v i t e n s k a p e t

Gjennombrudd i forskningen på kardiomyopatisyndrom – CMSDet nasjonale brukerstyrte industriprosjektet på CMS er inne i sitt tredje og siste år. Denne artikkel- en oppsummerer vitenskapelige fremskritt som vil ha betydning for sykdomsbekjempelse og videre forskning på denne hjertesykdommen i årene fremover. Bl.a. er et nytt virus som forårsaker CMS karakterisert, og vil åpne for grundigere studier av forekomst, spredningsmønster og patogenese.

Av Sven MArtin JørgenSen, HArAld tAkle, gerrit tiMMerHAuS, AlekSei krASnov (noFiMA MArin), Britt BAng-JenSen, Birgitte Fineid, JAnnicke Wiik-nielSen, renAte JoHAnSen, cAMillA FritSvold, edgAr Brun (veterinærinStituttet), MArtA AlArcon, trygve PoPPe (norgeS veterinærHøgSkole), rune WAAgBø, SoFie c. reMø (niFeS), MArit rode, Pål nilSen (PHArMAQ), ninA SAnti, Arne StorSet (AQuA gen), HArAld Sveier (lerøy SeAFood grouP ASA/AAkvik SetteFiSk), SiMon WAdSWortH (eWoS innovAtion) og olAv Breck (MArine HArveSt norWAy)E-post: olav.breck@marineharvest.com

Verktøy for å forbedre overvåkning og kontroll av sykdommen er allerede utviklet, og en om-fattende screening for det nye viruset samt an-dre virus og parasitter i oppdrettsanlegg med og uten CMS-diagnose langs kysten, har gitt oss ny og verdifull innsikt i sameksistens og ut-bredelse av disse. Undersøkelser av Aqua Gens avlskjerne som ble rammet av CMS, viser et betydelig potensial for å avle frem fisk med økt motstandskraft mot sykdommen. Molekylære analyser av laksens respons mot CMS i smit-teforsøk har avdekket kausale mekanismer for beskyttelse og sykdomsutvikling, samt avdek-ket nye sykdomsmarkører. Ulike biokjemiske sykdomsmarkører er også studert, flere som kan påvirkes gjennom fôret, og kombinert med lovende resultater fra kliniske ernæringsforsøk med HSMB vil et tilsvarende forsøk bli utført for CMS. Dette vil kunne benyttes av næringen for å påvirke sykdomsforløp og -omfang.

Nytt CMS-virus identifisert

Prosjektets sentrale problemstillinger har vært knyttet til årsak, diagnostikk, patogenese og risikofaktorer forbundet med CMS. Ved pro-sjektoppstart i 2008 hadde andre smitteforsøk

sannsynliggjort en infeksiøs årsak, men iden-tifisering av sykdomsagenset som forårsaker CMS ville være av avgjørende betydning for å lykkes med prosjektets sentrale mål. Ikke minst vil man da endelig kunne fastslå om CMS er en produksjonslidelse eller en infeksiøs sykdom. To parallelle løp med ulike strate-gier har resultert i samme funn av et dobbelt- trådig RNA-virus som er assosiert med syk-dommen (Haugland et al., submittert, Løvoll et al., 2010). Viruset er foreslått kalt piscine myocarditis virus (PMCV) (Haugland et al., submittert). Konklusjonen om at PMCV er agenset som forårsaker CMS er basert på un-dersøkelser av laks fra både kontrollerte smit-teforsøk og fra felt. Viruset befinner seg i hjer-temuskelceller, og forekomst av PMCV er godt korrelert med skader i hjertet til fisken som gir diagnosen CMS. Det ser ikke ut til at det nylig karakteriserte reoviruset (PRV) forbundet med HSMB (Palacios et al., 2010), uten at kausalitet er entydig bekreftet, har noen innvirkning på forekomsten av CMS.

