xây dựng quy trình định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương...

8/20/2019 Xây dựng quy trình định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC và HPTLC

http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-dinh-luong-anthocyanin-trong-thuc-pham-chuc 1/72

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ THÚY HƯƠNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢ NGANTHOCYANIN TRONG THỰ C PHẨM

CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLCVÀ HPTLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ THÚY HƯƠNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢ NGANTHOCYANIN TRONG THỰ C PHẨM

CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLCVÀ HPTLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤTMÃ SỐ: 6072 04 10

Người hướ ng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Tườ ng VyNCS. Cao Công Khánh

HÀ NỘI 2014




LỜ I CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày t ỏ lòng kính tr ọng và l ờ i cảm ơn sâu sắ c t ớ i cô

giáo PGS.TS. Nguyễn Tườ ng Vy, NCS Cao Công Khánh là những người đã tr ự ctiế p ở bên hướ ng d ẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suố t quá trình thự c hiện

luận văn.

Tôi cũng xin g ử i l ờ i cảm ơn tớ i toàn thể các anh chị ở labo Hóa độc thự c phẩ m - Viện kiể m nghiệm an toàn vệ sinh thự c phẩ m quố c gia, những người đãdìu d ắt, hướ ng d ẫn và đóng góp rấ t nhiề u ý kiến quý báu giúp đỡ tôi hoàn thành

luận văn này.

Tôi xin cảm ơn các anh chị của nhóm t ải báo đã giúp tôi rấ t nhiề u trong

việc tìm tài liệu tham khảo cho luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, các

thầy cô đã tạo mọi điề u kiện trong suố t quá trình học t ậ p t ại trườ ng và thự c hiện

luận văn này.

Cuố i cùng tôi xin dành l ờ i cảm ơn tới gia đình, ngườ i thân và bạn bè đãluôn ủng hộ , khích l ệ tôi trong thờ i gian học t ậ p và nghiên cứ u vừ a qua.

Hà N ội, ngày 23 tháng 8 năm 2014.

H ọc viên

Đinh Thị Thúy Hương

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUY

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPO

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

ng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú



MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC, CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC HÌNH VẼ TRONG KHÓA LUẬN

ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................. 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................ 3

1.1. Tổng quan về thực phẩm chức năng .................................................. 3

1.2. Tổng quan về anthocyanin ................................................................. 3

1.2.1. Cấu trúc anthocyanin .................................................................. 3

1.2.2. Tác dung của anthocyanin .......................................................... 5

1.2.3. Tính chất của Anthocyanin ......................................................... 7

1.2.4. Một số phƣơng pháp phân tích anthocyanin ............................... 8

1.3. Tổng quan về HPTLC ...................................................................... 10

1.3.1. Sắc ký lớp mỏng ....................................................................... 10

1.3.2. HPTLC ...................................................................................... 12

1.4. Tổng quan về HPLC ........................................................................ 14

1.4.1.Khái niệm chung ........................................................................ 14

1.4.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký ...................................... 14

1.4.3. Thiết bị sắc ký lỏng ................................................................... 16

1.5. Tổng quan về chiết pha rắn SPE ...................................................... 20

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 21

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................... 21

2.2. Nguyên vật liệu – thiết bị................................................................. 21

2.2.1. Nguyên vật liệu .......................................................................... 21

2.2.2. Thiết bị ...................................................................................... 22

2.3. Nội dung nghiên cứu........................................................................ 23

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................. 23







2.4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích anthocyanin bằng HPLC ...... 23

2.4.2. Khảo sát các điều kiện phân tích anthocyanin bằng HPTLC ... 25

2.4.3.Khảo sát điều kiện xử lý mẫu .................................................... 26

2.4.4. Thẩm định quy trình.................................................................. 272.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................... 27

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ......................................... 28

3.1.Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích anthocyanin bằng HPLC ... 28

3.2. Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích Anthocyanin bằng HPTLC 31

3.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ......................................................... 32

3.4. Thẩm định phƣơng pháp .................................................................. 34

3.4.1. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu ...................................................... 343.4.2. Tính thích hợp hệ thống ............................................................ 36

3.4.3. Khoảng tuyến tính ..................................................................... 38

3.4.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng ................................... 33

3.4.5. Độ thu hồi của phƣơng pháp ..................................................... 42

3.4.6. Độ lặp lại của phƣơng pháp ...................................................... 44

3.5. Kết quả áp dụng phƣơng pháp xác định Anthocyanin trong một số

sản phẩm ................................................................................................. 46

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN.......................................................................... 48

4.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật ............................................................ 48

4.1.1. Lựa chọn phƣơng pháp ............................................................. 48

4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu.................................................................. 48

4.1.3. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng .......................................... 50

4.1.4. Thẩm định phƣơng pháp đã xây dựng ...................................... 52

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 54

KẾT LUẬN ......................................................................................... 54

KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC







DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

AOAC (Association of Official Analytical Chemists) Hiệ p hội các nhà hóa

phân tích chính thức

PDA (Photodiod array detector) Detector mảng diod

HPLC (high – performance liquid chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năngcao

HPTLC (high – performance thin layer chromatography) Sắc ký lớ p mỏng hiệu

năng cao

LOD (Limit of Detection) Giớ i hạn phát hiện

LOQ (Limit of quantification) Giớ i hạn định lượ ng

RSD (Relative standard deviation) Độ lệch chuẩn tương đối

SD (Standard deviation) Độ lệch chuẩn

S Diện tích pic (mAu.s)

C Nồng độ

HL Hàm lượ ng

tR Thời gian lưu

µL microlit

TPCN Thực phẩm chức năng

m Khối lượ ng

TFA Trifluoroacetic acid

TCA Trichloroacetic acid







DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Tên bảng Trang

Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích Anthocyanin 8

Bảng 2.1 Danh mục các mẫu phân tích 21

Bảng 2.2 Danh mục các pha động HPLC khảo sát 24

Bảng 2.3 Gradient hệ pha động HPTLC khảo sát 25

Bảng 3.1 Gradient hệ pha động 1,2 29

Bảng 3.2 Chương trình gradient của hệ pha động, 3 và 4 30

Bảng 3.3K ết quả định lượ ng Anthocyanin trong mẫu bột

Bilberry theo dung môi dùng để chiết mẫu33

Bảng 3.4K ết quả đánh giá độ thích hợ p hệ thống vớ i dung dịch biberry trên HPLC

37

Bảng 3.5 K ết quả đánh giá độ thích hợ p hệ thống vớ i dung dịchBilberry trên HPTLC

38

Bảng 3.6K ết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩncyanidin chloride

39

Bảng 3.7Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đườ ng

chuẩn39

Bảng 3.8 K ết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩn bilberry 40

Bảng 3.9 Độ thu hồi của phương pháp HPLC vớ i mẫu thực phẩm chức năng dạng dung dịch 42

Bảng 3.10Độ thu hồi của phương pháp HPTLC vớ i mẫu thực phẩm chức năng dạng dung dịch

43

Bảng 3.11Độ lặ p lại của phương pháp HPLC vớ i mẫu bột đôngkhô Bilberry

44

Bảng 3.12Độ lặ p lại của phương pháp HPLC trên nền mẫu nangmềm

45

Bảng 3.13Độ lặ p lại của phương pháp HPTLC trên nền mẫu

nang mềm46

Bảng 3.14K ết quả phân tích Anthocyanin trong thực phẩm chứcnăng

47







DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN

Tên hình Trang

Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin 4

Hình 1.2 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 16

Hình 3.1Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Bilberry vớ i hệ pha

động 129

Hình 3.2Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bilberry vớ i hệ pha động2

29

Hình 3.3Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bilberry vớ i hệ pha động3

30

Hình 3.4Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin vớ i hệ pha

động 430

Hình 3.5

Sắc ký đồ dung dịch đánh giá độ phân giải vớ i hệ

pha động 4 31

Hình 3.6 Hình ảnh HPTLC vớ i hệ pha động 4 32

Hình 3.7Sắc ký đồ dung dịch chuẩn gốc cyanidin chloride 10µg/mL

33

Hình 3.8Sắc ký đồ dung dịch bilberry chiết bằngmethanol:HCl2N(80:20)

33

Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch bilberry sau thủy phân. 35

Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 100 µg/mL 35

Hình 3.11 Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng khôngchứa anthocyanin

35

Hình 3.12Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng khôngchứa anthocyanin đượ c thêm chuẩn cyanidin

36

Hình 3.13

Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng khôngchứa anthocyanin đượ c thêm chuẩn cyanidin trên

HPTLC

36

Hình 3.14 Đườ ng chuẩn dung dịch gốc Cyanidin chloride 39

Hình 3.15 Đườ ng chuẩn dung dịch bilberry trên HPTLC 40

Hình 3.16 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 0,5 µg/mL 41

Hình 3.17 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 0,2 µg/mL 42







có nghiên cứu nào về phương pháp xác định hàm lượ ng Anthocyanin trong

thực phẩm chức năng. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi đặt vấn đề nghiên

cứu đề tài:“Xây dựng quy trình định lượ ng Anthocyanin trong th ự c ph ẩ m ch ứ c

năng bằng phương pháp HPTLC và HPLC”

Vớ i các mục tiêu sau đây:

1. Xây d ự ng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượ ng anthocyanin

trong thự c phẩ m chức năng bằ ng k ỹ thuật HPLC và k ỹ thuật HPTLC.

2. Áp d ụng quy trình k ỹ thuật đã xây dự ng phân tích một số mẫ u thự c phẩ m

chức năng trên thị trườ ng




CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.

Khái niệm về thự c phẩm chức năng:Thực phẩm chức năng (Functional foods) được ngườ i Nhật sử dụng đầu

tiên trong những năm 1980 để chỉ những thực phẩm chế biến có chứa những

thành phần tuy không có giá tr ị dinh dưỡng nhưng giúp nâng cao sức khoẻ

cho ngườ i sử dụng. Theo Viện Khoa học và Đờ i sống quốc tế (International

Life Science Institute - ILSI) thì "thự c phẩ m chức năng là thự c phẩ m có l ợ i

cho một hay nhiề u hoạt động của cơ thể như cải thiện tình tr ạng sứ c khoẻ và

làm giảm nguy cơ mắ c bệnh hơn là so vớ i giá tr ị dinh dưỡ ng mà nó mang

l ại". Theo IFIC, thực phẩm chức năng là những thực phẩm hay thành phần

của chế độ ăn có thể đem lại lợ i ích cho sức khoẻ nhiều hơn giá trị dinh dưỡ ng

cơ bản. Thực phẩm chức năng có thể là sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hoặc

là thực phẩm trong quá trình chế biến đượ c bổ sung thêm các chất khác. Cũng

như thực phẩm thuốc, thực phẩm chức năng nằm ở nơi giao thoa giữa thực

phẩm và thuốc và người ta cũng gọi thực phẩm chức năng là thực phẩm -

thuốc.

Bộ Y tế Việt Nam theo thông tư số 08/TT – BYT ngày 23/08/2004 về

việc “ Hướ ng dẫn việc quản lý các sản phẩm thực phẩm chức năng” định

nghĩa thực phẩm chức năng: “là thự c phẩm dùng để hỗ tr ợ chức năng của các

bộ phận trong cơ thể ngườ i, có tác d ụng dinh dưỡ ng, t ạo cho cơ thể tình

tr ạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh”. Tuỳ theo

công thức, hàm lượ ng vi chất và hướ ng dẫn sử dụng, thực phẩm chức năng

còn có các tên gọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡ ng, thực phẩm bổ

sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, sản phẩm dinh dưỡ ng y học.

1.2. Tổng quan về Anthocyanin

1.2.1.

C ấ u trúc c ủa Anthocyanin:




Anthocyanin thuộc nhóm các hợ p chất flavonoid, là những glucozit do

gốc đườ ng glucose, glactose... k ết hợ p vớ i gốc aglucol có màu

(anthocyanidin). Aglycon của chúng có cấu trúc cơ bản đượ c mô tả trong hình1. Các gốc đườ ng có thể đượ c gắn vào vị trí 3,5,7; thường đượ c gắn vào vị trí

3 v à 5 còn vị trí 7 r ất ít. Phân tử anthocyanin gắn đườ ng vào vị trí 3 gọi là

monoglycozit, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycozit [4], [12].

R 1

OH

OH O+

3R 2

OH

A 3

5

7

B

Hình 1.1: C ấu trúc cơ bản của aglycon của anthocyanin

Các aglycon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vàovị trí R1 và R2, thườ ng là H, OH hoặc OCH3 [8], [27].

