xây dựng quy trình định lượng đồng thời các vitamin b1, b2, b6, b9 trong sản...

8/20/2019 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời các vitamin b1, b2, b6, b9 trong sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ…

http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-dinh-luong-dong-thoi-cac-vitamin-b1-b2 1/112

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢ C HÀ NỘI

LÊ THỊ CÚC

XÂY DỰ NG QUY TRÌNH

ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜ I CÁC

VITAMIN B1, B2, B6, B9 TRONG SẢN

PHẨM DINH DƢỠ NG CÔNG THỨ C

CHO TR Ẻ EM BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON



BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢ C HÀ NỘI

LÊ THỊ CÚC

XÂY DỰ NG QUY TRÌNH

ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜ I CÁC

VITAMIN B1, B2, B6, B9 TRONG SẢN

PHẨM DINH DƢỠ NG CÔNG THỨ C

CHO TR Ẻ EM BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớ ng dẫn:

ThS. Nguy ễ n Lâm H ồng

ThS. Lê H ồng Dũng

Nơi thự c hiện:

Vi ện D inh dưỡ ng Qu ố c gia .

HÀ NỘI – 2015





LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoànthành khóa luận là lúc tôi xin phép đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình

với những ngƣời đã dạy dỗ, hƣớng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian

qua.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân

thành tới thạc sĩ Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích - độc chất

và thạc sĩ Lê Hồng Dũng – Trƣởng phòng khoa Hóa thực phẩm, Viện Dinh dƣỡng,

những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết, giúpđỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Đồng thời, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Thanh Nga, cô

Nguyễn Thúy Dung, anh Hoàng Trung Hiếu, chị Bùi Thị Thanh Xuân – cán bộ

khoa Hóa thực phẩm, Viện dinh dƣỡng đã luôn quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ

tôi thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội,

các thầy cô giáo, Bộ môn Hóa phân tích – độc chất, anh chị Viện Dinh dƣỡng Quốc

Gia đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài.

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè những ngƣời đã luôn động

viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm

nay.

Hà Nội, ngày 8 tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Lê Thị Cúc





MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮTDANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 2

1.1. TỔ NG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢ NG NGHIÊN CỨ U. .............................................. 2

1.1.1. Vài nét về các vitamin B1, B2, B6, B9. ......................................................... 2

1.1.2. Một số phƣơng pháp định lƣợ ng các vitamin B1, B2, B6, B9 trong thực

phẩm hiện nay. .......................................................................................................... 4

1.2. TỔ NG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎ NG HIỆU NĂNG CAO. ................................... 8

1.2.1. Nguyên tắc và phân loại............................................................................... 8

1.2.2. Các thông số đặc trƣng. ............................................................................... 9

1.2.3. Các k ỹ thuật định lƣợ ng bằng HPLC. ........................................................ 11

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U ........................ 13

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ. ............................................................... 13

2.1.1. Nguyên vật liệu. ......................................................................................... 13

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, máy móc. ...................................................................... 13

2.1.3. Đối tƣợ ng nghiên cứu ................................................................................ 14

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨ U. .............................................................................. 14

2.2.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thờ i 4 vitamin nhóm B gồm B1,

B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡ ng công thức cho tr ẻ em bằng phƣơng pháp HPLC. ................................................................................................ 14

2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợ ng. ........................................................ 14

2.2.3. Ứ ng dụng. .................................................................................................. 15

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U. ...................................................................... 15

2.3.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thờ i 4 vitamin nhóm B gồm B1,

B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡ ng công thức cho tr ẻ em bằng

phƣơng pháp HPLC. ................................................................................................ 15





2.3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích. ........................................................... 15

2.3.3. Ứ ng dụng. .................................................................................................. 17

2.3.4. Tính toán và xử lý số liệu. ......................................................................... 18

CHƢƠNG 3. THỰ C NGHIỆM, K ẾT QUẢ. ............................................................. 19

3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN

SẮC KÝ. ............................................................................................................. 19

3.1.1. Lựa chọn mẫu. ........................................................................................... 19

3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu. .................................................................. 19

3.1.3. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký........................................................... 24

3.1.4. Quy trình phân tích các vitamin B1, B2, B6, B9 trong sản phẩm dinh

dƣỡ ng công thức cho tr ẻ em. ................................................................................... 28

3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP. ........................................................................ 30

3.2.1. Chuẩn bị mẫu. ............................................................................................ 30

3.2.2. Độ phù hợ p của hệ thống. ......................................................................... 31

3.2.3. Độ chọn lọc. ............................................................................................... 32

3.2.4. Khoảng tuyến tính. ..................................................................................... 33

3.2.5. Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lƣợ ng. ............................................... 37

3.2.6. Độ lặ p lại, độ chính xác trung gian. ........................................................... 38

3.2.7. Độ thu hồi. ................................................................................................. 40

3.2.8. Độ ổn định của các vitamin trong dung dịch chạy sắc ký. ........................ 42

3.3. Ứ NG DỤNG ĐỊNH LƢỢNG ĐỒ NG THỜI VITAMIN B1, B2, B6, B9

TRONG MỘT SỐ SẢ N PHẨM DINH DƢỠ NG CÔNG THỨ C CHO TR Ẻ

EM TRÊN THỊ TRƢỜ NG. ................................................................................. 43

BÀN LUẬN ................................................................................................................... 47

K ẾT LUẬN ................................................................................................................... 48

ĐỀ XUẤT ...................................................................................................................... 51





DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOACHiệp hội các nhà hóa phân tích hóa học ( Association of Official

Analytical Chemists)

HPLC:Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography)

LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ: Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantification)

MeOH: Methanol

PAD: Detector mảng diode (Photodiode array detector)

QC Mẫu kiểm chứng (Quality Control)

RSD (%): Độ lệch chuẩn tƣơ ng đối (Relative Standard Deviation)

SD: Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

TCA: Axit Trichloroacetic

UPLC-MS/MS:

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao ghép khối phổ (Ultra high

performance chromatography – Mass spectrometry)

UV: Tử ngoại (Ultraviolet)

v/v Thể tích/thể tích (volume/volume)

w/v K hối lƣợng/thể tích (weight/volume)





DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Nội dung Trang

1.1Một số nghiên cứu định lƣợ ng đồng thờ i các vitamin nhóm Btrong thực phẩm bằng phƣơ ng pháp HPLC.

6

3.1 Nồng độ của các vitamin vớ i mỗi quy trình 20

3.2 Nồng độ của các vitamin tại các thể tích TCA 20% khác nhau 21

3.3 Nồng độ của các vitamin với mỗi cách lắc khác nhau 23

3.4 Nồng độ của các vitamin với thời gian siêu âm khác nhau 23

3.5 Ba chƣơng trình gradient khảo sát 25

3.6 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký 31

3.7 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của các vitamin B1, B2, B6, B9 34

3.8 Kết quả thẩm định LOD, LOQ của vitamin B1 37

3.9 Kết quả thẩm định LOD, LOQ của vitamin B2, B6, B9 383.10 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơ ng pháp 38

3.11 Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phƣơ ng pháp 39

3.12Pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ thấp, trung bình vàcao

40

3.13Kết quả thẩm định độ thu hồi của phƣơng pháp với vitaminB1

41

3.14Kết quả thẩm định độ thu hồi của phƣơng pháp với vitaminB2, B6, B9

42

3.15 Kết quả độ ổn định của các vitamin 43

3.16Hàm lƣợng vitamin B1 trong một số sản phẩm dinh dƣỡngcông thức cho trẻ em trên thị trƣờng

44


44






45

3.19 Hàm lƣợng vitamin B9 trong một số sản phẩm dinh dƣỡngcông thức cho trẻ em trên thị trƣờng

45





DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình Nội dung Trang

1.1 Công thức cấu tạo của vitamin B1 2




3.1 Sắc ký đồ mẫu QC với cột C8 (tại 290nm) 24

3.2 Sắc ký đồ mẫu QC với cột C18 (tại 290nm) 25

3.3Sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp chuẩn tại bƣớc sóng 267nm của3 chƣơ ng trình gradient

26

3.4 Phổ hấp thụ UV của các vitamin 28

3.5Sắc ký đồ mẫu trắng tại bƣớc sóng 246nm (đánh giá tínhchọn lọc)

32

3.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp tại bƣớc sóng 246nm. 33

3.7Sắc ký đồ mẫu sữa bột Dutch Lady nguyên kem tại bƣớcsóng 246nm

33

3.8Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích picvà nồng độ của các vitamin B1, B2, B6, B9

36





1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các vitamin có vai trò cần thiết đối với sức khỏe con ngƣời, đặc biệt là khả

năng tăng trƣởng, phát triển toàn diện ở trẻ nhỏ. Trong số 13 loại vitamin rất quan

trọng, các vitamin nhóm B tan trong nƣớc nhƣ: thiamin (B1), riboflavin (B2), niacin

(B3), pyridoxin (B6 ), cyanocobamine (B12)... quan trọng cho quá trình trao đổi chất,

điều hòa hoạt động của các cơ quan, đặc biệt khi cơ quan đang hoàn thiện chức

năng; hỗ trợ tăng trƣởng thể chất và phát triển tinh thần, trí tuệ; cung cấp năng

lƣợng và tổng hợp các tế bào máu. Rất nhiều trƣờng hợp do bệnh lý hoặc chế độ

dinh dƣỡng kém dẫn tới thiếu viatmin B, gây ra ảnh hƣởng xấu cho sức khỏe. Ngàynay, trên thị trƣờng có nhiều sản phẩm giúp bổ sung vitamin nhƣ các thực phẩm

công thức sữa, bột dinh dƣỡng... hoặc thuốc dƣới dạng viên vitamin B đơn hay hỗn

hợp các vitamin. Trong đó, thực phẩm công thức là thức ăn bổ sung quan trọng cho

trẻ nhỏ. Hiện nay Bộ Y Tế đã ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các

sản phẩm dinh dƣỡng công thức [3], [4], [5] quy định hàm lƣợng cũng nhƣ phƣơng

pháp phân tích các chất dinh dƣỡng, bao gồm các vitamin nhóm B. Việc xác định

chính xác hàm lƣợng các vitamin đƣợc bổ sung có ý nghĩa trong vấn đề đảm bảo

quyền lợi và sức khỏe của ngƣời tiêu dùng.

Xuất phát từ nhu cầu thực tế để kiểm tra, đánh giá chất lƣợng sản phẩm và phụ c

vụ các nghiên cứu dinh dƣỡng chúng tôi tiến hành đề tài:

“Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thờ i các vitamin B1, B2, B6, B9 trong

sản phẩm dinh dƣỡ ng công thứ c cho trẻ em bằng HPLC” vớ i 2 mục tiêu chính:

1.

Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thờ i 4 vitamin nhóm

B gồm B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡ ng công thức cho tr ẻ

em bằng phƣơng pháp HPLC.

2. Ứ ng dụng định lƣợng đồng thờ i vitamin B1, B2, B6, B9 trong một số sản

phẩm dinh dƣỡ ng công thức cho tr ẻ em trên thị trƣờ ng.





2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU.

Mặc dù các sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng (sữa bột,

bột dinh dƣỡng) chứa hỗn hợp nhiều vitamin, thậm chí 10-11 loại vitamin khác

nhau, nhƣng trong khuôn khổ có hạn của khóa luận, chúng tôi chỉ nghiên cứu định

lƣợng các vitamin B1 (Thiamin hydroclorid), B2 (Riboflavin), B6 (Pyridoxin

hydroclorid) và B9 (Acid folic).

1.1.1. Vài nét về các vitamin B1, B2, B6, B9.

1.1.1.1.

Công thức cấu tạo, công thức phân tử [6] , [9] , [35] , [37] .

Hình 1.1: Vitamin B1 Hình 1.2: Vitamin B2

Hình 1.3: Vitamin B6 Hình 1.4: Vitamin B9

1.1.1.2. Tính chất và tác dụng.

Vitamin B1 (Thiamin hydroclorid).





3

- Tính chất: Thiamin dạng base không ổn định vì có cấu trúc nitơ bậc 4 nên B1

thƣờng đƣợc bào chế dạng muối hydrochlorid hoặc mononitrat, hai dạng muối

này có tính chất tƣơng tự nhau. Thiamin hydroclorid là tinh thể không màu hoặc

bột kết tinh trắng, vị đắng, dễ tan trong nƣớc (1g/1ml) và glycerin (1g/18ml);

khó tan trong ethanol (1g/315ml cồn tuyệt đối); không tan trong aceton, ether,

chloroform và benzene [6], [9], [35]. Nó ổn định trong dung dịch có pH axit (2-

4); không ổn định với nhiệt và ánh sáng [37]. Do có dị vòng thơm nên vitamin

B1 hấp thụ mạnh bức xạ UV [9].

- Tác dụng: Phòng và điều trị bệnh beri- beri; phối hợp với vitamin B6, B12 điều trị

các trƣờng hợp đau nhức dây thần kinh hông, lƣng, dây thần kinh sinh ba; dùng

trong trƣờng hợp mệt mỏi, chán ăn, suy dinh dƣỡng và rối loạn tiêu hóa [8].

Vitamin B2 (Rioflavin).

- Tính chất: Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam, hơi có mùi, k hó tan trong

nƣớc, ethanol; không tan trong ether, cloroform, benzen [6], [9]. Nó dễ tan

nhƣng không ổn định trong môi trƣờng kiềm; ổn định trong môi trƣờng acid

[35], [37]; k hông ổn định với ánh sáng [35], [37]. Do có hệ nối đôi luân phiênnên vitamin B2 hấp thụ mạnh bức xạ UV-Vis [9].

- Tác dụng: Dùng trong các trƣờng hợp thiếu B2 gây tổn thƣơng da, niêm mạc,

viêm giác mạc mắt, viêm kết mạc, loét miệng, suy nhƣợc, mệt mỏi, chậm

lớn,…Thƣờng dùng phối hợp với vitamin PP [8].

Vitamin B6 (Pyridoxin hydroclorid).

- Tính chất: Vitamin B6 là tên chung của 3 chất có cấu trúc hóa học khác nhau ở

vị trí nhóm chức số 4: pyridoxin, pyridoxal và pyridoxamin. Dạng pyridoxin

hydroclorid thƣờng đƣợc dùng trong thực phẩm dinh dƣỡng công thức.

Pyridoxin hydroclorid là những tinh thể không màu hoặc bột kết tinh màu trắng,

bền vững trong không khí, dễ tan trong nƣớc (1g/4,5ml), tan trong ethanol

(1g/90ml), không tan trong ether, cloroform [6], [9]. Ổn định trong môi trƣờng

nƣớc với pH từ 2-4,5; hấp thụ mạnh bức xạ UV [9].





4

- Tác dụng: Phòng và điều trị trong các trƣờng hợp thiếu vitamin B 6, biểu hiện:

tổn thƣơng mắt, mũi, miệng, co giật, thiếu máu. Phòng và điều trị một số bệnh ở

hệ thần kinh do các thuốc khác (isoniazid) gây ra [8].

Vitamin B9

- Tính chất: Bột kết tinh màu vàng nhạt hoặc vàng cam, thực tế không tan trong

nƣớc và hầu hết các dung môi hữu cơ, tan trong các dung dịch acid và kiềm

loãng [6], [9], [35]. Dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, chất oxy hóa, chất khử,

acid, kiềm và khi bị đun nóng. Dung dịch trong nƣớc kém bền trong môi

trƣờng pH dƣới 6 [9].

- Tác dụng: Phòng và điều trị trong các trƣờng hợp thiếu vitamin B9 (thiếu máu

tan máu, thiếu máu hồng cầu to). Bổ sung acid folic cho ngƣời đang điều trị

bằng các thuốc kháng acid folic (methotrexat), đang điều trị thuốc chống

động kinh hydantoin, bệnh nhân sốt rét, ngƣời nhu cầu tăng [8].

1.1.2.

Một số phƣơng pháp định lƣợng các vitamin B1, B2, B6, B9 trong thực

phẩm hiện nay.

1.1.2.1.

Trên thế giới. Nghiên cứu các vitamin nhóm B trong thực phẩm đã phát triển từ lâu với nhiều

kỹ thuật đã đƣợc tiêu chuẩn hóa, tuy nhiên các kỹ thuật tiêu chuẩn này hầu hết là

các kỹ thuật phân tích riêng lẻ từng loại vitamin. Các kỹ thuật tiêu chuẩn AOAC để

phân tích vitamin B1, B2 thƣờng dùng phƣơng pháp quang phổ huỳnh quang [23],

[24], [29]; phân tích vitamin B3, B6, B12, B9 hiện nay là phƣơng pháp vi sinh [25],

[26], [27]. Phƣơng pháp sắc ký cũng ngày càng phát triển nhƣ tiêu chuẩn AOAC

2004.07 phân tích vitamin B6 trong sản phẩm dinh dƣỡng công thức trẻ em [30].

Bên cạnh đó phƣơng pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ (UPLC/MS)

cũng đƣợc sử dụng ngày càng nhiều để phân tích các vitamin nhƣ vitamin B5 vì

tính chọn lọc và độ nhạy cao, đồng thời giảm bớt công đoạn xử lý mẫu phức tạp

[28].

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã công bố các phƣơng pháp phân

tích đồng thời các vitamin nhóm B trong thực phẩm. Một số nghiên cứu dùng





5

phƣơng pháp đo quang kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến hoặc đạo hàm [40],

[38]; phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [33], [39], [34], [22].

Một số quy trình xử lý mẫu dùng để định lƣợng đồng thời các vitamin nhóm B

trong chế phẩm dinh dƣỡng công thức:

Quy trình 1: Joon Hyuk Suh và cộng sự [34]:

Cân chính xác 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 15ml

Thêm 2ml nƣớc cất, lắc đều, lắc xoáy 3 phút ở nhiệt độ phòng

Thêm 6 ml acetonitrile, lắc đều

Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút

Hút lấy dịch trong, thổi khô dung môi bằng khí nitơ

Hòa tan phần còn lại trong 5ml nƣớc cất

Lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm HPLC

Quy trình 2: Soledad Albalá- Hurtado cùng cộng sự [22 ]

Cân chính xác 8 g mẫu bột vào ống ly tâm 50ml

Thêm 10ml nƣớc cất, lắc đều

Thêm 1g TCA, lắc tan, lắc bằng khuấy từ 10 phút

Ly tâm 1250 vòng trong 10 phút

Thu dịch trong. Tủa: thêm 3ml TCA 4%, lắc 10 phút, ly tâm, loại tủa.

Gộp dịch chiết, định mức bằng TCA 4% vừa đủ 10ml

Lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm HPLC





6

Bảng 1.1: Một số nghiên cứu định lƣợng đồng thờ i các vitamin nhóm B trong thự c phẩm bằng phƣơng pháp HPLC.

Tài

liệuMẫu thử

Xác định

vitamin

Dung môi

chiếtPha động Cột Detector

Thể tích

tiêm mẫu

( µl )

LOQ, LOD

[33]

Bột dinh

dƣỡ ng tr ẻ

em

B5, B8,

B9, B12

Methotrexate,

dung dịch

amoni axetat,

chloroform

- R ửa giải gradient: G m

acetonitrile và nƣớ c có

chứa 0,1% axit formic

- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút

- Cột Acquity

UPLC Ben C18

(2,1 mm × 100

mm, 1,7μm)

- Nhiệt độ cột:

35°C

UPLC MS-MS

- Chế độ MRM:

mảnh có m/z

220,1 → 89,9 cho

B5; 245,1

→227,1 cho B8;

442,3→ 295,2

cho B9 và 678,9

→147,0 cho B12

10

- LOD (µg/L):

B5: 0,005

B8 : 0,030

B9: 0,006

B12: 0,006

- LOQ (µg/L):

B5: 0,016B8: 0,090B9: 0,020B12: 0,019

[39] Thịt saukhi nấu

B1, B6,B12

TCA

- Pha A: octanesulfonic

axit 5 mM, trietylamine

0,5%, axit acetic 2,4%và MeOH 15%

- Pha B: acetonitrile 100%.

- Tỷ lệ: 90% A, 10% B.

- Cột Luna 5µm

C8 (250 mm × 4,6

mm) từ Phenomenex

(USA)

- Nhiệt độ phòng

PAD:

- λB1=249 nm

- λB6=290 nm- λB12=361 nm

20





7

[34]

Bột dinh

dƣỡ ng.

ngũ cốc,

thực phẩm

năng

lƣợ ng

thấ p

B1, B2,

B3, B5,

B6, B9

Nƣớ c và

acetonitrile

- R ửa giải gradient:

A: 20 mM kali

phosphate pH 3.0

B: 50% acetonitrile (v/v)

trong 20 mM kali

phosphate pH 3,0- Tốc độ dòng chảy giữa

0,8 và 1,0mL / phút.

- Develosil

RPAQUEOUS

C30 (4,6 mm ×

250 mm, 5 µm)

- Nhiệt độ cột:

300C

PAD:

- λ= 275nm,

- λB5= 205nm

20

- LOQ (µg/g):

B1: 0,2

B2: 0,2

B3: 2,0

B5: 0,5

B6: 0,2B9: 0,1

[22]

Sữa cho

tr ẻ sơ sinh

(lỏng, bột)

B1, B2,

B3, B6,

B9, B12

TCA, nƣớ c

- Gồm 5 mM acid

octanesulfonic; 0,5%

trietylamine; 2,4%

glacial acetic acid và

MeOH 15%.

- Tốc độ dòng: 1ml/phút

- Cột Tracer

Spherisorb ODS-

2 C18 (250x 4,6

mm, 5 µm)

- Nhiệt độ phòng

UV:

- λB1=246 nm

- λB2=268 nm

- λB3=261 nm

- λB6=290 nm

- λB9=282 nm

- λB12=361 nm

20

- LOD (µg/ml):

0,02 đến 0,10

-

LOQ (µg/ml):

0,03 đến 0,25





8

1.1.2.2. Ở Việt Nam.

Ở Việt Nam, các kỹ thuật tiêu chuẩn để định lƣợng các vitamin nhóm B trong

thực phẩm cũng mới dừng lại là các kỹ thuật phân tích riêng lẻ từng vitamin. Một số

tiêu chuẩn dùng phƣơng pháp HPLC để phân tích vitamin B1 [21] , B2 [18]; phƣơng

pháp vi sinh hoặc HPLC với B6 [19], [17]; phƣơng pháp vi sinh với B9 [20]. Hiện

nay, Bộ Y Tế cũng đã ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản

phẩm dinh dƣỡng công thức [3], [4], [5] quy định phƣơng pháp phân tích riêng từng

vitamin nhóm B – áp dụng các phƣơng pháp của AOAC.

Việc nghiên cứu định lƣợng đồng thời nhiều vitamin nhóm B cũng đã phát triển

trong những năm gần đây nhƣng đó hầu hết là các nghiên cứu trên đối tƣợng dƣợc

phẩm [1], [14], [15]; nghiên cứu trên đối tƣợng thực phẩm còn rất ít. Tác giả Phạm

Thị Thanh Hà và cộng sự [12] đã định lƣợng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9, C,

PP trong cốm dinh dƣỡng bằng phƣơng pháp điện di mao quản.

Phƣơng pháp đo quang kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến hoặc đạo hàm

đƣợc ứng dụng trong phân tích vô cơ, hữu cơ, môi trƣờng, dƣợc phẩm,.. nhƣng yêu

cầu sử dụng các thuật toán phức tạp, cần có máy tính và phần mềm chuyên dụng.Phƣơng pháp vi sinh có nhƣợc điểm là tính chọn lọc, độ lặp lại kém và thời gian

phân tích kéo dài. Phƣơng pháp điện di mao quản có ƣu điểm sử dụng tiết kiệm

dung môi, hóa chất và thân thiện với môi trƣờng nhƣng độ lặp lại không cao.

Kỹ thuật HPLC đã khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của các phƣơng pháp định

lƣợng trên. Phƣơng pháp HPLC đƣợc sử dụng rộng rãi vì thao tác đơn giản, khả

năng tách tốt các vitamin trong mẫu nhiều thành phần, rút ngắn thời gian phân tích,

đồng thời cho độ chính xác và tính chọn lọc cao.

1.2. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO.

1.2.1. Nguyên tắc và phân loại.

HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một

pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao [2].

Thứ tự rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột phụ thuộc vào khả năng lƣu giữ

khác nhau của các chất phân tích với hai pha tĩnh và pha động [10].





9

Tùy vào bản chất các pha, cơ chế tách mà HPLC phân làm nhiều loại sắc ký

khác nhau. Pha tĩnh có thể là chất rắn đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân cho sắc

ký hấp thụ hoặc pha tĩnh là chất mang rắn đƣợc liên kết hóa học với các nhóm hữu

cơ cho sắc ký phân bố. Ngoài ra còn có các loại sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ,

sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học. Trong đó , sắc ký lỏng phân bố đƣợc

dùng phổ biến nhất hiện nay.

Sắc ký phân bố đƣợc chia thành sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký pha đảo,

với sắc ký pha đảo đƣợc sử dụng nhiều hơn cả trong kiểm nghiệm. Kỹ thuật này có

pha tĩnh gồm các nhóm không phân cực (octyl C8, octadecyl C18 hay phenyl C6H5),

pha động là những dung môi phân cực (nƣớc, methol, acetonitril,…), thứ tự rửa giải

là các chất phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên [2], [10], [11], [13].

1.2.2. Các thông số đặc trƣng.

1.2.2.1.

Thời gian lưu.

Thời gian lƣu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất phân

tích xuất hiện đỉnh pic trên sắc ký đồ.

Với một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là xác định. Vìvậy có thể dùng thời gian lƣu để định tính các chất.

1.2.2.2.

Hệ số phân bố K.

Là đại lƣợng đặc trƣng cho sự phân bố của chất phân tích giữa pha động và pha

tĩnh.

Với: CS : nồng độ mol chất phân tích trong pha tĩnh. CM : nồng độ mol chất phân tích trong pha động.

K phụ thuộc vào bản chất chất phân tích và bản chất hai pha. Trị số K càng lớn,

sự di chuyển của chất phân tích qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn

hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ [10].

1.2.2.3. Hệ số dung lượng k’ .

k’ là hệ số phân bố khối lƣợng giữa hai pha.





10

Vớ i: K : hệ số phân bố VS, VM : thể tích pha tĩnh và pha động.

Cần chọn điều kiện sắc ký sao cho: 1 < k' < 8 [2], [10], [13].

1.2.2.4. Hệ số chọn lọc α.

Đặc trƣng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B ta dùng hệ số chọn lọc

α:

Với k’B>k’A. Tối ƣu với 1,5 < α < 2 [2], [10], [13].

1.2.2.5.

Hệ số đối xứng F.

Để đánh giá tính đối xứng của pic ta dùng hệ số đối xứng F:

Với: W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.

a: khoảng cách từ đƣờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đƣờng cong phía trƣớc tại vị trí 1/20 chiều cao pic.

Yêu cầu: F khi chuẩn hóa cột từ 0,9 – 2,0.

1.2.2.6. Số đĩa lý thuyết N.

Đặc trƣng cho hiệu lực cột sắc ký:

(

)

Với: W0,5 là chiều rộng đo ở vị trí ½ chiều cao pic.

W là chiều rộng đo ở đáy pic

1.2.2.7.

Độ phân giải R S .

R S đánh giá mức độ tách của các chất trong một hệ pha.

Với: tRA , tRB : thời gian lƣu hiệu lực của hai pic liền kề nhau A, B.





11

WA , WB : độ rộng pic đo ở các đáy pic.

W0,5A , W0,5B : độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.

Yêu cầu: R S >1,25; tối ƣu R S ≥1,5 [2], [10], [13].

1.2.3. Các k ỹ thuật định lƣợ ng bằng HPLC.

Tất cả các kỹ thuật định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ

của chất phân tích tỷ lệ thuận với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.

Có 4 kỹ thuật định lƣợng đƣợc sử dụng trong sắc ký: kỹ thuật chuẩn ngoại, kỹ

thuật chuẩn nội, kỹ thuật thêm chuẩn, kỹ thuật chuẩn hóa diện tích. Chúng tôi xin

trình bày cụ thể kỹ thuật chuẩn ngoại và kỹ thật thêm chuẩn đƣợc sử dụng trong

khóa luận.

Kỹ thuật chuẩn ngoại: Tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện mẫu chuẩn và mẫu

thử. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều

cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ các chất trong mẫu thử. Có thể sử

dụng phƣơng pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm.

Chuẩn hóa 1 điểm: Chuẩn bị mẫu thử có nồng độ xấp xỉ nộng độ mẫu

chuẩn. Nồng độ của mẫu thử đƣợc tính theo công thức:

CX, CS: Nồng độ mẫu thử, mẫu chuẩn.

SX, SS: Diện tích của pic mẫu thử, mẫu chuẩn.

Chuẩn hóa nhiều điểm:

Cách tiến hành: chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn với các nồng độ tăng dần

rồi tiến hành sắc ký. Vẽ đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa diện tích S (hoặc

chiều cao H) pic với nồng độ chất chuẩn C. Sử dụng khoảng tuyến tính của

đƣờng chuẩn để tính nồng độ của chất cần xác định. Xây dựng phƣơng trình hồi

quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích hoặc chiều cao pic vớ i nồng độ chất

cần xác định:

Trong đó: Y: diện tích hoặc chiều cao pic.

a: giao điểm của đƣờng chuẩn với trục tung.

b: độ dốc của đƣờng chuẩn.

CX: nồng độ của chất phân tích.





12

Chú ý: Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử phải nằm trong khoảng

tuyến tính của đƣờng chuẩn [2], [10], [13].

Kỹ thuật thêm chuẩn:

Cách tiến hành: Chuẩn bị 2 mẫu thử, thêm một lƣợng chất chuẩn ngoại vào mẫu

thử thứ hai. Tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ của

mẫu thử đƣợc tính theo công thức

Trong đó: CX, SX : Nồng độ, diện tích pic của mẫu thử.

ΔC, ΔS: Chênh lệch về nồng độ, diện tích của pic mẫu thử và mẫu

thử nạp chuẩn.





13

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ.

2.1.1.

Nguyên vật liệu.

- Chất chuẩn:

Thiamine hydrochloride C12H17ClN4OS.HCl: hàm lƣợng 100%, độ ẩm

3,5%, CAS number 67-03-8, hãng Sigma-aldrich.

Riboflavin C17H20 N4O6: hàm lƣợng 99,9%, CAS number 83-88-5, hãng

Sigma-aldrich.

Pyridoxine hydrochlororide C8H11 NO3.HCl: hàm lƣợng 99,64%, CAS

number 58-56-0, LOT number 02F86602, hãng Phyto Technology.

Acid Folic C19H19 N7O6: hàm lƣợng 99,57%, độ ẩm dƣới 8,5%, hãng Wako

Nhật.

- Dung môi, hóa chất:

TCA, acetonitrile, NaOH, HCl, natri bicarbonat (NaHCO3), natri heptan

sulfonat đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết phân tích (PA) của Merck- Đức.

Methanol (MeOH) và H3PO4 đặc loại HPLC của Merck - Đức. Khí nitơ 99,99%.

Nƣớ c khử ion 18MΩ.

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, máy móc.

- Hệ thống máy HPLC Waters Alliance gồm bơm Waters 2695 - Photodiode

Array Detector 2996 (Mỹ) vớ i phần mềm Empower software.

- Máy siêu âm Elmasonic S80H (Đức).

-

Máy lắc ngang Edmund M6103000 (Đức)

- Máy lắc xoáy Thermolyne Maxi-Mix II Type 37600, M37619-26 (Mĩ).

- Máy ly tâm Hettich Rotofix II (Đức)

- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi; lọc mẫu vớ i màng lọc 0,45 μm.

- Cân phân tích Sartorius BP 121S (d = 0,1 mg; Max 120g) (Đức)

- Ống nghiệm thủy tinh 15ml, ống ly tâm 50ml.

- Các dụng cụ khác: Bình định mức, pipet thủy tinh, pipetman, cốc có mỏ,….





14

2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu

- Mẫu QC do công ty Abbott cung cấp.

-

Mẫu nghiên cứu: Sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em (bột dinh

dƣỡng, sữa bột bổ sung vi chất) mua trên thị trƣờng.

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.

2.2.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B1, B2,

B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng

phƣơng pháp HPLC.

Quy trình xử lý mẫu: Khảo sát một số quy trình xử lý mẫu phân tích đồng thời

các vitamin B1, B2, B6, B9 để từ đó lựa chọn và xây dựng một quy trình chiết

phù hợp với yêu cầu phân tích.

Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu.

Khảo sát thể tích dung môi chiết

Khảo sát cách lắc mẫu thử.

Khảo sát thời gian chiết.

Lựa chọn điều kiện sắc ký: Khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký phù hợpđể phân tích đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 có trong mẫu:

Cột sắc ký.

Chƣơng trình gradient của pha động.

Detector và bƣớc sóng.

2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng.

Theo hƣớng dẫn chung thẩm định quy trình phân tích đối với chế phẩm định

tính, định lƣợng [7], [16], [32], [36] chúng tôi tiến hành thẩm định phƣơng pháp

phân tích đã đƣợc lựa chọn với các chỉ tiêu:

Độ phù hợp của hệ thống.

Độ chọn lọc.

Khoảng tuyến tính và khoảng nồng độ xác định.

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng.

Độ lặp lại, độ chính xác trung gian.





15

Độ thu hồi.

2.2.3. Ứng dụng.

Ứng dụng định lƣợng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 trong một số sản phẩm

dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

2.3.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B1, B2,

B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng

phƣơng pháp HPLC.

2.3.1.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu.

Chúng tôi tiến hành khảo sát hai quy trình xử lý mẫu đƣợc xây dựng dựa trên

hai quy trình của Joon Hyuk Suh cùng cộng sự [34] và của Soledad Albalá-Hurtado

cùng cộng sự [22].

Với quy trình đã chọn, tiếp tục khảo sát các yếu tố: thể tích TCA 20%, cách lắc,

thời gian chiết.

2.3.1.2.

Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký .

Dùng phƣơng pháp HPLC pha đảo để tách, định lƣợng đồng thờ i các vitaminB1, B2, B6, B9 trong mẫu. Cụ thể, chúng tôi khảo sát các điều kiện nhƣ sau:

- Cột sắc ký: Khảo sát các cột C8, C18 pha đảo hiện có ở phòng thí nghiệm.

- Pha động: Khảo sát các chƣơng trình gradient khác nhau.

- Detector: Khảo sát trên detector DAD, lựa chọn bƣớ c sóng phù hợ p.

2.3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích [7], [16], [31], [32], [36].

2.3.2.1. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký.

- Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một

mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ các vitamin nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại

thời gian lƣu và diện tích pic của các lần sắc ký.

- Yêu cầu: chênh lệch diện tích pic, tR giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu

thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) không lớn hơn 2,00%.

2.3.2.2. Tính ch ọn l ọc

- Chuẩn bị các mẫu sau:





16

Mẫu trắng

Mẫu chuẩn hỗn hợp các vitamin B1, B2, B6, B9.

Mẫu thử

- Tiến hành chạy sắc ký 3 mẫu trên, so sánh các pic trên các sắc ký đồ thu đƣợc.

- Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu trắng thu đƣợc, tại thời điểm xuất hiện pic

của các vitamin không đƣợc xuất hiện pic lạ.

2.3.2.3. Khoảng tuyến tính và khoảng nồng độ xác định.

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp bốn vitamin có nồng độ tăng dần. Tiến

hành sắc ký, xây dựng phƣơng trình hồi quy và xác định hệ số tƣơng quan r.

- Yêu cầu: đƣờng hồi quy thu đƣợc phải có dạng đƣờng thẳng và 0,995 ≤ r ≤1.

2.3.2.4. Giới hạn p hát hiện và giới hạn định lượng [16].

- Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu

thử có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc theo phƣơng pháp đã

xây dựng. Giới hạn định lƣợng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong

mẫu thử có thể định lƣợng đƣợc theo phƣơng pháp đã xây dựng với độ chính xác và

độ đúng thích hợp. - Cách xác định: Sử dụng phƣơng pháp dựa trên độ lệch chuẩn, làm trên mẫu

thử. Làm 10 lần song song.

Tính LOD: Tính giá trị trung bình xtb và độ lệch chuẩn SD

LOD = 3×SD

LOQ = 10×SD

Đánh giá LOD đã tính đƣợc: tính R= xtb/LOD.

Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính đƣợc

là đáng tin cậy.

Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít

chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung

dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.

2.3.2.5.

Độ lặp lại, độ chính xác trung gian.





17

Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân

tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng

nhất dƣới những điều kiện mô tả.

- Độ lặ p lại (độ chính xác trong cùng điều kiện định lƣợng) xác định bằng cách

tiến hành 6 phép thử song song trên một mẫu thử. Ghi sắc ký đồ, diện tích pic, xác

định k ết quả định lƣợ ng của các vitamin. Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá

tr ị RSD (%).

Yêu cầu: chênh lệch k ết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chẩn tƣơng

đối RSD (%) của mỗi vitamin phải không lớn hơn 11,00% [16], [31].

- Độ chính xác trung gian: Diễn tả mức dao động của k ết quả trong cùng một

phòng thí nghiệm đƣợ c thực hiện ở các ngày khác nhau.

Yêu cầu: chênh lệch k ết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chẩn tƣơng

đối RSD (%) trong ngày của mỗi vitamin phải không lớn hơn 11,00% và trong hai

ngày phải không lớn hơn 16,00% [31].

2.3.2.6.

Độ thu hồi.

- Xác định độ thu hồi của phƣơng pháp bằng phƣơng pháp thêm chuẩn vào mẫuthử đã biết hàm lƣợng hoạt chất. Lƣợng chuẩn thêm vào ở 3 mức nồng độ: nồng độ

thấp, nồng độ trung bình, nồng độ cao. Tại mỗi mức nồng độ, phân tích lặp lại 10

lần.

- Tính tỷ lệ thu hồi của các vitamin B1, B2, B6, B9 chuẩn thêm vào mẫu thử.

- Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 80% - 110% [16], [31].

2.3.3. Ứng dụng.

Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng và thẩm định, tiến hành định lƣợng đồng

thời vitamin B1, B2, B6, B9 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em

(bột dinh dƣỡng, sữa bột bổ sung vi chất) mua trên thị trƣờng. Chúng tôi tiến hành

chọn mẫu ngẫu nhiên đơn giản:

Thu thập thông tin các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức có trên thị

trƣờng Hà Nội, tên và địa điểm một số siêu thị, đại lý.

Bốc thăm ngẫu nhiên lấy 3 địa điểm để mua mẫu.





18

Bốc thăm ngẫu nhiên 10 loại sản phẩm để phân tích.

Tại mỗi địa điểm đã chọn, mỗi loại sản phẩm mua 1 mẫu đại diện.

Tổng số mẫu thu thập: 1 mẫu/loại/điểm x 10 loại x 3 điểm = 30 mẫu.

2.3.4. Tính toán và xử lý số liệu.

Sử dụng ba phần mềm: Microsoft Office Excel 2010, GraphPad Prism và phần

mềm Microsoft Office Word 2010 để xử lý số liệu và trình bày k ết quả.





19

CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ.

3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN

SẮC KÝ.

3.1.1. Lự a chọn mẫu.

- Mẫu QC: Mẫu do công ty Abbot cung cấ p.

- Hàm lƣợ ng các vitamin trong QC: B1 là 1,257 mg/100g; B2 là 2,037

mg/100g; B6 là 1,346 mg/100g; B9 là 0,2293 mg/100g.

3.1.2. Xây dự ng quy trình xử lý mẫu.

Qua tham khảo các nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới, chúng tôi tiếnhành khảo sát hai quy trình sau:

Quy trình 1 (tham khảo Joon Hyuk Suh và cộng sự)

Cân 1g mẫu bột vào ống ly tâm 50ml

Thêm 4 ml nƣớc 18MΩ, lắc xoáy 1 phút ở nhiệt độ phòng

Thêm 12 ml acetonitrile, lắc đều

Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút

Hút 10 ml dịch trong vào ống ly tâm 50ml

Thổi khô dung môi bằng khí nitơ đến khoảng 2ml

Thêm pha động A đến 5ml

Lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm vào HPLC

Quy trình 2 (tham khảo Soledad Albalá-Hurtado cùng cộng sự)

Cân 1g mẫu bột vào ống thủy tinh 15ml

Thêm 4ml nƣớc 18MΩ, lắc xoáy 1 phút

Thêm 1ml TCA 20%, lắc xoáy 1 phút

Siêu âm 30 phút.





20

↓ Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút

Lọc. Rửa tủa và định mức bằng pha động A vừa đủ 10 ml.Hút 1ml dịch + 1ml pha động A

Tr ộn đều, lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm vào HPLC

K ết quả độ nồng độ các vitamin thu đƣợ c từ 2 quy trình xử lý mẫu đƣợ c trình

bày ở b ảng 3.1.

Bảng 3.1: Nồng độ của các vitamin vớ i mỗi quy trình.

Nồng độ (mg/100g)Viamin

Quy trình 1 Quy trình 2 Mẫu QC

B1 0,960 1,558 1,257

B2 1,473 1,376 2,037

B6 1,347 1,435 1,346

B9 0 0,145 0,2293

Nhận xét:

Mẫu QC sau khi xử lý bằng quy trình 1, 2 đem phân tích bằng phƣơng phápHPLC đều cho pic các vitamin tách r ờ i hoàn toàn khỏi các pic tạ p.

Quy trình 1 không phân tích đƣợ c vitamin B9. Quy trình 2 phân tích đƣợ c đồng

thờ i cả 4 vitamin, tuy nhiên nồng độ vitamin B2 và B9 thu đƣợ c thấp hơn so vớ i hàm

lƣợ ng thực trong QC.

Do vậy chúng tôi lựa chọn quy trình 2 và tiế p tục khảo sát xử lý các điều kiện

chiết xuất: thể tích TCA 20%, cách lắc chiết, thờ i gian chiết để tối ƣu quy trình xử

lý mẫu.

Kh ảo sát th ể tích TCA 20%:

Mục đích sử dụng dung dịch TCA là để k ết tủa protein trong mẫu nhằm làm

sạch mẫu, thuận lợ i cho quá trình phân tích bằng HPLC.

Chúng tôi khảo sát 4 thể tích TCA 20%: 0.5ml; 1ml; 1,5ml; 2ml; 3ml. K ết quả

đƣợ c trình bày ở b ảng 3.2.





21

Bảng 3.2: Nồng độ của các vitamin tại các thể tích TCA 20% khác nhau.

Thê tích TCA

20% (ml)

Nồng độ

(mg/100g)

0,5 1 1,5 2 3

Vitamin B1

1,537 1,519 1,441 1,503 1,5231,501 1,498 1,429 1,553 1,494

1,432 1,473 1,553 1,510 1,557

1,624 1,466 1,508 1,570 1,5081,670 1,528 1,528 1,504

1,601 1,5881,494 1,501

Vitamin B2

1,350 1,471 1,486 1,455 1,520

1,347 1,426 1,432 1,603 1,5941,366 1,444 1,553 1,506 1,647

1,582 1,434 1,536 1,581 1,567

1,570 1,476 1,577 1,6151,503 1,5451,444 1,541

Vitamin B6

1,401 1,436 1,326 1,409 1,3871,391 1,394 1,295 1,417 1,392

1,320 1,382 1,458 1,384 1,3991,496 1,323 1,381 1,399 1,372

1,532 1,380 1,389 1,389

1,465 1,4351,367 1,384

Vitamin B9

0,099 0,187 0,143 0,163 0,1540,118 0,150 0,129 0,147 0,168

0,135 0,137 0,137 0,141 0,1790,105 0,139 0,134 0,150 0,147

0,108 0,120 0,121 0,142

0,118 0,1310,129





22

Vớ i mỗi vitamin, so sánh nồng độ thu đƣợ c giữa 5 cách sử dụng thể tích TCA

20% khác nhau, chúng tôi sử dụng hàm ANOVA-test và T-test trên phần mềm

GraphPad Prism. K ết quả:

- Khi dùng hàm ANOVA-test: giá tr ị p-value của các vitamin đều lớn hơn

0,05: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê.

- Khi dùng hàm T-test:

Vitamin B9: Khi so sánh giữa các thể tích 1ml; 1,5ml; 2ml; 3ml cho giá

tr ị p-value > 0,05: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Khi so sánh

giữa cặ p thể tích 0,5ml và 1ml TCA 20% cho giá tr ị p-value = 0,0082<0,05: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Nhìn b ảng 3.2 ta thấy khi dùng

thể tích 0,5 ml TCA 20% cho nồng độ B9 thấp hơn các thể tích khác.

Các giá tr ị p-value của các vitamin còn lại đều lớn hơn 0,05: sự khác biệt

không có ý nghĩa thống kê.

Nhận xét: K ết quả khảo sát cho thấy:

- Vớ i các vitamin B1, B2, B6: không có sự khác biệt khi sử dụng các thể tích

TCA 20% là 0,5ml; 1ml; 1,5ml; 2ml; 3ml.

- Vớ i vitamin B9: không có sự khác biệt khi sử dụng các thể tích TCA 20% là

1ml; 1,5ml; 2ml; 3ml. Nhƣng khi dùng 0,5ml TCA 20% thì thu đƣợ c nồng

độ B9 nhỏ hơn các thể tích khác.

Vậy để phân tích tối ƣu cả 4 vitamin đồng thờ i tiết kiệm dung môi, chúng tôi

chọn thể tích TCA 20% là 1ml cho các khảo sát tiế p theo.

Kh ảo sát cách l ắc m ẫ u.

Lắc mẫu có tác dụng tăng độ hòa tan của các vitamin trong dung môi chiết.

Chúng tôi tiến hành khảo sát 3 cách lắc: siêu âm, lắc ngang, lắc xoáy . Mỗi cách lắc,

tiến hành hai mẫu độc lập.

Kết quả nồng độ các vitamin đƣợc trình bày ở bảng 3.3.





23

Bảng 3.3: Nồng độ của các vitamin vớ i mỗi cách lắc khác nhau.

Cách lắc

Nồng độ

(mg/100g)Siêu âm Lắc ngang Lắc xoáy

B11,469 1,486 1,503

1,490 1,480 1,480

B21,430 1,444 1,474

1,473 1,472 1,459

B61,398 1,389 1,389

1,403 1,396 1,391

B90,136 0,136 0,141

0,141 0,143 0,137

Nhận xét: K ết quả khảo sát cho thấy, ba cách lắc cho nồng độ của các vitamin

tƣơng đƣơng nhau. Siêu âm và lắc ngang có thể làm đồng thờ i nhiều mẫu hơn so

vớ i lắc xoáy do đó tiết kiệm thờ i gian chiết. Chúng tôi lựa chọn cách siêu âm cho

các khảo sát tiế p theo.

Kh ảo sát th ờ i gian chi ế t:

Chúng tôi tiến hành khảo sát các thời gian siêu âm là 5, 10, 15, 20, 30, 60 phút.

Mỗi khoảng thời gian, tiến hành ba mẫu độc lập. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.4.

Bảng 3.4: Nồng độ của các vitamin vớ i thờ i gian siêu âm khác nhau.

Thờ i gian

Nồng độ

(mg/100g)

5 phút 10 phút 15 phút 20 phút 30 phút 60 phút

B1

1,516 1,570 1,561 1,488 1,521 1,5721,498 1,606 1,518 1,335 1,401 1,330

1,526 1,505 1,508 1,159 1,432 1,234

B2

1,392 1,491 1,446 1,429 1,442 1,4321,387 1,521 1,483 1,279 1,298 1,285

1,480 1,470 1,440 0,990 1,345 1,206

B6 1,403 1,433 1,389 1,374 1,410 1,425





24

1,234 1,409 1,395 1,203 1,286 1,201

1,324 1,399 1,399 0,954 1,337 1,157

B90,112 0,117 0,118 0,124 0,127 0,1300,149 0,149 0,129 0,105 0,132 0,1210,137 0,145 0,122 0,095 0,106 0,116

Vớ i mỗi vitamin, so sánh nồng độ thu đƣợ c giữa các thờ i gian siêu âm khác

nhau, chúng tôi sử dụng hàm ANOVA-test, T-test trên phần mềm GraphPad Prism.

K ết quả giá tr ị p-value của các vitamin đều lớn hơn 0,05 cho thấy sự khác biệt

không có ý nghĩa thống kê. Do vậy chúng tôi chọn thờ i gian siêu âm ngắn nhất là 5

phút.

Từ các kết quả khảo sát thu được, chúng tôi lựa chọn được các điều kiện xử lý

mẫu như sau:

Lựa chọn quy trình 2 để xử lý mẫu.

Sử dụng 1ml TCA 20% để kết tủa protein trong mẫu.

Lựa chọn cách lắc siêu âm để tăng hòa tan các vitamin.

Lựa chọn thời gian siêu âm 5 phút.

3.1.3. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký.

Cột sắc ký: Chúng tôi tiến hành chạy sắc ký trên các cột:

- Cột Inertsil C8 (150 x 4,6 mm; 5µm), nhiệt độ cột 35oC

- Cột Agllent HC C18(2) (150 x 4,6 mm; 5µm), nhiệt độ cột 35oC

Kết quả thu đƣợc các sắc ký đồ sau:

Hình 3.1: Sắc ký đồ mẫu QC với cột C8 (tại 290nm)





25

Hình 3.2: Sắc ký đồ mẫu QC với cột C18 (tại 290nm) Nhận xét : Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 350C, hai cột có khả năng tách vitamin

B1, B6 là tƣơng đƣơng nhau. Nhƣng cột Inertsil C8 (150 x 4,6 mm; 5µm) tách

vitamin B2, B9 kém hơn (pic B9 dính pic B2) so với cột Agllent HC C18(2) (150 x

4,6 mm; 5µm). Vì vậy cột Agllent HC C18(2) (150 x 4,6 mm) là phù hợp, tách tốt

và chọn lọc các vitamin trong mẫu phân tích.

Pha động: Qua tham khảo tài liệu, chúng tôi lựa chọn pha động gồm pha A là

0,5g natri heptan sulfonat + 1,14g H3PO4 đặc, pha trong 1 lít nƣớc 18 MΩ; pha

B là MeOH. Tốc độ dòng: 1ml/ phút.

Mẫu chuẩn hỗn hợp: vitamin B1 (10,2 ppm), B2 (2, ppm), B6 (7,5 ppm), B9 (10,8

ppm).

Tiến hành khảo sát 3 chƣơng trình gradient sau:

Bảng 3.5: Ba chƣơng trình gradient khảo sát.

Chƣơng trình gradient 1 Chƣơng trình gradient 2 Chƣơng trình gradient 3

Thờigian

(phút)

%A %B CurveThờigian

(phút)

%A %B CurveThờigian

(phút)

%A %B Curve

0 90 10 0 90 10 0 90 105 90 10 6 2 90 10 6 4 90 10 6

12 80 20 6 10 80 20 618 50 50 6 18 55 45 6 18 60 40 622 90 10 11 22 90 10 11 22 90 10 1125 90 10 11 25 90 10 11 25 90 10 11





26

Kết quả cho thấy:

Chƣơng trình gradient 3 cho khả năng tách tốt cả bốn vitamin B1, B2, B6, B9

Chƣơng trình gradient 1, 2: khả năng tách kém, chƣa tách hoàn toàn hai pic

vitamin B2, B9 . K ết quả sắc ký đồ đƣợc trình bày ở hình 3.3.

Hình 3.3: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp tại bước sóng 267nm của 3

chương trình gradient.





27

Detector: Qua tham khảo tài liệu, để định lƣợng các vitamin B1, B2, B6, B9 có

thể sử dụng các loại detector PAD, MS-MS. Với điều kiện trang thiết bị phòng

thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn sử dụng máy HPLC với detector PAD.

Tiến hành quét phổ dung dịch chuẩn đơn của các vitamin B1, B2, B6, B9 cho kết

quả nhƣ hình 3.4 sau:





28

Hình 3.4: Phổ hấp thụ UV của các vitamin.

Trên phổ hấp thụ cho thấy: vitamin B1 có cực đại hấp thụ ở bƣớc sóng 246nm,

B2 có cực đại hấp thụ ở bƣớc sóng 267nm, B6 có cực đại hấp thụ ở bƣớc sóng

291nm, B9 có cực đại hấp thụ ở bƣớc sóng 285nm. Vì vậy chúng tôi quyết địnhchọn bƣớc sóng phát hiện B1 ở 246nm, B2 ở 267nm, B6 và B9 ở 290nm.

3.1.4. Quy trình phân tích các vitamin B1, B2, B6, B9 trong sản phẩm dinh

dƣỡng công thức cho trẻ em.

Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn đƣợc quy trình xử lý mẫu và

điều kiện sắc ký có thể tách tốt đƣợc đồng thời các vitamin B1, B2, B6, B9 trong các

mẫu thử nhƣ sau:





29

Quy trình xử lý mẫu.

Quy trình xử lý mẫu đƣợc trình bày theo sơ đồ sau:

+ 4 ml nƣớc 18MΩ

+ Lắc xoáy khoảng 1 phút

+ 1ml TCA 20% + Lắc xoáy 1 phút.

+ Siêu âm 5 phút

+ Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút

+ Lọc

+ R ửa tủa, định mức bằng pha động A vừa đủ 10 ml

+ Hút 1ml dịch + 1 ml pha động A

+ Trộn đều, lọc qua màng lọc 0,45µm

Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc k ý: Agllent HC C18(2) (150 x 4,6 mm; 5µm), nhiệt độ cột: 35oC.

- Detector: PAD

- Bƣớc sóng phát hiện: Vitamin B1 tại 246nm

Vitamin B2 tại 267nm

Vitamin B6 và B9 tại 290nm.

- Pha động:

Pha động A: 0,5g natri heptan sulfonat + 1,14g H3PO4 đặc. Hoà tan,

định mức vừa đủ 1 lít bằng nƣớc 18MΩ. Trộn đều, lọc qua màng lọc

đƣờng kính lỗ lọc 0,45µm, rung siêu âm 15 phút.

Hỗn hợ p

Cân 1g mẫu bột sữa vào ốngnghiệm thủy tinh 15ml

Dịch lọc

Dịch tiêm sắc ký





30

Pha động B: Methanol.

Chế độ rửa giải: gradient theo thời gian:

Thời gian

(phút)

Lƣu lƣợng dòng

(ml/phút)%A %B Curve

0 1,00 90 10

4 1,00 90 10 6

18 1,00 60 40 6

22 1,00 90 10 11

25 1,00 90 10 11

-

Thể tích tiêm: 20 µl.

3.2.

THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP.

3.2.1.

Chuẩn bị mẫu.

3.2.1.1.

Mẫu chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc đơn từng vitamin: Với mỗi vitamin B1, B2, B6, B9 tiến

hành cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn, hòa tan và định mức trong bình định

mức 20,00 ml đƣợc dung dịch chuẩn gốc nồng độ 500 ppm. Vitamin B1, B6: hòa tan và định mức bằng dung dịch acid acetic 2,4%

(v/v).

Vitamin B2: thấm ƣớt bằng 200 µl nƣớc 18MΩ, cho thêm 100 µl NaOH

0,2N. Lắc tan. Sau đó cho ngay 200 µl HCl 0,1N để trung hòa kiềm, tránh

thủy phân vitamin B2. Định mức vừa đủ 20,00 ml bằng acid acetic 2,4%.

Vitamin B9: hòa tan và định mức bằng dung dịch Natri bicarbonat

(NaHCO3) 5% (w/v).

- Dung dịch chuẩn đơn trung gian: Vớ i mỗi dung dịch chuẩn đơn gốc, hút

chính xác 1,00 ml dung dịch gốc, pha loãng bằng pha động A trong bình định mức

10,00 ml đƣợ c dung dịch chuẩn đơn nồng độ 50 ppm.

Bảo quản: Các dung dịch chuẩn đơn của các vitamin đƣợ c bảo quản trong điều

kiện -40C, tránh ánh sáng.





31

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp bốn vitamin: từ dung dịch chẩn đơn trung gian: hút

chính xác 1,00 ml chuẩn B1; 1,50 ml chuẩn B2; 0,50 ml chuẩn B6; 0,10 ml chuẩn B9

vào bình định mức 20,00 ml; định mức tới vạch bằng pha động A. Nhƣ vậy thu

đƣợc dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm B1 (2,5ppm), B2 (3,75 ppm), B6 (1,25 ppm), B9

(0,25 ppm). Dung dịch chuẩn hỗn hợp đƣợc pha mới trƣớc khi dùng.

3.2.1.2. Mẫu thử

Mẫu sữa bột Dutch Lady nguyên kem đƣợc xử lý theo quy trình đƣợc trình bày

ở mục 3.1.4.

3.2.1.3. Mẫu trắng

Thay 1g sữa bột trong quy trình xử lý mẫu bằng 1ml pha động A :B (90:10). Sau

đó tiến hành tƣơng tự nhƣ chuẩn bị mẫu thử.

3.2.2. Độ phù hợp của hệ thống.

Từ dung dịch chuẩn hỗn hợ p chuẩn bị nhƣ m ục 3.2.1.1 , pha loãng 4 lần (hút

chính xác 5,00 ml; định mức trong bình định mức 20,00 ml bằng pha động A) đƣợ c

dung dịch chuẩn hỗn hợ p có nồng độ các vitamin B1 (0,608 ppm), B2 (0,938 ppm),

B6 (0,304 ppm), B9 (0,067 ppm). Tiêm sắc ký lặ p lại 6 lần với điều kiện sắc ký nhƣđã nêu ở m ục 3.1.4 .

Xác định các thông số mỗi lần tiêm mẫu: thời gian lƣu, diện tích pic của các

vitamin. K ết quả thực nghiệm đƣợ c trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.6: K ết quả khảo sát tính phù hợ p của hệ thống sắc ký (n = 6)

Thời gian lƣu (phút) Diện tích pic (mAU.s)

Lần

tiêm B1 B2 B6 B9 B1 B2 B6 B9

1 21,136 16,975 14,658 16,371 29681 98939 12833 3793

2 21,134 16,975 14,687 16,381 28362 97031 12861 3625

3 21,135 16,98 14,682 16,38 28702 99421 12923 3682

4 21,125 16,969 14,667 16,378 29416 97397 12983 3698

5 21,122 16,967 14,666 16,379 29229 98999 12897 3636

6 21,116 16,962 14,669 16,374 29128 99101 12940 3726





32

Trung

bình21,128 16,971 14,671 16,377

29086,33

98481,33

12906,17

3693,33

RSD% 0,04 0,04 0,07 0,02 1,65 1,02 0,42 1,67

Nhận xét: Độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) của các thông số phân tích đều

dƣới 2,00%, điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký phù hợp, có thể ứng dụng để phân

tích mẫu trong thực tế.

3.2.3. Độ chọn lọc.

- Tiến hành chuẩn bị các mẫu:

Mẫu trắng: chuẩn bị nhƣ mục 3.2.1.3 Mẫu chuẩn hỗn hợp: chuẩn bị nhƣ mục 3.2.2.

Mẫu thử: Mẫu thử chuẩn bị nhƣ mục 3.2.1.2

- Tiến hành sắc ký các mẫu trên theo điều kiện đƣợc trình bày ở mục 3.1.4, thu

đƣợc sắc ký đồ ở bƣớc sóng 246nm (B1) nhƣ hình 3.5, 3.6 và 3.7.

Hình 3.5: Sắc ký đồ mẫu trắng tại bước sóng 246nm (B1 ) (đánh giá tính chọn lọc)





33

Hình 3.6 : Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp tại bước sóng 246nm (B1 )

Hình 3.7 : Sắc ký đồ mẫu sữa bột Dutch Lady nguyên kem tại bước sóng 246nm (B1 )

Nhận xét vitamin B1 (246nm):

- Trên các sắc ký đồ thu đƣợc, tại thời điểm ứng với thời gian lƣu của vitamin

B1 trên mẫu chuẩn (khoảng 21 phút), thì sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện

pic nào, trên sắc ký đồ của mẫu thử có 1 pic rõ nét của vitamin B1.

- Pic vitamin B1 trên các sắc ký đồ cân đối, rõ nét, tách riêng biệt.

Vậy phƣơ ng pháp có tính chọn lọc vớ i viatamin B1. Tƣơng tự vậy, phƣơng pháp

có tính chọn lọc với vitamin B2, B6, B9 (xem phụ lục 2, mục 2.2)

3.2.4. Khoảng tuyến tính.

Chúng tôi tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn với các khoảng nồng độ:





34

Vitamin B1: khoảng nồng độ từ 0,054 ppm tới 2,430 ppm.




Từ dung dịch chuẩn hỗn hợp chuẩn bị nhƣ mục 3.2.1.1, pha các dung dịch

chuẩn có nồng độ các vitamin B1, B2, B6, B9 nhƣ bảng 3.7 .

Tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn hỗn hợp trên. Thiết lập phƣơng trình hồi quy

biểu diễn sự tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ các vitamin B1, B2, B6, B9.

Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.7 , hình 3.8.

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của các vitamin B1, B2, B6, B9.

B1

Nồng độ (ppm) 0,054 0,216 0,648 1,080 1,620 2,430

Diện tích pic

(mAU.s)2400 9220 29416 50773 77392 118754

B2

Nồng độ (ppm) 0,014 0,334 1,001 1,668 2,501 3,752

Diện tích pic

(mAU.s)1599 32355 97397 166459 253195 378691

B6

Nồng độ (ppm) 0,061 0,243 0,487 0,730 0,974 1,217

Diện tích pic

(mAU.s)2971 12834 25291 38095 51084 62023

B9

Nồng độ (ppm) 0,033 0,066 0,133 0,199 0,266

Diện tích pic

(mAU.s)

1929 3702 7073 10653 14531





35

y = 49082x - 1482,6

r = 0,9998

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

D i ệ n t í c h ( m A U . s

)

Nồng độ (ppm)

Vitamin B1

y = 101300x - 1540,8

r = 0,9999

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

D i ệ n t í c h ( m A U . s )

Nồng độ (ppm)

Vitamin B2





36

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ

của các vitamin B1 , B2 , B6 , B9.

y = 51540x + 111,79

r = 0,9997

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4


)

Nồng độ (ppm)

Vitamin B6

y = 53869x + 66,079

r = 0,9996

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3


)

Nồng độ (ppm)

Vitamin B9





37

Nhận xét: K ết quả trên cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát với mỗi

vitamin, có sự tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ:

-

Vitamin B1: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,054 ppm tới 2,430 ppm,

hệ số r là 0,9998.

- Vitamin B2: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,014 ppm tới 3,752 ppm,

hệ số r là 0,9999.


hệ số r là 0,9997.


hệ số r là 0,9996.

3.2.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng.

Tiến hành làm trên mẫu thử sữa bột Dutch Lady nguyên kem, làm 10 lần song

song. Tính giá trị xtb, độ lệch chuẩn SD, từ đó tính LOD = 3×SD, LOQ = 10×SD.

Thí nghiệm đƣợc tiến hành với: hệ số pha loãng của vitamin B1 là 8; B2 là 40;

B6 là 3; B9 là 1. Kết quả đƣợc trình bày trong các bảng sau:

Bảng 3.8: Kết quả thẩm định LOD, LOQ của vitamin B1.

Mẫu m (mg) Diện tích pic(mAU.s) Nồng độ (ppm)

1 1,0046 3326 0,076

2 1,0102 3325 0,076

3 1,0197 3489 0,080

4 1,0201 3462 0,079

5 0,9973 3166 0,072

6 1,0069 3126 0,0717 0,9956 3017 0,069

8 1,0145 3258 0,074

9 1,0211 3459 0,079

10 1,0267 3484 0,080

Trung bình 0,076

SD 0,004

LOD 0,012





38

R 6,34

LOQ 0,040

Với cách tính tƣơng tự nhƣ vitamin B1, ta có kết quả LOD, LOQ của vitamin

B2, B6, B9 đƣợc tổng hợp ở bảng 3.9 (Bảng chi tiết trình bày ở phụ lục 2, mục 2.4)

Bảng 3.9: Kết quả thẩm định LOD, LOQ của vitamin B2, B6, B9.

Vitamin SD LOD (ppm) R LOQ (ppm)

B2 0,001 0,004 6,16 0,012

B6 0,005 0,014 5,62 0,046

B9 0,003 0,009 7,23 0,028 3.2.6. Độ lặp lại, độ chính xác trung gian.

3.2.6.1. Độ lặp lại.

Tiến hành với mẫu Dutch Lady nguyên kem. Phân tích 6 mẫu độc lập và chạy

sắc ký với điều kiện nhƣ ở mục 3.1.4. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.10.

Bảng 3.10: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp.

B1 B2 B6 B9

Diện

tích pic

(mAU.s)

Hàm

lƣợng

mg/100g

Diện

tích pic

(mAU.s)

Hàm

lƣợng

mg/100g

Diện

tích pic

(mAU.s)

Hàm

lƣợng

mg/100g

Diện

tích pic

(mAU.s)

Hàm

lƣợng

mg/100g

29667 0,629 87082 0,868 13244 0,248 3575 0,065

31244 0,653 88837 0,873 13357 0,247 3362 0,060

27016 0,567 88755 0,870 13570 0,250 3077 0,055

29865 0,624 88669 0,870 12857 0,237 3308 0,059

28932 0,613 90609 0,900 13151 0,245 3288 0,059

31576 0,660 89118 0,877 13043 0,241 3540 0,063

Trung bình

0,624 0,876 0,245 0,060

RSD(%) 5,34 1,40 2,02 5,93





39

Nhận xét: Phƣơng pháp có độ lặp lại tốt, với giá trị RSD (%) của các vitamin

khi tiến hành 6 lần phân tích đều nhỏ hơn 11,00%. (phụ lục 2, mục 2.5)

3.2.6.2.

Độ chính xác trung gian.

Tiến hành xác định hàm lƣợng các vitamin B1, B2, B6, B9 trong mẫu thử ở ngày

khác. Tiến hành tƣơng tự xác định độ lặp lại với 6 mẫu độc lập ở ngày phân tích

khác. Độ chính xác trung gian của các vitamin trong mẫu thử đƣợc đánh giá trên 12

mẫu trong 2 ngày và kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.11.

Bảng 3.11: Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phƣơng pháp.

B1 B2 B6 B9

Diện

tích pic

(mAU.s)

Hàm

lƣợng

mg/100g

Diện

tích pic

(mAU.s)

Hàm

lƣợng

mg/100g

Diện

tích pic

(mAU.s)

Hàm

lƣợng

mg/100g

Diện

tích pic

(mAU.s)

Hàm

lƣợng

mg/100g

31954 0,677 88048 0,879 12878 0,241 3520 0,064

28416 0,597 91125 0,896 13048 0,241 3295 0,059

26793 0,565 90106 0,886 13428 0,248 3492 0,062

28904 0,611 91839 0,909 13357 0,249 3342 0,060

27018 0,569 89570 0,881 13243 0,245 3556 0,064

25522 0,561 88471 0,907 13045 0,251 3175 0,059

Trung bình

0,597 0,893 0,246 0,061

RSD(%) 7,40 1,45 1,70 3,72Trung

bình 2

ngày

0,610 0,885 0,245 0,061

RSD(%)2 ngày

6,55 1,69 1,80 4,80

Nhận xét : Độ lặp lại khác ngày đạt trong khoảng giới hạn (tất cả RSD (%) của

các vitamin đều nhỏ hơn 16,00% ( phụ lục 2, mục 2.5)), cho thấy phƣơng pháp có độ

lặp lại giữa các ngày khác nhau tốt.

Nhƣ vậy phƣơng pháp đã chọn có độ lặp lại và độ chính xác trung gian tốt, đạt

yêu cầu cho phép định lƣợng hoạt chất.





40

3.2.7. Độ thu hồi.

Xác định độ thu hồi của phƣơng pháp bằng phƣơng pháp thêm chuẩn vào mẫu

thử Dutch Lady nguyên kem đã biết hàm lƣợng hoạt chất. Lƣợng chuẩn thêm ở 3

mức nồng độ: nồng độ thấp, nồng độ trung bình và nồng độ cao. Tại mỗi mức nồng

độ, phân tích lặp lại 10 lần.

Chuẩn bị mẫu:

Các dung dịch chuẩn hỗn hợp: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc đơn trung

gian nhƣ mục 3.2.1.1, sau đó hút các thể tích vitamin phù hợp cho vào một bình

định mức 20,00 ml, định mức tới vạch bằng pha động A, lắc đều.

Cách pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp đƣợc trình bày trong bảng 3.12.

Bảng 3.12: Pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ thấp, trung bình và cao.

Dung dịch chuẩngốc đơn trung

gian (ppm)

Thể tích hút phachuẩn nồng độ

thấp


trung bình


cao

B1 48,60 1,25 ml 2,50 ml 8,00 mlB2 50,03 2,00 ml 4,00 ml 10,00 ml

B6 48,69 500 µl 1,00 ml 3,00 mlB9 53,12 125 µl 250 µl 700 µl

Định mức bằng pha động A trong bình định mức 20,00 ml

Mẫu chạy sắc ký: 10 mẫu độc lập/ một mức nồng độ.

- Cân chính xác khoảng 1g mẫu Dutch Lady nguyên kem vào ống nghiệm thủy

tinh 15 ml, thêm 4 ml nƣớc 18MΩ, lắc xoáy 1 phút.

- Thêm chính xác 1,00 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp vào ống nghiệm trên, lắc

đều. - Thêm chính xác 1,00 ml TCA 20%, lắc xoáy 1 phút, siêu âm 5 phút, ly tâm

3000 vòng trong 10 phút, lọc lấy dịch. Thêm pha động A đến 5ml.

- Hút 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm sạch, thêm 1 ml pha động A, lắc đều. Lọc

qua màng lọc 0,45 µm.

Tiến hành chạy sắc ký các mẫu đã chuẩn bị. Ghi sắc ký đồ, diện tích píc, tính hệ

số thu hồi các vitamin. Độ thu hồi của phƣơng pháp đƣợc tính theo công thức sau:





41

R(%)=

Với: Cc: Hàm lƣợng chuẩn thêm vào (mg/100g).

Cm: Hàm lƣợng vitamin có trong mẫu Dutch Lady nguyên kem (mg/100g).

Ct: Hàm lƣợng vitamin tính đƣợc của mẫu thêm chuẩn (mg/100g).

Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.13 và3.14.

Bảng 3.13: Kết quả thẩm định độ thu hồi của phƣơng pháp với vitamin B1.

B1

Cc

(mg/100g)

Cm

(mg/100g)

Ct

(mg/100g)

Hệ số thu

hồi (%)

Hệ số thu hồi

trung bình (%)

Thêm

chuẩn

nồng

độ

thấp

0,304 0,610 0,895 93,7

93,4

0,304 0,610 0,882 89,2

0,304 0,610 0,911 99,0

0,304 0,610 0,912 99,3

0,304 0,610 0,904 96,7

0,304 0,610 0,867 84,4

0,304 0,610 0,863 83,1

0,304 0,610 0,896 93,9

0,304 0,610 0,892 92,5

0,304 0,610 0,921 102,2

Thêm

chuẩn

nồngđộ

trung

bình

0,608 0,610 1,138 86,8

94,7

0,608 0,610 1,138 86,8

0,608 0,610 1,141 87,4

0,608 0,610 1,207 98,2

0,608 0,610 1,232 102,3

0,608 0,610 1,242 103,9

0,608 0,610 1,223 100,8

0,608 0,610 1,206 98,0

0,608 0,610 1,161 90,6

0,608 0,610 1,171 92,3

Thêm 1,944 0,610 2,313 87,6 95,5

1,944 0,610 2,425 93,3





42

chuẩn

nồng

độ cao

1,944 0,610 2,326 88,3

1,944 0,610 2,403 92,2

1,944 0,610 2,515 98,01,944 0,610 2,603 102,5

1,944 0,610 2,396 91,9

1,944 0,610 2,629 103,8

1,944 0,610 2,515 98,0

1,944 0,610 2,549 99,7

Với cách tính tƣơng tự nhƣ vitamin B1, ta có kết quả thẩm định độ thu hồi của

vitamin B2, B6, B9 trình bày ở bảng 3.14. (Bảng chi tiết đƣợc trình bày ở phụ lục 2,mục 2.6)

Bảng 3.14: Kết quả thẩm định độ thu hồi với vitamin B2, B6, B9

Hệ số thu hồi trung bình (%)

Thêm chuẩn nồng độ

thấp


trung bình


cao

B2 95,9 97,1 91,2

B6 97,8 103,3 96,2

B9 91,2 88,5 84,2

Nhận xét: Kết quả cho thấy phƣơng pháp có độ thu hồi cao với cả bốn vitamin,

hệ số thu hồi đáp ứng yêu cầu đạt từ 80% - 110% ( phụ lục 2, mục 2.6 )

3.2.8. Độ ổn định của các vitamin trong dung dịch chạy sắc ký.

Thời gian chạy sắc ký với mỗi mẫu là 30 phút, khi tiến hành phân tích nhiều

mẫu thì thời gian chạy tới mẫu cuối tƣơng đối dài. Chúng tôi tiến hành khảo sát độ

ổn định của các vitamin sau 24 giờ trong dung dịch chạy sắc ký với hai điều kiện

bảo quản tại -40C, tránh ánh sáng và tại nhiệt độ phòng (250C), tránh ánh sáng.

Mẫu phân tích: mẫu QC

Tiến hành làm song song 2 mẫu, chạy sắc ký ngay sau khi xử lý mẫu xong. Sau

đó bảo quản dịch chạy sắc ký: một mẫu bảo quản -40C, một mẫu để nhiệt độ phòng,





43

cả hai cùng tránh ánh sáng. Chạy sắc ký hai mẫu sau 24h bảo quản. Ghi sắc ký đồ,

diện tích pic và tính nồng độ các vitamin.

Kết quả nồng độ các vitamin đƣợc trình bày bảng sau:

Bảng 3.15: Kết quả độ ổn định của các vitamin.

Nồng độ ngaysau khi xử lý

mẫu (mg/100g)

Nồng độ sau 24htrong điều kiệnnhiệt độ -40C vàtránh ánh sáng

(mg/100g)

Nồng độ ngaysau khi xử lý

mẫu (mg/100g)

Nồng độ sau 24htrong điều kiệnnhiệt độ phòng

(250C), tránh ánhsáng (mg/100g)

B1 1,411 1,429 1,497 1,493B2 1,410 1,426 1,492 1,476

B6 1,376 1,389 1,403 1,385

B9 0,145 0,149 0,144 0,144

Nhận xét: Kết quả cho thấy dung dịch chạy sắc ký sau 24h ở cả hai điều kiện

bảo quản đều có nồng độ các vitamin thay đổi không đáng kể so với khi mới xử lý

mẫu xong.

3.3.

ỨNG DỤNG ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN B1, B2, B6, B9

TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO

TRẺ EM TRÊN THỊ TRƢỜNG.

Phƣơng pháp chọn mẫu thị trƣờng đƣợc trình bày ở mục 2.3.3.

Tiến hành xử lý các sữa thị trƣờng và chạy sắc ký với điều kiện nhƣ mục 3.1.4.

Mỗi mẫu làm 1 lần.

Hàm lƣợ ng các vitamin trong mẫu đƣợ c tính theo công thức sau:

X (mg/100g)=

Trong đó: Ct: nồng độ của các vitamin trong mẫu thử tính theo đƣờ ng chuẩn (ppm)

f: hệ số pha loãng của mẫu thử.

V: thể tích mẫu thử trƣớ c khi pha loãng (ml).

m: khối lƣợ ng mẫu thử (g).

K ết quả đƣợ c trình bày trong các b ảng 3.16, 3.17, 3.18 và3.19.





44

Bảng 3.16: Hàm lƣợ ng vitamin B1 trong một số sản phẩm dinh dƣỡ ng công

thứ c cho trẻ em trên thị trƣờ ng.

Hàm lƣợ ngvitamin

(mg/100g)Tênsản phẩm

Địa điểm 1 Địa điểm 2 Địa điểm 3 Trên nhãn

Sản phẩm 1 0,761 0,724 0,841 0,580

Sản phẩm 2 0,570 0,582 0,590 0,587

Sản phẩm 3 0,106 0,109 0,121 0,230Sản phẩm 4 0,110 0,091 0,119 0,204

Sản phẩm 5 0,564 0,566 0,573 0,526

Sản phẩm 6 0,725 0,747 0,713 0,540

Sản phẩm 7 0,651 0,549 0,615 0,450

Sản phẩm 8 0,597 0,578 0,523 0,430

Sản phẩm 9 0,701 0,721 0,718 0,660

Sản phẩm 10 0,531 0,528 0,654 0,390

Bảng 3.17: Hàm lƣợng vitamin B2 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công

thức cho trẻ em trên thị trƣờng.


(mg/100g)

Tên

sản phẩm


Sản phẩm 1 0,554 0,613 0,561 1,000

Sản phẩm 2 0,934 0,912 0,956 1,300

Sản phẩm 3 0,837 0,890 0,873 1,130

Sản phẩm 4 0,781 0,817 0,855 1,170

Sản phẩm 5 0,769 0,815 0,788 1,480

Sản phẩm 6 0,797 0,826 0,831 1,000





45

Sản phẩm 7 0,712 0,570 0,722 0,700

Sản phẩm 8 0,899 0,972 0,960 0,820

Sản phẩm 9 0,928 0,997 1,044 1,100Sản phẩm 10 0,926 1,022 0,951 0,660

Bảng 3.18: Hàm lƣợng vitamin B6 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng côngthức cho trẻ em trên thị trƣờng.


(mg/100g)

Tênsản phẩm


Sản phẩm 1 0,745 0,768 0,608 0,730

Sản phẩm 2 0,532 0,637 0,644 0,625

Sản phẩm 3 0,000 0,000 0,000 0,110

Sản phẩm 4 0,000 0,000 0,000 0,120

Sản phẩm 5 0,425 0,597 0,544 0,526Sản phẩm 6 0,295 0,305 0,308 0,320

Sản phẩm 7 0,447 0,354 0,369 0,385

Sản phẩm 8 0,238 0,247 0,231 0,310

Sản phẩm 9 0,445 0,381 0,427 0,400

Sản phẩm 10 0,247 0,191 0,293 0,410

Bảng 3.19: Hàm lƣợng vitamin B9 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng côngthức cho trẻ em trên thị trƣờng.


(mg/100g)

Tênsản phẩm


Sản phẩm 1 0,070 0,062 0,063 0,110





46

Sản phẩm 2 0,154 0,076 0,109 0,190

Sản phẩm 3 0,105 0,071 0,080 0,140

Sản phẩm 4 0,097 0,067 0,125 0,150Sản phẩm 5 0,000 0,000 0,000 0,030

Sản phẩm 6 0,065 0,066 0,069 0,065

Sản phẩm 7 0,106 0,097 0,093 0,100

Sản phẩm 8 0,060 0,066 0,053 0,087

Sản phẩm 9 0,066 0,075 0,079 0,076

Sản phẩm 10 0,063 0,073 0,073 0,083

Nhận xét:

- Vitamin B1: sản phẩm 2, 5, 9 có hàm lƣợng xấp xỉ trên nhãn (96,15% –

109,3%). Sản phẩm 3, 4 có kết quả hàm lƣợng thấp hơn hàm lƣợng ghi trên

nhãn (44,4% - 58,2%). Các sản phẩm 1, 6, 7, 8, 10 đều cho hàm lƣợng B1 cao

hơn trên nhãn (121,5% - 167,6%).

- Vitamin B2: sản phẩm 6, 7, 8, 9 có hàm lƣợng xấp xỉ so với trên nhãn (80,0% -

118,6%); các sản phẩm 1, 2, 3, 4, 5 có kết quả hàm lƣợng thấp hơn hàm lƣợng

ghi trên nhãn (51.9% - 78,8%); sản phẩm 10 có hàm lƣợng cao hơn trên nhãn

(140,3% - 154,9%).

- Vitamin B6: Các sản phẩm 1, 2, 5, 6, 7, 9 đều cho kết quả hàm lƣợng vitamin

xấp xỉ hàm lƣợng trên nhãn (80,7% – 116,1%). Sản phẩm 8, 10 có kết quả hàm

lƣợng B6 thấp hơn trên nhãn (46,6% - 79,6%). Đặc biệt, sản phẩm 3 và 4 đều

không tìm thấy vitamin B6 ở cả 3 địa điểm.

-

Vitamin B9: sản phẩm 6, 7, 9 cho hàm lƣợng B9 xấp xỉ lƣợng trên nhãn (87,2%- 105,8%). Các sản phẩm 1, 2, 3, 4, 8, 10 có kết quả hàm lƣợng thấp hơn hàm

lƣợng nghi trên nhãn (39,8% - 76,3%). Đặc biệt, sản phẩm 5 không tìm thấy

viatmin B9 ở cả 3 địa điểm.





47

BÀN LUẬN1. Phương pháp xử lý mẫ u.

Mẫu sản phẩm dinh dƣỡ ng công thức cho tr ẻ em chứa các vitamin B1, B2, B6 vàB9 đƣợ c hòa tan trong nƣớ c 18MΩ, k ết tủa loại protein bằng TCA, sau đó siêu âm,

lọc thu dịch để bơm chạy sắc ký. Phƣơng pháp xử lý mẫu này có ƣu điểm: đơn giản;

phân tích đƣợc đồng thờ i bốn vitamin, thờ i gian phân tích hợ p lý; thiết bị thông

dụng, dễ thực hiện trong phòng thí nghiệm ở Việt Nam, dễ triển khai, tiết kiệm chi

phí.

2. Khảo sát điề u kiện sắ c ký HPLC.

Các điều kiện sắc ký HPLC đƣợ c khảo sát dựa trên những nghiên cứu trƣớc đó

và tài liệu đã công bố. Nghiên cứu này khảo sát 3 yếu tố: cột sắc ký, gradient pha

động và detector cùng bƣớ c sóng phát hiện. K ết quả đã chọn đƣợ c những điều kiện

sắc ký cho hiệu suất cao và thờ i gian chạy sắc ký phù hợ p.

Ƣu điểm: điều kiện sắc ký tƣơng đối đơn giản và cho khả năng tách tốt các

vitamin trong mẫu nhiều thành phần, rút ngắn thời gian phân tích. Đồng thời

phƣơng pháp HPLC là phƣơng pháp hiện đại đƣợc ứng dụng rộng rãi trên thế giớivà ở Việt Nam do có những ƣu điểm nối trội về độ ổn định, độ chính xác cao.

Việc đánh giá phƣơng pháp qua những tiêu chí thẩm định phƣơng pháp cho

thấy chƣơng trình HPLC đã xây dựng là đáng tin cậy. Ngoài ra, đa số các trung tâm

kiểm nghiệm và cơ sở sản xuất hiện nay đều có hệ thống HPLC, có thể triển khai và

ứng dụng phƣơng pháp vào thực tế.





48

KẾT LUẬN

Từ kết quả thu đƣợc chúng tôi có kết luận sau:

1.

Đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B1 , B2 ,

B6 , B9 trong các loại sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em bằng phương

pháp HPLC. Cụ thể là:

Quy trình xử lý mẫu:

+ 4 ml nƣớc 18MΩ + Lắc xoáy khoảng 1 phút

+ 1ml TCA 20%

+ Vortex 1 phút.

+ Siêu âm 5 phút

+ Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút

+ Lọc

+ Rửa tủa, định mức bằng pha động A vừa đủ 10 ml

+ Hút 1ml dịch + 1 ml pha động A

+ Trộn đều, lọc qua màng lọc 0,45µm

Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: Agllent HC C18(2) (150 x 4,6 mm; 5µm), nhiệt độ cột: 35oC.

- Detector: PAD

- Bƣớc sóng phát hiện: Vitamin B1 tại 246nm, B2 tại 267nm, B6 và B9 tại 290nm

- Pha động:

Hỗn hợ p

Dịch lọc

Dịch tiêm sắc

Cân 1g mẫu bột sữa vào ốngn hi m thủ tinh 15ml





49

Pha động A: 0,5g natri heptan sulfonat + 1,14g H3PO4 đặc. Hoàn tan,

định mức vừa đủ 1 lít bằng nƣớc 18MΩ. Trộn đều, lọc qua màng lọc

đƣờng kính lỗ lọc 0,45µm, rung siêu âm 15 phút.

Pha động B: Methanol.

Chế độ rửa giải: gradient theo thời gian:

- Thể tích tiêm: 20 µl.

2. Thẩm định được phương pháp định lượng đã xây dự ng.

K ết quả thẩm định:

- Phƣơng pháp có tính chọn lọc vớ i các vitamin: thời gian lƣu của vitamin B1,

B2, B6, B9 lần lƣợ t khoảng 21,1 phút; 16,9 phút; 14,6 phút; 16,3 phút. Pic của

các vitamin rõ nét, cân đối và tách riêng ra khỏi các pic khác.

- Có sự tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ giữa đáp ứng phân tích và nồng độ của

các vitamin:

Vitamin B1: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,054 ppm tớ i 2,430

ppm, hệ số r là 0,9998.






ppm, hệ số r là 0,9996

Thời gian

(phút)

Lƣu lƣợng dòng

(ml/phút)%A %B Curve

0 1,00 90 104 1,00 90 10 618 1,00 60 40 622 1,00 90 10 1125 1,00 90 10 11





50

- Phƣơng pháp có giới hạn phát hiện của các vitamin B1, B2, B6, B9 lần lƣợt là

là 0,012 ppm; 0,004 ppm; 0,014 ppm; 0,009 ppm; giới hạn định lƣợng lần

lƣợt là 0,040 ppm; 0,012 ppm; 0,046 ppm; 0,028 ppm.

- Phƣơng pháp có độ thu hồi tốt: B1 (93,4%-95,5%), B2 (91,2%-97,1%), B6

(96,2%-103,3%), B9 (84,2%-91,2%); độ lặp lại và độ chính xác trung gian

đảm bảo.

- Độ ổn định: các vitamin trong dịch chạy sắc ký ổn định trong vòng 24h sau

khi xử lý mẫu xong (bảo quản -40C, tránh ánh sáng hoặc nhiệt độ phòng

(250C), tránh ánh sáng).

3. Đã xác định được đồng thời hàm lượ ng các vitamin B1 , B2 , B6 , B9 trong 30 mẫ u

sữ a công thứ c cho tr ẻ em trên thị trườ ng .

- Hàm lƣợ ng bốn vitamin B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm tại các địa

điểm khác nhau có sự dao động lớ n so với hàm lƣợng đƣợ c ghi trên nhãn: B1

(44,4% - 167,6%), B2 (51,9% - 154,9%), B6 (46,6% - 116,1%), B9 (39,8% -

105,8%).

-

Sản phẩm 9 cho hàm lƣợ ng cả 4 vitamin đều xấ p xỉ hàm lƣợ ng trên nhãn(81,7% - 111,3%) (ở cả 3 địa điểm).

- Sản phẩm 3, 4 cho hàm lƣợ ng cả 4 vitamin đều thấp hơn trên nhãn (0% -

78,8%) (ở cả 3 địa điểm).

- Vitamin B1, B2, B6, B9 là các vitamin tan trong nƣớ c, kém bền trong đó

vitamin B9 dễ bị phân hủy nhất bởi tác động của: nhiệt độ, ánh sáng, acid,

base,… Vì vậy để đảm bảo hàm lƣợ ng các vitamin trong sản phẩm, các nhà

sản xuất cần phải tuân thủ đúng yêu cầu k ỹ thuật cũng nhƣ tiêu chuẩn an toàn

thực thẩm của nhà nƣớ c.





51

ĐỀ XUẤTDựa vào những kết quả đã đạt đƣợc từ khóa luận, chúng tôi xin đƣa ra một vài

đề xuất nhƣ sau: 1. Tiếp tục nghiên cứu phương pháp, mở rộng định lượng đồng thời với nhiều

vitamin tan trong nước khác: B3 , B5 , B12 , C.

2. Tiếp tục nhiên cứu phương pháp , mở rộng các đối tượng nghiên cứu khác

như: sữa lỏng, gạo, rau, củ quả...là các nhóm đối tượng mẫu giàu vitamin

nhóm B nhưng có nền mẫu phức tạp khi thực hiện quá trình xử lý mẫu.

3. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng các vitamin B1 ,

B2 , B6 , B9 trong các sản phẩm dinh dưỡng trên thị trường (sữa bột, bột dinh

dưỡng).





TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Dƣơng Thị Tú Anh, Mai Xuân Trƣờng (2006), "Định lƣợng đồng thờ i các

vitamin B1, B2 và B6 trong viên nén Narotex theo phƣơng pháp lọc

Kalman", T ạ p chí khoa học và công nghệ Đại học t ự nhiên, số 2 (38), t ậ p 2,

pp. 66-69.

2. Bộ Y tế (2013), Kiể m nghiệm dượ c phẩ m, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp.

84-105.

3. Bộ Y tế (2012), Quy chuẩ n quốc gia đố i vớ i sản phẩm dinh dưỡ ng công thứ ccho tr ẻ đế n 12 tháng tuổ i, QCVN 11-1/2012.

4. Bộ Y tế (2012), Quy chuẩ n quốc gia đố i vớ i sản phẩm dinh dưỡ ng công thứ c

vớ i mục đích ăn bổ sung cho tr ẻ t ừ 6 đế n 36 tháng tuổ i, QCVN 11-3/2012.

5. Bộ Y tế (2012), Quy chuẩ n quốc gia đố i vớ i sản phẩm dinh dưỡ ng công thứ c

vớ i mục đích y tế đặc biệt cho tr ẻ đế n 12 tháng tuổ i, QCVN 11-2/2012.

6. Bộ Y tế (2009), Dược điể n Việt Nam IV , Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp.

239, 247, 279.7. Bộ Y tế (2009), Hướ ng d ẫ n của Asean về thẩm định quy trình phân tích,

Phụ l ục 7 – Thông tư 22/2009/TT - BYT Quy định về đăng ký thuố c.

8. Bộ Y tế (2007), Dượ c lý học t ậ p 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp. 333-

338.

9. Bộ Y tế (2007), Hóa dượ c t ậ p 1, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp. 226-242.

10. Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích t ậ p 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp. 123-

143, 168-200.

11. Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mạc, Từ Vọng Nghi (2007), Cơ sở hóa học

phân tích, Nhà xuất bản Khoa học và k ỹ thuật, Hà Nội, pp. 341-361.

12. Phạm Thị Thanh Hà, Phan Mai Phƣơng, Nguyễn Thị Thanh Nhài (2010),

"Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng các vitamin tan trong nƣớ c trong thuốc

và thực phẩm bổ sung bằng điện di mao quản", T ạp chí Dượ c học, S ố 410,

pp. 53-56.





13. Tr ần Tứ Hiếu và cộng sự (2007), Hóa học phân tích phần 2: Các phương

pháp phân tích d ụng cụ, Nhà xuất bản Khoa học và k ỹ thuật, Hà Nội, pp.

267-295, 372-376.

14. Tr ần Tứ Hiếu, Mai Xuân Trƣờng, Đặng Ứ ng Vận (2007), "Phƣơng pháp trắc

quang định lƣợng đồng thờ i các vitamin B1, B2, B6, B12 và Vitamin PP

trong hỗn hợp theo phƣơng pháp lọc Kalman", T ạ p chí phân tích Hóa, Lý và

Sinh học, S ố 2, pp. 20-25.

15. Vũ Đặng Hoàng (1999), K ế t quả bước đầu định lượ ng 5 vitamin (B1, B2, B6,

Pp, C ) và 2 vi kim loại ( Zn,Fe ) trong 4 chế phẩ m Polyvitamin bằ ng k ỹ

thuật cự c phổ sóng vuông , Luận văn thạc sĩ dƣợ c học, Trƣờng Đại học Dƣợ c

Hà Nội.

16. Tr ần Cao Sơn-Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia

(2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật , Nhà

xuất bản Khoa học và k ỹ thuật, Hà Nội, pp. 10-59.

17. Tiêu chuẩn Việt Nam (2012), TCVN 9513:2012 Thự c phẩ m - Xác đinh

vitamin B6 (bao g ồm các d ạng glycosyl) bằ ng sắ c ký l ỏng hiệu năng cao(HPLC).

18. Tiêu chuẩn Việt Nam (2011), TCVN 8975 : 2011 Thự c phẩ m - Xác đinh

vitamin B2 bằ ng sắ c ký l ỏng hiệu năng cao (HPLC).

19. Tiêu chuẩn Việt Nam (2011), TCVN 8976:2011 Thự c phẩ m - Xác đinh

vitamin B6 bằ ng phép thử vi sinh.

20. Tiêu chuẩn Việt Nam (2011), TCVN 8978:2011 Thự c phẩ m - Xác định folat

bằ ng phép thử vi sinh.

21. Tiêu chuẩn Việt Nam (2008), TCVN 5162 : 2008 Thự c phẩ m - Xác đinh

vitamin B1 bằ ng sắ c ký l ỏng hiệu năng cao (HPLC).

TIẾNG ANH

22. Soledad Albalá-Hurtado, M. Teresa Veciana-Nogués, María Izquierdo-

Pulido, Abel Mariné-Font (1997), "Determination of water-soluble





vitamins in infant milk by high-performance liquid chromatography",

Journal of Chromatography A 778, pp. 247-253.

23. AOAC 942.23 ( 2005), Thiamine (Vitamin B1) in Human and Pet Foods,

Fluorometric Method .

24. AOAC 970.65 (2005), Riboflain (Vitamin B2) in Foods and Vitamin

Preparations, Fluorometric Method .

25. AOAC 985.32 (2005), Vitamin B6 (Pyridoxine, Pyridoxal, Pyridoxamine) in

Ready-To-Feed Milk-Based Infant Formula, Microbiological Method .

26. AOAC 985.34 (2005), Niacin and Niacinamide (Nicotinic Acid and

Nicotinamide) in Ready-To-Feed Milk-Based Infant Formula,

Microbiological-Turbidimetric Method .

27. AOAC 992.05 (2005), Folic Acid (Pteroylglutamic Acid) in Infant Formalu,

Microbiological Methods.

28. AOAC 2012.16 (2012), Pantothenic Acid (Vitamin B5) in Infant Formula

and Adult/Pediatric Nutritional Formula, Ultra-Performance Liquid

Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Method .29. AOAC 986.27 (2005), Thiamine (Vitamin B1) in Milk-Based Infant Formula,

Fluorometric Method .

30. AOAC Official Method 2004.07 (2005), Vitamin B6 in reconstitute infant

formula, Liquid chromatographic method. First action 2004.

31. AOAC official methods of analysic (2012), Guidelines for standard method

performance requirements.

32. Asean (2009), Guidelines for valdatin of analytical procedures.

33. Baiyi Lu, Yiping Ren, Baifen Huang, Wenqun Liao, Zengxuan Cai, and

Xiaowei Tie (2008), "Simultaneous Determination of Four Water-Soluble

Vitamins in Fortified Infant Foods by Ultra-Performance Liquid

Chromatography Coupled with Triple Quadrupole Mass Spectrometry",

Chromatographic Science, 46, pp. 225-232.





34. Byung Kyu Lee, Joon Hyuk Suh, Dong-Hyug Yang, Han Young Eom,

Unyong Kim, Junghyun Kim, Hyeyeon Lee, and Sang Beom Han (2011),

"Simultaneous Determination of B Group Vitamins inSupplemented Food

Products by High Performance Liquid Chromatography-Diode Array

Detection", Bull. Korean Chemical Society, 32(8), pp. 2648-2656.

35. Gerald F. Combs, Jr. (2008), The vitamins: Fundamental Aspects in

Nutrition and Health Third Edition, pp. 52-57.

36. ICH (1996), Guidance for Industry, Q2B Validation of Analytical

Procedures: Methodology.

37. Paul Lawrance, LGC, Analytical procedures for the determintion of vitamins

B1 and B2 in foods, feeds and supplements. 2007, A report published as part

of the Government Chemist Programme Project CB1.4- The determination of

B- Vitamins.

38. Pedro L. López-de-Alba, Leticia Lopez-Martinez, Victor Cerdáb and Judith

Amador -Hemandez (2006), J.Braz.Chem.Soc., Vol. 17, No. 4, pp. 715-722.

39. Carmela Mennella, Vincenzo Fogliano, Fortuna Riccio (2006), "Effect ofcooking on the concentration of Vitamins B in fortified meat products",

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41(5), pp. 1592 – 1595.

40. Mahmure Ustun OZGUR, KOYUNCU Ikbal (2002), "Determination of

Ternary Mixtures of Vitamins (B1, B6, B12) by Zero-Crossing Derivative

Spectrophotometry", Turk J Chem, 26, pp. 385- 391.





PHỤ LỤC 1

MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ KHI XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU

1.1. KHẢO SÁT THỂ TÍCH TCA 20%





1.2. KHẢO SÁT CÁCH LẮC MẪU





1.3. KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT





PHỤ LỤC 2

MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ, KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP

2.1.

ĐỘ PHÙ HỢP CỦA HỆ THỐNG





2.2. MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ THẨM ĐỊNH ĐỘ CHỌN LỌC





1. S ắc ký đồ thẩm định độ chọn l ọc của vitamin B2 (267nm).

Mẫu tr ắng

Dung dịchchuẩn hỗn hợ p





2.2.2. S ắc ký đồ thẩm định độ chọn l ọc của vitamin B6 , B9 (290nm).

Sữa bột Dutch

Lady nguyênkem

Mẫu tr ắng





Dung dịchchuẩn hỗn hợ p

Sữa bột DutchLady nguyên

kem





2.3. MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ THẨM ĐỊNH ĐỘ TUYẾN TÍNH





2.4. MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ THẨM ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT HIỆN,

GIỚI HẠN ĐỊNH LƢỢNG





Kết quả thẩm định LOD, LOQ của các vitamin B2, B6, B9.

Mẫu m (mg)

Vitamin B2 Vitamin B6 Vitamin B9

Diện tích pic

(mAU.s) Nồng độ (ppm)

Diện tích pic


Diện tích pic


1 1,0046 2024 0,020 3846 0,073 3575 0,0652 1,0102 2235 0,022 4097 0,077 3362 0,061

3 1,0197 2137 0,021 3982 0,075 3520 0,064

4 1,0201 2188 0,022 4123 0,078 3077 0,056

5 0,9973 2132 0,021 4381 0,083 3308 0,060

6 1,0069 2304 0,023 3982 0,075 3295 0,060

7 0,9956 2308 0,023 3754 0,071 3288 0,060

8 1,0145 2417 0,024 4227 0,080 3492 0,064

9 1,0211 2342 0,023 4347 0,082 3540 0,065

10 1,0267 2134 0,021 4481 0,085 3342 0,061

Trung

bình0,022 0,078 0,062

SD 0,001 0,005 0,003





LOD 0,004 0,014 0,009

R 6,16 5,62 7,23

LOQ 0,012 0,046 0,028





2.5. MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ THẨM ĐỊNH ĐỘ LẶP LẠI, ĐỘ CHÍNH

XÁC TRUNG GIAN.





Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau theo AOAC.

TT

Hàm lƣợng

(%) Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%)

1 100 1 100% 1,3

2 ≥ 10 10- 10% 1,9

3 ≥ 1 10- 1% 2,7

4 ≥ 0,1 10-3 0,1% 3,7

5 0,01 10- 100 ppm 5,3

6 0,001 10- 10 ppm 7,3

7 0,0001 10-6 1 ppm 11

8 0,00001 10- 100 ppb 15

9 0,000001 10- 10 ppb 21

10 0,0000001 10-9 1 ppb 30

Độ chính xác khác ngày tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác

nhau theo AOAC.

Nồng độ RSD (%)

100% 2

1% 4

0,01% 8

1 ppm 16

10 ppb 32

1 ppb 45





2.6. MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ THẨM ĐỊNH ĐỘ THU HỒI.

BẢNG KẾT QUẢ CHI TIẾT CỦA CÁC VITAMIN.





Kết quả thẩm định độ thu hồi của phƣơng pháp với vitamin B2.

B2

Cc

(mg/100g)

Cm

(mg/100g)

Ct

(mg/100g)

Hệ số thu

hồi (%)

Hệ số thu hồi

TB (%)

Nạp

chuẩn

nồngđộ

thấp

0,500 0,885 1,313 85,7

95,9

0,500 0,885 1,368 96,5

0,500 0,885 1,351 93,2

0,500 0,885 1,348 92,7

0,500 0,885 1,341 91,2

0,500 0,885 1,406 104,2

0,500 0,885 1,375 98,1

0,500 0,885 1,347 92,5

0,500 0,885 1,403 103,6

0,500 0,885 1,393 101,5

Nạp

chuẩn

nồng

độ

trung

bình

1,001 0,885 1,774 88,9

97,1

1,001 0,885 1,787 90,2

1,001 0,885 1,793 90,8

1,001 0,885 1,925 104,0

1,001 0,885 1,916 103,0

1,001 0,885 1,948 106,2

1,001 0,885 1,850 96,5

1,001 0,885 1,928 104,2

1,001 0,885 1,841 95,6

1,001 0,885 1,797 91,2

Nạp

chuẩn

2,502 0,885 3,151 90,6

91,22,502 0,885 3,168 91,3

2,502 0,885 3,086 88,0





nồng

độ

cao

2,502 0,885 3,236 94,0

2,502 0,885 3,164 91,1

2,502 0,885 3,153 90,7

2,502 0,885 3,183 91,9

2,502 0,885 3,240 94,1

2,502 0,885 3,169 91,3

2,502 0,885 3,113 89,1


B6

Cc

(mg/100g)

Cm

(mg/100g)

Ct

(mg/100g)

Hệ số thu

hồi (%)

Hệ số thu hồi

TB (%)

Nạpchuẩn

nồng

độ

thấp

0,122 0,245 0,365 98,9

97,8

0,122 0,245 0,361 95,5

0,122 0,245 0,366 99,5

0,122 0,245 0,366 99,0

0,122 0,245 0,366 99,2

0,122 0,245 0,369 101,4

0,122 0,245 0,362 96,1

0,122 0,245 0,361 95,5

0,122 0,245 0,360 94,2

0,122 0,245 0,365 98,8

Nạp

chuẩn

nồng

độ

0,244 0,245 0,508 107,8

103,3

0,244 0,245 0,496 102,9

0,244 0,245 0,486 98,7

0,244 0,245 0,492 101,3

0,244 0,245 0,500 104,5





trung

bình

0,244 0,245 0,496 103,1

0,244 0,245 0,491 100,8

0,244 0,245 0,501 105,0

0,244 0,245 0,512 109,7

0,244 0,245 0,486 98,8

Nạpchuẩn

nồng

độ

cao

0,730 0,245 0,900 89,6

96,2

0,730 0,245 0,972 99,5

0,730 0,245 0,972 99,5

0,730 0,245 0,922 92,6

0,730 0,245 0,938 94,9

0,730 0,245 0,924 92,9

0,730 0,245 0,953 97,0

0,730 0,245 0,984 101,1

0,730 0,245 0,946 96,0

0,730 0,245 0,970 99,2


B9

Cc

(mg/100g)

Cm

(mg/100g)

Ct

(mg/100g)

Hệ số thu

hồi (%)

Hệ số thu hồi

TB (%)

Nạp

chuẩn

nồng

độ

thấp

0,033 0,061 0,088 83,7

91,2

0,033 0,061 0,092 94,0

0,033 0,061 0,090 87,7

0,033 0,061 0,092 94,7

0,033 0,061 0,088 83,0

0,033 0,061 0,092 94.3

0,033 0,061 0,090 96,0





0,033 0,061 0,092 94,9

0,033 0,061 0,090 88,5

0,033 0,061 0,092 94,8

Nạp

chuẩn

nồng

độ

trung

bình

0,066 0,061 0,116 82,9

88,5

0,066 0,061 0,117 84,9

0,066 0,061 0,122 91,7

0,066 0,061 0,121 90,2

0,066 0,061 0,123 94,3

0,066 0,061 0,117 84,6

0,066 0,061 0,122 93,1

0,066 0,061 0,121 90,4

0,066 0,061 0,118 86,1

0,066 0,061 0,118 86,3

Nạp

chuẩn

nồng

độ

cao

0,186 0,061 0,217 83,9

84,2

0,186 0,061 0,222 86,6

0,186 0,061 0,218 84,8

0,186 0,061 0,217 84,2

0,186 0,061 0,215 83,1

0,186 0,061 0,214 82,5

0,186 0,061 0,218 84,8

0,186 0,061 0,219 85,4

0,186 0,061 0,218 84,4

0,186 0,061 0,214 82,3





Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC:

TT

Hàm lƣợng

(%) Tỷ lệ chất Đơn vị

Độ thu hồi

(%)

1 100 1 100% 98-102

2 ≥ 10 10- 10% 98-102

3 ≥ 1 10- 1% 97-103

4 ≥ 0,1 10-3 0,1% 95-105

5 0,01 10- 100 ppm 90-107

6 0,001 10- 10 ppm 80-110

7 0,0001 10-6 1 ppm 80-110

8 0,00001 10- 100 ppb 80-110

9 0,000001 10- 10 ppb 60-115

10 0,0000001 10-9 1 ppb 40-120





2.7. SẮC KÝ ĐỒ XÁC ĐỊNH ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CÁC VITAMIN

TRONG DUNG DỊCH CHẠY SẮC KÝ





PHỤ LỤC 3

MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ CỦA MẪU THỊ TRƢỜNG



xây dựng quy trình định lượng đồng thời các vitamin b1, b2, b6, b9 trong sản...

Documents