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찰스리버엔도세이프코리아㈜ Korean Endosafe Times Vol1, No.1 July, 2007 www.endosafe.kr , Tel : 02)2057-5200, Fax : 02)2057-5203 1 Vol 1, No.1 July, 2007 찰스리버엔도세이프코리아㈜, 서울시 서초구 양재동 333-5 한아름빌딩 6층, T:02)2057-5200, F:02)2057-5203 새로운 Endosafe Time를 발간하며. 안녕하십니까? 찰스리버엔도세이프코리아 입니다. 이번에 새롭게 여러분을 엔도세이프타임즈를 통하여 만나 뵙게 되었습니다. 앞으로 좋은 제품과 더 빠르고 최선을 다하는 기술지원을 드릴 것을 약속 드립니다. 감사합니다. –찰스리버엔도세이프코리아 직원일동- 대표이사 인사말 Hello Korean customers, I’m Foster T. Jordan, representative director of Charles River Endosafe Korea. 한국의 고객 여러분 안녕하십니까? 저는 찰스리버엔도세이프코리아의 대표이사 포스터 조단이라고 합니다. I am pleased to welcome the newly established Charles River Endosafe Korea to the Charles River Laboratories family. 저는 Charles River Laboratories의 가족으로 새롭게 설립된 찰스리버 엔도세 이프 코리아를 환영하게 되어 기쁩니다. This new, state-of-the-art Korean facility will directly supply Endosafe® products to our customers, ensuring rapid product availability and direct communication with our efficient Korean Customer Service staff. 이 새로운 한국회사는 엔도세이프의 모든 제품을 직접 고객 여러분께 공급해 드림 으로써, 제품의 보다 빠르고 원활한 공급, 그리고 우리 한국지사의 고객지원 부서를 통해 엔도세 이프 고객간의 보다 효율적인 의사 소통을 직접 전해 드릴 것입니다. Customers will also receive expert technical support from our in-house Technical Assistance team who has considerable experience with LAL methodology. 여러분은 또한 LAL 시험법에 많은 경험 을 가진 우리 본사의 기술지원 팀으로부터도 전문적인 기술지원을 받을 실 수 있습니다. Our Managing Director, Mr. Hongjin Min, will ensure that Korean customers receive a great deal of

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찰스리버엔도세이프코리아㈜ Korean Endosafe Times Vol1, No.1 July, 2007

www.endosafe.kr, Tel : 02)2057-5200, Fax : 02)2057-5203 1

Vol 1, No.1 July, 2007

찰스리버엔도세이프코리아㈜, 서울시 서초구 양재동 333-5 한아름빌딩 6층, T:02)2057-5200, F:02)2057-5203

새로운 Endosafe Time를 발간하며.

안녕하십니까? 찰스리버엔도세이프코리아 입니다. 이번에 새롭게 여러분을 엔도세이프타임즈를

통하여 만나 뵙게 되었습니다. 앞으로 좋은 제품과 더 빠르고 최선을 다하는 기술지원을 드릴

것을 약속 드립니다. 감사합니다. –찰스리버엔도세이프코리아 직원일동-

대표이사 인사말

Hello Korean customers, I’m Foster T. Jordan, representative director of Charles River Endosafe

Korea. 한국의 고객 여러분 안녕하십니까? 저는 찰스리버엔도세이프코리아의 대표이사 포스터

조단이라고 합니다.

I am pleased to welcome the newly established Charles River Endosafe Korea to the Charles River

Laboratories family. 저는 Charles River Laboratories의 가족으로 새롭게 설립된 찰스리버 엔도세

이프 코리아를 환영하게 되어 기쁩니다.

This new, state-of-the-art Korean facility will directly supply Endosafe® products to our customers,

ensuring rapid product availability and direct communication with our efficient Korean Customer

Service staff. 이 새로운 한국회사는 엔도세이프의 모든 제품을 직접 고객 여러분께 공급해 드림

으로써, 제품의 보다 빠르고 원활한 공급, 그리고 우리 한국지사의 고객지원 부서를 통해 엔도세

이프 고객간의 보다 효율적인 의사 소통을 직접 전해 드릴 것입니다.

Customers will also receive expert technical support from our in-house Technical Assistance team

who has considerable experience with LAL methodology. 여러분은 또한 LAL 시험법에 많은 경험

을 가진 우리 본사의 기술지원 팀으로부터도 전문적인 기술지원을 받을 실 수 있습니다.

