vjeŽbe iz biokemije - pharma.unizg.hr · vjeŽbe iz biokemije za studente studija farmacije i...

VJEŽBE IZ

BIOKEMIJE za studente studija Farmacije i Medicinske biokemije

T. Žanić Grubišić

K. Barišić L. Rumora

M. Grdi ć Rajković M. Matokanović

A. Somborac Bačura

ISBN 978-953-6256-60-0

T. Žanić Grubišić K. Barišić L. Rumora

M. Grdi ć Rajković M. Matokanović

A. Somborac Bačura

VJEŽBE IZ

BIOKEMIJE za studente studija Farmacije i Medicinske biokemije

Zagreb, 2014.

FARMACEUTSKO-BIOKEMIJSKI FAKULTET SVEUČILIŠTA U ZAGREBU ZAVOD ZA MEDICINSKU BIOKEMIJU I HEMATOLOGIJU

Urednik:

prof. dr. sc. Lada Rumora

Recenzenti:

prof. dr. sc. Ivana Čepelak

prof. dr. sc. Ivančica Delaš

Zabranjen je svaki oblik pretiska ili kopiranja dijela ili cjeline ovog izdanja.

Izdavač: Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

Slika na prednjoj stranici korica prikazuje enzim acetilkolinesterazu u kompleksu s inhibitorom, alkaloidom huperzinom A.

(preuzeto s http://bidd.nus.edu.sg/group/research.htm)

ISBN 978-953-6256-60-0

S a d r ž a j

Str. 1. HOMOGENIZIRANJE TKIVA I RAZDVAJANJE STANIČNIH ORGANELA DIFERENCIJALNIM CENTRIFUGIRANJEM 1 1.1. Diferencijalno centrifugiranje 2 1.2. Odreñivanje koncentracije deoksiribonukleinske kiseline (DNA) 2 1.3. Odreñivanje koncentracije laktata 3 1.4. Odreñivanje katalitičke aktivnosti sukcinat-dehidrogenaze 5 2. IZOLACIJA STANIČNIH MEMBRANA 9 2.1. Svojstva membrana i osobitosti membranskih enzima 9

2.2. Izolacija vezikula membrana četkaste prevlake proksimalnih tubula bubrega 12

2.3. Odreñivanje koncentracije proteina 15 2.4. Odreñivanje katalitičke aktivnosti alkalne fosfataze 16 2.5. Odreñivanje katalitičke aktivnosti γ-glutamiltransferaze 17 3. ELEKTROFOREZA 22 3.1. Razdvajanje aminokiselina elektroforezom na papiru 22 3.2. Elektroforeza hemoglobina na agar-gelu 24

3.3. Elektroforeza hemoglobina na SDS-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) 25 4. KATALITI ČKA AKTIVNOST ENZIMA 31 4.1. Kinetika enzimske reakcije 31 4.2. Ureaza (EC 3.5.1.5) 35 4.2.1. Odreñivanje katalitičke aktivnosti ureaze 35 4.2.1.1. Utjecaj natrijevih iona i anorganskog fosfata na katalitičku aktivnost

ureaze 37 4.2.1.2. Utjecaj temperature na katalitičku aktivnost ureaze 37 4.2.1.3. Utjecaj pH na katalitičku aktivnost ureaze 38 4.2.1.4. Aktivacija i inaktivacija ureaze 39

4.3. Alkalna fosfataza (EC 3.1.3.1) 42 4.3.1. Odreñivanje katalitičke aktivnosti alkalne fosfataze 43 4.3.1.1. Utjecaj temperature na katalitičku aktivnost alkalne fosfataze 44 4.3.1.2. Utjecaj inhibitora na katalitičku aktivnost alkalne fosfataze 44 4.3.1.3. Utjecaj EDTA na katalitičku aktivnost alkalne fosfataze 45

4.4. Acetilkolin-esteraza (EC 3.1.1.7) 50 4.4.1. Odreñivanje Km i Vmax za acetilkolin 51

5. IZOLACIJA PLAZMIDNE DNA IZ TRANSFORMIRANIH BAKTERIJA 58 5.1. Elektroforeza nukleinskih kiselina na agaroznom gelu 61 5.2. Spektrofotometrijsko odreñivanje koncentracije DNA u otopini 62 6. ISPITIVANJE CITOTOKSIČNOSTI MTT TESTOM 65 7. ODREðIVANJE BRZINE GLIKOLIZE U STANICI 69 7.1. Pripremanje uzoraka tkiva jetre i mozga 70 7.2. Praćenje tijeka glikolize u različitim uvjetima 70 7.2.1. Odreñivanje koncentracije glukoze 73 8. ODREðIVANJE KONCENTRACIJE TIOLNIH SKUPINA I GLUTATIONA 77 8.1. Odreñivanje koncentracije tiolnih skupina 78 8.2. Odreñivanje koncentracije glutationa 80

IME I PREZIME _________________________________________________________ SKUPINA _________________________________________________________ GODINA _________________________________________________________

1

1. HOMOGENIZIRANJE TKIVA I RAZDVAJANJE STANIČNIH ORGANELA DIFERENCIJALNIM CENTRIFUGIRANJEM UVOD Metaboličke funkcije stanice mogu se ispitivati korištenjem histokemijskih metoda za utvrñivanje staničnih dijelova koji sadrže visoku katalitičku aktivnost enzima. Ovakav je pristup djelomično ograničen, pa se zato češće provodi odjeljivanje staničnih organela, a zatim ispitivanje osobina izoliranih sastojaka.

Homogeniziranje: Uzorak tkiva mehanički se homogenizira primjenom različitih homogenizatora, pri čemu stanične membrane pucaju i sadržaj se oslobaña u okolinu. Pažljivim kontroliranjem uvjeta homogeniziranja moguće je izbjeći oštećenja staničnih organela. Pojedine organele se zatim mogu razdvojiti diferencijalnim taloženjem tijekom centrifugiranja. Čitav se postupak izvodi na temperaturi od 4°C kako bi se izbjegao gubitak aktivnosti enzima.

Centrifugiranje: Nakon homogeniziranja, suspenzija se diferencijalnim centrifugiranjem (pri različitim brzinama odnosno gravitacijskim silama) razdvaja u pojedine frakcije. Stanične organele se talože brzinom koja prvenstveno ovisi o njihovoj masi, ali i o veličini, odnosno gustoći. Uvjeti razdvajanja (pufer, gustoća medija, brzina i trajanje centrifugiranja) ovise o sadržaju ispitivanog uzorka. Neki enzimi su smješteni isključivo u jednom staničnom odjeljku, te se koriste za provjeravanje “čistoće” preparata odreñenih staničnih organela. Takvi su enzimi poznati kao enzimi-biljezi. Tablica sadrži izbor enzima-biljega: FRAKCIJA ENZIMI-BILJEZI mitohondriji glutamat-dehidrogenaza

sukcinat-dehidrogenaza lizosomi

kisela fosfataza

mikrosomi citosol

glukoza-6-fosfataza laktat-dehidrogenaza

___________________________________________________________________________

2

1.1. DIFERENCIJALNO CENTRIFUGIRANJE Zadatak: Diferencijalnim centrifugiranjem (diferencijalnim taloženjem) razdvojiti homogenat jetrenog tkiva na stanične frakcije i odrediti koju staničnu frakciju predstavlja vaš uzorak. Načelo:

Uzorak tkiva mehanički se homogenizira primjenom homogenizatora, pri čemu se

razaraju stanične membrane te se stanični sadržaj oslobaña u okolinu. Pri različitim brzinama centrifugiranja stanične organele se talože i razdvajaju u stanične frakcije ovisno o njihovoj masi, ali i o veličini, odnosno gustoći. Reagensi: 1. 0,14 mol/L otopina kalijevog klorida Postupak: Jetreno se tkivo neposredno nakon žrtvovanja životinje homogenizira u ultra-turrax T25 metalnom homogenizatoru s 0,14 mol/L otopinom kalijevog klorida (razrjeñenje 1:5) dva puta po 30 sekundi uz 12000 okretaja tučka u minuti. Razdjeljivanje staničnih sastojaka homogenata izvršit će se diferencijalnim centrifugiranjem u rashladnoj centrifugi na sljedeći način:

a) Homogenat se centrifugira 5 minuta uz 500 g. Odlije se nadsloj, a na dnu epruvete zaostaje talog jezgara, nerazorenih stanica i dijelova staničnih membrana. Talog se razmuti u 0,14 mol/L otopini kalijevog klorida u omjeru 1:5 i oprezno homogenizira Potter-Elvehjemovim teflonskim homogenizatorom. Ta suspenzija predstavlja frakciju staničnih jezgara.

b) Nadsloj se centrifugira 10 minuta uz 8000 g. Odlije se bistra tekućina koja sadrži mikrosome i citosol. Talog, koji sadrži mitohondrije, razmuti se u 0,14 mol/L otopini kalijevog klorida u omjeru 1:5 i oprezno homogenizira. Nastala smjesa predstavlja frakciju mitohondrija.

c) Nadsloj se centrifugira 30 minuta uz 16000 g. Odlije se nadsloj koji predstavlja frakciju citosola, a u talogu ostaje frakcija mikrosoma. 1.2. ODREðIVANJE KONCENTRACIJE DEOKSIRIBONUKLEINSKE KISELINE (DNA) Zadatak: Odrediti koncentraciju deoksiribonukleinske kiseline (DNA) u pojedinim staničnim frakcijama, pripravljenim diferencijalnim centrifugiranjem (diferencijalnim taloženjem).

3

Načelo: Na 95°C, u uvjetima niskog pH, hidrolizom DNA oslobaña se deoksiriboza. U reakciji

deoksiriboze s difenilaminskim reagensom stvara se produkt kojem se mjeri apsorbancija na 595 nm.

Reagensi: 1. 1 mol/L otopina perklorne kiseline 2. difenilaminski reagens

1 g difenilamina otopi se u 100 mL ledene octene kiseline i oprezno doda 2,5 mL koncentrirane sumporne kiseline. Reagens se pripravlja neposredno prije upotrebe.

3. standardna otopina DNA 0,5 g/L Za pripremu standardne otopine DNA 50 mg DNA otopi se u 100 mL 1 mol/L perklorne kiseline. Miješanjem različitih volumena (0-1 mL) standardne otopine DNA i 1 mol/L perklorne kiseline pripravi se niz radnih otopina DNA konačnog volumena 1 mL za konstruiranje baždarnog dijagrama u koncentracijskom području od 0,05 do 0,5 mg/mL.

Postupak: U niz epruveta otpipetira se po 0,5 mL uzorka (homogenata, frakcije jezgara, frakcije mitohondrija ili frakcije citosola), te 0,5 mL 1 mol/L perklorne kiseline za slijepu probu. U sve se epruvete doda po 0,5 mL destilirane vode, te 2 mL difenilaminskog reagensa. Epruvete se stave u vrijuću vodenu kupelj i reakcija provodi 20 minuta. Epruvete se ohlade i izmjeri apsorbancija prema slijepoj probi pri 595 nm. Masena koncentracija DNA u uzorku očita se iz baždarnog dijagrama. 1.3. ODREðIVANJE KONCENTRACIJE LAKTATA Zadatak: Odrediti koncentraciju laktata u pojedinim staničnim frakcijama, pripravljenim diferencijalnim centrifugiranjem (diferencijalnim taloženjem). Načelo:

Proteini iz uzorka se istalože trikloroctenom kiselinom. Nakon centrifugiranja u nadsloju zaostaju spojevi koji mogu ometati odreñivanje koncentracije laktata. Ovi se spojevi uklone taloženjem s bakrenim sulfatom i kalcijevim hidroksidom. Konačno, u pročišćenom uzorku sumporna kiselina prevodi mliječnu kiselinu (laktat) u acetaldehid, koji u prisutnosti Cu2+ iona reagira s p-hidroksifenilom, dajući ružičasto obojeni kompleks koji maksimalno apsorbira svjetlo valne duljine od 570 nm.

4

Reagensi: 1. 0,612 mol/L (10%) otopina trikloroctene kiseline 2. 0,801 mol/L (20%) otopina bakrovog sulfata (CuSO4) 3. 0,04 mol/L (1%) otopina CuSO4 4. bezvodni kalcijev hidroksid 5. koncentrirana sumporna kiselina 6. p-hidroksidifenilni reagens

Uz miješanje i zagrijavanje otopi se 500 mg p-hidroksidifenila u 5 mL 1,25 mol/L (5%) otopine natrijevog hidroksida i dopuni redestiliranom vodom do 150 mL. Ako se čuva u smeñoj boci u hladioniku otopina je stabilna nekoliko mjeseci.

7. 3,71 mmol/L (100 mg%) matična otopina bezvodnog litijevog laktata 106,5 mg bezvodnog litijevog laktata otopi se u 10 mL redestilirane vode, doda 0,5 mL koncentrirane sumporne kiseline i razrijedi redestiliranom vodom do 100 mL. Ako se čuva u hladioniku koncentracija se ne mijenja mjesecima. Od matičnog standarda pripravljaju se radni standardi (0,551, 1,117, 2,775 i 5,55 mmol/L, tj. 5, 10, 25 i 50 mg% mliječna kiselina).

Postupak: 1 mL homogenata ili frakcije jezgara, mitohondrija ili citosola razrijedi se vodom u omjeru 1:5 i pomiješa s 1 mL trikloroctene kiseline. Nakon 10 minuta otopina se centrifugira 10 minuta uz 3000 okretaja u minuti*. 1,5 mL bistrog nadsloja pomiješa se s 0,2 mL 0,801 mol/L (20%) otopine CuSO4, doda 200 mg bezvodnog kalcijevog hidroksida i snažno promiješa, te nakon 5 minuta centrifugira 10 minuta uz 2500 okretaja u minuti. U konačni postupak se uzima 0,5 mL bistre tekućine odnosno 0,5 mL redestilirane vode za slijepu probu, te se dodaje po 1 kap 0,04 mol/L (1%) otopine CuSO4 i 3 mL hladne koncentrirane sumporne kiseline, uz polagano miješanje. Sadržaj u epruvetama grije se 4 minute u vrijućoj vodenoj kupelji, ohladi pod tekućom vodom i oprezno se dodaje 0,1 mL p-hidroksifenila na površinu kiseline. Sadržaj u epruveti se u početku taloži, a uz blago protresivanje talog se ponovno otopi. Uzorci se drže na sobnoj temperaturi 30 minuta uz povremeno protresivanje, a zatim se griju točno 90 sekundi u vrijućoj vodenoj kupelji, ohlade i izmjeri se apsorbancija prema slijepoj probi pri 570 nm. Za izradu baždarnog dijagrama koristi se 1 mL radnog standarda mliječne kiseline u koncentracijama 0,551, 1,117, 2,775 ili 5,55 mmol/L, tj. 5, 10, 25 ili 50 mg%. Koncentracija mliječne kiseline u uzorku očita se iz baždarnog dijagrama. * Broj okretaja u minuti je prilagoñen centrifugi TEHTNICA, na Zavodu za medicinsku biokemiju i hematologiju.

5

1.4. ODREðIVANJE KATALITI ČKE AKTIVNOSTI SUKCINAT -DEHIDROGENAZE Zadatak:

Odrediti katalitičku aktivnost sukcinat-dehidrogenaze uz upotrebu metilenskog modrila kao krajnjeg akceptora elektrona. Načelo: Neke su boje, kao što je metilensko modrilo (MB), obojene samo u oksidiranom obliku, a postaju bezbojne u reduciranom obliku (Slika 1.). Pojedine od njih mogu izravno reagirati s biološkim oksido-redukcijskim sustavima, pa tijek reakcije oksidacije pratimo vizualno ili spektrofotometrijskim mjerenjem nestanka obojenja. Ovaj sustav oponaša respiratorni lanac u stanicama tkiva, gdje je kisik krajnji akceptor elektrona.

