zborník prác - uniba.sk · 2014. 12. 4. · 3. skupie se aplikovali veselektív vy ihibítor no...

Nové trendy vo farmakoterapii V.

1

Martin, 2013


Zborník prác

Nové trendy vo farmakoterapii V. Recenzovaný zborník prác Zostavovatelia: doc. RNDr. Soňa Fraňová, PhD., mim. prof. doc. MUDr. Juraj Mokrý, PhD. Recenzenti: prof. MUDr. Gabriela Nosáľová, DrSc. doc. RNDr. Anna Strapková, CSc. Zborník neprešiel jazykovou korektúrou. Za jazykovú a gramatickú stránku zodpovedajú autori jednotlivých príspevkov. Miesto a rok vydania: Jesseniova lekárska fakulta UK v Martine, 2013 Počet strán: 62 Dostupné online: www.jfmed.uniba.sk ISBN: 978-80-89544-50-9 EAN: 9788089544509

http://www.jfmed.uniba.sk/


3

Obsah Antošová et al. Vplyv neselektívnej inhibície oxidu dusnatého na interleukín-4

a alergénom indukovanú hyperreaktivitu dýchacích ciest 5

Jošková et al. Mechanizmy regulujúce pohyb cílií respiračného traktu 12

Kazimierová et al. Vplyv Provinolu a kombinovanej terapie Provinolu s klinickými anti-astmati-kami na hyperreaktivitu dýchacích ciest počas experimen-tálneho alergického zápalu

17

Kocmálová et al. Vplyv dlhodobého podávania blokátora aktivity ORAI proteínu na experi-mentálne vyvolanú alergickú astmu u morčiat

25

Medveďová et al. Vplyv roflumilastu na reaktivitu dýchacích ciest a apoptózu v pod-mienkach experimentálne navodeného alergického zápalu

31

Mokrá et al. Nové možnosti v liečbe akútneho poškodenia pľúc 39

Píštěková a Mokrá Glukokotikoidy a jejich účinky na kardiovaskulární systém 44

Porvazník et al. Diagnostika rezistentných foriem tuberkulózy – konvenčné metódy versus molekulárno-genetické metódy

51

Sadloňová et al. Tachykiníny v myometriu maternice 58

JLF UK v Martine, 2013

4

Predhovor

Piate vydanie „Nových trendov vo farmakoterapii“ ponúka čitateľovi okrem originál-

nych výskumných prác aj metodologické a prehľadové práce, a to prevažne z oblasti vý-

skumu farmakológie respiračných ochorení. Zaradené sú však aj práce zaoberajúce sa prob-

lematikou antituberkulotík, kardiovaskulárneho systému, resp. myometria.

Zostavovatelia i všetci autori sa snažili i touto cestou priblížiť dosiahnuté výsledky či-

tateľom a prispieť tak k rozvoju všeobecného poznania v oblasti medicíny a najmä farmako-

lógie.

V Martine, 27.6.2013

Zostavovatelia


5

Vplyv neselektívnej inhibície oxidu dusnatého na interleukín-4 a alergénom indukovanú hyperreaktivitu dýchacích ciest

Martina Antošová1, Anna Strapková2, Juraj Mokrý2, Pavol Mikolka1, Daniela Mokrá1

1 Ústav fyziológie, Jesseniova lekárska fakulta UK, Martin, 2 Ústav farmakológie, Jesseniova lekárska fakulta UK, Martin

e-mail: [email protected]

Úvod Oxid dusnatý (NO) patrí

k mediátorom, ktoré majú dôležitú úlohu v širokom spektre fyziologických i patologických procesov. Vzniká z L-arginínu pôsobením NO-syntáz a môžeme ho charakterizovať ako nestabilný radikál s krátkym biologickým polčasom (1-2 s), ktorý veľmi rýchlo difunduje do okolia a je schopný interakcie s inými molekulami. Konečný efekt je potom výsledkom pria-meho pôsobenia NO alebo vzniká pro-stredníctvom pôsobenia reaktívnych fo-riem kyslíka alebo dusíka.

V súčasnosti poznáme niekoľko izo-foriem NO-syntáz – enzýmov podieľajúcich sa na tvorbe oxidu dusnatého. K základným izoformám patrí neuronálna NO-syntáza (nNOS – neuronal nitric oxide synthase, NOS-1), ktorú niektorý autori pre jej vysokú koncentráciu v nervovom a predovšetkým mozgovom tkanive ozna-čujú aj skratkou bNOS (brain NOS). Druhou izoformou je endotelová NOS (eNOS – endothelial nitric oxide synthase, NOS-3), ktorá je viazaná na membránu buniek en-dotelu. Obe tieto izoformy sú konštitučne exprimované a ich aktivácia je závislá na intracelulárnej hladine vápnika. Treťou najznámejšou izoformou je induktívna NOS (iNOS – inducible nitric oxide syntha-se, NOS-2), ktorej je pripisovaná cytotoxic-ká funkcia. Daná izoforma nie je konšti-tučne exprimovaná a nie je závislá na in-tracelulárnej hladine vápnika.

Zapojenie jednotlivých izoforiem vo fyziologických a patologických procesoch prebiehajúcich v ľudskom organizme je

stále diskutované. Predpokladá sa, že kon-štitučné NO-syntázy vytvárajú relatívne malé, stabilné množstvá NO, ktoré sa po-dieľajú prevažne na regulácii fyziologic-kých procesov. Patologický efekt je spro-stredkovaný najmä vysokou hladinou oxi-du dusnatého produkovaného iNOS.

Z literatúry je známe, že v pato-genéze ochorení dýchacích ciest sú popi-sované tak neprimerane vysoké, ako aj neprimerane nízke hladiny oxidu dusnaté-ho. Vo vzťahu k alergickému zápalu a ochoreniam, s ktorými je alergický zápal dýchacích ciest spojený, sa však stretáva-me s abnormálne vysokými hladinami NO. Na základe našich predchádzajúcich vý-sledkov predpokladáme, že na ich tvorbe sa nepodieľa len induktívna NO-syntáza, ale aj obe konštitučne exprimované izo-formy.

Ako už bolo uvedené, oxid dusnatý veľmi rýchlo interaguje. Dokáže modulo-vať expresiu viacerých prozápalovo pôso-biacich cytokínov (napr. interleukín 4 - IL-4), Th1 a TH2 lymfocytov a podporovať tak rozvoj alergického zápalu v dýchacích ces-tách (Chang et al., 1997). V tomto vzťahu je zaujímavý práve interleukín-4. Je to cy-tokín, ktorý reguluje imunitný systém na viacerých úrovniach a akékoľvek anomálie v jeho regulácii sa odrazia aj v anomáliách na úrovni imunitného systému. Zo základ-ných účinkov IL-4 by sme mohli uviesť vplyv na diferenciáciu B a T lymfocytov, ochranu lymfocytov pred apoptózou, vplyv na diferenciáciu, proliferáciu a apoptózu hematopoetických a iných buniek (napr. svalových, endotelových, nervových, den-

mailto:[email protected]


6

dritických) a pod. Najvýznamnejší účinok IL-4 je spájaný s alergickými ochoreniami, predovšetkým s alergickou astmou. IL-4 je spolu s interleukínom-13 (IL-13) kľúčovým cytokínom v patogenéze alergickej astmy. Regulujú Th2 lymfocyty, mastocyty, eozí-nofily, neutrofily, tvorbu IgE, tvorbu ad-héznych molekúl a chemokínov, vznik hy-perplázie gobletových buniek ako aj hy-perreaktivity dýchacích ciest (Zamorano et al., 2003). Zapojenie cytokínov do patoge-nézy alergickej astmy potvrdzuje aj práca Gruniga a spol. (1998), kedy aplikácia IL-4 a IL-13 vyvolala u myší eozinofíliu, sekréciu hlienu a hyperreaktivitu dýchacích ciest.

Vzájomná interakcia NO a cyto-kínov nie je úplne presne objasnená. Predpokladá sa, že viaceré látky s priamym účinkom na syntézu oxidu dusnatého mô-žu modulovať aj hladiny interleukínov s pozitívnym vplyvom na celkový priebeh ochorenia. Preto sme sa v našej práci za-merali na neselektívnu inhibíciu NO-syntáz a jej vplyv na zmeny hladín IL-4 v podmienkach experimentálne vyvolané-ho alergického zápalu dýchacích ciest u malých laboratórnych zvierat (morčiat).

Metodika

K experimentom sme použili mor-čatá, samce, s hmotnosťou 200 – 250 g. Zvieratá boli po privezení 1 týždeň adap-tované v centrálnom zverinci, kde dostáva-li plnohodnotnú stravu a vodu ad libitum. Experimentálna časť práce bola schválená Etickou komisiou JLF UK v Martine.

Desing experimentu

Pre potreby experimentu sme nad-izajnovali 4 skupiny zvierat (n = 8). 1. skupina predstavovala kontrolnú sku-

pinu zvierat, ktoré nedostávali žiadnu látku a boli pracovne označené ako „zdravé zvieratá“,

2. skupina predstavovala kontrolnú sku-pinu zvierat, ktoré boli senzibilizované alergénom – ovalbumínom (OVA; sub-

stancia Sigma Aldrich®) podľa senzibi-lizačnej schémy,

3. skupine sme aplikovali neselektívny

inhibítor NO-syntáz - metylester N-nitro-L-arginínu (L-NAME - substancia Sigma Aldrich®) v dávke 40 mg.kg-1 i.p. bez následnej senzibilizácie alergé-nom,

4. skupine sme aplikovali neselektívny inhibítor NO-syntáz L-NAME v dávke 40 mg.kg-1 i.p. s následnou senzibilizá-ciou alergénom.

L-NAME sme zvieratám v tretej a štvrtej skupine aplikovali počas 14 dní v rovnakom čase, pričom v deň senzibilizá-cie (1., 3. a 14. deň) sme inhibítor apliko-vali 30 minút pred podaním ovalbumínu.

Ovalbumín v dávke 100 mol.l-1 sme zvieratám aplikovali vo fyziologickom roztoku v súlade so stanovenou senzibili-začnou schémou: 1. deň – 0,5 ml i.p a 0,5 ml s.c., na 3. deň – 1 ml i.p a na 14. deň – 1 ml inhalačne. K inhalácii ovalbumínu sme použili celotelový bodypletyzmograf pre malé laboratórne zvieratá (Hugo Sachs Electronic®, typ 885, Nemecko).

Sledovanie reaktivity dýchacích ciest

Zmeny reaktivity dýchacích ciest a hladiny IL-4 sme sledovali v podmien-kach in vitro. Zvieratá sme 24 hodín po poslednej senzibilizácii usmrtili, pripravili sme preparáty z trachey a pľúcneho tkani-va, ktoré sme následne 60 minút inkubo-vali v orgánových kúpeľoch obsahujúcich Krebs – Henseleitov roztok (110,0 mmol.l-1 NaCl, 4,8 mmol.l-1 KCl, 2,35 mmol.ml-1 CaCl2, 1,20 mmol.l-1 MgSO4, 1,2 mmol.l-1 KHPO4, 25,0 mmol.l-1 NaHCO3 a glukóza 10,0 mmol.l-1 v destilovanej vode). Roztok bol kontinuálne saturovaný pneumoxidom (95 % O2 + 5% CO2) pri teplote 37 ± 0,5 °C a pH 7,5 ± 0,1 a vymieňaný každých 10 minút. Zmeny amplitúdy kontrakcie inku-bovaných tkanivových stripov na kumula-tívne dávky histamínu a acetylcholínu

(Sigma Aldrich; 10-8 – 10-3 mol.l-1) sme


7

zaznamenávali s pomocou „In vitro Isola-ted Tissue Bath System“ (Experimetria Ltd.®, Maďarsko).

Detekcia interleukínu 4

K detekcii hladín IL-4 sme využili metódu ELISA (Enzyme-linked immuno-sorbent assay), ELISA kit (USCN Life Scien-ce, Inc.®, Wuhan, Čína), v súlade s inštrukciami výrobcu. Krv použitú na de-tekciu sme odobrali zo srdca usmrtených zvierat do EDTA skúmaviek a centri-fugovali 15 minút pri 1000 x g. Pred spra-covaním sme plazmu uchovali pri teplote -80°C. Vzorky plazmy sme po rozmrazení pridali do 96-jamkovej platničky s protilátkou proti IL-4 a inkubovali po dobu 120 minút pri teplote 37 °C. Po pre-mytí sme platničku inkubovali s detek-čným činidlom po dobu 60 minút pri rov-nakej teplote. Následne sme pristúpili k farbeniu s roztokom substrátu (15 min.) a zmerali absorbanciu pri 450 nm. Hodno-ty IL-4 sú vyjadrené ako koncentrácie IL-4 v plazme v pg.ml-1.

Štatististika

Výsledky sme spracovali a štatis-ticky vyhodnotili pomocou programu Mic-rosoft Excel a programu GrafPad. Rozdiely v odpovedi boli hodnotené studentovým t-testom. Za štatisticky významne rozdielne

boli považované hodnoty p0.05.

Výsledky Zmeny reaktivity dýchacích ciest po apliká-cii OVA

Aplikácia ovalbumínu v súlade so stanovenou senzibilizačnou schémou vy-volala signifikantné zvýšenie reaktivity trachey a pľúcneho tkaniva na oba použité bronchokonstrikčné mediátory (p < 0,05*, p < 0,001**). Grafické znázornenie vzhľa-dom k rozsahu článku neprezentujeme. Zmeny reaktivity dýchacích ciest po apliká-cii L-NAME

Dvojtýždňová aplikácia neselektív-neho inhibítora NO-syntáz L-NAME „zdra-vým zvieratám“ vyvolala kontrakciu hlad-kého svalu trachey a pľúcneho tkaniva, ktorá ale nereagovala na postupné zvyšo-vanie koncentrácií nami použitých bron-chokonstrikčných mediátorov - histamínu a acetylcholínu. Vzhľadom k takmer iden-tickým zmenám prezentujeme len zmeny reaktivity na histamín (obr. 1).

Podávanie L-NAME senzibilizova-ným zvieratám vyvolalo takmer identický efekt ako aplikácia inhibítora „zdravým zvieratám“. Zaznamenali sme kontrakciu tak hladkého svalu trachey ako aj pľúcne-ho tkaniva na histamín i acetylcholín, pri-čom hladký sval nereagoval na postupne sa zvyšujúce koncentrácie oboch broncho-konstrikčných mediátorov a amplitúda kontrakcie bola takmer konštantná počas celého experimentu. Podobne ako v prvom prípade, aj tu vzhľadom k takmer identickým zmenám prezentujeme len zmeny reaktivity na histamín (obr. 2). Interleukín 4

Priemerná hladina interleukínu 4 u zdravých zvierat bola detegovaná na úrovni 0,038 pg.ml-1 (SEM=0,0086), u zvierat liečených L-NAME bola hladina IL-4 0,023 pg.ml-1 (SEM=0,0032). Pokles hladín u liečených zvierat v porovnaní s kontrolnou skupinou nebol signifikantný.

Priemerná hladina interleukínu 4 u senzibilizovaných zvierat bola detegova-ná na úrovni 0,045 pg.ml-1 (SEM=0,0154), u senzibilizovaných zvierat liečených L-NAME bola hladina IL-4 0,022 pg.ml-1 (SEM=0,0038). Pokles hladín u liečených zvierat v porovnaní s kontrolnou skupinou podobne ako v predchádzajúcom prípade nebol signifikantný.

Následne sme porovnali rozdiely v hladinách IL-4 u zdravých a senzibilizo-vaných zvierat. Aj napriek pozorovateľné-mu vzostupu IL-4 po aplikácii ovalbumínu


8

(0,045 pg.ml-1 vs 0,038 pg.ml-1) tento rozdiel taktiež nebol štatisticky významný.

Obr. 1 Zmeny reaktivity hladkého svalu trachey (vľavo) a pľúcneho tkaniva (vpravo) na histamín v kontrolnej skupine („zdravé zvieratá“) a u zvierat po 14 dňovej aplikácii L-NAME. P < 0,05*, p < 0,01**, p < 0,001***

Obr. 2 Zmeny reaktivity hladkého svalu trachey (vľavo) a pľúcneho tkaniva (vpravo) na histamín v kontrolnej skupine OVA) a u zvierat po 14

dňovej aplikácii L-NAME v kombinácii so senzibilizáciou. P < 0,01**, p < 0,001***

Diskusia Na regulácii bronchomotorického

tonusu sa podieľa viacero endogénnych mediátorov, nevynímajúc oxid dusnatý. Z literatúry je známy tak charakter pôso-benia NO na hladký sval dýchacích ciest, ako aj vplyv určitých zmien homeostázy NO na vznik hyperreaktivity dýchacích ciest (Nevin a Broadley 2002). Modifikácia hladín NO vo vzťahu k hyperreaktivite dý-

chacích ciest ako aj k iným parametrom zápalu stále nie je úplne objasnená. Preto sme sa v našej práci zamerali na inhibíciu tvorby oxidu dusnatého v skupine „zdra-vých“ a alergénom senzibilizovaných zvie-rat a následné sledovanie zmien reaktivity hladkého svalu trachey a pľúcneho tkaniva na dva bronchokonstrikčné mediátory – histamín a acetylcholín. Zaujímalo nás tiež, ako inhibícia tvorby NO ovplyvní tvorbu IL-


9

4, ktorý je považovaný za jeden z hlavných prozápalových cytokínov v patogenéze alergickej astmy.

Použili sme nešpecifický inhibítor, aj vzhľadom k stále pretrvávajúcej nejed-noznačnosti participácie jednotlivých NO-sytáz v konkrétnych fyziologických a patologických procesoch prebiehajúcich v dýchacích cestách. L-NAME je charakte-rizovaný ako L-arginínový analóg, ktorý inhibuje produkciu NO prevažne v cievnom systéme, t.j. jeho dominantný inhibičný efekt je na endotelovú NO-syntázu. Napriek tomu dokáže v porovnaní s inými, selektívnejšími inhibítormi, zablo-kovať aj aktivitu ostatných NO-syntáz (Re-es et al., 1990). Aplikácia L-NAME v našich podmienkach vyvolala kontrakčnú odpo-veď na úrovni hladkého svalu trachey a pľúcneho tkaniva. Kontrakcia bola tak-mer konštantná a nereagovala na kumula-tívne dávky histamínu a acetylcholínu. Tento efekt sme zaznamenali tak v skupine „zdravých zvierat“ dostávajúcich L-NAME v porovnaní s kontrolou ako aj v skupine zvierat senzibilizovaných ovalbumínom. Signifikantné rozdiely sme nazaznamenali ani v porovnaní amplitúdy kontrakcie na úrovni dýchacích ciest (trachea/pľúcne tkanivo) a ani v závislosti od typu použité-ho bronchokonstrikčného mediátora (his-tamín/acetylcholín). Výsledky niektorých autorov poukazujú na to, že účinok NO je dominantnejší v horných dýchacích ces-tách, kde NO pôsobí bronchodilatačne (Belvisi et al., 1991; Prado et al., 2005). Hodnoteniu pľúcnych vzoriek sa v súčasnosti venuje len veľmi málo auto-rov, nakoľko táto oblasť je ovplyvnená postupným znižovaním počtu nitrergic-kých nervových vlákien v bronchiálnom strome ako aj prítomnosťou vaskulatúry (Ricciardolo et al., 2004). Naše výsledky sú v súlade s výsledkami Prada a spol. (2005) ktorí zistili, že dlhodobá aplikácia L-NAME vyvoláva bronchokonstrikciu v horných dýchacích cestách tak vo fyziologických

podmienkach ako aj v podmienkach aler-gického zápalu. Tento efekt bol však po-tvrdený len u viacerých druhov experi-mentálnych zvierat, nie u ľudí (Maniscalco et al., 1997; Rubini 2011). Na druhej stra-ne, účinok L-NAME je ovplyvnený aj inými faktormi, na čo poukazuje aj naša pred-chádzajúca práca, kde poukazujeme na rozdiely v odpovedi hladkého svalu tra-chey a pľúcneho tkaniva v dvoch rozdiel-nych modeloch alergického zápalu dýcha-cích ciest. V podmienkach zápalu vyvola-nom exogénnym iritantom L-NAME signi-fikatne redukoval hyperreaktivitu dýcha-cích ciest v porovnaní s kontrolnou skupi-nou. Zmeny boli závislé na kumulatívnych dávkach bronchokonstrikčných mediáto-rov a tiež na spôsobe aplikácie (Antošová a Strapková, 2008).

Z našich výsledkov jednoznačne vyplýva, že NO moduluje tonus hladkého svalu trachey a pľúcneho tkaniva. Stabilita kontrakčnej odpovede je však pomerne ťažko charakterizovateľná. Kým pri nižších koncentráciách mediátora je značný bron-chokonstrikčný efekt, je možné definovať signifikantný pokles kontrakčnej odpovede pri vyšších koncentráciách bronchokon-strikčného mediátora v porovnaní s kontrolou za bronchodilatačnú odpoveď? Pravdepodobne nie. Ak vychádzame z aktuálnych poznatkov a NO je jeden z hlavných mediátorov inhibičného nead-renergického necholinergického systému a zabezpečuje bronchodilatáciu resp. opti-málnu homeostázu bronchomotorického tonusu, potom jeho inhibícia skôr prispie-va k vzniku ochorení dýchacích ciest spo-jených s hyperreaktivitou. V súvislosti s výsledkami u senzibilizovaných zvierat však budeme musieť zrealizovať ďalšie experimenty.

Otázkou taktiež ostáva zapojenie jednotlivých izoforiem NO-syntáz a ich pro- a antihyperreaktívne pôsobenie. V modeli senzibilizácie alergénom bolo do-kázané zvýšenie aktivity induktívnej NO-


10

syntázy, ktorá je ovplyvňovaná predovšet-kým prozápalovými cytokínmi. Jej aktivita je ovplyvňovaná pôsobením tzv. aktivač-ných a inhibičných cytokínov. Z aktivač-ných môžeme uviesť napr. interferon gamma (INF-γ), interleukín 1 beta (IL-1β) alebo faktor nekrotizujúci tumory alfa (TNF-α). Aktivitu iNOS znižuje epidermálny rastový faktor (EGF), cytokíny produkova-né Th2 lymfocytmi (IL-4, 8,10) alebo trans-formačný rastový faktor beta (TGF-β) (Ad-cock et al., 1994; Asano et al., 1994). Preto sme sa zamerali aj na detekciu hladín IL-4 ako jedného z najdôležitejších prozápalo-vých cytokínov a zároveň inhibičného cy-tokínu iNOS. Zistili sme, že hladiny IL-4 v podmienkach alergicky vyvolaného zápa-lu stúpajú, tento vzostup však nebol signi-fikantný. L-NAME ako neselektívny inhibí-tor znižuje aktivitu aj induktívnej NO-syntázy, IL-4 ako inhibičný cytokín by sa mal na znížení aktivity iNOS spolupodieľať. Nami získané výsledky poukazujú na to, že hladina IL-4 po podaní L-NAME klesla, jeho inhibičná aktivita tak bola potenciálne zre-dukovaná u zdravých zvierat o 1/3 a u senzibilizovaných zvierat na ½ hodnôt detegovaných u „zdravých zvierat“. Ak uvažujeme, že v našich podmienkach bola hladina IL-4 znížená pôsobením L-NAME, nepôsobil na iNOS ako inhibičný cytokín, resp. len v malej miere. Potom môžeme predpokladať, že L-NAME spôsobil zníže-nie aktivity všetkých troch izoforiem, ne-priamo zablokoval bronchodilatačné pô-sobenie NO a vyvolal bronchokonstrikciu. Je tiež možné, že vplyvom inhibítora došlo k imunomodulácii, ktorá mohla ovplyvniť kontrakčnú odpoveď. Z literatúry je zná-me, že inhibícia NO má downregulačné účinky na niektoré prozápalovo pôsobiace cytokíny. Postavenie L-NAME je ale v tom-to smere pomerne problematické a viacerí autori preferujú používanie špecifických inhibítorov (Walley et al., 1999). Na zákla-de výsledkov môžeme predpokladať, že účasť jednotlivých izoforiem NO-syntáz na

tvorbe oxidu dusnatého je v našom modeli alergénom vyvolanej hyperreaktivity rov-nako dôležitá, čo v ďalšej práci potvrdíme detekciou expresie mRNA jednotlivých NO-syntáz. Budeme tiež identifikovať ďal-šie cytokíny a definovať ich vzájomné in-teraktívne vzťahy s látkami modulujúcimi hladinu endogénneho oxidu dusnatého.

