi吋n vi huỳnh quang..................................................................... 18

3.2 Các kỹ thu壱t đ鵜nh l逢嬰ng vi sinh v壱t trong m磯u bằng ph逢挨ng pháp nuôi c医y............... 19 3.2.1 Ph逢挨ng pháp đ院m khu育n l衣c ................................................................................. 20 3.2.2 Ph逢挨ng pháp 逢噂c đoán s嘘 l逢嬰ng vi sinh bằng kỹ thu壱t MPN (Most Probable Number): ........................................................................................................................ 28 3.2.3 Ph逢挨ng pháp lai khu育n l衣c .................................................................................... 29

3.3 Ph逢挨ng pháp đo đ瓜 đ映c ................................................................................................ 31 IV. ÁP D影NG Đ渦I V閏I M浦T S渦 VI SINH V一T GÂY B烏NH TRONG TH衛C PH域M ............... 32

4.1 Đ鵜nh l逢嬰ng Fecal Coliform và E. Coli bằng ph逢挨ng pháp đ院m đĩa ............................ 32 4.2 Đ鵜nh l逢嬰ng Vibrio Parahaemolyticus .......................................................................... 33 4.3 Đ鵜nh l逢嬰ng Coliforms, Coliforms ch鵜u nhi羽t, E. Coli gi違 đ鵜nh (Fecal Coliforms) bằng ph逢挨ng pháp MPN ............................................................................................................. 35 4.4 Đ鵜nh l逢嬰ng Enterococci đ逢運ng ru瓜t trong n逢噂c bằng ph逢挨ng pháp màng lọc ........... 37

Thi院t b鵜: .......................................................................................................................... 37 4.5 Đ鵜nh l逢嬰ng Clostridium khử sunfite trong n逢噂c bằng ph逢挨ng pháp tăng sinh trong môi tr逢運ng c医y l臼ng................................................................................................................... 38

K蔭T LU一N ........................................................................................................................................ 40 TÀI LI烏U THAM KH謂O.................................................................................................. 41 PH影 L影C ........................................................................................................................... 42

http://www.ebook.edu.vn 1

M雲 Đ井U Các vi sinh v壱t gây b羽nh nhi宇m trong th詠c ph育m th逢運ng gặp gồm các vi

khu育n Salmonella Shigella, E.coli, Bibrio choterea, Clostridium botulinum,

Clostridium perfringens; các vius Hepatis, virus Hepatis virus A, Rotavirus; các ký sinh trùng Amip, sán lá gan, sán bò, trùng lông; các n医m m嘘c và n医m men Aspergillus, candida, Furanium...

Vi sinh v壱t gây b羽nh nhi宇m trong th詠c ph育m bằng 4 con đ逢運ng chính: qua súc v壱t, qua môi tr逢運ng, ch院 bi院n và b違o qu違n. M泳c đ瓜 nguy hi吋m và tri羽u ch泳ng c栄a b羽nh có th吋 gây nên do đ瓜c t嘘 c栄a vi sinh v壱t ti院t vào th詠c ph育m hay do chính t院 bào c栄a chúng gây nên. Đ吋 có th吋 gây ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m, vi sinh ph違i hi羽n di羽n v噂i s嘘 l逢嬰ng t院 bào l噂n và ph映 thu瓜c li隠u l逢嬰ng c栄a từng ch栄ng lo衣i nhi宇m vào, th詠c ph育m ph違i có các đ隠u ki羽n lý hoá thích h嬰p cho vi sinh v壱t đó phát tri吋n, nhi羽t đ瓜 và th運i gian ph違i thích h嬰p cho quá trình tăng tr逢荏ng c栄a chúng từ khi chúng nhi宇m vào cho đ院n khi tiêu th映 đ吋 vi sinh v壱t nhân lên đ院n đ栄 li隠u l逢嬰ng hay s違n xu医t đ栄 l逢嬰ng đ瓜c t嘘 gây h衣i. Khi nhi宇m th詠c ph育m, vi sinh v壱t gây h逢 h臼ng làm th詠c ph育m b鵜 đổi màu, đổi v鵜, có mùi. Tuy nhiên cũng có m瓜t s嘘 lo衣i gây nhi宇m th詠c ph育m nh逢ng không làm thay đổi màu, mùi, v鵜 hay hình d衣ng bên ngoài c栄a th詠c ph育m. Vì v壱y r医t khó nh壱n bi院t bằng c違m quan. Do đó, vi羽c xác đ鵜nh và đ鵜nh l逢嬰ng các vi sinh v壱t gây b羽nh nhi宇m trong th詠c ph育m là đi隠u r医t c亥n thi院t.


I. TÌNH HÌNH NG浦 Đ浦C TH衛C PH域M TRÊN TH蔭 GI閏I VÀ VI烏T NAM

雲 các n逢噂c phát tri吋n có t噂i 10% dân s嘘 b鵜 ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m và mắc b羽nh truy隠n qua th詠c ph育m m厩i năm; v噂i các n逢噂c kém phát tri吋n tỷ l羽 này cao h挨n nhi隠u. Nhi隠u n逢噂c có quy đ鵜nh báo cáo nh逢ng ch雨 đ衣t 1% s嘘 ca b鵜 ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m. Ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m 荏 Mỹ chi院m 5% dân s嘘/năm (>10 tri羽u ng逢-運i/năm), trung bình 175 ca/100.000 dân, m厩i năm ch院t 5.000 ng逢運i; 荏 Anh: 190 ca/100.000 dân; 荏 Nh壱t: 20-40 ca/100.000 dân; 荏 Úc là 4,2 tri羽u ca/năm.

Th詠c tr衣ng vi ph衣m v羽 sinh an toàn th詠c ph育m 荏 n逢噂c ta r医t đáng báo đ瓜ng. Ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m c医p tính trong nh英ng năm qua v磯n có chi隠u h逢噂ng gia tăng c違 v隠 s嘘 v映 và quy mô mắc. Tỷ l羽 mắc/100.000 dân trung bình từ năm 2001 – 2005 là 5,48. Có nhi隠u nguyên nhân gây ra các v映 ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m trong toàn qu嘘c nh逢 th詠c ph育m ô nhi宇m, môi tr逢運ng ô nhi宇m; th詠c ph育m có đ瓜c; đi隠u ki羽n s違n xu医t, ch院 bi院n th詠c ph育m không b違o đ違m an toàn, nh壱n th泳c – hành vi đúng v隠 phòng ch嘘ng ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m c栄a c瓜ng đồng còn nhi隠u h衣n ch院…

Trung bình m厩i năm có 202.2 v映 ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m x違y ra v噂i 5.525,1 ng逢運i mắc và 55.2 ng逢運i ch院t. S嘘 v映 ng瓜 đ瓜c x違y ra nhi隠u nh医t là từ tháng 4 - 7 và tháng 9 – 11. Tỷ l羽 mắc ng瓜 đ瓜c trung bình là 7.14/100.000 dân, tỷ l羽 ch院t là 0,06/100.000 dân/năm.

S嘘 v映 ng瓜 đ瓜c l噂n (≥ 30 ng逢運i) chi院m 26,8% v噂i s嘘 mắc chi院m 83,2%. V映 ng瓜 đ瓜c nh臼 và vừa (<30 ng逢運i) chi院m 73,2% v噂i s嘘 mắc chi院m 16,8%. Tỷ l羽 mắc ng瓜 đ瓜c chi院m 18.7% tổng s嘘 đ嘘i t逢嬰ng cùng ăn chung b英a ăn; tỷ l羽 ch院t là 0,8% tổng s嘘 đ嘘i t逢嬰ng b鵜 mắc ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m. Mọi l泳a tuổi đ隠u có th吋 b鵜 ng瓜 đ瓜c, tuổi nh臼 (0 - 4 tuổi) và tuổi cao ≥ 50 có nguy c挨 mắc và ch院t cao do ng瓜 đ瓜c Bi吋u hi羽n chung trong các v映 ng瓜 đ瓜c là buồn nôn (81,0%), nôn (83,9%), đau b映ng chi院m 79.0%, 雨a ch違y 72.2 %, đau đ亥u chi院m 53.2%, chóng mặt 43,4%, s嘘t 26,3%….

C挨 s荏 nguyên nhân ng瓜 đ瓜c ch栄 y院u là gia đình (54,6%), b院p ăn t壱p th吋 (15,6%), đám c逢噂i/gi厩 (16,6%), th泳c ăn đ逢運ng ph嘘 (5,4%), b院p ăn tr逢運ng học (4,0%). Th泳c ăn nguyên nhân ch栄 y院u là th詠c ph育m h厩n h嬰p (40,0%); thuỷ s違n 14,1%; n医m 13,2%; ngũ c嘘c và các s違n ph育m là 7,8%…

Nguyên nhân ng瓜 đ瓜c ch栄 y院u là nguyên nhân vi sinh v壱t (34,0%), đ瓜c t嘘 t詠 nhiên (24,0%), hoá ch医t (10,0%). Còn 32,0% s嘘 v映 không xác đ鵜nh đ逢嬰c nguyên nhân. Vi sinh v壱t gây ng瓜 đ瓜c là Salmonella, Streptoccocus, E.coli, Staphylococcus aurerus và Vibrio parahaemolyticus; đ瓜c t嘘 t詠 nhiên ch栄 y院u là đ瓜c t嘘 c栄a n医m đ瓜c (13,2%).


Th運i gian báo cáo trung bình c栄a v映 ng瓜 đ瓜c là 9.74 ngày. V噂i v映 ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m ≥30 ng逢運i là 8.53 ngày (0-31 ngày), v噂i v映 ng瓜 đ瓜c <30 ng逢運i là 10,20 ngày (1-37 ngày).

L医y m磯u xét nghi羽m nguyên nhân v映 ng瓜 đ瓜c đ衣t tỷ l羽 r医t th医p: M磯u th詠c ph育m là 47,3%, m磯u b羽nh ph育m là 23,9 %; d映ng c映, bao gói đ衣t t雨 l羽 th医p 1,5 % các v映 ng瓜 đ瓜c.

Bảng 1: S嘘 l逢嬰ng các v映 ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m toàn qu嘘c từ năm 2000 – 2008

K院t qu違 đi隠u tra Năm

V映 ng瓜 đ瓜c (vụ) S嘘 mắc (người) Ch院t (người)

2000 213 4233 59

2001 245 3901 63

2002 218 4.984 71

2003 238 6.428 37

2004 145 3.584 41

2005 144 4.304 53

2006 165 7.135 57

2007 247 7.329 55

2008 205 7.828 61

Trung bình/năm 202.2 (247 - 144) 5.525,1 (7.828 - 3.584) 55.2 (71 – 31)

Tổng c瓜ng 1.820 49.726 497

Bảng 2. Tình hình ngộ độc tại Hà Nội trong 3 năm gần đây

S嘘 v映 ng瓜 đ瓜c Nguyên nhân gây ng瓜 đ瓜c

Năm S嘘 v映

S嘘 ng逢ời mắc

S嘘 ng逢ời ch院t

Vi sinh v壱t

Th詠c ph育m bi院n chất

Hóa chất

tồn d逢 trong th詠c

ph育m

Đ瓜c t嘘 t詠

nhiên

Nguyên nhân khác

2006 2 41 0 2 0 0 0 0 2007 8 137 0 7 0 1 0 0 2008 8 354 0 8 0 0 0 0

Cộng 18 620 0 17 0 1 0 0


Bảng 3: Nguyên nhân trong các v映 ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m trong năm 2007

K院t qu違 đi隠u tra TT Nguyên nhân ng瓜 đ瓜c

Số lượng Tỷ lệ (%)

1 Salmonella 3 1.5 2 Streptoccocus 2 1.0 3 E.coli 4 2.0 4 Staphylococcus aurerus 7 3.4 5 Vibrio parahaemolyticus 1 0.5 6 Thu嘘c di羽t chu瓜t 0 0.0 7 Hoá ch医t 1 0.5 8 Đ瓜c t嘘 c栄a cá nóc 8 3.9 9 Đ瓜c t嘘 con so 2 1.0 10 Đ瓜c t嘘 c栄a con sam 2 1.0 11 Đ瓜c t嘘 trong th鵜t cóc 2 1.0 12 Đ瓜c t嘘 Histamin 3 1.5 13 Đ瓜c t嘘 trong mắm tép 0 0.0 14 Đ瓜c t嘘 trong r逢嬰u 5 2.4 15 Đ瓜c t嘘 c栄a Lá ngón 2 1.0 16 N医m đ瓜c 27 13.2 17 Không rõ nguyên nhân 136 66.3

Tổng c瓜ng 205 100,0


Salmonella Shigella E. coli Vibrio

Staphylococcus Campylobacter Clostridium Listeria


II. M浦T S渦 VI SINH V一T CÓ TH韻 GÂY NG浦 Đ浦C TH衛C PH域M

2.1 Salmonella

Salmonella Tr逢噂c năm 1983 các nhà khoa học chia Salmonella ra làm 3 loài d詠a theo ph違n 泳ng sinh hóa mà chúng tham gia : S.typhi, S.choleraesuis,S. enteridis.

Salmonella là tr詠c khu育n garm (-), hi院u khí và k鵜 khí tùy ý, có kh違 năng di đ瓜ng không t衣o bào tử, lên men glucose và manitol sinh acid nh逢ng không lên men sacarose và lactose, không sinh indole, không phân gi違i urê không có kh違 năng tách nhóm amin từ tryptophane, h亥u h院t các ch栄ng đ隠u sinh H2S. pH t嘘i 逢u cho chúng phát tri吋n nằm trong vùng trung tính, tuy nhiên đôi khi phát tri吋n trong vùng pH từ 4 ÷ 9, không có kh違 năng phát tri吋n 荏 nồng đ瓜 mu嘘i cao.

Vi khu育n Salmonella tồn t衣i trong c挨 th吋 nhi隠u loài đ瓜ng v壱t và có th吋 gây b羽nh cho ng逢運I. Vi khu育n Salmonella có th吋 gây b羽nh truy隠n nhi宇m cho đ瓜ng v壱t nh逢 phó th逢挨ng hàn bò, phó th逢挨ng hàn l嬰n, b羽nh s育y thai cừu và ng詠a, b羽nh b衣ch lỵ gà, b羽nh viêm ru瓜t bò,… Nh英ng b羽nh k吋 trên do Salmonella gây ra ng逢運i ta gọi là b羽nh truy隠n nhi宇m nguyên phát, ngoài ra có th吋 phá hi羽n đ逢嬰c Salmonella trong ch医t bài ti院t c栄a đ瓜ng v壱t.

S嘘 l逢嬰ng Salmonella đ栄 đ吋 gây ng瓜 đ瓜c là khi chúng hi羽n di羽n c違 tri羽u t院 bào trong m瓜t gam th詠c ph育m. Các tri羽u ch泳ng do Salmonella gây ra th逢運ng là tiêu ch違y, ói mửa, buồn nôn. Th運i gian 栄 b羽nh cho đ院n khi các tri羽u ch泳ng bi吋u hi羽n th逢運ng sau 12-36 gi運 k吋 từ khi tiêu th映 th詠c ph育m b鵜 nhi宇m. Tri羽u ch泳ng th逢運ng kéo dài ít nh医t từ 2-7 ngày. Không ph違i t医t c違 mọi ng逢運i khi tiêu th映 th詠c ph育m b鵜 nhi宇m Salmonella đi隠u có bi吋u hi羽n b羽nh, ng逢嬰c l衣i m瓜t s嘘 ng逢運i không có tri羽u ch泳ng lâm sàng khi tiêu th映 ph違i th詠c ph育m nhi宇m vi sinh v壱t này khi đó chúng đ逢嬰c bài ti院t ra ngoài. Các lo衣i th詠c ph育m có nguy c挨 b鵜 nhi宇m Salmonella nh逢 th鵜t gia c亥m, s違n ph育m th鵜t, tr泳ng và các s違n ph育m c栄a tr泳ng, th栄y s違n. Nguồn nhi宇m vi sinh v壱t vào các lo衣i th詠c ph育m th逢運ng có nguồn g嘘c từ đ逢運ng ru瓜t c栄a ng逢運i và các loài đ瓜ng v壱t, chúng có th吋 đ逢嬰c nhi宇m gián ti院p hay tr詠c ti院p. Salmonella gây nên b羽nh s嘘t th逢挨ng hàn thu瓜c các serotype Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C. các dòng này th逢運ng không gây b羽nh cho các loài đ瓜ng v壱t.

2.2 Campylobacter

Đây là vi sinh v壱t gây nên b羽nh viêm nhi宇m đ逢運ng ru瓜t, bằng các ph逢挨ng pháp phân l壱p đã ch泳ng minh vi sinh v壱t này hi羽n di羽n khắp n挨i. Campylobacters là m瓜t trong nh英ng h羽 vi sinh v壱t c栄a nhi隠u lo衣i đ瓜ng v壱t và chim. Nh逢ng các dòng có kh違 năng gây ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m không th吋 phát tri吋n khi nhi羽t đ瓜 th医p h挨n 300C, đây là vi sinh v壱t 逢a nhi羽t bắt bu瓜t. S違n ph育m


s英a và th鵜t gia c亥m là nh英ng nguồn có th吋 gây nên ng瓜 đ瓜c do vi sinh v壱t này. N逢噂c cũng là m瓜t trong nh英ng nguồn mang b羽nh này. Campylobacters là vi sinh v壱t r医t nh衣y v噂i nhi羽t đ瓜, chúng b鵜 tiêu di羽t hoàn toàn bằng ph逢挨ng pháp thanh trùng Pasteur, chúng không th吋 s嘘ng sót trong th詠c ph育m có môi tr逢運ng acid. Chúng không th吋 phát tri吋n trong th詠c ph育m b違o qu違n trong đi隠u ki羽n hi院u khí mà ch雨 phát tri吋n trong các lo衣i th詠c ph育m hút chân không.

Khi xâm nhi宇m Campylobacter, th運i gian 栄 b羽nh th逢運ng từ 2-11 ngày. Các tri羽u ch泳ng do vi sinh v壱t này gây nên nh逢 đau nh泳c, tiêu ch違y, s嘘t, đau đ亥u, khó ch鵜u, chu瓜t rút, l衣nh cóng, mê s違n. Th雨nh tho違ng có nh英ng bi吋u hi羽n b羽nh gi嘘ng nh逢 c違m cúm.

2.3 Clostridium perfringens

Quan ni羽m v隠 s詠 ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m do Clostridium perfringens gây ra đã có nh英ng thay đổi trong nh英ng năm g亥n đây. Theo nh英ng quan ni羽m tr逢噂c đây cho rằng các dòng C.perfringens kháng nhi羽t, t衣o bào tử và không làm tan máu m噂i có th吋 gây ng瓜 đ瓜 th詠c ph育m. Nh逢ng trong nh英ng năm gây đây các dòng nh衣y c違m v噂i nhi羽t, không làm tan máu cũng đ逢嬰c tìm th医y trong các v映 ng瓜 đ瓜c do vi sinh v壱t này gây nên.

Vì các bào tử c栄a C. perfringen kháng nhi羽t nên chúng th逢運ng s嘘ng sót qua quá trình n医u chín. Tuy nhiên cũng ph映 thu瓜c vào th運i gian ti院p xúc v噂i nhi羽t. N院u nh英ng bào tử s嘘ng sót, khi gặp đi隠u ki羽n thích h嬰p chúng s胤 n育y m亥m và nhân lên. Khi đun n医u th泳c ăn 荏 nhi羽t đ瓜 th医p và th運i gian ngắn có th吋 làm cho các dòng kháng nhi羽t tồn t衣i vì th院 chúng s胤 gây tái nhi宇m sau khi b違o qu違n. Các nguồn th詠c ph育m có th吋 gây ng瓜 đ瓜c v噂i các vi sinh v壱t này th逢運ng là th鵜t gia c亥m, nh医t là các lo衣i gia c亥m l噂n đông l衣nh sâu, th鵜t trong các h亥m ch泳a. C. perfringens cũng đ逢嬰c tìm th医y trong đ医t, trong phân ng逢運i và trong các lo衣i th詠c ph育m khác. Các tri羽u ch泳ng do vi sinh v壱t này gây ra th逢運ng là đau thắt vùng b映ng, tiêu ch違y. Th運i gian 栄 b羽nh từ 12-24 gi運. Các tri羽u ch泳ng lâm sàng gây nên do đ瓜c t嘘 c栄a chúng.

