Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

MỞ ĐẦU

Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu hoá của

vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được coi là một

giải pháp rất hữu hiệu. Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất phong phú về

chủng loại và số lượng, những biến động về cơ cấu, số lượng các loài vi sinh vật

đường ruột là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến những rối loạn trong

tiêu hoá và hấp thu. Bởi vậy, việc sử dụng các biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn

và nuôi dưỡng nhằm tạo nên một thế cân bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đường

ruột theo hướng có lợi cho vật chủ đã và đang là hướng nghiên cứu được các nhà

nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm. Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ

cân bằng giữa các nhóm vi khuẩn có lợi và có hại trong đường tiêu hoá của gia súc,

gia cầm. Biện pháp cổ điển được ứng dụng rộng rãi từ những năm 1950 của thế kỷ

trước là sử dụng kháng sinh liều thấp. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong

thức ăn chăn nuôi ngày càng bị hạn chế (kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, các

nước thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi -

Hector Cervanter, 2006), nên nhu cầu tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh ngày

càng trở thành cấp bách. Một trong những giải pháp hữu hiệu nhất hiện nay là

probiotic. Probiotic - theo Fuller (1992)- là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích

trong thức ăn nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có

lợi cho vật chủ.

Các sản phẩm probiotic nhập khẩu dùng trong chăn nuôi có mặt trên thị

trường Việt Nam nhiều nhưng các đáp ứng tích cực cho vật nuôi chưa được rõ ràng.

Các nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật đó không phù hợp với hệ vi sinh

vật đường ruột của vật chủ bản địa. Mặt khác, các nghiên cứu sản xuất các chế

phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi ở nước ta còn rất hạn chế. Chúng tôi thực hiện

đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản

xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi” với định hướng đưa ra được

các giải pháp công nghệ để sản xuất các chế phẩm nói trên bằng các nguyên liệu

trong nước. Đề tài này được thực hiện thành công sẽ mở ra triển vọng trong việc sản

===========================================================

1

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

xuất các sản phẩm sinh học chất lượng cao, đáp ứng với yêu cầu ngày càng cao của

ngành chăn nuôi hữu cơ (hoàn toàn dựa vào các nguyên liệu từ thiên nhiên) theo

hướng công nghiệp ở nước ta, hạn chế nhập khẩu.

===========================================================

2

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Chương 1 – TỔNG QUAN

1.1. Lịch sử và định nghĩa probiotic

1.1.1. Lịch sử probiotic

Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser

(1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ

mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ

khỏe mạnh [53].

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng

minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh

vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc

ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn,

nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này

được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life

(1908) [53].

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất

mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về

probiotic [26].

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn

lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [27]. Cùng năm đó, các nhà nghiên

cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm

bệnh táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi

khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu

hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể

vật chủ không tự sản xuất ra được [26]. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên

men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal

health) được sản xuất. Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong

nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở

Châu Âu những năm của thập niên 80 [27].

===========================================================

3

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus

được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm

chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi.

1.1.2. Định nghĩa probiotic

Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ

probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi

sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989). Từ đó đến

nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh

vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước

uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm

probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa

được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều

trong các ấn phẩm khoa học: (i) theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi

sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa

theo hướng có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001),

probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số

lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”.

1.2. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của

vật nuôi

Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai trò

quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể. Do đó, nó là hệ thống

bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm. Thêm

vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng đặc hiệu và

không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Khu hệ vi sinh vật đường

ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân gây bệnh [36].

Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hoá của vật nuôi ở trạng thái vô trùng,

nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở thành những

“cư dân” bình thường trong đường tiêu hoá (WHO, 2001). Theo thời gian, do tiếp

===========================================================

4

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và tính

đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên. Số lượng tế

bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mười lần số

lượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng (Fonty, 1995). Số lượng loài có thể lên tới từ

400-500 (Tannock, 1999). Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau

của đường tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dày

đơn rất khác nhau (khoảng 101-103; 101-104; 105-108 và 109-1012 cfu/ml chất chứa

tương ứng) (Jans, 2005).

Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: trạng thái sinh lý của

vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật. Các yếu tố này chịu tác động của môi

trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau. Trong số các nhân tố trên, hệ vi

sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất lợi của một

trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật (Conway, 1994). Sự

cộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hoá của vật nuôi (chủ yếu là

trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật

được xác lập chỉ một thời gian rất ngắn sau khi sinh (Jans, 2005).

Có nhiều quan điểm khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi sinh

vật ruột. Theo Jans (2005), để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh vật ruột

được chia thành 3 nhóm (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài vi khuẩn kị khí

(Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides, Eubacteria); (2) nhóm vệ

tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus và E. coli, và (3) nhóm còn lại

(Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và

Pseudomonas… Một quần thể vi sinh vật được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các

nhóm dao động trong khoảng 90; 1,0 và 0,01% tương ứng. Trạng thái mà các nhóm

này hình thành một tỷ lệ 90:1:0,01 được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy Lạp

có nghĩa là sự chung sống có lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật chủ). Ở trạng

thái “eubiosis”, vật chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ổn định,

pH trung tính, dinh dưỡng và sự đào thải các chất chuyển hóa. Đổi lại, hệ vi sinh vật

sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu hóa các chất dinh dưỡng,

===========================================================

5

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K, loại trừ các vi sinh vật có hại,

tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong

đường tiêu hóa bị tác động bởi một số nhân tố vô sinh và hữu sinh như: sinh lý vật

chủ, khẩu phần thức ăn và cơ cấu nội tại của bản thân hệ vi sinh vật. Thức ăn là nền

dinh dưỡng cơ bản của vi sinh vật, bởi vậy sự thay đổi thành phần khẩu phần, thức

ăn không đảm bảo vệ sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý... đều làm tổn hại đến

trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật ruột. Tương tự như vậy, các chất bài tiết của hệ

tiêu hóa (dịch mật, các enzym, chất đệm và chất nhầy...) cũng như kiểu và tần số

nhu động ruột cũng tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật. Kiểu và tần số nhu động

ruột bị tác động rất lớn bởi các stress (sinh đẻ, cai sữa, dồn chuồng, vận chuyển...).

Khi quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ tạo nên trạng thái

“dysbiosis” (trạng thái “chung sống có hại”). Biểu hiện của trạng thái “dysbiosis” ở

vật chủ thường là thể tạng kém, sinh trưởng chậm và mắc các bệnh đường tiêu hóa

như tiêu chảy, viêm ruột hoại tử... (tóm tắt trạng thái eubiosis và dysbiosis có trong

bảng 1). Để cải thiện quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột ở vật nuôi, một

phương pháp thường được áp dụng là bổ sung vào khẩu phần thức ăn một số loại

kháng sinh liều thấp như những chất kích thích sinh trưởng. Tuy nhiên, việc sử

dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi một cách không có kiểm soát đã và đang

gây ra những hậu quả đáng lo ngại về vệ sinh an toàn thực phẩm và đặc biệt là gây

nên tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng của các vi khuẩn gây bệnh trên người

và vật nuôi. Hiện nay, khối liên minh châu Âu (EU) đã cấm sử dụng kháng sinh để

bổ sung vào thức ăn như chất kích thích sinh trưởng từ ngày 01 tháng 01 năm 2006.

Việc cấm sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi cũng đặt ra những thách thức

lớn về kỹ thuật, đặc biệt đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm non hoặc trong điều kiện

vệ sinh kém và vật nuôi chịu nhiều stress. Để vượt qua những thách thức đó, đã có

rất nhiều những nghiên cứu nhằm tìm ra tác nhân để thay thế kháng sinh nhưng an

toàn với vật nuôi. Một trong những tác nhân tìm ra đó là probiotic.

===========================================================

6

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Bảng 1: Tóm tắt trạng thái Eubiosis và Dysbiosis cùng các đặc điểm đặc trưng của

chúng

Trạng thái Eubiosis

- Sự cùng tồn tại giữa vật chủ và hệ vi

sinh vật đường ruột – Sự cộng sinh

- Sự bảo vệ bề mặt của đường tiêu hóa

chống lại các vi sinh vật xâm nhiễm.

- Kích thích hệ miễn dịch của vật chủ.

- Tiêu hóa các chất dinh dưỡng.

- Tổng hợp protein.

- Tổng hợp các vitamin

Trạng thái Dysbiosis

- Sự không cùng tồn tại giữa vật chủ và

hệ vi sinh vật đường ruột.

- Sự phá hủy biểu mô đường ruột, làm

cho thành đường ruột mỏng đi dẫn đến

giảm sự hấp thụ các chất dinh dưỡng.

- Sinh ra các cơ chất gây độc (NH3, chất

độc…)

- Phân hủy, tăng sản sinh khí gas (CH4,

H2S, CO2).

- Làm yếu hệ thống miễn dịch

- Làm tăng chu trình tế bào, cần nhiều

năng lượng

1.3. Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic

1.3.1. Vai trò của probiotic

Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng như chất kích thích sinh trưởng trong thức

ăn chăn nuôi ở một số nước thuộc khối liên minh châu Âu (bắt đầu là Thụy Điển

vào năm 1986) thì probiotic được coi là một trong những nguồn thay thế có triển

vọng nhất vì có nhiều đặc tính ưu việt. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhiều

tác giả, Patterson (2003) đã tổng kết các ảnh hưởng có lợi của probiotic đối với đời

sống động vật thể hiện ở các khía cạnh sau:

- Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi

cho vật chủ.

- Tăng cường khả năng miễn dịch.

===========================================================

7

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

- Giảm phản ứng viêm.

- Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.

- Tăng sản xuất các axit béo bay hơi.

- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B.

- Tăng hấp thu chất khoáng.

- Làm giảm cholesterol huyết thanh.

- Làm tăng năng suất vật nuôi.

- Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải.

Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi trường.

Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ không tạo ra

các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe người tiêu dùng.

1.3.2. Cơ chế tác động

Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần lớn

các tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại trừ; (ii) đối

kháng vi khuẩn và (iii) điều chỉnh miễn dịch (Steiner, 2006). Minh họa cơ chế hoạt

động của probiotic thông qua hình 1.

Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh

vật. Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật ruột là cạnh tranh vị

trí bám dính. Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các

vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác như E. coli,

Salmonella... Một số nấm men probiotic (Saccharomyces cereviese; S.boulardii)

không chỉ tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn khác mà còn gắn kết các vi khuẩn

có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại) thông qua các cơ quan thụ cảm mannose

và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm mạc ruột (Czerucka và Rampal, 2002).

Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì sự

sinh sôi với số lượng lớn của một loài vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm trọng

đối với các loài khác về nguồn cơ chất cho phát triển.

===========================================================

8

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic còn sản sinh các

chất kìm hãm vi khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng như một

số axit hữu cơ khác. Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ yếu

là do sự giảm thấp pH trong ruột (Conway, 1996).

Phản ứng miễn dịch được kích thích và hoạt tính kháng thể của vật chủ tăng lên

Cạnh tranh chất dinh dưỡng: các sinh vật probiotic cạnh tranh với các vi sinh vật gây bệnh các chất dinh dưỡng quan trọng.

Cạnh tranh loại trừ: các sinh vật probiotic khóa chặt các vị trí thụ cảm do đó loại trừ được các vi sinh vật gây bệnh

Màng chắn: nơi các sinh vật probiotic chiếm giữ các thụ cảm trên bề mặt ruột, độc tố được loại trừ

Gây bệnh: các vi sinh vật gây bệnh và chất độc của chúng bám vào niêm mạc và các thụ cảm trên ruột và phá hủy chúng

Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, ngăn cản sự bám dính và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh

Hình 1. Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic

Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có vú. Giữa hệ vi sinh vật ruột

và hệ thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù. Năng lực miễn dịch thể dịch và

miễn dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự cân

bằng của hệ vi sinh vật ruột (Cebra, 1999). Thông qua tương tác với hệ thống miễn

dịch ruột, các probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc

cả hai. Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào chủng

===========================================================

9

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

giống hoặc các loài vi khuẩn probiotic (Dugas và ctv, 1999). Tuy nhiên, cơ chế tác

động của probiotic đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chưa được

hiểu biết đầy đủ.

1.4. Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic

1.4.1. Lựa chọn các chủng probiotic

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn

cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh

(colonization) trong đường tiêu hóa vật chủ. Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp

lý hóa thông qua các thí nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng có

tiềm năng như là nguồn probiotic [22].

Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu

sau:

Tính bám dính trên bề mặt đường tiêu hóa hoặc các tế bào biểu mô: Các chủng

probiotic phải bám dính được vào thành ruột non, khu trú tốt trong đường tiêu hoá

và sinh sôi nảy nở. Khả năng bám dính được xem là một yêu cầu quan trọng để tăng

khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô và tăng khả năng miễn dịch

của vật chủ. Đặc tính này làm tăng khả năng cạnh tranh của các chủng probiotic với

các vi sinh vật bất lợi khác.

Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được các

chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trong

phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh

như E. coli, Salmonella và Campylobacteria. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có

thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:

+ Sản sinh ra các chất Bacteriocin.

+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic.

+ Tạo ra H2O2.

+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau.

+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.

===========================================================

10

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh.

Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày: Khoang miệng và dạ dày của

vật chủ là nơi có môi trường axit pH từ 2-3 và có mặt các enzym tiêu hoá (amylaza,

proteaza, lysozym…). Các chủng vi sinh vật được coi như là nguồn probiotic phải

tồn tại được trong điều kiện này. Hiện nay các công ty đã khuyến cáo dùng vỏ bọc

(microcapsute) với chế phẩm probiotic nhằm tăng khả năng sống của vi khuẩn

probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày.

Khả năng chịu muối mật: Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của

động vật dao động 1-3% [48]. Để tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải có

khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%, ngoài ra một số chủng

probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh enzym tiêu hoá

như: amylaza, xenlulaza và proteaza, lipaza và phytaza có vai trò làm tăng khả năng

tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ.

1.4.2. Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic

Vi khuẩn lactic: gồm 2 chi vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và

Bifidobacterium.

Các loài thuộc chi Lactobacillus: L. acidophilus, L. amylovorus, L. brevis, L. casei,

L. casei subsp. rhamnosus (Lactobacillus GG), L. caucasicus, L. crispatus, L.

delbrueckii subsp. bulgaricus (L. bulgaricus), L. fermentum (L. fermenti), L.

gasseri, L. helveticus, L. johnsonii, L. lactis, L. leichmannii, L. paracasei, L.

plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus

Các loài thuộc chi Bifidobacterium: B. adolescentis, B. bifidum, B. breve, B.

infantis, B. lactis (B. animalis), B. licheniformis, B. longum

Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic Lactobacillus và

Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii,

Saccharomyces cerevisiae.

1.4.3. Công thức chế phẩm probiotic

===========================================================

11

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Như đã trình bày ở phần 1.4.2 có 3 đối tượng chủ yếu cho nghiên cứu phát

triển chế phẩm là vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và nấm men. Vai trò cũng như

cơ chế tác động của chúng lên vật chủ rất khác nhau [36], cụ thể có trong bảng sau:

Bảng 2: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic lên vật chủ

Vi khuẩn lactic Vi khuẩn Bacillus Nấm men

- Sinh bacteriocin

- Cạnh tranh vị trí bám.

- Sinh các peptit, kích thích hệ

thống miễn dịch của vật chủ.

- Cạnh tranh dinh dưỡng và vị trí

bám vào biểu mô.

- Sinh các axit hữu cơ, tăng hiệu

quả hấp thu chất dinh dưỡng.

- Sinh enzym phân

giải các cơ chất như

tinh bột, xenluloza;

kích thích tiêu hoá.

- Sinh axit hữu cơ, kích

thích tiêu hoá

- Hấp thu chất độc và

cạnh tranh dinh dưỡng,

vị trí bám trên biểu mô

với vi sinh vật gây

bệnh.

