Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của

bệnh nhân ung thƣ gan

Lê Lan Phƣơng

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Ngƣời hƣớng dẫn: PGS. TS. Trịnh Hồng Thái

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thƣ so với

mô gan bình thƣờng của các bệnh nhân ung thƣ gan thông qua các điểm

protein trên bản gel điện di hai chiều. Nhận dạng đƣợc một số protein có

phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thƣ gan) đặc hiệu với các kháng thể

trong huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ gan. Đƣa ra kết quả và bà luận: tách

triết Protein từ mô gan; phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều; nhận

dạng Protein bằng phƣơng pháp Maldi-Tof MS; thẩm tách miễn dịch-

Western Blot hai chiều; đặc điểm, vai trò của các protein biểu hiện khác

biệt.

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Bệnh ung thƣ; Ung thƣ gan; Bệnh nhân;

Miễn dịch

Content

Ung thƣ gan hiện là một trong các loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới và Việt

Nam, đây là bệnh ung thƣ có tỷ lệ tử vong cao, hơn nữa, tỷ lệ mắc bệnh đang có xu hƣớng

tăng lên. Hiện nay, các phƣơng pháp xét nghiệm lâm sàng nhƣ: sinh thiết gan, chụp cắt

lớp vi tính, siêu âm chẩn đoán hình ảnh và xác định các chỉ thị sinh học nhƣ anpha

fetoprotein là các “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán ung thƣ gan. Tuy nhiên, các xét

nghiệm này chỉ phát hiện đƣợc bệnh vào giai đoạn muộn làm giảm khả năng sống sót của

bệnh nhân ung thƣ gan. Nhu cầu đặt ra là phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học mới giúp

chẩn đoán, phát hiện ung thƣ gan ở giai đoạn sớm.

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm kiếm

các chỉ thị ung thƣ gan sử dụng công cụ proteomics. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chứng

minh rằng các protein nội bào có liên quan đến quá trình hình thành khối u, kích thích

đáp ứng miễn dịch sinh ra các tự kháng thể và nhiều kháng nguyên ung thƣ đã đƣợc xác

định trong cơ thể bệnh nhân ung thƣ. Vì thế, các tự kháng thể có thể đƣợc dùng để chẩn

đoán lâm sàng ung thƣ và dùng trong phân tích proteomics để nhận dạng các kháng

nguyên liên quan đến khối u có khả năng liên quan đến sự chuyển dạng ác tính của tế

bào. Đây là hƣớng nghiên cứu mới nhằm tìm kiếm các chỉ thị sinh học ung thƣ liên quan

đến đáp ứng miễn dịch.

Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác định

kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan” nhằm mục đích: (a)

Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng của

bệnh nhân ung thƣ gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện di hai chiều. (b)

Nhận dạng đƣợc một số protein khác biệt đặc trƣng giữa mô gan ung thƣ so với mô gan

bình thƣờng. (c) Xác định đƣợc protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thƣ

gan) đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ gan.

Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm

Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học

Quốc gia Hà Nội.

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ GAN

Ung thƣ gan gồm hai dạng là ung thƣ gan nguyên phát và ung thƣ gan thứ phát (di

căn). Ung thƣ gan nguyên phát là ung thƣ xuất phát từ các loại tế bào gan, chiếm trên 80%

ung thƣ gan nguyên phát, vì vậy, trong phạm vi luận văn này, chúng tôi chỉ đề cập tới ung

thƣ gan nguyên phát với dạng phổ biến nhất là ung thƣ tế bào biểu mô gan (Hepatocellular

Carcinoma-HCC) thƣờng gọi là ung thƣ gan.

1.1.1. Phân loại ung thƣ gan nguyên phát

Dựa vào phân loại mô bệnh học và loại tế bào phát sinh ung thƣ, ung thƣ gan

nguyên phát đƣợc phân thành các loại chính nhƣ sau:

- Ung thƣ tế bào biểu mô gan là dạng ung thƣ biểu mô hay gặp nhất trong ung thƣ

gan.

- Ung thƣ tế bào ống mật, đây là dạng ung thƣ bắt đầu ở các đƣờng mật nhỏ trong

gan.

- U nguyên bào gan là loại u gan ác tính ở trẻ em, hiếm gặp ở ngƣời lớn.

- Ung thƣ tế bào mạch là loại ung thƣ rất hiếm gặp, nó bắt nguồn từ mạch máu trong

gan do gan tiếp xúc với các hóa chất công nghiệp.

1.1.2. Nguyên nhân dẫn tới ung thƣ gan

Mặc dù vẫn còn nhiều tranh cãi về cơ chế chính xác dẫn đến ung thƣ gan, song các

nghiên cứu đều chỉ ra rằng tác nhân gây ung thƣ là đa nhân tố và quá trình tiến triển

thành ung thƣ rất phức tạp, phải trải qua nhiều bƣớc. Các yếu tố nguy cơ chính có thể tiến

triển thành HCC bao gồm: các tác nhân gây bệnh nhƣ nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis

B virus - HBV), virus viêm gan C (Hepatitis C virus - HCV) dẫn tới viêm gan mạn tính;

xơ gan; các loại hóa chất nhƣ: rƣợu, aflatoxin B1, vinyl chlorid, asen hoặc các rối loạn

trao đổi chất nhƣ nhiễm sắt ở mô, bệnh thiếu hụt α1 - antitrypsin. Tuy rằng, các yếu tố

nguy cơ có thể tác động đến tế bào gan theo các con đƣờng khác nhau nhƣng cuối cùng

đều làm biến đổi di truyền và dẫn đến hình thành tế bào ung thƣ. Ngoài ra, các yếu tố

khác nhƣ tuổi, giới tính và chủng tộc cũng góp phần làm tăng nguy cơ bị ung thƣ gan.