2.4 Clostridium

Clostridium là các vi khu育n garm (+), hình que, k鵜 khí sinh bào tử , không di đ瓜ng, có th吋 th栄y gi違i saccaride và protein trong các ho衣t đ瓜ng thu nh壱n năng l逢嬰ng t衣o ra các s違n ph育m nh逢 acid acetic, butiric, r逢嬰u, t衣o ra các mùi khó ch鵜u trong s違n ph育m. Clostridium phát tri吋n m衣nh 荏 nhi羽t đ瓜 55oC, nhi羽t đ瓜 t嘘i 逢u là 43 ÷ 47oC. Nhi羽t đ瓜 15 ÷ 20oC làm ch壱m hoặc làm ng逢ng s詠 phát tri吋n c栄a vi khu育n này. Không phát tri吋n 荏 pH h挨n 5,0 hoặc trên 9,0, b鵜泳c ch院 b荏i 5% NaCl. Clostridium hi羽n di羽n trong đ医t, m瓜t s嘘 loài trong nhóm này gây b羽nh cho ng逢運i và đ瓜ng v壱t, m瓜t s嘘 loài khác gây h逢 h臼ng th詠c ph育m, khử sunphit thành sunphur t衣o ra màu đem và gây mùi khó ch鵜u.


Clostridium botulinum là vi sinh v壱t sinh đ瓜c t嘘 gây b羽nh ng瓜 đ瓜c th鵜t cho ng逢運i (botulism). B羽nh bi吋u hi羽n r医t nghiêm trọng 荏 ng逢運i. B羽nh gây ra do đ瓜c t嘘 đ逢嬰c hình thành b荏i C.botulinum nhi宇m trong th詠c ph育m. Tri羽u ch泳ng lâm sàng c栄a b羽nh là ói mửa, buồn nôn, sau đó có nh英ng bi吋u hi羽n r嘘i lo衣n thành kinh nh逢 choáng váng, r嘘i lo衣n th鵜 giác, r嘘i lo衣n các c挨荏 cổ và mi羽ng, đau 荏 vùng ng詠c, khó th荏 và tê li羽t, có th吋 d磯n đ院n tử vong. Các tri羽u ch泳ng trên bi吋u hi羽n sau 12-36 gi運 sau khi tiêu th映 th映c ph育m nhi宇m đ瓜c t嘘. Các tri羽u ch泳ng th逢運ng kéo dài 2-6 ngày tuỳ theo tình tr衣ng nhi宇m đ瓜c và s泳c khoẻ c栄ng từng b羽nh nhân.

Các lo衣i th詠c ph育m nh逢 th鵜t, rau qu違 không đ逢嬰c b違o qu違n đúng qui đ鵜nh hay lây nhi宇m từ đ医t, phân đ瓜ng v壱t hay do ch院 bi院n không đ栄 nhi羽t đ瓜 tr逢噂c khi dùng, các s違n ph育m đóng h瓜p không đúng qui cách cũng có nguy c挨 nhi宇m vi sinh v壱t này r医y cao. Đi隠u ki羽n thích h嬰p cho vi羽c hình thành đ瓜c t嘘 c栄a vi sinh v壱t này đi羽u ki羽n môi tr逢運ng kỵ khí, pH trung tính, không có các vi sinh v壱t khác c衣nh tranh. Đ瓜c t嘘 botuline do C. botulinum ti院t ra gồm m瓜t s嘘 lo衣i khác nhau nh逢 A, B, C1, C2, D, E, F, G. các đ瓜c t嘘 này là nh英ng protein có trọng l逢嬰ng phân tử l噂n kho違ng 1 tri羽u danton. Nh逢ng nh英ng d衣ng có tác đ瓜ng m衣nh đ院n con ng逢運i là A, B, và E. đây cũng là m瓜t trong nh英ng lo衣i đ瓜c t嘘 sinh học có c逢運ng đ瓜 m衣nh nh医t. Trong nh英ng năm g亥y đây, các v映 ng瓜 đ瓜c botulism gây ra do C.botulinum dòng E th逢運ng đ逢嬰c phát hi羽n khi tiêu th映 cá và các s違n ph育m th栄y s違n. Dòng vi sinh v壱t này th逢運ng xuyên phân l壱p đ逢嬰c từ các m磯u bùn đáy t衣i các cửa sông.

2.5 Staphylococcus

Staphylococcus là lo衣i c亥u khu育n gram (+), các t院 bào c栄a chúng liên k院t thành hình chùm nho. Khi phát tri吋n trong môi tr逢運ng, Staphylococcus có kh違 năng t衣o ra sắc t嘘 từ màu trắng đ院n vàng s壱m, nhi羽t đ瓜 20 ÷ 25oC thích h嬰p nh医t cho chúng t衣o màu. Staphylococcus không di đ瓜ng, không t衣o bào tử, nhi羽t đ瓜 thích h嬰p cho s詠 phát tri吋n là 37oC, ch鵜u đ逢嬰c s詠 khô h衣n, h挨i nóng (荏 nhi羽t đ瓜 50oC chúng v壱n s嘘ng trong 30 phút), có kh違 năng s嘘ng 荏 nồng đ瓜 mu嘘i 9 ÷ 10%. Staphylococcus phát tri吋n 荏 pH r医t r瓜ng (pH = 4,0 ÷ 9,8). Kho違ng pH t嘘i 逢u c栄a chúng là 6 ÷ 7 và aw t嘘i 逢u kho違ng 0,83 ÷ 0,86. Staphylococcus có kh違 năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose. Staphylococcus đ逢嬰c phân b嘘 khắp n挨i nh逢ng ch栄 y院u đ逢嬰c phân l壱p từ da và màng nh亥y c栄a ng逢運i và đ瓜ng v壱t máu nóng. Staphylococcus có th吋 nhi宇m vào trong th詠c ph育m qua con đ逢運ng ti院p xúc v噂i ng逢運i thao tác trong quá trình ch院 bi院n th詠c ph育m. S詠 hi羽n di羽n v噂i m壱t đ瓜 cao c栄a Staphylococcus

trong th詠c ph育m ch雨 th鵜 đi隠u ki羽n v羽 sinh và ki吋m soát nhi羽t đ瓜 kém c栄a quá trình ch院 bi院n.

Staphylococcus aureus là VSV có kh違 năng s違n sinh m瓜t s嘘 lo衣i đ瓜c t嘘 đ逢運ng ru瓜t b隠n nhi羽t, không b鵜 phân huỷ khi đun 荏 100oC trong kho違ng 30


phút. Khi vi sinh v壱t này xâm nhi宇m vào trong th詠c ph育m, chúng ti院t đ瓜c t嘘 vào trong s違n ph育m và gây đ瓜c. Khi con ng逢運i tiêu th映 lo衣i th詠c ph育m có ch泳a đ瓜c t嘘 này, sau 4-6 gi運栄 b羽nh s胤 b瓜c phát các tri羽u ch泳ng lâm sàng nh逢 tiêu ch違y, nôn m英a, các tri羽u ch泳ng này kéo dài từ 6-8 gi運. Các lo衣i th詠c ph育m có ch泳a hàm l逢嬰ng mu嘘i cao th逢運ng có nguy c挨 nhi宇m vi sinh v壱t này nh逢 jambon, kem tổng h嬰p, n逢噂c soup… vì các lo衣i th詠c ph育m này ít khi đ逢嬰c xử lý 荏 nhi羽t đ瓜 cao h挨n 40oC. Các lo衣i thuỷ s違n hay th詠c ph育m đóng h瓜p cũng th逢運ng hay b鵜 nhi宇m loài vi sinh v壱t này. Các nguồn lây nhi宇m vào th詠c ph育m ch栄 yêu từ các khâu ch院 bi院n trong nhà b院p. Trong t詠 nhiên các vi sinh v壱t này th逢運ng tình th医y trên da, mũi, tóc hay lông c栄a các loài đ瓜ng v壱t máu nóng.

2.6 Vibrio spp

Các loài Vibrio có nguồn g嘘c từ bi吋n, chúng c亥n ion Na+ đ吋 phát tri吋n. Gi嘘ng Vibrio có m瓜t s嘘 loài có kh違 năng gây b羽nh cho ng逢運i nh逢 V. cholerae,

V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. hollisae, V. furnsii, V. mimicus, V.

fluvialis, V. alginolyticus.

V. cholerae là tác nhân gây nên các v映 d鵜ch t違 trên toàn th院 gi噂i. Loài vi sinh v壱t này đ逢嬰c chia thành hai ki吋u huy院t thanh chính đó là O1 và non-O1, ki吋u huy院t thanh O1 bao gồm ba ki吋u huy院t thanh ph映 nh逢 sau: Ogawa; Inaba (hai ki吋u này đ逢嬰c gọi chung là ki吋u cổ đi吋n – Classic) và ki吋u Eltor (ki吋u Eltor còn đ逢嬰c gọi là ki吋u O139). Hai ki宇u huy院t thanh Inaba và Ogawa ngày nay ch雨 còn đ逢嬰c tìm th医y t衣i các n逢噂c thu瓜c khu v詠c châu A. Trong khi đó các v映 d鵜ch t違 trên khắp th吋 gi噂i gây ra do ki吋u Eltor. Khi có các tr壱n d鵜ch do V.

cholerae gây ra th逢運ng lan truy隠n r医t nhanh vào trong n逢噂c, gây nhi宇m vào th詠c ph育m, n院u đi隠u ki羽n v羽 sinh kém, vi khu育n s胤 lan truy隠n qua con ng逢運i và d鵜ch b羽nh càng thêm nghiêm trọng. Vi sinh v壱t này s違n sinh đ瓜c t嘘 cholaratoxin, đây là lo衣i đ瓜c t嘘 đ逢運ng ru瓜t có c逢運ng đ瓜 m衣nh, ch雨 c亥n 5µg gây nhi宇m qua đ逢運ng mi羽ng có th吋 gây tiêu ch違y cho ng逢運i tr逢荏ng thành. M瓜t s嘘 đ瓜c t嘘 khác cũng đ逢嬰c vi sinh này ti院t ra nh逢 hemolysine có đ瓜c tính t逢挨ng t詠 tetrodotoxin (đ瓜c t嘘 cá nóc) hay đ瓜c t嘘 t逢挨ng t詠 shiga-toxin.

Các lo衣i th詠c ph育m có th吋 lan truy隠n V. cholerae nh逢 n逢噂c u嘘ng, n逢噂c trái cây, rau qu違, s英a và các s違n ph育m s英a, th壱m chí bia cũng có kh違 năng nhi宇m vi sinh v壱t này. Các lo衣i s違n ph育m thuỷ s違n t逢挨i s嘘ng, không qua gia nhi羽t, gia nhi羽t nhẹ hay do s詠 nhi宇m chéo sau khi gia nhi羽t cũng đ逢嬰c khuy院n các là có nguy c挨 mang V.cholerae khá nghiêm trọng.

V. parahaemolyticus là loài vi sinh v壱t tồn t衣i và phát tri吋n trong môi tr逢運ng có hàm l逢嬰ng mu嘘i cao, chúng th逢運ng xuyên đ逢嬰c phân l壱p từ các s違n ph育m th栄y s違n, trong các vùng n逢噂c 医m ven b運 bi吋n. Chúng s違n sinh đ瓜c t嘘 hemolysine b隠n nhi羽t, ch医t này ch鵜u trách nhi羽m cho đặc tính kháng nguyên Kanagawa. Nh逢ng trong nh英ng năm g亥n đây các dòng V.parahaemolyticus có ph違n 泳ng Kanagawa âm tính cũng có th吋 gây b羽nh. Tri羽u ch泳ng bi吋u hi羽n c栄a


b羽nh có th吋 xu医t hi羽n trong kho違ng 2-96 gi運 sau khi tiêu th映 th詠c ph育m b鵜 nhi宇m, th運i gian này ph映 thu瓜c vào li隠u l逢嬰ng xâm nhi宇m và th吋 tr衣ng c栄a từng b羽nh nhân, lo衣i th詠c ph育m tiêu th映 và hàm l逢嬰ng acid trong d衣 dày. Các bi吋u hi羽n b羽nh lý khi vi sinh v壱t này xâm nhi宇m và đau thắt vùng b映ng, viêm nhi宇m đ逢運ng ru瓜t và tiêu ch違y nhẹ.

Các loài Vibrio khác khi xâm nhi宇m vào trong th詠c ph育m cũng có th吋 gây nên các b羽nh đ逢嬰ng ru瓜t và có bi吋u hi羽n b羽nh lý t逢挨ng t詠 nh逢 hai loài trên. Dĩ nhiên tuỳ từng loài và li隠u l逢嬰ng mà có nh英ng bi隠u hi羽n b羽nh nặng nhẹ khác nhau. Ch雨 riêng loài V. vulnificus không gây các tri羽u ch泳ng b羽nh đ逢運ng ru瓜t mà chúng gây nhi宇m trùng máu cho ng逢運i.

2.7 Escherichia coli

E.coli thu瓜c họ Enterbacteriaceae, catalose (+), oxidase (-), gram (-), tr詠c khu育n ngắn, không t衣o bào tử, ch鵜u đ逢嬰c nhi羽t, không b鵜 h栄y khi đun nóng 100oC trong 2 gi運. E.coli có th吋 kháng cồn, không b鵜 h栄y khi ti院p xúc v噂i cồn 50%, b鵜 h栄y b荏i focmol 5%, có kh違 năng phát tri吋n 荏 nhi羽t đ瓜 từ 30 ÷ 50oC, nhi羽t đ瓜 phát tri吋n t嘘i 逢u c栄a chúng là 37oC, phát tri吋n 荏 pH t嘘i 逢u là 4,4 và aw t嘘i 逢u là 0,95.

E. coli là vi sinh v壱t hi院u khí phổ bi院n trong đ逢運ng tiêu hoá c栄a ng逢運i và các loài đ瓜ng v壱t máu nóng. H亥u h院t các dòng E. coli tồn t衣i m瓜t cách t詠 nhiên và không gây h衣i trong đ逢運ng tiêu hoá, ng逢嬰c l衣i chúng còn đóng vai trò quan trọng trong vi羽c ổn đ鵜nh sinh lý đ逢運ng tiêu hoá. Tuy nhiên có ít nh医t 4 dòng sau đây có th吋 gây b羽nh cho ng逢運i và m瓜t s嘘 loài đ瓜ng v壱t:

Enterobathogenic E. coli (EPEC)

Enterotocigenic E. coli (ETEC)

Enteroinvasive E. coli (EIEC)

Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC)/ verocytocin E.coli (VTEC) hay Ecoli O157: H7

Các dòng E. coli gây b羽nh khi chúng xâm nhi宇m vào ng逢運i qua con đ逢運ng th詠c ph育m có th吋 gây nên các b羽nh r嘘i lo衣n đ逢運ng tiêu hoá, các bi吋u hi羽n lâm sàng bi院n đ瓜ng có th吋 từ nhẹ đ院n r医t nặng, có th吋 đe do衣 m衣ng s嘘ng c栄a con ng逢運i ph映 thu瓜c vào li隠u l逢嬰ng, dòng gây nhi宇m và kh違 năng đáp 泳ng c栄a từng ng逢運i.

2.8 Shigella

Gi嘘ng Shigella cũng là m瓜t thành viên c栄a họ vi khu育n đ逢運ng ru瓜t Enterobacteriacae, chúng gồm có 4 loài sau: S. dysenteriae, S. sonnei, S.

plexneri, S. boydii. Đây là gi嘘ng vi sinh v壱t có t院 bào ch栄 đặc hi羽u, chúng ch雨 thích nghi và phát tri吋n trong t院 bào ch栄 là ng逢運i và các loài linh tr逢荏ng. S詠 hi羽n di羽n c栄a chúng trong môi tr逢運ng là do s詠 nhi宇m phân c栄a ng逢運i và các loài mang vi sinh v壱t này. Shigella có th吋 tồn t衣i h挨n 6 tháng trong môi tr逢運ng


n逢噂c. Các v映 ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m do Shigella gây ra ch栄 y院u t壱p trung 荏 các n逢噂c kém phát tri吋n, ch院 bi院n th詠c ph育m trong đi隠u ki羽n kém v羽 sinh. B羽nh cũng có th吋 truy隠n tr詠c ti院p từ ng逢運i qua ng逢運i.

Shigella ch栄 y院u gây nên các b羽nh l鵜 tr詠c trùng. Th運i gian 栄 b羽nh sau khi tiêu th映 th詠c ph育m b鵜 nhi宇m là 1-7 ngày. Các bi吋u hi羽n tri羽u ch泳ng b羽nh có th吋 nhẹ, bi吋u hi羽n không rõ, ch雨 thoáng qua nh逢 tiêu ch違y nhẹ, nh逢ng đôi khi cũng có nh英ng bi吋u hi羽n nghiêm trọng nh逢 đi tiêu ra máu, có nh英ng m違nh niêm m衣c ru瓜t, m医t n逢噂c, s嘘t cao và b鵜 co rút thành b映ng. Các tri羽u ch泳ng trên có th吋 kéo dài 12-14 ngày hay lâu h挨n. Đ嘘i v噂i ng逢運i l噂n, các tr逢運ng h嬰p tử vong do Shigella hi院m khi di宇n ra, nh逢ng b羽nh bi吋u hi羽n r医t nghiêm trọng đ嘘i v噂i trẻ em và ng逢運i già. Hàng năm có kho違ng nửa tri羽u ng逢運i tử vong do vi sinh v壱t gây ra trên khắp th院 gi噂i.

S詠 lây nhi宇m vi khu育n Shigella ch栄 y院u đ逢運ng mi羽ng. N逢噂c là m瓜t môi tr逢運ng truy隠n b羽nh quan trọng, đặc bi羽t 荏 nh英ng n挨i kém v羽 sinh. Tuy nhiên các lo衣i th詠c ph育m cũng là nguyên nhân gây nên các b羽nh do Shigella. Vi sinh v壱t này nhi宇m vào th詠c ph育m qua nguyên li羽u hay quá trình ch院 bi院n. Ðôi khi nhi宇m b羽nh do v羽 sinh cá nhân kém.

2.9 Listeria monocytogenes

Trong nh英ng năm g亥n đây L. monocytogenes nổi lên nh逢 m瓜t m瓜t tác nhân gây b羽nh nguy hi吋m. Đ嘘i t逢嬰ng gây b羽nh c栄a vi sinh v壱t này là trẻ em, ph映 n英 mang thai hay nh英ng ng逢運i già. Đ嘘i v噂i nh英ng vi sinh v壱t gây b羽nh g瓜 đ瓜c th泳c ph育m khác, chúng b瓜c phát b羽nh khi con ng逢運i h医p thu đ栄 li隠u l逢嬰ng, sau th運i gian 栄 b羽nh các tri羽u ch泳ng lâm sàng bi吋u hi羽n. Ng逢嬰c l衣i L.

monocytogenes hi羽n di羽n v噂i m瓜t s嘘 l逢嬰ng nh臼 trong th詠c ph育m, khi đ逢嬰c đ逢a vào c挨 th吋, chúng tồn t衣i và ch挨 c挨 h瓜i. Khi có đi隠u ki羽n thu壱n l嬰i, chúng nhân lên xâm nhi宇m vào các mô sâu và gây b羽nh. Các b羽nh do vi sinh v壱t này gây nên bắt đ亥u từ đ逢運ng tiêu hoá nh逢 tiêu ch違y, s嘘t nhẹ. Sau đó chúng xâm nhi宇m vào các đ衣i th詠c bào gây nên b羽nh nhi宇m trùng máu, tác đ瓜ng lên h羽 th亥n kinh trung 逢挨ng, tim mắt, và có th吋 xâm nh壱p vào bào thai gây nên s育y thai, đẻ non hay nhi宇m trùng thai nhi.