Bảng 1. Cấu trúc cơ bản của Anthocyanin

Cấu trúc cơ bản Anthocyanidin R 3′ R 4′ R 5′ R 3 R 5 R 6 R 7

Cyanidin −OH −OH −H −OH −OH −H −OH

Delphinidin −OH −OH −OH −OH −OH −H −OH

Pelargonidin −H −OH −H −OH −OH −H −OH

Malvidin −OCH3 −OH −OCH3 −OH −OH −H −OH

Peonidin −OCH3 −OH −H −OH −OH −H −OH

Petunidin −OH −OH −OCH3 −OH −OH −H −OH


http://en.wikipedia.org/wiki/Cyanidin


http://en.wikipedia.org/wiki/Delphinidin


http://en.wikipedia.org/wiki/Pelargonidin


http://en.wikipedia.org/wiki/Malvidin


http://en.wikipedia.org/wiki/Peonidin


http://en.wikipedia.org/wiki/Petunidin








http://en.wikipedia.org/wiki/File:Anthocyanidine.svg



Cấu trúc của anthocyanin cho phép nó thay đổi màu sắc khác nhau tùy

thuộc giá tr ị pH. Việc bổ sung các OH trong cấu trúc phân tử sẽ loại bỏ các

điện tích dương của cấu trúc và gây ra độ hấ p thụ của các proton bướ c sónglớn hơn do đó xuất hiện màu xanh lá cây [21], [22].

Anthocyanins do cách sắ p xếp vòng thơm của chúng, chúng có thể hấ p

thụ bức xạ trong phạm vi năng lượ ng thấ p của quang phổ nhìn thấy đượ c.

Trong k ết quả của Vitis vinifera L., sáu anthocyanidins chính (cyanidin,

peonidin, delphinidin, petunidin, pelargonidin và malvidin) có mặt như 3-O-

glucosides, cũng như acetyl, hình thức este p-coumaroyl và caffeoyl của

chúng. Một chú ý đặc biệt đã đượ c trao cho tác dụng nội phân tử, chứng minh

sự tồn tại của một truyền điện tích tr ạng thái kích thích nội phân tử của p-

coumaroyl và các hình thức este caffeoyl [8], [21].

1.2.2.

Tác d ụng c ủa anthocyanin.

Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng khuẩn, kháng nấm, có vai

trò tạo điều kiện cho sự thụ phấn, phát tán nhờ màu sắc sặc sỡ trên cành hoavà quả. Mặt khác,anthocyanin là chất có khả năng hấ p thụ tia UV nhằm bảo

vệ bộ gen của thực vật trướ c các tia tử ngoại. Sinh tổng hợ p anthocyanin ở vỏ

được tăng cường để đáp ứng phù hợ p với môi trườ ng: hạn hán, ánh sáng

mạnh, UV, nhiệt độ cao, thiếu nitơ và phosphor, nhiễm nấm, vi khuẩn, tổn

thương, côn trùng, ô nhiễm… [12], [31].

Đối vớ i sức khỏe của con ngườ i, theo nghiên cứu của David Heber, Đại họcHarvard (Mỹ), chất anthocyanin có thể cắt được cơn đau tim, giảm thiểu các

tổn thương não liên quan đột quỵ và ngăn cản sự tạo thành các cục máu đông

trong lòng mạch máu (nguyên nhân dẫn đến tắc mạch, gây tai biến mạch máu

não và những cơn nhồi máu cơ tim đột ngột), hạn chế sự suy giảm sức đề

kháng. Các nhà khoa học cũng đã chứng minh đượ c r ằng anthocyanin có tác

dụng tốt trong chống lão hóa, ngăn ngừa sự phát triển của các khối u, bướ u,




hạn chế nguy cơ bị đột quỵ, giảm nguy cơ mắc ung thư… Khi tiêm một lượ ng

nhỏ anthocyanin chiết xuất từ khoai lang vào các tế bào ung thư ruột già, chất

này đã chứng tỏ khả năng ngăn chặn tế bào ung thư phát triển. Các nhà nghiêncứu cũng phát hiện trong một số trườ ng hợ p, sự biến đổi về cấu trúc của các

phân tử anthocyanin cũng làm tăng khả năng chống ung thư của chúng. Các

nghiên cứu còn cho thấy anthocyanin còn có tác dụng tốt trong việc điều hòa

lượng đườ ng huyết của những bệnh nhân đái tháo đườ ng. Khả năng chữa

bệnh của anthocyanin vẫn đang đượ c nghiên cứu để tìm hiểu cơ chế và ứng

dụng trong y học. Các ứng dụng trên đã mở ra một triển vọng về việc sản xuất

thực phẩm, dượ c phẩm chức năng chữa bệnh có hiệu quả [21], [26].

Trong lĩnh vực thực phẩm, vớ i khả năng chống oxy hóa cao, anthocyanin

đượ c sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy

hóa cho thực phẩm. K ết quả nghiên cứu cho thấy, vớ i một lượ ng nhỏ nguyên

liệu vỏ khoai lang (1% khối lượ ng), khả năng bảo quản của các sản phẩm thực

phẩm có chứa mỡ đượ c kéo dài khá lâu và có thể so sánh vớ i chất chống oxy

hóa tổng hợ p BHA. Ngoài các tác dụng chống oxy hóa, anthocyanin còn đượ c

sử dụng như chất màu tự nhiên tạo ra nhiều màu sắc hấ p dẫn cho thực phẩm

và khá an toàn. Ví dụ: dịch chiết anthocyanin từ các loại rau củ có màu đỏ

như vỏ quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang… đã được dùng để làm chất màu thay

thế màu tổng hợ p trong sản xuất k ẹo cứng [18].

Anthocyanin ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên đượ c sử dụng khá an

toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấ p dẫn cho mỗi sản phẩm,

anthocyanin còn là hợ p chất có nhiều hoạt tính sinh học quí như: khả năng

chống oxy hóa cao nên đượ c sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa

các sản phẩm thực phẩm, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng, có tác dụng làm

bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư, tác

dụng chống các tia phóng xạ [8], [27].




1.2.3.

Tính ch ấ t c ủa anthocyanin :

- Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợ p chất khá

phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực.- Khi đun nóng lâu trong nướ c, anthocyanin bị phá hủy và mất màu.

- Anthocyanin hòa tan tốt trong nướ c và trong dịch bão hòa, khi k ết hợ p vớ i

đườ ng làm cho phân tử anthocyanin càng dễ hòa tan hơn.

- Màu sắc của anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các sắc tố có

mặt và nhiều yếu tố khác… Khi tăng số lượ ng nhóm – OH trong vòng benzen

thì màu càng xanh đậm. Khi tác dụng vớ i Sn có màu lam, vớ i Al có màu tím,vớ i Fe, Cu thì bị biến màu [14].

- Mức độ methyl hóa các nhóm – OH trong vòng benzen càng cao thì màu

càng đỏ. Nếu nhóm – OH ở vị trí thứ 3 k ết hợ p vớ i các gốc đườ ng thì màu sắc

cũng thay đổi theo số lượ ng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít.

- Màu sắc của anthocyanin phụ thuộc r ất mạnh vào pH của môi trườ ng, khi

pH> 7 các anthocyanin cho màu xanh, pH< 7 các anthocyanin cho màu đỏ.

Tóm lại, các thực phẩm có chứa nhiều anthocyanin là nguồn cung cấ p

chất có hoạt tính sinh học, góp phần giúp tr ẻ lâu và phòng tránh bệnh tật. Bên

cạnh đó, anthocyanin có các đặc tính quý báu của chất màu tự nhiên mà các

chất màu khác hình thành trong quá trình gia công k ỹ thuật không có đượ c

[27], [31].

Cấu trúc của anthocyanin là những gì cho phép nó thay đổi màu sắc

khác nhau trong giá tr ị pH. Việc bổ sung các nhóm -OH vào trong cấu trúc

phân tử sẽ loại bỏ các điện tích dương của cấu trúc và gây ra độ hấ p thụ của

các proton bướ c sóng lớn hơn do đó do đó xuất hiện màu xanh lá cây xuất

hiện màu xanh lá cây [21], [22].




1.2.4. M ột s ố phương pháp phân tích Anthocyanin:

Stt K ỹ thuậtphântích

Mẫuphântích

Điều kiện phân tích Điều kiện xử lýmẫu

Tàiliệu

thamkhảo

1 HPLCRượ u

vang đỏ

-Ascentis C18, 25 cm × 4.6mm I.D., 5 μm particles(581325-U)-Pha động: (A) water:formicacid (9:1), (B)acetonitrile:water:formicacid (5:4:1)-Tốc độ dòng: 1 mL/phút-Nhiệt độ cột: 25 °C-Detector PDA: 520 nm-Thể tích tiêm mẫu: 10µL

Pha loãng vớ inướ c, ly tâm vàđi qua một mànglọc 0,45 µmtrướ c khi tiêm

sắc ký

[22]

2 HPLCMẫunướ c

hoa quả

-Cột ACE Phenyl(250 × 4,6 mm, 5 µm)-detector PDA: 520µm-Pha động: acetonitril - 10%(v/v) acetic acid and 1%(v/v) phosphoric acid trongnướ c.-Tốc độ dòng: 1 mL/phút-Nhiệt độ cột: 25oC-Thể tích tiêm mẫu: 25µL

Lọc qua mànglọc trướ c khitiêm sắc ký

[33]

3 HPLCMẫunướ c

hoa quả

-Cột Synergi Hydro-RP 80Å (150.0 × 2.0 mm, 4 µm)-Pha động: acetonitril – aceticacid:trifluoroaceticacid:acetonitril:nướ c(10:0,2:5:84,8)

-Tốc độ dòng: 1 mL/phút-Nhiệt độ cột: 25oC-Detector MS: 520 nm-Thể tích tiêm mẫu: 20µL

Lọc qua mànglọc trướ c khitiêm sắc ký

[33]

4 UHPLC Bilberry

-Cột Acclaim RSLC 120C18, (2.2 μm; 2.1 × 150mm)-Pha động: A: 10% FormicAcidB: 10% Formic Acid, 22.5%

Methanol, 22.5%

Chiết bằngmethanol-10%acid

phosphoric, phaloãng, lọc thô.




Acetonitrile-Tốc độ dòng: 0.475mL/phút-Nhiệt độ cột: 35OC

-Detector :Absorbance, vis,520 nm-Thể tích tiêm mẫu: 2 µL

5 HPTLCPowdered berry

extract

-Thiết bị: TLC sampler4(ATS4, camag, muttenz,switxerland)-Bản mỏng: Silica gel 60F254 (10mm × 20mm)-Pha động: Ethylacetate:2-

butanone:nướ c:acid formic(7:3:0,8:1,2)-Quét sắc đồ ở 520 nm, tốcđộ 20 mm/giây-Hiện vết: Phun thuốc thử Dragendoft

Chiết vớ imethanol :0,1%HCL, pha

loãng bằng ethylacetate

[16]

6 HPLCBilberryextract

-Cột:5 µm YMC-Pack ProC18 RS, 250 X 4.6 mm / 2µm YMC-UltraHT Pro C18RS, 100 X 3.0 mm.-Pha động: A: water/formicacid (90/10)B:ACN/methanol/water/for mic acid (22.5/22.5/40/10)-Tốc độ dòng: 1.0 ml/min-Nhiệt độ cột: 300C- Detector : VIS at 535 nm-Thể tích tiêm mẫu: 10 µL

Mẫu đượ c hòa

trong

methanol:nướ c(

85:15), rung

siêu âm, lọc

trướ c khi chạy

sắc ký

[32]

7

HPLC-DAD-ESI-

MS/MS

Quả mọng

(berries)

-Cột: YMC-pack ODS-AMC18 (250×4,6 mm, 5 µm)

-Pha động: ACN:nướ c:acidformic (87:3:10, v/v/v)-acetonitril:nướ c:acidformic (40:50:10, v/v/v)-Tốc độ dòng: 0,8mL/phút-Nhiệt độ cột: 400C-Thể tích tiêm: 25 µL-Detector: Sử dụng k ỹ thuật ESI để ion hóa chất

phân tích và phân tích khối

phổ 2 lần MS/MS.

Mẫu đượ c chiết

bằng

methanol/formic

acid(97:3)trướ c

khi tiêm sắc ký

[24]




1.3. Tổng quan về HPTLC

1.3.1. Sắc ký lớ p mỏng:

Sắc kí giấy và sắc kí lớ p mỏng đã đượ c xây dựng, phát triển và ứngdụng từ lâu. Tuy nhiên hiện nay sắc kí giấy ít đượ c sử dụng. Phổ biến nhất

hiện nay là sắc kí lớ p mỏng. Ở nước ta phương pháp sắc kí lớ p mỏng đã đượ c

sử dụng r ộng rãi, đã có nhiều tài liệu, chuyên gia có kinh nghiệm về phương

pháp này.

