VMM/LUC/2012/Genotox

Uitvoeren van genotoxische metingen in fijnstofmonsters

Van Den Heuvel Rosette Studie uitgevoerd in opdracht van Vlaamse Milieumaatschappij, Dienst Lucht

2015/MRG/R/0036 LNE/OL201300015/14001/M&G

Uitvoeren van effectgerichte metingen in de Gentse Kanaalzone

Van Den Heuvel Rosette, Den Hond Elly, Croes Kim, Nawrot Tim Studie uitgevoerd in opdracht van Vlaamse Overheid, Departement Leefmilieu, Natuur en Energie

2015/MRG/R/0037 December 2014

Alle rechten, waaronder het auteursrecht, op de informatie vermeld in dit document berusten bij de Vlaamse Instelling voor Technologisch Onderzoek NV (“VITO”), Boeretang 200, BE-2400 Mol, RPR Turnhout BTW BE 0244.195.916. De informatie zoals verstrekt in dit document is vertrouwelijke informatie van VITO. Zonder de voorafgaande schriftelijke toestemming van VITO mag dit document niet worden gereproduceerd of verspreid worden noch geheel of gedeeltelijk gebruikt worden voor het instellen van claims, voor het voeren van gerechtelijke procedures , voor reclame of antireclame en ten behoeve van werving in meer algemene zin aangewend worden

Voorliggend rapport werd opgemaakt in het kader van Joaquin, een Europees ‘INTERREG IVB NWE’- project dat de luchtkwaliteit in de Noordwest Europese regio wil verbeteren. Joaquin (Joint Air Quality Initiative) is een INTERREG IVB NWE project en concentreert zich op de luchtkwaliteit in Noordwest Europa, de gezondheidseffecten ervan en hoe die kwaliteit kan verbeterd worden. Dit project behelst het meten van parameters die een veel sterkere samenhang vertonen met gezondheidseffecten (ultrafijn stof, samenstelling van de deeltjes (metalen, roet e.d.) dan de PM10 en PM2,5-parameters die momenteel worden gemeten. Ook het onderbouwen van deze samenhang met gezondheidseffecten behoort tot de doelen van het Joaquin-project. Daarmee kunnen ook beleidsmaatregelen, die we binnen het project zullen evalueren en zelfs in de verschillende steden proefdraaien, op een gefundeerde wijze aan alle stakeholders en beleidsmakers voorgesteld worden. We zullen hen bovendien ook van de nodige tools voorzien om zelf aan de slag te gaan met deze maatregelen (o.a. een decision support tool). Tenslotte zal dit project ook informatie over deze nieuwe parameters op een verstaanbare manier naar experts enerzijds en de bevolking anderzijds verspreiden, om hen in staat te stellen de luchtkwaliteit in hun eigen regio te beoordelen. Looptijd: 01/05/2010-30/09/2015 Partners:

- België (4): Vlaamse Milieumaatschappij (VMM), Intergewestelijke Cel voor het Leefmilieu (IRCEL-CELINE), Vlaams Agentschap Zorg & Gezondheid (VAZG), Stad Antwerpen

- Frankrijk (2): École des Ingénieurs de la Ville de Paris (EIVP), Atmo Nord Pas de Calais - Nederland (4): GGD Amsterdam, Provincie Noord-Holland, Rijksinstituut voor

Volksgezondheid en Milieu (RIVM), Enery research Centre of the Netherlands (ECN) - Verenigd Koninkrijk (6): University of Brighton, University of Leicester, Leicester City Council,

London airTEXT, Greater London Authority (GLA), Transport for London (TfL) Meer informatie over het project kan verkregen worden via www.joaquin.eu.

Voorliggend rapport kadert in onderzoek van Steunpunt Milieu en Gezondheid, Humane biomonitoring in de Gentse Kanaalzone. Begin 2013 startte het Steunpunt Milieu en Gezondheid een humaan biomonitoringsonderzoek bij 14-15 jarige jongeren in de Gentse Kanaalzone. De bedoeling van dit onderzoek is nagaan of wonen nabij de industriezone van de Gentse Kanaalzone een invloed heeft op de gezondheid. Effectgerichte biologische testen kunnen bijdragen tot het inschatten van mogelijke gezondheidseffecten van luchtvervuiling. Op basis van de gekende analogie tussen de gemeten eindpunten in vitro en de toxische werkingsmechanismen van polluenten in vivo in de mens, kan men stellen dat de toxicologische eindpunten aangeven dat er mogelijk een risico bestaat voor bepaalde gezondheidseffecten. Effectgerichte metingen op luchtstalen vormen een tussenschakel tussen externe fysicochemische metingen op luchtstalen en biomerkers van effect in de mens, en kunnen helpen dus om de keten van blootstelling naar effect beter te begrijpen. De doelstelling van de opdracht is het analyseren van reeds verzamelde luchtstalen m.b.t. o.a. genotoxiciteit, cytotoxiciteit, immunotoxiciteit en hormonale verstoring. Het combineren van die resultaten van de jongeren uit de Gentse Kanaalzone met de effectgerichte metingen maken het mogelijk om te onderzoeken of effectgericht meten kan gebruikt worden om in te schatten wat het effect op de gezondheid is van de stoffen die voorkomen in de lucht. De resultaten hiervan bieden meerwaarde bij het inschatten van concrete gezondheidsrisico’s, complementair aan de klassieke chemische en humane biomonitoring analyses.

Samenvatting

I

SAMENVATTING

Dit rapport combineert de resultaten van twee studies waarin effectgerichte metingen werden ingezet voor de beoordeling van de luchtkwaliteit: - VMM studie in het kader van Joaquin, een Europees ‘INTERREG IVB NWE’- project - LNE studie in het kader van het Steunpunt Milieu en gezondheid, hotspot Gentse Kanaalzone De studies verliepen parallel en maakten gebruik van dezelfde achtergrondlocatie. In opdracht van de Vlaamse Milieumaatschappij werd in het kader van het INTERREG IVB NWE-project Joaquin een project uitgevoerd voor effectgerichte metingen op PM10-stof in het stedelijke gebied (Antwerpen –Borgerhout) en een achtergrondlocatie. Deze studie beoogde meer inzichten te verschaffen in het identificeren van gezondheidsrelevante polluenten met hun specifieke toxiciteit en een beoordeling van de correlatie met de meetresultaten van de chemische karakterisatie. Hiertoe werden effectgerichte metingen (genotoxische en immunologische effectmetingen) uitgevoerd in Borgerhout en een achtergrondlocatie (Houtem) op PM10-stof. De relaties tussen de effectgerichte metingen en de verschillende fysische en chemische parameters werden in dit project onderzocht evenals een gezondheidskundige interpretatie van de resultaten. De meetcampagne startte op 1 april 2013 en liep t.e.m. 8 mei 2014. In opdracht van het Departement Leefmilieu, Natuur en Energie werd in het kader van het Steunpunt Milieu en Gezondheid (2012-2015) een studie uitgevoerd met effectgerichte metingen in omgevingslucht in de Gentse Kanaalzone. De doelstelling van de opdracht was het analyseren van reeds verzamelde luchtstalen (PM10-stof) in de Gentse Kanaalzone en de achtergrondlocatie (Houtem) m.b.t. genotoxiciteit, cytotoxiciteit, immunotoxiciteit en hormoonverstoring. Het doel van de studie was (1) om na te gaan of de luchtkwaliteit in de Gentse Kanaalzone verschillend is t.o.v. een achtergrondlocatie in Vlaanderen; (2) de identificatie van gezondheidsrelevante polluenten via analyse van de relatie tussen de effectgerichte metingen en het voorkomen van de verschillende polluenten; (3) nagaan of de biomonitoringsresultaten gerelateerd zijn aan de resultaten van effectgericht meten op luchtstalen. De meetcampagne werd gestart op 1 april 2013 en werd 31 januari 2014 beëindigd. Meetcampagne In een eerste fase werd voor beide projecten een concreet en optimaal geïntegreerde meetstrategie uitgewerkt. Deze omvatte de selectie van de meetplaatsen, de frequentie en wijze van bemonstering en de keuze van de testsystemen. De meetstrategie werd afgestemd met de fysicochemische metingen in de verschillende meetnetten van VMM en de humane biomonitoring in de Gentse Kanaalzone (Steunpunt Milieu en Gezondheid). De meetcampagnes werden uitgevoerd op drie locaties: een industrieel gebied (Zelzate), een stedelijk gebied (Borgerhout) en een achtergrondlocatie (Houtem). Voor de drie gebieden werden de volgende meetposten geselecteerd: meetpost R801 in Borgerhout, meetpost R750 in Zelzate en meetpost N029 in Houtem. Het zwevend stof werd bemonsterd met een high-volume sampler van het type Digitel met PM10-voorafscheiding. De frequentie van bemonstering werd afgestemd met de fysico-chemische metingen die in Borgerhout in het kader van het Joaquin-project werden uitgevoerd. De metingen werden gespreid over een jaar en werden simultaan uitgevoerd op de twee locaties (Borgerhout en Houtem) en gelijklopend met de chemische karakterisatie die in Borgerhout werd uitgevoerd. In Borgerhout gebeurde de bemonstering met een tijdsinterval van 6 dagen (aantal bemonsterde dagen = 61). In Houtem gebeurde de bemonstering met een frequentie van 1 op 12 dagen (aantal bemonsterde dagen = 34).

Samenvatting

II

In Zelzate werd de frequentie van bemonstering afgestemd op de humane biomonitoringscampagne. Er werden enerzijds luchtstalen in Zelzate verzameld gedurende de 24 u de dag voor het veldwerk van de biomonitoring (aantal bemonsterde dagen = 14) en anderzijds werden 4 extra stalen per maand verzameld om deze te poolen tot een maandstaal. Daarnaast werden in Houtem en Zelzate glasvezelfilters bemonsterd met een frequentie van 1 op 6 dagen. De staalvoorbereiding gebeurde in functie van de biologische testsystemen. Van een deel van de beladen teflonfilter werden de partikels verzameld, een deel werd gebruikt voor het bepalen van het radicaalgenererend vermogen en het overige deel van de filter werd geëxtraheerd (ASE = Accelerated Solvent Extraction) om specifiek de organische componenten te weerhouden. Op de glasvezelfilters werd een organische extractie uitgevoerd. Afhankelijk van het testsysteem en het eindpunt, werden of de partikels of het organische extract toegevoegd om de toxicologische responsen te meten. Een batterij van testen werd uitgevoerd op de verzamelde luchtstalen in de meetcampagne in functie van Joaquin. De cytotoxiciteit (niet-specifieke cellulaire schade) van de PM10-fractie, de potentie om cellen te beschadigen, werd bepaald m.b.v. de neutraal rood test. Hiervoor werd gebruik gemaakt van de Beas-2B cellijn (humane bronchiale epitheliale adherente cellijn). Tegelijkertijd werden immunotoxische (inflammatoire) effecten in deze cellen geëvalueerd door de inductie van il-8 te bepalen. Partikelstalen werden getest voor aanwezigheid van endotoxines. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een kwantitatieve LAL-testkit. Om genotoxische effecten te meten werden enerzijds de extracten getest op hun mutageen karakter in de Ames II-test met de stam TA98 in de aan- en afwezigheid van de metaboliserende fractie S9 en werd anderzijds de komeettest uitgevoerd met partikels op de bronchiale epitheel cellijn Beas-2B. Na blootstelling van Beas-2B-cellen werd de alkalische komeettest uitgevoerd om DNA-schade te meten. De alkalische komeettest laat toe om een onderscheid te maken tussen DNA-breuken die een gevolg zijn van oxidatieve en niet-oxidatieve schade aan het DNA. Om het radicaalgenererend vermogen van partikels te bepalen werd een niet-biologische test meegenomen. Het vermogen van fijn stof om zuurstofradicalen te genereren, reflecteert de mate waarin het biologische schade kan veroorzaken. Op basis van de koppeling van de twee campagnes werden alle testen voor effectgericht meten uit de meetcampagne te Borgerhout weerhouden in de meetcampagne van de Gentse Kanaalzone, en werden bijkomend testen geselecteerd voor hormoonverstoring (ERE- en ARE-test). Voor het testen van de estrogene activiteit werd gebruik gemaakt van de humane BG1Luc4E2-eierstokkankercellijn (ERα positief). Androgene activiteit wordt gekwantificeerd met de humane T47D-ARE-borstkankercellijn. Gebiedsvergelijking Borgerhout-Houtem Humane bronchiale epitheelcellen werden blootgesteld aan een concentratiereeks van de partikelfractie afkomstig van de bemonsterde filters uit Borgerhout en Houtem. De leefbaarheid van de cellen is concentratie-afhankelijk (p<0.01). Het gemiddelde cytotoxisch effect bij de hoogste blootstellingsconcentratie bedraagt 24 ± 2.5(95% CL)% en 22 ± 6.2(95% CL)% voor respectievelijk Borgerhout en Houtem. Het schadelijk karakter van de partikels uit Borgerhout is niet significant verschillend van de partikels uit Houtem (p=0.135). Het toxisch effect varieerde van dag tot dag. In de wintermaanden is het schadelijk effect het grootst. Het inflammatoir potentieel van de partikels uit het stedelijk gebied Borgerhout is significant hoger ten opzichte van de partikels uit Houtem (p=0.002). De immunologische responsen bleken eerder op te treden in stalen van het voorjaar en de zomer, en konden niet volledig toegeschreven worden aan de aanwezigheid van endotoxines op de partikels. De inflammatoire capaciteit van de

Samenvatting

III

partikelfractie is concentratie afhankelijk (p<0.05) en varieerde sterk van dag tot dag. In de lente en zomermaanden van 2013 werd de hoogste activiteit gemeten. In meer dan de helft van de stalen werden endotoxineconcentraties gemeten boven de detectielimiet. De gemiddelde endotoxineconcentratie is verhoogd in Borgerhout (0.75 EU/ml) in vergelijking met Houtem (0.38 EU/ml). Er is een sterke dag tot dag variatie in de endotoxine-concentratie van de stalen. De hoogste concentraties werden gemeten in de zomermaanden juli en augustus 2013. Het radicaalgenererend vermogen van de partikels werd bepaald met behulp van een niet-biologische test. De meetresultaten van alle filters lagen boven de detectielimiet. Het oxidatief potentieel van PM10 uit Borgerhout (3655 AU/m3) is significant verhoogd t.o.v. Houtem (1035 AU/m3). De mutagene activiteit van de extracten werd bepaald bij blootstelling aan 20 m3 lucht-equivalent Zowel de directe (-S9) als de indirecte (+S9) mutagene activiteit is significant verhoogd in Borgerhout t.o.v. Houtem (p=0.04 (-S9) en p=0.03 (+S9)). Er kon geen verschil aangetoond worden in niet-oxidatieve DNA-schade tussen luchtstalen uit Borgerhout en Houtem (p=0.309). DNA-breuken als gevolg van oxidatieve schade waren daarentegen verhoogd in Houtem in vergelijking met Borgerhout (p=0.203). Als enkel de dagen (n=15) waarop op beide locaties de luchtstalen werden getest worden vergeleken, kon er geen statistisch significant verschil meer aangetoond worden in oxidatieve en niet-oxidatieve DNA-schade door partikels uit Borgerhout en Houtem (p=0.172). Gebiedsvergelijking Zelzate-Houtem Het cytotoxische potentieel van de partikels uit Zelzate werd getest in de Beas-2B cellijn. De gemiddelde vermindering in leefbaarheid van de cellen na blootstelling aan 100 µg PM10/ml bedroeg 31.8 ± 12.2 (95% CL) %. Het schadelijk karakter van de partikels uit Zelzate (n=13) was niet verschillend van deze uit Houtem (n=18) (p=0.114). Inflammatoire activiteit werd slechts vastgesteld in 3 van de 13 dagstalen uit Zelzate. De inflammatoire capaciteit van PM10 lag significant lager in Zelzate dan in Houtem (p=0.003). In 6 van de 13 stalen uit Zelzate werden endotoxineconcentraties gemeten boven de detectielimiet (0.1 EU/ml). De gemiddelde endotoxineconcentratie is verhoogd in Houtem (0.56 EU/ml) in vergelijking met Zelzate (0.17 EU/ml) maar het verschil is niet significant (p=0.6). De hogere gemiddelde waarde voor Houtem is te wijten aan 2 dagen met hoge endotoxineconcentraties. In de campagneperiode varieerde het radicaalgenererend vermogen van het fijn stof in Zelzate tussen 583 en 5317 AU/m3 met een gemiddelde van 2430 AU/m3. Het radicaalgenererend vermogen van PM10 uit Zelzate is significant verhoogd t.o.v. Houtem (p=0.03). Er kon geen statistisch significant verschil aangetoond worden in oxidatieve en niet-oxidatieve DNA-schade tussen partikels uit Zelzate (n=12) en Houtem (n=8) (p=0.46 (oxidatieve schade), p=0.07 (breuken)). De directe mutagene activiteit was significant verhoogd in Zelzate t.o.v. Houtem (p=0.05). De indirecte mutagene activiteit verschilde niet tussen beide locaties (p=0.14). Bij 10% van de glasvezelfilters kon geen estrogene activiteit berekend worden door het optreden van celdood. Er kon geen statistisch significant verschil in estrogene activiteit aangetoond worden tussen Zelzate en Houtem. De resultaten van de ARE-test tonen aan dat er geen agonistische androgene effecten meetbaar zijn in de PM10-extracten, maar dat er mogelijk wel antagonistische androgene stoffen aanwezig zijn in de extracten. Identificatie van gezondheidsrelevante polluenten Om te bepalen welke fysische en chemische determinanten een mogelijke verklaring kunnen zijn voor de waargenomen effecten werden de toxicologische resultaten vergeleken met enerzijds de fysische en chemische karakteristieken van de stofdeeltjes en anderzijds de meteorologische omstandigheden. Associaties tussen de biologische effectparameters en de fysicochemische

Samenvatting

IV

parameters werden getest via niet-parametrische Spearman rank-correlatie (significantieniveau van 0,05). Om de power van de analyse te verhogen werden de meetgegevens van Borgerhout, Houtem en Zelzate samengevoegd om de correlatie uit te voeren. Gegevens over de fysische en chemische samenstelling van omgevingslucht en de meteorologische condities werden ter beschikking gesteld door VMM en KMI. De overleving van de luchtwegcellen daalt met stijgende concentraties van black carbon (r=-0.27, p=0.005), elementaire koolstof (r=-0.26, p=0.045), de ionen Cl- (r=-0.32, p=0.01), Na+ (r=-0.26, p=0.04) en K+ (r=-0.37, p=0.003), de metalen cadmium (r=-0.27, p=0.005), lood (r=-0.20, p=0.04), en antimoon (r=-0.24, p=0.02) en de producten van houtverbranding in de omgevingslucht (levoglucosan (r=-0.42, p=0.001), galactosan (r=-0.46, p<0.001) en mannosan (r=-0.35, p=0.006)). De gemeten immuunreactie in bronchiale Beas-2B cellen is gecorreleerd met de concentratie van verschillende zware metalen in de omgevingslucht. De Spearman rank correlaties tonen aan dat er een significante correlatie is tussen de productie van het inflammatoire cytokine il-8 en de metalen Cu (r=0.25, p=0.011), Mn (r=0.22, p=0.027) en Zn (r=0.4, p<0.001). De aanwezigheid van Cl- ionen en produkten van houtverbranding in de omgevingslucht vertonen een negatieve correlatie met de il-8 inductie in Beas-2B. De cytokine inductie door PM10 in Beas-2B kon niet gecorreleerd worden met de aanwezigheid van black carbon en het radicaalgenererend vermogen van de partikels. Er werden geen verbanden gevonden tussen niet-oxidatieve DNA-breuken en de chemische componenten black carbon, organische en elementaire koolstof, ionen, metalen en producten van houtverbranding in de omgevingslucht. DNA-breuken door oxidatieve schade werden enkel verhoogd bij stijgende concentraties van cadmium (r=0.26, p=0.03) in PM10. De hoeveelheid zwevend stof (massa PM10 en PM2.5) zijn bepalend voor de intensiteit van de mutagene potentie van het fijn stof (r=0.5, p<0.001). De gemeten mutagene activiteit (direct en indirect) van de filterextracten kon gerelateerd worden aan het totale PAK-gehalte (-S9: r=0.5, p<0.001; +S9: r=0.5, p<0.001) en aan de som van zowel de carcinogene PAK’s (-S9: r=0.6, p<0.001; +S9: r=0.6, p<0.001) als de niet-carcinogene PAKs (-S9: r=0.4, p<0.001; +S9: r=0.4, p<0.001). Er werd ook een verband aangetoond tussen de directe en indirecte mutageniciteit en het radicaalgenererend vermogen van PM10 (-S: r=0.5, p<0.001; +S9: r=0.5, p<0.001), de hoeveelheid black carbon (roetdeeltjes) (-S9: r=0.7, p<0.001; +S9: r=0.7, p<0.001), organische (-S9: r=0.6, p<0.001; +S: r=0.5, p<0.001) en elementaire (-S9: r=0.7, p<0.001; +S9: r=0.7, p<0.001) koolstof en

de merkers voor houtverbranding in de omgevingslucht (-S9: r=0.8, p<0.001; +S9: r=0.8, p<0.001). Er kon een verband aangetoond worden tussen de gemeten oestrogene activiteit in de extracten en de PM10-massa (r=0.27, p=0.035), black carbon (r=0.27, p=0.024) en de som van de niet-carcinogene PAK’s (r=0.2,. p=0.044). Er werd een verband aangetoond tussen het radicaalgenererend vermogen van de fijn stof stalen op teflonfilters en verschillende metalen in de omgevingslucht: lood (r=0.7, p<0.001); zink (r=0.7, p<0.001); koper (r=0.8, p<0.001); arseen (r=0.4, p=0.001); mangaan (r=0.5, p<0.001); cadmium (r=0.5, p<0.001); chroom (r=0.8, p<0.001); ijzer (r=0.5, p=0.016); molybdeen, (r=0.6, p=0.004); aluminium (r=0.7, p=0.036) en barium (r=0.5, p=0.014). Het radicaalgenererend vermogen neemt ook toe bij stijgende concentraties van PM10 (r=0.37, p=0.012), PM2.5 (r=0.35, p=0.015), elementaire koolstof (r=0.53, p=0.021) en black carbon (r=0.8, p<0.001) in de omgevingslucht. Invloed van meteorologische omstandigheden Associaties tussen de biologische effectparameters en de meteorologische parameters werden getest via niet-parametrische Spearman rank-correlatie (significantieniveau van 0.05). Bij hogere temperaturen was het toxisch effect van de partikels lager (r=0.3, p=0.002). Er werd een verband aangetoond tussen de omgevingstemperatuur en de capaciteit van PM10 om il-8 te induceren in de longcellen (r=0.55, p<0.001). Ook de endotoxinegehaltes in PM10 nemen toe bij stijgende temperatuur (r=0.50, p<0.001). Zowel de directe (r=-0.36, p<0.001) als indirecte (r=-0.38, p<0.001) mutagene capaciteit van de PM10-extracten verhogen als de omgevingstemperatuur

Samenvatting

V

daalt. Ook de oxidatieve DNA-schade in de komeettest (r=-0.3, p=0.007) en de oestrogene activiteit in de extracten (r=-0.25, p=0.04) zijn hoger bij lagere omgevingstemperaturen. Het radicaalgenerend vermogen bleek niet beïnvloed te worden door de omgevingstemperatuur. Er werd geen significant verband gevonden tussen de hoeveelheid neerslag en de oxidatieve potentie, de inflammatoire activiteit, de directe mutageniciteit en de hormoonverstorende capaciteit van het fijn stof. Er werd een zwak verband aangetoond tussen de indirecte mutagene capaciteit en de hoeveelheid neerslag (r=-0.21, p=0.034): hoe meer neerslag des te lager de mutagene capaciteit. De resultaten toonden aan dat bij sterke wind (hoge windsnelheid) er een afname is van zowel de directe (r=-0.46, p<0.001) als de indirecte (r=-0.44, p<0.001) mutagene capaciteit en van het radicaalgenererend vermogen (r=-0.5, p<0.0001) van het fijn stof. Meervoudige lineaire regressie analyse Door middel van een stapsgewijze selectieprocedure werd voor elke eindpunt een meervoudig lineair regressiemodel opgebouwd waarbij enkel de confounder en de significante verklarende parameters (p<0.05) in het model blijven. Voor mutagene en oestrogene activiteit werd PM10 geselecteerd als confounder. Er kon een significante positieve associatie worden aangetoond tussen de directe (-S9) en indirecte mutagene (+S9) activiteit met levoglucosan in de omgevingslucht (respectievelijk p=0.0003 en p<0.0001). De mutageniciteit van de stalen bleek tevens PM10 afhankelijk (respectievelijk p=0.06 en p=0.009). PM10-massa verklaarde respectievelijk 20% en 30% van de variantie in de directe en indirecte mutagene potentie terwijl levoglucosan verantwoordelijk was voor respectievelijk 16% en 28% van de totale variantie in het aantal gemeten revertanten in de af- en aanwezigheid van S9. De aanwezigheid van niet-carcinogene PAK’s verklaarde 16% van de variantie in de oestrogene activiteit van de stalen (p=0.006). Het schadelijk karakter van levoglucosan op de leefbaarheid van de bronchiale epitheelcellen werd bevestigd in het meervoudig model (p<0.0001). Bij een toename van levoglucosan in de omgevingslucht daalde de leefbaarheid van de cellen. Levoglucosan verklaarde 29% van de variantie in cytotoxiciteit van luchtstalen. De aanwezigheid van Cl- ionen (p=0.02) en levoglucosan (p<0.0001) in de omgevingslucht vertoonden een negatieve correlatie met de il-8 inductie in Beas-2B. Alhoewel er een significant positieve associatie werd gevonden tussen K+ concentratie en het inflammatoir karakter van de stalen (p=0.024), kon deze variabele slechts 0.4% van de totale variantie in il-8 inductie verklaren. Voor de komeet-test (niet-oxidatieve DNA-breuken) werd geen significant model gevonden. De positieve associatie tussen DNA-breuken als gevolg van oxidatieve schade en de Cd concentratie in de omgevingslucht werd bevestigd in het meervoudig model (p=0.023). De variantie in de oxidatieve potentie van de stalen (Teflonfilters) kon voor 74% verklaard worden door de aanwezigheid van Cr (p=0.004), Pb (p<0.0001) en BC (p<0.0001) in de omgevingslucht. De interactie van de verklarende variabelen met de omgevingstemperatuur en de windsnelheid werd eveneens getest. Er werd een significante interactie aangetoond tussen PM10 en temperatuur voor het effect op de directe (p=0.007) en indirecte (p=0.0007) mutageniciteit. Voor de andere biologische testen kon geen interactie worden aangetoond met de omgevingstemperatuur of de windsnelheid. Gezondheidskundig interpretatie Binnen het huidige Steunpunt Milieu en Gezondheid (2012-2015) werd een humane biomonitoringscampagne (HBM-studie) uitgevoerd in de Gentse Kanaalzone. De resultaten van de effectgerichte metingen werden vergeleken met humane gezondheidsgegevens uit de HBM-studie die beschikbaar zijn voor de jongeren uit het noordelijk studiegebied van de Gentse Kanaalzone, nl. 150 deelnemers met vragenlijstgegevens waarvan ook 83 met biomerkermetingen in bloed, urine en adem. De meetresultaten van 8 van de 14 dagstalen uit Zelzate komen in aanmerking voor deze analyses.

Samenvatting

VI

Voor de relaties tussen effectgerichte metingen (il-8 inductie, radicaalgenererend vermogen, oxidatieve komeettest) en de korte-termijneffect-biomerkers (immuunmerkers: uitgeademd NO (eNO), interleukine-1β in ademcondensaat, pH van ademcondensaat) en genotoxiciteits- en oxidatieve stressmerkers (komeettest, micronucleustest, 8-OH-deoxy-guanosine, mitochondriale DNA-schade (mtDNA)) werden partiële of gecorrigeerde correlatiecoëfficiënten berekend op basis van een niet-parametrische test (Spearman rank). Partiële correlaties werden gecorrigeerd voor geslacht, leeftijd, roken. De aangetoonde verbanden zijn onafhankelijk van de PM10-massa. Er werd nagegaan of er een verband kon aangetoond worden tussen de humane biomerkers voor inflammatie en het inflammatoir karakter (il-8 inductie in longcellen) en het oxidatief potentieel (ROS-test) van de luchtstalen. Er werd een verband aangetoond tussen de pH van het ademcondensaat en het inflammatoir karakter. Een daling van de pH wijst op ontstekingsreacties in de longen. De analyses tonen aan dat de pH van het condensaat verlaagd is als de inflammatoire potentie van de luchtstalen toeneemt (r=-0.24, p=0.035). Voor oxidatief potentieel van de partikels werd een tegengesteld effect waargenomen (r=0.28, p=0.01). De resultaten tonen daarentegen aan dat een verhoging van het oxidatief potentieel van fijn stof een verhoging van de productie van il-1β in ademcondensaat induceert (r=0.271, p=0.016). Er werd tevens een verband aangetoond tussen de inflammatiemerker eNO en de inflammatoire potentie van de luchtstalen maar de relatie was borderline niet-significant (r=0.17, p=0.08). Voor de biomerkers van DNA-schade kon enkel een significant verband aangetoond worden tussen komeettest (DNA-breuken) en het oxidatief potentieel van PM10 (r=0.29, p=0.01). Er werden geen significante associaties aangetoond tussen de effectgerichte metingen en de genotoxiciteitsmerkers micronucleus, mtDNA-inhoud in bloed en 8-OH-deoxyguanosine in urine. De beschikbare gezondheidsgegevens over astma, allergie en infecties tonen aan dat er geen verhoging is van long- en luchtwegaandoeningen in de Gentse Kanaalzone in vergelijking met de Vlaamse referentiepopulatie. De effectgerichte metingen geven geen indicatie van een verhoogde inflammatoire potentie van de luchtstalen uit Zelzate in vergelijking met Houtem. Deze studie leert ons dat il-8 inductie in Beas-2B na blootstelling aan PM10 eerder gecorreleerd kan worden aan de humane inflammatiemerkers (merkers voor recente blootstelling). In de HBM-studie werden geen significante verschillen waargenomen in schildklierhormoonwaarden in vergelijking met de referentie populatie. Voor puberteitsontwikkeling werden er geen verschillen gedetecteerd bij de jongens, maar waren er mogelijke indicaties voor verschillen in puberteitsontwikkeling bij meisjes. Deze resultaten moeten heel voorzichtig geïnterpreteerd worden omwille van de kleine subgroepen, grote impact van kleine verschillen in leeftijd, en inconsistentie tussen de verschillende eindpunten. In de huidige studie werd endocrien verstorende activiteit in de PM10-extracten afkomstig van Zelzate waargenomen die verschilden van de gemeten oestrogenen activiteit in de achtergrondlocatie.

Summary

VII

SUMMARY

1. Introduction This report combines the results of two studies in which in vitro assays were used for the assessment of air quality. The studies were carried out simultaneously and made use of the same background location. The study commissioned by the Flemish Environment Agency (VMM) within the framework of JOAQUIN (Joint Air Quality Initiative), an EU cooperation project supported by the INTERREG IVB Northwest-Europe programme, investigated the in vitro toxicity of PM10 collected in the urban area (Antwerp-Borgerhout) and a background site (Houtem). This study aimed (1) to measure different cellular responses (cytotoxicity, pro-inflammatory changes, DNA damage) of airway epithelial cells to PM10 and mutagenic and oxidative potential of PM10; (2) to provide more insights in identifying health-relevant pollutants with specific toxicity in relation to PM chemical characterization. The sampling campaign started on April 1, 2013 and ended on May 8, 2014. The study commissioned by the Environment, Nature and Energy Department (LNE) of the Flemish Government and within the framework of the Flemish Centre of Expertise on Environment and Health (2012-2015), investigated the in vitro toxicity of PM10 collected in the Ghent Canal zone (Zelzate) and the background location (Houtem). PM-mediated cellular responses (cytotoxicity, pro-inflammatory changes, DNA damage) of airway epithelial cells to PM10 and endocrine disruptive, mutagenic and oxidative potential of PM10 were assessed. The aims of the study were (1) to verify whether the air quality based on the cellular and oxidative responses in the Ghent Canal zone is different compared to a background site in Flanders; (2) the identification of health-relevant pollutants through analysis of the relationship between the in vitro measurements and PM10 composition; (3) to investigate whether human biomarkers from the local human biomonitoring campaign in adolescents were related to in vitro results. The sampling campaign started on April 1, 2013 and ended on January 31, 2014. In a first phase, both projects worked out a concrete and fully integrated monitoring strategy. This included the selection of the PM sampling locations, the frequency and method of sampling and the selection of test systems. The measuring strategy was aligned with the physicochemical measurements in the different monitoring networks of VMM and the human biomonitoring campaign in the Ghent Canal zone.

2. Methods

2.1. PM sampling The sampling campaigns were conducted at three locations in Flanders: an industrial area (Zelzate), an urban area (Borgerhout) and a background location (Houtem). The location Zelzate is representative for an industrial background due to its location near the industrial canal zone Ghent-Terneuzen. The urban site Borgerhout is located near the ring road of the city of Antwerp, the location is representative for an urban background site with meaningful traffic influence. The measurement site in Houtem is generally considered as a rural background site. The station is located in the middle of the polders 500 m from the French-Belgian border, 2 km from the center of Houtem (700 inhabitants), slightly more than 8 km from the Belgian coast and 15 km from Duinkerke.

Summary

VIII

Samples were collected using a high volume sampler, Digitel DHA-80 (Digitel, Hegnau, Switzerland) with a PM10 pre-separator. Samples were collected on Teflon T38 filters (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) or Munktell glass fiber filters. The filters were changed automatically after 24 h. Sampling in Borgerhout and Houtem was conducted during the period April 2013-May 2014. The sampling schedule was designed to sample with an interval of 6 days in Borgerhout and with an interval of 12 days in Houtem, yielding 61 days in Borgerhout and 34 days in Houtem over a 1-year period. The sampling occurred simultaneously on the two locations (Borgerhout and Houtem). In Zelzate, the frequency of sampling on Teflon filters matched with the human biomonitoring campaign between April 2013 and January 2014. Samples (n=14 days) were collected during the 24h-period preceding the medical examination day of the study population. Besides that, extra samples were collected and pooled per month after extraction. In addition, glass fiber filters were sampled in Houtem and Zelzate with a frequency of 1 in 6 days during the period April 2013-January 2014. Filters were stored at -20°C until further handling.

2.2. PM characterisation Information on the mass and composition of ambient aerosol throughout the campaign was obtained by VMM: daily PM concentrations (µg/m3) (PM10 and PM2.5); elemental carbon (EC), organic carbon (OC) and total carbon (TC = EC + OC) (µg/m³) in PM10; several polyaromatic hydrocarbons in TSP (PAHs) (naphthalene, acenaphtylene, acenaphthene, fluorene, fenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, benzo(a)anthracene, chrysene, benzo(b)fluoranthene, benzo(k)fluoranthene, benzo(e)pyrene, benzo(a)pyrene, dibenzo(a,h)anthracene, benzo(g,h,i)-perylene and indeno(1,2,3-cd)pyrene); heavy metal concentrations (ng/m3) in PM10 (Pb, Zn, Cu, Ni, As, Mn, Cd, Cr), ion concentrations (µg/m³) in PM10 (NO3

-, Cl-, SO4-, NH4

+, K+, Mg2+, Ca2+); markers for wood burning including levoglucosan, galactosan, mannosan in PM10 and black carbon (BC) (µg/m3) in TSP. Meteorological conditions, such as air temperature, wind speed and precipitation amount were monitored and recorded during the sampling campaigns by VMM and RMI (Royal Meteorological Institute from Belgium).

2.3. PM preparation To perform toxicological characterisation using a battery of biological tests and oxidative potential analyses on the same sample, each daily Teflon filter was sectioned into 3 parts. A small part of the Teflon filter was used for oxidative potential (OP) analyses. Biological tests were performed using either the particle phase of the samples or an organic extract of the sample. A portion of the filters was used for particle extraction as described elsewhere [Salonen et al., 2004; Steerenberg et al., 2006]. Briefly, the collected PM10 samples were extracted from the Teflon substrate into pure methanol by sonication for 30 minutes. The suspension was evaporated using a rotavapor at 40 °C, 337 mbar and 100 rpm. The suspension was sonicated and transferred to a pre-weighed 1.5 ml conical tube. The tube was evaporated under N2 in a speedvac. The conical tube was subsequently weighed and the weight of the particles was determined. The particles were kept in the freezer at -20 °C. Half of the Teflon filter was extracted using Accelerated Solvent Extraction (Dionex ASE) [Nobels et al., 2012]. Each filter was loaded into 11 ml extraction cells. The extractions were performed at a pressure of 140 bar and a temperature of 100 °C. A solvent mixture of 1:1 hexane/acetone was used for extraction. Finally, the extracts were dried under N2 and dissolved in DMSO to obtain 20 m3 of air volume equivalents per 1 mL of extract volume. The extracts were stored at 4 °C prior to use in the bioassay. An organic extraction was also run on the glass fiber filters.

Summary

IX

2.4. Biological endpoints Cell culture

The BEAS-2B cell line was obtained from American Type Culture Collection (ATCC number: CRL-9609, LGC Promochem, Teddington, UK) and was originally derived from normal bronchial epithelial cells obtained from autopsy of noncancerous individuals. These cells were cultured as described before [Verstraelen et al., 2009; Remy et al., 2014].

Cytotoxicity BEAS-2B cells were seeded in 96-well plates 24 h before exposure to PM10. The cells (20,000 cells/96-well/200 µl) were exposed for 24 h to a concentration range of particles: 100, 50, 25, 12.5 and 0 µg PM10/ml medium. After PM exposure, the supernatants were collected and the viability of the cells was determined using the Neutral-Red Uptake test. Each concentration was tested in six fold.

Il-8 analyses The chemokine il-8 was measured in the supernatants using enzyme-linkedimmunosorbent assay (ELISA) kits (Life Technologies. Il-8 Human Antibody Pair (Novex®).

Endotoxin The presence of possible microbial endotoxin contamination in the samples, was assessed in the PM samples using a quantitative LAL (Limulus Amebocyte Lysate) test kit according to the manufactures instructions (QCL-1000 kit, Lonza).).

Comet assay BEAS-2B cells were seeded in 24-well plates 24 h before exposure to PM10. Cells were exposed to particles (100 μg PM10/ml). The amount of DNA-strand breaks was evaluated by the alkaline Comet assay (single cell gel electrophoresis assay) as described by Verschaeve et al. (2007). Median percentages of DNA migration in the tail areas were determined and used as a measure of DNA damage.

Ames II The test was performed with the Xenometrix Ames II Mutagenicity Test kit (Endotell). This Ames II-test, based on bacterial reverse mutations, was used to detect base pair substitutions or frameshift mutations, caused by a test item in Salmonella typhimurium bacterial strain TA98 [Smith et al., 2013]. The direct and indirect mutagenic potential was determined in the presence and absence of an exogenous activating metabolizing enzyme system (S9 mix). The mutagenic potential of each ASE extract was tested at 1 concentration (20 m3 air equivalent) in triplicate.

ERE assay and ARE assay The estrogenic activity was measured using the human BG1Luc4E2-ovarian carcinoma cell line (ERα positive). Androgenic activity was quantified with the human T47D-ARE breast cancer cell line. Transfected cells contain an estrogen or androgenic responsive element associated with a luciferase reporter gene (pSV2Neo and pGudLuc7) [Rogers and Denison., 2000; Ahn et al., 2008]. The hormone disrupting estrogenic or androgenic activity is proportional to the amount of luciferase enzyme produced in the cell. The activity of the sample extracts was quantified in relation to the reference standard (17β-estradiol E2 or dihydrotestosterone DHT).

2.5. Oxidative potential

The method used for the detection of oxidant (radical) generation capacity of PM is the electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy using the spin trap 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide

Summary

X

(DMPO) [Yang et al., 2014; Hellack et al., 2014]. The analysis was done by RIVM using a direct method without PM extraction from the filters.

2.6. Statistics For statistical analysis, we used Statistica and SAS software. Concentration-response relationships between PM exposure and the different toxicological responses were assessed by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s post-test. Comparison of data from different sites was determined by Factorial ANOVA followed by the Tukey’s multiple comparison post-test or non-parametric tests (Mann-Whitney U Test, Wilcoxon Matched Pairs Test). The statistically significance level was set at p = 0.05. Correlations between different biological responses and PM characteristics and meteorological conditions were primarily assessed using Spearman rank correlation. In addition, multiple linear regression analysis was conducted. Variables with a non-Gaussian distribution were logarithmically transformed. Explanatory variables were identified by a stepwise regression procedure with the p-values for variables to enter and to stay in the model set at 0.20. PM10 was selected as a confounder to investigate the associations between PM constituents and mutagenic and estrogenic activity. The confounders were forced into the multiple regression model regardless of their level of significance. Interactions between explanatory variables and temperature and wind speed on the biological responses were also considered. To increase statistical significance, data points from all sites were pooled in this analysis.

3. Results Comparison Borgerhout-Houtem Human bronchial epithelial cells were exposed to a concentration range of PM10 particles collected from the sampled filters from Borgerhout and Houtem. The viability of the cells was concentration-dependent (ANOVA, p < 0.01). The average reduction in cell viability at the highest exposure concentration was 24 ± 2.5 (95% CL)% and 22 ± 6.2 (95% CL)% for Borgerhout and Houtem respectively. The cytotoxic nature of the PM10 fraction was not significantly different between Borgerhout and Houtem (Factorial ANOVA, p = 0.135). The toxic effect varied from day to day. The detrimental effect of PM10 on cell viability was highest during the winter months. The inflammatory potential of particles as measured by il-8 induction in BEAS-2B cells was significantly higher in the urban area Borgerhout compared to the background location Houtem (Factorial ANOVA, p = 0.002). The immunological responses were more pronounced in samples collected during spring and summer, and could not be fully attributed to the presence of endotoxins on the particles. The inflammatory capacity was concentration dependent (ANOVA, p < 0.05) and varied greatly from day to day. Endotoxin concentrations above the detection limit were detected in more than half of the samples. The average endotoxin concentration was higher in Borgerhout (0.75 EU/ml) compared to Houtem (0.38 EU/ml) (Mann-Whitney U Test, p=0.11). A strong day to day variation in the endotoxin concentration of the samples was seen. The highest concentrations were measured in the summer months of July and August 2013. The radical generating ability of the particles (ROS) was determined using a non-biological test. All samples showed oxidative potential above the detection limit. The oxidative potential of PM10 from Borgerhout (3655 AU/m3) was significantly increased compared to PM10 from Houtem (1035 AU/m3) (Mann-Whitney U Test, p<0.01). The mutagenic activity of the extracts was assessed at a concentration of 20 m3 air-equivalent. Both direct (-S9) and indirect (+ S9) mutagenic activity were significantly increased in samples from Borgerhout compared to samples from Houtem (Mann-Whitney U test, p=0.04 (-S9) and p=0.03 (+S9)).

