xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong vài loại thực...

8/20/2019 Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong vài loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội b…

http://slidepdf.com/reader/full/xac-dinh-dong-thoi-du-luong-khang-sinh-nhom-nitrofuran-trong 1/77

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

TR ẦN THỊ HỒNG

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢ NG

KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG

MỘT SỐ LOẠI THỰ C PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN

ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG KHỐI PHỔ LC/MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012



ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

TR ẦN THỊ HỒNG

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢ NGKHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG MỘT

SỐ LOẠI THỰ C PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀNHÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

KHỐI PHỔ LC/MS/MS

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚ NG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO

Hà Nội – 2012



MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔ NG QUAN ....................................................................................... 3

1.1. Giớ i thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran ....................................................... 3

1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì? ...................................................................................... 3

1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran ................................................................................. 3

1.2. Tác dụng ca các chất kháng sinh nhóm nitrofuran…………………………….61.3. Dƣ lƣợng kha ng sinh nho m nitrofuran trong thực phẩm ..................................... 6

1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng vớ i detector UV ....................................................... 6

1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assay-

ELISA) ........................................................................................................................ 7

1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS .............................................. 8

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U ....................... 11

2.1. Đối tƣợ ng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu ..................................................... 11

2.1.1. Đối tƣợ ng, mục tiêu nghiên cứu ...................................................................... 11

2.1.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 11

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 12

2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ ................................................................. 12

2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu .................................................................................. 18

2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu ........................................................................ 23

2.3.1. Dụng cụ, thiết bị .............................................................................................. 23

2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn ........................................................................................ 24

2.3.3 Pha chế chất chuẩn ........................................................................................... 25

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N ............................................................ 27

3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS ......... 27

3.1.1. Khảo sát các điều kiện khối phổ ..................................................................... 27



3.1.2. Lựa chọn cột tách ............................................................................................ 29

3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient ....................................................................... 30

3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu .......................................................................... 33

3.2. Thâ m đi nh phƣơng pha p .................................................................................... 38

3.2.1 Tính đc hiệu .................................................................................................... 38

3.2.1. Khảo sát lập đƣờ ng chuẩn ............................................................................... 38

3.2.2. Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lƣợ ng ca phƣơng pháp ......................... 43

3.2.3. Độ l p lại và độ thu hồi ................................................................................... 46

K ẾT LUẬ N ............................................................................................................... 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56



DANH MỤC CA C BẢ NG

STT Nội dung Trang

Bảng 1.1 Câu tru c ho a ho c cu a mô t số chất nho m nitrofuran

đƣơ c xa c đi nh trong đề tai

4

Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI 27

Bảng 3.2 K ết quả bắn phá các ion mẹ 28

Bảng 3.3 Năng lƣợ ng bắn phá và các ion con ca các chất

chuyển hóa nitrofuran

29

Bảng 3.4Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng

chiết lỏng – lỏng

35

Bảng 3.5Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng

chiết pha r ắn

37

Bảng 3.6 So sa nh độ thu hồi ca 2 quá trình chiết 37

Bảng 3.7 Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran sử dụng nội chuẩn 41

Bảng 3.8 Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran không sử dụng nội

chuẩn

43

Bảng 3.9 Giớ i hạn phát hiện ca AOZ trên nền mẫu thịt 44

Bảng 3.10 Giớ i hạn phát hiện ca AMOZ trên nền mẫu thịt 45

Bảng 3.11 Giớ i hạn phát hiện ca AHD trên nền mẫu thịt 45

Bảng 3.12 Giớ i hạn phát hiện ca SEM trên nền mẫu thịt 46

Bảng 3.13 Độ l p lại và độ thu hồi ca các nitrofuran trên nền

mẫu thịt lợ n tại 1 ppb

47

Bảng 3.14Độ l p lại và độ thu hồi ca các nitrofuran trên nền

mẫu thịt lợ n tại 1,5 ppb

48

Bảng 3.15Độ l p lại và độ thu hồi ca các nitrofuran trên nền

mẫu thịt lợ n tại 2 ppb

49



Bảng 3.16 K ết quả phân tích trên mẫu thực 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Nội dung Trang

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ 13

Hình 2.2 Sơ đồ phân tích khối phổ 3 tứ cực 16

Hình 2.3 Các bƣớ c ca quá trình chiết pha r ắn 19

Hình 3.1 Săc đô hô n hơ p chuâ n khi cha y chế đô gradient1 ở nồng đồ 20 ng/ml

30

Hình 3.2 Săc đô hô n hơ p chuâ n khi cha y chế đô gradient

2 ở nồng đồ 20 ng/ml

31



31



32



32

Hình 3.6 Sắc đồ mâ u thi t lơ n thêm chuâ n hô n hơ p

nitrofuran ta i mƣ c nồng đô 20 ng/ml sƣ du ng

quy tr nh chiết lo ng - lỏng

35

Hình 3.7 Sắc đồ mâ u thi t lơ n thêm chuâ n hô n hơ pnitrofuran ta i mƣ c nồng đô 20 ng/ml sƣ du ng

quy tr nh chiết pha răn

38

Hình 3.8 Đƣờ ng chuẩn AOZ sử dụng nội chuẩn 39

Hình 3.9 Đƣờ ng chuẩn AMOZ sử dụng nội chuẩn 39

Hình 3.10 Đƣờ ng chuẩn SEM sử dụng nội chuẩn 40



Hình 3.11 Đƣờ ng chuẩn AHD sử dụng nội chuẩn 40

Hình 3.12 Đƣờ ng chuẩn AOZ không sử dụng nội chuẩn 41

Hình 3.13 Đƣờ ng chuẩn AMOZ không sử dụng nội chuẩn 42

Hình 3.14 Đƣờ ng chuẩn AHD không sử dụng nội chuẩn 42

Hình 3.15 Đƣờ ng chuẩn SEM không sử dụng nội chuẩn 43


nitrofuran ta i mƣ c nồng đô 1 ng/g

47


nitrofuran ta i mƣ c nồng đô 1,5 ng/g

48

Hình 3.18 Sắc đồ mâ u thi t lơ n thêm chuâ n hô n hơ pnitrofuran ta i mƣ c nồng đô 2 ng/g

49



DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

CAD Collision Gas Presure Áp suất khí mang trong tứ cực Q2

CE Collision Energy Thế áp vào tứ cực Q

CUR Curtain Gas Khí mang

CXP Collision Cell Exit Potential Thế áp giữa tứ cực Q2 và Q3

DP Declustering Potential Thế đầu vào áp vào màn chắn

EP Entrance Potential Thế áp vào nguồn ion mẹ

ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử

EU European Union Liên minh châu Âu

GS1 Ion Source Gas 1 Áp suất khí hai bên đầu phun

GS2 Ion Source Gas 2 Áp suất ca luồng khí nóng

HPLC High performance liquid

chromatographySắc kí lỏng hiệu năng cao

IP Identification point Điê m nhâ n da ng

IS IonSpray Voltage Thế ion hóa

LC – MS Liquid chromatography –

mass spectrometrySắc kí lỏng khối phổ

LOD Limit of detection Giớ i hạn phát hiện

LOQ Limit of quality Giớ i hạn định lƣợ ng

MeOH Methanol Methanol

MRPLMinimum required

performance limit

Yêu cầu giớ i hạn hiệu năng nhỏ nhất

ca phƣơng pháp

RSD% Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối



SPE Solid phase extraction Chiết pha r ắn

TEM Temperature Nhiệt độ ca nguồn khí nóng thổi vào



1

MỞ ĐẦU

An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề đang đƣợ c cả xã hội quan tâm, đc biệt

là ở đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị phát

hiện trong thực phẩm khiến dƣ luận lo ngại. Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinh

doanh nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiều vấn đề

đáng lo ngại, nhƣ việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình tr ạng sử

dụng các chất bổ tr ợ trong chăn nuôi khá tùy tiện. Từ đó đã để lại tồn dƣ các hóa

chất, kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức

khỏe ngƣời tiêu dùng.

Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thƣờng đƣợ c sử dụng cho va o

thức ăn gia súc đê kích thích tăng trƣởng và là phƣơng pháp điều tr ị dự phòng, điều

tr ị các bệnh nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong

chăn nuôi gia súc, gia cầm. Chúng cũng đã đƣợ c sử dụng để điều tr ị nhiễm trùng do

vi khuẩn và sinh vật đơn bào trong nuôi trồng thy sản...Vì vậy sự tồn dƣ ca

chúng gây tác hại cho sức khỏe con ngƣời, đc biệt là gây ung thƣ và đột biến ở

ngƣời. Năm 2002 – 2003 phát hiện dƣ lƣợ ng chất chuyển hóa ca nitrofuran trong

số lƣợ ng lớn các mẫu từ gia cầm và nuôi trồng thy sản các sản phẩm nhậ p khẩu

vào Châu Âu từ một số khu vực Đông Nam Á và các nƣớ c Nam Mỹ. Từ đó đã dẫn

đến lệnh cấm sử dụng nitrofuran trong sản xuất thực phẩm động vật tại nhiều quốc

gia bao gồm Mỹ, Canada và EU... Các nƣớc này đã đt lệnh cấm trên tất cả các loại

thực phẩm nhậ p khẩu có chứa dƣ lƣợng nitrofuran. Tháng 3 năm 2003 EU đã quy

định yêu cầu giớ i hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất

chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nông

nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định cấm sản xuất, nhậ p khẩu, lƣu thông và

sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh TACN trong

đó có nitrofuran [9].

Hiện nay việc sử dụng dƣ lƣợng kháng sinh sai mục đích đang ở mức báo động

ảnh hƣở ng tớ i sức khỏe con ngƣời và động vật. Vì vậy vớ i nhu cầu bức thiết về vấn



2

đề đảm bảo VSATTP, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển phƣơng pháp

“Xác định đồng thời dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại

thự c phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối

phổ LC/MS/MS”.



3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.

Giớ i thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran

1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì?

Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợ p có chứa nhóm 5-nitro, thƣờ ng

đƣợ c sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trƣở ng, ch yếu đối với gia súc

(nhƣ gia cầm, lợ n), nuôi trồng thy sản (cá, tôm) và nuôi ong đê điều tr ị các vi

khuẩn và sinh vật đơn bào nhiễm trùng nhƣ viêm ruột tiêu hóa gây ra bở i

Escherichia coli và Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu đen đầu

[12].

1.1.2.

Các chất nhóm nitrofuran

Các chất nhóm n itrofuran bao gôm Furazolidone, furaltadone, furazolidone,

nitrofurazone, khi đi va o cơ thê sinh vâ t nó tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng

ứng (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kết trong ca c mô tồn ta i trong nhiêu tuần sau

khi sƣ du ng [12]. Ví dụ nhƣ quá trình chuyển hóa ca nitrofurazone nhƣ sau :



4

Bảng 1.1: Cấu tru c ho a ho c cu a mô t sô chất nho m nitrofuran đƣơ c xa c đi nh trong đề ta i

STT Các chất nitrofuran Công thƣ cphân tƣ

Khô i

lƣơ ng

phân

tƣ

(g/mol)

Công thƣ c câ u ta o

1AOZ

3-amoni-2-oxazolidinoneC3H6 N2O2 102,09

2

NPAOZ

3-(2-nitrobenzylidenamino)-

2-oxazolidinone)C10H9 N3O4 235,2

3

AMOZ

3-amoni-5-morpholinomethyl

-1,3-oxazolidinone

C8H15 N3O3 201,22

4

NPAMOZ

5-(morpholinomethyl)-3-(2-

nitrobenzylidenamino)-2-

oxazolidinone

C15H18 N4O5 334,33

5AHD

1-aminohydantoinC3H5 N3O2 116,05

6

NPAHD

[3-(2-nitrobenzylidenamino)

-2,4-imidazolidinedione]

C10H8 N4O4 248,19



5

7

SEM

semicarbazide

CH5 N3O

75,08

8

NPSEM

3[(2-nitrophenyl)methylene]-

hydrazinecarboxamide

C8H8 N4O3 208,174

1.2. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran

McCracken va ca c cô ng sƣ 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra r ằng các

hợ p chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng

ứng liên kết trong các mô.

