virus de l'hépatite a et e virus et marqueurs diagnostiques
DESCRIPTION
P. LebrayTRANSCRIPT
V.Thibault DU_janv.-11 1
Virus de l'hépatite A et EVirus et marqueurs diagnostiques
Vincent THIBAULTLaboratoire de Virologie
Groupe HospitalierPitié-Salpêtrière
Assistance Publique Hôpitaux de Paris
V.Thibault DU_janv.-11 2
Hépatites virales
parentéral
non A, non BB1965 D
1977
A1972
féco-oral
mode de transmission préférentiel
F, G, TTV, autres…
C1990
E1991
VaccinVaccin
(Vaccin)
V.Thibault DU_janv.-11 3
V.Thibault DU_janv.-11 4
Historique VHAAvant J.C.: “La Jaunisse” (Ikterus / kirrhos)
1745 : Cockayne, hépatites épidémiques
1908 : McDonald, "notion de virus…"
Reproduction de la maladie 1942 :
Volontaires (Voegt, Havens), Paul 1943 ingestion feces/serum
Entité clinique : 17-18ème siècle - 1923 Blumer - 1947 McCallum (VHA "infectious"-VHB "serum")
Transmission nosocomiale (préparation vaccinale : variole, fièvre jaune…)
Visualisation : 1973 (Feinstone)
Développement de la sérologie : épidémiologie
1979 : culture (Provost et Hilleman)
1981... : Clonage, Séquences nucléotidiques
1991… : Vaccination
2006 : Déclaration obligatoire
1995 : Vaccin
1996 : recommandations
1999 : recommandations
V.Thibault DU_janv.-11 5
Virus de l'hépatite A
V.Thibault DU_janv.-11 6
Virus de l’Hépatite A
ARN (+)
Vpg
Capside
27-32nm
• Famille : Picornaviridae(entérovirus type 72)
• Genre : hépatovirus• Taille 27-32 nm• Non enveloppé• Structure icosaèdrique• ARN simple brin,
• polarité positive• lié de façon covalente à
une protéine Vpg
V.Thibault DU_janv.-11 7
VP1VP3VP2VP4 2AProtéines de surface
immunogénicité
3D (POL)3C (PRO)2C2B1D1C1B 3A-B2A
P1 prot. Capside
Vpg2.5kDa
P2 P3
0 7478
1AAAA
Structurales Non structurales
IRESTraduction(eIF-4G)
3D (POL)3C (PRO)2C2BVP1VP3VP2
3A-B
VP4
2Apoly-
protéine2 227 AA
?
Liaison NTPHélicase
Vpg
Protéase
ARNPolymérase
RéplicationVP1VP3VP2VP4 2A
VP0
Maturation finale
X5 – X12
V.Thibault DU_janv.-11 8
Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules
P3
P2
P1
TraductionSynthèse
de la polyprotéine
+-
-
+
Réplication
Maturation
Libérationdu génome
Attachement
Relargage
Mem
bran
e ce
llulaire
Réticulum endoplasmique
Espace de Disse
Canaliculebiliaire
Empaquetage
V.Thibault DU_janv.-11 9
Seth et al. Cell Research (2006)16: 141-147Fensterl et al. JOURNAL OF VIROLOGY, Sept. 2005, p. 10968–10977Yang et al. (2007) PNAS 104 :7253-7258
Hepatitis A Virus Suppresses RIG-I Mediated IRF-3 Activation To Block Induction of Beta Interferon
*
*
V.Thibault DU_janv.-11 10
VHA : physiopathologie
Absence d'effet cytopathique direct :cytolyse résultant du processus immun de défense de l'hôte,
médiation cellulairemédiation humorale
V.Thibault DU_janv.-11 11
Agents Stabilité
ChaleurAutoclavage (121°C, 20')100°C60°Ctempérature ambiante
4°CCongelé
InactivationInactivationStable 1 heureStable 1 mois (selles, eaux, sols)Plusieurs jours sur surface sèche4 h. Sur les mainsStable plusieurs moisStable des mois ou années
Acide-base pH 1 : stable 5 h.PH 3-11 : stable au moins 30'
U.V. InactivationChimiques
Chlore, ozone,glutaraldéhyde, iode
Inactivation