Summary

XI

No difference in non-oxidative DNA damage (comet) could be demonstrated between samples from Borgerhout and Houtem (Mann-Whitney U Test, p=0.31). On the other hand, DNA fractures resulting from oxidative damage (comet ox.)were significantly increased in samples from Houtem compared to samples from Borgerhout (Mann-Whitney U Test,. p=0.023). When considering only the contemporaneous days (n = 15) on which the samples were collected at both locations, no statistically significant difference could be demonstrated in oxidative and non-oxidative DNA damage between Borgerhout and Houtem (Wilcoxon Matched Pairs test, p=0.17 and p=0.17). A summary of the results of the Borgerhout campaign is presented in figure 1.

0,97

1,46

2,00

0,770,98

3,53

1,30 1,38

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

rati

o:

Bo

rge

rho

ut

vs. H

ou

tem

p=0,13 p=0,002 p=0,11 p=0,17 p=0,31 p<0,01 p=0,04 p=0,03

grey: no statistically significant difference

red: significant increase in Borgerhout

Figure 1: Summary of toxicological profile of Borgerhout compared to Houtem.

Comparison Zelzate-Houtem The cytotoxic potential of the particles from Zelzate was tested in Beas-2B cells. The average reduction in viability of the cells after exposure to 100 μg/ml PM10 was 31.8 ± 12.2 (95% CL)%. The harmful nature of the particles from Zelzate (n = 13) was not different from those from Houtem (n = 18) (Factorial ANOVA, p = 0.114). Inflammatory activity was only seen on 3 out of 13 samples from Zelzate. The inflammatory capacity of PM10 (il-8) was significantly lower in Zelzate compared to Houtem (Factorial ANOVA, p=0.003). Endotoxin concentrations above the detection limit (0.1 EU/ml) were measured in 6 out of 13 samples from Zelzate. The average endotoxin concentration was increased in Houtem (0.56 EU/ml) compared to Zelzate (0.17 EU/ml) but the difference was not significant (Mann-Whitney U Test, p=0.60). The higher average value for Houtem is due to 2 days with very high endotoxin concentrations.

Summary

XII

During the campaign period the radical generating ability (ROS) of PM10 in Zelzate ranged from 583 to 5317 AU/m3 with an average of 2430 AU/m3. The oxidative potential of PM10 from Zelzate was significantly increased compared to Houtem (Mann-Whitney U Test, p=0.03). No statistically significant difference in oxidative and non-oxidative DNA damage (comet) was seen between samples from Zelzate (n = 12) and Houtem (n = 8) (Mann-Whitney U Test, p=0.46 (oxidative DNA breaks), p=0.07 (DNA-strand breaks)). Direct mutagenic activity (without S9 mix) was significantly increased in Zelzate compared to Houtem (Wilcoxon Matched Pairs Test, p=0.05) while indirect mutagenic activity (+S9) did not differ between the two locations (Wilcoxon Matched Pairs Test, p = 0.14). Estrogenic activity could not be measured in 13% of the glass fiber filter extracts due to the induction of cell death. No statistically significant difference in estrogenic activity was seen between samples from Zelzate and Houtem (Wilcoxon Matched Pairs Test, p=0.43). The results of the ARE test showed no agonistic androgenic effects in the PM10 extracts, but there might be some antagonistic androgenic substances present in the extracts. A summary of the results of the campaign in the Ghent Canal area is presented in figure 2.

0,89

0,460,29

0,91

0,64

2,43

1,691,54

1,22

0,0

1,0

2,0

3,0

rati

o:

Zelz

ate

vs.

Ho

ute

m

p=0,11 p=0,003 p=0,24p=0,60 p=0,46 p=0,07 p=0,03 p=0,05 p=0,14

grey: no statistically significant difference

red: significant increase in Zelzate

green: significant decrease in Zelzate

Figure 2: Summary of toxicological profile of Zelzate compared to Houtem.

Identification of health-relevant pollutants In order to identify which physical and chemical determinants may provide a possible explanation for the observed adverse effects, the biological results were compared to either the physical or the chemical characteristics of PM10 and to the meteorological conditions. Associations between the biological effects and the physicochemical parameters were tested using nonparametric Spearman rank correlation. To increase the power of the statistical analysis, data from Borgerhout, Houtem

Summary

XIII

and Zelzate were pooled. Data on the physical and chemical composition of ambient air and the meteorological conditions were made available by VMM and RMI. The viability of the airway cells decreased with increasing concentrations of black carbon (r =-0.27, p = 0.005), elemental carbon (r = -0.26, p = 0.045), the ions Cl- (r =-0.32, p = 0.01), Na+ (r =-0.26, p = 0.04) and K+ (r =-0.37, p = 0.003), the metals cadmium (r =-0.27, p = 0.005), lead (r =-0.20, p = 0.04), and antimony (r =-0.24, p = 0.02) and the products of wood combustion in ambient air (levoglucosan (r =-0.42, p = 0.001), galactosan (r =-0.46, p < 0.001) and mannosan (r =-0.35, p = 0.006)). The inflammatory response in bronchial Beas-2B cells was correlated with the concentration of various heavy metals in ambient air. The Spearman rank correlations showed a significant correlation between the production of the inflammatory cytokine il-8 and the metals copper (r = 0.25, p = 0.011), manganese (r = 0.22, p = 0.027) and zinc (r = 0.4, p < 0.001). The presence of Cl- ions and products of wood combustion in ambient air showed a negative correlation with the il-8 induction. The cytokine induction by PM10 could not be correlated with the presence of black carbon and the oxidative potential of the particles. No correlation was seen between non-oxidative DNA damage and the chemical components black carbon, organic and elemental carbon, ions, metals and markers of wood combustion in the ambient air. Oxidative DNA strand breaks increased with increasing concentrations of cadmium (r = 0.26, p = 0.03) in PM10. The amount of particulate matter (PM10 and PM2.5 mass) determined the intensity of the mutagenic response (r = 0.5, p < 0.001). The measured mutagenic activity (direct and indirect) of the filter extracts was related to the total PAH content (-S9: r = 0.5, p < 0.001; + S9: r = 0.5, p < 0.001) and to the sum of both the carcinogenic PAHs (-S9: r = 0.6, p < 0.001; + S9: r = 0.6, p < 0.001) and non-carcinogenic PAHs (-S9: r = 0.4, p < 0.001; + S9: r = 0.4, p < 0.001). There was also a relation between the direct and indirect mutagenicity and oxidative potential of PM10 (-S: r = 0.5, p < 0.001; + S9: r = 0.5, p < 0.001), the amount of black carbon (soot particles) (-S9: r = 0.7, p < 0.001; + S9: r = 0.7, p < 0.001), organic (-S9: r = 0.6, p < 0.001; + S: r = 0.5, p < 0.001) and elemental (-S9: r = 0.7, p < 0.001; + S9: r = 0.7, p < 0.001) carbon and the markers for wood combustion in ambient air (-S9: r = 0.8, p < 0.001; + S9: r = 0.8, p < 0.001). A correlation was seen between the estrogenic activity in the extracts and PM10 mass (r = 0.27, p = 0.035), black carbon (r = 0.27, p = 0.024) and the sum of non-carcinogenic PAHs (r = 0.2, p = 0.044). No association was found between the oxidative ability of PM10 on Teflon filters and various metals in ambient air: lead (r = 0.7, p < 0.001); zinc (r = 0.7, p < 0.001); copper (r = 0.8, p < 0.001); arsenic (r = 0.4, p = 0.001); manganese (r = 0.5, p < 0.001); cadmium (r = 0.5, p < 0.001); chrome (r = 0.8, p < 0.001); iron (r = 0.5, p = 0.016); molybdenum, (r = 0.6, p = 0.004); aluminium (r = 0.7, p = 0.036) and barium (r = 0.5, p = 0.014). The oxidative potential increased with increasing concentrations of PM10 (r = 0.37, p = 0.012), PM2.5 (r = 0.35, p = 0.015), elemental carbon (r = 0.53, p = 0.021) and black carbon (r = 0.8, p < 0.001) in the ambient air. Influence of meteorological conditions The effect of meteorological conditions on the cellular responses was studied using nonparametric Spearman rank correlation (significance level of 0.05). PM10 toxicity decreased with increasing ambient temperatures (r = 0.3, p = 0.002). A positive correlation was seen between the ambient temperature and the capacity of PM10 to induce il-8 in the airway cells (r = 0.55, p < 0.001). Endotoxin levels in PM10 increased with increasing temperature (r = 0.50, p < 0.001). Both direct (r = -0.36, p < 0.001) and indirect (r = -0.38, p < 0.001) mutagenic capacity of the PM10 extracts increased as the ambient temperature decreased. Similarly, the oxidative DNA damage in the Comet assay (r = -0.3, p = 0.007) and the estrogenic activity in extracts (r = -0.25, p = 0.04) were higher at lower ambient temperatures. Ambient temperature had no effect on the oxidative potential of the samples.

Summary

XIV

No significant associations were found between the amount of rainfall and the oxidative potential, the inflammatory activity, the direct mutagenicity and hormone disrupting capacity of the samples. A weak inverse correlation was found between the indirect mutagenic capacity and the amount of rainfall (r = -0.21, p = 0.034). Results showed a negative correlation between wind speed and either the direct (r = -0.46, p < 0.001) or indirect (r = -0.44, p < 0.001) mutagenic capacity and of the oxidative potential (r =-0.5, p < 0.0001) of the samples. Multiple linear regression analysis A significant positive association was found between the direct (-S9) and indirect mutagenic (+ S9) activity and levoglucosan in the ambient air (respectively, p = 0.0003 and p < 0.0001). The mutagenicity of the samples was also related to ambient PM10 concentration (respectively, p = 0.06 and p = 0.009). PM10 mass explained respectively 20% and 30% of the variance in the direct and indirect mutagenic potential while levoglucosan explained respectively 16% and 28% of the total variance in the direct and indirect mutagenic activity of the samples. The presence of non-carcinogenic PAHs explained 16% of the variance in the estrogenic activity of the samples (p = 0.006). The harmful character of levoglucosan on the viability of the bronchial epithelial cells was confirmed in the multiple model (p < 0.0001). An increase of ambient levoglucosan decreased the viability of the bronchial cells. Levoglucosan explained 29% of the variance in cytotoxicity of the samples. The presence of Cl- ions (p = 0.02) and levoglucosan (p < 0.0001) in the ambient air showed a negative correlation with il-8 induction in Beas-2B cells. Although a significant positive association was found between K+ concentration and the inflammatory nature of the samples (p = 0.024), the latter explained only 0.4% of the total variance in il-8 induction. No significant statistical model was found for non-oxidative DNA breaks in the Comet-assay. However, the positive association between DNA fractures resulting from oxidative damage and ambient Cd concentrations was confirmed in the multiple model (p = 0.023). A total of 74% of the variance in the oxidative potential of the samples could be explained by the presence of chromium (p = 0.004), lead (p < 0.0001) and black carbon (p < 0.0001) in the ambient air. The interaction of the explanatory variables with the ambient temperature and the wind speed was also tested. A significant interaction between temperature and PM10 on the direct (p = 0.007) and indirect (p = 0.0007) mutagenicity was found. For the other biological tests interaction with the ambient temperature or the wind speed could not be demonstrated. Health interpretation Within the framework of the Flemish Centre of Expertise on Environment and Health (2012-2015), a human biomonitoring (HBM) population study was set up in the Ghent Canal zone. The results of the biological measurements on air samples (results of 8 of the 14 field work days from Zelzate were eligible for these analyses) were compared with human health data from the HBM study which were available from the study population (adolescents 14-15 years) from the northern study area of the Ghent Canal area. The study population included 150 participants with questionnaire data whereof 83 participants with biomarker data in blood, urine and breath. The relations between either cellular responses (il-8 induction, oxidative comet test) or oxidative potential of PM10 and the human biomarkers of effect reflecting recent exposure (immune markers including exhaled NO (eNO), interleukin-1β in breath condensate, pH of breath condensate), genotoxic and oxidative stress markers (comet test, micronucleus test, 8-OH-deoxy-guanosine in urine, mitochondrial DNA (mtDNA) damage) were analysed on the basis of a non-parametric test (Spearman rank). Partial or corrected correlation coefficients were calculated. Partial correlations were adjusted for gender, age and smoking. The associations were independent of PM10 mass. The relationship between human biomarkers of inflammation and either inflammatory potential (il-8 induction in airway cells) or the oxidative potential (ROS test) of the air samples was investigated.

Summary

XV

A significant relation between pH of the breath condensate and the inflammatory character of PM10 was demonstrated. A decrease in pH of the breath condensate is an indication of inflammatory reactions in the lungs. The analyses indicated that a reduction in the pH of the condensate was associated with an increase in the inflammatory potential of the air samples (r =-0.24, p = 0.035). Concerning the oxidative potential of PM10 an opposite effect was observed (r = 0.28, p = 0.01). On the other hand, an increase in the oxidative potential of PM10 was associated with an increase in the production of il-1β in breath condensate (r = 0.271, p = 0.016). A positive correlation was seen between the inflammatory marker eNO and the inflammatory potential of PM10 but the relationship was borderline non-significant (r = 0.17, p = 0.08). A positive correlation was found between the human biomarkers of DNA damage in the comet test and the oxidative potential of PM10 (r = 0.29, p = 0.01). No significant associations were found between the PM10-induced biological responses and the other human biomarkers of genotoxicity including the micronucleus, mtDNA content in blood and 8-OH-deoxyguanosine in urine. The available health data on asthma, allergy and infections (human biomarkers reflecting long-term exposure) showed no increase of lung and respiratory diseases in the Ghent Canal zone compared to the Flemish reference population. The cellular response of PM10 gave no indication of an increased inflammatory potential of the air samples from Zelzate in comparison to Houtem. From this study we can conclude that it is preferable to correlate il-8 induction in Beas-2B with human inflammation biomarkers reflecting recent exposure. No significant differences were observed in thyroid hormone values in the Ghent Canal zone compared to the Flemish reference population. Regarding pubertal development, no differences were detected for puberty development among the boys, but there might be some indications for differences in puberty development among girls. These results should be interpreted very cautiously because of the small subgroups, high impact of small differences in age, and inconsistency between different endpoints. In the current study no differences in endocrine disruptive activity in the PM10 extracts from Zelzate were observed compared to the estrogen activity in the background location.

4. Conclusion The following conclusions are the core messages resulting from the two studies in which in vitro toxicity of PM10 was used for the assessment of air quality. Campaigns The particulate matter samples (PM10 dust) collected in the urban area Borgerhout, the industrial area Zelzate and a background location Houtem were toxicologically characterised using a battery of tests. Different cellular responses (cytotoxicity, pro-inflammatory changes, DNA damage) of airway epithelial cells to PM10, the mutagenic and oxidative potential of PM10 and the presence of endotoxins were evaluated in samples from Borgerhout. PM-mediated cellular responses (cytotoxicity, pro-inflammatory changes, DNA damage) of airway epithelial cells to PM10 and endocrine disruptive, mutagenic and oxidative potential of PM10 were assessed in samples from Zelzate and Houtem. The studies have shown that the air quality for a given location can be characterised

toxicologically.

Summary

XVI

The PM10 fraction induced a concentration-dependent decrease in cell viability and an increase in inflammatory cytokine induction (il-8).

Compared to the background location a significant increase in inflammatory mutagenic and oxidative potential of PM10 collected in Borgerhout was seen.

Compared to the background location a significant increase in mutagenic and oxidative potential of PM10 collected in Zelzate was seen. On the other hand, the inflammatory capacity was significantly lower in Zelzate compared to Houtem.

Using the ARE assay, it was shown for the second time that substances with estrogenic activity are present in the Flemish ambient air. The results of the ARE test showed no agonistic androgenic effects in the PM10 extracts, but antagonistic androgenic substances might be present in the extracts.

Identification of health relevant pollutants The biological in vitro measurements can help to identify which characteristics of air pollution in addition to PM mass, such as particle size, chemical composition, oxidative potential, … are most related to health effects due to exposure to air pollution. Toxicological characterisation of PM10 using a battery of in vitro tests aims to give more insight into the unhealthy properties of the mixture of substances present in ambient air. Biological assays respond to the mixture of all substances together and directly take into account the bioavailability of the compounds. To determine which physical and chemical determinants provide a possible explanation for the observed in vitro effects, the toxicological results were compared to either the physical or chemical characteristics of PM10 or the meteorological conditions. The results of this study agree with other studies which have shown that both PM mass as well

as the chemical composition of particulate matter determine the observed in vitro toxicity.

o The survival of the airway cells decreased with increasing concentrations of black carbon, elemental carbon, ions (Cl-, Na+, NH4

+ and K+), the metals cadmium, lead, and antimony and the presence of products of wood combustion in the ambient air.

o The observed inflammatory response was correlated with the presence of metals (copper, manganese and zinc).

o DNA strand breaks due to oxidative damage were increased with increasing concentrations of cadmium in PM10.

o The measured mutagenic activity (direct and indirect) of the filter extracts could be related to the total PAH content and to the sum of the carcinogenic and non-carcinogenic PAHs, the oxidative ability of PM10, the amount of black carbon, organic and elemental carbon and the markers for wood combustion in ambient air.

o A relationship was seen between the measured estrogenic activity in the extracts and black carbon and the sum of non-carcinogenic PAHs.

o Oxidative potential of PM10 on Teflon filters was associated with various metals in ambient air (lead, zinc, copper, arsenic, manganese, cadmium, chromium, iron, molybdenum, aluminum, barium), elemental carbon and black carbon in the ambient air.

Summary

XVII

o No chemical component was predictive for all studied health endpoints. The results of this study gave no evidence that neither the PM characteristics nor the oxidative potential were a better predictor for the harmful health effect of PM compared to particle mass concentration.

Variation of biological responses was evaluated using physico-chemical measurements as explanatory variables in multi-variate linear regression analyses.

o The harmful nature of levoglucosan on the viability of the bronchial epithelial cells was confirmed in the multiple model. Levoglucosan explained 29% of the variance in cytotoxicity of air samples.

o The presence of Cl- ions in the ambient air and levoglucosan showed a negative correlation with the IL-8 induction in Beas-2B.

o The positive association between DNA breaks resulting from oxidative damage, and ambient Cd concentration was confirmed in the multiple regression model.

o A significant positive relationship was found between the direct (-S9) and indirect (+ S9) mutagenic activity and ambient levoglucosan. The mutagenic activity also depended on the PM10 mass concentrations.

o The presence of non-carcinogenic PAHs explained 16% of the variance in the estrogenic activity of the samples.

o The presence of chromium, lead and black carbon in the ambient air explained 74% the variance in the oxidative potential of the samples.

o A significant interaction was found between PM10 and temperature for the effect on the mutagenicity. No significant interactions between wind speed and PM characteristics were found.

Relation to human biomarkers in adolescents living in the Ghent Canal zone The study population In the Ghent Canal zone included 150 participants with questionnaire data whereof 83 participants with biomarker data in blood, urine and breath. Combining the human biomarker results and the biological in vitro results allowed to investigate whether biological tests can be used to estimate the human health effect of air quality. Associations were found between biological toxicity tests and markers for airway inflammation

and DNA damage in the study population.

o The analyses showed that the pH of the breath condensate decreased as the inflammatory potential of the air samples increased. A decrease in pH indicates inflammatory reactions in the lungs.

o An increase in the oxidative potential of PM10 samples induced an increase in the production of il-1β in breath condensate of the adolescents, reflecting more inflammation.

o A positive relation was seen between the inflammation marker eNO and the inflammatory potential of the air samples.

o Higher oxidative potential of PM10 was associated with more DNA breaks in blood of the adolescents as measured by the comet assay.

The available health data on asthma, allergy and infections showed no increase of lung and respiratory diseases in the Ghent Canal zone compared to the Flemish reference population. The results on il-8 induction gave no indication of an increased inflammatory potential of the air samples from Zelzate in comparison with Houtem.

Summary

XVIII

o From this study we can conclude that it is preferable to correlate il-8 induction in Beas-2B with human inflammation biomarkers reflecting recent exposure.

o IL-8 induction is a marker for inflammation and is not suitable for screening the sensitising potential (induction of allergic reaction).

No significant differences were observed in thyroid hormone values and puberty development

in the Ghent Canal zone compared to the Flemish reference population. In the current study no differences in endocrine disruptive activity in the PM10 extracts from Zelzate were observed compared to the estrogen activity in the background location.

Reference List

Ahn KC, Zhao B, Chen J, Cherednichenko G, Sanmarti E, Denison M S, Lasley B, Pessah I N, Kultz D, Chang D P, Gee S J, Hammock B D. 2008. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116 1203-1210.

Hellack B, Yang A, Cassee F, Janssen N A, Schins R P, Kuhlbusch T A J. 2014. Intrinsic hydroxyl radical generation measurements directly from sampled filters as a metric for the oxidative potential of ambient particulate matter . Journal of Aerosol Science 72 47-55.

Nobels I, Vanparys C, Van Den Heuvel R, Vercauteren J, Blust R. 2012. Added value of stress related gene inductions in HepG2 cells as effect measurement in monitoring of air pollution. Atmospheric Environment 55 154-163.

Remy S, Verstraelen S, Van Den Heuvel R, Nelissen I, Lambrechts N, Hooyberghs J, Schoeters G. 2014. Gene expressions changes in bronchial epithelial cells: markers for respiratory sensitizers and exploration of the NRF2 pathway. Toxicol. In Vitro 28 209-217.

Rogers JM, Denison M S. 2000. Recombinant cell bioassays for endocrine disruptors: development of a stably transfected human ovarian cell line for the detection of estrogenic and anti-estrogenic chemicals. In Vitr. Mol. Toxicol. 13 67-82.

Salonen RO, Halinen A I, Pennanen A S, Hirvonen M R, Sillanpaa M, Hillamo R, Shi T, Borm P, Sandell E, Koskentalo T, Aarnio P. 2004. Chemical and in vitro toxicologic characterization of wintertime and springtime urban-air particles with an aerodynamic diameter below 10 microm in Helsinki. Scand. J Work Environ Health 30 Suppl 2 80-90.

Smith KE, Heringa M B, Uytewaal M, Mayer P. 2013. The dosing determines mutagenicity of hydrophobic compounds in the Ames II assay with metabolic transformation: passive dosing versus solvent spiking. Mutat. Res. 750 12-18.

Steerenberg PA, van Amelsvoort L, Lovik M, Hetland R, Alberg T, Halatek T, Bloemen H, Rydzynski K, Swaen G, Schwarze P, Dybing E, Cassee F R. 2006. Relation Between Sources of Particulate Air Pollution and Biological Effect Parameters in Samples from Four European Cities: An Exploratory Study. Inhalation Toxicology 18 333.

Verschaeve L, Koppen G, Gorp U V, Schoeters G, Jacobs G, Zwijzen C. 2007. Seasonal variations in spontaneous levels of DNA damage; implication in the risk assessment of environmental chemicals. J. Appl. Toxicol. 27 612-620.

Summary

XIX

Verstraelen S, Nelissen I, Hooyberghs J, Witters H, Schoeters G, Van Cauwenberge P, Van Den Heuvel R. 2009. Gene profiles of a human bronchial epithelial cell line after in vitro exposure to respiratory (non-)sensitizing chemicals: Identification of discriminating genetic markers and pathway analysis. Toxicology 255 151-159.

Yang A, Jedynska A, Hellack B, Kooter I, Hoek G, Brunekreef B, Kuhlbusch T A, Cassee F, Janssen N A. 2014. Measurement of the oxidative potential of PM2.5 and its constituents: The effect of extraction solvent and filter type. Atmospheric Environment 83 35-42.

Inhoud

XX

INHOUD

Samenvatting ____________________________________________________________________ I

Summary _____________________________________________________________________ VII

Inhoud _______________________________________________________________________ XX

Lijst van tabellen ______________________________________________________________ XXII

Lijst van figuren _______________________________________________________________ XXIII

Lijst van afkortingen en Symbolen ________________________________________________ XXV

1 Inleiding ___________________________________________________________________ 1

1.1 Meetcampagne in Borgerhout 1

1.2 Meetcampagne in Gentse Kanaalzone 1

2 Meetcampagne _____________________________________________________________ 3

2.1 Locaties 3 2.1.1 Stedelijk gebied Borgerhout ____________________________________________ 3 2.1.2 Industrieel gebied Gentse Kanaalzone ____________________________________ 3 2.1.3 Achtergrond-referentiegebied Houtem ___________________________________ 4

2.2 Procedures monsterneming 6 2.2.1 Bemonsteringstoestellen ______________________________________________ 6 2.2.2 Filterkeuze _________________________________________________________ 6 2.2.3 Frequentie van bemonsteren ___________________________________________ 7

2.3 Procedures staalbehandeling 15 2.3.1 Organische extractie _________________________________________________ 16 2.3.2 Verzamelen van de partikels __________________________________________ 17

2.4 Effectgerichte metingen 19 2.4.1 Meetcampagne Borgerhout ___________________________________________ 19 2.4.2 Meetcampagne Gentse Kanaalzone _____________________________________ 19 2.4.3 Beschrijving testsystemen ____________________________________________ 22

3 Toxicologisch profiel Borgerhout ______________________________________________ 25

3.1 Cytotoxiciteit 25

3.2 Radicaalgenererend vermogen 26

3.3 Endotoxine 29

3.4 Il-8 inductie 31

3.5 Ames II 32

3.6 Komeettest 33

3.7 Toxicologisch profiel van Borgerhout 34

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone __________________________________ 36

Inhoud

XXI

4.1 Cytotoxiciteit 36

4.2 Radicaalgenererend vermogen 37

4.3 Endotoxine 38

4.4 Il-8-inductie 40

4.5 Ames II 41

4.6 Komeettest 42

4.7 ERE-test 43

4.8 ARE-test 47

4.9 Toxicologisch profiel van Zelzate 48

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit _______________________________________ 50

5.1 Relatie effectgerichte metingen en fysicochemische samenstelling 50

5.2 Relatie effectgerichte metingen en meteorologische metingen 60

5.3 Meervoudige regressie analyse 62 5.3.1 Statistisch analyse ___________________________________________________ 62 5.3.2 Resultaten _________________________________________________________ 63

6 Effectgerichte metingen en humane biomonitoring ________________________________ 65

6.1 Humane biomonitoring 65

6.2 Relatie effectgerichte metingen met biomerkers van inflammatie en DNA-schade 66

6.3 Relatie effectgerichte metingen met biomerkers van astma, allergie, infecties en hormoonverstoring 69

7 Conclusie __________________________________________________________________ 71

Literatuurlijst __________________________________________________________________ 76

Bijlagen _______________________________________________________________________ 82

Bijlage 1: Cytotoxiciteit 82

Bijlage 2: Radicaalgenererend vermogen 88

Bijlage 3: il-8 inductie 90

Bijlage 4: Endotoxine 93

Bijlage 5: Ames II 95

Bijlage 6: Komeettest 106

Bijlage 7: ERE test 109

Lijst van tabellen

XXII

LIJST VAN TABELLEN

Tabel 1: Staalname dagen en filtercodering in Borgerhout en Houtem. ______________________ 8 Tabel 2: Staalnamedagen en filtercodering van glasvezelfilters in Houtem. __________________ 11 Tabel 3: Staalname dagen en filtercodering van teflonfilters voor dagstalen in Zelzate. ________ 12 Tabel 4: Staalnamedagen en codering voor poolstalen in Zelzate. _________________________ 13 Tabel 5: Overzicht van de filters voor ROS analyse. _____________________________________ 15 Tabel 6: Overzicht van de massa’s PM10 na methanolextractie. ___________________________ 17 Tabel 7: Overzicht van de testsystemen. _____________________________________________ 21 Tabel 8: Endotoxine concentratie in de PM10-fractie uit Borgerhout en Houtem. _____________ 29 Tabel 9: Endotoxine concentratie in de PM10-fractie uit Zelzate en Houtem. _________________ 39 Tabel 10: Mutagene activiteit (revertanten/20 m3-luchteq) van extracten. __________________ 42 Tabel 11: Oestrogene activiteit van PM10-extracten (fg E2 eq/m³). _________________________ 45 Tabel 12: Overzicht resultaten Zelzate androgene verstoring. Df is dilutiefactor. * df 80-133

microscopische waarneming van stresstoestand. __________________________________ 47 Tabel 13: Overzicht resultaten Houtem androgene verstoring. Df is dilutiefactor. _____________ 47 Tabel 14: Overzicht van fysicochemische gegevens en de lokale meetposten. ________________ 52 Tabel 15: Concentraties aan zware metalen in PM10 bepaald met geoptimaliseerde methode. __ 53 Tabel 16: Concentratie metalen in PM10 na ASE extractie met hexaan/aceton 50/50 v/v%. _____ 53 Tabel 17: Recovery’s van de metalen in het ASE-extract. ________________________________ 53 Tabel 18: Associatie tussen de biologische effectparameters getest op partikelfractie en de

fysicochemische karakteristieken van PM10 (Spearman rank correlatie coëfficiënt (r), p-waarde en aantal gegevens(N)). P-waarden < 0.5 zijn in rood aangeduid. ______________________ 57

Tabel 19: Associatie tussen de biologische effectparameters getest op organisch extract en de fysicochemische karakteristieken van PM10 (Spearman rank correlatie coëfficiënt (r), p-waarden en aantal gegevens(N)). P-waarden < 0.5 zijn in rood aangeduid. ______________ 58

Tabel 20: Associatie tussen het radicaalgenererend vermogen en de fysicochemische karakteristieken van PM10 (Spearman rank correlatie coëfficiënt (r), p-waarden en aantal gegevens(N)). P-waarden < 0.5 zijn in rood aangeduid. ______________________________ 58

Tabel 21:Spearman rank correlatie tussen biologische eindpunten en meteorologische parameters. P-waarden < 0.5 in rood aangeduid. ____________________________________________ 61

Tabel 22: Verklarende variabelen voor mutagene en oestrogene activiteit. __________________ 63 Tabel 23: Verklarende variabelen voor cytotoxisch, inflammatoir en oxidatieve activiteit. ______ 64 Tabel 24: Aantal deelnemers in de Gentse Kanaalzone met enkel vragenlijstgegevens. ________ 65 Tabel 25: Aantal deelnemers in de Gentse Kanaalzone met vragenlijstgegevens en

biomerkermetingen. _________________________________________________________ 65 Tabel 26: Partiële correlatiecoëfficiënten tussen effectgerichte metingen en biomerkers voor

genotoxiciteit en inflammatiemerkers. Partiële correlaties werden gecorrigeerd voor geslacht, leeftijd en roken. ___________________________________________________________ 68

Lijst van figuren

XXIII

LIJST VAN FIGUREN

Figuur 1: De meetplaats te Zelzate (R750). (bron: VMM) __________________________________ 5 Figuur 2: De meetplaats te Borgerhout (R801). (bron: VMM) ______________________________ 5 Figuur 3: De meetplaats te Houtem (N029). (bron: VMM) _________________________________ 5 Figuur 4: Cytotoxiciteit van partikels afkomstig van Borgerhout en Houtem (gemiddelde ± 95%

confidentie interval). _________________________________________________________ 25 Figuur 5: Maandgemiddelde cytotoxiciteit in Beas-2B na blootstelling aan 100 µgPM10/ml in functie

van de staalname periode (gemiddelde ± SE, aantal meetdagen per maand). ____________ 26 Figuur 6: Radicaalgenererend vermogen van de fijn stof luchtstalen van Borgerhout en Houtem

(gemiddelde ± 95% CL). _______________________________________________________ 27 Figuur 7: Radicaalgenererend vermogen in Borgerhout en Houtem in functie van de

bemonsteringsdagen. ________________________________________________________ 27 Figuur 8: Correlatie tussen radicaalgenererend vermogen gemeten op kwartsfilters bemonsterd

met een low-volume Leckeltoestel en op teflonfilters bemonsterd met een high-volume Digitel-toestel (n=22, R=0.504 , p=0.017). ________________________________________ 28

Figuur 9: Radicaalgenererend vermogen van PM10 luchtstalen gemeten op kwartsfilters bemonsterd met een low-volume Leckeltoestel en op teflonfilters bemonsterd met een high-volume Digitel-toestel (box plot, gemiddelde ± 95% CL). _____________________________ 28

Figuur 10: Endotoxine concentratie in de PM10-fractie uit Borgerhout en Houtem. ____________ 30 Figuur 11: Maandgemiddelde endotoxine concentraties in PM10-fractie uit Houtem en Borgerhout

in functie van de tijd (gemiddelde ± SE, aantal meetdagen per maand). _________________ 30 Figuur 12: Correlatie tussen endotoxine gehalte van PM10 en il-8 inductie in Beas-2B na

blootstelling aan 100 µg PM10 (n=105, r=0.76, p<0.001). _____________________________ 31 Figuur 13: Il-8 inductie na blootstelling van Beas-2B aan PM10 afkomstig van Borgerhout en Houtem

(gemiddelde 95%CL). ______________________________________________________ 32 Figuur 14: Maandgemiddelde inflammatoire potentie in Beas-2B na blootstelling aan 100

µgPM10/ml in functie van de staalnameperiode (gemiddelde ± SE), aantal meetdagen per maand). ___________________________________________________________________ 32

Figuur 15: Mutagene activiteit in Borgerhout en Houtem (revertanten/20 m3-luchteq) (gemiddelde±95%C) (-S9: directe mutageniciteit; +S9: indirecte mutageniciteit). _________ 33

Figuur 16: % DNA-migratie van Beas-2B ten gevolge van oxidatieve DNA-schade en DNA-breuken na PM10 blootstelling (gemiddelde ± 95%CL). ________________________________________ 34

Figuur 17: Overzicht van het toxicologisch profiel van Borgerhout in vergelijking met Houtem. __ 35 Figuur 18: Cytotoxiciteit van partikels afkomstig van Zelzate en Houtem (gemiddelde ± 95% CL)._ 36 Figuur 19: Maandgemiddelde cytotoxiciteit in Beas-2B na blootstelling aan 100 µgPM10/ml in

functie van de staalname periode (gemiddelde ± SE, aantal meetdagen per maand). ______ 37 Figuur 20: Radicaalgenererend vermogen van fijn stof luchtstalen afkomstig van Zelzate en Houtem

(gemiddelde ± 95%CL). _______________________________________________________ 38 Figuur 21: Radicaalgenererend vermogen in Zelzate en Houtem in functie van de

bemonsteringsdagen. ________________________________________________________ 38 Figuur 22: Endotoxine concentratie in de PM10-fractie uit Zelzate en Houtem. _______________ 39 Figuur 23: Maandgemiddelde endotoxine concentraties in PM10-fractie uit Houtem en Zelzate in

functie van de tijd (gemiddelde ± SE, aantal meetdagen per maand). ___________________ 40 Figuur 24: Il-8-inductie na blootstelling aan PM10 uit Zelzate en Houtem (gemiddelde ±95%CL).__ 41 Figuur 25: Maandgemiddelde inflammatoire potentie in Beas-2B na blootstelling aan 100

µgPM10/ml in functie van de staalname periode (gemiddelde ± SE; aantal meetdagen per maand). ___________________________________________________________________ 41

Figuur 26: Mutagene activiteit in Zelzate en Houtem (revertanten/20 m3-luchteq) (gemiddelde ± 95%CL) (-S9: directe mutageniciteit; +S9: indirecte mutageniciteit). ____________________ 42

Lijst van figuren

XXIV

Figuur 27: Gemiddelde % DNA-migratie van BEAS-2B ten gevolge van oxidatieve DNA-schade en DNA-breuken (gemiddelde ± 95%CL). ___________________________________________ 43

Figuur 28 :Oestrogene activiteit van de dagstalen in Houtem en Zelzate. ___________________ 44 Figuur 29: Oestrogene activiteit in Houtem en Zelzate. _________________________________ 45 Figuur 30: Maandgemiddelde oestrogene activiteit (gemiddelde ± SE; aantal metingen per maand).

_________________________________________________________________________ 46 Figuur 31: Overzicht van het toxicologisch profiel van Zelzate in vergelijking met Houtem. _____ 49 Figuur 32: Correlatie tussen directe en indirecte mutagene potentie en PM10 concentratie in de

omgevingslucht (-S9: directe mutageniciteit, r=0.47, n=100, p<0.001; +S9: indirecte mutageniciteit, r=0.49, n=100, p<0.001). _________________________________________ 55

Figuur 33: Correlatie tussen oestrogene activiteit en PM10 concentratie in de omgevingslucht.(n=60, r=0.27 ,p=0.035). ___________________________________________________________ 56

Figuur 34: Radicaalgenererend vermogen in relatie tot concentraties van black carbon (n=62, r=0.795, p<0.001), chroom (n=61, r=0.765, p<0.001), cadmium (n=61,r=0.489, p<0.001) en lood (n=61, r=0.692, p<0.001) in de omgevingslucht. (blauw=Borgerhout; groen=Houtem; rood=Zelzate). ______________________________________________________________ 59

Figuur 35: Mutagene activiteit directe (-S9: r=-0.45, p<0.001; +S9: r=-0.42, p<0.001) en radicaalgenererend vermogen (r=-0.5, p<0.0001) in relatie tot de windsnelheid (blauw=Borgerhout; groen=Houtem; rood=Zelzate). _______________________________ 62

Figuur 36: Correlatie tussen de inflammatoire capaciteit van PM10 en de pH van het ademcondensaat in jongeren uit de Gentse Kanaalzone (n=82, r=-0.24, p=0.4). __________ 68

Figuur 37: Correlatie tussen het radicaalgenererend vermogen van PM10 (ROS-test) en de komeettest in jongeren uit de Gentse Kanaalzone (n=82, r=0.29, p=0.01). ______________ 69

Lijst van afkortingen en Symbolen

XXV

LIJST VAN AFKORTINGEN EN SYMBOLEN

2-AA 2-aminoanthracene 2-NF 2-nitrofluorene 4-NQO 4-nitroquinoline-N-oxide Al Aluminium As Arseen ASE Accelerated Solvent Extraction AU/m3 Arbitraire eenheden per m3

Ba Barium BC Black carbon Beas-2B- Humaan-bronchiaal-epitheelcellijn BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BTEX Benzeen, tolueen, ethylbenzeen en xyleen Ca Calcium Cd Cadmium Cl Chloor CL Confidentie limiet CO Koolstofmonoxide Cr Chroom Cu Koper DDE Dichloordifenyldichloorethyleen DDT Dichloordifenyltrichloorethaan DEET N,N-di-ethyl-meta-tolueenamide df Dilutiefactor DHT Dihydrotestosteron DL Detectielimiet DMPO 5.5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide DMSO Dimethylsulfoxide DNA Desoxyribonucleïnezuur E2 17β-estradiol of EC Elementaire koolstof EC50 Effectconcentratie 50%, concentratie waarbij bij 50% van de testorganismen na een

bepaalde blootstellingduur een effect optreedt (b.v. groei remming). ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay eNO Exhaled NO EPR Electron paramagnetic resonance ERE/ARE Estrogen / Androgen Responsive Element ERα Estrogen receptor alpha ESR Electron spin resonance EU/ml Europese units per milliliter Fe IJzer H2O2 Waterstofperoxide HBM Humane biomonitoring HCB Hexachloorbenzeen HCH Hexachloorhexaan IL-8 Interleukine-8 Joaquin Joint Air Quality Initiative K Kalium LAL Limulus amoebocyte lysaat

Lijst van afkortingen en Symbolen

XXVI

Mg Magnesium Mn Mangaan Mo Molybdeen mtDNA Mitochondriaal DNA N2 Stikstof NH4

+ Ammonium Ni Nikkel NO3

- Nitraat NOx Stikstofoxide NR Neutraal rood O3 Ozon OC Organische koolstof OH Hydroxylradicalen PAK Polycyclische aromatische koolwaterstoffen Pb Lood PBS Phosphate buffered saline PCB’s Polychloorbifenyl PCDD/F’s Polychloordibenzo dioxins/furanen pH Zuurtegraad PM10 Stofdeeltjes met een aerodynamische diameter kleiner dan 10 µm PM2,5 Stofdeeltjes met een aerodynamische diameter kleiner dan 2,5 µm pNA P-nitro-aniline RIVM Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu ROS Reactive oxygen species S9 Metaboliserend activerend enzymesysteem Sb Antimoon SD Standaard afwijking SI Stimulatie index SO2 Zwaveldioxide SO4

- Sulfaat TC Totale koolstof Ti Titanium

TNF- Tumornecrosefactor-alfa, stimuleert ontstekingsprocessen

TSP Total suspended matter UFP Ultrafijne partikels US EPA United States Environmental Protection Agency V Vanadium VMM Vlaamse Milieumaatschappij VOC’s Vluchtige organische componenten Zn Zink

1 Inleiding

1

1 INLEIDING

1.1 MEETCAMPAGNE IN BORGERHOUT

De huidige EU-luchtkwaliteit wetgeving is gericht op monitoring, het beperken en het verminderen van massaconcentraties van zwevende deeltjes. Echter, recent toxicologisch en epidemiologisch onderzoek stelt dat andere parameters (o.a. UFP, EC, BC) beter in verband kunnen gebracht worden met gezondheidseindpunten dan massaconcentratie. Het Europese Interreg IVB NWE project Joaquin (Joint Air Quality Initiative) heeft als doel de luchtkwaliteitsproblematiek verder in kaart te brengen en moet leiden tot een gezondheidsgericht luchtkwaliteitsbeleid in Noordwest-Europa. In het kader van dit project (WP1 actie 2: Data en informatie verzamelen over de huidige lokale situatie voor nieuwe componenten en de gezondheidsimpact van luchtvervuiling beter inschatten) wenst VMM een aantal effectgerichte metingen (genotoxische en immunologische effectmetingen) te laten uitvoeren in Borgerhout en een achtergrondlocatie op PM10-stof. Op de stedelijke achtergrondlocatie (Antwerpen – Borgerhout) zijn continue metingen van PM10, PM2.5, black carbon, PAK’s en andere parameters beschikbaar. In het kader van het internationaal Joaquin-project zullen hier ook chemische metingen (ionen, EC/OC, elementen) uitgevoerd worden, alsmede ROS-analyses. De relatie tussen de effectgerichte metingen en de verschillende fysische en chemische parameters zullen in dit project onderzocht worden evenals een gezondheidskundige interpretatie van de resultaten. De opdracht heeft tot doel kennis te verwerven over - de gezondheidsrisico’s van fijn stof (PM10) in de omgevingslucht in een stedelijke achtergrond via het uitvoeren van effectgerichte metingen en - de identificatie van gezondheidsrelevante polluenten via analyse van de relatie tussen de effectgerichte metingen en het voorkomen van de verschillende polluenten. Deze studie beoogt meer inzichten te verschaffen in het identificeren van gezondheidsrelevante polluenten met hun specifieke toxiciteit en een beoordeling van de correlatie met de meetresultaten van de chemische karakterisatie.