Tuỳ thuộc vào từng loại sản phẩm mà có thành phần vi sinh vật khác nhau.

1.4.4. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic

Việc nghiên cứu, phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn nuôi

bắt đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia súc, gia cầm

[9]. Như vậy các chủng vi sinh vật đã qua nhiều khâu tiếp xúc với con người, môi

trường trước khi vào cơ thể động vật. Điều này cho thấy là yêu cầu an toàn đối với

chủng vi sinh vật là vấn đề quan trọng nhất đối với vật nuôi, con người và môi

trường. Đối với động vật cần có thời gian thử nghiệm từ 1-3 tháng, kiểm tra các chỉ

tiêu tăng trọng, phản ứng cơ thể, theo dõi các bệnh tiêu hoá, bệnh nhiếm khuẩn và

các phản ứng phụ. Ngoài ra cần có những thông số phân tích sinh hoá về máu và

đánh giá chỉ số coliform trong phân. Đối với con người không cần thiết phải thử

nghiệm như trên động vật nhưng cần chú ý các phản ứng phụ như dị ứng với da,

mũi, mắt (Arturo et al, 2006). Với môi trường cần đảm bảo là vi sinh vật không có

hại đối với con người và động vật, không mang gen lạ. Nói chung các chủng vi sinh

vật probiotic có nguồn gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi) là các

===========================================================

12

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

chủng được khuyến cáo sử dụng. Tổ chức FAO (2002) đưa ra hướng dẫn với việc

tuyển chọn các chủng probiotic, ngoài các đặc tính probiotic và đảm bảo an toàn thì

các chủng này phải được cụ thể hoá các thông tin về nguồn gốc chủng, tên phân loại

đến chi và loài. Đối với vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu Âu đã lập một Uỷ

ban khoa học về dinh dưỡng động vật (SCAN: scientific committee for animal

nutrition) đưa ra những quy định đánh giá an toàn đối với sản phẩm và những

khuyến cáo cho vấn đề này qua các điều luật và kỹ thuật online ((SCAN, 2000).

Tổ chức FAO (2002) khuyến cáo các chủng probiotic không những cần được

phân loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo tàng vi sinh

vật đạt tiêu chuẩn quốc tế. Quy trình sản xuất phải theo tiêu chuẩn GMP (Good

Manufacturing Practices).

1.4.5. Phân loại vi sinh vật

Yêu cầu tiên quyết là các chủng vi sinh vật probiotic phải được định danh

chính xác đến chi (genus) và loài (species) (FAO, 2002). Hiện nay, trên thị trường

có nhiều loại KIT định danh vi sinh vật khác nhau như API 50CH, API-20E... Tuy

nhiên các KIT này được phát triển dựa trên các đặc tính sinh lý và sinh hoá của các

vi sinh vật đã biết, vì vậy với yêu cầu định danh chính xác cần kết hợp các đặc tính

phân loại về hình thái, sinh lý sinh hoá và sinh học phân tử. Phương pháp định danh

dựa theo sinh học phân tử hiện nay chủ yếu vẫn là dựa theo kỹ thuật giải trình tự

đoạn gen mã hoá cho ARN riboxom 16S (đối với vi khuẩn) và đoạn D1D2 của gen

mã hoá cho ARN riboxom 28S hoặc vùng ITS (đối với nấm men). Trong những

điều kiện cho phép thì người ta tiến hành kỹ thuật lai ADN với các chủng chuẩn để

khẳng định vị trí phân loại của chủng nghiên cứu tới loài.

1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam

1.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên

thế giới

Việc sử dụng thực phẩm có probiotic (hoặc như 1 thành phần tự nhiên của

thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng việc nghiên

===========================================================

13

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotic mới thực sự phát triển từ những

năm 80 của thể kỷ 20 (Patterson và ctv, 2003). Những nghiên cứu phân loại và đặc

điểm của quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật được tiến hành bởi

Savage (1987); Vahjen và ctv (1998); Apajalahti và ctv (1998); Vander Wielen và

ctv (2000) đã cho thấy nếu như trong ruột non của người Bacteroides và

Bifidobacterium chiếm ưu thế thì ở gà là Ruminococcus và Streptococcus. Bằng kỹ

thuật phân tử, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 đến 50% số loài

vi sinh vật đường ruột ở động vật được phân lập, nuôi cấy như nguồn probiotic

(Patterson và ctv, 2003). Apajialahti và ctv (1998); Netherwood và ctv (1999);

Gong và ctv (2002); Zhu và ctv (2002) đã sử dụng kỹ thuật phân tử để nghiên cứu

sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở

động vật dưới tác động của probiotic. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào

góp phần tạo nên 1 hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi

sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ (Patterson và ctv, 2003). Đã có

rất nhiều nghiên cứu về vai trò của probiotic đối với đời sống động vật như tác động

của probiotic đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc ruột (Schat và Myer, 1991;

Hersbberg và Mayer, 2000); đối với sự thay đổi của niêm mạc ruột non ở vật nuôi

(Glick, 1995; Fontaine và ctv, 1996; Dai và ctv, 2000; McCracken và Lorenz,

2001).

Những ảnh hưởng có lợi của probiotic thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau

nhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotic còn rất hạn

chế. Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotic trong việc ức chế sự phát

triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất

quan trọng. Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh

dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi (các axit béo bay hơi, các chất

giống kháng sinh...), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ

thống miễn dịch ruột (Fuller, 1989; Gibson và Fuller, 2000; Rolfe, 2000; S.C.

Knight và cs, 2009).

Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nhờ ứng dụng những tiến bộ kỹ thuật trong

===========================================================

14

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật giải trình tự axit nucleic trong nghiên

cứu phân loại và định danh các chủng vi sinh vật, công nghệ sản xuất các sản phẩm

probiotic phục vụ chăn nuôi ngày càng trở nên dễ dàng và phổ biến hơn ở nhiều

nước trên thế giới. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu về sử dụng các sản phẩm

probiotic trong chăn nuôi rất khác nhau, đôi khi trái ngược nhau. Nhiều nghiên cứu

bổ sung chế phẩm probiotic trên lợn và gà cho thấy có đáp ứng tích cực (Henrich và

ctv, 2006): tăng cường khả năng miễn dịch ở lợn con; tăng tỷ lệ tiêu hóa các chất

dinh dưỡng; tăng hiệu quả sử dụng thức ăn...). Bên cạnh đó cũng có nhiều nghiên

cứu đã chứng tỏ hiệu quả không rõ rệt của việc bổ sung các chế phẩm probiotic trên

lợn (Breston và ctv, 1995): không quan sát thấy ảnh hưởng tích cực của probiotic

(Lactobacillus) bổ sung trong khẩu phần cho lợn cái và đực thiến ở giai đoạn lợn

choai và vỗ béo; Navas-Sanchez và ctv (1995): khuyến cáo rằng đối với lợn con sau

cai sữa không nên sử dụng các chế phẩm probiotic; Galassi và ctv (2001): không

thấy có sự khác nhau về tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng năng lượng ở các

nhóm lợn thí nghiệm và đối chứng được ăn thức ăn có và không có bổ sung

probiotic...

Có rất nhiều ý kiến khác nhau khi giải thích sự khác biệt của các kết quả

nghiên cứu, nhưng ý kiến được nhiều nhà khoa học thống nhất là các chế phẩm

probiotic tạo nên các đáp ứng tích cực ở gia súc và gia cầm chỉ khi nó có đầy đủ các

đặc tính probiotic, sự thiếu một hoặc nhiều các đặc tính của probiotic có thể là

nguyên nhân chủ yếu của các đáp ứng âm tính.

1.5.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt

nam

Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu sản xuất probiotic phục vụ cho đời sống

dân sinh nói chung và chăn nuôi nói riêng còn rất mới mẻ và bắt đầu được quan tâm

trong khoảng một thập kỷ gần đây. Lê Thanh Bình và ctv (1999) đã sản xuất chế

phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và nuôi thử nghiệm trên gà Broiler cho

thấy quần thể vi sinh vật đường ruột thay đổi theo chiều hướng tích cực, các vi

===========================================================

15

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

khuẩn lactic tăng, E.coli giảm rõ rệt ở nhóm gà được ăn thức ăn có thức ăn bổ sung

PRO99. Khối lượng cơ thể lúc 50 ngày tuổi của gà ở nhóm được ăn thức ăn có bổ

sung PRO99 cao hơn so với đối chứng 10,6%. Phạm Ngọc Lan và ctv (2003) đã

phân lập được hai trong số 789 chủng vi khuẩn lactic trong ruột gà. Bằng các

phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định được các

chủng CH123 và CH156 có những tính chất probiotic gần với Lactobacillus agillis

và Lactobacillus salivarius (có khả năng đề kháng được với 40% axit mật; sinh

trưởng được ở môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với

Salmonella, E.coli) có khả năng sử dụng như nguồn probiotic ứng dụng trong chăn

nuôi. Nguyễn Thị Hồng Hà và ctv (2003) đã sử dụng hai chủng Bifidobacterium

bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic, bước đầu đã

nghiên cứu được công nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun. Chế phẩm sau 6

tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức 106 CFU/g và có khả năng ức chế vi

khuẩn Salmonella. Nguyễn Thùy Châu (2003) thông báo đã lựa chọn được chủng

nấm men Candida ultilis CM 125 cho sinh khối cao trên môi trường rỉ mật, bước

đầu đã đưa ra quy trình công nghệ sản xuất sinh khối loại nấm men này. Nguyễn La

Anh và ctv (2003) đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic BC 5.1 từ nước bắp cải

muối chua và đã xác định được rằng chủng vi khuẩn này có tính chất probiotic và

có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm Biochie dạng dung dịch (từ vi khuẩn

Bacillus và Lactobacillus) với mật độ 108 CFU/ml có tác dụng cải thiện môi trường

nước nuôi tôm, cá. Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hồng Hạnh và ctv (2003) đã nghiên cứu

sản xuất hai chế phẩm probiotic BIO I và BIO II. Chế phẩm BIO II gồm các nhóm

vi khuẩn Lactobacillus, Bacillus và nấm men Sacharomyces phối hợp với các

enzym -amylaza và proteaza dùng trong xử lý môi trường nước nuôi tôm, cá và

chế phẩm BIO I dùng trong chăn nuôi. Hiện nay chế phẩm BIO II đã được ứng

dụng rộng rãi nhưng chế phẩm BIO I hiệu quả sử dụng chưa cao.

Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường:

===========================================================

16

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Bảng 3: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường

Sản phẩm Nước sản xuất

Vi sinh vật sử dụng và mật độ (CFU/g)

Vi khuẩn Lactic Bacillus Nấm men

BioGuard Việt Nam 107

E.lac Hàn Quốc 2 x 107 4 x 107

BioSix Việt Nam 105 105

Lactacids Việt Nam 107

Adepro Việt Nam 107

Lactizym Việt Nam 6 x 105

Ferment Trung Quốc 109

Lacto-Sacc Mỹ 2,5 x 108 4,6 x 106

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

===========================================================

17

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Nguồn vi sinh vật

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích từ các nguồn khác nhau: chất

chứa trong đường tiêu hóa của lợn, gà; các nguồn khác nhau trong tự nhiên (đất, các

thực phẩm lên men…)

- Các vi sinh vật kiểm định: E.coli, Shigella sp., Salmonella sp… từ Bảo tàng giống

Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia

Hà Nội

2.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng

2.1.2.1. Hóa chất

Glucoza; MgSO4.7H2O; NaCl; K2HPO4; CaCO3; FeCl3.6H2O; Pepton; cao

nấm men; cao malt; Tween 80; cao thịt; KI; I2 và các hóa chất khác của hãng

Merck, Sigma…

2.1.2.2. Máy móc và dụng cụ

Các máy móc, dụng cụ được sử dụng có tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật

(VTCC) – Viện Vi Vinh Vật – Đại học Quốc gia Hà Nội. Bao gồm:

Kính hiển vi quang học (Olympus, Nhật Bản)

Nồi lên men (Hanil R&D- Hàn Quốc)

Máy sấy phun (Changzou SPD-5, Trung quốc)

Máy ly tâm lạnh C30P (Sigma, Đức)

Máy điện di ADN, máy phát hiện ADN trên gel (Biorad, Mỹ)

Máy đo pH (Horiba, Nhật Bản)

Máy lắc ổn nhiệt (Metler, Thụy Sĩ)

Máy PCR Mastercycler gradient (Eppendorf, Đức)

Máy đo quang phổ Ultrospec 3000 pro (Anh)

Tủ cấy vô trùng (Nuaire, Mỹ)

Cân điện tử (Precisa, Thụy Sĩ)

===========================================================

18

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

2.1.3. Môi trường nghiên cứu

2.1.3.1. Môi trường MRS (g/l):

Đường glucoza 20,0 K2HPO4 2,0

CaCO3 5,0 CH3COONa 5,0

Cao thịt 10,0 Triamoni xitrat 2,0

Pepton 10,0 MgSO4.7H2O 0,58

Cao nấm men 5,0 MnSO4.4H2O 0,28

Tween 80 1 ml Nước cất vừa đủ 1000 ml

pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút Thạch 15,0

Môi trường dịch thể bỏ thạch và CaCO3

2.1.3.2. Môi trường LB (g/l):

Bacto-Tryptone 10 NaCl 10

Cao nấm men 5 Nước cất vừa đủ 1000 ml

pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút

2.1.3.3. Môi trường thạch thường (g/l):

Thạch 15,0 NaCl 1,0

Pepton 5,0 Nước cất vừa đủ 1000ml

Cao thịt 2,0

pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút

2.1.3.4. Môi trường YM (g/l):

Glucoza 10,0 Cao nấm men 3,0

Pepton 5,0 Thạch 15,0

Cao malt 3,0 Nước cất vừa đủ 1000 ml

pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút

2.1.3.5. Môi trường Mueller Hinton (g/l):

Cao thịt 2,0 Tinh bột 1,5

===========================================================

19

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Axit casein Hydrolysate 17,5 Thạch 15,0

Nước cất vừa đủ 1000 ml

pH= 7,3; khử trùng ở 121oC/15 phút

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Các phương pháp định tính và định lượng

2.2.1.1. Định tính axit lactic

Đánh giá khả năng sinh axit của các chủng vi sinh vật bằng phương pháp đục

lỗ. Phương pháp như sau: lấy phần dịch nuôi cấy các chủng phân lập được ly tâm

lạnh 12000 vòng/phút lấy dịch trong. Nhỏ phần dịch trong vào các giếng trên đĩa

thạch đã có CaCO3, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Khả năng sinh axit của các

chủng vi khuẩn được tính đánh giá thông qua đường kính vòng trong phân giải

CaCO3.

∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng trong phân giải CaCO3 (mm).

d: đường kính lỗ thạch (mm).

2.2.1.2. Định lượng axit lactic theo Therner [61]:

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng hấp phụ màu của dịch axit lactic mà vi khuẩn sinh

ra với phenolphtalein. Ta xác định được hàm lượng axit lactic của mẫu.

Tiến hành: Lấy 10ml dịch lên men đã li tâm bỏ sinh khối, bổ sung 20ml nước cất và

thêm 2 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 900). Sau đó chuẩn độ bằng

NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại

thể tích NaOH (ml) đã dùng. Độ axit được tính như sau:

% axit lactic = VNaOHtiêu tốn x 0,009 (g/l)

2.2.1.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn

===========================================================

20

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp đục lỗ. Phương

pháp như sau: môi trường thử hoạt tính kháng khuẩn được đổ trên đĩa Petri (đã chứa

vi khuẩn kiểm định), sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch. Nhỏ

phần dịch trong (dịch nuôi cấy đã li tâm) vào các lỗ đã đục, để ở 40C trong 6 giờ,

sau đó mang các đĩa thạch để 370C. Sau 24 giờ quan sát vòng kháng khuẩn tạo

thành. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được tính bằng

đường kính vòng kháng khuẩn ∆D.

∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng vô khuẩn (mm).

d: đường kính lỗ thạch (mm).

Khả năng sinh bacteriocin: dịch trong thu được sau li tâm được trung hòa bằng

NaOH 0,1N (mục đích trung hòa axit tạo thành), sau đó làm tiếp tục các bước như

trên để xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic được tuyển

chọn.

2.2.1.4. Xác định hoạt tính enzym

Hoạt tính enzym được xác định bằng phương pháp đục lỗ. Phương pháp như

sau: Bản thạch thử hoạt tính enzym (cơ chất tinh bột, xenluloza) được đổ trên đĩa

Petri, sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch. Nhỏ dịch enzym vào

các lỗ đã đục, để ở 370C trong 24 giờ, sau đó nhuộm bằng thuốc thử Lugol để vòng

phân giải cơ chất hiện rõ. Đo vòng phân giải D-d (mm), D là đường kính vòng

ngoài, d là đường kính lỗ nhỏ dịch.

2.2.2. Phương pháp phân lập

2.2.2.1.Vi khuẩn lactic

Để phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu chất chứa trong đường tiêu hóa, các

nguồn khác nhau trong tự nhiên, sử dụng phương pháp pha loãng mẫu bằng nước vô

trùng, cấy gạt dịch pha loãng ở nồng độ 10-3 và 10-5 trên đĩa Petri chứa môi trường

MRS, sau đó phủ tiếp 1 lớp thạch mỏng để tạo điều kiện kị khí. Nuôi ở 370C trong

48 giờ. Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa Petri, tách và thuần khiết các

===========================================================

21

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

khuẩn lạc có vùng trong suốt xung quanh (axit phân giải CaCO3 tạo vòng trong).

Bảo quản giống trong ống nghiệm môi trường MRS thạch nghiêng. Mỗi mẫu phân

lập chọn các khuẩn lạc có hình thái khác nhau và quan sát tế bào dưới kính hiển vi.

2.2.2.2. Vi khuẩn Bacillus

Mẫu trước khi pha loãng ở nồng độ tương tự như phân lập vi khuẩn lactic

được xử lý ở nhiệt độ 800C/30 phút, sau khi pha loãng, dịch mẫu được gạt trên đĩa

Petri chứa môi trường thạch thường. Nuôi ở 370C trong 48 giờ. Tách và thuần khiết

các khuẩn lạc tạo thành.

2.2.2.3. Nấm men

Phương pháp làm tương tự như trên, nhưng thay bằng môi trường YM có bổ

sung kháng sinh cloramphenicol. Nuôi cấy các đĩa Petri đã gạt mẫu ở 300C. Sau 48

giờ chọn các khuẩn lạc tạo thành và soi dưới kính hiển vi quang học.

2.2.3. Phương pháp tuyển chọn

2.2.3.1. Vi khuẩn lactic

Sau khi thuần khiết các chủng vi khuẩn lactic phân lập được, tiến hành tuyển

chọn các chủng có khả năng sinh axit lactic cao (định tính) và khả năng sinh

bacteriocin kháng vi khuẩn kiểm định.

2.2.3.2. Vi khuẩn Bacillus

Sau khi thuần khiết các chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành tuyển chọn

các chủng có khả năng sinh enzym amylaza và xenlulaza cao và khả năng kháng vi

khuẩn kiểm định.

2.2.3.3. Nấm men

Tuyển chọn các chủng nấm men phân lập được thông qua đánh giá khả năng

kháng các vi khuẩn kiểm định.

2.2.4. Phương pháp phân loại

===========================================================

22

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

2.2.4.1. Phân loại vi khuẩn

Phương pháp sinh lý, sinh hóa

Nhuộm gram

Nguyên tắc: Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trò đặc biệt trong việc phân loại

vi khuẩn. Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với tím kết tinh

và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào. Khi vi khuẩn

Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hoà tan làm tăng tính thấm của

màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím – iot và làm cho vi khuẩn mất màu. Khi

nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc này (Đỏ vàng với Safranin hay đỏ tía

với Fuchsin). Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co

lại do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào.

Tiến hành: Dùng que cấy vô trùng lấy dịch huyền phù tế bào vi khuẩn đặt lên phiến

kính. Cố định tiêu bản bằng ngọn lửa rồi nhuộm thuốc đầu bằng dung dịch tím kết

tinh (crystal violet) trong khoảng 1 phút. Rửa bằng nước. Nhuộm tiếp bằng dung

dịch Lugol trong 1 phút. Rửa bằng nước. Phủ lên vết bôi dung dịch etanol 95% :

axeton (1:1) trong khoảng 1 phút. Lại rửa bằng nước. Sau đó nhuộm tiếp bằng thuốc

nhuộm màu đỏ (như Safranin hay Fuchsin Ziehl) trong 30 giây - Rửa qua nước, để

khô, soi kính.

Xác định khả năng đồng hóa các loại đường

1% các loại đường sử dụng thay cho glucoza trong môi trường MRS (vi khuẩn

lactic), LB (vi khuẩn Bacillus): L-arabinoza, D-riboza, D-Xyloza, D-fructoza, D-

mannoza, D-mannitol, D-sorbitol, lactoza, trehaloza, raffinoza, Na-gluconat.

Môi trường được chia vào các ống nhỏ. Cấy vi sinh vật, để 2 -3 ngày.

Đối chứng dương được cấy trên môi trường chứa glucoza, đối chứng âm được cấy

trên các môi trường không chứa nguồn đường nào.

Thử khả năng lên men nguồn đường glucoza (chỉ với vi khuẩn lactic)

===========================================================

23

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Nguyên tắc: Việc phát triển trên môi trường với các hợp chất này có thể làm dẫn

đến việc tích luỹ các axit hữu cơ, các sản phẩm trung hoà, các loại khí.

Cách tiến hành: Sử dụng môi trường dịch thể (Glucoza - 2%). Cho vào mỗi ống

nghiệm 2ml môi trường cơ sở và 1 ống Durham để ngược. Khử trùng ở 121oC/15

phút. Bổ sung 100l dịch vi khuẩn vào mỗi ống, nuôi cấy trong 1-2 ngày. Quan sát

khả năng sinh khí CO2, nếu sinh khí là lên men dị hình và ngược lại là lên men đồng

hình.

Phản ứng catalaza (chỉ với vi khuẩn lactic)

Phần lớn các chủng vi khuẩn lactic có phản ứng catalaza âm tính nhưng đặc biệt có

một số loài thuộc chi Pedioccocus lại có phản ứng catalaza dương tính gọi là

“Catalaza giả” như P. pentosaceus do chúng không nhảy cảm với cyanide và azide

và không chứa một nhóm giả của Haem (C34H3204N2Fe).

Tiến hành: Nhỏ trực tiếp vài giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc vi khuẩn, quan sát

sự xuất hiện bọt khí bằng mắt thường.

Phương pháp sinh học phân tử

Xác định trình tự rARN 16S của các chủng vi khuẩn theo phương pháp của

Sakiyama và cs (2009).

Tách chiết ADN

- Ly tâm 1.5ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào.

- Hoà sinh khối tế bào trong 100 l TE ( TE buffer: 15 mM Tris-HCl +1 mM EDTA

(pH 7,5)).

- Thêm 0,4 mg lysozym. Trộn đều, ủ 370C/1 giờ. Trộn đều 3 phút.

- Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 370C/30 phút.

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn

đều. Ly tâm 15000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác.

- Thêm 8 l ARNaza 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút.

- Thêm 12 l proteinaza K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 560C.

===========================================================

24

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn

đều. Ly tâm 15000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác.

- Thêm 1 thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm

15000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác.

- Thêm 1/ 10 V Natri axetat 3M và 1ml Etanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30

phút. Ly tâm 15000v/p trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên.

- Rửa tủa bằng Etanol 70%.

- Làm khô ADN bằng máy cô quay chân không.

- Hoà tan ADN trong 50-100l nước hoặc TE.

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di:

Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza:

1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập

trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l

mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế

100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr

(nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel

Phản ứng khuếch đại ADN.

Thành phần phản ứng:

Thành phần Thể tích (l)

10X buffer 10

MgCl2 8

dNTP 2.0 mM 10

Primer xuôi (10 pmol/l) 2

Primer ngược (10 pmol/l) 2

Taq polymerase 2

Template 1-2

H2O cho đủ 100

Chu trình nhiệt:

===========================================================

25

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

950C - 3 phút

950C - 30giây

560C - 15 giây 30 chu kỳ

720C - 1 phút

720C - 5 phút

40C -

Primer:

Primer xuôi : 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.

Primer ngược: 1525R 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza:

1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập

trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l

mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế

100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr

(nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel

Tinh sạch sản phẩm PCR.

- Sử dụng bộ kit QIA gen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

+ Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều.

+ Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút .

+ Đổ bỏ dịch phía dưới cột.

+ Bổ sung 750 l PE buffer lên cột. Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

+ Đổ bỏ dịch dưới cột

+ Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút

+ Chuyển cột sang ống eppendoft mới

+ Thêm 30l nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút

+ Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

+ Lấy dịch phía dưới.

===========================================================

26

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

- Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:

Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh

sạch: OD260/OD280 > 1,7

Phản ứng khuếch đại ADN cho sequence:

- Terminator Ready Reaction Mix (Termix):

Buffer 5X 9l

Bigdye Ready Reaction premix 18l

H2O 9l

- Thành phần phản ứng PCR cho sequence:

Termix 8l

Primer (*) 1l

Template 1l ( nồng độ ADN là 40-60 g/ml)

H2O 10l

(*) Các loại primer đã sử dụng:

27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.

1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'.

780F: 5'- GAATTGATACCCTGGTAG-3.'

350R: 5'- CTGCTGCCTCCCGTAG-3'.

1100F: 5'- GCAACGAGCGCAACCC-3'.

920R: 5'- GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'.

- Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen:

960C-1phút

960C - 10giây

500C - 5 giây 25 chu kỳ

600C - 4 phút

Tinh sạch sản phẩm RCR cho sequence.

===========================================================

27

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

- Chuyển 20l sản phẩm sang ống eppendoft sạch

- Thêm 5l EDTA 125mM và 60l Etanol 100%. Để khoảng 15 phút ở nhiệt độ

phòng.

- Ly tâm 15.000v/p, 15phút

- Bỏ dịch, thêm 60l Etanol 70% để rửa, ly tâm 15000v/p, 10 phút

- Làm khô.

- Thêm 10l HiDi Formamide

- Để ở 960C trong 2 phút

- Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh

- Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho sequence.

- Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant

Đọc trình tự ADN.

Trình tự của rADN của các mẫu được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự

động 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các loài

đã được xác định trong ngân hàng gen, để xác định đến tên loài.

2.2.4.2. Phân loại nấm men

Phương pháp sinh lý, sinh hóa

Xác định khả năng đồng hóa các loại đường

1% các loại đường sử dụng thay cho glucoza trong môi trường cơ sở (Bacto

yeast nitrogen base 6,7g; Bacto yeast extract 50 mg; Bacto casamino acid 50 mg):

L-arabinoza, D-riboza, D-Xyloza, D-fructoza, D-mannoza, D-mannitol, D-sorbitol,

lactoza, trehaloza, raffinoza, Na-gluconat.

Môi trường được chia vào các ống nhỏ. Cấy vi sinh vật, sau 2 -3 ngày quan

sát sự sinh trưởng của các chủng được tuyển chọn.

Đối chứng dương được cấy trên môi trường chứa glucoza, đối chứng âm

được cấy trên các môi trường không chứa nguồn đường nào.

Thử khả năng lên men nguồn đường glucoza

===========================================================

28

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Phân vào mỗi ống nghiệm 2 ml môi trường có thành phần như sau:

Cao nấm men 0,5%

Glucoza 2%

Cho vào mỗi ống 1 ống Durham để ngược, sau đó đem khử trùng ở 121 oC

trong 15 phút.

Cấy vào mỗi ống một vòng que cấy 1-2 ngày tuổi, quan sát sau 1 tuần nuôi

cấy.

Phương pháp sinh học phân tử

Xác định trình tự rARN của chủng nghiên cứu theo phương pháp của Manitis và

cộng sự [1982]. Bao gồm các bước:

Tách ADN cho phản ứng PCR

- Cho 100 l đệm lysis vào ống nhựa 1,5 ml. Lấy một vòng que cấy mẫu,

trộn thật đều bằng máy vortex hoặc nghiền bằng dụng cụ chuyên.

- Đun hỗn hợp 100oC trong 15 phút. Thêm 100 l kaliaxetat, sau đó trộn đều

và đặt trên đá 1 giờ.

- Ly tâm 15.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 4oC, sau đó lấy phần nổi

phía trên.

- Thêm 200 l CHCl3-Isoamyl alcohol và trộn đều, ly tâm 15.000 v/ph trong

15 phút, sau đó lấy phần nổi phía trên. Làm lại như vậy thêm một lần nữa.

- Thêm 200l 2-propanol (Iso-propanol) và đặt trong đá 20phút. Ly tâm

15.000 v/ph trong vòng 15 phút và lấy phần kết tủa.

- Rửa sạch phần tủa (pellet) bằng etanol 70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong 10

phút và lấy tủa.

- Làm khô bằng máy cô quay chân không trong 3-5 phút.

- Hoà tan tủa trong TE (30-50 l), giữ trong tủ lạnh 4oC trong 1 ngày.

- Giữ ở -20oC trước khi sử dụng.

Phản ứng PCR

- Hỗn hợp phản ứng:

===========================================================

29

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

10X Buffer 10l

dNTP mixture 16l

Mồi xuôi 2l

Mồi ngược 2l

TaqTm 1.2 l

Mẫu ADN ( 50 ng) 1 l

Nước cất đến 100l

+ Mồi cho phản ứng PCR các vùng ITS (Internal transcribed spacer)

Mồi xuôi ITS1: 5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’

Mồi ngược ITS4: 5’ – TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’

- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCRBước tiến hành Nhiệt độ (0C) Thời gian

1 94 3 phút

2 lặp lại 30 lần chu kỳ sau

94 1 phút

52 1 phút 30 giây

72 2 phút 30 giây

3 72 7 phút

4 4 -

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza:

1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập

trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l

mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế

100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr

(nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel

Tinh sạch ADN sau khi thực hiện phản ứng PCR.

- Sử dụng bộ kit QIA (Invitrogen, Đức) thực hiện theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

===========================================================

30

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

+ Thêm dung dịch PB vào mẫu theo thể tích 3:1. Trộn đều, đưa vào cột, ly

tâm 13.000 v/p trong 30 giây.

+ Đổ bỏ dịch phía dưới cột.

+ Bổ sung 500 l PE lên cột. Ly tâm 13.000 v/p trong 30 giây

+ Đổ bỏ dịch dưới cột

+ Ly tâm tiếp 13.000 v/p trong 2 phút

+ Chuyển cột sang ống eppendoft mới

+ Thêm 30l nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút

+ Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút

+ Lấy dịch phía dưới.

- Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:

Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ khả kiến ở các bước sóng 260 và

280. Tính tỷ lệ tinh sạch: OD260/OD280 > 1,7

Phản ứng khuếch đại ADN cho sequencing.

Các sản phẩm PCR tinh sạch được khuếch đại với bộ kít ABI PRISM Cycle

sequencing và đệm 5X sequence (Perkin-Elmer Applied Biosystem) với hỗn hợp

phản ứng như sau :

Terminator Ready Reaction Mix 8 l

Mẫu ADN sau PCR 200 ng/ml

Mồi 1 l

Nước cất đủ đến 20l

Mồi ITS1: 5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’

Mồi ITS4: 5’ – TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’

- Chu trình nhiệt khuếch đại ADN cho sequencing:

Bước tiến hành Nhiệt độ (0C) Thời gian

1 96 1 phút

2 lặp lại 25 lần chu kỳ sau

===========================================================

31

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

96 10 giây

50 5 giây

60 4 phút

3 4 -

Sản phẩm lúc này là các đoạn ADN đơn được duỗi ra.