Slika 1. Reakcija redukcije metilenskog modrila (MB). Reducirani se oblik spontano i vrlo brzo reoksidira stajanjem na zraku. Zbog toga, kod odreñivanja katalitičke aktivnosti sukcinat-dehidrogenaze, kisik treba isključiti iz sustava kako bi se spriječila spontana reoksidacija metilenskog modrila. Dehidrogenaze koje sudjeluju u respiratornom lancu kataliziraju prijenos elektrona sa supstrata na koenzime NAD+ ili NADP+ odnosno prostetičke skupine FMN ili FAD kao primarne akceptore. Bilo da su elektroni preneseni na NAD+, NADP+ ili na flavinske nukleotide, sljedeći korak je prijenos elektrona na metilensko modrilo (Slika 2.).

Slika 2. Reakcija redukcije metilenskog modrila (MB) staničnim dehidrogenazama.

6

Uobičajeni biokemijski potencijal je takav da je tijek elektrona usmjeren od nižeg potencijala prema višem, tj. od negativnog (-) prema pozitivnom (+). To znači da će tvar u reduciranom obliku s negativnim ili manje pozitivnim potencijalom reducirati oksidirani oblik tvari s pozitivnijim potencijalom.

E’0 (NAD/NADH) = - 0,32 V E’0 (FMN/FMNH2) = - 0,12 V E’0 (MB/MBH) = + 0,01 V

NADH će stoga reducirati FMN, a NADH i FMNH2 će reducirati metilensko modrilo. Reagensi: 1. 0,1 mol/L fosfatni pufer, pH 7,4

Pomiješa se 400 mL 0,2 mol/L otopine natrijevog hidroksida i 500 mL 0,2 mol/L otopine primarnog fosfata (27,6 g NaH2PO4 x H2O u 1000 mL) i dopuni redestiliranom vodom na 1000 mL.

2. 0,2 mol/L natrijev sukcinat Otopi se 5,4 g natrijevog sukcinata x 6 H2O u 100 mL redestilirane vode i pH otopine podesi na 7,4.

3. 0,625 mmol/L (0,02%) otopina metilenskog modrila (MB) Postupak: OTOPINA DODATI

(mL) 0,1 mol/L fosfatni pufer, pH 7,4

0,5

0,2 mol/L natrijevog sukcinata 0,5 0,625 mmol/L otopina MB 0,2 stanična frakcija 0,4

Nakon dodatka svih reagensa, u epruvete se stavlja odgovarajuća stanična frakcija,

sadržaj se promiješa i nadsloji se parafinsko ulje (0,5 – 1 cm) tako da se onemogući dodir s kisikom iz zraka. Tijekom 30 minuta na 37°C prati se promjena obojenosti sadržaja u epruvetama i zabilježi se koliko je vremena proteklo do potpunog nestajanja boje. Sadržaj se zatim promućka, tako da se omogući dodir sa zrakom (kisikom), te se promatra da li će doći do reoksidacije metilenskog modrila odnosno do ponovnog obojenja otopine.

7

Pitanja: 1. Koji uvjeti moraju biti zadovoljeni tijekom obrade za dobivanje kvalitetnog tkivnog pripravka (homogenata ili stanične frakcije)? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

2. Objasnite ulogu enzima-biljega u procjeni čistoće izolirane stanične frakcije.

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

Rezultati: 1. U tablice upišite izmjerene apsorbancije uzoraka te koncentracije DNA i laktata, odnosno vrijeme proteklo do obezbojenja metilenskog modrila pod djelovanjem sukcinat-dehidrogenaze.

apsorbancija koncentracija DNA (µg/mL)

laktat (mg/100 mL)

obezbojenje vrijeme (minute) katalitička aktivnost sukcinat-dehidrogenaze

8

2. Na temelju dobivenih rezultata (DNA, laktat, sukcinat-dehidrogenaza) zaključite koju ste frakciju dobili kao uzorak i obrazložite svoj zaključak. ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

Literatura:

1. Lodish H, Berk A, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Bretscher A, Ploegh H, Matsudaira P. Molecular Cell Biology. New York: W. H. Freeman & Co.; 2008.

2. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Biochemistry. New York: W. H. Freeman and Co.; 2006.

3. Alberts B, Johnson A, Walter P, Lewis J. Molecular Biology of the Cell. New York and London: Garland Science; 2008.

4. Cooper GM, Hausman RE. The Cell - A Molecular Approach. Sunderland (MA): Sinauer Associates, Inc.; 2007.

9

2. IZOLACIJA STANI ČNIH MEMBRANA 2.1. SVOJSTVA MEMBRANA I OSOBITOSTI MEMBRANSKIH ENZ IMA Sve organele stanice, pa i sama stanica, obavijene su tankom elastičnom strukturom nazvanom membrana. Funkcije membrane su raznovrsne:

1. odjeljivanje stanice od okoline, 2. nadziranje prolaza tvari meñu staničnim odjeljcima, 3. komunikacija stanice s okolinom i/ili meñu stanicama, 4. kontrola tijeka informacija kemijskih i električnih signala. Membrane različitih organela i stanica se razlikuju i po strukturi i po funkciji, ali postoje i neke zajedničke karakteristike membrana svih stanica. Debljina membrana je približno 5-10 nm. Lipidi i proteini su glavni sastojci koji doprinose hidrofobnim i hidrofilnim interakcijama u strukturi membrane. Funkcija svake membrane odreñena je specifičnim proteinima koji ujedno uvjetuju asimetričnost strukture membrane.

Slika 3. Struktura stanične membrane. Od lipida su najviše zastupljeni fosfolipidi i kolesterol. Proteini

su asimetrično usañeni u lipidni dvosloj. Neki od njih su glikoproteini koji sadrže oligosaharidni lanac.

10

Membrana koja obavija stanicu naziva se stanična membrana (Slika 3.). Njezina temeljna struktura jest fosfolipidni dvosloj u koji su uklopljene molekule proteina. Od lipida su najviše zastupljeni fosfolipidi i kolesterol. Fosfolipidi i glikolipidi asimetrično su rasporeñeni u lipidnom dvosloju. Membranski su proteini razvrstani prema smještaju unutar membrane na: integralne (zalaze u lipidni dvosloj) i periferne (prijanjaju samo uz površinu membrane) (Slika 4.).

Slika 4. Tipovi povezanosti proteina i membrane. Proteini obilježeni brojkama 1, 2 i 4 su integralni

proteini, dok je brojkom 3 obilježen periferni protein. Integralni proteini mogu biti uklopljeni u lipidni dvosloj na nekoliko načina: protein 1 premošćuje membranu, protein 2 je potpuno unutar membrane, a protein 4 je usañen u membranu, ali je u dodiru s izvanmembranskom okolinom.

U postupcima izolacije staničnih membrana bitno je odrediti čistoću željene frakcije. U tu svrhu odreñuju se katalitičke aktivnosti enzima-biljega, tj. onih enzima koji su svojstveni isključivo staničnoj frakciji na koju smo usmjerili pozornost. Enzimi-biljezi stanične membrane su, meñu ostalim, alkalna fosfataza (AP), leucin-aminopeptidaza (LAP) i γ-glutamiltransferaza (γ-GT). U postupku izolacije membranskih enzima i proteina potrebno je prvenstveno oslabiti meñudjelovanja lipida i proteina, tj. protein treba učiniti topljivim . Za oslobañanje membranski vezanih proteina primjenjuju se posebni reagensi, primjerice detergenti (Slika 5). Osnovno djelovanje detergenta je interakcija s hidrofobnim i hidrofilnim djelovima proteina. Meñusobne interakcije molekula detergenata doprinose oslobañanju proteina iz lipidnog dvosloja. Proces djelovanja detergenata odvija se u 4 faze (Slika 6):

1. vezanje detergenta za membranu, 2. liza membrane, 3. solubilizacija membrane u obliku ternarnog kompleksa protein-lipid-detergent, 4. solubilizacija kompleksa protein-detergent i lipid-detergent.

Prema kemijskom sastavu detergenti se dijele na: 1. ionske (primjerice deoksikolat i saponin), 2. neionske (primjerice Tween i Triton koji su po svojem kemijskom sastavu polieteri).

11

Slika5. A) Strukture dvaju često upotrebljavanih detergenata: natrijev dodecilsulfat (SDS) i

Triton X-100. B) Presjek micele detergenta u vodi.

Slika 6. Solubiliziranje membranskih proteina. Detergent kida lipidni dvosloj dovodeći proteine u

otopinu kao komplekse protein-lipid-detergent.

A) B)

12

Stupanj čistoće frakcije koju želimo izolirati izražava se pomoću specifične aktivnosti enzima i faktora obogaćenja. Specifična aktivnost enzima definira se kao omjer ukupne katalitičke aktivnosti enzima (izražene u jedinicama aktivnosti, katal ili U) i koncentracije proteina u tom uzorku: katalitička aktivnost (U/mL)

specifična aktivnost (U/mg) = ---------------------------------------- koncentracija proteina (mg/mL) Faktor obogaćenja je omjer specifičnih aktivnosti enzima u dvjema frakcijama tijekom postupka pročišćavanja: specifična aktivnost enzima u frakciji (U/mg)

faktor obogaćenja = --------------------------------------------------------------- specifi čna aktivnost enzima u homogenatu (U/mg) Proteaze (tripsin, papain) kidaju peptidne veze membranskih proteina na odreñenim mjestima: tripsin na položaju lizina i arginina, a papain kida veze kiselih ili aromatskih aminokiselina. Djelovanje proteaza na aktivnost membranskih enzima je specifično: ono ovisi o položaju enzima u fosfolipidnom dvosloju, te o grañi samog enzima. Tako će u nekim slučajevima proteaze djelovati inhibitorno, dok kod drugih enzima može doći čak i do povećanja specifične aktivnosti. Zbog toga se proteaze upotrebljavaju u procesu izolacije membranskih proteina. Naravno, željeni protein (enzim) ne smije biti razgrañen i/ili inaktiviran proteolitičkim djelovanjem. Zadatak: Izolirati vezikule membrana četkaste prevlake tubula bubrega štakora. Ispitati učinak različitih detergenata na solubilizaciju i katalitičku aktivnost enzima. Odrediti specifičnu aktivnost te faktore obogaćenja za alkalnu fosfatazu i γγγγ-glutamiltransferazu u frakcijama prije i poslije obrade detergentima. Utvrditi djelovanje tripsina na katalitičke aktivnosti enzima. 2.2. IZOLACIJA VEZIKULA MEMBRANA ČETKASTE PREVLAKE PROKSIMALNIH TUBULA BUBREGA Načelo: Metoda za izolaciju vezikula membrana četkaste prevlake proksimalnih tubula bubrega temelji se na selektivnom taloženju membrana četkaste prevlake Mg2+ ionima. Reagensi: 1. 1 mol/L otopina MgCl2 2. 0,25%-tni tripsin 3. 2,5%-tni Tween-20

13

4. 2,5%-tni deoksikolat 5. 2,5%-tni saponin 6. test-paket za odreñivanje katalitičke aktivnosti alkalne fosfataze (p-nitrofenil fosfat, aminometil-propanol, NaOH, MgSO4, p-nitrofenol) 7. test-paket za odreñivanje katalitičke aktivnosti γ- glutamiltransferaze (Tris, γ-glutamil-p-nitroanilid, glicil-glicin, MgCl2, NaOH) 8. 18,5 mmol/L koncentrirana mravlja kiselina 9. 70 mg/L otopina Coomassie Brilliant Blue (CBB-G250) 10. pufer I 12 mmol/L Tris HCl, pH 7,4 5 mmol/L EGTA (etilen glikol-bis(β-aminoetil eter)-N,N,N’,N’-tetraoctena kiselina) 300 mmol/L manitol 11. pufer II 6 mmol/L Tris HCl, pH 7,4 2.5 mmol/L EGTA 150 mmol/L manitol 12. pufer III 5 mmol/L HEPES Tris, pH 7,0* 100 mmol/L KCl 300 mmol/L manitol Postupak: Životinje se žrtvuju uz anesteziju eterom, bubrezi se izvade, očiste od masnog tkiva, te se ukloni kapsula. Sve se provodi na 0°C, a bubrezi se do izrade narezaka bubrežne kore drže u fiziološkoj otopini. Bubrežna se kora pažljivo izreže mikrotomom (treba paziti da se ne zahvati tkivo bubrežne srži). Tkivo kore bubrega se usitni i prenese u 10 mL pufera I. 1. Uzorci se homogeniziraju ultra-turrax T25 metalnim homogenizatorom prema sljedećoj shemi: 1 minuta homogeniziranja, 2 minute stanke, 3 minute homogeniziranja. Nakon prvog jednominutnog homogeniziranja doda se 10 mL hladne redestilirane vode. 2. Doda se MgCl2 (1 mol/L) da ukupna koncentracija Mg2+ bude 12 mmol/L i ostaviti na hladnom 15 minuta. Homogenat zatim centrifugirati uz 2400 g (4500 rpm*) 15 minuta u rashladnoj centrifugi. 3. Nadsloj se odvoji, te se centrifugira uz 30000 g (16000 rpm*) 30 minuta. 4. Nadsloj se odlije, a talog razmuti u 5 mL pufera II i homogenizira u staklenom homogenizatoru s teflonskim tučkom. Potom se dolije još 5 mL pufera II i MgCl2 (1 mol/L) do ukupne koncentracije Mg2+ iona od 12 mmol/L. * HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselina)

14

5. Nakon 15 minuta stajanja na hladnom, obrañeni se homogenat centrifugira uz 2400 g (4500 rpm*) 15 minuta. Dobiveni talog se baci, a nadsloj centrifugira uz 30000 g (16000 rpm*) 30 minuta. 6. Nadsloj se odsiše, a dobiveni talog razmuti u 1-2 mL pufera III. Otopina membrana se propusti 10 puta kroz injekcijsku iglu (No. 19) kako bi se ubrzalo stvaranje vezikula. 7. Nakon 30 minuta stajanja na hladnom, otopina se centrifugira uz 30000 g (16000 rpm*) 30 minuta. Dobiveni talog, koji sadrži vezikule membrana četkaste prevlake proksimalnih tubula bubrega, se razmuti u 100-200 µL pufera III. 8. U neobrañenom uzorku membrana treba odrediti: 1) koncentraciju proteina, 2) katalitičku aktivnost alkalne fosfataze (AP), 3) katalitičku aktivnost γ-glutamiltransferaze (γ-GT). Postupci za navedena odreñivanja slijede u daljnjem tekstu. 9. S neobrañenim uzorkom membrana postupa se prema sljedećoj shemi: neobrañeni uzorak membrana

1. način 2. način

250 µL membrana + 200 µL tripsina 400 µL membrana + 100 µL detergenta

ostaviti 4 sata na 37°C

nakon toga odrediti: katalitičku aktivnost AP

katalitičku aktivnost γ-GT

ostaviti na ledu u plastičnim centrifugirkama 30 minuta,

uz povremeno miješanje

centrifugirati 60 minuta uz 3000 g (16000 rpm*), odvojiti nadsloj u drugu epruvetu,

talog otopiti u 500 µL pufera, uz miješanje na mješalici tijekom 15 minuta

nakon toga odrediti: u talogu

koncentraciju proteina katalitičku aktivnost AP

katalitičku aktivnost γ-GT u nadsloju

koncentraciju proteina katalitičku aktivnost AP

katalitičku aktivnost γ-GT

* Broj okretaja u minuti (rpm) je prilagoñen centrifugi MISTRAL 2L, na Zavodu za medicinsku biokemiju i hematologiju.