Záver

Inhibícia tvorby oxidu dusnatého patrí k oblastiam s potenciálom využitia v terapii akútnych a chronických ochorení dýchacích ciest. Naša práca poukázala na to, že inhibícia tvorby NO môže zásadným spôsobom ovplyvniť reaktivitu dýchacích ciest. Dokáže tiež modulovať hladinu pro-zápalovo pôsobiacich cytokínov, čo môže byť pozitívne predovšetkým v podmien-kach zápalu vyvolaného alergénom. Stále však existujú mnohé nezodpovedané otázky týkajúce sa zapojenia NO do zá-kladných fyziologických procesov prebie-hajúcich v dýchacích cestách ako aj otázky účasti oxidu dusnatého v patogenéze ochorení dýchacích ciest. Podporené Grantom MZ SR 2007/UK-46-11 a projektom "Zvýšenie možností kariérneho rastu vo výskume a vývoji v oblasti lekárskych vied”, ktorý je spolufinancovaný z prostriedkov EÚ - ESF. Zoznam použitej literatúry 1. Adcock IM, Brown CR, Kwon O, Barnes PJ.

Oxidative stress NF kappa B DNA binding and inducible NOS mRNA in human epithelial ce-lls. Biochem Biophys Res Commun 1994; 199: 1518-1524.

2. Antošová, M., Strapková A.: Dual effect of L-NAME on airway hyperreactivity. Acta Med Martin 2008; 8/1: 8-16.

3. Asano K, Chee CBE, Gaston B, Lilly CM, Gerard C, Drazen JM, Stamler JS. Constitutive and in-ducible nitric oxide synthase gene expression, regulation, and activity in human lung epithe-lial cells. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 10089-10093.


11

4. Belvisi MG, Stretton D, Barnes PJ. Nitric oxide as an endogenous modulator of cholinergic neuriotransmission in guinea-pig airways. Eur J Pharmacol 1991;198: 219–221.

5. Grunig G, Warnock M, Wakil AE, Venkayya R, Brombacher F, Rennick DM. Requeriment for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma. Science 1998; 282: 2261-2264.

6. Chang RH, Feng MH, Liu WH, Lai MZ. Nitric oxide increased interleukin-4 expression in T lymphocytes. Immunol 1997; 90(3):364-9.

7. Maniscalco M, Sofia M, Smith A, Demoncheaux EA, Mormile A, Faraone S, Higenbottam T. Lack of effect of nitric oxide inhibition on bronchial tone and methacholine induced bronchoconstriction in man. Respir Med 1997; 91: 335–340.

8. Nevin BJ, Broadley KJ. Nitric oxide in respiratory diseases. Pharmacol Therap 2002; 95:259-293.

9. Prado CM, Leick-Maldonado EA, Kasahara DI, Capelozzi VL, Martins MA, Tibe´rio FLCI. Ef-fects of acute and chronic nitric oxide inhibi-tion in an experimental model of chronic pulmonary allergic inflammation in guinea

pigs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2005: 289: L677– L683.

10. Rees D D, Palmer R M J, Schulz R , Hodson HF, Moncada S. Characterization of three inhibitors of endothelial nitric oxide synthase in vitro and in vivo. Brit J Pharmacol1990; 101 (3): 76-752.

11. Ricciardollo FL, Sterk PJ, Gaston B, Folkers G. Nitric oxide in health and disease of the respi-ratory system. Physiol Rev 2004; 84: 731–765.

12. Rubini A. The Effect of N G -Nitro- L -Arginine Methyl Ester, a Nitric Oxide Synthase Inhibi-tor, on Respiratory Mechanics in Rats. Respir 2011;82:468–475.

13. Walley KR, McDonald TE, Higashimoto Y, Hay-ashi S. Modulation of Proinflammatory Cyto-kines by Nitric Oxide in Murine Acute Lung In-jury. Am J Respir Crit Care Med 1999;160: 698–704.

14. Zamorano J, Rivas MD, Pérez-G, M. Interleukin-4: A multifunctional cytokine. Inmunol 2003; 22(2): 215-224.


12

Mechanizmy regulujúce pohyb cílií respiračného traktu

Marta Jošková1, Vladimíra Sadloňová1, Dušan Koniar2, Libor Hargaš2, Miroslav Hrianka2, Soňa Fraňová1

1 Ústav farmakológie, Jesseniova lekárska fakulta UK, Martin, 2 Katedra mechatroniky

a elektroniky, Žilinská univerzita, Žilina e-mail: [email protected]

Cílie, pokrývajúce povrch ciliárnych buniek respiračného epitelu, sú ako vý-konné jednotky mukociliárneho transpor-tu (MCT), zodpovedné za odstraňovanie hlienov a tkanivového sekrétu z dýchacích ciest. Vykonávajú pritom koordinovaný kmitavý pohyb, čím posúvajú cudzorodé častice ako alergény, baktérie, prachové častice a iné polutanty, zachytené v hlienovej vrstve, orálnym smerom do orofaryngu. MCT je závislý od ich počtu, štruktúry, aktivity a koordinovanej činnos-ti.

Optimálna aktivita cílií bola potvr-dená pri teplote 37 °C a absolútnej vlhkos-ti 44 mg/dl3, čo korešponduje s relatívnou 100 % vlhkosťou (Williams et al., 1996). Za normálnych okolností cílie kmitajú veľmi pomaly. Tento pohyb je výsledkom ATP-ázovej aktivity dyneínu, základného sta-vebného proteínu cílií. Avšak, veľké množ-stvo stimulov, sprostredkovaných recep-tormi, môže dramaticky tento pohyb urýchliť.

Zrýchlenie frekvencie kmitania cílií (CBF) bolo v experimentálnych podmien-kach potvrdené po aktivácii purinergných P1 a P2 (Gheber et al., 1995), cholinerg-ných (Slaughter a Aiello, 1982) a adrenergných receptorov (Maruyama, 1984). Navyše purinergná stimulácia po-tencuje ciliostimulačný vplyv β- adrenerg-nej aktivácie (Allen-Gipson et al., 2011). Dôležitú úlohu v zrýchlení pohybu riasiniek zohráva zvýšená intracelulárna koncentrá-cia kalcia (Ca2+). Ide o výsledok mobilizácie vnútrobunkových zdrojov Ca2+ zo sarkop-

lazmatického retikula, ako aj vstupu Ca2+ do vnútra buniek z extracelulárneho prie-storu, po inhibícii K+ kanálov, spojených s depolarizáciou membrány a otvorením napäťovo riadených Ca2+ kanálov. Ióny Ca2+ participujú v organizme na regulácii všetkých bunkových procesov. Ich účinok je sprostredkovaný väzbou a reguláciou aktivity veľkého množstva bunkových pro-teínov, ku ktorým patria kinázy a fosfatázy, kalmodulín (CaM), fosfodiesterázy, adeny-látcyklázy, ATP-ázy, membránové kanály, jednotlivé časti cytoskeletu a iné.

Zvýšenie intracelulárnej koncentrá-cie Ca2+, po aktivácii cieľových kináz (PKA a PKG), je spojené aj so zvýšením CBF (obr. 1).

Z ďalších sekundárnych poslov, kto-ré sú implementované v stimulácii cílií prostredníctvom aktivácie PKA a/PKG sú cAMP, oxid dusný a cGMP (Wyatt et al., 1998).

V motilite buniek zohráva rozhodu-júcu úlohu membránový potenciál. Môže byť modifikovaný pôsobením mechanic-kých, chemických a termických stimulov. Mechanické stimuly aktivujú mechanosen-zitívne Ca2+ kanály. Ich pôsobením je zvý-šený vstup Ca2+ napäťovo riadenými Ca2+ kanálmi dovnútra cílie. Zvýšenie intracelu-lárnej koncentrácie Ca2+ akceleruje pohyb cílie dopredu alebo dozadu. V ciliárnych bunkách vnútrobunkové Ca2+ aktivuje Ca2+-senzitívne K+ kanály, nasledované repolari-záciou ciliárnej membrány, čím sa pohyb cílie dopredu alebo dozadu ukončí (obr. 2).



13

Receptor + agonista

mobilizácia Ca2+ z vnútrobunkových zdrojov

↑cGMP

PKG

Ca2+ + PKG

fosforylácia a defosforylácia axonémy

silné, ale krátkodobé zrýchlenie CBF

influx Ca2+ z extracelulárneho priestoru

↑cAMP

PKA

PKA + PKG

fosforylácia axonémy

stredné prolongované zrýchlenie CBF

zvýšenie účinnosti MCT

↑[ Ca2+]i ↑[ Ca2+]i

Obr. 1 Signálne dráhy, regulujúce pohyb cílií, po aktivácii purinergných/cholinergných receptorov (upravené podľa Braiman a Priel, 2008).

CBF- frekvencia kmitania cílií, MCT – mukociliárny transport, [Ca2+]i- intracelulárne kalcium

Obr. 2 Úloha membránového potenciálu v kontrole kmitavého pohybu cílií (Schwab et al., 2008). 1- mechanosenzitívne Ca2+ kanály (ružo-

vá), 2- napäťovo riadené Ca2+ kanály (fialová), 3- Na2+ kanály závislé na kalmodulíne (červená), rýchlo aktivované K+ kanály (modrá), 4- pomaly aktivované K+ kanály (šedá), 5- Ca2+-senzitívne K+ kanály (zelená), 6- hyperpolarizáciou aktivované Na2+ kanály (oranžová), [Ca2+]i- intracelulárne kalcium.

Spomalenie pohybu cílií v dýchacom trakte môže byť výsledkom pôsobenia bakteriálnych produktov, lipoo-ligosacharidov, chronickej expozície ciga-

retovému dymu, pneumolyzínu, acetalde-hydu, peroxidu, neuropeptidu Y a phorbol esteru. Cieľovým miestom ich pôsobenia je proteínkináza C (PKC). Táto se-


14

rín/treonínová proteínová kináza reguluje niekoľko bunkových procesov, ku ktorým patrí proliferácia, apoptóza, diferenciácia, angiogenéza, odpoveď na stres a lipidový metabolizmus. Jej endogénnym aktiváto-rom je diacylglycerol (DAG), produkovaný účinkom fosfatidylinozitol bifosfonátu. Aktivácia signálnych dráh spojených s PKC je zapojená do patologických procesov, prebiehajúcich v pľúcach, vedúcich k vývo-ju nádorových a intersticiálnych pľúcnych ochorení, astmy, fibrózy a chronickej ob-štrukčnej choroby pľúc. Výskum potvrdil participáciu bronchokonstrikcie, vazokon-strikcie, hypoxie, ako aj vplyv environmen-tálnych faktorov, cigaretového dymu a azbestu na aktiváciu PKC (Stapleton et al., 2010).

PKC sa vyskytuje v 3 izoformách: 1. konvenčná PKC (cPKC) závislá na Ca2+ a DAG (α, βI, βII a γ), 2. nová PKC (nPKC) nezávislá na Ca2+ a závislá na DAG (δ, ε, μ, ξ a νλ) a 3. izoformou je atypická PKC (aPKC) nezávislá od Ca2+ a DAG. Aktivácia PKC je spojená so signifikantným cilioinhi-bičným účinkom (Kobayashi et al., 1989). Najnovšie štúdie dokázali kľúčovú úlohu PKCε v spomalení CBF po pôsobení cigare-tového dymu a alkoholu (Wyatt et al., 2012). Jej prítomnosť bola potvrdená v axonéme cilií respiračného epitelu. PKCδ reguluje tvorbu cytokínov v pľúcach, ale pravdepodobne nesúvisí so spomalením CBF (Zhao et al., 2006; Wyatt et al., 2012).

Cílie v dýchacom trakte kmitajú ba-zálnou frekvenciou. V podmienkach stre-su, indukovaného námahou alebo zápa-lom, sa ich pohyb zrýchľuje, čím sa snažia očistiť dýchacie cesty od nadbytočného množstva inhalovaných častíc (Wyatt et al., 1998). Naopak chronické ochorenia dýchacích ciest, spojené s poškodením ultraštruktúry epiteliálnych buniek, vedú k ciliárnej dysfunkcii, spojenej s redukciou účinnosti MCT (Lapperre et al., 2007; Thomas et al., 2010; Yaghi et al., 2012).

V súvislosti s reguláciou činnosti riasiniek v dýchacom systéme sme na na-šom ústave realizovali niekoľko experi-mentov, zameraných na potvrdenie stimu-lačného vplyvu cholinergnej neurotrans-misie na CBF. Experimenty boli vykonané v in vitro experimentálnych podmienkach, po dekapitácii morčiat, za udržiavania štandardných podmienok (teplota podlož-ného sklíčka a fyziologického roztoku 37 °C). Ster sliznice trachey morčiat bol odo-bratý „brushingovou metodikou“, pričom materiál bol nanášaný priamo do kvapky fyziologického roztoku na podložné sklíč-ko. Z jedného steru boli pripravené 2 mi-kroskopické preparáty. V prípade sledova-nia participácie muskarínových receptorov na regulácii CBF sme do pripravného mi-kroskopického preparátu pridali kvapku metacholínu (10-8 mol.l-1) alebo metacho-línu a atropínu (10-8 mol.l-1). Po 5 minúto-vej inkubácii bola vzorka vyšetrená v svetelnom mikroskope (Kvant model IM1C). Pomocou vysokorýchlostnej kame-ry (Basler A504kc) boli zaznamenané krát-ke videosekvencie. Do štúdie boli začlene-né len časti nepoškodenej sliznice epitelu dýchacích ciest s prítomnosťou funkčných cílií. Záznamy boli spracované pomocou softwéru Ciliary analysis a následne upra-vené pomocou tzv. postanalýzy (vylúčili sa záznamy neobsahujúce cílie, napr. ciliárne bunky bez cílií, pohyblivé krvné elementy a pod.) (obr. 3).

Výsledky boli štatisticky spracované Studentovým t-testom. Za štatisticky vý-znamný rozdiel sme považovali p<0,05. Naša experimentálna štúdia potvrdila si-gnifikantný ciliostimulačný vplyv metacho-línu na CBF (*p<0,05), ktorý bol blokovaný pôsobením kompetitívneho antagonistu muskarínových receptorov, atropínu (**p<0,01). Naše výsledky boli v súlade s výsledkami iných experimentálnych štú-dií venovaných spomínanej problematike (Wong et al, 1988; Yang et.al, 1997).


15

Náš výskum v oblasti obranných mechanizmov bude ďalej pokračovať a sledovať vplyv látok alebo kombinácie látok, s odlišným mechanizmom účinku, pôsobiacich na úrovni respiračného traktu,

na úpravu patologicky zmenenej kinemati-ky cílií. Úpravou MCT by mohli zlepšiť prognózu chronických respiračných ocho-rení.

Obr. 3 Analýza a postanalýza frekvencie kmitania cílií po podaní metacholínu (10-8 mol.l-1) pomocou softwéru Ciliary analysis. Oblasti záuj-mu (ROI) označené zelenou farbou po spracovaní softwérom Ciliary analysis. Červenou farbou označené hodnoty najčastejšie sa vy-skytujúcich frekvencií kmitania cílií (CBF) v danom ROI. Modrou farbou manuálne označená ROI obsahujúca len funkčné cílie ciliár-nych buniek. Tabuľka s maximálnymi, minimálnymi, priemernými a najčastejšie sa vyskytujúcimi hodnotami CBF.

Práca bola podporená nasledovnými projek-tami: „Zvýšenie možností kariérneho rastu vo výskume a vývoji v oblasti lekárskych vied“, „Dobudovanie centra experimentálnej a klinickej respirológie II (CEKR II)“ , „Meranie kinetiky cílií respiračného traktu“ a VEGA 1/0020/11. Zoznam použitej literatúry 1. Braiman A, Priel ZV. Efficient mucociliary

transport relies on efficient regulation of cilia-ry beating. Respir Physiol Neurobiol 2008; 163: 202-207.

2. Gheber L, Priel Z, Aflalo C, Shoshan-Barmatz V. Extracellular ATP binding proteins as po-tential receptors in mucociliary epithelium: characterization using [32P]39-O-(4-benzoyl) benzoyl ATP, a photoaffinity label. J Membr Biol 1995; 147: 83-93.

3. Kobayashi K, Tamaoki J, Sakai N, Chiyotani A, Takizawa T. Inhibition of ciliary activity by phorbol esters in rabbit tracheal epithelial ce-lls. Lung 1989; 167: 277-284.

4. Lapperre TS, Sont JK, van Schadewijk A, Gos-man MME, Postma DS, Bajema IM, Timens W, Mauad T, Hiemstra PS, and the GLUCOLD Stu-dy Group. Smoking cessation and bronchial epithelial remodelling in COPD: a cross-sectional study. Respir Res 2007; 8: 85.

5. Maruyama I. Conflicting effects of noradrena-

lin on ciliary movement of frog palatine mu-

cosa. Eur J Pharmacol 1984; 97: 239-245.

6. Schwab A, Hanley P, Fabian A, Stock Ch. Po-tassium channels keep mobile cells on the go. Physiology 2008; 23: 212-220.

7. Slaughter M and Aiello E. Cholinergic nerves

stimulate mucociliary transport, ciliary activi-

ty, and mucus secretion in the frog palate.

Cell Tissue Res 1982; 227: 413-421.

8. Stapleton CM, Joo JH, Kim YS, Liao G, Panet-tieri Jr. RA and AM Jetten. Induction of ANGPTL4 expression in human airway smooth muscle cells by PMA through activation of PKC and MAPK pathways. Exp Cell Res 2010; 316: 507.

9. Thomas B, Rutman A, Hirst RA, Haldar P, Wardlaw AJ, Bankart J, Brightling ChE, O´Callaghan Ch. Ciliary dysfunction and ultra-structural abnormalities are features of seve-re asthma. J Allergy Clin Immunol 2010; 126: 722-729.

10. Williams, R., Rankin, N., Smith, T., Galler, D., Seakins, P. Relationship between humidity and temperature of inspired gas and the fun-ction of the airway mucosa. Crit Care Med 1996; 24: 1920-1929.

11. Wong LB, Miller IF, Yeates DB. Regulation of ciliary beat frequency by autonomic mecha-


16

nisms: in vitro. J Appl Physiol 1988, 65:1895-901.

12. Wyatt TA, Sisson JH, Allen-Gipson DS, McCas-kill ML, Boten JA, DeVasure JM, Bailey KL, Po-ole JA. Co-Exposure to cigarette smoke and alcohol decreases airway epithelial cell cilia beating in a protein kinase Cε-dependent manner. Am J Pathol 2012; 181:2.

13. Wyatt TA, Spurzem JR, May K, Sisson JH. Re-gulation of ciliary beat frequency by both PKA and PKG in bovine airway epithelial cells. Am J Physiol 1998; 275: L827–L835.

14. Yaghi A, Zaman A, Gerard C, Dolovich MB. Ciliary beating is depressed in nasal cilia from

chronic obstructive pulmonary disease sub-jects. Respir Med 2012; 106: 1139-1147.

15. Yang B, Schlosser RJ, McCaffrey TV. Signal

transduction pathways in modulation of cilia-

ry beat frequency by methacholine. Ann Otol

Rhinol Laryngol 1997;106:230-236.

16. Zhao Y, He D, Saatian B, Watkins T, Spannha-ke EW, Pyne NJ, Natarajan V. Regulation of lysophosphatidic acid-induced epidermal growth factor receptor transactivation and in-terleukin-8 secretion in human bronchial epithelial cells by protein kinase Cdelta. Lyn kinase, and matrix metalloproteinases. J Biol Chem 2006; 281: 19501-19511.


17

Vplyv Provinolu a kombinovanej terapie Provinolu s klinickými antiastmati-kami na hyperreaktivitu dýchacích ciest počas experimentálneho alergického

zápalu

Ivana Kazimierová1, Marta Jošková1, Oľga Pecháňová2, Martina Šutovská1, Soňa Fraňová1

1 Ústav farmakológie, Jesseniova lekárska fakulta UK, Martin, 2 Ústav normálnej a patologic-

kej fyziológie SAV, Bratislava e-mail: [email protected]

Alergická astma je chronické zápa-

lové ochorenie dýchacích ciest charakteri-zované zvýšenou aktiváciou mastocytov, tvorbou imunoglobulínov IgE, proliferá-ciou eozinofilov a zvýšeným počtom Th2 lymfocytov. Okrem prítomnosti zápalo-vých buniek je v dýchacích cestách astma-tikov pozorovaná bronchiálna hyperreak-tivita a remodelácia tkaniva dýchacích ciest (Broide, 2008).

Počas prvej fázy alergickej odpove-de organizmu po expozícii alergénom a rozoznaní bunkami prezentujúcimi anti-gén, dochádza k diferenciácii B-lymfocytov a zvýšenej tvorbe imunoglobulínov typu E. IgE sa viažu na povrch mastocytov pro-stredníctvom špecifických IgE receptorov. Senzibilizáciou mastocytov dochádza k uvoľneniu zápalových mediátorov, cyto-kínov a chemokínov. V štádiu chronického zápalu sa posúva rovnováha v pomere Th lymfocytov smerom k Th2, tvorbe zápalo-vých cytokínov, ktoré regulujú zápalovú odpoveď organizmu. Z hľadiska chronické-ho alergického zápalu sú najvýznamnejšie cytokíny tvorené Th2 lymfocytmi IL-4, IL-5, IL-13 a IL-9 (Meeyoung et al., 2009). Cytokíny IL-4 a IL-13 stimulujú B-bunky k syntéze IgE, IL-5 potencuje proliferáciu eozinofilov a IL-9 stimuluje proliferáciu mastocytov (Bradding et al., 2006). Aktivá-ciou mastocytov dochádza tiež k uvoľňovaniu chemokínov a zápalových mediátorov (histamín, prostaglandíny, leukotriény, atď) spôsobujúcich kontrakciu hladkej svaloviny dýchacích ciest a k zvý-šenej vaskulárnej permeabilite (Iwamura

et.al, 2010). Dlhodobý zápal stimuluje tvorbu rastových faktorov, ktoré spôsobu-jú remodeláciu dýchacích ciest.

Terapia astmy sa v súčasnosti riadi odporúčaniami GINA 2011 (Global iniciati-ve for asthma). Aj napriek pokroku v liečbe astmy, pribúdajú prípady ťažkých foriem ochorenia. Terapia astmy je v mnohých prípadoch nedostatočná, alebo spojená s výskytom nežiaducich účinkov. V súčasnosti sa hľadajú nové alternatívy liečby astmy. Cieľom experimentálnych štúdií je hľadať látky, ktoré majú simultán-ny bronchodilatačný a protizápalový úči-nok. Jedným z vhodných kandidátov sú prírodné látky zo skupiny polyfenolov.

Provinol je bezalkoholový extrakt polyfenolov z červeného vína, ktorý v predchádzajúcich experimentoch preu-kázal protizápalové účinky, antioxidačnú aktivitu a protektívny účinok na endotel.

Cieľom našej práce bolo overiť účinnosť Provinolu na citlivosť obranných reflexov dýchacích ciest (kašľa a bronchokonstrikcie) v podmienkach ex-perimentálneho alergického zápalu. Efekt Provinolu bol porovnávaný s referenčnými antiastmatikami (budesonid a teofylín) a antitusický účinok s opioidným antitusi-kom kodeínom. Zároveň bolo cieľom štú-die študovať možný benefit kombinácie Provinolu s klinickými antiastmatikami.

Materiál a metódy

V experimente boli použité morča-tá – samce kmeňa TRIK (200g-350g), ktoré



18

boli náhodne rozdelené do 7 skupín (10 ks v každej skupine):

Skupina 1: kontrolná – 21.dní podáva-ný fyziologický roztok

Skupina 2: 21 dní senzibilizácia oval-bumínom

Skupina 3: 21 dní senzibilizácia oval-bumínom a súčasne liečba Provino-lom (20mg/kg p.o.)Skupina 4: 21 dní senzibilizácia ovalbumínom a súčasne liečba budesonidom (1mM inhalač-ne počas 5 minút)

Skupina 5: 21 dní senzibilizácia oval-bumínom a súčasne liečba teofylínom (10mg/kg i.p.)

Skupina 6: 21 dní senzibilizácia oval-bumínom a súčasne liečba Provinolom (10mg/kg) a budesonidom (1 mM in-halačne počas 2minút 30sekúnd)

Skupina 7: 21 dní senzibilizácia oval-bumínom a súčasne liečba Provinolom (10mg/kg) a teofylínom (5mg/kg)

Experiment bol schválený Etickou komisiou Jesseniovej lekárskej fakulty v Martine.

