vybrané pojmy pro molekulární klonování
DESCRIPTION
Vybrané pojmy pro molekulární klonování. Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D., Ústav imunologie, LF Univerzita Palackého v Olomouci. Základní pojmy. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Vybrané pojmy pro molekulární klonování
Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D., Ústav imunologie,
LF Univerzita Palackého v Olomouci
Operon - skupina genů nebo segment DNA, které fungují jako jedna transkripční jednotka. Zahrnuje operátor, promotor a jeden nebo více strukturních genů, které jsou transkribovány do polycistronické mRNA. Gen - základní, fyzická a funkční jednotka dědičnosti. Strukturní gen - úsek DNA zapojený do produkce polypeptidového řetězce. Určuje strukturu proteinu a RNA molekuly ale zahrnuje i oblasti zapojené do regulace jejich exprese. Ne-regulační gen. Operátor - oblast DNA, na kterou se váže specifický protein (represor), bránící iniciaci transkripce z přilehlého promotoru. Promotor - oblast DNA, na kterou se váže RNA polymeráza a transkripční faktory zahajující transkripci mRNA.
Základní pojmy
Cis-trans komplementační test - párovací test sloužící k určení zda dvě různé recesivní mutace na opačných chromosomech diploidního organismu (pozice in trans) se vzájemně kompenzují (komplementují). Pokud ano, postihují různé geny, pokud ne, postihují stejný gen. Tento test se označuje i jako test alelismu
Cistron – (Benzer) nejmenší genetická jednotka nevykazující genetickou komplementaci dvou trans mutací ve výše zmíněném cis-trans testu, ale vykazující genetickou komplementaci, jestliže tytéž mutace jsou na jednom chromosomu (v poloze in cis).
Cistron je tedy slučitelný s pojmem kódující částí jednoho genu. Cis regulace - odpovídající cis poloze v cis-trans testu. Polycystronická mRNA - mRNA kódující více než jeden protein. Vnitřní místo nasedání ribozomů – místo mezi dvěma úseky mRNA kde může dojít k sestavení ribozomu a iniciaci translace mimo 5’nepřekládanou oblast
Základní pojmy
Čtecí rámec - transferové RNA (tRNA) nasedají na templátovou mRNA v přesně určených pozicích podle principu komplementarity bází a přinášejí aminokyseliny k tvorbě polypeptidového řetězce. Komplementarita bází - báze se spojují vždy A-T nebo C-G. Toto pravidlo je nutné dodržet při navrhování překryvných míst a kohezivních konců DNA během klonování.
GMO - geneticky modifikovaný organismus. Vnesením cizorodé DNA jinou než přirozenou cestou (jako je infekce bakteriofágem či virem, konjugací přirozených plasmidů a td.) Manipulace je definována zákony a vyhláškami České republiky (zákon 178/2001; 185/2001; 78/2004; 346/2005; vyhláška 209/2004; 195/2005; 86/2006) a nařízeními Evropského parlamentu a Rady (ES) (1830/2003; 1946/2003). Roční hlášení
Základní pojmy
Nonsense suppression - potlačení efektu STOP kodonů v důsledku přítomnosti abnormálních tRNA- vážou se na STOP triplet a přinášejí aminokyselinu- umožňují další průběh translace. - geny jsou uvedeny v genotypu bakterie (SupD, SupE)- většina supresorových tRNA nasedá na STOP Amber (UAG), Orche (UAA).
Základní pojmy
Získání templátu kódujícího
požadovaný rekombinantní
protein
Identifikace kódující NK
1. Protin o známé sekvenci mRNA, cDNA, DNA (sekvenčně specifická
amplifikace cDNA, PCR)
2. Protein u nějž je známá sekvence u jiného druhu (identifikace hybridizací,
sekvenčně specifická amplifikace cDNA , PCR)
3. Protein u nějž je známá sekvence pouze určitého fragmentu (identifikace
mRNA nebo cDNA hybridizací, sekvenování, PCR)
4. Neznámý protein (izolace funkční frakce (fenotyp) buněčného lyzátu a
analýza sekvence proteinu, návrh prób umožňující identifikaci a izolaci
genu z cDNA knihovny hybridizací, PCR, srovnání s dostupnou databází
genů ....