15

2.3. ODREðIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA Zadatak: Odrediti koncentracije proteina u neobrañenim uzorcima membrana, te u uzorcima membrana obrañenima detergentima i tripsinom. Načelo:

Vezanjem proteina boja Coomassie Brilliant Blue prelazi iz kationskog u anionski oblik koji ima maksimum apsorpcije na 595 nm. Porast apsorbancije na 595 nm je proporcionalan količini anionskog oblika boje, a time i koncentraciji proteina u uzorku. Reagensi: 1. koncentrirana mravlja kiselina 2. reagens

70 mg boje Coomassie Brilliant Blue (CBB G-250) otopiti u 50 mL etanola i miješati preko noći. Zatim dodati 100 mL 8,673 mol/L (85%) orto-fosfatne kiseline i 850 mL redestilirane vode, te reagens profiltrirati.

3. detergent 2,5%-tni deoksikolat, 2,5%-tni Tween-20 ili 2,5%-tni saponin. Postupak:

DODATI (mL)

P Sp1 (talog) Sp2 (nadsloj) uzorak

0,05

-

-

mravlja kiselina (1)

0,05

0,05

0,05

reagens (2)

2,50

2,50

2,50

redestilirana voda

-

0,05

0,04

detergent

-

-

0,01

Sadržaj epruvete dobro promiješati i nakon 15 minuta mjeriti apsorbanciju pri 595 nm. Koncentracija se očitava iz baždarnog dijagrama. Baždarni se dijagram priprema upotrebom standardne otopine albumina goveñeg seruma koncentracije 1 g/L.

16

2.4. ODREðIVANJE KATALITI ČKE AKTIVNOSTI ALKALNE FOSFATAZE Zadatak: Odrediti katalitičku aktivnost, specifičnu aktivnost te faktor obogaćenja za alkalnu fosfatazu u uzorcima membrana prije i nakon obrade detergentima i tripsinom. Načelo: Alkalna fosfataza katalizira hidrolizu monoestera fosfatne kiseline i alkohola u alkalnom mediju, pri pH>9. Metoda odreñivanja enzimske aktivnosti alkalne fosfataze (AP) temelji se na mjerenju brzine hidrolitičke razgradnje p-nitrofenilfosfata pri čemu se oslobaña p-nitrofenol. Reakcija se odvija kod pH 10,4 i u prisutnosti Mg2+ iona. Koncentracija p-nitrofenola nastalog u reakciji može se odrediti mjerenjem apsorbancije ovog spoja pri 405 nm. Intenzitet žućkastog obojenja direktno je proporcionalan koncentraciji osloboñenog produkta, odnosno katalitičkoj aktivnosti alkalne fosfataze. Rezultat se očitava iz baždarnog dijagrama. Reagensi: 1. 4,0 mmol/L otopina puferiranog supstrata p-nitrofenilfosfata

4,0 mmol/L otopina p-nitrofenilfosfata prireñuje se u 840 mmol/L aminometilpropanolskom puferu (AMP), pH 10,4. Otopina sadrži i 0,5 mmol/L MgSO4.

2. 50 mmol/L NaOH

17

Postupak: DODATI (mL) OTOPINA Sp P puferirani supstrat (1) (p-nitrofenilfosfat u AMP puferu s Mg2+)

0,5

0,5

predinkubacija na 30°C tijekom 5 minuta uzorak

-

0,05

inkubacija na 30°C tijekom 30 minuta; reakcija se prekida dodatkom NaOH (2)

5,0

5,0

uzorak 0,05 -

Mjeri se apsorbancija probe (P) prema slijepoj probi (Sp) pri 405 nm. Rezultat se očitava iz baždarnog dijagrama. 2.5. ODREðIVANJE KATALITI ČKE AKTIVNOSTI γγγγ-GLUTAMILTRANSFERAZE Zadatak: Odrediti katalitičku aktivnost, specifičnu aktivnost te faktor obogaćenja za γγγγ-glutamiltransferazu u uzorcima membrana prije i nakon obrade detergentima i tripsinom. Načelo: γ-glutamiltransferaza (γ-GT) katalizira prijenos γ-glutamil-skupine iz γ-glutamil-peptida na druge peptide ili aminokiseline. γ-glutamiltransferaza u ovom postupku katalizira razgradnju γ-glutamil-p-nitroanilida i prijenos γ-glutamila na glicil-glicin, oslobañajući p-nitroanilin. Fotometrijski se mjeri osloboñeni p-nitroanilin koji maksimalno apsorbira svjetlo pri 405 nm.

18

Reagensi: 1. 0,05 mol/L Tris HCl, pH 8,6 2. 2,9 mmol/L γ-glutamil-p-nitroanilid, 22 mmol/L glicil-glicin i 11 mmol/L magnezijev klorid (otopina supstrata)

249,6 mg γ-glutamil-p-nitroanilida, 872,4 mg glicil-glicina i 671,4 MgCl2 x 6 H2O otopi se uz stalno miješanje u 300 mL pufera (1) uz održavanje temperature izmeñu 50 i 60°C. Svježa otopina vrlo slabo apsorbira svjetlo. Mjereći prema vodi, otopina supstrata treba imati apsorbanciju od 0,05 do 0,06. Preporučljivo je pripravljati svakodnevno svježi supstrat, jer apsorbancija otopine vremenom raste.

3. 7,5 mmol/L natrijev hidroksid 7,5 mL 1 mol/L otopine NaOH razrijedi se na 1 L.

Postupak: DODATI (mL) OTOPINA P Sp1 Sp2 supstrat (2) (γ-glutamil-p-nitroanilid) redestilirana voda

1,0

-

-

1,0

1,0

-

predinkubacija na 37°C tijekom 3 minute

uzorak redestilirana voda

0,1 -

0,1 -

-

0,1

inkubacija na 37°C tijekom 45 minuta; reakcija se prekida dodatkom

NaOH (3)

5,0

5,0

5,0

Mjere se apsorbancije (P) probe, slijepe probe uzorka (Sp1) i slijepe probe reagensa (Sp2) pri 405 nm.

19

Račun: katalitička aktivnost enzima (U/L*) = [AP - (ASp1 + ASp2)] x 137 Faktor 137 izračunat je iz jednakosti: 106 x V 106 x 5,1 mL --------------------- = ---------------------------------------------------------- = 137 µmol L-1 min-1* ε405 x d x v x t 9900 cm-1 mol-1 L x 1 cm x 0,1 mL x 45 min 106 = faktor za preračunavanje mol L-1 u µmol L-1 V = ukupni volumen reakcijske smjese (5,1 mL) v = volumen uzorka u reakcijskoj smjesi (0,1 mL) ε405 = molarni apsorpcijski koeficijent p-nitroanilina (9900 cm-1 mol-1 L) d = debljina kivete (1 cm) t = vrijeme inkubacije (45 minuta) * U/L = µmol L-1 min-1 (internacionalna jedinica = aktivnost enzima koja katalizira pretvorbu 1 µmol supstrata u 1 µmol produkta tijekom 1 minute u standardiziranim uvjetima)

1 U/L = 16,67 nkat/L**

** kat/L = mol L-1 s-1 (katal = aktivnost enzima koja katalizira pretvorbu 1 mol supstrata u 1 mol produkta tijekom 1 sekunde u standardiziranim uvjetima)

20

Pitanja: 1. Objasnite karakteristike slijepih proba u postupku odreñivanja koncentracije proteina, te u postupku odreñivanja katalitičke aktivnosti γ-GT. ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

2. Što možete reći o utjecaju tripsina na katalitičku aktivnost AP i γ-GT? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

Rezultati: 1. Dobivene rezultate unesite u tablicu.

tripsin Tween-20 deoksikolat saponin konc. proteina (mg/mL)

katal. akt. AP (U/mL)

specif. akt. AP (U/mg)

faktor obogaćenja za AP

katal. akt. γ-GT (U/mL)

specif. akt. γ-GT (U/mg)

faktor obogaćenja za γ-GT

21

2. Koji detergent smatrate najboljim za solubilizaciju γ-GT, a koji za AP? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

Literatura:

1. Voet D, Voet JG. Biochemistry. John Wiley & Sons; 2004. 2. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Biochemistry. New York: W. H. Freeman and Co.;

2006. 3. Alberts B, Johnson A, Walter P, Lewis J. Molecular Biology of the Cell. New York

and London: Garland Science; 2008. 4. Lodish H, Berk A, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Bretscher A, Ploegh H,

Matsudaira P. Molecular Cell Biology. New York: W. H. Freeman & Co.; 2008.

22

3. ELEKTROFOREZA UVOD Mnoge biološki važne molekule, kao što su aminokiseline, peptidi, nukleotidi i nukleinske kiseline, sadrže kemijske skupine koje mogu ionizirati, te zato u otopini mogu biti u obliku kationa ili aniona. Molekule sličnog naboja, a različite molekularne mase, imaju različite omjere naboj/masa. To omogućava razdvajanje nabijenih molekula u otopini u električnom polju, što je osnovno načelo metode elektroforeze. Tijekom elektroforeze kationi putuju prema katodi (-), a anioni prema anodi (+), brzinom koja ovisi o ravnoteži izmeñu sile električnog polja i elektrostatičkih efekata izmeñu uzorka i medija. Uzorak se razrjeñuje u puferu za elektroforezu. Tok struje izmeñu elektroda stvaraju ioni pufera i uzorka u njemu. Električno polje isključuje se prije nego ioni uzorka stignu do elektroda. Nakon identifikacije različitim analitičkim postupcima uočavaju se komponente uzorka razdvojene elektroforezom u jasno odjeljenim zonama. Za elektroforezu se upotrebljavaju različiti tipovi nosača: papir, celuloza-acetat, škrobni gel, agar, agaroza i poliakrilamid. 3.1. RAZDVAJANJE AMINOKISELINA ELEKTROFOREZOM NA PA PIRU Zadatak: Provesti elektroforezu aminokiselina His, Asp i Lys svake zasebno, te smjese tih triju aminokiselina pri pH 8,6 i pH 3,0. Usporediti dobivene rezultate i objasniti ih. Načelo: Naboj molekula ovisi o kiselosti medija, što je osobito uočljivo kod aminokiselina (Slika 7.).

Slika 7. Naboj nekih aminokiselina pri pH 7,6.

23

Zbog toga se aminokiseline mogu razdvojiti elektroforezom. Položaj vrpce pojedine aminokiseline može se učiniti vidljivim, reakcijom s ninhidrinskim reagensom. Ninhidrin je jako oksidacijsko sredstvo koje reagira sa svim α-aminokiselinama. Ako je reakcija provedena u pH rasponu 4-8 nastaje ljubičasto obojenje (Slika 8.). Uz α-aminokiseline, reakcije daju i primarni amini i amonijak. Aminokiseline prolin i hidroksiprolin takoñer reagiraju s ninhidrinom, ali pri tome nastaje žuto obojenje. Reakcija je vrlo osjetljiva.

Slika 8. Reakcija α-aminokiselina s ninhidrinom. Reagensi: 1. 5 mmol/L aminokiseline (Asp, His, Lys i smjesa svih triju aminokiselina) u Tris acetatnom puferu, pH 7,6

2. 0,07 mol/L Tris acetatni pufer, pH 7,6 8,84 g Tris (Mr 121,14) otopi se u 1000 mL redestilirane vode i pH podesi koncentriranom octenom kiselinom na 7,6.

3. 0,04 mol/L veronalni pufer, pH 8,6 8,24 g natrijevog dietilbarbiturata (Mr 206) otopi se u 1000 mL redestilirane vode i pH podesi dodatkom koncentrirane HCl na 8,6.

4. 0,07 mol/L citratni pufer, pH 3,0 20,6 g natrijevog citrata x 2 H2O (Mr 294,1) otopi se u 1000 mL redestilirane vode i pH podesi dodatkom citratne kiseline (0,1 M) na 3,0.

5. ninhidrinski reagens 0,2 g ninhidrina otopi se u 100 mL acetona neposredno prije upotrebe. Postupak: Kadica za elektroforezu napuni se elektrodnim puferom (veronalni ili citratni). Četiri papirne trake namoče se u pufer, postave na most za elektroforezu, te se na svaku nanese po 10 µL uzorka (otopine pojedinih aminokiselina ili smjese aminokiselina). Elektroforeza se provodi tijekom 90 minuta uz napon 8 V/cm. Nakon završetka elektroforeze trake se osuše na 110°C. Aminokiseline su fiksirane na trakama. Pripremi se svježa otopina ninhidrina kojom se navlaže osušene trake. Kad aceton (koji se nalazi u ninhidrinskom reagensu) ishlapi, trake se stavljaju na 110°C dok se ne razvije boja.

24

3.2. ELEKTROFOREZA HEMOGLOBINA NA AGAR-GELU Zadatak: Provesti elektroforezu hemoglobina iz krvi čovjeka i različitih vrsta životinja na agar-gelu. Načelo: Naboj molekula ovisi o pH medija. Pri pH 6,5 molekule hemoglobina iz krvi čovjeka i različitih vrsta životinja su pozitivno (+) nabijene i kreću se prema katodi (-). Različita elektroforetska pokretljivost hemoglobina iz krvi čovjeka i različitih vrsta životinja upućuje na razlike u vrijednostima izoelektričnih točaka (pI) pojedinih molekula hemoglobina. Reagensi: 1. radni pufer: 0,035 mol/L fosfatni pufer, pH 6,5 100 mL 0,035 mol/L KH2PO4 pomiješa se s 39 mL 0,035 mol/L Na2HPO4. 2. 0,45 mol/L fosfatni pufer, pH 6,5 100 mL 0,045 mol/L KH2PO4 pomiješa se s 66 mL 0,045 mol/L Na2HPO4. 3. 2,171 mol/L (20%) otopina glicerola

Pomiješa se u epruveti 5 mL radnog pufera (0,035 mol/L fosfatni pufer, pH 6,5) s 1 mL glicerola (doda se na način da se odreže vršak nastavka za mikropipete; staničevinom se izvana pobriše nastavak). Epruveta se prekrije parafilmom i dobro se promućka sadržaj u epruveti.

4. agar 5. krv čovjeka i različitih vrsta životinja 6. EDTA (etilendiamintetraoctena kiselina) Postupak: 1. Priprava hemolizata eritrocita. 50-100 mL ljudske i/ili životinjske krvi se uzme uz antikoagulans EDTA (1 mg EDTA / 1 mL krvi). Eritrociti se istalože centrifugiranjem tijekom 10 minuta uz 3000 okretaja u minuti*, nadsloj (plazma) se odlije, nadomjesti se hladnom fiziološkom otopinom i ponovno centrifugira. Nakon dvokratnog ispiranja s hladnom fiziološkom otopinom i odlijevanja nadsloja, talogu eritrocita se dodaje hladna redestilirana voda (na 1 volumen stanica se dodaju 2 volumena hladne redestilirane vode). Tako pripremljena otopina se drži 30 minuta na -20 °C te se zatim centrifugira 15 minuta uz 3500 okretaja u minuti na +4°C. Nadsloj se razrijedi s redestiliranom vodom (na 1 volumen nadsloja se dodaju 2 volumena redestilirane vode), otopina se promiješa te se dobiveni hemolizat eritrocita spremi u hladionik (+4°C). * Broj okretaja u minuti je prilagoñen centrifugi Biofuge stratos, na Zavodu za medicinsku biokemiju i hematologiju.