Experimentálny model alergickej astmy

Alergický zápal u morčiat bol indu-kovaný ovalbumínom pri dávke 5mg oval-bumínu + 100mg Al(OH)3 počas 21 dní. Alergén bol aplikovaný parenterálne 1. deň (s.c., i.p.), 4., 11., 15. deň (i.p.), 9., 14. deň (s.c.). 16., 17., 18., 19., 20., 21. deň bol ovalbumín (1%) inhalovaný prostred-níctvom celotelového bodypletyzmografu (HSE typ 855, Hugo Sachs Elektronic Ne-mecko). 24 hodín po poslednej senzibilizá-cii boli zvieratá usmrtené prerušením mie-chy.

Vyhodnotenie kašľového reflexu

Počet nárazov kašľa vyvolaného in-haláciou 0,3M kyselinou citrónovou bol zaznamenávaný u bdelých morčiat metó-dou in vivo na celotelovom bodypletyzmo-grafe (HSE typ 855, Hugo Sachs Elektronic, Nemecko). Kašeľ bol sledovaný dvoma

nezávislými pozorovateľmi. Sledovaný bol pohyb morčaťa charakteristický pre kašeľ, zvuk kašľa a zmeny prietoku vzduchu pri náraze kašľa. Antitusický účinok sledova-ných látok bol porovnávaný s opioidným antitusikom kodeínom.

Reaktivita dýchacích ciest in vivo

Zmeny odboru dýchacích ciest me-tódou in vivo boli hodnotené použitím dvojkomorového celotelového bodyple-tyzmografu (HSE typ 855, Hugo Sachs Elek-tronic, Nemecko). Ako mediátor broncho-konstrikcie bol použitý histamín (10-6 mol/l). Po krátkodobej inhalácii histamínu bol hodnotený špecifický odpor dýchacích ciest pomocou softvéru HSE Pulmodyn Pennock (Hugo Sachs Elektornic, Nemec-ko).

Reaktivita dýchacích ciest in vitro

Po 21 dňovej senzibilizácii ovalbu-mínom a liečbe Provinolom boli zvieratá usmrtené a následne bola zhodnotená reaktivita hladkej svaloviny trachey v podmienkach in vitro. Zmeny amplitúdy kontrakcie izolovanej hladkej svaloviny po podaní bronchokonstrikčných mediátorov – acetylcholínu (10-8 – 10-3 mol/l ) a histamínu ( 10-8 – 10-3 mol/l ) boli pozo-rované a vyhodnotené použitím aparatúry firmy Experimetria-ISO-09-TSZ8 ,,Multi chamber tissue bathy systems“ so softve-rom.

Výsledky

Počet nárazov kašľa po inhalácii ky-seliny citrónovej bol signifikantne znížený po podaní Provinolu v porovnaní so senzi-bilizovanou skupinou. Najvýraznejší anti-tusický účinok Provinolu bol zaznamenaný 21. deň podávania po kombinácii s budesonidom. Na základe týchto výsled-kov bol potvrdený jeho antitusický účinok na experimentálnom modely alergickej astmy.


19

Obr. 1 Zmeny v počte nárazov kašľa indukovaného kyselinou citrónovou medzi kontrolnou, ovalbumínovou skupinou (OVA) a skupinami,

ktorým bol podávaný Provinol (POVA), budesonid (BOVA), teofylín (TOVA), budesonid+Provinol (PBOVA) a teofylín+Provinol (PTOVA) a so skupinou liečenou kodeínom testovaných za rovnakých experimentálnych podmienok. Výsledky sú udávane ako priemer ± SEM. Štatistická významnosť: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

Obr. 2 Zmeny v počte nárazov kašľa indukovaného kyselinou citrónovou medzi kontrolnou, ovalbumínovou skupinou a skupinami, ktorým bol podávaný Provinol, budesonid, teofylín, budesonid+Provinol a teofylín+Provinol a so skupinou liečenou kodeínom testovaných za rovnakých experimentálnych podmienok. Výsledky sú udávane ako priemer ± SEM. Štatistická významnosť: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

7.deň

*

******

***

0

2

4

6

8

10

12

14

16

kontrola

OVA

7

kodeín

POVA7

TOVA7

BO

VA7

PTOVA7

PBOVA

7

po

če

t n

ára

zov

ka

šľa

14.deň

*

***

***

** **

0

2

4

6

8

10

12

kontrola

OVA

14

kodeín

POVA14

TOVA14

BO

VA14

PTOVA14

PBOVA

14

po

če

t n

ára

zov

ka

šľa


20

Obr. 3 Zmeny v počte nárazov kašľa indukovaného kyselinou citrónovou medzi kontrolnou, ovalbumínovou skupinou a skupinami, ktorým

bol podávaný Provinol, budesonid, teofylín, budesonid+Provinol a teofylín+Provinol a so skupinou liečenou kodeínom testovaných za rovnakých experimentálnych podmienok. Výsledky sú udávane ako priemer ± SEM. Štatistická významnosť: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

Špecifický odpor dýchacích ciest meraný v dvojkomorovom bodypletyzmo-grafe bol použitý ako marker in vivo reak-tivity dýchacích ciest. Výsledky experimen-tu ukázali, že Provinol, budesonid, teofylín a ich kombinácie signifikantne znížili hod-noty špecifického odporu dýchacích ciest po inhalácii histamínu. Výsledky získané

z meraní po 7. a 14. dni liečby boli takmer totožné. Najvýraznejšie zmeny hodnôt špecifického odporu dýchacích ciest boli získané z meraní po 21 dňovej liečbe sen-zibilizovaných zvierat, kde účinky Provino-lu boli porovnateľné s budesonidom a teofylínom.

Obr. 4 Zmeny špecifického odporu merané metódou in vivo po inhalácii histamínu zaznamenávané medzi kontrolnou, ovalbumínovou skupinou a skupinami liečenými Provinolom, budesonidom, teofylínom a ich kombináciami. Výsledky sú udávane ako priemer ± SEM. Štatistická významnosť: *p<0,05, **p<0,01.

21.deň

***

***

****

*

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

kontrola

OVA

21

kodeín

POVA21

TOVA21

BO

VA21

PTOVA21

PBOVA

21

po

če

t n

ára

zov

ka

šĺa

7.deň

*****

*

*

0

5

10

15

20

25

kontrola OVA7 POVA7 TOVA7 BOVA7 PTOVA7 PBOVA7

Rx

V/m

l/s


21

Obr. 5 Zmeny špecifického odporu merané metódou in vivo po inhalácii histamínu zaznamenávané medzi kontrolnou, ovalbumínovou skupinou a skupinami liečenými Provinolom, budesonidom, teofylínom a ich kombináciami. Výsledky sú udávane ako priemer ± SEM. Štatistická významnosť: *p<0,05, **p<0,01.

Obr. 6 Zmeny špecifického odporu merané metódou in vivo po inhalácii histamínu zaznamenávané medzi kontrolnou, ovalbumínovou skupinou a skupinami liečenými Provinolom, Budesonidom, Teofylínom a ich kombináciami. Výsledky sú udávane ako priemer ± SEM. Štatistická významnosť: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

Reaktivita dýchacích ciest hodnotená

metódou in vitro po podaní bronchokon-strikčných mediátorov acetylcholínu a histamínu poukázala na bronchodilatačný účinok Provinolu v porovnaní s ovalbumínovou

skupinou. Signifikantne znížená amplitúda kontrakcie hladkého svalu dýchacích ciest bola pozorovaná u morčiat liečených kombináciou liečiv Provinolu a budesonidu.

14.deň

****

****

*

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

kontrola

OVA

14

POVA14

TOVA14

BO

VA14

PTOVA14

PBOVA

14

Rx

V/m

l/s

21.deň

***

***

******

******

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

kontrola OVA21 POVA TOVA BOVA PTOVA PBOVA

Rx

V/m

l/s


22

Obr. 7 Zmeny v reaktivite dýchacích ciest metódou in vitro použitím bronchokonstrikčného mediátora histamínu, po dlhodobej liečbe senzibilizovaných morčiat Provinolom a jeho kombináciou s klinickými antiastmatikami. Výsledky sú udávané ako priemer ± SEM. Štatistická významnosť **p<0,01.

Obr. 8 Zmeny v reaktivite dýchacích ciest metódou in vitro použitím bronchokonstrikčného mediátora acetylcholínu, po dlhodobej liečbe senzibilizovaných morčiat Provinolom a jeho kombináciou s klinickými antiastmatikami. Výsledky sú udávané ako priemer ± SEM. Štatistická významnosť: *p < 0,05; **p < 0,01.

Diskusia V súčasnosti sa na liečbu astmy

používajú krátkodobo pôsobiace beta2-mimetiká, anticholinergiká, glukokortikoi-dy, teofylín, antileukotriény, dlhodobo pôsobiace b2-mimetiká a anti IgE terapia. Avšak táto terapia je u mnohých pacientov nedostatočná a výskyt vedľajších účinkov obmedzuje ich použitie. Z hľadiska pre-

vencie a liečby astmy sú zaujímavou sku-pinou polyfenolické látky. Mnohé z nich preukázali v experimentálnych štúdiách z hľadiska astmatického zápalu pozitívne farmakodynamické účinky (Newall et al., 1996; Mali et al., 2011).

Polyfenoly v respiračnom trakte pôsobia antialergickým, protizápalovým a bronchodilatačným účinkom (Sanbongi


23

et al., 2004). Quercetín patrí do skupiny flavonolov s bronchodilatačným účinkom. Rogerio a spol. (2010) vo svojej práci po-tvrdil schopnosť quercetínu znižovať hy-perreaktivitu dýchacích ciest. Antialergic-kým účinkom sa vyznačujú katechíny, zlož-ky zeleného čaju, ktoré sú schopné potlá-čať tvorbu IgE (Wu et al., 2012). Meeyo-ung a spol. (2008) poukázal na antiastma-tický účinok resveratrolu, ktorý je výsled-kom inhibície uvoľňovania cytokínov, po-tlačenia eozinofílie, hyperreaktivity dýcha-cích ciest a hypersekrécie hlienu. Tento polyfenolický stilbén môže byť zodpoved-ný za zdraviu prospešné účinky, ktoré sú pripisované konzumácii červeného vína. Aj napriek mnohým štúdiám, ktoré poukázali na pozitívny účinok polyfenolov v liečbe astmy, sú tieto prírodné zdroje nedosta-točne využité. V našom experimente sme skúmali, či aplikácia Provinolu bude viesť k inhibícii alergickej astmy. Provinol, bezal-koholový polyfenolický extrakt červeného vína obsahuje proantokyaníny, celkove antokyaníny, katechíny, hydroxycinamovú kyselinu, flavonoly, polymérické taníny. Je známy svojimi protizápalovými vlastnos-ťami, antioxidačnou aktivitou, bráni po-škodeniu endotelu, stimuluje konštitutívne formy NOS a inhibuje induktívne formy NOS (Joskova et al., 2009). Naše predchá-dzajúce štúdie poukázali, že suchý prášok polyfenolických zmesí červeného vína je schopný viesť k ex-vivo relaxácii tracheál-neho stripu u morčiat senzibilizovaných alergénom a ovplyvniť metabolizmus NO podieľajúcom sa na jeho bronchodilatač-nom účinku. Provinol inhibuje kontrakciu hladkej svaloviny trachey vyvolanú acetyl-cholínom a histamínom u morčiat, ktorým bola experimentálne vyvolaná hyperreak-tivita dýchacích ciest (Franova et al., 2007). Výsledky našej práce potvrdili jeho bronchodilatačný účinok. Liečba Provino-lom výrazne znížila hodnoty amplitúdy kontrakcie hladkej svaloviny trachey v podmienkach in vitro a hodnoty špecific-

kého odporu dýchacích ciest v podmienkach in vivo. Významným vý-sledkom je fakt, že Provinol je účinný v kombinácii s klinicky používanými antias-tmatikami teofylínom a budesonidom. Kombinácie uvedených liečiv s Provinolom dosahovali v polovičných dávkach bron-chodilatačný účinok zaznamenaný v monoterapii.

Jedným z charakteristických symp-tómov ochorení dýchacích ciest je kašeľ. Kašľový reflex je obranný mechanizmus dýchacích ciest vyvolaný mechanickým alebo chemickým stimulom (Widdicombe et al., 2006). Jedným z cieľov nášho expe-rimentu bolo hodnotiť zmeny nárazov chemicky indukovaného kašľa. Aj keď sup-resia kašľa po 21 dňovej liečbe Provino-lom nedosiahla účinok kodeínu, kombiná-cie polovičných dávok Provinolu s budesonidom a teofylínom mali výraz-nejší antitusický účinok.

Záverom je možné konštatovať, že Provinol dosiahol v našich experimentál-nych podmienkach výrazný bronchodila-tačný a antitusický účinok. Významným zistením je, že kombinácia Provinolu s budesonidom a teofylínom potencuje ich bronchodilatačné a antitusické pôsobenie. Práca vznikla za podpory „Centra experimen-tálnej a klinickej respirológie II“ Projektu pod-porovaného zo zdrojov EÚ a grantu VEGA 1/0020/11. Zoznam použitej literatúry 1. Bradding P, Walls AF, Holgate ST: The role of

the mast cell in the pathophysiology of as-thma. J Allergy Clin Immunol 117(6), s. 1277-1284, 2006

2. Broide D: New perspectives on mechanisms underlying chronic allergic inflammation and asthma in 2007. Journal of Allergy and Clinical Immunology 122 (3), s. 475-480, 2008

3. Franova S, Nosalova G, Pechanova O, Sutov-ska M.: Red wine polyphenolic compounds inhibit tracheal smooth muscle contraction during allergen-induced hyperreactivity of the airways. J Pharm Pharmacol 59, s. 727–32, 2007


24

4. Iwamura Ch, Shinoda K, Yoshimura M, Wata-nabe Y, Obata A, Nakayama T: Naringenin chalcone suppresses allergic asthma by inhibi-ting the type-2 function of CD4 T cell. Allergo-logy International,59 s. 67-73, 2010

5. Joskova M, Franova S, Nosalova G, Pechanova O, Prisenznakova L, Sutovska M: A beneficial influence of Provinol on the reduction of al-lergen induced hyperreactivity in guinea pigs. Bratisl Lek Listy 110 (8), s. 454-458, 2009

6. Mali RG, Dhake AS.: A review on herbal anti-asthmatics. Orient Pharm Exp Med 11 (2), s.77–90, 2011

7. Meeyoung L, Soyoung K, Ok-Kyoung K, Sei-Ryang O, Hyeong-Kyu L, Kyungseop A: Anti-inflammatory and anti-asthmatic effects of resveratrol, a polyphenolic stilbene, in a mou-se model of allergic asthma. International immunopharmacology 9, s. 418-424, 2009

8. Newall CA, Anderson LA, Phillipson JD.: Herbal medicines: a guide for healthcare professio-nals. London: Pharmaceutical Press; 1996

9. Rogerio AP, Dora CL, Andrade EL, Chaves JS, Silva LF, Lemos-Senna E, Calixto JB: Anti-inflammatory effect of quercetin-loaded mic-roemulsion in the airways allergic inflamma-tory model in mice. Pharmacol Res. 61(4), s. 288-97, 2010

10. Sanbongi C, Takano H, Osakabe N, Sasa N, Natsume M, Yanagisawa R, Inoue KI, Sadaka-ne K, Ichinose T, Yoshikawa T: Rosmarinic acid in perilla extract inhibits allergic inflammation induced by mite allergen, in a mouse model. Clin Exp Allergy. 34, s. 971-977, 2004

11. Widdicombe J, Fontana G: Cough: whats“s in a name?. Eur Respir J 28, s. 10-15, 2006

12. Wu SY, Silverberg JI, Joks R, Durkin HG, Smith-Norowitz TA: Green tea (Camelia sinensis) mediated suppression of IgE production by peripheral blood mononuclear cells of allergic asthmatic humans. Scand J Immunolo-gy.76(3), s. 306-310, 2012.


25

Vplyv dlhodobého podávania blokátora aktivity ORAI proteínu na experi-mentálne vyvolanú alergickú astmu u morčiat

Michaela Kocmálová1, Maroš Oravec1, Marián Adamkov2 , Martina Šutovská1,

Soňa Fraňová1

1 Ústav farmakológie, 2 Ústav histológie a embryologie, Jesseniova lekárska fakulta UK,

Martin email: [email protected]

Úvod Zvýšenie cytoplazmatickej koncen-

trácie Ca2+ je kľúčový aktivačný signál širo-kého spektra kineticky odlišných procesov v každej bunke. K nárastu vnútrobunkovej hladiny Ca2+ dochádza predovšetkým po uvoľnení intracelulárnych zdrojov alebo vtokom Ca2+ do bunky cez membránové iónové kanály (Parekh a Putney, 2005). V bunkách respiračného systému sa na uvedenej aktivite podieľajú dve podskupi-ny membránových iónových kanálov: SOC (store-operated ion channels) a ROC (re-ceptor-operated ion channels).

SOC sú aktivované iba v čase aktu-álnej potreby, t.j. pri znížení zásob Ca2+

v ER a ich hlavnou ale nie jedinou funkciou je doplnenie vnútrobunkových zásob Ca2+. K najlepšie preskúmaným subtypom SOC patria CRAC (calcium-release calcium acti-vated) kanály (Parekh a Putney, 2005). Tento typ iónových kanálov sa odlišuje od ostatných SOC extrémne vysokou selekti-vitou pre Ca2+ a nízkou vodivosťou (Prak-riya a Lewis, 2003). CRAC kanál sa skladá z dvoch proteínov: STIM (stromal interac-tion molecule) a Orai. STIM zaznamenáva pokles hladiny Ca2+ v ER. Orai podjednotka je lokalizovaná na plazmatickej membrá-ne a predstavuje vlastný kanálový pór (Zhang et al., 2005). Pri deplécii Ca2+ v ER sa STIM priblíži k plazmatickej membráne, spojí sa s Orai proteínom a vytvoria aktív-ny CRAC kanál (Hogan et al., 2010). Na-opak, zvýšenie hladiny Ca2+ v intracelulár-nom priestore vedie k disociácii podjedno-tiek a inaktivácii CRAC kanála.

CRAC kanály sú vo vysokom počte zastúpené na cytoplazmatickej membráne buniek imunitného systému, predovšet-kým mastocytov, T buniek a eozinofilov a sú zodpovedné za mediáciu širokého spek-tra aktivít, ktoré majú kľúčový význam najmä v priebehu alergického zápalu. De-granulácia mastocytov a uvoľnenie mediá-torov (histamínu, serotonínu, heparínu, neutrálnej proteázy a tiež aj de novo syn-tetizovaných leukotriénov, prostaglandí-nov, cytokínov, chemokínov) aj z ďalších imunokompetentných buniek je jeden z biologických procesov závislých na Ca2+ (Woolisher et al., 2011).

Vzhľadom na uvedené fakty pre-zentovaná práca hodnotí vplyv dlhodobej inhibície aktivity CRAC kanálov na hlavné klinické príznaky alergickej astmy v expe-rimentálnych podmienkach. Na simuláciu podmienok alergického zápalu bol použitý overený zvierací model alergického zápalu dýchacích ciest (DC).

Materiál a metódy

Všetky experimenty boli schválené Etickou komisiou JLF UK (číslo rozhodnutia EK 611/2010) a realizované na dospelých morčatách-samcoch kmeňa TRIK (10 je-dincov v každej skupine), ktorých telesná hmotnosť bola v rozmedzí 150-300g. Zvie-ratá pochádzali z akreditovaného chovu Velaz-Praha a pred pokusom boli adapto-vané na naše laboratórne podmienky.

Celkovo sme v tejto štúdii použili 50 morčiat, ktoré boli rozdelené do piatich skupín.



26

a) Negatívna kontrolná skupina – skupi-na senzibilizovaných zvierat, ktorá do-stávala fyziologický roztok v dávke 1ml/kg i.p.

b) Tri pozitívne kontrolné skupiny – sen-zibilizovaným skupinám zvierat bol podávaný salbutamol – bronchodila-tačná kontrola (10 mg/kg i.p.), kodeín – antitusická kontrola(10 mg/kg p.o.) alebo budesonid – protizápalová kon-trola (3mg/ml inhalácia 5 minút).

c) Experimentálna skupina – senzibilizo-vaným zvieratám bol 14 dní podávaný blokátor CRAC kanálov - kyselina 3-fluoropyridín-4-karboxylová (ďalej FPCA; v dávke 1,5 mg/kg i.p.)

Model experimentálne indukovaného zá-palu DC

Morčatá sme senzitizovali alergé-nom – ovalbumínom počas 21 dní. Oval-bumín bol adsorbovaný na hydroxid hlinitý a podávaný parenterálne v rovnakej dávke (5mg ovalbumínu a 100 mg Al(OH)3) na-sledovne: 1. deň i.p. a s.c., 4. deň iba i.p. a 9. deň len s.c. Počas 12., 15., 18. a 20. dňa sme alergén (c = 1 %) podali inhalačne použitím dvojkomorového bodypletyzmo-grafu pre malé laboratórne zvieratá (HSE typ 855, Hugo Sachs Elektronik, Nemecko). Všetky následné experimenty sme usku-točnili 24 hodín po poslednej inhalácii alergénu.

Meranie špecifického odporu dýchacích ciest

Špecifický odpor DC (sRaw) je v in vivo podmienkach veľmi citlivým indikáto-rom reaktivity buniek hladkej svaloviny dýchacích ciest (HSDC). Zvieratá boli počas pokusu umiestnené v dvojkomorovom bodypletyzmografe, ktorý sa skladá z nazálnej a torakálnej časti. Hodnotu sRaw sme vypočítali na základe časového posunu tlakových zmien medzi jednotli-vými komôrkami pletyzmografu. Odpor bol meraný 1 minútu po iritácii DC kyseli-

nou citrónovou (AC; c = 0,3 mol/l) a hista-mínom (10-6 mol/l). Hodnoty sRaw sme merali pred podaním FPCA a salbutamolu (N hodnota v grafoch) a potom po 60, 120 a 300 minútach od ich aplikácie.

Experimentálne indukovaný kašľový reflex

Kašľový reflex sme vyvolali inhalá-ciou aerosólu 0,3 mol/l AC počas 3 minú-tového časového intervalu, kedy dvaja nezávislí pozorovatelia zaznamenávali po-čet kašľov. Sledovali typický pohyb, zvuk kašľa a korešpondujúce zmeny na prieto-kovej krivke. Počet zakašlaní sme vyhod-nocovali pred podaním kodeínu a FPCA a následne po 60, 120 a 300 minútach od ich aplikácie. Medzi jednotlivými meraniami bol zachovaný odstup minimálne 2 hodiny v súlade s odporúčaniami Európskej respi-rologickej spoločnosti (Morice et al., 2007).

Meranie ENO

Hladiny vydychovaného NO sme orientačne merali chemiluminiscenčnou metódou, pri ktorej boli bdelé morčatá umiestnené do jednokomorového pletyz-mografu spojeného s NIOX Flex Offline Start Kit 04-1210-F (Aerocrine AB, Swe-den). Hodnoty ENO sme hodnotili u skupín liečených budesonidom a FPCA pred senzi-tizáciou, po jej ukončení a zároveň po ukončení dlhodobej terapie.

Expresia iNOS

Z homogenátu pľúcnych vzoriek sme izolovali RNA pomocou RNeasy® Mic-ro Kit (QIAGEN Group). Syntéza cDNA bola vykonaná použitím QuantiTect® Reverse Transcription Kit (QIAGEN Group). RT-PCR bola vykonaná pomocou QuantiTect® SYBR® Green PCR Kit (QIAGEN Group) pod-ľa inštrukcií výrobcu.

Imunohistochemické vyšetrenie Pri imunohistochemickom vyšetre-

ní tracheálnych a pľúcnych vzoriek sme


27

sledovali infiltráciu tkaniva mastocytmi. Stanovenie infiltrácie bolo založené na detekcii tryptázy mastocytov. Stupeň mas-tocytárnej infiltrácie sme posudzovali po-mocou 4-stupňovej semikvantitatívnej škály (negatívny výsledok = stupeň infiltrá-cie 0-1, t.j. žiadne alebo sporadicky sa vy-skytujúce elementy; pozitívny výsledok = stupeň infiltrácie 2-3, t.j. mierna alebo difúzna infiltrácia mastocytmi).

Štatistická analýza

Výsledky získané v tomto experi-mente sme hodnotili použitím Studentov-ho t-testu. Údaje v grafoch predstavujú priemerné hodnoty, vyznačené odchýlky predstavujú štandardnú chybu priemeru (± SEM). Pre hodnotenie výsledkov získa-ných z imunohistochemickej analýzy sme použili Fisherov presný test.