L. monocytogenes thu瓜c lo衣i vi sinh v壱t 逢a l衣nh, chúng có th吋 phát tri吋n 噂 nhi羽t đ瓜 từ 2-44oC. Chúng th逢運ng đ逢嬰c phân l壱p từ các lo衣i th詠c ph育m nh逢 phomat s英a, th鵜t cá rau qu違 và th壱m chí phân l壱p đ逢嬰c từ trong n逢噂c mặt. Trong t医t c違 các công đo衣n ch院 bi院n th詠c ph育m, s英a hay rau qu違 đ隠u có kh違 năng xâm nhi宇m vi sinh v壱t v壱t này. Đặt bi羽t trong công đo衣n b違o qu違n các s違n ph育m 噂 nhi羽t đ瓜 th医p, vi sinh v壱t này có c挨 h瓜i phát tri吋n thành s嘘 l逢嬰ng l噂n. Các s違n ph育m thanh trùng Pasteur và đ逢嬰c b違o qu違n 噂 nhi羽t đ瓜 th医p trong các t栄 l衣nh có nguy c挨 nhi宇m vi sinh v壱t này r医t cao.


2.10 Các virus gây bệnh trong thực phẩm

Các đ嬰t d鵜ch b羽nh gây ra từ th詠c ph育m do tác nhân virus cho đ院n nay v磯n là v医n đ隠 bí 育n. Nh逢ng m瓜t s嘘 tác gi違 v磯n tin rằng virus trong th詠c ph磯m là tác nhân gây nên các b羽nh hi宇m nghèo. Nh英ng ti院n b瓜 trong các nhiên c泳u v隠 virus th逢c ph育m v磯n còn h衣n ch院. Cho d院n nay các đặc đi吋m sinh lý c栄a virus đ逢運ng ru瓜t v磯n còn bi院t r医t h衣n ch院. Cho đ院n nay các ph逢挨ng pháp nuôi c医y đ吋 phát hi羽n virus trong th詠c ph育m cho đ院n nay v磯n ch逢a th吋 th詠c hi羽n đ逢嬰c. Nh逢ng v噂i các ti院n b瓜 v隠 kỹ thu壱t sinh học phân tử nh逢 kỹ thu壱t lai phân tử, kỹ thu壱t PCR có th吋 phát hi羽n đ逢嬰c các virus có h衣i cho con ng逢運i trong th詠c ph育m.

S詠 lan truy隠n virus cho ng逢運i qua con đ逢運ng th詠c ph育m đ逢嬰c bi院t từ nh英ng năm 1950. Các virus gây b羽nh đ逢運ng ru瓜t cho ng逢運i ch栄 y院u có nguồn g嘘c từ các s違n ph育m thuỷ s違n. Cho đ院n nay đ逢嬰c bi院t có kho違ng h挨n 100 lo衣i virus đ逢運ng ru瓜t. Nh逢ng ch雨 m瓜t vài loài trong s嘘 đó có kh違 năng gây b羽nh cho ng逢運i. Theo Kilgen và Cole (1991) các loài virus sau đây có th吋 gây nguy hi吋m cho ng逢運i.

Hepatitis type A (HAV)

Virus Norwalk

Calicivirus

Astrovirus

Virus NonA và Non B.

Virus tồn t衣i 荏 th吋 không ho衣t đ瓜ng khi 荏 bên ngoài t院 bào, chúng không th吋 t詠 nhân lên trong n逢噂c hay trong các s違n ph育m th詠c ph育m cho dù 荏 b医t kỳ đi隠u ki羽n hoá lý nh逢 th院 nào. Chúng xâm nhi宇m vào th詠c ph育m hoàn toàn do quá trình ch院 bi院n, từ n逢噂c b鵜 ô nhi宇m. Các loài nhuy宇n th吋 ăn lọc có kh違 năng tích luỹ nhi隠u virus trong n逢噂c. Hàng ngày m瓜t con nguy宇n th吋 có th吋 lọc 1500 lít n逢噂c, theo đó m瓜t s嘘 l逢嬰ng l噂n virus có th吋 vào c挨 th宇 c栄a con v壱t này và tích luỹ t衣i đó. Vì th院 m壱t đ瓜 virus trong c挨 th吋 nhuy宇n th吋 cao h挨n r医t nhi隠u so v噂i môi tr逢運ng n逢噂c chúng đang sinh s嘘ng.

Li隠u l逢嬰ng gây b羽nh c栄a virus có th吋 th医p h挨n r医t nhi隠u so v噂i vi khu育n khi con ng逢運i tiêu th映 th詠c ph育m b鵜 nhi宇m. Li隠u l逢嬰ng gây nhi宇m t嘘i thi吋u c栄a m瓜t s嘘 loài vurus đ逢運ng ru瓜t t逢挨ng đ逢挨ng v噂i s嘘 l逢嬰ng hi羽n di羽n trong th詠c ph育m mà các phòng thí nghi羽n có th吋 phát hi羽n đ逢嬰c bằng ph逢挨ng pháp nuôi c医y.

C挨 th吋 ng逢運i và các loài đ瓜ng v壱t là nguồn ch泳a các virus đ逢運ng ru瓜t. Virus đ逢嬰c tìm th医y v噂i s嘘 l逢嬰ng l噂n trong phân c栄a nh英ng ng逢運i b鵜 nhi宇m và tồn t衣i trong nhi隠u ngày đ院n nhi隠u tu亥n. S詠 nhi宇m phân vào trong th詠c ph育m bằng con đ逢運ng gián ti院p hay tr詠c ti院p là con đ逢運ng xâm nhi宇m virus vào th詠c ph育m.

S詠 s嘘ng sót c栄a virus trong môi tr逢運ng hay trong th詠c ph育m ph映 thu瓜c vào y院u t嘘 nh逢 nhi羽t đ瓜, nồng đ瓜 mu嘘i, c逢運ng đ瓜 b泳c x衣 mặt tr運i hay s詠 hi羽n di羽n c栄a các thành ph亥n h英u c挨 khác. Virus đ逢運ng ru瓜t cũng có kh違 năng tồn


t衣i nhi隠u tháng trong n逢噂c bi吋n 荏 nhi羽t đ瓜 < 10oC th壱m chí có th吋 lâu h挨n. Vì th院 đây cũng là nhân t嘘 ch雨 th鵜 ô nhi宇m phân. T医t c違 các virus đ逢運ng ru瓜t đ隠u kháng v噂i acid, các enzym th栄y gi違i, hay mu嘘i m壱t có trong đ逢運ng tiêu hoá. M瓜t s嘘 virus có th吋 kháng nhi羽t nh逢 Hepatits type A, m瓜t s嘘 khác có th吋 kháng v噂i các ch医t t育y u院 nh逢 phenolic, ethanol …. Ozon và chlorine là nh英ng tác nhân có th吋 làm b医t ho衣t m瓜t vài lo衣i virus đ逢運ng ru瓜t.

Đ吋 ngăn ngừa các b羽nh do virus từ th詠c ph育m, các lo衣i th泳c ăn ph違i đ逢嬰c n医u chín,khử virus tr逢噂c khi tiêu th映, các lo衣i nhuy宇n th吋 ăn lọc ph違i đ逢嬰c khai thác tronng nh英ng vùng n逢噂c không nhi宇m virus hay đ逢嬰c nuôi trong các vùng n逢噂c s衣ch tr逢噂c khi tiêu th映.

2.11 Coliforms

Coliforms là nh英ng tr詠c khu育n hình g壱y, gram âm (-), không sinh bào tử, hi院u khí hoặc kỵ khí tùy ý. Chúng có kh違 năng phát tri吋n 荏 nhi羽t đ瓜 r医t r瓜ng từ -2oC đ院n 50oC, pH trong kho違ng 4,4 ÷ 9,0. Coliforms có kh違 năng lên men lactose sinh acid và sinh h挨i 荏 37oC trong 24 ÷ 48gi運.

Coliforms hi羽n di羽n r瓜ng rãi trong t詠 nhiên trong ru瓜t ng逢運i, đ瓜ng v壱t. Khi s嘘 Coliforms c栄a th詠c ph育m cao thì kh違 năng hi羽n di羽n c栄a các vi sinh v壱t gây b羽nh khác cũng cao….

Coliforms ch鵜u nhi羽t là nh英ng Coliforms có kh違 năng lên men lactose sinh h挨i trong kho違ng 24 gi運 khi đ逢嬰c 栄荏 44oC tromg môi tr逢運ng canh EC. Coliforms phân là Coliforms ch鵜u nhi羽t có kh違 năng sinh indole khi đ逢嬰c 栄 kho違ng 24 gi運荏 45,5oC trong canh Trypton. Coliforms phân là m瓜t thành ph亥n c栄a h羽 vi sinh v壱t đ逢運ng ru瓜t 荏 ng逢運i và các đ瓜ng v壱t máu nóng khác và đ逢嬰c sử d映ng đ吋 ch雨 th鵜 m泳c đ瓜 v羽 sinh trong quá trình ch院 bi院n, b違o qu違n, v壱n chuy吋n th詠c ph育m, n逢噂c u嘘ng.

Căn c泳 vào nhi羽t đ瓜 vi sinh v壱t có th吋 phát tri吋n đ吋 chia nhóm Coliform thành hai nhóm. Nhóm Coliform có nguồn g嘘c từ phân c栄a các loài đ瓜ng v壱t và, nhóm này đ逢嬰c gọi là Coliform phân và nhóm không có nguồn g嘘c từ phân đ瓜ng v壱t. Trên th詠c t院, các ph逢挨ng pháp ki吋m nghi羽m ch雨 xác đ鵜nh Coliform

phân là xác đ鵜nh nhóm coliform có nguồn ng嘘c từ ru瓜t ng逢運i và các đ瓜ng v壱t máu nóng bao gồm các gi嘘ng nh逢 Escherichia; Klebsiella và Enterobater.

2.12 Nấm men và nấm m嘘c

N医m men và n医m m嘘c là nhóm vi sinh v壱t r医t đa d衣ng, đây là nhóm vi sinh v壱t nhân th壱t có vách t院 bào và l噂p v臼 chitin, có nhân và các bào quan khác. T医t c違 các loài n医m men và n医m móc đ隠u thu瓜c nhóm vi sinh v壱t d鵜 d逢叡ng. Chúng ch雨 có kh違 năng nh壱n các ch医t dinh d逢叡ng 荏 d衣ng hòa tan. Trong quá trình trao đổi ch医t x違y ra 荏 t院 bào chúng l衣i có kh違 năng chuy吋n hóa các ch医t hòa tan thành các ch医t không hòa tan nh逢 lignocellulose,…. Ngoài ra, chúng còn có th吋 t衣o ra các ch医t đ瓜c, các ch医t đ瓜c c栄a chúng đ逢嬰c gọi chung là


đ瓜c t嘘 vi n医m (mycotoxins). Tiêu bi吋u có Aspegillus flavus, Aspegillus

parasiticus, Aspegiluus moninus, Penicillium italicum, Penicillium digitatum,

Penicillium roquefortii, Penicillium cammenbertii. Trong th詠c ph育m n医m m嘘c và n医m men hi羽n di羽n có th吋 tăng tr逢荏ng làm thay đổi màu c栄a th詠c ph育m, làm phát sinh muồi hay v鵜 l衣, làm h逢 h臼ng hay thay đổi c挨 c医u c栄a th詠c ph育m, m瓜t s嘘 có th吋 t衣o đ瓜c t嘘 gây ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m.


III. CÁC PH姶愛NG PHÁP Đ卯NH L姶営NG VI SINH V一T

3.1 Đ鵜nh l逢嬰ng vi sinh v壱t bằng ph逢挨ng pháp đ院m tr詠c ti院p

S嘘 l逢嬰ng Vi sinh v壱t trong m磯u có th吋 đ逢嬰c xác đ鵜nh bằng cách đ院m tr詠c ti院p trên kính hi吋n vi. Qui trình đ院n tr詠c ti院p cho phép xác đ鵜nh đ逢嬰c s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t v噂i k院t qu違 cao nh医t. Mặt dù ph逢挨ng pháp đ院m tr詠c ti院p bằng kính hi吋n vi cho phép 逢噂c l逢嬰ng nhanh chóng s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t có trong m磯u. Tuy v壱y ph逢挨ng pháp này có nh英ng đi吋m h衣n ch院 nh医t đ鵜nh nh逢 không phân bi羽t đ逢嬰c s嘘 l逢嬰ng t院 bào s嘘ng và s嘘 l逢嬰ng t院 bào ch院t, d吋 nh亥m l磯n t院 bào vi sinh v壱t v噂i các m違nh v荏 nh臼 c栄a m磯u và không cho phép tìm hi吋u các đặc đi吋m khác c栄a c栄a vi sinh v壱t đ逢嬰c đ逢嬰c quan sát.

3.1.1 Đ院m bằng buồng đ院m hồng c亥u

Đ嘘i v噂i các vi sinh v壱t có kích th逢噂c l噂n nh逢 n医m men, n医m m嘘c, t違o và protozoa, ph逢挨ng pháp đ院m tr詠c ti院p d宇 dàng th詠c hi羽n v噂i các lo衣i buồng đ院m. Có r医t nhi隠u lo衣i buồn đ院m vi sinh v壱t khác nhau phù h嬰p v噂i từng th吋 tích và kích th逢噂c c栄a từng nhóm vi sinh v壱t. Ví d映 có th吋 sử d映ng buồng đ院m hồng c亥u Petroff – Hauser đ吋 đ院m vi khu育n. Đ嘘i v噂i các m磯u n逢噂c và các m磯u khác, buồng đ院m Holber đ逢嬰c sử d映ng r瓜ng rãi nh医t.

Buồng đ院n Holber là m瓜t lam kính dày 2-3mm có m瓜t vùng đĩa đ院m nằm gi英a lame kính vùng này đ逢嬰c bao quanh b荏i m瓜t rãnh. Đĩa đ院m th医p h挨n b隠 mặt c栄a lame kính kho違ng 0,02mm, có hình tròn vì th院 khi ph栄 lên trên bằng kính đ壱y v壱t thì đ瓜 sâu c栄a đĩa đ院m s胤 đồng đ隠u nhau. Vùng đĩa đ院m có đi羽n tích 1mm2 và đ逢嬰c chia thành 400 ô vuông nh臼 h挨n, m厩i ô có di羽n tích 0.0025mm2. th吋 tích c栄a m厩i ô là 0,02 x 0,0025 mm2, th吋 tích này t逢挨ng đ逢挨ng v噂i 0,00005ml. Thêm vài giọt formalin vào trong nh英ng lọ ch泳a m磯u, tr瓜n đ隠u. Pha loãng m磯u c亥n đ院m sao cho trong m厩i ô nh臼 c栄a buồng đ院m có khoãng 5 - 10 t院 bào vi sinh v壱t. Đ吋 đ衣t đ逢嬰c đ瓜 pha loãng nh逢 v壱y c亥n ph違i 逢噂c l逢嬰ng đ逢嬰c s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t trong m磯u, đồng th運i ph違i thử vài l亥n trong quá trình pha loãng. M磯u ph違i đ逢嬰c pha loãng bằng dung d鵜ch pha loãng ch泳a 0,1% pepton và 0,1% laurylsulphat và 0,01% methyl blue. T医t c違 các dung d鵜ch pha loãng đ隠u ph違i c亥n lọc tr逢噂c khi sử d映ng.


Đặt m瓜t giọt m磯u đ逢嬰c pha loãng vào trong đĩa đ院m trên buồng đ院m, đ壱y bằng kính đ壱y v壱t. T医t c違 các buồng đ院m và kính đ壱y v壱t ph違i đ逢嬰c lau th壱t s衣ch. Th吋 tích m磯u ch泳a trong buồng đ院m là kho違ng không gian gi英a đĩa đ院m và kính đ壱y v壱t, không đ吋 m磯u tràng ra bên ngoài rãnh c栄a đĩa. Sau khi đ衣t m磯u, đ吋 yên kho違ng 5 phút đ吋 ổn đ鵜nh v鵜 trí c栄a các t院 bào trong buồng đ院m. Đ院m ng磯u nhiên kho違ng 50-100 ô nh臼. Tính trung bình s嘘 l逢嬰ng vi khu育n trong t医t c違 các ô đã đ院m. Sau đó nhân v噂i 20 000 và v噂i đ瓜 pha loãng m磯u tr逢噂c khi đ院m đ吋 có đ逢嬰c s嘘 l逢嬰ng t院 bào trong 1ml. Lặp l衣i hai l亥n hay nhi隠u h挨n đ吋 l医y giá tr鵜 s嘘 đ院m trung bình. Đ嘘i v噂i các vi sinh v壱t t映 thành từng c映m, không th吋 phân bi羽t từng t院 bào thì m厩i c映m đ逢嬰c xem là m瓜t vi khu育n.

V噂i nh英ng kinh nghi羽m c栄a m厩i cá nhân v隠 đ瓜 pha loãng, thao tác kỹ thu壱t thành th衣o có th吋 nh壱n đ逢嬰c các s嘘 đ院m chính xác. Tuy v壱t k院t qu違 có chính xác hay không còn ph映 thu瓜c vào s詠 s衣ch s胤 c栄a buồng đ院m, kính đ壱y v壱t nhằm đ違m b違o không có vi khu育n khác không ph違i từ m磯u hi羽n di羽n trong buồng đ院m và trong kính đ壱y v壱t.

3.1.2 Kỹ thu壱t đ院m Breed

Kỹ thu壱t này r医t h英u ích trong vi羽c xác đ鵜nh tổng s嘘 vi sinh v壱t bằng ph逢挨ng pháp đ院m tr詠c ti院p. Lame kính Breed có m瓜t vùng có di羽n tích 1cm2 đ逢嬰c đánh d医u trên lame. Dùng b挨m tiêm, hay que c医y vòng cho 0,01ml m磯u c亥n đ院m vào trong vùng này, s医y khô bằng ngọn lửa sau đó nhu瓜m v噂i methyl blue. Khi đ院m, cho d亥u nhúng lên di羽n tích vùng c亥n đ院m. Thông th逢運ng vùng này có đ逢運ng kính 0,16 mm. Di羽n tích vùng đ院m là pr2 hay 3,14 x 0,08 x 0,08 = 0,02mm2. V噂i di羽n tích này chi院m 1/5000 trong tổng di羽n tích đặt m磯u là 100mm2 hay th吋 tích trong vùng đ院m là 1/5000 x 0,01ml. Nh逢 v壱y n院u có 1 vi sinh v壱t trong vùng đ院m thì t逢挨ng đ逢挨ng v噂i 5000/0,01ml hay 500 000 t院 bào/ml. S嘘 đ院m c栄a các vi sinh v壱t trong các vùng khác nhau c栄a vùng qui 逢噂c đ逢嬰c tính bằng công th泳c nh逢 sau:

4

2

Nx4x10C =

dπ

d: đ逢運ng kính v栄a vùng đ院m

N: s嘘 l逢嬰ng t院 bào trong 1 vùng

C: s嘘 t院 bào trong 1ml

Khi sử d映ng kính hi吋n vi huỳnh quang v噂i các ch医t nhu瓜m khác nh逢 acridin cam (AODC), 4’,6-dianidino-2-phenyl-indol (DAPI), fluorescein isothiocyanate (FITC) cũng đ逢嬰c sử d映ng r瓜ng rãi đ吋 đ院m s嘘 l逢嬰ng vi khu育n. Các nghiên c泳u c栄a K.G. Porter và Y.S. Feig cho th医y rằng khi sử d映ng DAPI đ吋 đ院m s嘘 l逢嬰ng vi khu育n trong n逢噂c cho k院t qu違 t嘘t h挨n khi sử d映ng ch医t nhu瓜m AODC khi trong m磯u n逢噂c có nhi隠u ch医t dinh d逢叡ng và nhi隠u phiêu sinh v壱t khác. V隠 đ瓜 b隠n tính phát huỳnh quang c栄a DAPI cũng cao h挨n


AODC. Hai tác gi違 trên cũng ch泳ng minh rằng khi nhu瓜m v噂i DAFI có th吋 b違o qu違n trong t嘘i đ院n 24 tu亥n mà c逢運ng đ瓜 phát quan không thay đổi. Trong khi đó AODC c逢運ng đ瓜 và s嘘 l逢嬰ng phát quang b鵜 gi違m khi b違o qu違n trong vòng 1 tu亥n 荏 c栄ng đi隠u ki羽n.