Funnet av PMCV vil ha stor betydning for videre kunnskapsbygging rundt sykdom-men. Både forekomst, spredningsmønster og patogenese vil nå kunne studeres grundig, og

verktøy for å forbedre overvåkning og kon-troll av sykdommen er allerede utviklet. Mens det HSMB-assosierte reoviruset synes å være svært utbredt hos både villfisk og oppdretts-fisk uten å gi sykdomssymptomer, tyder stu-dier så langt på at infeksjon med PMCV er klart assosiert med utvikling av CMS. Graden av hjertepatologi korrelerer også med mengde virus, noe som er et lovende utgangspunkt for diagnostikk basert på målinger av virusmeng-de ved for eksempel real-time PCR.

Kasus-kontroll studie

Det er utført et epidemiologisk studium for å oppnå en bedre forståelse av risikofaktorer for-bundet med utbrudd av CMS. Det er samlet inn vevsprøver og spørreskjema fra 86 anlegg lokalisert langs norskekysten fra mars 2009 til juli 2010 (47 kasus og 39 kontroller). Kasus er anlegg med bekreftet CMS-diagnose fra Veterinærinstituttet. Kontroller er tilfeldig utvalgte oppdrettsanlegg uten en forutgående CMS-diagnose. Histopatologisk vurdering av hjerte fra 25–30 fisk per anlegg, totalt ca. 2300 fisk, er utført for å stille diagnose per fisk og per anlegg. Resultatene viser høy preva-

• Avlusingspresenninger og skjørt.

• Telt for kar i alle størrelser/lysstyring.

• Plasthaller for hele smoltanlegg.

• Presenninger i alle størrelser og kvaliteter.

• Hetter og trekk.

Seim Industrihus5912 SeimTlf. 56 35 64 00Fax. 56 35 64 01E-post: firmapost@nwp.as

www.nwp.as

Norsk kvalitettil markedetsbeste pris!

44 norsk fiskeoppdrett #3.2011

v i t e n s k a p e t

lens av CMS blant kasusanlegg, men noen av anleggene har i tillegg diagnosen HSMB og/eller PD. Et uventet funn blant kontrollanleg-gene er tilstedeværelsen av CMS patologi hos enkeltfisk i et relativt høyt antall av anleggene. Real-time PCR-analyser av virusene PMCV, PRV (assosiert med HSMB) og SAV (forårsa-

ker PD) bekrefter resultatene. PCR-analyser utført på hjertevev av fisk fra et utvalg av an-leggene (12 kasus- og 13 kontrollanlegg) viser at tilstedeværelse av PMCV og SAV i stor grad samsvarer med de histopatologiske diagnosene for henholdsvis CMS og PD. PRV påvises hos nesten all fisk også i anlegg med «ren» CMS-

eller PD-diagnose. Likevel ser PRV ut til å være tilstede i større mengder i anlegg som har fått HSMB-diagnose. PCR-analyser av mi-krosporidien Desmozoon Lepeophtherii viser en geografisk todeling, med stor utbredelse i sør og avtagende mot nord. Det ble ikke på-vist noen sammenheng mellom tilstedeværelse av mikrosporidien og histopatologiske for-andringer assosiert med CMS, HSMB og PD. Oppsummert gir resultatene et bredt innblikk i prevalensen av sykdomsagens i anlegg langs kysten vår, og morgendagens utfordringer i forhold diagnostikk, sykdomsovervåkning og operasjonelle mottiltak for å begrense disse sykdommene.

Forskjeller i motstandskraft mot CMS hos laks med ulik genetikk

Som en del av det pågående samarbeidspro-sjektet var det ønskelig å se på muligheten for å avle for økt motstandsdyktighet mot CMS. Det ble satt opp en longitudinell feltstudie av en gruppe som inneholdt 200 ulike familier fra Aqua Gens avlskjerne. Fisken ble sjøsatt som null-åring høsten 2008 i et område hvor CMS er vanlig forekommende. CMS ble påvist hos den aktuelle fiskegruppen i januar 2010. Dødeligheten i feltutbruddet varierte mellom