Výsledky a diskusia

Bronchiálna astma je komplexné zápalové ochorenie spojené s hyperreaktivitou HSDC, patologickým kašľom, remodeláciou DC, nadmernou produkciou hlienu a bunkovou infiltráciou, ktorá je zložená z lymfocytov, eozinofilov a neutrofilov (Bradding, 2008). Počas zápa-lu sú mastocyty rozšírené medzi bunkami HSDC. Toto zistenie viedlo Britlingha a spol. k poznatku, že mastocyty sú rozho-dujúcim faktorom v patogenéze astmy, ktorá vzniká na alergickom podklade (Brightling et al., 2002). Vedú tiež k chemotaxii, adhézii a aktivácii leukocy-tov, diferenciácii Th2 lymfocytov a stimulujú tvorbu IgE B-bunkami. Spúšťa-jú proces, ktorý vedie k typickej bunkovej štruktúre alergického zápalu.

Okrem alergického zápalu majú mastocyty, ako zásadný zdroj rôznych me-diátorov, významnú úlohu aj pri vzniku hyprereaktivity DC (Begueret et al., 2007). Mediátory mastocytov ako histamín, tryptáza, IL-4, IL13, PGD2 a LTC4 vyvolá-vajú kontraktilitu HSDC, napr. tryptáza

spôsobuje bronchiálnu hyperreaktivitu u psov a v izolovanej svalovine humánnej vzorky priedušiek zvyšuje produkciu a uvoľňovanie cytokínov z buniek HS (Ber-ger et al., 2002). Peel a spol. (2006, 2008) dokázali existenciu CRAC kanálov na ľud-ských bunkách HSDC. V našej predchád-zajúcej štúdii sme podmienkach in vivo ako aj in vitro potvrdili účasť CRAC kanálov na kontraktilite buniek HSDC u morčiat (Šutovská et al., 2013). Dlhodobá liečba senzitizovaných zvierat viedla k výraznému poklesu hodnôt sRaw bez ohľadu na typ použitého bronchokonstrikčného mediá-tora (AC, histamín). Blokátor CRAC kanálov ovplyvňoval bronchokonstrikciu vyvolanú AC podobne ako kontrolné liečivo salbu-tamol (obr. 1). Dlhodobá aplikácia bloká-tora CRAC kanálov viedla dokonca ku vý-raznejšiemu zníženiu kontrakčnej odpove-de HSDC na iritáciu histamínom ako štandardné bronchodilatačné liečivo.

Široké spektrum buniek zapoje-ných do alergickej zápalovej reakcie, pro-dukuje zároveň substancie (napr. pro-staglandíny a histamín) schopné zvýšiť citlivosť kašľových receptorov – rýchlo sa adaptujúcich receptorov (RAR) a C vlákien. Uvedená senzitizácia je podkladom zvýše-nia kašľovej odpovede na stimuláciu tusi-génmi pri zápale a má za následok aj vznik patologického kašľa ako jedného zo zá-kladných symptómov alergickej astmy. Na kašľovom reflexe sa podieľa aj zvýšená reaktivita DC, dokonca aj samotná bron-chokonstrikcia môže vyvolať kašeľ (Widdi-combe, 2003). Dlhodobá terapia blokáto-rom CRAC kanálov preukázala signifikant-ný, rýchlo nastupujúci antitusický účinok. Pri meraní počtu zakašlaní po 120 min-útach od podania látok sme dokonca zisti-li, že FPCA tlmí kašel výraznejšie a štatis-ticky významnejšie ako kontrolné liečivo kodeín, ktoré stále predstavuje najúčinnej-šie klinicky používané antitusikum (obr. 2).


28

Obr. 1 Zmeny špecifického odporu (sRaw) vyvolané iritáciu DC kyselinou citrónovou (AC) a histamínom zazna-menané u morčiat po dlhodobej terapii blokátorom CRAC kanálov (CRAC LT AC, CRAC LT Hi) a kontrolného liečiva salbutamolu (salbutamol AC, salbutamol Hi). *p<0.05; **p<0.01 skupina CRAC LT vs skupina salbutamol.

Obr. 2 Zmeny počtu kašľov indukovaných kyselinou citrónovou (AC) u morčiat po dlhodobej terapii blokátorom CRAC kanálov v porovnaní so skupinou liečenou kodeínom a senzibilizovanou skupinou bez liečby (NC OVA 21) testovaných za rovnakých podmienok. *p<0.05 skupina CRAC LT vs skupina kodeín

Mnoho typov buniek, ktoré sa pri-amo alebo nepriamo zapájajú do zápalu, produkujú NO. Patria k nim najmä epitelo-vé bunky, fibroblasty, chondrocyty, mono-cyty/makrofágy, antigén prezentujúce bunky, NK bunky, eozinofily a mastocyty. Synergickým pôsobením rôznych cytokí-nov (napr. TNF, IL-1β a IFN-γ) sa v uvedených bunkách indukuje expresia iNOS, pričom táto odpoveď je inhibovaná glukokortikoidmi. NO produkované iNOS

zvyšuje pomer medzi Th2 a Th1 bunkami a zosilňuje symptomatológiu alergickej ast-my. Počas zápalového procesu v DC iNOS vytvára pomerne vysoké a trvalé množstvo NO, ktoré je u astmatikov ľahko detekova-teľné vo vydychovanom vzduchu. V predchádzajúcich prácach sme dokázali, že u zvierat s experimentálne indukova-ným alergickým zápalom DC výrazne vzrástli hodnoty vydychovaného oxidu dusnatého (ENO) (Sutovska et al., 2013).

0

5

10

15

20

25

N 60 120 300

CRAC LT AC salbutamol AC CRAC LT Hi salbutamol Hi

**

*

Špec

ific

ký o

dp

or

DC

(sR

aw, m

l/s)

min

0

2

4

6

8

N 60 120 300

CRAC LT kodeín OVA 21 NC OVA 21

*

Po

čet

kašľ

ov

vyvo

lan

ých

AC

min


29

Dlhodobé podávanie FPCA a kontrolného liečiva – budesonidu viedlo ku signifikantnému poklesu tohto zápalo-vého parametra. Podľa meraní RT-PCR (obr. 3) je zrejmé, že tento pokles je vyso-

ko pravdepodobne výsledkom inhibície iNOS. Kontrolné liečivo budesonid však viedlo ku signifikantnejšiemu zníženiu ex-presiu iNOS ako FPCA.

Obr. 3 Expresia iNOS u senzibilizovaných zvierat (OVA+) v porovnaní so skupinami dlhodobo liečenými blokáto-rom CRAC kanálov (CRAC LT) a budesonidom (BUD LT). Hodnoty prahového cyklu (ΔCt) boli získané od-počítaním HPRT (hypoxanthine phosphoribosyltransferase) Ct hodnôt z Ct hodnôt príslušného cieľového génu (iNOS). #p vs CRAC LT; **/ *** p vs OVA21.

Pre potvrdenie vyšetrenia expresie

iNOS sme stanovovali aj stupeň mastocy-tárnej infiltrácie pľúcneho a tracheálneho tkaniva. U senzitizovaných zvierat výrazne vzrástol počet vzoriek pozitívnych na mas-tocytárnu tryptázu. Po dlhodobej terapii FPCA bol tento počet štatisticky významne nižší. V tracheálnych vzorkách bola masto-cytárna infiltrácia redukovaná signifikant-nejšie ako v pľúcnom tkanive. Už počas predchádzajúcich experimentov bol proti-zápalový efekt blokátora CRAC kanálov orientačne potvrdený signifikantným po-klesom hodnôt ENO a tento účinok bol po-rovnateľný s kontrolou budesonidom (Šu-tovská et al., 2013). Závery imunohisto-chemického vyšetrenia teda korešpondujú s výsledkami ENO a expresie iNOS

a poukazujú na silný protizápalový účinok sledovanej látky (tab. 1). Záver

Naše experimentálnej práce pot-vrdili, že blokátor CRAC kanálov znižuje reaktivitu hladkého svalu dýchacích ciest v podmienkach in vivo, experimentálne vy-volaný kašlový reflex, expresiu iNOS a infil-tráciu dýchacích ciest aktivovanými mas-tocytmi. Na základe uvedených zistení je možné konštatovať, že CRAC kanály pred-stavujú racionálny cieľ pre vývoj nových antiastmatík.

Táto práca vznikla za podpory grantu VEGA SR 1/0020/11 a 1-0062/11, Centrum experimen-tálnej a klinickej respirológie I „CEKR I“ a gran-tu UK/213/2012. Za vyšetrenie expresie iNOS ďakujeme Mgr. P. Mikolkovi.

0

1

2

3

4

5 OVA+ CRAC LT BUD LT

**

#

***

60 min

ΔCt


30

Tab. 1 Počet tracheálnych a pulmonárnych vzoriek s negatívnou (stupeň 0 a 1) a pozitívnou (stupeň 2 a 3) mas-tocytárnou infiltráciou u nesenzitizovanej kontrolnej skupiny, senzitizovanej kontrolnej skupiny a senzitizovaných zvierat po dlhodobej terapii blokátorom CRAC kanálov. Štatistická signifikantnosť bola vyhodnotená Fisherovým presným testom, pričom

1p predstavuje hodnotenie vs. CRAC LT. NCG – nega-

tívna kontrolná skupina, OVA21 – neliečená senzitizovaná skupina, CRAC LT – experimentálna skupina po dlhodobej terapii, TN – celkový počet vzoriek.

Pľúcne vzorky Tracheálne vzorky

negatívne pozitívne počet 1p negatívne pozitívne počet 1p

NCG 9 0 9 1.00

(one sided 0.5) 9 1 10

1.00 (one sided

0.5)

OVA21 2 4 6 0.089

(one-sided 0.047)

0 6 6 0.0001 (one-sided 0.0001)

CRAC LT 8 1 9 10 0 10

TN 19 5 24 19 7 26

Zoznam použitej literatúry 1. Begueret H, Berger P, Vernejoux JM, Dubuis-

son L, Marthan R, Tunon-de-Lara JM. Inflam-mation of bronchial smooth muscle in allergic asthma: Thorax 2007; 62: 8-15

2. Berger P, N`Guyen C, Buckley M, Scotto-Gomez E, Marthan R, Tunon-de-Lara JM. Pas-sive sensitization of human airways induces mast cell degranulation and release of tryptase: Allergy 2002; 57: 592-599

3. Bradding P. Eosinophil dinase, mast cell disea-se or both?: Allergy, asthma and clinical imu-nology 2008, 4: 84-90

4. Brightling CE, Bradding P, Symon FA, Holgate ST, Wardlaw AJ, Pavord ID. Mast-cell infil-tration of airway smooth muscle in asthma: N. Engl. J. Med. 2002; 346: 1699-1705

5. Hogan PG, Lewis RS, Rao A. Molecular basis of calcium signaling in lymphocytes: STIM and ORAI: Annu. Rev. Immunol. 2010, 28: 491-533

6. Hoth M, Penner R. Depletion of intracellular kalcium stores activates a kalcium current in mast cells: Nature 1992, 355: 353-356

7. Morice AH, Fontana GA, Belvisi MG, Birring SS, Chung KF, Dicpinigaitis PV, Kastelik JA, McGarvey LP, Smith JA, Tatar M, Widdicombe J. ERS guidelines on the assessment of cough: Eur. Respir. J. 2007, 29: 1256-1276

8. Parekh AB, Putney JW Jr. Store-operated cal-cium channels: Physiol. Rev. 2005, 85: 757-810

9. Peel SE, Liu B, Hall IP. A key role for STIM1 in store operand kalcium channel activation in airway smooth muscle: Respir. Res. 2006, 7: 119

10. Peel SE, Liu B, Hall IP. ORAI1 and store-operated kalcium infix in human airway smo-oth muscle cells: Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2008; 38: 744-749

11. Prakriya M., Lewis RS. CRAC channels: acti-vation, permeation, and the search for a mo-lecular identity: Cell Calcium 2003, 33: 311-321

12. Šutovská M. Adamkov M, Kocmálová M, Me-sárošová L, Oravec M, Fraňová S. CRAC Ion Channels and Airway Defence Reflexes in Ex-perimental Allergic Inflammation: Adv. Exp. Med. Biol. 2013, 756: 39-48

13. Šutovská M., Kocmálová M., Adamkov M., Výbohová D., Mikolka P., Mokrá D., Hatok J., Antošová M., Fraňová S.: The long-term ad-ministration of Orai 1 antagonist possesses antitussive, bronchodilatory and anti-inflammatory effects in experimental asthma model. General Physiology and Biophysics 2013

14. Widdicombe JG. Overview of neural pathways in Alleny and asthma: Pulm. Pharmacol. Ther. 2003; 16: 23-30

15. Woolhiser JP, Pei J, Cao J, Wang Z, Rogers E, Dyck B, Grey J. Compounds that modulate in-tracellular calcium: US patent No. WO/2011/139765

16. Zhang SL, Yu Y, Roos J, Kozak JA, Deerinck TJ, Ellisman MH, Stauderman KA, Calahan MD. STIM1 is a Ca

2+ sensor that activates CRAC

channels and migrates from the Ca2+

store to the plasma membrane: Nature 2005, 437: 902-905


31

Vplyv roflumilastu na reaktivitu dýchacích ciest a apoptózu v podmienkach experimentálne navodeného alergického zápalu

Ivana Medveďová1, Marek Pršo1, Alexandra Eichlerová1, Pavol Mikolka2, Daniela Mokrá2,

Juraj Mokrý1

1Ústav farmakológie, 2Ústav fyziológie, Jesseniova lekárska fakulta UK, Martin e-mail: [email protected]

Úvod Astma je ochorenie charakterizo-

vané chronickým zápalom dýchacích ciest a štrukturálnymi zmenami bronchiálneho tkaniva, označovaného ako remodelácia dýchacích ciest. Vývoj chronického zápalu dýchacích ciest pri astme závisí od schop-nosti zápalových buniek prestupovať z krvného riečiska do bronchiálnej mukózy a ich následnej aktivácii. Predpokladá sa, že mechanizmy podieľajúce sa na regulácii prežitia a apoptózy zápalových buniek zohrávajú kľúčovú úlohu v pretrvávajúcom zápalovom procese charakterizujúcom toto ochorenie. Táto zosilnená schopnosť prestupu a aktivácie zápalových buniek do cieľového tkaniva podporuje prežívanie buniek a ich vzájomné interakcie v dýchacích cestách zohrávajú významnú úlohu pri vývoji chronického zápalu dýcha-cích ciest pri astme. Reprezentujú hlavnú príčinu v poškodení tkaniva a jeho remo-delácie (Todo-Bom et al., 2007).

Bronchiálna astma ako zápalové ochorenie dýchacích ciest je riadené akti-váciou Th2 typu T lymfocytov. Tieto bunky produkujú rôzne zápalové cytokíny, akými sú IL-4, IL-13 a IL-5. Interleukín IL-4 a IL-13 stimulujú B bunky imunitného systému k produkcii IgE protilátok. IL-5 napomáhajú aktivácii eozinofilov nachádzajúcich sa v dýchacích cestách a IL-9 spolu s IL-13 prispievajú k bronchálnej hyperreaktivite (Vignola et al., 2000).

V súčasnosti sa prisudzuje čoraz väčší význam skutočnosti, že dysregulácia bunkovej apoptózy môže zohrávať ústred-nú úlohu v rozvoji zápalu dýchacích ciest spojenú s bronchiálnou astmou. Podľa niektorých štúdií inhibícia programovanej bunkovej smrti eozinofilov vedie k patologickému procesu v dôsledku naru-šenia rovnováhy fyziologických procesov s následkom vyvolania choroby týmito charakteristickými bunkami (Robinson et

al., 2005; obr. 1). Apoptóza ako fyziologický proces je

charakteristická zmenšením bunky, kon-denzáciou chromatínu, segmentáciou jad-ra, opúchaním membrány a tvorbou apop-totických teliesok, ktoré sú následne pohl-tené fagocytmi. Dôležitý je fakt, že apop-tóza nie je sprevádzaná uvoľňovaním zá-palových mediátorov, preto neprispieva k rozvoju zápalu dýchacích ciest (Häcker, 2000).

Jednou z charakteristík alergického zápalu je akumulácia aktivovaných eozino-filov v mieste zápalu. Dĺžka prežívania eo-zinofilov je menej ako 4 dni. Prostredníc-tvom zápalových cytokínov, ako IL-3, IL-5 a GM-CSF (obr. 2), sa zvyšuje ich životnosť a zvyšuje sa aj ich efektívnosť v zápalovom procese (Raouf, 2007). Inhibítory fosfo-diesterázy (PDE) 4, ako je roflumilast, inhi-bujú IL-5, čo následne znižuje schopnosť eozinofilov prežívať dlhší čas a znižuje sa riziko rozvoja zápalového procesu (Otha a Yamashita, 1999).



32

Obr. 1 Schéma popisuje spôsob eliminácie granulocytov: Granulocyty podstupujú apoptózu a následne sú rozpoznávané makrofágmi a

dochádza k fagocytóze. V dôsledku tohoto spôsobu odstránenia granulocytov dochádza k uvoľňovaniu protizápalových mediáto-rov, akými sú: transformačný rastový faktor β1 (TGF- β1) a interleukín (IL-10). Granulocyty taktiež môžu podstúpiť apoptózu, ale nemusia byť rozpoznávané makrofágmi ako odpoveď na ich zvýšený počet a dochádza k sekundárnej nekróze. Ak dochádza k nekróze primárne, tieto nekrotické bunky sú schopné poškodzovať okolité tkanivo, a pretože sa uvoľňujú prozápalové mediátory, zosilňuje sa zápal. Následne dochádza k fagocytóze nekrotických buniek a uvoľneniu prozápalových mediátorov, akými sú trombo-xán B2 (TxB2), IL-8 a tumor nekrotizujúci faktor α (TNF-α) (upravené podľa Ward et al., 1999)

Obr. 2 Faktory, ktoré ovplyvňujú počet zápalových buniek: tumor nekrotizujúci faktor α (TNF-α), stimulačný faktor granulo-

cyt/makrofágovej línie (GM-CSF), lipopolysacharidy (LPS), interleukín 5 (IL-5), transformačný rastový faktor β1 (TGF-β1), interleukín 1β ( IL-1β), interferon γ (INF-γ) (upravené podľa Ward et al., 1999)


33

PDE4 je jedným z izoenzýmov celej rodiny enzýmov – fosfodiesteráz, ktoré inaktivujú cAMP a cGMP. Roflumilast ako selektívny druhogeneračný inhibítor PDE4 bráni rozpadu cAMP a tým zvyšuje jeho hladiny v bunkách. Nakoľko sa v zápalových bunkách počas zápalových ochorení dýchacích ciest (ako napríklad chronická obštrukčná choroba pľúc; CHOCHP) exprimuje práve izoenzým PDE4, predpoklad, že jeho inhibícia bude mať priaznivé terapeutické účinky, sa potvrdil a v súčasnosti sa aj klinicky využíva (Spina, 2008). Napriek tomu, že sa testujú viaceré PDE4 inhibítory, roflumilast je prvým z tejto skupiny, ktorý bol zaregistrovaný pre liečbu ťažkej CHOCHP ako perorálne liečivo. Zistilo sa, že roflumilast zlepšuje pľúcne funkcie a znižuje frekvenciu exa-cerbácií pri CHOCHP. Čo je však dôležité, jeho mechanizmus účinku predpokladá jeho významné protizápalové pôsobenie a predstavuje dôležitú prídavnú liečbu popri bronchodilatačne pôsobiacich sym-patomimetikách a protizápalovo pôsobia-cich glukokortikoidoch (Rabe, 2011).

Okrem roflumilastu sa v súčasnosti testujú v klinických podmienkach najmä inhibítory PDE4 druhej generácie (cilomi-last, piklamilast), u ktorých sa predpokladá aj ich protizápalové pôsobenie pri men-šom výskyte vedľajších účinkov v porovna-ní s neselektívnymi inhibítormi PDE (Karish a Gagnon, 2006). Ich účinnosť po perorál-nom podaní je porovnateľná s teofylínom pri relatívne nižšom výskyte vedľajších účinkov (Rennard et al., 2008). K určitej opatrnosti nabádajú aj nedávne negatívne výsledky štúdie s novým inhalačným PDE4 inhibítorom UK-500,001 (Vestbo et al., 2009), naopak pozitívne sa javí v experi-mentálnej fáze oglemilast, prípadne Zl-n-91 (Wang et al., 2010). Podobne sa pova-žuje za veľmi sľubný cieľ aj duálna inhibícia PDE4 a PDE7 (Chung KF, 2006).

Z vyššie uvedeného vyplýva, že kým pri CHOCHP je klinické využívanie už

realitou, v podmienkach alergického zápa-lu, aký je prítomný pri bronchiálnej astme, tomu tak nie je. Aj preto sme sa rozhodli zistiť, akú bude mať účinnosť roflumilast v modeli alergénom navodenej hyperreak-tivity dýchacích ciest, a to jednak na in vivo a in vitro reaktivitu dýchacích ciest, zápa-lové markery a tiež na samotnú apoptózu. Práve vzťah medzi apoptózou zápalových buniek a inhibíciou PDE4 môže byť z tohto pohľadu veľmi zaujímavý a v literatúre nie je dostatočne opísaný. Hatzelmann so spo-luautormi (2010) popisuje vo svojej práci, že v podmienkach in vitro vedie inhibícia PDE4 okrem iného k potlačeniu apoptózy, avšak najmä neutrofilov. Výsledkom môže byť vyčistenie spúta. Je otázne, či takéto prejavy bude možné pozorovať aj v bunkách z bronchoalveolárnej laváže v podmienkach ovalbumínom navodeného alergického zápalu, kde je vyššie zastúpe-nie eozinofilov (Mokrý a Nosáľová, 2011; Mokrý et al., 2013). Materiál a metódy

Všetky postupy boli schválené Etickou komisiou Jesseniovej lekárskej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave. V experimentech boli použité zdravé dospelé samce morčiat kmeňa TRIK, ktorých hmotnosť sa pohybovala v rozmedzí od 250-400 g. Zvieratá boli umiestnené v centrálnom zverinci a bolo im podávané krmivo a voda ad libitum. Zvieratá pochádzali z akreditovaného cho-vu a podstúpili 7-dňovú karanténu a akli-matizáciu pred začatím experimentu. Zvie-ratá boli rozdelené do 3 skupín po 7 mor-čiat, pričom u dvoch skupín sme hyperre-aktivitu dýchacích ciest indukovali expozí-ciou k ovalbumínu. Jedna skupina slúžila ako nesenzibilizovaná kontrola a bolo jej podávané vehiculum. Jednej senzibilizova-nej skupine bol podávaný roflumilast (DND Pharm-Technology Co. Inc., Šanghai, Čína) po dobu 7 dní v dávke 0,5 mg/kg. Druhá


34

skupina bola bez liečby a slúžila ako senzi-bilizovaná kontrola.

Ovalbumínom indukovaná hyperreaktivita dýchacích ciest a liečba

Senzibilizácia morčiat ovalbumí-nom bola vykonávaná počas 21 dní. Aler-gén (ovalbumín, Sigma Aldrich, Nemecko) bol podaný v 1 % koncentrácii 1. deň sen-zibilizácie intraperitoneálne (0,5 ml) a sub-kutánne (0,5 ml), pričom ovalbumín bol rozpustený v aqua pro injectione. Na 3. deň senzibilizácie bol ovalbumín podaný iba intraperitoneálne (1 ml) a na 14. a 21. deň iba inhalačne (30 sekúnd), pričom bol rozpustený vo fyziologickom roztoku. Od 14. dňa bol morčatám podávaný roflumi-last perorálne 0,5 mg/kg (3 ml/kg) rozpus-tený v 0,5 % metylcelulóze po dobu 7 dní.

Meranie špecifického odporu dýchacích ciest

Špecifický odpor dýchacích ciest (RxV) bol meraný in vivo na bdelých zviera-tách použitím celotelového pletyzmografu pre malé zvieratá (morčatá), ktorý sa skla-dá z torakálnej a nazálnej komory. Špeci-fický odpor dýchacích ciest bol meraný po 2 minútovej nebulizácii fyziologického roz-toku a 2 minútovej nebulizácii broncho-konstrikčnej látky (histamín, Sigma-Aldrich, Nemecko, 10-6 mol.l-1), a to 1. deň senzibilizácie pred podaním ovalbumínu a v 14. a 21. deň senzibilizácie 5 hodín po aplikácii ovalbumínu.

Meranie kontraktility hladkej svaloviny in vitro

Zmeny amplitúdy kontrakcie pľúc-nych a tracheálnych stripov s hladkou sva-lovinou na bronchokonstrikčné mediátory histamín a acetylcholín (vzostupná kon-centrácia od 10-8 mol/l-1 – 10-3 mol.l-1) v podmienkach in vitro boli merané použi-tím metódy orgánových kúpeľov. Do jed-notlivých komôrok aparatúry, v ktorých sa nachádzali tkanivové stripy, bol privádza-

ný pneumoxid (95 % O2 a 5 % CO2), aby zabezpečil prísun O2 a aby sa udržalo stále pH Krebs-Henseleitovho roztoku. Teplota roztoku bola udržiavaná prostredníctvom vodného kúpeľa na hodnotách 37 ± 0,5 °C.