Prokaryotní / eukaryotní geny
• Prokaryontní geny jsou bez intronu
• Pro klonování není nutné pracovat s mRNA
• Pokud je známa sekvence požadovaného genu možná PCR amplifikace
genomické DNA
• Eukaryontní geny jsou mnohem složitější
• Genomická DNA obsahuje introny a dlouhé 5’ a 3’ nepřekládané oblasti
• Při izolaci genu se nejčastěji pracuje s cDNA
• Připravena reverzní transkripcí mRNA izolované z buněk
• Odpadá komplikované hledání a eliminace intronů
• NetGene2 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).
Genové a proteinové databáze
Práce s genovými a proteinovými databázemi
NCBI
HUGO Gene Nomenclature Committee
HUGO Gene Nomenclature Committee
GeneCards
GeneCards
NCBI - Gene
NCBI - Gene, Reference Seq.
Práce s genovými a proteinovými databázemi
ExPASy Proteomics Server
Protein Data Bank
Překlad cDNA do proteinové sekvence
E. coli
v molekulárním klonování
• Gram negativní tyčka• Cirkulární chromozomem 3.106 párů bází• Roste na minimálním médiu obsahujícím
• zdroj uhlíku (glukóza) • soli jako zdroj dusíku, fosforu a stopových kovů
• Na médiích obohacených aminokyselinami, prekurzory nukleotidů, vitamíny atd. roste mnohem rychleji
• Po naočkování inokula do obohacených médií • úvodní lag fáze • exponenciální fáze log (zdvojovací čas 20 - 30 minut)• V log fázi setrvává dokud
• nespotřebuje veškeré živiny• nespotřebuje kyslík • zplodiny metabolismu (kyseliny) nepřesáhnou hranici inhibice růstu
• nepatogenní linie E. coli K-12 je prekurzorem pro většinu laboratorních kmenů • původně izolovaná v roce 1922 ze stolice pacienta uzdravujícího se z difterie v Palo Alto v Kalifornii.
Základní charakteristika E. coli
• Jsou popsány plasmidy dobře se replikující v E. coli• Plasmidy jsou schopny nést DNA inzerty od stovek po statisíce párů bází (bacmidy)• V E. coli probíhá α komplementace• Je známa řada antibiotik použitelných pro selekci E. coli (Ampicillin, Kanamycin,
Chloramfenikol, Tetracyklin, Neomycin Zeocine)• Dobře popsány metody transformace E. coli
•chemická CaCl2, RbCl, CCMB80 (KOAc+CaCl2+MnCl2+MgCl2)•elektroporace
• Vyvinuty kity na izolaci plasmidové DNA z E. coli•
Základní charakteristika E. coli
•Minimální média•A médium: obsahuje v 1 litru média 1 g (NH4)2SO4; 4,5 g KH2PO4; 10,5 g
K2HPO4; 0,5 g citrát sodný 2H2O; 1 mM MgSO4·7H2O; 0,2% glycerol (nebo cukr).
•Bohatá média •Luria nebo Lenox Broth (LB): obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 5 g
kvasničného autolyzátu; 5 g NaCl; (1 mN NaOH).•H medium: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 8 g NaCl•Lambda broth: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 2.5 g NaCl
•Obohacení některými nutrienty může například usnadnit purifikci některých kontaminujících proteinů
Kultivace E. coli
α komplementace - je fenomén, kdy exprese dvou genů, z nichž jeden kóduje N’ terminální úsek -galaktozidázy (ɑ fragment) a druhý kóduje C’ terminální úsek -galaktozidázy (ω fragment), vede k vytvoření funkčního enzymu sestavením dvou polypeptidových podjednotek po jejich nezávislé translaci
α komplementace
F faktor, F plasmidV praxi minimalizovaná verze
geny záměrně vnesené do F plasmidu (nebo F episomu)ori místo pro zahájení replikacerep gen kódující replikázupar segregační geny kódující jednotlivé podjednotky topoizomerázy IV a
ccd (ccd stands for coupled cell division) geny
vnášeny geny rezistence na antibiotikum, pomocí nějž je plasmid udržován v následujících generacích a dále například gen kódující ω fragment -galaktozidázy umožňující komplementaci.
XL-1 Blue F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15].
F' = bakterie, potomek kmene, v němž do chromozomu integrovaný F faktor uvolnil i s několika chromozomovými geny a dále je ve formě episomu. [Geny získané z chromozomální DNA]
část transpozonu Tn10 - gen rezistence na tetracyklinproAB - γ-glutamyl fosfát reduktáza a kináza - metabolismus prolinurepresor laktózového operonu lacI, gen kódující ω fragment -galaktozidázy Δ(lacZ)M15.