Alcool 70° 3' : inactivation partielle
Propriétés Physiques du VHA
V.Thibault DU_janv.-11 12
VHA et agents physiques ou chimiques
http://www.invs.sante.fr/publications/2009/guide_hepatite_a
V.Thibault DU_janv.-11 13
Variabilité génétique
Comparaison nucléotidique
⌦7 Génotypes : IA,B ; II; IIIA,B ; IV-VII⌦Homme : génotype I (90%), (III, II=VII)
⌦Singes : IV, V, VI
Sérotype unique⌦Nombre limité d'épitopes antigéniques VP1, VP3
⌦Tests immunologiques
⌦Vaccination (HM175, CR326)
⌦virus inactivé cultivé sur MRC-5
3D (POL)3C (PRO)2C2B1D1C1B 3A-B2A
P1 prot. Capside
Vpg2.5kDa
P2 P3
0 7478
1AAAA
Structurales Non structurales
V.Thibault DU_janv.-11 14
IV Nonhuman primate, Philippines V Nonhuman primate, KenyaVI Nonhuman primate, Indonesia
D'après Nainan et al. 2006Clin. Microb. Rev. ; 19:63-79
Génotypes et phylogénie
Phylogenetic analysis of 3,582 HAV isolatesin the VP1/P2B region (315-bp fragment).
VP1/P2AGénotypes : >15% variationsSous types : 7.5% variations
V.Thibault DU_janv.-11 15
Répartition mondiale des génotypes
Génotypes infectant l'homme en noir , les singes en rouge. Souche PA21 (génotype IIIA), isolée d'un singe Panamanian Owl en vert.
Cristina J, Costa-Mattioli M. Virus Res. 2007 Aug;127(2):151-7.
V.Thibault DU_janv.-11 16
Application à l'étude de diffusion de
certaines souches
Diffusion du génotype IIA en France à partir d'une origine
Africaine
Diversité génétique d’un génotype rare du virus de l’hépatite APathologie Biologie, In Press, Availableonline 6 September 2010D. Desbois et al.
I
II
III
V.Thibault DU_janv.-11 17
Symptomes
Ictère
VHA : Paramètres Biologiques
Semaines
Ag foie
VHA Sang
VHA Selles
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24
IgM
IgGprotection contre réinfection
Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccinationIgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique)
V.Thibault DU_janv.-11 18
IgM HAV uniquement à bon escient !
Alaska : test "réflexe" si Ig-VHA totales + Ig M HAV⌦32 % de faux + (Castrodale CID 2005:41;e86)
Vaccination : 8 à 20 % d'IgM VHA + dans les 2 à 3 semaines suivant l'injection…
NE RECHERCHER L'IgM anti-VHA QU'EN CAS D'HEPATITE AIGUË
Roque Afonso et al. CID 2006:42 -887
82 %11 %1 %
Faux positifs
V.Thibault DU_janv.-11 19
Diagnostic
Sérologie +++
IgM anti VHA : infection récente
IgG anti VHA : infection passée ou vaccination
IgM et IgG anti VHA
Diagnostic direct (-) [uniquement dans le cadre d'études]Virémie : techniques sensibles (105 v./mL)
Recherche de virus dans les selles, prolongée, importante (109v./mL), épidémiologie
Marqueurs biochimiques
⌦Transaminases (ALAT, ASAT)
⌦Bilirubine
⌦Phosphatase alcaline
⌦Facteurs de coagulation
Salive : IgG (ELISA)Génome viral (RT-PCR)
V.Thibault DU_janv.-11 20Rezende et al., Hepatology 38:613-618 (2003)
Hépatite fulminante Evolution bénigne
Limite de quantification
50 Hépatites A dont 19 fulminantes (10 OLT)Hépatite fulminante :
-virémie (p=0.03) *-bilirubine -(p=0.04) *-age (p=0.09)-génotype non IA (p=0.09)
Normann et al., Journal of Medical Virology 72:10–16 (2004)
11 Hépatites A
Quantification de la virémie ?
