一．教学内容 1. 色谱法的历史及分类2.色谱法的分离原理3.薄层色谱法4.纸色谱法

一．教学内容 1. 色谱法的历史及分类2.色谱法的分离原理3.薄层色谱法4.纸色谱法

二．重点与难点 1. 色谱法的分离原理2.薄层色谱法的基本原理及操作，定性、定量分析

二．重点与难点 1. 色谱法的分离原理2.薄层色谱法的基本原理及操作，定性、定量分析

第十六章 液相色谱法

三．教学目标1. 掌握色谱分析法的分离原理2.掌握薄层色谱法比移值的计算3.了解色谱分析法的分类四 .学时安排 5学时

三．教学目标1. 掌握色谱分析法的分离原理2.掌握薄层色谱法比移值的计算3.了解色谱分析法的分类四 .学时安排 5学时

第十六章 液相色谱法

俄国植物学家 Tswett 于 1901 年发现：利用吸附原理分离植物色素

流动相：石油醚 固定相：碳酸钙实质：使各组分得以分离。根据混合物各组分在固定相和流动相中吸附差异，使各组分在色谱柱中的迁移速度不同而获得分离。

（一）色谱法的历史

第一节 概述

1938年 Izmailov 发明薄层色谱

1944年 Consden,Gordon & Martin 发明纸色谱

1952年Martin & Synge 发明气 -液色谱

1953年 Janak发明气 -固色谱

1957年Martin & Golay 发明毛细管色谱

1960年液相色谱技术完善

1954年我国研究成功第一台色谱仪

流动相：固体、液体固定相：气体、液体色谱柱：起分离作用

色谱法的实质：根据混合物各组分在固定相和流动相中吸附、脱附、溶解、析出或其它亲和力和渗透性的差异，使各组分在色谱柱中的迁移速度不同而获得分离。

二、色谱法的分类1.按物理状态分类根据流动相的物态：气相色谱法 (GC) 和液相色谱法 (LC) 超临界流体色谱法根据固定相的物态：气 -固色谱法、气 -液色谱法 液 -固色谱法、液 -液色谱法2.按操作形式分类(1) 柱色谱法 (2) 平面色谱法 (3) 毛细管电泳法 3. 按分离机理分类

(1) 吸附色谱 (2) 分配色谱 (3) 离子交换色谱

(4) 空间排阻色谱

三、色谱法分离原理

1. 分离原理 吸附 -解吸 - 再吸附 -再解吸的过程

吸附能力弱的的组分在柱中迁移速度快，先流出色谱柱吸附能力强的的组分在柱中迁移速度慢，后流出色谱柱

2. 分配系数与保留行为的关系

m

s

C

CK

)1(0m

sR V

VKtt

K 值与组分的性质、固定相和流动相的性质及温度有关

K 值小， tR 小，在固定相上保留时作用弱，迁移速度快，先流出色谱柱 K 值大， tR 大，在固定相上保留时作用强，迁移速度慢，后流出色谱柱

分配系数不等是分离的前提。

3.K 值在四种类型色谱法中的含义

分配色谱法： K表示分配系数吸附色谱法： K表示吸附平衡常数离子交换色谱法： K表示交换系数空间排阻色谱法： K表示渗透系数

四、色谱法的特点(1) 高选择性 (2) 高效能 (3) 高灵敏度

五、色谱法的应用(1) 色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析；

(2) 色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，常用于制备分离，得到高纯样品。

(3) 色谱—质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。

吸附色谱：利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。

第二节 柱色谱法一、 液 -固吸附柱色谱法

1. 分离原理 吸附 -解吸 - 再吸附 -再解吸的过程

吸附能力弱的的组分在柱中迁移速度快，先流出色谱柱吸附能力强的的组分在柱中迁移速度慢，后流出色谱柱

分配系数与保留行为的关系

m

s

C

CK

K 值小， Cs 小，在固定相上保留时作用弱，迁移速度快，先流出色谱柱 K 值大， Cs 大，在固定相上保留时作用强，迁移速度慢，后流出色谱柱

K 与组分性质，固定相和流动相的性质、温度有关。一定条件下， K在低温下为常数，

要求：具有较大的吸附表面和一定的吸附能力，颗粒应有一定的细度且粒度要均匀     常用吸附剂：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭

2.吸附剂的选择

（ 1） 硅胶（ SiO2·XH2O ）

结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构 表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心

