wyk.ad okre.lanie struktury r..nych toksyn przy zastosowaniu techniki chromatografii ... · 2013....
TRANSCRIPT
-
OKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCHOKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCHTOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKITOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJCHROMATOGRAFII CIECZOWEJSPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETREMSPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETREM
MASOWYM (HPLC-MS)MASOWYM (HPLC-MS)
Dr inż.Agata Kot-Wasik
Katedra Chemii Analitycznej,Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska
ul. G.Narutowicza11/12,80-952 Gdańsk, [email protected]
Dr Hanna Mazur-Marzec
Instytut Oceanografii, Uniwersytet Gdański,
Al. Marszałka Piłsudskiego 46,81-378 Gdynia, [email protected]
-
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCETECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCEANALIZĘ TOKSYN:ANALIZĘ TOKSYN:
TESTY IMMUNOLOGICZNE I ENZYMATYCZNETESTY IMMUNOLOGICZNE I ENZYMATYCZNE
––ELISA (ELISA (angang.. EEnzymenzyme--LLinked inked IImmunommunossorbentorbentAAssayssay)) pozwala na oszacowanie obecności toksyn,np. wydzielanych przez glony z rodzaju Microcystis,na poziomie kilku µgL-1 bez przygotowania próbki,lecz nie pozwala na ich identyfikację.
––PPIPPI ((angang. . PProteinrotein PPhospatase hospatase IInhibition assaynhibition assay))
metody wysoce selektywne, czułe i szybkie
J. Rapala, K. Erkomaaa, J. Kukkonen, K. Sivonen, K. Lahti, Analytica Chimica Acta 466 (2002) 213-231
-
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCETECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCEANALIZĘ TOKSYN:ANALIZĘ TOKSYN:
METODY CHROMATOGRAFICZNEMETODY CHROMATOGRAFICZNE
– GC–MSGC–MS - zapewnia wysoką selektywność(specyficzność) oznaczenia, lecz wymagaderywatyzacji analitów, a poza tym nie możebyć zastosowana do analizy nielotnych toksynwysokocząsteczkowych.
-
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCETECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCEANALIZĘ TOKSYN:ANALIZĘ TOKSYN:
–– HPLC-UVHPLC-UV lub HPLC-DADHPLC-DAD - jedna z najczęściejnajczęściejstosowanych technik, jednakże nie zapewniaona wystarczającej jakości uzyskiwanychwyników bez zastosowania żmudnych idługotrwałych procedur przygotowania próbki.
––HPLC-fluorescencjaHPLC-fluorescencja - rzadziej stosowanatechnika, gdyż wymaga derywatyzacji analitów;ale znacznie czulsza niż HPLC-UV.
-
HPLC–DADHPLC–DADanaliza ekstraktu analiza ekstraktu NodulariiNodularii
HPLC-DAD
238 nm254 nm
-
HPLC–DADHPLC–DADanaliza ekstraktu analiza ekstraktu NodulariiNodularii
Analiza widma DAD
Wniosek: niezbędny jest wzorzeccelem potwierdzenia czasu
retencji i porównania widma UV
238 nm254 nm
-
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCETECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCEANALIZĘ TOKSYN:ANALIZĘ TOKSYN:
––HPLC-UVHPLC-UV lub HPLC-DADHPLC-DAD
Pozwala na uzyskanie informacji omasie cząsteczkowej oznaczanychtoksyn, a nawet ich identyfikację.
HPLC–DAD-MSHPLC–DAD-MS
-
HPLC-MSHPLC-MS
TAK, ALE ...
problem połączenia LC i MS !
Przepływ fazy ruchomej w LC wymusza problemy związane zuzyskaniem wysokiej próżni. Podczas analizy GC (faza ruchoma:gaz) przepływ gazu u wlotu do MS wynosi około 0.5-2ml/min.
Podczas kiedy w HPLC faza ruchoma w postaci ciekłej daje przepływgazu u wlotu MS rzędu 350ml/min w przypadku metanolu i aż
1000 ml/min w przypadku wody!