Meranie viability imunokompetentných buniek

Životnosť imunokompetentných buniek bola meraná v roztoku z broncho-alveolárnej laváže na automatickom počí-tači buniek LunaTM (Life Technologies, Ne-mecko) po zafarbení špecifickým farbivom. Všetky vzorky z bronchoalveolárnej laváže boli spracované do 1 hodiny po ich odob-ratí.

Štatistické spracovanie výsledkov

Výsledky sú uvádzané v grafoch ako priemerné hodnoty a SEM. Štatistické rozdiely medzi skupinami boli vypočítané použitím Studentovho t-testu, pričom za štatisticky významné boli považované roz-diely s p < 0,05.

Výsledky a diskusia

Inhibítory fosfodiesteráz predsta-vujú v súčasnosti veľký potenciál v liečbe astmy a CHOCHP ako alternatíva alebo náhrada terapie glukokortikoidmi. Kumar a spol. (2003) vo svojej práci porovnávali účinok roflumilastu (selektívny PDE4 inhi-bítor) s pentoxifylínom (neselektívnym inhibítorom) a dexametazonom na zmier-nenie príznakov chronickej astmy na my-šacom modeli. Myši boli vystavené expo-zícii ovalbumínu (alergénu) po dobu 6 týž-dňov. Počas 5. a 6. týždňa im bol podávaný roflumilast a dexametazón pomocou žalú-dočnej sondy a intraperitoneálne im bol podávaný pentoxifylín. Hyperreaktivita dýchacích ciest bola zaznamenávaná po-mocou celotelového pletysmografu. Ma-ximálna reaktivita charakterizovaná špeci-fickým odporom dýchacích ciest bola po-zorovaná u zvierat, ktoré boli vystavené alergénu a bolo im podávané iba vehicu-


35

lum. U skupín liečených roflumilastom a dexametazónom bolo pozorované ne-signifikantné zníženie špecifického odporu dýchacích ciest. Skupina liečená pentoxi-fylínom (neselektívny PDE inhibítor) preu-kázala štatisticky významné zníženie reak-tivity dýchacích ciest. Naše výsledky pou-kazujú na to, že senzibilizácia ovalbumí-nom viedla ku signifikantnému zvýšeniu reaktivity dýchacích ciest v in vivo aj in vitro podmienkach, čo korešponduje s Kumarovou štúdiou. Roflumilast znížil špecifický odpor dýchacích ciest po nebuli-zácii histamínom (obr. 3) a taktiež in vitro reaktivitu dýchacích ciest (obr. 4 a 5) na kumulatívne dávky acetylcholínu u pľúc-nych a tracheálnych tkanivových stripov. Aj keď Kumar a spol. poukázali skôr na to, že medikácia neselektívnymi inhibítormi fosfodiesteráz, ako je napríklad pentoxify-lín, má lepšie predpoklady pozitívne ovplyvniť reaktivitu dýchacích ciest a se-lektívne inhibítory, ako napríklad roflumi-

last, ovplyvňujú reaktivitu DC len nepatr-ne, naše výsledky potvrdili účinnosť v podmienkach alergénom navodenej hy-perreaktivity aj u selektívnych inhibítorov PDE4. V ďalšej štúdii popisuje Louw a spol. (2007) dôležitosť redukcie hyperre-aktivity dýchacích ciest ako jedného z najdôležitejších aspektov v liečbe astmy a CHOCHP. V humánnej štúdii vplyvu rof-lumilastu na reaktivitu dýchacích ciest zis-tili, že u dobrovoľníkov so stredne perzis-tujúcou astmou, ktorým bol podaný rof-lumilast jednorázovo v dávke 1000 μg perorálne, nebol preukázaný akútny bron-chodilatačný účinok inhalácie histamínu. Naopak roflumilast výrazne znížil hyperre-aktivitu dýchacích ciest vyvolanú alergé-nom po jednorázovom podaní v porovnaní s placebo skupinou, čo je v súlade s našimi výsledkami, kde roflumilast mal významný vplyv na reaktivitu dýchacích ciest nielen v experimentálnych podmienkach.

Obr. 3 Špecifický odpor dýchacích ciest po inhalácii aerosólu histamínu (10-6 mol/l-1) u senzibilizovaných a senzibilizovaných morčiat lieče-

ných roflumilastom (roflumilast podávaný od 14. dňa senzibilizácie). * p<0,05 vs pred; + p<0,05 vs ovalbumín

0

1

2

3

4

5

6

7

pred 14. d 21. d

Špe

cifi

cký

od

po

r d

ých

acíc

h c

iest

(R

xV; m

l/s)

Špecifický odpor DC po inhalácii histamínu 10-6 mol/l

ovalbumín

ovalbumín + roflumilast


36

Obr. 4 Zmeny reaktivity hladkého svalu trachey na acetylcholín po 7 dňoch aplikácie roflumilastu v podmienkach in vitro. * p<0,05 vs

kontrola, + p<0,05 vs ovalbumín

Obr. 5 Zmeny reaktivity hladkého svalu pľúc na acetylcholín po 7 dňoch aplikácie roflumilastu v pomienkach in vitro. * p<0,05, + p<0,05 vs

ovalbumín

Hyperreaktivita dýchacích ciest pri astme a CHOCHP je sprevádzaná chronic-kým zápalom dýchacích ciest. Jedným z charakteristických znakov tohto alergic-kého zápalu je akumulácia aktivovaných eozinofilov v mieste zápalu. Táto akumulá-cia môže byť spôsobená dysreguláciou rastu alebo diferenciácie eozinofilov v kostnej dreni a ich migráciou na miesto zápalu. V mieste zápalu sa nachádzajú taktiež aktivované T-lymfocyty, ktoré pro-

dukujú zápalové cytokíny. Najdôležitejšími z nich sú IL-5, IL-3 a GM-CSF. V dôsledku prítomnosti týchto cytokínov eozinofily nielenže prežívajú dlhšie, ale produkujú aj kyslíkové radikály, ktoré znásobujú poško-denie tkaniva v mieste zápalu (Raouf, 2007). Otha a spol. (2006) vo svojej práci publikoval, že inhibícia IL-5 viedla k významnému poklesu dĺžky prežívania eozinofilov a taktiež k indukcii apoptózy. Na druhej strane, inhibične na apoptózu

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

-8 -7 -6 -5 -4 -3

kon

trak

cia

(g)

acetylcholín (logM)

Trachea - acetylcholín

ovalbumín

kontrola


-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

-8 -7 -6 -5 -4 -3

kon

trak

cia

(g)

acetylcholín (logM)

Pľúca - acetylcholín

ovalbumín

kontrola



37

môže pôsobiť vysoká hladina intracelulár-neho cAMP (Ward et al., 1999). Roflumi-last má potenciál tieto hladiny zvyšovať v zápalových bunkách, a tým znižovať schopnosť makrofágov rozpoznávať apop-totické eozinofily, ktoré následne podstú-pia sekundárnu nekrózu. Výsledky našej štúdie poukazujú na to, že aj keď roflumi-last zvyšuje hladiny intracelulárneho

cAMP, výrazne ovplyvňuje apoptózu zápa-lových buniek (obr. 6). Z toho vyplýva, že inhibícia IL-5 ako faktora ovplyvňujúceho dĺžku prežívania eozinofilov má omnoho väčší vplyv na ich apoptózu ako inhibičný faktor v podobe vysokých hladín vntútro-bunkového cAMP, ktorý znižuje schopnosť makrofágov rozpoznať apoptotické eozi-nofily.

Obr. 6 Viabilita imunokompetentných buniek vyšetrených z roztoku bronchoalveolárnej laváže

Záver Na podklade našich vyššie uvede-

ných zistení môžeme povedať, že roflumi-last ako selektívny inhibítor PDE4 pozitívne ovplyvňuje reaktivitu dýchacích ciest v in vivo aj in vitro podmienkach a výrazne znižuje počty zápalových buniek v dýchacích cestách u alergizovaných zvie-rat. Ovplyvnenie apoptózy ako formy fy-ziologickej bunkovej smrti, ktorá na rozdiel od nekrózy nepoškodzuje okolité tkanivo a nepodporuje zápalový proces, predstavuje veľký potenciál v liečbe astmy a CHOCHP. Veľkým prínosom môže byť štúdium a po-rovnanie vplyvu ďalších inhibítorov fosfo-diesteráz, ako je napríklad tadalafil, na indukciu apoptózy, dôsledkom čoho by mohlolo dôjsť k eliminácii zápalových bu-niek v dýchacích cestách u zvierat s experimentálne navodeným alergickým zápalom.

Práca vznikla s podporou projektu „Dobudo-vanie Centra experimentálnej a klinickej respi-rológie – CEKRII“, spolufinancovaných z pro-striedkov EÚ a grantov VEGA 1/0030/11 a UK/159/2013. Zoznam použitej literatúry 1. Hatzelmann A, Morcillo EJ, Lungarella G,

Adnot S, Sanjar S, Beume R, Schudt C, Te-nor H. The preclinical pharmacology of roflumilast – a selective, oral phospho-diesterase 4 inhibitor in development for chronic obstructive pulmonary disease. Pulm Pharmacol Ther 2010; 23:235–256.

2. Häcker G. The morphology of apoptosis. Cell Tissue Res 2000; 301:5-17

3. Chung KF. Phosphodiesterase inhibitors in airways disease. Eur J Pharmacol 2006; 533:110-7

4. Karish SB, Gagnon JM. The potential role of roflumilast: the new phosphodiestera-

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

viab

ilita

(%

)

ovalbumín

ovalbumín+roflumilast

*

* p < 0,05


38

se-4 in-hibitor. Ann Pharmacother 2006; 40:1096-104.

5. Kumar RK, Herbert CH, Thomas PS, Wollin C, Beume R, Yang MM, Webb DC, Foster PS. The Journal of Pharmacology and Ex-perimental Therapeutics 2003; 307:349-355

6. Louw C, Williams Z, Venter L, Leichtl S, Schmidt-Wirlitsch C, Bredenbroker D, Bardin PG. Roflumilast, a phosphodieste-rase 4 inhibitor reduces airway hyperres-ponsiveness after allergen challenge. Respiration 2007; 74:411-417

7. Mokry J, Joskova M, Mokra D, Christen-sen I, Nosalova G. Effects of Selective In-hibition of PDE4 and PDE7 on Airway Re-activity and Cough in Healthy and Oval-bumin-Sensitized Guinea Pigs. Advances in Experimental Medicine and Biology 2013; 756:57-64.

8. Mokry J, Nosalova G. The influence of the PDE inhibitors on cough reflex in guinea pigs. Bratisl Lek Listy 2011; 112(3):131–135.

9. Otha K, Yamashita N. Apoptosis of eosi-nophils and lymfocytes in allergic inflam-mation. Journal of Allergy and Clinical Immunology 1999; 104:14-21

10. Otha K, Sawamoto S, Nakajima M, Kubota S, Tanaka Y, Miyasaka T. The prolonged survival of human eosinophils with inter-leukin-5 and ist inhibition by theophilline via apoptosis. Clin Exp Allergy 2006; 26:10-5

11. Rabe KF. Update on roflumilast, a phos-phodiesterase 4 inhibitor for the treat-ment of chronic obstructive pulmonary disease. British Journal of Pharmacology 2011; 163(1):53-67.

12. Raouf AA. Apoptosis and Asthma. Egyp-tian Journal of Bronchology; Vol.1, No1

13. Rennard S, Knobil K, Rabe KF, Morris A, Schachter N, Locantore N, Canoni-Ca WG, Zhu Y, Barnhart F. The efficacy and safety of cilomilast in COPD. Drugs 2008; 68:3-57.

14. Robinson DR. The Role of Regulatory T lymfocytes in Asthma Pathogenesis. Cur-rent Allergy and Asthma Reports 2005; 5:136-141

15. Spina D. PDE4 inhibitors: current sttus. Br J Pharmacol 2008; 155:308-15.

16. Todo-Bom AM, Pinto AM, Alves V, Pereira SV, Rosa MS. Apoptosis and Asthma in the Erderly. J Investig Allergol Clin Immu-nol 2007; Vol.17(2):107-112

17. Vestbo J, Tan L, Atkinson G, Ward J on behalf of the UK-500,001 Global Study Team. A controlled trial of 6-weeks` tre-atment with a novel inhaled phospho-diesterase type-4 in-hibitor in COPD. Eur Respir J 2009; 33:1039-44.

18. Vignola AM, Chiaparra G, Gagliardo R, Gjomarkaj M, Merendino A, Sien L, Bous-quet J, Bonsignore B. Apoptosis and air-way inflammation in asthma. Apoptosis 2000; 5(5):473-85.

19. Wang YJ, Jiang YL, Tang HF, Zhao CZ, Chen JQ. Zl-n-91, a selective phosphodieste-rase 4 inhibitor, supresses inflammatory res-ponse in a COPD-like rat model. Int Immunopharmacol 2010; 10:252-8.

20. Ward C, Dransfield I, Chilvers ER, Has-lett C, Rossi AG. Pharmacological mani-pulation of granulocyte apoptosis: poten-tial therapeutic targets. Trends Pharma-col Sci 1999; 20(12): 503-9.


39

Nové možnosti v liečbe akútneho poškodenia pľúc

Daniela Mokrá1, Hana Píštěková1, Lucia Tomčíková-Mikušiaková1, Pavol Mikolka1, Juraj Mokrý2, Martina Antošová1, Andrea Čalkovská1

1 Ústav fyziológie, 2 Ústav farmakológie, Jesseniova lekárska fakulta UK, Martin


Definícia ALI/ARDS Syndróm akútnej respiračnej tiesne

(acute respiratory distress syndrome, ARDS) a jeho miernejšia forma akútne po-škodenie pľúc (acute lung injury, ALI) predstavujú život ohrozujúci stav, ktorý vzniká ako následok rôznych ochorení (pneumónie, sepsy, polytraumy, popále-nín, akútnej pankreatitídy, šoku atď.). ALI/ARDS je charakterizované difúznym poškodením alveol v dôsledku zápalu, pľúcneho edému a poruchy ventilačno-perfúznych vzťahov, čo sa prejaví na zhor-šení poddajnosti pľúc a hypoxémii (Dus-hianthan et al. 2011, Donahoe 2011, Pier-rakos et al. 2012). American-European Consensus Conference v roku 1994 určila základné diagnostické kritériá ARDS: - prítomnosť akútnej hypoxémie, defi-

novanej pomerom medzi parciálnym tlakom kyslíka v arteriálnej krvi (PaO2) a frakcie inspirovaného kyslíka (FiO2); v prípade ARDS je hodnota PaO2/FiO2 <200 mmHg (26,7 kPa), pri ALI je hod-nota PaO2/FiO2 medzi 200 mmHg (26,7 kPa) a 300 mmHg (40 kPa)

- prítomnosť bilaterálnych infiltrátov na RTG snímke hrudníka

- neprítomnosť zvýšenia zaklineného tlaku v a. pulmonalis (pulmonary arte-ry wedge pressure) (Pierrakos et al. 2011, Donahoe 2011, Bernard et al. 1994).

Nová, tzv. Berlínska definícia, z roku 2012 upravila kategórie ARDS na základe stupňa hypoxémie, a to na miernu (s PaO2/FiO2 200-300 mmHg), strednú (s PaO2/FiO2 100-200 mmHg) a závažnú (s

PaO2/FiO2 menej ako 100 mmHg) formu ARDS (ARDS Definition Task Force 2012).

Patofyziológia ALI/ARDS

V akútnej fáze ochorenia dochádza k poškodeniu na úrovni alveolárnych epi-telových, ale aj endotelových buniek, čo vedie k prenikaniu tekutiny bohatej na plazmatické bielkoviny do alveol. Poško-denie alveolárnych buniek I. typu vedie nielen ku vzniku pľúcneho edému, ale strata bariérovej funkcie predisponuje aj ku zvýšenému riziku bakteriémie a sepsy. Poškodenie pneumocytov II. typu má za následok narušenie syntézy a metabolizmu pľúcneho surfaktantu, čo spôsobí zvýšenie povrchového napätia v alveolách a ich následný kolaps. Histopa-tologicky je možné pozorovať difúzne alvo-lárne poškodenie s masívnou infiltráciou neutrofilov, alveolárnu hemorágiu a tvor-bu hyalínnych membrán. V dôsledku pre-biehajúceho neutrofilného zápalu dochá-dza ku zvýšenej tvorbe prozápalových lá-tok, ako sú cytokíny (najmä IL-1β, -6, -8, TNFα), proteázy, reaktívne formy kyslíka, či matrix-metaloproteinázy, čo ďalej zhor-šuje poškodenie pľúcneho tkaniva. Akútnu fázu postupne strieda fibroproliferatívna fáza s rôznym stupňom fibrózy, neovasku-larizácie a vyhojenia (Dushianthan et al. 2011, Donahoe 2011, Pierrakos et al. 2012).

Liečba ALI/ARDS

Základom liečby ALI/ARDS je umelá pľúcna ventilácia a protizápalová liečba (Dushianthan et al. 2011, Donahoe 2011, Pierrakos et al. 2012). Pri ALI/ARDS sa



40

vzhľadom na poškodenie pľúcneho paren-chýmu a endogénneho surfaktantu odpo-rúčajú „šetriace“ konvenčné ventilačné režimy (intermittent positive pressure ventilation, IPPV), ktoré používajú malé dychové objemy (cca 6 ml/kg hmotnosti) a primerané hodnoty end-exspiračného tlaku (PEEP). V prípade nedostatočnej účinnosti IPPV sa odporúča použitie vyso-kofrekvenčnej oscilačnej ventilácie (VFOV). Doteraz však neexistuje jednoznačný kon-senzus ohľadom dychových objemov, frekvencie ventilácie, či ventilačných tla-kov pri rôznych typoch umelej pľúcnej ventilácie (Artigas et al. 1998, Girard a Bernard 2007, Briel et al. 2010, Pierrakos et al. 2012) v liečbe ALI/ARDS.

V rámci farmakologickej liečby zá-palu boli pri ALI/ARDS doteraz použité rôzne látky z viacerých farmakologických skupín. Použitie glukokortikoidov je zalo-žené na ich schopnosti redukovať zápal a ovplyvniť fibrotizačné procesy v pľúcach. Napriek tomu, že podanie glukokortikoi-dov pri ALI/ARDS je pomerne bežné, aj v tomto prípade chýbajú jednoznačné od-porúčania pre ich použitie, dávkovanie, dĺžku trvania liečby a pod. (Peter et al. 2008, Tang et al. 2009, Lamontagne et al. 2010). Navyše, podaniu glukokortikoidov v liečbe ARDS často bránia ich výrazné nežiaduce účinky, a to najmä u detí a starších pacientov s chronickými ocho-reniami (De Bosscher et al. 2012). Z týchto dôvodov sa aktivity viacerých výskumných tímov sústredili na hľadanie nových mož-ností ovplyvnenia glukokortikoidových receptorov (GR) tzv. selektívnymi agonis-tami, ktoré by disociovali mechanizmy GR-sprostredkovanej transaktivácie, ktorá je o.i. zodpovedná aj za časť nežiaducich účinkov, od transrepresie prozápalových génov, ktorej hlavným účinkom je protizá-palový efekt (Löwenberg et al. 2008, De Bosscher et al. 2012, Vandevyver et al. 2013). Tieto tzv. SEGRAs boli nedávno po-dané v liečbe viacerých stavov s výraznou

zápalovou zložkou (Schäcke et al. 2009, Rauch et al. 2011, Reber et al. 2012), dote-raz však neboli použité v liečbe ARDS.

Súčasťou liečby pľúcnej hyperten-zie u kriticky chorých pacientov s ARDS sa postupne stáva aj inhalácia NO ako účin-ného pľúcneho vazodilatátora (Siobal a Hess 2010, Fioretto et al. 2012). Keďže pridanie NO ku glukokortikoidom znásobu-je ich protizápalový efekt (Paul-Clark et al. 2000, Perretti et al. 2003, Di Filippo et al. 2004), ich spoločné podanie napr. vo for-me nitro-steroidov by mohlo byť výhodné aj v liečbe ARDS. Zatiaľ však chýbajú in-formácie o podaní nitro-steroidov pri ARDS alebo podobnom ochorení.

V liečbe ALI/ARDS boli úspešne po-užité aj niektoré inhibítory fosfodiesteráz (PDE) (The ARDS Clinical Trials Network; National Heart, Lung, and Blood Institute; National Institutes of Health 2002, Salari et al. 2005, Blanch a Albaiceta 2010). V budúcnosti by bolo zaujímavé porovnať účinky neselektívnych PDE inhibítorov (napr. aminofylínu) so selektívnymi inhibí-tormi PDE-3, 4 a 5, u ktorých sa predpo-kladá, že by v porovnaní s neselektívnym PDE inhibítorom mohli mať porovnateľný protizápalový, antioxidačný, antiedema-tózny a vazodilatačný efekt na pľúca pri nižšom výskyte nežiaducich účinkov, keďže pôsobia len na jeden typ PDE.

Okrem glukokortikoidov a PDE in-hibítorov boli v liečbe ALI/ARDS použité aj iné látky: ketokonazol (The ARDS Network 2000), inhibítor elastázy neutrofilov sive-lestat (Iwata et al. 2010, Fujino et al. 2012), antioxidanty (Moradi et al. 2009), prostacyklín (Afshari et al. 2010, Siobal a Hess 2010), či exogénny surfaktant (Will-son a Notter 2011, Raghavendran et al. 2011).

Experimentálne modely ALI/ARDS

Nové možnosti liečby akútneho po-škodenia pľúc je možné testovať v laboratórnych podmienkach, a to na via-


41

cerých modeloch ALI/ARDS. Najčastejšie používaným modelom ALI/ARDS je model ochorenia vyvolaný opakovanými lavážami pľúc pomerne veľkými objemami fyziolo-gického roztoku (25-30 ml/kg hmot.) (Me-yer et al. 2006, Fioretto et al. 2012, Ronchi et al. 2012), ktoré odstránia podstatnú časť pľúcneho surfaktantu a v priebehu niekoľkých desiatok minút navodia stav podobný klinickému ALI/ARDS.

V našich nedávnych experimentoch sme na vyvolanie ALI/ARDS použili dospelé králiky, u ktorých sme opakovane (6-10 krát) vykonali bronchoalveolárnu laváž fyziologickým roztokom (30 ml/kg), kým sme nedosiahli požadované zníženie PaO2 na menej ako 10-12 kPa pri ventilácii 100 % kyslíkom (FiO2 1,0). Po 5 hodinách od vyvolania ALI/ARDS sme okrem výrazného zhoršenia oxygenácie (P<0,001) pozorovali aj zvýšenie celkového počtu buniek v BAL tekutine (P<0,05), a to najmä neutrofilov a eozinofilov (obe P<0,001) v porovnaní so zdravými kontrolami. Zároveň došlo ku zvýšeniu plazmatických koncentrácií pro-zápalových cytokínov – TNFα (P<0,001), IL-8 a IL-1β (obe P<0,05) a zvýšenej akumulá-cii tekutiny v pľúcnom tkanive (tzv. wet/dry ratio, P<0,001) v porovnaní s kontrolami (Mokrá et al., zatiaľ nepubli-kované výsledky).

Závery

ALI/ARDS je syndróm charakterizo-vaný difúznym poškodením pľúcnych al-veol v dôsledku zápalu, pľúcneho edému a poruchy ventilačno-perfúznych vzťahov, čo vedie k zhoršeniu poddajnosti pľúc a hypoxémii. Dynamika postupne sa rozví-jajúceho zápalu má pritom výrazný vplyv nielen na pľúcne parametre pacienta, ale aj na jeho ďalšiu prognózu. Vo všeobec-nosti platí, že čím skôr sa podá vhodná liečba, tým lepší efekt je možné pozorovať nielen na respiračných parametroch, ale aj na parametroch vyjadrujúcich poškodenie pľúcneho parenchýmu.