1.2 MEETCAMPAGNE IN GENTSE KANAALZONE

Binnen het huidige Steunpunt Milieu en Gezondheid (2012-2015) werd een humane biomonitoringscampagne uitgevoerd in de Gentse Kanaalzone. De centrale onderzoeksvraag is of wonen nabij de industriezone van de Gentse Kanaalzone een invloed heeft op de gezondheid. Door middel van humane biomonitoring wordt de interne blootstelling aan milieupolluenten en de daaraan gekoppelde gezondheidseffecten bestudeerd bij 400 jongeren van 14-15 jaar oud uit de regio nabij het industriegebied, en vergeleken met een groep van 200 jongeren van dezelfde leeftijdsklasse uit algemeen Vlaanderen. In de Gentse Kanaalzone worden biomerkers gemeten in urine, bloed en adem bij 200 jongeren en worden vragenlijsten ingevuld (o.m. over astma, allergie, infecties, puberteit) door 400 jongeren. De groep wordt ingedeeld in een noordelijk gebied (Wachtebeke, Zelzate) en een zuidelijk gebied (Gent, Evergem).

1 Inleiding

2

Eén van de subvragen uit het geplande onderzoek is of de resultaten van de humane biomonitoring (meting in de mens) gerelateerd kunnen worden aan milieumeetgegevens (externe omgeving). Het koppelen van biomonitoringsresultaten aan meetgegevens in de omgeving zoals fijn stof, zware metalen, PAK’s, dioxines, PCB’s in de verschillende milieucompartimenten (lucht, bodem, water) kan meer inzicht verschaffen in de blootstellingroutes, en mogelijk zelfs toelaten om de link te leggen met bronnen in de omgeving. Naar beleidsrelevantie en het uitwerken van beleidsadviezen levert dit een grote meerwaarde. Om de link tussen de verschillende schakels van de keten - nl. externe milieublootstelling, interne dosis, biologisch effect, gezondheidsschade - nog beter te begrijpen zou de informatie die bekomen wordt uit effectgerichte metingen van luchtstalen een belangrijke meerwaarde betekenen. Effectgerichte metingen op luchtstalen vormen een tussenschakel tussen externe chemische metingen op luchtstalen en biomerkers van effect in de mens, en helpen dus om de keten van blootstelling naar effect beter te begrijpen. De doelstelling van de huidige opdracht is het analyseren van reeds verzamelde luchtstalen in de Gentse Kanaalzone m.b.t. genotoxiciteit, cytotoxiciteit, immunotoxiciteit en hormoonverstoring. In dit project ‘effectgericht meten’ willen we volgende onderzoeksvragen beantwoorden: 1) Is de luchtkwaliteit in de Gentse Kanaalzone verschillend t.o.v. een achtergrondlocatie in Vlaanderen, en in hoeverre vertonen de verschillen in luchtkwaliteit (genotoxiciteit, immunotoxiciteit, hormoonverstoring) overeenkomst met de conclusies uit de humane biomonitoringscampagne, uitgevoerd in dezelfde periode? 2) Zijn de biomonitoringsresultaten gerelateerd aan de resultaten van effectgericht meten op luchtstalen, uitgevoerd in dezelfde periode? In overleg met de VMM werd voorgesteld om als achtergrondlocatie gebruik te maken van de achtergrondlocatie uit het VMM-project in het kader van de Joaquin-studie (VMM/LUC/2012/ Genotox), namelijk de VMM-meetpost in Houtem. Gebruik van deze locatie als controlegroep voor de Gentse Kanaalzone is mogelijk aangezien de bemonsteringsperiode van de omgevingslucht gelijktijdig verloopt in het VMM-project en het huidige project.

2 Meetcampagne

3

2 MEETCAMPAGNE

2.1 LOCATIES

De meetcampagnes werden uitgevoerd op drie locaties: een industrieel gebied (Zelzate), een stedelijk gebied (Borgerhout) en een referentielocatie (Houtem).

2.1.1 STEDELIJK GEBIED BORGERHOUT

In het kader van het JOAQUIN project worden in de stedelijke achtergrondlocatie (Antwerpen-Borgerhout) continue metingen van PM10, PM2.5, black carbon en PAK’s uitgevoerd evenals een chemische karakterisatie van PM10 (ionen, EC/OC, elementen) en ROS-analyses. Bij voorkeur wordt de bemonstering in functie van deze opdracht op dezelfde meetpost uitgevoerd. In Borgerhout beschikt VMM over 2 meetposten: - Borgerhout (R801; Plantin en Moretuslei 165; Lambert coördinaten: X = 154407 Y = 211080, hoogte = 6 m). Volgende parameters worden standaard gemeten: PAK’s, VOC, zware metalen in PM10, PM10, PM2.5, zwarte rook, zwarte koolstof, O3, NOx, CO, SO2, BTEX metingen. Het meetstation R801 is gelegen in een stedelijke omgeving met vooral een residentiële en commerciële functie. Het meetstation wordt beschouwd als een stedelijk achtergrondstation met een aanzienlijke verkeersinvloed. Op 30 m ten zuiden ervan ligt de Plantin en Moretuslei, één van de belangrijkste verkeersassen van Antwerpen. Op 750 m in oostelijke richting bevindt zich de ring rond Antwerpen. Aan één zijde van de meetplaats bevindt zich de speelplaats van een lagere school en aan de andere een klein parkeerterrein van een kantoorgebouw. Ter hoogte van de straat bevindt zich een bushalte. Op enkele kilometers afstand bevinden zich enkele belangrijke industriële bronnen (bijvoorbeeld Umicore in het ZW en de Antwerpse haven in het NW). - Borgerhout (R802; Plantin en Moretuslei 165, straatkant; Lambert coördinaten: X = 154396 Y = 211055, hoogte = 6 m). Volgende parameters worden standaard gemeten: PM10, PM2.5, NOx, dioxinen en PCB126 metingen. De meetplaats R802 bevindt zich op hetzelfde adres als meetplaats R801 maar is vlak aan de straatkant gelegen en wordt geklasseerd als straatstation. Voor de PM10 bemonstering in functie van de huidige opdracht is een bemonsteringstoestel geplaatst op de meetpost R801.

2.1.2 INDUSTRIEEL GEBIED GENTSE KANAALZONE

In de humane biomonitoringscampagne van het eerste Steunpunt Milieu en Gezondheid (2002-2006) vormde de Gentse Kanaalzone samen met de Antwerpse haven het aandachtsgebied ‘havens’. De leefbaarheid in de woonzones rond de Gentse Kanaalzone behouden in harmonie met de verdere economische ontwikkeling van deze industriezone is één van de belangrijkste aandachtspunten waarrond momenteel al veel gewerkt wordt in deze regio. Door de humane biomonitoringscampagne te plannen in de volledige Gentse Kanaalzone wordt waardevolle informatie verkregen over verschillende gezondheidsparameters en blootstellingsmerkers over de volledige Gentse Kanaalzone. Hiermee wordt ook tegemoet gekomen aan de bezorgdheid van de inwoners van alle woonzones rond de Gentse Kanaalzone. In de folder van de Stuurgroep Netwerk

2 Meetcampagne

4

Gentse Kanaalzone is een omschrijving van de Gentse Kanaalzone terug te vinden zoals deze in 2005 door de Vlaamse overheid werd vastgelegd: ‘de Gentse Kanaalzone is het gebied rond het kanaal Gent-Terneuzen en de R4-oost en de R4-west dat bestaat uit grote delen van de stad Gent en de gemeenten Evergem en Zelzate. In het zuiden wordt de Kanaalzone begrensd door de woonwijken van Mariakerke/Wondelgem, de Gentse kernstad (Dampoort) en Oostakker/Sint-Amandsberg. In het noorden door de kern van Zelzate.’ Op de VMM-meetpost in Zelzate (Burgemeester Jos Chalmetlaan; Lambert coördinaten: X = 111845, Y = 209705, hoogte = 6 m) worden volgende parameters standaard gemeten: PM10, NOx, SO2, CO, zwarte rook, zwarte koolstof, depositie van dioxinen (n=17) en PCB’s (n=12), zware metalen, PAK’s en VOC’s (VMM 2013). De meetpost in Zelzate (60R750) is gelegen in een woonzone aan de Chalmetlaan. De industriezone langs het kanaal Gent-Terneuzen situeert zich hoofdzakelijk in het zuidzuidwesten tussen 0,5 en 10 kilometer. Op ongeveer 1,7 kilometer ten noordwesten ligt het bedrijf Rütgers Belgium, met daartussen het centrum van de gemeente. Het terrein van ArcelorMittal Gent bevindt zich ongeveer 3 kilometer ten zuiden van de meetplaats. De bemonstering van lucht i.f.v. de PAK’s-meting gebeurt iedere 3de dag. Op de andere 2 dagen werden in de periode 1/4/2013-31/01/2014 filters geplaatst bestemd voor het Steunpunt M&G.

2.1.3 ACHTERGROND-REFERENTIEGEBIED HOUTEM

Een belangrijk punt voor het interpreteren en communiceren van effectgerichte metingen is het afbakenen van achtergrond- of referentiewaarden, m.a.w. wanneer is een meting significant verhoogd ten overstaan van de normale verwachte achtergrondwaarden. Bij de selectie van een ‘achtergrond-referentie’ locatie werden een aantal opties in beschouwing genomen. Om een optimale integratie met het bestaande luchtkwaliteitnetwerk te bekomen, werden de filters verzameld op een reeds aanwezige monitoringlocatie die als een achtergrondlocatie of landelijke gebied wordt beschouwd in één van de VMM-meetnetten. Er werd overeengekomen om voor deze studie de meetpost Houtem (N029; Westmoerstraat; Lambert coördinaten: X = 24655 Y = 191071, hoogte = 2 m) te nemen als referentie locatie. Dit station behoort tot het telemetrisch, PAK’s en VOS meetnet. Volgende parameters worden standaard gemeten: PM10, PM2.5, O3, NOx, SO2, zwarte rook, PAK’s, dioxinen en PCB126 en BTEX metingen. Bovendien beschikt Houtem over een meteostation. De meetpost Koksijde (00KK02; Lambert coördinaten: X = 30270 Y = 202583, hoogte = 7 m) uit het meetnet zware metalen in zwevend stof bevindt zich op 12.8 km afstand. De meetplaats in Houtem wordt algemeen beschouwd als een landelijke achtergrondlocatie. Het meetstation bevindt zich in het midden van de polders op 500 m van de Frans-Belgische grens, op 2 km van de dorpskern van Houtem (ca. 700 inwoners), iets meer dan 8 km van de Belgische kustlijn en 15 km van Duinkerke. In de directe omgeving bevinden zich akkers, enkele bomen en een aantal huizen. Uit de meetresultaten van de afgelopen jaren blijkt dat Houtem qua PM10 één van de minst vervuilde meetplaatsen in Vlaanderen is [VMM, 2010; VMM, 2011; VMM, 2012].

2 Meetcampagne

5

Figuur 1: De meetplaats te Zelzate (R750). (bron: VMM)

Figuur 2: De meetplaats te Borgerhout (R801). (bron: VMM)

Figuur 3: De meetplaats te Houtem (N029). (bron: VMM)

2 Meetcampagne

6

2.2 PROCEDURES MONSTERNEMING

2.2.1 BEMONSTERINGSTOESTELLEN

Uit de vorige Vlaamse studies [Van Den Heuvel et al., 2008; Van Den Heuvel et al., 2011] komt duidelijk naar voor dat het essentieel is om zoveel mogelijk gestandaardiseerd te werken, gebruik makend van dezelfde bemonsteringstoestellen op de verschillende staalnamelocaties. Het is immers niet duidelijk wat de mogelijke effecten zijn van de verschillende toestellen op de resultaten van de effectgerichte metingen.

Voor het uitvoeren van het minimumpakket van testen dient een relatief grote hoeveelheid lucht bemonsterd te worden om een voldoende partikelbelading van de filters te hebben. Het zwevend stof wordt daarom bemonsterd met een high-volume sampler van het type Digitel met PM10-voorafscheiding. Karakteristieken van high-volume sampler Digitel DHA-80: -bemonstering inlaatkop: PM10 -aanzuigdebiet:

TSP: 900 L/min, 54 m3/u , 1296 m3/24 u PM10: 500 L/min, 30 m3/u, 720 m3/24 u

-filter Ф = 150 mm -filtermagazijn met capaciteit van 15 filters -automatische filterwisselaar In het kader van het VMM-project (VMM/LUC/2012/Genotox) werd door de opdrachtgever een Digitel beschikbaar gesteld op de meetplaats te Houtem voor de duurtijd van het project (1/4/2013-8/5/2014). Een Digitel toestel van VITO werd ingezet op de locatie te Borgerhout gedurende de looptijd van de meetcampagne zodat de staalname op beide locaties zo uniform mogelijk gebeurde. De toestellen in Borgerhout en Houtem werden identiek afgesteld. In Zelzate werd een extra toestel geplaatst, nl. een Digitel met PM10-meetkop voor het nemen van de stalen in functie van de effectgerichte meetcampagne.

2.2.2 FILTERKEUZE

De keuze van de filters is belangrijk omdat sommige types filter toxiciteit veroorzaken in de in vitro testsystemen. Op basis van de literatuurgegevens en voorgaande effectgerichte meetcampagnes wordt gekozen voor teflonfilters van het type T38 (Schleicher & Schuell, Duitsland, ref nr 10411130). Deze filters zijn geschikt voor gebruik in de Digitel high-volume samplers. In de pilootstudie [Van Den Heuvel et al., 2008] hebben we aangetoond dat deze T38-filters geen achtergrondtoxiciteit geven in de verschillende in vitro testen die door de opdrachtgever gevraagd werden. Karakteristieken van de T38-membraanfilters: - PTFE met polyester support - Ф = 150 mm - poriegrootte: 0,2 μm-5,0 μm.

2 Meetcampagne

7

De teflonfilters zijn echter niet geschikt voor meting van hormoonverstoring. De perfluorcomponenten waaruit de teflonfilter is opgebouwd zijn hormoonverstorend, wat resulteert in een hoog achtergrondsignaal van de niet-beladen blanco filter (procedure blanco). Door de hoge temperatuur tijdens de ASE-extractie komen er vezels los van de filter en kunnen componenten van de filter in het organisch solvent oplossen. Zelfs na voorbehandeling van de filter (dit is wassen van de filter met het extractiesolvent) werden nog te hoge achtergrondsignalen gemeten. Kwarts- en glasvezelfilters zijn beter geschikt voor organische extractie op hogere temperatuur en druk en geven geen achtergrondsignaal bij meting van de hormoonverstorende activiteit met in vitro cellijnen [Matsumoto et al., 2005a; Novak et al., 2009a; Wenger et al., 2009a; Wenger et al., 2009b]. In de Digitel-toestellen gebruikt VMM glasvezelfilters (PAK-meetnetwerk), terwijl in de low-volume samplers kwartsfilters worden gebruikt. Testen aan de VUB met de estrogene cellijn toonden aan dat beide filters (geleverd door VMM) geen achtergrondsignaal geven wanneer het verdunde staalextract gedoseerd wordt aan de cellen. De beste resultaten worden bekomen na voorbehandeling (warmtebehandeling of spoelen met solvent) van de glasvezelfilters. De kwartsfilters werden reeds voorbehandeld door de leverancier en kunnen bijgevolg zonder bijkomende behandeling gebruikt worden. Aangezien Pall Tissuquartzfilters met een diameter van 150 mm niet beschikbaar zijn, is het eenvoudigst om voor de effectgerichte metingen van hormoonverstoring in Zelzate gebruik te maken van het Digiteltoestel met de voorbehandelde Munktell-glasvezelfilters. Glasvezel- of kwartsfilters van andere fabrikanten zijn waarschijnlijk ook geschikt voor de meting van hormoonverstorende activiteiten, maar dienen bij voorkeur eerst getest te worden. Karakteristieken van de glasvezelfilters : - type: micro glass fiber filter with binder - Munktell grade 227/1/60 - Ф = 150 mm http://www2.munktell.se/eng/katalog1.php?meny=1&page=70 Deze filter is geschikt voor gebruik in de Digitel high-volume samplers.

2.2.3 FREQUENTIE VAN BEMONSTEREN

Meetcampagne Borgerhout De frequentie van bemonstering werd afgestemd met de fysicochemische metingen die in Borgerhout in het kader van het Joaquin-project worden uitgevoerd. De metingen werden gespreid over een jaar en werden simultaan uitgevoerd op de twee locaties (Borgerhout en Houtem) en gelijklopend met de chemische karakterisatie die in Borgerhout werd uitgevoerd. De bemonsteringscampagne is gestart op 1/04/2013 en liep tot en met 8/05/2014 . In Borgerhout gebeurde de bemonstering met een tijdsinterval van 6 dagen. In Houtem gebeurde de bemonstering met een frequentie van 1 op 12 dagen. Door technische problemen met het Digitel toestel in de beginperiode van de staalname in Houtem werd de oorspronkelijk vooropgestelde bemonsteringsperiode (tot en met 31/03/2014) met een maand verlengd en werd de frequentie van bemonstering verhoogd naar 1 op 6 dagen. De bemonsteringstijd per filter duurde 24 u (0.00 u-24.00 u UTC). Voor elke filter werd de exacte bemonsteringstijd en –volume genoteerd. Bij hoge concentraties van stofdeeltjes in de lucht kan de beladingscapaciteit van de filter binnen de 24 u bereikt worden en stopt de bemonstering. Voor een aantal data werd geen filter afgeleverd door VMM. De reden hiervoor zijn divers o.a. technische fout van het Digitel-toestel en stroomonderbreking.

2 Meetcampagne

8

Tabel 1 geeft een overzicht van de beschikbare filters (op VITO afgeleverd door VMM) met specificatie van plaats, datum, bemonsteringstijd en bemonsteringsvolume en code. Tabel 1: Staalname dagen en filtercodering in Borgerhout en Houtem.

Datum Borgerhout Houtem

Filtercode m3 Uren per

dag Filtercode m3

Uren per dag

1/04/2013 B1 738.964 23 u 34 min H1 /

7/04/2013 B2 +

13/04/2013 B3 722.825 24 u H2 729.120 24 u

19/04/2013 B4 715.220 24 u

25/04/2013 B5 705.316 24 u H3 723.682 24 u

1/05/2013 B6 697.053 24 u

7/05/2013 B7 648.406 24 u H4 719.381 24 u

13/05/2013 B8 697.379 24 u

19/05/2013 B9 701.947 24 u H5 733.052 24 u

25/05/2013 B10 696.060 24 u

31/05/2013 B11 728.176 24 u H6 730.298 24 u

6/06/2013 B12 731.516 24 u

12/06/2013 B13 731.500 24 u H7 738.844 24 u

18/06/2013 B14 741.355 24 u

24/06/2013 B15 733.484 24 u H8 / /

30/06/2013 B16 702.319 24 u

6/07/2013 B17 704.976 24 u H9 / /

12/07/2013 B18 699.432 24 u

18/07/2013 B19 709.668 24 u H10 665.706 24 u

24/07/2013 B20 712.300 24 u

30/07/2013 B21 701.710 24 u H11 722.732 24 u

5/08/2013 B22 711.592 24 u

11/08/2013 B23 698.922 24 u H12 735.213 24 u

17/08/2013 B24 708.631 24 u

23/08/2013 B25 708.720 24 u H13 662.026 24 u

29/08/2013 B26 704.384 24 u

4/09/2013 B27 708.568 24 u H14 665.597 24 u

10/09/2013 B28 693.692 24 u

16/09/2013 B29 702.677 24 u H15 /

22/09/2013 B30 /

28/09/2013 B31 700.960 24 u H16 668.688 24 u

4/10/2013 B32 706.234 24 u

10/10/2013 B33 694.308 24 u H17 +

16/10/2013 B34 691.211 24 u

2 Meetcampagne

9

22/10/2013 B35 708.938 24 u H18 623.743 24 u

28/10/2013 B36 703.348 24 u

3/11/2013 B37 / H19 /

9/11/2013 B38 701.792 24 u

15/11/2013 B39 689.869 24 u H20 683.365

21/11/2013 B40 691.756 24 u

27/11/2013 B41 685.900 24 u H21 +

3/12/2013 B42 526.961 24 u

9/12/2013 B43 688.245 24 u H22 +

15/12/2013 B44 713.379 24 u

21/12/2013 B45 713.854 24 u H23 +

27/12/2013 B46 724.305 24 u

2/01/2014 B47 724.787 24 u H24 +

8/01/2014 B48 698.336 24 u

14/01/2014 B49 691.401 24 u H25 717.053

20/01/2014 B50 692.287 24 u

26/01/2014 B51 695.994 H26 717.773 24 u

1/02/2014 B52 695.372

7/02/2014 B53 / H27 725.583 24 u

13/02/2014 B54 722.624 24 u H28 719.213 24 u

19/02/2014 B55 700.000 24 u H29 715.663

25/02/2014 B56 721.273 24 u H30 719.933

3/03/2014 B57 724.644 24 u H31 723.533

9/03/2014 B58 724.908 24 u H32 719.241

15/03/2014 B59 717.443 24 u H33 715.613

21/03/2014 B60 717.841 24 u H34 717.773

27/03/2014 B61 721.395 24 u H35 715.622 24 u

2/04/2014 B62 733.290 24 u H36 729.292 24 u

8/04/2014 B63 718.430 24 u H37 714.893 24 u

14/04/2014 B64 716.070 24 u H38 714.893 24 u

20/04/2014 B65 731.947 24 u H39 729.309 24 u

26/04/2014 B66 727.059 24 u H40 720.653 24 u

2/05/2014 B67 721.183 24 u H41 717.773 24 u

8/05/2014 B68 724.774 24 u H42 722.093 24 u

/: geen filter +: filter zonder gegevens over bemonsteringstijd of -volume

Meetcampagne Gentse Kanaalzone In Zelzate werd de frequentie van bemonstering afgestemd op de humane biomonitoringscampagne (HBM-campagne). Hierbij werd gebruik gemaakt van de ervaring die werd opgedaan bij het project effectgericht meten in Genk-Zuid [Van Den Heuvel et al., 2011].

In de HBM-studie worden zowel chronische als acute gezondheidseffecten bestudeerd. Kortdurende effectmerkers zoals komeettest, 8-OH-deoxyguanosine in urine, bloeddruk en NO in

2 Meetcampagne

10

ademlucht (eNO) zijn voorbeelden van acute gezondheidsparameters. Astma en allergie en puberteitsontwikkeling zijn voorbeelden van gezondheidseffecten die zich ontwikkelen op langere termijn. Voor het bestuderen van de relatie tussen deze biomerkers en de effectgerichte metingen op luchtstalen is het belangrijk dat de tijdsperiodes gerespecteerd worden. Deze keuze werd enerzijds gestuurd door praktische redenen. VMM heeft een standaardpatroon voor de eigen metingen waarmee rekening moet gehouden worden. De bemonstering in het kader van de huidige studie beperkte zich tot de tijden waarop het Digiteltoestel nog beschikbaar was. Anderzijds werd de keuze gemaakt op basis van de halfwaardetijden van de biomerkers. De kortdurende biomerkers hebben een halfwaardetijd van enkele uren tot meer dan 24 uur, dus bemonstering van de omgevingslucht in een periode van 1 tot 2 dagen voor de staalname is optimaal. Voor biomerkers zoals eNO en oxidatieve stressmerkers (8-OH-deoxyguanosine, komeettest) worden binnen 24 u in een omgeving met verhoogde partikelconcentratie al verhoogde effecten waargenomen [Moller et al., 2010; Strak et al., 2012]. Voor de meeste acute effecten is het dus belangrijk om te vergelijken met luchtstalen van een korte periode vóór het veldwerk. Daarom werd voorgesteld om te werken met dagstalen, nl. luchtstalen te verzamelen gedurende 24 u de dag voor het veldwerk. Voor de acute merkers werd aan VMM gevraagd om telkens 1 extra filter te plaatsen op de dag die voorafgaat aan het veldwerk van de biomonitoring. Voor de chronische effecten wordt er vergeleken met de resultaten van effectgerichte metingen over een langere periode. Er werd geopteerd om gepoolde stalen te maken van filters genomen over een periode van maximum 1 maand. De meetcampagne is van start gegaan op 1 april 2013 en liep tot en met 31 januari 2014. VMM was verantwoordelijk voor de monsterneming op beide locaties. Het verwisselen van de filters (volgens standaardprocedure voor het bemonsteren van filters voor de PAK-bepaling in lucht) en de controle van de toestellen werden uitgevoerd door VMM. De bemonsteringstijd per filter duurde 24 uur (0.00 u-24.00 u). Voor elke filter noteerde VMM de exacte bemonsteringstijd en het exacte bemonsteringsvolume. Het Digiteltoestel in Houtem voor bemonstering in functie van het VMM-Genotoxproject heeft een regime van 1 op 12 dagen. Op de tussenliggende dagen werd met een frequentie van 1 op 6 dagen een glasvezelfilters bemonsterd (Tabel 2). Het Digiteltoestel in Zelzate heeft een bemonsteringsregime van 1 op 3 dagen met afwisselend een teflon en glasvezelfilter. Tijdens de periode 1 april 2013 – 31 januari 2014 werden volgende staalnames gepland in Zelzate:

TEFLONFILTERS VOOR DAGSTALEN: Een T38-teflonfilter werd ingepland op de dag die voorafgaat aan het veldwerk van de biomonitoring (zie Tabel 3).

TEFLONFILTERS VOOR POOLSTALEN: Op basis van de ervaring uit vorige projecten en een inschatting van het aantal te verwachten vrije plaatsen, werd beslist om 4 stalen per maand te nemen, en deze te poolen tot een maandstaal (zie

Tabel 4). GLASVEZELFILTERS VOOR POOLSTALEN: Er werd beslist om 4 stalen per maand te nemen en deze te poolen tot een maandstaal. Bij de eerste testmetingen werd echter vastgesteld dat sommige dagstalen toxiciteit vertonen en dus de meting verstoren. Daarom werd beslist om voor de meting van de oestrogene activiteit 4 individuele stalen per maand te meten en maandgemiddelden te berekenen (zie

Tabel 4).

2 Meetcampagne

11

De dagen waarop luchtstalen werden genomen in Zelzate zijn niet gelijklopend met de bemonsteringsdagen in Houtem. Tabel 2: Staalnamedagen en filtercodering van glasvezelfilters in Houtem.

Datum Filtercode m3 Uren per

filter

4/04/2013 H1 720.610 24 u

10/04/2013 H2 727.500 24 u

16/04/2013 H3 726.806 24 u

22/04/2013 H4 715.141 24 u

28/04/2013 H5 714.012 24 u

4/05/2013 H6 726.175 24 u

10/05/2013 H7 718.958 24 u

16/05/2013 H8 732.326 24 u

22/05/2013 H9 728.765 24 u

28/05/2013 H10 736.905 24 u

3/06/2013 H11 724.661 24 u

9/06/2013 H12 728.304 24 u

15/06/2013 H13 735.170 24 u

21/06/2013 H14 735.296 24 u

27/06/2013 H15 +

3/07/2013 H16 +

9/07/2013 H17 +

15/07/2013 H18 667.267 24 u

21/07/2013 H19 743.401 24 u

27/07/2013 H20 745.466 24 u

2/08/2013 H21 747.069 24 u

8/08/2013 H22 736.452 24 u

14/08/2013 H23 734.835 24 u

20/08/2013 H24 669.414 24 u

26/08/2013 H25 663.132 24 u

1/09/2013 H26 673.857 24 u

7/09/2013 H27 669.571 24 u

13/09/2013 H28 /

19/09/2013 H29 669.494 24 u

25/09/2013 H30 667.023 24 u

1/10/2013 H31 670.991 24 u

7/10/2013 H32 674.234 24 u

13/10/2013 H33 /

19/10/2013 H34 680.381 24 u

25/10/2013 H35 677.501 24 u

31/10/2013 H36 /

6/11/2013 H37 /

2 Meetcampagne

12

12/11/2013 H38 /

18/11/2013 H39 688.269 24 u

24/11/2013 H40 +

30/11/2013 H41 +

6/12/2013 H42 +

12/12/2013 H43 +

18/12/2013 H44 +

24/12/2013 H45 +

30/12/2013 H46 /

5/01/2014 H47 /

8/01/2014 H48 720.705 24 u

11/01/2014 H49 711.294 24 u

17/01/2014 H50 723.533 24 u

20/01/2014 H51 715.613 24 u

23/01/2014 H52 714.893 24 u

29/01/2014 H53 718.493 24 u

/: geen filter +: filter zonder gegevens over bemonsteringstijd of -volume

Tabel 3: Staalname dagen en filtercodering van teflonfilters voor dagstalen in Zelzate.

Datum veldwerk

Plaats veldwerk

Datum Staalname

Filtercode m3 Uren per

filter

8/04/2013 Evergem 7/04/2013 Z1 698.510 24 u

9/04/2012 Zelzate 8/04/2012 Z2 701.560 24 u

11/04/2013 Wachtebeke 10/04/2013 Z3 700.910 23 u 46 min

29/04/2013 Evergem geen filter

22/05/2013 Zelzate 21/05/2013 Z4 ±720* 24 u

25/05/2013 Oostakker 24/05/2013 Z5 ±720* 24 u

28/05/2013 Zelzate 27/05/2013 Z6 711.976 24 u

27/08/2013 Evergem 26/08/2013 Z7 717.403 24 u

8/10/2013 Evergem 7/10/2012 Z8 703.264 24 u

21/10/2013 Wachtebeke 20/10/2013 Z9 ±720* 24 u

28/10/2013 Oostakker 27/10/2013 Z10 713.776 24 u

29/10/2013 Zelzate 28/10/2013 Z11 711.310 24 u

21/11/2013 Zelzate 20/11/2013 Z12 ±720* 24 u

25/11/2013 Zelzate 24/11/2013 Z13 ±720* 24 u

29/01/2014 Oostakker 28/01/2014 Z14 1249.336** 24 u

N=15 N=14

*Door een elektronisch probleem met het Digiteltoestel werd het bemonsteringsvolume niet weggeschreven. Men mag ervan uitgaan dat ongeveer 720 m

3 werd bemonsterd in 24 uur.

**Er was een foute instelling in het toestel na tussenkomst (onderhoud) van Fabricom. De inlaatkop was steeds PM10.

2 Meetcampagne

13

Tabel 4: Staalnamedagen en codering voor poolstalen in Zelzate.

Staalcode Datum m3 Uren per filter

Teflonfilters

GZ april

1/04/2013 434.208 15 u 4 min

13/04/2013 708.480 24 u

19/04/2013 698.681 24 u

25/04/2013 712.351 24 u

GZ mei

1/05/2013 704.974 24 u

7/05/2013 711.184 24 u

19/05/2013 ±720* 24 u

31/05/2013 709.122 24 u

GZ juni

6/06/2013 + 24 u

12/06/2013 715.788 24 u

24/06/2013 729.817 24 u

30/06/2013 ±720* 24 u

GZ juli

6/07/2013 ±720* 24 u

18/07/2013 717.009 24 u

24/07/2013 720.326 24 u

30/07/2013 713.725 24 u

GZ augustus

5/08/2013 719.500 24 u

11/08/2013 713.127 24 u

23/08/2013 719.867 24 u

29/08/2013 713.856 24 u

GZ september

4/09/2013 718.108 24 u

10/09/2013 707.767 24 u

16/09/2013 +

28/09/2013 +

GZ oktober

10/10/2013 704.469 24 u

16/10/2013 704.542 24 u

22/10/2013 ±720* 24 u

29/10/2013 706.062 24 u

GZ november

3/11/2013 712.415 24 u

15/11/2013 695.350 24 u

21/11/2013 +

27/11/2013 /

3/12/2013 /

9/12/2013 /

15/12/2013 /

21/12/2013 /

GZ januari 2/01/2014 /

8/01/2014 1248.746** 24 u

2 Meetcampagne

14

14/01/2014 1240.861** 24 u

26/01/2014 1244.266** 24 u

Glasvezel filters

Z1 4/04/2013 696.960 24 u

Z2 16/04/2013 705.890 24 u

Z3 22/04/2013 703.319 24 u

Z4 28/04/2013 703.247 24 u

Z5 4/05/2013 706.428 24 u

Z6 10/05/2013 707.576 24 u

Z7 16/05/2013 /

Z8 22/05/2013 +

Z9 28/05/2013 712.012 24 u

Z10 3/06/2013 701.536 24 u

Z11 9/06/2013 +

Z12 15/06/2013 710.365 24 u

Z13 21/06/2013 713.106 24 u

Z14 27/06/2013 729.659 24 u

Z15 3/07/2013 +

Z16 9/07/2013 712.789 24 u

Z17 15/07/2013 714.702 24 u

Z18 21/07/2013 721.860 24 u

Z19 27/07/2013 720.549 24 u

Z20 2/08/2013 724.774 24 u

Z21 8/08/2013 713.166 24 u

Z22 14/08/2013 709.335 24 u

Z23 20/08/2013 709.446 24 u

Z24 1/09/2013 706.655 24 u

Z25 7/09/2013 714.460 24 u

Z26 13/09/2013 +

Z27 19/09/2013 707.662 24 u

Z28 25/09/2013 710.848 24 u

Z29 1/10/2013 707.612 24 u

Z30 13/10/2013 730.746 24 u

Z31 19/10/2013 +

Z32 25/10/2013 +

Z33 31/10/2013 702.860 24 u

Z34 6/11/2013 710.186 24 u

Z35 12/11/2013 697.103 24 u

Z36 18/11/2013 700.371 24 u

Z37 30/11/2013 +

Z38 6/12/2013 +

Z39 12/12/2013 +

Z40 18/12/2013 +

Z41 24/12/2013 740.819 24 u

2 Meetcampagne

15

Z42 30/12/2013 /

Z43 5/01/2014 /

Z45 17/01/2014 1233.000** 24 u

Z46 20/01/2014 1258.142** 24 u

Z47 23/01/2014 1246.817** 24 u

Z48 29/01/2014 1242.249** 24 u

*Door een elektronisch probleem met het Digiteltoestel werd het bemonsteringsvolume niet weggeschreven. Men mag ervan uitgaan dat ongeveer 720 m

3 werd bemonsterd in 24 uur.

**Er was een foute instelling in het toestel na tussenkomst (onderhoud) van Fabricom. De inlaatkop was steeds PM10. Deze verandering in het bemonsteringsvolume heeft geen invloed op de resultaten van de effectgerichte metingen. /: geen filter +: filter zonder gegevens over bemonsteringstijd of -volume

2.3 PROCEDURES STAALBEHANDELING

De toxicologische karakterisatie gebeurde op 2 fracties: a. Organisch extract van het op de filters gecollecteerde materiaal. Deze extracten bevatten voornamelijk de organische componenten. Op deze extracten wordt de Ames-test uitgevoerd om de mutagene potentie van het zwevend stof te bepalen en de ERE/ARE-test om het hormoonverstorend karakter van het fijn stof na te gaan. b. Particulair materiaal. Op deze fractie worden biotesten uitgevoerd om het cytotoxisch, radicaalgenererend vermogen (ROS), inflammatoir en genotoxisch (komeettest) karakter te bepalen. Elke beladen teflonfilter werd verdeeld waarbij een deel werd gebruikt voor het organisch extract en een deel voor de collectie van partikels en een deel voor de bepaling van het radicaal genererend vermogen van de partikels. Voor de teflonfilters werden dezelfde extractiemethodes toegepast als deze beschreven in de voorgaande Vlaamse effectgerichte meetcampagnes [Van Den Heuvel et al., 2008; Van Den Heuvel et al., 2011] en andere studies [Godri et al., 2011; Steerenberg et al., 2006]. Van de teflonfilters werd 1/8 filterdeel naar RIVM verstuurd voor ROS analyse. Tabel 5 geeft een overzicht van de filters (Borgerhout: n=22, Houtem: n=28, Zelzate=14) die geselecteerd werden voor ROS bepaling van de partikels. Tabel 5: Overzicht van de filters voor ROS analyse.

Borgerhout Houtem Zelzate

Filtercode Filtercode Filtercode

B3 H2 Z1

B9 H5 Z2

B13 H7 Z3

B19 H10 Z4

B21 H11 Z5

B23 H12 Z6

B25 H13 Z7

2 Meetcampagne

16

B27 H14 Z8

B31 H16 Z9

B39 H20 Z10

B49 H25 Z11

B51 H26 Z12

B55 H27 Z13

B57 H28 Z14

B59 H29

B61 H30

B63 H31

B64 H32

B65 H33

B66 H34

B67 H35

B68 H36

H37

H38

H39

H40

H41

H42

2.3.1 ORGANISCHE EXTRACTIE

2.3.1.1 Teflonfilters

M.b.v. Accelerated Solvent Extractie (ASE) worden extracten bekomen bij verhoogde druk en temperatuur. Bij de ASE-methode wordt gebruik gemaakt van een 33 ml-extractiecel (ø 150mm filters) die van onder naar boven wordt gevuld met een cellulose-glasvezelfilter, de te extraheren filters, natriumsulfaat en celite. Celite wordt gebruikt als droogmiddel en hierboven brengt men 2 gram zeezand als vulling. De extractie gebeurt met hexaan/aceton (50/50 v/v) als extractiesolvent en er wordt geëxtraheerd bij een temperatuur van 100 °C en een druk van 140 bar. Het extract wordt vervolgens over een kolom gebracht. Het bekomen extract wordt ingedampt onder N2 bij 37 °C en uiteindelijk gesubstitueerd in 100% DMSO. Het extract wordt bewaard bij 4 °C. Er wordt eveneens een extractie uitgevoerd van niet-beladen filters.

2.3.1.2 Glasvezelfilters

M.b.v. Accelerated Solvent Extractie (ASE) worden extracten bekomen bij verhoogde druk en temperatuur. Bij de ASE methode wordt gebruik gemaakt van een 33 ml extractiecel (ø 150mm filters). De extractie gebeurt met hexaan/aceton (50/50 v/v) als extractiesolvent en er wordt geëxtraheerd tijdens 2 cycli bij een temperatuur van 100 °C, een druk van 1500 psi (100 MPa), een statische tijd van 5 min en een opwarmingsfase van 6 min. Het extract wordt vervolgens ingedampt (aan de lucht bij kamertemperatuur) en uiteindelijk gesubstitueerd in 10 ml hexaan. Het extract wordt bewaard bij kamertemperatuur in het donker. Er

2 Meetcampagne

17

wordt eveneens een extractie uitgevoerd van blanco filters (procedure blanco) en van blanco filters die in het Digitel toestel geplaatst werden, maar waar geen staalname werd uitgevoerd (veld-blanco).

2.3.2 VERZAMELEN VAN DE PARTIKELS

Voor het verzamelen van de partikelfase van de beladen filters wordt een methanolextractie gebruikt. In een erlenmeyer wordt de filter gebracht samen met methanol. Dit mengsel wordt 30 minuten gesoniceerd. Het supernatans wordt gedecanteerd. De bovenstaande stappen worden nog 2 x herhaald. De suspensie wordt ingedampt met de rotavapor bij 40 °C, 337 mbar en 100 rpm. Deze suspensie wordt gesoniceerd en overgebracht naar een vooraf gewogen 1,5 ml conische tube. Deze tube wordt ingedampt onder N2. Uiteindelijk plaatst men de tube in de speedvac voor een viertal uur en nadien plaatst men deze in een oven op 30 °C gedurende 24 uur. De conische tube wordt achteraf gewogen zodat men het gewicht van de partikels kan bepalen. De partikels worden bewaard in de vriezer bij -20 °C. Er wordt eveneens een extractie uitgevoerd van niet-beladen blanco filters (procedure blanco’s). De filters uit Houtem werden in 3 verdeeld. Een methanolextractie werd uitgevoerd op 3/8 filter. Voor de dagstalen uit Zelzate werd een methanolextractie uitgevoerd op 7/8 filter. Een overzicht van de massa’s fijn stof die werden geëxtraheerd van de filterdelen is terug te vinden in Tabel 6. Tabel 6: Overzicht van de massa’s PM10 na methanolextractie.