Về mt cơ chế tác dụng, các chất chuyển hóa tƣ nitrofuran đã kìm hãm hoc

phá hy các hệ thống men điều hòa trao đổi chất ở vi khuẩn. Do đó vi khuẩn không

phát triển va không sinh sản đƣợ c nữa. Tác dụng tốt vớ i vi khuẩn gram âm và gramdƣơng. Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác

dụng tốt trong viê c giê t trƣ giun đũa [7].

Vơ i nồng độ thấ p, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác

dụng diệt khuẩn.

Theo nhiều báo cáo, nitr ofuran tác dụng r ất tốt trong viê c diê t khuâ n

salmonellosis, colisepticeamia. Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dƣỡ ng.

Tr ộn nitrofuran vớ i thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp se giúp cho gà và lợn còn tăng trọng

nhanh.

Nitrofuran ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và đột biến

[7], khi thƣ c phâ m co tồn dƣ nitrofuran va ca c dâ n xuât cu a no .

Do đó hầu hết ca c nƣơ c trên thế giơ i đa cấm sƣ du ng kha ng sinh nho m

nitrofuran trong chăn nuôi . Ở Việt Nam, bô Nông nghiê p va pha t triê n nông thôn đa

quyết đi nh câm sƣ du ng ni trofuran cho va o trong thƣ c ăn chăn nuôi [9]. EU đã quy



6

định yêu cầu giớ i hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất

chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29].

1.3. Dƣ lƣợ ng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thự c phẩm

Từ năm 2002 – 2003 nitrofuran thƣờng xuyên đƣơ c phát hiện thấy trong thịt

gia cầm và các sản phẩm nuôi trồng thy sản nhậ p khẩu vào các nƣớ c EU từ Thái

Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil [25].

Hơn nữa, dƣ lƣợng nitrofuran cũng đƣợc tìm thấy trong sản phẩm gia súc và

gia cầm ở Châu Âu nhƣ: Bồ Đào Nha, Ý, Hy Lạ p, Romania và Bulgari. Sau đó EU

đã kiểm tra và cho thấy nitrofuran ô nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn

9 quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc(37%), Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phẩm bao gồm

tôm, mật ong và thịt hộ p [25].

Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thy sản nhậ p

khẩu từ Trung Quốc có nhiễm nitrofuran. K ết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê,

cá ba sa..cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cấm nitrofuran

trong tôm [11].

Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát ca TS . Nguyê n Quôc Ân , phó trƣởng

phòng quản lý thuốc , cục thú y vào năm 2007 đa phát hiện 5 mâ u thu y sa n nuôi lấy

tại ao nuôi nhiễm SEM (3 mâ u tôm, 1 mâ u ca va 1 mâ u cua lô t) vơ i ha m lƣơ ng tƣ 0

– 3,55 ng/g. Năm 2008 phát hiện 1 mâ u tôm the chân trăng ta i Phu My – Bình Định

nhiê m AOZ vơ i ha m lƣơ ng 12,6 ng/g; 2/754 mâ u cua lô t ta i Cân Guô c – Long An

nhiê m SEM vơ i ha m lƣơ ng tƣ 2 – 2,2 ng/g [1].

1.4.

Các phƣơng pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran

Hiê n nay co nhiều phƣơng pha p đê xa c đi nh kha ng sinh nho m nitrofuran , bao

gồm: phƣơng pha p săc ky lo ng v ới detector UV , phƣơng pha p vi sinh (kỹ thuật

Elisa), phƣơng pha p săc ky lo ng vơ i detector MS/MS.

1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng vớ i detector UV

Một số tác giả đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng vớ i detector tử ngoại khả

kiến (HPLC-UV-VIS) để phân tích kháng sinh nhóm nitrofuran và các dẫn xuất ca



7

nó trong một số đối tƣợ ng thực phẩm. Horne và cộng sự, đã xây dựng phƣơng pháp

xác định AOZ, AMOZ trong gan lợ n sử dụng HPLC – UV. Phƣơng pháp dựa trên

sự dẫn xuất các nitrofuran vớ i 2-nitrobenzaldehyde, sau đó chiết vớ i ethyl acetate,

làm sạch bằng n-hexan và phân tích bằng HPLC-UV sử dụng cột C18 kêt hơ p vơ i

detector UV ơ bƣơ c so ng 275nm. Giớ i hạn phát hiện ca phƣơng pháp là 5 và 10

µg/kg tƣơng ứng cho AOZ và AMOZ vơ i độ thu hồi trong khoảng 71-101% [18].

Tác giả Cooper và cộng sự cũng giớ i thiệu phƣơng pháp xác định AOZ,

AMOZ, AHD, SEM trong gan và thận ca lợn dùng HPLC-UV đã tách đƣợ c 4 chất

chuyển hóa nhóm nitrofuran. Giớ i hạn phát hiện ca phƣơng pháp là từ 2 – 5 µg/kg

[21].

Phƣơng pháp HPLC -UV co ƣu điê m là dễ thực hiện , và có thể ứng dụng

phân t ch rô ng ra i . Tuy nhiên phƣơng pha p la i không đa p ƣ ng đƣơ c yêu cầu về đô

nhạy để phân tích các nitrofuran trong thực phẩm vì hiện nay giới hạn cần phải đạ t

tơ i (MRPL) là 1 µg/kg.

1.4.2.

Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assay-

ELISA)Hiện nay, ELISA đƣợ c sử dụng r ộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhƣ

y học, nông nghiệ p và đc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lƣợ ng

các sản phẩm sinh học. Nguyên tắc chung đều dựa trên sự k ết hợp đc hiệu giữa

kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợ c gắn vớ i một enzyme, enzyme

s thy phân thành một chất có màu .

Phòng thí nghiệm randox ca Anh đa nghiên cứu xác định các chất chuyển

hóa nhóm nitr ofuran sử dụng phƣơng pha p Elisa: mẫu đƣợc đồng nhất, thy phân

và dẫn xuất bằng o-NBA trong môi trƣơ ng axit HCl , trung hòa axit bằng NaOH,

chiết và làm sạch mẫu bằng ethyl acetate và n-hexane. Giớ i hạn phát hiện ca

phƣơng pháp từ 0,2 – 0,6 ng/g [28].

Vass và cộng sự (2008) sử dụng k ỹ thuật Elisa tr ực tiế p sử dụng kháng thể

đc hiệu cho NPSEM, kháng thể đƣợ c gắn 1 enzym HRP xác định SEM trong tr ứng

với quy trình xử lý mẫu: mẫu đƣợc đồng nhất, thy phân và dẫn xuất bằng o-NBA

http://vi.wikipedia.org/wiki/Y_h%E1%BB%8Dc



http://vi.wikipedia.org/wiki/N%C3%B4ng_nghi%E1%BB%87p


http://vi.wikipedia.org/wiki/Sinh_h%E1%BB%8Dc








8

trong môi trƣơ ng axit HCl , sau đo trung hòa bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu

bằng ethyl acetate và n-hexane. Giớ i hạn phát hiện ca phƣơng pháp là 0,13 µg/kg,

CCα = 0,3 µg/kg [25].

Diblikova và cộng sự (2005) giơ i thiê u k ỹ thuật Elisa tr ực tiế p, sử dụng

kháng thể đc hiệu cho NPAOZ, kháng thể đƣợ c gắn 1 enzym HRP xác định AOZ

trong tôm, thịt gà, thịt lợ n, thịt bò vớ i CCβ là 0,4 µg/kg, độ thu hồi từ 66 – 119%

[20].

Lui và cộng sự (2007) giơ i thiê u k ỹ thuật Elisa gián tiế p, sử dụng kháng thể

NFT, kháng thể đƣợ c gắn 1 enzym HRP xác định AHD trong nƣớ c. Giớ i hạn phát

hiện là 0,2 µg/l, độ thu hồi từ 88 – 103% [31].Tƣơng tự Chang và cộng sự (2008) xác định trong gan lợn, gan gà và cá vớ i

giớ i hạn phát hiện lần lƣợt là 0,19; 0,24; 0,18 µg/kg [15].

Phƣơng pha p Elisa đa p ƣ ng đƣơ c yêu cầu về đô nha y , đơn gia n dê thƣ c hiê n ,

tuy nhiên đô đă c hiê u bi giơ i ha n v pha i đa nh dâu cho tƣ ng kha ng thê chuyên biê t

cho tƣ ng đối tƣơ ng.

1.4.3.

Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

Đây là một phƣơng pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thờ i dƣ lƣơ ng

nitrofuran. Sau khi qua cột tách, chất phân tích đƣợc hóa hơi, các hợ p chất hữu cơ

trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh ca phân tử mang điện

dƣơng hoc âm, các gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đƣa sang bộ phận tách theo

khối lƣợ ng. Từ các tín hiệu thu đƣợ c, dựa vào khối lƣợng ion phân tử, dựa vào đồng

vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ

liệu các ion và mảnh ion, ngƣời ta định tính và định lƣợng đƣợ c chất phân tích một

cách chính xác.

Ở Việt Nam năm 2004, Bộ Thy sản (nay là Bộ Nông nghiệp và phát triển

nông thôn) đa ban hành TCN 194:2004 xác định các chất chuyển hóa thuộc nhóm

nitrofuran trong thy sản và sản phẩm thy sản bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối

phổ phân t ch dƣ lƣợng liên kết với mô ca các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran

trong sản phẩm thy sản đƣợ c thy phân bằng axit clohydric loãng để thu đƣợ c



9

mạch nhánh ca các chất nhóm nitrofuran. Các mạch nhánh này đƣợ c dẫn xuất bằng

2-nitrobenzaldehyde, sau đó đƣa pH đến 7 và đƣợ c chiết bằng ethyl axetat. Dịch

chiết đƣợ c thổi khô bằng N2 đến cạn, hòa tan cn, sau đó đo dung di ch mâ u na y

băng hệ thống LC/MS/MS vơ i pha đô ng kênh A la axit acetic , kênh B la acetonitril .

Giớ i hạn phát hiện ca phƣơng pháp là 1 µg/kg [10].

Năm 2002 phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi ca Thái Lan đƣa ra quy

trình phân tích 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran (AOZ, AMOZ, AHD, SEM)

bằng LC/MS/MS giớ i hạn phát hiện lần lƣợ t ca từng chất là AHD 0,1 µg/kg; AOZ

0,04 µg/kg; SEM 0,15 µg/kg; AMOZ 0,02 µg/kg [29].

Tác giả Pascal Mottier và cộng sự, xác định 4 chất chuyển hóa nhómnitrofuran trong thịt bằng LC/MS/MS vơ i pha đô ng kênh A la axit acetic 0,025%,

kênh B la acetonitril , sƣ du ng quy tr nh làm sạch bằng cột chiết pha r ắn polymeric

trƣớc khi phân tích bằng LC/MS/MS và thu đƣợc CCα từ 0,11 – 0,21 µg/kg, CCβ từ

0,19 – 0,36 µg/kg [26].

Trong ta i liê u [25] ca tác giả M .Vass, tác giả Boket và cộng sự (2007) xác

định các chất chuyển hóa nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS, CCα lần lƣợ t ca

từng chất AOZ, AMOZ, AHD, SEM là 0,03; 0,05; 0,22; 0,2. Độ thu hồi từ 95,2 –

102,1 %.

Leitner và cộng sự xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt

gia súc, gia cầm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS vơ i pha đô ng

kênh A la amoniacetat 10mM, kênh B la methanol , sƣ du ng qua tr nh la m sa ch bằng

cột chiết pha r ắn SPE vớ i chất hấ p thụ polystyrene đƣợ c k ết hợ p bằng cách thy

phân các chất chuyển hóa hình thành liên kết trong các mô và đƣợ c dẫn xuất bằng

2-nitrobenzaldehyde. Giớ i hạn phát hiện ca phƣơng pháp là 0,5 – 5 ng/g; giớ i hạn

định lƣợ ng từ 2,5 – 10 ng/g [12].

Verdon và cộng sự năm 2007 cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định các

chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt lợ n bằng LC/MS/MS vơ i cô t C 18, pha

đô ng kênh A la amonifomiat 1mM, kênh B la methanol , sử dụng phƣơng pha p chiêt

lỏng – lỏng thu đƣơ c CCα = 0,08 – 0,54 µg/kg và CCβ = 0,10 – 0,66 µg/kg [19].



