voltage-induced release of nucleic acids from palaeontological samples

5
Voltage-induced release of nucleic acids from palaeontological samples Most of the protocols for the recovery of ancient DNA from palaeontological specimens are time-consuming and tend to yield inconsistent polymerase chain reaction (PCR) results. ªVoltage-induced releaseº is a novel and rapid approach for the extraction of ancient DNA. Nucleic acids are directly electrophoresed out of powder derived from hard and soft tissues. This technique is much faster than other methods in which pulv- erized tissue conventionally undergoes time-consuming crude lysis steps. The total preparation time is 5±6 h. The reliability of the voltage-induced release method was validated by (i) measuring the ratio of D-to L-enantiomers of the amino acids aspartic acid, alanine, and leucine, and (ii) by specific PCR amplification of four single-copy markers of human chromosome 17 and 18. We compare voltage-induced release to a frequently used silica-based protocol. DNA extracted employing voltage-induced release was more effective in PCR amplifications, which may be attributed to the effec- tive removal of PCR inhibitors. Keywords: Amino acid racemization / Ancient DNA / DNA extraction / Electrophoresis / Palaeo- genetics EL 3887 Lutz Bachmann 1 Michael Scholz 2 Martina Broghammer 3 Ian Giddings 4 Carsten M. Pusch 3 1 Pritzker Laboratory for Molecular Systematics and Evolution, The Field Museum, Chicago, IL, USA 2 Institute of Proto- and Prehistory, Department of Archaeobiology, University of Tübingen, Germany 3 Molecular Genetics Laboratory, University Eye Hospital II, University of Tübingen, Tübingen, Germany 4 Molecular Carcinogenesis Institute of Cancer Research, Haddow Laboratories, Sutton, Surrey, UK 1 Introduction It has been shown that genetic information may survive in hard and soft tissues under suitable conditions of preser- vation for a long period of time. Two major problems arise when working on ancient DNA (aDNA): (i) aDNA is seri- ously damaged and degraded, and (ii) the authenticity of recovered aDNA must be verified at all times. The aDNA extraction method is crucial in this context. In order to minimize the risk of contaminating the sample with con- temporary DNA, an optimal extraction protocol for aDNA should involve as few steps and chemicals as possible and it should be rapid. The majority of protocols used in the recovery of aDNA from palaeontological material are quite similar [1±10]. A typical aDNA extraction protocol can be divided into six distinct phases; (i) cleaning/preparation of the tissue/tis- sue chip, (ii) pulverization of the chosen sample, (iii) a crude lysis step to release the aDNA, (iv) purification of the lysate, (v) concentration of the DNA isolate, and (vi) further purification procedures to remove remaining impurities that might impede subsequent techniques such as PCR. While steps (i) and (ii) are quick (1±2 h), the remaining ones are considerably more time-consuming (2±4 days). This is particularly true for the crude lysis (step iii). We introduce voltage-induced release (VIR) as a rapid protocol for the isolation of aDNA, in which steps (iii)±(vi) of previously published protocols are replaced by an elec- trophoresis-based approach. The total preparation time (complete VIR, including steps (i and ii) takes approxi- mately 5±6 h. VIR utilizes the mobility of nucleic acids within a polysaccharide matrix, even though they may be encapsulated in hard or soft tissue. The tissue/bone pow- der is loaded into the slots of a polysaccharide gel, cov- ered by a loading solution, and then electrophoresed. Subsequently, the DNA is recovered by gel extraction, precipitated, and dissolved into an appropriate buffer for further analyses such as subcloning or PCR. 2 Material and methods 2.1 Samples and sample processing Ten ancient bone samples and three mummified tissues ranging in age from approximately 5200 before present (BP) to the late 16 th century were used for the analyses (Table 1). Samples were handled under aseptic condi- tions in a laminar flow cabinet in a laboratory dedicated to aDNA work. Benches and equipment (e.g., electrophore- sis equipment) were washed with 5% sodium hypochlor- Correspondence: Dr. Lutz Bachmann, Pritzker Laboratory for Molecular Systematics and Evolution, The Field Museum, 1400 South Lake Shore Drive, Chicago, IL 60605-2496, USA E-mail: [email protected] Fax: +312-665-7754 Abbreviations: AD, anno domini; aDNA, ancient DNA; BP, before present;; VIR, voltage-induced release 1488 Electrophoresis 2000, 21, 1488±1492 WILEY-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, 2000 0173-0835/00/0808-1488 $17.50+.50/0