3.1.3 Đ院m bằng kính hi吋n vi huỳnh quang

M瓜t kỹ thu壱t khác d詠a trên nguyên tắc nhu瓜m màu đặc hi羽u DNA đ逢嬰c gọi là Hoechst 33258 cũng đ逢嬰c sử d映ng đ吋 nhu瓜m và đ院m s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t trên kính hi吋n vi huỳnh quang. Ph逢挨ng pháp này nh逢 sau: Bisbenzumide k院t h嬰p v噂i vùng DNA giàu adenine và thyamine sau khi gắn ph泳c h嬰p này s胤 phát huỳng quang. Hoechst 33258 đ逢嬰c sử d映ng nhi隠u trong vi羽c đ鵜nh l逢嬰ng vi sinh v壱t trên b隠 mặt. Đặt bi羽t trên b隠 mặt có gắn các acridine orange. M瓜t s詠 thu壱n l嬰i khác khi sử d映ng ph逢挨ng pháp nhu瓜m màu bisbenzimide cho phép đ院m s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t trong các d映ng d鵜ch ch医t t育y rửa, trong mu嘘i dùng cho các phòng thí nhi羽m hay trong các ch院 ph育m sinh học khác mà không có s詠 hi羽n di羽n c栄a DNA. Ph逢挨ng pháp đ院m s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t bằng ph逢挨ng pháp phát huỳnh quang đ逢嬰c 泳ng d映ng r瓜ng rãi trong vi羽c phân tích các m磯u môi tr逢運ng nh逢 n逢噂c đ医t ….

Sử d映ng d亥u nhúng phát quang th医p là m瓜t phát minh quan trọng trong vi羽c h衣n ch院 s詠 phát huỳnh quang c栄a các màng lọc. Màng carbonate Nuclepore là m瓜t màng cellulose cao c医p dùng trong vi羽c đ院m tr詠c ti院p vi khu育n b荏i vì chúng có kích th逢噂c lổ đồng nh医t và b隠 mặt màng phẳng, chúng có th吋 gi英 l衣i t医t c違 các vi sinh v壱t trên b吋 mặt c栄a chúng. Màng Nuclepore có th吋 nhu瓜m v噂i thu嘘c nhu瓜m Irgalan đen hay các lo衣i thu嘘c nhu瓜m phù h嬰p khác đ吋 t衣o nên m瓜t n隠n màu đen t逢挨ng ph違n v噂i màu phát quang c栄a vi sinh v壱t vì th院 vi羽c đ院m đ逢嬰c th詠c hi羽n d宇 dàng. Khi sử d映ng thu嘘c nhu瓜m là acridine cam vi khu育n và các vi sinh v壱t khác phát quang màu xanh hay màu cam. Màu phát quang xanh hay cam là ph映 thu瓜c vào tình tr衣ng sinh lý c栄a từng vi sinh v壱t. Nh逢ng kh違 năng phân bi羽t t院 bào đang s嘘ng hay t院 bào đã ch院t b荏i m亥u phát quang đôi khi đ逢a đ院n s詠 nh亥m l磯n. Sử d映ng ADPI nhu瓜m DNA c栄a t院 bào vi khu育n chúng đ逢a đ院n s詠 phát quang màu xanh d逢挨ng đ逢嬰c cho là t嘘i 逢u h挨n so v噂i vi羽c sử d映ng acridin cam đ吋 nhu瓜m các vi khu育n có kích th逢噂c nh臼.

S嘘 đ院m nh壱n đ逢嬰c từ ph逢挨ng pháp đ院m tr詠c ti院p trên kính hi吋n vi phát huỳnh quang luôn cho k院t qu違 cao t逢挨ng đ逢挨ng hai l亥n so v噂i k院t qu違 nh壱n đ逢嬰c bằng kỹ thu壱t nuôi c医y khác. Nh英ng vi khu育n có kích th逢噂c nh臼, có hình d衣ng b医t th逢運ng khác cũng đ隠u có th吋 nhìn th医y bằng ph逢挨ng pháp phát huỳnh quang. M瓜t s嘘 d衣ng vi sinh v壱t không th吋 nuôi c医y trong các môi tr逢運ng tổng h嬰p trong phòng thí nghi羽m. Hi羽n t逢嬰ng không th吋 nuôi c医y c栄a các vi sinh v壱t cho đ院n nay v磯n ch逢a rõ là do chúng thoái hoá, không th吋 nhân lên trong các môi tr逢運ng nhân t衣o hay do không đáp 泳ng đ逢嬰c các đi隠u ki羽n sinh lý c亥n thi院t


cho s詠 phát tri吋n c栄a chúng. Trong m瓜t s嘘 tr逢運ng h嬰p, s詠 t逢挨ng quan cao gi英a ph逢挨ng pháp đ院m tr詠c ti院p bằng ph逢挨ng pháp phát huỳnh quang và ph逢挨ng pháp đ院m khu育n. Tuy nhiên trong m瓜t s嘘 tr逢運ng h嬰p khác s詠 t逢挨ng quang này r医t kém. S詠 khác bi羽t gi英a ph逢挨ng pháp đ院m tr詠c ti院p và ph逢挨ng pháp đ院m khu磯n l衣c ph違n ánh s詠 chọn lọc c栄a môi tr逢運ng và đi隠u ki羽n nuôi c医y, m瓜t ph亥n t院 bào b鵜 ch院t hay b鵜 th逢挨ng tổn và s嘘 loài c映 th吋 trong m磯u.

Giá tr鵜 c栄a s嘘 đ院m tr詠c ti院p bằng ph逢挨ng pháp phát huỳnh quang trên kính hi吋n vi t逢挨ng đ逢挨ng v噂i v噂i s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t th壱t s詠 có th吋 có v噂i t医t c違 các loài khác nhau. Đi隠u đó cho phép 逢噂c đoán đ逢嬰c đ逢嬰c s嘘 l逢嬰ng th壱t s詠 trong n逢噂c bi吋n, trong n逢噂c t詠 nhiên, trong trong m瓜t lo衣i m磯u nào đó, mặt dù các loài này có s詠 khác bi羽t l噂n v隠 s嘘 l逢嬰ng c栄a từng ch栄ng loài, khác bi羽t v隠 đặc đi吋m sinh lý di吋n ra trong cùng đi隠u ki羽n c栄a m磯u. S嘘 đ院m tr詠c ti院p th逢運ng ph違n ánh đúng v噂i sinh kh嘘i, vì th院 th逢運ng đ逢嬰c dùng đ吋逢噂c l逢嬰ng sinh kh嘘i vi sinh v壱t có trong m磯u. Tuy nhiên đ吋 có đ逢嬰c s嘘 đ院m chính xác bằng kính hi吋n vi phát huỳng quang c亥n ph違i đ院m nhi隠u l亥n và nhi隠u v鵜 trí khác nhau trên m磯u.

Thêm vào đó n院u đ院m nhi隠u t院 bào đang phân chia có th吋 cho phép 逢噂c đoán t嘘c đ瓜 phát tri吋n c栄a vi sinh v壱t trong m磯u. T亥n su医t c栄a t院 bào đang phân chia đ逢嬰c nhìn th医y có m嘘i liên h羽 v噂i ch雨 s嘘 đo khác c栄a t嘘c đ瓜 phát tri吋n vi sinh v壱t nh逢 t嘘c đ瓜 tổng h嬰p RNA đ逢嬰c đo b荏i s詠 phòng thích c栄a adenine đ逢嬰c đánh d医u. T亥ng xu医t c栄a t院 bào đang phân chia đ逢嬰c tính bằng th運i gian gi英a lúc bắt đ亥u s詠 thắt c栄a t院 bào đ院n khi t院 bào phân chia là m瓜t hằng s嘘. Con s嘘 này không ph違i là b医t bi院n. Th壱t khó khăn đ吋 nh壱n ra s詠 phân chia t院 bào khi sử d映ng kính hi吋n vi quang học mà không sử d映ng kính hi吋n vi phát huỳnh quang.

3.2 Các kỹ thu壱t đ鵜nh l逢嬰ng vi sinh v壱t trong m磯u bằng ph逢挨ng pháp nuôi cấy

Có hai cách đ吋 xác đ鵜nh s嘘 l逢嬰ng vi khu育n bằng ph逢挨ng pháp nuôi c医y: ph逢挨ng pháp đ院m khu育n l衣c và ph逢挨ng pháp 逢噂c đoán s嘘 l逢嬰ng vi khu育n (MPN – Most probable number). T医t c違 các ph逢挨ng pháp đ鵜nh l逢嬰ng vi khu育n


trong m磯u bằng ph逢挨ng pháp nuôi c医y đ隠u yêu c亥u các t院 bào ph違i đ逢嬰c tách r運i nhau, qua quá trình nuôi c医y các t院 bào này phát tri吋n thành các dòng riêng bi羽t. T医t các qui trình đ鵜nh l逢嬰ng bằng ph逢挨ng pháp nuôi c医y nhằm chọn lọc m瓜t hay nhi隠u nhóm vi khu育n nh医t đ鵜nh nào đó, m泳c đ瓜 chọn lọc ph映 thu瓜c và từng qui trình qui trình c映 th吋. Đ吋 xác đ鵜nh tổng s嘘 vi sinh v壱t trong m磯u ph違i chọn qui trình gi違m t嘘i thi吋u kh違 năng chọn lọc. Nh逢ng dù m泳c đ瓜 chọn lọc 荏 m泳c t嘘i thi吋u cũng ch雨 đ鵜nh l逢嬰ng đ逢嬰c s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t có th吋 nuôi c医y. Còn m瓜t s嘘 l逢嬰ng l噂n vi sinh v壱t khác không th吋 phát tri吋n đ逢嬰c trong quá trình nuôi c医y thì không th吋 đ鵜nh l逢嬰ng đ逢嬰c bằng ph逢挨ng pháp này. Có các ph逢挨ng pháp đ鵜nh l逢嬰ng nuôi c医y nh逢 sau nh逢 sau:

3.2.1 Ph逢挨ng pháp đ院m khu育n l衣c

Ph逢挨ng pháp đ院m khu育n l衣c trên đĩa đ逢嬰c sử d映ng r瓜ng rãi đ吋 đ鵜nh l逢嬰ng vi sinh v壱t, đặc bi羽t là vi khu育n, nh逢ng pháp này có nh英ng khuy院t đi吋m và đã có nh英ng cách nhìn nh壱n khác nhau v隠 mặt khoa học. Khuy院t đi吋m c栄a ph逢挨ng pháp này nằm trong s詠 l衣m d映ng đ吋 bi吋u đ衣t sai các k院t qu違. T医t c違 mọi ng逢運i đ隠u mắc sai l亥m khi nh壱n ra rằng ph逢挨ng pháp này không th吋 dùng đ吋 thu đ逢嬰c k院t qu違 tổng s嘘 vi sinh v壱t.

Ph逢挨ng pháp đ院m khu育n l衣c sử d映ng nhi隠u lo衣i môi tr逢運ng và các đi隠u ki羽n nuôi c医y khác nhau. Agar là ch医t th逢運ng đ逢嬰c dùng đ吋 làm đặc các môi tr逢運ng nuôi c医y vì h亥u h院r các vi sinh v壱t đ隠u m医t các gen tổng h嬰p enzym phân gi違i agar. Các m磯u đã đ逢嬰c pha loãng đ吋 trãi lên b隠 mặt môi tr逢運ng agar (ph逢挨ng pháp trãi) hay khuy院t tán vào trong nôi tr逢運ng tr逢噂c khi làm đặc (ph逢挨ng pháp đổ đĩa). M瓜t v医n đ隠 c亥n ph違i cân nhắc là các vi sinh v壱t c亥n xác đ鵜nh có th吋 tồn t衣i và phát tri吋n trong môi tr逢運ng agar hay không. M瓜t s嘘 vi sinh v壱t có th吋 b鵜 ch院t khi trãi trên b隠 mặt môi tr逢運ng trong qui trình c医y tr違i b隠 mặt. M瓜t s嘘 loài vi khu育n khác không th吋 s嘘ng trong đi隠u ki羽n nhi羽t đ瓜 duy trì tr衣ng thái l臼ng c栄a agar trong qui trình đổ đĩa. B荏i vì agar ch雨 là tác nhân làm rắn môi tr逢運ng nuôi c医y trong qui trình đ鵜nh l逢嬰ng vi sinh v壱t vì th院 trong m瓜t s嘘 tr逢運ng h嬰p agar có th吋 đ逢嬰c thay th院 bằng các tác nhân làm rắn khác. Trong m瓜t s嘘 tr逢運ng h嬰p các vi sinh v壱t có các nhu c亥u dinh d逢叡ng đặc bi羽t khác, các ch医t nh逢 silicagel có th吋 đ逢嬰c thay th院 đ吋 làm rắn môi tr逢運ng. Nh逢 ng vì chu育n b鵜 môi tr逢運ng silicagel khó khăn h挨n chu育n b鵜 môi tr逢運ng agar nên ch雨 dùng môi tr逢運ng silicagel khi không th吋 thay th院 đ逢嬰c môi tr逢運ng agar.

Ph逢挨ng pháp 嘘ng cu瓜n đ逢嬰c dùng đ吋 đ鵜nh l逢嬰ng các vi sinh v壱t kỵ khí bắt bu瓜c. Đây là m瓜t ph逢挨ng pháp c違i biên c栄a ph逢挨ng pháp đổ đĩa. Các đĩa hay các 嘘ng sau khi c医y vi khu育n đ逢嬰c 栄 trong đi隠u ki羽n nhi羽t đ瓜 đặc bi羽t trong m瓜t th噂i gian nh医t đ鵜nh đ吋 cho sinh v壱t phát tri吋n thành các khu育n l衣c có th吋 nhìn th医y bằng mắt tr逢運ng, s嘘 l逢嬰ng khu育n l衣c xu医t hi羽n trên đĩa s胤 đ逢嬰c đ院m. S嘘 l逢嬰ng khu育n l衣c s胤 đ逢嬰c gán cho s嘘 t院 bào đ挨n lẻ trong m磯u ban đ亥u. Đ吋 s嘘 l逢嬰ng khu育n l衣c ph違n ánh đ逢嬰c s嘘 l逢嬰ng t院 bào vi khu育n, m磯u ph違i đ逢嬰c phân


tán đ隠u vào trong môi tr逢運ng hay trên b隠 mặt môi trt逢運ng rắn. Nh英ng đĩa có quá nhi隠u khu育n l衣c xu医t hi羽n thì không th吋 cho s嘘 l逢嬰ng đ院m chính xác b荏i vì chúng có th吋 chồng l医p lên nhau. Nh英ng đĩa có quá ít khu育n l衣c cũng ph違i b臼 đi vì theo nguyên tắc c栄a xác su医t.

Nh英ng v医n đ隠 chính y院u c亥n xem xét trong qui trình đ院m khu育n l衣c là thành ph亥n môi tr逢運ng, đi隠u ki羽n và th運i gian nuôi 栄. Môi tr逢運ng đ吋 đ鵜nh l逢嬰ng các vi sinh v壱t d鵜 d逢叡ng không th吋 c嘘 đ鵜nh nit挨 ph違i ch泳a các nguồn nit挨, carbon, phosphate d宇 sử d映ng và các cation, anion c亥n thi院t nh逢 sắt, mangie, calci, natri, clo và sulphate. Thành ph亥n c栄a các hàm l逢嬰ng không nh医t đ鵜nh, chúng đặt thù cho từng lo衣i môi tr逢運ng và từng lo衣i m磯u nh医t đ鵜nh đ吋 có th吋 nh壱n đ逢嬰c s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t m映c tiêu cao nh医t. Nh逢 v壱y môi tr逢運ng nuôi c医y ph違i có các thành ph亥n dinh d逢叡ng phù h嬰p v噂i từng yêu c亥u c栄a loài vi sinh v壱t, bao gồm c違 các nhân t嘘 c亥n thi院t khác cho s詠 phát tri吋n c栄a m瓜t h羽 vi sinh v壱t nh医t đ鵜nh. M映c đích chung c栄a môi tr逢運ng là hàm l逢嬰ng dinh d逢叡ng ph違i cao h挨n các thành ph亥n có trong các m磯u đang phân tích. Hàm l逢嬰ng dinh d逢叡ng trong các lo衣i môi tr逢運ng đ院m tổng s嘘 vi sinh v壱t ph違i đ栄 cao, và đ瓜c tính c栄a môi tr逢運ng đ嘘i v噂i sinh v壱t 荏 m泳c th医p nh医t.

Đ吋 nâng cao hi羽u qu違 c栄a qui trình đ鵜nh l逢嬰ng vi sinh v壱t bằng ph逢挨ng pháp đ院m khu育n l衣c, các đi隠u ki羽n c亥n ph違i đi隠u ch雨nh sao cho ch雨 có các thành viên vi sinh v壱t c亥n phát hi羽n theo đ鵜nh nghĩa đ逢嬰c đ院m. Các môi tr逢運ng đ院m đĩa đ逢嬰c chọn lọc hay phân bi羽t v噂i các thành viên vi sinh v壱t khác. Qui trình đ院m đĩa chọn lọc đ逢嬰c thi院t k院 cho thích h嬰p v噂i s詠 phát tri吋n c栄a vi sinh v壱t mong mu嘘n. S詠 phát tri吋n c栄a các nhóm vi sinh v壱t khác đ逢嬰c lo衣i b臼 b荏i các thành ph亥n c栄a môi tr逢運ng hay đi隠u ki羽n nuôi 栄. Môi tr逢運ng phân bi羽t là môi tr逢運ng không lo衣i b臼 các nhóm vi sinh v壱t không mong mu嘘n mà ng逢嬰c l衣i cho phép chúng phát tri吋n cũng trên môi tr逢運ng đó nh逢ng có th吋 bi羽t phân bi羽t các nhóm vi sinh v壱t mong mu嘘n v噂i các nhóm khác bằng các đặc đi吋m nh壱n d衣ng.