10

Tác giả C.Bock và cộng sự đã thẩm định phƣơng pháp xác định dƣ lƣợ ng 4

chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong tr ứng bằng LC/MS/MS vơ i CCα từ 0,03 –

0,22 µg/kg [14].

Các tác giả Chung-Wei Tsai, Chuan-ho Tang và Wei-Hsien Wang đã xác

định các chất chuyển hóa nitrofuran trên LC/MS/MS vớ i pha đô ng kênh A la

amoniacetat 20mM, kênh B la methanol co giớ i hạn định lƣợng 1 µg/kg vơ i CCα =

0,19 – 0,43 µg/kg. Khoảng tuyến tính từ 1 – 10 µg/kg [16].

Tác giả Lech Rodziewicz (2008), xác định các chất chuyển hóa nitrofuran

trong sữa bằng LC/MS/MS vơ i pha đô ng kênh A la amoniacet at 0,5mM, kênh B la

methanol. Phƣơng pháp có hê số biến thiên nho hơn 9,3%, độ tái lậ p nội bộ nhỏ hơn13%, CCα từ 0,12 – 0,29 µg/kg, CCβ từ 0,15 – 0,37 µg/kg [22].

Tác giả Caroline Douny và cộng sự (2012), đã xác định các chất chuyển

hóa nhóm nitrofuran, nghiên cứu ứng dụng để đánh giá furanzolidone trong tôm sú

ở Việt Nam. Mẫu đƣợc đồng nhất, thy phân và dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte,

chiết lỏng – lỏng bằng etylacetat trƣớc khi xác định băng hệ thống LC/MS/MS vơ i

pha đô ng kênh A la axit acet ic 0,1%, kênh B la acetonitril thu đƣơ c CCα từ 0,08 –

0,36 µg/kg, CCβ từ 0,12 – 0,61 µg/kg [13].

Tóm lại : Các phƣơng pháp ( phƣơng pha p săc ky lo ng vơ i detector UV -VIS, phƣơng

pháp hóa sinh Elisa , phƣơng pha p s ắc ký lỏng với detector MS /MS) đều có điểm

chung là thy phân để đƣa các chất chuyển hóa nitrofuran liên kết trong các mô

thành dạng tự do sau đó sử dụng 2-nitrobenzaldehyde để chuyển nitrofuran thành

các dẫn xuất tƣơng ứng. Các dẫn xuất này sau đó đƣợ c chiết lỏng lỏng hoc chiết

pha r ắn và phân tích bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ. Phƣơng pháp này có

ƣu điểm là có độ nhạy r ất tốt, thƣờ ng từ 0,1 µg/kg có độ chọn lọc cao và có độ

chính xác đáp ứng để xác định nitrofuran trong thực phẩm. Do đó trong nghiên cứu

đề tài chúng tôi thống nhất lựa chọn phƣơng pháp LC-MS/MS vớ i quá trình thy

phân bằng axit clohydric và dẫn xuất vớ i 2-nitrobenzaldehyde để xác định các chất

chuyển hóa ca nitrofuran.



11

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.1. Đối tƣợ ng, mục tiêu và nội dung nghiên cứ u

2.1.1. Đối tƣợ ng, mục tiêu nghiên cứ u

Đối tƣợng nghiên cứu là các chất chuyển hóa ca nitrofuran, bao gồm: AOZ,

AMOZ, SEM và AHD.

Vật liệu nghiên cứu là sản phẩm thực phẩm tƣơi sống bao gồm thịt và gan

ca gia súc gia cầm.

Mục tiêu chung ca đề tài là nghiên cứu xây dƣ ng phƣơng pháp xác định

đồng thờ i 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran: AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong thực

phẩm tƣơi sống bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS. Các mục tiêu cụthê nhƣ sau:

- Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thờ i 4 chất chuyển hóa ca nitrofuran trong

thực phẩm tƣơi sống bằng LC-MS/MS.

- Ứ ng dụng phƣơng pháp để xác định các chất chuyển hóa ca nitrofuran trong thực

phẩm tƣơi sống cụ thể trong thịt lợn, thịt bò, thịt gà, gan.

2.1.2. Nội dung nghiên cứ u

2.1.2.1. Xây dựng phƣơng pháp

Khảo sát phƣơng pháp bao gồm:

Điều kiện và thông số vận hành máy LC/MS/MS,

Điều kiện tách chiết lây chât phân t ch.

Thẩm định phƣơng pháp:

Giớ i hạn phát hiện LOD, giớ i hạn định lƣợ ng LOQ,

Khoảng tuyến tính,

Độ chụm (độ l p lại),

Độ đúng (độ thu hồi, độ chệch).

2.1.2.2. Ứ ng dụng phƣơng pháp

Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định dƣ lƣợng kháng sinh nhóm

nitrofuran cụ thể là các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống

đang ba n trên địa bàn Hà Nội.



12

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứ u

2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ

2.2.1.1. Nguyên tắc chung về phƣơng pháp sắc kí lỏng HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chấ t r ắn và

pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng – r ắn). Mẫu phân tích đƣợ c chuyển lên cột tách

dƣớ i dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phan tích đƣợc phân bố

liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc

phân tử và tính chất lí hóa ca các chất khác nhau, nên khả năng tƣơng tác ca

chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển vớ i tốc độ

khác nhau và tách ra khỏi nhau thành từng lớp ca mỗi chất.2.2.1.2. Pha tĩnh trong HPLC [8]

Trong LC, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ

tách hỗn hợ p chất phân tích. Đó là những chất r ắn, xốp và kích thƣớ c hạt r ất nhỏ, từ

3-7µm. Tuỳ theo bản chất ca pha tĩnh, trong phƣơng pháp sắc ký lỏng pha liên kết

thƣờng chia làm 2 loại: sắc ký pha thƣờ ng (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-

HPLC). Khi dùng chất nhồi cột có cỡ hạt nhỏ hơn đƣờng kính hạt 1,7 µm, chịu

đƣợc áp suất cao lên tới 700 atm làm tăng độ phân giải và giảm thời gian phân tích

đó là những ƣu điểm ca sắc ký lỏng UPLC (Ultra Performance Liquid

Chromatography).

2.2.1.3. Pha động trong HPLC [8]

Có thể chia pha động làm hai loại: là pha động có độ phân cực cao và pha

động có độ phân cực thấ p.

Loại thứ nhất có thành phần ch yếu là nƣớc, tuy nhiên để phân tích các chất

hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực. Pha động loại này đƣợc dùng

trong sắc ký pha ngƣợ c.

Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực nhƣ cychlorpentan, n-pentan, n-

heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene…Tuy nhiên

pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đƣợ c khả năng rửa giải, ngƣờ i ta



13

thƣờ ng phối hợ p 2 hay 3 dung môi để có đƣợc dung môi có độ phân cực từ thấp đến

cao phù hợ p với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra

theo thời gian, trƣờ ng hợp này ngƣờ i ta gọi là chƣơng trình r ửa giải gradient.

2.2.1.4. Detector trong HPLC [5]

Detector là bộ phận quan tr ọng quyết định độ nhạy ca phƣơng pháp. Đối

vơ i ca c chất chuyê n ho a nho m nitrofuran co khối lƣơ ng phân tƣ thấp không co kha

năng hấp thu tia UV , có thể tạo dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde ta o sa n phâ m co

khả năng hấp thụ tia UV và đƣợc xác định bằng detector HPLC -UV.

Hiê n nay, detector có thể cung cấp thông tin định tính, định lƣợng và cấu trúc

ca các chất phân tích là detector khối phổ.

2.2.1.5. Hệ thống detector khối phổ (Mass Spectrometry)

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân tử ca

các hợ p chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lƣợ ng

và điện tích (m/z) ca chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích

ca chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa,…Các ion tạo thành này đƣợc tách theo

tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lƣợ ng hoc cấu trúc phântử ca hợ p chất.

Hình 2.1: Sơ đồ cấ u t ạo thiế t bị khố i phổ

Cấu tạo ca một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị

phân tích khối và bộ phận phát hiện. Trƣớ c hết, các mẫu đƣợc ion hóa trong nguồn

ion, sau đó đƣa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín

hiệu thu đƣợ c s chuyển vào máy tính để xử lí và lƣu trữ.

Ƣu điểm ca phƣơng pháp là:

Giúp phát hiện hầu hết các chất tan



14

Độ nhạy cao

Có thể giúp xác định đƣợc các chất tan ngay khi độ phân giải chƣa tốt.

Hữu hiệu cho nghiên cứu các hợp chất.

Cung cấp đầy đ thông tin về cấu trúc và khối lƣợ ng

2.2.1.5.1. Bô nguồn ion (Ion sources)

Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớ n nhất ở đây là

phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi. Theo kỹ thuật ion hoá ca

LC/MS, năng lƣợ ng ca máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoc r ắn để tạo thành

ion ở thể hơi. Trong máy khối phổ, có rất nhiều cách để ion hoá phân tử và nguyên

tử ca mẫu ở tr ạng thái khí hoc hơi. Sau đây là một số k ỹ thuật thƣờng dùng:

a) Ion hóa bằng dòng electron (Electron Ionization – EI):

Trong phổ EI-MS, dòng electron có năng lƣợng cao đƣợc phát ra từ sợi dây

catot vonfram hoc reni đƣợc đốt nóng sinh ra dòng electron chuyển động vuông

góc vớ i mẫu về phía anot xảy ra sự va chạm biến các mẫu thành các ion phân tử

hoc ion mảnh. Thông thƣờng các hợ p chất hữu cơ có thế ion hóa nằm trong khoảng

8 eV đến 15 eV nhƣng để đạt đƣợ c hiệu quả cao thƣờng áp dụng dòng 70 eV .

ABC + e → ABC+● + 2e (1) (ion phân tử)

ABC+●

→ A+ + BC

● (2) (ion mảnh, gốc tự do, mảnh trung hòa)

ABC+●

→ A+ + B +C

●

Ƣu điểm: áp dụng cho phân tử nhỏ, cho cơ sở dữ liệu phổ. Tuy nhiên, một số

hợ p chất dễ phân mảnh thì thờ i gian sống ngắn, nhiều mảnh nhỏ hay ít hoc không

thu đƣợc ion phân tử và đòi hỏi hợ p chất phải dễ bay hơi.

b) Chế độ ion hóa phun điện t ử (Electrospray Ionization- ESI)

Nguyên tắc: biến đổi ion ở thể lỏng thành ion ở thể hơi, dung dịch mẫu đƣợ c

dẫn vào điện trƣờ ng mạnh và duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch

mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và đƣợc hút tĩnh điện tớ i lối vào ca bộ



16

phép phân tích định lƣợ ng ở mức picomol tới femtomol, thích hợ p cho những chất

có phân tử khối 1000 đơn vị nhƣng đòi hỏi chất phân tích phải dễ dàng bay hơi.

2.2.1.5.2. Bộ phận phân giải khốiSau khi đƣợ c ion hóa, chất phân tích đƣợc đƣa vào bộ phận phân giải khối.

Tại đây, các ion đƣợc tách ra khỏi nhau theo tỉ số m/z. Bộ phận phân tích khối đƣợ c

chia thành 4 loại: bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích bẫy ion tứ cực

và bộ phân tích thờ i gian bay. Trong đó bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)

và bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser) đƣợ c sử dụng

phổ biến.

a)

Bộ phân giải t ứ cự c (Quadrupole Analyser)

Tứ cực đƣợ c cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng

tr ống để các ion bay qua. Một trƣờng điện từ đƣợ c tạo ra bằng sự k ết hợ p giữa dòng

một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực đƣợc đóng vai trò nhƣ một

bộ lọc khối. Khi một trƣờng điện từ đƣợc áp vào, các ion chuyển động trong nó s

dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trƣờ ng RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z

phù hợ p mới có thể có thể đi qua đƣợ c bộ lọc này.

Bộ phân giải tứ cực đƣợc phát triển và cho ra đờ i bộ phận phân giải khối phổ

ba tứ cực (Triple Quadrupole).

Hình 2.2: Sơ đồ bộ phân g iải khố i phổ ba t ứ cự c



17

Bộ phân tích khối phổ ba tứ cực gồm một buồng va chạm (collision cell,

đƣợc xem là tứ cực thứ hai Q2) đt ở giữa 2 tứ cực (Q1 và Q3).