Vzhľadom na multifaktoriálnu patogenézu ALI/ARDS aj jeho liečba musí byť viaczložková, cielene zameraná predovšetkým na riešenie dysfunkcie pľúcneho surfaktantu, zápal, oxidačné poškodenie pľúc a pľúcny edém. Základom „ideálnej“ kauzálnej liečby by mala byť šetrná umelá pľúcna ventilácia (ventilácia dychovými objemami 6-8 ml/kg, prípadne vysokofrekvenčná ventilácia) vhodne doplnená o liečivá s protizápalovým, antioxidačným a antiedematóznym účinkom. Z protizápalových látok majú veľký potenciál pre priaznivé ovplyvnenie priebehu ALI/ARDS najmä glukokortikoidy a inhibitory fosfodiesteráz (PDE), ich bene-fit je však výrazne limitovaný ich nežiaducimi účinkami. Vzhľadom na výsledky štúdií z nedávnych rokov sa dá predpokladať, že niektoré zo selektívnych agonistov glukokortikoidových receptorov či selektívnych PDE inhibítorov by mohli predstavovať vhodnú alternatívu liečby klasickými glukokortikoidmi resp. neselektívnymi PDE inhibítormi, ale s cielenejším efektom a menším výskytom nežiaducich účinkov. Sľubným môže byť aj podanie nitro-steroidov, u ktorých sa zistil výrazný protizápalový a vazodilatačný účinok.

Exaktne mierené protizápalové a ventilačné intervencie zvýšia efektivitu liečby ALI/ARDS. Sledovanie účinnosti lieč-by na viacerých úrovniach v laboratórnych i klinických podmienkach umožňuje ciele-ne zamerať terapiu tak, aby sa eliminovali jej možné nežiaduce účinky v rámci celko-vého monitoringu terapie a aby v konečnom dôsledku viedla k záchrane života pacientov s ALI/ARDS.

Práca vznikla s podporou projektu APVV-0435-11 a projektu spolufinancovaného zo zdrojov EÚ „Dobudovanie centra experimentálnej a klinickej respirológie, CEKR II“.


42

Zoznam použitej literatúry 1. Afshari A, Brok J, Møller AM, Wetterslev J.

Aerosolized prostacyclin for acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS). Cochrane Database Syst Rev 2010; CD007733.

2. ARDS Definition Task Force, Ranieri VM, Ru-benfeld GD, Thompson BT, Ferguson ND, Cal-dwell E, Fan E, Camporota L, Slutsky AS. Acute respiratory distress syndrome: the Berlin De-finition. JAMA 2012; 307: 2526-33.

3. Artigas A, Bernard GR, Carlet J, Dreyfuss D, Gattinoni L, Hudson L, Lamy M, Marini JJ, Matthay MA, Pinsky MR, Spragg R, Suter PM. The American-European Consensus Confe-rence on ARDS, part 2: Ventilatory, pharma-cologic, supportive therapy, study design stra-tegies, and issues related to recovery and re-modeling. Acute respiratory distress syndro-me. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157: 1332-47.

4. Bernard GR, Artigas A, Brigham KL, Carlet J, Falke K, Hudson L, Lamy M, LeGall JR, Morris A, Spragg R. Report of the American-European Consensus conference on acute respiratory distress syndrome: definitions, mechanisms, relevant outcomes, and clinical trial coordination. Consensus Committee. J Crit Care 1994; 9: 72-81.

5. Blanch L, Albaiceta GM. Sildenafil for pulmo-nary hypertension in ARDS: a new pleasant ef-fect? Intensive Care Med 2010; 36:729-31.

6. Briel M, Meade M, Mercat A, Brower RG, Talmor D, Walter SD, Slutsky AS, Pullenaye-gum E, Zhou Q, Cook D, Brochard L, Richard JC, Lamontagne F, Bhatnagar N, Stewart TE, Guyatt G. Higher vs lower positive end-expiratory pressure in patients with acute lung injury and acute respiratory distress syn-drome: systematic review and meta-analysis. JAMA 2010; 303: 865-73.

7. De Bosscher K, Haegeman G, Elewaut D. Tar-geting inflammation using selective glucocor-ticoid receptor modulators. Curr Opin Phar-macol 2010; 10: 497-504.

8. Di Filippo C, Rossi F, Ongini E, Del Soldato P, Perretti M, D'Amico M. The distinct altera-tions produced in cardiovascular functions by prednisolone and nitro-prednisolone (NCX-1015) in the rat highlight a causal role for endothelin-1. J Pharmacol Exp Ther 2004; 310: 1133-41.

9. Donahoe M. Acute respiratory distress syn-drome: A clinical review. Pulm Circ 2011; 1: 192-211.

10. Dushianthan A, Grocott MP, Postle AD, Cu-sack R. Acute respiratory distress syndrome

and acute lung injury. Postgrad Med J 2011; 87: 612-22.

11. Fioretto JR, Campos FJ, Ronchi CF, Ferreira AL, Kurokawa CS, Carpi MF, Moraes MA, Bonatto RC, Defaveri J, Yeum KJ. Effects of inhaled ni-tric oxide on oxidative stress and histopathological and inflammatory lung inju-ry in a saline-lavaged rabbit model of acute lung injury. Respir Care 2012; 57: 273-81.

12. Fujino N, Kubo H, Suzuki T, He M, Suzuki T, Yamada M, Takahashi T, Ota C, Yamaya M. Administration of a specific inhibitor of neut-rophil elastase attenuates pulmonary fibrosis after acute lung injury in mice. Exp Lung Res 2012; 38: 28-36.

13. Girard TD, Bernard GR. Mechanical ventilation in ARDS: a state-of-the-art review. Chest 2007; 131: 921-9.

14. Iwata K, Doi A, Ohji G, Oka H, Oba Y, Takimoto K, Igarashi W, Gremillion DH, Shimada T. Ef-fect of neutrophil elastase inhibitor (sivelestat sodium) in the treatment of acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS): a systematic review and meta-analysis. Intern Med 2010; 49: 2423-32.

15. Lamontagne F, Briel M, Guyatt GH, Cook DJ, Bhatnagar N, Meade M. Corticosteroid thera-py for acute lung injury, acute respiratory dis-tress syndrome, and severe pneumonia: a meta-analysis of randomized controlled trials. J Crit Care 2010; 25: 420-35.

16. Löwenberg M, Stahn C, Hommes DW, Buttge-reit F. Novel insights into mechanisms of glu-cocorticoid action and the development of new glucocorticoid receptor ligands. Steroids 2008; 73: 1025-9.

17. Meyer J, Cox PN, McKerlie C, Bienzle D. Pro-tective strategies of high-frequency oscillato-ry ventilation in a rabbit model. Pediatr Res 2006; 60: 401-6.

18. Moradi M, Mojtahedzadeh M, Mandegari A, Soltan-Sharifi MS, Najafi A, Khajavi MR, Haji-babayee M, Ghahremani MH. The role of glu-tathione-S-transferase polymorphisms on cli-nical outcome of ALI/ARDS patient treated with N-acetylcysteine. Respir Med 2009; 103: 434-41.

19. Paul-Clark M, Del Soldato P, Fiorucci S, Flower RJ, Perretti M. 21-NO-prednisolone is a novel nitric oxide-releasing derivative of predniso-lone with enhanced anti-inflammatory prop-erties. Br J Pharmacol 2000; 131: 1345-54.

20. Perretti M, Paul-Clark MJ, Mancini L, Flower RJ. Generation of innovative anti-inflammatory and anti-arthritic glucocorticoid derivatives that release NO: the nitro-steroids. Dig Liver Dis 2003; 35 Suppl 2: S41-8.


43

21. Peter JV, John P, Graham PL, Moran JL, Geor-ge IA, Bersten A. Corticosteroids in the pre-vention and treatment of acute respiratory distress syndrome (ARDS) in adults: meta-analysis. BMJ 2008; 336: 1006-9.

22. Pierrakos C, Karanikolas M, Scolletta S, Kara-mouzos V, Velissaris D. Acute respiratory dis-tress syndrome: pathophysiology and thera-peutic options. J Clin Med Res 2012; 4: 7-16.

23. Raghavendran K, Willson D, Notter RH. Sur-factant therapy for acute lung injury and acu-te respiratory distress syndrome. Crit Care Clin 2011; 27: 525-59.

24. Rauch A, Gossye V, Bracke D, Gevaert E, Jac-ques P, Van Beneden K, Vandooren B, Rauner M, Hofbauer LC, Haegeman G, Elewaut D, Tuckermann JP, De Bosscher K. An anti-inflammatory selective glucocorticoid recep-tor modulator preserves osteoblast differen-tiation. FASEB J 2011; 25: 1323-32.

25. Reber LL, Daubeuf F, Plantinga M, De Cauwer L, Gerlo S, Waelput W, Van Calenbergh S, Ta-vernier J, Haegeman G, Lambrecht BN, Fros-sard N, De Bosscher K. A dissociated glucocor-ticoid receptor modulator reduces airway hy-perresponsiveness and inflammation in a mo-use model of asthma. J Immunol 2012; 188: 3478-87.

26. Ronchi CF, Fioretto JR, Ferreira AL, Berchieri-Ronchi CB, Correa CR, Kurokawa CS, Carpi MF, Moraes MA, Yeum KJ. Biomarkers for oxidati-ve stress in acute lung injury induced in rab-bits submitted to different strategies of me-chanical ventilation. J Appl Physiol 2012; 112: 1184-90.

27. Salari P, Mojtahedzadeh M, Najafi A, Sadraie S, Bahaadini K, Moharreri M, Hadavand N, Abdollahi M. Comparison of the effect of aminophylline and low PEEP vs. high PEEP on

EGF concentration in critically ill patients with ALI/ARDS. J Clin Pharm Ther 2005; 30: 139-44.

28. Schäcke H, Zollner TM, Döcke WD, Rehwinkel H, Jaroch S, Skuballa W, Neuhaus R, May E, Zügel U, Asadullah K. Characterization of ZK 245186, a novel, selective glucocorticoid re-ceptor agonist for the topical treatment of in-flammatory skin diseases. Br J Pharmacol 2009; 158: 1088-103.

29. Siobal MS, Hess DR. Are inhaled vasodilators useful in acute lung injury and acute respira-tory distress syndrome? Respir Care 2010; 55: 144-57.

30. Tang BM, Craig JC, Eslick GD, Seppelt I, McLe-an AS. Use of corticosteroids in acute lung in-jury and acute respiratory distress syndrome: a systematic review and meta-analysis. Crit Care Med 2009; 37: 1594-603.

31. The ARDS Clinical Trials Network; National Heart, Lung, and Blood Institute; National In-stitutes of Health. Randomized, placebo-controlled trial of lisofylline for early treat-ment of acute lung injury and acute respirato-ry distress syndrome. Crit Care Med 2002; 30: 1-6.

32. The ARDS Network. Ketoconazole for early treatment of acute lung injury and acute res-piratory distress syndrome: a randomized controlled trial. JAMA 2000; 283: 1995-2002.

33. Vandevyver S, Dejager L, Tuckermann J, Libert C. New insights into the anti-inflammatory mechanisms of glucocorticoids: an emerging role for glucocorticoid-receptor-mediated transactivation. Endocrinology 2013; 154: 993-1007.

34. Willson DF, Notter RH. The future of exoge-nous surfactant therapy. Respir Care 2011; 56: 1369-86.


44

Glukokortikoidy a jejich účinky na kardiovaskulární systém

Hana Píštěková, Daniela Mokrá

Ústav fyziológie, Jesseniova lekárska fakulta UK, Martin


Klinická aplikace glukokortikoidů

Glukokortikoidy patří v současnosti k jedné z nejpředepisovanějších skupin léčiv (Ng a Celermajer, 2004; Walker, 2007), což vyplývá z jejich schopnosti v terapeutických dávkách inhibovat všech-ny fáze zánětlivé reakce. Nacházejí proto široké uplatnění v terapii celé škály zánět-livých, alergických a autoimunitních one-mocnění a klinicky se využívají v řadě me-dicínských oborů jako je revmatologie, neurologie, gastroenterologie, endokrino-logie atd. Slouží rovněž k inhibici rejekce transplantátu (Ng a Celermajer, 2004) a aplikovány jsou i antenatálně při hrozím předčasném porodu ke stimulaci sekrece surfaktantu u fetu.

Klinicky jsou využívány již od 50/60. let (Ng a Celermajer, 2004), avšak teprve počátkem 90. let se glukokortikoidy (a to převážně dexametazon a hydrokortizon) začaly uplatňovat jako terapeutický pro-středek u předčasně narozených dětí při léčbě syndromu akutní respirační tísně (Bal et al., 2008). Toto použití však nebylo a dosud ani není všeobecně akceptováno, v některých zemích není součástí doporu-čených terapeutických postupů. Důvodem je zejména nedostatečná znalost možných nežádoucích účinků této terapie.

Nežádoucí účinky glukokortikoidů

Obecně lze říci, že nežádoucí účin-ky, které jsou s tímto druhem léčby spoje-ny, závisejí na dávce, způsobu aplikace, délce trvání terapie, věku pacienta a také základním onemocnění, které může rov-něž ovlivňovat kardiovaskulární, jakož i další parametry. Je všeobecně známo, že přebytek glukokortikoidů v organizmu u

dospělých jedinců vede k rozvoji iatrogen-ního Cushingova syndromu, inzulinové rezistence, hyperglykémie, dyslipidémie, přírůstku hmotnosti, hyperhomocystei-némii, osteoporóze, rozvoji hypertenze, ateroskleróze (Brotman et al., 2005; Ng a Celermajer, 2004; Walker 2007) atd. U neonatologických pacientů je terapie glu-kokortikoidy spojena s akutní hypertenzí, hyperglykemií (Lin et al., 1999) a hypertro-fickou kardiomyopatií. I když jsou tyto změny všeobecně považovány za pře-chodné (Bal et al., 2008), mohou být velmi závažné. U dětí léčených časně postnatál-ně dexametazonem byly ve školním věku pozorovány nepříznivé důsledky na neu-romotorické a kognitivní funkce a retarda-ce tělesného vzrůstu (Yeh et al., 2004). Je však třeba poznamenat, že těmto pacien-tům byly podávány mnohem vyšší dávky léčiva, než jaké udávají současné doporu-čené terapeutické postupy. Dlouhodobější pozorování nejsou dosud k dispozici, ne-boť s tímto druhem léčby se započalo po-měrně nedávno.

Kardiovaskulární účinky glukokortikoidů

Výsledky experimentů na animál-ních modelech ukazují, že terapie gluko-kortikoidy kromě akutních změn v kardiovaskulárních parametrech může vést ke kardiovaskulární dysfunkci i v pozdějším věku. Zatímco diastolické funkce signifikantně narušeny nejsou, po-zorováno bylo snížení funkcí systolických provázené kompenzační dilatací. Důvo-dem je patrně skutečnost, že neonatální aplikace – v tomto případě dexametazonu potkanům – inhibuje mitotické dělení kar-diomyocytů, z čehož plyne redukovaný



45

počet těchto buněk v dospělosti (Bal et al., 2008).

Možných mechanizmů, kterými jsou glukokortikoidy schopny navodit kar-diotoxický efekt, je řada (Jain et al., 2004). Nežádoucí účinky vyplývají z vlastního me-chanizmu působení glukokortikoidů v organizmu, ovlivňují je i odlišné farma-kokinetické a farmakodynamické vlastnos-ti konkrétních léčiv tohoto druhu. Z terapeutického hlediska je relevantní, že účinkují na genomické i negenomické úrovni (obr. 1). Je známo, že hierarchie ve schopnosti jednotlivých klinicky užívaných glukokortikoidů vyvolat nespecifický ne-genomický účinek je kompletně odlišná

v komparaci s jejich klasickým genomic-kým efektem. Z glukokortikoidů porovná-vaných ve studii Buttgereita a kol. má sil-nější nespecifický negenomický účinek prednyliden, následovaný dexametazo-nem a metylprednizonem, než metylpred-nizolon a betametazon. Uvedené zjištění je v příkrém kontrastu s jejich genomickým účinkem, kde potenciál dexametatazonu a betametazonu je výrazně vyšší než u ostatních testovaných léčiv. Tato diference znamená, že genomický a negenomický účinek jsou zprostředkovány zcela odliš-ným mechanizmem (Buttgereit et al., 1999).

Obr. 1 Genomický a negenomický efekt glukokortikoidů (převzato a upraveno podle Berki et al., 2011).

Velmi dobře prozkoumaný je ge-

nomický účinek. Je závislý na glukokortiko-idním receptoru (Buttgereit et al., 1999), který je klidovém stádiu, tedy bez přítom-nosti příslušného ligandu, vázán v inaktivní formě v cytosolu buňky. Po vstupu ligandu do buňky je glukokortikoidový receptor uvolněn z inhibičního proteinového kom-plexu s chaperony – jako jsou proteiny tepelného šoku (Hsp90 a Hsp70), dimeri-zuje a je translokován do jádra. Zde se

váže na specifické DNA sekvence zvané „glucocorticoid response elements“. Glu-kokortikoidový receptor pak funguje jako na ligandu závislý transkripční faktor a je schopen přímo ovlivňovat expresi množ-ství genů – ať už ve smyslu up-regulace nebo represe. Glukokortikoidový receptor inhibuje transkripci genů i interferenci s jinými signalizačními drahami zapojený-mi v zánětlivé reakci, jako je např. dráha transkripčních faktorů: nukleárního fakto-


46

ru kappa B (NFκB) či aktivačního proteinu 1 (AP-1) (Marketon a Sternberg, 2010). Ovlivňuje tak v konečném důsledku synté-zu řady pro- a protizánětlivých mediátorů (McColl et al., 2007).

Negenomický účinek byl objeven poměrně nedávno a není ještě kompletně prozkoumán. Jedná se o další děje, do kte-rých jsou glukokortikoidy zapojeny, aniž by přitom docházelo k vlastní transkripci ge-nů. Zahrnují stabilizaci samotné buněčné membrány (Buttgereit et al., 1999) nebo mohou glukokortikoidy cestou posttran-skripční regulace jak na úrovni samotné mRNA, tak proteinů inhibovat expresi, syntézu a uvolňování prozánětlivých me-diátorů z buňky. Změnou organizace chromatinu a acetylace histonů zasahují do exprese a represe dalších genů (McColl et al., 2007), mají přímý efekt i na mito-chondriální membránu. Metylprednizolon zvyšuje protonovou permeabilitu. Tím dochází k částečnému odpojení oxidativní fosforylace na vnitřní mitochondriální membráně – ovlivňuje tak buněčný meta-bolizmus (Buttgereit et al., 1999). Specific-ký negenomický účinek nastupuje během minut a předpokládá se, že je zprostřed-kován steroid-selektivním membránovým receptorem. Nespecifický negenomický účinek oproti tomu nastupuje ještě rychleji – v průběhu sekund a děje se tak pro-střednictvím fyzikálně-chemických in-terakcí s buněčnou membránou. Léčivo se „rozpouští“ v membráně, mění její fyzikál-ně-chemické vlastnosti a aktivitu s membránou asociovaných proteinů – ovlivňuje tak např. výměnu iontů mezi buňkou a vnějším prostředím (Buttgereit et al., 1999). Negenomický účinek je tedy přímý a okamžitý, zatímco genomický efekt je pozorovatelný ne dříve než 30 min po vazbě glukokortikoidu na receptor. Z praktického hlediska je přitom podstat-né, že negenomický účinek je výrazný při vysokých dávkách, kdežto genomický efekt se projeví v jakékoli terapeutické koncent-

raci léčiva. Při velmi nízkých dávkách je tedy možné docílit v podstatě výlučně ge-nomický efekt, se zvyšující se dávkou roste přidružený negenomický účinek (Buttgere-it et al., 1999). Ve vysokých dávkách při „pulzní terapii“ preferovaný metylpredni-zolon inhibuje přechod kationtů sodíku a kalcia přes plazmatickou buněčnou mem-bránu a snižuje tak koncentraci volného kalcia intracelulárně, má však malý efekt na syntézu proteinů (Buttgereit et al., 1999). Vzrůst intracelulární koncentrace vápníku je přitom esenciální pro aktivaci lymfocytů, metylprednizolon takto snižuje nebo zabraňuje akutní imunitní odpovědi organizmu (Buttgereit et al., 1999). Nege-nomické působení glukokortikoidů tak může být částečně zodpovědné za ovliv-nění vaskulárních změn v rámci zánětlivé odpovědi organizmu, včetně inhibice in-terakce leukocytů s cévním endotelem a non-transkripční aktivaci endoteliální NO-syntázy (Ng a Celermajer, 2004).

Efekt jednotlivých glukokortikoidů se liší v závislosti na jejich chemické struk-tuře - tedy lipofilitě, afinitě k receptoru a dalších vlastnostech. Kromě vazby ke glu-kokortikoidnímu receptoru vykazují tyto látky i jistou míru afinity k mineralokortikoidnímu receptoru. Za-tímco glukokortikoidní receptory najdeme exprimované prakticky všude, mineralo-kortikoidní receptory jsou přítomné jen v určitých tkáních. Oba typy jsou hojně zastoupeny ve tkáních kardiovaskulárního systému včetně srdce a stěny arterií, kde prostřednictvím nich glukokortikoidy udr-žují cévní tonus a modifikují vaskulární zánětlivé procesy, proliferaci a remodelaci v odpovědi na poškození. V buňkách ně-kterých z těchto tkání (např. v cévním en-dotelu) dochází působením 11β-hydroxysteroid dehydrogenázy typu 2 k lokální transformaci glukokortikoidu na inertní formu ještě před navázáním na mineralokortikoidní receptor; mineralo-kortikoidní receptor je pak obsazován ex-


47

kluzivně aldosteronem. V jiných oblastech, jako je právě myokard nebo hladká svalo-vina cév, kde tento enzym schází, gluko-kortikoid vstupuje do kompetice o vazbu na receptor s aldosteronem (Walker, 2007). Navíc v hladké svalovině cév, bron-chů nebo v makrofázích a dalších tkáních, kde je přítomná 11β-hydroxysteroid de-hydrogenáza typu 1, imunitní stimul indu-kuje reduktázovou aktivitu tohoto enzy-mu. Jejím působením pak dochází k regeneraci kortizolu z inertního kortizo-nu (Cai et al., 2001). Stoupá tak intracelu-lární koncentrace kortizolu, která ovlivňuje obsazenost receptoru. Zesiluje se aktivace glukokortikoidního receptoru a tím i od-pověď. Senzitivita jednotlivých tkání ke glukokortikoidům je vlivem těchto faktorů odlišná (Walker, 2007).

Syntetické steroidy se liší v citlivosti na metabolizování 11β-hydroxysteroid dehydrogenázou 2 a rovněž ve vazebné afinitě ke glukokortikoidnímu a mineralo-kortikoidnímu receptoru. Samotný kortizol je neselektivním agonistou glukokortiko-idního a mineralokortikoidního receptoru. Afinity k mineralokortikoidnímu receptoru byl zbaven prednizolon, který je relativně selektivní pro glukokortikoidní receptor (více než pro receptor mineralokortikoid-ní) a citlivý k metabolizování 11β-hydroxysteroid dehydrogenázou 2. A zejména pak dexametazon, který je vůči 11β-hydroxysteroid dehydrogenáze 2 po-měrně rezistentní a současně účinkuje jako silně selektivní agonista glukokortiko-idního receptoru (Walker, 2007). Většina glukokortikoidů využívaných v klinické praxi (prednison, hydrokortizon, metyl-prednizolon) má však ve farmakologických dávkách podstatný mineralokortikoidní efekt (Brotman et al., 2005). Nedávné randomizované klinické studie ukázaly, že blokátory mineralokortikoidního recepto-ru (spironolacton) nebo selektivní antago-nisté aldosteronu (eplerenon) snižují mor-biditu a mortalitu u pacientů se srdečním

selháním (Ng a Celermajer, 2004). Vypoví-dá to o podstatné roli mineralokortikoid-ního receptoru, jehož aktivace je pravdě-podobně ve značné míře zodpovědná za sledované změny kardiovaskulárních pa-rametrů. Mineralokortikoidní aktivace nepůsobí negativně jen zvýšením hladiny sodíku a retencí vody v organizmu, ale rovněž podporou fibrózní remodelace sr-dečních předsíní a komor (Ng a Celerma-jer, 2004). I u glukokortikoidů s nízkou mineralokortikoidní aktivitou však zůstává riziko nežádoucích efektů, které aktivace glukokortikoidního receptoru může indu-kovat uvnitř cév. Tyto změny zahrnují např. zvýšení lokální hladiny angiotenzinu II, endotelinu-1 nebo pokles generování lokální endoteliální NO-syntázy (Walker, 2007). Mineralokortikoidní působení je zanedbatelné u dexametazonu, přesto i zde je při aplikaci možné pozorovat určité změny. Podle zjištění Brotmana a kol. dexametazon zvyšuje systolický krevní tlak a naopak snižuje klidovou srdeční frekven-ci a hladinu aldosteronu. Neovlivňuje však diastolický krevní tlak ani srdeční frekvenci snímané po zátěži (Brotman et al., 2005). K podobným výsledkům jsme dospěli i na našem pracovišti. Na králičím modelu syn-dromu aspirace mekonia (MAS) i.v. podání jedné i dvou dávek dexametazonu vyvola-lo akutní změny kardiovaskulárních para-metrů. Některé z těchto změn přitom pře-trvávaly po celých pět hodin od podání léčby, tedy až do ukončení pokusu. Pozo-rovali jsme zvýšení krevního tlaku, snížení srdeční frekvence, zvýšení variability sr-deční frekvence a zvýšený výskyt arytmií během a bezprostředně po aplikaci léčiva. Snížená srdeční frekvence a zvýšená varia-bilita srdeční frekvence však přetrvávala po celou dobu pozorování (Mokrá et al., 2008a; Mokrá et al., 2008b; Mokrá et al., 2009).