( J.Abian "The coupling of Gas and Liquid Chromatography with Mass Spectrometry ")
HPLC, 1 ml/min, 100-250 bar MS, próżnia
-
HPLC-MSHPLC-MS
KwadrupolKwadrupol
KolumnaKolumna HPLC HPLC
CiśnienieCiśnienieatmosferyczneatmosferyczne
PróżniaPróżniaWysokie ciśnienieWysokie ciśnienie
+HV+HV
ElektrorozpylanieElektrorozpylanie((electrosprayelectrospray))
ODPAROWANIEROZPUSZCZALNIKA
ROZPYLENIE
ROZSZCZEPIENIEI POWSTANIE JONÓW
[M+[M+nHnH]]n+n+
++
+
+
++
+
++
+
++ +
++++
++
+++
+++
+
++++
++
+++
+++
+
++++
++
+++
+++++
+ +++
++ +
+
++
++
-
HPLC–MSHPLC–MSanaliza ekstraktu analiza ekstraktu NodulariiNodularii
HPLC-MS
SCAN
SIM
-
HPLC–MSHPLC–MSanaliza ekstraktu analiza ekstraktu NodulariiNodularii
Widmo MS
SCAN
-
HPLC–MSHPLC–MSanaliza ekstraktu analiza ekstraktu NodulariiNodularii
Analiza widma MS
Wniosek: wzorzec może potwierdzićhipotezę o obecności nodularyny wekstrakcie, ale nie jest niezbędny.
[M+H][M+H]++ = 825.4 = 825.4
M=824.4M=824.4
NH
H
H
H H
H
OMe
H
NH
O
HN
H COOH
O
CH3
H
NH
O
O
NH
NH
NH2NH
O
CH3H
HCOOHH
CH3
-
HPLC–MSHPLC–MSanaliza ekstraktu analiza ekstraktu NodulariiNodularii
Widmo MS
SCAN
-
HPLC–MSHPLC–MSanaliza ekstraktu analiza ekstraktu NodulariiNodularii
HPLC-MS
NH
H
H
H H
H
OMe
H
NH
O
HN
H COOH
O
CH3
H
NH
O
O
NH
NH
NH2NH
O
CH3H
HCOOHH
CH3
[M+H][M+H]++ = 811.3 = 811.3
M=810.3M=810.3
dm-Nod
-
HPLC–DAD-MS HPLC–DAD-MS analiza ekstraktu:analiza ekstraktu:jezioro Karczemnejezioro Karczemne
HPLC-DAD
HPLC-MS
MS-SCAN
MS-SIM
DAD
-
MS-SCAN MS-SCAN analiza ekstraktu: jezioro Karczemneanaliza ekstraktu: jezioro Karczemne[M+H][M+H]++
NH2+ O
Anatoksyna A
NH
CH3H
HCH3
H
CH3
H
HH
O
NH
OCH3
H
N
O
OHH
NH
CH2
OCH3
A
H
CH3
O
NH
H
NH
O
NH
OH
R1
H
H
NH2NH MC RR
[M+2H][M+2H]2+2+
-
MS-SIM MS-SIM analiza ekstraktu: jezioro Karczemneanaliza ekstraktu: jezioro Karczemne
Jon monitorowany:166 (Anatoksyna-a)
Jon monitorowany:995 (MC-LR)
Jon monitorowany:520 (MC-RR)
Jon monitorowany:825 (Nod)
1046 (MC-YR)
-
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCETECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCEANALIZĘ TOKSYN:ANALIZĘ TOKSYN:
– HPLC–MSHPLC–MS - technika ta pozwala nauzyskiwanie informacji o masie cząsteczkowejoznaczanych toksyn.
Widmo masowe - “odcisk palca” substancjipozwala na jej identyfikację. Technika HPLC-DAD-MSzaczyna być coraz powszechniej stosowana do analizy
toksyn ze względu na jej zalety oraz fakt, iż dzisiajsystemy HPLC-MS stają się niezawodne, oferuje je corazwiększa liczba producentów, a ich ceny zbliżają się do
poziomu akceptowalnego przez większość laboratoriów.
-
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCETECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCEANALIZĘ TOKSYN:ANALIZĘ TOKSYN:
– HPLC–MSHPLC–MS
-
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCETECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCEANALIZĘ TOKSYN:ANALIZĘ TOKSYN:
niezwykle użytecznym rozwinięciem techniki HPLC-MSjest LC-MS-MSLC-MS-MS
––HPLC-MS-MSHPLC-MS-MS - dzięki zastosowaniudodatkowego detektora masowego możliwa jestidentyfikacja nieznanych substancji jedynie napodstawie ich widma masowego (nawet bezkonieczności posiadania wzorców).
-
WNIOSKI KOŃCOWE:WNIOSKI KOŃCOWE:
Technika HPLC–MSHPLC–MS zaczyna być corazpowszechniej stosowana w laboratoriachanalitycznych ze względu na jej zalety.
Wkrótce technika LC-MS stanie się technikąrutynowych analiz.