Our Managing Director, Mr. Hongjin Min, will ensure that Korean customers receive a great deal of

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www.endosafe.kr, Tel : 02)2057-5200, Fax : 02)2057-5203 2

attention and consideration. His extensive knowledge of endotoxins and proficiency with LAL test

methods is highly regarded in the industry. His business and technical skills will bring a great deal

of enhanced and focused support to our Asian customers. 우리 한국지사의 지사장인 민홍진씨는

한국 고객분들이 많은 관심과 고려를 받을 수 있도록 해 줄 것입니다. 그의 엔도톡신에 관련된

광범위한 지식과 LAL 시험방법에 대한 숙련은 제약업계에서 높게 평가되고 있습니다. 또한 그의

영업에서의 기술은 우리의 아시아 고객들에 대한 더 발전되고, 집중적인 지원을 가져다 줄 것입

니다.

I personally am delighted to see a dream come true in the opening of the Endosafe Korea facility.

I could not be more impressed by the technical expertise and dedication of the staff. I feel

fortunate that our customers will have direct access to the broad portfolio of Endosafe® products

and will receive unmatched technical and customer support. 저는 개인적으로 엔도세이프코리아

설립의 꿈이 실현된 것을 보게 되어 기쁩니다. 저는 우리 직원들의 기술적 전문성과 헌신에 아

주 깊은 감명을 받았습니다. 저는 우리의 고객들이 다양한 엔도세이프 제품에 직접 접근할 수 있

고, 무궁무진한 지술지원과 고객지원을 해드릴 수 있는 것에 대해 행운으로 느끼고 있습니다.

Foster T. Jordan

Corporate Vice President, In Vitro Products & Services

대표이사, 찰스리버엔도세이프코리아㈜

ENDOSAFETIMES를 발간하면서..

James F. Cooper, Ph.D., consultant

이번 엔도세이프타임즈에서는 초창기의 발열성 실험에서부터 최근의 가장 진보적인

엔도톡신(endotoxin) 실험방법인 Endosafe-PTS에 대해서 전반적으로 다루고자 합니다.

이번 호에는 Marly Weary씨가 저서한 정맥주사제의 발달과 함께 이루어진 발열성 실험에 대한

복잡하고 긴 얘기들을 간단하게 요약하여 싣게 되었습니다.

정맥을 통해 약을 투여하는 것에 대해서는 거의 4세기 동안 연구가 이루어진 반면에 발열성

실험에 관한 퍼즐은 주사제의 안정성과 관련한 것에서 시작합니다. 정맥 주사와 관련한 발열

현상이나 심장마비가 박테리아로부터 유래되는 발열성 물질에 의한 것일 수 있음을 인식하면서

물에서 발열성 물질을 제거하는 방법과 토끼 실험을 통해 주사제의 안정성을 실험하는 방법이

개발되었습니다. 현재 우리가 알고 있는 발열성 실험이 최근에 들어서야 이루어지기 시작했다는

것은 믿기 힘든 사실입니다.

LAL test의 출현은 발열성 물질 실험이라는 퍼즐의 마지막 조각이라고 할 수 있습니다. 이는 LAL

실험이 주사용 약의 처음 생산 단계부터 최종 제품 생산까지 엔도톡신(endotoxin)을 모니터

하기에 간단하고, 민감하며, 명확한 방법이기 때문입니다.

앞서 발표했듯이 LAL 시약이 들어있는 카트리지(cartridge)를 장착하여 실험하는 Endosafe-PTS는

작년에 FDA승인을 받았습니다. LAL 실험을 하는 모든 제품에 대해 PTS를 사용하여 LAL실험을 할

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www.endosafe.kr, Tel : 02)2057-5200, Fax : 02)2057-5203 3

수 있습니다. PTS는 LAL 실험을 함으로서 다른 박테리아 엔도톡신 시험(Bacterial Endotoxin Test-

BET)이 가지는 실험 결과의 다양성에 영향을 미치는 여러 요인들이 배제된 상태에서

엔도톡신(endotoxin) 시험을 가능하게 했습니다. PTS를 사용하여 실험할 경우 특별한 실험적

기술이 요구되지 않습니다. 이미 LAL 실험을 하고 있는 실험실의 경우 PTS라는 새로운 실험법을

사용함에 있어 수행해야 하는 validation은 아주 간단합니다. 제품에 대한 간섭이나 특성은 이미

LAL 실험을 통해 실험한 자료가 있으므로 제품에 대한 예비시험(screening)을 다시 수행할 필요가

없습니다. 단지 이미 설정된 농도나 희석배수에서 각 제품에 대해 제품의 3lot를 PTS를 이용하여

실험을 하여 PPC(Positive Product Control)의 회수율(recovery %)이 범위 안에 나오면 됩니다.