25

2. Priprema agara. Za 20 mL 1%-tnog agara otopi se u Erlenmayerovoj tikvici 0,2 g agara u 18,4 mL vode, uz zagrijavanje. Kad se agar u potpunosti otopi, doda se 1,6 mL 0,45 mol/L fosfatnog pufera, pH 6,5. U kadicu za elektroforezu se postave pregrade kako bismo spriječili izlijevanje agara prije polimerizacije. Otopljeni agar se izlije u kadicu za elektroforezu. Postavi se „češalj“ oko 2 cm od ruba kako bi se napravile jažice za nanošenje uzoraka. Nakon oko 30 minuta oprezno se izvadi „češalj“. Gel je spreman za elektroforezu. 3. Nanošenje uzoraka. U jažice se mikropipetom unosi oko 10 µL uzorka (u maloj epruveti se pomiješa 2,5 µL otopine glicerola (3) s 10 µL hemolizata eritrocita iz različitih vrsta). U kadicu za elektroforezu se oprezno ulije radni pufer (1) kojim se prekrije gel. Kod pH radnog pufera (pH 6,5) se očekuje putovanje molekula hemoglobina prema katodi. 4. Elektroforeza. Elektrode se spoje s izvorom struje. Elektroforeza se provodi oko 1,5 sat (tj. dok se ne uoče razlike u brzini putovanja molekula hemoglobina različitih vrsta) uz jakost električnog polja od 35 V. Vrpce hemoglobina su vidljive zbog boje hema, pa je već tijekom elektroforeze moguće pratiti njihovo kretanje. Kod većine proteina to nije moguće, te je elektroforetski nosač potrebno uroniti u otopinu neke boje koja se specifično veže na proteine. 3.3. ELEKTROFOREZA HEMOGLOBINA NA SDS-POLIAKRILAMID NOM GELU (SDS-PAGE) Zadatak: Provesti elektroforezu hemoglobina iz krvi čovjeka i različitih vrsta životinja na SDS-poliakrilamidnom gelu. Načelo:

Proteini su nabijene molekule pri onim pH vrijednostima koje se razlikuju od njihove izoelektrične točke (pI). U električnom polju kreću se stoga ovisno o gustoći njihova naboja. Elektroforeza je izuzetna analitička i preparativna metoda koja može razlučiti i razdvojiti individualne komponente proteinske mješavine. Takvo se elektroforetsko razdvajanje danas uglavnom izvodi na različitim elektroforetskim nosačima, zbog smanjenja konvekcija i difuzija, kao što su agarni ili agarozni gel, gel celuloznog acetata ili poliakrilamidni gel. Visoka rezolucija elektroforeze na poliakrilamidnom gelu (PAGE) čini je metodom izbora za većinu primjena.

Postoji nekoliko elektroforetskih tehnika koje razdvajaju proteine na osnovi jednog ili kombinacije sljedećih svojstava: veličina, naboj i relativna hidrofobnost.

Elektroforeza u nativnim uvjetima koristi se za razdvajanje topljivih proteina koji pri tome sačuvaju biološku aktivnost. Kod elektroforeze u denaturirajućim uvjetima mogu se uspješno razdvajati manje topljivi proteini, ali oni nemaju više svoju biološku aktivnost. Posebno je važan postupak PAGE koji se provodi u prisutnosti anionskog detergenta, natrijevog dodecilsulfata (SDS), pri čemu se proteini elektroforetski razdvajaju na temelju svoje veličine (Slika 9.).

Poliakrilamidni gel nastaje kopolimerizacijom akrilamidnih monomera s umreživačkim agensom, najčešće N,N -metilenbisakrilamidom (Bis). Polimerizacija je

26

injicirana amonijevim persulfatom i N,N,N´,N´-tetrametiletilendiaminom (TEMED). Gel se priprema iziljevanjem odgovarajućih otopina za donji, a nakon njegove polimerizacije, izlijevanjem odgovarajućih otopina za gornji gel, izmeñu dva stakla smještena u kalupu za pripremu gela. Razmak izmeñu staklenih ploča odreñuje debljinu gela.

Anionski detergent SDS vrlo je efikasan solubilizirajući agens za veliki broj proteina. Većina proteina veže 1,4g SDS po 1g proteina, čime se maskira vlastiti naboj proteina, tako da omjer ukupnog naboja po masi postaje skoro konstantnim. U skladu s tim, elektroforetsko razdvajanje tih proteina ovisno je samo o efektivnom promjeru molekule, što se može grubo aproksimirati molekulskom masom.

Za optimalnu reakciju s SDS proteinski uzorak treba prokuhati 3-5 minuta u prisutnosti 2-5% (w/v) SDS i 0,1M 2-merkaptoetanola ili 20 mM ditiotreitola (DTT) da bi se pokidale disulfidne veze.

Slika 9. Razdvajanje mješavine makromolekula vertikalnom elektroforezom.

Najčešće korišteni puferski sustav za SDS-PAGE je Laemmlijev diskontinuirani puferski sustav. Prednost diskontinuiranog puferskog sustava je zbijanje proteinskog uzorka u usku startnu vrpcu prije samog postupka razdvajanja. Zbijanje uzorka u usku startnu vrpcu rezultat je kretanja proteinskog uzorka izmeñu brzog kloridnog iona (prisutan u donjem gelu) i tromog glicinskog iona (prisutan u gornjem gelu). Vrpce nastaju u gelu manje koncentracije s obzirom na poliakrilamid (gornji odnosno sabirni gel nižeg pH). Porast pH u razdvajajućem gelu potiče disocijaciju glicinata i povećava njegovu pokretljivost tako da se glicinat nalazi odmah iza vrpce kloridnog iona. Taj efekt zajedno sa smanjenjem veličina pora u donjem gelu potiče razdvajanje proteina prema njihovoj veličini.

Svaki SDS-PAGE se može kalibrirati nanošenjem proteina poznate molekularne mase i utvrñivanjem pripadne pokretljivosti. Pokretljivost je obrnuto proporcionalna logaritmu molekularne mase (Slika 10).

27

Slika 10. Odreñivanje molekularne mase utvrñivanjem relativne pokretljivosti tijekom SDS-PAGE. Reagensi: 1. 6x koncentriran pufer za nanošenje uzorka

0,375 M Tris HCl, pH 6,8, 12% SDS, 3% glicerol, 0,2% bromfenol plavilo, 12% ß-merkaptoetanol, u destiliranoj vodi

2. 4% sabirni gel 4% mješavina akrilamida (30% matična otopina koja se čuva na 4°C, zaštićena od svjetla), 25% pufer za sabijanje (0,5 M Tris HCl, pH 6,8, 10% SDS), 10% amonijev persulfat i 0,05% TEMED, u destiliranoj vodi

3. 13,5% razdvajajući gel 13,5% mješavina akrilamida (30% matična otopina koja se čuva na 4°C, zaštićena od svjetla), 25% pufer za razdvajanje (1,5 M Tris HCl, pH 8,8, 10% SDS), 10% amonijev persulfat i 0,05% TEMED, u destiliranoj vodi

4. pufer za elektroforezu 0,25 M Tris HCl, pH 8,3, 2 M glicin, 0,1% SDS

5. Coomassie plavilo R-250 otopina za bojanje proteina 0,1% Coomassie plavilo R-250, 40% metanol, 10% octena kiselina, u destiliranoj vodi 6. otopina za odbojavanje Coomassie plavila 40% metanol, 10% octena kiselina, u destiliranoj vodi Postupak:

Hemolizat eritrocita pripremi se kao u vježbi 3.2. U dijelu hemolizata odreñuje se koncentracija proteina, a u preostali se dio dodaje pufer za nanošenje uzorka (na 80 µL uzorka dodaje se 20 µL 6x koncentriranog pufera za nanošenje uzorka). Uzorci se zagrijavaju na 95˚C tijekom 5 minute, ohlade se na ledu i pohrane na -20˚C.

Nakon polimerizacije gelova za razdvajanje i sabiranje, u jažice se dodaju uzorci (15 µL) koji sadržavaju jednaku koncentraciju proteina (30 µg u svaku jažicu) i standard (komercijalna smjesa proteina za SDS-elektroforezu poznate molekularne mase), pomoću kojeg se može približno odrediti molekularna masa proteina. Elektroforeza se provodi u

28

puferu za elektroforezu tijekom 90 minuta, uz napon od 100 V. Nakon elektroforeze se bojaju gelovi u otopini za bojanje (5) tijekom 5-10 minuta uz miješanje. Gelovi se zatim odbojavaju (6) uz miješanje (barem 3 puta po 5 minuta uz promjenu otopine) i ostave se preko noći u destiliranoj vodi. Pitanja: 1. Zbog čega molekule hemoglobina čovjeka i različitih životinjskih vrsta pokazuju različitu elektroforetsku pokretljivost? Usporedite pokretljivost hemoglobina različitih životinja s pokretljivošću hemoglobina čovjeka. Što možete zaključiti o njihovom aminokiselinskom sastavu? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

2. pHi (pI) oksihemoglobina čovjeka je 6,87. Na temelju opažene pokretljivosti zaključite da li je pHi hemoglobina različitih životinja viši ili niži? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

3. Kakva će biti pokretljivost hemoglobina čovjeka kod pH 6,0, a kakva kod pH 7,0, u usporedbi s opaženom pokretljivošću? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

4. Kakva će biti pokretljivost mioglobina u odnosu na pokretljivost hemoglobina neke životinje, uz pretpostavku da imaju isti pHi? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

29

5. U prisutnosti ureje i SDS doći će do potpune denaturacije hemoglobina. Koliko će se vrpci dobiti elektroforezom u takvom “denaturirajućem” gelu? Da li će vrpce biti vidljive? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

Rezultati: 1. Napišite princip elektroforeze. ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

2. Nacrtajte agar-gel s razdvojenim vrpcama hemoglobina, te označite vrpce, start, elektrode i smjer putovanja u električnom polju.

30

3. Nacrtajte SDS-poliakrilamidni gel s razdvojenim vrpcama hemoglobina, te označite vrpce, start, elektrode i smjer putovanja u električnom polju. Naznačite koji je gel sabirni, a koji razdvajajući. Literatura:




31

4. KATALITI ČKA AKTIVNOST ENZIMA 4.1. KINETIKA ENZIMSKE REAKCIJE Michaelis i Menten su početkom ovog stoljeća analizirali kinetiku enzimske reakcije na temelju jednostavne pretpostavke da supstrat (S) može biti preveden u produkt (P) samo ako doñe u funkcionalni dodir s enzimom (E) stvorivši kompleks enzim-supstrat (ES) (Slika 11.).

Slika 11. Mihaelis-Mentenov prikaz nastajanja kompleksa enzim-supstrat (ES).

Model vrijedi za jednosupstratnu reakciju, a ES predstavlja sve oblike kompleksa, počevši od onog u kojem je supstrat nepromijenjen, preko svih meñustanja, do kompleksa enzim-produkt (EP). Model pretpostavlja mjerenje početne brzine enzimske reakcije (vo) pod uvjetima kada se povratna reakcija može zanemariti zbog toga što je [P] = 0 i/ili što je k-2<k2. U praksi se brzina reakcije mjeri nakon što se pomiješaju enzim i supstrat, te nakon što se uspostavi ustaljeno stanje, tj. stalna koncentracija kompleksa ES (Slika 12.). Ovisno o uvjetima, ustaljeno se stanje može dostići za samo nekoliko djelića sekunde, ali i mnogo kasnije.

Slika 12. Vremenski tijek enzimske reakcije. U prvim trenucima dolazi do zasićenja enzima supstratom, pa koncentracija ES raste. Ubrzo nastaje ustaljeno stanje u kojem je koncentracija ES konstantna, a produkt P nastaje stalnom brzinom vo. Nakon što se koncentracija supstrata značajnije promijeni, dolazi do smanjenja koncentracije ES, pa i do smanjenja brzine nastanka produkta. Mjerenja je potrebno načiniti pri ustaljenom stanju.

32

U uvjetima kada se može zanemariti povratna reakcija, početna brzina nastajanja produkta je proporcionalna koncentraciji kompleksa [ES]: vo = k2 [ES] (1) Najveća moguća brzina će se dostići u uvjetima kada sve molekule enzima budu u obliku kompleksa [ES]. Tu brzinu definiramo kao maksimalnu brzinu (Vmax). Vmax = k2 [Eo] (2) [Eo] označava početnu (ukupnu) koncentraciju enzima. Meñutim, kod svih je realnih koncentracija supstrata [ES] < [E], pa moramo izračunati [ES] da bismo mogli izraziti vo. [ES] nastaje u reakciji drugoga reda izmeñu E i S, pa je brzina njegovog nastajanja jednaka k1 [E] [S], gdje je [E] koncentracija slobodnog enzima, tj. [Eo] - [ES]. Dakle, [ES] nastaje brzinom k1 ([Eo] - [ES]) [S]. S druge strane, [ES] se razgrañuje u dvije reakcije prvoga reda disocirajući na E+S i pretvarajući se u E+P, pa je brzina razgradnje [ES] jednaka k-1 [ES] + k2 [ES], tj. (k-1 + k2) [ES]. U ustaljenom stanju koncentracija [ES] je stalna, što znači da [ES] nastaje istom brzinom kojom se i razgrañuje: k1 ([Eo] - [ES]) [S] = (k-1 + k2) [ES] (3) iz čega se može lako izračunati [ES]:

[Eo] [S] [ES] = -------------------------- (4)

(k-1 + k2) / k1 + [S]

Tri konstante mogu se skupiti u novu konstantu: (k-1 + k2) / k1 = Km (Michaelisova konstanta). Ukoliko uvrstimo jednadžbu brzine reakcije (1), te izrazimo k2 [Eo] kao Vmax (jednadžba 2), dobivamo Michaelis-Mentenovu jednadžbu:

Vmax [S] vo = ------------------ (5)

Km + [S] Ova jednadžba opisuje hiperbolu, u kojoj se vo postupno povećava s porastom koncentracije [S], dosegnuvši maksimalnu brzinu kod [S] = ∞ (Slika 13). Valja imati na umu da je Vmax, pa tako i vo, proporcionalna koncentraciji [E]. U slučaju kad je k-1 > k2 Michaelisova konstanta postaje Km = k-1 / k1 = Kd, tj. konstanta disocijacije kompleksa [ES], koja je mjerilo afiniteta enzima prema odreñenom supstratu. Rješenje jednadžbe (5) za vo = Vmax / 2 daje Km = [S], što znači da je Km numerički jednak onoj koncentraciji supstrata kod koje je brzina enzimske reakcije jednaka polovici maksimalne brzine.

33

Slika 13. Michaelis-Mentenov prikaz ovisnosti brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata (lijevo) i prikaz porasta koncentracije produkta s vremenom kod rastućih koncentracija supstrata od S1 do S6 (desno). Da bismo izračunali katalitičku konstantu k2 = Vmax / [Eo] potrebno je poznavati molarnu koncentraciju enzima. To je moguće samo ukoliko imamo čisti enzim i znamo mu Mr. Zadatak kinetičkog mjerenja je odrediti Km i Vmax. Niti jedno niti drugo se ne može precizno odrediti iz prikaza na slici 13. Postoje mnogo prikladniji linearni prikazi, dobiveni transformacijama jednadžbe (5). Dvostruko recipročni oblik te jednadžbe je jednadžba Lineweaver-Burk (Slika 14 A):

1 Km 1 1 ---- = ----------- x ------ + ---------- (6) vo Vmax [S] Vmax

Množenjem ove jednadžbe s vo x Vmax dobiva se jednadžba Eadie-Hofstee (Slika 14 B):

vo vo = Km ------ + Vmax (7)

[S] a množenjem s [S] jednadžba Hanes-Woolf (Slika 14 C):

[S] Km [S] ------ = -------- + --------- (8) vo Vmax Vmax

34

Slika 14. Grafičko odreñivanje Km i Vmax pomoću tri linearna prikaza: (A) Lineweaver-Burkov, (B) Eadie-Hofsteeov i (C) Hanes-Woolfov. Vrlo je koristan grafički način odreñivanja Km i Vmax metodom Eisenthal Cornish-Bowden (Slika 15):

Vmax = vo + Km vo / [S] Za grafički prikaz nije potrebno nikakvo računanje, a lako je prepoznati kriva mjerenja jer daju pravce daleko od zajedničkog sjecišta.