Borgerhout Houtem Zelzate

Filtercode Massa PM10 (mg)

Filtercode Massa PM10 (mg)

Filtercode Massa PM10

(mg)

B1 53.5 H1 / Z1 15.1

B2 6.3 Z2 13.0

B3 3.3 H2 5.9 Z3 31.4

B4 5.9 Z4 8.2

B5 5.3 H3 0.5 Z5 0.5

B6 5.2 Z6 7.1

B7 6.3 H4 0.4 Z7 7.4

B8 3.3 Z8 11.3

B9 6.8 H5 6.8 Z9 7.2

B10 0.7 Z10 8.2

B11 6.0 H6 0.4 Z11 6.8

B12 3.9 Z12 6.6

B13 2.1 H7 2.7 Z13 6.8

B14 5.2 Z14 6.8

B15 1.0 H8 3.6

B16 2.1

B17 3.8 H9 0.4

B18 2.0

B19 3.3 H10 3.8

B20 3.4

B21 1.9 H11 1.8

B22 3.0

B23 2.1 H12 1.1

B24 1.7

2 Meetcampagne

18

B25 5.2 H13 8.6

B26 5.9

B27 3.5 H14 8.6

B28 0.9

B29 2.4 H15 /

B30 /

B31 2.7 H16 5.2

B32 2.5

B33 1.4 H17 2.8

B34 3.8

B35 2.5 H18 0.3

B36 2.4

B37 1.0 H19 /

B38 1.4

B39 4.1 H20 3.8

B40 3.7

B41 6.6 H21 5.9

B42 6.1

B43 4.7 H22 4.9

B44 1.6

B45 2.2 H23 2.3

B46 1.6

B47 1.9 H24 0.4

B48 2.3

B49 3.3 H25 2.8

B50 6.2

B51 3.1 H26 3.1

B52 1.7

B53 / H27 1.8

B54 3.7 H28 2.3

B55 4.6 H29 2.5

B56 3.7 H30 1.6

B57 2.6 H31 4.6

B58 8.4 H32 11.8

B59 8.3 H33 7.6

B60 3.4 H34 2.5

B61 8.7 H35 8.4

B62 9.1 H36 6.5

B63 2.9 H37 2.8

B64 3.8 H38 2.5

B65 7.1 H39 9.9

B66 2.5 H40 2.9

B67 4.3 H41 4.0

B68 1.9 H42 2.0

/: geen filter

2 Meetcampagne

19

2.4 EFFECTGERICHTE METINGEN

2.4.1 MEETCAMPAGNE BORGERHOUT

Volgende testen werden uitgevoerd op de verzamelde luchtstalen:

Genotoxiciteit: Ames II en komeettest op Beas-2B;

Immunologische effecten: Beas-2B (il-8 inductie) en endotoxine test;

Systemische toxiciteit: cytotoxiciteit en radicaal genererend vermogen (ROS). Het pakket effectgerichte metingen met uitzondering van de ROS-metingen werden uitgevoerd op alle bemonsterde filters uit Borgerhout (61 filters) en Houtem (31 filters). Er werden 50 ROS-metingen uitgevoerd op de beladen teflonfilters (Borgerhout n=22; Houtem n=28) na Digitel-bemonstering. Binnen het Joaquin-project werden eveneens ROS-metingen uitgevoerd op kwartsfilters bemonsterd met een low-volume Leckeltoestel in Borgerhout. Er werd nagegaan wat het gezamenlijke effect is van de filtermatrix op de ROS-data en van de bemonstering via een high-volume/low-volume toestel. De blootstelling van de in vitro systemen aan de organische extracten werden uitgevoerd bij concentraties die overeenkomen met dagequivalenten (hoeveelheid ingeademde lucht/24 uur). Een ventilatiesnelheid van 14 l/min (normale ademhaling) gedurende 24 uur geeft een equivalent 20 m3 lucht/dag. ASE extracten werden getest voor hun mutageen karakter in de Ames II test bij een blootstellingsconcentratie die overeenkomt met een dagequivalent van 20 m3 lucht. De partikels van de filters die werden verzameld via een methanolextractie werden opgelost in PBS (phosphate buffered saline). De partikels werden getest voor cytotoxiciteit met Beas-2B cellen en hun inflammatoir karakter (il-8 productie in Beas-2B cellen) en de aanwezigheid van endotoxines werden geëvalueerd. Het genotoxisch karakter van de partikels wordt bepaald via de komeettest op Beas-2B cellen. De Beas-2B cellen worden blootgesteld aan een concentratiereeks van partikels: 100, 50, 25, 12.5, 6.25 µg PM10/ml.

2.4.2 MEETCAMPAGNE GENTSE KANAALZONE

De selectie van de testen voor effectgericht meten gebeurde op basis van de gezondheidskundige eindpunten uit de humane biomonitoringscampagne (zie 6.1) en de beschikbaarheid van controlewaarden uit het achtergrondgebied. Op basis van de koppeling van beide campagnes (biomonitoring en geplande campagne effectgericht meten in VMM project Genotox) werd voorgesteld om alle testen voor effectgericht meten uit het VMM-meetcampagne te Borgerhout te weerhouden in de Gentse Kanaalzone en bijkomend een test te selecteren voor hormoonverstoring (ERE-test en ARE-test). Al de testen, behalve de Ames II test, werden in Zelzate uitgevoerd op de dagstalen. Ames II werd uitgevoerd op gepoolde luchtstalen. Volgend pakket van testen werd uitgevoerd:

Genotoxiciteit: Ames II en komeettest op Beas-2B;

Immunologische effecten: Beas-2B (il-8 inductie) en endotoxine test;

Systemische toxiciteit: cytotoxiciteit en radicaal genererend vermogen (ROS);

Hormonale verstoring: ERE/ARE test. Voor de controlewaarden van effectgericht meten werd een beroep gedaan op de beschikbare

2 Meetcampagne

20

metingen in de achtergrondlocatie uit het VMM-project VMM/LUC/2012/Genotox (zie 2.4.1). Voor de bepaling van controlewaarden voor hormoonverstoring werden extra glasvezelfilters (Munktell, diameter 150 mm) gecollecteerd via de Digitel toestellen (PAK-meetnet) in Houtem. Deze staalname werd gepland in dezelfde periode als in Zelzate. Tabel 7 geeft een overzicht van de testsystemen die gebruikt werden om een toxicologisch profiel op te stellen van het bemonsterde stof.

2 Meetcampagne

21

Tabel 7: Overzicht van de testsystemen.

Gezondheidseffect In vitro test Betekenis Filter Staal PM10-fractie Genotoxische effecten Ames II Maat voor aanwezigheid van

mutagene stoffen Teflon

Poolstaal

Organisch extract

Komeettest Maat voor aanwezigheid van genotoxische stoffen en oxidatieve schade

Teflon

Dagstaal

Partikels

Immunologische effecten

Beas-2B bronchiale-cellijn: il-8

Inflammatie Teflon

Dagstaal

Partikels

LAL test Maat voor aanwezigheid van endotoxines

Teflon

Dagstaal

Partikels

Systemische toxiciteit Cytotoxiciteit in Beas-2B

Maat voor acute toxiciteit Teflon

Dagstaal

Partikels

ROS-test Maat voor radicaalgenererend vermogen

Teflon

Dagstaal

Partikels

Hormoonverstoring ERE- en ARE-test

Maat voor aanwezigheid van hormoonverstorende stoffen

Glasvezelfilters

Dagstaal

Organisch extract

2 Meetcampagne

22

2.4.3 BESCHRIJVING TESTSYSTEMEN

2.4.3.1 Systemische toxiciteit

2.4.3.1.1 Cytotoxiciteit in Beas-2B

De cytotoxiciteit van de teststof, de potentie om cellen te beschadigen, wordt bepaald m.b.v. de neutraal-rood-test. De test is gebaseerd op de potentie van een chemische stof om op een dosisafhankelijke manier te interfereren met de celgroei. Neutraal rood (NR) wordt gebruikt om het aantal levende cellen te bepalen. NR is een zwak kationische kleurstof, die in de cel diffundeert en in intacte lysosomen bindt aan negatief geladen bindingsplaatsen. Beschadiging van de lysosomen door de teststof resulteert in een verminderde NR-opname en -binding. De cytotoxiciteit van de partikels wordt bepaald gebruikmakend van de bronchiale epitheel-cellijn Beas-2B. De cellen werden in cultuur gebracht zoals beschreven in Verstraelen et al. (2009). Van de PM-poolstalen werd een stockoplossing van 10 mg PM10/ml PBS aangemaakt. Deze oplossing werd ’s nachts geschud en dan verder verdund tot 1 mg PM/ml BEGM-medium. Na een nacht schudden werd deze oplossing verder verdund in medium en toegevoegd aan de Beas-2B-cellen. De cellen (20000 cellen/96-well/200 µl) werden gedurende 24 uur blootgesteld aan een concentratiereeks van partikels: 100, 50, 25, 12.5 en 0 µg PM/ml. Na blootstelling werd met de Neutraal Rood Uptake test de leefbaarheid van de cellen bepaald. Elke concentratie werd in zesvoud getest. De methanolextracten van de blanco filters (procedure blanco) werden op dezelfde manier behandeld en getest.

2.4.3.1.2 ROS analyses

Het vermogen van fijn stof om zuurstofradicalen in de longen te genereren reflecteert hoogstwaarschijnlijk de mate waarin het biologische schade kan veroorzaken. Deze metingen werden uitgevoerd door RIVM die eveneens de ROS-metingen uitvoerde op de stalen van Borgerhout in het kader van het Joaquin-project. Om de resultaten van Borgerhout en Houtem te kunnen vergelijken is het belangrijk dat dezelfde analysemethode wordt gebruikt voor de stalen uit beide meetlocaties.

De analyse werd uitgevoerd volgens EPR-DMPO RIVM in-house protocol gebaseerd op het protocol van B. Hellack uit UITA (Duisburg) [Yang et al., 2014; Hellack et al., 2014]. Er werd gebruik gemaakt van de directe methode zonder langdurige extracties van de filters. Het radicaalgenererend vermogen van de partikels werd bepaald via EPR (electron paramagnetic resonance) spectroscopie met spin trap DMPO (5.5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide) om de vorming van hydroxylradicalen (OH) te bepalen in de aanwezigheid van H2O2. Deze methode is vooral gevoelig aan metaal gemedieerde ROS (reactive oxygen species) vorming, via Fenton-type-reacties.

2.4.3.2 Inflammatietesten

2.4.3.2.1 IL-8-productie door Beas-2B-cellen (humaan-bronchiaal-epitheelcellijn)

Pro-inflammatoire cytokines spelen een belangrijke rol in ontstekingsreacties. IL-6 en IL-8 zijn pro-inflammatoire cytokines die vrijgesteld kunnen worden door respiratoire cellen (o.a. Beas-2B). IL-8 is een typisch inflammatoir chemokine dat neutrofielen, eosinofielen en basofielen aantrekt naar de plaats van inflammatie. Interleukine-8 wordt geproduceerd in het celkweekmedium door de Beas-2B-cellen. De Beas-2B-cellijn (ATCC: CRL-9609) is een humane bronchiale epitheliale

2 Meetcampagne

23

adherente cellijn, afkomstig van normaal humaan bronchiaal epitheel, maar geïnfecteerd met adenovirus 12-SV40 hybride en gekloneerd. Na 24 uur blootstelling van Beas-2B-cellen aan de partikels worden cytokines in het supernatans via Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) gekwantificeerd (Life Technologies. Il-8 Human Antibody Pair (Novex®)). Na 24 uur blootstelling van Beas-2B cellen aan de partikels (zie 2.4.3.1.1Cytotoxiciteit) werd het supernatans van de cytotoxiciteitsexperimenten verzameld, gepoold per blootstellingconcentratie (100, 50, 25 µg PM10/ml) en hierin werd IL-8 bepaald via Elisa.

2.4.3.2.2 Endotoxinetest

Er werd reeds eerder aangetoond dat endotoxines (o.a. bacteriële infectieuze agentia) kunnen voorkomen in stofdeeltjes in de lucht en op die manier eveneens een respons kunnen geven in toxiciteittesten, hetgeen met name belangrijk is bij het interpreteren van cytokine-signalen voor immuuntoxiciteit. Partikelstalen werden geëvalueerd voor aanwezigheid van endotoxines. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een kwantitatieve LAL-testkit (QCL-1000 kit, Lonza). Deze is gebaseerd op het lysaat van amoebocyten van de degenkrab (LAL= limulus amoebocyte lysaat). Endotoxines zorgen voor de omzetting van een pro-enzyme in het LAL-reagens, waarbij het gevormde enzyme de katalyse van het toegevoegde substraat in gang zet, met aanmaak van een eindproduct p-nitro-aniline (pNA), dat fotometrisch gemeten kan worden. De activiteit wordt bepaald door vergelijking met een endotoxinestandaard (E. coli-endotoxine). Per PM-staal werd de hoogste concentratie van het partikelextract waaraan de Beas-2B-cellen werden blootgesteld (100 µg/ml) getest op de aanwezigheid van endotoxine. Per filter werden twee replicametingen uitgevoerd.

2.4.3.3 Genotox testen

2.4.3.3.1 Ames II-test

De test wordt uitgevoerd met de Xenometrix Ames II Mutageniciteit Test kit (Endotell). Deze Ames II-test, gebaseerd op bacteriële reversiemutaties, wordt gebruikt om basenpaarsubstituties of frameshiftmutaties te detecteren, die veroorzaakt worden door een testitem, in Salmonella typhimuriumbacteriën in een in vitrosysteem. Puntmutaties in het histidine (His)-operon in Salmonella typhimurium verhinderen histidineproductie door deze bacteriën. Deze His-stammen kunnen niet groeien in medium zonder histidine. In een mutagene omgeving zullen basenpaarsubstituties of frameshiftmutaties in het His-gen een reversie tot het histidine-prototype tot stand brengen. Deze gereverteerde bacteriën zullen groeien in medium zonder histidine. De gebruikte stam is Salmonella typhimurium TA98 welke reverteert bij frameshiftmutaties. Binnen 2 dagen zullen gereverteerde bacteriënkolonies gevormd worden. Het metabolisme van de bacteriële kolonie verlaagt de pH van het medium waardoor de kleur in de well verandert van paars naar geel. Het aantal wells met veranderde kleur wordt geteld en vergeleken met de solventcontrole. Een toename van het aantal revertante kolonies (=kleurverandering) na blootstelling aan een chemische stof t.o.v. het aantal spontane bacteriële revertanten in de solventcontrole geeft een aanduiding van het mutagene potentieel van de teststof (Fold increase). Het mutagene potentieel wordt direct en indirect bepaald d.w.z. in aan- en afwezigheid van een exogeen metaboliserend activerend enzymesysteem (S9-fractie). De directe en de indirecte mutagene potentie van elk ASE-extract werden getest bij 1 concentratie (20 m3-luchtequivalent) met 3 replica wells per concentratie. Volgende controles werden meegenomen:

negatieve controle (topagar zonder toevoeging) om het aantal spontane revertanten te bepalen

2 Meetcampagne

24

solventcontrole: DMSO (dimethylsulphoxide)

positieve controle in afwezigheid van S9: 4-nitroquinoline-N-oxide (4-NQO) 0.5 µg/ml + 2NF 2.0 µg/ml

positieve controle in aanwezigheid van S9: 2- aminoanthracene (2-AA) 5 µg/ml Het extract van een blanco filter (procedure blanco) werd eveneens getest.

2.4.3.3.2 Komeettest

Eén van de belangrijkste mechanismem voor de gezondheidseffecten van partikels is inductie van oxidatieve stress. Oxidatieve stress treedt op als er een verstoring is van de balans tussen oxidatieve schade en anti-oxidantia in het lichaam. Reactieve zuurstofverbindingen (ROS) gevormd als reactie op of bij blootstelling aan partikels, die vaak transitiemetalen en poly-aromatische koolwaterstoffen (PAK’s) bevatten, kunnen schade teweegbrengen aan proteïnen, nucleïnezuren en vetzuren in de cel. Schade in DNA kan aan de basis liggen van kanker. Beas-2B cellen werden blootgesteld aan partikels (100 µg PM10/ml). De alkalische komeettest (single cell gel electrophoresis assay) werd gebruikt om (oxidatieve) DNA-schade te meten. Het principe van de komeettest berust op een verhoogde migratie van DNA - tijdens elektroforese – als het meer breuken bevat. De DNA-breuken gedetecteerd door de alkalische komeettest zijn een gevolg van oxidatieve en niet-oxidatieve schade en repair aan/van het DNA. Het DNA-migratiepatroon in elke cel apart ziet eruit als een kop met intact DNA en een staart met lussen gemigreerd DNA. Daarnaast kan specifiek oxidatieve DNA-schade geanalyseerd worden door een enzyme te gebruiken (formamidopyrimidine-DNA-glycosylase-enzyme), dat onder andere geoxideerde purinebasen uitknipt en DNA-migratie verhoogt. Als positieve controle (voor het enzyme) werden lymfocyten blootgesteld aan Ro-component. Dit is een lichtgevoelige component die bij blootstelling aan licht, radicalen vormt en dus oxidatieve stress.

2.4.3.4 Hormonale verstoring

2.4.3.4.1 ERE/ARE-test

Tijdens deze studie werd de estrogene activiteit gemeten met de humane BG1Luc4E2-eierstokkankercellijn (ERα positief). Androgene activiteit werd gekwantificeerd met de humane-T47D-ARE-borstkankercellijn. Beide cellijnen werden ontwikkeld door Dr. M. Denison (University of California-Davis. USA). De getransfecteerde cellen bevatten respectievelijk een Estrogen of Androgen Responsive Element gekoppeld aan een luciferase-reportergen (pSV2Neo en pGudLuc7) [Rogers and Denison, 2000; Ahn et al., 2008]. De hormoonverstorende estrogene of androgene activiteit is evenredig met de hoeveelheid luciferase-enzym dat geproduceerd wordt in de cel. De activiteit van het staal wordt gekwantificeerd t.o.v. de referentiestandaard (17β-estradiol E2 of dihydrotestosteron DHT). Van elk staalextract worden 10 verdunningen (van 36 m³ tot 0.36 m³ lucht-equivalent) gemeten en gebeurt de kwantificatie a.d.h.v. een fitting (Hillfunctie of Box-Cox-transformatie) door al deze meetpunten (Weighted least square regression, chi-kwadraattest). Zowel de referentiestandaarden als de verdunningen van het staal worden gemeten in duplicaat. De agonist respons (= de hormoonverstorende activiteit) van het staal wordt uitgedrukt in pg E2 of DHT biologisch equivalent per m³ lucht (voor respectievelijk estrogene en androgene verstoring). De extracten van een blanco filter (procedure blanco) en een veldblanco worden eveneens getest. Deze aanpak resulteerde in een statistisch onderbouwde kwantificatie van de hormoonverstorende activiteit in het staal.

3 Toxicologisch profiel Borgerhout

25

3 TOXICOLOGISCH PROFIEL BORGERHOUT

3.1 CYTOTOXICITEIT

Humane bronchiale epitheelcellen werden blootgesteld aan een concentratiereeks van de partikelfractie afkomstig van de bemonsterde filters uit Borgerhout (n=61) en Houtem (n=34). Er werd nagegaan in hoeverre de partikels het vermogen van de cellen om zich te vermenigvuldigen hebben beschadigd. De procedure blanco ’s vertoonden geen toxiciteit in de Beas-2B cellen. De leefbaarheid van de cellen, uitgedrukt als % t.o.v. de negatieve controle, is concentratie-afhankelijk (ANOVA, p<0.01) (Figuur 4). Het gemiddelde toxische effect (gemiddelde ± 95% CL) bij de hoogste blootstellingsconcentratie bedraagt 24 ± 2.5 % en 22 ± 6.2 % voor respectievelijk Borgerhout en Houtem. Het schadelijk karakter van de partikels uit Borgerhout is niet significant verschillend van de partikels uit Houtem (Factorial ANOVA, p=0.135). Het toxisch effect varieerde van dag tot dag. In de wintermaanden is het schadelijk effect het grootst (Figuur 5). De meetresultaten van de verschillende stalen zijn terug te vinden in Bijlage 1: Cytotoxiciteit.

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150

Leef

baar

heid

(% to

v co

ntro

le)

PM10 (µg/ml)

Borgerhout (n=61)

Houtem (n=34)

Figuur 4: Cytotoxiciteit van partikels afkomstig van Borgerhout en Houtem (gemiddelde ± 95% confidentie interval).

3 Toxicologisch profiel Borgerhout

26

-10

10

30

50

70

90

110

apr/13 mei/13 jun/13 jul/13 aug/13 sep/13 okt/13 nov/13 dec/13 jan/14 feb/14 mrt/14 apr/14 mei/14

Lee

fbaa

rhe

id (

% t

ov

con

tro

le)

Borgerhout

Houtem

4 523252524251 1 2255554425

2

524

Figuur 5: Maandgemiddelde cytotoxiciteit in Beas-2B na blootstelling aan 100 µgPM10/ml in functie van de staalname periode (gemiddelde ± SE, aantal meetdagen per maand).

3.2 RADICAALGENEREREND VERMOGEN

Oxidatieve stress werd geschat met behulp van een niet-biologische test, namelijk het bepalen van het radicaalgenererend vermogen van fijn stof in de luchtstalen met ‘electron spin’-resonantiespectroscopie (ESR) en uitgedrukt in arbitraire eenheden per m3 bemonsterde lucht. De meetresultaten van alle filters lagen boven de detectielimiet. De meetresultaten van de verschillende stalen na blanco correctie, zijn terug te vinden in Bijlage 2. In Borgerhout varieerde het radicaalgenererend vermogen van het fijn stof tussen 1495 en 6374 AU/m3 (n=22) met een gemiddelde van 3655 AU/m3. In Houtem varieerde het radicaalgenererend vermogen van het fijn stof tussen 212 en 2265 AU/m3 (n=28) met een gemiddelde van 1035 AU/m3. Over de volledige meetcampagne is het radicaal genererend van PM10 uit Borgerhout significant verhoogd t.o.v. van Houtem (Mann-Whitney U Test, p<0.01) (Figuur 6). Ook wanneer alleen de gepaarde dagen (n=22) in Borgerhout en Houtem in beschouwing worden genomen, is het verschil in radicaalgenererend vermogen tussen de twee meetplaatsen significant (Wilcoxon Matched Pairs test, p<0.01). Een verhoging van het radicaal genererend vermogen van PM in een stedelijk gebied in vergelijking met een landelijk gebied werd eerder aangetoond [Healy et al., 2012]. De oxidatieve potentie van de stalen varieerde sterk van dag tot dag. Er konden geen duidelijke seizoenseffecten worden waargenomen. Figuur 7 geeft een verloop van het radicaalgenererend vermogen in functie van de tijd.

3 Toxicologisch profiel Borgerhout

27

Mean Mean±SE Mean±1,96*SE Houtem Borgerhout

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

Radic

aal genere

rend v

erm

ogen (

AU

/m3)

Figuur 6: Radicaalgenererend vermogen van de fijn stof luchtstalen van Borgerhout en Houtem (gemiddelde ± 95% CL).

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

18/10/2012 26/01/2013 6/05/2013 14/08/2013 22/11/2013 2/03/2014 10/06/2014

Rad

icaa

lge

ne

rere

nd

ve

rmo

gen

(A

U/m

3 )

Borgerhout

Houtem

Figuur 7: Radicaalgenererend vermogen in Borgerhout en Houtem in functie van de bemonsteringsdagen.

In de huidige studie werd het radicaalgenererend vermogen bepaald op de teflonfilters bemonsterd met een high-volume Digitel-toestel. In het kader van Joaquin werden ROS-metingen uitgevoerd op kwartsfilters bemonsterd met een low-volume Leckeltoestel. Tijdens de meetcampagne werd op 22 dagen simultaan PM10 bemonsterd op dezelfde meetpost te Borgerhout en werden ROS-metingen uitgevoerd op de beladen teflon- en kwartsfilters met dezelfde analyse methode. Er kon een significante correlatie aangetoond worden tussen de metingen op teflon- en kwartsfilters (Pearson correlatiecoëfficiënt r=0.504, p=0.017) (Figuur 8). De gemiddelde meetwaarde voor de kwartsfilters (3141 AU/m3) is echter statistisch significant lager dan de gemiddelde waarde van de teflonfilters (3655 AU/m3) (gepaarde t- test, p=0.042) (Figuur 9). Uit deze resultaten kan niet afgeleid worden of het verschil te wijten is aan de verschillende filtertypes of aan de verschillende bemonsteringstoestellen. Voor vergelijkingen van het

3 Toxicologisch profiel Borgerhout

28

radicaalgenererend vermogen van fijn stof tussen meetplaatsen of in de tijd is het daarom belangrijk om de bemonstering uit te voeren met dezelfde toestellen en met hetzelfde filtertype. Yang et al. (2014) hebben het effect van extractiesolvent en filtertype op de meting van het oxidatief potentieel van PM2.5 onderzocht. De metingen op de kwartsfilters waren sterk gecorreleerd met de metingen op teflonfilters (Spearman correlatiecoëfficient= 0.76, p<0.01). Het oxidatief potentieel gemeten op de kwartsfilter was significant verlaagd t.o.v. de metingen op teflonfilters.

Figuur 8: Correlatie tussen radicaalgenererend vermogen gemeten op kwartsfilters bemonsterd met een low-volume Leckeltoestel en op teflonfilters bemonsterd met een high-volume Digitel-toestel (n=22, R=0.504 , p=0.017).

Mean

Mean±SE

Mean±1,96*SE Teflonfilter Kwartsfi lter

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

Ra

dic

aa

lge

ne

rere

nd

ve

rmo

ge

n (

AU

/m3)

Figuur 9: Radicaalgenererend vermogen van PM10 luchtstalen gemeten op kwartsfilters bemonsterd met een low-volume Leckeltoestel en op teflonfilters bemonsterd met een high-volume Digitel-toestel (box plot, gemiddelde ± 95% CL).

3 Toxicologisch profiel Borgerhout

29

3.3 ENDOTOXINE

Er werd reeds eerder aangetoond dat endotoxines (celwandbestanddelen afkomstig van gramnegatieve bacteriën) kunnen voorkomen in stofdeeltjes in de lucht en op die manier eveneens een respons kunnen geven in immuun-gerelateerde testen, hetgeen met name belangrijk is bij het interpreteren van cytokinesignalen. De meetresultaten van de verschillende stalen zijn terug te vinden in Bijlage 4. Per filter werd de hoogste concentratie van het partikelextract waaraan de cellen werden blootgesteld (100 µg/ml) getest voor de aanwezigheid van endotoxine. De resultaten worden weergegeven in Tabel 8. In 45 van de 61 stalen uit Borgerhout werden endotoxineconcentraties gemeten boven de detectielimiet (0.1 EU/ml). In Houtem werden in 20 van de 34 stalen waarden boven de detectielimiet gemeten. De gemiddelde endotoxineconcentratie is verhoogd in Borgerhout (0.75 EU/ml) in vergelijking met Houtem (0.38 EU/ml) maar het verschil is niet significant (Mann-Whitney U Test, p=0.11). Als enkel de dagen (n=32) waarop op beide locaties endotoxine werd gemeten in beschouwing worden genomen is er significante verhoging in Borgerhout (gemiddelde=0.7 EU/ml, mediaan=0.20 EU/ml) t.o.v. Houtem (gemiddelde=0.38 EU/ml, mediaan=0.12 EU/ml) (Wilcoxon Matched Pairs Test, p=0.05) (Figuur 10). Er is een sterke dag tot dag variatie in de endotoxineconcentratie van de stalen. De hoogste concentraties werden gemeten in de zomermaanden juli en augustus 2013 (Figuur 11). Ook in andere studies werd aangetoond dat de concentraties endotoxine het hoogst waren tijdens de zomermaanden ten opzichte van de wintermaanden [Hetland et al., 2005; Ferguson et al., 2013; Allen et al., 2011; Hetland et al., 2004; Carty et al., 2003]. Tabel 8: Endotoxineconcentratie in de PM10-fractie uit Borgerhout en Houtem.

Borgerhout (n=61) Houtem (n=34)

Gemiddelde (EU/ml)* 0.75 0.38

SD 1.74 1.72

Range (EU/ml) <DL-8 <DL-3.05

Mediaan (EU/ml)* 0.23 0.14

Aantal onder DL 16 (26%) 14 (41%) DL=detectielimiet; EU=Europese Unit; *waarden onder de DL werden gelijkgesteld aan de helft van de DL

3 Toxicologisch profiel Borgerhout

30

M ean M ean±SE M ean±1, 96*SE

Bor ger hout Hout em0, 0

0, 2

0, 4

0, 6

0, 8

1, 0

1, 2

1, 4

EU

/m

l (1

00

µ

g P

M1

0/m

l)

Figuur 10: Endotoxineconcentratie in de PM10-fractie uit Borgerhout en Houtem.

0

1

2

3

4

5

apr/13 mei/13 jun/13 jul/13 aug/13 sep/13 okt/13 nov/13 dec/13 jan/14 feb/14 mrt/14 apr/14 mei/14

End

oto

xin

e (

EU/m

l)

Borgerhout

Houtem

452325252

4

2

5

11

22

5

55544252524

Figuur 11: Maandgemiddelde endotoxineconcentraties in PM10-fractie uit Houtem en Borgerhout in functie van de tijd (gemiddelde ± SE, aantal meetdagen per maand).

Om uitsluitsel te kunnen geven of deze gemeten endotoxineconcentraties aanleiding kunnen geven tot de gemeten il-8 inducties van de luchtstalen werden Beas-2B cellen blootgesteld aan een concentratiereeks van endotoxine (0.1; 0.2; 0.4; 0.8; 1.6; 3.2; 6.4 en 12.7 EU/ml). Vervolgens werd il-8 gemeten in het supernatans. Vanaf een concentratie van 0.8 EU/ml endotoxine werd een significante toename van de hoeveelheid il-8 waargenomen (ANOVA, Tukey HSD test,. p<0.05). Op 7 dagen in Borgerhout en op 3 dagen in Houtem is de gemeten endotoxineconcentraties in de luchtstalen voldoende hoog om il-8 inducties te induceren in de Beas-2B cellen. Op deze dagen kan de aanwezigheid van endotoxine in de bemonsterde lucht de inflammatoire potentie van de PM10 stalen deels verklaren. De endotoxineconcentratie van de stalen is significant gecorreleerd met de il-8 inductie (Spearman Rank correlatiecoëfficiënt= 0.76, p<0.001) (Figuur 12).

3 Toxicologisch profiel Borgerhout

31

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8 10 12

End

oto

xin

e (

EU/m

l)

il-8 inductie

Borgerhout

Houtem

Zelzate

R2=0,578

Figuur 12: Correlatie tussen endotoxine gehalte van PM10 en il-8 inductie in Beas-2B na blootstelling aan 100 µg PM10 (n=105, r=0.76, p<0.001).

3.4 IL-8 INDUCTIE

Bronchiale epitheelcellen worden in vitro door partikels gestimuleerd tot de productie van pro-inflammatoire cytokines die de mogelijke aanzet vormen tot ontstekingsreacties in de luchtwegen. IL-8 is een chemokine met een chemotactische werking dat immuuncellen (o.a. neutrofielen, eosinofielen en basofielen) aantrekt naar de plaats van inflammatie. Na 24 u blootstelling van de Beas-2B cellen aan een concentratiereeks van PM10 werd in het supernatans il-8 gemeten. De meetresultaten van de verschillende stalen zijn terug te vinden in Bijlage 3. De methanol-extracten van de procedure blanco ‘s induceerden na blootstelling van Beas-2B cellen geen verhoging in il-8 productie t.o.v. de negatieve controle (SI= stimulatie index). Een significant concentratie-effect werd vastgesteld voor zowel de luchtstalen uit Borgerhout en Houtem waarbij de productie van il-8 toeneemt bij stijgende concentratie PM10 (One-way ANOVA, p<0.05). Over de volledige meetperiode is het inflammatoir karakter van de partikels uit Borgerhout (n=61) significant verhoogd ten opzichte van de partikels uit Houtem (n=34) (Factorial ANOVA, p=0.002) (Figuur 13). De inflammatoire capaciteit van de partikelfractie varieerde sterk van dag tot dag. In de lente en zomermaanden van 2013 werd de hoogste activiteit gemeten (Figuur 14).

3 Toxicologisch profiel Borgerhout

32

0

1

2

3

4

0 20 40 60 80 100 120

il-8

ind

uct

ie

µg PM10 (µg/ml)

Borgerhout

Houtem

Figuur 13: Il-8 inductie na blootstelling van Beas-2B aan PM10 afkomstig van Borgerhout en Houtem

(gemiddelde 95% CL).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

apr/13 mei/13 jun/13 jul/13 aug/13 sep/13 okt/13 nov/13 dec/13 jan/14 feb/14 mrt/14 apr/14 mei/14

il-8

ind

uct

ie

Borgerhout

Houtem

4 523252524251 1 22525544252524

Figuur 14: Maandgemiddelde inflammatoire potentie in Beas-2B na blootstelling aan 100 µg PM10/ml in functie van de staalnameperiode (gemiddelde ± SE, aantal meetdagen per maand).

3.5 AMES II

De Ames II-test werd uitgevoerd op de organische extracten met de stam TA98 in aan- en afwezigheid van de metaboliserende fractie S9. De meetresultaten van de verschillende stalen zijn terug te vinden in Bijlage 5. In al de stalen van Borgerhout kon mutagene activiteit worden aangetoond (toename van het aantal revertante kolonies na blootstelling t.o.v. het aantal spontane bacteriële revertanten in de solventcontrole ≥2). In Houtem kon in 26 van de 31 luchtstalen directe en indirecte mutageniciteit worden aangetoond. De mutagene activiteit van de stalen uit Borgerhout (n=61) werd vergeleken met de mutagene activiteit van luchtstalen verzameld in dezelfde periode in de achtergrondlocatie Houtem (n=33). Zowel de directe (-S9) als de indirecte (+S9) mutagene activiteit is significant verhoogd in Borgerhout t.o.v. Houtem (Mann-Whitney U test, p=0.04 (-S9) en p=0.03 (+S9). Als de mutagene activiteit wordt vergeleken op de identieke meetdagen in beide locaties (n=31) blijft de directe en indirecte mutagene activiteit hoger in Borgerhout dan in Houtem (Wilcoxon Matched Pairs Test, p<0.01). De resultaten worden weergegeven in Figuur 15.

3 Toxicologisch profiel Borgerhout

33

0

5

10

15

20

25

30

35

40

- S9 + S9

reve

rtan

ten

/20

m3

luch

t e

q

Borgerhout

Houtem

p=0,001

p=0,002

Figuur 15: Mutagene activiteit in Borgerhout en Houtem (revertanten/20 m3-luchteq) (gemiddelde ± 95% CL) (-S9: directe mutageniciteit; +S9: indirecte mutageniciteit).

3.6 KOMEETTEST

Na blootstelling van Beas-2B-cellen aan 100 µg PM10/ml werd de alkalische komeettest uitgevoerd om DNA-schade te meten. De alkalische komeettest laat toe om een onderscheid te maken tussen DNA-breuken die een gevolg zijn van oxidatieve en niet-oxidatieve schade aan het DNA. De meetresultaten van de verschillende stalen zijn terug te vinden in Bijlage 6. Over de volledige meetcampagne is de gemiddelde netto-oxidatieve DNA-schade na PM10-blootstelling hoger dan de DNA-schade ten gevolge van DNA-breuken, respectievelijk 30% en 16% voor de stalen uit Borgerhout en 38% en 16% voor de stalen uit Houtem. Er kon geen verschil aangetoond worden in niet-oxidatieve DNA-schade tussen luchtstalen uit Borgerhout (n=41) en Houtem (n=19) (Mann-Whitney U Test, p=0.31). DNA-breuken als gevolg van oxidatieve schade waren daarentegen verhoogd in Houtem in vergelijking met Borgerhout (Mann-Whitney U Test, p=0.023). Het percentage DNA-migratie van Beas-2B-cellen bij breuken en de berekende oxidatieve schade zijn weergegeven in Figuur 16. Als enkel de dagen (n=15) waarop op beide locaties de luchtstalen werden getest worden vergeleken, kon er geen statistisch significant verschil aangetoond worden in oxidatieve en niet-oxidatieve DNA-schade door partikels uit Borgerhout en Houtem (Wilcoxon Matched Pairs test, p=0.17 en p=0.17). De fpg-modified comet assay werd gebruikt om de inductie van oxidatieve DNA-schade na te gaan in A549 cellen [Wessels et al., 2010]. De fijn stof stalen uit het achtergrond- en stedelijk gebied bleken minder potent in de inductie van oxidatieve DNA-schade in de A549 cellen in vergelijking met stalen uit locaties met veel verkeer.

3 Toxicologisch profiel Borgerhout

34

0

10

20

30

40

50

oxidatieve stress breuken

% s

taar

t le

ngt

e

Komeet

Borgerhout

Houtem

p=0,02

p=0,31

Figuur 16: % DNA-migratie van Beas-2B ten gevolge van oxidatieve DNA-schade en DNA-breuken na PM10 blootstelling (gemiddelde ± 95% CL).

3.7 TOXICOLOGISCH PROFIEL VAN BORGERHOUT

Humane bronchiale epitheelcellen werden blootgesteld aan de partikelfractie afkomstig van de bemonsterde filters uit Borgerhout en Houtem. Het schadelijk karakter van de partikels uit het stedelijk gebied Borgerhout is niet significant verschillend van de partikels uit Houtem (p=0.135). Het inflammatoir potentieel van de partikels uit Borgerhout is wel significant hoger ten opzichte van de partikels uit Houtem (p=0.002). De immunologische responsen bleken eerder op te treden in stalen van het voorjaar en de zomer, en konden niet volledig toegeschreven worden aan de aanwezigheid van endotoxines op de partikels. In meer dan de helft van de stalen werden endotoxineconcentraties gemeten boven de detectielimiet. De gemiddelde endotoxineconcentratie is verhoogd in Borgerhout in vergelijking met Houtem maar het verschil is niet significant (p=0.11). Er kon geen verschil aangetoond worden in niet-oxidatieve DNA-schade tussen luchtstalen uit Borgerhout en Houtem (p=0.309). DNA-breuken als gevolg van oxidatieve schade waren daarentegen verhoogd in Houtem in vergelijking met Borgerhout, echter niet statistisch significant (p=0.172). Het radicaalgenererend vermogen van de partikels uit Borgerhout is significant verhoogd t.o.v. Houtem (p<0.01). De mutagene activiteit van de extracten werd bepaald bij blootstelling aan 20 m3 lucht-equivalent Zowel de directe (-S9) als de indirecte (+S9) mutagene activiteit is significant verhoogd in Borgerhout t.o.v. Houtem (p=0.04 (-S9) en p=0.03 (+S9)). De resultaten worden samengevat in Figuur 17.

3 Toxicologisch profiel Borgerhout

35

0,97

1,46

2,00

0,770,98

3,53

1,30 1,38

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

rati

o:

Bo

rge

rho

ut

vs. H

ou

tem

p=0,13 p=0,002 p=0,11 p=0,17 p=0,31 p<0,01 p=0,04 p=0,03

grijs: niet significant verschillend

rood: significant hoger in Borgerhout Figuur 17: Overzicht van het toxicologisch profiel van Borgerhout in vergelijking met Houtem.

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

36

4 TOXICOLOGISCH PROFIEL VAN DE GENTSE KANAALZONE

4.1 CYTOTOXICITEIT

Humane bronchiale epitheelcellen werden blootgesteld aan een concentratiereeks van de partikelfractie afkomstig van de filters bemonsterd 24 uur voorafgaand aan de veldwerkdagen van de HBM. Er werd nagegaan in hoeverre de partikels het vermogen van de cellen om zich te vermenigvuldigen hebben beschadigd. De leefbaarheid van de cellen, uitgedrukt als % t.o.v. de negatieve controle, in functie van de concentratie partikels wordt weergegeven in Figuur 18. De volledige dataset is terug te vinden in Bijlage 1. Het toxisch effect varieerde van dag tot dag. Met uitzondering van de dagstalen van 10/04/2013 en 21/05/2013 werd voor alle stalen een significant toxisch effect waargenomen bij de hoogste blootstellingsconcentratie (Tukey HSD test, p<0.05). De gemiddelde vermindering in leefbaarheid van de cellen na blootstelling aan 100 µg PM10/ml bedraagt 31.8 ± 12.2 (95% CL) %. De dagstalen van 24/11/2013 en 28/01/2014 induceerden de hoogste toxiciteit van respectievelijk 82% en 77% celdood. In de wintermaanden is het schadelijk effect van de partikels het grootst (Figuur 19). Er werd nagegaan of er een verschil kon vastgesteld worden in de cytotoxische potentie van de partikels verzameld in Zelzate ten opzichte van partikels verzameld in de achtergrondlocatie Houtem. Over de volledige meetcampagne was het schadelijk karakter van de partikels uit Zelzate (n=13) niet verschillend van deze uit Houtem (n=18) (Factorial ANOVA, p=0.114)

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150

Lee

fbaa

rhe

id (

% t

ov

con

tro

le)

PM10 (µg/ml)

Houtem (n=34)

Zelzate (n=13)

Figuur 18: Cytotoxiciteit van partikels afkomstig van Zelzate en Houtem (gemiddelde ± 95% CL).

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

37

-10

10

30

50

70

90

110

apr/13 mei/13 jun/13 jul/13 aug/13 sep/13 okt/13 nov/13 dec/13 jan/14

Lee

fbaa

rhe

id (

% t

ov

con

tro

le)

Houtem

Zelzate

1

2222

41212222231

Figuur 19: Maandgemiddelde cytotoxiciteit in Beas-2B na blootstelling aan 100 µgPM10/ml in functie van de staalname periode (gemiddelde ± SE, aantal meetdagen per maand).

4.2 RADICAALGENEREREND VERMOGEN

In de periode van april 2013 t.e.m. januari 2014 varieerde het radicaalgenererend vermogen van het fijn stof in Zelzate tussen 583 en 5317 AU/m3 (n=14) met een gemiddelde van 2430 AU/m3. In Houtem varieerde het radicaalgenererend vermogen van het fijn stof tussen 295 en 2265 AU/m3 (n=12) met een gemiddelde van 1088 AU/m3 (Figuur 20). Het radicaalgenererend vermogen van PM10 uit Zelzate is significant verhoogd t.o.v. van Houtem (Mann-Whitney U Test, p=0.03). De meetresultaten van de verschillende stalen zijn terug te vinden in Bijlage 2. De oxidatieve potentie van de stalen varieerde sterk van dag tot dag. Er is een tendens tot een verhoging van het radicaalgenererend vermogen in Zelzate gedurende de wintermaanden. Er moet echter opgemerkt worden dat er in de zomermaanden geen bemonstering was. Figuur 21 geeft een verloop van het radicaalgenererend vermogen in functie van de tijd.