물론 여기서 말하는 validation이란 실험법 자체의 validation이 아닌 제품에 대한 PTS의 적합성

실험(suitability test)을 의미합니다. Laboratory Notebook(실험에 관한 구체적인 사례 및 설명)에

기존의 방법을 대체하는 실험법으로서 그리고 새로운 박테리아 엔도톡신 시험(Bacterial Endotoxin

Test-BET)으로서 Endosafe-PTS를 이용하여 validation을 수행하는 과정을 자세하세 정리해

놓았습니다.

발열성 물질과 발열성 실험 역사에 관한

짧은 이야기..

Marlys Weary, MERIT Consulting Services

발열성 물질(pyrogen)이란 사람이나 포유동물의

혈액에 일정 양 이상이 들어갔을 때 열을 일으키는

물질을 이르는 말입니다. 그러므로 정맥 내로 약을

투여하는 치료법의 역사와 발열성 물질의 연구의

역사는 서로 접한 관련이 있습니다.1 Willian Hervey 박사의 혈액의 순환에 대한 연구를

시작으로 정맥 내로 약을 투여하는 치료법의 역사는 1600년대 초반으로 거슬러 올라갑니다.

1656년 Christopher 박사의 실험에 의해 혈액 시스템을 이용하여 약을 투여할 수 있는 가능성이

증명되었습니다. Christopher 박사는 돼지 방광에 와인, 맥주, 모르핀 등을 담은 후 거위 깃털을

꽂아 개의 혈관에 주사하는 실험을 하였습니다.2 그리고 얼마 안 있어 1670년에 네덜란드

Clymatica Nova라는 저널에 정맥의 흐름에 대한 묘사와 사람의 팔과 다리에 약물을 주사하는

기술에 관한 글이 기재되었습니다.3 그 후 18세기에서 19세기 초반에 이르기까지 의학계에서는

정맥주사 치료에 관한 많은 연구가 이루어졌습니다. 그러나 이러한 치료 방법을 통해 치료받은

환자들에게서는 항상 발열 현상이 나타났습니다. 실질적으로 정맥주사를 통한 치료는 환자에게

열을 일으키기 위해 종종 일부러 투여하기도 했습니다. 이는 발열현상이 몸의 면역체계가 병과

싸우는 과정에서 발생하는 이로운 현상이라고 생각했기 때문입니다.

의사들은 정맥주사를 통한 치료 방법이 환자들에게 열을 일으킨다는 것을 알고는 있었으나,

어떠한 메커니즘(mechanism)에 의해 열이 일어나는지는 몰랐습니다. 단지 이러한 열이 수술한

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부위가 부패하거나 상처에 의해 조직이 드러났을 때 발생하는 상처에 의한 열이거나 혈액의

부패에 의한 열이라고만 알려져 있었습니다. 그래서 의사들은 발열 물질(pyrogen)이 발효나

부패에 의해 조직에서 생성되는 것이라고 추측했습니다. 그 후 루이 파스퇴르(Louis Pateur, 1822-

1895)가 미생물이 발효나 부패를 일으키는 감염 물질이라는 사실을 발견함으로서, 발열

물질(pyrogen)은 미생물과 관련이 있거나 미생물 자체의 어느 부분일 것이라는 또 다른 가설이

생겨났습니다.

1899년 Roussy는 그람 음성 균(Gram-negative bacteria)에서 열을 일으키는 물질을 효과적으로

분리해냈습니다.4 5년 뒤 Centanni는 대장균(E. coli), 장티푸스 균(typhoid)을 포함하여 크고 다양한

박테리아에서 발열 물질을 효과적으로 추출해 냈습니다.5 또한 Centanni는 박테리아에 근원 하는

발열물질(pyrogen)들이 단백질이 아니며 열에 안정적이라는 사실도 밝혀냈습니다. 1912년 Hort와

Penfold는 주사에 의한 발열 현상의 특성에 관한 연구 논문을 발표하였습니다.6,7,8 이들 과학자는

발열에 대한 분석법을 표준화 시키기 위해 토끼를 이용하였습니다. 그리고 나서 다양한 종류의

박테리아를 이용하여 각 박테리아 종류별로 열을 일으키는 정도를 실험하였으며, 덴마크 의사인

Hans Christian Gram이 1814년 고안한 그람 염색법을 이용하여 박테리아를 염색했을 때 열을

일으키는 박테리아는 그람 음성 균(Gram-negative bacteria)이며, 그람 양성 균(Gram-positive

bacteria)은 열을 일으키지 않는 다는 사실을 증명했습니다. 또한 그들은 죽은 그람 음성

균(Gram-negative bacteria)도 살아 있는 균과 마찬가지로 발열을 일으킨다는 실험 결과를 통해

정맥 주사에 의한 열은 필터를 통과할 수 있고, 열에 안정적인 박테리아의 물질에서 기인한다고

결론 지었습니다.