- Tinh sạch sản phẩm cho sequencing:

Mẫu được chuyển sang ống eppendoft 1,5 ml. Thêm 5l EDTA 1,25 M,

thêm 60l ethanol 100%. Trộn thật nhẹ nhàng. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.

Ly tâm 15.000 v/ph trong 15 phút. Đổ bỏ dịch phía trên. Rửa bằng 100l ethanol

70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong 10 phút. Làm khô mẫu băng máy cô quay chân

không trong 3-5 phút.

Đọc trình tự ADN.

Trình tự của ITS rARN của chủng nấm được đọc trực tiếp trên máy đọc trình

tự tự động 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các

loài đã được xác định trong ngân hàng gen.

2.2.4. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp

2.2.4.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng của các chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dịch thể có pH = 7,0,

trong máy lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút) với các dải nhiệt độ khác nhau 30; 37; 40;

45oC.

2.2.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng của các chủng vi sinh vật

Tương tự như trên, các chủng vi sinh vật cũng được nuôi cấy trên môi trường

dịch thể có độ pH khác nhau (2; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0), trên máy lắc ổn nhiệt giữ

37oC.

2.2.4.3. Ảnh hưởng của môi trường có nồng độ muối mật khác nhau đến sinh

trưởng của các chủng vi sinh vật

===========================================================

32

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Các chủng vi sinh vật probiotic được nuôi riêng rẽ trên môi trường dịch thể

phù hợp cho từng vi sinh vật chứa nồng độ muối mật thay đổi (0,2; 0,5; 1; 2; 3; 4 và

5%) từ đó tìm giới hạn nồng độ muối mật không ảnh hưởng đến sinh trưởng của các

chủng probiotic lựa chọn.

Sau 48 giờ, tốc độ sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được đánh giá: với

vi khuẩn (thông qua mật độ quang OD660); với nấm men (thông qua CFU/ml).

2.2.5. Phát triển chế phẩm

2.2.5.1. Đánh giá tính đối kháng của các chủng lựa chọn

Đánh giá tính đối kháng của các chủng thông qua phương pháp cấy vạch.

2.2.5.2. Đánh giá khả năng bám dính của các chủng vi sinh vật vào niêm mạc

đường tiêu hóa

Chuẩn bị vi khuẩn và nấm men probiotic:

- Vi khuẩn và nấm men được thu tại giữa pha log từ môi trường dịch thể tương ứng

bằng ly tâm (6000 vòng/phút/15 phút) sau đó rửa 2 lần với đệm PBS.

- Tế bào được huyền phù lại trong môi trường dịch thể (MRS cho vi khuẩn lactic,

LB cho Bacillus, YM cho nấm men) trước khi tiến hành cho bám dính đạt mật độ 4

x 108 CFU/ml

Chuẩn bị vật liệu bám dính:

- Chuẩn bị các mẫu ruột tươi (ruột gà) có cùng kích thước sau đó rửa 3 lần với đệm

PBS sao cho tất cả các vi khuẩn không còn trên bề mặt niêm mạc ruột nữa. Rửa lại

1 lần với môi trường dịch thể MRS (LB hoặc YM).

Tiến hành bám dính:

- Bổ sung dịch tế bào đã chuẩn bị ở trên vào vật liệu bám dính (2 thể tích tế bào/1

trọng lượng vật liệu), ủ tại 370C trong 90 phút.

- Rửa tế bào:

===========================================================

33

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

+ Rửa mẫu ruột sau khi ủ lần 1 với 2 thể tích muối sinh lý 1%.

+ Rửa 3 lần với 2 thể tích đệm PBS, thu lấy dịch rửa 3 lần, đếm tế số lượng tế bào

bám dính trên mẫu.

2.2.5.3. Đánh giá tính tương thích của các chủng vi sinh vật với một số thành

phần có hoạt tính trong khẩu phần ăn.

Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường dịch thể tương ứng (MRS cho

vi khuẩn lactic; thạch thường cho vi khuẩn Bacillus và YM cho nấm men) nhưng có

bổ sung các thành phần có hoạt tính thường có trong các khẩu phần ăn cho lợn và

gia cầm gồm các loại kháng sinh thương mại BMD (50 ppm); Saigon Nox (100

ppm), Colistine 98% (100 ppm), CTC 15% (100 ppm); một số loại khoáng CuSO4

(250 ppm Cu); ZnSO4 (100 ppm Zn) và hỗn hợp axit hữu cơ (gồm axit lactic axit,

axit formic, axit citric...) với liều 200mg/lít. Nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) trong tủ

ấm (37oC). Đếm mật độ tế bào trên môi trường đĩa thạch sau 48h.

2.2.5.4. Phát triển chế phẩm probiotic

Các chủng vi sinh vật probiotic được sử dụng để phát triển chế phẩm dạng bột theo

nghiên cứu trước đây (Trần Quốc Việt và cs, 2007).

- Hai chế phẩm probiotic dạng bột đa chủng gồm PBB1 và PBB2 được sử dụng cho

thí nghiệm này. Mật độ các chủng vi sinh vật hữu ích đạt 107 – 108 cfu/g.

- Chín mươi sáu (96) lợn con lai thương phẩm cai sữa 21 ngày tuổi có khối lượng

bình quân từ 7-8 kg đã được sử dụng. Lợn được nuôi trong thời gian 50 ngày, trong

chuồng nền xi măng, thông thoáng tự nhiên.

- Khẩu phần cơ sở cho lợn thí nghiệm được phối chế từ các nguyên liệu: ngô ép

đùn, tấm gạo tẻ, khô dầu đậu tương tách vỏ, bột thay thế sữa (milk replacer), bột sữa

whey, premix vitamin-khoáng và các axit amin tổng hợp.

Phương pháp bố trí thí nghiệm.

===========================================================

34

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

- Lợn thí nghiệm được phân ngẫu nhiên vào 4 lô theo thể thức ngẫu nhiên hoàn

toàn, mỗi lô 24 con được nuôi trong 3 ô chuồng, 8 con/ô (đồng đều tính biệt), mỗi ô

là một lần lặp lại. Lợn ở các lô 1 (đối chứng âm) và 2 (đối chứng dương) được ăn

khẩu phần cơ sở (bảng 2) không và có bổ sung colistin với liều 100g/tấn tương ứng.

Lợn ở các lô 3 và 4 được ăn khẩu phần cơ sở có bổ sung probiotic (PBB1 và PBB2)

với liều 2000 g/tấn.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

===========================================================

35

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật hữu ích.

Vi sinh vật probiotic chủ yếu là vi khuẩn lactic, Bacillus và nấm men

Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycess boulardii. Trên thực tế các đối tượng

trên có mặt trong hầu hết các mẫu trong tự nhiên, để thu được chúng có thể phân lập

từ nhiều nguồn khác nhau như thực phẩm lên men (rau, củ, nem chua, bún), đất

nước, thực phẩm các loại, bánh men... Trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung

phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật tồn tại trong đường tiêu hoá của vật

nuôi (gà, lợn) và một số nguồn khác nhau (đất, các sản phẩm lên men). Việc lấy

mẫu phân lập sẽ có nhiều khả năng thu nhận và tuyển chọn được các chủng vi sinh

vật có đặc tính probiotic như chịu axit, muối mật, sinh enzym thuỷ phân và

bacteriocin kháng khuẩn gây bệnh.

Từ các nguồn khác nhau, 254 chủng vi sinh vật đã được phân lập, trong đó

có 164 chủng vi khuẩn lactic, 45 chủng vi khuẩn Bacillus và 45 chủng nấm men

(bảng 4).

Bảng 4: Kết quả phân lập các vi sinh vật từ các nguồn khác nhau

Nguồn phân lập

Nhóm vi sinh vật đã phân lập

Vi khuẩn lactic Bacillus Nấm men

Chất chứa trong ruột non và ruột già của lợn ngoại

48 20 18

Chất chứa trong ruột non và ruột già của lợn Móng cái

43 16 13

Chất chứa trong ruột non, ruột già của gà Lương Phượng

38 2 5

Chất chứa trong ruột non, ruột già của gà Ri

20 2 2

Các nguồn khác nhau trong tự nhiên 15 5 7Tổng 164 45 45

Tổng số 254

===========================================================

36

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Trong đó từ chất chứa trong ruột non, ruột già của lợn và gia cầm đã phân

lập được 149 chủng vi khuẩn lactic, 40 chủng Bacillus và 38 chủng nấm men. Từ

các nguồn khác nhau trong tự nhiên (đất, các sản phẩm lên men...), đã phân lập

được 15 chủng vi khuẩn lactic, 5 chủng Bacillus và 7 chủng nấm men.

Các chủng vi sinh vật sau khi phân lập được giữ trong ống nghiệm môi

trường (MRS, thạch thường và YM) thạch nghiêng để sử dụng cho các nghiên cứu

tiếp theo. Đồng thời các chủng này còn được bảo quản lạnh sâu ở - 800 C nhằm giữ

được giống trong thời gian dài.

3.2. Tuyển chọn các vi sinh vật có đặc tính probiotic

3.2.1. Vi khuẩn lactic.

3.2.1.1. Đánh giá khả năng sản sinh axit

164 chủng vi khuẩn lactic phân lập được được nuôi cấy lắc trên 20 ml môi

trường MRS dịch thể trong 48 giờ. Thu dịch nuôi cấy, ly tâm lạnh 12000 vòng/phút

lấy dịch trong. Để xác định khả năng sinh axit chúng tôi tiến hành đục thạch và nhỏ

dịch vào các giếng trên đĩa thạch đã có CaCO3, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

Kết quả tuyển chọn khả năng sinh axit được trình bày ở bảng 5.

Bảng 5. Số lượng chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axit

Khả năng sinh axit Số lượng chủng Tỷ lệ (%)

Cao (D-d ≥25mm) 30 18,3

Trung bình (10≤D-d<25mm) 89 54,3

Yếu (0<D-d<10mm) 45 27,4

Tổng 164 100

(D-d là đường kính vòng phân giải CaCO3)

Kết quả thu được cho thấy khả năng sinh axit của vi khuẩn lactic khá đa

dạng, số chủng sinh axit trung bình là 89 chủng chiếm nhiều nhất (54,3%), trong khi

đó khả năng sinh axit mạnh có 30 chủng chiếm 18,3%, còn lại là 45 chủng (27,4%).

===========================================================

37

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Các chủng sinh axit với hàm lượng cao nhất được dùng trong các nghiên cứu tiếp

theo.

3.2.1.2. Đánh giá khả năng sản sinh bacteriocin

Một trong những đặc tính quan trọng nhất làm căn cứ tuyển chọn các chủng

vi khuẩn probiotic là khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định. Trong số 30 chủng

sản sinh axit lactic cao nhất, 12 chủng được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn

mạnh nhất. Kết quả được trình bày ở bảng 6.

Bảng 6: Khả năng sản sinh bacteriocin kháng vi khuẩn kiểm định của 12 chủng vi

khuẩn lactic (được đánh giá bằng đường kính vòng kháng khuẩn - ∆D, mm)

STTKý hiệu chủng

Vi khuẩn kiểm định (∆D, mm*)Salmonella entriristic E. coli Shigella flexneri

1 1K8 11 2 62 2M33 13 4 7,53 3K2 11 0 104 5M2 5 0 10,55 5H4 9 0 116 6H2 21 12 107 C3 16 11 108 Đ2 12 3 69 Đ12 6 1,5 3

10 Đ7 10 7 711 NC1 8 6 1212 NC2 6 3 9

(* ∆D = D-d: đường kính vòng kháng khuẩn)

Kết quả ở bảng 6 cho thấy, cả 12 chủng đều có hoạt tính kháng vi khuẩn

Salmonella và Shigella. 09 chủng có khả năng ức chế cả 3 loại vi khuẩn kiểm định

(Salmonella, E. coli và Shigella). Tuy nhiên, mức độ kháng các vi khuẩn kiểm định

của các chủng rất khác nhau. Vòng kháng khuẩn (cả 3 loại vi khuẩn kiểm định) có

đường kính lớn thuộc về các chủng 6H2; C3 (D-d ≥10mm đối với cả 3 chủng kiểm

===========================================================

38

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

định); vòng kháng khuẩn trung bình thấy ở chủng Đ2; Đ7; 1K8; NC1; NC2 và

2M33 (D-d ‹ 10mm). Có 3 chủng 3K2; 5M2 và 5H4 có hoạt tính kháng E. coli

không rõ rệt (D-d = 0 mm) (Hình minh họa hoạt tính kháng khuẩn của một số

chủng lactic có trong hình 4, 5 thuộc phụ lục 1).

Vì vậy 09 chủng sinh bacteriocin kháng cả 3 loại vi khuẩn kiểm định được

dùng trong các nghiên cứu tiếp theo.

0

5

10

15

20

25

1K8 2M33 3K2 5M2 5H4 6H2 C3 Đ2 Đ12 Đ7 NC1 NC2

Kí hiệu chủng

Đư

ờng

kín

h vò

ng k

háng

khu

ẩn

(D-d

,mm

)

SalmonellaentriristicE. coli

Shigellaflexneri

Hình 2: Sơ đồ minh họa hoạt tính kháng khuẩn của các chủng lactic.

3.2.2. Vi khuẩn Bacillus

3.2.2.1. Đánh giá khả năng sản sinh enzym

Tổng số 45 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được, đã được nuôi lắc trên

20ml môi trường LB dịch thể trong 48 giờ. Thu dịch nuôi cấy, ly tâm lạnh 10000

vòng/phút lấy dịch enzym. Để xác định khả năng phân giải cơ chất chúng tôi tiến

hành đục thạch và nhỏ dịch vào các giếng trên đĩa thạch đã có cơ chất khác nhau

(tinh bột, xenluloza), để ở nhiệt độ 370 C trong 24 giờ, sau đó nhuộm bằng thuốc thử

Lugol và đo vòng phân giải. Kết quả được thể hiện ở bảng 7.

Bảng 7: Số lượng chủng Bacillus có khả năng sinh enzym ngoại bào phân giải cơ chất

===========================================================

39

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Hoạt tính enzym

Số lượng chủng Bacillus có khả năng phân giải

cơ chất

Tinh bột Xenluloza

Mạnh (D-d ≥25mm) 7 6

Trung bình (8≤D-d<25mm) 23 5

Yếu (0<D-d<8mm) 15 34

(D-d là đường kính vòng phân giải cơ chất)

Các chủng có hoạt tính enzym mạnh và trung bình (D-d ≥8mm) với cả 2 cơ

chất (11 chủng) được dùng trong các nghiên cứu tiếp theo. Khả năng sinh enzym

của 11 chủng Bacillus được lựa chọn được trình bày trong bảng 8.

Bảng 8: Khả năng sản sinh enzym (thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ

chất D-d, mm) của 11 chủng vi khuẩn Bacillus.

TT Ký hiệu chủng Amylaza (D-d, mm) Xenlulaza (D-d, mm)

1 H3 34 30

2 M51 32 28

3 H4 30 27

4 M73 29 24

5 B71 16 15

6 M12 15 14

7 B75 18 16

8 D11 9 8

9 M16 10 9

10 M17 11 10

11 M21 8 8

(D-d là đường kính vòng phân giải cơ chất)

===========================================================

40

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

H×nh 3. Sơ đồ minh họa hoạt tính amylaza của 11 chủng vi khuẩn Bacillus

Kết quả ở bảng 8 trên cho ta thấy cả 11 chủng vi khuẩn Bacillus được lựa

chọn thì hoạt tính enzym amylaza và xenlulaza mạnh nhất thuộc về chủng H3, tiếp

đến là các chủng M51, H4 và M73 (đường kính vòng phân giải từ 24-34 mm).

(Hình minh họa hoạt tính enzym của một số chủng Bacillus có trong hình 6, 7, 8

thuộc phụ lục 1).