Ở buồng Q1: Các ion đƣợc tách.

Ở buồng Q2: Với áp suất cao, các ion bị phân ly do va chạm vớ i khí trơ

có mt nhƣ nitơ, argon, heli nên chúng bị phân mảnh tiế p tạo ra các ion

nhỏ hơn (ion con).

Ở buồng Q3: Làm nhiệm vụ tách các ion con.

b) Bộ phân giải bẫ y ion t ứ cự c (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)

Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) vớ i nhiều điện

cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dƣới. Trái vớ ilại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đƣờ ng cong ổn

định đƣợ c bẫy lại cho đến khi một điện áp RF đƣợc đt trên điện cực vòng. Các ion

khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và s có hƣớng đi về phía detector. Do

điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu đƣợ c một phổ khối lƣợng đầy đ

Các ion tồn tại trong bẫy có thể đƣợ c chọn riêng và phân tích theo sự khác

nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu đƣợ c

các mảnh ion con từ đó thực hiện phân tích theo m/z ca ion con (khối phổ 2 lần).

Về nguyên tắc các ion con có thể tồn tại trong bẫy thờ i gian đ lâu để có thể thực

hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thƣờ ng chỉ có khả năng thực hiện đến

khối phổ 3 lần.

2.2.1.5.3. Bộ phận phát hiện

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân giải khối lƣợng, các ion đƣợc đƣa tớ i phần

cuối ca thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu ca các ion tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợ c

khuếch đại hoc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát

hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.

Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất,

có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mt dinot làm bật ra các electron. Các electron



18

thứ cấp sau đó đƣợ c dẫn tới các dinot tiếp theo và s tạo ra electron thứ cấ p nhiều

hơn nữa, tạo thành dòng electron.

Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống nhƣ thiết bị nhân electron, các ion

ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng electron. Khác với detector nhân electron,

các electron sau đó s đập vào một màn chắn photpho và giải phóng ra các photon.

Các photon này đƣợc phát hiện bở i một bộ nhân quang hoạt động nhƣ thiết bị nhân

electron. Ƣu điểm ca phƣơng pháp này là các ống nhân quang đƣợc đt trong chân

không nên loại bỏ đƣợc các khả năng nhiễm bẩn.

2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu

2.2.2.1. Xử lý mẫu bằng chiết lỏng lỏng [8]

Chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật dựa trên sự phân bố khác nhau ca chất tan vào

2 pha không trộn lẫn, từ đó tách chiết chất phân tích ra khỏi nền hoc tách các tạ p

chất ra khỏi chất phân tích. Cho nên, nguyên tắc ca k ỹ thuật chiết này là cho chất

tan (chất phân tích) ƣu tiên tan vào một trong hai pha lỏng không trộn lẫn, còn tạ p

chất hay các chất khác ở lại trong pha kia.

Để có đƣợ c k ết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm

bảo đƣợc các yêu cầu nhất định sau đây:

- Dung môi chiết và dịch chất mâ u cân chiết gọi tắt là hai pha không đƣợ c

tr ộn lẫn vào nhau , trong đó dung môi chiết phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo

không làm nhiễm bẩn chất phân tích.

- Hệ số tách 1 DB

DA

K

K và hiển nhiên là α càng khác 1 càng tốt. Điều

kiện tối ƣu là K DA . K DB = 1.

- Cân bằng chiết đạt đƣợc nhanh và thuận nghịch, sự phân lớ p phải rõ ràng

để tách hai pha đƣợ c tốt.

- Phải chọn đƣợc điều kiện chiết tối ƣu bao gồm: pH ca dung dịch mâ u,

nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia…

2.2.2.2. Xử lý mẫu bằng chiết pha rắn [8]



19

Chiết pha r ắn là một phƣơng pháp chuẩn bị mẫu để tách làm giàu và làm

sạch mẫu phân tích từ dung dịch mâ u bằng cách hấ p phụ lên cột chiết pha r ắn. Sau

đó chất phân tích đƣợ c r ửa giải bằng một lƣợng nho dung môi thích hợp. Các chất

ảnh hƣởng đƣợ c loại bỏ.

Cột SPE đƣợ c nhồi cht bằng những vật liệu xố p, hạt nhỏ có các nhóm chức

khác nhau. Chất lỏng qua cột dƣới tác dụng ca áp suất hoc chân không.

Các bƣớ c tiến hành trong quá trình chiết pha r ắn:

Hình 2.3: Các bướ c của quá trình chiế t pha r ắ n

1. Hoạt hóa chấ t hấ p phụ pha r ắ n

Làm ƣớ t vật liệu nhồi, solvat hóa các nhóm chức ca chất hấ p phụ,

Loại không khí trong các khoảng tr ống trong lớ p chất hấ p phụ,

Không đƣợc để chất hấ p phụ bị khô.

1. M ẫu và chất phân tích đượ c chả y qua cột

Chất phân tích đƣợc làm giàu trên chất hấ p phụ,

Một vài thành phần ảnh hƣởng khác cũng có thể bị giữ lại,



20

Các thành phần không bị hấ p phụ bị loại ra làm sạch chất phân tích.

2. Loại bỏ các chất gây ảnh hưở ng ra khỏi cột

Giữ lại chất phân tích,

Nếu mẫu là dung dịch nƣớ c, sử dụng dung dịch đệm hoc hỗn hợp nƣớ c-

dung môi hữu cơ ,

Nếu mẫu bị hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể sử dụng

chính dung môi hữu cơ .

3. Giải hấ p chất phân tích bằng dung môi thích hợ p

Dung môi đƣợ c chọn đc trƣng đê phá vỡ tƣơng tác giữa chất phân tích

và chất hấ p phụ vớ i mục đích rửa giải đƣợ c chất phân tích vớ i hiệu quả cao,

Dung môi sử dụng r ửa giải đồng thời càng ít chất gây ảnh hƣở ng tới phép

phân tích càng tốt.

Chất hấ p phụ chiết pha r ắn thƣờng đƣợ c sử dụng gồm các loại:

- Chất hấ p thụ pha thƣờng: Các silica trung tính, oxit nhôm,

- Chất hấ p phụ pha ngƣợc: Các silica đã đƣợc ankyl hóa nhóm OH,

-

Chất có khả năng trao đổi ion,

- Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thƣớ c,

- Chất hấ p phụ pha khí-r ắn,

Hiện nay, phƣơng pháp chiết pha r ắn ngày càng đƣợ c sử dụng r ộng rãi và phổ

biến do những ƣu điểm vƣợ t tr ội sau:

- Hiệu suất thu hồi cao,

- Khả năng làm giàu, làm sạch các chất phân tích lớ n,

- Giảm lƣợng dung môi sử dụng,

- Có khả năng kết hợp các phƣơng pháp phân tích,

- An toàn, đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt,

Oasis HLB (hydrophilic-lipophilic balance) là một chất hấ p phụ k ết hợp cơ

chế tƣơng tác pha đảo và tƣơng tác ƣa nƣớc. Pha tĩnh này đƣợc trùng hợ p từ hai

monomer có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidone có tính ƣa nƣớc và divinylbenzen



21

có tính kỵ nƣớ c. Chất hấ p phụ Oasis có cấu trúc không gian lớ n (thể tích lỗ r ỗng là

1.3 cm2/g), có diện tích bề mt trên một đơn vị khối lƣợng pha tĩnh cao (810 m2

/g).

Các nhóm chức phân cực ca monomer N-vinylpyrolidone đã tạo ra các hốc phân

cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lƣu giữ tốt đối với các chất phân tích phân cực đồng

thời có khả năng làm việc trong khoảng pH r ộng.

2.2.3. Thẩm định phƣơng pha p

2.2.3.1. Tính đc hiệu

Sƣ du ng ca c p hƣơng pha p xa c nhâ n (confirmation method ) là một cách rất

tốt đê đa m ba o t nh đă c hiê u cu a phƣơng pha p . Hô i đông châu Âu quy đi nh ca ch

tính điểm IP (điê m nhâ n da ng – identification point) đối vơ i ca c phƣơng pha p kha cnhau đê khă ng đi nh chăc chăn sƣ co mă t cu a ca c chất . Cách tính điểm IP đƣợc chỉ

ra ơ phu lục 3.

2.2.3.2. Khoảng tuyến tính

Tiến hành thực nghiệm: Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn ca chất phân tích . Xác

định các giá trị đo đƣợ c y theo nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có

khoảng khảo sát đƣờ ng biểu diễn là một phƣơng trình:

y = ax + b

và hệ số tƣơng quan:

Nếu 0,995 < r 2 ≤ 1 : Có tƣơng quan tuyến tính

Khi đã xác định đƣợ c khoảng tuyến tính, có thể xây dựng phƣơng trình hồi quy ca

khoảng này, tức là xác định hệ số a và b. Trên đƣờ ng hồi quy, lấy đoạn tuyến tính

làm khoảng xác định (k ể cả hai điểm đầu và cuối).

2.2.3.3. LOD, LOQ

Tính LOD va LOQ theo biê u thƣ c:

)()(

))((

2Y y X x

Y y X xr

ii

ii



22

Tính giá trị trung bình

x , và độ lệch chuẩn SD

LOD = 3 x SD

LOQ = 10 x SD

Vơ i 1n

)xx(SD

2

i

Đánh giá LOD đã tính đƣợc: tính R =

x / LOD là hệ số đánh giá LOD

Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợ p và LOD

tính đƣợc là đáng tin cậy.

Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đc hơn, hoc thêm

một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và

tính lại R.

Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoc pha loãng

dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.

2.2.3.4. Độ l p lại, đô thu hồi

Độ thu hồi và độ l p lại đƣợc xác định theo các đại lƣợng SD và RSD nhƣ

công thức dƣới đây:

Trong đó:

Stb : Diện tích pic trung bình.

Si : Diện tích píc thứ i

n: Số lần đo.

SD: Độ lệch chuẩn

R SD: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (%).

Độ thu hồi ca phƣơng pháp theo công thức sau :



23

100)(

%

C

C C H

mcm

Trong đó: Cm+c : nồng độ nitrofuran xác định đƣợ c trong mẫu có thêm chuẩn (ng/g).

Cm: nồng độ nitrofuran có trong mẫu (ng/g).

C: nồng độ chuẩn nitrofuran đƣợc thêm vào (ng/g).

H: độ thu hồi (%).

2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Các kết quả phân tích trên LC-MS/MS đƣợc tính toán và xử lý bằng phần mềm

Analyst, Excel, origin 6.0.

Các công thức thống kê t nh đô lă p la i, đô thu hồi, tính LOD, LOQ…

2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứ u

2.3.1. Dụng cụ và thiết bị

2.3.1.1. Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL ca

Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ ca Aplied Biosystem: bộ phận bơm dung

môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt.- Cột sắc ký Agilent C18 (150mm x 2,1mm x 3,5µm).

- Cột chiết pha r ắn SPE (Oasis HLB).

- Máy lắc vortex VELP.

- Máy đồng nhất mẫu.

- Máy li tâm MIKRO 22R.

- Cân phân tích (có độ đọc 0,1mg và 0,01mg).

- Cân kĩ thuật (có độ đọc 0,01g).

- Máy thổi khí N2 làm khô có điều nhiệt.

- Bể điều nhiệt

2.3.1.2 Dụng cụ

- Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200 ml.

- Ống đong dung tích 10, 100, 200 ml.

- Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200 µl; 1000 µl; 5 ml…đầu côn.



24

- Ống ly tâm 50 ml, màng lọc 0,2 µm.

- Vial loại 1,8 ml.

- Bình định mức loại A dung tích 10, 25, 50, 100 ml.

- Ống nghiệm thy tinh…

2.3.2 Hóa chất và chất chuẩn

Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

2.3.2.1 Chất chuẩn

- AOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- AMOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- AHD.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- SEM.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99,5%

- d4-AOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- d5-AMOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- d2-AHD.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 99%

-13

C15 N2-SEM.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 98%

2.3.2.2 Hóa chất

- Methanol (Merck hoc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)

- Amoni acetate (Merck hoc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 98%)

- 2-NBA (Merck hoc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99%)

- K 2HPO4.3H2O (Merck hoc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99%)

- NaOH (Merck hoc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)

- HCl 37% (Merck hoc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)

- HCl 0,2M: Hút 17 ml HCl 37% vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch

bằng nƣớ c cất.