Antibiotika běžně používaná pro selekci transformovaných E. coli
Antibiotikum Zás.mg/ml
Prac.ug/ml
Mechanismus působení Mechanismus rezistence
Ampicilin 4 50 - 100
Baktericidní; zabíjí pouze rostoucí E. coli, inhibuje syntézu stěny E.coli potlačením tvorby
příčných vazeb mezi peptidoglykany
b-laktamáza hydrolyzuje ampicillin dříve než se dostane do buňky
Chloramfenikol v methanolu
10 20 Bakteristatický; inhibuje proteosyntézu interakcí s 50S podjednotkou rybozomu a inhibuje reakci
peptidyltransferázy
Chloramphenikol acetyltransferáza inaktivuje chloramphenikol
Gentamycin 10 15 Baktericidní; inhibuje proteosyntézu interakcí s L6 proteinem 50S podjednotky rybozomu
Aminoglycosid acetyltransferáza a aminoglykosid nukleotydil transferáza inaktivyje gentamicin; mutace v rplF
(kódující L6 protein) brání vazbě gentamycinu
Kanamycin 10 30 Bactericidní, inhibuje proteosyntézu, inhibuje translokaci a vyvolává poruchy čtení tripletů
Aminoglycosid fosfotransferáza rovněž známá jako neomycin fosphotransferáza,
Aminoglycosid acetyltransferáza a aminoglykosid nukleotydil transferáza
inaktivyje gentamicin inaktivují kanamycin
Tetracyklin v 70% ethanolu
12 12 Bacteriostatic; inhibuje proteosyntézu bránění ve vazbě aminoacyl tRNA na místo A ribozomu
Aktivní eflux tetracyklinu z buňky
1. Ukázka optimální hustoty kolonií E. coli pro sekci
Selekce transformovaných E. coli
1. Ukázka satelitních kolonií po vyočkování husté bakteriální suspenze na LB agar – typický obraz pro selekci Ampicilinem
Šipky ukazují centrální kolonie transformovaných E. coli. Do okolí je sekretována β-laktamáza.
Jakmile dojde v okolí centrální kolonie k degradaci Ampicilinu, začnou se objevovat satelitní kolonie.
Satelitní kolonie ampicilin
Aseptické podmínky manipulace s živými
organismy
Aseptické podmínky manipulace s živými
organismy
• Sterilizace laboratorního materiálu
• horkovzdušná sterilizace 160°C, 2 hod
• autoklávování 120 – 136°C, 20 - 30 min
• chemická (70% alkohol, ostatní) a UV sterilizace povrchů
• Sterilizace médií – filtrace 0,22 nebo 0,1 mm
• Manipulace s kultivačními nádobami
• uspořádání pracovní plochy
• postup otevírání a zavírání kultivačních nádob
• způsob pipetování
• po doteku okolních povrchů předpokládat přenos kontaminace
Volba expresního systému
Vhodnost expresního systému podle velikosti rek. proteinu
Velikost proteinuPovaha proteinu E. coli kvasinky hmyzí buňky savčí buňky
< 8 kDaFúzní
+++
> 8 kDaIntracelulární
+++ +++ +++ +++
8-50 kDaSekretované
++ +++ ++ +++
> 50 kDaSekretované a povrchové
+++
Vhodnost expresního systému podle posttranslační modifikace
Expresní systém
Posttranslační modifikace
N-glykozylace O-glykozylace Fosforylace Acetylace Acylace γ-karboxylace
E. coli Chybí - - - - -
Kvasinky
Vysoce manosilované
glykany+ + + + -
Hmyzí buňkyJednoduchá, bez sializace + + + + -
Savčí buňky Komplexní + + + + +
Výtěžek expresních systémů
Protein E. colikvasinky
P. pastoris S.cerevisiae
hmyzí buňky savčí buňky
sekretovaný[g/l biomasy] < 0,5 0,2 ÷ 4 ≤ 0,25 0,001 ÷ 0,5 0,001 ÷ 0,1
intracelulární rozpustný[g/l biomasy]
0,5 ÷ 5 0,2 ÷ 12 1 ÷ 4 0,001
intracelulární inkluze[g/l biomasy]
0,5 ÷ 5 1 ÷ 4
Expresní systémyExpresní systémyProdukt Společnost Systém