Slika 15. Grafičko odreñivanje Vmax i Km metodom Eisenthal Cornish-Bowden. Za svako mjerenje nanosi se vrijednost -[S] na os Km i vrijednost v na os Vmax. Povuče se pravac kroz svaki par točaka. Km i Vmax su koordinate sjecišta pravaca.

35

4.2. UREAZA (EC 3.5.1.5) Ureaza (ureja amidohidrolaza) je vrlo aktivan i u potpunosti specifičan enzim koji katalizira hidrolizu ureje (Slika 16).

O H2N - C - NH2 + 3 H2O CO2 + 2 NH4OH Slika 16. Hidrolizom ureje djelovanjem ureaze nastaju ugljični dioksid i amonijak.

Ureaza se nalazi u gljivama, rakovima, puževima, te u mnogim višim biljkama. To je prvi enzim prireñen u kristalnom stanju (1926. godine). Molekularna masa ureaze izolirane iz soje iznosi 483000, a sastoji se od 6 jednakih strukturnih podjedinica. Aktivni centar čine tri ili četiri slobodne sulfhidrilne (-SH) skupine koje se mogu reverzibilno i ireverzibilno inhibirati. Inhibitori ureaze su ioni žive, srebra, bakra, kao i fenil-merkurijev acetat, pa čak i ioni natrija i kalija. Anorganski fosfat je aktivator ureaze.

Iz literaturnih navoda je poznat niz postupka za odreñivanje katalitičke aktivnosti ureaze. Najčešće su to titrimetrijska mjerenja količine nastalog amonijaka, dok drugi postupci uključuju još manometrijske, kolorimetrijske, potenciometrijske metode i pH-metrijska mjerenja. U kliničkim se laboratorijima ureaza koristi kao katalizator za kvantitativno odreñivanje ureje (nastali amonijak se može titrirati i mjera je količine ureje u krvi ili u mokraći). Zadatak:

Odrediti brzinu hidrolize ureje ureazom. Ispitati utjecaj temperature i pH te utjecaj cisteina i fenil-merkurijevog acetata na aktivnost ureaze. Načelo:

Ureja se hidrolizira ureazom, a nastali amonijak se titrira otopinom kloridne kiseline uz metilensko modrilo kao indikator do pojave ružičasto-crvene boje. Brzina hidrolize ureje se izračunava na temelju utroška kloridne kiseline. 4.2.1. ODREðIVANJE KATALITI ČKE AKTIVNOSTI UREAZE Reagensi: 1. 0,05 mol/L Tris pufer, pH 7,2

Pomiješa se 215 mL 0,2 mol/L HCl i 250 mL 0,2 mol/L otopine Tris hidroksimetil-aminometana (24,2 g/L) i dopuni do 1000 mL.

ureaza

36

2. 0,04 mol/L citratni pufer, pH 4,0 Pomiješa se 33 mL 0,1 mol/L limunske kiseline i 17 mL 0,1 mol/L natrijevog citrata i dopuni redestiliranom vodom do 100 mL.

3. 0,067 mol/L fosfatni pufer, pH 6,6 Pomiješa se 62 mL 0,067 mol/L KH2PO4 i 38 mL 0,67 mol/L Na2HPO4.

4. 0,067 mol/L fosfatni pufer, pH 7,8 Pomiješa se 8,6 mL 0,067 mol/L KH2PO4 i 91,4 mL 0,67 mol/L Na2HPO4.

5. 2 mol/L glicinski pufer, pH 10,0 Pomiješa se 38,1 mL 2 mol/L otopine glicina i 50 mL 11 mol/L NaOH i nadopuni redestiliranom vodom do 1000 mL.

6. 0,3 mol/L otopina ureje (supstrat) u odgovarajućem puferu 18 g ureje otopi se u 1000 mL pufera (reagensi: 1, 2, 3, 4 i 5). U svakom pojedinom puferu prireñuje se odgovarajuća otopina supstrata (0,3 mol/L ureja).

7. otopina ureaze Otopi se 200 mg čistog preparata ureaze (aktivnost 20 IJ/mg) u 100 mL 0,05 mol/L Tris pufera, pH 7,2.

8. 0,05 mol/L HCl 9. 1,48 mmol/L (0,04%) otopina metilenskog crvenila u alkoholu 10. 0,037 mol/L (1%) otopina živinog (II) klorida (HgCl2) 11. 1 mmol/L otopina fenil-merkurijevog acetata Otopi se 33,7 mg fenil-merkurijevog acetata u 100 mL redestilirane vode. 12. 10 mmol/L otopina cisteina Otopi se 158 mg cisteinskog hidroklorida u 100 mL redestilirane vode. 13. 1 mol/L otopina natrijevog klorida Otopi se 5,85 g NaCl u 100 mL redestilirane vode. 14. 1 mol/L otopina amonijevog hidrogenfosfata [(NH4)2HPO4] Otopi se 13,21 g (NH4)2HPO4 u 100 mL redestilirane vode. 15. 1,48 mmol/L (0,04 %) otopina metilenskog crvenila u alkoholu Postupak: U epruvetu za slijepu probu stave se svi reagensi, 2 kapi otopine živinog (II) klorida i konačno otopina ureaze. Ostale epruvete obrañuju se prema odgovarajućoj shemi. Enzimska reakcija se prekida dodatkom 2 kapi otopine živinog (II) klorida (potrebno je dobro promiješati otopinu). Iz svake se epruvete uzima po 5 mL u Erlenmayerovu tikvicu, doda se 1-2 kapi metilenskog crvenila kao indikatora i titrira nastali amonijak otopinom kloridne kiseline do pojave ružičasto-crvene boje (tj. dok otopina, koja je inače zelenkaste boje, ne poprimi ujednačeno crvenkastu boju). Na temelju utroška 0,05 mol/L HCl izračunava se brzina hidrolize ureje (µmol/min).

37

Račun: (VP - VSp) x [HCl] x 1000 Vreakcijske smjese brzina reakcije = --------------------------------- x -------------------- (µmol/min) tinkubacije x 2 Vtitranda

VP = volumen utrošen za titraciju uzorka VSp = volumen utrošen za titraciju slijepe probe [HCl] = 0,05 mol/L Vreakcijske smjese = 6,5 mL tinkubacije = 15 minuta Vtitranda = 5 mL 4.2.1.1. Utjecaj natrijevih iona i anorganskog fosfata na katalitičku aktivnost ureaze DODATI (mL) OTOPINA Sp1 P1 P2 P3 Tris pufer

2,5

2,5

2,5

2,5

redestilirana voda 1,0 1,0 - - NaCl - - 1,0 - (NH4)2HPO4 - - - 1,0 ureaza - 0,5 0,5 0,5 ureja 2,5 2,5 2,5 2,5 HgCl2 (kapi)

2 - - -

inkubacija na 37°C tijekom 15 minuta

HgCl2 (kapi)

-

2

2

2

ureaza

0,5 - - -

Napomena: Poslije svakog postupka dobro oprati suñe zbog zaostalih Hg2+ iona! 4.2.1.2. Utjecaj temperature na katalitičku aktivnost ureaze Postupak: Priprave se 3 slijepe probe (Sp1) i 3 probe 1 (P1) kao u vježbi 4.2.1.1. Po jedna slijepa proba i po jedna proba drže se na sljedećim temperaturama: na sobnoj temperaturi, na 37°C (vježba 4.2.1.1) i na 60°C. Nakon 15 minuta prekida se djelovanje ureaze dodatkom 2 kapi HgCl2. Titracijom 5 mL otopine odredi se brzina hidrolize ureje.

38

4.2.1.3. Utjecaj pH na katalitičku aktivnost ureaze Postupak: U epruvetu za slijepu probu stave se svi reagensi, 2 kapi otopine živinog (II) klorida i konačno otopina ureaze. Ostale epruvete obrañuju se prema dolje navedenoj shemi. Enzimska reakcija se prekida dadatkom 2 kapi otopine živinog (II) klorida. Iz svake epruvete uzima se po 5 mL i titrira otopinom kloridne kiseline uz metilensko crvenilo kao indikator. Na temelju utroška 0,05 mol/L HCl izračunava se brzina hidrolize ureje. DODATI (mL) OTOPINA Sp1, Sp2, Sp3, Sp4, Sp5 P1, P2, P3, P4, P5 pufer (1, 2, 3, 4 i 5)

2,5

2,5

redestilirana voda 1,0 1,0 ureaza

- 0,5

predinkubacija na 37°C tijekom 10 minuta otopina ureje u odgovarajućem puferu (1, 2, 3, 4 i 5)

2,5

2,5

inkubacija na 37°C tijekom 15 minuta HgCl2 (kapi)

2

2

ureaza 0,5 -

39

4.2.1.4. Aktivacija i inaktivacija ureaze DODATI (mL) OTOPINA SP P1 P2 Tris pufer

2,5

2,5

2,5

redestilirana voda 0,5 0,5 - cistein - - 0,5 fenil-merkurijev acetat - 0,5 0,5 ureaza -

0,5 0,5

predinkubacija na 37°C tijekom 10 minuta

ureja (u Tris puferu)

2,5

2,5

2,5

inkubacija na 37°C tijekom 15 minuta

HgCl2 (kapi)

2

2

2

ureaza 0,5

- -

Pitanja: 1. Objasnite pojam reverzibilne inaktivacije.

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

2. Koju funkciju ima cistein u ispitivanoj reakciji (vježba 4.2.1.4)?

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

40

Rezultati: 1. U tablicu upišite izračunatu brzinu hidrolize ureje.

brzina hidrolize ureje (µmol/min)

vježba 4.2.1.1. P1 P2 P3

vježba 4.2.1.2. P1 P2 P3

vježba 4.2.1.3. P1 P2 P3 P4 P5

vježba 4.2.1.4. P1 P1

2. Objasnite rezultate postignute inkubacijom kod različitih temperatura i nacrtajte graf (vježba 4.2.1.2).

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

41

3. Objasnite utjecaj pH na katalitičku aktivnost ureaze i nacrtajte graf (vježba 4.2.1.3). ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

42

4.3. ALKALNA FOSFATAZA (EC 3.1.3.1) Fosfataze (ortofosfat-monoester-fosfohidrolaze) su enzimi iz skupine hidrolaza koji razgrañuju organske monoestere fosfatne kiseline na odgovarajući alkohol i fosfat (Slika 17).

Slika 17. Hidroliza organskih monoestera fosforne kiseline na odgovarajući alkohol i fosfat fosfatazama. Pod nazivom alkalna fosfataza podrazumijeva se skupina enzima s optimumom aktivnosti u alkalnom području (pH 9,8-10,5). Većina podataka o strukturi ovog enzima dobivena je u eksperimentima s pročišćenim enzimom iz bakterije Escherichia coli. Alkalna fosfataza E. coli je dimer, a svaka podjedinica sadrži Zn. Djelovanjem fenilalanina, ureje ili gvanidina te kraćim zagrijavanjem na visokoj temperaturi, dimer disocira na dva monomera koji pri tome gube Zn, što ima za posljedicu gubitak enzimske aktivnosti. Mg se smatra aktivatorom fosfataza i stabilizatorom molekule enzima. Kompleksoni (primjerice EDTA) vežu Zn i Mg te na taj način inaktiviraju enzim. Na temelju eksperimentalnih podataka dobivenih u vježbama 4.3.1, 4.3.1.1, 4.3.1.2. i 4.3.1.3. moći ćemo odrediti neka svojstva i karakteristike alkalne fosfataze. Zadatak:

Odrediti katalitičku aktivnost alkalne fosfataze u serumu čovjeka. Ispitati utjecaj temperature, ureje, fenilalanina i EDTA na katalitičku aktivnost alkalne fosfataze. Načelo: Alkalna fosfataza katalizira hidrolitičku razgradnju p-nitrofenilfosfata, pri čemu se oslobaña p-nitrofenol, koji se u alkalnim uvjetima pretvara u 4-nitrofenoksidni ion (Slika 18). Reakcija se odvija kod pH 10,4 i u prisutnosti Mg2+ iona. Akceptor fosfata je 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP). Koncentracija p-nitrofenola nastalog u reakciji može se odrediti mjerenjem apsorbancije ovog spoja pri 405 nm. Intenzitet žućkastog obojenja direktno je proporcionalan koncentraciji osloboñenog produkta odnosno katalitičkoj aktivnosti alkalne fosfataze.

Slika 18. Hidroliza p-nitrofenilfosfata alkalnom fosfatazom (AP).

43

Reagensi: 1. 4,0 mmol/L otopina puferiranog supstrata p-nitrofenilfosfata

4,0 mmol/L otopina p-nitrofenilfosfata prireñuje se u 840 mmol/L aminometilpropanolskom puferu (AMP), pH 10,4. Otopina sadrži i 0,5 mmol/L MgSO4.

2. 50 mmol/L NaOH 3. 3 mol/L ureja 4. 5 mmol/L fenilalanin 5. otopina puferiranog supstrata bez magnezijevog sulfata 6. 0,5 mmol/L EDTA 4.3.1. ODREðIVANJE KATALITI ČKE AKTIVNOSTI ALKALNE FOSFATAZE

Postupak: DODATI (mL) OTOPINA Sp P puferirani supstrat (1) (p-nitrofenilfosfat u AMP puferu s Mg2+)

0,5

0,5

predinkubacija na 30°C tijekom 5 minuta uzorak

-

0,05

inkubacija na 30°C tijekom 30 minuta; reakcija se prekida dodatkom NaOH

5,0

5,0

uzorak 0,05 -

Mjeri se apsorbancija probe (P) prema slijepoj probi (Sp) pri 405 nm. Rezultat se očitava iz baždarnog dijagrama.

44

4.3.1.1. Utjecaj temperature na katalitičku aktivnost alkalne fosfataze Postupak:

Priprave se 3 slijepe probe (Sp) i 3 probe (P) kao u vježbi 4.3.1. Po jedna slijepa proba i po jedna proba inkubiraju se na sljedećim temperaturama: na sobnoj temperaturi, na 30°°°°C (vježba 4.3.1) i na 60°°°°C tijekom 30 minuta. Reakcija se prekida dodatkom 5 mL NaOH. Nakon dodatka NaOH u slijepe probe doda se po 50 µL uzorka. Mjeri se apsorbancija probi (P25°C, P30°C, P60°C) prema odgovarajućim slijepim probama (Sp25°C, Sp30°C, Sp60°C) pri 405 nm. Rezultat se očitava iz baždarnog dijagrama. 4.3.1.2. Utjecaj inhibitora na katalitičku aktivnost alkalne fosfataze Postupak: Ureja (3 mol/L) i fenilalanin (5 mmol/L) ireverzibilno inhibiraju aktivnost alkalne fosfataze. Pipetira se po 180 µL uzorka u 2 male epruvete. U jednu se doda 20 µL otopine ureje, a u drugu se doda 20 µL otopine fenilalanina. Reakcijske smjese inkubiraju se točno 20 minuta na 30°C. Nakon toga provede se reakcija odreñivanja enzimske aktivnosti kao u vježbi 4.3.1., pri čemu se u postupak uzima 50 µµµµL uzorka s inhibitorom nakon 20-minutne inkubacije na 30°C. Mjeri se apsorbancija probe (Pureja, Pfenilalanin) prema slijepoj probi (Sp) iz vježbe 4.3.1. pri 405 nm. Rezultat se očitava iz baždarnog dijagrama.