Upload: lutz-bachmann

Post on 06-Jun-2016

215 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Voltage-induced release of nucleic acids from palaeontological samples

���������� �� ������� �� � �� � �� ��������������� �� �������

���� �� ��� ������� �� ��� ���� �� ������ ��� ��� ��������������� ���������� ������������� ��� ���� �� ���� ����������� ��� ����� ���� ������ ������������ � ������������� ������! �� � ����� ��� ���� ������ �� ��� �"������ �������� ���� ����� ���� �� ����� ������������ ��� �� ��#�� ������ ������ ��� ���� �������� $��� �����%�� �� ��� ����� ���� ���� ������� �� #��� �������&�� ������ ������������ �������� ������������� ��� � ��� ������ $�� �������������� ���� �� '() �� $�� ����*���� �� ��� �������������� ������ ������ #����������� * ��� �������� ��� ���� �� ���� +����������� �� ��� ����� ���� ���������, �������, ��� ������, ��� ���� * ������ ��� ������������ �� ��� ��������� ��-�� �� ����� �������� ./ ��� .0� 1� ����� �������������� ������ �� ���%����� ���� ������*���� ������� ��� �"����� ����� ��� �������������������� #�� ��� �������� �� ��� �������������, #��� �� *� ����*���� �� ��� ��������� ������ �� ��� ����*�����

��������� ����� ��� ����&����� 2 ������ ��� 2 ��� �"������ 2 3����������� 2 �������

������� 3+ 400/

���� �� ����

� ���� � �����

����� �����������

� !����"

#����� �$ %�� ��

.���&-� +�*���� ��������� 5 �������� ���3��������, $�� 6����������, ������, 7+, 85�97�������� �� ����� ���������� , ��������� �������*����� , 8������� �� $:*�����, ;���� 4������� ;������+�*���� , 8������� 3 �<������� 77, 8������� ��$:*�����, $:*�����,;���� =������� ������������7�������� �� ����������, <����#+�*�������, 5�����,5�� , 8>

� ����� ��

7� ��� *��� ���#� ���� ������ ���������� �� ������ ����� ��� ���� ������� ���� �����*�� ��������� �� ����������� �� � ���� ����� �� ����� $#� ��?� ��*���� ����#��� #�-��� �� ������ ��� ������@ ��� ���� �� �������� ������� ��� �������, ��� ���� ��� ���������� �������� ���� ���� *� ������� �� ��� ������ $�� �����"������ ������ �� ���� �� ���� ����"�� 7� ��� ��������&� ��� ��- �� ������������ ��� ������ #��� ��������� ���, �� ������� �"������ ������ �� ���������� ������� �� ��# ����� ��� ������� �� �����*����� �� ������ *� �����

$�� ��?��� �� ������� ���� �� ��� ���� �� ������� ��������������� ������� �� %���� ������ A.(.BC� �� ���� ���� �"������ ������ �� *� ������� ���� ��"������� ������D ��� �������2��������� �� ��� ������2������� ���, ���� ������&����� �� ��� ����� ������, ����� ���� � ��� ���� �� ������ ��� ����, ���� ���������� ����� � ����, ��� ���������� �� ��� ��� �������, ������� ����� ���������� ������� �� ����� ��������

��������� ���� ����� ������ ��*��%���� �����%��� ����� ���� 1���� ����� ��� ��� ���� �� %��- �.(9 ��, ����������� ���� �� �������*� ��� ��������������9(= �� ��� $��� �� �������� ��� �� ��� ��� � �������� �����

1� ������� �������������� ������ � 7�� �� � ���������� �� ��� ��������� �� ����, �� #��� ����� �����(������ �������� ��*������ ������� �� ������ * �� ��������������*���� ������� $�� ����� ��������� ������������ 7�, �������� ����� �� ��� ��� ��-�� ����"������� '() �� 7� �����&�� ��� ��*���� �� ����� ����#����� � ��� ������� ����", ���� ������ ��� �� *������������ �� ��� � ���� ������� $�� ������2*��� ��#��� �� ������ ���� ��� ����� �� � ��� ������� ���, ������ * � ������� ��������, ��� ���� �������������5�*��%����� , ��� ��� �� ������ * ��� �"������,����������, ��� ��������� ���� �� ��������� *���� ������� ���� ��� ��� �� ��*������ � ����

� ������� �� �������

�$� ������� �� ������ ��� ����

$�� ������ *��� ������� ��� ���� ��������� ������������� �� ��� ��� ����"������ '9BB *���� �������E�� �� ��� ���� .)�� ���� #�� ���� �� ��� ���� ����$�*�� .�� 5������ #�� ������� ���� ������ ���������� �� � ������ ���# �*���� �� � ��*���� �������� ������ #�-� E����� ��� �%������� �����, ������������� �%�������� #�� #����� #��� 'F ������ � ������

#��������� �� �� +��& E������, ���&-� +�*���� ��������� 5 �������� ��� 3��������, $�� 6���� ������, .=BB5���� +�-� 5��� ����, ������, 7+ )B)B'�9=G), 85�&����� *������H������������'�(� I4.9�))'�//'=

)**��+����� ),, ���� ������D �,-), ������ ���D �%,*���� ������DD � ., �������������� ������

.=00 ���������� � 9BBB, ��, .=00(.=G9

J 17+3K� �< ���� ;�*<, )G='. 1�������, 9BBB B./4�B04'2BB2B0B0�.=00 L./�'BI�'B2B

Page 2: Voltage-induced release of nucleic acids from palaeontological samples

���� 5������ ���������, ��� �� ��� ��� �� ������� �������� ���� ��� 8 ��������� �.) �� ��������� ��� ������*�����, #�� ��-�� �� ��� �� ����� ������������ #������� ����� ��� ����� *��� �������� A/, 0C� E������� �� ��� �"������ #�� �������� #��� � ���� ������E� 5���, >�����*�� ��� ����, E�*���, ;���� ����� #�� �%������ #��� � ������� ��������� ��� �M����������, 8������" G.9�36�� 8���� � ����� ��� �M����������, )04BD ������� ���� �� ������ ������� #��� 4��� � ������ ������� ����"������ 9(4 �� #�� ��������� ��� ����� �� ��� ������ �������� �� ��� �� ���������������� ��� ��� ���� ����� �� ��� ����� 5������� #�� ���� ��������� ����� ���� � ���� ��#��#��� � ��*����� ���� ��� ������ ����� ������ 5��� ������������� #�� �"����� ��� ��� ������� #��� ������������� ��� ��*��%����� �������� ���� ��%��� ��������� ������ ������&������

�$� )�� � � �� ������

$�� ��� �� ����� ��� ����&����� �� ������ ��������, ������� ����� ��� ������ �+��� �� ��� ������� #��������� �� �������� ��� ������� ��� ������������ ����� ������ #��� ����������� ��� A..C� M�� �� �� ����������&�� ������ #�� � ��� &�� ��� ����� ������������#��� <����� ��� 5���� A.9C� ���� ������ �� �"�������������� ��� ����, ��� ����� ��� ���������� #����������� �� 9B �+ ������� ��� ���� &�� * �����������

��� ���������� �5 �� � �������� �� ������ $������ ��� .=B, .09 ��� .') ���������� �� ���, +��, ������, ��������� , #�� �������� ��������� �

�$� !�� ��� ����������

1� ����� �� � ��# ����5�*$� ��� ��� �E������, ��������, ��, 85�� ������������ ���*� ���� �� , .B �/ �� ���� ��� ��� *��� ���� �� ��� �"�������� ��������� � $�� ���*� #�� ������ ������ #��� ����#� �������� E���������, 5�� �����, ��, 85��D ��*���%���� 8 ���������� �� 9 � *��#��� �"�������� ������� �� ��� ���2� ������ � ��* #��� � ����� ��&� �� '� .B � 9 �� #�� ������� �� ����# � ������� ������ ���*��� 'B �+ �� ��� ����� . � $���*�����3�$� �$E3����� #�� ��� ����� 5�������$� �;�*� E�+ +��� $�����������, ;������*��, ��, 85��, � ��� ����" ���������� ��������� ����� ���*���������� ��� ���������5������8N ��� �� ������*�� ������������ ������ ����������� * ��� ��-��� ���� �� � 9F #2� ��� ����"#�� ����, �� �� ������� ���� ��������� �� ��� ��������� �� 'B('BB *�� 3������� *����� �.BB ��2�+� #������� �� ��� ��� ��� �� ������� � . � $E;3 *�����0G �� $��, 0G �� *� ���, '�/9 �2+ �� ���, ��� 9�'�� 3�$�D �< 0�B� #�� ���� �� ��� ������ *����� ����� ������������ " ���� ����2*��������� *��� #������� �� �� ���� ���� *�� ��� ����� �� ��� ������� ������� ���-��� ��� ����� ��������� �� ����� � .�' �

���������� � 9BBB, ��, .=00(.=G9 ������������� ������ �� ����� ���� .=0G

/�*�� �$ 5����� ���*�, ����, ��� ��� �� ��� ������� ���� �� ���������� �� 7�

�� 5��� 5����� ��� ������� ������� 5$� ��-���� ��� ��� +�� ��� �./5G90 �.05'/ �.05/B �.05'95������ )/(GG *� 00(..9 *� .BG(.9/ *� ..=(.4B *�

7� 5*� 7� 5*� 7� 5*� 7� 5*�

O. 1�*��, ;���� E��� P' 9BB E� B�BB= B�BB9 B�B4' I I I I I ( I (O9 1�*��, ;���� E��� P' 9BB E� B�BB' B�BB9 B�B40 I I I I I ( I (O4 1�*��, ;���� E��� P' 9BB E� B�BB= B�BB4 B�B=/ I I I I I I ( (O= 1�*��, ;���� E��� P' 9BB E� B�BB4 B�BB9 B�B4. I I I I I I I (O' 1�*��, ;���� E��� P' 9BB E� B�BB4 B�BB9 B�B4G I I I I I I I IO) ��*�����, ;���� E��� P9 4BB E� B�BB9 B�BB9 B�B'B I I I I I ( I (O/ ��*�����, ;���� E��� P9 4BB E� B�BB9 B�BB4 B�B=G I I I I I I I (O0 ��������, ;���� E��� =4B('=B �� B�BB. B�BB. B�B== I I I I I ( I (OG ��������, ;���� E��� =4B('=B �� B�BB9 B�BB9 B�B=B I I I I I ( ( (O.B ��������, ;���� E��� =4B('=B �� B�BB/ B�BB= B�B'9 I I I I I I I (O.. 5��� ����, 1��� ��"�� ����� .=�� ���� B�BB4 B�BB= B�B'B I I I I I ( I (O.9 ����, ��� ����� .'�� ���� B�BB' B�BB= B�B4G I I I I I ( I (O.4 ���������, ;���� ����� .)�� ���� B�BB. B�BB. B�B40 I I I I I I I (���, ����� ���� E��� 9 ��� B�BB9 B�BB. B�BB0

����, ��� ��������� 7�, 7� ������5*�, ������*���� ������$�� ������ ������� ����� �� ���� +������������ �� ��� ����� ���� ���, +�� ��� ��� �� ���#�� $�� �������� ������������� �� ��������� 5$� ��-�� ��� ��� �"����� * ����� 7� � � ������*���� ������ �� ������� * I�

-�

��

��

Page 3: Voltage-induced release of nucleic acids from palaeontological samples

����������� *���� #�� ������ * ��*����� .' �+ ��'BF #2� �� ��� �������� ������ .'F�, /�' �+ �� � 9BF#2� 5�5 ���- �������� ������ 4FD ������������ �����,��� 9�' �+ �� � . � $���<�� ��������, �< /�' ������'B ���� ������������� ��$$D .'B ��� #�� ����� ?��� ����� ���� ;���������� *���� ��-��� �$$ �� *� ����� ����� ���������� 6�� �+ �� ����������� �������� #��������� �� ��� ����, ��� ��� ��� #�� ���� �� .' ��� ��9 2� ��� �� ������ ������� �� ����# �� ��� �%����*������ �� ��� 5�������$� ����" ��"� �� ��� ������

�$" � .