Fujiwara K et al. J. Med Virol. 2011 Feb;83(2):201-7.
Hepatitis A viral load in relation to severity of the infection.
11 patients with fulminant hepatitis10 with severe acute hepatitis70 with self-limited acute hepatitis
V.Thibault DU_janv.-11 21
Durée de la virémie: conséquences cliniques et biologiques
Duration of viremia in hepatitis A virus infection
Bower et al. Journal of Infectious Diseases2000;182:12–7
6-7 5-6 2-5 Log particules/mL
Suivi de 13 patients : durée moyenne 95 joursdont 2 avec rechute (1-2 mois)
Suivi de 27 patients
High and Persistent Excretion of Hepatitis AVirus in Immunocompetent Patients
Tjon et al. Journal of Medical Virology 78:1398–1405 (2006)
V.Thibault DU_janv.-11 22
Hépatite A : le vaccinvirus inactivé
AVAXIM 160U suspension injectable seringue préremplie ⌦Virus de l'hépatite A souche GBM cultivée sur cellules diploïdes humaines MRC-
5 , inactivé
HAVRIX 1 440 U Elisa/ml susp inj IM Ad en seringue
HAVRIX 720 U Elisa/0,5 ml susp inj IM Enf/Nour en seringue⌦Souche HM 175 du virus de l'hépatite A cultivée sur cellules humaines
diploïdes MRC5
Le schéma vaccinal habituel comprend 1 dose suivie d'un rappel (1 dose) 6 à 12 mois plus tard.
La persistance des anticorps anti-VHA après vaccination n'est actuellement pas connue . Les données disponibles suggèrent la persistance des anticorps anti-VHA à un niveau protecteur au moins jusqu'à 20 ans après primo-immunisation.
Hepatitis A Vaccine versus Immune Globulin for Post-exposure ProphylaxisVictor et al. 2007 N Engl J Med 357;17
V.Thibault DU_janv.-11 23
Difficultés diagnostiquesEn routine
Adresser prélèvementsau
Centre national de référence du VHA
Pr E DussaixLaboratoire de virologie
Hôpital Paul Brousse12-14 av Paul Vaillant Couturier
94804 Villejuif cedexTel : 01 45 59 37 21
http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste
V.Thibault DU_janv.-11 24
Grippe
SRAS ?
Hépatite E ?Hépatite E ? GrippeHépatite E ?
V.Thibault DU_janv.-11 25
Historique VHEDécouverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites⌦1955 : Inde, hépatite chez des personnes immunisées contre le
VHA, épidémie particulière. "NANBH"
Entité clinique 1980 - similitude avec l’hépatite A :Inde : prévalence de l’hépatite A importanteEpidémie : autre virus des hépatites, contamination par l’eau
1983 : reproduction de l’hépatite non A-non B chez un volontaire immunisé contre VHA (Balayan)
Hépatite à J36J28-45, visualisation de particules virales > VHA (27-30nm)Reproduction de l’infection chez le singe (cynomolgus)Hépatite "non A - non B" à transmission entérique (ENANB)
1990 : Reyes et al. clonage et séquençage "VHE"1991 : Tam et al. VHE2000 : Panda et al. cDNA infectieux
V.Thibault DU_janv.-11 26
Coloured transmission electron micrograph of hepatitis E virus particles (purple)
Holmberg, Lancet Vol 376 September 11, 2010
V.Thibault DU_janv.-11 27
VHE Virus non enveloppéSphérique (SRV)
Surface irrégulièreCapside 27-34 nm
Symétrie icosaédrique
ARN simple brinhélice droite
polarité +7,5kb
poly-A extrémité 3’
StabilitéAu laboratoire : instable(-70 à +8°C)
Décongélation/congélationTractus GI : stable (pH)
Famille : HepeviridaeGenre : Hepevirus
V.Thibault DU_janv.-11 28
Organisation génomiqueNon structurales Structurales
28 5109 71245’ NC 3’NCPoly-A
ARN polarité + 7 200 nt
Protéinesimmunogènes DIAGNOSTIC
MeT Y Pro P X Hel RdRp
ORF3
ORF2
Génotypes 1-3
Hétérogénéité génétiqueAu moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés en 24 sous groupes dont homologues animauxEpitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2 Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype⌦ Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre
les différents types ?)⌦ Vaccin : ORF 2 recombinante
V.Thibault DU_janv.-11 32
Similarités des souches humaines et animalesBilic et al. Journal of General Virology
(2009), 90, 863–873
Unrooted phylogenetic tree of four avian HEV and nine mammalian HEV isolates, based on the complete genome region
aviaireshumaines
Epidémique
Sporadique
V.Thibault DU_janv.-11 33
Evolution VHE
Purdy MA, Khudyakov YE. Evolutionary history and population dynamics of hepatitis e virus. PLoS One. 2010 Dec 17;5(12):e14376.