3.2.2.2. Đánh giá khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định

11 chủng có hoạt tính enzym mạnh nhất được lựa chọn để đánh giá tiếp hoạt

tính kháng vi khuẩn kiểm định. Các kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của

11 chủng vi khuẩn Bacillus được trình bày ở các bảng 9.

Các kết quả ở bảng 9 cho thấy, trong 11 chủng được lựa chọn thì 09 chủng

Bacillus không có khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định và 2 chủng có khả năng

kháng các vi khuẩn kiểm định (H3 và H4) nhưng với hàm lượng rất thấp và cả 2

chủng này đều không kháng vi khuẩn E.coli. Vì vậy 2 chủng H3 và H4 được dùng

trong các nghiên cứu tiếp theo. (Hình minh họa hoạt tính kháng khuẩn của một số

chủng Bacillus có trong hình 9 thuộc phụ lục 1).

===========================================================

41

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Bảng 9: Hoạt tính kháng khuẩn của 11 chủng vi khuẩn Bacillus

TT Ký hiệu

chủng

Hoạt tính kháng khuẩn (D-d, mm)

Salmonella entriristic E. coli Shigella flexneri

1 H3 0,5 0 2

2 M51 0 0 0

3 H4 0,5 0 2,8

4 M73 0 0 0

5 B71 0 0 0

6 M12 0 0 0

7 B75 0 0 0

8 D11 0 0 0

9 M16 0 0 0

10 M17 0 0 0

11 M21 0 0 0

(D-d là đường kính vòng kháng khuẩn)

3.2.3. Nấm men

3.2.3.1. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn kiểm định

Trong số 45 chủng nấm men đã được phân lập, các chủng được xác định khả năng

kháng các vi khuẩn kiểm định. 01 chủng được xác định là có khả năng kháng các vi

khuẩn kiểm định là chủng SB. Kết quả tóm tắt được trình bày ở bảng 10, 11.

Bảng 10: Số lượng chủng nấm men có hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn Số lượng chủng Tỷ lệ (%)

Có 01 2,2

Không 44 97,8

Tổng 45 100

===========================================================

42

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Bảng 11: Hoạt tính kháng khuẩn của chủng nấm men SB

Khả năng kháng khuẩn (D-d, mm)

Salmonella entriristic E. coli Shigella flexneri

0 0 10

(D-d là đường kính vòng kháng khuẩn)

Các số liệu ở bảng 11 cho thấy, chủng SB chỉ có khả năng kháng Shigella,

còn không kháng E.coli và Salmonella. Tuy không có một số đặc tính probiotic như

các vi khuẩn lactic và Bacillus, nhưng các chủng nấm men hữu ích tác động có lợi

đối với vật nuôi qua một số cơ chế sau: (i) kích hoạt một số enzym thuộc nhóm

disacharridaza (surcraza, lactaza, maltaza) làm tăng khả năng tiêu hoá đường đa

(Buts và ctv, 1986); (ii) trung hòa một số loại độc tố của vi khuẩn (Castagliuolo và

ctv, 1998); (iii) kết dính một số vi khuẩn gây bệnh có roi bám vào biểu mô ruột nhờ

các thụ quan mannose và loại chúng ra ngoài theo phân (Czerucka và ctv, 2002);

(iv) kích thích hệ miễn dịch, tăng sản xuất IgA (Qamar et al, 2001).

Từ phần tuyển chọn các chủng vi sinh vật 09 chủng lactic (1K8, 2M33, 6H2,

C3, Đ2, Đ12, Đ7, NC1 và NC2), 02 chủng vi khuẩn Bacillus (H3 và H4) và 01

chủng nấm men (SB) được dùng trong nghiên cứu tiếp theo.

3.3. Phân loại các chủng được tuyển chọn

3.3.1. Nghiên cứu phân loại vi khuẩn lactic

Việc phân loại các chủng vi khuẩn được tiến hành căn cứ vào các kết quả

nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và phân tích, giải trình tự gen

16S rARN.

Bảng 12 trình bày các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của 09 chủng

vi khuẩn lactic. Tất cả 09 chủng vi khuẩn lactic đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram

dương, phản ứng catalaza âm tính và có 3 dạng hình thái khác nhau: hình que ngắn

(1K8; NC1; NC2), hình que dài (2M33; C3; Đ12 và Đ2) và hình cầu chuỗi (6H2 và

===========================================================

43

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Đ7). Khả năng đồng hoá tinh bột của các chủng không cao (chỉ có 2 chủng có khả

năng nhưng ở mức độ yếu là 1K8; Đ7).

Bảng 12: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn

Đặc điểm Ký hiệu chủng giống1K8 2M33 6H2 C3 Đ2 Đ12 Đ7 NC1 NC2

Hình dạng tế bào

Que ngắn

Que dài

Hình cầu

chuỗi

Que dài

Que dài

Que dài

Hình cầu,

chuỗi

Que ngắn

Que ngắn

Nhuộm Gram

Gram +

Gram +

Gram +

Gram +

Gram +

Gram +

Gram +

Gram +

Gram +

Phản ứng catalaza

- - - - - - - - -

Khả năng đồng hoá nguồn hydrat cacbonRiboza - + + + + + ++ - +Xyloza - + + ++ + + + - +Arabinoza + + + + + + + + +Rhamnoza + + + + - + + + +Trehaloza + ++ ++ ++ ++ ++ + + ++Lactoza +++ +++ ++ +++ +++ +++ + +++ ++Mannitol ++ ++ + + ++ ++ + ++ ++Sucroza +++ +++ ++ +++ +++ + +++ +++ +++Cellobioza +++ +++ ++ ++ +++ +++ ++ +++ +++Raffinoza ++ ++ + ++ ++ + + ++ ++Galactoza + +++ +++ +++ + +++ ++ + ++Tinh bột + ++ - - - - - + -Gluconat ++ ++ + ++ + +++ +++ ++ +++Fructoza + ++ + ++ ++ +++ + + ++

Căn cứ vào khoá phân loại của Bergeys (1982) và Okada (1992) trên cơ sở

các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa, 09 chủng trên được xác định thuộc các

chi Lactobacillus (1K8, 2M33, Đ2, Đ12, C3, NC1 và NC2), Streptococcus (Đ7) và

Enterococcus (6H2). Để phân loại đến loài, 9 chủng vi khuẩn này được trình tự gen

===========================================================

44

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

rARN 16S và được so sánh với các loài có quan hệ họ hàng gần. Kết quả giải trình

tự gen mã hóa cho rARN 16S được trình bày ở bảng 13.

Bảng 13: Kết quả giải trình tự gen mã hoá cho rARN 16S (xem phụ lục 2)

Chủng Kích thước đoạn gen đã

được đọc (bp)

Gần gũi với loài (BLAST

Search)

Tỷ lệ tương

đồng (%)

1K8 1400 Lactobacillus plantarum 99

2M33 1306 Lactobacillus plantarum 99,7

6H2 1306 Enterococcus faecium 99,8

C3 1450 Lactobacillus acidophilus 99,8

Đ2 1270 Lactobacillus plantarum 99,7

Đ12 1532 Lactobacillus plantarum 99,9

Đ7 1547 Pediococcus pentosaceus 99,7

NC1 1450 Lactobacillus fermentum 99,7

NC2 1499 Lactobacillus casei 99,9

Kết quả giải trình tự gen mã hóa rARN 16S của 09 chủng vi khuẩn lactic cho

thấy có 4 chủng có trình tự tương đồng gần gũi với loài Lactobacillus plantarum

(1K8, 2M33, Đ2, Đ12), còn lại 5 chủng trình tự tương đồng với các loài

Lactobacillus fermentum (NC1), Enterococcus faecium (6H2), Lactobacillus

acidophilus (C3), Pediococcus pentosaceus (Đ7) và Lactobacillus casei (NC2).

3.3.2. Nghiên cứu phân loại vi khuẩn Bacillus

Tương tự như đối với vi khuẩn lactic, việc phân loại các chủng vi khuẩn

Bacillus, được tiến hành căn cứ vào các kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái,

sinh lý, sinh hoá và xác định trình tự gen. Các số liệu được trình bày ở các bảng 14

và 15.

===========================================================

45

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Bảng 14: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của 2 chủng H3 và H4

Đặc diểmKý hiệu chủng

H3 H4

Hình thái tế bàoTế bào hình que và nhỏ,

nối lại thành sợi dài

Tế bào hình que, đơn và

nhỏ

Khả năng sinh bào tửBào tử hình bầu dục, lệch

tâm

Bào tử hình bầu dục, gần

tâm

Nhuộm Gram Gram + Gram +

Khả năng đồng hóa hydratcacbon

D-Maltoza + +

D-Glucoza + +

Fructoza + +

Lactoza - -

Sacaroza ++ +

Galactoza + +

D-Xyloza + +

Cellobioza ++ ++

Raffinoza + +

Galactoza + +

Tinh bột ++ ++

Gluconat ++ ++

Bảng 15: Kết quả giải trình tự gen mã hoá cho rARN 16S của 2 chủng Bacillus H3

và H4 (xem phụ lục 2)

Chủng Kích thước đoạn gen

đã được đọc (bp)

Gần gũi với loài (BLAST

Search)

Tỷ lệ tương

đồng (%)

H3 1450 Bacillus licheniformis 99,7

H4 1544 Bacillus subtilis 99,5

===========================================================

46

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

3.3.3. Nghiên cứu phân loại vi khuẩn nấm men

Tương tự như đối với vi khuẩn, việc phân loại các chủng nấm men được tiến

hành căn cứ vào các kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và

xác định trình tự gen. Các số liệu được trình bày ở các bảng 16 và 17.

Bảng 16: Một số đặc tính hình thái và sinh lý sinh hoá của chủng nấm men SB

Đặc điểm Chủng SBHình dạng tế bào Hình trứng, elíp, nảy chồi 1 phíaHình thái khuẩn lạc Trắng sữa tròn nhẵn bóng lồi có vòng đồng tâm

Khả năng đồng hoá nguồn cacbohydrat

Khả năng lên men nguồn cacbohydrat

Sorboza - -Xyloza - -Arabinoza - -Rhamnoza - -Trehaloza + +Lactoza - -Sucroza + +Cellobioza - -Raffinoza + +Galactoza + +Tinh bột - -Melibioza - -Glucoza + +

Bảng 17: Kết quả giải trình tự gen mã hoá cho đoạn ITS rARN của chủng SB (xem

phụ lục 2)

Kích thước đoạn gen

đã được đọc (bp)

Gần gũi với loài (BLAST

Search)

Tỷ lệ tương

đồng (%)

570 Saccharomyces boulardii 100

===========================================================

47

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Kết hợp số liệu thu được từ các bảng 12, 13, 14, 15, 16 và 17 chúng tôi xác

định các tên loài của 9 chủng vi khuẩn lactic, 2 chủng Bacillus và 1 chủng nấm men

lựa chọn trong bảng 18.

Bảng 18: Kết quả định danh các chủng vi sinh vật probiotic

STT Kí hiệu Tên loài

1 1K8 Lactobacillus plantarum

2 2M33 Lactobacillus plantarum

3 6H2 Enterococcus faecium

4 C3 Lactobacillus acidophilus

5 Đ2 Lactobacillus plantarum

6 Đ12 Lactobacillus plantarum

7 Đ7 Pediococcus pentosaceus

8 NC1 Lactobacillus fermentum

9 NC2 Lactobacillus casei

10 SB Saccharomyces boulardii

11 H3 Bacillus licheniformis

12 H4 Bacillus subtilis

Các kết quả ở bảng trên cho thấy các chủng được lựa chọn đều là những

chủng vi sinh vật lành tính, không phải là các vi sinh vật gây bệnh và được sử dụng

rất phổ biến để tạo ra các chế phẩm probiotic.

3.4. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng của các

chủng vi sinh vật được lựa chọn

3.4.1. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của vi

khuẩn lactic

3.4.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Nuôi lắc 220 vòng/phút 09 chủng vi khuẩn lactic trong bình tam giác chứa

20ml môi trường MRS dịch thể ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-450C. Sau 48 giờ

===========================================================

48

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

nuôi cấy thu dịch lên men đo OD và định lượng axit lactic tạo ra. Kết quả được

trình bày ở bảng 19.

Bảng 19: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng (OD660) và sản

sinh axit lactic (g/l) của 09 chủng lactic

Ký

hiệu

chủng

Nhiệt độ nuôi cấy (oC)

30 oC 37 oC 40 oC 45 oC

OD660 HA OD660 HA OD660 HA OD660 HA

1K8 2,131 2,52 2,157 2,57 0,354 0,92 0,241 0,63

2M33 1,654 2,34 1,876 2,39 0,426 1,15 0,354 0,68

6H2 1,466 1,48 1,481 1,53 1,134 1,28 0,221 0,65

C3 1,941 2,3 2,088 2,7 0,318 0,68 0,189 0,55

Đ2 1,912 1,95 2,121 2,09 0,985 0,89 0,208 0,78

Đ12 1,859 2,36 1,974 2,31 0,856 1,12 0,112 1,01

Đ7 1,945 2,34 2,029 2,43 1,119 1,26 0,195 0,86

NC1 1,578 2,68 1,924 3,08 1,234 1,8 0,667 0,63

NC2 1,657 2,34 1,885 2,58 1,053 1,1 0,725 0,49

HA: Hàm lượng axit lactic (g/l)

Kết quả ở bảng 19 cho thấy, khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic thể

hiện bằng mật độ quang OD660 tăng khi nhiệt độ tăng từ 30oC lên đến 37oC. Khi

nhiệt độ tăng lên trên 37oC (40 và 45oC) mật độ quang giảm rõ rệt. Qui luật này

quan sát thấy ở cả 09 chủng vi khuẩn. Các số liệu ở bảng 19 cũng cho thấy, nhiệt độ

từ 30oC đến 37oC là thích hợp nhất đối với các chủng vi khuẩn lactic. Tuy nhiên,

trong vùng nhiệt độ tối thích này, mật độ quang của các chủng cũng rất khác nhau.

Khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ 37oC thể hiện qua chỉ số OD660 xếp theo thứ tự cao

(OD660≥2) gồm 4 chủng (1K8, Đ2, C3, Đ7), trung bình (1,5<OD660<2) gồm 4 chủng

(Đ12, 2M33, NC1 và NC2) và thấp (OD660 ≤1,5) gồm 1 chủng (6H2).

Khả năng sản sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn cũng có xu hướng

tương tự như khả năng sinh trưởng. Nhìn chung, những chủng có khả năng sinh

===========================================================

49

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

trưởng tốt cũng là những chủng có khả sản sinh axit lactic cao. Kết quả nghiên cứu

của Phạm Thị Ngọc Lan và ctv (2003) cho thấy, khi phân lập từ phân gà tươi 789

chủng vi khuẩn lactic, có hai chủng được lựa chọn (CH123 và CH156) là có các đặc

tính probiotic và cả hai chủng đều có khả năng sinh trưởng ở khung nhiệt độ từ 15

đến 45oC.

3.4.1.2. Ảnh hưởng của pH môi trường dịch nuôi cấy

Nuôi lắc 220 vòng/phút các chủng lactic trong môi trường MRS có pH khác nhau từ

2,0 đến 7,0 ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng

20.

Kíhiệu chủn

g

pH2 3 4 5 6 7

OD HA OD HA OD HA OD HA OD HA OD HA

1K8 0,175 1,76 0,191 2,06 0,713 2,21 0,181 1,89 0,163 0,72 0,162 0,422M33 0,043 1,01 0,081 1,52 0,696 1,78 0,044 1,04 0,038 0,58 0,029 0,336H2 0,022 1,42 0,042 1,63 0,732 2,04 0,038 1,53 0,019 1,01 0,007 0,45C3 0,019 1,04 0,024 1,44 0,73 2,04 0,021 1,13 0,012 0,68 0,008 0,38Đ2 0,015 0,95 0,019 1,27 0,645 1,85 0,017 1,04 0,015 0,9 0,013 0,42Đ12 0,048 0,72 0,08 1,94 0,671 2,32 0,052 1,04 0,014 0,65 0,012 0,35Đ7 0,046 1,49 0,092 1,96 0,585 2,29 0,077 1,89 0,038 0,95 0,01 0,62

NC1 0,609 2,55 0,73 2,5 0,725 2,48 0,71 2,56 0,400 2,45 0,173 2,4NC2 0,690 2,18 0,8 2,18 0,805 2,12 0,789 2,2 0,578 2,08 0,257 2,0

Bảng 20: Ảnh hưởng pH nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng (OD660) và khả năng

sản sinh axit lactic (g/l).

