濾　膜　法原理：與冗長的多管發酵法實驗過程中，以濾膜法測定大腸桿菌類顯的簡多。主 要原因是將水樣經由抽氣幫浦真空抽氣，使其通過孔徑 0.45±0.02μm、直徑為 47mm 之無菌濾膜，大腸桿菌類因無法濾過而留置於濾膜上。接著將以過濾的濾膜置於吸滿乳糖培養液或 Laury1 tryptose 培養液之飽和吸收墊上，在攝氏 35±0.5℃恆溫下培養 1.5~2 小時，接著取出濾膜移至 E-Endoagar 培養基或 M-Endo 培養液之飽和吸收墊上，攝氏 35±0.5℃恆溫下培養 22~24 小時。培養過程中，大腸桿菌類會分解乳糖，產生氣體和醛類，醛類會與培養基（液）中的鹼性洋紅染料結合，在光線反射下，呈現綠色金屬光澤的菌落，數據計算大腸桿菌類的數目。通常濾膜上總菌數在 200 以下，且大腸菌數 20~30 個時最適宜計數，若總菌數超過 200 個時，可將水樣進行稀釋後再進行實驗；令檢驗濁度較高或已知有大腸菌類的水樣時，則可利用較小體積的水樣來進行過濾。濾膜法大腸桿菌群密度的計算以 100ml 水中總大腸桿菌群菌落數（CFU/100ml）表示之。每張濾膜以能生約 50 個大腸桿菌群菌落且總數已不超過 200 個菌落為最適宜。　　菌落數以下列公式計算之：

大腸桿菌群密度（CFU/100ml）＝所選取之大腸桿菌群菌落數×100所有選取之過濾水樣之體積（ml）

　　倘若整片或部分濾膜長滿了大腸桿菌群菌落，以致無法分開計算，其結果以「大腸桿菌群成群及生長（confluent growth with）」表示之。若群集生長者為非大腸桿菌，也必須以「非大腸桿菌群成群」及生長紀錄之。遇此情況，則重新採樣檢驗。若由濾膜上的大腸桿菌群及非大腸桿菌群菌落之總菌落數超過 200 個或濾膜上之落菌無法明顯計算，可用「太多無法計算（Too numerous to count，TNTC）」來表示之，或另採新水樣檢測當重新檢測時，可將 100ml 之水漾分成多份分別過濾，以減少因濾膜表面菌落長的過份擁擠而造成的干擾。　　本實驗讓學生學習如何以濾膜法檢驗待測水樣中的大腸桿菌類數量，由實驗中利用 M-Endo agar 培養基或 M-Endo 培養液培養大腸菌類以及大腸菌類所形成之綠色金屬光澤菌落進行計數。

設備： Ⅰ 塑膠培養皿（直徑 2mm）。 Ⅱ 無菌濾膜（0.45±0.0mm）：膜上應有格線以利計數。

Ⅲ 吸收墊。Ⅳ 錐形瓶。Ⅴ 塑膠（玻璃）滴管。Ⅵ 量筒。Ⅵ 定量玻璃吸管。Ⅶ 秤藥紙。Ⅶ 取藥杓。Ⅷ 安全吸球。Ⅸ 鑷子。Ⅹ 不銹鋼吸管桶。ⅩⅠ 酒精燈。

儀器： Ⅰ 恆溫烘箱。 Ⅱ 電磁加熱攪拌器。 Ⅲ 電子分析天秤。 Ⅳ 恆溫培養箱。 Ⅴ 菌落計數器。 Ⅵ 過濾抽氣裝置。 Ⅵ 紫外線滅菌器。 Ⅶ 無菌操作台。 Ⅷ 解剖顯微鏡。

實驗步驟：Ⅰ熟知濾膜法檢測之原理及判斷方法。Ⅱ 使用之培養基為 M-Endo agar.配置方法為水 1000 ml 加入 51 g M-Endo agar 及20 ml 95%酒精，現僅需 30 ml 水。因此：M-Endo agar 51 / 1000 = X / 3095%酒精　 20 / 1000 = Y / 30

Ⅲ 放入磁石於電磁加熱攪拌器上加熱，錐形瓶蓋子不得鎖緊，並在外圍用紙箱圍住作為一個簡單的隔離。Ⅳ 隨時注意瓶內的加熱狀況，一但有出現沸騰的現象，要立即將瓶子從加熱器上移除（須戴上隔熱手套）。Ⅴ 到入空的小培養皿中，每個約 4 ~ 5 ml共 6 個，等待培養基凝固。Ⅵ 紀錄水樣來源（使用自來水）。Ⅶ 已連續 10倍稀釋，由原液取出 11 ml 加入另一個 100 ml 培養液混合均勻，

再取出 11 ml 加入另一個 100 ml 培養液，依此類推，至10−5

倍，因此水樣有 6

個濃度各 100 ml，分別為原液、10−1

、10−2

、10−3

、10−4

、10−5

倍。Ⅷ 取 0.45μm 孔徑之濾膜置於真空抽氣幫浦上，將水樣過濾。Ⅳ 過濾完後，將濾膜取出平鋪於凝固的 M-Endo 培養上，並標示水樣濃度。Ⅹ 隔天觀看結果（一般 < 200 個菌落才算數）。ⅩⅠ 計算原液中應有之菌數，並回答章節後的問題。ⅩⅡ 分別記錄同學之心得。ⅩⅢ依規定時間繳交報告。

實驗數據：原液無法計算(因原液太多菌落數,無法確實讀出)10被稀釋

CFU/100ml=(17*100/100)*10=1.7*10^2

10^2稀釋無金屬光澤菌落(因在吸取菌液時,恰巧吸取到無菌之液體)