1.1.3. Các giai đoạn của ung thƣ gan

Căn cứ theo Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng Quốc tế bệnh ung thư (năm 1993), ung

thƣ gan đƣợc phân loại thông qua các chẩn đoán lâm sàng, sử dụng kỹ thuật hình ảnh để

xác định kích cỡ khối u nguyên phát và tình trạng bị xâm lấn các mạch máu. Ngoài cách

phân giai đoạn theo kích thƣớc u, hạch lympho, di căn (Tumor Node Metastasis - TNM),

ung thƣ gan còn đƣợc phân loại thành 4 giai đoạn, gồm: giai đoạn I (T1, N0, M0), II (T2,

N0, M0), IIIA (T3, N0, M0)/B (T4, N0, M0)/C (T bất kỳ, N1, M0) và giai đoạn IV (T bất kỳ,

N bất kỳ, M1).

1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ gan

Hiện nay, phát hiện HCC chủ yếu dựa vào việc xét nghiệm máu để định lƣợng

alpha fetoprotein (AFP) trong huyết thanh. Tuy vậy, AFP trong máu không đặc trƣng cho

ung thƣ gan vì nồng độ AFP có thể cũng tăng trong một số trƣờng hợp khác. Xét nghiệm

AFP cũng không nhạy bởi có khoảng 15% - 30% bệnh nhân ung thƣ gan mà hàm lƣợng

AFP vẫn không tăng, nhất là đối với các khối u gan nhỏ hơn 3cm. Hàm lƣợng AFP cao có

thể nghĩ đến ung thƣ gan nhƣng không thể là yếu tố quyết định chắc chắn. Vì thế, để chẩn

đoán ung thƣ gan cần kết hợp xét nghiệm định lƣợng AFP và chẩn đoán hình ảnh bằng siêu

âm, chụp cắt lớp vi tính hay chụp cộng hƣởng từ để có thể thấy đƣợc hình dạng, kích thƣớc

và kết cấu của khối u, nhƣng để chẩn đoán chính xác u lành tính hay ác tính thì nhất thiết

phải sinh thiết gan. Tuy nhiên, sinh thiết gan dễ gây biến chứng. Do đó, cần tìm kiếm các

chỉ thị sinh học có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn để hỗ trợ cho AFP giúp chẩn đoán sớm

ung thƣ gan.

1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ

Chỉ thị sinh học là các phân tử đƣợc tìm thấy trong máu, các loại dịch của cơ thể

hoặc trong mô đặc trƣng cho một quá trình sinh lý hoặc các giai đoạn bệnh lý. Chỉ thị

sinh học có thể đƣợc dùng để xem xét đáp ứng của cơ thể đối với một phác đồ điều trị

bệnh hoặc một trạng thái nhất định. Các chỉ thị ung thƣ là những đại phân tử xuất hiện ở

một bệnh ung thƣ, có nồng độ thay đổi theo chiều hƣớng tăng lên liên quan đến sự phát

sinh và tăng trƣởng của những khối u ác tính. Chỉ thị ung thƣ là những chất do các tế bào

hoặc mô ung thƣ tổng hợp và tiết ra từ khối u bị phá vỡ hoặc đƣợc tạo ra từ các phản ứng

của cơ thể đối với khối u, gồm hai dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch.

Đối với ung thƣ gan, chỉ thị ung thƣ đƣợc ứng dụng theo hai hƣớng chính sau: (a)

Sàng lọc các nhóm nguy cơ cao để xác định đƣợc ung thƣ khi kích thƣớc khối u còn nhỏ (<

3cm) để có liệu pháp điều trị hiệu quả. (b) Xác nhận chẩn đoán ung thƣ ở những bệnh nhân

có khối u lớn đã đƣợc phát hiện nhờ chụp X quang.

1.3. MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƢ

Khi nghiên cứu ung thƣ thực nghiệm, có nhiều bằng chứng thể hiện có sự kiểm

soát của hệ thống miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên ung thƣ, đồng thời, các

nghiên cứu cũng chứng minh đƣợc sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu trong ung thƣ.

Khi tế bào bình thƣờng chuyển dạng ác tính thành tế bào ung thƣ, trong khối u

xuất hiện các protein biểu hiện bất thƣờng, bị đột biến hoặc biến đổi sau dịch mã, đây

chính là các kháng nguyên liên quan đến ung thƣ.

Hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung theo hƣớng nghiên cứu tìm kiếm các

protein kháng nguyên liên quan đến khối u, các protein này kích thích sinh ra kháng thể

trong huyết thanh, đây cũng là các dạng chỉ thị ung thƣ tiềm năng.

Theo hƣớng nghiên cứu trên, trong đề tài này, chúng tôi đã kết hợp phân tích

proteomics mô gan của bệnh nhân ung thƣ gan và thực hiện phản ứng miễn dịch Western

blot hai chiều nhằm tìm ra các protein có biểu hiện khác biệt, đặc biệt là các protein

kháng nguyên phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tƣơng của bệnh nhân ung

thƣ gan, đây là các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học giúp chẩn đoán sớm

ung thƣ gan.

Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Mẫu nghiên cứu là mô gan tại vị trí có khối u của bệnh nhân HCC và huyết tƣơng

của chính bệnh nhân đó. Mẫu đối chứng là mô gan cách ít nhất 5cm trên cùng lá gan tại

vị trí không có khối u.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các trạng thiết bị, hóa chất, dụng cụ của

Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc. Phƣơng pháp nghiên cứu đƣợc mô tả trong các

hình dƣới đây:

Hình 1. Quy trình chiết protein từ mô gan

Hình 2. Quy trình phân tích proteomics mô gan

Hình 3. Quy trình thẩm tách miễn dịch Western blot hai chiều

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN

Sử dụng dung dịch PBS pH7,4 và đệm phá tế bào (Lysis) chúng tôi thu đƣợc 5

phân đoạn dịch chiết protein của mô gan. Hình ảnh điện di cho thấy các phân đoạn này có

độ sạch khác nhau, song đều chứa nhiều protein thể hiện qua số lƣợng băng protein trên

mỗi giếng nhiều, trải dọc theo giếng điện di.

Các phân đoạn dịch chiết chƣa sạch sẽ đƣợc tủa để loại các thành phần phi protein,

các phân đoạn dịch chiết đƣợc trộn lại với nhau thành dịch chiết protein mô gan và tiến

hành điện di hai chiều.