Koagulační faktory (VII, VIII, IX) Novo-Nordisk/Bayer/Centeon BHK buňky
Genetics Baxter/Centeon/Wyeth CHO buňky
Calcitonin Unigene E. coli
CHO buňky
DNáza (cystická fobróza) Roche CHO buňky
Erythropoetin Janssen–Cilag/Amgen/Boehringer CHO buňky
Darbepoetin Amgen CHO buňky
Folikuly stimulující hormon Serono/Organon CHO buňky
Luteinizační hormon Serono CHO buňky
Gonadotropin Serono CHO buňky
Glukagon Novo-Nordisk S. cerevisiae
Glukocerebrosidáza (Gaucher nemoc) Genzyme CHO buňky
Růstové hormony (somatotropiny) Upjohn/Lilly/Novo-Nordisk/Ferring E. coli
Serono Myší linie
Serono/Bio-Technology Gener. Corp CHO buňky
Eutropin LG Chemical S. cerevisiae
Growth factors (GCSF, GMCSF) Novartis/Essex/Amgen/Roche E. coli
Chugai Pharmaceuticals CHO buňky
Platelet derived growth factor (PDGF) Janssen-Cilag S. cerevisiae
Expresní systémyExpresní systémyProdukt Společnost Systém
PDGF-agonista ZymoGenetics S. cerevisiae
Hepatitis B vakcína GlaxoSmithKline S. cerevisiae
Rhein-Biotech H. polymorpha
Hirudin Aventis/Novartis S. cerevisiae
Insulin a muteiny Aventis/Lilly/Berlin-Chemie E. coli
Insulin Bio-Technology General Corp E. coli
Novo-Nordisk S. cerevisiae
Interferon alpha a muteins Roche/Essex/Yamanouchi E. coli
Interferon beta Schering E. coli
Biogen/Serono CHO buňky
Interferon gamma (mutein) Amgen/Boehringer E. coli
Interleukin 2 Chiron E. coli
Oprelvekin (agonista IL-11) Wyeth ROMI 8866
OP-1 (osteogenní, neuroprotekt. fakt) Curis/Striker E. coli
Tkáňový aktivátor plasminogenu Genentech/Roche/Boehringer CHO buňky
Aktivátor plasminogenu Genentech/Roche/Boehringer E. coli
Faktor kmenových buněk (SCF) Amgen CHO buňky
Tumor nekrosis faktor (TNF) Boehringer E. coli
Optimalizace kodonůExprese genů eukaryot nebo prokaryot
v euakryotním nebo prokaryotním
expresním systému
A B
Optimalizace kodonů
•Exprese genů eukaryot nebo prokaryot v euakryotním nebo prokaryotním expresním systému •Exprese cizorodých (virových) proteinů nečekaně nízká • Transgenem kódovaná mRNA využívá tRNA s jinou frekvencí než hostitelská buňka• Důsledek - buňka nemá dostatek některých tRNA pro translaci proteinu• možnost optimalizace kodonů (codon optimization)
• analýza pomoví www aplikací (in silico analýza)• k aa sekvenci se přiřadí nová cDNA , aby poměrné zastoupení tRNA
odpovídalo hostitelské buňce• cDNA lze připravit
• cílenou mutagenzou• připravit sunteticky buď celou nebo část
• Výtěžek rekombinantního proteinu se obvykle zvyšuje v rozsahu jednoho řádu• Kodonová optimalizace může zefektivnit například i DNA vakcinaci
Optimalizace kodonů
Optimalizace kodonů
Optimalizace kodonů
Izolace RNA
Proč RNA
• reprezentuje obraz aktuální proteinové produkce buněk, tkáně
• výhodné neboť odpadá nutnost eliminace intronů u eukaryotních genů
• přepis do cDNA možný i když neznáme kompletní sekvenci
• vhodné pro přípravu cDNA knihovny
Příprava na izolaci RNA
RNase free podmínky - RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor – nutno je denaturovat v prvním kroku manipulace s buňkami
roztoky (DEPC, certifikované chemikálie od dodavatelů)
laboratorní materiál
plast (chloroform - 2 hod; 0,1 – 0,02 % DEPC ddH2O – 2 hod)
(0.1 M NaOH, 1 mM EDTA - 2 hod; DEPC ddH2O – 2 hod)
(certifikovaný plast, nově otevřené balení standardního plastu)