Môi tr逢運ng cũng có th吋 đ逢嬰c thi院t l壱p đ吋 chọn lọc các loài n医m m嘘c. Mặt dù kỹ thu壱t đ院m khu育n l衣c không ph違i là ph逢挨ng pháp đ逢嬰c chọn cho vi羽c xác đ鵜nh s嘘 l逢嬰ng n医m m嘘c trong các m磯u th詠c ph育m và trong môi tr逢運ng. B荏i vì kỹ thu壱t này ch雨 thích h嬰p cho vi羽c đ鵜nh l逢嬰ng các loài vi sinh v壱t không có s嬰i hay bào tử. Dĩ nhiên ph逢挨ng pháp đ院m khu育n l衣c cũng thích h嬰p cho vi羽c đ鵜nh l詠挨ng các loài n医m men. Vì s嘘 l逢嬰ng c栄a vi khu育n luôn nhi隠u h挨n s嘘 l逢嬰ng c栄a n医m m嘘c nên đ吋 ngăn c違n s詠 phát tri吋n c栄a vi khu育n trong các khu育n l衣c c栄a n医m m嘘c, các tác nhân 泳c ch院 vi khu育n đ逢嬰c thêm vào trong các môi tr逢運ng nuôi c医y. Các thu嘘c nhu瓜m bengal rose và các kháng sinh nh逢 streptomycine, neomycine th逢運ng đ逢嬰c sử d映ng là nh英ng tác nhân 泳c ch院 vi khu育n. M瓜t bi羽n pháp đ挨n gi違n đ吋泳c ch院 s詠 phát tri吋n c栄a vi khu育n là h衣 th医p pH c栄a môi tr逢運ng nuôi c医y xu嘘ng kho違ng 4,5 - 5,5. H亥u h院t các n医m m嘘c đ隠u không b鵜 tác đ瓜ng khi phát tri吋n trong kho違ng pH này nh逢ng khi đó vi khu育n b鵜泳c ch院.


Môi tr逢運ng chọn đ逢嬰c xác l壱p công th泳c đ吋泳c ch院 s詠 phát tri吋n c栄a nhóm vi sinh v壱t và cho phép m瓜t nhóm vi sinh v壱t khác phát tri吋n. Ví d映 môi tr逢運ng Saubouraud Dextrose Agar đ逢嬰c dùng đ吋 đ鵜nh l逢嬰ng n医m m嘘c d詠a trên nguyên tắc pH th医p và nguồn carbohydrate. Bổ sung vào môi tr逢運ng các ch医t kháng sinh khác nh逢 peniciline hay methyl bule là nh英ng tác nhân 泳c ch院 vi khu亥n gram âm. Các vi sinh v壱t kháng kháng sinh cũng có th吋 đ逢嬰c đ鵜nh l逢嬰ng trên môi tr逢運ng bằng cách thêm vào đó m瓜t li隠u l逢嬰ng kháng sinh.

Môi tr逢運ng phân bi羽t đ逢嬰c thi院t l壱p d詠a trên nhi隠u cách. Các thu嘘c thử đ逢嬰c thêm vào trong môi tr逢運ng đ吋 cho phép nh壱n ra các s詠 khác bi羽t c栄a nh英ng vi sinh v壱t mong mu嘘n. Có th吋 thêm thu嘘c thử vào môi tr逢運ng sau khi nuôi c医y đ吋 nh壱n ra các loài vi sinh v壱t đặc tr逢ng c亥n tìm. Chìa khoá nâng cao kh違 năng phân bi羽t c栄a môi tr逢運ng là qui trình nuôi c医y đ吋 cho phép môi tr逢運ng phân bi羽t m瓜t cách t嘘t nh医t v噂i vi sinh v壱t c亥n đ鵜nh l逢嬰ng và các vi sinh v壱t khác có trong m磯u.

Môi tr逢運ng Eosin methyl blue (EMB) và MacConkey agar là nh英ng môi tr逢運ng đ逢嬰c sử d映ng r瓜ng rãi trong vi羽c phân tích vi sinh v壱t trong n逢噂c. Nh英ng môi tr逢運ng này bao gồm tính chọn lọc và tính phân bi羽t. Chúng chọn lọc cho s詠 phát tri吋n c栄a các vi khu育n gram âm b荏i trong đó có thêm vào các tác nhân 泳c ch院 các vi khu育n gram d逢挨ng. Môi tr逢運ng này có th吋 phân bi羽t các vi khu育n có th吋 sử d映ng lactose b荏i s詠 hình thành các khu育n l衣c có th吋 phân bi羽t bằng màu sắc. Trên môi tr逢運ng EMB, vi khu育n thu瓜c nhóm coliforms là nhóm gram âm t衣o nên nh英ng khu育n l衣c có màu tím ánh kim. Đ鵜nh l逢嬰ng s嘘 l逢嬰ng coliform bằng cách đ院m s嘘 l逢嬰ng khu育n l衣c có các đặc đi吋m này. Cách này th逢運ng xuyên đ逢嬰c s英 d映ng trong vi羽c phân bi羽t các vi sinh v壱t ch雨 th鵜 trong n逢噂c và trong th詠c ph育m.

V噂i kỹ thu壱t đ院n khu磯n l衣c, các m磯u c亥n phân tích ph違i đ逢嬰c pha loãng thành chu厩i pha loãng liên ti院p và đ逢嬰c xác đ鵜nh m瓜t vài nồng đ瓜 pha loãng nh医t đ鵜nh đ吋 c医y vào các môi tr逢運ng đã chọn phù h嬰p v噂i các đ嘘i t逢嬰ng c亥n xác đ鵜nh. Mổi khu磯n l衣c đ逢嬰c hình thành đ逢嬰c gán cho m瓜t đ挨n v鵜 hình thành khu育n l衣c (cfu-colony forming units). Kỹ thu壱t th逢運ng qua các b逢噂c nh逢 sau:

Dung d鵜ch pha loãng: m瓜t s嘘 dung d鵜ch dùng đ吋 pha loãng có th吋 làm ch院t t院 bào nh逢: n逢噂c mu嘘i, n逢噂c c医t. Các dung d鵜ch pha loãng không đ逢嬰c dùng ngay khi l医y ra từ t栄 l衣nh có th吋 gây s嘘c và làm cho vi sinh v壱t không th吋 phát tri吋n đ逢嬰c. Dung d鵜ch pepton water là dung đ鵜ch pha loãng đ逢嬰c sử d映ng nhi隠u nh医t và đ逢嬰c xem là dung d鵜ch pha loãng cho t医t c違 các lo衣i m磯u. N院u trong m磯u còn có m瓜t ít các ch医t khử trùng thì ph違i thêm vào dung d鵜ch pha loãng tác nhân gi違m thi吋u kh違 năng khử trùng c栄a chúng, ví d映: n院u trong m磯u còn d逢 l逢嬰ng c栄a các h嬰p ch医t amonium (NH4-) thì có th吋 thêm vào đó Tween 80 hay lecithin. Ng逢嬰c l衣i n院u trong m磯u có ch泳a các h嬰p ch医t chlorin hay iodin thì c亥n thêm vào đó các mu嘘i nh逢 sodium thiosulphate.


Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu

B挨m chính xác 9ml dung d鵜ch pha loãng vào trong 嘘ng nghi羽m có nắp đ壱y. N院u sử d映ng các 嘘ng nghi羽m có nắp không đóng chặc đ逢嬰c thì ph違i khử trùng 嘘ng nghi羽m, sau đó b挨m dung d鵜ch pha loãng vào, các thao tác này ph違i đ逢嬰c th詠c hi羽n m瓜t cách vô trùng. Phân ph嘘i dung d鵜ch pha loãng vào các 嘘ng sau khi khử trùng còn có ý nghĩa đ違m b違o th吋 tích dung d鵜ch pha loãng không b鵜 m医t do quá trình khử trùng. Các thao tác pha loãng tuỳ thu瓜c vào từng lo衣i m磯u. C映 th吋 nh逢 sau:

- N院u pha loãng các m磯u là ch医t l臼ng, tr逢噂c khi pha loãng m磯u ph違i đ逢嬰c lắc kỹ, cắm đ亥u pippette sâu vào trong m磯u kho違ng 1” hút ra 1ml, cho vào trong 嘘ng ch泳a dung d鵜ch pha loãng đ亥u tiên, lắc kỹ 嘘ng nghi羽m ch泳a m磯u, b臼 pippette vừa sử d映ng, dùng m瓜t pipptte m噂i th詠c hi羽n l衣i thao tác nh逢 trên v噂i các đ瓜 pha loãng ti院p theo. C泳 ti院p t映c nh逢 v壱y cho đ院n khi đ衣t đ逢嬰c đ瓜 pha loãng mong mu嘘n. M厩i đ瓜 pha loãng ch雨 đ逢嬰c phép sử d映ng 1 pippette. Hàm l逢嬰ng m磯u trong 1ml dung d鵜ch các đ瓜 pha loãng c栄a dãy nh逢 sau:

渦ng s嘘 1 2 3 4

T雨 l羽 pha loãng

1/10 1/100 1/1000 1/10000

Th吋 tích m磯u ban đ亥u (ml)

0,1 0,01 0,001 0,0001

Đ瓜 pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4

- Đ嘘i v噂i các m磯u rắn hay bán l臼ng, các thao tác đ逢嬰c ti院n hành nh逢 sau: cân 10 g m磯u vào trong các bao d壱p m磯u hay các máy xay vô trùng, thêm 90ml


dung d鵜ch pha loãng và đồng nh医t m磯u, ph違i đ違m b違o sao cho vi khu育n phân tán đ隠u vào trong dung d鵜ch. Sau khi m磯u và dung d鵜ch pha loãng đ逢嬰c đồng nh医t ta đ逢嬰c dung d鵜ch pha loãng 1/10. Các đ瓜 pha loãng sau đ逢嬰c ti院n hành t逢挨ng t詠 nh逢 ph亥n pha loãng m磯u l臼ng. Trong 1ml các dung d鵜ch pha loãng ch泳a hàm l逢嬰ng m磯u nh逢 sau:

渦ng s嘘 1 2 3 4

T雨 l羽 pha loãng

1/10 1/100 1/1000 1/10000

Th吋 tích m磯u ban đ亥u (g)

0,1 0,01 0,001 0,0001

Đ瓜 pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4

Cấy mẫu bằng phương pháp đổ đĩa

Các môi tr逢運ng agar đ逢嬰c đun ch違y trong các chai hay trong các 嘘ng nghi羽m có th吋 tích phù h嬰p. Đ逢嬰c làm mát trong các b吋 đi隠u nhi羽t 荏 45oC.

Hút 1ml m厩i dung d鵜ch pha loãng cho vào trong đĩa petri vô trùng. M厩i đ瓜 pha loãng th逢運ng đ逢嬰c c医y vào hai đĩa petri hay nhi隠u h挨n. Cũng s英 d映ng các pippette s衣ch cho m厩i đ瓜 pha loãng. Ch雨 chọn c医y vào đĩa petri nh英ng đ瓜 pha loãng có m壱t đ瓜 vi sinh v壱t phù h嬰p, th逢運ng trong kho違ng 25-300 t院 bào/ml. Đ厩 vào m厩i đĩa đã c医y 10-15ml môi tr逢運ng đã đ逢嬰c đun ch違y và làm ngu瓜i, lắc đĩa theo chi隠u và ng逢嬰c chi隠u kim đồng hồ kho違ng 5-6 l亥n, đặc đĩa lên mặt phẳng ngang và đ嬰i cho đ院n khi môi tr逢運ng trong đĩa đông đặc. L壱t ng逢嬰c đĩa và 栄 trong đi隠u ki羽n nhi羽t đ瓜 và th運i gian xác đ鵜nh.

Cấy mẫu trên bề mặt Đây là ph逢挨ng pháp thay th院 cho ph逢挨ng pháp đổ đĩa đ吋 phân tích các ch雨

tiêu vi sinh trong th詠c ph育m, nh医t là các ch雨 tiêu vi sinh v壱t nh衣y c違m v噂i nhi羽t đ瓜 nh逢 Pseudomonas, các vi sinh v壱t này s胤 b鵜 suy y院u khi ti院p xúc v噂i nhi羽t đ瓜 c栄a môi tr逢運ng agar 荏 tr衣ng thái l臼ng. Ph逢挨ng pháp này cũng đ逢嬰c dùng đ吋 phân tích các ch雨 tiêu mà các dòng nh壱n đ逢嬰c ph違i c医y chuy隠n 荏 các b逢噂c ti院p theo.

C医y 0,1ml hay th吋 tích phù h嬰p lên b隠 mặt bằng pipettes hay bằng que c医y lên đĩa môi tr逢運ng đã đ逢嬰c làm khô và tr違i đ隠u bằng que c医y trang hay que c医y vòng đ吋 trãi m磯u trên khắp b隠 mặt môi tr逢運ng. U các đĩa đã c医y 荏 đi隠u ki羽n nhi羽t đ瓜 và th運i gian xác đ鵜nh tuỳ theo từng ch雨 tiêu phân tích, đ院m các khu育n l衣c đặc tr逢ng hay t医t c違 các khu育n l衣c xu医t hi羽n trên đĩa.

Khi đ院m các khu育n l衣c, trong m瓜t s嘘 tr逢運ng h嬰p xu医t hi羽n các khu育n l衣c mọc lan, thông th逢運ng các khu育n l衣c khác cũng đ逢嬰c nhìn th医y bên trong các v院t khu育n l衣c loang. Khi đ院m ta ch雨 coi khu育n l衣c loang là m瓜t đ挨n v鵜 hình


thành khu育n l衣c và đ院n các khu育n l衣c khác trong khu育n l衣c loang. Các khu育n l衣c loang này là do các vi khu育n t壱p trung thành từng t壱p đoàn trong quá trình phát tri吋n.

Đếm khuẩn lạc trong trường hợp cấy trang hay đổ đĩa

Đ院m t医t c違 các khu磯n l衣c đ挨n lẻ trên các đĩa c医y đã chọn, thông th逢運ng chọn các đĩa có s嘘 l逢嬰ng khu育n l衣c trong kho違ng 30 - 300 khu育n l衣c. Th逢運ng dùng các bút có th吋 vi院t lên thuỷ tinh đ吋 đánh d医u các khu育n l衣c đã đ院m phía sau đĩa petri. Có th吋 dùng các thi院t b鵜 hổ tr嬰 trong quá trình đ院m s嘘 l逢嬰ng khu育n l衣c nh逢 máy đ院m hay kính lúp. Tính toán s嘘 đ挨n v鵜 hính thành khu育n l衣c theo các công th泳c th嘘ng kê d詠a trên th吋 tích m磯u c医y, s嘘 l逢嬰ng khu育n l衣c trên các đĩa, đ瓜 pha loãng đã c医y và s嘘 l逢嬰ng đĩa c栄a m厩i đ瓜 pha loãng. Thông th逢運ng s嘘 đ挨n v鵜 hình thành khu育n l衣c trong m瓜t gram m亥u hay 1ml đ逢嬰c tính toán ít nh医t từ hai n瓜ng đ瓜 pha loãng liên ti院p c栄a m磯u. Các t逢運ng trình k院t qu違 đ逢嬰c bi吋u di宇n d逢噂i d衣ng s嘘 đ挨n v鵜 hình thành khu育n l衣c/g (ml) (cfu/g). Không bi吋u di宇n k院t qu違 d逢噂i d衣ng s嘘 vi khu育n/g(ml).

Phương pháp đểm khuẩn lạc trên ống

Thay vì dùng đĩa petri, có th吋 dùng 嘘ng nghi羽m có đ逢運ng kính l噂n hay các chai nh臼 có nắp đ吋 thay th院. C医y m磯u vào, cho môi tr逢運ng vào, lắc theo chi隠u ngang cho đ院n khi môi tr逢運ng trong chai hay 嘘ng đ嘘ng đặc.

Phân ph嘘i 2-4 ml môi tr逢運ng có hàm l逢嬰ng agar cao h挨n các môi tr逢運ng dùng cho đổ đĩa kho違ng 0,5-1% vào 嘘ng nghi羽m có nắp v噂i th吋 tích 25ml, môi tr逢運ng đã đ逢嬰c làm ngu瓜i đ院n 45oC, c医y vào 嘘ng nghi羽m 0,1ml m磯u đã đ逢嬰c pha loãng. Lắc các 嘘ng theo chi隠u ngang trong n逢噂c l衣nh cho đ院n khi agar đ瓜ng đặc t衣o thành m瓜t màng film đồng nh医t trên thành 嘘ng nghi羽m. Vì th院 kỹ thu壱t này c亥n có nh英ng kỹ năng khéo léo. M瓜t ph逢挨ng pháp khác có th吋 đ逢嬰c dùng là sử d映ng m瓜t m磯u n逢噂c đá, đặt lên trên m瓜t m違nh v違i và làm m瓜t đ逢運ng r違nh bằng v噂i 嘘ng nghi羽m bằng các xoay tròn 嘘ng nghi羽m đặt ngang trên mi院ng băng. Các 嘘ng nghi羽m đã c医y m磯u và môi tr逢運ng đ逢嬰c xoay trên m違nh

Máy đ院m khu育n l衣c Máy đ院m khu育n l衣c

t詠 đ瓜ng


c栄a mi院ng băng. V噂i ph逢挨ng pháp này, các ng逢運i th詠c hi羽n có th吋 ti院t nhi羽n đ逢嬰c nhi隠u th噂i gian và s泳c lao đ瓜ng.

Các 嘘ng sau khi c医y m磯u đ逢嬰c l壱t ng逢嬰c đ吋 tránh s詠 ng逢ng t映 h噂i n逢噂c gây nên v院t loang sau khi 栄. Đ院m các khu育n l衣c xu医t hi羽n trong l噂p màng fiml agar xung quanh 嘘ng, các khu育n l衣c nằng sâu bên trong có th吋 đ逢嬰c quan sát bằng kính lúp.

Ph逢挨ng pháp dùng kỹ thu壱t 嘘ng xoay đ逢嬰c sử d映ng nhi隠u trong vi羽c phân tích các m磯u s英a và các s違n ph育m c栄a s英a, các lo衣i m磯u th詠c ph育m công nghi羽p. Cho đ院n nay đã có nh英ng thi院t b鵜 thay th吋 cho vi羽c xoay 嘘ng, đ違m b違o các màng film trên thành 嘘ng đồng nh医t và ti院t ki羽m đ逢嬰c th運i gian cũng nh逢 công lao đ瓜ng.

Phương pháp cấy theo đường xoắn ốc

Ph逢挨ng pháp này d詠a trên s詠 hổ tr嬰 c栄a m瓜t thi院t b鵜 xoay. Thi院t b鵜 này có th吋 ho壱t đ瓜ng hoàn toàn t詠 đ瓜ng và cũng có th吋 ho衣t đ瓜ng không t詠 đ瓜ng. Thi院t b鵜 này s胤 phân ph嘘i m瓜t l逢嬰ng m磯u xác đ鵜nh lên b隠 mặt đĩa đang xoay tròn. Đi吋m ti院p xúc c栄a m磯u và đĩa môi tr逢運ng bắt đ亥u từ trung tâm đĩa và di chuy吋n d亥n ra bên ngoài theo đ逢運ng xoắn 嘘c. Sau khi làm khô b隠 mặt môi tr逢運ng, đĩa đ逢嬰c 栄 trong đi隠u ki羽n xác đ鵜nh, vi khu育n s胤 phát tri吋n theo đ逢運ng xoắn 嘘c. Càng xa tâm c栄a đĩa, m壱t đ瓜 vi sinh v壱t sẻ gi違m d亥n và s胤 xu医t hi羽n các khu育n l衣c riêng bi羽t.

Căn c泳 vào t嘘c đ瓜 xoay c栄a thi院t b鵜, th吋 tích m磯u phân ph嘘i và kích th逢噂c c栄a đĩa, m壱t đ瓜 khu育n l衣c xu医t hi羽n 荏 vòng xoắn cu嘘i cùng s胤 tính đ逢嬰c m壱t đ瓜 vi sinh v壱t trong m磯u. K院t qu違 tổng s嘘 đ挨n v鵜 hình thành khu育n l衣c đ逢嬰c xác đ鵜nh bằng ph逢挨ng pháp này đ逢嬰c cho là t逢挨ng đ逢挨ng v噂i ph逢挨ng pháp đổ đĩa hay c医y tr違i trên b吋 mặt. Các h羽 th嘘ng t詠 đ瓜ng đ逢嬰c thi院t k院 d詠a trên nguyên tắc c医y xoay đ逢嬰c thi院t k院 v噂i s詠 h厩 tr嬰 c栄a các máy đ院m khu育n l衣c bắn tia laser đã đ逢嬰c bán ngoài th鵜 tr逢運ng r医t thu壱n ti羽n cho vi羽c phân tích tổng s嘘 vi sinh v壱t và cho k院t qu違 chính xác trong th噂i gian nuôi c医y ngắn.

Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc

Ph逢挨ng pháp này th逢運ng đ逢嬰c áp d映ng cho các m磯u l臼ng nh逢 n逢噂c, s英a… và đ逢嬰c đánh giá là cho k院t qu違 chính xác h挨n so v噂i ph逢挨ng pháp 泳挨c đoán MPN. Các m磯u ch医t l臼ng đ逢嬰c lọc qua màng lọc có kích th逢噂c lổ lọc nh臼 h挨n kích th逢噂c c栄a vi sinh v壱t. Vi sinh v壱t đ逢嬰c gi英a l衣i trên màng lọc. Màng đ逢嬰c đặt trên môi tr逢運ng agar hay trên gi医y th医m đ逢嬰c ng医m s栄n môi tr逢運ng nuôi c医y l臼ng đã chọn và 栄 trong đi隠u ki羽n xác đ鵜nh. Sau khi 栄, đ院m các khu育n l衣c s胤 xu医t hi羽n trên b隠 mặt màng lọc.

Thi院t bi lọc có th吋 bằng th栄y tinh, bằng kim lo衣i hay bằng nh詠a, bao gồm ph宇u lọc giá đ荏 màng lọc, b瓜 thi院t b鵜 hổ tr嬰 hút chân không và bình ch泳a. Màng lọc đ逢嬰c làm bằng cellulose ester có l厩 lọc mằm trong kho違ng 0,1-1 µm, các


lo衣i màng lọc dùng cho vi羽c phân tích tổng s嘘 vi sinh v壱t th逢運ng có kích th逢噂c lổ lọc là 0,47µm, đ逢運ng kính màng lọc có nhi隠u kích c荏 khác nhau phù h嬰p v噂i đ逢運ng kính c栄a ph宇u lọc, b隠 dày c栄a màng kho違ng 120µm. Khi lọc t医t c違 các vi khu育n đ隠u đ逢嬰c gi英 l衣i trên màng. Khi đặc màng lọc sao cho b隠 trên c栄a màng h逢噂ng lên phía trên, vi khu育n không ti院p xúc tr詠c ti院p v噂i môi tr逢運ng nh逢ng, các thành ph亥n c栄a môi tr逢運ng d宇 dàng th医m qua màng và nuôi vi khu育n phát tri吋n thành khu育n l衣c. M瓜t s嘘 lo衣i màng lọc có gắn các l逢噂i kỵ n逢噂c ch雨 cho phép khu育n l衣c phát tri吋n trong m厩i ô c栄a l逢噂i và không cho lan sang các ô khác nhằm t衣o đi隠u ki羽n thu壱n ti羽n khi đ院m.

Các b瓜 ph壱n c栄a thi院t b鵜 lọc


3.2.2 Ph逢挨ng pháp 逢噂c đoán s嘘 l逢嬰ng vi sinh bằng kỹ thu壱t MPN (Most Probable Number):

Ph逢挨ng pháp MPN là ph逢挨ng pháp có th吋 thay th院 ph逢挨ng pháp đ院m khu育n l衣c đ吋 xác đ鵜nh m壱t đ瓜 vi sinh v壱t trong m磯u, ph逢挨ng pháp này đ逢嬰c d詠a trên nguyên tắc xác su医t th嘘ng kê s詠 phân phân b嘘 vi sinh v壱t trong các đ瓜 pha loãng khác nhau c栄a m磯u. M厩i đ瓜 pha loãng đ逢嬰c nuôi c医y lặp l衣i nhi隠u l亥n trong các môi tr逢運ng l臼ng đã đ逢嬰c chọn, thông th逢運ng ph違i c医y lặp l衣i từ 3-10 l亥n t衣i m厩i nồng đ瓜 pha loãng. Các đ瓜 pha loãng đ逢嬰c ti院n hành sao cho trong các l亥n lặp l衣i có m瓜t s嘘 l亥n cho d亥u hi羽u d逢挨ng tính và m瓜t s嘘 l亥n cho d医u hi羽u âm tính. S嘘 l亥n lặp l衣i cho d医u hi羽u d逢挨ng tính và âm tính đ逢嬰c ghi nh壱n đ吋 đ嘘i chi院u v噂i b違ng th嘘ng kê s胤 đ逢嬰c giá tr鵜逢噂c đoán s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t trong m磯u. Qui trình MPN cho giá tr鵜 s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t trong m磯u có ý nghĩa th嘘ng kê theo xác su医t phân b嘘 vi sinh v壱t trong m磯u khi sử d映ng m瓜t s嘘 l亥n lặp l衣i, vì th院 kho違ng tin c壱y là r医t l噂n. Ph逢挨ng pháp MPN đ吋 đ鵜nh l逢嬰ng vi sinh v壱t cho đ院n nay đã có nhi隠u c違i ti院n cho phép ti院n hành qui trình d宇 dàng và t嘘n ít s泳c lao đ瓜ng h挨n và cho giá tr鵜 chính xác cao h挨n.

Chọn nồng đ瓜 pha loãng sao cho trong các l亥n lặp l衣i có m瓜t s嘘 l亥n cho k院t qu違 d逢挨ng tính và m瓜t s嘘 l亥n cho k院t qu違 âm tính , s詠 l詠a chọn này r医t quan trọng. Trong nhi隠u tr逢運ng h嬰p qui trình MPN đ逢嬰c thi院t l壱p sao cho gia tăng s嘘 l逢嬰ng l亥n lặp cho k院t qu違 d逢挨ng tính bằng tín hi羽u phát tri吋n c栄a vi sinh v壱t. Trong m瓜t s嘘 tr逢運ng h嬰p khác, qui trình đ逢嬰c thi院t l壱p có nhi隠u thử nghi羽m khẳng đ鵜nh sau khi các l亥n lặp l衣i 荏 các đ瓜 pha loãng cho tín hi羽u phát tri吋n c栄a vi sinh v壱t nh逢 phát hi羽n protein hay m瓜t emzym nào đó. Các thử nghi羽m sau này cho k院t qu違 d逢挨ng tính thì các l亥n lặp l衣i ban đ亥u m噂i đ逢嬰c khẳng đ鵜nh là d逢挨ng tính. Cũng gi嘘ng nh逢 qui trình đ院m khu育n l衣c, qui trình MPN cũng đ逢嬰c sử d映ng các môi tr逢運ng chọn lọc, không chọn lọc hay môi tr逢運ng phân bi羽t.

Ph逢挨ng pháp MPN cũng đ逢嬰c dùng đ吋 đ鵜nh l逢嬰ng virus đ逢運ng ru瓜t. Trong ph逢挨ng pháp này, m瓜t chu厩i pha loãng c栄a m磯u c亥n ki吋m tra đ逢嬰c cho vào trong các 嘘ng nghi羽m ch泳a t院 bào ch栄 thích h嬰p đ逢嬰c nuôi c医y. Sau khi 栄, các 嘘ng nghi羽m đ逢嬰c ki吋m tra hi羽u 泳ng cytopathic (CPE), đó là các bi吋u hi羽n làm ch院t t院 bào b鵜 xâm nhi宇m. S嘘 l逢嬰ng virus trong m磯u cũng nh壱n đ逢嬰c từ b違ng MPN bằng s詠 tham chi院u s嘘 l逢嬰ng các ông nuôi c医y cho hi羽u 泳ng CPE d逢挨ng tính. S嘘 l逢嬰ng c栄a virus cũng có th吋 đ逢嬰c đ鵜nh l逢嬰ng bằng ch雨 s嘘 TCID 50 (Tissue culture infectious dose 50%). Nồng đ瓜 pha loãng th医p nh医t có s詠 hi羽n di羽n c栄a virus đó là n瓜ng đ瓜 có t雨 s嘘 CPE là 50% trong các 嘘ng nghi羽m.

Cũng gi嘘ng nh逢 qui trình đ院m đĩa, trong ph逢挨ng pháp MPN, môi tr逢運ng và nồng đ瓜 nuôi c医y cũng đ逢嬰c đi隠u ch雨nh đ吋 chọn lọc cho m瓜t nhóm vi sinh v壱t hay phân bi羽t các nhóm vi sinh v壱t này v噂i các nhóm vi sinh v壱t khác v噂i các đặc đi吋m mong mu嘘n, r臼 ràng rằng s詠 k院t h嬰p gi英a đi隠u ki羽n nuôi c医y và môi tr逢運ng cũng có th吋 đ鵜nh l逢嬰ng nh英ng nhóm vi sinh v壱t đặc bi羽t nào đó


theo đ鵜nh nghĩa c映 th吋. M厩i qui trình ph違i đ逢嬰c chọn lọc m瓜t cách c映 th吋 và c育n th壱n đ吋 có th吋 thu đ逢嬰c k院t qu違 m瓜t cách chính xác.

Theo quan đi吋m c栄a C.H. Collins và Patricia M. Lyne th詠c ch医t con s嘘 MPN bi吋u di吋n s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t trong m磯u là s嘘 l逢嬰ng trung bình sau các l亥n lặp l衣i. N院u s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t trong m磯u l噂n thì s詠 khác bi羽t c栄a các m磯u gi英a các l亥n lặp l衣i là nh臼, k院t qu違 riêng lẻ c栄a t医t c違 các l亥n lặp g亥n v噂i k院t qu違 trung bình. N隠u s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t trong m磯u nh臼, s詠 khác bi羽t này s胤 l噂n. N隠u trong m瓜t m磯u ch医t l臼ng ch泳a 100 vi sinh v壱t/100 ml, thì trong 10 ml m磯u s胤 ch泳a trung bình 10 t院 bào. Dĩ nhiên có m瓜t s嘘 ph亥n m磯u nhi隠u h挨n 10 t院 bào, th壱m chí có nh英ng ph亥n m磯u có th吋 ch泳a 20 t院 bào trong 10ml m磯u và m瓜t s嘘 ph亥n m磯u ch泳a ít h挨n. N院u t医t c違 các ph亥n m磯u trên đ逢嬰c nuôi c医y trong môi tr逢運ng và đi隠u ki羽n thích h嬰p, các vi sinh v壱t trong m磯u s胤 phát tri吋n và cho tín hi羽u d逢挨ng tính.

T逢挨ng t詠 nh逢 v壱y, 1ml s胤 ch泳a trung bình 1 t院 bào vi sinh v壱t, nh逢 v壱y có nh英ng l亥n l医y s胤 có 2 hay 3 t院 bào và có nh英ng l亥n l医y s胤 không có t院 bào nào. N院u các l亥n hút này đ逢嬰c nuôi c医y trong môi tr逢運ng và đi隠u ki羽n thích h嬰p s胤 thu đ逢嬰c nh英ng 嘘ng nghi羽m cho k院t qu違 d逢挨ng tính và nh英ng 嘘ng cho k院t qu違 âm tính.

N院u hút 0,1ml thì sau 10 l亥n hút m噂i có kh違 năng nh壱n đ逢嬰c 1 l亥n hút có 1 t院 bào, nh逢 v壱y h亥u h院t các l亥n nuôi c医y khi l医y 0,1ml thì đ隠u cho k院t qu違 âm tính.

Có th吋 tính toán con s嘘 chắc chắn s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t trong trong 100ml m磯u bằng s詠 k院t h嬰p các k院t qu違 nh壱n đ逢嬰c từ các chu厩i c医y nh逢 trên. B違ng giá tr鵜 MPN khi sử d映ng h羽 th嘘ng c医y v噂i các dãy 5 嘘ng 10ml, 5 嘘ng 1ml và 5 嘘ng 0.1ml đã đ逢嬰c tính sẵn và dùng cho phân tích các m磯u n逢噂c hay các m磯u đã pha loãng. Cho đ院n nay có r医t nhi隠u b違ng giá tr鵜 MPN đ逢嬰c sử d映ng v噂i đ瓜 chính xác và các kho違ng tin c壱y khác nhau và đ逢嬰c sử d映ng cho các m映c đích khác nhau.

Ph逢挨ng pháp MPN đ逢嬰c dùng ch栄 y院u đ吋 phân tích Coliforms và các vi sinh v壱t khác khi chúng phát tri吋n trong môi tr逢運ng nuôi c医y l臼ng cho các tín hi羽u d宇 dàng nh壱n d衣ng nh逢 sinh h挨i, làm đ映c môi tr逢運ng chọn lọc, thay đổi pH môi tr逢運ng … Ví d映 n医m men và n医m m嘘c trong n逢噂c trái cây hay rau qu違, vi sinh v壱t kỵ khí hay các bào tử Clostridia.

3.2.3 Ph逢挨ng pháp lai khu育n l衣c

Lai khu育n l衣c là ph逢挨ng pháp k院t h嬰p gi英a ph逢挨ng pháp lai phân tử và ph逢挨ng pháp nuôi c医y truy隠n th嘘ng trong vi羽c phân tích các ch雨 tiêu vi sinh v壱t trong các m磯u. Sau th運i gian nuôi c医y trên b隠 mặt môi tr逢運ng th衣ch, các khu育n l衣c vi khu育n đ逢嬰c chuy吋n lên màng lai, các khu育n l衣c này đ逢嬰c ly gi違i trong môi tr逢運ng ki隠m hay xử lý bằng emzym, sau đó ti院n hành lai phân tử. Ph逢挨ng


pháp này ph映 thu瓜c vào kh違 năng phát tri吋n c栄a vi sinh v壱t m映c tiêu trên môi tr逢運ng, chúng không ph映 thu瓜c s詠 phát tri吋n các các qu亥n th吋 vi sinh v壱t khác. S詠 phát tri吋n c栄a vi sinh v壱t m映c tiêu trong môi tr逢運ng làm gia tăng s嘘 l逢嬰ng b違n sao c栄a các gen m映c tiêu, vì th院 chúng s胤 gia tăng kh違 năng phát hi羽n c栄a các m磯u dò.

Nguyên tắc c栄a ph逢挨ng pháp này đ逢嬰c phát tri吋n đ亥u tiên b荏i M. Grunstein và S.D. Hogness (1975) nhằm m映c đích sàng lọc trên đĩa có m壱t đ瓜 cao cho các dòng nuôi c医y thu亥n. Trong qui trình nuôi c医y khu育n l衣c vi khu育n phát tri吋n trên môi tr逢運ng rắn đ逢嬰c chuy吋n lên m瓜t giá đ荏 phù h嬰p nh逢 màng nitrocellulose, ly gi違i đ吋 tách DNA và bi院n tính chúng sau đó c嘘 đ鵜nh chúng trên màng. Màng lọc c嘘 đ鵜nh DNA đ逢嬰c 栄 v噂i m磯u dò. M磯u dò đ逢嬰c tách ra từ m瓜t đo衣n thông tin di truy隠n. Và đ逢嬰c đánh d医u bằng các các đ嘘ng v鵜 phóng x衣 nh逢 32P hay các ch医t phát quang khác nh逢 biotin. Hi羽n t逢嬰ng lai đ逢嬰c din ra n院u các trình t詠 base c栄a các t院 bào đ逢嬰c ly gi違i t逢挨ng đồng v噂i các trình t詠 trên m磯u dò đ吋 hình thành các đo衣n lai m衣ch đôi. Các đo衣n lai này đ逢嬰c phát hi羽n bằng bằng các film phóng x衣 t詠 ghi khi các m磯u dò đ逢嬰c đánh d亥u bằng các đồng v鵜 phóng x衣, hay các film nh衣y sáng khi các m磯u dò đ逢嬰c đánh d医u bằng biotin. Bằng ph逢挨ng pháp này, các đặc đi吋m di truy隠n đặc tr逢ng đ逢嬰c phát hi羽n m瓜t cách chuyên bi羽t. N院u chọn m磯u dò đặc tr逢ng cho m瓜t nhóm vi sinh v壱t, ph逢挨ng pháp này có th吋 phát hi羽n và đ鵜nh l逢嬰ng nhóm vi sinh v壱t đó trong m磯u.

M磯u dò đ逢嬰c lai v噂i các vi sinh v壱t có nguồn g嘘c từ m磯u, hay các dòng thu亥n đ逢嬰c phân l壱p và nuôi c医y th泳 c医p. Bằng ph逢挨ng pháp này có th吋 c違i thi羽n đ逢嬰c các b医t ti羽n trong quá trình phân tích bằng ph逢挨ng pháp nuôi c医y thu亥n tuý nh逢:

- Tránh đ逢嬰c nh英ng sai l羽ch trong quá trình đ院m khu育n l衣c trên môi tr逢運ng nuôi c医y chọn lọc.

- Chắc chắn phát hi羽n đ逢嬰c các dòng mang ki吋u gen m映c tiêu c亥n phát hi羽n dù các gen đó không hay bi吋u hi羽n r医t kém trong m瓜t s嘘 đi隠u ki羽n nuôi c医y.

- Có th吋 phân tích đ逢嬰c các vi sinh v壱t b鵜 tress hay không th吋 nuôi c医y đ逢嬰c trên các môi tr逢運ng chọn lọc bằng cách thay th院 bằng môi tr逢運ng không chọn lọc hay môi tr逢運ng dinh d逢叡ng t嘘i đa.

- Gi違m đ逢嬰c th運i gian phân tích bằng cách gi違m th運i gian nuôi c医y, quá trình đ鵜nh l逢嬰ng gi違 đ鵜nh và th運i gian khằng đ鵜nh ki吋u gen hay ki吋u hình.

Ph逢挨ng pháp lai khu育n l衣c cũng đ逢嬰c sử d映ng đ吋 khẳng đ鵜nh các dòng vi sinh v壱t nghi ng運 đã đ逢嬰c làm thu亥n.

永ng d映ng ch栄 yêu c栄a ph逢挨ng pháp lai khu育n l衣c là phát hi羽n, đ鵜nh l逢嬰ng và phân l壱p các vi sinh v壱t có ki吋u hình và ki吋u gen đặc tr逢ng. Và đ逢嬰c sử d映ng đặc bi羽t trong vi羽c ki吋m soát s詠 hi羽n di羽n và ho衣t đ瓜ng c栄a các dòng vi sinh v壱t


trong môi tr逢運ng. Nghiên c泳u s詠 phân b嘘 các vi sinh v壱t kháng kháng sinh, kháng kim lo衣i nặng trong n逢噂c trong các m磯u môi tr逢運ng và trong th詠c ph育m.

3.3 Ph逢挨ng pháp đo đ瓜 đ映c

Là ph逢挨ng pháp gián ti院p xác đ鵜nh m壱t đ瓜 vi sinh v壱t. Đ鵜nh l逢嬰ng m壱t đ瓜 t院 bào thông qua đo đ瓜 đ映c bằng máy so màu 荏 các b逢噂c sóng từ 550 – 610 nm.

Ph逢挨ng pháp xác đ鵜nh m壱t đ瓜 t院 bào theo đ瓜 đ映c có th吋 đ逢嬰c dùng đ吋 so sánh m泳c đ瓜 tăng tr逢荏ng c栄a hai hay nhi隠u ch栄ng vi sinh v壱t trong môi tr逢運ng l臼ng. ph逢挨ng pháp này cho k院t qu違 nhanh chóng và th逢運ng đ逢嬰c 泳ng d映ng trong theo dõi hoặc nghiên c泳u đặc tr逢ng tăng tr逢荏ng c栄a các ch栄ng vi sinh v壱t trong phòng thí nghi羽m hoặc trong s違n xu医t tuy nhiên không thích h嬰p dùng trong ki吋m nghi羽m vi sinh v壱t.