Zvýšení krevního tlaku po podání glukokortikoidů je závislé na dávce (Ng a Celermajer, 2004) a rozdíly jsou pozorova-


48

telné i mezi jednotlivými přípravky. Hydro-kortizon vykazuje významné natriumre-tenční působení, prednison, prednisolon a metylprednisolon jen slabé, zatímco dexametazon žádné. Za mechanizmus této reakce je však jen částečně zodpovědné renální zvýšení retence sodíku a expanze objemu plazmy zprostředkované minera-lokortikoidním receptorem (Walker, 2007); principiálně se vztahuje spíše ke zvýšení periferní cévní rezistence (Ng a Celermajer, 2004). Experimentální modely ukazují, že glukokortikoidy up-regulují re-ceptor typu 1 pro angitenzin II a α-1 recep-tor v hladké svalovině cév, jsou schopné zvýšit produkci angitenzinogenu adipocyty a rovněž mohou stimulovat expresi angio-tenzin konvertujícího enzymu, zatímco syntézu prostacyklinu E2 na úrovni en-dotelu a hladké cévní svaloviny redukují (Brotman et al., 2005).

Studie Souvereina a kol. ukázala spojitost na dávce závislé orální aplikace glukokortikoidů a zvyšujícího se rizika sr-dečního selhání. Příčinou může být přímo hypertenzní efekt glukokortikoidů či akti-vace mineralokortikoidního receptoru. Následná retence tekutin může vyvolat kardiální insuficienci. Uvažovalo se také o nepřímém vlivu – a sice navození faktorů rizikových pro vznik srdečně-cévních one-mocnění (jako je inzulinová rezistence, hyperglykémie, dyslipidémie, obezita, hy-pertenze) (Souverein et al., 2004). Avšak úprava stavu (krevního tlaku, koncentrace lipidů v plazmě, glykémie) popsaný nepří-znivý efekt glukokortikoidů neeliminuje (Walker, 2007).

Disturbance v kardiovaskulární čin-nosti byly zaznamenány i po aplikaci stero-idů pulzní formou (tj. po i.v. podání supra-farmakologických dávek kortikosteroidů), která je užívaná v dermatologii, u one-mocnění pojiva nebo při terapii revmato-idní artritidy (Jain et al., 2004) a rovněž tak při akutním traumatu spinální míchy, edému mozku a skleróze multiplex (Butt-

gereit et al., 1999; Vasheghani-Farahani et al., 2011). Změny se objevily jak u dětí, tak u dospělých pacientů bez ohledu na zá-kladní onemocnění během a bezprostřed-ně po podání, resp. v prvních 24 hodinách po aplikaci léčiva. Jedná se o různé typy arytmií (sinusovou tachykardii, sinusovou bradykardii, atriální tachykardii, atriální fibrilaci, supraventrikulární tachykardii, ventrikulární tachykardii), nebyly však per-zistentní a většinou proběhly asymptoma-ticky (Vasheghani-Farahani et al., 2011). Dále byla pozorována ischemie myokardu, kardiovaskulární kolaps, arteriální trombó-za vyvolaná závažnou hyperkoagulací; v ojedinělých případech došlo dokonce k náhlému úmrtí (Jain et al., 2004). Vysoké dávky kortikosteroidů indukují akutní změny v elektrolytech na vnitřním a vněj-ším povrchu buněčné membrány. Mění exkreci sodíku a draslíku ledvinami, dochá-zí k extracelulárnímu zvýšení a intracelu-lárnímu snížení koncentrace draslíku. Vý-sledkem je hyperpolarizace buněčné membrány, která ji činí vodivější. Mění stimulační práh buněk myokardu, což v konečném důsledku vede k poruchám vedení vzruchu a k arytmiím (Jain et al., 2004; Vasheghani-Farahani et al., 2011). Zvýšená vaskulární reaktivita na endogen-ní vazopresory (jako jsou katecholaminy) a zřídkavá anafylaktická reakce na kortiko-idy může být zodpovědná za kardiovasku-lární kolaps (Jain et al., 2004; Vasheghani-Farahani et al., 2011).

Kortikoidy mohou působit i nepří-mo prostřednictvím ovlivňování činnosti jiného systému kontrolujícího kardio-vaskulární funkce. Např. výskyt reverzibilní bradykardie může být vysvětlen potlače-ním aktivity HPA osy (Jain et al., 2004). Tato léčiva ovlivňují rovněž systém renin – angiotenzin – aldosteron (RAAS) a rovno-váhu sympatiku a parasympatiku. Na dru-hé straně pokles srdeční frekvence po po-dání dexametazonu ukazuje, že zvýšení tonu sympatiku se na pozorovaném zvý-


49

šení tlaku krve nepodílí (Brotman et al., 2005).

Glukokortikoidy hrají roli také v patogenezi aterosklerózy (Ng a Celerma-jer, 2004). Krátkodobé podávání glukokor-tikoidů nemá prokazatelný nepříznivý vliv na cévní endotel (Brotman et al., 2005). Je dokonce možné, že může mít i určitý anti-aterosklerotický efekt. Dexametazon na experimentální úrovni ukázal schopnost redukovat aterosklerózu (Ng a Celermajer, 2004). Prolongovaná protizánětlivá terapie glukokortikoidy u pacientů se zánětlivým onemocněním, jako je revmatoidní artriti-da, indukuje aterogenezi. Nadbytek gluko-kortikoidů může podporovat i kalcifikaci aterosklerotických plátů. Mineralokortiko-idní antagonisti redukují formování atero-sklerotických plátů, zabraňují migraci a proliferaci buněk hladké svaloviny cév (Walker, 2007).

Některé experimenty na animál-ních modelech ukázaly, že vysoké dávky glukokortikoidů chrání myokard před akutním ischemickým poškozením (Ng a Celermajer, 2004). Předpokládalo se, že patrně negenomickým mechanizmem glu-kokortikoidy akutně indukují endoteliální NO-syntázu, což by mohlo působit protek-tivně po infarktu myokardu a redukovat poškození srdeční tkáně. Účinek glukokor-tikoidů je však komplexní. Limituje do-stupnost tetrahydrobiopterinu coby kofak-toru NO-syntázy. Spíše než protektivní NO tak glukokortikoidy podporují syntézu škodlivých reaktivních forem kyslíku (Wal-ker, 2007) a mohou tak uspíšit endoteliální dysfunkci. V dosud jediné publikované in vivo studii na toto téma byl však použit hydrokortizon, jehož mineralokortikoidní efekt sám mohl vést k dysfunkci endotelu (Brotman et al., 2005). Navíc aktivace glu-kokortikoidního receptoru zamezuje angi-ogenezi a zhoršuje tak reperfuzi (Walker, 2007).

Ve srovnání se závažností dosud uváděných nežádoucích účinků spojených

se systémovou aplikací, je lokální způsob podání glukokortikoidů bezpečnější. Odvíjí se samozřejmě také od způsobu podání a dávky. Při nebulizační formě aplikace zů-stává v plicích deponováno méně než 20 % léčiva, zbytek je absorbován do cirkulace a vyvolává systémový efekt (Rizzo a Solé, 2006).

Závěr

Terapie glukokortikoidy velice účinně potlačuje zápal s jeho přidruženými projevy. Na straně druhé však způsobuje nejrůznejší akutní i chronické nežádoucí účinky včetně kardiovaskulárních. Vzhle-dem k uvedeným skutečnostem je tedy třeba zdůraznit obezřetnost v přístupu k používání glukokortikoidů, a to zejména u dětí a nutnost monitoringu pacientů v průběhu terapie i následně po ní.

Práce vznikla s podporou projektů CEPV II a CEKR II, spolufinancovaných z prostředků EK; projektu APVV-0435-11 a grantu VEGA 1/0057/11. Zoznam použitej literatúry 1. Bal MP, de Vries WB, van Oosterhout MF,

Baan J, van der Wall EE, van Bel F, Steendijk P. Long-term cardiovascular effects of neonatal dexamethasone treatment: hemodynamic fol-low-up by left ventricular pressure-volume loops in rats. J Appl Physiol 2008; 104: 446-50.

2. Berki T, Boldizsár F, Szabó M, Talabér G, Va-recza Z. Signal transduction (Medical Biotech-nology). Pécs: University of Pécs 2011; 155 p.

3. Brotman DJ, Girod JP, Garcia MJ, Patel JV, Gupta M, Posch A, Saunders S, Lip GY, Worley S, Reddy S. Effects of short-term glucocortico-ids on cardiovascular biomarkers. J Clin Endo-crinol Metab 2005; 90: 3202-8.

4. Buttgereit F, Brand MD, Burmeister GR. Equi-valent doses and relative drug potencies for non-genomic glucocorticoid effects: a novel glucocorticoid hierarchy. Biochem Pharmacol 1999; 58: 363-8.

5. Cai TQ, Wong B, Mundt SS, Thieringer R, Wright SD, Hermanowski-Vosatka A. Inducti-on of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 but not -2 in human aortic smooth


50

muscle cells by inflammatory stimuli. J Steroid Biochem Mol Biol 2001; 77: 117-22.

6. Jain R, Bali H, Sharma VK, Kumar B. Cardio-vascular effects of corticosteroid pulse thera-py: a prospective controlled study on pem-phigus patients. Int J Dermatol 2005; 44: 285-8.

7. Lin YJ, Yeh TF, Hsieh WS, Chi YC, Lin HC, Lin CH. Prevention of chronic lung disease in pre-term infants by early postnatal dexamethaso-ne therapy. Pediatr Pulmonol 1999; 27: 21-6.

8. Marketon JI, Sternberg EM. The glucocortico-id receptor: a revisited target for toxins. To-xins (Basel) 2010; 2: 1357-80.

9. McColl A, Michlewska S, Dransfield I, Rossi AG. Effects of glucocorticoids on apoptosis and clearance of apoptotic cells. Scienti-ficWorldJournal 2007; 7: 1165-81.

10. Mokra D, Calkovska A, Tonhajzerova I, Petras-kova M, Bulikova J, Redfors B. Dexamethaso-ne treatment improved lung functions in me-conium-instilled rabbits, but influenced cardi-ovascular variables. Bratisl Lek Listy 2008a; 109: 95-101.

11. Mokra D, Tonhajzerova I, Mokry J, Drgova A, Petraskova M, Calkovska A, Javorka K. Rapid cardiovascular effects of dexamethasone in rabbits with meconium-induced acute lung in-jury. Can J Physiol Pharmacol 2008b; 86: 804-14.

12. Mokra D, Tonhajzerova I, Petraskova M, Cal-kovska A. Effects of dexamethasone on cardi-ovascular functions in acute phase in meconi-um-injured rabbits. Pediatr Int 2009; 51: 132-7.

13. Ng MKC, Celermajer DS. Glucocorticoid treatment and cardiovascular disease. Heart 2004; 90: 829-30.

14. Rizzo MC Solé D. Inhaled corticosteroids in the treatment of respiratory allergy: safety vs. efficacy. J Pediatr (Rio J) 2006; 82: S198-205.

15. Souverein PC, Egberts AC, Meuleman EJ, Urquhart J, Leufkens HG. Incidence and de-terminants of sildenafil (dis)continuation: the Dutch cohort of sildenafil users. Int J Impot Res 2002; 14: 259-65.

16. Vasheghani-Farahani A, Sahraian MA, Darabi L, Aghsaie A, Minagar A. Incidence of various cardiac arrhythmias and conduction distur-bances due to high dose intravenous methyl-prednisolone in patients with multiple sclero-sis. J Neurol Sci 2011; 309: 75-8.

17. Walker BR. Glucocorticoids and cardiovascu-lar disease. Eur J Endocrinol 2007; 157: 545-59.

18. Yeh TF, Lin YJ, Lin HC, Huang CC, Hsieh WS, Lin CH, Tsai CH. Outcomes at school age after postnatal dexamethasone therapy for lung di-sease of prematurity. N Engl J Med 2004; 350: 1304-13.


51

Diagnostika rezistentných foriem tuberkulózy – konvenčné metódy versus molekulárno-genetické metódy

Igor Porvazník1,2, Juraj Mokrý2, Ivan Solovič1

1Národný ústav tuberkulózy, pľúcnych chorôb a hrudníkovej chirurgie, Vyšné Hágy, 2Ústav farmakológie JLF UK, Martin

E-mail: [email protected]

Úvod Napriek tomu, že tuberkulóza (TB)

patrí v súčasnosti na území SR k zriedkavejším respiračným ochoreniam a Slovenská republika (SR) sa zaraďuje ku krajinám s jej nízkym výskytom, jej inci-dencia v niektorých krajinách z roka na rok rastie (Migliori et al., 2012). Oveľa závaž-nejší je však fakt, že sa čoraz objavujú čas-tejšie kmene mykobaktérií, ktoré sú rezis-tentné na rôzne antituberkulotiká (AT). Ku krajinám, kde sa takéto kmene objavujú čoraz to častejšie, patria aj krajiny bývalé-ho Sovietskeho zväzu, z ktorých emigranti často využívajú práve Slovensko ako tran-zitnú krajinu (Skrahina et al., 2012). S tým je spojené zvýšené nebezpečenstvo im-portu rezistentných kmeňov aj do našej krajiny.

Vznik a šírenie multirezistentnej tuberkulózy (MDR – TB) a x-liekovo rezis-tentnej tuberkulózy (XDR – TB) sú hlavné problémy pre globálnu kontrolu tuberku-lózy, nakoľko liečba rezistentných foriem je náročná ako z medicínskeho, tak aj fi-nančného hľadiska.

Pri diagnostike sa už dlhé roky na Slovensku opierame o štandardné postupy založené na kultivácii mykobaktérií a následnom stanovení citlivostí na antitu-berkulotiká. Keďže tieto metódy si vyžadu-jú čas, mnohokrát prevyšujúci čas iniciál-nej fázy liečby tuberkulózy, je potrebné opierať sa o nové, čas šetriace možnosti. Jednou z možností je používanie automati-zovaných systémov, ktoré urýchľujú čas kultivácie ako aj čas potrebný na stanove-

nie citlivostí. Avšak aj v tomto prípade trvá testovanie citlivostí 7 – 10 dní od získania pozitívnej kultúry (Piersimoni et al., 2006).

Najrýchlejším a najmodernejším spôsobom je využívanie molekulárno ge-netických metód, umožňujúcich ako pria-my dôkaz M. tuberculosis v biologickom, resp. kultivačnom materiáli, tak aj dôkaz rezistencie na niektoré dôležité antituber-kulotiká (Hillemann et al., 2006).

Rezistencia na antituberkulotiká

Rezistencia M. tuberculosis na AT je spontánna genetická mutácia znásobe-ná nesprávnym konaním človeka. Moleku-lárno-biologicky je rezistencia založená na mutáciách v géne mykobaktérií, ktoré ve-dú najčastejšie ku zmene cieľovej moleku-ly. Takto zmenená molekula už ďalej nie je miestom účinkom AT (Solovič, 2008).

Rezistencia u novozistených ocho-rení – primárna – sa týka rezistentných kmeňov M. tuberculosis vylučovaných no-vodiagnostikovanými jedincami, ktorí ne-boli nikdy liečení AT alebo liečba trvala menej ako jeden mesiac. Rezistencia na AT, ktorá vznikla počas liečby a je označo-vaná ako akvirovaná, resp. sekundárna rezistencia, je dôsledkom pomnoženia rezistentných mutantov nachádzajúcich sa v mykobakteriálnej populácii už pred lieč-bou. Jej výskyt je zvyčajne vyšší u recidivujúcich pacientov (Rozborilová, 2009).

V súčasnosti sa rezistencia na anti-tuberkulotiká klasifikuje nasledovne (van der Werf et al., 2012):



52

Monorezistencia – rezistencia na jed-no zo základných AT

Polyrezistencia – rezistencia na dve a viac AT

Multirezistencia – rezistencia mini-málne na kombináciu izoniazid + ri-fampicín

XDR – extensively drug-drug resistant - x-lieková rezistencia - INH + RIF + fluorochinolóny a minimálne jedno AT z troch injekčných AT 2. línie (amika-cín, kanamycín alebo kapreomycín).

V poslednom období sa v niektorých článkoch objavil nový termín - TDR TB – totally drug-resistant, v ktorom autori popisovali rezistenciu voči všetkým dostupným prvolíniovým a druholíniovým AT (Udwadia, 2012). WHO nateraz neod-porúča používanie tohto nového termínu, hlavne vzhľadom na technické problémy pri in vitro stanovovaní citlivostí na niekto-ré druholíniové AT, nedostatok štandardi-zovaných metód stanovenia citlivostí a nedostatočne preukázateľnú súvislosť výsledkov takýchto testov a výsledkov liečby pacientov.

Molekulárno – genetické testy

Test GenoType MTBDR plus je ur-čený na molekulárno – genetickú identifi-káciu komplexu Mycobacterium tubercu-losis a detekciu rezistencie na Izoniazid a Rifampicín, test MTBDRsl na detekciu rezistencie na Etambutol, fluorochinolóny (napr. Ofloxacín, Moxifloxacín) a aminoglykozidy, resp. cyklické peptidy (Kanamycín, Amikacín, resp. Kapreomycín) z kultivačných vzoriek alebo priamo z mikroskopicky pozitívnych pľúcnych vzo-riek (spútum, bronchoalveolárna laváž). Detekcia rezistencie je založená na identi-fikácii mutácií najvýznamnejších génov.

Drvivá väčšina rezistencie na Ri-fampicín je spôsobená mutáciou rpoB gé-nu, ktorý kóduje β-podjetnotku DNA-dependentnej RNA-polymerázy, zodpo-vednej za syntézu nukleových kyselín my-

kobaktérií (Telenti a kol., 1993). Naopak mutácie spôsobujúce rezistenciu Izoniazi-du sa nachádzajú v niekoľkých génoch. U 50 – 95 % INH rezistentných kmeňov bola preukázaná mutácia v kodóne 315 katG génu, kódujúcom mykobakteriálnu katalázu – peroxidázu, ktorá aktivuje Izo-niazid na vlastnú účinnú látku (Musser a kol., 1996), 20 – 35% kmeňov vykazovalo mutáciu v géne inhA, kódujúcom NADH enoyl-acyl-carrier-proteín-reduktázu, en-zýmu, ktorý je zapojený do syntézy myko-lových kyselín. Práve preto je test MTBDR plus založený na detekcii mutácií v génoch rpoB (pre RIF), katG a inhA (pre INH).

Test MTBDRsl je založený na de-tekcii mutácií génoch embB (pre ETB), naj-významnejších mutácií združených v géne gyrA (pre fluorochinolóny) a génu 16S rR-NA - rrs (pre aminoglykozidy, resp. poly-peptidy). Etambutol je baktériostatické antituberkulotikum, ktoré inhibuje arabi-nosyl transferázu kódovanú génom embB, čím blokuje biosyntézu arabinogalaktanu – esenciálnej zložky bunkovej steny myko-baktérií. Mutácia v géne embB je najčas-tejšou príčinou vzniku rezistencie na Etambutol (Telenti et al., 1997). Flurochi-nolóny inhibujú DNA gyrázu (topoizomerá-zu II) a topoizomerázu IV, čo má za násle-dok bakteriálnu smrť (Drlica, 1999). Topoi-zomerázy sú nevyhnutné enzýmy pre rep-likáciu a transkripciu bakteriálnej DNA (Zhao et al., 1997). Rezistencia na fluoro-chinolóny je spôsobená mutáciou ovplyv-ňujúcou DNA gyrázu, ktorá sa skladá z Gy-rA a GyrB podjednotiek, kódovanú gyrA a gyrB génov. Väčšina mutácií vyvolávajú-cich rezistenciu na fluorochinolóny sa vy-skytuje na géne gyrA, mutácie v géne gyrB sa v klinických izolátoch M. tuberculosis vyskytujú zriedkavo (Zhang et al., 2009). Aminoglykozidy (kanamycín a amikacín) inhibujú proteosyntézu prostredníctvom zmeny štruktúr ribozómov v 16S rRNA podjednotke (Alangaden et al., 1998). Mutácie 16S RNA - rrs génu sú spojené


53

s vysokou rezistenciou na kanamycín a amikacín (Zhang et al., 2009). Kapreo-mycín je polypeptidové antibiotikum a rezistencia voči nemu je rovnako ako pri amynoglykozidoch spôsobená mutáciou v géne pre rrs (Maus et al., 2005).

Obidva testy sú založené na tech-nológii DNA Strip® a celý postup je rozde-lený do troch krokov: izolácia DNA z materiálu, multiplexná PCR s biotinylova-nými primermi a reverzná hybridizácia.

Izolácia DNA

Na izoláciu DNA môžeme použiť mykobaktérie narastené na tuhých i v tekutých médiách, ale rovnako aj mik-roskopický pozitívny pľúcny materiál. Test však nemožno použiť na detekciu myko-baktérií z mikroskopicky negatívneho ma-teriálu získaného od pacienta. Pracovné prostredie nesmie obsahovať amplifikova-nú DNA. Kľúčové je zahriatie vzorky na teplotu 95 - 105° C, ktorá musí pôsobiť minimálne 15 minút aby sa bunky úplne zlyzovali a došlo k inaktivácií vegetatívnych baktérií. DNA vhodnú pre amplifikáciu je možné získať aj nasledujúcim rýchlym po-stupom: V prípade kultúry z pevnej pôdy nabe-

rieme jednu kľučku a resuspendujeme ju v 300 µl vody (normovanej pre mo-lekulárno-biologické metódy).

V prípade kultúry z tekutej pôdy, na-berieme 1 ml priamo z média (je po-trebné ho jeden až dvakrát premyť sterilnou injekčnou vodou a centrifu-govať), pokiaľ používame priamy pľúcny materiál, naberieme 0,5 ml dekontaminovanej vzorky a centrifu-gujeme 15 minút pri 10000 g. Super-natant odsajeme a pelet resuspendu-jeme v 100 – 300 µl vody (pre vzorky

z tekutej pôdy) alebo v 100 µl vody (pre priamy materiál).

Bakteriálnu suspenziu získanú v pred-chádzajúcich krokoch inkubujeme 20 minút pri teplote 95 °C.

Suspenziu následne vložíme na 15 mi-nút do sonifikačného kúpeľa.

Centrifugujeme 15 minút a pre PCR použijeme priamo 5 µl supernatantu. V prípade, že je potrebné roztok DNA skladovať dlhšiu dobu, prenesieme super-natant do novej čistej skúmavky.

Amplifikácia

V miestnosti bez DNA si pripravíme amplifikačnú zmes. Vzorku izolovanej DNA je potrebné pridávať v oddelenej miest-nosti.

Na jednu vzorku pridávame : 1. 35 µl PNM (Primer nukleotid

mix) 2. 5 µl inkubačného pufru 3. 4 µl MgCl2 roztoku 4. 1 – 2 jednotky termostabilnej

DNA polymerázy 5. x µl vody na doplnenie do cel-

kového objemu 45 µl + 5 µl amplifikovanej DNA, čím do-siahneme celkové množstvo 50 µl.

Vzorky je možné po amplifikácii skladovať pri teplote od +4 do -20 °C. Správnosť amplifikácie je potrebné overiť elektroforézou: Nanesieme 5 µl každej vzorky priamo do 2 % agarózového gélu, bez pridania nanášaciehu pufru. Amplikó-ny majú dĺžku približne 63 bp (amplifikač-ná kontrola), 115bp (M. tuberculosis kom-plex), 166 bp (rpoB), 120 bp (katG) a 110 bp (inhA).


54

Tab. 1 Amplifikačný profil

Kultivačné vzorky Priamy materiál

5 min. 95°C 1 cyklus 1 cyklus

30 s 95°C

10 cyklov 10 cyklov

2 min. 58°C

25 s 95°C

40 s 53°C 20 cyklov 30 cyklov

40 s 70°C

8 min. 1 cyklus 1 cyklus

Hybridizácia Hybridizácia zahrňuje nasledujúce

kroky : chemická denaturácia amplifikova-

ných produktov, hybridizácia reťazcových, biotínom

značených amplikónov so sondami fi-xovanými na prúžku nitrocelulózovej membrány,

premytie, pridanie konjugátu streptavi-

dín/alkalická fosfatáza, ktorá vedie k vizualizácii farebných prúžkov na stripoch nitrocelulózovej membrány.