Trong sắc kí mặt phẳng, quá trình sắc kí đượ c tiến hành trên một tờ

giấy hay một lớ p bột r ải đều và đượ c giữ trên mặt một tấm kính, chất dẻo haykim loại, ví dụ nhôm. Bản thân lớ p mỏng có thể là pha tĩnh hoặc chỉ là chất

mang để giữ pha tĩnh trên đó. Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớ p

mỏng do tác dụng của lực mao dẫn và đôi khi cả tr ọng lực và điện thế [1],

[13]

a. Nguyên t ắ c của SKLM

Cũng như tất cả các phương pháp sắc ký khác, quá trình tách hỗn hợ p

các chất bằng SKLM xảy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh.

Trong SKLM, pha tĩnh đượ c r ải thành một lớ p mỏng trên một giá đỡ phẳng.

Dướ i tác dụng của lực mao quản, pha động thấm theo lớ p mỏng đi qua điểm

xuất phát – nơi hỗn hợ p chất cần phân tích đã được đưa lên bản mỏng. Trong

quá trình di chuyển của pha động qua lớ p mỏng chất hấ p thụ (pha tĩnh), nhờ

các quá trình hấ p thụ và giải hấ p thụ đượ c lặp đi lặ p lại và do hệ số phân bố

khác nhau mà những chất khác nhau di chuyển theo hướ ng chuyển động của

pha động vớ i các tốc độ khác nhau. K ết quả là mỗi chất trong hỗn hợ p phân

tích có thể sẽ đượ c tách riêng ra ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng [29].

Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích đượ c hòa tan trong một dung môi

thích hợp và đượ c hút lên bản sắc ký nhờ lực mao dẫn tách dung dịch thí

nghiệm dựa trên độ phân cực của các thành phần trong dung dịch [13], [29]




Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ

số lưu giữ R f . Tr ị số của nó đượ c tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển

của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

R f

dR : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích.

dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động( đo

trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm).

R f : Có giá tr ị dao động từ 0-1 [1].

Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thướ c 10 –30µm đượ c r ải đều và k ết dính

thành lớ p mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông. Bản

mỏng có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thườ ng 5÷20cm, nhiều

khi có đưa thêm chất huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện

chất phân tích. Chất hấ p phụ thườ ng dùng nhất là silicagel [7], [9].

Pha động dùng cho TLC r ất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Để tăng cườ ng r ửa giải thườ ng dùng 2 dung môi. Nguyên lý chia tách dựa vào hệ

số phân bố giữa 2 pha. Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký chủ yếu dựa vào

kinh nghiệm [1].

b .K ỹ thuật TLC:

Đưa chất phân tích lên bản mỏng:

Lượ ng hỗn hợ p các chất được đưa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan tr ọng

đối vớ i hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến giá tr ị R f , lượ ng mẫu đưa lên bản

mỏng khoảng 0,1 - 50µg đượ c pha trong dung môi thích hợ p. Thể tích dung

dịch chấm 1 – 5 µL đối vớ i vớ i sắc ký phân tích và 0,1 – 0,2µL đối vớ i sắc

ký điều chế.

Đườ ng xuất phát cách mép bản mỏng khoảng 1,5 – 2,0 cm và cách bề mặt

dao động 0,8 – 1,0 cm.




Khai triển sắc ký:

Sau khi chấm sắc ký, bản đã đượ c sấy khô đượ c cho bào bình sắc ký đã bào

hòa pha động. Mép dướ i bản mỏng được nhúng vào pha động nhưng vết chấmcòn cách bề mặt pha động khoảng 1cm.

Phát hiện vết sắc ký đồ:

Dựa trên các tính chất lý hóa khác nhau của chất phân tích để lựa chọn

cách phát hiện thích hợ p các vết sắc ký.

o Phun thuốc thử hiện mầu

o Soi dưới đèn UV

o Dùng densitometer: Thiết bị này đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản

mỏng khi soi dưới đèn UV – VIS. Chất phân tích hấ p thụ bức xạ đượ c

ghi lại thành pic sắc ký [9], [13], [29].

c, Ứ ng d ụng của SKLM trong phân tích kiể m nghiệm:

Phân tích định tính.

Thử tinh khiết.

Bán định lượ ng,

Định lượ ng [2], [23].

1.3.2. Sắc ký lớ p mỏng hiệu năng cao:

Sắc ký lớ p mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tân tiến nhất

của công cụ TLC. HPTLC vớ i dụng cụ tinh vi được điều khiển bở i một phần

mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng, độ tin cậy, độ lặ p lại cao nhất của các

số liệu đưa ra. Trong phân tích HPTLC, các thông số của quá trình phân tích

đượ c ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó lặ p lại được độ lặ p lại cao. Các bướ c

của quá trình phân tích bao gồm phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết

đượ c tiến hành bán tự động, giảm thiếu tối đa các sai số có thể gặ p phải. Quá

trình phun mẫu đượ c tiến hành bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu

phun, tốc độ phun và không có nguy cơ hỏng cơ học bản mỏng. Trong quá

trình khai triển, điều kiện khai triển về nhiệt độ và độ ẩm đượ c kiểm soát chặt




chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm bảo độ lặ p lại của k ết quả khi tiến hành tại các

phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợ p máy ảnh và hệ thống

phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượ ng. Thiết bị của HPTLC:

- Thiết bị chấm mẫu bán tự động.

- Thiết bị phát triển tự động.

- Buồng chụ p ảnh TLC được điều khiển thông qua phần mềm

winCAT và phần mềm Video Scan trên máy tính: quét bản mỏng vớ i

hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera k ỹ thuật số có độ phân giải

cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy

tính [2], [19].

Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của k ết quả phân tích, người ta đưa

vào thị trườ ng bản mỏng hiệu năng cao (high – performance plates). Bản này

đượ c tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn (dày khoảng 100 µm) vớ i bột mịn có kích

thướ c hạt 5 µm độ đồng đều cao hơn. Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ

phân tích được tăng lên bở i vì:

Vết sắc ký nhỏ hơn.

Thờ i gian sắc ký ngắn hơn.

Lượng dung môi dùng ít hơn.

Pha tĩnh dùng silica và pha liên kết siloxan cho sắc ký lớ p mỏng hiệu

năng cao (HPTLC) có sẵn trên thị trườ ng. Tuy vậy trong k ỹ thuật này k ể cả

HPTLC sai số của phương pháp dao động trong khoảng 5 – 10% [9], [13],

[29]

Ưu điểm của HPTLC:

+ Phù hợ p vớ i cả phân tích định tính và phân tích định lượ ng

+ Trong một lần triển khai sắc ký có thể phân tích đồng thờ i r ất nhiều

mẫu một lúc, tiết kiệm thờ i gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao.




+ Các mẫu phân tích và các dung dịch chuẩn đượ c chấm trên cùng 1

bản mỏng sắc ký, khai triển cùng trong một điều kiện dung môi, nhiệt

độ, độ ẩm nên cho độ lặ p lại cao, hạn chế sự tác động của môi trườ nggiữa các lần phân tích [19].

Do bởi các ưu điểm trên nên chúng tôi lựa chọn k ỹ thuật HPTLC để

nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượ ng anthocyanin trong

thực phẩm chức năng.

1.4. Tổng quan về HPLC

1.4.1. Khái niệm chung

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography –

HPLC) là k ỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha

động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào

ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển vớ i

tốc độ khác nhau, do đó thứ tự r ửa giải khác nhau. Thành phần pha động đưa

chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để r ửa giải các chất vớ i thờ i gian hợ p

lý [2], [5].

1.4.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký [2], [1], [5]

Thời gian lƣu:

Khoảng thờ i gian từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi pic đến detector là

thời gian lưu tR .

Thờ i gian chết: thờ i gian tM của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó

bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động).

Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR - tM

Hệ số phân bố K:

K = M

S

C

C

Trong đó:

CS, CM: nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động




K càng lớ n, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Các chất trong

hỗn hợ p có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng

hơn. Hệ số dung lƣợng k’:

k’ = M

S

M M

S S

V

V K

V C

V C .

.

. = M

M R

t

t t

Trong đó:

VS, VM tương ứng là thể tích của pha tĩnh, pha động.

k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha vào hệ số VS/VM

Thông thườ ng chọn k’ = 1-5.

Hệ số chọn lọc α:

Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B:

α = M A R

M B R

A

B

A

B

t t

t t

k

k

K

K

'

'

Trong đó:

K B, K A lần lượ t là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trướ c).

k’A,k’B tương ứng là hệ số dung lượ ng của chất A, B.

(tR )A, (tR )B tương ứng là thời gian lưu của chất A, B.

Hai chất A và B chỉ có thể tách đượ c khỏi nhau nếu > 1. Trong phân tích sắc

ký, thườ ng lựa chọn điều kiện phân tích để có được α = 1,05 - 2. Nếu α quá

lớ n, thờ i gian phân tích kéo dài.

Số đĩa lý thuyết:

Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký

2

2/1

2

55,516W

t

W

t

H

L N

R R

Trong đó:




Cột nhồi thườ ng có hạt cỡ 5-10 µm. Ưu điểm của cột có cột nhồi có hạt cỡ

nhỏ là chạy tốn ít dung môi và ít thờ i gian và số đĩa lý thuyết lớ n.

- Để bảo vệ cột sắc ký, ngườ i ta sử dụng cột bảo vệ được đặt trướ c cột sắc kýđể loại các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi

thọ cột. Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, đượ c nhồi hạt cùng loại nhưng kích

thướ c hạt lớn hơn.

- Sắc ký lỏng phân bố là k ỹ thuật sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Loại pha

tĩnh phổ biến nhất đượ c chế tạo từ silic dioxid (silica). Nhóm OH trên bề mặt

silica phản ứng vớ i dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan.

Bề mặt silica Dẫ n chấ t clorosilan Dẫ n chấ t siloxan

Dựa vào gốc R’ của dẫn chất siloxan, ngườ i ta chia ra 2 nhóm:

- Pha tĩnh không phân cực có R’ là:

Gốc octadecyl (C18)

Gốc octyl (C8)

Gốc phenyl propyl

- Pha tĩnh phân cực có R’ là:

Cyano

Amino

Diol

Dựa vào độ phân cực tương đối của pha tĩnh và pha động đã hình thành hai

loại sắc ký phân bố là sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo:

- Sắc ký phân bố pha thuận: thường dùng pha tĩnh lỏng phân cực như

triethylen glycol, nước. Còn pha động là dung môi ít phân cực hơn như hexan.




- Sắc kí phân bố pha đảo: pha tĩnh không phân cực như hydrocacbon (C18

hoặc C8) còn pha động phân cực hơn pha tĩnh như nướ c, acetonitril.

d. DetectorCó nhiều detector đượ c sử dụng trong HPLC và thườ ng sử dụng 6 loại sau:

- Detector hấ p thụ UV-VIS

- Detector huỳnh quang

- Detector chỉ số khúc xạ

- Detector tán xạ bay hơi

- Detector đo dòng

- Detector độ dẫn

Trong nghiên cứu này, để quy trình xây dựng đượ c có khả năng ứng dụng

r ộng, chúng tôi lựa chọn detector PDA, loại detector phổ biến trong cấu hình

tiêu chuẩn của thiết bị HPLC hiện tại. Về bản chất, đây là một detector UV-

Vis cho phép đồng thờ i ghi nhận tín hiệu hấ p thụ đồng thờ i trên toàn dải phổ

UV gần và Vis. Dải bức xạ UV-Vis (thườ ng các detector PDA có dải bướ c

sóng trong khoảng 190 – 800 nm) sau khi đi qua tế bào đo được đưa đến một

cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một mảng diod quang. Mỗi diod

quang đón nhận một phần dải bức xạ tương ứng vớ i một khoảng bướ c sóng

hẹp. Như vậy, mỗi một diod có thể phát hiện một sự hấ p thu ở một bướ c sóng

nhất định. Toàn bộ dãy diod đượ c quét nhiều lần trong 1 giây bở i bộ phận vi

xử lý. K ết quả phổ có thể hiện trên màn hình máy tính hoặc được lưu trữ để in

ra dướ i dạng bản phổ bằng máy in.

Ưu điểm của detector này là tạo đượ c phổ UV của các chất phân tích trong

khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh

đượ c sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký vớ i phổ của

một ngân hàng dữ liệu hoặc vớ i phổ của chất chuẩn biết trướ c [2], [1], [5].

e. Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu




CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợ ng nghiên cứ u

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác địnhhàm lượ ng của Anthocyanin trong thực phẩm chức năng.