45

4.3.1.3. Utjecaj EDTA na katalitičku aktivnost alkalne fosfataze Postupak: DODATI (mL) OTOPINA SpEDTA PEDTA puferirani supstrat (2) (p-nitrofenilfosfat u AMP puferu bez Mg2+)

0,5

0,5

predinkubacija na 30°C tijekom 5 minuta uzorak EDTA

-

0,05

0,05 0,05

dobro promiješati epruvete; inkubacija na 30°C tijekom 30 minuta; reakcija se prekida dodatkom NaOH

5,0

5,0

uzorak

0,05 -

Mjeri se apsorbancija probe (PEDTA) prema slijepoj probi (SpEDTA) pri 405 nm.

46

Pitanja: 1. Objasnite značenje slijepe probe pri spektrofotometrijskom mjerenju. Kakve vrste slijepih proba poznajete? Detaljno sve razjasnite. ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________

47

2. Skicirajte i objasnite baždarni dijagram za odreñivanje katalitičke aktivnosti alkalne fosfataze s točno unesenim parametrima na apscisi i ordinati. ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

3. Objasnite mehanizam inhibicije katalitičke aktivnosti alkalne fosfataze djelovanjem EDTA. ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

48

Rezultati: 1. U tablicu upišite dobivene apsorbancije uzoraka te iz baždarnog dijagrama odreñene katalitičke aktivnosti alkalne fosfataze.

apsorbancija katalitička aktivnost (U/L*)

vježba 4.3.1. P vježba 4.3.1.1. P25°C P30°C P60°C vježba 4.3.1.2. Pureja Pfenilalanin vježba 4.3.1.3. PEDTA

2. Nacrtajte graf u kojem ćete prikazati utjecaj temperature na katalitičku aktivnost alkalne fosfataze te objasnite dobivene rezultate (vježba 4.3.1.1). ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

* U/L = µmol L-1 min-1 (internacionalna jedinica = aktivnost enzima koja katalizira pretvorbu 1 µmol supstrata u 1 µmol produkta tijekom 1 minute u standardiziranim uvjetima)

1 U/L = 16,67 nkat/L** ** kat/L = mol L-1 s-1 (katal = aktivnost enzima koja katalizira pretvorbu 1 mol supstrata u 1 mol produkta tijekom 1 sekunde u standardiziranim uvjetima)

49

3. Nacrtajte graf u kojem ćete prikazati utjecaj ureje, fenilalanina i EDTA na katalitičku aktivnost alkalne fosfataze te objasnite dobivene rezultate (vježba 4.3.1.2. i vježba 4.3.1.3). ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

50

4.4. ACETILKOLIN-ESTERAZA (EC 3.1.1.7) Acetilkolin-esteraza i acilkolin-acilhidrolaza su dva slična enzima i oba imaju sposobnost hidrolitičke razgradnje acetilkolina.

Acetilkolin-esteraza (AChE) je enzim čija se aktivnost može naćiu eritrocitima i naziva se eritrocitnom kolinesterazom, “pravom” kolinesterazom ili kolinesterazom I. Osim u eritrocitima, AchE se može naći u sivoj supstanciji mozga, plućima, slezeni, timusu, završecima kolinergičnih živaca, poprečno-prugastim mišićima, glatkim mišićima, srčanom mišiću, kromatofilnim stanicama srži nadbubrežne žlijezde, postsinaptičkim neuronima i u autonomnim ganglijima. Enzim je odgovoran za brzu hidrolizu acetilkolina - neurotransmitera koji se osobaña na završecima živčanih vlakana, da bi posredovao u prijenosu živčanih impulsa kroz sinapse. Razgradnja acetilkolina je neophodna kako bi došlo do depolarizacije živca i tako se omogućila nova repolarizacija, potrebna za prijenos sljedećeg živčanog impulsa.

Druga kolinesteraza je acilkolin-acilhidrolaza (ChE) koja se najčešće naziva serumskom kolinesterazom, pseudokolinesterazom, butirilkolinesterazom ili kolinesterazom II. ChE se nalazi u serumu, bijeloj supstanciji mozga, glatkim mišićima, jetri, gušterači, srcu, bubrezima, masnom tkivu, koži i sluznici tankog crijeva, a biološka uloga joj je nepoznata. Odreñivanje katalitičke aktivnosti enzima u serumu ima kliničko značenje, jer se promjenjene koncentracije mogu upotrijebiti kao dobar indikator sintetske funkcije jetre, te kao indikator otrovanja organofosfatima i/ili karbamatima koji se upotrebljavaju kao pesticidi, fungicidi i herbicidi. Prema nekim supstratima ova dva enzima imaju sličan afinitet, dok se afinitet prema drugim supstratima bitno razlikuje.

51

4.4.1. ODREðIVANJE K m I Vmax ZA ACETILKOLIN Zadatak: Odrediti Km i Vmax vrijednosti eritrocitne acetilkolin-esteraze za acetilkolin na temperaturi od 37°°°°C i kod pH 7.2. Načelo: Aktivnost acetilkolin-esteraze odreñuje se na temelju mjerenja količine preostalog supstrata, acetilkolina, nakon izvršene enzimske hidrolize. Razlika izmeñu početne koncentracije supstrata acetilkolina i one zaostale na kraju reakcije izravno govori o količini nastalog produkta. Koncentracija acetilkolina odreñuje se na temelju njegove reakcije s hidroksilaminom u alkalnom mediju. Nastala acetilhidroksamska kiselina prevodi se u obojeni ferikompleks, a koncentracija kompleksa odreñuje se spektrofotometrijski pri 540 nm (Slika 19).

R = -H + R1 = -CH2-CH2-N-(CH3)3 Slika 19. Metoda odreñivanja acetilkolina na temelju njegove reakcije s hidroksilaminom u alkalnom mediju. Nastala acetilhidroksamska kiselina prevodi se u obojeni ferikompleks.

52

Reagensi: 1. 0,00667 mol/L fosfatni pufer, pH 7,2

Otopi se u redestiliranoj vodi posebno 16,72 g Na2HPO4 x 12 H2O i 2,72 g KH2PO4. pH se podesi na 7,2 i dopuni redestiliranom vodom do 100 mL.

2. 2 mol/L otopina hidroksilamin hidroklorida Otopi se 13,9 g NH2OH x HCl u redestiliranoj vodi i nadopuni do 100 mL. 3. 3,5 mol/L otopina natrijevog hidroksida

Otopi se 14,0 g NaOH u redestiliranoj vodi i nakon hlañenja na sobnoj temperaturi dopuni na 100 mL.

4. reagens Pomiješa se 10 mL otopine hidroksilamin hidroklorida i 10 mL 3,5 mol/L otopine natrijevog hidroksida.

5. 3,8 mol/L HCl 1 volumni dio koncentrirane HCl (1L ≈ 1,18 kg) razrijedi se s 2 volumna dijela redestilirane vode.

6. 0,1 mol/L HCl 8,733 mL koncentrirane HCl (1L ≈ 1,18 kg) razrijedi se na 1000 mL. 7. 0,37 mol/L otopina željezovog (III) klorida Otopi se 10,0 g FeCl3 x 6 H2O u 100 mL 0,1 mol/L HCl. 8. fiziološka otopina Otopi se 9,0 g NaCl u 1000 mL redestilirane vode. 9. 0,04 mol/L matična otopina acetilkolin klorida

Otopi se 0,7266 g acetilkolin klorida u redestiliranoj vodi, pH se podesi koncentriranom kloridnom kiselinom na 4,0 i dopuni redestiliranom vodom na 100 mL.

10. 0,004 mol/L radna otopina acetilkolina (ACh) Prepremi se miješanjem 1,0 mL matične otopine acetilkolina (0,04 mol/L) i 9,0 mL fosfatnog pufera. Uzimajući različite volumene radne otopine acetilkolina i fosfatnog pufera (od 0 do 1,0 mL) pripravi se serija koncentracija acetilkolina, pomiješa se s reagensom i izradi se baždarni dijagram za koncentracijsko područje od 0,05 do 5 µmola ACh/mL.

11. EDTA Priprava hemolizata eritrocita (enzimski pripravak) 50-100 mL pune krvi se uzima uz antikoagulans EDTA (1 mg EDTA / 1 mL krvi). Eritrociti se istalože centrifugiranjem tijekom 10 minuta uz 3000 okretaja u minuti*, nadsloj (plazma) se odlije, nadomjesti se hladnom fiziološkom otopinom i ponovno centrifugira. Nakon dvokratnog ispiranja s hladnom fiziološkom otopinom i odlijevanja nadsloja, talogu eritrocita se dodaje hladna redestilirana voda (na 1 volumen stanica se dodaju 2 volumena hladne redestilirane vode). Tako pripremljena otopina se drži 30 minuta na -20 °C te se zatim centrifugira 15 minuta uz 3500 okretaja u minuti na +4°C. Dobiveni hemolizat (nadsloj) se spremi u hladionik (+4 °C).

Aktivnost acetilkolin-esteraze se ne mijenja tijekom tjedan dana čuvanja hemolizata u hladnjaku na +4°C.

* Broj okretaja u minuti je prilagoñen centrifugi Biofuge stratos, na Zavodu za medicinsku biokemiju i hematologiju.

53

Postupak: ___________________________________________________________________________ DODATI (mL)

Sp P1* P2* P3* P4* P5* ___________________________________________________________________________

0,00667 mol/L 1,45 1,25 1,20 1,15 1,10 1,05 fosfatni pufer, pH 7,2 supstrat 0,004 mol/L ACh - 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40

___________________________________________________________________________ inkubirati probe na 37°C tijekom10 minuta; u razmacima od 30 sekundi dodavati

___________________________________________________________________________

enzimski pripravak 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 (hemolizat eritrocita) (jako promućkati)

___________________________________________________________________________

ukupni volumen 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50 ___________________________________________________________________________

inkubirati svaku probu 30 minuta na 37°C;

u razmacima od 30 sekundi zaustaviti reakciju dodavajući ___________________________________________________________________________

reagens 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 (jako promućkati)

___________________________________________________________________________ tri minute poslije dodatka reagensa dodati

___________________________________________________________________________

3,8 mol/L HCl 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,37 mol/L FeCl3 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

___________________________________________________________________________ Poslije svakog dodatka kratko, no temeljito, promućkati epruvete i zatim izmjeriti apsorbanciju proba (P1,2,3,4,5) prema slijepoj probi (Sp) pri 540 nm. Rezultat se očitava iz baždarnog dijagrama. * sve probe rade se u duplikatu

54

Pitanja: 1. Koji su poznati supstrati i inhibitori za acetilkolin-esterazu?

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

Rezultati:

1. Prikažite dobivene rezultate u tablicama:

apsorbancija

srednja vrijednost

apsorbancije

konačna

koncentracija acetilkolina (mol/L)

1 1'

2 2'

3 3'

4 4'

5 5'

55

PROBA

1

2

3

4

5

mL supstrata (0,004 mol/L ACh)

moli ACh u 1.5 mL reakcijske smjese

mol/L ACh, početna koncentracija supstrata [S]

1/[S]

apsorbancija

mol/L ACh, konačna koncentracija supstrata

∆[S] (početna - konačna koncentracija supstrata)

1/v = ∆t/∆[S] = 30'/∆[S]

v0

2. Prema dobivenim rezultatima konstruirajte Michaelis-Mentenov prikaz te označite Vmax i Km.

56

3. Prema dobivenim rezultatima konstruirajte Lineweaver-Burkov prikaz, odredite Km i Vmax te izračunajte početnu brzinu enzimske reakcije. -1/Km = _____________________________ Km = _____________________________

1/Vmax = ____________________________

Vmax = ____________________________

Vmax x [S]P1

vo (1) = ----------------- Km + [S]P1

vo (1) = _____________________________

57

Literatura:



3. Siegel G, Albers RW, Brady S, Price D. Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular, and Medical Aspects. Philadelphia: Lippincott,Williams & Wilkins; 2005.

58

5. IZOLACIJA PLAZMIDNE DNA IZ TRANSFORMIRANIH BAKTERIJA UVOD Plazmidi su ekstrakromosomske, dvolančane molekule DNA u obliku superuzvojnice koje se često upotrebljavaju kao vektori za kloniranje. Plazmid pBR 322 sadrži 4363 parova baza i može se replicirati u bakteriji Escherichia coli neovisno o replikaciji kromosomske DNA. Na taj način bakterijska stanica proizvodi plazmidnu DNA u mnogo kopija. Plazmid pBR 322 sadrži gene odgovorne za rezistenciju prema antibioticima ampicilinu i tetraciklinu, te se plazmidom transformirane stanice mogu jednostavno razlikovati od netransformiranih. Poznata je potpuna primarna struktura plazmida pBR 322. Plazmid sadrži brojna restrikcijska mjesta pogodna za umetanje fragmenata strane DNA, koja se u transformiranim bakterijama umnožava zajedno s DNA molekulama plazmida. Plazmidi su znatno manji čak i od fragmentiranih kromosoma, te se relativno lako i brzo izoliraju iz stanica transformiranih bakterija. Zadatak:

Izolirati DNA plazmida pBR 322. Odrediti koncentraciju DNA u uzorku te stupanj čistoće uzorka. Provesti elektroforezu izolirane plazmidne DNA u 0,7% agaroznom gelu. Načelo:

Izoliranje alkalnom lizom najčešće je korištena metoda za izolaciju DNA malih plazmida (manjih od 15 kb). Bakterijske stanice se liziraju dodatkom lužine koja denaturira i DNA i proteine. Zatim slijedi neutralizacija, pri kojoj se genomska DNA i proteini talože, a plazmidna se DNA previlno renaturira i ostaje u otopini. Tako se plazmidna DNA jednostavno odvaja od bakterijske genomske DNA i proteina. Reagensi: 1. otopina za razaranje peptidoglikanskog sloja stanične stijenke bakterija

50 mmol/L glukoza, 10 mmol/L EDTA, 4 mg/mL lizozim, 25 mmol/L Tris HCl, pH 8,0. 2. otopina za alkalnu lizu

0,2 mol/L NaOH, 10 g/L natrijev dodecilsulfat (SDS). 3. 3 mol/L kalijev acetatni pufer, pH 4,8

Dodati 11,5 mL ledene octene kiseline i 28,5 mL redestilirane vode u 60 mL 5 mol/L kalijevog acetata.

4. smjesa fenola (zasićenog Tris puferom) i kloroforma 5. apsolutni etanol 6. TE pufer

10 mmol/L Tris HCl, pH 8,0 i 1 mol/L EDTA.

59

7. TAE pufer za elektroforezu 0,04 mol/L Tris HCl, 5 mmol/L natrijev acetat, 0,04 mmol/L EDTA, pH 7,9.

8. pufer za nanošenje uzorka 2,5 g/L bromfenol plavilo, 400 g/L saharoza.

9. matična otopina etidijevog bromida Otopiti 1 g etidijevog bromida u 100 mL redestilirane vode. Posudu s otopinom zamotati u aluminijsku foliju i miješati par sati na mješalici.

10. agaroza Zagrijavanjem potpuno otopiti 0,7 g agaroze u 100 mL pufera za elektroforezu. Ohladiti na oko 50°C. Dodati 10 µL matične otopine etidijevog bromida u 100 mL agaroze i dobro promiješati.

11. standard molekulskih masa (višekratnik 100 pb) Postupak*: 1. Inokulirati medij, koji sadrži sve potrebne hranjive sastojke za rast bakterije, te

odgovarajućim antibiotikom izolirati kolonije koje nose plazmid pBR 322. Inkubirati preko noći na 37°C uz stalno protresivanje.