Anthropotropic
enzootic
536 to 1344 years ago
V.Thibault DU_janv.-11 35
V.Thibault DU_janv.-11 36
Culture et Modèles animaux
• CultureDifficileCulture primaire d’hépatocytes de macaques (cynomolgus)Cellules PLC/PRF/5 hépatocarcinome (Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007)
Cellule embryonnaire
• Modèles animauxPrimates : reproduction de la pathologie humaineVolontaires...VHE du porc, du pouletPrésence d’Ac chez poulet, porc, rat, souris, mouton...
Lapin… Ma H et al. Experimental infection of rabbits with rabbit and genotypes 1
and 4 hepatitis E viruses. PLoS One. 2010 Feb 11;5(2):e9160
V.Thibault DU_janv.-11 37
Résistance thermique du VHE…
Colson et al. JID 2010:202
VHE dans des suspensions fécales :Inactivation : 70°C 10' ou 95°C 1 min; 56 °C 30 min maintien de l'infectiosité
Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007
V.Thibault DU_janv.-11 38
VHE et contamination des eaux
J. Rodriguez-Manzano et al. Excretion patterns of HAV and HEV infections in Eastern Spain Journal of Water and Health 08.2 2010
Presence of hepatitis A virus (HAV) and hepatitis E virus (HEV) in urban wastewater
Prédominance du génotype 3
V.Thibault DU_janv.-11 39
Symptomes
Ictère
VHE : Paramètres Biologiques
Jours
VHE Sang
VHE Selles
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200
IgM
IgG
Titre peu élevéprotection contre réinfection ?
Khuroo MS, Khuroo MS.Seroepidemiology of a second epidemic of hepatitisE in a population that had recorded first epidemic30 years before and has been under surveillance since then. Hepatol Int. 2010 Feb 3;4(2):494-9
V.Thibault DU_janv.-11 40
Virémie et excrétion fécale
Aggarwal et al. THE LANCET • Vol 356 • September 23, 2000, p1081-1082Détection du RNA-VHE chez 20 patients ayant une hépatite E aiguë
Virémie Selles
Chandra NS et al. Dynamics of HEV viremia, fecal sheddingand its relationship with transaminases and antibodyresponse in patients with sporadic acute hepatitis E. Virol J. 2010 Sep 6;7:213
V.Thibault DU_janv.-11 41
HEV – virémie-transmission
Matsubayashi K, et al. Transfusion. 2008 Jul;48(7):1368-75.
serum
salive
selle
IgG
IgM
Concentré de plaquettes à J0 Transfusé à un homme de 64 ans traité pour Lymphome non-Hodgkinien par GM autologue
V.Thibault DU_janv.-11 42
Immunodépression, hépatite chronique et stratégie diagnostique
Kamar et al. American Journal of Transplantation 2008; 8: 1744–1748
Dans le cadre d'une investigation chez un patient immuno déprimé,
La détection du génome viral (RT-PCR) sera privilégiée !