Đối tượ ng mẫu phân tích là anthocyanin và đối tượ ng nghiên cứu là các

thực phẩm chức năng dướ i một số dạng bào chế: viên nang cứng, viên nang

mềm và mẫu dạng dung dịch. Các mẫu phân tích đượ c lấy ngẫu nhiên trên thị

trườ ng Hà Nội có nguồn gốc từ các công ty sản xuất khác nhau và đượ c mã

hóa như bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục các mẫ u phân tích

Mẫu Dạng bào chế Nhà sản xuấtHạndùng

NM01 Nang mềmFactor group of Nutritional Companies

Inc07/2016

NM02 Nang mềm Life Cycle Herbal Products Inc 02/2015

NM03 Nang mềm Công ty St. Paul Brands – Mỹ 11/2015

NM04 Nang mềmYunan Baian Medicinal Science&

Technology co., Ltd12/2015

NM05 Nang mềmLaboratoriya Sovremennogo Zdorovya

- LBN3/2015

DD01 Dung dịch USA O&K trading 11/2014

NC01 Nang cứng Atrapharmaceuticals PVT-LTD 05/2016

NC02 Nang cứng Parmachem Lobotorie 03/2016

NC03 Nang cứng AFC- HD AMS Life Science Co. Ltd 03/2016

DD02Dung dịch

Hankook Drink. Co. Ltd 04/2015

DD03 Dung dịch Paginbio Co. Ltd 07/2017

2.2. Nguyên vật liệu - thiết bị

2.2.1.

Nguyên vật liệu




- Chất chuẩn Cyanidin hydroclorid (Sigma - Adrich) (hàm lượ ng: 98%

(HPLC)).

- Bột đông khô bilberry đượ c mua từ Viện dượ c liệu trung ương. - Dung môi loại tinh khiết cho HPLC: methanol, acetonitril, tetrahydrofuran

(Merck)

- Dung môi loại tinh khiết phân tích: ethanol, aceton (Merck)

- Hóa chất tinh khiết phân tích: amoniacetate (Merck), trichloroacetic acid

(Merck).

- Nướ c cất 2 lần.

Dung d ịch chấ t chuẩ n g ố c Cyanidin chloride: 1mg chất chuẩn Cyanindin

chloride trên hòa tan vớ i khoảng 5 ml methanol r ồi chuyển toàn bộ vào bình

định mức 10ml sau đó thêm methanol tớ i vạch ở nhiệt độ phòng, lắc k ỹ và

bảo quản ở điều kiện lạnh.

Dung d ịch chuẩ n bilberry: 0,1g bột đông khô bilberry hòa tan trong 10 mL

dung dịch methanol: HCl 2N (80:20) ở nhiệt độ phòng, đem thủy phân ở 800C

trong 2,5 giờ. Định mức vớ i dung môi trên tớ i chính xác thể tích 10mL trong

bình định mức, lắc k ỹ và bảo quản ở điều kiện lạnh.

2.2.2. Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lớ p mỏng hiệu năng cao HPTLC Camag: bộ phận chấm

mẫu bán tự động Linomat 5, bộ phận triển khai sắc kí ADC2 và Scanner4.

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (LC 20AD) trang bị

detector PDA.

- Cột sắc ký C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm).

- Tiền cột C18 Symmetry Waters (20 mm x 3,9 mm; 5 µm).

- Cân k ỹ thuật XT1200c có độ chính xác 0,01g.

- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g và 0,00001 g.

- Máy đo pH: pH Meter 744.

- Máy lắc siêu âm Elma (Germany).




- Máy ly tâm Hermle Z383K.

- Máy lắc Vortex IKA.

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 10mL, 20 mL, 50 mL, cốc cómỏ, pipet các loại, autopipet 1000 μL, 200 μL, 5000 µL.

- Ống ly tâm 50 mL, 25mL, lọ thủy tinh có nắ p kín.

- Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm, 0,2 µm.

2.3. Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát xây dựng điều kiện chạy máy HPLC, HPTLC để phân tích

Anthocyanin.

- Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết Anthocyanin trong thực

phẩm chức năng.

- Đánh giá (thẩm định) quy trình phân tích và xử lý mẫu.

- Áp dụng quy trình phân tích và xử lý mẫu vớ i một số sản phẩm trên thị

trườ ng.

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứ u

2.4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích Anthocyanin bằng HPLC

Thành phần pha động ảnh hướ ng r ất nhiều tớ i quá trình tách sắc ký.

Pha động khác nhau sẽ có độ phân cực khác nhau. Dựa vào các bài báo tham

khảo [15], [20], [30], chúng tôi chọn pha động chạy vớ i chế độ gradient nồng

độ vớ i pha động A và B như sau:

STT Pha động (A) Pha động (B)Chƣơng

trình chạy1 Methanol – Acid Formic

Methanol hoặcAcetonitril

Gradient2 Methanol – TFA

3 Methanol - TCA

Chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện chạy máy HPLC như sau:




- Pha tĩnh: dựa vào các tài liệu tham khảo chúng tôi chọn pha tĩnh là cột C18

Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm.)

- Pha động: khảo sát chế độ gradient nồng độ với các pha động sau: Bảng 2.2: Danh mục các pha động HPLC khảo sát

Thành phần pha động (%) Chế độ chạy máyA B

Pha động 1 0,1% acid Formic (pH 3,0) Methanol

Gradient

Pha động 20,1% acid Formic, 1% THF

(pH 2,5)Acetonitril

Pha động 3

2%TCA, 1%Amoniacetate, 2%

THF (pH 2,5) Methanol

Pha động 42%TCA, 1%Amoniacetate, 2%

THF (pH 2,5)Acetonitril

- Tốc độ dòng: Dựa trên nhiều bài báo nghiên cứu [11], [15], [30], chúng tôi

lựa chọn vớ i tốc độ dòng 1 mL/phút.

- Thể tích tiêm mẫu: 50 µL.

-

Detector: PDA quét dải phổ từ bướ c sóng 190 nm đến 800 nm.- Bướ c sóng phát hiện: 520 nm (do Anthocyanin có bướ c sóng hấ p thụ cực

đại là 520 nm) [15], [30], [32].

- Nhiệt độ cột: 400C [28].

- Dung dịch chuẩn gốc Cyanidin chlorid 100 µg/mL: Bảo quản trong tủ

lạnh.

-

Dung dịch chuẩn làm việc: hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml, thêm methanol vừa đủ (dung dịch chuẩn làm việc có

nồng độ Cyanidin 10 µg/mL

- Các dung dịch chuẩn Cyanidin có nồng độ nhỏ hơn đượ c pha từ dung dịch

chuẩn gốc.




- Dung dịch pha động A (pH 2,5): cân chính xác 2,5 g muối amoniacetate,

5g trichloroacetic acid hòa tan vào khoảng 400 mL nướ c cất 2 lần, thêm

nướ c vừa đủ 2,5L và điều chỉnh đến pH 2,5 bằng dung dịch acidtrichloroacetic 4%, thêm 50mL tetrahydrofuran, lọc qua màng lọc 0,2 µm.

2.4.2. Khảo sát các điều kiện phân tích Anthocyanin bằng HPTLC:

Dựa theo các tài liệu tham khảo [10], [16], [17] chúng tôi khảo sát điều

kiện chạy HPTLC như sau:

Pha tĩnh: HPTLC Silica gel 60 F254 (10mm × 20mm)

Pha động: chúng tôi khảo sát với các pha động sau đây:

Bảng 2.3: Danh mục các pha động HPTLC khảo sát

Thành phần và tỷ lệ pha động

Pha động 1 n –butanol: acid acetic: nước (4:1:5; v/v/v) Pha động 2 Chloroform: methanol: nước (25:10:1,1; v/v/v)

Pha động 3 Ethyacetate: 2 –butanol: aicd formic: nước

(7:3:0,8:1,2; v/v/v/v)Pha động 4 Ethyacetate: aicd formic: nước (10:2:3; v/v/v)

- Tiến hành quét phổ ở bước sóng 490-550.

- Bước sóng phát hiện là 520µm.

- Thể tích tiêm mẫu: 5µL

- Thể tích dung môi bão hòa: 25ml; dung môi khai triển: 10ml.

- Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút.

-

Thời gian bão hòa bản mỏng: 5 phút. - Thời gian sấy khô bản mỏng: 5 phút.

- Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 80 mm

- Dung dịch chuẩn gốc Cyanidin chlorid 100 µg/mL: Bảo quản trong tủ

lạnh.




- Dung dịch chuẩn làm việc: hút chính xác 1mL dung dịch chuẩn gốc vào

bình đinh mức 10mL, thêm methanol vừa đủ (dung dịch chuẩn làm việc có

nồng độ Cyanindin 10 µg/mL). - Các dung dịch chuẩn Cyanidin có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch

chuẩn gốc.

- Dung dịch Bilberry: bảo quản ở nhiệt độ lạnh.

- Pha pha động: sử dụng các dụng cụ hóa chất dùng cho HPLC để pha pha

động có thành phần và tỷ lệ như bảng 2.3 trên.

2.4.3. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Dựa khả năng hòa tan của Anthocyanin và tham khảo nhiều bài báo

[22], [25], [28], nghiên cứu, chúng tôi khảo sát khả năng chiết Anthocyanin từ

nền mẫu bằng cách thủy phân mẫu ở nhiệt độ 800C vớ i thờ i gian 30 phút, 60

phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút bằng hỗn hợ p dung môi sau đây:

methanol acid hóa bằng HCl 2N vớ i các tỷ lệ như sau [16], [18]:

Methanol: HCl 2N: 90:10; 80:20; 70:30; 60:40.

Quy trình chiết Anthocyanin cho đối tượ ng phân tích là thực phẩm

chức năng dạng nang cứng và nang mềm dự kiến gồm các bướ c sau:

- Xác định khối lượ ng trung bình thuốc trong nang, đồng nhất mẫu.

- Cân chính xác một lượ ng mẫu sau khi đồng nhất (cân 1 lượng tương đương

vớ i khối lượ ng 2 viên) vào ống ly tâm 50 mL.

- Thêm khoảng 10 mL dung môi chiết vào ống ly tâm.

- Lắc xoáy ống ly tâm 5 - 10 phút, sau đó lắc siêu âm 15 - 30 phút ở nhiệt độ

phòng.

- Thủy phân ở nhiệt độ 800C vớ i hỗn hợ p dung môi methanol: HCl 2N (80:20)

- Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút

- Gạn lấy phần dịch, định mức 10 mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng

lọc 0,45 µm.

- Tiêm vào hệ sắc ký HPLC, HPTLC (pha loãng nếu cần).




Quy trình chiết Anthocyanin cho đối tượ ng phân tích là thực phẩm chức

năng dạng dung dịch dự kiến gồm các bước sau: tương tự các bước đối vớ i

thực phẩm chức năng dạng viên nén, nang mềm và nang cứng nhưng thêm bướ c cuối làm sạch và làm giầu mẫu bằng phương pháp chiết pha r ắn (SPE

C18) như sau:

- Hoạt hóa cột: Lần lượ t bằng các dung môi 6mL methanol, 6mL nướ c cất

- Nạ p dịch lên cột: tốc độ không quá 2 ml/phút

- R ửa, loại tạ p chất: 6mL nướ c cất

- R ửa lấy dịch: 2 mL methanol/lần × 2 lần.

- Chạy máy HPTLC, HPLC (pha loãng nếu cần).

2.4.4. Thẩm định quy trình

Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích Anthocyanin bằng HPLC

đượ c thẩm định về các tiêu chí:

- Tinh chọn lọc, đặc hiệu

- Độ lặ p lại hệ thống

- Khoảng tuyến tính

- Độ lặ p lại phương pháp

- Độ thu hồi.

- Giớ i hạn phát hiện (LOD), giớ i hạn định lượ ng (LOQ).

2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu

- Các k ết quả thu đượ c trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều đượ c xử lí

bằng các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPLC, và HPTLC.

- Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán

học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để tính

toán: k ết quả trung bình, độ lệch, độ lệch chuẩn, phương sai, độ lệch chuẩn

tương đối, hệ số biến thiên, độ thu hồi khi xử lý các k ết quả thực nghiệm và

đánh giá thẩm định phương pháp.




CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích Anthocyanin bằng HPLC

Để xây dựng quy trình phân tích Anthocyanin bằng HPLC, chúng tôi sử dụng các điều kiện sắc ký thông dụng dưới đây cố định trong toàn bộ nghiên

cứu:

- Cột C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột cùng loại.

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 50 µL

- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 190 nm đến 800 nm- Bướ c sóng phát hiện: 520 nm.