sklo (mytí jako pro tkáně, žíhání horkovzdušný sterilizátor 180°C, 8 h
laboratorní přístroje (čistota, RNAzap, chloroform)
laboratorní pracovník (čistota, organizace práce, rukavice)
Resuspendovat bb. v denaturačním roztoku (10 ml/1g buněk)guanidin thiocyanate 4M (efektivní denaturace proteinů, RNA
solubilní)citrát sodný 25 mM pH7N-lauroylsarcosine 0.5 %2- ME 0.1 M těsně před použitím (1.8 ml)
přidat CH3COONa na finální 100 mM
přidat vodou saturovaný fenol (objem ekvivalentní objemu denat. roztoku)
přidat CH-IAA (0,2 objemu fenolu) homogenizovat a inkubovat 15 min 0°C
Kyselý F-Ch-IAA = DNA a proteiny v organické fázi
centrifugace a přenos vodní fáze do nové zkumavky a další reextrakce
precipitace ekvivalentním objemem isopropanolu
rozpuštění pelety v DEPC-ddH2O
Guanidinová metoda izolace totRNARNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor
– nutno je denaturovat v prvním kroku manipulace s buňkami
Směs všech komponent (kromě chloroform-IAA) v jednom roztoku je základem
mnoha komerčně dostupných kitů
Isogen (Nippon Gene)
RNA-Stat 60 (Tel-Test)
RNAzol B (Cinna Scientific)
Tri-Pure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim)
TRI Reagent (Molecular Research Center)
TRIzol Reagent (Life Technologies)
Guanidinová metoda izolace totRNARNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor
– nutno je denaturovat v prvním kroku manipulace s buňkami
Izolace RNA pomocí anexové kolony RNeasy
Aktivované silikagelové kolony umožňují purifikaci RNA pomocí guanidinových pufrů s proměnnou koncentrací solí (Qiagen)
Izolace NK pomocí výměnné chromatografie na anexu
DEAE RNA
DEAE aktivovaný silikagel - vazba DNA ovlivněna pH a koncentrace solí
vazba
promývání
eluce
Purifikace NK iontově výměnnou chromatografií na anexu
Purifikace NK iontově výměnnou chromatografií na anexu
Izolace RNA
savčí RNA (Qiagen) fungální RNA
Izolace RNA pomocí silika-kolony RNeasyZdroj Výtěžek totRNA (μg) max 100 μg Bb. kultura (1 x 106 bb.)NIH/3T3 10HeLa 15COS-7 35LMH 12Huh 15Myš/potkan tkáň (10 mg)Embryo (13 dní) 25Ledviny 20–30Játra 40–60Slezina 30–40Thymus 40–50Plíce 10–20Kvasinkovité houby (1 x 107 bb.)S. cerevisiae 25Rostliny (100 mg listů)Arabidopsis 35Maize 25Tomato 65Tobacco 60
Po izolaci je RNA rozpouštěna ve
H2O při -20°C může dojít k degradaci během několika hodin
formamid vhodné pro dlouhodobé uložení (- 80°C)
před reakcemi s enzymy nutno formamid ředit na max. koncentraci
5%, jinak zvyšuje stringenci, (jakoby reakce probíhala při vyšší
teplotě z pohledu hybridizačních podmínek)
EtOH precipitát při -20°C až -80°
před použitím přidat CH3COONa (pH5,2) na finální koncentraci 0.3M, precipitovat
peletu zpracovat jako obvykleykle
Využití inhibitorů RNáz
Placentarní inhibitor RNáz – pracovní koncentrace (25 to 50 U/ml)
Uložení RNA a protekce při enzymatické manipulaci
Příprava cDNA plné délky RACE
• Pokud je znám pouze fragment cDNA, mRNA• U eukaryontních mRNA
• Na 5’ konci mRNA se nachází metylační čepička• Na 3’konci polyA• systém gene RACE• kyselá pyrofosfatáza (TAP)
Příprava cDNA plné délky RACE
Molekulární klonování
Molekulární klonování
1. přenos jednoho fragmentu DNA do nebo mezi úseky DNA jiné
2. výhoda použití plasmidů
1. snadná analýza konstruktů (restrikce, PCR, sekvenování, ...)