特性： 1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键 物质极性↑，吸附能力↑→强极性吸附中心，不易洗脱 吸附活性次序：活泼型 > 束缚型 > 游离型 2）吸水→失活 →105 ～ 110OC烘干 30分钟 (可逆失水 )→吸附力最大 →500OC烘干 ( 不可逆失水 )→活性丧失，无吸附力

适用：适用：分析酸性或中性物质

（ 2） 氧化铝碱性氧化铝 pH 9 ～ 10 适于分析碱性、中性物质中性氧化铝 pH＞ 7.5 适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝 pH 4～ 5 适于分析酸性、中性物质

      分离极性小的物质，选用活度大的吸附剂，吸附能力强，以免保留程度太小，难以分离。

       硅胶与氧化铝的活性分为五级。含水量越少，活度越大，吸附能力越强。

常用Ⅱ、Ⅲ

3. 色谱分离条件的选择

（ 1） 被测组分性质（极性大小）：     烷烃＜烯烃 ＜卤代烃＜醚＜硝基化合物＜叔胺＜酯＜酮＜醛＜酰胺 ＜羧酸，醇 

（ 2） 吸附剂的活性：    吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强     强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂（ 3） 流动相的极性：     流动相极性↑大，对被测组分的洗脱能力↑大 “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活性， 选择适当极性的流动相

（ 4） 三者关系：  组分 吸附剂 流动相 极性 活性小 极性 非 (弱 )极性 活性大 非极性或弱极性

流动相极性递增的次序

石油醚 < 环己烷 <四氯化碳 < 苯 <甲苯 <乙醚 < 氯仿 <醋酸乙酯 <正丁醇 < 丙酮 <乙醇 < 甲醇 < 水

二、 液 -液分配柱色谱法  1. 原理 以液体作为固定相和流动相，利用被分离物质组分在固定相和流动相中的溶解度不同，造成分配系数上的差异而实现分离的色谱方法。

m

s

C

CK

2.载体（支持剂）：硅胶、硅藻土及纤维素等 固体相 : 水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等极性溶剂

K 为分配系数

K越大，保留时间越长，后流出K越小，保留时间越短，先流出

4. 按洗脱顺序： 正相分配色谱法：极性弱的组分先被洗脱，极性强的组分后被洗脱 反相分配色谱法：极性强的组分先被洗脱，极性弱的组分后被洗脱

3.分类：正相分配色谱法和反相分配色谱法正相分配色谱法：流动相的极性小于固定相的极性反相分配色谱法：流动相的极性大于固定相的极性

     反相色谱：固定相：石蜡油，化学键合相（如十八烷基硅胶键合相）流动相：水、甲醇、乙腈等强极性有机溶剂洗脱顺序：极性大，先出柱；极性小，后出柱。应用：适合于脂溶性成分，如高级脂肪酸、油脂

   正相色谱： 固定相：水、缓冲溶液 流动相：氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂 洗脱顺序：极性小的化合物先出柱，极性大的后出柱 应用：适用于水溶性或极性较大的化合 物，如生物碱、 苷、糖类、有机酸等。

三、离子交换色谱法：1.原理：可交换离子与树脂上的交换基团进行离子交换，并被吸附，用适当的溶剂从柱上洗脱下来，实现物质的分离。

2.固定相：离子交换树脂 （ 1） .分类：a.阳离子交换树脂 强酸性阳离子交换树脂（ R—SO3H ） 弱酸性阳离子交换树脂（ R—OH ）

HNaRSONaHRSO

nHMRSOMHnRSO nn

33

33 )(

酚羟基在 pH>9.5羟基 pH>4

树脂可以再生

b.阴离子交换树脂   强碱性阴离子交换树脂 [R-N （ CH3） +

3OH-]   弱碱性阴离子交换树脂

）、、 OHCHNHROHCHNHROHCHNR 233233 )()()((

 （ 2）吸附规律 阳离子交换树脂——分离碱性成分 阴离子交换树脂——分离酸性成分

OHClCHNHRClOHCHNHR 2323 )()(

（ 3）洗脱液：稀酸或稀碱溶液

（二）离子交换树脂的性能 1. 交联度：树脂中交联剂的含量。以重量百分数表示。 交联度高，孔隙小，，交换速度慢。 一般选择交联度较高的树脂。 阳离子交换树脂常用 8%交联度，阴离子交换树脂常用 4%交联度。