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

A. Dịch chiết mô gan bình thƣờng B. Dịch chiết mô gan ung thƣ

Hình 4. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thƣờng và mô

gan ung thƣ trên gel polyacrylamide 10% có SDS

(Giếng 1: Dịch chiết PBS1; Giếng 2: Dịch chiết PBS2; Giếng 3: Dịch chiết Lysis1;

Giếng 4: Dịch chiết Lysis2; Giếng 5: Dịch chiết Lysis3)

3.2. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU

3.2.1. Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều

Trƣớc tiên, protein mô gan đƣợc phân tách theo pI trên thanh strip dài 17cm, pH

3-10 và điện di chiều 2 để phân tách theo khối lƣợng phân tử trên bản gel polyacrylamide

10% có SDS

Hình ảnh bản gel 2DE mô gan bình thƣờng và mô gan ung thƣ cho thấy, các protein

đã đƣợc phân tách tƣơng ứng với các spot trên bản gel. Tuy hệ protein mô gan rất phức tạp,

song hàm lƣợng của các protien trong gan khá đồng đều, do đó, các protein đƣợc phân tách

khá tốt trên bản gel 2-DE. Số lƣợng các spot lớn, kích thƣớc khá đồng đều, song phần lớn

các spot tập trung ở vùng giữa cuả mỗi bản gel. Do đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành diện di,

phân tách protein trong khoảng pH hẹp hơn.

A - Mô gan bình thƣờng B - Mô gan ung thƣ

Hình 5. Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều

Chiều 1: Điện di đẳng điện sử dụng thanh IPG strip dài 17cm, pH 3 - 10 (A1 và B1); IPG strip dài

7cm, pH 4 - 7 (A2 và B2); Chiều 2: Điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 10%.

Bƣớc đầu sử dụng phần mềm chuyên dụng phân tích hình ảnh bản gel điện di hai

chiều - Phoretix, chúng tôi đã xác định đƣợc tổng số spot đƣợc phân tách trên các bản gel

2-DE (bảng 5).

Bảng 1. Tổng số spot trên mỗi bản gel điện di hai chiều

Mã bệnh

nhân

Bản gel 17cm Bản gel 7cm

Mô bình thường Mô ung thư Mô bình thường Mô ung thư

8261 272 spot 171 spot 75 spot 136 spot

8460 329 spot 288 spot 139 spot 123 spot

8935 258 spot 291 spot 53 spot 61 spot

8977 229 spot 254 spot 72 spot 91 spot

9242 275 spot 334 spot 108 spot 155 spot

10480 220 spot 268 spot 145 spot 141 spot

3.2.2. Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều

Tiếp tục sử dụng phần mềm phoretix để phân tích sự biểu hiện của các spot

protein trên bản gel điện di. Phần mềm này giúp xác định các spot tƣơng ứng trên các cặp

bản gel của từng bệnh nhân, đƣa ra giá trị cƣờng độ khối trung bình của các spot (các

spot tƣơng ứng có giá trị này chênh lệch từ 1 đến 1,5 lần mới đƣợc tính là khác biệt).

Ngoài ra, phần mềm còn đƣa ra hình ảnh ba chiều (3-D) của các spot, trong đó: độ lớn

của spot đƣợc thể hiện bằng bề rộng của đáy spot trên hình 3-D; độ đậm của spot đƣợc

thể hiện bằng chiều cao của spot tính từ đáy lên đỉnh; độ sắc nét của spot nhuộm màu

coomasie đƣợc thể hiện bằng độ nhọn của spot ấy trên hình ảnh 3-D. Đây là tiêu chí để

đánh giá biểu hiện khác biệt của các spot trên các cặp bản gel gồm: spot tăng hoặc giảm ở

bản gel mô ung thƣ so với bản gel mô BT; Spot chỉ xuất hiện rõ rệt ở một trong hai bản

gel.

Khi phân tích độc lập từng cặp bản gel, chúng tôi đã xác định đƣợc các spot

protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng trên từng cặp

bản gel 2-DE phân tách protein trong khoảng pH 3 - 10, dài 17cm (bảng 6) và phân tách

protein trong khoảng pH 4 - 7, dài 7cm (bảng 7).

Bảng 2. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình

thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10

8261 8460 8935 8977 9242 10480

↑ 31 16 51 23 21 39

↓ 19 33 20 22 27 21

- 7 11 2 4 1 4

+ 2 4 7 3 2 5

Tổng 59 64 80 52 51 69

Bảng 3. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình

thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7

8460 8935 8977 9242 10480

↑ 6 17 18 11 16

↓ 9 3 10 5 8

- 5 1 1 2 1

+ 1 2 3 2 2

Tổng 21 23 32 20 27

Ghi chú: Spot protein biểu hiện tăng (↑); spot protein biểu hiện giảm (↓) ở bản gel mẫu ung thƣ

so với bản gel mô bình thƣờng; spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mẫu ung thƣ (+); xuất

hiện mờ nhạt hoặc không thấy trên bản gel mẫu mô ung thƣ (-).

Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thƣ so với

bản gel mô gan bình thƣờng của cả 6 bệnh nhân HCC, chúng tôi nhận thấy có 52 spot

khác biệt rõ ràng, xuất hiện trên các bản gel mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng,

bao gồm: 6 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thƣ; 5 spot chỉ thấy xuất hiện

rõ rệt ở bản gel mô đối chứng; 23 spot biểu hiện tăng ở bản gel mô ung thƣ; 18 spot biểu

hiện giảm ở bản gel mô ung thƣ.

Khi so sánh hình ảnh các bản gel điện di thu đƣợc trong nghiên cứu này với hình

ảnh bản gel mô gan ngƣời trong cơ sở dữ liệu SWISS-2D-PAGE, chúng tôi nhận dạng

đƣợc 13 protein tƣơng ứng với 13 spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thƣ

so với bản gel mô gan bình thƣờng (bảng 8).

Bảng 4. Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thƣ so với

mô gan bình thƣờng đƣợc xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL

STT Protein

Yếu tố

nhận dạng

protein

Cƣờng độ khối

trung bình Biểu

hiện

ĐC HCC

1 Alpha-1-antitrypsin (Alpha-1-protease

inhibitor) (A1AT) P01009 0,0015 0,608 +

2 Protein disulfide-isomerase (PDIA1) P07237 0,738 0,078 ↓

3 Cellular tumor antigen p53 (p53) P04637 0,114 − −

4 Beta-actin, cytoplasmic 1 (ACTB) P60709 0,003 4,599 +

5 Haptoglobin (HPT) P00738 0,002 0,839 +

6 Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) P12004 0,0008 0,265 +

7 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

(GAPDH/G3P) P04406 0,248 − −

8 Cathepsin D (CATD) P07339 0,0007 0,124 +

9 Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial

(ECHM) P30084 0,0005 0,129 +

10 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial

(SODM) P04179 2,730 0,315 ↓

11 UMP-CMP kinase (KYC) P30085 0,306 0,014 ↓

12 Superoxide dismutase [Cu-Zn] (SODC) P00441 4,524 1,467 ↓

13 Glutamate dehydrogenase 1, mitochondrial

(GDH/ DHE3) P00367 0,686 − −

Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; -, protein không biểu hiện ở

mẫu bệnh; +, protein không biểu hiện ở mẫu mô bình thƣờng; ĐC, bản gel mô gan bình thƣờng;

HCC, bản gel mô gan ung thƣ.

3.3. NHẬN DẠNG PROTEIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP MALDI-TOF MS

Sau khi phân tích hình ảnh bản gel 2-DE, những spot protein biểu hiện khác biệt

giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng đƣợc cắt và thủy phân, thu đƣợc hỗn

hợp peptide sử dụng cho phân tích khối phổ. Mỗi protein cho kết quả là một tập hợp dữ

liệu về khối lƣợng của các peptide khác nhau sau khi bị phân cắt bởi enzyme trypsin.

Protein đƣợc nhận dạng theo phƣơng pháp PMF (Peptide mass fingerprint), khối lƣợng của

peptide đƣợc tạo ra sau khi thủy phân đƣợc so sánh với cơ sở dữ liệu NCBInr, sử dụng

phần mềm Mascot thông qua webside www.matrixscience.com. Danh sách các protein đã

xác định theo phƣơng pháp này đƣợc trình bày ở bảng 9.

Bảng 5. Danh sách các protein đƣợc xác định bằng MALDI-TOF MS từ bản gel mô gan

ung thƣ so sánh với mô gan đối chứng của bệnh nhân HCC

Spot Tên protein

Yếu tố

nhận

dạng

protein

KLPT

(Dalton) pI

%

phù

hợp

Score Biểu

hiện

C43C

Suppressor of

tumorigenicity 7 protein-

like (ST7L)

Q8TDW4 37.024 8,42 12 73 ↑

C56B Protein disulfide-isomerase

A3 (Erp57/ PDIA3) P30101 28.483 5,49 20 71 ↑

C52C Human Mitochondrial

Aldehyde Dehydrogenase P05091 54.394 5,7

19 88 ↓

N80A 15 71 ↓

C256B REST corepressor 1

(Protein CoREST) Q9UKL0 47.762 8,23 12 74 ↑

P130B Glutamine synthetase (GS) P15104 42.745 6,43 14 69 ↑

P193B Transcription Factor Ca150 O14776 9.408 9,69 54 85 ↑

P221B Heat shock protein beta-1

(HSPB1/HSP27) P04792 22.826 5,98 24 66 ↓

O50C Heat shock protein 27 34 89 ↓

P71B Apolipoprotein L2 Q9BQE5 45.887 8,79 14 74 ↑

P57D MHC class I antigen Q95460 9600 11,26 30 73 ↓

O167B BAT2 protein (Protein

PRRC2A) P48634 17.081 9,94 25 88 ↑

O244B

Bromodomain and PHD

finger containing 1 (Protein

Peregrin)

P55201 59.536 8,66 13 71 ↑

O67B Immunoglobulin G heavy

chain variable region AEX28843 13.503 8,62 59 69 ↑

O301B

Mitochondrial 3-oxoacyl-

CoA thiolase (3-ketoacyl-

CoA thiolase)

P42765 42.469 8,51 23 69 ↑

O113A Zinc finger protein AAC50263 28.889 9,6 20 67 −

O137B AP-2 complex subunit

alpha-1 O95782 106.378 7,75 9 89 ↑

O286B Metastasis related protein AAG27483 10.414 5,43 56 84 ↑

O46D Heterogeneous nuclear

ribonucleoprotein L-like Q8WVV9 49.517 9,01 14 66 −

O285B Peroxiredoxin 2 A6NIW5 15.243 5,82 33 68 ↑

O8D Heat shock protein 60 P10809 61.346 5,7 15 81 ↑

O241B T cell receptor alpha chain AAK37512 13.640 7,88 40 66 ↑

N24B Interleukin-32 P24001 15.127 4,8 23 70 ↑

N97B

Chain A, Crystal Structure

Of Human Enolase 1

(Alpha-enolase)

P06733 47.481 7,01 18 69 ↑

N296A

Neuropolypeptide h3

(Phosphatidylethanolamine-

binding protein 1)

P30086 21.027 7,42 41 78 ↓

N35B TFEC protein

(Transcription factor EC) O14948 22.696 9,67 17 71 ↑

N139C Microfibrillar-associated

protein 3 (MFAP3) O75121 34.362 4,9 15 68 ↓

P46D LOC643854 protein AAI01323 61.880 5,45 9 74 ↑

P228A TPA protein Q6LBF5 13.392 7,85 24 72 ↓

P229A Unnamed protein product BAC04847 32.496 8,51 14 70 ↓

P10C Protein FAM180A Q6UWF9 19.834 8,59 16 68 ↓

P15C hCG1989686 EAX08132 11.676 9,55 32 68 ↓

P14A Uncharacterized protein

C12orf45 Q8N5I9 20.168 5,1 20 69 ↓

P48A COMM domain containing 3 Q5T8Z0 18.286 6,14 20 83 ↓

C55D GDDM protein Q86XP7 4.086 10,54 80 71 ↑

C151A Interphase cyctoplasmic

foci protein 45 variant G6DPS4 35.150 8,11 15 68 ↑

O218B IFT172 protein A5PKZ0 60.583 5,66 11 68 ↑

O243B KIAA1179 protein Q9UG01 142.340 5,51 9 67 ↑

N244A hCG2041492 EAW97522 15.331 5,31 36 66 ↓

Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; -, protein không biểu hiện ở

mẫu bệnh; +, protein không biểu hiện ở mẫu mô bình thƣờng.

Sử dụng kỹ thuật MALDI-TOF MS, chúng tôi đã nhận dạng đƣợc 39 spot protein,

trong đó có 27 spot tƣơng ứng với 25 protein đã đƣợc định danh và 12 protein giả thuyết.

Tóm lại, kết hợp kỹ thuật MALDI-TOF MS và tra cứu cơ ở dữ liệu, chúng tôi đã

nhận dạng đƣợc 38 protein trên tổng số 52 spot protein biểu hiện khác biêt trên các bản

gel mô gan của bệnh nhân HCC.

3.4. THẨM TÁCH MIỄN DỊCH - WESTERN BLOT HAI CHIỀU

Song song với việc phân tích proteomics mô gan của bệnh nhân ung thƣ gan,

chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng western blot 2D. Trong nghiên cứu này, chúng tôi

sử dụng Kit ECL Advance Western Blotting Detection là kit có độ nhạy cao do tín hiệu

phát quang của phản ứng oxy hóa Luminol mạnh. Do đó, để giảm liên kết không đặc hiệu

và tín hiệu nhiễu trên màng cần tối ƣu nồng độ kháng thể bậc một khi ủ màng với dung

dịch huyết tƣơng của bệnh nhân HCC.

A - Mô gan bình thƣờng B - Mô gan ung thƣ

Hình 6. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 8977

Dựa vào vị trí tƣơng ứng của các spot phát sáng trên màng PVDF với các spot trên

bản gel 2-DE dài 7cm và kết quả định danh protein, chúng tôi đã xác định đƣợc 4 protein

trong mô gan của bệnh nhân có phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tƣơng của

chính bệnh nhân đó là: protein ST7L biểu hiện tăng và protein MHC lớp I, HSP27,

aldehyde dehydrogenase biểu hiện giảm ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng.

3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN CÓ PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH

Những điểm protein khác biệt, kể cả những protein biểu hiện tăng/giảm trong mô

gan bệnh nhân ung thƣ gan đều là những đặc trƣng về bệnh và có thể là những protein chỉ

thị ung thƣ. Kết hợp xác định protein bằng MALDI-TOF MS và tra cứu cơ sở dữ liệu,

chúng tôi đã nhận dạng đƣợc 38 protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với

mô gan bình thƣờng. Để tìm hiểu mối liên quan của các protein này với ung thƣ, chúng

tôi đã tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu về protein, từ đó xác định đƣợc chức năng chính của

protein và mô tả sơ lƣợc, phân nhóm các protein nhƣ trong bảng 10 và hình 14.

Bảng 6. Tóm tắt chức năng chính của các protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ

so với mô gan đối chứng đã đƣơc nhận dạng

Ptotein Chức năng chính

Protein liên quan đến chu trình tế bào, tăng sinh tế bào và apoptosis: 5 protein

Protein ST7L Ức chế phát triển khối u

Metastasis related protein Protein liên quan đến quá trình di căn

Protein Neuropolypeptide h3 Ức chế hoạt động của protein Raf

Protein p53 Protein ức chế khối u, điều hòa sự tăng sinh tế bào, kiểm

soát chu trình tế bào và apoptosis

Proliferating cell nuclear antigen

(PCNA)

Tăng sinh tế bào, điều khiển sao chép DNA, sửa chữa DNA

Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể: 11 protein

Protein sốc nhiệt beta-1

(HSPB1/HSP27)

Đáp ứng lại stress, nhiễm virus, kích thích sản xuất

interleukin-1

HSP60 Tƣơng tác vật chủ - virus, hoạt hóa tế bào T, kích thích tế

bào B sản xuất cytokine, than gia cuộn gấp protein.

Kháng nguyên MHC lớp I Trình diện kháng nguyên nội sinh

Interleukin-32 Tham gia đáp ứng miễn dịch, kích thích sinh ra IL-8, yếu tố

hoại tử mô (TNFA)

Immunoglobulin G heavy chain

variable region

Cấu tạo phân tử Ig

T cell receptor alpha chain Tham gia nhận dạng kháng nguyên

Peroxiredoxin 2 Chống lại các stress oxy hóa

Alpha-1-antitrypsin Ức chế protease nhóm serine, tham gia quá trình đông máu

Haptoglobin Liên kết với Hemoglobin

Superoxide dismutase [Cu-Zn] Phá hủy gốc tự do bảo vệ cơ thể

Superoxide dismutase [Mn] Phá hủy gốc tự do bảo vệ cơ thể

Protein tham gia cấu trúc tế bào: 2 protein

Beta-actin (ACTB) Cấu trúc tế bào

Microfibrillar-associated protein 3 Liên quan đến microfibri, tham gia cấu tạo tế bào

(MFAP3)

Protein tham gia các quá trình trao đổi chất: 10 protein

Aldehyde Dehydrogenase Chuyển hóa rƣợu, phân giải ethanol

Enoyl-CoA hydratase Trao đổi lipid

Glutamine synthetase (GS) Chuyển hóa glutamate, dẫn truyền thần kinh (có liên quan

đến quá trình tăng sinh tế bào)

Glutamate dehydrogenase Truyền xung thần kinh

Apolipoprotein L2 Chuyển hóa và vận chuyển lipid

3-ketoacyl-CoA thiolase Chuyển hóa lipid và acid béo

UMP-CMP kinase (KYC) Chuyển gốc phosphate từ ATP sang UMP và CMP, tổng

hợp Pyrimidin

Glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase (G3P)

Tham gia quá trình đƣờng phân, vận chuyển các chất qua

màng tế bào.

AP-2 complex subunit alpha-1 Vận chuyển protein

Cathepsin D (CATD) Proteinase nội bào

Protein tham gia vào quá trình phiên mã, dịch mã, cải biến: 10 protein

Protein PDIA3 Tái sắp xếp liên kết S-S

Protien PDIA1 Phá vỡ và tái tạo liên kết S-S

Yếu tố phiên mã Ca150 Điều hòa phiên mã

Yếu tố phiên mã EC Điều hòa phiên mã

BAT2 protein (Protein PRRC2A) Tham gia ghép nối tiền mARN

Protein Peregrin Điều hòa phiên mã gene RUNX1, RUNX2, tham gia acetyl

hóa Histone H3

Zinc finger protein Gắn với DNA tại vị trí liên kết với yếu tố phiên mã

Heterogeneous nuclear

ribonucleoprotein L-like

Chế biến mARN (cắt nối luân phiên)

REST corepressor 1

(Protein CoREST)

Tham gia phiên mã và điều hòa phiên mã, tƣơng tác virus -

vật chủ.

Alpha-enolase Glycosyl hóa, hoạt hóa plasminogen, điều hòa phiên mã.

Căn cứ vào chức năng chính của protein, các protein có biểu hiện khác biệt giữa

mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng đƣợc nhóm thành 5 nhóm khác nhau dựa vào

quá trình sinh học mà protein tham gia. Tỷ lệ protein thuộc 5 nhóm này không đồng đều

(hình 14), trong đó, các protein tham gia vào quá trình quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ

thể chiếm tỷ lệ cao nhất (~ 29%) và các protein tham gia cấu trúc tế bào chiếm tỷ lệ thấp

nhất (~5%).

Hình 7. Tỷ lệ các nhóm protein tham gia vào các quá trình sinh học khác nhau

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận dạng đƣợc 4 protein trong mô gan của bệnh

nhân có phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tƣơng của chính bệnh nhân đó là:

protein ST7L biểu hiện tăng và protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu

hiện giảm ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng. Các protein này đƣợc tiếp tục

tìm hiểu sâu hơn về chức năng và mối liên hệ của chúng với tình trạng ung thƣ.

3.5.1. Protein ST7L

Protein ST7L là protein thuộc nhóm liên quan đến chu trình tế bào. Gene ST7L

tƣơng đồng với gene ức chế khối u trên vùng q31 của NST số 7. Protein này tham gia quá

trình điều hòa âm tính sự sinh trƣởng tế bào, trong trƣờng hợp này, nó có vai trò ức chế

sự phát triển của khối u. Kết quả nghiên cứu cho thấy protein này biểu hiện tăng ở mô

ung thƣ, điều này có thể là do: protein này tăng nhƣng bị biến đổi về cấu trúc nên k thực

hiện đƣợc chức năng và bị cơ thể nhận là “lạ” và sinh đáp ứng miễn dịch; hoặc trong giai

đoạn này, ng bệnh ở giai đoạn phục hồi, nên có phản ứng để kìm hãm sự phát triển của

khối u. Đây là protein lần đầu tiên đƣợc phát hiện trong nghiên cứu của chúng tôi và tôi

chƣa tìm thấy nghiên cứu nào về HCC đề cập tới protein này.

3.5.2. Protein MHC lớp I

Các phân tử MHC lớp I tham gia trình diện kháng nguyên nội sinh: trong tế bào

mang virus hay tế bào ung thƣ, các kháng nguyên VR, kháng nguyên ung thƣ là kháng

nguyên nội sinh sẽ đƣợc các vi thể proteasome phân căt, chế biến tạo thành các peptide

kháng nguyên. Các peptide kháng nguyên này đƣợc TAP vận chuyển đến lƣới nội chất và

liên kết với các phân tử MHC I; phức hệ MHCI-peptide kháng nguyên đƣợc đóng gói và

đƣa ra bề mặt tế bào, trình diện cho thụ thể TCD8 của tế bào T, kích thích tế bào T tiết ra

lymphokin giết chết tế bào. Các phân tử MHCI biểu hiện giảm, kháng nguyên nội sinh ko

dc trình diện, gây ảnh hƣởng đến quá trình đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào.

3.5.3. Protein sốc nhiệt HSP27

HSP27 biểu hiện khác nhau trong các giai đoạn biệt hóa và sinh trƣởng tế bào, là

phân tử đa chức năng. HSP27 hoạt động nhƣ phân tử chaperone đảm bảo cho các protein

hoàn thiện về cấu trúc phù hợp với chức năng của nó: protein này liên kết với ubiquitin,

đồng thời vận chuyển các protein già đến “thùng rác” trong tế bào. Tƣơng tác với actin

tránh phá hủy actin giúp ổn định cấu trúc tế bào. Tham gia trình diện kháng nguyên, kích

hoạt các proteasome phân cắt các kháng nguyên nội sinh, đồng thời kích thích sản sinh

IL-1: hoạt hóa đại thực bào, tế bào T, khỏi động phản ứng viêm. Biểu hiện bất thƣờng

của HSP27 cũng đƣợc phát hiện ở ung thƣ ruột kết và ung thƣ tuyến tiền liệt. Protein này

biểu hiện giảm gây ảnh hƣởng tới nhiều hoạt động chức năng trong gan và giúp tế bào

ung thƣ thoát khỏi apoptosis. Kết quả của chúng tôi tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu

của Li & đn (2005); Wong & đn (2006); Yao & đn (2007).

3.5.4. Protein aldehyde dehydrogenase

ALDH thuộc họ enzym tham gia phản ứng oxy hóa khử, tham gia quá trình

chuyển hóa ethanol trong gan và truyền điện tử (H+). ALDH bị suy giảm chức năng cũng

có thể làm tăng các chất hoạt động hóa học mạnh, gốc tự do đƣợc cảm ứng bởi aldehyde.

Enzym này tham gia vào quá trình giải độc gan, enzym này biểu hiện giảm: có thể là hệ

quả của quá trình tiến triển thành ung thƣ gây suy giảm chức năng gan; hoặc thiếu hụt

enzym này dẫn tới tình trạng gan nhiễm độc, từ đó bị biến đổi thành tế bào ung thƣ.

KẾT LUẬN

Bƣớc đầu phân tích proteomics miễn dịch của bệnh nhân ung thƣ gan, chúng tôi

rút ra một số kết luận sau:

2. Đã phân tách đƣợc protein mô gan trên bản gel 2-DE và xác định đƣợc các spot

protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ và mô gan bình thƣờng của từng bệnh

nhân ung thƣ gan. Trong đó có 52 spot khác biệt chung ở các bệnh nhân gồm: 23 spot

biểu hiện tăng, 18 spot biểu hiện giảm, 6 spot chỉ xuất hiện ở bản gel mô ung thƣ, 5 spot

không xuất hiện ở bản gel mô ung thƣ.

3. Đã nhận dạng đƣợc 52 spot tƣơng ứng với 38 protein đã đƣợc định danh và 12

protein giả thuyết. Các protein đƣợc chia thành 5 nhóm chức năng, bao gồm: nhóm

protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis; protein liên quan đến quá trình miễn

dịch và bảo vệ cơ thể; protein tham gia cấu trúc tế bào; protein tham gia các quá trình trao

đổi chất và protein tham gia vào quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến sau phiên mã,

dịch mã.

4. Sử dụng kit ECL Advance Western Blotting Detection , đã xac đinh đƣơc t ỷ lệ

pha loãng tôi ƣu kháng thể bậc môt và thẩm tách miễn dịch thành công trên 4 cặp bản gel

điện di 2 chiều của 4 bệnh nhân ung thƣ gan và đã xác định đƣợc 4 protein có phản ứng

miễn dịch la : protein ST7L biểu hiện tăng và protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde

dehydrogenase biểu hiện giảm ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng.

KIẾN NGHỊ

Trải qua nghiên cứu thực tế, chúng tôi đƣa ra một số kiến nghị sau:

1. Tiếp tục nhận dạng các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ so với

mô gan thƣờng và kết hợp với kết quả phân tích thẩm tách miễn dịch Western blot hai

chiều trên số lƣợng bệnh nhân lớn hơn nhằm tìm ra các protein có tính kháng nguyên đặc

trƣng cho ung thƣ gan.

2. Tiếp tục thu thập mẫu và phân tích proteomics miễn dịch mô gan của bệnh nhân

ung thƣ gan ở các giai đoạn ung thƣ khác nhau nhằm phân tích sự biến đổi thành phần

các protein liên quan đến bệnh.

3. Thu thập mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân viêm gan B và C đang tiến triển thành

ung thƣ gan và bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử nhiễm HBV và HCV nhằm tìm hiểu mối

liên hệ giữa viêm gan B , C và ung thƣ gan trên cac đôi tƣơng bênh nhân ung t hƣ gan ơ

Viêt Nam.

References

Tiếng Việt

1. Phan Văn Chi (2006), PROTEOMICS Khoa học về hệ protein, Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.

2. Phan Văn Chi (2009), “Thực trạng nghiên cứu về Proteomics”, Hội thảo

VNProteomics lần 1, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ.

3. Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học cơ sở, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia

Hà Nội.

4. Hoàng Văn Sơn (2009), “Proteomics lâm sàng”, Hội thảo VNProteomics

lần 1, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ.

5. Hoàng Văn Sơn (2011), “Các chỉ tố ung thƣ gan”, Tạp chí y học Việt Nam,

348, 5-11.

6. Bùi Phƣơng Thảo, Lê Lan Phƣơng, Trịnh Hồng Thái (2011), “Phân tích các

protein biểu hiện khác biệt của mô gan ở bệnh nhân ung thƣ gan”, Tạp chí y học Việt

Nam, 348, 67-71.

7. Trƣờng Đại học Y Hà Nội (2006), Miễn dịch học, Nhà xuất bản Y học, Hà

Nội.

Tiếng Anh

8. American Cancer Society (2012), Cancer Facts & Figures, National Health

Council.

9. Bradford M. M. (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation

of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”,

Analytical Biochemistry, 72, 248-254.

10. Chen Y. (2007), “Identification of tumor-associated antigens as markers for

immunodiagnosis of human cancers”, ETD Collection for University of Texas, El Paso,

Paper AAI3262904.

11. Chen Y., Zhou Y., Qiu S., Wang K., Liu S., Peng X.X., Li J., Tan E.M.,

Zhang J.Y. (2010), “Autoantibodies to tumor-associated antigens combined with

abnormal alpha-fetoprotein enhance immunodiagnosis of hepatocellular carcinoma”,

Cancer Letters, 289(1), 32-39.

12. Diamandis E.P. (2004), “Identification of serum amyloid A protein as a

potentially useful biomarker for nasopharyngeal carcinoma”, Clinical Cancer Research,

10, 5293-5294.

13. Farazi P.A., Depinho R.A. (2006), “Hepatocellular carcinoma pathogenses:

from genes to evironment”, Nature Reviews Cancer, 6, 674-687.

14. Farombi E.O. (2006), “Aflatoxin contamination of foods in developing

countries: Implications for hepatocellular carcinoma and chemopreventive strategies”,

African Journal of Biotechnology, 5(1), 001-014.

15. Govekar R. and Zingde S.M. (2007), “Cancer Proteomics: How far are we

from the Clinics? ”, International Journal of Human Genetics, 7(1), 91-97.

16. He Q.Y., Lau G.K.K., Zhou Y., Yuen S.T., Lin M.C., Kung H.F. and Chiu

J.F. (2003), “Serum biomarkers of hepatitis B virus infected liver inflammation: A

proteomic study”, Proteomics, 3(5), 666-674.

17. Jain K.K. (2002), “Role of proteomics in diagnosis of cancer”, Technology

in Cancer Research and Treatment, 1(4), 281-286.

18. Jemal A., Bray F., Center M. M., Ferlay J., Ward E., Forman D., (2011),

“Global Cancer Statistics, CA Cancer J Clin, 61, 69-90.

19. Kim W., Lim S.O., Kim J.S., Ryu Y.H., Byeon J.Y., Kim H.J., Kim Y.L.,

Heo J.S., Park Y.M., and Jung G. (2003), “Comparison of Proteome between Hepatitis B

virus-and Hepatitis C virus-Associated Hepatocellular Carcinoma”, Clinical Cancer

Research, 9, 5493-5500.

20. Le L.P., Pham A.T., Trinh H.T. (2010), “Proteomics analysis of human

hepatocellular carcinoma”, Vietnam National University Journal of Science, Natural

Science and Technology, 26(1), 85-90.

21. Li C., Tan Y.X., Zhou H., Ding S.J., Li S.J., Ma D.J., Man X.B., Hong Y.,

Zhang L., Li L., Xia Q.C., Wu J.R., Wang H.Y., Zeng R. (2005), “Proteomic analysis of

hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma: Identification of potential tumor

markers”, Proteomics, 5(4), 1125-1139.

22. Li L., Chen S.H., Yu C.H., Li Y.M. and Wang S.Q. (2008), “Identification

of Hepatocellular-Carcinoma-Associated Antigens and Autoantibodies by Serological

Proteome Analysis Combined with Protein Microarray”, Journal of Proteome Research,

7(2), 611-620.

23. Liebler D.C. (2002), Introduction to proteomics, Human Press, Totowa,

New Jersey.

24. Liu W., Peng B., Lu Y., Xu W., Qian W., Zhang J.Y. (2011),

“Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer

immunodiagnosis”, Autoimmunity Reviews, 10(6), 331-335.

25. Long J., Lang Z.W., Wang H.G., Wang T.L., Wang B.E. (2010),

“Glutamine synthetase as an early marker for hepatocellular carcinoma based on

proteomic analysis of resected small hepatocellular carcinomas”, Hepatobiliary Pacreat

Diseases International, 9(3), 296-305.

26. Looi K.S., Nakayasu E.S., Diaz R.A., Tan E.M., Almeida I.C., Zhang J.Y.

(2008), “Using Proteomic Approach to Identify Tumor-Associated Antigens as Markers

in Hepatocellular Carcinoma”, Journal of Proteome Research, 7(9), 4004-4012.

27. Lu H., Goodell V., Disis M.L. (2008), “Humoral immunity directed against

tumor-associated antigens as potential biomarkers for the early diagnosis of cancer”,

Journal of Proteome Research, 7(4), 1388-1394.

28. Martin K., Ricciardelli C., Hoffmann P., K.Oehker M., (2011), “Exploring

the Immunoproteome for Ovarian Cancer Biomarker Discovery”, International Journal of

Molecular Sciences, 12, 410-28.

29. Mendy M., Walton R. (2009), “Molecular pathogenesis and early detection

of Hepatocellular perspectives from West Africa”, Cancer Letters; 286(1), 44-51.

30. Polanski M., Anderson N.L. (2006), “A list of candidate cancer biomarkers

for targeted proteomics”, Biomark Insights, 1, 1-48.

31. Qin L.X., Tang Z.Y. (2002), “The prognostic molecular markers in

hepatocellular carcinoma”, World Journal of Gastroenterology, 8(3), 385-392.

32. Rubin P., Hansen J.T. (2008), TNM Staging Atlas, Lippincott Williams &

Wilkins, a Wolters Kluwer Business, Bogota, Colombia.

33. Takashima M., Kuramitsu Y., Yokoyama Y., Iizuka N., Harada T.,

Fujimoto M., Sakaida I., Okita K., Oka M., (2006), “Proteomic analysis of autonantibides

in patients with hepatocellular carcinoma”, Proteomics, 6(13), 3894-3900.

34. Tan H., Low J., Lim S.G., Chung M.C. (2009), “Serum autoantibodies as

biomarkers for early cancer detection”, FEBS journal, 276(23), 6880-6904.

35. Tjalsma H., Schaeps R.M., Swinkels D.W. (2008), “Immunoproteomics:

From biomarker discovery to diagnostic applications”, Proteomics Clinical Appllications,

2(2), 167-180.

36. Tran T.T., Le L.P, Trinh H.T (2011), “Analysis of differentially expressed

proteins of plasma in hepatocellular carcinoma”, Vietnam National University Journal of

Science, Natural Science and Technology, 27(2), 279-284.

37. Westermeier R., Naven T. (2002), Proteomics in Practice, Wiley-VCH

Verlag-GmbH, Freiburg.

38. Wong C.H., Chan S.K.P., Chan H.L.Y., Tsui S.K.W. (2006), “The

Molecular Diagnosis of Hepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma”,

Clinical Laboratory Sciences, 43(1), 69-101.

39. Yao D.F., Dong Z.Z., Yao M. (2007), “Specific molecular markers in

hepatocellular carcinoma”, Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 6(3), 241-247.

40. Zhang J.Y., Megliorino R., Peng X.X., Tan E.M., Chen Y., Chan E.K.

(2007), “Antibody detection using tumor-associated antigen mini-array in

immunodiagnosing human hepatocellular carcinoma”, Journal of Hepatology, 46(1), 107-

114.

Công cụ World Wide Web

41. http://benhvienk.com/index.php/vi/pcut/tin-tuc-phong-chong-ung-thu/677-

dau-hieu-cua-benh-ung-thu-gan (5/6/2012)

42. http://cancerhelp.cancerresearchuk.org/type/liver-cancer/about/types-of-

primary-liver-cancer (14/02/2012)

43. http://expasy.org/swiss-2dpage/viewer (5/6/2012)

44. http://igrid-ext.cryst.bbk.ac.uk/WWW/PhD_thesis.htm (10/06/2012)

45. http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/adult-primary-

liver/HealthProfessional/page3 (14/02/2012)

46. http://www.cancer.gov/dictionary?cdrid=45618 (15/03/2012)

47. http://www.hupo.org/research/hlpp/ (25/04/2012)

48. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/54879 (10/06/2012)

49. http://www.mayoclinic.com/health/medical/IM04073 (30/03/2012)

50. http://www.medicinenet.com/liver_biopsy/article.htm (15/03/2012)

51. http://www.uniprot.org/ (05/06/2012)

52. www.matrixscience.com (05/06/2012)