2. Rasporediti po 2,5 mL zasićene stanične kulture u epruvete. Centrifugirati 5 minuta na

4°C uz 1140 g (3000 rpm** ). 3. Odliti nadsloj, a u istaloženim bakterijama započeti s postupkom izolacije plazmidne

DNA. 4. Dobro razmutiti talog u 100 µL hladne otopine za razaranje peptidoglikanskog sloja stanične stijenke bakterija. Lizozim je enzim koji razgrañuje peptidoglikanski sloj stanične stijenke bakterija.

Dodaje se u otopinu neposredno prije upotrebe. Slobodni magnezijevi ioni inhibiraju aktivnost lizozima.

5. Držati epruvete 5 minuta na sobnoj temperaturi. 6. Dodati 200 µL svježe pripremljene otopine za alkalnu lizu. Pažljivo promućkati sadržaj epruveta 2-3 puta i ostaviti ih 5 minuta u ledu. 7. Dodati 150 µL hladne otopine 3 mol/L kalijevog acetatnog pufera, pH 4,8. Pažljivo promućkati sadržaj epruveta i držati ih 5 minuta u ledu.

Talog koji nastaje tijekom stajanja na 0°C sastoji se od bakterijske kromosomske DNA, visokomolekularne RNA i kompleksa kalij/SDS/protein/membrana.

8. Centrifugirati 5 minuta na 4°C uz 18350 g (12000 rpm** ). Plazmidna DNA i male molekule ostaju u nadsloju. * Studenti započinju vježbu točkom broj 4 u postupku. ** Broj okretaja u minuti (rpm) je prilagoñen centrifugi EBA 12 R, na Zavodu za medicinsku biokemiju i hematologiju.

60

9. Prenijeti mikropipetom nadsloj u čistu epruvetu. 10. Dodati nadsloju jednaki volumen fenola (zasićenog Tris puferom). Dobro promućkati sadržaj epruvete i centrifugirati 5 minuta na 4°C uz 18350 g (12000 rpm** ) kako bi se odvojili slojevi.

Na ovaj se način vrši ekstrakcija zaostalih proteina koji su zadržani u fenolnom sloju i u meñusloju, te masti koje su topljive u kloroformu. Nukleinske kiseline nalaze se u gornjem, vodenom sloju. Pazi! Fenol ne smije dospjeti na kožu i oči.

11. Prenijeti mikropipetom vodeni sloj u čistu epruvetu.

Pazi! Potrebno je prenijeti što više nadsloja, a pri tome paziti da se ne prenese i meñusloj.

12. Dodati vodenom sloju 2 volumena hladnog apsolutnog etanola. 13. Promućkati sadržaj epruvete i ostaviti u ledu 60 minuta.

Etanolom se talože nukleinske kiseline. Dodatkom kontrolirane količine hladnog etanola (2 volumena) istalože se pretežno molekule DNA, dok bi za taloženje molekula RNA trebalo dodati 2,5 do 3 volumena hladnog etanola.

14. Centrifugirati 30 minuta na 4°C uz 18350 g (12000 rpm** ). 15. Odliti nadsloj. Ostaviti epruvetu u preokrenutom položaju da se uklone svi tragovi etanola (oko 30 minuta). 16. Talog otopiti u 30 µL TE pufera. 17. Dobiveni uzorak (izolirana plazmidna DNA) se zatim analizira elektroforezom na agaroznom gelu (vježba 5.1) te se koristi za spektrofotometrijsko odreñivanje koncentracije DNA (vježba 5.2). ** Broj okretaja u minuti (rpm) je prilagoñen centrifugi EBA 12 R, na Zavodu za medicinsku biokemiju i hematologiju.

61

5.1. ELEKTROFOREZA NUKLEINSKIH KISELINA NA AGAROZNO M GELU Načelo: Fragmenti dvolančane DNA kod neutralnog pH nose negativan naboj i dobro se odjeljuju elektroforezom na agaroznom gelu. Elektroforetska pokretljivost ovisi o veličini fragmenata i uglavnom je neovisna o nukleotidnom sastavu. Meñutim, na pokretljivost utječe i oblik molekule DNA (cirkularna, linearna, superuzvojnica) te koncentracija agaroze u agaroznom gelu za elektroforezu DNA. Za razdjeljivanje vrlo malih fragmenata DNA koriste se gelovi s visokim udjelom agaroze (do 2%), dok se veliki fragmenti znatno bolje odjeljuju na niskopostotnim agaroznim gelovima (0,3-0,7%). Postupak: 1. U kadicu za elektroforezu postaviti pregrade kako bi se spriječilo izlijevanje otopine agaroze prije polimerizacije. Pomoću kapalice dodati malo otopine agaroze uz rubove pregrada kako bi se provjerilo da li otopina agaroze negdje curi.

2. Nakon nekoliko minuta uliti toplu otopinu agaroze u kadicu za elektroforezu i odmah postaviti “češalj” koji omogućava formiranje jažica za nanošenje uzorka. 3. Nakon što se gel polimerizira (oko 30 minuta), maknuti “češalj” te dodati toliko pufera da malo prekrije gel (1-2 mm iznad gela). 4. Prirediti uzorke DNA (20 µL izolirane plazmidne DNA + 5 µL pufera za nanošenje uzorka) i uzorak standarda molekulskih masa (1 µL standarda molekulskih masa + 1 µL pufera za nanošenje uzorka + 8 µL redestilirane vode). 5. Nanijeti uzorke DNA (6 µL) i uzorak standarda molekulskih masa (5 µL) u jažice na gelu i provoditi elektroforezu pri naponu od 50 V (1-5 V/cm). 6. Isključiti ispravljač kada boja bromfenol plavilo (iz pufera za nanošenje uzorka) doputuje blizu kraja gela.

7. Nakon elektroforeze, pogledati gel pod izvorom UV svjetla (UV lampa ili UV transiluminator). Razdvojeni fragmenti se mogu fotografirati polaroidnom kamerom.

62

5.2. SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREðIVANJE KONCENTRACIJE DNA U OTOPINI Načelo: Spektrofotometrijsko mjerenje količine apsorbiranog UV zračenja od strane nukleotidnih baza je metoda kojom se odreñuje koncentracija DNA ili RNA u uzorku. Za odreñivanje koncentracije DNA ili RNA u otopini potrebno je imati dobro pročišćeni uzorak odnosno uzorak bez značajne količine nečistoća kao što su proteini, fenol, agaroza ili druge nukleinske kiseline. Ukoliko je koncentracija DNA ili RNA u uzorku vrlo mala ili uzorak sadrži značajnu količinu nečistoća, koncentracija nukleinske kiseline se odreñuje na temelju inteziteta fluorescencije koju emitira etidijev bromid. Apsorbancija očitana pri 260 nm omogućava izračunavanje koncentracije nukleinske kiseline u uzorku.

A260 = 1,0 odgovara 50 µg/mL ds DNA A260 = 1,0 odgovara 33 µg/mL ss DNA A260 = 1,0 odgovara 40 µg/mL ss RNA

ds = dvolančana DNA ss = jednolančana DNA, RNA Omjer A260/A280 ukazuje na čistoću pripravka nukleinskih kiselina, zbog toga što proteini apsorbiraju pri valnoj duljini od 280 nm. Čisti pripravci DNA ili RNA imaju omjer A260/A280 = 1,8 do 2,0. U slučaju onečišćenja fenolom ili proteinima omjer će biti znatno manji, te odreñivanje koncentracije nukleinskih kiselina nije moguće. Postupak: Uzorak DNA razrijedi se 100 puta u TE puferu (10 µL DNA otopljene u TE puferu + 990 µL TE pufera). Izmjeri se A260 i A280. Iz dobivenih vrijednosti izračuna se koncentracija DNA u uzorku i odredi čistoća uzorka. Pitanja: 1. Zašto se u medij za uzgoj bakterija E. coli transformiranih plazmidom pBR 322 dodaje antibiotik? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

63

2. Fragment strane DNA kloniran je u Sall-mjesto plazmida pBR koje se nalazi u genu odgovornom za rezistenciju prema tetraciklinu. Umnažanje kimernog plazmida vrši se u bakteriji Escherichia coli. Kako biste izvršili: a) selekciju transformiranih i netransformiranih bakterija?

b) selekciju bakterija koje sadrže kimerni plazmid od onih koje sadrže čisti pBR 322? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

3. Zašto se dodaje EDTA u otopinu u kojoj je jedan od sastojaka lizozim?

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

4. Da li će tijekom elektroforeze nukleinske kiseline putovati prema katodi ili prema anodi?

___________________________________________________________________________

5. Kakve su relativne elektroforetske pokretljivosti linearne DNA, cirkularne DNA i DNA u obliku superuzvojnice na agaroznom gelu?

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

64

Rezultati: 1. U tablicu upišite dobivene apsorbancije uzorka, te izračunatu koncentraciju DNA i stupanj čistoće uzorka.

A260 A280 c (µg/mL) A260/A280

Literatura:


2. Cooper GM, Hausman RE. The Cell - A Molecular Approach. Sunderland (MA): Sinauer Associates, Inc.; 2007.



65

6. ISPITIVANJE CITOTOKSI ČNOSTI MTT TESTOM UVOD Preživljenje stanica, odnosno učinak nekih toksičnih tvari na stanice, može se utvrditi na više načina. Primjerice, na temelju ugradnje radioaktivno obilježenog timidina, na temelju koncentracije ATP u stanici ili na temelju aktivnosti nekih citosolnih, mitohondrijskih ili lizosomalnih enzima. Zadatak:

Ispitati učinak otopine bpV(phen) [bisperokso-(1,10-fenantrolin)-oksovanadat (V)] na vijabilnost stanica korištenjem MTT testa Načelo: Tetrazolijeva sol MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolijev bromid] se često upotrebljava u testovima kojima se ispituje proliferacija i citotoksičnost, odnosno vijabilnost stanica. MTT se reducira enzimima vezanim za endoplazmatski retikulum (mikrosomalnim enzimima) koji trebaju NADH i NADPH. Sukcinat takoñer može biti elektron-donor pri redukciji MTT mitohondrijskom sukcinat-dehidrogenazom. Ovom metaboličkom redukcijom MTT (blijedo-žuti supstrat, topljiv u vodi) nastaje formazan (intenzivno tamno-plavo obojeni krajnji produkt, topljiv u dimetilsulfoksidu) (Slika 20). MTT reduciraju samo žive stanice, pa ovim kolorimetrijskim testom mjerimo redukcijski potencijal stanica, tj. metaboličku aktivnost stanica.

Slika 20. Metabolička redukcija MTT u formazan. Reagensi: 1. otopina fosfatnog pufera, PBS; sterilna

137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 x 7 H2O, 1,4 mM KH2PO4 (sterilno profiltrirati).

66

2. matična otopina MTT (5 mg/mL u sterilnom PBS) Otopinu je potrebno sterilno profiltrirati kroz 0,2 µm filter, omotati aluminijskom folijom (zaštititi od svjetla) i spremiti u hladnjak na +4°C.

3. dimetilsulfoksid, DMSO; nesterilan 4. 10 mM matična otopina bpV(phen) [bisperokso-(1,10-fenantrolin)-oksovanadat (V)]; sterilna

Otopinu je potrebno omotati aluminijskom folijom (zaštititi od svjetla) i spremiti u hladnjak na +4°C.

Postupak: Stanice se nasade na 3 ploče sa 6 jažica i tretiraju se različitim koncentracijama (1, 5, 10, 100 i 200 µM) bpV(phen) tijekom 24 sata. Ista koncentracija bpV(phen) se dodaje u 3 jažice. U kontrolne stanice (3 jažice) se ne dodaje bpV(phen). Stanice se zatim inkubiraju 4 sata s MTT (50 µL matične otopine MTT na 1 mL medija) u CO2 inkubatoru u vlažnoj atmosferi s 5% CO2 i pri temperaturi 37°C (Slika 21). Stanice se nakon inkubacije drže na ledu. Odsiše se medij, stanice se dva puta isperu s 1 mL sterilnog PBS i u svaku se jažicu dodaje 500 µL nesterilnog DMSO. Nakon 20-minutne inkubacije na ledu, stanice se podignu blagim struganjem silikonskim strugačem, prebace u plastične epruvetice od 1,5 mL i centrifugiraju tijekom 20 minuta pri brzini od 14000 rpm∗ i na temperaturi 4°C. Za spektrofotometrijsko mjerenje koristi se nadsloj koji se razrijedi s nesterilnim DMSO u omjeru 1:10. Mjerenje se vrši pri 595 nm prema nesterilnom DMSO kao slijepoj probi.

Slika 21. Shematski prikaz MTT testa.

* Broj okretaja u minuti (rpm) je prilagoñen centrifugi EBA 12 R, na Zavodu za medicinsku biokemiju i hematologiju.

67

Račun: Potrebno je izračunati preživljavanje tretiranih stanica (postotak u odnosu na kontrolne, netretirane stanice) prema sljedećoj formuli:

% vijabilnih stanica = (A UZORKA / AKONTROLE ) x 100 % Pitanja: 1. Na koji način utvrñujemo vijabilnost stanica MTT testom? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

2. Čemu nam služe kontrolne stanice? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

68

Rezultati: 1. U tablicu upišite izmjerene vrijednosti apsorbancija te izračunajte vijabilnost.

uzorak

A595

srednja vrijednost A595

vijabilnost (%)

kontrolne stanice

1 µM bpV(phen)

5 µM bpV(phen)

10 µM bpV(phen)

100 µM bpV(phen)

200 µM bpV(phen)

2. Dobivene podatke prikažite linijskim grafom tako da se koncentracija bpV(phen) stavi na x-os, a postotak preživljenja u odnosu na kontrolne stanice na y-os. Literatura:

1. Ambriović Ristov A. Metode u molekularnoj biologiji. Zagreb: Institut Ruñer Bošković; 2007.

69

7. ODREðIVANJE BRZINE GLIKOLIZE U STANICI UVOD Većina bioloških sustava koristi glukozu kao izvor energije. Glikoliza predstavlja niz metaboličkih reakcija u citosolu stanice kojima se glukoza razgrañuje do jednostavnijih meñuprodukata, a osloboñena se energija djelomično pohranjuje u obliku ATP. Konačni produkti glikolize ovise o organizmu, vrsti tkiva, kao i o dostupnosti dovoljne količine kisika potrebne za daljnje oksidacijske procese.

U slučaju kada je opskrba kisikom zadovoljavajuća, u tkivima sisavaca stvaraju se 2 molekule piruvata, 2 ATP i 2 NADH, kao produkti glikolize. Da bi glikoliza tekla normalno, mora se regenerirati NAD+ utrošen u reakciji koju katalizira gliceraldehid-3-fosfat-dehidrogenaza. Pod aerobnim se uvjetima NAD+ regenerira prijenosom elektrona s NADH na O2 kroz lanac za prijenos elektrona. Uz anaerobne uvjete, kada nije dostatna opskrba kisikom, NADH se oksidira u reakciji koju katalizira laktat-dehidrogenaza, pri čemu se piruvat reducira u laktat. Tada u tkivu nastaju 2 molekule laktata i 2 ATP. Pojačano stvaranje laktata dogaña se u slučaju intenzivnog mišićnog rada. Glikoliza ima dva temeljna cilja: dobivanje energije u obliku ATP i dobivanje meñuprodukata potrebnih za biosintetske procese. Brzina glikolize regulira se na način da se zadovolje ove potrebe. Najvažnije mjesto kontrole tijeka glikolize je enzim fosfofruktokinaza koji katalizira odlučni korak u glikolizi. Pretvorba glukoze u laktat u tkivu životinje uključuje stvaranje velikog broja meñuprodukata i zahtjeva dovoljne količine oksidiranog koenzima NAD+. To ne predstavlja problem u intaktnoj životinji (in vivo), ali u slučaju kada se glikoliza prati in vitro u homogenatu tkiva potrebno je dodavati odreñene meñuprodukte kako bi se ostvarila maksimalna brzina cjelokupnog procesa. Brzina tijeka glikolize razlikuje se u pojedinim tkivima. Odreñena su tkiva, primjerice moždano tkivo i maligne stanice, karakterizirana vrlo velikom brzinom glikolize. Zadatak: Odrediti inhibitore ključnih enzima glikolize i usporediti brzine glikolize u moždanom i jetrenom tkivu te u eritrocitima.