HA= Hàm lượng axit lactic (g/l)

Kết quả ở bảng 20 cho thấy với dải pH rộng: 2; 3; 4; 5; 6 và 7, đáp ứng về

sinh trưởng và khả năng sản sinh axit lactic của 09 chủng vi khuẩn lactic là khác

nhau. Các số liệu ở bảng 20 cũng cho thấy mật độ quang (OD660) ở môi trường có

độ pH 4 của 07 chủng là cao nhất (dao động từ 0,58 đến 0,8), riêng chủng NC1 thì

tại pH 3 mật độ quang và hàm lượng axit lactic sinh ra là cao hơn cả. Ở môi trường

có độ pH cao hơn (từ 5 trở lên) mật độ quang giảm. Khả năng sản sinh axit lactic

===========================================================

50

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

cũng có xu hướng tương tự. Điều đó chứng tỏ các vi khuẩn lactic chỉ sinh trưởng tốt

trong môi trường có độ pH thấp (3-4) và ở môi trường pH cao hơn (pH từ 5-7) tốc

độ sinh trưởng của chúng chậm, nhưng chúng vẫn tồn tại. Những kết quả nghiên

cứu này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Lan và ctv

(2003) trên hai chủng CH123 và CH156 thuộc các vi khuẩn lactic, hai chủng này

cũng chỉ sinh trưởng tốt ở môi trường có độ pH thấp (pH = 4).

3.4.1.3. Ảnh hưởng của muối mật trong môi trường nuôi cấy

Khả năng chịu được muối mật ở các nồng độ khác nhau là một trong những

tiêu chí quan trọng để đánh giá các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn đã

được lựa chọn. Nồng độ muối mật trong dưỡng chấp của đường tiêu hoá của động

vật có vú dao động từ 1 đến 3% (Sameh. H. M, 2003). Các chủng vi khuẩn hữu ích

muốn khu trú và phát huy tác dụng được trong đường tiêu hoá của các loài vật nuôi

phải sống và sinh trưởng bình thường trong môi trường có hàm lượng muối mật

tương tự. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường có hàm lượng muối mật

khác nhau đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic được trình bày ở bảng 21.

Bảng 21: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có nồng độ muối mật khác nhau

đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic.

Ký hiệu chủng

Nồng độ muối mật (%)0,2 0,5 1 2 3 4 5

1K8 ++ +++  +++ ++++ +++ +++ ++2M33  + +  + +++ ++ - -6H2 ++ +++  +++ +++ +++ ++++ ++C3  + ++  ++ +++ + + -Đ2  ++ ++  ++ +++ + - -

Đ12  ++ +++  +++ ++ ++ ++++ ++Đ7  + +  + +++ + + -

NC1 ++ +++ +++  +++  +++  ++  ++ NC2 +  ++  +++  +++  +++  ++  + 

(+): biểu thị khả năng sinh trưởng; (-):biểu thị khả năng không sinh trưởng.

===========================================================

51

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Kết quả bảng 21 cho thấy, nhìn chung tất cả các chủng đều chịu được nồng

độ muối mật 1-3%, đó là nồng độ muối mật bình thường trong dưỡng chấp của ruột

non. Tuy nhiên, khả năng chịu muối mật giữa các chủng là không giống nhau.

Trong số 09 chủng, có 5 chủng có khả năng sinh trưởng ở nồng độ muối mật 5%; 4

chủng chịu được nồng độ muối mật 4%. Các chủng có khả năng sinh trưởng trong

môi trường muối mật cao (từ 4-5%) là 1K8; 6H2; Đ12; Đ7; NC1; NC2 và C3.

3.4.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của vi

khuẩn Bacillus

3.4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Nuôi lắc 02 chủng vi khuẩn Bacillus trong bình tam giác chứa 20ml môi

trường LB dịch thể ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-550C. Sau 24 giờ nuôi cấy thu

dịch lên men đo OD và định lượng hàm lượng enzym tạo ra. Kết quả được trình bày

ở bảng 22.

Bảng 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng (OD660) và

sản sinh enzym của 02 chủng Bacillus

Nhiệt

độ(oC)

Chủng H3 Chủng H4

OD660

Amylaza

(D-d, mm)

Xenlulaza

(D-d, mm)OD660

Amylaza

(D-d, mm)

Xenlulaza

(D-d, mm)

300C 2,213 29 26 2,013 27 24

370C 2,534 34 30 2,234 30 27

400C 1,876 35 30 1,576 29 28

450C 1,185 28 24 0,885 22 23

(D-d, mm: vòng phân giải cơ chất)

Kết quả ở bảng 22 cho thấy, khả năng sinh trưởng của 2 vi khuẩn Bacillus

tăng khi nhiệt độ tăng từ 30oC lên đến 37oC. Khi nhiệt độ tăng lên trên 37oC (40 và

45oC) mật độ quang giảm, tuy nhiên sự giảm này không nhiều như vi khuẩn lactic.

Điều này có thể hiểu được vì các chủng Bacillus chịu các điều kiện bất lợi tốt hơn vi

khuẩn lactic. Tuy nhiên, nhiệt độ thích hợp cho enzym amylaza, xenlulaza hoạt

===========================================================

52

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

động của chủng H4 là 400C, chủng H3 là 370C. Ở nhiệt độ nuôi cấy cao hơn (450C),

hoạt tính của các enzym giảm dần. Do đó, nhiệt độ 37oC là thích hợp nhất cho sự

sinh trưởng và sản sinh enzym của 02 chủng vi khuẩn Bacillus.

3.4.2.2. Ảnh hưởng của pH môi trường dịch nuôi cấy

Nuôi lắc 220 vòng/phút các chủng Bacillus trong môi trường LB có pH khác

nhau từ 2,0 đến 7,0 ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Kết quả nghiên cứu cho thấy cả 2

chủng Bacillus sinh trưởng ở môi trường có pH từ 5-7 tốt hơn khi so với môi trường

có pH <5. Tuy nhiên hoạt tính enzym mạnh nhất là khi nuôi cấy tại môi trường có

pH 7.

3.4.2.3. Ảnh hưởng của muối mật trong môi trường nuôi cấy

Tương tự như với vi khuẩn lactic, kết quả về sự ảnh hưởng của môi trường

nuôi cấy có nồng độ muối mật khác nhau được trình bày ở bảng 23.

Bảng 23: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có nồng độ muối mật khác nhau

đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus.

Ký hiệu

chủng

Nồng độ muối mật (%)

0,2 0,5 1 2 3 4 5H4 ++ +++  +++ ++++ +++ +++ ++

H3  + + + ++ +++ ++++ +++ ++

(+): biểu thị khả năng sinh trưởng

Kết quả bảng 23 cho thấy, cả 2 chủng đều chịu được nồng độ muối mật 0,2-

5% nhưng khả năng chịu muối mật giữa các chủng là không giống nhau. Trong đó

chủng H4 sinh trưởng tốt nhất là ở môi trường có nồng độ muối mật 2% còn chủng

H3 là 3%. Nói chung, nồng độ muối mật thích hợp cho sự sinh trưởng của 2 chủng

Bacillus là 1-4%.

3.4.3. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của nấm

men

3.4.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

===========================================================

53

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Nuôi cấy lắc 120 vòng/phút chủng nấm men SB trong bình tam giác chứa

20ml môi trường YM dịch thể ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-450C. Sau 24 giờ nuôi

cấy, dịch nuôi cấy được đếm số lượng tế bào (CFU/ml). Kết quả được trình bày

trong bảng 24.

Bảng 24: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chủng

nấm men SB (CFU/ml).

Nhiệt độ nuôi cấy (oC) Số lượng tế bào (CFU/ml)30 oC 2 x 109

37 oC 6 x 107

40 oC 4 x 106

450C 3,8 x 103

Kết quả ở bảng 24 cho thấy chủng nấm men SB phát triển tốt ở phạm vi nhiệt

độ từ 30-37oC, sinh trưởng tốt nhất là 300C. Khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao hơn (40 và

45oC) sinh khối giảm rõ rệt (từ 2 x 109 ở 30oC xuống 3,8 x 103 cfu/ml ở 45oC). Đáp

ứng về sinh trưởng đối với nhiệt độ nuôi cấy ở chủng nấm men SB có xu hướng

tương tự như đối với nhóm vi khuẩn lactic.

3.4.3.2. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy

Một đặc tính rất quan trọng khác của các vi sinh vật probiotic là khả năng

sống trong các môi trường có độ pH khác nhau. Các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng

của pH môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của chủng nấm men SB được trình bày

ở bảng 25.

Bảng 25: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của

chủng nấm men SB.

pH môi trường 2 3 4 5 6 7

Số lượng tế bào (CFU/ml) 1x107 2,7x108 4,6x108 2,2x109 4x109 2,5x108

Kết quả ở bảng 25 cho thấy khả năng sinh trưởng của chủng SB không thay

đổi nhiều khi pH môi trường thay đổi (2; 3; 4; 5; 6 và 7). Tuy nhiên, chủng SB phát

triển mạnh hơn ở môi trường có độ pH 5 và 6. Ở môi trường pH 7 mật độ các chủng

giảm nhưng vẫn duy trì được ở mức 2,5 x 108 cfu/ml. Kết quả này cho thấy, chủng

===========================================================

54

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

SB được lựa chọn đều có khả năng sống trong môi trường pH thay đổi từ rất toan

(pH = 2) đến trung tính. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng đối với các vi sinh vật

probiotic vì muốn phát huy tác dụng, chúng phải thích ứng được với môi trường

trong đường dạ dày-ruột của lợn và gà, nơi mà độ pH môi trường thay đổi (từ rất

toan ở dạ dày đến gần trung tính ở ruột non).

3.4.3.3. Ảnh hưởng của muối mật trong môi trường nuôi cấy

Khi thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng chịu muối mật của chủng SB

chúng tôi nhận thấy chủng này đều phát triển bình thường (không có sự khác biệt

đáng kể giữa mẫu thí nghiệm có nồng độ muối mật khác nhau (1-5%) và mẫu đối

chứng khi không có mặt muối mật).

Trên cơ sở phân loại, đánh giá các đặc tính probiotic, 6 chủng vi sinh vật

được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo. Các chủng vi sinh vật bao gồm: 4

chủng vi khuẩn lactic (6H2, C3, Đ7, NC1); 1 chủng vi khuẩn Bacillus (H4) và 1

chủng nấm men (SB).

3.5. Phát triển chế phẩm

3.5.1. Kết quả về tính đối kháng của các chủng được lựa chọn

Bằng phương pháp cấy vạch để thử tính đối kháng, kết quả thu được cho

thấy 6 chủng nghiên cứu không có tính đối kháng lẫn nhau.

3.5.2. Các kết quả nghiên cứu về tính tương thích của các chủng được lựa chọn

với một số thành phần có hoạt tính bổ sung trong thức ăn

Trong số các yếu tố ảnh hưởng đến sức sống và hoạt tính của các vi sinh vật

probiotic thì sự tương tác của chúng đối với các thành phần khẩu phần (chủ yếu là

các thành phần có hoạt tính như một số loại muối vô cơ, các chất axit hóa và một số

loại kháng sinh) có một ý nghĩa rất quan trọng. Kết quả nghiên cứu về tương thích

của các vi sinh vật lựa chọn đối với một số thành phần có hoạt tính bổ sung trong

khẩu phần (gồm các loại kháng sinh thương mại BMD (50 ppm); Saigon Nox (100

ppm), Colistine 98% (100 ppm), CTC 15% (100 ppm); một số loại khoáng CuSO4

===========================================================

55

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

(250 ppm Cu); ZnSO4 (100 ppm Zn) và hỗn hợp axit hữu cơ (gồm axit lactic axit,

axit formic, axit citric...) với liều 200mg/lít) được trình bày ở bảng 26.

Bảng 26: Khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được lựa chọn trong môi

trường có chứa một số thành phần có hoạt tính bổ sung trong khẩu phần ăn.

Thành phần Số lượng tế bào ( CFU/ml)

C3 Đ7 6H2 NC1 SB H4

Đối chứng 7,0 x 108 8 x 1010 7,6 x 109 5,2 x 109 2,0 x 109 6 x 1010

Kháng sinh

- BMD 4,3 x 103 2,5 x 106 3,9 x 109 4,8 x 109 7,5 x 108 6,2 x 108

- Saigon Nox 120 4 x 104 4,8 x 103 1,1 x 103 6,8 x 108 9,8 x 105

- Colistine 7,0 x 108 3,2 x 109 5,8 x 109 2,8 x 109 5,6 x 108 2,0 x 1010

- CTC 3,7 x 104 6 x 104 3,4 x 104 2,6 x 104 1,0 x 108 2,0 x 105

Muối khoáng

- CuSO4.5H2O 5,7 x 108 1 x 1010 6,8 x 109 1,8 x 109 1,0 x 109 7,2 x 109

- ZnSO4.5H2O 6,0 x 108 9,3 x 109 4 x 109 8,8 x 108 9,0 x 108 8,0 x 109

Hỗn hợp axit

hữu cơ

5,2 x 107 1 x1010 9,2 x 108 4 x109 1,8 x109 3,0 x 109

*Saigon Nox: Kitasamycin 50g/kg + Sulphamethazon 50g/kg.

BMD: Bacitracin Methylene disalicylate

CTC: Chlotetracyline

Kết quả ở bảng 26 cho thấy, chủng nấm men (SB) và vi khuẩn Bacillus (H4)

vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường trong môi trường hiện diện một số loại

kháng sinh, các muối sulfat của đồng và kẽm cũng như hỗn hợp một số loại axit hữu

cơ với liều tương tự như liều khuyến cáo bổ sung trong khẩu phần. Trong số các vi

khuẩn lactic, chủng 6H2 và NC1 sống tốt trong môi trường có BMD, Colistine,

CuSO4.5H2O và ZnSO4.5H2O và hỗn hợp axit hữu cơ, ngoại trừ Saigon Nox và

CTC. Hai chủng vi khuẩn lactic còn lại (C3 và Đ7) phát triển yếu trên môi trường

có BMD, Saigon Nox và CTC. Qua kết quả đó cho thấy, các chủng vi khuẩn nghiên

cứu có tính tương thích cao với các axit hữu cơ, các muối sulfat của đồng và kẽm và

===========================================================

56

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

một số loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trong thức ăn chăn nuôi. Điều này có

ý nghĩa rất quan trọng trong việc hướng dẫn sử dụng các sản phẩm probiotic có

chứa các chủng trên trong chăn nuôi lợn và gà. Với những sản phẩm probiotic mà

các chủng vi sinh vật có tính tương thích càng cao với các thành phần có hoạt tính

trong khẩu phần thức ăn thì tính ứng dụng càng lớn. Bởi trong công nghệ chế biến

thức ăn chăn nuôi, probiotic chỉ là một chất bổ sung cùng với các thành phần khác

vào thức ăn (như một số loại kháng sinh, các muối sulfat của đồng và kẽm cũng như

hỗn hợp một số loại axit hữu cơ với tỷ lệ tượng tự như thí nghiệm và kết quả ở bảng

26).

3.5.3. Kết quả đánh giá khả năng bám dính của các chủng probiotic

Khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hoá của 06 chủng sinh vật

được trình bày ở bảng 27.