- 2- NBA 1000 mg/l: cân 100 mg 2- NBA hòa tan và định mức vào bình 10 ml bằng

methanol. Dung dịch chuẩn bị hằng ngày.

- K 2HPO4 0,2 M: cân 45,7 mg K 2HPO4.3H2O hòa tan và định mức vào bình 1000

ml bằng nƣớ c cất 2 lần.



25

- NaOH 2 M: cân 8 g NaOH hòa tan và định mức vào bình định mức 1000 ml bằng

nƣớ c cất 2 lần.

- CH3COONH4 10 mM: cân 0,077 g CH3COONH4 hòa tan và định mức vào bình

định mức 1000 ml bằng nƣớ c cất 2 lần.

2.3.3 Pha chế chất chuẩn

- Chuẩn AHD 1000 mg/l: cân 13,2 mg ± 0,1 mg chuẩn AHD.HCl hòa tan và định

mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ du ng đƣơ c

trong 6 tháng.

- Chuẩn AHD 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn AHD 1000 mg/l định mức bằng methanol

vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200

C sƣ du ng đƣơ c trong 6 tháng.- Chuẩn SEM 1000 mg/l: cân 14,9 mg ± 0,1 mg chuẩn SEM.HCl hòa tan và định

mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml.

- Chuẩn SEM 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn SEM 1000 mg/l định mức bằng methanol

vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ du ng đƣơ c trong 6 tháng.

- Hỗn hợ p chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 1 mg/l: hút lần lƣợ t 1 ml chuẩn

AOZ 10 mg/l, AMOZ 10 mg/l, AHD 10 mg/l, SEM 10 mg/l định mức bằng

methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ du ng đƣơ c trong 3 tháng.

- Hỗn hợ p chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 20 µg/l: hút 200 µl hỗn hợ p

chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) định mức bằng methanol vào bình định

mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ du ng đƣơ c trong 1 tháng.

- d4-AOZ 1000 mg/l: Cân 10 mg ± 0,1 mg d4-AOZ định mức bằng methanol vào

bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ du ng đƣơ c trong 6 tháng.

- d4-AOZ 10 mg/l: hút 100 µl d4-AOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình

định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ du ng đƣơ c trong 6 tháng.

- d5-AMOZ 1000 mg/l : Cân 10 mg ± 0,1 mg d 5-AMOZ định mức bằng methanol

vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ du ng đƣơ c trong 6 tháng.

- d5-AMOZ 10 mg/l: Hút 100 µl d5-AMOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào

bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ du ng đƣơ c trong 6 tháng.



26

- Hỗn hợ p nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13

C15 N2-SEM.HCl) 1 mg/l:

hút lần lƣợ t 1 ml chuẩn d4-AOZ 10 mg/l, d5-AMOZ 10 mg/l, d2-AHD.HCl 10 mg/l

và 13

C15 N2-SEM.HCl 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml.

Bảo quản ở - 200C sƣ du ng đƣơ c trong 3 tháng.

- Hỗn hợ p nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13

C15 N2-SEM.HCl) 20 µg/l:

hút lần lƣợt 200 µl hỗn hợ p nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13

C15 N2-

SEM.HCl) 1 mg/l vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ du ng đƣơ c trong

1 tháng.



27

CHƢƠNG 3: K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS

Phân tích dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran dựa trên việc phân tích các

chất chuyển hóa ca nhóm nitrofuran. Các chất chuyển hóa ca nitrofuran có khối

lƣợng phân tử thấp gây nhiễu phổ nền cao, hiệu quả ion hóa thấp và không đc hiệu

cho sự phân mảnh (ch yếu là mất nƣớ c, NH3, CO2), độ nhạy phát hiện băng MS

tƣơng đối thấ p. Vì vậy sử dụng 2-nitrobezaldehyte để dẫn xuất các chất chuyển hóa

nhóm nitrofuran để có đƣợc các hợ p chất dâ n xuất (NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD,

NPSEM) vớ i nhiều đc tính thuận lợ i.

3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ khô i 3.1.1.1. Khảo sát ion mẹ

Các chất NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM có khối lƣợng phân tử nhỏ

và phân cực. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23,

26], chúng tôi tiến hành khảo sát xác định NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM

bằng k ỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI vớ i chệ độ bắn phá ion dƣơng. Để tối ƣu

hóa điều kiện khối phổ, dùng xylanh 500 µl bơm từng chuẩn AOZ, AMOZ, AHD,

SEM 500 ng/ml đã đƣợ c dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte , sau đó đƣa vào

detector để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối vớ i từng chất, tối ƣu hóa

từng ion mẹ, thu đƣợc điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ở bảng 3.1.

Bảng 3.1: Điề u kiện chạ y nguồn ion hóa ESI

Khí màn (CUR) 20 psi

Khí va chạm (CAD) 8 psi

Thế ion hóa (IS) 5000 V

Nhiệt độ mao quản (TEM) 400 C

Áp suất khí 2 bên đầu phun (GS1) 50 psi

Áp suất ca luồng khí nóng (GS2) 40 psi



28

Trong k ỹ thuật ion hóa phun điện tử vớ i chế độ bắn phá ion dƣơng, các ion

mẹ có dạng (MH)+ vơ i số khối m = (M+1) theo pha n ƣ ng:

M0 + H

+ → (MH)

+

Tiến hành khảo sát bắn phá tạọ các ion mẹ, k ết quả đƣợ c chỉ ra ở bảng 3.2

Bảng 3.2: K ế t quả bắn phá các ion mẹ

Chuyển hóa nhóm

nitrofuranKhối lƣợng phân tử M Ion mẹ (M+H)

NPAOZ 235 236

NPAMOZ 334 335

NPSC 208 209

NPAHD 248 249

d4-AOZ 239 240

d5-AMOZ 339 340

13C-

15N2 SEM.HCl 211 212

D2-AHD.HCl 250 251

3.1.1.2. Khảo sát điều kiện bắn phá ion me đê thu đƣơ c ion con

Detector sử dụng trong nghiên cứu này là hê khối phổ 2 lần, do đó để phát

hiện đúng chất phân tích thì việc lựa chọn đƣợ c ion con là rất quan tr ọng. Ion con

phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so vớ i ion mẹ. Để thu đƣợ c mảnh ion con có tín

hiệu cao cần phải chọn đƣợ c mức năng lƣợ ng bắn phá thích hợp. Dùng xylanh 500

µl bơm từng chuẩn đã đƣợ c dẫn xuất vào detector khối phổ và lựa chọn 2 ion conđă c trƣng có cƣờng độ tín hiệu cao nhất để định tính và định lƣợ ng. Mảnh ion con

m/z có cƣờng độ lớ n nhất dùng để định lƣợ ng, mảnh ion con thứ 2 có cƣờng độ thấ p

hơn dùng để xác nhận chất phân tích. Đối với các chất nội chuẩn, lựa chọn 1 ion

con đc trƣng có cƣờng độ cao nhất. K ết quả thu đƣợ c ở bảng 3.3



29

Bảng 3.3: Năng lượ ng bắn phá và các ion con của các chấ t chuyển hóa nitrofuran

Chuyển hóa

nhóm

nitrofuran

Ion mẹ

(M+H)+

Ion con DP (V) CE (eV) CXP (V)

NPAOZ 236134 80 15 10

104 80 27 14

NPAMOZ 335291 80 15 16

262 80 21 16

NPSEM 209192 80 11 18

166 80 13 14

NPAHD 249 134 80 15 18104 80 27 14

d4-AOZ 240 134 80 17 16

d5-AMOZ 340 296 80 15 1613

C-15

N2

SEM.HCl212 168 80 13 12

d2-AHD.HCl 251 134 80 15 14

Nhâ n xe t:

Theo qui đi nh cu a Châu Âu 2002/657/EC, số điê m nhâ n da ng (IP) đƣơ c t nh đối vơ i

kỹ thuật LC/MS/M, tƣơng ƣ ng vơ i 1 ion me va 2 ion con, số điê m nhâ n da ng (IP) là

4. Nhƣ vâ y phƣơng pha p đa đa p ƣ ng đƣơ c yêu cầu cu a Châu Âu [ phụ lục 4]. Phù

hơ p vơ i ca c nghiên cƣ u kha c cu a mô t số ta c gia nhƣ ta c gia Leitner , tác giả D.Tyler

ca phòng thí nghiệm ca Anh…

3.1.2. Lự a chọn cột tách

Các chất nhóm nitrofuran là các chất phân cực, đồng thờ i theo khuyến cáoca nhà sản xuất thiết bị khối phổ thì hệ pha động sử dụng an toàn vớ i thiết bị là các

dung môi phân cực và phân cực trung bình nhƣ methanol, acetonitrile, nƣớ c, acid

formic (0 đến 1%, amoni acetate (0 tới 1%)…cột tách nên sử dụng là cột tách pha

đảo. Do đó chúng tôi lựa chọn cột tách pha đảo C18 vơ i ca c thông số dƣơ i đây cho

các nghiên cứu tiếp theo:

- Cột C18 ca Agilent có:



30

- Chiêu da i 150mm,

- Đƣờng kính 2,1mm,

- Cơ ha t 3,5µm.

3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient pha đô ng

Các dẫn xuất ca nhóm nitrofuran có cấu trúc gần giống nhau, nên sử dụng

chế độ r ửa giải đẳng dòng (isocratic) không phù hợ p. Chúng tôi tiến hành khảo sát

một số chƣơng trình rửa giải gradient. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 16, 17,

24] chúng tôi sử dụng pha động kênh A: Amoniacetat 10 mM, kênh B là methanol.

Cố định các điều kiện sắc ký:

-

Cột C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm),- Pha động: kênh A: amoniacetat 10 mM, kênh B: methanol,

- Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút,

- Mẫu phân tích: hỗn hợp dâ n xuất nitrofuran, nồng độ: 20 ng/ml.

Tiến ha nh thí nghiệm theo:

a) Chƣơng tr nh Gradient 1, thu đƣơ c sắc đồ nhƣ trong h nh 3.1 :

Thời gian (phút) 0,01 12,00 14,00 15,00 20,00

% MeOH 20 90 90 20 20

Hình 3.1: săc đô hô n hơ p chuâ n khi cha y chế đô gradient 1 ở nồng đô 20 ng/ml



31

b) Chƣơng tr nh Gradient 2, thu đƣơ c săc đô trong h nh 3.2:

Thời gian (phút) 0,01 5 8 9 12

% MeOH 20 90 90 20 20

Hình 3.2: săc đô hô n hơ p chuâ n khi cha y chế đô gradient 2 ở nồng độ 20 ng/ml

c) Chƣơng tr nh Gradient 3, thu đƣơ c săc đô trong h nh 3.3 :

Thời gian (phút) 0,01 8 10 13 13,01% MeOH 20 90 90 20 20

Hình 3.3: săc đô hô n hơ p chuâ n khi cha y chế đô gradient 3 ở nồng độ 20 ng/



32

d) Chƣơng tr nh Gradient 4, thu đƣơ c săc đô trong h nh 3.4:

Thời gian (phút) 0,01 10 12 15 15,01

% MeOH 20 90 90 20 20


e) Chƣơng tr nh Gradient 5, thu đƣơ c săc đô trong h nh 3.5:

Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00

% MeOH 20 90 90 20 20




33

Bàn luận :

- Khi tăng nồng độ MeOH trong khoảng thờ i gian ngắn (chƣơng tr nh gradient 1,

gradient 2, gradient 3, gradient 4) píc ca AOZ r ất xấu và bị chẻ píc. Hiê n tƣơ ng

chẻ pic này là do hàm lƣợng MeOH cao , AOZ tồn ta i đồng thơ i ơ hai da ng la amin

bâ c nhât R -NH2 và dạng R -NH3+. Do đo , nồng đô MeOH cân pha i đƣơ c không chế

phù hợp, đồng ngh a vơ i tăng nồng đô CH3COONH4 để chuyển toàn bộ dạng amin

thành dạng R -NH3+.