불행하게도 Hort와 Penfold의 연구는 그 당시에는 크게 주목 받지 못했습니다. 박테리아 발열

물질과 관련한 연구는 Florence Seibert가 1923년에서 1925년 사이에 수립한 학설이 전형적인

학설로 받아들여지고 있습니다. 이 학설에서 그녀는 정맥 주사에 의한 열은 필터를 통과할 수

있고, 열에 안정적인 그람 음성 균의 구성 성분 혹은 현재 우리가 박테리아 엔도톡신이라고

부르는 물질에 기인 한다고 결론 지었습니다.9,10,11 Seibert는 시카고 대학 병원의 약사로서 정맥

주사제를 안전하게(주사 발열에 대한 토끼 실험을 통과할 수 있게) 계속적으로 생산하는 방법을

성공적으로 개발하였습니다. 12,13 그녀가 개발한 방법은 병원 내에서 발열성 물질이 오염되지

않은 주사제를 일관적으로 생산 가능하게 했으며, 이를 통해 환자에게 안전하게 투여될 수

있었습니다. 그녀의 제조 공법은 제2차 세계대전 직전부터 10년에 걸쳐 대용량수액제(LVP-Large

Volume Parenteral)를 생산하는 회사에도 진출되었습니다.

제 2차 세계대전 당시 대용량수액제의 수요가 급증하면서 이들 상업적 주사 제들의 발열설

물질에 대한 안전성을 검증할 필요가 생겼습니다. 이에 따라 미국 약전에 발열성 물질 실험에

대한 실험법 수록과 관련한 작업이 착수되었습니다. 생물학 시험과 관련한 3개의 소위원회로

구성된 미국 약전 개정 위원회는 발열성 물질에 대한 공동 연구를 시작했습니다. FDA(미국

식약청) 세균 분과에서 슈도모나스(Pseudononas aeruginos)균을 필터 하여 준비한 발열 물질을

이용하여, FDA(미국 식약청), NIH(미국 국립 보건원) 그리고 14개의 제약회사가 공동 연구를

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착수하였습니다. 14,15 이 공동 연구는 토끼 실험법을 이용하였으며, 초기에 Hort와 Penfold 그리고

Seibert와 그녀의 동료들이 했던 실험 방법과 유사합니다. 실험은 많은 수의 토끼에 발열성

물질과 발열성 물질이 오염되지 않은 생리식염수를 모두 투여하여 결과를 비교하였습니다.

연구결과는 1943년에 출판되었으며, 이 연구 결과를 바탕으로 1942년 미국 약전(USP) 12

개정판에 처음으로 발열성 실험에 대한 항목이 기재되었습니다. 시간이 지남에 따라 발열성

실험에 관한 항목은 계속 개선이 되었지만 현재 미국 약전이나 다른 나라들의 발열성 실험법에

관해 개요상에 나와있는 방법은 초기 미국 약전에 실려 있던 토끼 발열성 실험의 기본 방식을

따르고 있습니다. 토끼를 이용한 발열성 시험법은 토끼에 주사제를 주사한 후 주사하기 전과

후의 직장체온을 측정하여, 주사 후 토끼가 열을 내서 설정한 기준 이상으로 체온이 올라갈 경우

이 주사제를 발열성 물질로 판정하는 방법입니다.

현재는 발열 반응이 발열성 물질(pyrogen)이 사람의 순환계로 들어갔을 때 나타나는 다양한 생리

현상 중에 하나라는 것을 알고 있습니다. 그러나 2차 세계대전 당시, 그리고 그 후로 수년 동안

박테리아 엔도톡신을 실험하는데 있어 발열 현상을 실험하는 것이 가장 쉬운 방법이었습니다.

다른 발열성 실험법과 비교하여 토끼를 이용한 발열성 시험법의 가장 큰 장점은 토끼의 발열

현상이 사람이 발열현상과 가장 닮아 있고, 실질적이라는 것입니다. 그러나 토끼를 이용한 발열성

실험은 특정한 한 종류의 발열성 물질에 대해 실험할 수는 없습니다. 토끼는 박테리아 엔도톡신

뿐만 아니라 내인성 사이토카인과 같은 발열성 물질을 포함하여 주사되는 모든 종류의 발열성

물질에 반응합니다. 토끼를 이용한 발열성 실험은 많은 단점이 있습니다. 토끼 실험을 위해서는

토끼를 사육하기 위한 시설이 필요하며, 토끼를 훈련시키고 관리하는 사람, 실험 하는 사람이

필요합니다. 이렇듯 토끼 실험은 비용이 많이 소비 될 뿐 아니라 시간도 오래 걸리고, 실험

자체도 복잡합니다. 토끼 실험법은 어느 특정한 유독성 약이나 열을 억제하는 종류의 약의

실험에는 적용할 수 없습니다. 또한 특정한 종류의 발열성 물질에 대해서는 내성이 생기며, 다른

모든 동물 실험이 그러하듯이 토끼 실험 또한 생물학적 다양성이라고 할 수 있는 반응의

다양성이 나타납니다.