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

38

Mean

Mean±SE

Mean±1,96*SE Zelzate Houtem0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Radic

aalg

enere

rend v

erm

ogen (A

U/m

3)

Figuur 20: Radicaalgenererend vermogen van fijn stof luchtstalen afkomstig van Zelzate en Houtem (gemiddelde ± 95% CL).

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

17

/03

/20

13

6/0

5/2

01

3

25

/06

/20

13

14

/08

/20

13

3/1

0/2

01

3

22

/11

/20

13

11

/01

/20

14

2/0

3/2

01

4

Houtem

Zelzate

Figuur 21: Radicaalgenererend vermogen in Zelzate en Houtem in functie van de bemonsteringsdagen.

4.3 ENDOTOXINE

De aanwezigheid van endotoxine werd nagegaan in het partikelextract bij de hoogste blootstellingsconcentratie van 100 µg PM10/ml. De meetresultaten van de verschillende stalen zijn terug te vinden in Bijlage 4. De samenvattende resultaten worden weergegeven in Tabel 9 en Figuur 22. In 6 van de 13 stalen uit Zelzate werden endotoxineconcentraties gemeten boven de detectielimiet (0.1 EU/ml). In Houtem lag de endotoxineconcentratie in de helft van de stalen onder de detectielimiet. De gemiddelde endotoxineconcentratie is verhoogd in Houtem (0.56 EU/ml) in vergelijking met

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

39

Zelzate (0.17EU/ml) maar het verschil is niet significant (Mann-Whitney U Test, p=0.6). De hogere gemiddelde waarde voor Houtem is te wijten aan 2 dagen (30/7/2013 en 11/8/2013) met hoge endotoxineconcentraties. De bemonsteringsdagen in Zelzate zijn niet homogeen verspreid over de volledige periode. Er zijn maanden waarin geen endotoxinegegevens beschikbaar zijn voor Zelzate. De hoogste endotoxineconcentratie in Zelzate werd gemeten in augustus 2013 (Figuur 23). Tabel 9: Endotoxine concentratie in de PM10-fractie uit Zelzate en Houtem.

Zelzate (n=13) Houtem (n=18)

Gemiddelde (EU/ml)* 0.17 0.56

SD 0.18 0.99

Range (EU/ml) <DL-0.54 <DL-3.05

Mediaan (EU/ml)* <DL <DL

Aantal onder DL 7 (54%) 9 (50%) DL=detectielimiet; EU=Europese Unit; *waarden onder de DL werden gelijkgesteld aan de helft van de DL

Om uitsluitsel te kunnen geven of deze gemeten endotoxineconcentraties aanleiding kunnen geven tot de gemeten il-8 inducties van de luchtstalen werden Beas-2B cellen blootgesteld aan een concentratiereeks van endotoxine (0.1; 0.2; 0.4; 0.8; 1.6; 3.2; 6.4 en 12.7 U/ml). Vervolgens werd il-8 gemeten in het supernatans. Vanaf een concentratie van 0.8 U/ml endotoxine werd een significante toename van de hoeveelheid il-8 waargenomen (ANOVA, Tukey HSD test, p<0.05). Op 3 dagen in Houtem is de gemeten endotoxineconcentraties in de luchtstalen voldoende hoog om il-8 inducties te induceren in de Beas-2B cellen. Op deze dagen kan de aanwezigheid van endotoxine in de bemonsterde lucht de inflammatoire potentie van de PM10 stalen deels verklaren. In Zelzate kan de il-8 inductie na blootstelling aan PM10 niet verklaard worden door de aanwezigheid van endotoxines.

Mean

Mean±SE

Mean±1,96*SE Houtem Zelzate

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

En

do

toxin

e (

EU

/ml)

Figuur 22: Endotoxine concentratie in de PM10-fractie uit Zelzate en Houtem.

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

40

0

1

2

3

apr/13 mei/13 jun/13 jul/13 aug/13 sep/13 okt/13 nov/13 dec/13 jan/14

End

oto

xin

e (

EU/m

l)

Houtem

Zelzate

122224

1

2

122

2

223

1

Figuur 23: Maandgemiddelde endotoxine concentraties in PM10-fractie uit Houtem en Zelzate in functie van de tijd (gemiddelde ± SE, aantal meetdagen per maand).

4.4 IL-8-INDUCTIE

Na blootstelling van de Beas-2B aan 100, 50 en 25 µg PM10/ml werd in het supernatans il-8 gemeten. Een significante dosis-effectrelatie waarbij de il-8-inductie toeneemt met stijgende PM10-concentratie werd slechts vastgesteld op 3 van de 13 dagstalen: 8/04/2013, 26/08/2013 en 28/10/2013 (Multiple Regression, p<0.01). Op de andere dagen werd geen il-8 inductie waargenomen na blootstelling aan PM10. De meetresultaten van de verschillende stalen zijn terug te vinden in Bijlage 3. Voor de periode van 8 maanden werd de globale inflammatoire potentie van PM10 uit Zelzate vergeleken met deze van PM10 uit Houtem (Figuur 24). Er werd een significant verschil in il-8-inductie vastgesteld tussen Houtem (n=18) en Zelzate (n=13) waarbij de inflammatoire respons het hoogst was in de achtergrondlocatie (Factorial ANOVA, p=0.003). De hoogste inflammatoire respons in Zelzate werd gemeten in augustus 2013 (Figuur 25). Hierbij moet worden opgemerkt dat de luchtstalen in Houtem en Zelzate niet op dezelfde dagen werden verzameld. Tevens werden in de stalen van Houtem hoge endotoxine concentraties gemeten die de hogere il-8 inductie in Houtem deels kunnen verklaren. Een significante correlatie kan aangetoond worden tussen de il-8 inductie in Beas-2B en de endotoxineconcentratie (Spearman Rank correlatiecoëfficiënt= 0.76, p<0.001) (zie 3.3). Een associatie tussen de aanwezigheid van endotoxine en de productie van pro-inflammatoire merkers in vitro werd ook gerapporteerd in andere studies [Steenhof et al., 2011].

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

41

0

1

2

3

4

0 20 40 60 80 100 120

il-8

ind

uct

ie

PM10 (µg/ml)

Houtem

Zelzate

Figuur 24: Il-8-inductie na blootstelling aan PM10 uit Zelzate en Houtem (gemiddelde ±95%CL).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

apr/13 mei/13 jun/13 jul/13 aug/13 sep/13 okt/13 nov/13 dec/13 jan/14

il-8

ind

uct

ie

Houtem

Zelzate

12222412122222

31

Figuur 25: Maandgemiddelde inflammatoire potentie in Beas-2B na blootstelling aan 100 µgPM10/ml in functie van de staalname periode (gemiddelde ± SE; aantal meetdagen per maand).

4.5 AMES II

De Ames II-test werd uitgevoerd op de organische extracten van de maandstalen. De meetresultaten van de verschillende stalen zijn terug te vinden in Bijlage 5. In de stalen van Zelzate kon mutagene activiteit worden aangetoond (toename van het aantal revertante kolonies na blootstelling t.o.v. het aantal spontane bacteriële revertanten in de solventcontrole ≥2). De resultaten van de mutagene activiteit (aantal revertanten/20 m3-luchteq) zijn weergegeven in Tabel 10. De mutagene activiteit van de stalen uit Zelzate werd vergeleken met de mutagene activiteit van luchtstalen verzameld in dezelfde periode in de achtergrondlocatie Houtem (Figuur 26). Voor Houtem werd de Ames II-test uitgevoerd op dagstalen. Voor elke maand werd het gemiddelde berekend van de verschillende dagwaarden. Het aantal staalnamedagen per maand is beperkt door technische problemen met het Digitel toestel waardoor in Houtem slechts 1 of 2 dagen per maand werd bemonsterd. De directe mutagene activiteit is significant verhoogd in Zelzate t.o.v. Houtem (Wilcoxon Matched Pairs Test, p=0.05). De indirecte mutagene activiteit is niet verschillend tussen beide locaties (Wilcoxon Matched Pairs Test. p=0.14).

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

42

Tabel 10: Mutagene activiteit (revertanten/20 m3-luchteq) van extracten.

Zelzate Houtem

-S9 +S9 Aantal

dagen/maand -S9 +S9

April 2013 48.0 33.7 1 12.3 2.0

Mei 2013 17.3 5.7 1 3.3 1.3

Juni 2013 26.7 8.3 2 1.8 1.7

Juli 2013 24.0 6.3 2 5.2 3.2

Augustus 2013 29.0 20.0 2 15.3 6.3

September 2013 28.0 14.3 2 44.3 17.8

Oktober 2013 31.7 7.0 1 3.7 3.0

November 2013 26.0 5.7 2 27.7 24.3

December 2013 - - 2 39.8 21.7

Januari 2014 43.0 29.7 2 26.7 13.0 ‘-S9’: directe mutageniciteit; ‘+S9’: indirecte mutageniciteit

0

5

10

15

20

25

30

35

40

- S9 + S9

reve

rtan

ten

/20

m3

luch

t e

q

Zelzate

Houtem

p=0,05

p=0,14

Figuur 26: Mutagene activiteit in Zelzate en Houtem (revertanten/20 m3-luchteq) (gemiddelde ± 95% CL) (-S9: directe mutageniciteit; +S9: indirecte mutageniciteit).

4.6 KOMEETTEST

Na blootstelling van Beas-2B-cellen aan 100 µg PM10/ml werd de alkalische komeettest uitgevoerd om DNA-schade te meten. De alkalische komeettest laat toe om een onderscheid te maken tussen DNA-breuken die een gevolg zijn van oxidatieve en niet-oxidatieve schade aan het DNA. De meetresultaten van de verschillende stalen zijn terug te vinden in Bijlage 6. In Zelzate is de gemiddelde netto-oxidatieve DNA-schade (40%) na PM10-blootstelling hoger dan de DNA-schade ten gevolge van DNA-breuken (7%). Het percentage DNA-migratie van Beas-2B-cellen bij breuken en de berekende oxidatieve schade zijn weergegeven in Figuur 27. Er kon geen statistisch significant verschil aangetoond worden in oxidatieve en niet-oxidatieve DNA-schade tussen partikels uit Zelzate (n=12) en Houtem (n=8) (Mann-Whitney U Test, p=0.46 (oxidatieve schade), p=0.07 (breuken)).

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

43

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

oxidatieve schade breuken

% s

taar

t le

ngt

e

Houtem

Zelzatep=0,07

p=0,46

Figuur 27: Gemiddelde % DNA-migratie van BEAS-2B ten gevolge van oxidatieve DNA-schade en DNA-breuken (gemiddelde ± 95% CL).

4.7 ERE-TEST

Tijdens de looptijd van het project werden 45 stalen genomen per locatie. Initieel was het de bedoeling om de hormoonverstoring (ERE- en ARE-test) te meten in poolstalen (4 filters per maand samenvoegen), maar aangezien preliminaire testen uitwezen dat de belading van de filters, en dus ook de celrespons en het al dan niet optreden van cytotoxiciteit sterk varieert in de tijd, werd besloten om de metingen uit te voeren op dagstalen. De meetresultaten van de verschillende stalen zijn terug te vinden in Bijlage 7. Van de meetpost in Zelzate werden 37 individuele glasvezelfilters gemeten. Bij 4 filters (10% van het totale aantal) kon geen estrogene activiteit berekend worden door het optreden van celdood (cytotoxiciteit) bij alle verdunningen van het extract. Acht filters werden door technische problemen niet bemonsterd. Van de meetpost in Houtem werden 33 individuele glasvezelfilters gemeten. Bij 5 filters (13% van het totale aantal) kon geen estrogene activiteit berekend worden door het optreden van celdood (cytotoxiciteit) bij alle verdunningen van het extract. Twaalf filters werden door technische problemen niet bemonsterd. Hierdoor was er voor november 2013 geen en voor oktober 2013 slecht 1 staal beschikbaar. Er werden eveneens 2 procedureblanco ‘s en 8 veldblanco’s gemeten gedurende de hele periode. Figuur 28 geeft een overzicht van de gemeten activiteit op de dagstalen in beide locaties.

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

44

Figuur 28: Oestrogene activiteit van de dagstalen in Houtem en Zelzate.

Dagstalen met een activiteit lager dan de blanco werden op de helft van de mediaanwaarde van de blanco (8.3 +/- 2.7 fg E2 eq/m³) gezet voor verdere statistische verwerking. Dagstalen met een activiteit van 0 fg E2 eq per m³ zijn stalen waarbij cytotoxiciteit over de hele verdunningsreeks optrad. Deze stalen zijn niet in rekening genomen bij de verdere statistische verwerking. De estrogene activiteit van dagstalen van beide locaties was niet significant verschillend (Wilcoxon Matched Pairs Test en gepaarde t-test, p=0.43). Voor elke maand werd per locatie het gemiddelde berekend van de verschillende dagwaarden. Tabel 11 en Figuur 29 geven een overzicht van de maandgemiddelden per locatie. Er kon geen statistisch significant verschil aangetoond worden tussen de maandgemiddelden (gepaarde t-test, p=0.28).

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

45

Mean

Mean±SE

Mean±1,96*SE Zelzate Houtem

0

10

20

30

40

50

Oes

tro

gen

e ac

tivi

teit

(fg

E2 e

q /

m³)

Figuur 29: Oestrogene activiteit in Houtem en Zelzate.

Tabel 11: Oestrogene activiteit van PM10-extracten (fg E2 eq/m³).

Zelzate Houtem

April 2013 37.1 12.4

Mei 2013 29.9 58.0

Juni 2013 53.6 40.0

Juli 2013 20.2 42.5

Augustus 2013 44.9 25.2

September 2013 11.4 8.3

Oktober 2013 39.5 33.8

November 2013 86.4 -

December 2013 93.9 65.8

Januari 2014 46.1 54.7

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

46

Figuur 30: Maandgemiddelde oestrogene activiteit (gemiddelde ± SE; aantal metingen per maand).

In een aantal studies werden oestrogene en/of anti-oestrogene effecten gemeten in fijn stof met behulp van in vitro studies. In een studie uit Zwitserland werden estrogene effecten gemeten in PM1 in een landelijk en stedelijk gebied tijdens een wintersmogperiode in 2006 [Wenger et al., 2009]. Net zoals in deze studie was er geen verschil in mediaanwaarde tussen beide locaties, maar de algemene oestrogene activiteit lag wel hoger in de Zwitserse studie. Aangezien hier in een wintersmogperiode gemeten werd en zowel de verzamelde fractie als de extractiemethode en cellijn verschillend waren in vergelijking met deze studie, is het echter niet mogelijk om de gemeten activiteiten te vergelijken. In studies in Tsjechië (zomer 2005) en Bosnië-Herzegovina (zomer 2008) werden geen oestrogene (maar wel anti-oestrogene) effecten gemeten in de gas- en partikel fase [Novak et al., 2013; Novak et al., 2009b]. Klein et al. (2006a) detecteerde oestrogene activiteiten in zowel de gasfase als de partikelfase van PM10-stalen uit Canada. Gekende polluenten met oestrogene werking zijn o.a. PAK’s en hun metabolieten [Wenger et al., 2009c; Matsumoto et al., 2005a; Matsumoto et al., 2005b;], (bis)fenolen [Matsumoto et al., 2005b; Leusch et al., 2010; Matsumoto et al., 2005a], ftalaten [Klein et al., 2006b], bepaalde hydroxy-PCB’s [Bonefeld-Jorgensen, 2010], parabenen [Rudel et al., 2003], perfluorverbindingen [Bjerregaard-Olesen et al., 2014] en een heel aantal pesticiden [Sonneveld et al., 2005]. De distributie tussen de gas- en partikelfase is afhankelijk van het type polluent. Zo komen PAK’s met een lager molecuulgewicht meer voor in de gasfase, terwijl PAK’s met een hoger molecuulgewicht (meestal structuren met meer dan 4 ringen) en hydroxy-PAK’s vooral aan partikels gebonden zijn. Verschillende studies toonden ook aan dat de estrogene activiteit in de gasfase hoger is dan in de partikelfase [Klein et al., 2006a; Kennedy et al., 2009; Novak et al., 2009a]. Novák et al. (2009) rapporteerden dat de concentraties aan de 16 US EPA PAK’s, 7 indicator PCB's en de organochloor-pesticiden DDT, HCH en HCB (allen oestrogeen verstorend) 10 maal hoger waren in de gasfase dan in de partikelfase bij luchtstalen uit Tsjechië. Ook Klein et al. (2006) vond hogere concentraties aan PAK’s, PCB’s en organochloorpesticiden in de gasfase. De PCDD/F's daarentegen waren hoger in de partikelfase. Een studie uit Italië toonde aan dat fluoreen en fenanthreen vooral in de gasfase (> 80%) gemeten worden, terwijl pyreen en fluorantheen zowel in gas- en partikelfase voorkomen

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

47

(Sangiorgi et al., 2014). Sangiorgi et al. (2014) toonden ook aan dat absorptie van meer vluchtige PAK’s en alkanen op EC en OC en adsorptie van deze stoffen aan roetdeeltjes (voornaamste bestanddeel van BC) de distributie tussen gas- en partikelfase kan beïnvloeden. Om een volledig beeld te krijgen van de oestrogene activiteit in de lucht is het dus noodzakelijk om zowel de gas- als partikelfase te bemonsteren.

4.8 ARE-TEST

Voor het bepalen van de androgene activiteit (agonisme) werden telkens 10 stalen (1 staal per maand) van de meetstations in Zelzate en Houtem geselecteerd. Er werd getracht om zoveel mogelijk stalen van dezelfde staalnamedatum, die weinig cytotoxiciteit vertonen, te meten. In onderstaande tabellen (Tabel 12 en Tabel 13) wordt een overzicht gegeven van de activiteit (agonisme van het staal) en het optreden van celdood en/of mogelijk antagonisme. Aangezien er in Houtem geen stalen genomen werden in november, zijn er voor deze locatie slechts 9 stalen gemeten. Tabel 12: Overzicht resultaten Zelzate androgene verstoring. Df is dilutiefactor. * df 80-133 microscopische waarneming van stresstoestand.

Zelzate

datum Activiteit (agonisme) celdood (df) antagonisme? (df) blanco DMSO respons (df)

28/04/2013 - - 40 80-2000

22/05/2013 - - 40 80-2000

3/06/2013 - - 40 80-2000

27/07/2013 - - 40 80-2000

14/08/2013 - - 40-80 100-2000

1/09/2013 - - 40 80-2000

31/10/2013 - 40 80-400 800-2000

30/11/2013 - 40 (80-133)* - 200-2000

18/12/2013 - 40-80 100-400 800-2000

17/01/2014 - 40-80 100-2000 -

Tabel 13: Overzicht resultaten Houtem androgene verstoring. Df is dilutiefactor.

Houtem

datum Activiteit (agonisme) celdood (df) antagonisme? (df) blanco DMSO respons (df)

28/04/2013 - - - 40-2000

22/05/2013 - - - 40-2000

3/06/2013 - - 40 80-2000

27/07/2013 - - 40 80-2000

14/08/2013 - - 40 80-2000

1/09/2013 - - 40 80-2000

7/10/2013 - - 40-80 100-2000

november geen staal beschikbaar

18/12/2013 - 40-80 100-133 200-2000

17/01/2014 - - 40-400 800-2000

Voor alle stalen werden 9 verdunningen (tussen df 40 of 18 m³ PM10 en df 2000 of 0.36 m³ PM10) gemeten. In geen enkel van de 19 stalen werd een activiteit (agonisme) gemeten. Bij 4 stalen (van de periode oktober- januari) werd celdood vastgesteld voor de meest geconcentreerde extracten. Bij alle stalen, uitgezonderd deze van november in Zelzate en deze van april en mei in Houtem,

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

48

werden mogelijke anti-androgene (antagonistische) effecten vastgesteld. Met antagonistische effecten wordt bedoeld dat de respons van het staal bij die bepaalde verdunningsfactor lager is dan de respons van de DMSO-blanco. Deze resultaten dienen echter met de nodige voorzichtigheid geïnterpreteerd te worden, aangezien (niet microscopisch waarneembare) cytotoxiciteit gelijkaardige resultaten kan geven. Om na te gaan of er inderdaad antagonistische effecten optreden, zijn er bijkomende metingen nodig waarbij het staal gespiked wordt met 1) de EC50 van dihydrotestosterone standaard of 2) met een overmaat van deze standaard om cytotoxiciteit en niet-receptorafhankelijke respons uit te sluiten. Deze bijkomende metingen werden niet voorzien in dit project. Er werden eveneens enkele veldblanco’s (dit zijn lege filters waarbij door technische problemen geen PM10-staal genomen werd) gemeten. Noch de veldblanco’s van Houtem noch die van Zelzate gaven een androgene respons en nergens werden cytotoxiciteit of mogelijke antagonistische effecten gemeten. Deze resultaten tonen dus aan dat er geen agonistische androgene effecten meetbaar zijn in PM10. maar dat er mogelijk wel antagonistische androgene stoffen aanwezig zijn in de extracten. Vooral de stalen van de winterperiode (oktober tot januari) lijken sterkere antagonistische effecten te vertonen, maar meer onderzoek is nodig om deze hypothese te bevestigen. Dit onderzoek is het eerste dat androgene effecten in luchtstalen in Vlaanderen onderzoekt. In de internationale literatuur zijn ook slechts een beperkt aantal studies beschikbaar. In een studie in Bosnië-Herzegovina werden geen androgene (wel anti-androgene) effecten gemeten in PM10 [Novak et al., 2013; Novak et al., 2009b]. In enkele andere studies werden sediment en waterstalen onderzocht, maar hier werden ook geen androgene effecten gemeten. Weiss et al. (2009) vonden in sedimentextracten van een zijrivier van de Schelde (dicht bij Antwerpen) geen androgene, maar wel een hoge anti-androgene activiteit. Na fractionatie van de stalen werd in bepaalde fracties wel androgene activiteit gemeten. Ook in een recente studie van Liscio et al. (2014) in het Verenigd Koninkrijk werden antagonistische, maar geen agonistische androgene activiteiten gemeten in rivierwater. Slechts één studie uit Nederland rapporteerde androgene (maar geen anti-androgene) effecten in afvalwater (waterzuivering, ziekenhuizen en industrie) en rivierwater [Van der Linden et al., 2008]. Gekende stoffen met androgene werking zijn natuurlijke en synthetische steroidhormonen (testosteron, nandrolone, levonorgestrel, enz.), UV-filters en perfluorverbindingen [Sonneveld et al., 2005; Freyberger et al., 2010]. Stoffen met een anti-androgene werking zijn o.a. PAK’s en hun metabolieten, pesticiden (waaronder DDE en DEET), muskusgeurstoffen en vlamvertragers [Liscio et al., 2014; Weiss et al., 2009; Weiss et al., 2011; Emeville et al., 2013].

4.9 TOXICOLOGISCH PROFIEL VAN ZELZATE

Van de luchtstalen die werden verzameld in Zelzate werd het vermogen om de overleving van luchtwegcellen te beschadigen om reactieve verbindingen te vormen (radicaal generend vermogen), om inflammatoire responsen te induceren, om schade aan DNA toe te brengen, de mate waarin deze stoffen het hormoon oestrogeen imiteren (oestrogene activiteit) en de aanwezigheid van endotoxines bepaald. De meetresultaten van Zelzate werden telkens vergeleken met een een achtergrondlocatie in Vlaanderen nl. Houtem. De giftigheid van het fijn stof voor de bronchiale cellen was niet verschillend van deze uit Houtem (p=0.114). Er zijn geen aanwijzingen dat de luchtstalen uit Zelzate een hoger vermogen hebben om ontstekingsreacties uit te lokken in luchtwegcellen in vergelijking met de achtergrondlocatie.

4 Toxicologisch profiel van de Gentse Kanaalzone

49

Inflammatoire potentie werd slechts vastgesteld in 3 van de 13 dagstalen uit Zelzate. De inflammatoire capaciteit lag significant lager in Zelzate dan in Houtem (p=0.003). Dit kan mogelijk deels verklaard worden door de aanwezigheid van endotoxines in de luchtstalen. Endotoxines kunnen ontstekingsreacties induceren. De gemiddelde endotoxineconcentratie is verhoogd in Houtem in vergelijking met Zelzate maar het verschil is niet significant (p=0.6). Het radicaalgenererend vermogen van de luchtstalen is hoger in Zelzate dan in Houtem (p=0.03). Stalen van zowel Zelzate als van de achtergrondlocatie blijken DNA te kunnen beschadigen. De directe mutagene activiteit was significant verhoogd in Zelzate t.o.v. Houtem (p=0.05). Er kon echter geen statistisch significant verschil aangetoond worden in oxidatieve en niet-oxidatieve DNA-breuken tussen partikels uit Zelzate en Houtem (p=0.46 (oxidatieve schade), p=0.07 (breuken)). Er kon geen statistisch significant verschil in estrogene activiteit aangetoond worden tussen Zelzate en Houtem. De resultaten van de ARE-test tonen aan dat er geen agonistische androgene effecten meetbaar zijn in de PM10-extracten, maar dat er mogelijk wel antagonistische androgene stoffen aanwezig zijn in de extracten. De resultaten worden samengevat in Figuur 31.

0,89

0,460,29

0,91

0,64

2,43

1,691,54

1,22

0,0

1,0

2,0

3,0

rati

o:

Zelz

ate

vs.

Ho

ute

m

p=0,11 p=0,003 p=0,24p=0,60 p=0,46 p=0,07 p=0,03 p=0,05 p=0,14

grijs: niet significant verschillend

rood: significant hoger in Zelzate

groen: significant lager in Zelzate Figuur 31: Overzicht van het toxicologisch profiel van Zelzate in vergelijking met Houtem.

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

50

5 EFFECTGERICHTE METINGEN EN LUCHTKWALITEIT

De afgelopen twintig jaar is een groot aantal epidemiologische studies verschenen over de associatie tussen kortdurende en langdurige blootstelling aan fijn stof (deeltjes) in de buitenlucht en luchtweg- en hart- en vaatziekten. Deze associaties zijn vooral aangetoond met de massa van deeltjes, zoals PM10 en PM2.5 concentraties, omdat PM10 en PM2.5 zijn vastgelegd in wet- en regelgeving in vele landen. In de laatste jaren is aangetoond door zowel epidemiologisch als toxicologisch onderzoek dat deeltjesmassa niet per se de causale factor is bij het ontstaan van gezondheidseffecten en daarom is steeds meer onderzoek gericht op het identificeren van de invloed van specifieke eigenschappen van luchtverontreiniging. Andere maten voor luchtkwaliteit waaraan aandacht wordt besteed, zijn ultrafijne deeltjes (PM0.1, deeltjes kleiner dan 100 nanometer), roet, chemische componenten zoals metalen en het oxidatief potentieel van fijn stof. Echter, op dit moment is het niet duidelijk welke specifieke eigenschappen (zoals bijvoorbeeld deeltjesgrootte, chemische samenstelling) of bronnen van de deeltjes verantwoordelijk zijn voor de waargenomen gezondheidseffecten. Effectgericht meten heeft als doel om meer informatie te geven over de ongezonde eigenschappen van de mengeling van stoffen die in de lucht voorkomt. Om te bepalen welke fysische en chemische determinanten een mogelijke verklaring kunnen zijn voor de waargenomen effecten worden de toxicologische resultaten vergeleken met enerzijds de fysische en chemische karakteristieken van de stofdeeltjes en anderzijds de meteorologische omstandigheden. Associaties tussen de biologische effectparameters en de fysicochemische/ meteorologische parameters werden getest via niet-parametrische Spearman rank-correlatie (significantieniveau van 0.05). Om de power van de analyse te verhogen werden de meetgegevens van zowel Borgerhout, Houtem en Zelzate samengevoegd om de correlatie uit te voeren. De helft

van de detectielimietwaarde werd gebruikt voor chemische metingen met een negatieve waarde. De gegevens van de fysicochemische metingen en meteorologische parameters worden hier niet besproken daar ze geen deel uitmaken van deze studie.

5.1 RELATIE EFFECTGERICHTE METINGEN EN FYSICOCHEMISCHE SAMENSTELLING

Gegevens over de fysische en chemische samenstelling van de omgevingslucht in de Gentse Kanaalzone, Borgerhout en de achtergrondlocatie werden ter beschikking gesteld door VMM om een verdere interpretatie van de bioassay resultaten toe te laten. Tabel 14 geeft een overzicht van de beschikbare data uit de VMM-meetnetten en de gegevens verzameld in kader van het JOAQUIN project voor de Gentse Kanaalzone, Borgerhout en de achtergrond locatie Houtem. Tabel 18 en Tabel 19 geven een overzicht van de berekende Spearman rank correlatiecoëfficiënten tussen de fysische en chemische determinanten en de biologische eindpunten. Significante correlaties zijn in rood aangeduid. Voor het jaar 2014 zijn er momenteel geen PAK-data beschikbaar. Vanaf 2014 gebeurt de bemonstering met Leckel, in plaats van Digitel in 2013 voor PAK-analyse. Door de omschakeling is de bemonstering een dag verschoven waardoor deze niet meer samenvalt met de bemonstering

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

51

van de filters in deze studie. De individuele PAK’s zijn onderling zeer sterk gecorreleerd (Spearman Rank r > 0.72). Daarom werden de correlaties met de biologische eindpunten alleen uitgevoerd met de som van de gemeten PAK’s. Een van de belangrijkste organische componenten van rookdeeltjes geproduceerd door verbranding van biomassa zijn de monosacharide anhydriden. Levoglucosan (1,6-anhydro-β-glucopyranose) is de meest voorkomende tracer en komt samen voor met lagere hoeveelheden van de isomeren mannosan (1,6-anhydro-β-D-mannopyranose) en galactose (1,6-anhydro-β-D-galactopyranose). De merkers voor houtverbranding zijn onderling sterk gecorreleerd (Pearson r > 0.95). Voor een goede interpretatie van de relaties tussen effectgerichte metingen en polluenten aanwezig in de PM10 fractie is het belangrijk om een onderscheid te maken tussen effectgerichte metingen uitgevoerd op organische extracten en deze op partikels. Bij de bepaling van de concentratie van de polluenten (vermeld in Tabel 14) op de verschillende meetposten worden namelijk geoptimaliseerde extractiemethoden gebruikt om het totale gehalte van een bepaalde polluent in de PM10 fractie te bepalen. Tijdens extractie voor effectgerichte metingen is dit niet steeds het geval. Hierbij gebruikt men namelijk een universele methode om zoveel mogelijk genotoxische, immuunverstorende of hormoonverstorende stoffen te extraheren. Aangezien voor de komeet-test en de ERE- en ARE-testen een organisch extract gebruikt wordt, verwachten we in deze stalen geen/weinig zware metalen meer. Om deze hypothese te testen werden 6 willekeurige glasvezelfilters (2 uit Zelzate, 1 uit Borgerhout en 3 uit Houtem) geëxtraheerd volgens de eerder beschreven ASE-methode en geanalyseerd met ICP-MS. In onderstaande tabellen worden respectievelijk de resultaten van de oorspronkelijke metingen (VMM, LV-sampler, kwartsvezelfilter, geoptimaliseerde methode) (Tabel 15) en deze van de extra meting van het ASE-extract (VUB, HV-sampler, glasvezelfilter, ASE-extractie met hexaan/aceton, 50/50 v/v%) (Tabel 16) voorgesteld. Uit tabellen 15 en 16 blijkt duidelijk dat ondanks het feit dat alle metalen (behalve nikkel) goed meetbaar zijn in de extracten, de gehalten zeer laag zijn. De recovery’s liggen tussen de 0.1 en 4%, met uitzondering van staal EZ2 waar recovery’s van 5 en 23% werden berekend voor respectievelijk koper en zink (Tabel 17). In het staal van Borgerhout (EB) werden additioneel ook nog de elementen ijzer, aluminium en vanadium gemeten (met recovery’s van 0.01, 3.53 en 0.03%). Op basis van deze resultaten kan er dus besloten worden dat het niet zinvol is om correlaties tussen metaalconcentraties in de lucht (PM10) en effectgerichte metingen op organische extracten (Ames II-test, ERE- en ARE-testen) te berekenen. Het kan echter wel niet uitgesloten worden dat zelfs deze lage concentraties aan verschillende metalen in het ASE-extract een invloed kunnen hebben op de effectgerichte meting zelf.

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

52

Tabel 14: Overzicht van fysicochemische gegevens en de lokale meetposten.

Polluenten Meetposten Regio Gentse Kanaalzone

Meetposten Achtergrond gebied

Meetposten Borgerhout

Zware metalen (ng/m3) in PM10 (Pb, Zn, Cu, Ni, As, Mn, Cd, Cr)

00R750 Zelzate 00KK02 Koksijde 00KK01

90R801 Borgerhout

PAK’s (ng/m3) in TSP 1.fluorantheen 2.pyreen 3.benzo(a)anthraceen* 4.chryseen* 5.benzo(b)fluorantheen* 6.benzo(k)fluorantheen* 7.benzo(a)pyreen* 8.dibenzo(a,h)anthraceen* 9.indeno(1,2,3-cd)pyreen*

60R750 Zelzate 60N029 Houtem

60R802 Borgerhout straatkant

PM10( µg/m3) 44R750 Zelzate 44N029 Houtem 90R801 Borgerhout

PM2.5 (µg/m3) 44N029 Houtem 90R801 Borgerhout

Black carbon (µg/m3) in TSP 24R750 Zelzate 44N029 Houtem 42R801 Borgerhout

Ionen (µg/m³) in PM10 (NO3

-, Cl-, SO4-, NH4

+, K+, Mg2+, Ca2+ )

90R801 Borgerhout

Elementen (µg/m³) in PM10 (Sb, Al, Ba, Fe, K, Mo, Ti, V en Ca)

90R801 Borgerhout

Elementaire koolstof (EC), organische koolstof (OC), totale koolstof (TC) (µg/m³) in PM10

90R801 Borgerhout

Houtverbranding (ng/m³) Levoglucosan, galactosan,mannosan in PM10

90R801 Borgerhout

*carcinogene PAK’s

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

53

Tabel 15: Concentraties aan zware metalen in PM10 bepaald met geoptimaliseerde methode.

Metalen in PM10 (ng/m³) meting VMM

staal Pb Zn Cu Ni As Mn Cd Cr

EZ 1 15.3 60.5 13.5 4.6 0.0 20.5 0.5 4.8

EZ 2 28.8 48.2 9.7 2.4 0.3 4.9 0.1 3.0

EH 1 9.5 32.7 6.9 16.7 1.0 12.7 0.2 4.0

EH 2 14.0 388.8 5.7 19.2 1.3 46.7 0.6 7.4

EH 3 28.6 46.6 7.2 1.4 1.1 5.2 0.4 1.2

EB 16.9 60.2 18.7 4.1 0.8 7.1 0.6 9.8

Z= Zelzate, B= Borgerhout, H= Houtem. In rood: onder de detectielimiet Tabel 16: Concentratie metalen in PM10 na ASE extractie met hexaan/aceton 50/50 v/v%.

metalen in PM10 extract (ng/m³) VUB ASE extractie met organisch solvent

staal Pb Zn Cu Ni As Mn Cd Cr

EZ 1 0.200 0.938 0.485 0.003 0.058 0.012 0.006 0.008

EZ 2 0.006 11.006 0.454 0.000 0.144 0.001 0.008 0.007

EH 1 0.005 0.332 0.020 0.003 0.020 0.001 0.001 0.003

EH 2 0.001 0.185 0.017 0.002 0.019 0.002 0.001 0.022

EH 3 0.002 0.246 0.016 0.006 0.011 0.004 0.001 0.031

EB 0.002 0.252 0.062 0.005 0.014 0.002 0.001 0.002

veld blanco filter 0.001 0.092 0.000 0.006 0.000 0.001 0.000 0.002

Z= Zelzate, B= Borgerhout, H= Houtem. Rood: blanco waarde Tabel 17: Recovery’s van de metalen in het ASE-extract.

% recovery

staal Pb Zn Cu Ni* As Mn Cd Cr

EZ 1 1.31 1.55 3.59 0* 0.06 1.22 0.16

EZ 2 0.02 22.83 4.68 0* 47.98 0.01 8.03 0.25

EH 1 0.06 1.02 0.30 0* 1.99 0.01 0.54 0.07

EH 2 0* 0.05 0.29 0* 1.50 0.00 0.09 0.29

EH 3 0.01 0.53 0.22 0* 0.96 0.07 0.14 2.59

EB 0.01 0.42 0.33 0* 1.83 0.02 0.10 0* Z= Zelzate, B= Borgerhout, H= Houtem * lager dan de veldblanco van het ASE-extract. Grijs gearceerd: onder de detectielimiet via geoptimaliseerde methode en dus geen betrouwbare recovery berekening mogelijk

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

54

Cytotoxiciteit Het vermogen van de luchtstalen om de overleving van luchtwegcellen te beschadigen (cytotoxiciteit) werd gecorreleerd met de verschillende chemische parameters. De blootstellingsexperimenten hebben aangetoond dat er een concentratie-afhankelijk afname is van de celviabiliteit (zie 3.1 en 4.1) d.w.z. dat het aantal levende cellen daalt met een stijgende PM10 concentratie. Er werd nagegaan of de celschade gemeten bij blootstelling aan 100 µg PM10 mede kan verklaard worden door de chemische samenstelling van de partikels. De overleving van de luchtwegcellen daalt met stijgende concentraties van black carbon (r=-0.27, p=0.005) en elementaire koolstof (r=-0.26, p=0.045) in de luchtstalen. Een daling van het aantal levende cellen werd ook vastgesteld bij hogere concentraties van de ionen Cl- (r=-0.32, p=0.01), Na+ (r=-0.26, p=0.04) en K+ (r=-0.37, p=0.003) en de metalen cadmium (r=-0.27, p=0.005), lood (r=-0.20, p=0.04), en antimoon (r=-0.24, p=0.02). Ionen behoren tot de anorganische fractie van het fijn stof naast metalen en elementaire koolstof (EC). De resultaten tonen aan dat de aanwezigheid van de producten van houtverbranding in de omgevingslucht (levoglucosan (r=-0.42, p=0.001), galactosan (r=-0.46, p<0.001) en mannosan (r=-0.35, p=0.006)) schadelijk zijn voor de luchtwegcellen. Vanadium (r=0.1, p=0.013) en SO4

2- (r=0.47, p<0.0001) hebben een positief effect op de leefbaarheid van de Beas-2B cellen. Inflammatie (Il-8 inductie) Eerder werd een verband tussen stijgende PM10 concentratie en een toename van de productie van il-8 aangetoond (zie 3.4). Er werd nagegaan of de gemeten inflammatoire respons kan verklaard worden door de chemische samenstelling van de partikels. De inductie van il-8 na blootstelling van de cellen aan 100 µg PM10 /ml in vergelijking met niet-blootgestelde cellen werd gebruikt in de statistische analyses. De statistische analyses werden ook uitgevoerd op de il-8 inductie na blootstelling aan 50 µg PM10/ml. Bij deze concentratie is de gemiddelde leefbaarheid van de cellen hoger (88% in vergelijking met 76%). Dezelfde trends werden teruggevonden tussen chemische samenstelling en cytokineproductie bij de verschillende blootstellingconcentraties PM10. De gemeten immuunreactie in bronchiale Beas-2B cellen is gecorreleerd met de concentratie van verschillende zware metalen in de omgevingslucht. De Spearman rank correlaties tonen aan dat er een significante correlatie is tussen de productie van het inflammatoire cytokine il-8 en de metalen Cu (r=0.25, p=0.011), Mn (r=0.22, p=0.027) en Zn (r=0.4, p<0.001). De aanwezigheid van Cl- ionen en producten van houtverbranding in de omgevingslucht vertonen een negatieve correlatie met de il-8 inductie in Beas-2B. De cytokine-inductie door PM10 in Beas-2B kon niet gecorreleerd worden met de aanwezigheid van black carbon en het radicaalgenererend vermogen van de partikels. Blootstelling van bronchiale epitheelcellen aan particulair materiaal induceert de productie van (pro)-inflammatoire cytokines. In de wetenschappelijke literatuur worden een aantal relaties aangetoond. Een specifieke rol van overgangsmetalen aanwezig op PM bij de inductie van de pro-

inflammatoire cytokines il-6, il-8 en TNF- (tumornecrosefactor-alfa) via de inductie van oxidatieve stress wordt gesuggereerd [Donaldson and MacNee William, 2001]. In een Japanse studie werden correlaties gevonden tussen il-8 productie in Beas-2B met Cr en Mn [Huang et al., 2003]. In primaire humane bronchiale epitheelcellen (NHBE) was de il-6 en il-8 productie significant gecorreleerd met de groep elementen Cr/Al/Si/Ti/Fe/Cu [Becker et al., 2005]. Fe en Si vertoonden een positieve correlatie met il-6 en Cr was gecorreleerd met il-8 productie. De speciale rol van de

metaalcomponenten op PM10 bij de inductie van il-6, il-8 en TNF- werd ook aangetoond in humane bronchiale epitheelcellen door het toevoegen van een metaalchelator [Carter et al., 1997]. Ook in de epitheliale longcellijn (A549) en macrofaag cellijnen werd de inductie van inflammatoire

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

55

cytokines geassocieerd met de aanwezigheid van metalen in het fijn stof [Healy et al., 2012; Steenhof et al., 2011]. Niet alle studies vinden een correlatie tussen de inductie van inflammatoire cytokines en overgangsmetalen [Rodriguez-Cotto et al., 2014]. Een negatieve associatie tussen de tracers voor de verbranding van biomassa (monosaccharide anhydriden) en de inductie van pro-inflammatoire cytokines in muis RAW 246.7 macrofagen werd eerder aangetoond [Jalava et al., 2009]. In tegenstelling tot andere studies kon in de huidige studie geen significante associatie aangetoond worden tussen het oxidatief potentieel van fijn stof en de inductie van inflammatoire cytokines [Van Den Heuvel et al., 2011; Cachon et al., 2014]. DNA-breuken (Komeettest) Er werden geen verbanden gevonden tussen niet-oxidatieve DNA-breuken en de chemische componenten BC, OC, EC, ionen, metalen en producten van houtverbranding. DNA-breuken door oxidatieve schade verhoogt bij stijgende concentraties van cadmium (r=0.26, p=0.03) in PM10. Dit verband kan mogelijks verklaard worden door het vermogen van cadmium om oxidatieve stress te induceren. Meerdere studies hebben aangetoond dat cadmium blootstelling oxidatieve stress induceert op cellulair niveau en wijzen op de centrale rol van oxidatieve stress als een onderliggend mechanisme in Cd-geïnduceerde pathologieën [Nair et al., 2013]. In deze studie is de cadmium concentratie in de omgevingslucht significant gecorreleerd met het oxidatief potentieel van PM10 (r=0.26, p=0.03)(zie 5.1). Mutageniciteit (Ames II-test) Bij blootstelling aan een dagequivalent van 20 m³ lucht-equivalent kan de gemeten biologische respons afhankelijk zijn van zowel de hoeveelheid particulair materiaal per m³ lucht als van de aard van de chemische belading van de partikels. De hoeveelheid zwevend stof is belangrijk voor de intensiteit van de mutagene respons die wordt opgewekt. Een significante positieve correlatie kon aangetoond worden tussen de directe en indirecte mutageniciteit en de concentratie PM10/m³ (-S9: r=0.5, p<0.001; +S9: r=0.5, p<0.001)) (Figuur 32) en PM2.5/m3 in de lucht (-S9: r=0.5, p<0.001; +S9: r=0.5, p<0.001).