Grafen viser høy korrelasjon mellom replikasjon av virus i form av RNA og histopatologisk score i hjertene til laks fra smitteforsøk. Det er altså en god sammenheng mellom mengden av virus og graden av vevsskade.

correlation = -0,75p-value = 5,508e-11

Ensretting og elektrobedøving

Melbu Systems ensretter i kombinasjonmed Seaside elektrobedøverog Seaside bløggerobot

Enkeltvis eller som en komplett linje

Ingen bemanning før bløgging

Patentsøkt løsning som er genialt enkelog som ivaretar fiskevelferden

Ta kontakt med oss for et uforpliktende tilbud

Melbu Systems as • Sminesgt 3 • N-8445 Melbu, NorwayTel.: (+47) 76 11 83 00 • Fax: (+47) 76 11 83 18 • post@melbusystems.no • www.melbusystems.no

➡

45norsk fiskeoppdrett #3.2011

de ulike familiene, fra 0 prosent hos de beste, opp til 32 prosent hos den hardest rammede familien. Vevsprøver ble høstet ved slaktere-gistreringer i mars 2010, og hjertehistologi på ti utvalgte familier viste en klar trend i at familier med lavere dødelighet også har lavere score på hjertepatologi. Disse funnene ble be-kreftet ved PCR-analyser for PMCV (Patogen Analyse AS), hvor familier med lav dødelighet i feltutbruddet hadde betydelig lavere nivå av virus i hjertemuskelen sammenlignet med fa-milier med høy dødelighet. Resultatene viser et betydelig potensial for å avle frem fisk med økt motstandskraft mot CMS.

Variasjon i laksens immunrespons under PMCV-infeksjon

Utviklingen av en smittemodell for CMS på laksesmolt har vært en viktig del av prosjek-tet (utført på VESO Vikan, tidligere omtalt i NF nr.1 2010). Et interessant funn fra dette smitteforsøket var den store andelen fisk som ikke utviklet sykdom i form av hjertepatologi. Dette på tross av at alle individer fra de tidlig-ste tidspunkt etter smitte (to uker) viste tilnær-met lik oppregulering av antivirus-respons og medfødte immunforsvarsgener, en indikasjon på at alle individer ble injisert med lik mengde virus. Microarray-analyse av genuttrykkspro-filer i hjertevev fra fisk med henholdsvis høy

histologiscore (3–4 = uttalt CMS-patologi) og lav score (0–1 = normalt friskt hjerte) åtte uker etter smitte, viste at de med høy score hadde en kraftig adaptiv cellulær immunre-spons sammenlignet med fisk med lav score. Ikke overraskende viste senere PCR-analyser av PMCV at fisk uten patologi også hadde la-vere virusmengde gjennom hele smitteforløpet. Resultatene viste også en moderat variasjon i virusmengde på tidligste tidspunkt som kan forklare variasjonen i patologiutvikling ved de senere tidspunkter, og som videre kan indikere at eventuelle forsvarsmekanismer på et tidlig tidspunkt er avgjørende for å kontrollere og motarbeide den primære virusreplikasjonen og unngå utvikling av vevsskade. I syk fisk ble det også observert en topp i både virusmengde og patologi etter åtte uker, etterfulgt av en nedad-gående kurve mot tolv uker. Dette sammenfalt med aktiveringen av det adaptive immunfor-svaret, og da spesielt gener involvert i effektor T-celle respons, noe som kan tyde på at disse cellene bidrar til å fjerne infiserte hjerteceller og redusere ytterligere vevsskade. Her må det legges til at disse observasjonene vil være gjel-dende for smittebetingelsene som ble brukt i dette forsøket, og at for eksempel en høyere dose virus (økt smittepress) vil kunne endre bildet. Flere av disse genmarkørene testes nå i feltmateriale, hvor både fisk fra kasus-kontroll studiet og Aqua Gens avlskjerne inngår.