수년 동안 제약 회사들은 토끼 실험법을 대체할 만한 실험 법을 조사하였습니다. 그 결과 찾은

가장 최선의 방법이 일반적으로 LAL test라고 불리는 Limulus amebocyte Lysate 실험법 입니다.

LAL 시험법을 이용한 박테리아 엔도톡신의 실험에 관한 역사 및 이용에 관한 내용은 다음 호

발열성 시험법의 역사에 계속 이어집니다.

참고 문헌(References) 1 Weary, Marlys E., Pyrogens and Pyrogen Testing, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,

Marcel Dekker,Inc., New York, 1996, pp. 179-205 2 Annen, G.l., l.: An exhibition of books on the growth of our knowledge of blood transfusion., Bull.

N. Y. Acad. Med., 15: 622-632(1939) ; cited in Dudrick, S.J., and Rhoads, J.E., JAMA, 215: 923-

949(1971). 3 Macht, S.D., Three hundred years of parenteral nutrition: the history of intravenous nutritional

therapy, Conn. Med., 44(1):27-30 (1980).

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4 Roussy, G., Recherches experimentales, Subtances calorignenes et frigorigenes d’origine

microbienne; Pyretogenine et Frigorigenine, Gaz. Hop., 62: 171 (1889). 5 Centanni, E., Untersuchungen uber das Infektionsfieber, das Fiebergift der Bakterien, Deutsch.

Med. Wochenschr., 20: 148 (1894). 6 Hort, E., and Penfold, W.J., Microorganisms and their relation to fever, J. Hyg., Camb., 12:361-390

(1912). 7 Hort, E., and Penfold, W.J., A critical study of experimental fever, Proc. Roy. Soc. Med. London, Ser.

B., 85:174-186 (1912). 8 Hort, E., and Penfold, W.J., The reaction of salvarson fever to other forms of injection fever, Proc.

Roy. Soc. Med. (PartIII. Pathology), 5 : 131-139 (1912). 9 Seibert, F.B., Fever-producing substances found in some distilled waters, Am. J.Physiol.,67: 90-

104(1923). 10 Seibert, F.B. and Mendel, L.B., Protein fevers. , Am. J.Physiol., 67: 83-89 (1923). 11 Seibert, F.B., The cause of many febrile reactions following intravenous injections, Am. J.Physiol.,

71: 621-651 (1925). 12 Seibert, F.B. and Mendel, L.B., Temperature variations in rabbits, Am. J. Physiol., 63: 83-89 (1923). 13 Seibert, F.B., Pyrogens form an historical viewpoint, Transfusion, 3:245-249 (1963). 14 Welch, H., Calvery, H.D., McClosky, W.T. and Price, C.W., Method of preparation and test for

bacterial pyrogens, J. Am. Pharm. Assoc. 32:65-69 (1943). 15 McClosky, W.T., Price,C.W., Van Winkle, Jr., W.J., Welch, H., and Calvery, H.O., Results of the first

USP collaborative study of pyrogens, J. Am. Pharm. Assoc. 32:69-73 (1943).

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Laboratory Notebook

Endosafe®- PTSTM를 이용한 제품 validation

박테리아 엔도톡신 시험(BET-Bacterial

Endotoxin Test, 미국 약전상의 85장이나

그와 비슷한 약전에 나와 있는 내용)에서의

method validation이란 특정한

제품(제약)이나, 의료 용구의 경우

엔토톡신을 용출한 액의 엔도톡신 실험을

함에 있어 특정한 LAL 시약이나

엔도톡신을 실험하는 시스템이 제품의

구성성분에 의해 간섭을 받지 않는다는

것을 문서화하는 작업을 의미합니다.

Endosafe®- PTSTM 카트리지(cartridge)는

박테리아 엔도톡신을 실험하는 LAL

시스템으로서 2006년 7월에 FDA 승인을

받았습니다. 이 새로운 제품(카트리지-

cartridge)을 이용하여 최종 생산품에 대한

LAL 실험을 하고자 할 경우 박테리아

엔도톡신 시험(BET)상의 광학 분석

예비시험 파트의 광학적 방법을 이용한

간섭인자 확인 시험 법에 따라 제품 validation을 수행해야 합니다. PTS(Portable Test System)는

일종의 정량 분석기기이므로 약전상의 정량 분석 파트를 참조하시면 됩니다.

