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Zwei Methoden zur Zellzahlbestimmung von
Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae)
Andreas Tessarek, AG Meckenstock
02.03.16 1
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Ziel des Versuches
• Erlernen von zwei verschiedenen Methoden
der Zellzahlbestimmung und deren Vergleich
– Wie viele Hefezellen sind in 1 g handelsüblicher
Backhefe enthalten?
• Unterscheidung von Gesamtzellzahl und
Lebendzellzahl
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Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae)
• Actinomycet
Eukaryoten
• Zelldurchmesser von
4-8 µm
• fakultativ anaerob
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http://www.pmbio.icbm.de/mikrobiologischer-garten/de/dehef01.htm (01.03.16)
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Zellzahlbestimmung
Gesamtzellzahl (GZZ) :=
Anzahl der Mikroorganismen pro
Volumeneinheit (Zellen/mL); unabhängig davon,
ob sie vermehrungsfähig sind oder nicht
Thoma-Kammer
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Zellzahlbestimmung
Lebendzellzahl (LZZ) :=
Anzahl der vermehrungsfähigen Organismen pro
Volumeneinheit; wird in KBE angegeben
Plattengussverfahren
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Thoma-Kammer
(Aus: Bast, 2001)
Im Praktikum wird eine Thoma-Kammer mit einer Tiefe von 0.1 mm verwendet!
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Thoma-Kammer
(Aus: Bast, 2001)
http://vorsam.uni-ulm.de/vs/Versuche/O/Bilder/O_017B51.jpg (01.03.16)
Newton‘sche Ringe
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} a-Feld
{ b-Feld
c-Feld
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(Aus: Bast, 2001)
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Hinweise und Anmerkungen
• Thomakammer und zugehöriges Deckglas sind KEIN Einwegmaterial (desinfizieren), spülen und abtrocknen vorsichtig handhaben nur an den Kanten anfassen
• Verdünnung 10-1 und 10-2 gut auswertbar
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Plattengussverfahren
• Mittel zur Bestimmung der Lebendzellzahl
1. Erstellen einer seriellen Verdünnungsreihe (bis einschließlich 10-8)
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Plattengussverfahren
• Je 1 mL der Verdünnungsstufen 4 bis 8 in je eine beschriftete Petrischale geben
• Agar hinzugeben, Platte verschließen und vorsichtig durch achtförmige Bewegung miteinander vermischen
• 20 bis 30 min erstarren lassen
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Hinweise und Anmerkungen
• zügig, aber dennoch steril arbeiten
• Reagenzgläser sofort ausspülen
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Mutationsfrequenz
Andreas Tessarek, AG Meckenstock
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Ziel des Versuches
Bestimmung, wie häufig Mutationen zu einer Antibiotikaresistenz führen, wenn sie durch ein Mutagen induziert werden Bestimmung der Mutationsfrequenz Allgemeine Formel: Mutationsfrequenz = Mutanten/mL : KBE/mL
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Definitionen
• Mutation :=
Vererbte Veränderung in der Basensequenz (der DNA) eines Organismus
(Madigan et al., 2006)
• Mutante :=
Stamm, der sich von seinen Eltern durch eine Mutation unterscheidet
(Madigan et al., 2006)
• Mutagen :=
Agens, das Mutationen auslöst, z.B. ionisierende Strahlung oder Chemikalien
(Madigan et al., 2006)
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Mutationen
• Letalmutation:
vermindert die Leistungsfähigkeit des Organismus
• Neutrale Mutationen:
treten phänotypisch nicht in Erscheinung
• Positive Mutationen:
stellen einen Selektionsvorteil dar
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Mutationstypen
• Mutationen, die einen größeren DNA-Bereich betreffen
• Punktmutationen:
– Substitution: ATG GCC ACT ATT GCC ACT
– Deletion: ATG GCC ACT ATT GCC AC
– Insertion: ATG GCC ACT ATT GCT CAC T
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Eigenschaften von Mutationen
• zufällig
• beruhen auf endogenen Faktoren, z.B. Fehlern
bei der DNA-Replikation, DNA-Reparatur oder
DNA-Rekombination
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Mutagene
• erhöhen die Rate von Zufallsmutationen
• stellen einen Selektionsdruck dar
• Beispiele:
– Nalidixinsäure
– UV-Strahlung
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Hinweise und Anmerkungen
• Versuch wird von je einer Laborbank gemeinsam
durchgeführt Zeitmanagement
• Zentrifuge wird ausschließlich von Betreuern bedient
• Ausplattieren wird vor Ort gezeigt
• Verdünnungsreihe:
0.5 mL Bakteriensuspension + 4.5 mL NaCl-Lösung
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