Zebrafish as a model system

In situ hybridization

Large clutches of embryos per mating, which are transparent throughout external development

Organogenesis advenced in 24h

RNA or antisense oligos microinjection

Rapid development

Mutagenesis screeninig

Analisi dell’espressione e della funzione del gene

dinamina1 (dnm1) durante lo sviluppo embrionale di

zebrafish (Danio rerio)

• Processo cellulare che permette alle cellule di assumere molecole di diversa natura dall’ambiente esterno, mediante movimenti della membrana

• può essere costitutiva o regolata da stimoli esterni (ligandi, virus….)

• classificazione sulla base della dimensione delle vescicole endocitotiche, sulla natura delle molecole internalizzate (ligandi, recettori, lipidi) e sulle modalità di formazione delle vescicole

Endocitosi

Endocitosi mediata da clatrina

Modalità di trasporto

vescicolare implicata nella comunicazione

intercellulare, nel recupero dei

neurotrasmettitori a livello del

terminale pre-sinaptico,

nell’internalizzazione di recettori,

fattori di crescita, antigeni e nutrienti

Endocitosi mediata da clatrina

In Drosophila melanogaster sono stati isolati mutanti temperatura sensibili del gene dnm1. A temperature non permissive si ha un fenotipo paralitico a causa del mancato recupero di neurotrasmettitori

• Lo stimolo elettrico arriva al terminale sinaptico

• Influsso di Ca2+

• esocitosi

• endocitosi mediata da clatrina

Invertebrati

• Drosophila melanogaster (shibire)

• C. elegans (dyn1)

Vertebrati

• Mus musculus (dnm1, dnm2, dnm3)

• Rattus norvegicus (dnm1, dnm2, dnm3)

• Homo sapiens (dnm1, dnm2, dnm3)

La famiglia delle dinamine (dnm)

La famiglia delle dinamine (dnm)

STOP1114 bp

1188 bp

1532

ORF 3’UTR5’UTR

67 2661

Identificazione del gene dnm1 di zebrafish

h dnm1

• Screening di database di sequenze EST di zebrafish

• 5’ RACE

Abbiamo ottenuto un clone di circa 2700 bp codificante per una proteina di 843 aminoacidi che presenta un’identità dell’80% con la proteina umana DNM1.

hDNM1 hDNM2 hDNM3

zDNM1 87% 76% 78%

zDNM2a 77% 85% 78%

zDNM2b 75% 82% 77%

zDNM3 72% 74% 75%

Geni dnm di zebrafishGeni dnm di zebrafish

nucleo

proteina

mRNAAUG5’UTR 3’UTR

AAAA

50s

30s

Il termine '''espressione genica''' indica il processo attraverso cui l'informazione

contenuta in un gene viene convertita in una proteina

Il termine '''espressione genica''' indica il processo attraverso cui l'informazione

contenuta in un gene viene convertita in una proteina

AAAA

AAAA

AAAA

gene1

gene2

gene3

mRNA 1mRNA 2

mRNA 3

AAAA

AAAA

gene1

gene2

gene3

mRNA 1mRNA 2

Cellula muscolare

Cellula nervosa

Espressione genica

• L’espressione di un gene può essere costitutiva o regolata nello spazio e nel tempo

• Equivalenza nucleare: i nuclei di tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso contenuto in termini di geni

cDNA1 cDNA2 cDNA1 cDNA2

cDNA3

ESTRAZIONE DELL’mRNA

RETRO-

TRASCRIZIONE

PCR

RT-PCR

IBRIDAZIONE IN SITU

ANALISI FUNZIONALE

ANALISI FUNZIONALE PER PERDITA DI FUNZIONE

Si inietta uno specifico morfolino, un oligonucleotide antisenso che si appaia al trascritto del gene target bloccando la traduzione.

ANALISI FUNZIONALE PER GUADAGNO DI FUNZIONE

RNA sintetizzato in vitro sulla regione codificante del gene d’interesseAUG AA

ANALISI FUNZIONALE

pcs2+ vector

• si testano diverse concentrazioni di morfolino o di RNA• vengono coiniettati traccianti vitali o RNA codificante per la proteina GFP allo scopo di verificare l’avvenuta iniezione• la microinezione viene eseguita nel tuorlo di embrioni fino allo stadio di 4 blastomeri • controlli: -embrioni non iniettati

-per morfolino si può usare morfolino STANDARD CONTROL allo scopo di dimostrare che i fenotipi

osservati nei morfanti non siano dovuti alla microiniezione in sé.

Sinapsi neuromuscolare

SNC

somite somiteNT

SNC

somiteNT

Primary motor neuron axons CaP (pink), MiP (blue), and RoP (green) exit the spinal cord through the ventral root and extend along the common pathway to the choice point (asterisk) located at the horizontal myoseptum as shown in the left myotomal segment. At the choice point, axons pause and then proceed to innervate a cell-appropriate territory. At later time points, MiP retracts its ventral axon, the dorsal MiP and ventral CaP axons reach the edge of the myotome and turn laterally, and RoP elaborates an axonal arbor laterally near the horizontal myoseptum as shown in the right myotomal segment. Beginning ca. 5 h after primary motor axons pioneer the common pathway, secondary motor axons (dark blue) exit the spinal cord and extend into the periphery as shown in the right myotomal segment

(Panzer et al., 2005)

SNC

SNC

C

A) defects in the activity of neuromuscolar synapses

B) defects in the axons pathfinding

somite

somite

Motility defects

Muscular defects

C

2 mutants with defects in neuromuscular synaptogenesis

Touch response defects

Hp: the loss of function of zdnm1 could limit the formation or the activity of CNS synapses and neuromuscolar synapses.

1. mutants with defects in the function of synaptic proteins involved in the control of synapse activity (acetylcholinesterase, acetylcholine receptor....)

PSDPSD

ctrl

Lower Dnm1 protein level after zdnm1-MO microinjection could limit neurotransmitters uptake decreasing endocytosis at presynaptic level.

dnm1-MO

We are analysing by electron microscopy the central nervous system of morphants, focusing on the number of synapses and the ultrastructure of presynaptic terminal.

synapse activity

semi-thin sections

(24 hpf, 48 hpf, 63 hpf, 90 hpf)

thin sections

(24 hpf, 48 hpf, 63 hpf, 90 hpf)

histological and cytological

analysis of somite structure

mutants with defects in the function of synaptic proteins involved in the control of synapse activity (acetylcholinesterase, acetylcholine receptor....)

motility defects

Defects in myofibrils organisation

nerve input works to refine the parameters that determine functional specialisation of the muscle.

Hp: the loss of function of zdnm1, could cause an impairment of nerve input that affects the myofibrils organisation

conclusions

• zdnm1 presents a temporally and spatially regulated expression pattern during zebrafish central nervous system development.

• the effects of zdnm1 knock down on motility and myofibrils organization in somite cells strongly suggest an important role of zDnm1 in formation and activity of neuromuscular synapses and synapses in central nervous system.

(Berghmans et al., 2005)

(Berghmans et al., 2005)

(Berghmans et al., 2005)

muscle cells development

PCR

• Metodica messa a punto da Kary Mullis (premio Nobel per la chimica,1993)

• Permette di amplificare una SPECIFICA sequenza di DNA

• Primer: oligonucleotidi con polarità 5’-3’ che fiancheggiano la sequenza che si vuole amplificare. Servono da innesco per la reazione di polimerizzazione catalizzata dalla Taq polimerasi

• Taq polimerasi: DNA polimerasi resistente al calore

5’

3’5’ 5’

5’3’

3’

3’

PCR

RT-PCR

Retrotrascrizione