- Chƣơng trình gradient 5 pic nhọn, cân xứng va co t n hiê u p c ro ra ng . Do đó

chúng tôi lựa chọn chƣơng trình gradient 5 cho các nghiên cứu tiế p theo.

Tóm lại : Các thông số ph hơp cho quá trình tách sắc ký là :

- Cột Agilent C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm)

- Pha động kênh A (amoniacetat 10 mM) ; kênh B (methanol) theo chƣơng

trình gradient 5:

Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00

% MeOH 20 90 90 20 20

- Tốc độ pha đô ng: 0,4 ml/phút,

-

Thể tích bơm mẫu : 10 µl, - Nhiệt độ cột: 30

0C.

3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu

Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26] có

một số quy trình đã và đang đƣợ c ứng dụng để tách chiết các chất nhóm nitrofuran

bao gồm : quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng, quy trình xử lý mẫu bằng

chiết pha r ắn. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát 2 quy trình chiết mẫu sau đây đê

tiến ha nh th nghiê m.

3.1.4.1. Lự a chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng

Dự kiến quy trình xử lý mẫu nhƣ sau:



34

Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm

Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml

Thêm 100 µl hỗn hợ p nội chuẩn vào mỗi ống

Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu

Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C

Trung hòa axit bằng 10 ml K 2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc

vortex 20 giây

Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lây dung di ch mâ u

Chiết lặp 2 lần mỗi lần bằng 4 ml ethylactetate, ly tâm hút lấy lớp trên thổi khô

bằng N2

Hòa tan cn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)

Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích băng LC/MS/MS

Tiến hành thêm chuẩn 20 ng/g vào mẫu thịt lợ n, sử dụng quy trình chiết lỏng

– lỏng nói trên làm l p lại 3 lần cho k ết quả chỉ ra ở bảng 3.4 và săc đô ơ h nh 3.6:



35

Bảng 3.4: Độ thu hồi mẫ u thịt l ợn thêm chuẩ n 20 ng/g sử d ụng chiế t l ỏng – l ỏng

Chất

phân tích

Lần 1

(ng/g)

Lần 2

(ng/g)

Lần 3

(ng/g)

TB

(ng/g)SD % RSD H (%)

AOZ 8,51 7,66 9,11 8,43 0,729 8,65 42,1

AMOZ 9,32 10,2 7,55 9,01 1,38 15,3 45,0

AHD 6,82 5,89 7,43 6,71 0,776 11,6 33,7

SEM 6,12 6,27 5,98 6,12 0,145 2,37 30,6

Hình 3.6: Săc đô mâ u thi t lơ n thêm chuâ n hô n hơ p nitrofuran ơ mƣ c nông đô 20

ng/g sƣ du ng quy tr nh chiết lo ng – lỏng.

3.1.4.2. Lự a chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn

Thƣ c hiê n theo sơ đồ sau:



36

Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm



Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu

Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C

Trung hòa mẫu bằng 10 ml K 2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắcvortex 20 giây


Hoạt hóa cột SPE (Oasis HLB): 3 ml EtAc → 3 ml MeOH → 2 x 2,5 ml H2O

Nạp mẫu vào cột, rử a loại chất bẩn bằng 2 x 2,5 ml H2O

Hút chân không cho khô cột SPE

R ử a giải châ t phân t ch bằng 4 ml EtAc vào ống nghiệm

Thổi khô bằng N2



Tiến hành thêm chuẩn 20 ng/g vào mẫu thịt lợ n, sử dụng quy trình chiết pha

r ắn làm l p lại 3 lần cho k ết quả chỉ ra ở bảng 3.5 và hình 3.7:



37

Bảng 3.5: Độ thu hồi mẫ u thịt l ợn thêm chuẩ n 20 ng/g sử d ụng chiế t pha r ắ n

Chất

phân tích

Lần 1

(ng/g)

Lần 2

(ng/g)

Lần 3

(ng/g)

TB

(ng/g)SD % RSD H (%)

AOZ 17,3 18,4 16,9 17,5 0,777 4,43 87,7

AMOZ 19,3 18,5 17,8 18,5 0,750 4,04 92,7

AHD 15,7 14,8 13,5 14,7 1,11 7,54 73,3

SEM 14,3 13,2 14,8 14,1 0,818 5,80 70,5

Hình 3.7: Săc đô thi t lơ n thêm chuâ n hô n hơ p nitrofuran ơ mƣ c nồng đô 20 ng/g sƣ

dụng qui trình chiết pha rắn SPE

Bảng 3.6: So sa nh đô thu hồi của 2 quy trình chiế t:

Thịt lợn thêm chuẩnChiết SPE Chiết lỏng-lỏng

H (%) H (%)

AOZ 20 ng/g 87,7 42,1

AMOZ 20 ng/g 92,7 45,0

AHD 20 ng/g 73,3 33,7

SEM 20 ng/g 70,5 30,6



38

Nhâ n xe t: Nhìn vào bảng trên ta thấy quy trình chiết SPE cho độ thu hồi cao

hơn so với quy trình chiết lỏng lỏng và đáp ứng đƣợc quy định ca Châu Âu

2002/657EC. Do đó chúng tôi chọn quy trình chiết SPE cho các nghiên cứu tiế p

theo

3.2. Thâ m đi nh phƣơng pha p

3.2.1 Tính đặc hiệu

Phƣơng pha p trên sƣ du ng ky thuâ t sắc ky lo ng khối phô 2 lần, thƣ c hiê n băn

phá ion mẹ m/z, đi nh lƣơ ng theo ion con ta o tha nh . Theo ca ch t nh điê m IP th vơ i 1

ion me va 2 ion thu đƣơ c 4 điê m IP, nhƣ vâ y phƣơng pha p co t nh đă c hiê u đa p ƣ ngđƣơ c yêu cầu cu a châu Âu 2002/657/EC [32].

3.2.1. Khảo sát lập đƣờ ng chuẩn

3.2.1.1. Đườ ng chuẩ n của các chất nhóm nitrofuran sử d ụng nội chuẩn (để phân

tích mẫ u thự c)

Chúng tôi khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính ca diện tích píc sắc kí, tỷ lệ diện

tích píc nitrofuran/nội chuẩn vào nồng độ chất phân tích ở các nồng độ khác nhau

xác định hệ số tƣơng quan va phƣơng trình đƣờ ng chuẩn. Theo quy định ca ChâuÂu các chất nhóm nitrofuran là chất cấm, MRPL về yêu cầu giớ i hạn hiệu năng nhỏ

nhất ca phƣơng pháp đối với các chất dẫn xuất nhóm nitrofuran là 1 µg/kg, do đó

chúng tôi khảo sát xây dựng khoảng đƣờ ng chuẩn từ 0,5 – 5 ppb, sử dụng các nội

chuẩn ở cùng nồng độ 2 ppb để phân tích mẫu thực. Sƣ du ng phần mềm origin 6.0

để xây dựng đƣờng chuẩn ca các kháng s inh nho m nitrofuran thu đƣơ c ca c h nh

3.8, 3.9, 3.10, 3.11 và bảng 3.7 dƣơ i đây:



39

0 1 2 3 4 5-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8 Y = 0.12426 + 0.31607 * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 0.01426 0.0141B 0.31607 0.00606

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99927 0.02411 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

A n a l y t e a r e a / I S

a r e a

Analyte conc/IS conc

Hình 3.8: Đƣờ ng chuẩn xác định AOZ sử dụng nội chuẩn

0 1 2 3 4 5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Y = 0.01807 + 0.45988 * X


------------------------------------------------------------ A 0.01807 0.01616

B 0.45988 0.00695

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99954 0.02764 6 <0.0001

------------------------------------------------------------ A n a l y t e a r e a / I S

a r e a


Hình 3.9: Đƣờ ng chuẩn xác định AMOZ sử dụng nội chuẩn



40

0 1 2 3 4 5

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Y = 0.26595 + 1.44626 * X


------------------------------------------------------------

A 0.26595 0.09471

B 1.44626 0.0407

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99842 0.16193 6 <0.0001

------------------------------------------------------------ A n a l y t e a r e a / I S a

r e a


Hình 3.10: Đƣờ ng chuẩn xác định SEM sử dụng nội chuẩn

0 1 2 3 4 5

0

1

2

3

4

5

6

7Y = 0.12446 + 1.22034 * X

Parameter Value Error ------------------------------------------------------------

A 0.12446 0.04298B 1.22034 0.01847------------------------------------------------------------

R SD N P------------------------------------------------------------0.99954 0.07348 6 <0.0001------------------------------------------------------------

A n a l y t e a r e a / I S a

r e a


Hình 3.11: Đƣờ ng chuẩn xác định AHD sử dụng nội chuẩn

Dƣ a va o đƣơ ng chuâ n xây dƣ ng ph a trên kêt hơ p tra ba ng gia tri chuâ n t vơ i

bâ c tƣ do f =4, đô tin câ y 95% có t = 2,776 nên phƣơng tr nh hôi quy y = (a ± t.Sa) +

(b ± t.S b)x co da ng nhƣ dƣơ i đây:



41

Bảng 3.7: Phương trình hồi quy 4 nitrofuran sử d ụng nội chuẩ n

TT Chất Phƣơng trình hồi qui Hệ số R

1 AOZ y = (0,21426 ± 0,039142) + (0,31607 ± 0,016822)x 0,9992

2 AMOZ y = (0,01807 ± 0,044860) + (0,45988 ± 0,019293)x 0,9995

3 AHD y = (0,12446 ± 0,119312) + (1,22034 ± 0,051273)x 0,9995

4 SEM y = (0,26595 ± 0,262915) + (1,44626 ± 0,112983)x 0,9984

Nhận xét: tỉ lệ diện tích pic nitrofuran/diện tích pic nội chuẩn (IS) trong khoảng 0,5

– 5 ng/ml có hệ số tƣơng quan R 2 > 0,99.

3.2.1.2. Đườ ng chuẩ n của các chất nhóm nitrofuran không sử d ụng nội chuẩn (để đánh giá hiệu suấ t thu hồi)

Lậ p mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ các chất nhóm

nitrofuran, thu đƣợc đƣờ ng chuẩn ca các chất nhóm nitrofuran chỉ ra ở hình 3.12,

3.13, 3.14, 3.15 và bảng 3.8:

0 1 2 3 4 5

-200000

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000Y = 14569.47368 + 307751.51579 * X


------------------------------------------------------------ A 14569.47368 11729.11536

B 307751.51579 5039.63638

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99946 20053.27825 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

A r e a

conc AOZ (ppb)

Hình 3.12: Đƣờ ng chuẩn ca AOZ không sử dụng nội chuẩn



42

0 1 2 3 4 5

0

500000

1000000

1500000

2000000

Y = 42232.68421 + 363894.58947 * X

Parameter Value Error ------------------------------------------------------------ A 42232.68421 19272.12625

B 363894.58947 8280.63376------------------------------------------------------------

R SD N P------------------------------------------------------------0.99897 32949.57021 6 <0.0001------------------------------------------------------------

A n a l y t e

a r e a

conc AMOZ (ppb)

Hình 3.13: Đƣờ ng chuẩn ca AMOZ không sử dụng nội chuẩn

0 1 2 3 4 5

0

50000

100000

150000

200000

Y = 6879.15789 + 36694.50526 * X

Parameter Value Error ------------------------------------------------------------ A 6879.15789 1594.06733B 36694.50526 684.92119------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------0.9993 2725.37823 6 <0.0001------------------------------------------------------------ A

n a l y

t e A r e a

conc AHD (ppb)

Hình 3.14: Đƣờ ng chuẩn ca AHD không sử dụng nội chuẩn



43

0 1 2 3 4 5

-20000

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Y = 592.13158 + 35485.42105 * X


------------------------------------------------------------ A 592.13158 1504.30234B 35485.42105 646.35197------------------------------------------------------------

R SD N P------------------------------------------------------------0.99934 2571.90695 6 <0.0001------------------------------------------------------------

A n a l y t e a r e a

conc SEM (ppb)

Hình 3.15: Đƣờ ng chuẩn ca SEM không sử dụng nội chuẩn

Dƣ a va o đƣơ ng chuâ n xây dƣ ng ph a trên kêt hơ p tra ba ng gia tri chuâ n t vơ i

bâ c tƣ do f =4, đô tin câ y 95% có t = 2,776 nên phƣơng tr nh hôi quy y = (a ± t.Sa) +

(b ± t.S b)x co da ng nhƣ dƣơ i đây:

Bảng 3.8: Phương trình hồi quy của 4 nitrofuran không sử d ụng nội chuẩ n

TT Chất Phƣơng trình hồi qui Hệ số R

1 AOZ y = (14569 ± 32560) + (307751 ± 13990)x 0,9994

2 AMOZ y = (42233 ± 53499) + (363895 ± 22988)x 0,9989

3 AHD y = (6879 ± 4425) + (36695 ± 1902)x 0,9993

4 SEM y = (592 ± 4175) + (35485 ± 1793)x 0,9993

Nhận xét: Diện tích nitrofuran vớ i nồng độ trong khoảng 0,5 – 5 ng/ml có hệ số tƣơng quan R 2 > 0,99.