엔도톡신시험을 하는 추가적인 방법으로서 Endosafe®- PTSTM를 이용한 validation은 아주

간단합니다. Endosafe®- PTSTM를 이용한 validation에는 2가지가 있는데 하나는 이미 validation이

되어 있는 제품을 PTS로 실험하고자 하여 실험방법이 바뀜에 따라 validation을 수행하는 경우고,

다른 하나는 새로운 제품을 validation하고자 하는 경우 입니다. PTS(Portable Test System)를

이용하여 validation을 수행할 경우 정량 분석 법과 같이 제품의 연속된 3lot혹은 제품의 연속된

3lot를 용출한 액을 실험하여 제품 양성 대조(PPC-Positive Product Control)의

회수율(recovery%)이 50~200%사이에 나오면 됩니다. 회수율이 잘 나왔다는 것은 시약을

조성하고 있는 buffer들에 의해 pH 조건이 만족되었다는 것을 의미합니다. PTS 카트리지 내에

들어 있는 시약과 비슷한 Endosafe 시약을 이용하여 시약과 샘플(validation을 수행하는

농도/희석한 샘플)을 1:1로 섞었을 때의 pH를 기록해두는 것이 유용합니다.

이미 validation되어 있는 제품을 PTS를 이용하여 re-validation하는 방법은 아래와 같습니다.

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1> 제품을 엔도톡신 기준 안에서 실험해야 하므로 기존에 validation을 수행하였을 때

사용한 스탠다드 범위를 확인합니다. PTS의 경우 스탠다드는 1~0.01EU/ml, 5~0.05EU/ml

2종류가 있습니다. 스탠다드의 범위가 다를 경우 MVD가 달라집니다.

2> 제품 3lot를 현재 실험 하고 있는 농도나 희석 배수(validation을 수행하여 간섭이 없다고

설정해 놓은 농도나 희석 배수)로 희석합니다.

3> 준비한 3lot의 샘플을 각각 1카트리지씩 사용하여 PTS로 실험합니다.

4> 제품 양성 대조(PPC-Positive product control)의 회수율(recovery%)을 기록합니다.

결과를 기록하고 이 결과가 판정기준을 만족한다면 PTS를 이용한 제품 validation이 수행된

것입니다. 판정 기준은 (a) PPC의 회수율이 50~200%사이에 들어야 하며, (b) 제품과 PPC의

반복간 편차(CV%)가 25% 미만이어야 합니다.

LAL 실험 법으로 validation이 되지 않았거나 새로운 제품의 경우 예비시험이 추가되며

validation을 수행하는 방법은 아래와 같습니다. 예비시험은 1lot로만 수행해도 됩니다.

1> 제품의 엔도톡신 기준(EL-Endotoxin Limit)을 설정합니다.

2> 제품의 엔도톡신 기준과 실험의 감도를 이용하여 최대 유효 희석 배수(MVD-Maximum

Valid Dilution) 혹은 최소 유효 시험 농도(MVC-Minimum Valid Concentration)를

계산합니다.

3> 가능하다면 2배에서 4배 정도의 안전 요소를 두고 제품의 MVD내에서 여러 희석 배수

혹은 여러 농도로 희석하여 각 농도 별로 1개의 카트리지를 사용하여 실험합니다. (비고;

Charles River의 R+D Inhibition/Enhancement four(4) spike cartridge를 이용하여

예비시험을 수행할 수 있습니다. PTS카트리지는 NPC와 PPC가 각각 2channel로 이루어진

반면에 이 카트리지는 예비시험을 위해 PPC 4 channel로 이루어져 있습니다. 이

카트리지를 통해 실험 조건을 찾은 후 정상의 카트리지(NPC와 PPC가 각각 2channel로

구성된 카트리지)를 이용하여 찾은 조건을 다시 한번 검증합니다.)

이와 같은 예비 시험을 통해 validation을 수행할 제품의 농도(희석 배수)를 결정합니다. 그리고

제품 연속된 3lot를 이용하여 위에 나와있는 이미 validation되어 있는 제품을 PTS를 이용하여 re-

validation하는 방법과 같은 방법으로 validation을 수행합니다.

PTS를 이용한 제품 validation 과정은 다른 LAL 정량 분석/광학적 방법을 이용한 제품 validation

과정과 동일합니다. Validation 수행 후 일상 실험 시에는 실험자가 스탠다드나 양성 제품 대조를

따로 준비할 필요가 없어 실험의 능률이 향상됩니다. 카트리지는 특정 lot별로 calibration code가

주어지며 이 calibration code에는 lot에 대한 스탠다드 정보 및 양성 제품 대조 channel에 spike

되어 있는 엔도톡신의 농도에 대한 정보를 담고 있습니다. 실험 시에는 PTS 기기에 이 calibration

code를 입력하면 됩니다.