70

7.1. PRIPREMANJE UZORAKA TKIVA JETRE I MOZGA Načelo:

Uzorak tkiva mehanički se homogenizira primjenom homogenizatora, pri čemu stanične membrane pucaju i sadržaj se oslobaña u okolinu. Centrifugiranjem pri velikoj brzini odnosno gravitacijskoj sili stanične organele se talože, a u nadsloju zaostaje frakcija citosola. Reagensi: 1. 0,14 mol/L kalijevog klorida Postupak:

Jetreno i moždano tkivo neposredno žrtvovane životinje homogenizira se u Potter-Elvehjemovom homogenizatoru s 0,14 mol/L kalijevog klorida (razrjeñenje 1:10, tj. na 1 g tkiva doda se 9 mL 0,14 mol/L kalijevog klorida) nekoliko puta (3-5 puta) po 30 sekundi uz 10000 okretaja tučka u minuti. Homogenat se centrifugira 10 minuta na +4°C uz 50000 g (23000 rpm*). Dobiveni talog sadrži jezgre i mitohondrije, a nadsloj, koji u daljnjim ispitivanjima služi kao uzorak, sadrži topljivi stanični sadržaj i predstavlja frakciju citosola.

Hemolizat eritrocita pripremi se na jednak način kao i u vježbi 3.2. (Elektroforeza hemoglobina na agar-gelu). 7.2. PRAĆENJE TIJEKA GLIKOLIZE U RAZLI ČITIM UVJETIMA Načelo:

Dodatak odreñenih meñuprodukata (glukoza, ATP, MgCl2, NAD+, KHCO3) nužan je

za nesmetano odvijanje glikolize u in vitro uvjetima. AMP i fruktoza-1,6-bisfosfat djeluju inhibitorno na glikolizu. * Broj okretaja u minuti (rpm) je prilagoñen ultracentrifugi Beckman, model OptimaTM LE-80K, na Zavodu za medicinsku biokemiju i hematologiju.

71

Reagensi: 1. 0,05 mol/L glukoza u 0,025 mol/L fosfatnom puferu, pH 7,2 2. 0,005 mol/L NAD+ u 0,25 mol/L nikotinamidu 3. 0,01 mol/L ATP 4. 0,01 mol/L AMP 5. 0,05 mol/L fruktoza-1,6-bisfosfat (F1,6BP) 6. 0,25 mol/L KHCO3

7. 0,08 mol/L MgCl2 8. 0,07 mol/L ZnSO4

9. 0,057 mol/L Ba(OH)2

Postupak:

DODATI (mL)

GLIKOLIZA

+AMP

+F1,6BP

NULTO

VRIJEME

glukoza

0,2

0,2

0,2

0,2

MgCl 2

0,1

0,1

0,1

0,1

NAD+

0,1

0,1

0,1

0,1

ATP

0,1

0,1

0,1

0,1

AMP

-

0,05

-

-

KHCO 3

0,1

0,1

0,1

0,1

fruktoza 1,6-bisfosfat

-

-

0,1

-

H2O

0,1

-

-

0,1

dobro promiješati sadržaj u svim epruvetama; pažljivo dodavati uzorak tkiva u intervalima od 45 sekundi uzorak tkiva

0,3

0,3

0,3

-*

inkubirati 30 minuta na 37 oC

Nakon inkubacije (30 minuta od dodatka uzorka tkiva u prvu epruvetu), reakciju treba prekinuti u točnim intervalima od po 45 sekundi na način da se pipetira po 0,5 mL reakcijske smjese u epruvete za centrifugiranje koje sadrže po 0,5 mL ZnSO4.

72

U EPRUVETE ZA CENTRIFUGIRANJE DODATI (mL)

_________________________________________________

GLIKOLIZA

+AMP

+F1,6BP

NULTO

VRIJEME ZnSO4

0,5

0,5

0,5

0,5

reakcijska smjesa

0,5

0,5

0,5

0,5

uzorak tkiva

-

-

-

0,15*

Ba(OH)2

0,5

0,5

0,5

0,5

H2O

3,5

3,5

3,5

3,35

_________________________________________________

snažno promiješati sadržaj; centrifugirati 5 minuta uz 3000 rpm**

________________________________________________ Bistri nadsloj koristit će se za odreñivanje koncentracije glukoze. * U epruveti koja predstavlja nulto vrijeme ne smije se odvijati reakcija glikolize, što znači da se 0,15 mL uzorka dodaje NAKNADNO, nakon dodatka 0,5 mL reakcijske smjese DIREKTNO u otopinu ZnSO4 koja služi kao sredstvo za deproteinizaciju. ** Broj okretaja u minuti (rpm) je prilagoñen centrifugi Tehtnica LC-320, na Zavodu za medicinsku biokemiju i hematologiju.

73

7.2.1. ODREðIVANJE KONCENTRACIJE GLUKOZE Načelo: Koncentracija glukoze će se odrediti enzimskom metodom. Glukoza iz uzorka oksidira se uz katalitičko djelovanje enzima glukoza-oksidaze (GOD) pri čemu nastaje H2O2. U slijedećoj, indikatorskoj, reakciji kataliziranoj peroksidazom (POD), stvoreni H2O2 će poslužiti za oksidaciju fenola i 4-aminoantipirina, pri čemu se stvara obojeni kinonimin. Reakcija se odvija prema sljedećoj shemi:

GOD glukoza + O2 glukonska kiselina + H2O2

POD 2 H2O2 + fenol + 4-aminoantipirin kinonimin + 4 H2O Reagensi: 1. test-paket za odreñivanje koncentracije glukoze (Herbos Dijagnostika) Postupak:

DODATI (mL) _________________________________________________

GLIKOLIZA

+AMP

+F1,6BP

NULTO

VRIJEME bistri nadsloj

0,02

0,02

0,02

0,02

otopina reagensa

2,0

2,0

2,0

2,0

promiješati i inkubirati na 37 °C tijekom 15 minuta

________________________________________________ Mjeri se apsorbancija pojedine probe i standarda (2 mL reagensa + 0,02 mL standarda) prema slijepoj probi (2 mL reagensa + 0,02 mL redestilirane vode) pri 500 nm.

74

Račun: AP

cglukoza = ------ x cstandard ASt

cstandard = 5,56 mmol/L

Metabolička aktivnost tkiva (jetra, mozak, eritrociti) uzrokuje pad koncentracije glukoze tijekom eksperimenta.

Na početku eksperimenta je sadržaj glukoze u svim uzorcima istovjetan i jednak je količini dodane glukoze. U epruveti nulto vrijeme on se neće promijeniti ni do kraja eksperimenta.

Glikoliti čka aktivnost u pojedinoj epruveti izražava se smanjenjem koncentracije glukoze tijekom glikolize. Utrošak glukoze tijekom glikolize (µmol/mL tijekom 30 minuta):

∆c (brzina glikolize) = cnulto vrijeme - cprobe

75

Pitanja: 1. Objasnite utjecaj ATP na brzinu glikolize u in vitro uvjetima. ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

2. Na koji način dodatak AMP i F1,6BP utječu na brzinu glikolize u in vitro uvjetima? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

3. Usporedite brzinu glikolize u različitim tkivnim uzorcima. Usporedite svoje rezultate s očekivanim rezultatima. ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

76

Rezultati: 1. Dobivene rezultate unesite u tablice.

a) za svoj uzorak tkiva i standard:

GLIKOLIZA

+AMP

+F1,6BP

NULTO

VRIJEME

STANDARD

A1

A2

srednja vrijednost apsorbancije

cglukoza

(mmol/L)

b) za sva tri tkiva jedne životinje:

MOZAK

JETRA ERITROCITI

GLUKOZA cglukoza

(mmol/L) ∆ c cglukoza

(mmol/L) ∆ c cglukoza

(mmol/L) ∆ c

GLIKOLIZA

+ AMP

+ F1,6BP

NULTO VRIJEME

Literatura:




77

8. ODREðIVANJE KONCENTRACIJE TIOLNIH SKUPINA I GLUTATIONA UVOD Glutation (γ-glutamil-cisteinil-glicin, GSH) je tripeptid koji posjeduje nekoliko važnih funkcija. Djeluje kao reducens, sudjeluje u transportu aminokiselina kroz staničnu membranu, kofaktor je nekih enzimskih reakcija. Takoñer sudjeluje u reakcijama konjugacije nekih lijekova, a kao reducens ima važnu ulogu u održavanju stabilnosti eritrocitnih membrana. Sulfhidrilna, odnosno tiolna skupina (-SH) glutationa reducira perokside koji se stvaraju u procesu staničnog disanja tijekom transporta elektrona do kisika. Uz djelovanje glutation-peroksidaze dolazi do redukcije vodikovog peroksida u vodu uz nastanak oksidiranog glutationa (dvije molekule glutationa povezane disulfidnom vezom, GSSG). Glutation-reduktaza, uz NADPH, katalizira pretvorbu oksidiranog glutationa u reducirani glutation (Slika 22). 2 γ-glutamil-cisteinil-glicin + H2O2

GLUTATION 2 H2O + γ-glutamil-cisteinil-glicin PEROKSIDAZA SH S (GSH) S γ-glutamil-cisteinil-glicin (GSSG) GSSG + NADPH + H+ GLUTATION 2 GSH + NADP+

REDUKTAZA

Slika 22. Oksidacija i redukcija glutationa djelovanjem glutation peroksidaze i glutation reduktaze. Slobodne tiolne skupine proteina u plazmi potječu od cisteinskih aminokiselinskih ostataka i podložne su oksidacijskim promjenama. Slobodne -SH skupine cisteina reverzibilno se oksidiraju pri čemu nastaje cistin (disulfid). U prisutnosti glutationa, disulfidi se reduciraju te se tako regeneriraju -SH skupine. Daljnja oksidacija disulfida dovodi do ireverzibilnih promjena i nastanka cisteinske kiseline. Zadatak:

Odrediti koncentraciju ukupnih tiolnih skupina i glutationa u serumu čovjeka.

78

Načelo:

Za odreñivanje glutationa i tiolnih skupina koristi se Ellmanov reagens (5,5'-ditiobis-2-nitrobenzojeva kiselina ili DTNB). U reakciji DTNB s tiolnim skupinama oslobaña se 5-tio-2-nitrobenzojeva kiselina (TNB) i nastaju miješani disulfidi (izmeñu molekule sa -SH skupinom i TNB) (Slika 23).

Reakcija se odvija brzo i stehiometrijski, jedan mol tiola oslobaña jedan mol TNB. TNB u vodenoj sredini pri alkalnom i neutralnom pH ionizira u žuto obojeni anion TNB-. Osloboñeni TNB- se odreñuje spektrofotometrijski mjerenjem apsorbancije pri 412 nm.

Slika 23. U reakciji DTNB s tiolnim skupinama oslobaña se 5-tio-2-nitrobenzojeva kiselina (TNB) i nastaju miješani disulfidi (izmeñu molekule sa -SH skupinom i TNB). 8.1. ODREðIVANJE KONCENTRACIJE TIOLNIH SKUPINA Reagensi:

1. 10 mM 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzojeva kiselina (DTNB) DTNB se otapa u apsolutnom metanolu; reagens je stabilan dva tjedna ako se čuva na +4°C.

2. 0,25 M Tris HCl, pH 8,2 koji sadrži 20 mM EDTA (Tris-EDTA pufer) 3. apsolutni metanol

79

Postupak:

PROBA

(A)

SLIJEPA PROBA

REAGENSA (B)

SLIJEPA PROBA

UZORKA (C)

serum 50 µL - 50 µL

voda - 50 µL 10 µL

Tris-EDTA pufer 150 µL 150 µL 150 µL

DTNB 10 µL 10 µL -

apsolutni metanol 790 µL 790 µL 790 µL

dobro promješati sadržaj;

inkubirati 20 minuta na sobnoj temperaturi;

centrifugirati 10 minuta na 3000 g na sobnoj temperaturi

Izmjeriti apsorbanciju nadsloja na 412 nm prema destiliranoj vodi. Račun:

(A-B-C) x 103 x V ctiolne skupine (mM) = ----------------------- ε412 x d x v

(A-B-C) x 103 x 1 mL

= ----------------------------------------- 14150 cm-1 M-1 x 1 cm x 0,05 mL

= (A-B-C) x 1,413 mM

103 = faktor za preračunavanje M u mM V = volumen reakcijske smjese (1 mL) v = volumen uzorka (0,05 mL) ε412 = molarni apsorpcijski koeficijent (TNB-) (14150 cm-1 M-1) d = debljina kivete (1 cm) A = apsorbancija probe na 412 nm B = apsorbancija slijepe probe reagensa na 412 nm C = apsorbancija slijepe probe uzorka na 412 nm

80

8.2. ODREðIVANJE KONCENTRACIJE GLUTATIONA Reagensi: 1. 0,3 M fosfatni pufer, pH 7,4

Pufer se priprema miješanjem 0,3 M Na2HPO4 x 12 H2O i 0,3 M NaH2PO4 x 2 H2O dok se ne postigne pH 7,4.

2. 1 mM 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzojeva kiselina (DTNB) DTNB se otapa u 0,3 M fosfatnom puferu, pH 7,4

3. 5% trikloroctena kiselina Postupak:

Proteini iz uzorka talože se s 5% trikloroctenom kiselinom. 300 µL seruma pomiješa se s 100 µL 5% trikloroctene kiseline te se centrifugira na 3000 okretaja u minuti* tijekom 10 minuta na sobnoj temperaturi. U daljnji postupak uzima se nadsloj.

PROBA

SLIJEPA PROBA

nadsloj 100 µL -

fosfatni pufer 600 µL 600 µL

DTNB 50 µL 50 µL

voda - 100 µL

dobro promiješati sadržaj

Izmjeriti apsorbanciju probe na 412 nm prema slijepoj probi. * Broj okretaja u minuti je prilagoñen centrifugi EBA 12 R, na Zavodu za medicinsku biokemiju i hematologiju.

81

Račun: A x 106 x V

cglutation (µM) = ----------------- ε412 x d x v

A x 106 x 0,75 mL

= ----------------------------------------- 14150 cm-1 M-1 x 1 cm x 0,1 mL

= A x 530 µM

106 = faktor za preračunavanje M u µM V = volumen reakcijske smjese (0,75 mL) v = volumen uzorka (0,1 mL) ε412 = molarni apsorpcijski koeficijent (TNB-) (14150 cm-1 M-1) d = debljina kivete (1 cm) A = apsorbancija probe na 412 nm Pitanja: 1. Objasnite razliku izmeñu reverzibilne i ireverzibilne oksidacije tiolnih skupina na proteinskim molekulama.

2. Koja je uloga glutationa u organizmu?

82

Rezultati: 1. U tablicu upišite dobivene vrijednosti apsorbancija te izračunajte koncentraciju tiolnih skupina u vašem uzorku.

apsorbancija

koncentracija tiolnih skupina

(mM)

A

B

C

Račun: 2. U tablicu upišite dobivene vrijednost apsorbancije te izračunajte koncentraciju glutationa u vašem uzorku.

apsorbancija

koncentracija glutationa (µM)

A

Račun: Literatura:



vjeŽbe iz biokemije - pharma.unizg.hr · vjeŽbe iz biokemije za studente studija farmacije i...

Documents