2. přesná amplifikace v hostitelských buňkách (E. coli)
3. dostupnost obrovského spektra
1. klonovacích
2. expresních plasmidů
4. vhodné pro přenos do cílových buněk k indukci exprese proteinu
Kohezivní a tupé konce dsDNA
Manipulace DNA pomocí restrikčních enzymů
Poprvé popsány jako faktory resistence bakterií vůči DNA virům
Enzymy s velikostí 157 aa (PvuII) až 1250 aa (CjeI) a více
Isoschizomer - soubor různých restriktáz rozlišujících stejnou DNA sekvenci
Symetrie rozlišované DNA
palindrom - úsek dvouřetězcové DNA, jehož pořadí basí je v obou vláknech totožné při protisměrném čtení
nepalindromatické DNázy – většinou štípou mimo rozlišovanou sekvenci
(výhodné pro klonování DNA)
Restrikční fragment má buď
5´ přečnívající konec
3´přečnívající konec
tupý konec
Izolace DNA z agarosového gelu
Izolace DNA z agarosového gelu
Specielní hřebínek pro přípravu preparativní DNA elektroforézy
Zpracování gelu po separaci DNA
Izolace DNA z agarosového gelu
Manipulace DNA pomocí restrikčních enzymů
Určení velikosti štěpných fragmentů
- možnost využití www pro
určení poloh štěpných míst
- restrikční mapy plasmidů
Restrikční analýza
1. nejjednodušší a nejrychlejší nástroj primární analýzy nově připraveného
plasmidu
2. dostupné in silico nástroje pro predikci (pokud známe sekvenci)
3. nenáročné na laboratorní vybavení
4. restrikce a ligace je i nástroj pro klonování
Úpravy a analýza cílové sekvence - restrikce
Dva faktory určující specificitu (pozitivitu) restrikční reakce
přítomnost / nepřítomnost produktu
velikost produktu štěpení nutno stanovit
zde hraje roli rozdíl mezi
cirkulární DNA (plasmidy)
lineární DNA (PCR, chromosomální DNA)
1000
750
600
400
300
200
100
1 2 3 4
Restrikční reakce
restriktáza aktivita v U
10x restrikční pufr
voda
DNA
Rozdělení na TEA agarové elfo.
Manipulace DNA pomocí restrikčních enzymů
Agarosový gel separuje DNA 100 - 25.000 párů bází
Forma DNA
Morfologie pohyblivost
I suprahelix. negativ. relaxovaná pozitiv. nejvyšší nízká nejvyšší
II prostá (zářezy) cirkulární nízká
III lineární dvouvlákno vysoká
Mobilita DNA je určena supramolekulární strukturou
Využití PCR při molekulárním
klonování
PCR klonování - tupé, kohezivní, orientované
PCR metoda izolace a amplifikace DNA úseku
Výchozí materiál
1. mRNA - reverzní transkripce
2. genomická DNA
PCR amplifikace
1. přesná polymeráza proof reading
2. podmínky PCR reakce se liší teplotou extenze a teplotou hybridizace
3. celkově časově náročnější
4. pro další manipulaci je třeba vnést PCR produkt do vektoru
PCR návrh primerů
PCR návrh primerůhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
PCR návrh primerůhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
PCR metoda izolace a amplifikace DNA
Základní vlastnosti DNA polymeráz použitých pro amplifikaci
MDA (multiple displacement amplification) DNA
1. genomická DNA pomocí fágové 29 DNA polymerázy
2. 1 z 106−107 chyb ve srovnání s Tag, 3’- 5’proofreading aktivita
3. amplifikace úseků 7 – 10 kb
4. primery hexamery modifikované thiofosfátem na 3’konci
MDA amplifikace DNA úseku
multiple displacement amplificationVýchozí materiál
1. genomická DNA
2. randomizované primery
MDA - multiple displacement amplification
DOP-PCR - degenerate oligonucleotide primed PCR
Izolace DNA
Degradace tkáňové struktury a buňky
fyzikální postupy (krájení, drcení, tření, mletí, var)