N

A (CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó:

n1Vf1 + …+ niVfi

A: s嘘 t院 bào vi khu育n trong 1g hay 1ml m磯u

N: tổng s嘘 khu育n l衣c đ院m đ逢嬰c trên các đĩa đã chọn

ni: s嘘 l逢嬰ng đĩa c医y t衣i đ瓜 pha loãng th泳 i

V: th吋 tích d鵜ch m磯u (ml) c医y vào trong m厩i đĩa

fi: đ瓜 pha loãng t逢挨ng 泳ng


IV. ÁP D影NG Đ渦I V閏I M浦T S渦 VI SINH V一T GÂY B烏NH TRONG TH衛C PH域M

4.1 Đ鵜nh l逢嬰ng Fecal Coliform và E. Coli bằng ph逢挨ng pháp đ院m đĩa

Coliforms ch鵜u nhi羽t: là nh英ng vi khu育n sinh tr逢荏ng cho khu育n l衣c đi吋n hình trên môi tr逢運ng th衣ch Violet Red Bile 荏 440C trong 24 gi運. Trong tr逢運ng h嬰p nghi ng運, vi khu育n đ逢嬰c khẳng đ鵜nh b荏i s詠 t衣o khí trong môi tr逢運ng EC broth 荏 44 0C trong 24 gi運.

E. coli: là Coliforms ch鵜u nhi羽t có kh違 năng sinh indol 荏 44 0C.

Nguyên tắc:

C医y m瓜t l逢嬰ng m磯u đã bi院t trên môi tr逢運ng rắn không chọn lọc. Sau đó , 栄 s挨 b瓜荏 nhi羽t đ瓜 phòng (20-250C) trong 1-2 gi運, ph栄 lên m瓜t l噂p môi tr逢運ng rắn chọn lọc có ch泳a Lactose. Các đĩa đ逢嬰c 栄荏 440C trong 24h, sau đó đ院m nh英ng khu育n l衣c đi吋n hình và nghi ng運 c医y nh英ng khu育n l衣c đã chọn lên nh英ng môi tr逢運ng khẳng đ鵜nh thích h嬰p.

Môi tr逢ờng-thu嘘c thử -d鵜ch pha loãng:

- Dung d鵜ch Saline Peptone

- Th衣ch Tryptone Soya ( TSA )

- Th衣ch Violet Red Bile ( VRB )

- Canh Escherichia coli (EC broth)

- Canh Tryptone

- Thu嘘c thử Kovac’s

Chủng chứng:

- Ch栄ng ch泳ng d逢挨ng: Escherichia coli

- Ch栄ng ch泳ng âm: Salmonella typhimurium

Thi院t b鵜 chính:

- T栄医m 44.0 + 0.50C

Quy trình:

Chuẩn bị mẫu.

Đổ đĩa: C医y 1ml m磯u 荏 nồng đ瓜 thích h嬰p vào đĩa Petri . Thêm vào 5ml môi tr逢運ng TSA đã đ逢嬰c làm ngu瓜i 荏 45.00+1.00C. Tr瓜n đ隠u d鵜ch nuôi c医y và môi tr逢運ng. 曳 s挨 b瓜 các đĩa 荏 nhi羽t đ瓜 phòng (20 - 25 0C) trong 1-2 gi運. Đổ thêm 10-15ml VRB agar đã đ逢嬰c làm ngu瓜i 荏 45.00 +1.00C . Tỷ l羽 môi tr逢運ng gi英a hai l亥n đổ ít nh医t là 1:2.

Nuôi ủ: Các đĩa đ逢嬰c l壱t ng逢嬰c lên và 栄荏 44.0 + 0.50C trong 24 ±3 h.


Đọc kết quả: Chọn các đĩa có s嘘 khu育n l衣c đi吋n hình và không quá 100 đ吋 đ院m. Khu育n l衣c coliform ch鵜u nhi羽t đi吋n hình có màu đ臼 s壱m, đ逢運ng kính ít nh医t là 0,5mm, xung quanh khu育n l衣c có vùng k院t t栄a đ臼.

Khẳng đ鵜nh:

Coliform chịu nhiệt : Chọn 5 khu育n l衣c nghi ng運 c栄a m厩i lo衣i, c医y vào môi tr逢運ng canh EC, 栄荏 44.0 + 0.50C trong 24±3 h. Ph違n 泳ng đ逢嬰c xem là d逢挨ng tính khi trong 嘘ng Durham có khí.

E. coli:Test d逢挨ng tính c栄a Coliform ch鵜u nhi羽t đ逢嬰c th詠c hi羽n thêm v隠 kh違 năng t衣o indol trong môi tr逢運ng canh tryptone bằng cách thêm 0.3- 0.5 ml thu嘘c thử Kovac's tr詠c ti院p vào trong môi tr逢運ng Tryptone đã đ逢嬰c 栄荏 44.0 + 0.5 0C trong 24±3 h. Ph違n 泳ng đ逢嬰c xem d逢挨ng tính khi có màu đ臼 xu医t hi羽n trên b隠 mặt. Màu vàng hay màu cam xu医t hi羽n trong 10 phút đ逢嬰c xem là âm tính. E.coli gi違 đ鵜nh cho ph違n 泳ng indol d逢挨ng tính.

Báo cáo k院t qu違: Đ院m k院t qu違 bằng cách nhân s嘘 khu育n l衣c đã đ院m v噂i nồng đ瓜 pha loãng và tỷ l羽 khẳng đ鵜nh d逢挨ng tính.

Các chú ý và gi噂i h衣n của ph逢挨ng pháp

Thu嘘c thử Kovacs’ là m嘘i nguy cho s泳c kh臼e, vì v壱y c亥n sử d映ng các bi羽n pháp ch嘘ng đ瓜c nh逢 đeo kh育u trang và pha thu嘘c thử trong t栄 h嘘t.

Không đ逢嬰c thanh trùng môi tr逢運ng VRB và đun quá nhi羽t. Rót môi tr逢運ng E.C vào các 嘘ng nghi羽m có 嘘ng Durrham đ違o ng逢嬰c. Các

嘘ng này s胤 chìm xu嘘ng sau khi h医p thanh trùng.

Tỷ l羽 đ瓜 dày gi英a l噂p trên và l噂p d逢噂i c栄a môi tr逢運ng VRB nên là 2:1.

4.2 Đ鵜nh l逢嬰ng Vibrio Parahaemolyticus

Nguyên tắc: C医y l逢嬰ng m磯u đã bi院t vào môi tr逢運ng th衣ch chọn lọc (TCBS). Nh英ng khu育n l衣c V.parahaemolyticus đi吋n hình s胤 đ逢嬰c thử nghi羽m sinh hoá.

Môi tr逢ờng và thu嘘c thử:

- Th衣ch TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose); Th衣ch Motility medium; Th衣ch OF

- Canh tryptone có nồng đ瓜 NaCl 0%, 6%, 8%, 7%

- Đĩa ONPG

- Đĩa O/129 Vibriostaticum ch泳a 150μg 2,4- diamino- 6,7- diisopropylpteridine

- Canh Lysine decacboxylase

- Dung d鵜ch các lo衣i đ逢運ng sucrose, lactose, cellobiose

- Canh Ure

- Thu嘘c thử N,N,N’,N’-tetramethyl-1,4 phenylenediamine (TMPD)


Thi院t b鵜 chính: T栄医m 37,0 ± 1,0 0C

Quy trình:

Chuẩn bị mẫu.

Cấy mẫu: C医y trang 1 ml d鵜ch m磯u 荏 nồng đ瓜 thích h嬰p bằng que c医y tam giác lên 03 đĩa môi tr逢運ng th衣ch TCBS.

Nuôi ủ: 曳 các đĩa 荏 37,0 ± 1,00C trong 2 ngày, đọc k院t qu違 sau 1 và 2 ngày.

Đọc kết quả:Trên môi tr逢運ng th衣ch TCBS khu育n l衣c V. parahaemolyticus tròn, có màu xanh, đ逢運ng kính 3 – 5mm.

Thử nghiệm sinh hoá: Từ các khu育n l衣c nghi ng運 trên TCBS c医y chuy吋n sang môi tr逢運ng TSA có bổ sung thêm 1% NaCl, 栄荏 37,0 ± 1,0 0C / 1 ngày.

Thử nghi羽m s挨 b瓜: Thử nghi羽m sinh hoá K院t qu違

Di đ瓜ng +

OF lên men, sinh khí

Oxidase +

KOH +

Ghi chú: A: Axit, K: Ki隠m.

Test khẳng đ鵜nh:

Thử nghi羽m sinh hoá K院t qu違 Phát tri吋n 荏 các nồng đ瓜

mu嘘i:

0%NaCl -

6%NaCl +

8%NaCl +

10%NaCl -

Sinh acid từ:

Succrose |%NaCl -

Mannitol +

Cellobiose -

ONPG -

ADH -

LDC +

Ure -

O/129 10 μg R(không nh衣y)

O/129 150 μg S(nh衣y)


4.3 Đ鵜nh l逢嬰ng Coliforms, Coliforms ch鵜u nhi羽t, E. Coli gi違 đ鵜nh (Fecal Coliforms) bằng ph逢挨ng pháp MPN

Trong ph逢挨ng pháp này:

Coliforms là nh英ng vi sinh v壱t sinh h挨i trong môi tr逢運ng canh Lauryl sulphate và canh Brilliant green lactose bile salt nuôi 栄荏 37.0oC ± 1.00C/ 2 ngày.

Coliforms ch鵜u nhi羽t là nh英ng vi sinh v壱t sinh h挨i trong môi tr逢運ng canh EC nuôi 栄荏 44.5oC ± 0.2 0C/1 ngày.

E. coli gi違 đ鵜nh (Coliforms phân) là Coliforms ch鵜u nhi羽t sinh indole trong canh trypton nuôi 栄荏 44.5oC ± 0.2 0C/ 1 ngày

Nguyên tắc:

S嘘 l逢嬰ng Coliforms, Coliforms ch鵜u nhi羽t, E.coli gi違 đ鵜nh (Coliforms phân) và E.coli đ逢嬰c xác đ鵜nh bằng ph逢挨ng pháp MPN, ph逢挨ng pháp này d詠a vào nguyên tắc m磯u đ逢嬰c pha loãng thành m瓜t dãy th壱p phân (hai nồng đ瓜 k院 ti院p chênh nhau 10 l亥n) và đ逢a vào các 嘘ng nghi羽m có ch泳a môi tr逢運ng thích h嬰p, 栄 và đọc s嘘嘘ng cho k院t qu違 d逢挨ng tính. S嘘嘘ng nghi羽m cho ph違n 泳ng d逢挨ng tính c栄a các nồng đ瓜 pha loãng đ逢嬰c tra theo b違ng MPN đ吋 xác đ鵜nh tổng s嘘 vi khu育n trong 1 g (hoặc 1 ml) m磯u.

Môi tr逢ờng và thu嘘c thử:

- Canh Lauryl sulphate (Sodium dodecyl sulphate - LSB)

- Canh Brilliant green lactose bile salt (BGBL)

- Canh EC (E.coli medium)

- Canh Tryptone

- Thu嘘c thử Kovac’s

Thi院t b鵜: - B吋 đi隠u nhi羽t 44.5oC ± 0.2 0C

- T栄医m 37.0oC + 1.00C

Ti院n hành:

- Coliforms:

C医y 1 ml d鵜ch m磯u đã pha loãng 1:9 vào dãy 5 嘘ng nghi羽m, m厩i 嘘ng ch泳a 10 ml canh Lauryl sulphate. Th詠c hi羽n t逢挨ng t詠 v噂i d鵜ch m磯u đã pha loãng 1:10 và 1:100. N院u nghi ng運 l逢嬰ng vi sinh v壱t trong m磯u quá cao, ph違i tăng đ瓜 pha loãng m磯u. 曳荏 37.0oC + 1.00C/2 ngày. Ghi nh壱n s嘘嘘ng có sinh h挨i sau 栄 1 ngày và 2 ngày.

Dùng khuyên c医y c医y chuy吋n d鵜ch m磯u từ các 嘘ng LSB d逢挨ng tính (嘘ng sinh h挨i) sang các 嘘ng có ch泳a canh Brilliant green lactose bile salt. 曳荏 37.0oC ± 1.00C/2 ngày. Đọc s嘘 l逢嬰ng các 嘘ng cho k院t qu違 d逢挨ng tính(嘘ng sinh h挨i). S嘘嘘ng nghi羽m cho ph違n 泳ng d逢挨ng tính c栄a các nồng đ瓜 pha loãng đ逢嬰c tra theo b違ng MPN đ吋 xác đ鵜nh tổng s嘘 Coliforms trong 1 g (hoặc 1 ml) m磯u.


- Coliforms chịu nhiệt: Dùng khuyên c医y c医y chuy吋n d鵜ch m磯u từ các 嘘ng canh Lauryl sulphate

có sinh h挨i sang môi tr逢運ng canh EC, 栄荏 44.5oC ± 0.2 0C/1 ngày. Đọc s嘘 l逢嬰ng các 嘘ng cho k院t qu違 d逢挨ng tính(嘘ng sinh h挨i). S嘘嘘ng nghi羽m cho ph違n 泳ng d逢挨ng tính c栄a các nồng đ瓜 pha loãng đ逢嬰c tra theo b違ng MPN đ吋 xác đ鵜nh tổng s嘘 Coliforms chịu nhiệt trong 1 g (hoặc 1 ml) s違n ph育m.

- Coliforms phân:

Dùng khuyên c医y c医y chuy吋n d鵜ch m磯u từ các 嘘ng có sinh h挨i trên môi tr逢運ng canh EC sang môi tr逢運ng canh Trypton, 栄荏 44.5oC ± 0.2oC/1ngày. Nh臼 thu嘘c thử Kovac’s vào các 嘘ng nghi羽m Trypton đã 栄. Ph違n 泳ng d逢挨ng tính khi có màu đ臼 xu医t hi羽n trong môi tr逢運ng trong vòng vài phút. Đọc s嘘 l逢嬰ng các 嘘ng cho k院t qu違 d逢挨ng tính. S嘘嘘ng nghi羽m cho ph違n 泳ng d逢挨ng tính c栄a các nồng đ瓜 pha loãng đ逢嬰c tra theo b違ng MPN đ吋 xác đ鵜nh tổng s嘘 Coliforms phân trong 1g (hoặc 1ml) m磯u.

Các chú ý và gi噂i h衣n của ph逢挨ng pháp:

Ph逢挨ng pháp MPN thông qua ph違n 泳ng lên men lactose không đ鵜nh l逢嬰ng đ逢嬰c vi sinh v壱t thu亥n ch栄ng. K院t qu違 sai có th吋 x違y ra do s詠 có mặt c栄a các vi sinh v壱t lên men lactose khác. Không nên c医y chuy吋n các bọt bóng có sau quá trình đồng nh医t m磯u vào môi tr逢運ng nuôi c医y.

Sau khi chuy吋n d鵜ch pha loãng m磯u vào 嘘ng Lauryl tryptose nên xoay từ từ 嘘ng nghi羽m đ吋 d鵜ch dính 荏 thành 嘘ng đi xu嘘ng.

Có th吋 có k院t qu違 âm tính gi違 do s詠 có mặt c栄a các Coliforms không lên men lactose.

Nhi羽t đ瓜 b吋 đi隠u nhi羽t c亥n đ逢嬰c duy trì 荏 44.50C và m詠c n逢噂c ph違i trên m詠c dung d鵜ch trong các 嘘ng nghi羽m. Nhi羽t đ瓜栄医m r医t quan trọng, s詠 thay đổi chút ít có th吋 làm thay đổi lo衣i và s嘘 l逢嬰ng vi sinh v壱t phát tri吋n trong môi tr逢運ng thử nghi羽m.

Các ch栄ng lo衣i chu育n E. coli và Enterobacter aerogenes c医y song song v噂i phép thử s胤 ch雨 ra s詠 sai l羽ch c栄a nhi羽t đ瓜 b吋 đi隠u nhi羽t. Nhi羽t đ瓜 cao s胤 d磯n đ院n s詠 lên men c栄a E.coli sai. S詠 lên men lactose c栄a E. aerogenes ch雨 ra nhi羽t đ瓜栄 th医p h挨n 44.50C.

Đ鵜nh l逢嬰ng E.coli bằng Lauryl tryptose broth có th吋 xu医t hi羽n âm tính gi違 do E.coli b鵜 tổn th逢挨ng trong quá trình ch院 bi院n th詠c ph育m.

Nên sử d映ng ch栄ng ch泳ng và ki吋m soát môi tr逢運ng trong su嘘t quá trình thử nghi羽m.


4.4 Đ鵜nh l逢嬰ng Enterococci đ逢ờng ru瓜t trong n逢噂c bằng ph逢挨ng pháp màng lọc

Enterococci đ逢運ng ru瓜t là các vi khu育n có kh違 năng phân gi違i 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride t衣o thành formazan và thuỷ phân aesculin 荏 440 C trên môi tr逢運ng quy đ鵜nh t衣i ph逢挨ng pháp này.

Lọc, nuôi cấy và đ院m:

Đ院m Enterococci đ逢運ng ru瓜t d詠a trên vi羽c lọc m瓜t th吋 tích xác đ鵜nh c栄a m磯u nu噂c qua m瓜t màng lọc có kích th逢噂c l厩 thích h嬰p (0,45 μm) đ吋 gi英 l衣i các vi khu育n. Màng lọc đ逢嬰c đặt vào trong môi tr逢運ng th衣ch chọn lọc ch泳a natri azide (đ吋 ngăn chặn s詠 sinh tr逢荏ng và phát tri吋n c栄a các vi khu育n gram âm) và 2,3,5-triphenyltetrazolium chlorua (m瓜t ch医t nhu瓜m không màu). Enterococci đ逢運ng ru瓜t s胤 khử thu嘘c nhu瓜m không màu thành focmazan đ臼.

Sau khi nuôi c医y 荏 36.0 ± 2.00C/ 44 ± 4 h, đ院m t医t c違 các khu育n l衣c mọc màu đ臼, màu h衣t dẻ hoặc màu hồng.

Khẳng đ鵜nh:

Chuy吋n màng lọc có các khu育n l衣c vào môi tr逢運ng bile-aesculin-azide agar, 栄荏 44.0 ± 0,50C. Enterococci đ逢運ng ru瓜t thuỷ phân aesculin trong môi tr逢運ng trong 2 gi運, s違n ph育m cu嘘i cùng là 6,7 - dihidroxycoumarin s胤 k院t h嬰p v噂i ion sắt (III) cho h嬰p ch医t màu nâu vàng đ院n đen và khu院ch tán vào môi tr逢運ng.

Môi tr逢ờng nuôi cấy:

- Môi tr逢運ng Slanetz and Bartley

- Th衣ch m壱t aesculin - azide

Thi院t b鵜: - Thi院t b鵜 màng lọc

- Màng lọc vô trùng v噂i kích th逢噂c l厩 0,45μm.

- T栄医m 36.0 ± 2.00C

- T栄医m 44.0 ± 0.50C

Quy trình ti院n hành:

Chuẩn bị: Chu育n b鵜 m磯u, thi院t b鵜 lọc vô trùng và môi tr逢運ng nuôi c医y. M磯u nên đ逢嬰c

phân tích ngay sau khi l医y. N院u m磯u b違o qu違n 荏 nhi羽t đ瓜 phòng (250C) thì không đ逢嬰c b違o qu違n quá 6 gi運, n院u m磯u b違o qu違n 荏 nhi羽t đ瓜 5 ± 30C thì không đ逢嬰c quá 24 gi運 tr逢噂c khi phân tích.

Lọc và nuôi ủ Lọc m瓜t th吋 tích n逢噂c thích h嬰p.