3.2.2. Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lƣợ ng của phƣơng pháp

Giớ i hạn phát hiện đƣợc định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất ca chất phân tích

mà phƣơng pháp phân tích có thể phát hiện đƣợc, có tín hiệu sắc ký lớ n gấ p 3 lần

tín hiệu đƣờ ng nền. Đây là một thông số đc trƣng cho độ nhạy ca phƣơng pháp.

Chất nào nhạy hơn s có giớ i hạn phát hiện nhỏ.



44

Cũng theo phƣơng pháp này giớ i hạn định lƣợng là nồng độ nhỏ nhất chất

phân tích mà có tín hiệu lớ n gấ p 10 lần tín hiệu nhiễu đƣờ ng nền hay mẫu tr ắng

(S/N = 10).

Chúng tôi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu thử không chứa chất phân tích,

làm 10 lần song song. Bảng 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 chỉ ra giớ i hạn phát hiện ca AOZ,

AMOZ, AHD, SEM

Bảng 3.9: Giớ i hạn phát hiện của AOZ trên nề n mẫ u thịt

Số TT

Thêm

chuẩn

AOZ 0,5

ng/ml

x SDLOD

(ng/g)

LOQ

(ng/g) LOD

x

Lần 1 0,386

0,434 0,0333 0,100 0,300 4,34

Lần 2 0,463

Lần 3 0,483

Lần 4 0,459

Lần 5 0,419

Lần 6 0,432

Lần 7 0,395

Lần 8 0,412

Lần 9 0,456

Lần 10 0,436



45

Bảng 3.10: Giớ i hạn phát hiện của AMOZ trên nề n mẫ u thịt

Số TT

Thêmchuẩn

AMOZ0,5 ng/ml

x SDLOD

(ng/g)

LOQ

(ng/g) LOD

x

Lần 1 0,405

0,485 0,0398 0,119 0,357 4,06

Lần 2 0,504

Lần 3 0,520

Lần 4 0,508

Lần 5 0,432

Lần 6 0,489

Lần 7 0,532

Lần 8 0,465

Lần 9 0,491

Lần 10 0,502

Bảng 3.11: Giớ i hạn phát hiện của AHD trên nề n mẫ u thịt

Số TT

Thêmchuẩn

AHD 1

ng/ml

x SDLOD

(ng/g)

LOQ

(ng/g) LOD

x

Lần 1 1,01

1,06 0,0743 0,223 0,669 4,73

Lần 2 1,13

Lần 3 0,983

Lần 4 1,10

Lần 5 0,94

Lần 6 1,15

Lần 7 1,11

Lần 8 1,01

Lần 9 1,12

Lần 10 0,997



46

Bảng 3.12: Giớ i hạn phát hiện của SEM trên nề n mẫ u thịt

Số TT

Thêmchuẩn

SEM 1,5

ng/ml

x SDLOD

(ng/kg)

LOQ

(ng/g) LOD

x

Lần 1 1,57

1,53 0,126 0,378 1,13 4,04

Lần 2 1,32

Lần 3 1,37

Lần 4 1,60

Lần 5 1,65

Lần 6 1,70

Lần 7 1,60

Lần 8 1,58

Lần 9 1,40

Lần 10 1,52

Trong đo :

-

x là trung bình của 10 l ần làm lặ p l ại

-

x / LOD là hệ số đánh giá LOD

Bàn luận:

- LOD cu

a ca

c chât kha

ng sinh nho

m nitrofuran năm trong khoảng từ 0,100 – 0,378

ng/g; LOQ tƣ 0,300 – 1,13 ng/g đa p ƣ ng đƣơ c yêu cầu cu a Châu Âu 2002/657/EC

vê đô nha y cu a phƣơng pha p . Phù hợp với các nghiên cứu tƣơng tự .

3.2.3. Độ lặp lại và độ thu hồi

Thực hiện thêm chuẩn vào mẫu thịt lợ n k hông chứa nitrofuran ở các mức nồng

độ (MRPL; 1,5MRPL; 2MRPL) đối vớ i mỗi chất là: 1 ng/g ; 1,5 n g/g ; 2 ng/g . Phân

tích l p lại 6 lần mỗi mẫu. Các kết quả thu đƣợ c ở bảng 3.13 đến 3.15:



47

Bảng 3.13: Độ l ặ p l ại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nề n mẫ u thịt l ợ n t ại 1 ng/g

ChấtThông

số

Mẫu

1

Mẫu

2

Mẫu

3

Mẫu

4

Mẫu

5

Mẫu

6

Trung

bình SD

%

RSD

AOZ

C

(ng/g)0,994 0,979 1,06 1,10 0,985 0,991 1,02 0,050 4,89

H (%) 99,4 97,9 106 110 98,5 99,1 102

AMOZ

C

(ng/g)1,03 1,07 0,998 1,04 1,06 1,03 1,038 0,025 2,45

H (%) 103 107 99,8 104 106 103 104

AHD

C

(ng/g)0,859 0,986 0,814 0,992 0,885 1,00 0,923 0,079 8,55

H (%) 85,9 98,6 81,4 99,2 88,5 100 92,3

SEM

C

(ng/g)0,805 0,732 0,859 0,781 0,659 0,992 0,805 0,076 9,42

H (%) 80,5 73,2 85,9 78,1 65,9 99,2 80,5

Hình 3.16: Săc đô mâ u thi t lơ n thêm chuâ n hô n hơ p nitrofuran ta i mƣ c nồng đô 1 ng/g.

AHD

AOZ



48

Bảng 3.14: Độ l ặ p l ại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nề n mẫ u thịt l ợ n t ại 1,5 ng/g.

ChấtThông

số

Mẫu

1

Mẫu

2

Mẫu

3

Mẫu

4

Mẫu

5

Mẫu

6

Trung

bình SD

%

RSD

AOZC

(ng/g)1,56 1,15 1,60 1,25 1,32 1,59 1,41 0,196 13,0

H (%) 104 76,7 106 83,3 88,0 106 94

AMOZ

C

(ng/g)1,56 1,54 1,55 1,57 1,60 1,58 1,57 0,023 1,46

H (%) 104 103 103 105 107 105 105

AHD

C

(ng/g)1,44 1,61 1,54 1,60 1,63 1,67 1,58 0,077 4,87

H (%) 96 107 103 107 109 111 106

SEM

C

(ng/g) 1,37 1,60 1,17 1,69 1,4 1,72 1,49 0,205 13,7H (%) 91,3 107 78,0 113 93,3 115 99,6

Hình 3.17: Sắc đồ mâ u thi t lơ n thêm chuâ n hô n hơ p nitrofuran ta i mƣ c nồng đô 1,5 ng/g.



49

Bảng 3.15: Độ l ặ p l ại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nề n mẫ u thịt l ợ n t ại 2 ng/g.

ChấtThông

số

Mẫu

1

Mẫu

2

Mẫu

3

Mẫu

4

Mẫu

5

Mẫu

6

Trung

bình SD

%

RSD

AOZ

C

(ng/g)2,14 1,98 1,73 2,05 2,15 2,17 2,04 0,171 8,41

H (%) 107 99,0 86,5 102 108 109 102

AMOZ

C

(ng/g)2,06 2,07 2,11 2,09 1,87 1,98 2,03 0,097 4,78

H (%) 103 104 105 93,5 99,0 102 101

AHD

C

(ng/g)

2,04 1,89 1,76 2,24 1,84 1,90 1,95 0,171 8,80

H (%) 102 94,5 88,0 112 92,0 95,0 97,2

SEM

C

(ng/g)1,77 2,04 2,00 2,06 1,,82 2,04 1,96 0,125 6,47

H (%) 88,5 102 100 103 91,0 102 99,8

Hình 3.18: săc đô mâ u thi t lơ n thêm chuâ n hô n hơ p nitrofuran ta i mƣ c nông đô 2 ng/g

Bàn luận: Ta thấy đô thu hồi trung b nh cu a ca c chât tƣ 80,5 – 106%, đô lă p lại tốt

(%RSD < 13,7%) đa t yêu câu theo quy đi nh cu

a Châu Âu 2002/657/EC. Tƣ

ca

c



50

điều kiê n đa đƣơ c tối ƣu ơ trên đu đa m ba o cho phe p phân t ch xác định 4 chất

nhóm nitrofuran.

Từ những k ết quả khảo sát và thẩm định phƣơng pháp, chúng tôi đƣa ra

phƣơng pháp phân tích các chất chuyển hóa ca nitrofuran nhƣ sau:

Cân 2 g mẫu/blank/QC vào ống ly tâm



Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu thêm chuẩn chỉ tính trên mẫu

Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sang để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C

Trung hòa mẫu bằng 10 ml K 2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc

vortex 20 giây


Hoạt hóa cột SPE (Oasis HLB): 3 ml EtAc → 3 ml MeOH → 2 x 2,5 ml H2O

Nạ p mẫu vào cột chiết r ửa bằng 2 x 2,5 ml H2O

Hút chân không cho khô cột SPE

R ửa giải chât phân t ch bằng 4 ml EtAc vào ống nghiệm

Thổi khô dung di ch mâ u bằng N2





51

3.3. Ứng dụng phƣơng pháp trong phân tích thực phẩm

Trên cơ sở phƣơng pháp đã xây dựng và thẩm định, chúng tôi ứng dụng để

phân tích một số loại thực phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội. Các kết quả đƣợ c

trình bày ở bảng 3.16

Bảng 3.16: K ế t quả phân tích mẫ u thự c theo phương pha p thêm chuâ n

STT Mẫu NitrofuranLƣợng thêm

vào (ng)

Lƣợng tìm

thấy (ng)R%

1Thịt lợ n chợ

Nguyễn Cao

AOZ0 KPH -

1 0,87 87

AMOZ0 KPH -

1 0,96 96

AHD0 KPH -

1 0,78 78

SEM0 KPH -

1 0,72 72

2Thịt gà chợ

Nguyễn Cao

AOZ0 KPH -

1 1,12 112

AMOZ0 KPH -

1 1,02 102

AHD0 KPH -

1 0,95 95

SEM0 KPH -

1 0,89 89

3Thịt bò chợ Mai

Động

AOZ0 KPH -

1 0,99 99

AMOZ0 KPH -

1 1,05 105



52

AHD0 KPH -

1 1,03 103

SEM0 KPH -

1 1,09 109

4Gan chợ Mai

Động

AOZ0 KPH -

1 0,88 88

AMOZ0 KPH -

1 0,97 97

AHD0 KPH -

1 0,75 75

SEM0 KPH -

1 0,69 69

5Thịt lợ n chợ Cầu

Giấy

AOZ0 KPH

1 1,02 102

AMOZ0 KPH

1 0,79 79

AHD0 KPH

1 1,01 101

SEM0 KPH

1 1,03 103

6Thịt bò chợ Cầu

Giấy

AOZ0 KPH

1 0,92 92

AMOZ0 KPH

1 0,88 88

AHD0 KPH

1 0.79 79

SEM0 KPH

1 1,06 106



53

7Thịt lợ n chợ Ngọc

Hà

AOZ0 KPH

1 1,05 105

AMOZ0 KPH

1 1,11 110

AHD0 KPH

1 0,98 98

SEM0 KPH

1 0,67 67

8Thịt gà chợ Ngọc

Hà

AOZ0 KPH

1 0,76 76

AMOZ0 KPH

1 0,82 82

AHD0 KPH

1 0,97 97

SEM0 KPH

1 0,73 73

KPH: không phát hiện < LOD của phương pháp ,

R %: Phần trăm độ thu hồi.