10^3稀釋CFU/

1

0 0ml=(8*100/100)*10^3

= 8*10^2

10^4稀釋CFU/100ml=(11*100/100)*10^4=1.1*10^5

10^5稀釋CFU/

100ml=(14*100/100)*10^5=1.4*10^6

課本習題：

１．比較同一樣品以濾膜法、多管發酵法兩種實驗方法所記錄整理出來的數據，並參照法規（附錄四）所訂定之標準，是否樣品超過標準及受到大腸桿菌污染？請進行合理的解釋和推論。否，低於放流水標準。我們所採的水樣---崑山湖 一直都有在做保養和維護，如果有優養化之類的事件發生，學校也會迅速的處理解決

２．是述濾膜法與多管發酵法之間之異同及優缺點。濾膜法與多管發酵法之優缺點比較:優點: 1. 短時間可獲得結果；

2. 可增加水樣靈敏度較高具代表性；3. 培養基配置簡單；4. 水樣不需特別處理；5. 再現性高可直接計數；6. 經費較節省。

缺點: 1. 水中濁度太高不適合使用；2. 若有有毒物質會吸附或濃縮於濾膜上，不適合使用；3. 易受環境污染影響數據。

３．試述多管發酵法與濾膜法中所使用的 LST、BGLB、EMB 培養皿、M-

Endo 培養皿（液）之特性，並說明其主要用途為何？LST:有膽鹽作為表面張力抑制劑抑制大腸菌類以外之其它菌生長 用途:推定試驗,EX污水處理廠放流水、工業廢水。BGLB:煌綠和膽汁能抑制革蘭氏陽性及生成胞子之細菌生長 用途:確定試驗,EX 水廠配水、家庭用水。EMB:伊紅甲烯藍可抑制革蘭氏陽性菌之生長 用途:完成試驗,EX 原水或配水之水質控制，決定給水是否合乎安全。M-Endo:大腸菌類會分解乳糖產生氣體和醛類，醛類會和鹼性洋紅作用，產生綠色金屬光澤之菌落 用途:濾膜法,EX 實驗中來判定是否有大腸菌類。

4．試問濾膜法之操作流程?其實驗結果如何決定待測水樣中是否有大腸菌類?

Ⅰ 熟知濾膜法檢測之原理及判斷方法。Ⅱ 使用之培養基為 M-Endo agar.配置方法為水 1000 ml 加入 51 g M-Endo agar 及 20 ml 95%酒精，現僅需 30 ml 水。因此：M-Endo agar 51 / 1000 = X / 3095%酒精　 20 / 1000 = Y / 30

Ⅲ 放入磁石於電磁加熱攪拌器上加熱，錐形瓶蓋子不得鎖緊，並在外圍用紙箱圍住作為一個簡單的隔離。Ⅳ 隨時注意瓶內的加熱狀況，一但有出現沸騰的現象，要立即將瓶子從加熱器上移除（須戴上隔熱手套）。Ⅴ 到入空的小培養皿中，每個約 4 ~ 5 ml共 6 個，等待培養基凝固。Ⅵ 紀錄水樣來源（使用自來水）。Ⅶ 已連續 10倍稀釋，由原液取出 11 ml 加入另一個 100 ml 培養液混合均勻，

再取出 11 ml 加入另一個 100 ml 培養液，依此類推，至10−5

倍，因此水樣有 6

個濃度各 100 ml，分別為原液、10−1

、10−2

、10−3

、10−4

、10−5

倍。Ⅷ 取 0.45μm 孔徑之濾膜置於真空抽氣幫浦上，將水樣過濾。Ⅳ 過濾完後，將濾膜取出平鋪於凝固的 M-Endo 培養上，並標示水樣濃度。Ⅹ 隔天觀看結果（一般 < 200 個菌落才算數）。看濾膜紙上有無墨綠色金屬光澤

心得：信宏:再這一次的實驗，我們要用濾膜法來檢測大腸桿菌的菌落數，當配置培養基時要非常的小心，因為聽上一組說那是致癌物時，當下我還嚇了一跳，再來使用磁石攪拌器時也要格外的注意，磁石攪拌器的轉速不能過快，不然會看不到有氣泡的產生且蓋子不能旋緊周圍也要有防護的措施在。在使用真空過濾機時，我們做到最後一個是原液，在當時我們看它過濾速度的緩慢就知道這可能會數不出菌落了，再者在那原液中我們還看到了有生物在那邊游動啊!!

明哲:這次的實驗因為用道太多的培養液還其他組使用不夠.真是有點不好意思.但實驗要用我們也必須這樣所以沒辦法呀~~稀釋出的菌落雖然不容易數但真的好漂亮喔.有金屬綠色光澤就像寶石一樣.還使用道單操.那一台所謂的過濾抽器裝置.用起來也真的是很緊張.因為要考眼力.深怕把紙給搓破了證憲:對於我這一次的實驗¬---濾膜法，他的培養基聽說有會致癌，讓我很擔心自己會不會中標，結果...在到培養基時不慎漏了一些出來，還好友馬上清理掉，沒弄到手真是不幸中的大幸。而對於這次得實驗，中間有一段時間很無聊，原因是要稀釋樣本的培養液竟然還沒做好，在等的時間差點沒睡死。隔天在觀察我們做的實驗之前，我還怕沒有墨綠色光澤的菌，害我當天上課不太認真呢貢獻度:

明哲:%90

信宏:%100

証憲:%90