Đi隠u ch雨nh các d鵜ch pha loãng sao cho các khu育n l衣c có th吋 mọc tách bi羽t ra và d宇 dàng đ院m đ逢嬰c.


Sau khi lọc, tháo màng bằng kẹp đã khử trùng và đặt màng lọc lên mặt th衣ch Slanetz and Bartley. Nuôi các đĩa 荏 36.0 ± 2.00C trong 44 gi運 ± 4 gi運.

Khẳng định và đếm :

Sau khi nuôi, đ院m t医t c違 các khu育n l衣c có màu nâu đ臼 hoặc màu hồng từ trung tâm hoặc toàn b瓜 khu育n l衣c.

N院u trên màng có các khu育n l衣c đặc tr逢ng, chuy吋n màng lọc sang môi tr逢運ng bile –aesculin-azide agar đã đ逢嬰c 栄医m đ院n 440 C (không l壱t ng逢嬰c màng), 栄荏 44.00 C ± 0.50C trong 2 gi運.

Đọc k院t qu違 ngay. T医t c違 các đĩa cho khu育n l衣c có màu từ nâu đ院n đen, hoặc môi tr逢運ng bao quanh có màu nâu hay đen đ逢嬰c coi là ph違n 泳ng d逢挨ng tính.

Báo cáo k院t qu違: K院t qu違 bi吋u th鵜 bằng s嘘 vi khu育n Enterococci đ逢運ng ru瓜t trong m瓜t đ挨n

v鵜 th吋 tích m磯u và đ逢嬰c tính theo h逢噂ng d磯n trong ISO 8199.

Các chú ý và gi噂i h衣n của ph逢挨ng pháp

Bile-aesculin-azide-agar có ch泳a Natri azide. Do Natri azide có đ瓜c tính cao nên chú ý khi th詠c hi羽n c亥n tránh ti院p xúc tr詠c ti院p v噂i hoá ch医t đó, đặc bi羽t không đ逢嬰c hít các h衣t b映i c栄a môi tr逢運ng trong quá trình pha ch院 môi tr逢運ng tổng h嬰p. Môi tr逢運ng có ch泳a azide không nên pha v噂i các axit vô c挨 m衣nh b荏i vì nó có th吋 t衣o ra ch医t đ瓜c HN3. Dung d鵜ch ch泳a azide cũng có th吋 hình thành nnên h嬰p ch医t gây nổ khi ti院p xúc v噂i các 嘘ng d磯n bằng kim lo衣i.

Màng lọc đ逢嬰c làm từ cellulose và có đ逢運ng kính mắt l逢噂i kho違ng 47-50mm.

Màng lọc ph違i đ違m b違o không có tính ch医t 泳c ch院 hoặc kích thích s詠 phát tri吋n c栄a vi khu育n, m詠c in sử d映ng đ吋 in các mắt l逢噂i trên màng lọc cũng không đ逢嬰c 違nh h逢荏ng đ院n s詠 phát tri吋n c栄a vi khu育n. N院u ch逢a vô trùng thì chúng c亥n ph違i đ逢嬰c khử trùng theo h逢噂ng d磯n c栄a nhà s違n xu医t. Vi羽c sử d映ng màng lọc c栄a các hãng khác nhau có th吋 d磯n đ院n vi羽c hình thành màu sắc khác nhau c栄a vi khu育n trên màng.

4.5 Đ鵜nh l逢嬰ng Clostridium khử sunfite trong n逢噂c bằng ph逢挨ng pháp tăng sinh trong môi tr逢ờng cấy l臼ng

Gi嘘ng Clostridium thu瓜c họ Bacillaceace bao gồm các đặc đi吋m nh逢 sau: sinh bào tử, ph亥n l噂n di đ瓜ng, gram d逢挨ng, hình que, k鵜 khí. Hi羽n di羽n trong phân c栄a đ瓜ng v壱t và ng逢運i, trong n逢噂c th違i và trong đ医t. Các bào tử c栄a vi sinh v壱t này s嘘ng sót trong n逢噂c r医t lâu vì chúng b隠n v英ng h挨n các d衣ng t院 bào sinh d逢叡ng đ嘘i v噂i các tác đ瓜ng c栄a các y院u t嘘 v壱t lý và hóa học. Vì v壱y chúng có th吋 làm ch雨 th鵜 v隠 s詠 ô nhi宇m n逢噂c. Chúng th壱m chí b隠n v噂i c違 chlorin 荏 m泳c th逢運ng v磯n đ逢嬰c sử d映ng đ吋 xử lý n逢噂c.


Nguyên tắc: S嘘 l逢嬰ng vi khu育n Clostridium đ逢嬰c xác đ鵜nh trong m瓜t th吋 tích n逢噂c xác đ鵜nh theo các b逢噂c tăng sinh trong môi tr逢運ng c医y l臼ng, nuôi trong đi隠u ki羽n k鵜 khí.

Môi tr逢ờng:

- Môi tr逢運ng phân l壱p: DRCM nồng đ瓜 kép và nồng đ瓜 đ挨n.

- Dung d鵜ch pha loãng- n逢噂c mu嘘i pepton (saline pepton)

D映ng c映 và thi院t b鵜: - Máy d壱p m磯u.

- B吋 đi隠u nhi羽t 75±50C.

- T栄医m 37±1.00C.

- Bình k鵜 khí v噂i thi院t b鵜 t衣o đi隠u ki羽n k鵜 khí.

Ti院n hành thử nghi羽m:

Xử lý mẫu: M磯u đ逢嬰c xử lý nhi羽t bằng cách đun nóng trong b吋 đi隠u nhi羽t 荏 75oC + 5 trong 15-20 phút k吋 từ lúc đ衣t nhi羽t đ瓜 trên, đ吋 gi違m b噂t th吋 dinh d逢叡ng c栄a vi khu育n.

Cấy mẫu và nuôi ấm: C医y 50ml m磯u n逢噂c ban đ亥u vào 50ml canh DRCM nồng đ瓜 kép. C医y 10ml m磯u n逢噂c ban đ亥u vào 5 嘘ng nghi羽m, m厩i 嘘ng ch泳a 10 ml canh DRCM đặc. C医y 1ml m磯u n逢噂c ban đ亥u vào 5 嘘ng nghi羽m, m厩i 嘘ng ch泳a 25 ml canh DRCM đ挨n. N院u nghi ng運 l逢嬰ng vi sinh v壱t trong m磯u quá cao, ph違i tăng đ瓜 pha loãng m磯u.

N院u c亥n, đổ lên mặt t医t c違 các 嘘ng đã c医y m瓜t l逢嬰ng canh DRCM đ挨n đ吋 th吋 tích ch医t l臼ng đ亥y 嘘ng và đ違m b違o rằng ch雨 còn l衣i m瓜t th吋 tích nh臼 không khí, sau đó gắn kín các 嘘ng nghi羽m và các bình, hoặc đem nuôi trong đi隠u ki羽n k鵜 khí, 栄荏 37.0 + 1.00C/44 + 4 gi運.

Bổ sung các đo衣n dây thép - đ逢嬰c nung đ臼 đặt vào môi tr逢運ng tr逢噂c khi c医y m磯u vào, có th吋 t衣o đi隠u ki羽n cho sinh v壱t k鵜 khí phát tri吋n.

Đọc và báo cáo kết quả: Các lọ trong đó th医y có v羽t đen đ逢嬰c coi là d逢挨ng tính. K院t qu違 bi吋u th鵜 theo s嘘 có xác su医t cao nh医t (MPN) c栄a Clostridium khử Sulfite trên th吋 tích m磯u thử.


K蔭T LU一N Hàng năm Vi羽t Nam có kho違ng h挨n 3 tri羽u tr逢運ng h嬰p nhi宇m đ瓜c từ th詠c

ph育m, gây thi羽t h衣i h挨n 200 tri羽u USD (WHO), h挨n 70% s嘘 ca do vi sinh v壱t gây nên, do đó vi羽c xác đ鵜nh vi sinh v壱t gây b羽nh trong th詠c ph育m (đ鵜nh tính, đ鵜nh l逢嬰ng) là r医t c亥n thi院t cho công tác ngăn chặn, phòng ngừa và gi違m thi羽t h衣i gây ra b荏i ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m.

Có nhi隠u ph逢挨ng pháp đ吋 đ鵜nh l逢嬰ng vi sinh v壱t, m厩i ph逢挨ng pháp đ隠u có nh英ng 逢u, nh逢嬰c đi吋m riêng và đ逢嬰c dùng đ吋 đ鵜nh l逢嬰ng nh英ng vi sinh v壱t nh医t đ鵜nh, do đó c亥n có s詠 nghiên c泳u v隠 đặc đi吋m sinh học c栄a vi sinh v壱t đ吋 có th吋 áp d映ng đúng ph逢挨ng pháp đ鵜nh l逢嬰ng, đem l衣i hi羽u qu違 cao nh医t.

Bài ti吋u lu壱n sử d映ng s嘘 li羽u c栄a C映c an toàn v羽 sinh th詠c ph育m - B瓜 y t院 và các ph逢挨ng pháp đ鵜nh l逢嬰ng c栄a C映c qu違n lý ch医t l逢嬰ng nông, lâm s違n & th栄y s違n - B瓜 NN&PTNT.


TÀI LI烏U THAM KH謂O

1. Nguy宇n Ti院n Dũng, 2007, Ph逢挨ng pháp ki吋m nghi羽m vi sinh v壱t trong th詠c ph育m, ĐH KHTN-ĐH QGHCM.

2. Tr亥n Xuân Hi隠n, 2001, Đánh giá ch医t l逢嬰ng th詠c ph育m, ĐH Nông Lâm TpHCM.

3. Lâm Qu嘘c Hùng, T衣 Ngọc Thanh, 2009, M瓜t s嘘 đặc đi吋m d鵜ch t宇 học các v映 ng瓜 đ瓜c th詠c ph育m trong toàn qu嘘c từ năm 2002 đ院n năm 2008, C映c An toàn v羽 sinh th詠c ph育m - B瓜 Y t院.

4. Lê Thanh Mai, 2006, Ki吋m tra vi sinh trong công ngh羽 th詠c ph育m, ĐH BKHN.

5. L逢挨ng Đ泳c Ph育m, 2005, Vi sinh v壱t học và an toàn v羽 sinh th詠c ph育m, NXB Nông nghi羽p.

6. TCVN 17025.053, 2005, Văn phòng công nh壱n ch医t l逢嬰ng.

7. Sổ tay Ph逢挨ng pháp vi sinh, 2009, C映c qu違n lý ch医t l逢嬰ng nông lâm th栄y s違n.


PH影 L影C

Ph映 l映c 1. Các ch雨 tiêu vi sinh v壱t trong th詠c ph育m đ逢嬰c quy đ鵜nh b荏i tiêu chu育n c栄a B瓜 Y t院 (B違ng 1) bao gồm các ch雨 tiêu sau: tổng s嘘 vi khu育n hi院u khí, Coliforms, E.coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Vibrio

parahaemolyticus, Bacillus cereus, Streptococcus faecalis, Pseudomonas

aeruginosa, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, tổng s嘘 n医m men, n医m m嘘c… Quy đ鵜nh v隠 gi噂i h衣n cho phép c栄a các ch雨 tiêu thay đổi theo nhóm và ch栄ng lo衣i th詠c ph育m.

Ph映 l映c 2. K院t qu違 giám sát vi sinh v壱t trong m瓜t s嘘 lo衣i th詠c ph育m do C映c An toàn v羽 sinh th詠c ph育m ti院n hành năm 2006 (B違ng 2) và 2007 (B違ng 3)

Ph映 l映c 3. H羽 th嘘ng ph逢挨ng pháp phân tích vi sinh v壱t – C映c Qu違n lý ch医t l逢嬰ng nông lâm th栄y s違n, B瓜 NN&PTNT.

Ph映 l映c 4. TCVN (7048,7049,7050) đ嘘i v噂i các s違n ph育m th鵜t.


B違ng 1. Tiêu chu育n vi sinh cho phép trong th詠c ph育m, B瓜 Y t院 4/1998 Gi噂i h衣n cho phép (CFU/g hoặc CFU/ml th詠c ph育m)

Nhóm th詠c ph育m TVKHK

ECO

SAUSAL/25

g BCE

COL

CPE

VPA

NM– MO

SFA

PAE

CBO

106

102

102

0

102

Nhóm th鵜t: - Th鵜t t逢挨i, th鵜t đông l衣nh, th鵜t xay

nh臼, th鵜t nghi隠n, th鵜t ch院 bi院n. - S違n ph育m ch院 bi院n từ th鵜t: th鵜t

hun khói, pate, xúc xích. 3. 105

3 10 0 10 50 10

106

102

102

0

102

102

105

3 10 0 10 10 10 10

Nhóm cá và h違i s違n: - Cá và thủy s違n t逢挨i s嘘ng - S違n ph育m ch院 bi院n: tôm, cá hấp

nóng hun khói, ch違 cá, ch違 m詠c, các lo衣i giáp xác, nhuy宇n th吋 lu瓜c hấp.

- Thủy s違n khô s挨 ch院: cá khô 106 10 102 0 102 20 102

105 3 10 0 102

Nhóm tr泳ng: - Trứng t逢挨i, d鵜ch trứng t逢挨i hoặc đông l衣nh.

- S違n ph育m ch院 bi院n từ trứng (đã ti羽t trùng bằng ph逢挨ng pháp Pasteur)

103 0 3 0 10


5. 104 0 0 0 10

5. 104 3 0 10

10

0 0 0 0

Nhóm s英a: - S英a khô, s英a b瓜t - S英a t逢挨i ti羽t trùng theo ph逢挨ng

pháp Pasteur. - S英a t逢挨i ti羽t trùng theo ph逢挨ng

pháp UHT - S違n ph育m ch院 bi院n từ s英a (b挨,

s英a chua, phomat) 104 0 0 0 10

106

102 102 102 103 102 103

S違n ph育m ch院 bi院n từ ngũ c嘘c, khoai c栄, đ壱u đ厩: - C亥n sử lý nhi羽t tr逢噂c khi dùng - Dùng tr詠c ti院p, không xử lý

nhi羽t: bánh b瓜t.

104 3 10 10 10 10 102

10

0 0 0 0 0

102

0 0 10 0 10 0 0

Nhóm n逢噂c khoáng và n逢噂c gi違i khát đóng chai: - N逢噂c gi違i khát có cồn - N逢噂c gi違i khát không cồn - N逢噂c khoáng đóng chai

Theo G.M.P

0 0 0 0

Nhóm gia v鵜:

104 3 102 0 102 102


104

0 3 0 102 10 10

Nhóm n逢噂c ch医m: - Nguồn g嘘c đ瓜ng v壱t: n逢噂c mắm - Nguồn g嘘c th詠c v壱t

104 0 3 0 102 10 10

105

10 102 0 102 10

Nhóm th泳c ăn khô và ch泳a dinh d逢叡ng cho trẻ em, th泳c ăn thay th院 đặc bi羽t: - Ph違i xử lý nhi羽t tr逢噂c khi sử

d映ng - Dùng tr詠c ti院p không qua xử lý

nhi羽t 104 0 3 0 10 10 10

Kem, n逢噂c đá 5. 104 0 10 0 102 10 Nhóm đồ h瓜p 0 0 0 0 0 Nhóm d亥u m叡 103 3 0 0 10 0 TVKHK: tổng vi khu育n hi院u khí; ECO: E.coli; SAU: Staphylococcus aureus; SAL: Salmonella; BCE: Bacillus cereus; COL: Coliforms; CPE: Clostridium perfringens; VPA: Vibrio parahaemolyticus; NM – MO: tổng s嘘 nấm men, nấm m嘘c; SFA: Streptococcus faecalis; PAE: Pseudomonas aeruginosa; CBO: Clostridium botulinum; G.M.P: Goof Manufacturing Practice: quy ph衣m s違n xuất GMP


B違ng 2 K院t qu違 giám sát chủ đ瓜ng – m磯u vi sinh 2006

Stt Tên m磯u Tổng s嘘 m磯u

Đ衣t Không đ衣t

Ch雨 tiêu không đ衣t

1 Th鵜t t逢挨i 40 6 34 Coliforms, E.coli,

S.aureus

2 Th栄y s違n khô s挨 ch院 17 8 9 Coliforms, E.coli,

S.aureus 3 Th栄y s違n t逢挨i 13 9 4 Coliforms, E.coli, 4 Bánh ăn li隠n các lo衣i 37 16 21 Coliforms, E.coli,

S.aureus, Cl. Perfringen,

B. cereus, TSNM- NM 5 N逢噂c gi違i khát các lo衣i:

n逢噂c mía, rau má, n逢噂c sâm, n逢噂c sinh t嘘….

20 0 21 Coliforms, E.coli,

S.aureus, Cl. Perfringen,

S. feacalis, TSNM- NM Tổng c瓜ng : 127 39

(30,7%) 88

(69,3%)

Nhận xét: 88/127 m磯u đ逢嬰c ki吋m tra không đ衣t các ch雨 tiêu vi sinh trọng đi吋m Coliforms, E.coli, S.aureus, C. perfringens, B. cereus, S. fecalis, TSBT m嘘c – men


B違ng 3 K院t qu違 giám sát chủ đ瓜ng – m磯u vi sinh 2007

STT Tên s違n ph育m

Tổng s嘘

m磯u

K院t qu違 đ衣t Coliforms E. coli

S. aureus

C. perfringens

S. fecalis

1 Nem chua lá chu嘘i

3 1 2 1 0 0 0

2 Nem chua h瓜p

3 1 2 2 0 0 0

3 Jambon 20 0 20 15 1 0 0 4 Bì thính 14 8 6 1 0 0 0

5 Nem chua cây

2 0 2 0 0 0 0

6 Nem bì 11 2 9 5 1 3 0

7 Nem chua

20 5 15 8 4 7 0

Tổng c瓜ng 73 17

(23,3%) 56

(76,7%) 31

(42,5%)6

(8,2%)10

(13,7%) 0

(0,0%) Nhận xét: Có 56/73 m磯u đ逢嬰c ki吋m tra (76,7%) không đ衣t ch雨 tiêu vi sinh ( xét nghi羽m các ch雨 tiêu vi sinh trọng đi吋m: Coliforms, E. Coli, S. Aureus, C. Perfringens)

STT Tên s違n ph育m

Tổng s嘘 m磯u

Đ衣t Không đ衣t Ghi chú

1 Mắm thái

16 6

(37,5%) 10

(62,5%)

Ch雨 tiêu không đ衣t: C. Perfringens

2 Mắm cá các lo衣i 74

51 (68,9%)

23 (31,1%)

Ch雨 tiêu không đ衣t: C. Perfringens

3 Mắm ru嘘c

23 15

(65,2%) 8

(34,8%) Ch雨 tiêu không đ衣t:

C. Perfringens

4 Mắm tôm chua

6 3

(50%) 3

(50%) Ch雨 tiêu không đ衣t:

C. Perfringens

5 Mắm ba khía

8 3

(37,5%) 5


C. Perfringens

6 Mắm tôm, mắm tép

11 8

(72,7%) 3


C. Perfringens

7 Mắm bồ h嘘c xay

5 3

(60%) 2

(40%) Ch雨 tiêu không đ衣t:

C. Perfringens

Tổng c瓜ng 143 89

(62,2%) 54

(37,8%)

Nhận xét: Không phát hi羽n Vibrio cholerae, V. Parahaemolyticus trong số mẫu được kiểm

tra.

Có 54/143 m磯u đ逢嬰c ki吋m tra (37,8%) nhi宇m C. Perfringens.Đặc bi羽t 荏 mắm ba khía và mắm thái có tỷ l羽 nhi宇m trên 62%.

vi sinh vật gay bệnh trong thực phẩm

Documents