-10 0 10 20 30 40 50

Ames -S9 (revertanten/m3 luchteq)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

PM

10 (

µg

/m3)

0,95 Conf.Int.

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Ames +S9 (revertanten/m3 lucht eq)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

PM

10 (

µg/m

3)

0,95 Conf.Int. Figuur 32: Correlatie tussen directe en indirecte mutagene potentie en PM10 concentratie in de omgevingslucht (-S9: directe mutageniciteit, r=0.47, n=100, p<0.001; +S9: indirecte mutageniciteit, r=0.49, n=100, p<0.001).

Niet enkel de hoeveelheid fijn stof is de bepalende factor voor het opwekken van de mutagene respons, ook de chemische samenstelling van de partikels is belangrijk.

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

56

De gemeten mutagene activiteit (direct en indirect) van de filterextracten kon gerelateerd worden aan het totale PAK-gehalte (-S9:r=0.5, p<0.001; +S9:r=0.5, p<0.001) en aan de som van zowel de carcinogene PAK’s (-S9:r=0.6, p<0.001; +S9:r=0.6, p<0.001) als de niet-carcinogene PAK’s (-S9:r=0.4, p=0.005); +S9:r=0.4, p=0.003). Er werd ook een verband aangetoond tussen de directe en indirecte mutageniciteit en het radicaalgenererend vermogen van PM10 (-S9:r=0.5, p<0.001; +S9:r=0.5, p<0.001), de hoeveelheid black carbon (roetdeeltjes) (-S9:r=0.7, p<0.001; +S9:r=0.7, p<0.001), organische (-S9:r=0.6, p<0.001; +S9:r=0.5, p<0.001) en elementaire (-S9:r=0.6, p<0.001; +S9:r=0.7, p<0.001) koolstof en de merkers voor houtverbranding in de omgevingslucht (-S9:r=0.8, p<0.001;

+S9:r=0.8, p<0.001). Oestrogene activiteit (ERE-test) Er kon een verband aangetoond worden tussen de gemeten oestrogene activiteit in de extracten en de PM10 massa (r=0.27, p=0.035) (Figuur 33), black carbon (r=0.27, p=0.024) en de som van de niet-carcinogene PAK’s (r=0.28, p=0.044).

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18

ERE (fg E2 eq/m³)

0

10

20

30

40

50

60

70

PM

10 (

µg/m

3)

0,95 Conf.Int. Figuur 33: Correlatie tussen oestrogene activiteit en PM10 concentratie in de omgevingslucht (n=60, r=0.27 ,p=0.035).

Onderzoek naar correlaties tussen oestrogene activiteiten en polluenten zijn eerder schaars. In twee studies werden positieve associaties vonden tussen de gehalten aan hydroxy-PAK’s en bisfenol A in fijn stof en oestrogene activiteit. Deze polluenten verklaarden echter maar een klein deel van de gemeten activiteit (Matsumoto et al., 2005; Wenger et al., 2009). Oxidatieve potentie (ROS-test) Er werd nagegaan of de oxidatieve potentie van de fijn stof deeltjes, de intrinsieke capaciteit van deeltjes om vrije radicalen te produceren en hierdoor antioxidanten, lipiden of andere moleculen te oxideren, wordt beïnvloed door de chemische samenstelling van PM10. Er werd een verband aangetoond tussen het radicaalgenererend vermogen van de fijn stof stalen op teflonfilters en verschillende metalen in de omgevingslucht: lood (r=0.7, p<0.001); zink (r=0.7, p<0.001); koper (r=0.8, p<0.001); arseen (r=0.4, p=0.001); mangaan (r=0.5, p<0.001); cadmium (r=0.5, p<0.001); chroom (r=0.8, p<0.001); ijzer (r=0.5, p=0.016); molybdeen (r=0.6, p=0.004); aluminium (r=0.7, p=0.036) en barium (r=0.5, p=0.014) (Tabel 20). Het radicaalgenererend vermogen neemt ook toe bij stijgende concentraties van PM10 (r=0.37, p=0.012), PM2.5 (r=0.35, p=0.015), elementaire koolstof (r=0.53, p=0.021) en black carbon (r=0.8, p<0.001) in de omgevingslucht. Figuur 34 toont de correlatie voor black carbon, chroom, cadmium en lood met het oxidatief potentieel van PM10. Alhoewel de methode voor het meten van de oxidatieve potentie verschillend was, bevestigen deze resultaten de bevindingen uit de campagne effectgericht meten in Genk Zuid [Van Den Heuvel

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

57

et al., 2011; Verma et al., 2010]. De sterke correlaties tussen radicaalgenererend vermogen en metaalconcentraties in de omgevingslucht werden ook beschreven in andere studies [Kunzli et al., 2006; Shi et al., 2003; Boogaard et al., 2012; Nawrot et al., 2009; Godri et al., 2010; Janssen et al., 2014; Verma et al., 2010; Price et al., 2014]. Tabel 18: Associatie tussen de biologische effectparameters getest op partikelfractie en de fysicochemische karakteristieken van PM10 (Spearman rank correlatie coëfficiënt (r), p-waarde en aantal gegevens(N)). P-waarden < 0.5 zijn in rood aangeduid.

Cytotoxiciteit il-8 inductie Komeet Komeet ox schade

N r p-value N r

p-value

N r p-

value N r

p-value

BC 104 -0.274 0.005 101 0.036 0.720 71 0.129 0.282 71 -0.056 0.640

OC 61 -0.167 0.198 58 0.107 0.424 40 -0.063 0.699 40 0.107 0.512

EC 61 -0.258 0.045 58 -0.261 0.048 40 0.197 0.223 40 -0.054 0.742

TC 61 -0.211 0.102 58 -0.011 0.932 40 0.048 0.769 40 0.037 0.819

NO3- 61 0.142 0.274 58 -0.079 0.555 40 -0.106 0.514 40 -0.021 0.899

Cl- 61 -0.322 0.011 58 -0.346 0.008 40 0.072 0.659 40 0.028 0.865

SO42- 61 0.471 0.000 58 0.466 0.000 40 -0.225 0.163 40 0.048 0.769

Na+ 61 -0.260 0.043 58 -0.176 0.187 40 0.054 0.741 40 0.074 0.649

NH4+ 61 0,180 0,164 58 -0,029 0,831 40 0,045 0,782 40 -0,090 0,580

K+ 61 -0.369 0.003 58 -0.200 0.131 40 0.042 0.797 40 0.240 0.136

Mg2+ 61 -0.189 0.146 58 -0.074 0.580 40 0.056 0.729 40 0.009 0.957

Ca2+ 61 0.062 0.635 58 0.321 0.014 40 0.103 0.527 40 -0.059 0.717

Al 29 -0.134 0.487 29 0.062 0.751 15 0.411 0.128 15 0.007 0.980

As 105 -0.061 0.533 102 0.047 0.639 72 0.184 0.122 72 -0.082 0.496

Ba 61 -0.171 0.186 58 -0.078 0.562 40 0.204 0.207 40 0.000 1.000

Ca 29 -0.028 0.887 29 0.077 0.692 15 -0.014 0.960 15 0.036 0.899

Cd 102 -0.274 0.005 99 -0.159 0.117 71 -0.134 0.266 71 0.258 0.030

Cr 103 -0.051 0.611 100 0.155 0.123 70 0.217 0.071 70 -0.212 0.078

Cu 103 -0.080 0.420 100 0.254 0.011 70 0.116 0.340 70 -0.125 0.303

Fe 61 -0.151 0.244 58 0.015 0.913 40 0.173 0.286 40 -0.033 0.839

K 61 0.131 0.313 58 0.013 0.926 40 -0.055 0.734 40 0.061 0.709

Mn 105 -0.094 0.340 102 0.219 0.027 72 -0.038 0.751 72 -0.115 0.336

Mo 61 0.003 0.980 58 -0.067 0.619 40 0.003 0.983 40 -0.032 0.844

Ni 105 0.017 0.866 102 0.012 0.905 72 0.076 0.527 72 -0.276 0.019

Pb 105 -0.198 0.043 102 0.031 0.755 72 0.019 0.875 72 -0.012 0.918

Sb 92 -0.241 0.021 89 -0.232 0.029 60 0.087 0.510 60 0.013 0.924

Ti 29 -0.241 0.208 29 0.087 0.655 15 0.196 0.483 15 0.339 0.216

V 61 0.315 0.013 58 0.229 0.083 40 -0.041 0.803 40 -0.261 0.103

Zn 73 0.167 0.158 73 0.398 0.000 47 -0.111 0.456 47 -0.174 0.243

Galactosan 61 -0.462 0.000 58 -0.653 0.000 40 0.098 0.549 40 0.148 0.363

Mannosan 61 -0.346 0.006 58 -0.624 0.000 40 0.089 0.586 40 0.096 0.554

Levoglucosan 61 -0.422 0.001 58 -0.669 0.000 40 0.033 0.841 40 0.171 0.292

ROS (kwarts) 61 -0.207 0.109 58 -0.186 0.163 40 0.015 0.925 40 0.121 0.458

ROS (teflon) 58 -0.189 0.155 57 0.112 0.405 40 0.005 0.976 40 0.081 0.617

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

58

Tabel 19: Associatie tussen de biologische effectparameters getest op organisch extract en de fysicochemische karakteristieken van PM10 (Spearman rank correlatie coëfficiënt (r), p-waarden en aantal gegevens(N)). P-waarden < 0.5 zijn in rood aangeduid.

Ames +S9 Ames –S9 ERE

N r p-value N r p-value N r p-value

PM10 99 0,490 0,000 99 0,471 0,000 60 0.273 0.035

PM2.5 88 0,509 0,000 88 0,532 0,000 33 0.177 0.326

BC 102 0,654 0,000 102 0,679 0,000 70 0.270 0.024

OC 58 0,524 0,000 58 0,574 0,000

EC 58 0,666 0,000 58 0,648 0,000

TC 58 0,613 0,000 58 0,654 0,000

Galactosan 61 0,809 0,000 61 0,777 0,000

Mannosan 61 0,751 0,000 61 0,721 0,000

Levoglucosan 61 0,797 0,000 61 0,758 0,000

Som PAK’S 57 0,501 0,000 57 0,529 0,000 51 0.233 0.100

Som carc PAK’S* 57 0,604 0,000 57 0,629 0,000 51 0.209 0.141

Som nt-carc PAK’S**

57 0,389 0,003 57 0,368 0,005 51 0.283 0.044

ROS (kwarts) 61 0,511 0,000 61 0,514 0,000

ROS (teflon) 50 0,449 0,001 50 0,504 0,000

*som carcinogene PAK’s; **som niet-carcinogene PAK’s Tabel 20: Associatie tussen het radicaalgenererend vermogen en de fysicochemische karakteristieken van PM10 (Spearman rank correlatie coëfficiënt (r), p-waarden en aantal gegevens(N)). P-waarden < 0.5 zijn in rood aangeduid.

Ros (teflon)

N Spearman r p-value

PM10 47 0.365 0.012

PM2.5 47 0.354 0.015

BC 62 0.795 0.000

OC 19 0.370 0.119

EC 19 0.525 0.021

TC 19 0.404 0.087

Galactosan 22 0.249 0.264

Mannosan 22 0.412 0.057

Levoglucosan 22 0.319 0.148

Som PAK’S 25 0.336 0.100

Som carc PAK’S 25 0.349 0.087

Som nt-carc PAK’S 25 0.348 0.089

NO3- 20 0.371 0.107

Cl- 20 -0.158 0.506

SO42-

20 0.036 0.880

Na+ 20 -0.247 0.295

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

59

NH4+ 20 0.454 0.044

K+ 20 -0.090 0.705

Mg2+

20 -0.253 0.283

Ca2+

20 0.044 0.855

Al 9 0.700 0.036

As 61 0.403 0.001

Ba 20 0.538 0.014

Ca 9 0.383 0.308

Cd 61 0.489 0.000

Cr 61 0.765 0.000

Cu 61 0.813 0.000

Fe 20 0.532 0.016

K 20 0.029 0.905

Mn 61 0.477 0.000

Mo 20 0.608 0.004

Ni 61 0.209 0.105

Pb 61 0.692 0.000

Sb 48 0.102 0.490

Ti 9 0.233 0.546

V 20 0.131 0.582

Zn 50 0.670 0.000

0

1

2

3

4

5

6

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

BC

(µ

g/m

3)

Radicaalgenererend vermogen (AU/m3)

R2=0,632

0

5

10

15

20

25

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

Cr

(ng/

m3

)

Radicaalgenererend vermogen (AU/m3)

R2=0,585R2=0,R2=0,

0

1

1

2

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

Cd

(n

g/m

3)

Radicaalgenererend vermogen (AU/m3)

R2=0,R2=0,R2=0,239

0

20

40

60

80

100

120

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

Pb

(n

g/m

3)

Radicaalgenererend vermogen (AU/m3)

R2=0,R2=0,R2=0,479

Figuur 34: Radicaalgenererend vermogen in relatie tot concentraties van black carbon (n=62, r=0.795, p<0.001), chroom (n=61, r=0.765, p<0.001), cadmium (n=61,r=0.489, p<0.001) en lood (n=61, r=0.692, p<0.001) in de omgevingslucht. (blauw=Borgerhout; groen=Houtem; rood=Zelzate).

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

60

5.2 RELATIE EFFECTGERICHTE METINGEN EN METEOROLOGISCHE METINGEN

Resultaten van vroegere studies geven aanwijzingen dat de weersomstandigheden een belangrijke rol spelen bij de inductie van immunologische en genotoxische effecten [Cerna et al., 1999; Schoeters et al., 2001; Ducatti and Vargas Vera Maria Ferrao, 2003; Zhao et al., 2002; Binkova et al., 2003; Salonen et al., 2004]. Seizoensvariaties werden meermaals aangetoond. De meteorologische parameters zijn waarschijnlijk geen causale factor voor de gezondheidseffecten. De weersomstandigheden kunnen echter wel de samenstelling van het fijn stof beïnvloeden, bv. door een verhoogde temperatuur kan meer verdamping van semi-vluchtige stoffen optreden. Een recente Belgische studie toonde ook aan dat de PM concentraties in de lucht negatief gecorreleerd zijn met temperatuur en windsnelheid [Buczyńska et al., 2014]. Analoog aan de analyses met de fysicochemische gegevens van de luchtstalen werd het effect van klimatologische parameters (temperatuur, neerslag, windsnelheid) op de testresultaten onderzocht. De meteogegevens van de KMI-meteopost Zelzate (6431) werden opgevraagd en de gegevens van de VMM-meteopost Houtem (T4N029) en Antwerpen-Luchtbal (42M802) werden door VMM aangeleverd. Detail gegevens van de meteoposten: KMI meetpost Zelzate (6431): Lambert-coördinaten: X=110964, Y=210805 Meethoogte 4 m: temperatuur, windsnelheid, windrichting, neerslag VMM-meteopost Houtem (T4N029): Lambert-coördinaten: X=24655, Y=191071 Meethoogte 3 m: neerslag, temperatuur Meethoogte 30 m: windrichting, windsnelheid VMM-meteopost Antwerpen-Luchtbal (42M802): Lambert-coördinaten: X=153884, Y=216790 Meethoogte 3 m: neerslag, temperatuur Meethoogte 30 m: windrichting, windsnelheid Merk op dat de windsnelheid op de KMI-meteopost in Zelzate op een lagere hoogte (4 m) wordt gemeten dan op de VMM-meteoposten in Houtem en Antwerpen-Luchtbal. Associatie tussen de biologische effectparameters en de meteorologische parameters werden getest via Spearman rank correlatie. De resultaten worden weergegeven in Tabel 21. Temperatuur Er werd een verband aangetoond tussen de omgevingstemperatuur en de capaciteit van PM10 om il-8 te induceren in de longcellen (r=0.55, p<0.001). Ook de endotoxine gehaltes in PM10 nemen toe bij stijgende temperatuur (r=0.50, p<0.001). Deze resultaten bevestigen de verhoogde cytokine- inductie na blootstelling aan PM10 verzameld in de lente en zomer. Zowel de directe (r=-0.36, p<0.001) als indirecte (r=-0.38, p<0.001) mutagene capaciteit van de PM10-extracten verhogen als de omgevingstemperatuur daalt. Deze resultaten bevestigen het verhoogde mutageen karakter tijdens de wintermaanden. De uitstoot bij verwarming van huizen en gebouwen wordt in verband gebracht met de verhoogde PAK-concentraties in de omgevingslucht tijdens de koudere maanden, wat mogelijks ook een verklaring is voor de waargenomen verhoogde mutageniciteit tijdens de winterperiode. Oxidatieve DNA-schade in de komeettest (r=-0.3, p=0.007) en de oestrogene activiteit in de extracten (r=-0.25, p=0.04) zijn hoger bij lagere omgevingstemperaturen . Niet alleen kan er bij lage wintertemperaturen meer uitstoot zijn van b.v. PAK’s, onderzoek toonde ook dat er in de winter meer (oestrogene) polluenten aan de partikels gebonden zijn t.o.v. de

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

61

concentratie in de gasfase (Vecchi et al., 2004). Dit is dus in overeenstemming met de hogere estrogene activiteit in PM10 bij lagere temperatuur in deze studie. Er werd voor temperatuur geen statistische significant verband gevonden met het radicaal generend vermogen. Een significante positieve correlatie kon aangetoond worden tussen enerzijds het cytotoxische effect (% levende cellen) van de partikels in de Beas-2B en de temperatuur (r=0.3, p=0.002). D.w.z. dat bij hogere temperaturen het schadelijke effect van de partikels lager is. Neerslag Er werd geen significant verband gevonden tussen de hoeveelheid neerslag en de oxidatieve potentie, de inflammatoire activiteit, de directe en indirecte mutageniciteit en de hormoonverstorende capaciteit van het fijn stof. Windsnelheid De resultaten toonden aan dat bij sterke wind (hoge windsnelheid) er een afname is van zowel de directe (r=-0.46, p<0.001) als de indirecte (r=-0.44, p<0.001) mutagene capaciteit en van het radicaalgenererend vermogen (r=-0.5, p<0.0001) van het fijn stof. Deze verbanden moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. In Houtem en Borgerhout is de windsnelheid op dezelfde hoogte gemeten, maar veel hoger dan de hoogte waarop fijn stof werd verzameld. De windsnelheid is significant hoger in Houtem dan in Borgerhout (t-test, p<0,05). Door het logaritmisch windprofiel (stijging met hoogte) is de hogere windsnelheid in Houtem dan in Borgerhout wellicht meer uitgesproken op 30 m dan op de hoogte van de fijnstofmetingen. Bovendien is de windsnelheid negatief gecorreleerd met PM10 massa en metalen- en PAK’s concentraties in PM10. De mogelijk invloed van de windsnelheid op de toxiciteit van omgevingslucht is waarschijnlijk een onrechtstreeks effect. In Figuur 35 wordt de relatie tussen de windsnelheid en mutagene activiteit en oxidatieve potentie grafisch voorgesteld. Tabel 21: Spearman rank correlatie tussen biologische eindpunten en meteorologische parameters. P-waarden < 0.5 in rood aangeduid.

windsnelheid (m/s)

temperatuur (°C)

neerslag (mm)

Cytotoxiciteit

N 107 106 108

r -0.039 0.295 -0.128

p-value 0.689 0.002 0.186

il-8 inductie

N 104 103 105

r -0.010 0.551 -0.131

p-value 0.918 <0.001 0.181

Komeettest

N 72 71 73

r 0.079 0.147 -0.199

p-value 0.510 0.222 0.091

Komeet ox schade

N 72 71 73

r 0.064 -0.316 0.097

p-value 0.595 0.007 0.415

Ames II (+S9) N 102 101 103

r -0.436 -0.377 -0.120

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

62

p-value <0.001 <0.001 0.227

AmesII (–S9)

N 102 101 103

r -0.461 -0.361 -0.158

p-value <0.001 <0.001 0.111

ERE-test

N 70 70 70

r 0.053 -0.248 -0.051

p-value 0.663 0.038 0.672

ROS-test*

N 62 61 63

r -0.501 0.164 -0.132

p-value <0.001 0.207 0.303

Endotoxine

N 107 106 108

r 0.021 0.502 -0.050

p-value 0.828 <0.001 0.607

*oxidatieve potentie gemeten op teflonfilters

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50

Win

dsn

elh

eid

(m

/s)

Revertanten/20m3 luchteq. (+S9)

R2=0,182

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50 60

Win

dsn

elh

eid

(m

/s)

Revertanten/20m3 luchteq. (-S9)

R2=0,198

0

2

4

6

8

10

12

14

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

Win

dsn

elh

eid

(m

/s)

Radicaalgenererend vermogen

R2=0,25

Figuur 35: Mutagene activiteit directe (-S9: r=-0.45, p<0.001; +S9: r=-0.42, p<0.001) en radicaalgenererend vermogen (r=-0.5, p<0.0001) in relatie tot de windsnelheid (blauw=Borgerhout; groen=Houtem; rood=Zelzate).

5.3 MEERVOUDIGE REGRESSIE ANALYSE

5.3.1 STATISTISCH ANALYSE

Meervoudige regressiemodellen laten toe om relaties tussen variabelen te onderzoeken na correctie voor meerdere verklarende parameters. Voor de continue biologische eindpunten werd gebruik gemaakt van lineaire regressiemodellen. De variabelen die mee werden opgenomen in de modellen zijn deze vermeld in Tabel 18, Tabel 19 en Tabel 20 afhankelijk van het biologisch eindpunt. De merkers voor houtverbranding zijn onderling sterk gecorreleerd (Pearson r > 0.95), daarom werd alleen levoglucosan meegenomen in de analyses. De verklarende parameters werden in enkelvoudige regressiemodellen getest. Alle parameters significant op het 20 procent

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

63

significantieniveau werden meegenomen in het meervoudig regressiemodel. Voor mutagene en oestrogene activiteit werd PM10 geselecteerd als confounder. Deze confounder werd in het meervoudige regressiemodel geforceerd, onafhankelijk van het significantieniveau. Voor de overige biologische eindpunten, uitgedrukt als effect per 100 µg PM10, werd PM massa niet meegenomen en werden bijgevolg geen confounders geselecteerd. Door middel van een stapsgewijze selectieprocedure werd dan voor elke eindpunt een meervoudig regressiemodel opgebouwd waarbij enkel de confounder en de significante verklarende parameters (p<0.05) in het model blijven. In tweede instantie werd onderzocht of er geen effectmodificatie optreedt ten gevolge van temperatuur en/of windsnelheid. Dit werd bekeken door middel van de interactie tussen temperatuur en/of windsnelheid en door de verklarende parameters mee te nemen in het finale meervoudige regressiemodel uit stap 1.

5.3.2 RESULTATEN

In de meervoudige modellen varieerde de proportie verklaarde variantie voor de verschillende biologische eindpunten tussen 7% en 74% (Tabel 22 en Tabel 23). Er kon een significante positieve associatie worden aangetoond tussen de directe (-S9) en indirecte mutagene (+S9) activiteit met levoglucosan in de omgevingslucht (respectievelijk p=0.0003 en p<0.0001) (Tabel 22). De mutageniciteit van de stalen bleek tevens PM10 afhankelijk (respectievelijk p=0.06 en p=0.009). PM10-massa verklaarde respectievelijk 20% en 30% van de variantie in de directe en indirecte mutagene potentie terwijl levoglucosan verantwoordelijk was voor respectievelijk 16% en 28% van de totale variantie in het aantal gemeten revertanten in de af- en aanwezigheid van S9. De aanwezigheid van niet-carcinogene PAK’s verklaarde 16% van de variantie in de oestrogene activiteit van de stalen (p=0.006) (Tabel 22). Tabel 22: Verklarende variabelen voor mutagene en oestrogene activiteit.

Variabele N* Estimate** 95% CI R2 p Totale R2

AMES (-S9) 61 0.36 PM10 1.16 0.99-1.35 0.20 0.0625 Levoglucosan 1.31 1.14-1.51 0.16 0.0003

AMES (+S9) 61 0.58 PM10 1.28 1.07-1.54 0.30 0.0094 Levoglucosan 1.68 1.42-1.99 0.28 < 0.0001

ARE-test 43 0.24 PM10 1.08 0.75-1.55 0.08 0.685 Som niet-carc PAK’s 1.37 1.10-1.71 0.16 0.0061

* N is het aantal dagen. **

Effect op mutagene en oestrogene activiteit berekend voor een stijging van PM10 met een IQR (inter-

kwartiel range) van 14.19 µg/m3, een stijging van levoglucosan met een IQR van 74.4 ng/m

3, een stijging van

niet-carcinogene PAK’s met een IQR van 0.791 ng/m3.

Het schadelijk karakter van levoglucosan op de leefbaarheid van de bronchiale epitheelcellen werd bevestigd in het meervoudig model (p<0.0001) (Tabel 23). Bij een toename van levoglucosan in de omgevingslucht daalt de leefbaarheid van de cellen. Levoglucosan verklaarde 29% van de variantie in cytotoxiciteit van luchtstalen.

5 Effectgerichte metingen en luchtkwaliteit

64

De aanwezigheid van Cl- ionen (p=0.02) en levoglucosan (p<0.0001) in de omgevingslucht vertoonden een negatieve correlatie met de il-8 inductie in Beas-2B. Alhoewel er een significant positieve associatie werd gevonden tussen K+ concentratie en het inflammatoir karakter van de stalen (p=0.024), kon deze variabele slechts 0.4% van de totale variantie in il-8 inductie verklaren. Voor de komeettest (niet-oxidatieve DNA-breuken) werd geen significant model gevonden. De positieve associatie tussen DNA-breuken als gevolg van oxidatieve schade en de Cd concentratie in de omgevingslucht werd bevestigd in het meervoudig model (p=0.023) (Tabel 23). De variantie in de oxidatieve potentie van de stalen (Teflonfilters) kon voor 74% verklaard worden door de aanwezigheid van Cr (p=0.004), Pb (p<0.0001) en BC (p<0.0001) in de omgevingslucht (Tabel 23). Tabel 23: Verklarende variabelen voor cytotoxisch, inflammatoir en oxidatieve activiteit.

Variabele N* Estimate** 95% Cl R2 p Totale R2

Cytotoxiciteit 61 0.29 Levoglucosan 0.89 0.84-0.93 0.29 < 0.0001

Il-8 inductie 58 0.38 Cl- 0.75 0.59-0.96 0.05 0.021 K+ 1.49 1.06-2.11 0.004 0.024 Levoglucosan 0.44 0.32-0.59 0.33 < 0.0001

Komeet oxidatieve schade 71 0.07 Cd 3.97 0.57-7.36 0.07 0.023

ROS-test 56 0.74 Cr 1.51 1.14-1.98 0.46 0.004 Pb 1.22 1.11-1.33 0.13 < 0.0001 BC 2.37 1.72-3.27 0.15 < 0.0001

* N is het aantal dagen. **

Effect berekend voor een stijging van levoglucosan met een IQR (inter-kwartiel range) van 348.62 ng/100

µg PM10 , een stijging van Cd met IQR van 1.3 ng/100 µg PM10, een stijging van K+ met IQR van 0.297 µg/100

µg PM10, een stijging van Cr met IQR van 29.59 ng/100 µg PM10, een stijging van Cl- met IQR van 6.61 µg/100

µg PM10, een stijging van Pb met IQR van 49.68 ng/100 µg PM10, een stijging van BC met IQR van 7.93 ng/100 µg PM10.

De interactie van de verklarende variabelen met de omgevingstemperatuur en de windsnelheid werd eveneens getest. Er werd een significante interactie aangetoond tussen PM10 en temperatuur voor het effect op de directe (p=0.007) en indirecte (p=0.0007) mutageniciteit. Er werd een positieve associatie tussen PM10 en de directe en indirecte mutageniciteit gevonden bij hoge omgevingstemperaturen (>10°C). Bij lage temperaturen (<10°C) werd er geen statistisch significant verband gevonden tussen PM10 en de directe en indirecte mutageniciteit. Voor de andere biologische testen kon geen interactie worden aangetoond met de omgevingstemperatuur of de windsnelheid. Wel was temperatuur een significante verklarende factor voor de oxidatieve schade in de komeettest (p=0.04), waar bij lage omgevingstemperaturen (<10°C) significant meer DNA-breuken optreden dan bij hoge omgevingstemperaturen (>10°C). De omgevingstemperatuur verklaarde 8% van de variantie in de komeettest.

6 Effectgerichte metingen en humane biomonitoring

65

6 EFFECTGERICHTE METINGEN EN HUMANE BIOMONITORING

6.1 HUMANE BIOMONITORING

Binnen het huidige Steunpunt Milieu en Gezondheid (2012-2015) werd een humane biomonitoringscampagne uitgevoerd in de Gentse Kanaalzone. De centrale onderzoeksvraag was of wonen nabij de industriezone van de Gentse Kanaalzone een invloed heeft op de gezondheid. Door middel van humane biomonitoring wordt de interne blootstelling aan milieupolluenten en de daaraan gekoppelde gezondheidseffecten bestudeerd bij 400 jongeren van 14-15 jaar oud uit de regio nabij het industriegebied en vergeleken met een groep van 200 jongeren van dezelfde leeftijdsklasse uit algemeen Vlaanderen. In de Gentse Kanaalzone werden biomerkers gemeten in urine, bloed en adem bij 200 jongeren en worden vragenlijsten ingevuld (o.m. over astma, allergie, infectie, puberteit) door 400 jongeren. De groep wordt ingedeeld in een noordelijk gebied (statistische sectoren van de gemeenten Zelzate, Wachtebeke) en zuidelijk gebied (statistische sectoren van de gemeenten Gent, Evergem).

Om na te gaan of er een associatie bestaat tussen de effectgerichte metingen op luchtstalen en de biomerkers van effect in de studiepopulatie komen alleen de deelnemers van het noordelijke studiegebied (Wachtebeke en Zelzate) in aanmerking, nl. 150 deelnemers met vragenlijstgegevens waarvan ook 83 met biomerkermetingen in bloed, urine en adem (Tabel 24 en Tabel 25). Tabel 24: Aantal deelnemers in de Gentse Kanaalzone met enkel vragenlijstgegevens.

Gentse Kanaalzone

Wachtebeke 31

Zelzate 36

Subtotaal gebied Noord 67

Evergem 60

Gent 71

Subtotaal gebied Zuid 131

Eindtotaal 198 Tabel 25: Aantal deelnemers in de Gentse Kanaalzone met vragenlijstgegevens en biomerkermetingen.

Gentse Kanaalzone

Wachtebeke 30

Zelzate 53

Subtotaal gebied Noord 83

Evergem 73

Gent 44

Subtotaal gebied Zuid 117

Eindtotaal 200

6 Effectgerichte metingen en humane biomonitoring

66

De gezondheidskundige eindpunten die in de biomonitoringscampagne bestudeerd worden in de Gentse Kanaalzone zijn de volgende: • Genotoxiciteit en oxidatieve stress: komeettest, micronucleustest, 8-OH-deoxy-guanosine, mitochondriale-DNA-schade (mtDNA); • Immuuneffecten: astma, allergie, infecties (vragenlijst), uitgeademd NO (eNO), interleukine-

1β in ademcondensaat, pH van ademcondensaat; • Hormoonverstoring: puberteitsontwikkeling, schildklierhormonen; • Hart en bloedvaten: bloeddruk; • Nierfunctie: klinische merkers voor glomerulaire en tubulaire nierfunctie; • Neurologische testen: psychosociaal gedrag, neurologische functie. Voor de laatste drie eindpunten werden geen biologische testen uitgevoerd op de verzamelde luchtstalen. De resultaten van de effectgerichte metingen werden vergeleken met humane gezondheidsgegevens uit de HBM-studie die beschikbaar zijn voor de jongeren uit het noordelijk studiegebied van de Gentse Kanaalzone. De meetresultaten van 8 van de 14 dagstalen uit Zelzate komen in aanmerking voor deze analyses. Bij de statistische analyse wordt een onderscheid gemaakt tussen de effectgerichte metingen die werden uitgevoerd op dagstalen en deze die werden uitgevoerd op poolstalen.

6.2 RELATIE EFFECTGERICHTE METINGEN MET BIOMERKERS VAN INFLAMMATIE EN DNA-SCHADE

Op basis van de humane biomonitoring was er geen indicatie voor verhoogde DNA-schade in de Gentse Kanaalzone. De gemiddelde waarde van de komeettest bij de jongeren lag significant lager in de Gentse Kanaalzone dan in de Vlaamse controlegroep (p<0.001); de micronucleustest was eveneens significant lager in de Gentse Kanaalzone, maar borderline significant (p=0.037); voor 8-OH-deoxyguanosine in urine werden geen verschillen tussen de regio’s vastgesteld. Er werd geen gebiedsvergelijking uitgevoerd voor mtDNA. Alle testen werden gecorrigeerd voor vooraf geselecteerde confounders (leeftijd, geslacht en roken), en voor significante covariaten. Voor de inflammatiemerkers werden er wel verschillen vastgesteld tussen de Gentse Kanaalzone en Vlaanderen, eNO was verhoogd, maar dit verschil was borderline niet-significant (p=0.053). De pH van het condensaat was significant lager (p=0.004). Beide resultaten wijzen op een verhoogde inflammatie van de luchtwegen bij deelnemers in de Gentse Kanaalzone. Interleukine-1β in ademcondensaat is ook een indicator voor inflammatie van de luchtwegen. Deze was niet verschillend tussen de Gentse Kanaalzone en Vlaanderen, maar de waarden van de metingen lagen heel dicht bij de detectielimiet. Merk op dat de gebiedsverschillen bestudeerd worden op basis van de deelnemers uit de hele regio (noordelijk + zuidelijk gebied). Gedurende de meetcampagne vonden 8 onderzoeksdagen plaats die in aanmerking komen voor de analyses en werden 83 adolescenten onderzocht. Het aantal meetdagen is relatief klein en de distributie van de variabelen is niet normaal verdeeld. Daarom werden voor de relaties tussen effectgerichte metingen en de korte-termijneffect-biomerkers partiële of gecorrigeerde correlatiecoëfficiënten berekend op basis van een niet-parametrische test (Spearman rank). Partiële correlaties werden gecorrigeerd voor geslacht, leeftijd en roken (Tabel 26).

6 Effectgerichte metingen en humane biomonitoring

67

Voor de analyses werden de effectgerichte metingen uitgedrukt effect per massa PM10. Hierdoor zijn de verbanden onafhankelijk van massa PM10 m.a.w. de relaties vertellen iets over de specifieke samenstelling van het fijn stof gestandaardiseerd voor de PM-massa. Er werd nagegaan of er een verband kon aangetoond worden tussen de humane biomerkers voor inflammatie en het inflammatoir karakter (il-8 inductie in longcellen) en het oxidatief potentieel (ROS-test) van de luchtstalen. Er werd een verband aangetoond tussen de pH van het ademcondensaat en het inflammatoir karakter. Een daling van de pH wijst op ontstekingsreacties in de longen. De analyses tonen aan dat de pH van het condensaat verlaagd is als de inflammatoire potentie van de luchtstalen toeneemt (r=-0.24, p=0.035) (Figuur 36). Voor oxidatief potentieel van de partikels werd een tegengesteld effect waargenomen (r=0.28, p=0.01). De resultaten tonen namelijk aan dat een verhoging van het oxidatief potentieel van fijn stof een verhoging van de productie van il-1β in ademcondensaat induceert (r=0.271, p=0.016). Er werd tevens een verband aangetoond tussen de inflammatiemerker eNO en de inflammatoire potentie van de luchtstalen maar de relatie was borderline niet-significant (r=0.17, p=0.08). De 8 onderzoeksdagen die in aanmerking komen voor de associatiestudie met humane biomerkers omvatten de 3 dagen waarop een luchtstaal werd bemonsterd met een verhoogde inflammatoire activiteit. De relaties met de inflammatoire potentie werd daarom ook geanalyseerd met il-8 inductie als een binaire variabele. Een daling van de pH in het ademcondensaat bij hogere inflammatoire potentie blijft behouden (r=-0.29, p=0.01). Er kon geen verband aangetoond worden met eNO en il-1β in ademcondensaat. Voor de biomerkers van DNA-schade kon enkel een significant verband aangetoond worden tussen komeettest (DNA-breuken) en het oxidatief potentieel van PM10 (r=0.29, p=0.01) (Figuur 37). Deze resultaten bevestigen de bevindingen uit de studie in Genk-Zuid [Van Den Heuvel et al., 2011]. Figuur 37 toont de associatie tussen het oxidatief potentaal en de komeettest in de jongeren. Er werden geen significante associaties aangetoond tussen de effectgerichte metingen en de genotoxiciteitsmerkers micronucleus, mtDNA inhoud in bloed en 8-OH-deoxyguanosine in urine. De literatuur betreffende de relatie tussen humane biomerker metingen en effectgerichte metingen in de omgevingslucht is zeer beperkt. In een Nederlandse studie werd geen associatie gevonden tussen uitgeademde NO bij volwassenen en het oxidatief potentieel van fijn stof [Strak et al., 2012]. De bevinding dat het radicaal generende vermogen van fijn stof linkt met humane toxiciteit (komeettest) in een populatie is consistent met de resultaten in Genk-Zuid [Van Den Heuvel et al., 2012] en eerdere gegevens van in vitro onderzoek [Shi et al., 2006].

6 Effectgerichte metingen en humane biomonitoring

68

Tabel 26: Partiële correlatiecoëfficiënten tussen effectgerichte metingen en biomerkers voor genotoxiciteit en inflammatiemerkers. Partiële correlaties werden gecorrigeerd voor geslacht, leeftijd en roken. Biomerker Biologische test n r p

komeettest (% DNA-schade)

ROS-test 82 0.290 0.010 Komeettest 77 0.073 0.536 Komeet ox schade 77 0.164 0.163

micronucleus (#/1000 cellen)

ROS-test 81 0.103 0.371

8-OH-deoxyguanosine in urine (µg/L)

ROS 82 0.021 0.856 Komeettest 77 0.146 0.215 Komeet ox schade 77 0.037 0.753

mt DNA inhoud (ratio mito/ nuclear DNA copy number)

ROS-test 64 -0.130 0.975 Komeet 61 0.319 0.190 Komeet ox schade 61 0.471 0.9233

eNO (ppb)

ROS-test 82 0.156 0.895 Il-8 inductie 82 0.170 0.084

IL-1β in ademcondensaat (fg/ml)

ROS-test 82 0.271 0.016 Il-8 inductie 82 -0.190 0.094

pH van ademcondensaat

ROS-test 82 0.284 0.011 Il-8 inductie 82 -0.237 0.035

4

5

6

7

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50

pH

ad

em

con

de

nsa

at

il-8 inductie

Figuur 36: Correlatie tussen de inflammatoire capaciteit van PM10 en de pH van het ademcondensaat in jongeren uit de Gentse Kanaalzone (n=82, r=-0.24, p=0.04).

6 Effectgerichte metingen en humane biomonitoring

69

0

1

2

3

4

5

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000

kom

ee

tte

st (

% D

NA

sch

ade

)

Radicaal genererend vermogen (AU/g PM10 )

Figuur 37: Correlatie tussen het radicaalgenererend vermogen van PM10 (ROS-test) en de komeettest in jongeren uit de Gentse Kanaalzone (n=82, r=0.29, p=0.01).

6.3 RELATIE EFFECTGERICHTE METINGEN MET BIOMERKERS VAN ASTMA, ALLERGIE, INFECTIES EN

HORMOONVERSTORING

Met behulp van biologische testen werd in deze studie relevante informatie verzameld met betrekking tot het schadelijk karakter van de omgevingslucht in de Gentse Kanaalzone. De in vitro testen geven een beeld over de potentiële gezondheidseffecten van het fijn stof. Voor de relatie tussen il-8-inductie in Beas-2B en het voorkomen van astma/allergie enerzijds en tussen ERE/ARE-activiteit en puberteit anderzijds is geen statistische analyse mogelijk aangezien de klinische eindpunten lange termijneffecten zijn die moeilijk gekoppeld kunnen worden aan periodische metingen op luchtstalen. Wel is een kwalitatieve analyse mogelijk, nl. er kan worden geëvalueerd of eventuele gebiedsverschillen (verhoging of verlaging) van de effectgerichte metingen tussen de Gentse Kanaalzone en het controlegebied in overeenstemming zijn met gebiedsverschillen in effectmerkers tussen de Gentse Kanaalzone en Vlaanderen in de humane biomonitoring. De beschikbare gezondheidsgegevens over astma, allergie en infecties tonen aan dat er geen verhoging is van long- en luchtwegaandoeningen in de Gentse Kanaalzone in vergelijking met de Vlaamse referentiepopulatie. Uit de vragenlijstgegevens kwam allergie voor metaal, verzorgings-, huishoud- of onderhoudsprodukten als significant verhoogd in de Gentse populatie naar voor. De effectgerichte metingen geven geen indicatie van een verhoogde inflammatoire potentie van de luchtstalen uit Zelzate in vergelijking met Houtem. Deze studie leert ons dat il-8 inductie in Beas-2B na blootstelling aan PM10 eerder gecorreleerd kan worden aan de humane inflammatiemerkers (merkers voor recente blootstelling). De effectgerichte meting van de inflammatoire cytokines in bronchiale epitheelcellen geeft een indicatie over het inflammatoir karakter van het testitem en is niet geschikt voor het screenen van het sensitiserend potentieel (inductie van allergische reactie). De optie om een in vitro test voor het opsporen van sensitiserende stoffen mee te nemen in de batterij van effectgerichte metingen moet overwogen worden. In de HBM-studie werden geen significante verschillen waargenomen in schildklierhormoonwaarden in vergelijking met de referentiepopulatie. Voor puberteitsontwikkeling werden er geen verschillen gedetecteerd bij de jongens, maar waren er mogelijke indicaties voor verschillen in puberteitsontwikkeling bij meisjes. Deze resultaten moeten heel voorzichtig geïnterpreteerd worden omwille van de kleine subgroepen, grote impact van

6 Effectgerichte metingen en humane biomonitoring

70

kleine verschillen in leeftijd, en inconsistentie tussen de verschillende eindpunten. In de huidige studie werd endocrien verstorende activiteit in de PM10-extracten afkomstig van Zelzate waargenomen die niet verschillend was van de gemeten oestrogene activiteit in de achtergrondlocatie.