아래의 <표1>과 <표2>는 PTS를 이용하여 새로운 제품에 대한 validation을 수행한 예시입니다.

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이 제품의 엔도톡신 기준(EL-Endotoxin Limit)은 100EU/ml이고 LAL 실험을 한 적이 없습니다.

제품의 pH가 간섭을 일으킬 수 있는 요인이나 이는 카트리지에 동결 건조되어 있는 시약의 버퍼

성분과 LRW(LAL Reagent Water)를 이용한 제품 희석에 의해 극복되었습니다. 제품의 일련의

연속된 희석 배수(2배수)로 희석하여 PTS로 실험하였으며, <표1>에서 보듯이 간섭이 1:256 희석

배수에서 극복되었음을 알 수 있습니다. 그 다음 제품 3lot를 예비시험을 통해 결정된 1:256 희석

배수에서 스탠다드 범위가 5~0.05EU/ml PTS 카트리지를 이용하여 제품 validation을

수행하였습니다. 시약의 감도가 0.05EU/ml이므로 검출 한계는 0.05 x 256 =12.8EU/ml입니다. 즉

결과 값은 12.8EU/ml이하로 표시 되며 제품의 엔도톡신 기준이 100EU/ml이하이므로 기준을

만족합니다. 제품의 3lot validation에 대한 실험은 <표2>에 정리되어 있습니다.

<표1> 예비시험-validation을 수행할 조건을 찾는 시험

희석배수 검출 한계(EU/ml) 회수율

1:4 <0.2 22%

1:8 <0.4 7%

1:16 <0.8 16%

1:32 <1.6 44%

1:64 <3.2 65%

1:128 <6.4 68%

1:256 <12.8 76%

1:512 <25.6 84%

1:1024 <51.2 80%

<표2> 제품의 3 lot validation

Batch 희석 배수 엔도톡신 값(EU/ml) 회수율

A 1:256 <12.8 83%

B 1:256 <12.8 88%

C 1:256 <12.8 87%

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제품 소개

Endosafe®-PTSTM

Charles River Laboratories의 최신의 엔도톡신분석시스템으로 미국 FDA의 허가를 받은

Endosafe®-PTSTM는 빠르고, point-of-use인 시스템으로 휴대용 스펙트로 포토메터

(spectrophotometer)를 이용하여 시험 LAL 시약이 미리 들어 있는 카트리지를 이용하는 장비입니

다. PTS는 어떤 상황에서든(실험실이든 샘플을 수집하는 그 장소에서건) 정량적인 LAL 시험결과

를 빠르게 얻는데 효과적으로 사용될 수 있으며, PTS의 시험결과는 15분 이내에 나오기 때문에,

여러 장소에서 나오는 샘플의 LAL 시험을 매우 효과적이고 정확하게 수행할 수 있습니다.

시험방법

PTS는 엔도톡신의 농도에 따라 직접적으로 발색의 정도를 측정하는 LAL kinetic chromogenic 방

법을 사용합니다. 각 카트리지는 정확한 양의 LAL 시약과, 발색기질, 그리고 control standard

endotoxin(CSE)를 포함하고 있습니다. 카트리지는 시험의 정확성, 일관성, 제품의 안정성을 높이

기 위해 엄격한 품질관리 공정에 따라 생산됩니다.

시험과정

시험을 수행하기 위하여, 시험자는 단지 25㎕의 샘플만을 카트리지의 4개의 샘플 첨가부에 넣으

면 됩니다. 기기가 이 샘플을 빨아 들이고, 두 채널에서는 LAL 시약과 샘플을 섞고(샘플 채널),

다른 두 채널에서는 LAL 시약 및 양성대조와 섞습니다(스파이크 채널). 그 이후 샘플이 배양되고

발색기질과 섞입니다(그림 1). 섞인 후 각 웰의 광학적 탁도가 측정되고 내부에 이미 저장된 표준

직선에 의해 분석됩니다. 설계에 의해 PTS 카트리지는 자동적으로 샘플과 양성제품대조를 두 반

복으로 수행하도록 되어 있고, 따라서 USP의 엔도톡신 시험법이나, FDA의 LAL Test Guideline을

만족시킵니다.