- Nhiệt độ cột: 400C

Để có được quy trình phân tích cho đáp ứng pic tốt vớ i chuẩn gốc cyanidin

chloride và có khả năng tách cyanidin chloride khỏi các thành phần khác

trong mẫu bột đông khô bilberry, thành phần pha động đượ c nghiên cứu khảo

sát thông qua k ết quả phân tích thu đượ c khi tiêm dung dịch đánh giá độ phân

giải vào hệ thống HPLC ở mỗi điều kiện pha động. Những k ết quả nghiên cứu

sơ bộ cho thấy phân tích ở chế độ đẳng dòng không cho phép tách đượ c

cyanidin chloride khỏi các thành phần khác. Vì vậy, việc sử dụng chế độ

gradient dung môi là bắt buộc để có được độ phân giải như mong muốn, đồng

thờ i cho thờ i gian phân tích vừa phải (khoảng 25-30 phút). Có tất cả 4 hệ

dung môi đượ c khảo sát:

- H ệ pha động 1: Methanol acid hóa vớ i 0,1% acid Formic (pH 3,0) –

methanol với chương trình gradient như ở bảng 3.1. K ết quả là không tách

đượ c các chất sau vài lần chạy(Hình 3.1)




Hình 3.1: S ắc ký đồ của dung d ịch chuẩ n Bilberry với pha động 01

Bảng 3.1 Gradient hệ pha động 1,2

Thời gian (phút)Thành phần pha động (%)

0,1% acid formic(pH=3)

Methanol

0,1 90 102 90 1010 80 2015 75 2520 70 3025 65 3527 90 10

- H ệ pha động 2: Methanol acid hóa vớ i 0,1% aicd Formic, 1% THF (pH

2,5) – acetonitril với chương trình gradient như ở bảng 3.1. Thay methanol

bằng acetonitril và vẫn chạy vớ i thờ i gian 27 phút. Tuy nhiên k ết quả cho

thấy pic vẫn chưa hoàn toàn tách đượ c (Hình 3.2).

Hình 3.2: S ắc ký đồ dung d ịch dung d ịch chuẩ n Bilberry vớ i hệ pha động 2

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

-100

0

100

200

300

400

500

600

700mAU

520nm,4nm (1.00)

/ 1 2 . 1

6 0 / 2 5 4 6 3 4 2

/ 1 2 . 9

9 7 / 1 0 1 3 2 5 7

/ 1 3 . 3

0 6 / 9 4 3 9 8 1

/ 1 3 . 6

3 0 / 5 3 3 6 6 4

4

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min

-100

0

100

200

300

400

500

mAU520nm,4nm (1.00)

/ 1 5 . 4

0 3 / 2 5 1 7 4 6 8

/ 1 6 . 5

7 8 / 1 1 3 5 9 4 3

/ 1 6 . 9

8 9 / 1 0 3 9 6 2 1

/ 1 7 . 3

2 3 / 5 3 3 2 1 7 2




0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min

-10

0

10

20

30

40

50

mAU520nm,4nm (1.00)

/ 2 4 . 7

7 5 / 8 3 1 0 0 3

Hình 3.7: S ắc ký đồ dung d ịch chuẩ n g ố c cyanidin chloride 10 µg/mL

Hình 3.8: S ắc ký đồ dung d ịch bilberry chiế t bằ ng methanol:HCl2N(80:20)

Bảng 3.3. K ế t quả định lượ ng Anthocyanin trong mẫ u bột Bilberry theo dungmôi dùng để chiế t mẫ u

Dung môi(MeOH:HCl

2N)

Lƣợ ngcânmẫu(g)

V(ml)

Hệ số pha

loãng

Diện tíchpic

(mAU.s)

C(µg/mL )

C(mg/g)

C(mg/

g)

90:10 1,1274 10 20 4288860 100,15 17,7717,0890:10 1,2651 10 20 4435760 103,58 16,38

80:20 1,2612 10 20 12408893 289,76 45,9546,40

80:20 1,2072 10 20 12088943 282,29 46,77

70:30 0,9886 10 20 4637757 108,30 21,9121,00

70:30 1,0481 10 20 4509380 105,28 20,09

60:40 1,2314 10 20 2802257 65,44 10,639,79

60:40 1,5233 10 20 2916390 68,10 8,94

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

0

250

500

750

mAU520nm4nm (1.00)

/ 2 4 . 8

3 0 / 1 0 4 2 8 8 9 3




Như vậy, k ết quả khảo sát thực nghiệm (Bảng 3.3) cho thấy ở mẫu bột

Bilberry khi chiết vớ i MeOH: HCl 2N (80:20) ở 150 phút cho hàm lượ ng

Anthocyanin cao nhất. Do vậy dung môi chúng tôi lựa chọn để chiết mẫu làmethanol acid hóa bằng acid chlorid 2N vớ i tỷ lệ 80:20 và quy trình xử lý

mẫu trướ c khi phân tích Anthocyanin gồm các bước như sau:

- Cân chính xác một lượ ng 0,1091g mẫu bột Bilberry vào ống ly tâm 15 mL.

- Thêm khoảng 10 mL hỗn hợ p methanol acid hóa bằng HCl 2N (80:20) vào

ống ly tâm.

- Lắc xoáy ống ly tâm 5 phút, sau đó lắc siêu âm 15 - 30 phút ở nhiệt độ

phòng.

- Thủy phân ở nhiệt độ 800C trong 150 phút

- Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút

- Gạn lấy phần dịch, định mức 10,0 mL bằng methanol : HCL 2N (80:20) và

lọc qua màng lọc 0,45 µm.

- Tiêm vào hệ thống sắc kí HPLC, HPTLC (pha loãng nếu cần).

3.4. Thẩm định phƣơng pháp [6]

3.4.1. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu:

Phân tích đồng thờ i 04 mẫu: mẫu dung dịch chuẩn Cyanidin chlorid,

dung dịch bilberry sau khi thủy phân, mẫu tr ắng và mẫu tr ắng thêm chuẩn

trên hệ thống HPLC và HPTLC. K ết quả thu được như sau:

Đối vớ i HPLC:

-

Sắc đồ mẫu tr ắng không xuất hiện pic nào tại thời gian lưu của Cyanidin

trên mẫu chuẩn và mẫu tr ắng thêm chuẩn.

- Mẫu tr ắng thêm chuẩn xuất hiện 01 pic tại thời gian lưu của Cyanidin trên

mẫu chuẩn và 02 pic này có dạng phổ hấ p thụ UV-VIS giống nhau.

- Pic Cyanidin trên mẫu chuẩn và mẫu tr ắng thêm chuẩn có độ tinh khiết pic

(peak purity) lớn hơn 0.995.




Như vậy phương pháp có độ đặc hiệu và độ chọn lọc cao, đạt yêu cầu sử dụng

để phân tích Anthocyanin trong thực phẩm chức năng.

Hình 3.9: S ắc ký đồ dung d ịch chuẩ n bilberry sau thủ y phân

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

-250

0

250

500

750

1000

1250

mAU520nm,4nm (1.00)

/ 0 . 3

2 0 / 7 2 4 3 3

/ 2 3 . 1

3 7 / 6 5 2 5 5 3 2

Hình 3.10: S ắc ký đồ dung d ịch chuẩ n cyanidin chloride 50 µg/mL

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

mAU520nm,4nm (1.00)

/ 2 3 . 2

2 7 / 2 1 4 1 2 0 6

Hình 3.11: S ắc ký đồ của mẫ u thự c phẩ m chức năng không chứ a anthocyanin.




Hình 3.12: S ắc ký đồ của mẫ u thự c phẩ m chức năng không chứ a anthocyanin

đượ c thêm chuẩ n cyanidin.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min-10

0

10

20

30

40

50

mAU520nm,4nm (1.00)

/ 2 3 . 3

1 4 / 5 9 7 8 6 3

Đối vớ i HPTLC:

- Sắc ký đồ của mẫu tr ắng thêm chuẩn cho các vết chính có cùng hình

dạng, màu sắc, giá tr ị Rf vớ i các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn.

- Sắc ký đồ các mẫu tr ắng không xuất hiện các vết tương ứng vớ i các vết

chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu tr ắng thêm chuẩn:

Hình 3.13: S ắc đồ mẫ u thự c phẩ m chức năng không chứa anthocyanin đượ c

thêm chuẩ n trên HPTLC




3.4.2. Tính thích hợ p hệ thống:

Đối vớ i HPLC:

Phân tích lặ p lại 07 lần dung dịch chuẩn Bilberry sau khi đã thủy phântrên hệ thống HPLC với các điều kiện đã lựa chọn ở trên. Tính độ lặ p lại về

thời gian lưu và diện tích pic thu đượ c. K ết quả thu được như sau:

Bảng 3.4: K ế t quả đánh giá độ thích hợ p hệ thố ng vớ i dung d ịch Bilberry trên HPLC

Lần phântích

Thời gian lƣu (phút)

Diện tích pic(mAU.s)

Lần 1 24,798 2304047

Lần 2 24,820 2378300

Lần 3 24,832 2308276

Lần 4 24,828 2366502

Lần 5 24,842 2389406

Lần 6 24,857 2390784Lần 7 24,858 2380071

TB 24,834 2359627

SD 0,0212 37411

RSD (%) 0,085 1,59

Nhận xét: Từ các k ết quả ở bảng trên nhận thấy: độ lặ p lại của thời gian lưu

và diện tích pic thu đượ c có giá tr ị RSD (%) đều nhỏ hơn 2%. Như vậy hệ

thống HPLC đạt yêu cầu để phân tích Anthocyanin trong các mẫu thực phẩm

chức năng.


Phân tích lặ p lại 08 lần dung dịch chuẩn Bilberry sau khi đã thủy phân ở

các nồng độ khác nhau trên hệ thống HPLC với các điều kiện đã lựa chọn ở




trên. Tính độ lặ p lại về hệ số di chuyển và diện tích pic thu đượ c. K ết quả thu

được như sau:

Bảng 3.5: K ế t quả đánh giá độ thích hợ p hệ thố ng vớ i dung d ịch Bilberry trên HPTLC

Lần phân tích RfDiện tích pic

(mAU.s)

Lần 1 0,3989 53723,78

Lần 2 0,3894 54768,98

Lần 3 0,3894 54096,38

Lần 4 0,3856 53624,00

Lần 5 0,3894 55180,95

Lần 6 0,3894 54046,61

Lần 7 0,3932 56691,12

TB 0,3925 54685,00

SD 0,006 1036,5

RSD (%) 1,59 1,89

Từ các k ết quả ở bảng trên nhận thấy: độ lặ p lại của R f và diện tích

pic thu đượ c có giá tr ị RSD (%) đều nhỏ hơn 2%. Như vậy hệ thống HPTLC

đạt yêu cầu để phân tích Anthocyanin trong các mẫu thực phẩm chức năng.

3.4.3. Khoảng tuyến tính:

Đối vớ i HPLC:

Phân tích dãy dung dịch chuẩn Cyanidin có các nồng độ 50ppm, 20ppm,

10ppm, 5ppm, 2ppm, 1ppm, 0,5ppm, 0,2ppm từ dung dịch chuẩn gốc 100ppm

r ồi tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC. Xây dựng đườ ng chuẩn biểu hiện

mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương

ứng. K ết quả thu được như sau:




Bảng 3.6. K ế t quả đánh giá độ tuyế n tính của chấ t chuẩ n cyanidin chloride

Nồng độ (µg/mL)

0,5 1 2 5 10 20 50 100


20329 41528 91128 230863 475605 872719 2141206 4436713

PT đƣờ ngchuẩn

Y=44066x+ 777.12

R 2 0,9996

Hình 3.14 Đườ ng chuẩ n dung d ịch g ố c Cyanidin chloride

Ngoài ra để khảo sát thêm độ phù hợ p của đườ ng chuẩn, từ đườ ng chuẩn thuđượ c và từ diện tích pic chúng tôi đã tính lại nồng độ tương ứng của cyanidin,

từ đó xác định các giá tr ị độ lệch so với điểm chuẩn ban đầu. K ết quả như ở bảng 3.7.

Bảng 3.7: Độ l ệch của t ừng điể m chuẩ n dùng xây d ựng đườ ng chuẩ n

Nồng độ ban đầu(µg/mL)


Nồng độ đƣờ ng chuẩn(µg/mL)

Độ lệchBias (%)

100 4436713 100,67 0,67

50 2141206 48,57 -2,8020 872719 19,79 -1,06

10 475605 10,78 7,75

5 230863 5,22 4,43

2 91128 2,05 2,52

1 41528 0,93 -7,52

0,5 20329 0,44 -11,2

0,2 7026 0,14 -30

y = 44066x + 777.12R² = 0.9996

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

0 20 40 60 80 100 120




Nhận xét: Từ các k ết quả ở bảng và hình vẽ trên ta thấy: đườ ng chuẩn có

R 2=0,9996, các giá tr ị độ lệch so với điểm chuẩn ban đầu cũng đều nằm trong

giớ i hạn ±15% theo yêu cầu của nhiều tổ chức Mỹ, Canada, châu Âu [6]. Nhưvậy, đườ ng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic vớ i

nồng độ cyanidin chloride (0,5 – 100 ppm) tương ứng là đạt yêu cầu và đượ c

chấ p nhận theo AOAC [6]. Ở nồng độ 0,2 ppm thì độ lệch là 30% vượ t quá

mức yêu cầu (<15%) nên khoảng nồng độ tuyến tính là 0,5 – 100 ppm.


Phân tích dãy dung dịch chuẩn bilberry có các nồng độ 50ppm, 20ppm,10ppm, 5ppm, 2ppm, 1ppm từ dung dịch chuẩn bilberry r ồi tiến hành phân

tích trên hệ thống HPTLC. Xây dựng đườ ng chuẩn biểu hiện mối quan hệ

tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương ứng. K ết quả thu

được như sau:

Bảng 3.8. K ế t quả đánh giá độ tuyế n tính của chấ t chuẩ n bilberry

Nồng độ (µg/mL)

10 20 20 50 50


188 654 683 1972 1997

PT đƣờ ng chuẩn Y= 44,464x – 235,13

R 2 0,9994

Hình 3.15 Đườ ng chuẩ n dung d ịch bilberry trên HPTLC

y = 44.464x - 235.13R² = 0.9994

0

500

1000

1500

2000

2500

0 10 20 30 40 50 60




Nhận xét: vớ i giá tr ị r > 0.90, nhận thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ cyanidin chloride và diện tích pic sắc ký.

3.4.4. Giớ i hạn phát hiện, giớ i hạn định lƣợ ng:

Trong phương pháp phân tích HPLC này để phù hợ p vớ i mục đích phát

hiện anthocyanin trong các thực phẩm chức năng ta tiến hành xác định LOD

như sau: pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợ p làm việc nhiều lần bằng hốn hợ p

methanol: HCl 2N (80:20) cho đến khi không còn thu được đáp ứng pic của

cyanidin chloride trên sắc ký đồ. K ết quả thực nghiệm khi xây dựng đườ ng

chuẩn thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và tỷ lệ

diện tích pic chuẩn tương ứng cho thấy điểm nồng độ thấ p nhất trên đườ ng

chuẩn là 0,5ppm. Chính vì thế chúng tôi xác định đây chính là giớ i hạn định

lượ ng (LOQ) của phương pháp phân tích này. Ở mức nồng độ cyanidin

chloride là 0,2 µg/mL (nồng độ dung dịch tiêm sắc ký), trên sắc ký đồ cho pic

cyanidin chloride có đáp ứng cao khoảng gấ p 3 lần (Hình 3.15) dao động

đườ ng nền. Như vậy, phương pháp đã xây dựng có giớ i hạn phát hiện (LOD)

là 0,2 µg/mL, còn giớ i hạn định lượ ng (LOQ) là 0,5 µg/mL vớ i cyanidin

chloride, tính theo nồng độ dung dịch tiêm sắc ký.

Hình 3.16 S ắc ký đồ dung d ịch chuẩ n cyanidin chloride 0,5 µg/mL.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

-5

0

5

10

15

20

25

mAU520nm,4nm (1.00)

/ 2 3 . 1

9 0 / 2 0 3 2 9




0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

-2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

mAU520nm,4nm (1.00)

/ 2 3 . 2

2 5 / 7 0 2 6

Hình 3.17 S ắc ký đồ dung d ịch chuẩ n cyanidin chloride 0,2 µg/mL

Đối với phương pháp HPTLC, theo như đườ ng chuẩn và k ết quả thực nghiệmcho thấy ở mức nồng độ 10ppm trên sắc đồ mớ i xuất hiện vết của cyanidin

chloride. Như vậy phương pháp này có giớ i hạn phát hiện, định tính là

10ppm.

3.4.5. Độ thu hồi của phƣơng pháp

Đối vớ i HPLC:

Độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách thêm chuẩn cyanidin

vào nền mẫu thực phẩm chức năng không chứa anthocyanin qua đánh giá sơ

bộ và xác định tỷ lệ (%) thu hồi của chuẩn cyanidin chloride khi xử lý mẫu và

phân tích theo quy trình đã xây dựng. Độ thu hồi của phương pháp đượ c thẩm

định trên 1 nền mẫu dạng dung dịch. K ết quả phân tích thực nghiệm đượ c tậ p

hợ p trong

Bảng 3.9: Độ thu hồi của phương pháp HPLC vớ i mẫ u thự c phẩ m chức năngd ạng dung d ịch

Lần phântích

Lƣợ ngchuẩn

Bilberrythêm vào

(g)

Lƣợ ngchuẩn

cyanidinthêm vào

(mg)

Diện tích(mAU.s)

Lƣợ ngchuẩn

cyanidin tìmlại đƣợ c

(mg)

Độ thu hồi(%)

01 0,0753 3,47 723845 3,28 94,50

02 0,0822 3,79 871975 3,95 104,30




03 0,0721 3,32 714230 3,23 97,38

04 0,0679 3,13 632629 2,86 91,57

05 0,0744 3,43 721234 3,27 95,29

06 0,0715 3,29 691365 3,13 95,04

07 0,0737 3,39 721305 3,27 96,21

08 0,0746 3,44 723845 3,28 95,38

09 0,0718 3,31 731891 3,32 100,20

10 0,0841 3,87 908088 4,12 106,16

Trung bình 97,61SD 4,59

RSD (%) 4,70

Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ >10 ppm-10 µg/mL, độ thu hồi

của phương pháp phải đạt là 80-110% [6]. Từ bảng k ết quả trên ta thấy

cyanidin chloride có hiệu suất thu hồi đều nằm trong giớ i hạn cho phép. Như

vậy phương pháp có độ thu hồi đạt yêu cầu của AOAC khi phân tích cyanidin

trong việc phân tích TPCN.


Bảng 3.10: Độ thu hồi của phương pháp HPTLC vớ i mẫ u thự c phẩ m chứ c

năng dạng dung d ịch

Lần phântích

Lƣợ ngchuẩn

Bilberrythêm vào (g)

Lƣợ ngchuẩn

cyanidinthêm vào

(mg)

Diện tích(mAU.s)

Lƣợ ng chuẩncyanidin tìm lại

đƣợ c (mg)

Độ thuhồi(%)

01 0,0753 3,47 998 2,77 79,8902 0,0822 3,79 996 2,76 73,0703 0,0721 3,32 478 3,21 96,4904 0,0679 3,13 472 3,18 101,6005 0,0737 3,39 539 3,48 102,4706 0,0746 3,44 524 3,41 99,2807 0,0718 3,31 509 3,34 101,1108 0,0841 3,87 458 3,12 80,41

Trung bình 91,79SD 11,94

RSD (%) 13,01




Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ >10 ppm-10 µg/mL, độ thu

hồi của phương pháp phải đạt là 80-110% [6]. Từ bảng k ết quả trên ta thấy

cyanidin chloride có độ lệch tương đối RSD (%) là 13,01 (>10) nên khôngtrong giớ i hạn cho phép (<10). Như vậy phương pháp có độ thu hồi không đạt

yêu cầu của AOAC khi phân tích cyanidin trong việc phân tích TPCN.

3.4.6. Độ lặp lại của phƣơng pháp

Đối vớ i HPLC:

Khảo sát trên 1 nền mẫu bột đông khô bilberry có phát hiện

anthocyanin, 11 mẫu viên nang mềm (NM01) đượ c thêm mẫu chuẩn bilberry.Xử lý mẫu và tiêm mẫu vào hệ thống HPLC ở các điều kiện đã chọn. Độ lặ p

lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn

tương đối. K ết quả phân tích thực nghiệm đượ c tậ p hợ p trong Bảng 3.11, 3.12

vớ i mẫu bột đông khô và nền mẫu nang mềm thêm chuẩn:

Bảng 3.11: Độ l ặ p l ại của phương pháp HPLC vớ i mẫ u bột đông khô Bilberry

TT m (g) V (ml) k S(mAU.s) C (µg/ml)HL

(mg/g)

01 0,1091 10 10 2222200 50,41 46,20

02 0,1199 10 10 2357751 53,48 44,61

03 0,1123 10 10 2324916 52,74 46,96

04 0,1205 10 10 2485572 56,39 46,79

05 0,1181 10 10 2451800 55,62 47,09

06 0,1201 10 10 2500763 56,73 47,2307 0,1286 10 10 2542623 57,68 44,85

08 0,1292 10 10 2574504 58,41 45,21

TB (mg/g) 46,12

SD 1,08

RSD (%) 2,33




Bảng 3.12: Độ l ặ p l ại của phương pháp HPLC trên nề n mẫ u nang mề m thêm

chuẩ n

Lƣợ ngnangcứng

01 (g)

Lƣợng cyanidintrongNC01(mg)

Lƣợng thêmchuẩn

Bilberry (g)

Lƣợng Cyanidinthêmchuẩn(mg)

S (mAu.s)

C(ppm)

C (mg/g)

Hiệusuất (%)

0,1587 3,66 0,0811 3,74 3423451 77,67 7,76 109,64

0,2195 5,20 0,1162 5,35 4717476 107,03 10,70 102,60

0,1419 3,08 0,0796 3,67 3082064 69,92 6,99 106,40

0,1503 3,26 0,0909 4,19 3313951 75,18 7,52 101,49

0,2032 4,41 0,1077 4,96 4314001 97,88 9,78 108,20

0,2176 4,72 0,1141 5,25 4596376 104,28 10,43 108,37

0,2458 5,34 0,1305 6,01 5360822 121,61 12,16 113,39

0,1855 4,03 0,0924 4,26 3914547 88,81 8,88 113,82

0,1861 4,04 0,0967 4,45 3986562 90,45 9,04 112,13

0,2367 5,14 0,1205 5,55 4844665 109,92 10,99 105,28

0,2205 4,79 0,1296 5,97 5092536 115,54 11,55 113,15

Trung bình 108,58

RD 4,32

RSD (%) 3,98

Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ 100ppm-100 µg/mL, độ lặ p

tối đa chấ p nhận có giá tr ị RSD(%) là 5,3, còn tại mức 1000 ppm thì giá tr ị tối

đa của RSD(%) là 3,7 [6]. Từ bảng k ết quả trên ta thấy cyanidin có độ lặp đềunằm trong giớ i hạn cho phép. Như vậy phương pháp có độ lặp đạt yêu cầu của

AOAC khi phân tích cyanidin trong viên nang.





Bảng 3.14: K ế t quả phân tích Anthocyanin trong thự c phẩ m chức năng

Trong đó dấu “-“: không phát hiện hoặc dưới ngưỡ ng phát hiện của

phương pháp. Bảng k ết quả sau khi phân tích các mẫu thực phẩm chức năng ở bảng trên cho

thấy r ằng không phải tất cả các sản phẩm công bố là có chứa Anthocyanin

đều đạt chất lượ ng. Chính vì vậy chúng ta cần có biện pháp kiểm soát chặt

chẽ hơn đối vớ i các sản phẩm này trên thị trườ ng.

SttMã sản

phẩm

Dạng bào

chế

Nhà sản xuất, hàm lƣợ ng

Anthocyanin trong 1 viên

Hàm

lƣợ ngAnthocya

nin

(mg/viên)

1 NM01 Nang mềmFactor group of Nutritional

Companies Inc (100mg)39,67

2 NM02 Nang mềmLife Cycle Herbal Products Inc

(25mg)19,59

3 NM03 Nang mềmCông ty St. Paul Brands – Mỹ

(100mg) 0,12

4 NM04 Nang cứngYunan Baian Medicinal Science&

Technology co., LTD (100mg)1,23

5 NM05 Nang cứng Laboratoriya SovremennogoZdorovya – LBN (320mg)

99,28

6 DD01 Nước USA O&K trading -

7 NC01 Nang cứngAtrapharmaceuticals PVT-LTD

(450mg)0,74

8 NC02 Nang cứng Parmachem Lobotorie (250mg) 8,73

9 NC03 Nang cứngAFC- HD AMS Life Science Co.

Ltd (120mg)5,76

10 DD02 Nướ c Hankook Drink. Co. Ltd -

11 DD03 Nướ c Paginbio Co. Ltd -




CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN

4.1. Xây dự ng quy trình k ỹ thuật:

4.1.1.

Lự a ch ọn phương pháp:

Anthocyanin có cấu trúc vòng chứa nhiều nối đôi, có khả năng hấ p thụ

UV mạnh, đây là cơ sở để chúng tôi thực hiện định lượ ng bằng phương pháp

HPLC vớ i Detector PDA. Ngoài ra trên cấu trúc của Anthocyanin còn có

nhiều nhóm – OH tự do, phân cực mạnh và dễ đồng tan vớ i dung môi phân

cực khác như nước, methanol, ethanol,…thích hợ p cho việc tiến hành sắc ký

trên cột sắc ký pha đảo.Mặt khác HPLC là phương pháp có nhiều ưu điểm: có độ đặc hiệu, độ

nhạy cao, k ết quả chính xác và HPTLC là phương pháp mớ i, tiến hành đượ c

trên một số lượ ng mẫu lớn, có ưu điểm là khá đơn giản, có độ nhạy cao, có

tính kinh tế và tiết kiệm thờ i gian phân tích. Dựa vào các đặc điểm trên chúng

tôi tiến hành xây dựng quy trình phân tích anthocyanin bằng cả hai phương

pháp và lựa chọn phương pháp tối ưu góp phần vào việc tiêu chuẩn hóa chấtlượ ng thực phẩm chức năng chứa anthocyanin thúc đẩy việc quản lý chất

lượ ng sản phẩm.

4.1.2. Điều ki ện x ử lý m ẫ u:

Xử lý mẫu trong phân tích là bướ c vô cùng quan tr ọng, nó là một trong

những yếu tố ảnh hưở ng r ất lớn đến hiệu xuất, đến độ chính xác của k ết quả

phân tích. Chính vì thế lấy mẫu như thế nào, lấy bao nhiêu mẫu tùy thuộc vào

mục đích của nghiên cứu. Trong quy trình này của chúng tôi mục đích lấy

mẫu để đánh giá tính khả thi của quy trình xem quy trình có phù hợp để đánh

giá hàm lượ ng anthocyanin trong thực phẩm chức năng hay không. Vì vậy

chúng tôi lấy ngẫu nhiên trên thị trườ ng hà nội vớ i số lượ ng mẫu không nhiều

(11 mẫu) và đượ c bào chế dướ i nhiều dạng khác nhau. Một số nghiên cứu đã

sử dụng hỗn hợ p acid phosphoric/methanol, acid chlohydric/methanol, acid




formic/methanol…để chiết mẫu cho k ết quả tốt [32], [33], [22]. Qua nghiên

cứu và thử nghiệm chúng tôi thấy r ằng chiết mẫu bằng cách thủy phân mẫu

vớ i dung môi HCl 2N/methanol (20:80) trong 150 phút ở nhiệt độ 80

0

C chohiệu quả tốt, đạt yêu cầu phân tích.

Sơ đồ xử lý mẫu

Nghiền nhỏ

Pha loãng nếucần Pha loãncầ

10 ml dung môiMeOH:HCl 2N(80:20)

Rung siêu âm 10 – 15 phút

Thủy phân 800C trong2,5h

Ly tâm 5 phút, 6000

vòng/phút

10 viên nang cứng 10 viên nang mềm

1-2 g mẫu 1-2 g mẫu

Gạn lấy dịch chiết Gạn lấy dịch chiết

40 ml dịch

Nghiền nhỏ

10 ml dung môiMeOH:HCl

Rung siêu âm 10 – 15 phút

Thủy phân 800Ctrong 2,5h

10 ml dung môiHCl 2N

Lọc lấy dịch chiết

Rung siêu âm 10 – 15 hút

Thủy phân 800Ctrong 2,5h

Định mức 50 ml Định mức 10 mlĐịnh mức 10 ml

Dịch tiêm mẫu

Dịch qua cột SPE

Hoạt hóa cột: bằng các dm6mL methanol, 6mL nướ c

Nạ p dịch lên cột: tốc độ khôn uá 2 ml/ hút

R ửa lấy dịch: 2 mLmethanol/lần × 2 lần.

R ửa, loại tạ p chất: 6mL nướ c

Ly tâm 5 phút,6000 vòn / hút




4.1.3.

Xây d ự ng phương pháp định lượ ng

Cùng vớ i việc tham khảo tài liệu và thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn

đượ c quy trình phân tích Anthocyanin trong các thực phẩm chức năng chứa

anthocyanin, các thông số chạy máy quan tr ọng như sau:

HPTLC: thể tích tiêm mẫu là 5µL, bướ c sóng phát hiện và định lượ ng

là 520nm,quét sắc đồ ở 520 nm, tốc độ 20 mm/giây, pha tĩnh là silica gel 60

F254, thành phần pha động là Ethyacetate: aicd formic: nướ c (10:2:3;v/v/v)

HPLC: thể tích bơm mẫu là 50 µL; bướ c sóng phát hiện và định lượ ng đối vớ i

Anthocyanin là 520 nm; cột sắc ký C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6mm; 5µm) vớ i tiền cột cùng loại; tốc độ pha động là 1 mL/phút; nhiệt độ

buồng cột là 400C; thành phần pha động gồm acetonitril và 2% TCA, 1%

Amoniacetate, 2% THF ( pH 2,5) chạy theo chương trình gradient nồng độ.

Các thông số phù hợ p với điều kiện phòng thí nghiệm và vớ i hệ thống HPLC

của chúng tôi. Điểm khác trong đề tài của chúng tôi là đã lựa chọn đượ c

chương trình gradient giúp rửa giải đượ c anthocyanin một cách hiệu quả trênmẫu và thờ i gian cho mỗi lần phân tích chỉ mất 26 phút trong khi các nghiên

cứu trước đó [22], [16], [33], [24] thì thờ i gian phân tích khá dài (trên 40

phút).

Quy trình xử lý mẫu của chúng tôi lựa chọn đơn giản, có khả năng làm sạch

đượ c mẫu, giúp cho việc xác định và định lượ ng các chất trên sắc đồ dễ dàng,

điều này đượ c khẳng định thông qua k ết quả khảo sát dung môi ở trên.Phương pháp của chúng tôi đượ c thẩm định phù hợ p vớ i các yêu cầu của

AOAC. Khoảng tuyến tính của Anthocyanin r ộng từ 0,5 – 100 ppm. So sánh

k ết quả vớ i nghiên cứu của tác giả Dolores Muller và các cộng sự [12] có

khoảng tuyến tính từ 15 - 159 ppm, của tác giả Brown et al (2005) có khoảng

tuyến tính là 15 - 182 ppm, của tác giả Teow et al (2007) có khoảng tuyến

tính là 24,6 – 258 ppm cho thấy nghiên cứu của chúng tôi có khoảng nồng độ




tuyến tính r ộng hơn, Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượ ng (LOD = 0,2

ppm, LOQ = 0,5 ppm) cũng bằng hoặc nhỏ hơn vớ i các nghiên cứu sử dụng

HPLC ở trên [32], [12]. Tác giả Teow et al (2007) cho k ết quả giớ i hạn pháthiện và giớ i hạn định lượ ng lần lượ t là 24,6 – 43 ppm, tác giả Brown et al

(2005) cho giớ i hạn phát triển và giớ i hạn định lượ ng là 15 ppm, 38 ppm.

Để khẳng định lựa chọn phương pháp HPLC là phù hợ p trong phân tích

anthocyanin trong các mẫu thực phẩm chức năng chứa nó, chúng tôi tiến hành

thử nghiệm phân tích hàm lượ ng anthocyanin trong mẫu bột đông khô

bilberry chuẩn với phương pháp của AOAC. Mẫu sau khi tr ải qua quá trình

xử lý thì đượ c pha loãng 100 lần vớ i 2 dung dịch là pH 1 và pH 4 (theo

AOAC) và đem đi đo UV ở bước sóng 520 và 700 thì thu đượ c k ết quả như

sau:

STTLƣợng

cân mẫu pH 1 pH 4 Hàm lƣợng

mg/g520 700 520 7001 0,0945 0,499 0,038 0,132 0,056 44,422 0,0945 0,501 0,032 0,138 0,053 44,30

3 0,0908 0,428 0,048 0,136 0,05 35,304 0,0908 0,429 0,049 0,138 0,05 35,065 0,0914 0,465 0,047 0,196 0,063 33,996 0,0914 0,047 0,048 0,187 0,06 35,197 0,0938 0,429 0,046 0,155 0,056 33,018 0,0938 0,43 0,046 0,154 0,054 33,019 0,0893 0,536 0,047 0,187 0,059 44,0710 0,0893 0,537 0,046 0,186 0,055 43,95

Hàm lƣợng trung bình 38,23RD 5,19

RSD(%) 13,57

Bảng k ết quả 3.11 cho thấy mẫu bột đông khô bilberry chuẩn theo

phương pháp HPLC cho thấy hàm lượ ng (mg/g) là 46,12% và độ lệch tương

đối của phương pháp là 2,33, còn theo AOAC hàm lượ ng anthocyanin đạt

đượ c là 38,23% và độ lệch tương đối theo phương pháp này là 13,57. Nhìn

k ết quả trên chúng ta có thể thấy được khi định lượ ng anthocyanin bằng

phương pháp HPLC có độ chính xác cao hơn, hiệu xuất tốt hơn, ít sai số hơn.




Điều này một lần nữa khẳng định r ằng quy trình định lượ ng anthocyanin bằng

phương pháp HPLC là phù hợp hơn cả.

4.1.4.

Th ẩm định phương pháp đã xây dự ng

o Tính thích hợ p của hệ thố ng

K ết quả thẩm định tính thích hợ p của hệ thống cho thấy :

Vớ i HPLC: RSD% của thời gian lưu là 0,085 và diện tích pic là 1,59

đều nằm trong giớ i hạn chấ p nhận được. Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký

lỏng hiệu năng cao phù hợ p cho việc định lượ ng anthocyanin trong thực phẩm

chức năng. Vớ i HPTLC: RSD % của giá tr ị Rf là 1,59 và diện tích pic là 1,99, đều

nhỏ hơn 2 nên nằm trong giớ i hạn chấ p nhận đượ c. Chính vì thế hệ thống

HPTLC cũng phù hợ p cho việc đinh lượ ng anthocyanin trong thực phẩm chức

năng.

o

Khoảng nồng độ tuyến tính , LOD, LOQ

Chúng tôi đã xây dựng khoảng tuyến tính đủ rộng để ứng dụng đánh

giá nhiều chỉ tiêu về hàm lượng. Khoảng nồng độ tuyến tính của hệ thống

HPLC là 0,5 – 100 ppm có biên độ dưới cao hơn so với một vài nghiên cứu

trước.

Trong khoảng nồng độ tuyến tính (0,5 – 100 ppm) hệ số tương quan

hồi quy của phương pháp HPLC có r 2 = 0.9996. Phương pháp HPTLC trong

khoảng nồng độ tuyến tính (10-50 ppm) có r 2 = 0.9994. Điều này cho thấy có

sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích với nồng độ của chất phân

tích ở cả hai phương pháp. Tuy nhiên kết quả LOD, LOQ ở 2 phương pháp

trên cũng cho thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao hơn, khoảng nồng độ

tuyến tính cao, khả năng phát hiện và định lượng anthocyanin ở khoảng nồng

độ rộng hơn, giới hạn phát hiện dưới thấp hơn với nồng độ rất nhỏ (0,5ppm)

còn phương pháp HPTLC thì có giới hạn phát hiện ở nồng độ cao hơn 20 lần




(10ppm). Đây cũng là bước đầu thể hiện hệ thống HPLC phù hợp hơn, tối ưu

hơn HPTLC khi xác định hàm lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng.

o

Độ lặp lại của phương pháp Kết quả thẩm định độ lặp lại: với phương pháp HPLC trên mẫu chuẩn

bilberry cho giá trị RSD % về hàm lượng là 2,33; trên mẫu NM01 thêm chuẩn

bilberry là 3,98. Trong khi giá trị trên mẫu NM01 thêm chuẩn ở phương pháp

HPTLC là 10,13. Điều đó cho thấy phương pháp HPLC có độ chính xác cao

hơn rất nhiều so với phương pháp HPTLC. Từ nghiên cứu này có thể áp dụng

phương pháp HPLC để định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng

còn áp dụng HPTLC để phát hiện nhanh khi tiến hành kiểm tra chất lượng chế

phẩm (định tính).

o Độ thu hồi

Kết quả thẩm định độ thu hồi với phương pháp HPLC trên mẫu TPCN

không có anthocyanin và được thêm chuẩn bilberry cho giá trị RSD % về hàm

lượng là 4,70 và với phương pháp HPTLC là 13,01 . Điều đó cho thấy

phương pháp HPLC có độ đúng, độ thu hồi cao hơn rất nhiều so với phương

pháp HPTLC. Từ k ết quả thực nghiệm trong suốt quá trình nghiên cứu trên 2

phương pháp này chúng tôi thấy HPLC là phương pháp được lựa chọn trong

việc xác định hàm lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng nên có thể

áp dụng phương pháp HPLC để định lượng anthocyanin trong thực phẩm

chức năng còn áp dụng HPTLC để phát hiện nhanh khi tiến hành kiểm tra

chất lượng chế phẩm (định tính).