7 Conclusie

71

7 CONCLUSIE

Hierna worden de kernboodschappen geformuleerd die resulteren uit de twee studies waarin effectgerichte metingen werden ingezet voor de beoordeling van de luchtkwaliteit. Meetcampagne Borgerhout De fijnstofmonsters (PM10-stof) verzameld in het stedelijke gebied Borgerhout en een achtergrondlocatie Houtem werden gescreend op hun toxicologische eigenschappen met behulp van een batterij van testen. Van de luchtstalen die werden verzameld werd het vermogen bepaald om de overleving van luchtwegcellen te beschadigen, om reactieve verbindingen te vormen (radicaal generend vermogen), om inflammatoire responsen te induceren, om schade aan DNA toe te brengen en de aanwezigheid van endotoxines. Deze studie heeft aangetoond dat de luchtkwaliteit voor een gegeven locatie toxicologisch kan

worden gekarakteriseerd.

De PM10-fractie induceerde een concentratie-afhankelijke afname van de celviabiliteit en een toename in inflammatoir cytokine (interleukine-8).

In vergelijking met de achtergrondlocatie is er een verhoging van de inflammatoire, mutagene en oxidatieve potentie van PM10 verzameld in Borgerhout.

o Celviabiliteit: Het schadelijk karakter van de partikels uit Borgerhout is niet significant verschillend van de partikels uit Houtem.

o Inflammatoire respons: Het inflammatoir potentieel van de partikels uit het stedelijk gebied Borgerhout is significant hoger ten opzichte van de partikels uit Houtem. De gemiddelde endotoxineconcentratie is verhoogd in Borgerhout in vergelijking met Houtem maar het verschil is niet significant.

o DNA-schade: Er kon geen verschil aangetoond worden in DNA-breuken tussen luchtstalen uit Borgerhout en Houtem. Zowel de directe (-S9) als de indirecte (+S9) mutagene activiteit is significant verhoogd in Borgerhout t.o.v. Houtem.

o Het radicaalgenererend vermogen van de partikels uit Borgerhout is significant verhoogd t.o.v. Houtem.

Meetcampagne Gentse Kanaalzone De fijnstofmonsters (PM10-stof) verzameld in het industrieel gebied Zelzate en de achtergrondlocatie Houtem werden gescreend op hun toxicologische eigenschappen met behulp van een batterij van testen.

7 Conclusie

72

Van de luchtstalen die werden verzameld werd het vermogen bepaald om de overleving van luchtwegcellen te beschadigen, om reactieve verbindingen te vormen (radicaal generend vermogen), om inflammatoire responsen te induceren, om schade aan DNA toe te brengen, de mate waarin deze stoffen het hormoon oestrogeen imiteren (oestrogene activiteit) en de aanwezigheid van endotoxines. Deze studie heeft aangetoond dat de luchtkwaliteit voor een gegeven locatie toxicologisch kan

worden gekarakteriseerd.

In vergelijking met de achtergrondlocatie is er een verhoging van de mutagene en oxidatieve potentie van PM10 verzameld in Zelzate.

o Celviabiliteit: De giftigheid van het fijn stof voor de bronchiale cellen was niet verschillend van deze uit Houtem.

o Inflammatoire respons: Er zijn geen aanwijzingen dat de luchtstalen uit Zelzate een hoger vermogen hebben om ontstekingsreacties uit te lokken in luchtwegcellen in vergelijking met de achtergrondlocatie. De inflammatoire capaciteit lag significant lager in Zelzate dan in Houtem. De gemiddelde endotoxineconcentratie is verhoogd in Houtem in vergelijking met Zelzate maar het verschil is niet significant.

o DNA-schade: Er kon geen verschil aangetoond worden in DNA-breuken tussen luchtstalen uit Borgerhout en Houtem. De directe mutagene activiteit was significant verhoogd in Zelzate t.o.v. Houtem.

o Hormonale verstoring: Er kon geen statistisch significant verschil in estrogene activiteit aangetoond worden tussen Zelzate en Houtem.

o Het radicaalgenererend vermogen van de partikels uit Zelzate is significant verhoogd t.o.v. Houtem.

Met behulp van de BG1 eierstokkanker cellijn werd voor de tweede keer aangetoond dat er stoffen met oestrogene activiteit aanwezig zijn in de Vlaamse omgevingslucht.

De resultaten van de ARE-test tonen aan dat er geen agonistische androgene effecten meetbaar zijn in de PM10-extracten, maar dat er mogelijk wel antagonistische androgene stoffen aanwezig zijn in de extracten.

Identificatie van gezondheidsrelevante polluenten De biologische effectmetingen kunnen een bijdrage leveren om te identificeren welke eigenschappen van luchtverontreiniging naast PM-massa, zoals deeltjesgrootte, chemische samenstelling, of oxidatief potentieel van fijn stof, het meeste verband houden met gezondheidseffecten ten gevolge van blootstelling aan luchtverontreiniging. Effectgericht meten heeft als doel om meer informatie te geven over de ongezonde eigenschappen van de mengeling van stoffen die in de lucht voorkomt. Biologische effectmetingen reageren op het mengsel van alle aanwezige stoffen die onderling, hierbij kunnen interacties tussen stoffen optreden, er wordt ook rechtstreeks rekening gehouden met biobeschikbaarheid. Om te bepalen welke fysische en chemische determinanten een mogelijke verklaring kunnen zijn voor de waargenomen effecten werden de toxicologische resultaten vergeleken met enerzijds de fysische en chemische karakteristieken van de stofdeeltjes en anderzijds de meteorologische

7 Conclusie

73

omstandigheden. De resultaten van de enkelvoudige regressie analyses van de gegevens onderschrijven andere

studies die aangetoond hebben dat zowel de massa fijn stof als de chemische samenstelling van fijn stof bepalend zijn voor de geobserveerde in vitro toxiciteit.

o De overleving van de luchtwegcellen daalt met stijgende concentraties van black carbon, elementaire koolstof, ionen (Cl-, Na+, NH4

+ en K+), de metalen cadmium, lood , en antimoon en de aanwezigheid van de producten van houtverbranding in de omgevingslucht.

o De waargenomen inflammatoire respons is gecorreleerd met de aanwezigheid van metalen (Cu, Mn en Zn).

o DNA-breuken door oxidatieve schade waren verhoogd bij stijgende concentraties van cadmium in PM10.

o De gemeten mutagene activiteit (direct en indirect) van de filterextracten kon gerelateerd worden aan het totale PAK-gehalte en aan de som van de carcinogene PAK’s, het radicaalgenererend vermogen van PM10, de hoeveelheid black carbon, organische en elementaire koolstof en de merkers voor houtverbranding in de

omgevingslucht.

o Er kon een verband aangetoond worden tussen de gemeten oestrogene activiteit in de extracten en black carbon en de som van de niet-carcinogene PAK’s.

o Er werd een verband aangetoond tussen het radicaalgenererend vermogen van de fijn stof stalen op teflonfilters en verschillende metalen (lood, zink, koper, arseen, mangaan, cadmium, chroom, ijzer, molybdeen, aluminium, barium), elementaire koolstof en black carbon in de omgevingslucht.

o Geen enkele chemische component was voorspellend voor alle geëvalueerde gezondheidseindpunten. In deze studie kon niet worden aangetoond dat chemische componenten, noch het oxidatief potentieel een betere voorspeller zijn voor de schadelijke eigenschappen van fijn stof dan deeltjesmassaconcentratie.

Via een stapsgewijze selectieprocedure werd voor elke eindpunt een meervoudig regressiemodel opgebouwd.

o Het schadelijk karakter van levoglucosan op de leefbaarheid van de bronchiale epitheelcellen werd bevestigd in het meervoudig model. Levoglucosan verklaarde 29% van de variantie in cytotoxiciteit van luchtstalen.

o De aanwezigheid van Cl- ionen en levoglucosan in de omgevingslucht vertoonden een negatieve correlatie met de il-8 inductie in Beas-2B.

o De positieve associatie tussen DNA-breuken als gevolg van oxidatieve schade en de Cd concentratie in de omgevingslucht werd bevestigd in het meervoudig model.

o Er kon een significante positieve relatie worden aangetoond tussen de directe (-S9) en indirecte (+S9) mutagene activiteit en levoglucosan in de omgevingslucht. De mutagene activiteit was ook afhankelijk van de PM10 massa.

7 Conclusie

74

o De aanwezigheid van niet-carcinogene PAK’s verklaarde 16% van de variantie in de oestrogene activiteit van de stalen.

o De variantie in de oxidatieve potentie van de stalen kon voor 74% verklaard worden door de aanwezigheid van Cr, Pb en BC in de omgevingslucht.

o Er werd een significante interactie aangetoond tussen PM10 en temperatuur voor het effect op de mutageniciteit. Voor de andere biologische testen kon geen interactie worden aangetoond met de omgevingstemperatuur of de windsnelheid.

Verband met meetresultaten jongeren in de Gentse Kanaalzone In de Gentse Kanaalzone werden biomerkers gemeten in het bloed, urine en uitgeademde lucht van 200 jongeren. Dit onderzoek gebeurde in opdracht van de Vlaamse overheid en werd uitgevoerd door het Steunpunt Milieu en Gezondheid. Het combineren van die resultaten van de 200 jongeren met de metingen van het meetnet lucht maken het mogelijk om te onderzoeken of effectgericht meten kan gebruikt worden om in te schatten wat het effect is op de gezondheid van de stoffen die voorkomen in de lucht. Er konden verbanden worden aangetoond tussen effectgerichte metingen en merkers voor

luchtweg inflammatie en DNA-schade in de jongeren.

o De analyses toonden aan dat de pH van het condensaat verlaagt als de inflammatoire potentie van de luchtstalen toeneemt. Een daling van de pH wijst op ontstekingsreacties in de longen.

o Een verhoging van het oxidatief potentieel van fijn stof induceert een verhoging van de productie van il-1β in ademcondensaat (meer inflammatie).

o Er werd een positief verband aangetoond tussen de inflammatiemerker eNO en de inflammatoire potentie van de luchtstalen (meer schade bij hogere potentie).

o Voor de biomerkers van DNA-schade werd een hoger oxidatief potentieel van PM10 in verband gebracht met een hogere komeettest (DNA breuken).

De beschikbare gezondheidsgegevens over astma, allergie en infecties tonen aan dat er geen verhoging is van long- en luchtwegaandoeningen in de Gentse Kanaalzone in vergelijking met de Vlaamse referentiepopulatie. De effectgerichte metingen geven geen indicatie van een verhoogde inflammatoire potentie van de luchtstalen uit Zelzate in vergelijking met Houtem.

o Deze studie leert ons dat il-8 inductie in Beas-2B na blootstelling aan PM10 eerder gecorreleerd kan worden aan de humane inflammatiemerkers (merkers voor recente blootstelling).

o Il-8 inductie geeft een indicatie over het inflammatoir karakter van het testitem en is niet geschikt voor het screenen van het sensitiserend potentieel (inductie van allergische reactie).

In de HBM-studie werden geen significante verschillen waargenomen tussen de Gentse Kanaalzone en Vlaanderen voor de schildklierhormonen en puberteitsontwikkeling bij jongens; de verschillen die geobserveerd werden bij meisjes zijn mogelijk toe te schrijven aan kleine

7 Conclusie

75

subgroepen en een verschil in leeftijdsdistributie. In de huidige studie werd endocrien verstorende activiteit in de PM10-extracten afkomstig van Zelzate waargenomen die niet verschillend was van de gemeten oestrogenen activiteit in de achtergrondlocatie.

Literatuurlijst

LITERATUURLIJST

Ahn KC, Zhao B, Chen J, Cherednichenko G, Sanmarti E, Denison M S, Lasley B, Pessah I N, Kultz D, Chang D P, Gee S J, Hammock B D. 2008. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116 1203-1210.

Allen J, Bartlett K, Graham M, Jackson P. 2011. Ambient concentrations of airborne endotoxin in two cities in the interior of British Columbia, Canada. J. Environ. Monit. 13 631-640.

Becker S, Dailey L A, Soukup J M, Grambow S C, Devlin R B, Huang Y C. 2005. Seasonal variations in air pollution particle-induced inflammatory mediator release and oxidative stress. Environ. Health Perspect. 113 1032-1038.

Binkova B, Cerna M, Pastorkova A, Jelinek R, Benes I, Novak J, Sram R J. 2003. Biological activities of organic compounds adsorbed onto ambient air particles: comparison between the cities of Teplice and Prague during the summer and winter seasons 2000-2001. Mutation research 525 43-59.

Bjerregaard-Olesen C, Bossi R, Bech B H, Bonefeld-Jorgensen E C. 2014. Extraction of perfluorinated alkyl acids from human serum for determination of the combined xenoestrogenic transactivity: A method development. Chemosphere.

Bonefeld-Jorgensen EC. 2010. Biomonitoring in Greenland: human biomarkers of exposure and effects - a short review. Rural. Remote. Health 10 1362.

Boogaard H, Janssen N A, Fischer P H, Kos G P, Weijers E P, Cassee F R, van der Zee S C, de Hartog J J, Brunekreef B, Hoek G. 2012. Contrasts in oxidative potential and other particulate matter characteristics collected near major streets and background locations. Environ. Health Perspect. 120 185-191.

Buczyńska, A.J., Krata, A., Van Grieken, R., Brown, A., Polezer, G., De Wael, K., Potgieter-Vermaak, S., 2014. Composition of PM2.5 and PM1 on high and low pollution event days and its relation to indoor air quality in a home for the elderly. Science of the total Environment 490, 134-143.

Cachon BF, Firmin S, Verdin A, Ayi-Fanou L, Billet S, Cazier F, Martin P J, Aissi F, Courcot D, Sanni A, Shirali P. 2014. Proinflammatory effects and oxidative stress within human bronchial epithelial cells exposed to atmospheric particulate matter (PM(2.5) and PM(>2.5)) collected from Cotonou, Benin. Environ. Pollut. 185 340-351.

Carter JD, Ghio A J, Samet J M, Devlin R B. 1997. Cytokine production by human airway epithelial cells after exposure to an air pollution particle is metal-dependent. Toxicol Appl Pharmacol 146 180-188.

Carty CL, Gehring U, Cyrys J, Bischof W, Heinrich J. 2003. Seasonal variability of endotoxin in ambient fine particulate matter. J. Environ. Monit. 5 953-958.

Cerna M, Pastorkova A, Vrbikova V, Smid J, Rossner P. 1999. Mutagenicity monitoring of airborne particulate matter (PM10) in the Czech Republic. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 444 373.

7 Conclusie

Donaldson K, MacNee W. 2001. Potential mechanisms of adverse pulmonary and cardiovascular effects of particulate air pollution (PM10). International Journal Of Hygiene And Environmental Health 203 411.

Ducatti A, Vargas V M F. 2003. Mutagenic activity of airborne particulate matter as an indicative measure of atmospheric pollution. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 540 67.

Emeville E, Giton F, Giusti A, Oliva A, Fiet J, Thome J P, Blanchet P, Multigner L. 2013. Persistent organochlorine pollutants with endocrine activity and blood steroid hormone levels in middle-aged men. PLoS. One. 8 e66460.

Ferguson MD, Migliaccio C, Ward T. 2013. Comparison of how ambient PMc and PM2.5 influence the inflammatory potential. Inhal. Toxicol. 25 766-773.

Freyberger A, Witters H, Weimer M, Lofink W, Berckmans P, Ahr H J. 2010. Screening for (anti)androgenic properties using a standard operation protocol based on the human stably transfected androgen sensitive PALM cell line. First steps towards validation. Reprod. Toxicol. 30 9-17.

Godri KJ, Duggan S T, Fuller G W, Baker T, Green D, Kelly F J, Mudway I S. 2010. Particulate matter oxidative potential from waste transfer station activity. Environ. Health Perspect. 118 493-498.

Godri KJ, Harrison R M, Evans T, Baker T, Dunster C, Mudway I S, Kelly F J. 2011. Increased oxidative burden associated with traffic component of ambient particulate matter at roadside and urban background schools sites in London. PLoS One 6 e21961.

Healy DA, Hellebust S, Silvari V, Lopez J M, Whittaker A G, Wenger J C, Heffron J J A, Sodeau J R. 2012. Using a pattern recognition approach to link inorganic chemical fingerprints of ambient Pm2.5-0.1 with in vitro biological effects. Air Qual Atmos Health 5 125-147.

Hellack B, Yang A, Cassee F, Janssen N A, Schins R P, Kuhlbusch T A J. 2014. Intrinsic hydroxyl radical generation measurements directly from sampled filters as a metric for the oxidative potential of ambient particulate matter . Journal of Aerosol Science 72 47-55.

Hetland RB, Cassee F R, Lag M, Refsnes M, Dybing E, Schwarze P E. 2005. Cytokine release from alveolar macrophages exposed to ambient particulate matter: heterogeneity in relation to size, city and season. Part Fibre. Toxicol. 2 4.

Hetland RB, Cassee F R, Refsnes M, Schwarze P E, Lag M, Boere A J F, Dybing E. 2004. Release of inflammatory cytokines, cell toxicity and apoptosis in epithelial lung cells after exposure to ambient air particles of different size fractions. Toxicology In Vitro 18 203.

Huang SL, Hsu M K, Chan C C. 2003. Effects of submicrometer particle compositions on cytokine production and lipid peroxidation of human bronchial epithelial cells. Environ Health Perspect 111 478-482.

Jalava PI, Hirvonen M R, Sillanpaa M, Pennanen A S, Happo M S, Hillamo R, Cassee F R, Gerlofs-Nijland M, Borm P J, Schins R P, Janssen N A, Salonen R O. 2009. Associations of urban air particulate composition with inflammatory and cytotoxic responses in RAW 246.7 cell line. Inhal. Toxicol. 21 994-1006.

Literatuurlijst

Janssen NA, Yang A, Strak M, Steenhof M, Hellack B, Gerlofs-Nijland M E, Kuhlbusch T, Kelly F, Harrison R, Brunekreef B, Hoek G, Cassee F. 2014. Oxidative potential of particulate matter collected at sites with different source characteristics. Sci. Total Environ. 472 572-581.

Kennedy K, Macova M, Leusch F, Bartkow M E, Hawker D W, Zhao B, Denison M S, Mueller J F. 2009. Assessing indoor air exposures using passive sampling with bioanalytical methods for estrogenicity and aryl hydrocarbon receptor activity. Anal. Bioanal. Chem. 394 1413-1421.

Klein GP, Hodge E M, Diamond M L, Yip A, Dann T, Stern G, Denison M S, Harper P A. 2006a. Gas-phase ambient air contaminants exhibit significant dioxin-like and estrogen-like activity in vitro. Environ. Health Perspect. 114 697-703.

Klein GP, Hodge E M, Diamond M L, Yip A, Dann T, Stern G, Denison M S, Harper P A. 2006b. Gas-phase ambient air contaminants exhibit significant dioxin-like and estrogen-like activity in vitro. Environ. Health Perspect. 114 697-703.

Kunzli N, Mudway I S, Gotschi T, Shi T, Kelly F J, Cook S, Burney P, Forsberg B, Gauderman J W, Hazenkamp M E, Heinrich J, Jarvis D, Norback D, Payo-Losa F, Poli A, Sunyer J, Borm P J. 2006. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environ Health Perspect 114 684-690.

Leusch FD, de J C, Levi Y, Lim R, Puijker L, Sacher F, Tremblay L A, Wilson V S, Chapman H F. 2010. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 3853-3860.

Liscio C, Abdul-Sada A, Al-Salhi R, Ramsey M H, Hill E M. 2014. Methodology for profiling anti-androgen mixtures in river water using multiple passive samplers and bioassay-directed analyses. Water Res. 57 258-269.

Matsumoto H, Adachi S, Suzuki Y. 2005a. Bisphenol A in ambient air particulates responsible for the proliferation of MCF-7 human breast cancer cells and Its concentration changes over 6 months. Arch. Environ. Contam Toxicol. 48 459-466.

Matsumoto H, Adachi S, Suzuki Y. 2005b. Bisphenol A in ambient air particulates responsible for the proliferation of MCF-7 human breast cancer cells and Its concentration changes over 6 months. Arch. Environ. Contam Toxicol. 48 459-466.

Moller P, Jacobsen N R, Folkmann J K, Danielsen P H, Mikkelsen L, Hemmingsen J G, Vesterdal L K, Forchhammer L, Wallin H, Loft S. 2010. Role of oxidative damage in toxicity of particulates. Free Radic. Res 44 1-46.

Nair AR, Degheselle O, Smeets K, Van K E, Cuypers A. 2013. Cadmium-Induced Pathologies: Where Is the Oxidative Balance Lost (or Not)? Int. J. Mol. Sci. 14 6116-6143.

Nawrot TS, Kuenzli N, Sunyer J, Shi T, Moreno T, Viana M, Heinrich J, Forsberg B, Kelly F J, Sughis K, Nemery B, Borm P. 2009. Oxidative properties of ambient PM2.5 and elemental composition: heterogeneous associations in 19 European cities. Atmospheric Environment 43 4595-4602.

Novak J, Giesy J P, Klanova J, Hilscherova K. 2013. In vitro effects of pollutants from particulate and volatile fractions of air samples-day and night variability. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 6620-6627.

7 Conclusie

Novak J, Jalova V, Giesy J P, Hilscherova K. 2009a. Pollutants in particulate and gaseous fractions of ambient air interfere with multiple signaling pathways in vitro. Environ. Int. 35 43-49.

Novak J, Jalova V, Giesy J P, Hilscherova K. 2009b. Pollutants in particulate and gaseous fractions of ambient air interfere with multiple signaling pathways in vitro. Environ. Int. 35 43-49.

Price HD, Jones T P, BeruBe K A. 2014. Resolution of the mediators of in vitro oxidative reactivity in size-segregated fractions that may be masked in the urban PM(10) cocktail. Sci. Total Environ. 485-486 588-595.

Rodriguez-Cotto RI, Ortiz-Martinez M G, Rivera-Ramirez E, Mateus V L, Amaral B S, Jimenez-Velez B D, Gioda A. 2014. Particle pollution in Rio de Janeiro, Brazil: increase and decrease of pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 in human lung cells. Environ. Pollut. 194 112-120.

Rogers JM, Denison M S. 2000. Recombinant cell bioassays for endocrine disruptors: development of a stably transfected human ovarian cell line for the detection of estrogenic and anti-estrogenic chemicals. In Vitr. Mol. Toxicol. 13 67-82.

Rudel RA, Camann D E, Spengler J D, Korn L R, Brody J G. 2003. Phthalates, alkylphenols, pesticides, polybrominated diphenyl ethers, and other endocrine-disrupting compounds in indoor air and dust. Environ. Sci. Technol. 37 4543-4553.

Salonen RO, Halinen A I, Pennanen A S, Hirvonen M R, Sillanpaa M, Hillamo R, Shi T, Borm P, Sandell E, Koskentalo T, Aarnio P. 2004. Chemical and in vitro toxicologic characterization of wintertime and springtime urban-air particles with an aerodynamic diameter below 10 microm in Helsinki. Scand. J Work Environ Health 30 Suppl 2 80-90.

Sangiorgi G, Ferrero L, Perrone M G, Papa E, Bolzacchini E. 2014. Semivolatile PAH and n-alkane gas/particle partitioning using the dual model: up-to-date coefficients and comparison with experimental data. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 21 10163-10173.

Schoeters G, Don Porto Carero A, Brits E, Verschaeve L. 2001. Naar een effectgerichte evaluatie van luchtkwaliteit in Vlaanderen. Studie in opdracht van VMM. 2001/TOX/R/008 (contract 99-1495).

Shi T, Duffin R, Borm P J, Li H, Weishaupt C, Schins R P. 2006. Hydroxyl-radical-dependent DNA damage by ambient particulate matter from contrasting sampling locations. Environ Res 101 18-24.

Shi T, Schins R P, Knaapen A M, Kuhlbusch T, Pitz M, Heinrich J, Borm P J. 2003. Hydroxyl radical generation by electron paramagnetic resonance as a new method to monitor ambient particulate matter composition. J Environ Monit 5 550-556.

Sonneveld E, Jansen H J, Riteco J A, Brouwer A, van der Burg B. 2005. Development of androgen- and estrogen-responsive bioassays, members of a panel of human cell line-based highly selective steroid-responsive bioassays. Toxicological Sciences 83 136-148.

Steenhof M, Gosens I, Strak M, Godri K J, Hoek G, Cassee F R, Mudway I S, Kelly F J, Harrison R M, Lebret E, Brunekreef B, Janssen N A, Pieters R H. 2011. In vitro toxicity of particulate matter (PM) collected at different sites in the Netherlands is associated with PM composition, size fraction and oxidative potential--the RAPTES project. Part Fibre Toxicol 8 26.

Steerenberg PA, van Amelsvoort L, Lovik M, Hetland R, Alberg T, Halatek T, Bloemen H, Rydzynski K, Swaen G, Schwarze P, Dybing E, Cassee F R. 2006. Relation Between Sources of Particulate Air

Literatuurlijst

Pollution and Biological Effect Parameters in Samples from Four European Cities: An Exploratory Study. Inhalation Toxicology 18 333.

Strak M, Janssen N A, Godri K J, Gosens I, Mudway I S, Cassee F R, Lebret E, Kelly F J, Harrison R M, Brunekreef B, Steenhof M, Hoek G. 2012. Respiratory Health Effects of Airborne Particulate Matter: The Role of Particle Size, Composition, and Oxidative Potential-The RAPTES Project. Environ Health Perspect 120 1183-1189.

Van Den Heuvel R, Smolders R, Nawrot T, Witters H, Mampaey M. 2011. Opmaak van een concreet en praktisch toepasbaar draaiboek voor toepassing van effectgerichte metingen in het lopende en toekomstige milieu- en gezondheidsbeleid met inbegrip van validatie door toepassing op de geselecteerde hot spot Genk-Zuid van het 2de generatie Steunpunt Milieu en Gezondheid. Studie uitgevoerd in opdracht van: Vlaamse Overheid, Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, Dienst Milieu & Gezondheid. Vito rapport 2011/MRG/R/232 1-235.

Van Den Heuvel RL, Lambrechts N, Verstraelen S, Nelissen I C, Schoeters G E. 2012. Chemical sensitization and allergotoxicology. EXS 101 289-314.

Van Den Heuvel RL, Witters H., Schoeters G. 2008. Uitwerken en uitvoeren van een pilootproject voor effectgerichte metingen om de luchtkwaliteit in Vlaanderen te kunnen evalueren Studie uitgevoerd in opdracht van: Vlaamse Overheid, Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, Dienst Milieu & Gezondheid. Vito rapport 2008/TOX/R/0010 1-170.

Van der Linden SC, Heringa M B, Man H Y, Sonneveld E, Puijker L M, Brouwer A, van der Burg B. 2008. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents and surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 5814-5820.

Verma V, Shafer M M, Schauer J J, ., Sioutas C. 2010. Contribution of transition metals in the reactive oxygen species activity of PM emissions from retrofitted heavy-duty vehicles. Atmospheric Environment 44 5165-5173.

Verstraelen S, Nelissen I, Hooyberghs J, Witters H, Schoeters G, Van Cauwenberge P, Van Den Heuvel R. 2009. Gene profiles of a human bronchial epithelial cell line after in vitro exposure to respiratory (non-)sensitizing chemicals: Identification of discriminating genetic markers and pathway analysis. Toxicology 255 151-159.

VMM. Luchtkwaliteit in het Vlaamse Gewest. Jaarverslag immissiemeetnetten. Kalenderjaar 2009.

VMM. Luchtkwaliteit in het Vlaamse Gewest. Jaarverslag immissiemeetnetten. Kalenderjaar 2010.

VMM. Luchtkwaliteit in het Vlaamse Gewest. Jaarverslag immissiemeetnetten. Kalenderjaar 2011.

Weiss JM, Hamers T, Thomas K V, van der Linden S, Leonards P E, Lamoree M H. 2009. Masking effect of anti-androgens on androgenic activity in European river sediment unveiled by effect-directed analysis. Anal. Bioanal. Chem. 394 1385-1397.

Weiss JM, Simon E, Stroomberg G J, de B R, de B J, Van der Linden S C, Leonards P E, Lamoree M H. 2011. Identification strategy for unknown pollutants using high-resolution mass spectrometry: androgen-disrupting compounds identified through effect-directed analysis. Anal. Bioanal. Chem. 400 3141-3149.

7 Conclusie

Wenger D, Gerecke A C, Heeb N V, Hueglin C, Seiler C, Haag R, Naegeli H, Zenobi R. 2009a. Aryl hydrocarbon receptor-mediated activity of atmospheric particulate matter from an urban and a rural site in Switzeland. Atmospheric Environment 43 3556-3562.

Wenger D, Gerecke A C, Heeb N V, Schmid P, Hueglin C, Naegeli H, Zenobi R. 2009b. In vitro estrogenicity of ambient particulate matter: contribution of hydroxylated polycyclic aromatic hydrocarbons. J. Appl. Toxicol. 29 223-232.

Wenger D, Gerecke A C, Heeb N V, Schmid P, Hueglin C, Naegeli H, Zenobi R. 2009c. In vitro estrogenicity of ambient particulate matter: contribution of hydroxylated polycyclic aromatic hydrocarbons. J. Appl. Toxicol. 29 223-232.

Wessels A, Birmili W, Albrecht C, Hellack B, Jermann E, Wick G, Harrison R M, Schins R P. 2010. Oxidant generation and toxicity of size-fractionated ambient particles in human lung epithelial cells. Environ. Sci. Technol. 44 3539-3545.

Yang A, Jedynska A, Hellack B, Kooter I, Hoek G, Brunekreef B, Kuhlbusch T A, Cassee F, Janssen N A. 2014. Measurement of the oxidative potential of PM2.5 and its constituents: The effect of extraction solvent and filter type. Atmospheric Environment 83 35-42.

Zhao X, Wan Z, Chen G, Zhu H, Jiang S, Yao J. 2002. Genotoxic activity of extractable organic matter from urban airborne particles in Shanghai, China. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 514 177.

Literatuurlijst

BIJLAGEN

BIJLAGE 1: CYTOTOXICITEIT

Viabiliteit van de Beas-2B cellen uitgedrukt als % van de negatieve controle na blootstelling aan een concentratiereeks van PM10. Gemiddelde en standaarddeviatie van 6 replica wells per blootstellingsconcentratie. Meetwaarden in rood zijn significant verschillend van de negatieve controle (0 µgPM10/ml) (ANOVA, Tukey post-hoc, p<0.05).