(ceci s'applique pour de nombreux diagnostics viraux - PCR)
V.Thibault DU_janv.-11 43
Marqueurs non biologiques
circonstances de la maladie (voyage, autres causes, épidémie)A adapter en fonction de la zone géographique ? (Sud versus Nord ?)
clinique : hépatite “classique”, absence de chronicité (chez l'immunocompétent ! ) – Portage prolongé en cas d'immunodépression
Absence de marqueurs biologiques : diagnostic d'exclusion
Absence des marqueurs des virus des autres hépatites (A, B, C, D)
Notions sérologiques pour d’autres virus (EBV, CMV, herpès)
Marqueurs sérologiques spécifiques
IgM anti-HEV
IgG anti-HEV (+++)
RT-PCR : détection du génome viral (sang, selles)ATTENTION : spécificité - performances
Stratégie Diagnostique
V.Thibault DU_janv.-11 44
Incidence des cas d'hépatite E en France :un gradient Nord-Sud
Nicand et al. Pathol Biol. 2009 Mar;57(2):203-11
Renou et al. 2008 Aliment Pharmacol Ther 27, 1086–1093
V.Thibault DU_janv.-11 46
Performance des tests
MicroplaqueAdaltis
MicroplaqueMP Diagnostics
941644545Total (n=50)544545Negatif (n=9)437239140Positif (n=41)
négatifpositifnégatifpositifnégatifpositif
Test rapideMP Diagnostics
IgM anti-HEV
anti-HEV IgG
Legrand-Abravanel CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, May 2009, p. 772–774
Panels50 sérums ARN HEV (+), G3406 sérums IgG ARN HEV (-)
Sensibilité 90 88 82Spécificité 100 99.5 100VPP 100 95.7 100VPN 98.8 98.5 97.8
V.Thibault DU_janv.-11 47
Stratégie DiagnostiqueSe donner les moyens de faire le diagnostic
--+Immunitéancienne
--+++Douteux
+-- ou +Probable
+++++Certain
RT-PCRIgMIgGDiagnostic
Diagnostic DirectRecherche du génome sur prélèvements sang et selles
Diagnostic IndirectRecherche de l'immunité antivirale
IgM anti VHEIgG anti VHE
Huang S et al. 2010 Profile of Acute Infectious Markers in Sporadic Hepatitis E. PLoS ONE 5(10): e13560
V.Thibault DU_janv.-11 48
VHE et traitement
Efficacité du PEG-IFN
Efficacité de la ribavirine chez les patients
⌦Pas de mécanisme virologique précis décrit
Haagsma EB et al Liver Transpl. 2010 Apr;16(4):474-7Mallet V et al. Ann Intern Med. 2010 Jul 20;153(2):85-9. Kamar N et al. Nephrol Dial Transplant. 2010 Aug;25(8):2792-5.Kamar N et al. Gastroenterology. 2010 Nov;139(5):1612-8.
V.Thibault DU_janv.-11 49
VHE et vaccination
Risque cumulé d'un premier épisode d'hépatite E
Moyenne géométrique du taux d'anticorps anti-VHE
20 μg d'antigène rHEV (capside exprimée dans baculovirus) dans 0.5 ml de PBS sur 0.5 mg d'hydroxyde d'aluminium.3 injections
Shrestha,et al 2007 N Engl J Med 356;9
Efficacité : 95,5% après 3 doses
V.Thibault DU_janv.-11 50
VHE et vaccination
Zhu et al Lancet. 2010 Sep 11;376(9744):895-902
HEV 239 (Hecolin; Xiamen Innovax Biotech, Xiamen, China),produced in bacterial cells : safe and efficacious against infection with hepatitis E virus in seronegative participants in a phase 2 trial
V.Thibault DU_janv.-11 51
Difficultés diagnostiquesEn routine
Adresser les prélèvementsau
Centre national de référence du VHA/VHE
Pr E DussaixLaboratoire de virologie
Hôpital Paul Brousse12-14 av Paul Vaillant Couturier
94804 Villejuif cedexTel : 01 45 59 37 21
http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste