základy imunologických metod -...
TRANSCRIPT
![Page 1: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/1.jpg)
Základy imunologických metod:
Precipitační a aglutinační reakce
Ústav imunologie 2.LF UK a FN Motol
![Page 2: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/2.jpg)
Metody, ve kterých se používají protilátky
Neznačený antigen/protilátka
• Precipitace
• Aglutinace
Značený antigen/protilátka
• Enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA)
• Radioimmunoassay (RIA)
• Western blotting
• Immunofluorescence
• Průtoková cytometrie
![Page 3: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/3.jpg)
Citlivost imunochemických metod
precipitace - 30 mg/ml
aglutinace - 1 mg/ml
nefelometrie – 0,1 mg/ml
radioimunoassay, ELISA - 1 pg/ml
![Page 4: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/4.jpg)
Imunoprecipitační křivka
Charakteristická křivka vyjadřující závislost tvorby imunoprecipitátu na
množství antigenu, přidávaného ke konstantnímu množství protilátky
![Page 5: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/5.jpg)
Oblast nadbytku protilátky
• se zvyšujícím se množstvím antigenu vzrůstá
precipitát. Na všechna vazebná místa antigenu
jsou navázány protilátky. Výsledkem je vznik
malých rozpustných komplexů antigenu a
protilátky, které se vzájemně nepropojují. V
supernatantu neprokazujeme žádný antigen.
• V oblasti nadbytku protilátky je množství komplexu
antigen-protilátka úměrné koncentraci přítomného
antigenu. Tyto reakční poměry se využívají u
imunoturbidimetrie a imunonefelometrie a
nekompetitivních imunoanalýz.
![Page 6: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/6.jpg)
Oblast ekvivalence
• dochází k vzájemnému propojování molekul
antigenu a protilátky a tím vznikají velké
nerozpustné imunokomplexy s mřížkovitou
strukturou, které agregují a vytvářejí
imunoprecipitát. V supernatantu neprokazujeme
volný antigen ani volnou protilátku
• Dosažení ekvivalence se používá u
imunodifúzních metod.
![Page 7: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/7.jpg)
Oblast nadbytku antigenu
• množství precipitátu klesá v důsledku vysoké
koncentrace antigenu. Velké vzájemně propojené
imunokomplexy se rozpadají. Všechna vazebná místa
protilátek jsou vysycena antigenem a některé molekuly
antigenu zůstávají bez navázané protilátky. Vznikají
malé rozpustné imunokomplexy. V supernatantu nejsou
přítomny volné protilátky, ale vzestupné množství
volného antigenu.
• Podmínka nadbytku antigenu musí být splněna u
kompetitivních imunoanalýz.
![Page 8: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/8.jpg)
Precipitační reakce
Imunoprecipitační křivka je základem pro různé
imunochemické metody, které mohou být prováděny v gelu
nebo v roztoku
Flokulační : postupné ředění jedné z reagujících složek -
ve zkumavce
Řada metod založených na měření stupně zákalu – turbidity
Turbidimetrie - optická metoda založená na měření
procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích
Nefelometrie měří rozptýlené (tzv. Tyndallovo) světlo , které
vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem, který je
odlišný od směru dopadajícího záření.
![Page 9: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/9.jpg)
![Page 10: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/10.jpg)
Precipitační reakce v gelu
Imunoprecipitační metody v gelu:
•Radiální imunodifuze
•Dvojitá difuze
•Imunoelektroforéza
Imunodifuzní (ID) : ředění se dosahuje difuzí do prostředí
gelu
Jedna z nejstarších imunologických metod, dnes ji
nahrazuje nefelometrie
Velká pracnost, nízký rozsah měření a časová náročnost (až
48 h)
![Page 11: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/11.jpg)
Radiální imunodifuze
Protilátka je rozpuštěná v gelu;
Ag je přidán do jamek
Měření koncentrace různých sérových
proteinů, např. hladiny imunoglobulinů
![Page 12: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/12.jpg)
Dvojitá difuze
Identické Neidentické Částečně identické
Ab a Ag difundují proti sobě
• Stanovení homogenity systému antigen-protilátka
• Diagnostika specifických autoimunitních onemocnění
• Používáno následně po purifikaci směsi antigenů
• Hledání reakcí mezi serologicky příbuznými antigeny
![Page 13: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/13.jpg)
Dvojitá imunodifuze
Ouchterlony
Örjan Ouchterlony
Vyvinul techniku
dvojité imunodifuze v
roce 1948
![Page 14: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/14.jpg)
Dvojitá difuze (Ouchterlony)
![Page 15: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/15.jpg)
Dvojitá difuze
![Page 16: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/16.jpg)
Dvojitá difuze
![Page 17: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/17.jpg)
Dvojitá difuze
![Page 18: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/18.jpg)
Imunoelektroforéza Kombinace separace antigenů elektroforézou s identifikací
pomocí dvojité difuze
detekce přítomnosti nebo absence proteinu v séru
![Page 19: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/19.jpg)
Imunofixační elektroforéza (IFE)
• Stále používaná metoda pro stanovení
monoklonální gamapatie a typu Ig řetězců
• Monoklonální gamapatie je onemocnění, při kterém
jeden klon plazmatických buněk produkuje vyšší
hladiny protilátky – tato protilátka má těžký řetězec
jednoho typu a jeden idiotyp (nazývá se paraprotein
nebo M-protein)
• Po elektroforetické separaci proteinů vyšetřovaného
séra se na gel nanesou protilátky anti IgG, anti IgA,
anti IgM, anti kappa a anti lambda
![Page 20: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/20.jpg)
Imunofixační elektroforéza (IFE)
![Page 21: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/21.jpg)
Raketková imunoelektroforézaAntigen je podroben elektroforéze v gelu obsahujícím protilátku
Vzdálenost od startovací jamky k vrcholu raketky odpovídá koncentraci antigenu
![Page 22: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/22.jpg)
Aglutinační reakce
• Přímá aglutinace
• Pasivní aglutinace
• Inhibice aglutinace
Ab + částicový Ag Aglutinace (shlukování)
Nenáročná, rychlá a levná metoda, ale:
Aglutinují pouze protilátky třídy IgG a IgM
Nevýhodou je nízká citlivost (0,2 – 2 µg/ml)
Částice s navázanou protilátkou mají tendenci se
při skladování shlukovat
![Page 23: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/23.jpg)
Přímá aglutinace
• Ag je přirozenou složkou částice
• Např. testování pacientova séra na přítomnost
protilátek proti určité bakterii:
– Pacientovo sérum je sériově ředěno do zkumavek
s danou bakterií. Poslední zkumavka s viditelnou
aglutinací určuje titr protilátky v séru
![Page 24: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/24.jpg)
Přímá aglutinace• Stanovení protilátek proti erytrocytům
• Erytrocyty: negativně nabité (zeta potenciál), může
být ovlivněna agluginační reakce (zejména IgG
protilátky)
• Řešení: Coombsův test - použití anti
imunoglobulinového séra
Příklad: detekce anti-Rh protilátek v krvi Rh- matek
![Page 25: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/25.jpg)
Coombsův Test
• Přímý: přidá se protilátka proti lidskému imunoglobulinu (Coombsovo činidlo) k červeným krvinkám. Aglutinace se objeví, pokud jsou erytrocyty pokryty protilátkami
• Nepřímý: inkubuje se testované sérum s erytrocyty zdravého dárce. Po promytí se přidá Coombsovo činidlo
• stanovení Rh protilátek
• diagnostika získané hemolytické anémie - průkaz volných antierytrocytárních protilátek v plazmě (séru)
![Page 26: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/26.jpg)
Přímý a nepřímý Coombsův test
Měření
vázané
protilátky
Měření sérové
protilátky
![Page 27: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/27.jpg)
Pasivní aglutinace
• Aglutinace mezi protilátkou a solubilním
antigenem vázaným na nesolubilní částici
(latexová částice)
• Mnohonásobné zvýšení citlivosti oproti
precipitační reakci
• Diagnostika autoprotilátek u autoimunitních
onemocnění
– Diagnostika autoimunitní thyroitidy:
Thyroglobulin je připojen k latexové částici a je použit
k detekci anti-thyroidních protilátek v séru pacienta
- Diagnostika revmatoidní artritidy
![Page 28: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/28.jpg)
Inhibice aglutinace
• velmi citlivá metoda, umožňující detekci malých
množství antigenu. Ag je navázán např. na latexové
partikule a v testu je přítomná protilátka proti tomuto Ag,
která aglutinuje.
• Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje
aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab.
• Průkaz užívání drog (kokain, heroin).
• Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice
hemaglutinace sérovými protilátkami může být využita k
diagnostice (zarděnky, chřipka).
![Page 29: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/29.jpg)
Inhibice aglutinace
• Kompetice se solubilním Ag
+
Prior to Test
+ +
Test
Patient’s sample
![Page 30: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/30.jpg)
Inhibice aglutinace
V řadě A jsou pozitivní jamky 1-8
![Page 31: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/31.jpg)
Průkaz HCG v moči
![Page 32: Základy imunologických metod - imunologie.lf2.cuni.czimunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/Imunologicke metody... · Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022021715/5c7a49d809d3f236078bb196/html5/thumbnails/32.jpg)
Hemaglutinace