K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

K ẾT LUẬN

Sau khi hoàn thành nghiên cứu này, trên cơ sở nghiên cứu các điều kiệnthực nghiệm, vớ i mục đích ứng dụng phương pháp HPLC, HPTLC để xáchàm lượ ng anthocyanin, chúng tôi thu đượ c k ết quả như sau: Xây dựng được phương pháp định lượ ng anthocyanin trong các thực

phẩm chức năng chứa anthocyanin tr ải qua 2 giai đoạn: Giai đoạn xử lý mẫu: mẫu đượ c chiết bằng methanol : HCl 2N (80:20),

lắc xoáy, rung siêu âm, thủy phân 150 phút ở nhiệt độ 800, định mức, lọcr ồi tiến hành chạy sắc ký đối vớ i viên nang, chạy SPE lấy dịch chạy sắc

ký đối vớ i mẫu dạng dung dịch.

Giai đoạn phân tích bằng HPTLC:

o Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254 (20×10)

o Pha động: Ethylacetate: acid formic: nướ c (10:2:3;v/v/v)

o Quét sắc đồ ở 520 nm, tốc độ 20 mm/giây

o Thể tích tiêm mẫu: 5 µL

Giai đoạn phân tích bằng HPLC với điều kiện:o

Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) và tiền

cột cùng loại.

o Pha động: chạy theo chương trình gradient nồng độ

Kênh A:2% TCA, 1% Amoniacetate, 2%THF (pH 2,5), Kênh B: Acetonitril

Thờ i gian (phút) 0 2 22 23 26

Thành phần pha động (%)A 90 90 70 70 90

B 10 10 30 30 10

o Nhiệt độ cột: 400C

o Tốc độ dòng: 1 mL/phút

o Thể tích tiêm mẫu: 50 µL

o

Detector PDA với bướ c sóng phát hiện là 520 nm




Phương pháp đã xây dựng đã xác định đượ c khoảng tuyến tính và xâydựng được đườ ng chuẩn cho anthocyanin, xác định đượ c LOD, LOQ củaanthocyanin, có độ chọn lọc, độ lặ p lại, độ thu hồi tốt. Độ lặ p lại và độ thu hồi

đáp ứng yêu cầu của AOAC.

Áp dụng quy trình phân tích ở trên để xác định hàm lượ ng anthocyanin

trong 11 mẫu thực phẩm chức năng gồm cả viên nang cứng, nang mềm vàdạng dung dịch. K ết quả cho thấy, có 1 số mẫu không phát hiệnanthocyanin trong nghiên cứu. Đây là một k ết quả đáng báo động về tìnhtr ạng lạm dụng anthocyanin trong các thực phẩm chức năng, đặt ra mộtyêu cầu cần phải kiểm soát chặt chẽ hơn các thực phẩm này.

Từ các k ết quả thu đượ c, nhận thấy phương pháp HPLC là tối ưu hóa trongviệc xác định anthocyanin trong các thực phẩm chức năng và phương phápHPTLC đượ c lựa chọn để định tính, phát hiện nhanh anthocyanin trong cácmẫu chế phẩm khi cần tiến hành kiểm tra .

KIẾN NGHỊ

- Hai phương pháp trên cho k ết quả xác định anthocyanin có độ tin cậy cao.Cần tiế p tục mở r ộng nghiên cứu trên các đối tượ ng khác ngoài viên nang và

dạng dung dịch như: các loại trà thảo dượ c dạng lỏng, dạng túi, dạng bột, mộtsố loại thuốc, trong máu, nướ c tiểu...

- Nghiên cứu này chỉ thực hiện trên một đối tượ ng mẫu là thực phẩm chứcnăng mà còn r ất nhiều các đối tượ ng mẫu khác chứa anthocyanin mà nghiêncứu chưa đề cậ p tớ i. Vì vậy, cần tiế p tục nghiên cứu sâu hơn, tìm ra phương

pháp xác định hàm lượ ng anthocyanin trên nhiều đối tượ ng mẫu khác.

- Phương pháp này tiến hành trên anthocyanin dạng aglycon. Ngoài ra,

anthocyanin còn r ất nhiều dướ i dạng glycoside. Do đó, cần mở r ộng ngiêncứu trên anthocyanin dạng glycoside trên nhiều đối tượ ng khác nhau.




TÀI LIỆU THAM KHẢO

A.

Tiếng Việt

1. Tr ần Tử An (2010), "Kiểm nghiệm dượ c phẩm", Nhà xuấ t bản Y học, Hà N ội.

2. Tr ần Tử An (2007), "Hóa phân tích- tậ p 2", Nhà xuấ t bản Y học, Hà N ội.

3. Võ Thị Bạch Huệ (2007), Hóa Phân Tích.

4. Huỳnh Thị Thanh Huyền (2011), "Anthocyanin và những nguyên liệu chứa

Anthocyanin", luận văn thạc s ỹ, Trường Đại học K ỹ thuật Công Nghệ tp HCM ,

5. Phạm Luận (2010), "Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao", khoa Hóa học,

Trường ĐHKHTN Hà Nội.

6. Tr ần Cao Sơn (2010), "Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi

sinh vật", Nxb Khoa H ọc và K ỹ Thuật .

B. Tiếng Anh

7. Ajaz Ahmad, M Mujeeb, Bibhu Prasad Panda (2010), "An HPTLC Method for

the Simultaneous Analysis of Compactin and Citrinin in Penicillium citrinum

Fermentation Broth", Journal of Planar Chromatography-modern TLC , 23(4), pp.

282 – 285.

8. Fulcrand. 11. et al (1996), "Structure of new anthocyanin-derived wine pigments", J. Chem. Soc. Perkin Trans, pp. 735-739.

9. S. A. Borman (1982), "HPTLC: taking off", Anal. Chem, 54, pp. 790A-794A.

10.Tibo Cserhati (2007), "Liquid Chromatography of Natural Pigment and

Synthetic Dyes", journal of chromatography library, 71, pp. 63 - 349.

11. Dolores Müller, Markus Schantz, and Elke Richling (2012), "High Performance

Liquid Chromatography Analysis of Anthocyanins in Bilberries (Vaccinium

myrtillus L.), Blueberries (Vaccinium corymbosum L.), and Corresponding Juices",

Institute of Food Technologists, 10, pp. 1750-3841.

12. Dreiseitel A, et al (2009), "Berry anthocyanins and their aglycons inhibit

monoamine oxidases A and B", Pharmacol. Res, 59(5), pp. 306 – 311.

13. Bernard Fried, Joseph Sherma (2007), Thin-Layer Chromatography, pp.







14. Gabriele Korte, Andrea Dreiseitel, Peter Schreier, Anett Oehme, et al Sanja

Locher (2009), "An Examination of Anthocyanins and Anthocyanidins Affinity for

Cannabinoid Receptors", Journal of Medicinal Food , pp. 1407-1410.

15.L. Gao, G. Mazza (2005), "Characterization, Quantitation, and Distribution of

Anthocyanins and Colorless Phenolics in Sweet Cherries", American Chemical

Society, 11, pp. 1057-1109.

16. Georgiana C. Cretu , Gertrud E. Morlock (1 March 2014), "Analysis of

anthocyanins in powdered berry extracts by planar chromatography linked with

bioassay and mass spectrometry", Food Chemistry, Volume 146 , pp.104 – 112

17. Hassan Y. A. (2003), Separation Techniques in Clinical Chemistry.

18. Wu. L.C, R Prior (2005a), "Systematic identification and characterization ofanthocyanins by HPLC- ESI-MS/MS in common foods in the United States: Fruits

and berries", . J. Agric. Food Chem, 53, pp. 2589-2599.

19.Mokina Waksmundzka-Hajino, Joseph Sherma, Teres Kowalska (2008), Thin

Layer Chromatography in Phytochemistry.

20. Nakamura Yuko, Hitoshi Matsumoto, Masashi Morifuji, Hiroyuki Iida, and

Yasuo Takeuchi (2010), "Development and Validation of a LiquidChromatography Tandem Mass Spectrometry Method for Simultaneous

Determination of Four Anthocyanins in Human Plasma after Black Currant

Anthocyanins Ingestion", Agricutural Food Chemistry, 5S, pp. 1174-1179

21. Véronique C hey nier, Camila Gómez, Agnès Ageorges (2012), "Flavonoids:

Anthocyanins", Handbook of analysis of active compounds in functional foods, 18,

pp. 379 - 397.

22. Aracely Castandeca - Ovando, Ma. de Lourdes Pacheco - Hernandez, Ma.

Elena Paez - Hernandez, Jose A. Rodriguez, Andres Galan - Vidal* (2009),

"Chemical studies of anthocyanin: A review", Food Chemistry, 113, pp. 859 - 871.







23. Eike Reich, Anne Schilbli (2007), "High-Performacne Thin-Layer

Chromatography for the Analysis of Medicinal Plants", Thieme Medical

Publishers, Inc, US ISBN 1-58890-409-1.

24. Antonieta Ruiza, Isidro Hermosín-Gutiérrez b, Carola Vergaraa, Dietrich von

Baer a, Antonieta Hitschfelda Moisés Zapataa, Claudia Mardonesa Luis Obandoc

(May 2013), "Anthocyanin profiles in south Patagonian wild berries by HPLC-

DAD-ESI-MS/MS", Food Research International , 51(2), pp. 706 – 713.

25. Suhad S., Humadi, Viorica Istudor (2009), "Quantitative analysis of bioactive

compounds in hibiscus sabdariffa l. extracts. II. quantitative analysis and biological

activities of anthocyanins", Farmacia, 7, pp 77 - 81.

26. Seeram, Navindra P (2008), "Berry Fruits: Compositional Elements,Biochemical Activities, and the Impact of Their Intake on Human Health,

Performance, and Disease", Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(3), pp.

627 – 639.

27. Fossen. T, Andersen, O.M (2000), "Anthocyanins from tubers and shoots of the

purple potato", Solatium tuberosum. J. Ilort Sci. Biotech, 75, pp. 360-363.

28. Takashi Ichiyanagi, Yoshihiko Hanato,

Seiichi Matasugo, and TetsuyaKonishib (2004), "Structural Dependence of HPLC Separation Pattern of

Anthocyanins from Bilberry (Vaccinium myrtillus L.)", Chem Pharm Bull , 52(5),

pp. 628 — 630

29. Berezkin V. (1995), "The discovery of thin layer chromatography", J. Planar

Chro- matogr. — Mod. TLC 8, pp. 401-405.

30. Luigia Longo and Giuseppe Vasapollo, Dipartimento di Ingegneria

dell’Innovazione, Universita di Lecce (2004), "Determination of Anthocyanins in

Ruscus aculeatus L. Berries", Agricultural and food chemitry, 10, pp. 1120-1126.

31. Zhimin Xu, Luke R. Howard (2012), "Analysis Methods of Anthocvanins",

Analysis of Antioxidant-RichPhytochemicals, Chapter 5, pp. 945-978.







PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ hấp thụ UV – VIS của chất chuẩn gốc Cyanidin chloride

peak purity index: 0,999030

Phụ lục 2: Sắc ký đồ thể hiện độ tinh khiết của cyanidin chloride.

Phụ lục 3: Sắc ký đồ mẫu NM01 thêm chuẩn bilberry

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 nm

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

mAU

2 5 0

3 1 1

6 5 4

5 2 7

2 3 2

2 7 2

22.80 22.85 22.90 22.95 23.00 23.05 23.10 23.15 23.20 23.25 23.30 23.35 23.40 23.45 23.50 min

0.00

0.25

0.50

0

10

20

30

mAUPeak

Zero Line

PurityCurve

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

-50

0

50

100

150

200

250

300

mAU520nm,4nm (1.00)

/ 2 3 . 2

4 3 / 3 4 2 3 4 5 1







Phụ lục 4: Sắc ký đồ xác định độ thu hồi trên nền mẫu DD 01 thêm chuẩn

bilberry

Phụ lục 5: Sắc ký đồ xác định độ lặp lại trên nền mẫu thự c phẩm chức năng

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

-10

0

10

20

30

40

50

mAU520nm,4nm (1.00)

/ 2 3 . 3

1 4 / 5 9 7 8 6 3

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

mAU520nm,4nm (1.00)

/ 2 4 . 8

7 5 / 1 9 2 1 9 6 6

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

mAU520nm,4nm (1.00)

/ 2 4 . 8

6 7 / 1 9 8 9

9 9 5





xây dựng quy trình định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương...

Documents