Nye sykdomsmarkører

Analyser av ulike ernæringsfysiologiske og bio- kjemiske parametre i fisk fra et utvalgt CMS-anlegg ble utført og relatert til fiskens CMS-patologi, med tanke på å kunne benytte disse som markører for fiskens mottakelighet for CMS-infeksjon. Av de undersøkte parame-trene viste blant annet plasma ASAT (hjerte-skade), forholdet mellom GSH/GSSG i hjerte (oksidativ status) og hjertets innhold av N-acetyl histidin (bufringsevne og antioksi-dant) å være gode markører knyttet til alvor-lighetsgrad av CMS-sykdom. Videre analyser av fisk fra utvalgte CMS- og kontrollanlegg, samt fisk fra smitteforsøk (som omtalt over) er i gang, og disse vil avklare om oksida-sjon og metabolske forhold er bestemmende for hvorfor noen fisk utvikler uttalt CMS-hjertepatologi mens andre unngår dette. Flere av de undersøkte parametrene kan påvirkes gjennom fôret, noe som gir et potensial for å kunne påvirke sykdomsforløp og omfang.

v i t e n s k a p e t

Grafen viser utvalgte gener i laksens im-munforsvar som slås på i sen fase av CMS-infeksjon. Disse viser en kraftigere oppregu-lering med økende grad av vevsskade i hjerte, og er således gode patologiske markører. Genutrykk på y-aksen er vist i log2-skala (1= 2 ganger oppregulering), x-aksen viser hjer-tehistologi-score, der score 0–1 er normale hjerter, mens 3 er uttalt CMS-hjertepatologi.

a: TNF decoy receptor, cor = 0,953b: CD274, cor = 0,945c: T cell spec glycoprot, cor = 0,944d: CD8 beta, cor = 0,966a: Granzyme A precurser, cor = 0,952

WWW.MORENOT.NO

46 norsk fiskeoppdrett #3.2011

Analyser av disse vil implementeres i et fôr-ingsforsøk med CMS som beskrevet under.

Smitteforsøk med klinisk ernæring

På bakgrunn av lovende resultater fra HSMB-forsøk med ulike fôrsammensetninger som gir beskyttelse mot sykdom i regi av EWOS, vil et tilsvarende forsøk med CMS bli utført denne våren. Etter preklinisk fôring i tre må-neder vil ulike diettgrupper infiseres med vi-rus jamfør smittemodellen som er utviklet i prosjektet (omtalt over), og effekter måles ved hjertepatologi, virus PCR og sykdomsmarkø-rer som nevnt over (både genekspresjon og bi-okjemiske parametre). Suksess i dette forsøket

kan bety et utgangspunkt for formulering av et funksjonelt fôr som vil kunne tas i buk av industrien for å begrense omfanget av CMS-utbrudd.

Forskningen er utført av Veterinærinstituttet, Norges Veterinærhøgskole (NVH), NOFIMA Marin, NIFES og PHARMAQ.

Identifiseringen av PMCV er gjort i et samarbeid mellom PHARMAQ og Øyvind Haugland, Aase

Mikalsen, Beathe Thu og Øystein Evensen ved NVH.Prosjektet, ledet av Marine Harvest Norway

(MHN), er finansiert av Norges Forskningsråd, Fiskeri- og havbruksnæringens forskningsfond (FHF), MHN, PHARMAQ, Aqua Gen, Lerøy Seafood Group ASA/Aakvik Settefisk og EWOS Innovation.

Referanser kan fås ved henvendelse til førsteforfatter.

v i t e n s k a p e t

VÅR KUNNSKAP - DIN TRYGGHET

55 34 88 00www.frydenbosabb.no

NORGES NYE

LOMBARDINI

IMPORTØR

Iveco C13 500330Hk@1800 rpm

LMG 16500Effekt 16,5 kvA

En modell av den sannsynlige strukturen til piscint myocarditis virus (PMCV) som forårsaker CMS.

Laks rammet av CMS med typisk hjertesprekk som følge av virusinfeksjon og vevsskade i forkammeret. Foto: Sven M Jørgensen

47norsk fiskeoppdrett #3.2011