Bảng 27: Khả năng bám dính của các chủng vi sinh vật trên biểu mô ruột.

TT Ký hiệu chủngNồng độ ban đầu

(CFU/ ml)

Khả năng bám dính

(CFU/ gam ruột)

1 Đối chứng âm 6 x 109 1,8 x 102

2 Đ7 7,6 x 108 1 x 107

3 NC1 6,28 x 109 1,5 x 108

4 6H2 2,4 x 109 1 x 108

5 H4 5 x 109 2 x 108

6 C3 4,6 x 109 2,6 x 107

7 SB 3,8 x 109 4 x 108

Các kết quả ở bảng 27 cho thấy, các chủng vi sinh vật đều bám dính tốt vào

niêm mạc ruột nhưng mức độ không giống nhau. Chủng nấm men tỏ ra có độ bám

dính cao hơn so với các chủng vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn lactic, Bacillus và nấm

men đều có khả năng sống và phát triển trong môi trường tương tự như trong đường

tiêu hóa của lợn và gia cầm. Điều này rất thích hợp khi phát triển các chế phẩm

probiotic sau này.

===========================================================

57

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

3.5.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung các chế phẩm probiotic vào khẩu phần đến

tốc độ sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con.

Chúng tôi sử dụng 6 chủng cho phát triển sản phẩm thử nghiệm theo 2 tổ hợp

khác nhau: tổ hợp PBB1 có hai chủng Bacillus (H4) và nấm men Sacharomyces

boulardii (SB) và tổ hợp PBB2 gồm 6 chủng nghiên cứu (4 chủng lactic: 6H2, C3,

NC1, Đ7; 01 chủng Bacillus (H4) và chủng nấm men Sacharomyces boulardii

(SB)). Theo đánh giá của chúng tôi đây là các chủng tiềm năng nhất.

Kết quả sử dụng chế phẩm PBB1 và PBB2 trên lợn con (trọng lượng 7,7 -

8,1kg) sau 50 ngày thí nghiệm được trình bày trong bảng 28.

Bảng 28: Ảnh hưởng của việc bổ sung các chế phẩm Probiotic vào khẩu phần đến

sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con.

Chỉ tiêu Lô 1

ĐC (-)

Lô 2

ĐC (+)

Lô 3

(PBB1)

Lô 4

(PBB2)

SE P

SL lợn mỗi lô (c) 24 24 24 24

KL bắt đầu (kg) 7.7 8.0 8.1 7.9 0.09 0.762

KL Kết thúc (kg) 26.7a 29.8b 28.2ab 29.9b 0.29 0.021

TĐST (g/c/ngày) 396a 454b 421ab 462b 5.36 0.013

TĂĂV (g/c/ng) 604 631 655 654 19.41 0.388

TTTĂ/kg TT (kg) 1.53ab 1.39a 1.56b 1.42ab 0.036 0.021

Ghi chú: SL: Số lượng; KL: Khối lượng; TĐST: Tốc độ sinh trưởng; ĐC (-): Đối chứng

tiêu cực; ĐC (+): Đối chứng tích cực; TĂĂV: Lượng thức ăn ăn vào; TTTĂ: Tiêu tốn thức

ăn. Các giá trị trung bình trong cùng một hàng mang các chữ cái khác nhau thì khác nhau

ở mức P<0.05.

Sau 50 ngày thí nghiệm, lợn con ở các lô được ăn khẩu phần có bổ sung

colistin và chế phẩm PBB2 có khối lượng cơ thể cao hơn các lô khác (29,8 và 29,9

kg tương ứng). Tốc độ sinh trưởng thể hiện ở chỉ tiêu tăng trọng ngày cao nhất quan

sát thấy ở lợn lô 4, cao hơn so với lô đối chứng âm 16,7% (P < 0,05), nhưng cao

hơn không đáng kể so với đối chứng dương 1,76% (P >0,05). Ngoại trừ lô 1, 2 và 4,

===========================================================

58

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

tốc độ sinh trưởng của lợn ở các lô 3 dao động từ 421 đến 434 g/con/ngày và sự

chênh lệch này không có ý nghĩa thống kê (bảng 28).

Tỷ lệ chuyển hóa thức ăn tốt nhất quan sát thấy ở lợn lô 2 với mức tiêu tốn là

1,39 kg thức ăn/kg tăng trọng (thấp hơn so với lô 1 9,15%), sau đến là lô 4 (1,42 kg)

(thấp hơn so với lô 1 là 7,19%). Sự khác biệt về tiêu tốn thức ăn ở lô 2 và lô 4 so

với các lô khác là có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Tiêu tốn thức ăn/kg tăng trọng của

lợn ở lô 3 là 1,56 kg và sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê.

Thông qua những kết quả về sinh trưởng và chuyển hóa thức ăn của lợn thí

nghiệm như đã trình bày ở trên, có thể thấy bổ sung kháng sinh liều thấp (colistin

với liều 100g/tấn) và chế phẩm probiotic đa chủng dạng bột đã cải thiện được tốc độ

sinh trưởng của lợn con so với đối chứng âm (tăng 16,7%) và hiệu quả chuyển hóa

thức ăn (mức tiêu tốn thấp hơn 7,19%).

Mức độ cải thiện năng suất sinh trưởng ở vật nuôi của các sản phẩm probiotic

rất khác nhau phụ thuộc vào đặc tính sinh học, mật độ, sức sống, hoạt tính của các

chủng vi sinh vật probiotic được sử dụng (Sanders, 2001). Trong trường hợp của

nghiên cứu này, một chế phẩm probiotic đa chủng gồm cả vi khuẩn lactic, Bacillus

và nấm men ở dạng bột tỏ ra có tác dụng rõ rệt và tương tự các kết quả nghiên cứu

trên lợn con sau cai sữa của một số các tác giả khác như Lessard và Brisson (1987)

với sản phẩm probiotic gồm 3 chủng vi khuẩn lactic (L. bulgaricus, L. casei và S.

thermophilus); Fialho và ctv (1998) với sản phẩm probiotic gồm 2 chủng vi khuẩn

lactic và 1 chủng Bacillus (L. acidophilus; Streptococcus faecium và Bacillus toyoi).

Các số liệu ở bảng 28 cũng cho thấy, cùng là chế phẩm dạng bột nhưng chế phẩm

PBB1 kém hiệu quả hơn so với PBB2, nguyên nhân rất có thể do trong sản phẩm

PBB2 không có các vi khuẩn lactic.

===========================================================

59

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Trong 254 chủng được phân lập (164 chủng vi khuẩn lactic, 45 chủng vi khuẩn

Bacillus và 45 chủng nấm men) đã đánh giá, tuyển chọn và phân loại được 12

chủng gồm 9 chủng lactic, 2 chủng Bacillus và 1 chủng nấm men. Kết quả cho thấy

chúng thuộc về các loài Enterococcus faecium (6H2); Lactobacillus acidophilus

(C3); Lactobacillus plantarum (1K8, Đ2, Đ12, 2M33); Pediococcus pentosaceus

(Đ7); Lactobacillus casei (NC2); Lactobacillus fermentum (NC1); Bacillus

licheniformic (H3); Bacillus subtilis (H4); Saccharomyces boulardii (SB).

2. Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi sinh vật được lựa chọn: vi khuẩn

lactic (nhiệt độ nuôi cấy 370C, pH 3-4, nồng độ muối mật 1-3%); vi khuẩn Bacillus

(nhiệt độ nuôi cấy 370C, pH 5-7, nồng độ muối mật 1-4%); nấm men (nhiệt độ nuôi

cấy 300C, pH 5-6 và nồng độ muối mật 1-5%).

3. Sáu chủng vi sinh vật (4 chủng vi khuẩn lactic (C3, NC1, Đ7 và 6H2), 1 chủng

Bacillus (H4) và 1 chủng nấm men (SB)) được dùng để phát triển sản phẩm. Trong

đó chủng vi khuẩn Bacillus (H4) và nấm men (S. boulardii) có tính tương thích cao

với một số thành phần có hoạt tính bổ sung trong khẩu phần thức ăn; 4 chủng vi

khuẩn lactic có tính tương thích yếu hơn. Sáu chủng này đều có khả năng bám dính

tốt vào biểu mô ruột.

Sử dụng chế phẩm probiotic đa chủng dạng bột (PBB2) đã cải thiện được tốc

độ sinh trưởng (tăng 16,7% so với lô đối chứng âm), tăng hiệu quả chuyển hóa thức

ăn (giảm tiêu tốn thức ăn/kg tăng trọng 7,2%), giảm tỷ lệ tiêu chảy và chi phí kháng

sinh điều trị ở lợn con sau cai sữa 31%.

KIẾN NGHỊ

Thử nghiệm các chế phẩm probiotic từ các chủng đã được lựa chọn trên diện rộng

và trên nhiều đối tượng vật nuôi khác nhau và từ đó cho sản xuất thử chế phẩm

probiotic có hiệu quả nhất.

===========================================================

60

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn La Anh, Đinh Mỹ Hằng, Vũ Quỳnh Hương, Nguyễn Hương Giang,

Nguyễn Thị Lộc (2003), “Đặc điểm chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum

có ứng dụng trong công nghệ sản xuất nước CVAS”, Tuyển tập báo cáo tại

Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp. 159-161.

2. Lê Thanh Bình, Phạm Thị Ngọc Lan, Yoshimi Benno (1999), “Tác dụng tăng

trưởng đối với gia cầm của chế phẩm vi sinh vật PRO 99”, Tuyển tập báo

cáo tại Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 1999, pp. 139-144.

3. Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thuỳ Châu (2003), “Nghiên cứu

công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic”, Tuyển tập báo cáo

tại Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp. 251-255.

4. Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trương Thị Hồng Vân., Võ

Minh Sơn (2003), “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic BIO II và kết

quả thử nghiệm trên ao nuôi tôm”, Tuyển tập báo cáo tại Hội nghị Công

nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp. 75-79.

5. Phạm Thị Ngọc Lan, Lê Thanh Bình (2003), “Đặc điểm phân loại chủng

Lactobacillus probiotic CH123 và CH 126 phân lập từ đường ruột của gà”,

Tuyển tập báo cáo tại Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003,

pp. 101-105.

6. Võ Thị Thứ, Lã Thị Nga, Trương Ba Hùng, Nguyễn Minh Dương, Nguyễn Liêu

Ba (2003), “Nghiên cứu tạo chế phẩm BIOCHE và đánh giá tác dụng của chế

phẩm đến môi trường nước nuôi tôm cá”, Tuyển tập báo cáo tại Hội nghị

Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp. 119-122.

7. Trần Quốc Việt, Bùi Thị Thu Huyền, Dương Văn Hợp, Vũ Thành Lâm (2007),

“Nghiên cứu các thông số kỹ thuật sản xuất probiotic dạng lỏng và dạng bột

dùng trong chăn nuôi”, Báo cáo khoa học năm 2007 – Phần thức ăn và dinh

===========================================================

61

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

dưỡng vật nuôi, pp. 204 – 214.

TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI

8. Apajalahti. J.H.A, L.K. Sarkilabti, B.R.E. Maki, J.P. Heikkinen, P.H. Nurminen

and W.E. Holben (1998), “Effective recovery of bacteria DNA and percent-

guanine-plus-cytosin-based analysis of community structure in the

gastrointestinal tract of broiler chickens”, Appl Environ. Microbiol, 64, pp.

4084 - 4088.

9. Arturo. A., Mario Rosa M., and Maria A. M., (2006), “Probiotic for animal

nutrition in the European Union”, Regulation and safety assessments, 45, pp.

91-95.

10. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1984), Williams & Wilkins, pp.

158-168.

11. Breton. J and Munoz. A (1998), “Effects of probiotics in the incidence and

treatment of neonatal diarrhea”, 15th International Pig Veterinary Society

Congress. Nottingham University Press, pp. 24-32.

12. Buts. J. P., Bernasconi. P., Van Craynest. M.P., Maldague. P. and De Meyer. R.

(1986), “Response of human and rats small intestinal mucosa to oral

administration of Saccharomyces boulardii”, Pediatr., Res, 20(2), pp. 251-

256.

13. Castagliuolo I., Riegler M.F., Valenick L., Lamont J.T. and Pothoulakis C.

(1999), “Saccharomyces boulardii protease inhibits the effects of

Clostridium difficile Toxins A and B in Human Colonic Mucosa”, Infect.

Immun. 67, pp. 302-307.

14. Cebra. J. J. (1999), “Influences of microbiota on intestinal immune system

development”, American Journal of Clinical Nutrition, 69, pp. 1046S-1051S.

15. Conway. P. L. (1994), “Function and regulation of gastrointestinal microbiota of

the pig”. In: Proceedings of the VIth International Symposium on Digestive

===========================================================

62

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Physiology in Pigs. EAAP Publication no. 80. Edited by Souffrant, W.B.,

Hagemeister, H. pp. 231-240.

16. Conway. P. L. (1996), “Development of the intestinal microbiota.

Gastrointestinal microbes and host interactions”, In: Gastrointestinal

Microbiology: Vol. 2. Edited by Mackie, R.L., White, B.A., Isaacson, R.E.

pp. 3-39. Chapman and Hall, London.

17. Czerucka. D. and Rampal. P. (2002), “Experimental effects of Saccharomyces

boulardii on diarrheal pathogens”, Microbes and infection, 4, pp. 733-739.

18. Dai. D., Nanthkumar. N. N., Newburg. D. S. and Walker. W.A. (2000), “Role

of oligosaccharides and glycol conjugates in intestinal host defense. J.

Pediatric Gastroenterol. Nutr, 30, pp. S23–S33.

19. Damgaard and Mclaren (2006), “Probiotics for pigs”, www.pigsite.

20. Dugas. B., Mercenier. A., Lenoir – Wijnkoop. I., Arnaud. C., Dugas. N. and

Postaire. E. (1999), “Immunity and prebiotics”, Immunology Today, 20, pp.

387-390.

21. FAO/WHO. (2001), “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food

Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Report of a Joint

FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional

Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic

Acid Bacteria. Argentina October. 2001.

22. FAO/WHO (2002), Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, Joint

FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the

Evaluation of Probiotics in Food London, Ontario, Canada, April 30 and

May 1, 2002.

23. Fialho. E.T., Vassalo. M, Lima. J.A.F. and Bertechine. A.G. (1998), “Probiotics

utilization for piglets from 10 to 30 kg (performance and metabolism

assay)”, In: Proceedings. Contributed Papers - Vol. 1. The 8 th. World

===========================================================

63

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Conference on Animal Production. June. 28-July 4, 1998, Seoul National

University, Seoul, Korea. pp. 622-623.

24. Fonty. G, Jouany. J.P, Forano. E. and Gouet P. (1995), Cited by Didier Jans.

2005, Probiotic in animal nutrition, pp. 2-20.

25. Fontaine. N., Meslin. J. C., Lory. V and Andrieux. C (1996), “Intestinal mucin

distribution in the germ-free and in the heteroxenic rather boring a human

bacterial flora: Effect of inulin in the diet”, Br. J. Nutr, 75, pp. 881–892.

26. Fuller. R. (1989), “Probiotics in man and animals”. J Appl Bacteriol, 66, pp.

65–78.

27. Fuller. R. (1992), “History and development of probiotics”, In: R. Fuller (Ed.)

Probiotics: The Scientific Basis. pp 1−8. Chapman & Hall, London.

28. Galassi. G.; Sandrucci. A.; Tamburini. A.; Succi. G. (2001), “Energy utilization

of a low N-diet added with an antibiotic or with a probiotic in fattening

pigs”,  Animal physiology – Nutrition, Proceedings of the 15th symposium

on energy metabolism in animals, Wageningen, p. 145-148.

29. Gardiner. G.E., O’Sullivan. E., Kelly. J., Auty. M.A.E., Fitzgerald. G.F. (2000),

“Comparative Survival Rates of Human-Derived Probiotic Lactobacillus

paracasei and L. salivarius Strains during Heat Treatment and Spray

Drying”, Applied and Environmental Microbiology. 66(6), pp. 2605-2612.