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FDA-licensed LAL 시험

PTS는 의약품의 완제품 시험과, 공정시험에 대한 기존의 LAL 시험방법을 대체할 수 있는 시험법

으로 미국 FDA의 승인을 받았습니다. PTS는 QC 실험실에서 문제가 있는 제품에 대한 해결방안

으로 효과적으로 사용될 수 있고, 빠른 결과가 요구되는 원료나 샘플에 대해서도 효과적으로 사

용 될 수 있습니다. PTS는 모든 나라의 약전에 맞도록 디자인 되었고, 광학적 시험방법의 엔도톡

신시험법의 기준을 준수합니다. PTS의 벨리데이션은 제품의 3 롯드에 대하여 반응간섭인자확인

시험을 수행함으로써 완성됩니다.

신규 사용자에 대한 교육은 빠르고 쉬우며, 결과는 연구나 생산에서 귀중한 시간을 지체하지 않

고 빠르게 얻어집니다. Endosafe-PTS는 벨리데이션 되어 있고, 증명된 LAL 시험법이면서도 기존

의 LAL 시험방법에 비해 커다란 장점을 제공합니다.

데이터 분석

PST의 데이터 제공은 간단합니다. 시험이 종료되면, 엔도톡신 측정값과 시험의 유의성에 대한 파

라메터가 스크린에 표시됩니다. PST는 엔도톡신의 값을 10EU/mL부터 0.01EU/mL의 범위에 대해

측정을 할 수 있습니다. 이 데이터는 프린터를 통하여 출력할 수도 있고, 컴퓨터로도 다운로드

할 수 있습니다. PTS는 100개의 시험결과를 저장합니다.

내부적으로 PTS 리더는 각 채널의 반응시간을 측정합니다. 카트리지 특정 lot에 대해 저장된 표

준직선을 사용합니다. 이 표준직선은 반응시간의 로그 값에 대한 엔도톡신 표준 농도의 로그 값

으로 구성되어 있습니다. 샘플의 엔도톡신 값과 회수율은 반응 시간을 이용하여 표준직선 내에

서만 내삽(interpolation)에 의해 계산됩니다.

PTS 제품의 특장점

· FDA 승인제품

· 휴대용, handheld LAL 시험 시스템, 충전 식 배터리 사용

· 어느 장소에서든지 빠른 정량분석법

· 간단한, one button 작동

· 샘플만 첨가하는 간단한 정량분석법

· 15분 이내의 결과

· 스탠다드 준비, LAL 시약의 용해, spiking이 모두 필요 없음

· 검출범위 : 10EU/mL – 0.01EU/mL

· PC에 데이터 다운로드 가능하거나, 직접 결과 프린팅 가능, 100개의 시험결과 저장

시험방법

기기의 키패드를 이용 시험정보 입력(카트리지 lot 넘버, 샘플의 이름, 샘플의 lot 넘버 등) → 카

트리지삽입 → 카트리지의 4개의 채널에 샘플을 25㎕씩 분주 →· Enter 누름 → 15분이내에 결과

표시

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Charles River Endosafe Korea News..

1. 찰스리버엔도세이프코리아㈜는 Charles River Laboratories 사의 In Vitro Products & Services를

아시아 패시픽 지역에 직접 판매하기 위하여 미국 Charles River Laboratories, Inc가 100%

투자하여 설립된 한국 현지법인입니다.

2. 찰스리버엔도세이프코리아㈜의 임직원을 소개 합니다.

1) 대표이사 : 포스터 티 조단(Representative Director)

2) 지사장 : 민홍진(Managing Director)

3) 영업담당 과장 : 한기정(Sales & Marekting Manager)

4) 기술영업 과장 : 신영주(Technical Sales Manager)

5) 고객지원 : 최주연(Office Manager)

3. 찰스리버엔도세이프코리아의 소식은 인터넷 홈페이지 www.endosafe.kr에서 보실 수 있습니다.

현재 임시 홈페이지로 운영되고 있으며, 조만간 완성된 모습을 보실 수 있습니다. 홈페이지를

통해서 매달 진행되는 Gel clot LAL workshop과 Kinetic LAL Workshop의 일정을 확인하시기

바랍니다.

4. 저희 찰스리버엔도세이프코리아는 뛰어난 기술지원을 통해 고객 여러분의 필요에 부합하는

것을 최대의 목표로 하고 있습니다. 언제든지 제품에 대한 문의나, 시험에 대한 문의가

있으시면 어디든지 달려가 도와 드립니다.

5. 현재 2007년 12월 31일 까지 한시적으로 PTS 장비에 대한 Promotion 판매를 진행하고

있습니다. 자세한 내용은 문의 해 주시면 언제든지 성실히 답변해 드리겠습니다

The Endosafe®-PTSTM was

licensed by the FDA for

in-process and final product

release

of pharmaceutical products.