Bàn luận:

Qua quá trình phân tích một số mẫu thực trên địa bàn Hà Nội, không phát

hiện mẫu nào có chứa các chất nhóm nitrofuran.

Độ thu hồi hâu hêt ca c chât tƣ 67 – 112% đa p ƣ ng đƣơ c qui đi nh cu a Châu

Âu 2002/657/EC. Tƣ kết qua đô thu hồi na y cho t hây co thê mơ rô ng phƣơng pha pcho ca c sa n phâ m thƣ c phâ m tƣơi sống kha c.

3.4 Hƣớng phát triển của đề tài

Trong bản luận văn này, do điều kiện còn hạn chế nên chúng tôi chỉ xác định

đƣợc dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS trong một số mẫu thực

phẩm tƣơi sống (thịt gà , thịt lợn , thịt bò , gan). Phƣơng pháp còn có thể đƣợ c mở

r ộng phân tích trong những dạng nền mẫu khác nhau nhƣ: thức ăn chăn nuôi, mẫu



54

sinh học, mẫu sữa…Vì vậy r ất cần có những nghiên cứu tiếp theo để phát triển

phƣơng pháp và áp dụng phu c vu phân t ch mâ u va o thực tiễn.



55

K ẾT LUẬN

Trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, vớ i mục đích ứng dụng ky

thuâ t sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS để tách và xác định các kháng sinh nhóm

nitrofuran trong mẫu thực phẩm tƣơi sống, chúng tôi đa thu đƣợc các kết quả sau:

1. Đã nghiên cứu đƣợc các điều kiện chạy sắc ký lỏng khối phổ để xác định 4

chất chuyển hóa nhóm nitrofuran bao gồm:

- Khảo sát đƣợc các điều kiện đo phổ khối (thế phân nhóm (DP), năng lƣợ ng

va chạm (CE)..) để thu đƣợc các ion khôi đc trƣng ca từng chất nitrofuran.

- Khảo sát chọn đƣợc các điều kiện sắc ký lỏng: cột sắc C18 Agilent (150mm

× 2,1mm × 3,5µm); pha động vơ i kênh A amoniacetat 10mM trong nƣớc va kênh B là metanol; chƣơng trình rửa giải gradient.

2. Đã khảo sát đƣợc điều kiện tách và làm sạch các nitrofuran ra khỏi nền mẫu

thịt lợ n bằng chiết pha r ắn vớ i cột chiết oasis HLB.

3. Đã thẩm định các thông số ca phƣơng pháp bao gồm:

- Khoảng tuyến tính: trong khoảng từ 0,5 – 5 µg/kg vớ i hệ số tƣơng quan

tuyến tính R

2

> 0,996.

- Giớ i hạn phát hiện AOZ (0,100 µg/kg), AMOZ (0,119 µg/kg), AHD (0,223

µg/kg), SEM (0,378 µg/kg), đáp ứng yêu cầu về độ nhạy để phân tích các

chât nho m nitrofuran.

- Độ thu hồi trung b nh tƣ 80,5 – 106% cho thấy phƣơng pháp có độ đúng tốt.

- Độ lệch chuẩn tƣơng đối thấ p (RSD% < 13,7%) cho thấy phƣơng pháp có độ

l p lại va ch nh xa c cao.

4. Đã ứng dụng phƣơng pháp để phân tích các mẫu thực phẩm tại các chợ trên

địa bàn Hà Nội, cho thấy phƣơng pháp có thể ứng dụng để phân tích xác định

dâ n xuất nho m nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống.



56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyê n Quôc Ân (2009), Sư du ng kha ng sinh trong chăn nuôi thu y ơ Viê t Nam ,

Cục thú y.

2. Tr ần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa

học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ , Nhà xuất bản Khoa học

và Kỹ thuật, Hà Nội.

3. Nguyễn Đức Huệ (2005), Các phương pháp phân tích Hữu cơ, Nhà xuất bản Đại

học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội.

4. Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyế t sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC), Nhà xuất

bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.

5. Nguyễn Đình Thành (2011), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học

trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

6. Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê trong Hóa học phân tích, khoa Hóa học

trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

7. Bùi Thị Tho (2003), Thuốc kháng sinh và nguyên tắ c sử d ụng trong chăn nuôi,

Nhà xuất bản Hà Nội.

8. Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trƣờ ng

Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

9. Số 54/2002/QĐ-BNN, ngày 20 tháng 06 năm 2002 về việc cấ m sản xuấ t, nhậ p

khẩu, lưu thông và sử d ụng một số loại kháng sinh hóa chấ t trong sản xuất và kinh

doanh thức ăn chăn nuôi ca Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.

10. 28 TCN 194:2004,Các chấ t chuyển hóa thuộc nhóm nitrofuran trong thủ y sản

và sản phẩ m thủ y sản – Phương pháp định lượ ng bằ ng sắc ký lỏng khố i phổ - khố i

phổ , Bộ Thy Sản.



57

11. Trang web (2008), http//vietbao.vn/Kinh-te/My-kiem-tra-thuy-san-nuoi-Trung-

Quoc-Viet-Nam-lo-ngai/55154852/93. Việt Báo

Tiếng Anh12. Alexander Leitner, Peter Zollner, Wolfgang Lindner (2001),“Determination of

the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by high-performance liquid

chromatography –tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography A,

Volume 939, pp. 49-58.

13. Caroline Douny, Joelle Widart, Edwin De Pauw, Frederic sivestre, Packtrick

Kestemont, Huynh Thi Tu, Nguyen Thanh Phuong (2012), Development of an

analytical method to detect metabolites of nitrofurans: Application to the study of

furazolidone elimination in Vietnamese black tiger shrimp (Penaeus monodon),

Aquaculture, Volume 376-379, pp. 54-58.

14. C. Bock, C. Stachel, P.Gowik (2007), Validation of a confirmatory method for

the determination of residues of four nitrofurans in egg by liquid chromatography-

tandem mass spectrometry with the software interval, Analytica Chimica Acta,

Volume 586, pp. 348-358.

15. C. Chang, D.P. Peng, J.E. Wu, Y.L. Wang, Z.H. Yuan (2008), Development of

an indirect competitive ELISA for the detection of furazolidone marker residue in

animal edible tissues. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol.53, pp

8934-8939.

16. Chung-Wei Tsai, chuan-ho tang and Wei-Hsien wang (2010), “Quantitative

Determination of Four Nitrofurans and Corresponding Metabolites in the Fish

Muscle by Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Tandem Mass

Spectrometry” , Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 18, No. 2, pp. 98-106.

17. D. Tyler (2009), Analysis of nitrofurans in animal tissues a food of animal

origin by LC/MS/MS, sop FSG341.

18. E. Horne, A. Cadogan, M. OKeeffe, Hoogenboo, L.A.P. (1996), Analysis of

protein-bound metabolites of furazolidone and furaltadone in pig liver by high



58

performance liquid chromatography and liquid chromatography mass spectrometry.

Analyst, Vol.121, 1463-1468.

19. E. Verdon, P. Couedor, P. Sanders (2007), Multi-residue monitoring for the

simultaneous determination of five nitrofurans (furazolidone, furaltadone,

nitrofurazone, nitrofurantoine, nifursol) in poultry muscle tissue through the

detection of their five major metabolites (AOZ, AMOZ, SEM, AHD, DNSAH) by

liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry – Inhouse

validation in line with Commission Decision 657/2002/EC. Analytica Chimica Acta,

Vol.586, pp 336-347.

20. I. Diblikova, K.M. Cooper, D.G. Kennedy, M. Franek (2005), Monoclonalantibody-based ELISA for the quantification of nitrofuran metabolite 3-amino-2-

oxazolidinone in tissues using a simplified sample preparation. Analytica Chimica

Acta, Vol.540, 285-292.

21. K.M. Cooper, P.P. Mulder, van Rhijn J.A. van Rhijn, L. Kovacsics, R.J.

McCracken, P.B. Young, D.G. Kennedy (2005), Depletion of four nitrofuran

antibiotics and their tissue-bound metabolites in porcine tissues and determination

using LC-MS/MS and HPLC-UV. Food Additives and Contaminants, pp 405-414.

22. Lech Rodziewicz (2008), Determination of nitrofuran metabolites in milk by

liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, Journal

of chromatography, Vol.864, pp. 156-160.

23. Mayda I.Lopez (2007), “Determination and confirmation of Nitrofuran residues

in honey using LC-MS/MS”, Journal of agricultural and food chemistry, Vol.55,

pp. 1103-1108.

24. M. O’Keeffe , A. Conneely, K.M. Cooper, D.G. Kennedy, L. Kovacsics, A.

Fodor, P.P.J. Mulder, J.A. van Rhijn, G. Trigueros (2004), Nitrofuran antibiotic

residues in pork the FoodBRAND retail survey. Analytical Chimica Acta, Vol.520,

125-131.



59

25. M. Vass*, K. Hruska, M. Franek (2008), “Nitrofuran antibiotics: a review on the

application, prohibition and residual analysis”, Veterinarni Medicina, Vol.53, pp.

469 – 500.

26. Pascal Mottier, Seu-Ping Khong, Eric Gremaud, Janique Richoz, Thierry

Delatour, Till Goldmann, Philippe A.Guy (2005), Quantitative determination of

four nitrofuran metabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography-

electrospray ionization-tandem mass spectrometry, Journal of chromatography A,

Volume 1067, pp. 85-91.

27. P. Vinas, N. Campillo, L. Carrasco, M. Hernandez-Cordoba (2007), Analysis of

nitrofuran residues in animal feed using liquid chromatography and photodiode-array detection, Chromatographia, Vol.65, pp. 85-89.

28. Randox laboratory (2008), “Measurement of four nitrofuran metabolites with

elisa kits using multi-analyte reagents”, Randox life sciences.

29. Sujittra Phongvivat, Bangkok, Thailand (2004), “Nitrofurans Case Study:

Thailand’s experience” , Joint FAO/WHO Technical Workshop on, Residues of

Substances without ADI/MRL in Food.

30. Tao Ding, Jingzhong Xu, Chongyu Shen and Kefei Wang (2007),

“Determination of trace level nitrofuran metabolites in crawfish meat by

electrospray LC-MS/MS on the TSQ quantum discovery MAX, Thermo fisher

scientific, San Jose, CA, USA.

31. W. Lui, C. Zhao, Y. Zhang, S. Lu, J. Liu, R. Xi (2007), Preparation of

polyclonal antibodies to a derivative of 1-amonihydantoin (AHD) and development

of an indirect competitive ELISA for the detection of nitrofurantoin residue in

water. Journal of Agriculture and Food Chemistry, Vol.55, 6829-6834.

32. 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC concerning the

performance of analytical methods and the interpretation of results.



PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Săc đô cu a hô n hơ p chuâ n.

P 1.1: Sắc đồ hô n hơ p chuẩn nitrofuran 1 ppb.

P 1.2: Săc đô hô n hơ p chuẩn nitrofuran1,5 ppb.



P 1.3: săc đô hô n hơ p chuẩn nitrofuran 2 ppb.

P 1.4: săc đô hô n hơ p chuẩn nitrofuran 5 ppb.



Phụ lục 2: Sắc đồ mâ u thêm chuâ n

P 2.1: sắc đồ mâ u thi t lơ n thêm chuâ n hô n hơ p nitrofuran ta i mƣ c nồng đô 1 ng/g.

P 2.2: săc đô mâ u thi t lơ n thêm chuâ n hô n hơ p nitrofuran ta i mƣ c nông đô 1 ng/g.




P 2.4: sắc đồ mâ u thi t lơ n thêm chuâ n hô n hơ p nitrofuran ta i mƣ c nông đô 1,5 ng/g.




Phụ lục 3: cách tính điểm IP

P 3.1: Quan hê giƣ a ca c ky thuâ t khối phô va số điê m IP đa t đƣơ c



P 3.2: Ví dụ về số điểm IP đạt đƣợc đối với các kỹ thuật khối phổ khác nhau

Phụ lục 4:

P 4.1: Bảng qui định hệ số biến thiên tại các cấp nồng độ



P 4.2: Bảng qui định về độ thu hồi tại các cấp nồng độ

xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong vài loại thực...

Documents