� ��"���� �� 9'(4B �� �� ��� ������ #�� ������ ������� *����� �� � #��� ����� � ������������ M�� ���� #�� �������� *��#��� �������� �� �%��� ������ �P9' �+� ��.�'����� ������� *���� #�� ����� �� ��� ����, ����������� ���� ������ ���� �������, ��� ��"��� #�� ����� ����� #��� � ������ ���� ���� $�� ������������ #���� �� / 2�� ���� ��� � � ���� ��� ����� ���� ��� ���,��� #�� �������&�� �� � �����#��� �4B= ��� 8 ���������������� �E�����, ����������, ;���� �� $�� ���#�� %��-� ������ ��� ��� ��� �����#��� ��� ������%�� �� ���� A.4C, �� �������� ������*�� ���� ������� �� ��� ��������� �� ��� ���� �� 7�������� ��� ����� *����� �� ��� ����� ���������� �����-��� �� ����� 6� �������� ���� �� ���� %����� ����, ��� ��� �"������ �������� #�� ������ * <9M�

�$0 �� ��*���� �(��� �� �� �,-)

6� ��������, ���� #�� �"����� ������ �� ��������� �� <Q�� ��� �RR*� A4C, #��� #� ��� �� ��� ����� �������*���� ������!� E��� ��#�� �B�' �� �� ������� . �+ �� �"������ *���� ��������� �� .B � ��������������� �����, B�. � $���<��, �< )�=, B�B9 � 3�$�, �< 0�B,��� .�4F $���� S�.BB ��� ��*��%����� ���*���� �������� ���� �� �� ������ �� � �� )B��� 'BB �+ �� ������������� ������ ���� ������������ �� ' ��� ��'BBB �� �� ����� �� 'BB �+ �"������ *���� ��� =B �+����� ����������� 6����#��� ���*����� �� .B ��� �� ������������, ��� ����� �� #����� �#�� #��� .B � ������������ ���� �����, B�. � $���<��, �< )�=, ��� �#�� #���/BF �������� ���� � ��� ��� ������, ��� ��� �� ������#��� #��� ��� ����� �� (9B���

�$1 %#. �(�������

6�� ���� ������ ������ �5$��� �� ��� ����� ����������� ��./5G90, )/(GG *�D �.05'/, 00(..9 *�D�.05/B, .BG(.9/ *�D ��� �.05'9, ..=(.4B *�� #����������� * ��� ������ �� ��� ���������T� ���������� ��E7 ��75� +��-��� ������� 5��, ������ 94 ��� 9=D�3 E��� �����, 6���� ��� , ��, 85��� $� ������ ���

���������� ��������� ��� ������, �#� *���- �"�������� ��� ��� �� ������*���� �"������� � ��� ����� ����� ���� ���� ��� ��� �� 7�� ��� ��� #��� ����� #����*?���� �� ��� ���� �����

�$2 /���� ��� �� ������ �� %#. �*����

$�� ������� ��� ����� �� ������ ��� ��� 5$�� �����.B �� �������� ����� ��� �� � �������� #�� ������������ #��� . �+ ���� �"����� �����#��� ����� ��� 7� ������ � ��� ������*���� ������ A4C� 5�*���%����� , ��� ������������ ������� �� ��� ������� #�������� �� ���� �� � ������ #������ ���������� ���� * ������ ��������� �� ��� �������� �������� �� � .' �+ ���%����� � 9�BF ������ ���� 7� ��� ���� �� #��� �� ������������� �� ��� 5$� ��-�� #�� �*�����, ��� ��������� �������*���� #�� ������� * ����� �������� ����� ���� �����& �� ������ ���� *� �������

� .������ �� �� ����

������ �� ����� �� ��� A..C ��� �"���� �� ����&����� �������� ���, ������� ��� ������ �� ���� ����� �������� #����� ����������� ��� ������� �� �������������� 7� ���� #��� ��� �2+ ���� �� ������ ��� ������� �"��� 0B � .B(4 �� �� ��-�� ���� ��� �� *� �"�������� � ���� ���� �� ��� ����������� #��� �"������� ������ ���� ��� ����� *� �����*�� �� ��*��%���� ���������������� 6�������, ��� �2+ ���� �� ������ ��������� *� ����� ���� ���� �� ������� ��� ������*����� ��� ����&����� �� ������ ��� �� ����� �������� �� ���� ����� ����� $�� �2+���, �2+���, ��� �2+��� ������� �*������ �� ��� ������� ���� �� ���� ���� �$�*�� .����� ��� ����� �� ����� �� ��� A..C� $���, #� �������� ���� ����������� ��� ������� �� ��� ���������� ���� ���� �� �� ������*�� ������������ #��� �"�������� ���� 6� ��������, � 9� ������ *��� �� � ���#�� ���� ������� �$�*�� .��

$� ���� ��� %����� �� ��� ���� �� ���� �� �����*���� ����*��%���� ��� �"��������, ��� ��� 5$�� �� �������� ����� ������ ��./5G90, �.05'/, �.05/B,��� �.05'9� #�� ���������� $�� ������ �� ��� �"�������� ������ ����� ��� )/(GG *� �� �./5G90, 00(..9 *� �� �.05'/, .BG(.9/ *� �� �.05/B, ��� ..=(.4B *� �� �.05'9 ������ �� ��� �������� �E7��75� +��-��� ������� 5��� ������ 94, ����� 9=D �3E��� ������� ��� ������ �*������ #��� ���� �"�����* ��� 7� ������ #�� ������ �� ����� �*������ #������� �"����� ������ �� � ������*���� ������ A4C�1� ������� �� ������ ��� ��� ��� 5$�� #��� ������ ������� ������� �"����� ������ �� ��� ������� 7������� ��"������@ ������ O4 ��� OG ����� ��-��.05'9�� 7� ������, �� ��� ������� �"����� ����� ���

.=GB +� E������ �� ��� ���������� � 9BBB, ��� .=00(.=G9

Page 4: Voltage-induced release of nucleic acids from palaeontological samples

������*���� ������ A4C ����� ������� ������ �� ���� ���� ����� �� ��� ��-� �.05/B ��� .9 ������� ����� ��-� �.05'9 �$�*�� .�� $�� ��� ������ �� �#�������� �� ���#� �� 6��� ., ��� ������ ��� � ���� �2+���

����� �O.BD B�B'9�, ��� ��� ���� #��� � ��# ������ �O=DB�B4.�� $� ����� ���� �� ������� #�� ���� ��� ��������������� �������� ��� �������� * ���������� ����� ��� �"������ ������, ��� ������ ��� �� ��� �"��������� #�� ���� ��������� �� ���5$� � ����� ����� 5��� #� ��� ��� ����� �� ��������� ������ ������ �����*����� #� �� �"���� ���� ���� ����� �������������

M� ���� ���� ���# ���� 7� �� � ���� ��� �������������� �� �"������ ���� ��� �������� ��������<�#���, ��� ���� ���� �� �� ���� ��� �� �������� *� ���� ��� ����� ��� �� ��������� $���, 7� ����� *� ������ ��� ���� ������� #��� ��� ��- �� ������������� �� ��� ������ #��� ����������� �������� ��� �� ��� ����� $�� 7� ������ �� �� ��� �������*���� ������������ ���� ��� ������ ������*���� �������� ���� �"������ A4C �� ��� �����#��� ������� 6���,��� �*������ ����� ��� �� ��� ������� ��� ��� �������������� �� ��� ������ �������� $�� ������� �� �������� ��� #�� ������� * ��� ������ ��� ������������,

