WESTERN-BLOT

• Discriminación de antígenos específicos frente a los que se dirigen los anticuerpos presentes en una muestra.

• Prueba confirmatoria de infecciones virales (VIH, Hepatitis C, HTLV-1).

PROCEDIMIENTO

• Lisado del cultivo del agente infeccioso

• Electroforesis: separación de antígenos en gel de poliacrilamida

• Transferencia a matriz superpuesta de nitrocelulosa

• Incubación con suero del paciente

• Unión de anticuerpos específicos radiomarcados o unidos a enzima a proteína blanco

• Detección: bandas coloreadas por reacción enzimática en zonas correspondientes a anticuerpos específicos que contenga la muestra

Resultado:

• Positivo

• Negativo

• Indeterminado

CITOMETRÍA DE FLUJO

• Técnica de análisis celular

multiparamétrico que permite

caracterizar fenotípicamente una

célula mediante el estudio de la

dispersión de la luz y

fluorescencia emitidas cuando

atraviesa un rayo láser.

• Permite analizar células, núcleos, cromosomas, mitocondrias y otras partículas en suspensión.

SISTEMA HIDRÁULICO: controles neumático y fluidos para establecer un flujo laminar que permita a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo. 

SISTEMA ÓPTICO: láser (Argón con luz monocromática de 488nm, filtros, lentes y detectores. 

SISTEMA ELECTROINFORMÁTICO: convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para su análisis.

• Principio: hacer pasar células u otras partículas en suspensión alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso, induciendo variaciones ópticas que son detectadas por un sistema de fotomultiplicadores.

Señales de dispersión: interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección en todas direcciones. Determinada por el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula, llamado complejidad.

- en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión.

- en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula.

Fluorescencia: fluorocromo interacciona con luz láser y emite energía radiante. Parte se utiliza para la absorción y la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación. La diferencia entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina Stokes shiff.

Los CMF permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de Ac marcados con un fluorocromo y situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad de componentes fluorescentes de la partícula.

PARÁMETROS MEDIBLES POR CMF

Aplicaciones:

• Cuantificación de subpoblaciones linfocitarias para el Dx y seguimiento de inmunodeficiencias (ej. VIH); LCD4+ y CD8+

• Cuantificación de SC, CD34+ para valorar injertabilidad en muestras para TPH autólogo o alogénico.

• Diagnóstico, seguimiento, evaluación pronóstica y detección de EMR de hemopatías malignas. Identificación de tipos de leucemia.

• Detección de antígenos HLA para ayudar el diagnóstico de enfermedades autoinmunes con asociación estadística a determinados alelos.