2. 交换容量：每克干树脂所含酸性或碱性基团的数目。 单位： mmol/g 或 mmol/ml

一般为 1~10 mmol/g

（三）离子交换平衡

BARABR

sm

smBA

BA

ABK

/

B

ABA K

KK /

KA/B>1 时 , 说明树脂对 A 比对 B有更大的亲和力。

树脂对离子的选择性大小：1.离子浓度相同时，优先选择具有较高电荷的离子

2. 对同价离子的亲和力，随着原子量增大而增大

NaCaFeTh 234

2222 BaSrCaMg

四、间排阻色谱法 空间排阻色谱法也称凝胶色谱法，是一种根据试样分子的尺寸大小进行分离的色谱技术。1. 原理     空间排阻色谱的色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。       对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔甚至于完全被排斥。小个的组分分子，大孔小孔都可以渗入，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗脱出来，它的洗脱体积很小，小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，完成按分子大小而分离的洗脱过程。

2.凝胶的结构与选择

葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶

交联度大，孔隙小，吸水小，膨胀少，适于小分子物质的分离交联度小，孔隙大，吸水多，膨胀大，适于大分子物质的分离

   凝胶在使用前，应在流动相溶剂中浸泡，使其充分溶胀，然后充分装入色谱柱中。

特点：分离效能高，斑点集中 灵敏度高 展开快 仪器简单，操作方便

第三节 薄层色谱法        将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法。进行色谱分离和分析的方法。

分类：吸附薄层色谱法 分配薄层色谱法离子交换色谱法 排阻薄层色谱法

固定相为吸附剂的薄层色谱。利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 固定相为液体，吸留在载体上的薄层色谱。利用被分离组分在固定相与流动相中的分  配系数不同而被分离。

    一、分离原理一、分离原理

当流动相不断地流过吸附剂时，由于吸附剂对不同组分有不同的吸附力，组分在运行中会被吸附、解吸附、再吸附、再解吸，经过一段时间的展开，各组分在板上的运行速度不同而分离。

0L

LR f

原点到溶剂前沿的距离心的距离原点到组分斑点质量中

比移值与相对比移值1. 比移值 Rf(retardation factor； Rf)

Rf范围：              0< Rf <1

Rf = 0.2~0.8（常用） Rf = 0.3~0.5（最佳）

2. 相对比移值 Rr

s

i

sf

if

L

L

R

RRr

的距离原点到参考物斑点中心距离原点到组分斑点中心的

）（

）（

L0

L1

L2

0

11L

LR f

0

22L

LR f

比移值

例 1 ：化合物 A 在薄层板上从原点迁移 7.6cm ，溶剂前沿距原点 16.2cm ，（ 1 ）计算化合物 A 的 Rf 。（ 2 ）在相同的薄层色谱展开系统中，溶剂前沿距原点 14.3cm ，化合物 A 的斑点应在此薄板何处？

cmf

RLL

L

LRf

72.647.03.140

47.02.16

6.7

0

解：

例 2 ：样品和标准品经过薄层分离后，样品斑点中心距原点 9.0cm ，标准品斑点中心距离原点 7.5cm ，展开剂前沿距原点 15cm ，试求样品及标准品的 Rf值和 Rr 值？

2.15.0

6.0

5.00.15

5.7

0

2

6.00.15

0.9

0

1

标准品

样品

标准品

样品

Rf

RfRr

L

LRf

L

LRf

解：

二、吸附剂与展开剂

( 一）吸附剂1. 硅胶：硅胶 H 、硅胶 G 、硅胶 HF254

2. 氧化铝：可分为中性（ pH7.5) 、碱性（ pH9.0 ）和酸（ pH4.0） （二）展开剂     

按极性由弱到强： 石油醚 < 环己烷 <二硫化碳 <四氯化碳 <三氯乙烷<苯 <甲苯 <二氯甲烷 <乙醚 < 氯仿 <乙酸乙酯 <正丁醇 < 丙酮 <乙醇 < 甲醇 < 吡啶 <酸 < 水