���� ��������� �������������� ���� ��� ����� �� �E74/4� ��%���� �%������ #��� ;���5�� ����#��, �������� 5������ *��� � *���&����� ����� 5$�������� ���������������� �� ��*��� 5����, ��� �������� ������ ������ ��� �"�������� �� ��� ������������� �� �������������� ������������ #�� �������� #����� � ��� ������� #�� �"����� ������ �� ��� 7� ������ � ��<Q�� ��� �RR*� A4C� $���, ���� ������� �� �����"����� ������������ * �������� ������� ��� ��������� 7� �� *� ����� ���� ��� ������������ ���*������ �� 7� ������ *� ��������� �������������, ������� �� � ����� ��#*�- �� ��� ������� <�#���, #� ������ �*���� �� ������������ ����� �� �"����������� *����� ���� �� ���� ����� �������� �� ��� 7� ������� ���� �� ���� �������, ���� �� ���� ���� �� ��������������

5��� �� �� ������ �������*�� �� ����� ��� �������������%��� ����� , #� ����� ������ #� ���� �� 7���"����� ��� ����� ��� ��%����� ���� ���� ����� �"����� * ��� ������*���� ������� <�#���, #������ ���� 7� ������ � ��� ���� �"��� ���� ���������*���� ������� $�� ����� ���� �� �����"����� * 7� �� *� �"������� * ��� ���� �� ������������ ����*���� ������ ������������� 6� �"�����,

���������� � 9BBB, ��, .=00(.=G9 ������������� ������ �� ����� ���� .=G.

'���� �$ 5$� � ���� �� �#� ����� ������������ M�� ���������� �� ��� � �������� �P'9BB E�� ���� ���� �� 1�*��� ;����� ����� .D O=�, ��� ��� ���� �� ��� �� ��� �������� �P='B ���� ������ ���� *���� ���� �� �������, ;���� �����9D O.B�� ��� ����� ������ �� ��-�� �./5G90 �)/(GG *��, �.05'/ �00(..9 *��, �.05/B �.BG(.9/ *��, ��� �.05'9�..=(.4B *��� E���- �"������ ������ #�� ����� �� ��� ������������ ����� 4�� ���, �E� ������������ ������ ������� ��� �"���� �*������ ����� 7� ��� � ������*���� ���� �"������ ������ A4C, ��������� � 5�&�� �� �S./=2���777�������� �������� ������ �� �� ����� �� *��� ����� $�� =F #2� $�3 �=B �� $���������, . �� 3�$�, �< 0�B� ��������� ���5����25��>��D 4@.� #�� ������� #��� �������� *�����, �������� ���� 9'= �� 8 ������������, ��� � ������������� #�� ������ �3�5K <����*�� ���� ���� 5$� �.05'9, ��������� ��� ������ �������, �� ����� �� ������������ ��*��� �������� ������ ����� ��� ��� �"����� ������ �� ��� ������*���� ������ A4C� ������������ ���������� #��������� ����� #��� ���� #�� ������� ����� ��� 7��������� ����

Page 5: Voltage-induced release of nucleic acids from palaeontological samples

����*��� ������� ������� �*��� ���������� �*������� ��� ���� �"���� A9, .=C ���� � ����� ��*���� ���� ��� #����� ����, ��� �� ���� ����������� �"����� �� ��� ��*��%���� ��� �"������� M��� ���������� ��� �� ��� #����-��#� *�#���� ��� A9, ', .=(.)C������� �� *� ������� ������ �� ������ ����� A9,'C, ����� �� ���� ������ �� ��*���� �� ���� ��� �� ����*� �"������ $���� ��*������ ��, ��#���, ��%����� �*����� �� ��� �"���� ������ * ������*���� ������%���� 7� =)�'F �� �� �"��������, ��� ������������������� #�� ����������� ����� #��� ���� �"����������� �� ��� ������*���� ������ #�� �����, #������ � ������� �� ������������ ������� #�� ��� �*������ �� 4�/F �� ��� ���� #��� 7���������� ����#�� ������ � �������� �� ��� ��� ����*���� ��"���������� #��� ���� #�� ������� �� �#� ������� �O4 ���OG� ���� #�� ����� �� ��� ������������ �� ����.05'9 5$� �..= *�(.4B *��� 7� *��� ����, ����"���� �������� ������ �� ��� 7� ������ �%�������� �������� ���� ����� �������� ������ �� ��� ������*���� ������ �� ���� ����� ��� ��& �� ������ �$�*��9�� �� �� 7�, � ��� �������� ������ �� ��� ����*�������� ��� ������*���� ������ �� <Q�� ��� �RR*� A4C #��

���� ������ �� ���� �"������ �����%��� ��� �� ������������� �� ������*���� ���� ������ �U7�%��-D U������, 5���� ������, ��, 85�� A.BC� <�#���, 7� ��� ������������ �� *���� ��� ��� ���� ���� ����� ��*������� �����%����

�� ��� �������� � �� ��������� �� ��� � �� � ��� ��� ������ � ������� �� ���� ��� !��� � ����� "� #� $ ���%�� �� �&��� ��� ! �� �� � �� � ���� ��� ��� �� ��#���� �� '����(�� ������� � ��� ������� �� )� *���������� ����!������ ���� ��� ��� +� ����� ���!%���� �� * � ������ � ,������� � ��� - ��� .�����/�+� ����� )�(���� � .������� 0 ������ �� ��� �'��%� ��

������� M��*� 9=, .GGG

" .����� ��

A.C ��������, ��, ����, M� 3�, V����, �� $�, 5�-��, �� V�,#� -����� 0� � .GG/, 1�, ..9)(..4'�

A9C <R���, ��, E�������, $�, +�����, �, 5��������, ��, $���� ��� �� ,��� .GG', �2, 00.(009�

A4C <Q��, ��, �RR*�, 5�, $���� � �� �� ,��� .GG4, ��,4G.4(4G.=�

A=C ���?�, <�, ���&�����, 1� ��, ;������, V� ��, * ����� * %� �� ,��� ������ .GG9, �32, 4)/(4/=�

A'C �RR*�, 5�, +��� $���� ����� 0� � 40� .G0G, 3, .G4G(.G=4�A)C ���������, � ��, >������, �� E�, � �-��, ;�, "���� ��

.GG4, �5, )GB()G4�A/C ����, �� ��, 5���&, ��, ������ "����� .GG/, �2, =./�A0C 5���&, ��, ����, �� ��, ������ "����� .GG/, �2, 9=G�AGC $����, ��, �&�� ��� � .GG=, 67, '4B('4'�A.BC K���, �� K�, 3��, E�, 1� �, V� 5�, ����, V� ��, 5������,

5� ��, ��� #� +� �� ������� .GG0, �76, '4G('=4�A..C �����, <� ��, <Q��, ��, E���, V� +�, �RR*�, 5�, 0� ����

.GG), �8�, 0)=(0))�A.9C <�����, �� 5�, 5����, V� ��, +�� ���9 ���� ��� � 0��������

��� * �� , 3���, +����� .GG=�A.4C ����, �� ��, ���������� � .GG/, �3, ..B4(..B=�A.=C 5���&, ��, ;�������, 7�, ����, �� ��, ����� * �����

.GG0, �65, 904(90)�A.'C <R���, ��, +����, �, 5�--�, ��, E����, ��, 5��������, ��,

�� ,� ����� 0� � .GGB, 2�7, 4)'(4/B�A.)C �RR*�, 5�, <�����, �� ;�, 1�����, �� ��, #� * �� �����

.G0G, �:1, G/BG(G/.9�

.=G9 +� E������ �� ��� ���������� � 9BBB, ��� .=00(.=G9

/�*�� �$ $������� �� .' �+ ������� ��� ���� � �������-� �.05'9 �..=(.4B *�� ��� .B �� ��������� ����� ���

3"������ 5������ ��������������

.@. [email protected] .@9B .@4B .@=B .@'B .@)B .@/B 7� O4 ( I I I I I I I

OG ( ( I I I I I I5*� O4 ( ( ( ( I I I I

OG ( ( ( ( ( ( I I

7�, 7� ������5*�, ������*���� ������5���� ��������� �� ���� �������� #�� ����� �� ��� ������ ����� ���� ��� ��& �� ������ � 5������ O4 ��� OG#�� ���� �� ���� ����, ���� ��� #�� ����� �� ������������� ����� ����� ��� 7� ������ � ��� ������*���������� ���� $�*�� .�� 6��� ��� ��& �� ������ ��������� * I