30. Gibson. G. R and Fuller. R. (2000), “Aspect of in vitro and in vivo research

approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human

use”, J. Nut, 130, pp. 391-395.

31. Glick. B. (1995), The immune system of poultry, Poultry Production. P. Hunton,

ed. Elsevier Science, Amsterdam, pp. 55-62.

32. Gong. J, Forster. R. J., Yu. H., Chamber. J.R., Sabour. P.M., Wheatcroft. R. and

Chen. S. (2002), “Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the

===========================================================

64

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

muscosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen”,

FEMS. Microbiol. Lett, 208, pp. 1-7.

33. Hector. C (2006), Assessing The Results Of The EU Ban On Antibiotic Feed

Additives, http://www.the poultry site.com Feature Article on Feed and

Nutrition.

34. Henrich. S (2006), “Acute pancreatitis: ABCs”, Ann Surg, 243, pp. 154–168.

35. Hershberg. R.M. and L. F. Mayer (2000), “Antigen processing and presentation

by intestinal epithelial cells – polarity and complexity”, Immunol. Today 21,

pp. 123–128.

36. Jans. D. (2005), “Probiotics in Animal Nutrition”, Booklet. www. Fefana.org.

pp. 4-18.

37. Jin. L. Z., Ho. Y. W., Abdullah. N., Ali. M.A. and Jalaludin S. (1998), “Effects

of adherent Lactobacillus cultures on growth, weight of organs and intestinal

microflora and volatile fatty acids in broilers”, Animal Feed Science, 70, pp.

197–209.

38. Kalavathy. R, Abdullah. N, Jalaludin. S and Ho. Y. W (2003), “Effects of

Lactobacillus cultures on growth performance, abdominal fat deposition,

serum lipids and weight of organs of broiler chickens”, Br Poult Sci, 79, pp.

886–891.

39. Kozaki. M., Uchimura. T., and S. Okada (1992), “ Identification method for

lactic acid bacteria”, In Experimental Manual for Lactic acid bacteria,

Akasurashoten, Tokyo, pp. 21-73.

40. Lessard. M. and Brisson. G. J. (1987), “Effect of a Lactobacillus fermentation

product on growth, immune response and fecal enzyme activity in weaned

pigs”, Can. J. Anim. Sci, 67, pp. 509-516.

===========================================================

65

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

41. McCracken. V. J. and R. G. Lorenz (2001), “The gastrointestinal ecosystem:

Aprecarious alliance among epithelium, immunity and microbiota”, Cell.

Microbiol, 3, pp. 1–11.

42. Navas Sánchez, Yannellys; Quintero Moreno, Armando; Ventura, Max;

Casanova, Angel; Páez, Angel y Romero, Santos (1995), “Use of probiotics

in the feeding of pigs in the postweaning phase”, Revista Científica, 5(3), pp.

193-198

43. Netherwood. T, Gilbert. H.J., Parker. D.S. and O’Donnell. A.G. (1999),

“Probiotics shown to change bacterial community structure in the avian

gastrointetinal tract”, Appl. Environ. Microbiol, 65, pp. 5134-5138.

44. Patterson. J.A and Burkholder. K.M. (2003), “Application of prebiotics and

probiotics in poultry production”, J. Animal Science, 82, pp. 627-631.

45. Qamar. A., Aboudola. S. and Warny. M (2001), “Saccharomyces boulardii

stimulates intestinal immunoglobulin A immune response to Clostridium

difficile toxin A in mice”, Infect Immun, 69, pp. 2762.

46. Rolfe. R.D. (2000), “The role of probiotic cultures in the control of gastro-

intestinal health”, J. Nutr, 130, pp. 396S–402S.

47. Sakiyama, Y., Nguyen, K. N. T., Nguyen, M. G., Miyadoh, S., Duong, V. H. &

Ando, K. (2009), “Kineosporia babensis sp. nov., isolated from plant litter in

Vietnam”, Int J Syst Evol Microbiol, 59, pp. 550-554.

48. Sameh. H. M. (2003), “Influence of Different Capsule Materials on the

Physiologycal Properties of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus”,

Dessertation at the University of Bonn. pp. 49-50.

49. Sanders. M. E. and Klaenhammers. T. R. (2001), “The scientific basis of

Lactobacillus acidophilus NCFM functionality as a probiotic”, J. Dairy Sci.

84, pp. 319-321.

===========================================================

66

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

50. Savage. D.C. (1987), “Factors influencing biocontrol of bacterial pathogens in

the intestine”, Food Technol, 41, pp. 82-97.

51. SCAN (2000): Report of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the

Safety of Use of Bacillus Species in Animal Nutrition. European

Commission Health & Consumer Protection Directorate-General.

52. Schat. K.A. and Myers. T. J. (1991), “Avian Intestinal Immunity”, Crit. Rev.

Poult. Biol, 3, pp. 19–34.

53. Schillinger U. (1996), “Potential of antagonistic microorganisms and

bacteriocins for the biological preservation of foods”, Trend in food Science

and Technology, 64, pp. 158-164.

54. Ng. S. C., Hart. A. L., Kamm. M. A., Stagg. A. J. and Knight. S. C. (2009),

“Mechanisms of Action of Probiotics: Recent Advances”, Inflamm Bowel

Dis, 15(2), pp. 300 – 310.

55. Steiner. T. (2006), Managing Gut Health, First published 2006. Nottingham

University Press, Nottingham, UK, pp. 45-56.

56. Tannock. G.W. (1999), “Analysis of the intestinal microflora: A renaissance.”,

Antonie van Leenwenhoek, 76, pp. 265-278.

57. Vahjen. W., Glaser. V and Simon. O. (1998), “Influence of xylanase

supplemented feed on the development of selected bacterial groups in the

intestinal tract of broiler chicks”, J. Agr. Sci., 130, pp. 489-500

58. Van der Wielen. P.W.J, Biesterveld. J. S., Notermans. S., Hofstra. H. and Van

knapen. F. (2000), “Role of volatile fatty acid development of the cecal

microflora in broiler chicken during growth”, Appl. Environ. Microbiol, 66,

pp. 2536-2540.

59. Yeo. J. and Kim. K. (1997), “Effect of feeding diets containing an antibiotic, a

probiotic or yucca extract on growth and intestinal N rease activity in broiler

chicks”, Poult. Sc., 76, pp. 381-38.

===========================================================

67

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

60. Zhu. S.Y., Zhong. T., Pandya. Y. and Joerger. R. D. (2002), “16S rRNA-based

analysis of microbiota from the cecum of broiler chickens”, Appl. Microbiol,

68, pp. 124–137.

61. www.OzScientific.com

===========================================================

68

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1

(ẢNH MINH HỌA HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN KIỂM ĐỊNH, HOẠT

TÍNH ENZYM CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỢC TUYỂN CHỌN)

Hình 4: Hoạt tính kháng Shigella flexneri của các chủng lactic, số 1 (NC2); 2

(Đ12); 3 (C3); 4 (5H4); 5 (Đ7); 6 (6H2); 7 (NC1); 8 (3K2) và ĐC (đối chứng).

===========================================================

69

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Hình 5: Hoạt tính kháng E.coli của các chủng lactic: ĐC (đối chứng); 1 (C3); 2

(Đ7); 3 (NC2); 4 (NC1); 5 (3K2)

Hình 6. Hoạt tính xenlulaza của 1 số chủng

Bacillus: ĐC- Đối chứng; 1- M73; 2- B75; 3-

H3; 4- H4

Hình 7. Hoạt tính amylaza của 1 số chủng

Bacillus: ĐC- Đối chứng; 1-H3; 2-M12;

3-M17; 4-M16

===========================================================

70

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

Hình 8: Hoạt tính amylaza của 1 số chủng Bacillus: ĐC- Đối chứng; 1 (M21); 2

(M75); 3 (M71); 4 (M51); 5 (M17); 6 (M12); 7 (H4); 8 (M73)

Hình 9: Hoạt tính kháng Shigella flexneri của các chủng vi khuẩn Bacillus: 1 (H4);

3(H3); 2 (đối chứng) và 4 (M71)

===========================================================

71

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

PHỤ LỤC 2(KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA CHO rARN 16S VÀ ITS CỦA

CÁC CHỦNG NGHIÊN CỨU)

1. Chủng 1K8GAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGC

===========================================================

72

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

CGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTT

Trình tự rADN 16S của chủng 1K8 tương đồng với trình tự rADN 16S của Lactobacillus arizonensis 100 % (1400/1400 bp); Lactobacillus pentosus 100 % (1400/1400 bp); Lactobacillus plantarum 99,9 % (1/1400 bp ); Lactobacillus paraplantarum 99,9 % (1/1400 bp).

2. Chủng 6H2

CTTCTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCAAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAA

===========================================================

73

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

GAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTCGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT

Trình tự rADN 16S của chủng 6H2 tương ứng với trình tự rADN 16S của Enterococcus lactis 99,6% (1302/1306 bp); Enterococcus faecium 99,8% (1304/1306 bp).

3. Chủng Đ2GTGGGAAACCTGCCCAGAACGGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTT

===========================================================

74

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGGATCACCTCCTTT

Trình tự rADN 16S của chủng Đ2 tương ứng với trình tự rADN 16S của Lactobacillus arizonensis 99,8% (1268/1270 bp); Lactobacillus pentosus 99,8 % (1268/1270 bp); Lactobacillus plantarum 99,7% (1267/1270 bp); Lactobacillus paraplantarum 99,7 % (1267/1270 bp).

4. Chủng C3AcAtttGAGGTGAGTGGCgAACTGGTGAGTAaCGCGTGGGAAACCTGTCCCagAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCaaacTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCcTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTtAATTcGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAAtACGTTCCCGGGCcTTGTACACaCCGCCCGTCACACCAtGAgAGTTTGT

Trình tự rADN 16S của chủng C3 tương ứng với trình tự rADN 16S của Lactobacillus arizonensis 99,8% (1397/1400 bp); Lactobacillus pentosus 99,8% (1397/1400 bp); Lactobacillus plantarum 99,7% (1396/1400 bp).

5. Chủng NC1

===========================================================

75

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

GCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAAATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCGAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCGTTTCCTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAACTCGCGAGGGCAAGCAAATCTCTTAAAACCGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCCCACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTT

Trình tự rADN 16S của chủng NC1 tương đồng với trình tự rADN 16S của Lactobacillus fermentum 99,7 % (1446/1450).

6. Chủng NC2ACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGGCGAACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTGTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGA

===========================================================

76

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

GAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAATGATTAGGGG

Trình tự rADN 16S của chủng NC2 tương đồng với trình tự rADN 16S của Lactobacillus casei 99,7 % ( 1483/1486 ).7. Chủng Đ7

CGATGATTCTAAGTGTTGGAGGTTCCGCCCTTCATGCTGCAGCTAACGCTTTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGACAGTCTAAGAGATTAGAGGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACCGCGAGGTTAAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAGTCGTTACAAGGTAACAA

Trình tự rADN 16S của chủng Đ7 tương đồng với trình tự rADN 16S của Pediococcus pentosaceus 99,7 % ( 1542/1547).

===========================================================

77

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

8. Chủng Đ12 TTCCGCCCATTCAGTGCTGCAGCTAACGCTTTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAG

Trình tự rADN 16S của chủng Đ12 tương đồng với trình tự rADN 16S của Lactobacillus plantarum 99,9 % ( 1531/1532).

9. Chủng 2M33CCCTCCAACACATTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGC

===========================================================

78

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

TCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCGGTCCAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGGTTCCAGGTGTTATCCCCGCTTCTGGGCAGGTTCCCACGTGTTACTCACATCGCCTCCTCAATGTAATCATGAGGAAGCCATCATACAATCGTCGATTGCAGTATAGCCCAGGTGCTAAACGAAAAAAAAGGTGA

Trình tự rADN 16S của chủng Đ12 tương đồng với trình tự rADN 16S của Lactobacillus plantarum 99,7 % ( 1528/1532).

10. Chủng H4TGGcTCAGgACGAACGCTGGCGGCGtgCCTAATACATGCAaGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTtgcTCCCTGATgTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGgTAACCTGCcTGTAAGACTGGGATAAcTCCGGGAAACCGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACcTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACTCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAgGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGAC

===========================================================

79

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

AGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT

Trình tự rADN 16S của chủng H4 tương đồng với trình tự rADN 16S của Bacillus subtilis 99,8 % (1529/1532)

11. Chủng H3AGTTtgATcCTGGcTCAGgACGAACGCTGGCGgCGTgCTTaATACATGCAAgTCGAGCGgACCGACGGGAGCtTGcTCCcTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGgTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGtACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAgGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAgGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT

Trình tự rADN 16S của chủng H4 tương đồng với trình tự rADN 16S của Bacillus lichenifomics 99,9 % (1540/1541)

12. Chủng SB-I1

===========================================================

80

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

GCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTACCTCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATAC

Trình tự gen của SB tương đồng 100% với Saccharomyces boulardii

MỤC LỤCMỞ ĐẦU....................................................................................................................1Chương 1 – TỔNG QUAN.......................................................................................3

1.1. Lịch sử và định nghĩa probiotic...............................................................................31.1.1. Lịch sử probiotic..................................................................................................31.1.2. Định nghĩa probiotic............................................................................................4

1.2. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật nuôi....................................................................................................................................41.3. Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic..............................................................7

1.3.1. Vai trò của probiotic.............................................................................................71.3.2. Cơ chế tác động....................................................................................................8

1.4. Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic.................................................101.4.1. Lựa chọn các chủng probiotic............................................................................101.4.2. Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic........................................111.4.3. Công thức chế phẩm probiotic...........................................................................121.4.4. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic...................................121.4.5. Phân loại vi sinh vật...........................................................................................13

===========================================================

81

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam..............131.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế giới......................................................................................................................................131.5.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt nam15

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................182.1. Nguyên liệu..............................................................................................................18

2.1.1. Nguồn vi sinh vật...............................................................................................182.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng...............................................................................182.1.3. Môi trường nghiên cứu.......................................................................................19

2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................202.2.1. Các phương pháp định tính và định lượng.........................................................202.2.2. Phương pháp phân lập........................................................................................212.2.3. Phương pháp tuyển chọn....................................................................................222.2.4. Phương pháp phân loại.......................................................................................232.2.5. Phát triển chế phẩm............................................................................................33

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................363.1. Phân lập các chủng vi sinh vật hữu ích.................................................................363.2. Tuyển chọn các vi sinh vật có đặc tính probiotic.................................................37

3.2.1. Vi khuẩn lactic...................................................................................................373.2.2. Vi khuẩn Bacillus...............................................................................................393.2.3. Nấm men............................................................................................................42

3.3. Phân loại các chủng được tuyển chọn...................................................................433.3.1. Nghiên cứu phân loại vi khuẩn lactic.................................................................433.3.2. Nghiên cứu phân loại vi khuẩn Bacillus............................................................453.3.3. Nghiên cứu phân loại vi khuẩn nấm men...........................................................47

3.4. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được lựa chọn...................................................................................48

3.4.1. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic.............................................................................................................................483.4.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus.........................................................................................................................523.4.3. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của nấm men......................................................................................................................................53

3.5. Phát triển chế phẩm................................................................................................553.5.1. Kết quả về tính đối kháng của các chủng được lựa chọn...................................553.5.2. Các kết quả nghiên cứu về tính tương thích của các chủng được lựa chọn với một số thành phần có hoạt tính bổ sung trong thức ăn.................................................553.5.3. Kết quả đánh giá khả năng bám dính của các chủng probiotic..........................573.5.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung các chế phẩm probiotic vào khẩu phần đến tốc độ sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con..................................................58

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................60TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................61PHỤ LỤC..................................................................................................................69

===========================================================

82

Luận văn Thạc sỹ 2007 – 2009======================================================

===========================================================

83