Rf值在 0.2-0.8Rf值都较小 , 靠近原点 , 可增大展开剂的极性Rf值都较大 , 靠近溶剂前沿 ,可减小展开剂的极性

（三）吸附剂与展开剂的选择

展开剂的选择： 根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性

 吸附剂的选择：

根据被测物极性和吸附剂的吸附能力 被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂

酸性物质：甲酸、醋酸、磷酸和草酸碱性物质：二乙胺、氨水和吡啶

四、操作方法

定性分析——18cm×6cm 制备纯品——20cm×20cm 硅胶 G——自含粘合剂硅胶 H—— 不含粘合剂，铺板时另加入 CMC-Na

硅胶 GF254—— 含荧光剂， 254nm紫外光照发绿光硅胶 FH365—— 含荧光剂， 365nm紫外光照发光

（一）薄层板的制备

硬板制备方法：1.倾注法2.括平法3.涂铺器法

（二）活化 105℃活化 1h,置于干燥器中备用。（三）点样：用毛细管或微量注射器， 0.5-1mm

点样位置距薄层底边 1.5-2cm处（四）展开：在密闭的色谱缸中进行 展开操作时应注意的事项： 1. 色谱缸密闭性能好。 2.注意防止边缘效应。 3.将薄板下端浸入展开剂中展开时，薄板上的点样点不 得浸入展开剂中。 4. 在展开过程中注意恒温恒湿。 边缘效应是指同一物质的斑点在同一薄板上出现的两边缘部分的 Rf 值大于中间部分的 Rf 值的现象。 展开之前，先将展开剂预饱和 15min 或在展开装置的内壁贴上浸湿了展开剂的滤纸。

展开：层析缸，预饱和，防止边缘效应，浸入展开剂深度 0.51.0cm ，展开至整板 3/4距离 , 标记。

1 , 2 样品 3 标准品

前沿

原点 • • •1.5-2.0cm2.0cm

1 2 3

（五）显色方法：1.具有荧光的物质及少数紫外吸收的物质在紫外灯 (254 、365nm)检测

2. 具有紫外吸收的物质采用荧光薄层板检测3.显色剂显色通用型显色剂：硫酸、碘专用型显色剂：茚三酮用于氨基酸的显色 三氯化铁 -铁氰化钾用于含酚羟基化合物的显色

四、定性和定量分析

定性分析——利用Rf值，与对照品的 Rf值比较，同时在 一块薄层板上进行。也可采用相对比移值定性。

定量分析——斑点洗脱测量法，目视比较法，薄层扫描法

薄层扫描法

      薄层扫描法是用一定强度光束照射薄层上的斑点，用仪器测量照射前后光束强度的变化，从而求得物质含量的方法。

      检测方法  吸收测定法和荧光测定法        测量方法  投射法和反射法      扫描方式  单波长和双波长      定量方法  外标两点法定量

第四节  纸色谱法一、基本原理 以纸做载体的色谱法

固定相：纸纤维吸附的水 流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇） 分离机制：同液 -液分配色谱 定性参数： fR

各组分在固定相和流动相之间进行分配时，由于各组分分配系数的不同，使各组分的迁移速率不同，使之分离。

例 3 ：用纸色谱分离由 A 、 B两组分组成的混合溶液，已知它们的 Rf 值分别为 0.45 、 0.63 ，欲使分离后两斑点中心距离不小于 2cm ，问滤纸最少要多长？

1145.0

50

5

45.0

63.02

ARf

AL

L

cmxA

RfB

Rf

x

x

解：设 A 组分斑点到原点的距离为 Xcm

滤纸最少要 13cm

1. 组分性质 化合物极性大或亲水性强，组分 K值大， Rf小 化合物极性小或亲脂性强，组分 K值小， Rf大2.pH 离解度越大，极性越强，引起组分 K的变化3.温度4.纸的性质5.展开的距离 展开距离↑， Rf ↑） 展开距离↓ ， Rf ↓）

二、影响比移值的主要因素

三、实验条件的选择1.色谱滤纸的选择具备条件：表面洁白无污点，杂质少 有一定的机械强度 纸质均匀，边缘整齐 纸纤维松紧适宜2. 固定相的选择

极性小的物质：甲酰胺或二甲基甲酰胺、丙二醇作固定相极性大的物质：吸附纤维上的水作固定相 纸纤维起到一个惰性载体的作用

3.展开剂的选择含水的有机溶剂常用的展开剂：水饱和过的正丁醇、正戊醇、酚

四、操作步骤 选纸 →点样 → 展开 →显色 (定性 )/洗脱(定量 )

五、应用