Nakoniec nasleduje pomerne ľahké a rýchle vyhodnotenie výsledkov podľa priloženej šablóny a zápis výsledkov do formulára na vyhodnotenie.

Predohrejeme si trepací vodný kú-peľ/TwinCubator na 45 °C, maximálna to-lerovaná odchýlka je ± 1 °C. Rovnako pre-dohrejeme hybridizačný pufer a premývací roztok na 37 – 45 °C. Všetky činidlá musia byť bez zrazenín a ohriate na laboratórnu teplotu. Vo vhodných skúmavkách si na-riedime koncentráty konjugátu a substrátu s príslušnými puframi. Do rohu každého zvoleného žliabku

plastovej platničky napipetujeme 20 µl denaturačného roztoku

Pridáme 20 µl amplifikovanej vzorky, opakovanou aspiráciou dobre premie-šame a inkubujeme 5 minút pri labo-

ratórnej teplote. Počas tohto času vy-berieme zo skúmavky stripy a označíme ich pod farebný marker. Pri manipulácii so stripmi pracujeme vždy v rukaviciach.

Do každého žliabku napipetujeme opatrne 1 ml hybridizačného pufra. Opatrne pohybujeme platničkou do-vtedy, kým roztok nemá homogénne sfarbenie. Je dôležité dávať pozor, aby sa pri manipulácii roztok neprelial do susedných žliabkov.

Do každého žliabku vložíme strip. Stri-py musia byť v roztoku úplne ponore-né a tá strana stripu, na ktorej je fa-rebný marker musí byť otočená sme-rom nahor.

Doštičku umiestnime do trepacieho kúpeľa a inkubujeme pri 45 °C po do-bu 30 minút. Frekvenciu trepacieho kúpeľa upravíme tak, aby sme dosiahli stabilné a dôkladné premiešanie roz-toku. Kvôli adekvátnemu prenosu tep-la musí byť platnička ponorená aspoň do 1/3 svojej výšky.

Úplne odsajeme hybridizačný pufer. Na každý strip napipetujeme 1 ml

premývacieho roztoku a inkubujeme v trepacom kúpeli pri 45 °C po dobu 15 minút.

Úplne odsajeme premývací roztok. Od tohto momentu pracujeme už pri la-boratórnej teplote.


55

Každý strip oplachujeme jedenkrát v oplachovacom roztoku po dobu jed-nej minúty.

Napipetujeme na každý strip 1 ml na-riedeného konjugátu a inkubujeme 30 minút v trepacom kúpeli.

Vylejeme konjugát a každý strip opláchneme dvakrát po dobu jednej minúty v oplachovacom roztoku a raz v destilovanej vode.

Na každý strip pridáme 1 ml nariede-ného substrátu a necháme reagovať bez prístupu svetla a pretrepávania. V závislosti na podmienkach testova-nia sa môže doba inkubácie pohybo-vať v rozmedzí 3 až 20 minút. Predlžo-vanie času inkubácie substrátu môže viesť k intenzívnejšiemu sfarbeniu po-zadia a môže negatívne ovplyvniť in-terpretáciu výsledkov.

Reakciu ukončíme dvojnásobným prepláchnutím stripov v destilovanej vode.

Pinzetou vyberieme stripy zo žliabkov platničky a usušíme ich medzi dvoma vrstvami savého papiera.

Hodnotenie a interpretácia výsledkov

Osušené stripy nalepíme na vyzna-čené miesto vo formulári na vyhodnotenie tak, že priložíme zóny CC a AC k zodpovedajúcim farebným prúžkom, vyznačeným na formulári. Určíme stav rezistencie a zaznamenámeho do prísluš-ného stĺpca. Ako pomôcka na vyhodnote-nie nám slúži šablóna, ktorá musí byť pri-ložená tak, aby prúžky CC a AC stripu boli na úrovni s prúžkami na šablóne. Každý strip má celkovo 27 reakčných zón. Kontrola konjugátu (CC)

V tejto oblasti sa musí objaviť fa-rebný prúžok, potvrdzujúci účinnosť väzby konjugátu a reakciu substrátu. Kontrola amplifikácie (AC)

Pokiaľ je test správne vykonaný, kontrolný amplikón vytvorený v priebehu amplifikácie sa na stripe naviaže na zónu

amplifikačnej kontroly. Chýbajúci signál odhaľuje chyby vzniknuté počas amplifiká-cie alebo prenesením amplifikačných inhi-bítorov spoločne s izolovanou DNA. V prípade pozitívneho výsledku môže byť signál v zóne amplifikačnej kontroly slabý, avšak v tomto prípade bola amplifikačná reakcia prevedená správne a nie je po-trebné test opakovať. M. tuberculosis komplex (TUB)

Táto zóna hybridizuje s amplikónmi spoločnými pre všetky druhy komplexu M. tuberculosis. Pokiaľ je táto zóna nezafar-bená, t.j. negatívna, testované mykobakté-rie nepatria do komplexu M. tuberculosis. Lokusové kontroly (rpoB, katG, inhA,

gyrA, rrs, embB) Lokusové kontrolné zóny detekujú

génovú oblasť špecifickú pre príslušný lo-kus a musia vždy vykazovať pozitívny sig-nál. Wild type sondy

Wild type sondy obsahujú najdôle-žitejšie oblasti rezistencie príslušných gé-nov. Pokiaľ sú všetky sondy daného typu pozitívne, v skúmanej oblasti nie je žiadna detekovateľná mutácia. Testovaný kmeň je citlivý na príslušné antituberkulotiká.

V prípade mutácie sa príslušný am-plikón nemôže naviazať na zodpovedajúcu sondu. Preto chýbajúci signál pre mini-málne jednu z wild type sond indikuje re-zistenciu testovaného kmeňa na dané an-tituberkulotikum.

Do úvahy je možné brať len tie prúžky, ktorých intenzita sfarbenia je rov-nako silná alebo silnejšia ako zóna amplifi-kácie.

Každý profil, ktorý sa líši od wild type profilu, indikuje rezistenciu testova-ného kmeňa. Profil prúžkov získaný s rpoB sondami umožňuje vyvodiť záver o rezistencii na rifampicín, profil prúžkov s katG sondami záver o rezistencii na vy-sokú hladinu izoniazidu a profil prúžkov s inhA sondami zase záver o rezistencii na nízku hladinu izoniazidu. Profil so sondami


56

gyrA záver o rezistencii na fluorochinoló-ny, profil so sondami rrs o rezistencii na aminoglykozidy, resp. glykopeptidy a profil so sondami embB o rezistencii na etambu-tol.

Sondy s mutáciou Sondy s mutáciou detekujú niekto-

ré s najbežnejších mutácií zodpovedajúce za rezistenciu.

Obr. 2 Negatívne a pozitívne stripy, indikujúce rezistenciu na izoniazid a rifampicín (hore) a fluorochinolóny a

etambutol (dole). Zdroj: www.hain-lifescience.de

Záver Konvenčné kultivačné metódy

s následným stanovením citlivostí na anti-tuberkulotiká sú pomalé a komplikované,

vyžadujúce niekoľko postupných krokov na stanovenie diagnózy. Počas tejto doby môžu byť pacienti liečení nevhodne, rezis-tentné kmene sa môžu naďalej šíriť

http://www.hain-lifescience.de/


57

a môže dochádzať aj ku zosilneniu rezis-tencie. Preto je využívanie rýchlych mole-kulárno – genetických metód na identifi-káciu MDR – TB a XDR – TB s možnosťou identifikovať prítomnosť Mycobacterium tuberculosis komplexu a detekovať rezis-tenciu na dôležité antituberkulotiká v priebehu niekoľkých hodín predpokla-dom pre celosvetový boj s TBC. Zoznam použitej literatúry 1. Alangaden G. J., et al., 1998. Mechanism of

resistance to amikacin and kanamycin in My-cobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 42:1295–1297.

2. Drlica K., 1999. Mechanism of fluoroquinolo-ne action. Curr. Opin. Microbiol. 2:504–508.

3. Hillemann, D., S. Rüsch-Gerdes, and E. Rich-ter., 2006. Application of the GenoType MTBDR assay directly on sputum specimens. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 10:1057-1059.

4. Maus C. E., Plikaytis B. B., Shinnick T. M., 2005. Molecular analysis of cross resistance to capreomycin, kanamycin, amikacin, and viomycin in Mycobacterium tuberculosis. An-timicrob. Agents Chemother.

5. Migliori GB., Dara M., de Colombani P., Kluge H., Raviglione MC. Multidrug-resistant tuber-culosis in Eastern Europe: still on the increa-se? Eur Respir J 2012; 39: 1290-1.

6. Musser JM, Kapur V, Williams DL, Kreiswirth BN, van Soolingen D, van Embden JD, 1996. Characterization of the catalase-peroxidase gene (katG) and inhA locus in isoniazid-resistant and -susceptible strains of Mycobac-terium tuberculosis by automated DNA sequ-encing: restricted array of mutations associa-ted with drug resistance. J Infect Dis 1996, 173(1):196-202

7. Piersimoni, C., A. Olivieri, L. Benacchio, and C. Scarparo. 2006. Current perspectives on drug susceptibility testing of Mycobacterium tu-berculosis complex: the automated nonra-diometric systems. J. Clin. Microbiol. 44: 20-28.

8. Rozborilová E. Tuberkulóza a mykobakteriózy. Bratislava : Vydavateľstvo Univerzity Komen-ského v Bratislave, 2009. ISBN: 978-80-223-2577-6.

9. Skrahina A, Hurevich H, Zalutskaya A, Sahal-chyk E, Astrauko A, van Gemert W, Hoffenr S, Rusovich V, Zignol M. Alarming levels of drug-resistant tuberculosis in Belarus: results of a survey in Minsk. Eur Respir J 2012; 39: 1425-31

10. Solovič I. Tuberkulóza, vybrané kapitoly. Vyš-né Hágy : Národný ústav Tuberkuló-zy,pľúcnych chorôb a hrudníkovej chirurgie, 2008. ISBN 978-80-970024-4-2.

11. Somoskovi, A., J. Dormandy, D. Mitsani, J. Rivenburg, and M. Salfinger. 2006. Use of smear-positive samples to assess the PCR-based GenoType MTBDR assay for rapid, di-rect detection of the Mycobacterium tubercu-losis complex as well as its resistance to iso-niazid and rifampin. J. Clin. Microbiol. 44:4459-4463

12. Telenti A, Imboden P, Marchesi F, Lowrie D, Cole S, Colston MJ, Matter L, Schopfer K, Bodmer T, 1999, Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tu-berculosis. Antimicrob Agents Chemother. 43(10): 2550–2554.

13. Telenti A., et al., 1997. The emb operon, a gene cluster of Mycobacterium tuberculosis involved in resistance to ethambutol. Nat. Med. 3:567–570.

14. Udwadia ZF. MDR, XDR, TDR tuberculosis: ominous progression. Thorax 2012; 67(4): 286-8.

15. Van der Werf MJ, Langendam MW, Huitric E, Manissero D. Multidrug resistance after inap-propriate tuberculosis treatment_ a meta-analysis. Eur Respir J 2012; 39: 1511-9.

16. Zhang Y., Yew W. W., 2009. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculo-sis. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 13:1320–1330.

17. Zhao X., Xu C., Domagala J., Drlica K., 1997. DNA topoisomerase targets of the fluoroqui-nolones: a strategy for avoiding bacterial re-sistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94:13991–13996.


58

Tachykiníny v myometriu maternice

Vladimíra Sadloňová1, František Janíček1,2, Karol Dókuš2, Marta Jošková1, Jozef Višňovský2, Soňa Fraňová1

1 Ústav farmakológie, Jesseniova lekárska fakulta UK, Martin, 2 Gynekologicko-pôrodnícka

klinika, Jesseniova lekárska fakulta UK a MFN, Martin e-mail: [email protected]

Úvod

Tachykiníny, zahrňujúce neurokinín A (NKA), neurokinín B (NKB) a substanciu P (SP), sú rodinou štrukturálne príbuzných neuropeptidov, ktoré sú distribuované hlavne v periférnom a centrálnom nervo-vom systéme (Otsuka a Yoshioka, 1993; Magraner et al., 1998; Patak et al., 2003). Prítomnosť SP a NKA bola potvrdená v aferentných senzorických nervových zakončeniach urogenitálneho traktu u rôznych cicavcov vrátane človeka (Huang et al., 1984; Heinrich et al., 1986; Traurig et al., 1991; Patak et al., 2000), zatiaľ čo NKB v ľudskej placente (Page et al., 2000; Patak et al., 2002). Existujú dôkazy, že ok-rem nervového systému boli tachykiníny identifikované aj v iných ako neurálnych bunkách urogenitálneho traktu (Patak et al., 2005).

Biologické účinky SP sú sprostred-kované cez selektívne neurokinínové re-ceptory typu NK1, NKA cez selektívne NK2 receptory a NKB cez selektívne NK3 recep-tory (Guard a Watson, 1991; Stratowa et al., 1995). Pri vysokej koncentrácii, uvede-né tachykiníny môžu aktivovať všetky pod-typy spomenutých neurokinínových recep-torov (Maggi, 1995).

Neurokinínové receptory patria k membránovým receptorom spojených s G-proteínom. Ich stimulácia vedie ku aktivácii fosfolipázy C a následnému zvý-šeniu inozitoltrifosfátu a intracelulárnej koncentrácie kalcia (Gerard et al., 1993; Krause et al., 1994).

Tachykiníny zasahujú svojím pôso-bením do činnosti myometria maternice

v závislosti od jeho funkčného stavu. Nie-ktoré štúdie (Barr et al., 1991; Pennefat-her et al., 1993; Patak et al., 2002) potvrdi-li uterostimulačný účinok sprostredkovaný neurokinínovými receptormi v humánnom myometriu maternice. Kým najdôležitejšiu úlohu v kontraktilnej odpovedi zohráva aktivácia receptora NK2 (Magraner et al., 1998; Patak et al., 2000; Hamlin et al., 2000), NK1 a NK3 receptory kontrolujú vý-slednú kontrakčnú odpoveď myometria (Patak et al., 2002; Crane et al., 2002).

Z tohto dôvodu, cieľom našej práce bolo stanoviť aktivitu tachykinínov v humánnom gravidnom myometriu ma-ternice v termíne pôrodu v experimentál-nych in vitro podmienkach. Ako sledované látky sme použili NKA, NKB a SP. Analyzo-vali sme účinok tachykinínov na amplitúdu kontrakcií myometria maternice a porov-návali ich účinok s oxytocínom.

Metodika

Vzorky tkaniva humánneho myo-metria boli zozbierané na Gynekologicko-pôrodníckej klinike od tehotných žien s prítomnou spontánnou kontrakčnou činnosťou maternice v termíne pôrodu (38. - 42. týždeň tehotenstva), u ktorých bolo fyziologické tehotenstvo ukončené cisárskym rezom. Účinok tachykinínov v kontrakčnej činnosti myometria bol ana-lyzovaný použitím in vitro metódy v experimentálnych podmienkach na Ús-tave farmakológie JLF UK. Zo vzoriek tka-niva humánneho myometria sme pripravili myometriálne stripy veľkosti cca 2 x 7 mm, umiestnili ich do 5 kanálov s orgánovým



59

kúpeľom Krebsovým-Henseleitovým roz-tokom (NaCl 110,0 mmol.l-1, KCl 4,80 mmol.l-1, CaCl2 2,35 mmol.l-1, MgSO4 1,20 mmol.l-1, KHPO4 1,20 mmol.l-1, NaHCO3 25,0 mmol.l-1, glukóza 10,0 mmol.l-1) a počas 1 hodiny premývali Krebs-Henseleitovým roztokom v 15 minútových intervaloch. Fyziologické pH = 7,5 ± 0,1 bolo udržiavané saturáciou pneumoxidom (95 % O2 + 5 % CO2) pri teplote 36,5 ± 0,5 °C.

Vytvorili sme 5 experimentálnych skupín: 1. skupina - KONTROLA, spontánna činnosť myometria; 2. skupina - OXY, s aplikáciou oxytocínu; 3. skupina - NKA, s aplikáciou neurokinínu A; 4. skupina - NKB, s aplikáciou neurokinínu B a 5. skupi-na - SP, s aplikáciou substancie P. Oxyto-cín, NKA, NKB a SP boli v koncentráciách 10-6 mol.l-1 pridané k myometriálnym stri-pom do orgánových komôrok s orgánovým kúpeľom, s následným záznamom kon-trakčnej činnosti myometria. Mechanická odpoveď jednotlivých prúžkov myometria bola snímaná prostredníctvom transduk-tora (TENSIL10, RES Martin, Slovakia) s následným zosilnením signálu (TEMES

1052, RES Martin, Slovakia) a zaznamená-vaním zmien napätia myometriálnych prúžkov on line, použitím špeciálneho po-čítačového softvéru (TEMES 1, RES Martin, Slovakia).

Štúdia bola schválená Etickou ko-misiou JLF UK. Všetky rodičky boli infor-mované o priebehu štúdie a podpísali in-formovaný súhlas. V štatistickom hodno-tení sme použili Kolmogor-Smirnov test a Studentov párový t-test. Hodnoty p<0,05 boli považované za štatisticky signifikant-né.

Výsledky

Všetky nami testované tachykiníny spôsobili signifikantné zvýšenie amplitúdy kontrakcií v humánnom myometriu ma-ternice v termíne pôrodu (**p<0,01). V prípade NKA došlo k zvýšeniu kontrakč-nej aktivity myometria o 43,1 %, NKB o 38,1 % a SP o 39,7 %.

Uterostimulačný účinok oxytocínu v humánnom myometriu maternice bol v porovnaní s uterostimulačnými účinkami použitých tachykinínov najnižší, čo pred-stavovalo 36,1 %.

Obr. 1 Amplitúda kontrakcie humánneho gravidného myometria v termíne pôrodu po aplikácii oxytocínu a tachykinínov - NKA, NKB a SP

v experimentálnych in vitro podmienkach. KONTROLA - amplitúda spontánnych kontrakcií bez oxytocínu, OXY - amplitúda kontrakcií po aplikácii oxytocínu (10-6 mol.l-1), NKA - amplitúda kontrakcií po aplikácii neurokinínu A (10-6 mol.l-1), NKB - amplitúda kontrakcií po aplikácii neurokinínu B (10-6 mol.l-1), SP - amplitúda kontrakcií po aplikácii substancie P (10-6 mol.l-1). Údaje predstavujú priemerné hodnoty ± SEM. Signifikantný rozdiel, **p<0,01 OXY vs. KONTROLA, **p<0,01 NKA vs. KONTROLA, **p<0,01 NKB vs. KONTROLA, a **p<0,01 SP vs. KONTROLA.

**

**** **

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Am

pli

túd

a k

on

trakcie

(%

)

kontrola

OXY

NKA

NKB

SP


60

Diskusia a záver V našej štúdii sme pozorovali signi-

fikantnú participáciu tachykinínov v kon-traktilite humánneho gravidného myomet-ria v termíne pôrodu v experimentálnych in vitro podmienkach. Všetky nami hodno-tené tachykiníny mali signifikantný utero-stimulačný účinok, ktorý dokonca prevýšil uterostimulačný účinok oxytocínu, ktorý je považovaný za najsilnejšie doteraz v klinickej praxi používané uterotonikum.

Zatiaľ čo niektoré štúdie (Magraner et al., 1998; Patak et al., 2000; Hamlin et al., 2000) predpokladajú dominantnú úlo-hu selektívnych NK2 receptorov v kontrak-tilite myometria maternice, v našej štúdii boli rozdiely v participácii jednotlivých podtypov neurokinínových receptorov len minimálne. Domnievame sa, že v termíne pôrodu v humánnom gravidnom myomet-riu, nami sledované tachykiníny nevykazo-vali selektivitu voči uvedeným neurokiní-novým receptorom NK1, NK2 a NK3, čo by vysvetľovalo približne rovnakú stimulačnú intenzitu ich účinku. Práca bola realizovaná za podpory projektu ESF - „Zvýšenie možností kariérneho rastu vo výskume a vývoji v oblasti lekárskych vied”, VEGA 1/0127/13 a VEGA 1/0062/11. Zoznam použitej literatúry 1. Barr AJ, Watson SP, Lopez Bernal A, Nimmo

AJ. The presence of NK3 tachykinin receptors on rat uterus. Eur J Pharmacol 1991; 203: 287-290.

2. Crane LH, Williams MJ, Nimmo AJ, Hamlin GP. Estrogen-dependent regulation of neurokinin 3 receptor-mediated uterine contractility in the rat. Biol Reprod 2002; 67: 1480-1487.

3. Gerard NP, Bao L, Xiao-Ping H, Gerard C. Mo-lecular aspects of the tachykinin receptors. Regul Pept 1993; 43: 21-35.

4. Guard S, Watson SP. Tachykinin receptor types: classification and transmembrane sig-naling mechanisms. Neurochem Int 1991; 18: 149-166.

5. Hamlin GP, Williams MJ, Nimmo AJ, Crane LH. Hormonal variation of rat uterine contractile responsiveness to selective neurokinin recep-

tor agonists. Biol Reprod 2000; 62: 1661-1666.

6. Heinrich D, Reinecke M, Forssmann WG. Pep-tidergic innervation of the human and guinea pig uterus. Arch Gynecol 1986; 237: 213-219.

7. Huang WM, Gu J, Blank MA, Allen JM, Bloom SR, Polak JM. Peptide-immunoreactive nerves in the mammalian female genital tract. Histo-chem J 1984; 16: 1297-1310.

8. Krause JE, Blount P, Sachais BS. Molecular biology of receptors. Structures, expression and regulatory mechanisms. In: Buck SH (ed) The tachykinin receptors, Tolowa: Humana Press, 1994; 165-218.

9. Maggi CA. The mammalian tachykinin recep-tors. Gen Pharmacol 1995; 26: 911-944.

10. Magraner J, Pinto FM, Anselmi E, Hernandez M, Perez-Afonso R, Martin JD, Advenier C, Candenas ML. Characterization of tachykinin receptors in the uterus of the oestrogen-primed rat. Brit J Pharm 1998; 123: 259-268.

11. Otsuka M, Yoshioka K. Neurotransmitter func-tions of mammalian tachykinins. Physiol Rev 1993; 73: 229-308.

12. Page NM, Woods RJ, Gardiner SM, Lomthai-song K, Gladwell RT, Butlin DJ, Manyonda IT, Lowry PJ. Excessive placental secretion of neurokinin B during the third trimester causes pre-eclampsia. Nature 2000; 405: 797-800.

13. Patak EN, Ziccone S, Story ME, Fleming AJ, Lilley A, Pennefather JN. Activation of neu-rokinin NK2 receptors by tachykinin peptides causes contraction of uterus in pregnant women near term. Mol Human Reprod 2000; 6: 549-554.

14. Patak E, Pennefather JN, Fleming A, Story ME. Functional characterization of tachykinin NK1 receptors in the mouse uterus. Brit J Pharma-col 2002; 137: 1247-1254.

15. Patak E, Candenas L, Pennefather JN, Ziccone S, Lilley A, Martin JD, Flores C, Mantecon AG, Story ME, Pinto FM. Tachykinins and tachykinin receptors in human uterus. British J Pharmacol 2003; 139: 523-532.

16. Patak E, Pinto FM, Story ME, Pintado CO, Fleming A, Page NM, Pennefather JN, Cande-nas ML. Functional and molecular characteri-zation of tachykinins and tachykinin receptors in the mouse uterus. Biol Reprod 2005; 72: 1125-1133.

17. Pennefather JN, Zeng XP, Gould D, Hall S, Burcher E. Mammalian tachykinins stimulate rat uterus by activating NK-2 receptors. Pep-tides 1993; 14: 169-174.

18. Stratowa C, Machat H, Burger E, Himmler A, Schafer R, Spevak W, Weyer U, Wiche-Castanon M, Czernilofsky AP. Functional


61

characterization of the human neurokinin re-ceptors NK1, NK2, and NK3 based on a cellu-lar assay system. J Recept Signal Transduct Res 1995; 15: 617-630.

19. Traurig HH, Papka RE, Shew RL. Substance P and related peptides associated with the af-ferent and utonomic innervation of the uterus. Ann NY Acad Sci 1991; 632: 304-313.

Dobudovanie centra experimentálnej a klinickej respirológie (CEKR II)

„Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/Projekt je

spolufinancovaný zo zdrojov EÚ“

zborník prác - uniba.sk · 2014. 12. 4. · 3. skupie se aplikovali veselektív vy ihibítor no...

Documents