chemické neenzymatické postupy
lýza bb. membrány detergenty neionogenními (Triton X100, NP-40)
Denaturace proteinů
ionogenní detergenty SDS, sarcosyl
chaotropní látky NaI, guanidin thyokyanát
enzymatické trávení proteinů proteináza K
Uvolnění DNA z buňky a nukleoprot. komplexů
Purifikace fenolem
denaturuje proteiny a některé denaturované rozpouští
Chloroform
denaturuje proteiny
stabilizuje rozhraní vodné a organické fáze
zvyšuje hydrofobicitu organické fáze
Isoamylalkohol
brání vzniku bublin během vortexování směsi P-Ch-IAA + H2O
Selektivní adsorpce proteinů pomocí hydroxylovaných silika-částic
Oddělení DNA od kontaminujícíh bb. složek
Precipitace DNA
etanolem (octan sodný, octan amonný – vysokomolekulární DNA)
nutná přítomnost solí – monovalentní 0,1 až 0,5 mM
jelikož se většinou nesráží – efektivní odsolení
v 70% EtOH je NaCl relativně solubilní
isopropanolem
Koncentrace DNA v roztoku
butanolem
adsorpce na skleněné mikročástice DNA > 500 bp, menší se neeluují
adsorpce na DEAE aktivovaný silikagel - běžné kolony 50 bp < DNA < 50 kbp
Extrakce DNA a její koncentrace
DNA lze uchovat
jako peletu (při přesušení je DNA špatně rozpustná)
jako precipitát v 70% EtOH
rozpuštěnou v pufru pH7,5 – 8
10 mM Tris-Cl (udržuje optimální pH)
1 mM EDTA (protekce DNA - chelatační činidlo vážící ionty nezbytné pro aktivitu DNáz)
uložit +4°C pro krátkodobé skladování
uložit -20°C pro dlouhodobé skladování
uložit -80°C pro archivaci
třeba rozvrhnout velikost alikvotů – předcházení opakovanému rozpouštění a zamrazování
Forma uložení DNA před zpracováním
Koncentrace DNA
UV spektrofotometrie při 260 nm
DNA A260 = 1 při koncentraci 50 ug/ml
RNA A260 = 1 při koncentraci 44 ug/ml
Kontaminace proteiny ovlivňuje efektivitu následných enzymatických procesů
UV spektrofotometrie A260 / A280 > 1,8
(směs 50% DNA a 50% proteinů A260 / A280 = 1,5
Kontaminace DNA nebo RNA ostatními NK
elektroforéza
Stanovení množství a čistoty NK
Fragmentace tkáně
drcení tkáně v tekutém dusíku
Digesce buněk a denaturace proteinů lyzačním pufrem 50°C, 12 hod
0,5 % SDS (denaturace proteinů)
0,1 mg/ml proteináza K (digesce proteinů)
25 mM EDTA (inhibice DNáz)
10 mM Tris-Cl pH8 (pufr)
100 mM NaCl
Extrakce fenolem
Precipitace EtOH (pro genomické knihovny je vhodnější dialýza)
Rozpuštění v TE, H2O, Tris-Cl pH8
Základní postup izolace genomické DNA
Použitelné až pro fágové (>60 kb) or cosmidové (>120 kb) genomické knihovny
Fragmentace tkáně
drcení tkáně v tekutém dusíku
Digesce buněk a denaturace proteinů lyzačním pufrem 55°C, 2 hod
100 mM Tris-Cl, pH 8.0
100 mM EDTA, pH 8.0 (eliminace aktivity četných DNáz)
250 M NaCl
100mg/ml proteináza K
po homogenizaci přidat N laurylsarkosin na finálních 1% (w/v)
Odstranění drtě centrifugací
Precipitace DNA isopropanolem a rozpuštění v TE
Přidání CsCl a EtBr a odstranění drobných precipitátů a RNA centrifugací
Ultracentrifugace DNA v gradientu CsCl (300 000 x g, 12 h)
Přenos DNA do nové zkumavky odmytí EtBr, precipitace DNA a rozpuštění v TE
CsCl - izolace genomické DNAPoužitelné pro rostlinné tkáně, houby - vysoká hladina polysacharidů
CsCl - izolace genomické DNAPoužitelné pro rostlinné tkáně, houby - vysoká hladina polysacharidů
Genomická DNA
Plasmidová DNA
RNA
maximálně 200 až 400 ug chromosomální DNA na 4 ml
gradientu
Proteináza K – genomická DNA – savčí buňky
2 mg DNA z 1 g tkáně nebo z 109 buněk.