Borgerhout

µg PM10 per ml

100 50 25 12.5 6.25 0

B2 gemiddelde 86.07 91.74 97.15 100.48 102.54 100.00

STDV

5.33 2.93 5.09 2.29 5.30 5.66

B3 gemiddelde 84.52 91.57 93.84 97.19 101.55 100.00

STDV

5.33 6.31 7.79 5.64 4.18 6.93

B4 gemiddelde 84.26 91.45 96.99 102.58 101.87 100.00

STDV

6.83 8.86 10.25 3.90 6.43 7.11

B5 gemiddelde 80.17 77.73 81.26 89.53 92.56 100.00

STDV

5.39 8.03 5.21 9.23 9.05 1.01

B6 gemiddelde 78.34 88.38 96.59 112.50 99.43 100.00

STDV

5.12 9.37 8.49 9.42 5.04 3.43

B7 gemiddelde 85.74 84.27 94.51 101.42 100.26 100.00

STDV

3.65 5.13 7.52 4.19 7.43 9.16

B8 gemiddelde 78.18 82.18 95.20 105.39 108.53 100.00

STDV

2.83 5.46 2.76 4.16 4.23 6.14

B9 gemiddelde 86.87 97.34 99.10 105.55 104.69 100.00

STDV

4.35 3.11 4.13 3.99 5.14 3.61

B11 gemiddelde 79.71 93.93 106.70 107.93 107.98 100.00

STDV

2.64 4.06 3.23 6.87 4.03 5.68

B12 gemiddelde 76.31 84.58 93.31 101.23 103.20 100.00

STDV

2.81 2.34 2.64 4.28 3.08 4.91

B13 gemiddelde 83.19 87.35 91.10 101.23 98.83 100.00

STDV

2.81 2.16 3.50 3.29 2.93 2.73

B14 gemiddelde 79.54 88.81 90.81 95.23 98.36 100.00

STDV

5.12 6.39 5.14 3.71 6.72 4.24

B16 gemiddelde 74.06 85.33 90.15 97.22 95.37 100.00

STDV

5.74 6.10 7.26 9.34 7.21 8.33

B17 gemiddelde 75.00 91.08 96.16 108.84 108.38 100.00

STDV

4.96 5.61 4.74 4.86 7.73 3.64

B18 gemiddelde 87.48 95.05 95.04 102.41 103.05 100.00

STDV

7.42 7.85 11.39 6.13 10.38 4.09

B19 gemiddelde 80.74 97.57 98.18 98.62 103.23 100.00

0 Bijlagen

STDV

3.35 4.70 4.85 7.65 3.90 5.37

B20 gemiddelde 75.05 86.98 89.99 89.33 97.00 100.00

STDV

6.20 4.63 3.53 4.74 3.10 4.45

B21 gemiddelde 87.02 93.63 100.83 105.08 104.05 100.00

STDV

2.70 2.42 1.99 2.26 3.37 5.96

B22 gemiddelde 66.45 82.25 84.84 98.97 106.94 100.00

STDV

7.32 5.57 5.91 8.10 5.98 6.28

B23 gemiddelde 86.82 100.66 114.15 123.76 133.94 100.00

STDV

3.37 5.02 4.54 5.97 8.96 7.60

B24 gemiddelde 78.85 85.96 73.98 98.58 104.13 100.00

STDV

6.07 4.59 8.01 6.66 5.85 5.22

B25 gemiddelde 88.40 77.53 87.79 101.83 96.90 100.00

STDV

6.61 2.33 7.80 4.99 4.87 5.81

B26 gemiddelde 80.13 84.97 94.93 95.19 102.48 100.00

STDV

2.85 2.88 1.95 2.37 6.12 5.34

B27 gemiddelde 84.17 93.88 91.50 95.93 104.14 100.00

STDV

5.39 6.50 4.20 3.24 9.11 5.64

B29 gemiddelde 79.59 86.18 89.18 79.59 101.25 100.00

STDV

5.17 6.08 3.90 7.28 3.75 3.69

B31 gemiddelde 84.39 87.97 94.98 100.70 101.68 100.00

STDV

3.89 3.12 5.68 1.24 2.38 4.40

B32 gemiddelde 82.19 93.61 101.55 110.20 109.26 100.00

STDV

1.97 5.67 4.28 4.46 1.04 6.42

B33 gemiddelde 80.58 97.78 106.42 114.64 115.77 100.00

STDV

5.49 3.23 1.62 11.37 1.80 3.34

B34 gemiddelde 80.97 88.35 94.60 103.47 102.10 100.00

STDV

4.27 5.66 9.06 7.63 3.95 11.39

B35 gemiddelde 86.31 90.00 97.34 101.64 105.43 100.00

STDV

3.29 7.14 4.56 3.75 3.04 4.35

B36 gemiddelde 70.71 82.37 92.64 99.93 99.70 100.00

STDV

3.24 4.43 6.18 5.19 3.77 5.16

B38 gemiddelde 80.71 88.46 97.52 104.60 98.59 100.00

STDV

4.70 10.02 3.71 6.62 2.88 8.40

B39 gemiddelde 82.31 93.92 102.45 99.14 106.98 100.00

STDV

3.14 6.60 6.09 5.67 2.75 4.11

B40 gemiddelde 82.14 92.96 100.76 105.90 110.30 100.00

STDV

8.47 10.19 9.44 10.31 10.01 9.80

B41 gemiddelde 58.57 77.85 93.50 103.96 106.56 100.00

STDV

1.79 4.69 3.98 4.62 4.02 4.05

B42 gemiddelde 80.57 95.15 103.29 106.81 110.52 100.00

STDV

5.19 5.49 5.49 14.21 11.65 8.03

B43 gemiddelde 51.05 76.99 92.62 100.23 108.87 100.00

STDV

10.92 5.06 4.00 5.58 4.29 8.70

B44 gemiddelde 56.15 71.68 91.41 96.08 104.76 100.00

STDV

2.08 3.13 4.90 4.29 4.75 4.02

Literatuurlijst

B45 gemiddelde 69.49 80.42 102.03 108.21 117.31 100.00

STDV

3.35 9.18 6.52 2.69 6.98 12.50

B46 gemiddelde 57.21 86.11 99.81 105.29 114.52 100.00

STDV

5.13 2.83 2.66 6.04 8.87 5.19

B47 gemiddelde 75.08 94.42 102.96 109.84 113.57 100.00

STDV

4.19 10.00 4.95 7.51 7.59 2.47

B48 gemiddelde 63.29 76.20 90.99 102.60 105.40 100.00

STDV

3.75 3.27 3.28 7.77 3.59 10.77

B49 gemiddelde 69.24 81.49 90.89 91.48 101.42 100.00

STDV

4.35 3.47 13.12 5.12 11.58 7.83

B50 gemiddelde 83.32 105.52 117.81 116.22 117.34 100.00

STDV

5.25 15.09 11.31 10.60 10.75 7.27

B51 gemiddelde 76.44 88.57 102.28 106.63 109.56 100.00

STDV

7.07 8.12 8.21 9.41 5.63 5.71

B52 gemiddelde 64.96 81.55 98.68 105.49 109.35 100.00

STDV

3.64 5.36 7.77 5.68 4.80 6.05

B54 gemiddelde 63.94 86.23 100.10 113.14 121.48 100.00

STDV

7.39 10.16 4.85 5.46 7.19 17.79

B55 gemiddelde 73.57 84.86 93.24 104.55 102.89 100.00

STDV

2.66 2.70 3.96 3.05 6.25 7.96

B56 gemiddelde 74.08 94.80 104.78 109.47 114.76 100.00

STDV

3.87 5.64 4.20 7.02 7.33 4.20

B57 gemiddelde 59.92 79.98 86.68 92.04 100.59 100.00

STDV

2.68 3.17 3.67 5.59 8.35 4.04

B58 gemiddelde 62.98 81.59 90.79 103.55 107.03 100.00

STDV

9.55 11.60 10.66 13.46 11.37 11.92

B59 gemiddelde 75.45 85.19 92.06 98.12 99.09 100.00

STDV

2.86 4.72 5.62 6.14 6.12 2.28

B60 gemiddelde 57.43 76.86 85.15 98.53 102.42 100.00

STDV

6.40 7.11 7.18 5.42 5.60 8.11

B61 gemiddelde 79.19 90.44 92.34 93.54 99.48 100.00

STDV

3.45 6.88 5.53 11.16 8.55 10.58

B62 gemiddelde 82.53 70.66

100.00

STDV

6.90 9.22

7.19

B63 gemiddelde 64.75 86.80 104.49 113.63 115.68 100.00

STDV

4.51 10.36 9.30 8.49 7.59 9.69

B64 gemiddelde 88.95 85.79 88.18 101.90 96.61 100.00

STDV

36.44 20.29 20.18 15.16 14.23 11.32

B65 gemiddelde 46.68 63.75 59.57 103.22 113.89 100.00

STDV

8.41 20.85 6.36 19.88 16.64 28.79

B66 gemiddelde 80.71 110.55 100.53 101.53 103.77 100.00

STDV

10.26 36.79 12.60 5.82 6.44 5.78

B67 gemiddelde 76.92 90.37 106.42 105.99 104.92 100.00

STDV

7.62 18.84 11.71 10.85 12.44 7.78

B68 gemiddelde 76.77 85.25 102.96 97.03 93.98 100.00

0 Bijlagen

STDV

9.98 14.35 18.94 11.62 10.19 5.27

Houtem

µg PM10 per ml

100 50 25 12.5 6.25 0

H2 gemiddelde 87.65 94.96 102.27 103.58 102.25 100.00

STDV 25.82 18.11 6.81 6.11 5.93 22.87

H5 gemiddelde 95.04 95.72 98.89 98.88 99.17 100.00

STDV 2.60 4.02 3.69 1.60 2.96 3.88

H6 gemiddelde 93.80 98.87 101.64 103.31 105.98 100.00

STDV 1.82 3.45 2.66 2.18 2.58 2.63

H7 gemiddelde 83.79 94.75 99.07 104.11 102.87 100.00

STDV 2.20 2.26 4.26 3.59 6.42 2.63

H8 gemiddelde 90.21 97.83 106.73 105.48 111.74 100.00

STDV 3.03 2.51 3.70 3.23 4.18 4.67

H10 gemiddelde 79.89 87.90 96.59 104.81 105.46 100.00

STDV 2.48 3.08 3.76 3.56 3.54 2.94

H11 gemiddelde 72.49 82.79 90.77 92.61 98.11 100.00

STDV 4.37 0.30 2.61 4.48 3.65 3.21

H12 gemiddelde 89.77 94.73 103.00 102.99 104.05 100.00

STDV 5.76 3.46 3.36 4.64 3.98 2.95

H13 gemiddelde 102.04 99.54 100.67 100.06 98.35 100.00

STDV 2.55 3.10 2.02 2.15 3.36 4.17

H14 gemiddelde 81.57 85.03 90.31 102.15 103.95 100.00

STDV 3.83 4.16 6.67 4.33 3.29 4.79

H16 gemiddelde 81.51 85.41 87.77 95.28 97.53 100.00

STDV 8.00 4.40 2.89 5.49 2.62 5.18

H17 gemiddelde 98.43 101.01 100.89 101.83 99.92 100.00

STDV 4.09 4.31 7.45 5.04 2.63 7.08

H20 gemiddelde 83.17 105.10 111.54 108.93 109.30 100.00

STDV 8.15 14.16 12.62 8.51 8.55 6.31

H21 gemiddelde 31.96 71.44 84.49 96.26 112.61 100.00

STDV 4.80 4.83 5.18 7.29 4.46 4.65

H22 gemiddelde 31.67 69.83 88.18 91.37 99.14 100.00

STDV 6.06 5.59 10.65 11.63 9.56 5.52

H23 gemiddelde 66.67 90.88 98.31 109.74 116.46 100.00

STDV 6.22 9.71 5.94 6.54 8.41 7.53

H25 gemiddelde 38.75 67.88 90.23 106.62 110.71 100.00

STDV 2.73 4.47 4.66 6.18 6.63 8.81

H26 gemiddelde 78.80 86.98 98.60 104.73 108.18 100.00

STDV 5.26 7.36 8.57 10.01 9.85 7.50

H27 gemiddelde 60.34 81.60 99.81 96.07 106.28 100.00

STDV 5.63 9.47 4.00 14.91 7.24 7.64

H28 gemiddelde 85.30 94.98 93.64 95.52 103.09 100.00

STDV 8.67 6.59 3.81 4.94 4.51 6.03

H29 gemiddelde 71.26 88.16 96.52 98.88 107.64 100.00

Literatuurlijst

STDV 3.39 3.85 8.49 5.30 6.34 4.00

H30 gemiddelde 50.25 72.63 86.23 97.20 105.94 100.00

STDV 4.32 4.77 2.67 9.49 3.21 10.86

H31 gemiddelde 78.70 96.87 103.34 105.46 112.31 100.00

STDV 7.09 5.22 3.47 5.64 5.59 11.25

H32 gemiddelde 71.60 86.29 93.40 101.52 105.60 100.00

STDV 4.00 10.05 5.19 3.51 7.58 15.28

H33 gemiddelde 72.43 84.53 94.22 91.51 95.29 100.00

STDV 8.15 17.74 8.89 8.78 10.67 8.58

H34 gemiddelde 76.37 87.46 96.13 97.62 102.86 100.00

STDV 7.83 8.47 15.15 10.56 10.72 8.20

H35 gemiddelde 102.34 117.92 107.22 110.59 110.73 100.00

STDV 34.94 49.37 4.44 10.82 3.95 9.17

H36 gemiddelde 81.68 78.40 81.21 83.16 80.64 100.00

STDV 9.53 13.23 9.51 15.21 6.43 12.89

H37 gemiddelde 59.29 113.35 98.70 119.56 111.66 100.00

STDV 5.97 14.92 14.24 9.96 9.59 13.22

H38 gemiddelde 103.29 104.60 117.13 112.89 108.35 100.00

STDV 11.63 12.89 11.63 7.08 12.25 13.31

H39 gemiddelde 79.32 82.01 98.33 98.39 101.58 100.00

STDV 7.75 6.91 5.02 6.44 6.62 7.97

H40 gemiddelde 85.79 102.83 107.75 109.96 112.62 100.00

STDV 5.02 3.09 4.15 4.67 1.64 6.05

H41 gemiddelde 92.71 99.89 107.67 111.60 110.57 100.00

STDV 3.90 6.47 7.60 2.85 6.37 4.66

H42 gemiddelde 94.34 93.51 93.07 97.23 96.76 100.00

STDV 6.86 10.59 10.53 12.11 6.28 7.29

Zelzate

µg PM10 per ml

100 50 25 12.5 6.25 0

Z1 gemiddelde 83.06 89.14 93.46 96.18 96.22 100.00

STDV

4.84 5.88 5.56 6.95 5.00 9.40

Z2 gemiddelde 73.08 89.24 103.72 104.14 102.10 100.00

STDV

5.23 5.49 4.11 4.55 9.02 9.07

Z3 gemiddelde 83.56 91.37 92.81 97.43 104.26 100.00

STDV

2.66 3.59 14.70 5.22 8.47 6.19

Z4 gemiddelde 72.30 79.36 103.10 108.70 121.64 100.00

STDV

4.76 11.80 8.77 17.66 8.95 8.37

Z6 gemiddelde 83.56 100.25 104.36 103.43 108.22 100.00

STDV

5.23 4.01 3.08 2.68 8.01 4.71

Z7 gemiddelde 69.14 81.98 89.13 85.48 97.75 100.00

STDV

4.60 7.06 6.31 2.81 6.14 3.52

Z8 gemiddelde 81.41 86.78 97.17 102.07 106.24 100.00

STDV

6.89 5.57 9.48 4.29 5.11 8.80

Z9 gemiddelde 80.53 93.64 91.98 94.40 103.32 100.00

0 Bijlagen

STDV

6.29 6.93 3.52 5.64 5.30 9.85

Z10 gemiddelde 86.43 91.61 93.84 96.23 101.78 100.00

STDV

6.32 5.80 3.72 5.18 8.85 6.62

Z11 gemiddelde 70.62 80.54 93.47 101.99 106.34 100.00

STDV

9.19 16.53 7.48 9.85 6.24 19.17

Z12 gemiddelde 62.77 85.09 83.99 99.61 107.98 100.00

STDV

8.63 10.92 11.60 14.17 12.36 11.38

Z13 gemiddelde 17.83 65.14 88.64 119.33 121.81 100.00

STDV

1.78 6.72 6.53 8.64 8.43 13.49

Z14 gemiddelde 22.51 77.02 80.22 107.07 104.47 100.00

STDV

5.03 27.40 12.36 16.13 18.79 22.56

Literatuurlijst

BIJLAGE 2: RADICAALGENEREREND VERMOGEN

Borgerhout Houtem

Datum Filtercode AU/m3 Datum Filtercode AU/m3

13/04/2013 B3 2.394* 13/04/2013 H2 507

19/05/2013 B9 6.269* 19/05/2013 H5 1.146

12/06/2013 B13 3.458 12/06/2013 H7 580

18/07/2013 B19 2.135 18/07/2013 H10 1.094

30/07/2013 B21 3.254 30/07/2013 H11 728

11/08/2013 B23 2.740 11/08/2013 H12 327

23/08/2013 B25 4.608 23/08/2013 H13 1.609

4/09/2013 B27 6.374 4/09/2013 H14 2.233

28/09/2013 B31 4.161 28/09/2013 H16 2.266

15/11/2013 B39 5.068 15/11/2013 H20 295

14/01/2013 B49 5.056 14/01/2013 H25 2.114

26/01/2014 B51 2.186 26/01/2014 H26 646

19/02/2014 B55 5.433 7/02/2014 H27 595

3/03/2014 B57 5.094 13/02/2014 H28 339

15/03/2014 B59 3.200 19/02/2014 H29 944

27/03/2014 B61 5.024 25/02/2014 H30 1.333

8/04/2014 B63 2.995 3/03/2014 H31 628

14/04/2014 B64 1.495 9/03/2004 H32 1.607

20/04/2014 B65 2.735 15/03/2014 H33 1.284

26/04/2014 B66 2.876 21/03/2014 H34 551

2/05/2014 B67 1.600 27/03/2014 H35 2.083

8/05/2014 B68 2.258 2/04/2014 H36 2.152

8/04/2014 H37 767

14/04/2014 H38 212

20/04/2014 H39 1.207

26/04/2014 H40 983

2/05/2014 H41 529

8/05/2014 H42 231

*Gemeten op extract

0 Bijlagen

Zelzate

Datum filtercode AU/m3

7/04/2013 Z1 1.554

8/04/2012 Z2 2.934

10/04/2013 Z3 1.613

21/05/2013 Z4 1.034

24/05/2013 Z5 1.063

27/05/2013 Z6 584

26/08/2013 Z7 2.366

7/10/2012 Z8 5.317

20/10/2013 Z9 4.221

27/10/2013 Z10 4.036

28/10/2013 Z11 3.692

20/11/2013 Z12 4.443

24/11/2013 Z13 697

28/01/2014 Z14 463

Blanco

filters AU/m3

BL1 9360

BL2 9080

BL3 10320

BL4 10500

BL5 9500

Literatuurlijst

BIJLAGE 3: IL-8 INDUCTIE

Cytokine inductie in Beas-2B cellen (pg il-8/ml) na blootstelling aan een concentratiereeks van PM10. Waarden zijn het gemiddelde van 2 replica wells.

Datum Borgerhout PM10 µg/ml Houtem PM10 µg/ml

Filtercode 100 50 25 0 Filtercode 100 50 25 0

1/04/2013 B1

H1 7/04/2013 B2 184.09 78.87 56.86 29.21

13/04/2013 B3 31.59 14.68 14.02 24.39 H2 65.11 40.80 35.69 46.82

19/04/2013 B4 61.03 45.80 23.69 18.95 25/04/2013 B5 128.66 103.04 70.20 16.35 H3

1/05/2013 B6 173.45 139.91 68.62 24.37 7/05/2013 B7 106.88 82.83 46.70 27.20 H4

13/05/2013 B8 64.92 68.52 29.16 35.49 19/05/2013 B9 8.98 9.37 8.24 34.91 H5 75.14 72.52 82.54 100.47

25/05/2013 B10 31/05/2013 B11 45.61 29.64 19.50 7.51 H6 84.25 86.30 95.75 96.03

6/06/2013 B12 180.12 121.12 94.02 53.61 12/06/2013 B13 136.81 95.43 80.45 48.60 H7 123.67 95.46 82.30 83.98

18/06/2013 B14 93.68 74.57 63.09 50.02 24/06/2013 B15

H8 242.23 175.65 123.07 90.09

30/06/2013 B16 108.01 85.48 62.95 55.99 6/07/2013 B17 113.72 93.92 61.32 47.51 H9

12/07/2013 B18 125.00 81.94 67.06 52.13 18/07/2013 B19 237.07 148.24 95.23 45.97 H10 90.86 70.49 68.51 76.61

24/07/2013 B20 178.30 111.00 82.17 46.70 30/07/2013 B21 292.10 221.00 137.51 53.39 H11 584.75 403.27 241.25 82.30

5/08/2013 B22 430.40 294.40 215.40 43.93 11/08/2013 B23 438.65 326.45 203.48 45.37 H12 298.64 248.02 164.95 79.60

17/08/2013 B24 301.42 231.85 123.28 41.65 23/08/2013 B25 40.80 25.07 18.57 22.61 H13 171.41 138.52 100.91 83.92

29/08/2013 B26 117.09 85.77 44.38 20.85 4/09/2013 B27 106.42 87.78 77.52 76.58 H14 218.69 115.30 90.15 62.10

10/09/2013 B28 16/09/2013 B29 105.23 79.10 63.25 69.42 H15

22/09/2013 B30 28/09/2013 B31 140.82 108.26 84.57 81.19 H16 146.43 100.83 77.87 71.02

4/10/2013 B32 78.11 67.62 61.14 81.55 10/10/2013 B33 88.25 79.24 62.09 84.33 H17 376.63 226.05 145.58 77.04

16/10/2013 B34 77.25 64.96 63.62 81.14 22/10/2013 B35 235.59 180.33 120.27 73.73 H18

28/10/2013 B36 262.84 163.07 117.97 73.36 3/11/2013 B37

H19

0 Bijlagen

9/11/2013 B38 74.15 58.87 51.48 52.08 15/11/2013 B39 77.99 59.38 53.63 83.86 H20 269.85 166.71 100.57 62.55

21/11/2013 B40 82.88 68.42 56.82 73.90 27/11/2013 B41 72.88 57.15 47.11 71.24 H21 34.23 33.47 29.79 48.72

3/12/2013 B42 68.72 60.49 58.96 80.06 9/12/2013 B43 79.23 62.02 57.29 88.92 H22 69.48 52.38 52.59 41.07

15/12/2013 B44 96.07 71.12 60.87 77.51 21/12/2013 B45 87.16 62.68 55.23 98.16 H23 44.36 33.87 29.67 44.92

27/12/2013 B46 89.85 69.66 70.29 85.11 2/01/2014 B47 41.11 24.51 26.40 41.93 H24

8/01/2014 B48 44.79 41.22 28.81 46.40 14/01/2014 B49 38.75 37.97 32.55 48.89 H25 59.94 44.21 36.25 45.86

20/01/2014 B50 35.84 30.57 27.67 45.14 26/01/2014 B51 51.30 36.04 32.37 52.46 H26 12.02 5.46 2.71 22.88

1/02/2014 B52 73.15 44.28 35.89 50.56 7/02/2014 B53

H27 19.02 10.50 7.81 11.60

13/02/2014 B54 37.10 18.33 26.38 39.93 H28 25.58 20.91 12.98 21.69

19/02/2014 B55 42.59 32.04 28.60 44.61 H29 13.46 9.21 10.46 21.91

25/02/2014 B56 153.35 104.79 67.10 46.42 H30 23.32 14.02 14.72 21.28

3/03/2014 B57

H31 27.51 18.58 15.38 24.25

9/03/2014 B58

H32 33.17 19.40 13.65 22.99

15/03/2014 B59 74.62 61.32 53.29 69.40 H33 25.37 31.27 21.71 35.34

21/03/2014 B60

H34 49.38 35.09 29.25 39.29

27/03/2014 B61 22.05 17.69 14.08 22.73 H35 27.37 25.03 23.46 41.93

2/04/2014 B62 34.81 150.85 0.00 23.91 H36 118.85 57.41 45.61 35.55

8/04/2014 B63 44.14 28.07 24.54 22.18 H37 33.79 24.17 21.60 34.24

14/04/2014 B64 136.18 55.18 47.42 35.08 H38 36.30 35.60 29.94 37.89

20/04/2014 B65 49.79 31.36 28.46 35.25 H39 46.66 48.55 46.99 74.90

26/04/2014 B66 73.78 49.13 35.97 30.68 H40 100.25 71.44 63.81 84.62

2/05/2014 B67 60.49 40.87 32.14 35.51 H41 62.34 59.07 57.75 82.79

8/05/2014 B68 30.25 28.21 22.20 39.48 H42 153.29 109.35 84.88 68.55

Datum Zelzate PM10 µg/ml

filtercode 100 50 25 0

7/04/2013 Z1 63.23 55.89 48.49 75.43

8/04/2012 Z2 123.53 92.41 67.31 68.99

10/04/2013 Z3 55.69 46.57 51.09 75.84

21/05/2013 Z4 49.53 44.46 45.46 68.67

24/05/2013 Z5

27/05/2013 Z6 53.49 55.91 57.04 83.38

26/08/2013 Z7 209.05 123.07 124.90 94.72

7/10/2013 Z8 43.50 55.46 49.15 93.56

20/10/2013 Z9 55.25 52.53 42.80 96.00

27/10/2013 Z10 67.64 64.44 59.31 90.74

28/10/2013 Z11 197.00 101.81 87.62 95.75

Literatuurlijst

20/11/2013 Z12 28.44 13.86 12.32 25.51

24/11/2013 Z13 25.95 15.75 11.58 30.98

28/01/2014 Z14 27.24 30.05 12.78 26.32

0 Bijlagen

BIJLAGE 4: ENDOTOXINE

Endotoxine concentratie in het supernatans na blootstelling aan 100 µg PM10 /ml. Waarden zijn het gemiddelde van 2 replica metingen.

Datum Borgerhout Houtem Datum Zelzate

Filtercode Filtercode filtercode

1/04/2013 B1 H1 7/04/2013 Z1 0.05

7/04/2013 B2 0.30 8/04/2012 Z2 0.19

13/04/2013 B3 0.05 H2 0.05 10/04/2013 Z3 0.05

19/04/2013 B4 0.23 21/05/2013 Z4 0.05

25/04/2013 B5 0.55 H3 24/05/2013 Z5

1/05/2013 B6 0.50 27/05/2013 Z6 0.05

7/05/2013 B7 0.50 H4 26/08/2013 Z7 0.50

13/05/2013 B8 0.26 7/10/2013 Z8 0.05

19/05/2013 B9 0.11 H5 0.05 20/10/2013 Z9 0.05

25/05/2013 B10 27/10/2013 Z10 0.05

31/05/2013 B11 0.15 H6 0.05 28/10/2013 Z11 0.54

6/06/2013 B12 0.52 20/11/2013 Z12 0.19

12/06/2013 B13 0.43 H7 0.11 24/11/2013 Z13 0.10

18/06/2013 B14 0.23 28/01/2014 Z14 0.20

24/06/2013 B15 H8 0.31

30/06/2013 B16 0.18

6/07/2013 B17 0.21 H9

12/07/2013 B18 0.14

18/07/2013 B19 0.55 H10 0.05

24/07/2013 B20 0.43

30/07/2013 B21 6.28 H11 3.05

5/08/2013 B22 8.00

11/08/2013 B23 8.00 H12 2.73

17/08/2013 B24 5.07

23/08/2013 B25 0.23 H13 0.29

29/08/2013 B26 0.59

4/09/2013 B27 0.30 H14 0.27

10/09/2013 B28

16/09/2013 B29 0.26 H15

22/09/2013 B30

28/09/2013 B31 0.28 H16 0.11

4/10/2013 B32 0.24

10/10/2013 B33 0.05 H17 0.27

16/10/2013 B34 0.05

22/10/2013 B35 0.48 H18

28/10/2013 B36 4.03

3/11/2013 B37 H19

Literatuurlijst

9/11/2013 B38 0.17

15/11/2013 B39 0.12 H20 1.97

21/11/2013 B40 0.05

27/11/2013 B41 0.05 H21 0.05

3/12/2013 B42 0.05

9/12/2013 B43 0.05 H22 0.05

15/12/2013 B44 0.12

21/12/2013 B45 0.05 H23 0.05

27/12/2013 B46 0.11

2/01/2014 B47 0.05 H24

8/01/2014 B48 0.05

14/01/2014 B49 0.17 H25 0.05

20/01/2014 B50 0.05

26/01/2014 B51 0.05 H26 0.05

1/02/2014 B52 0.13

7/02/2014 B53 H27 0.27

13/02/2014 B54 0.05 H28 0.20

19/02/2014 B55 0.05 H29 0.13

25/02/2014 B56 0.28 H30 0.31

3/03/2014 B57 0.13 H31 0.29

9/03/2014 B58 0.05 H32 0.16

15/03/2014 B59 0.05 H33 0.14

21/03/2014 B60 0.32 H34 0.36

27/03/2014 B61 0.11 H35 0.05

2/04/2014 B62 0.50 H36 0.45

8/04/2014 B63 0.56 H37 0.40

14/04/2014 B64 1.06 H38 0.27

20/04/2014 B65 0.54 H39 0.05

26/04/2014 B66 0.65 H40 0.05

2/05/2014 B67 0.82 H41 0.05

8/05/2014 B68 0.23 H42 0.05

0 Bijlagen

BIJLAGE 5: AMES II

Aantal revertante kolonies na blootstelling van S98 stam aan 20 m3 lucht-equivalent in de af- en aanwezigheid van de metaboliserende fractie S9. Borgerhout

Test item In de afwezigheid van S9 Test item In de aanwezigheid S9

Revertant aantal Revertant aantal

Per 48 wells Gemiddeld

e +/- SD Per 48 wells Gemiddeld

e +/- SD

Solvent controle 2 Solvent controle 12

DMSO 4 3.67 +/-

1.53

DMSO 2 6.00 +/- 5.29

5 4

37 15

B2 28 33.33 +/-

4.73

B2 11 12.00 +/- 2.65

35 10

13 6

B3 15 14.67 +/-

1.53

B3 3 3.67 +/- 2.08

16 2

24 5

B4 22 20.67 +/-

4.16

B4 6 5.33 +/- 0.58

16 5

45 15

B5 31 38.33 +/-

7.02

B5 10 12.67 +/- 2.52

39 13

15 5

B6 15 17.00 +/-

3.46

B6 9 7.00 +/- 2.00

21 7

Solvent controle 4 Solvent controle 3

DMSO 3 2.33 +/-

2.08

DMSO 4 3.67 +/- 0.58

0 4

41 15

B7 42 41.00 +/-

1.00

B7 19 18.00 +/- 2.65

40 20

20 6

B8 12 15.67 +/-

4.04

B8 3 4.00 +/- 1.73

15 3

20 6

Literatuurlijst

B9 14 15.33 +/-

4.16

B9 6 6.00 +/- 0.00

12 6

22 5

B11 24 25.33 +/-

4.16

B11 10 6.00 +/- 3.61

30 3

20 4

B12 23 20.67 +/-

2.08

B12 10 5.00 +/- 4.58

19 1

Solvent controle 2 Solvent controle 0

DMSO 0 1.33 +/-

1.15

DMSO 3 1.67 +/- 1.53

2 2

7 6

B13 11 11.00 +/-

4.00

B13 5 5.00 +/- 1.00

15 4

33 22

B14 32 35.67 +/-

5.51

B14 18 19.33 +/- 2.31

42 18

15 9

B16 14 13.67 +/-

1.53

B16 3 6.33 +/- 3.06

12 7

6 2

B18 5 7.67 +/-

3.79

B18 4 3.33 +/- 1.15

12 4

18 8

B22 9 16.33 +/-

6.66

B22 2 5.67 +/- 3.21

22 7

6 5

B23 12 9.67 +/-

3.21

B23 6 4.33 +/- 2.08

11 2

Solvent controle 0 Solvent controle 3

DMSO 0 0.33 +/-

0.58

DMSO 3 2.33 +/- 1.15

1 1

24 7

B17 26 26.33 +/-

2.52

B17 3 5.33 +/- 2.08

29 6

23 8

B19 22 23.00 +/-

1.00

B19 2 5.00 +/- 3.00

0 Bijlagen

24 5

28 8

B20 35 32.67 +/-

4.04

B20 8 8.33 +/- 0.58

35 9

13 2

B21 12 13.67 +/-

2.08

B21 6 3.00 +/- 2.65

16 1

17 3

B24 11 16.67 +/-

5.51

B24 4 4.00 +/- 1.00

22 5

4 4

B25 4 5.00 +/-

1.73

B25 3 3.67 +/- 0.58

7 4

Solvent controle 1 Solvent controle 3

DMSO 1 1.00 +/-

0.00

DMSO 0 1.67 +/- 1.53

1 2

38 13

B26 40 36.33 +/-

4.73

B26 10 12.33 +/- 2.08

31 14

27 9

B27 34 30.33 +/-

3.51

B27 12 9.00 +/- 3.00

30 6

7 5

B29 8 7.33 +/-

0.58

B29 0 3.67 +/- 3.21

7 6

43 17

B31 44 42.67 +/-

1.53

B31 17 18.00 +/- 1.73

41 20

25 16

B32 27 26.67 +/-

1.53

B32 17 16.33 +/- 0.58

28 16

Solvent controle 1 Solvent controe: 1

DMSO 1 1.33 +/-

0.58

DMSO 1 1.00 +/- 0.00

2 1

16 8

B33 15 15.33 +/-

0.58

B33 11 8.67 +/- 2.08

15 7

45 36

Literatuurlijst

B34 47 46.33 +/-

1.15

B34 19 26.67 +/- 8.62

47 25

30 10

B35 26 27.33 +/-

2.31

B35 12 10.00 +/- 2.00

26 8

12 8

B36 10 11.33 +/-

1.15

B36 7 6.00 +/- 2.65

12 3

30 12

B38 30 29.67 +/-

0.58

B38 10 10.00 +/- 2.00

29 8

Solvent controle 5 Solvent controle 3

DMSO 2 3.00 +/-

1.73

DMSO 5 4.33 +/- 1.15

2 5

45 34

B39 47 44.33 +/-

3.06

B39 29 31.67 +/- 2.52

41 32

46 29

B40 48 47.00 +/-

1.00

B40 33 28.67 +/- 4.51

47 24

48 46

B41 48 47.33 +/-

1.15

B41 44 44.33 +/- 1.53

46 43

47 42

B42 45 46.00 +/-

1.00

B42 45 43.00 +/- 1.73

46 42

47 43

B43 47 46.33 +/-

1.15

B43 45 43.33 +/- 1.53

45 42

44 25

B44 42 42.00 +/-

2.00

B44 27 25.33 +/- 1.53

40 24

Solvent controle 3 Solvent controle 5

DMSO 1 2.33 +/-

1.15

DMSO 3 2.67 +/- 2.52

3 0

41 15

B45 28 34.67 +/-

6.51

B45 11 15.00 +/- 4.00

0 Bijlagen

35 19

26 11

B46 24 24.67 +/-

1.15

B46 13 10.67 +/- 2.52

24 8

32 10

B47 28 30.67 +/-

2.31

B47 7 10.67 +/- 4.04

32 15

43 25

B48 36 39.67 +/-

3.51

B48 24 24.00 +/- 1.00

40 23

46 27

B49 41 43.00 +/-

2.65

B49 35 31.33 +/- 4.04

42 32

46 37

B50 46 45.67 +/-

0.58

B50 37 36.67 +/- 0.58

45 36

43 24

B51 32 39.00 +/- 6.08 B51 22 21.67 +/- 2.52

42 19

Solvent controle 2 Solvent controle 0

DMSO 0 1.33 +/-

1.15

DMSO 3 1.67 +/- 1.53

2 2

37 5

B52 34 36.00 +/- 1.73 B52 13 12.00 +/- 6.56

37 18

Solvent controle 1 Solvent controle 1

DMSO 1 1.00 +/-

0.00

DMSO 0 1.00 +/- 1.00

1 2

42 30

B54 44 42.67 +/-

1.15

B54 32 28.67 +/- 4.16

42 24

48 37

B55 46 45.67 +/-

2.52

B55 40 36.67 +/- 3.51

43 33

34 13

B56 36 33.67 +/-

2.52

B56 10 12.00 +/- 1.73

31 13

37 18

Literatuurlijst

B57 32 36.00 +/-

3.61

B57 13 15.67 +/- 2.52

39 16

Solvent controe: 1 Solvent controle 1

DMSO 0 0.33 +/-

0.58

DMSO 0 1.00 +/- 1.00

0 2

47 43

B58 47 47.00 +/-

0.00

B58 42 42.67 +/- 0.58

47 43

41 27

B59 38 37.67 +/-

3.51

B59 22 24.33 +/- 2.52

34 24

37 18

B60 42 40.00 +/-

2.65

B60 19 18.33 +/- 0.58

41 18

47 39

B61 47 47.00 +/-

0.00

B61 31 34.33 +/- 4.16

47 33

46 33

B62 48 46.33 +/-

1.53

B62 33 31.67 +/- 2.31

45 29

12 8

B63 14 12.33 +/-

1.53

B63 5 6.00 +/- 1.73

11 5

12 6

B64 15 12.33 +/- 2.52 B64 5 5.00 +/- 1.00

10 4

Solvent controle 0 Solvent controle 0

DMSO 0 0.67 +/-

1.15

DMSO 1 0.33 +/- 0.58

2 0

38 38

B65 46 43.33 +/-

4.62

B65 37 36.00 +/- 2.65

46 33

25 3

B66 20 21.00 +/-

3.61

B66 6 4.33 +/- 1.53

18 4

16 5

B67 16 14.33 +/-

2.89

B67 4 4.00 +/- 1.00

0 Bijlagen

11 3

16 3

B68 6 9.33 +/-

5.77

B68 1 2.33 +/- 1.15

6 3

Houtem

Test item In de afwezigheid vanf S9 Test item In de aanwezigheid S9

Revertant aantal Revertant aantal

Per 48 wells Gemiddeld

e +/- SD Per 48 wells Gemiddeld

e +/- SD

Solvent controle 0 Solvent controle 1

DMSO 2 1.33 +/-

1.15

DMSO 1 1.67 +/- 1.15

2 3

8 1

H2 12 12.33 +/-

4.51

H2 3 2.00 +/- 1.00

17 2

5 0

H5 2 3.33 +/-

1.53

H5 2 1.33 +/- 1.15

3 2

3 1

H7 2 3.00 +/-

1.00

H7 3 2.00 +/- 1.00

4 2

0 1

H8 1 0.67 +/-

0.58

H8 1 1.33 +/- 0.58

1 2

Solvent controle 0 Solvent controle 1

DMSO 1 0.67 +/-

0.58

DMSO 1 0.67 +/- 0.58

1 0

8 3

H10 8 8.33 +/-

0.58

H10 1 2.00 +/- 1.00

9 2

3 6

H11 2 2.00 +/-

1.00

H11 3 4.33 +/- 1.53

1 4

3 4

H12 7 4.33 +/-

2.31

H12 2 2.33 +/- 1.53

3 1

28 10

Literatuurlijst

H13 26 26.33 +/-

1.53

H13 11 10.33 +/- 0.58

25 10

40 14

H14 42 41.33 +/-

1.15

H14 14 15.67 +/- 2.89

42 19

Solvent controle 1 Solvent controle 2

DMSO 0 0.67 +/-

0.58

DMSO 2 1.67 +/- 0.58

1 1

47 22

H16 48 47.33 +/-

0.58

H16 17 20.00 +/- 2.65

47 21

4 2

H17 4 3.67 +/-

0.58

H17 2 3.00 +/- 1.73

3 5

10 4

H20 7 7.67 +/-

2.08

H20 6 4.67 +/- 1.15

6 4

48 41

H21 48 47.67 +/-

0.58

H21 44 44.00 +/- 3.00

47 47

48 36

H22 48 47.00 +/-

1.73

H22 32 35.33 +/- 3.06

45 38

31 9

H23 36 32.67 +/-

2.89

H23 4 8.00 +/- 3.61

31 11

Solvent controle 1 Solvent controle 5

DMSO 1 1.00 +/-

0.00

DMSO 4 3.67 +/- 1.53

1 2

44 20

H25 45 42.00 +/-

4.36

H25 24 21.33 +/- 2.31

37 20

11 5

H26 12 11.33 +/-

0.58

H26 6 4.67 +/- 1.53

11 3

31 14

H27 28 28.67 +/-

2.08

H27 10 12.00 +/- 2.00

0 Bijlagen

27 12

23 2

H28 21 19.67 +/-

4.16

H28 5 3.00 +/- 1.73

15 2

30 8

H29 36 33.67 +/-

3.21

H29 20 10.67 +/- 8.33

35 4

36 12

H30 37 36.67 +/-

0.58

H30 12 12.00 +/- 0.00

37 12

30 7

H31 22 25.00 +/-

4.36

H31 9 5.67 +/- 4.16

23 1

Solvent controle 2 Solvent controle 12

DMSO 4 3.67 +/-

1.53

DMSO 2 6.00 +/- 5.29

5 4

34 11

H32 28 30.67 +/-

3.06

H32 10 9.67 +/- 1.53

30 8

Solvent controle 0 Solvent controle 0

DMSO 0 +/-

1.15

DMSO 1 +/- 0.58

2 0

28 19

H33 27 26.33 +/-

2.08

H33 19 17.33 +/- 2.89

24 14

8 10

H34 7 9.00 +/-

2.65

H34 5 5.67 +/- 4.04

12 2

43 23

H35 42 41.00 +/- 2.65 H35 18 20.33 +/- 2.52

38 20

Solvent controle 1 Solvent controle 3

DMSO 0 1.67 +/-

2.08

DMSO 3 2.33 +/- 1.15

4 1

47 36

H36 47 46.67 +/-

0.58

H36 25 28.00 +/- 7.00

46 23

10 6

Literatuurlijst

H37 4 6.00 +/-

3.46

H37 5 4.33 +/- 2.08

4 2

8 1

H38 8 8.67 +/-

1.15

H38 6 4.33 +/- 2.89

10 6

48 43

H39 48 48.00 +/-

0.00

H39 43 42.00 +/- 1.73

48 40

18 7

H40 26 20.33 +/-

4.93

H40 5 5.00 +/- 2.00

17 3

18 8

H41 11 11.00 +/-

7.00

H41 6 7.33 +/- 1.15

4 8

Solvent controle 7 Solvent controle 4

DMSO 4 4.67 +/-

2.08

DMSO 7 5.00 +/- 1.73

3 4

8 7

H42 9 6.67 +/-

3.21

H42 3 3.67 +/- 3.06

3 1

Zelzate

Test item In de afwezigheid van S9 Test item In de aanwezigheid van S9

Revertant aantal Revertant aantal

Per 48 wells Gemiddeld

e +/- SD Per 48 wells

Gemiddelde

+/- SD

Solvent controle 7 Solvent controle 4

DMSO 4 4.67 +/- 2.08

DMSO 7 5.00

+/- 1.73

3 4

48 33

GZ1 48 48.00 +/- 0.00

GZ1 31 33.67

+/- 3.06

48 37

17 6

GZ2 25 17.33 +/- 7.51

GZ2 5 5.67

+/- 0.58

10 6

24 6

GZ3 29 26.67 +/- 2.52

GZ3 11 8.33

+/- 2.52

27 8

0 Bijlagen

27 7

GZ4 24 24.00 +/- 3.00 GZ4 4 6.33 +/- 2.08

21 8

Solvent controle 3 Solvent controle 1

DMSO 6 3.33 +/- 2.52

DMSO 0 1.00

+/- 1.00

1 2

30 23

GZ 5 30 29.00 +/- 1.73

GZ 5 23 20.00

+/- 5.20

27 14

29 15

GZ 6 28 28.00 +/- 1.00

GZ 6 14 14.33

+/- 0.58

27 14

35 8

GZ 7 28 31.67 +/- 3.51

GZ 7 5 7.00

+/- 1.73

32 8

18 5

GZ 8 32 26.00 +/- 7.21

GZ 8 4 5.67

+/- 2.08

28 8

44 35

GZ 9 40 43.00 +/- 2.65

GZ 9 29 29.67

+/- 5.03

45 25

Literatuurlijst

BIJLAGE 6: KOMEETTEST

% DNA migratie (staartlengte) na blootstelling van Beas-B cellen bij 100µg PM10/ml. Eén meting per staal. Waarde is gemiddelde van minstens 50 geanalyseerde cellen.

Datum Borgerhout

Houtem

Netto ox schade

Netto ox schade

Filtercode

met enzyme

zonder enzyme

met-zonder Filtercode

met enzyme

zonder enzyme

met-zonder

1/04/2013 B1

H1 7/04/2013 B2 54.79 6.67 48.12

13/04/2013 B3

H2 10.83 7.778 3.052

19/04/2013 B4 25/04/2013 B5 42.417 16.264 26.153 H3

1/05/2013 B6 36.469 22.61 13.859 7/05/2013 B7 28.787 19.872 8.915 H4

13/05/2013 B8 18.722 12.76 5.962 19/05/2013 B9 32.34 12.287 20.053 H5

25/05/2013 B10 31/05/2013 B11

H6 6/06/2013 B12 45.492 16.874 28.618

12/06/2013 B13 62.685 22.625 40.06 H7 46.36 29.44 16.92

18/06/2013 B14 45.478 14.442 31.036 24/06/2013 B15

H8

30/06/2013 B16 55.384 4.563 50.821 6/07/2013 B17 30.538 11.909 18.629 H9

12/07/2013 B18 48.969 14.031 34.938 18/07/2013 B19

H10

24/07/2013 B20 30/07/2013 B21 27.505 8.132 19.373 H11

5/08/2013 B22 11/08/2013 B23

H12 17/08/2013 B24

23/08/2013 B25

H13 29/08/2013 B26 17.449 11.438 6.011

4/09/2013 B27

H14 10/09/2013 B28

16/09/2013 B29 46.673 2.55 44.123 H15 22/09/2013 B30

28/09/2013 B31

H16 4/10/2013 B32

10/10/2013 B33

H17 62.96 7.991 54.969

16/10/2013 B34

0 Bijlagen

22/10/2013 B35

H18 28/10/2013 B36

3/11/2013 B37 27.592 26.942 0.65 H19 9/11/2013 B38

15/11/2013 B39 46.028 15.588 30.44 H20 21/11/2013 B40

27/11/2013 B41 44.574 29.648 14.926 H21 72.477 10.279 62.198

3/12/2013 B42 9/12/2013 B43 63.335 30.33 33.005 H22 62.909 12.012 50.897

15/12/2013 B44 64.487 8.158 56.329 21/12/2013 B45 45.265 15.191 30.074 H23 58.862 6.076 52.786

27/12/2013 B46 50.881 15.163 35.718 2/01/2014 B47 50.984 10.928 40.056 H24

8/01/2014 B48 44.373 24.226 20.147 14/01/2014 B49

H25 69.166 10.474 58.692

20/01/2014 B50 35.032 7.716 27.316 26/01/2014 B51 43.655 20.685 22.97 H26 55.392 9.041 46.351

1/02/2014 B52 40.862 20.702 20.16 7/02/2014 B53

H27 54.252 7.131 47.121

13/02/2014 B54 49.149 6.662 42.487 H28 19/02/2014 B55 35.256 11.023 24.233 H29 47.784 8.753 39.031

25/02/2014 B56 31.629 8.471 23.158 H30 69.211 9.714 59.497

3/03/2014 B57 53.395 37.145 16.25 H31 54.699 10.718 43.981

9/03/2014 B58 57.56 21.549 36.011 H32 54.833 12.248 42.585

15/03/2014 B59

H33 55.412 42.882 12.53

21/03/2014 B60 56.376 14.608 41.768 H34 77.53 45.243 32.287

27/03/2014 B61 47.916 5.938 41.978 H35 2/04/2014 B62 40.187 8.48 31.707 H36 44.678 6.314 38.364

8/04/2014 B63 55.717 8.732 46.985 H37 50.188 13.496 36.692

14/04/2014 B64 67.259 33.394 33.865 H38 46.674 30.282 16.392

20/04/2014 B65 60.856 17.512 43.344 H39 43.94 20.239 23.701

26/04/2014 B66 59.423 17.435 41.988 H40 2/05/2014 B67 45.801 11.328 34.473 H41 8/05/2014 B68 47.011 24.376 22.635 H42 47.403 22.157 25.246

Datum Zelzate

Netto ox schade

Filtercode met enzyme zonder enzyme met-zonder

7/04/2013 Z1 33.489 6.237 27.252

8/04/2012 Z2 43.347 3.945 39.402

10/04/2013 Z3 35.6 3.786 31.814

21/05/2013 Z4 45.518 7.567 37.951

24/05/2013 Z5

27/05/2013 Z6 33.152 4.371 28.781

Literatuurlijst

26/08/2013 Z7

7/10/2013 Z8 33.12 8.368 24.752

20/10/2013 Z9 46.858 6.992 39.866

27/10/2013 Z10 30.843 3.063 27.78

28/10/2013 Z11 39.642 7.899 31.743

20/11/2013 Z12 68.293 8.705 59.588

24/11/2013 Z13 79.164 11.594 67.57

28/01/2014 Z14 70.622 17.119 53.503

0 Bijlagen

BIJLAGE 7: ERE TEST

Datum

Zelzate Houtem

pg E2eq/m³ SE toxische df pg E2eq/m³ SE toxische df

4/04/2013 celdood 7 celdood 10

10/04/2013 celdood 6

16/04/2013 0.076 0.009 3 0.021 0.006 2

22/04/2013 0.027 6 0.008 0.003 2

28/04/2013 0.008 0.003 3 0.008 0.003 0

4/05/2013 0.035 0.004 2 0.008 0.003 1

10/05/2013 0.023 0.009 4

16/05/2013 0.034 0.010 0

22/05/2013 0.023 0.005 1 0.163 0.017 2

28/05/2013 0.039 0.006 3 0.027 0.003 1

3/06/2013 0.045 0.006 2 0.091 0.013 2

9/06/2013 0.080 0.012 5 0.023 0.010 0

15/06/2013 0.036 0.023 1 0.027 0.003 2

21/06/2013 0.053 0.008 1 0.019 0.007 4

27/06/2013

3/07/2013 0.008 0.003 2 0.031 0.006 0

9/07/2013 0.022 0.005 5 0.024 0.005 1

15/07/2013 celdood 7 celdood 10

21/07/2013 0.022 0.005 1 0.046 0.029 7

27/07/2013 0.029 0.007 1 0.069 0.017 6

2/08/2013 0.054 0.014 6 0.048 0.008 2

8/08/2013 0.030 0.006 5 0.008 0.003 4

14/08/2013 0.054 0.017 1 0.008 0.003 4

20/08/2013 0.042 0.005 3 0.036 0.005 5

26/08/2013

1/09/2013 0.021 0.003 2 0.008 0.003 1

7/09/2013 0.008 0.003 1 0.008 0.003 2

13/09/2013 celdood 5

19/09/2013 0.008 0.003 2 0.008 0.003 0

25/09/2013 0.008 0.003 4 celdood 4

1/10/2013 0.031 0.006 5 celdood 6

7/10/2013 0.034 0.006 2

13/10/2013

19/10/2013 0.023 0.003 4

25/10/2013 0.021 0.002 4

31/10/2013 0.075 0.009 4

6/11/2013 0.008 0.003 5

12/11/2013 0.168 0.018 7

Literatuurlijst

18/11/2013 0.032 8 <Pr blank probleem toestel?

24/11/2013 <Pr blank probleem toestel?

30/11/2013 0.138 0.016 6 <Pr blank probleem toestel?

6/12/2013 0.079 0.008 3 <Pr blank probleem toestel?

12/12/2013 0.151 8 0.093 8

18/12/2013 0.052 0.007 5 0.057 0.007 3

24/12/2013 celdood 4 0.067 0.009 2

30/12/2013 0.047 0.005 0

5/01/2014 0.032 0.006 2

8/01/2014 0.048 0.012 3

11/01/2014 0.096 0.005 7 0.062 0.009 5

17/01/2014 0.019 0.003 5 0.035 0.006 3

20/01/2014 0.037 8 0.167 0.031 6

23/01/2014 0.008 0.003 4

29/01/2014 0.008 0.003 4

waarden in groen: onder procedure blanco (helft van mediaan gebruikt in tabel)

grijs: geen staal

rood: waarschijnlijk niet gesampeld Pr blank=procedure blanco filter