DNA fragmenty > 100 kb a musí být štěpitelné restriktázami
CTAB – genomická DNA – rostlinná tkáň
100 to 500 ug DNA z 1 g čerstvé tkáně (DNA < 50 kb dlouhá)
kopurifikuje se i RNA což lze využít
CsCl – genomická DNA – rostlinná tkáň
10 až 40 ug DNA z 1 g čerstvé tkáně (DNA 50 kb dlouhá)
CTAB kombinovaná CsCl – genomická DNA – bakterie
0.5 až 2 mg DNA z 100 ml kultury (108 to 109 bakterií / ml)
Výtěžky NK při izolaci různými postupy
DEAE DNA
Purifikace DNA iontově výměnnou chromatografií na anexu
Purifikace DNA iontově výměnnou chromatografií na anexu
Kompatibilní lyzační pufry: 800 mM guanidine HCl30 mM Tris·Cl pH 8.030 mM EDTA, pH 8.05% Tween-200.5% Triton X-100
1.28 M sacharóza40 mM Tris·Cl, pH 7.520 mM MgCl24% Triton X-100
Purifikace DNA iontově výměnnou chromatografií na anexu
Výtěžek DNA při izolaci na anexu (Qiagen)
Vzorek Výtěžek NK bez RNázyA Výtěžek DNA po RNázaA (μg) (μg)
Krev (200 μl) 4–12 4–12
Buffy coat (200 μl) 25–50 25–50
Bb. kultura (5 x 106) 20–30 15–20
Játra (25 mg) 60–115 10–30
Mozek (25 mg) 35–60 15–30
Plíce (25 mg) 8–20 5–10
Srdce (25 mg) 25–45 5–10
Ledviny (25 mg) 40–85 15–30
Slezina (10 mg) 25–45 5–30
Transformace prokaryontních buněk
Chemická transformace E. coli
• velmi efektivní• standardně používaná ve většině laboratoří• nízké náklady na provedení
• vyhřívaná lázeň nebo kádínka s 42°C vodou je jediný přístroj • příprava chemicky kompetentních buněk
•CaCl2 •RbCl •CCMB80 (KOAc+CaCl2+MnCl2+MgCl2)
• vlastní transformace spočívá v přidání DNA ke kompetentním buňkám• krátká inkubace - dochází k adhezi DNA na povrch buněk• tepelný šok (42°C, 30-90 min) (DNA vstupuje do buňky)• preinkubace buněk v LB médiu (37°C, 1 hod)• vyočkování na tuhé selekční půdy
Elektroporace E. coli• dočasná destabilizaci buněčné membrány navozené elektrickým pulsem
• možnost připravit kompetentní bakterie předem
• bakteriální suspenze ve sterilní vodě při teplotě tání ledu
• uchování kompetentních bakterií v 10% vodném roztoku glycerolu při -80°C.
• podmínky elektroporace
• elektrický puls přes elektroporační kyvetu s kompetentními buňky a DNA
• koncentrace buněk
• množství DNA
• velikost elektroporační kyvety
• elektrické napětí
•kapacita
•případně odpor a průběh pulsu
Peleta z 25 ml bakteriální kultury O.D:600 = 0,3; 10 pg DNA; předchlazené elektroporační kyvety 0,1 cm štěrbina; 25 F; 1800 V; 200 Ω. Transfekční účinnost dosahuje 3,6x108 transformovaných E. coli na 1 g DNA.
Transfekce eukaryontních buněk
Metody transfekce savčích buněk
Chemické metody
•DEAE-dextran
•CaPO4
•Elektroporace
•Nukleofekce
•Liposomální transfekce
•Kationické polymery
•Gene gun
•Virové vektory
• buňky se připravují bezprostředně před elektroporací • promýváním v elektroporačním pufru například:
1. RPMI 16402. RPMI 1640, 10 mM dextróza, 0,1 mM dithiothreitol3. 1 x PBS4. 15 mM HEPES pufr5. elektroporační pufr 272 mM sacharóza, 7 mM fosfát sodný,
pH 7,4, 1 mM MgCl2 6. pufr o složení 50 mM K2HPO4, 20 mM CH3CO2K, 20 mM KOH,
pH 7,47. hypoosmolární elektroporační pufr
Elektroporace savčích buněk
Nukleofekce - nezveřejněné podmínky
Nukleofekce - nezveřejněné podmínky
Nukleofekce buněkNukleofekce buněk
DNA / polyplexyKationické polymery schopné vázat negativně nabitou DNA a
mediovat transport do buňky