一.教学内容 1. 色谱法的历史及分类2.色谱法的分离原理3.薄层色谱法4.纸色谱法
一.教学内容 1. 色谱法的历史及分类2.色谱法的分离原理3.薄层色谱法4.纸色谱法
二.重点与难点 1. 色谱法的分离原理2.薄层色谱法的基本原理及操作,定性、定量分析
二.重点与难点 1. 色谱法的分离原理2.薄层色谱法的基本原理及操作,定性、定量分析
第十六章 液相色谱法
三.教学目标1. 掌握色谱分析法的分离原理2.掌握薄层色谱法比移值的计算3.了解色谱分析法的分类四 .学时安排 5学时
三.教学目标1. 掌握色谱分析法的分离原理2.掌握薄层色谱法比移值的计算3.了解色谱分析法的分类四 .学时安排 5学时
第十六章 液相色谱法
俄国植物学家 Tswett 于 1901 年发现:利用吸附原理分离植物色素
流动相:石油醚 固定相:碳酸钙实质:使各组分得以分离。根据混合物各组分在固定相和流动相中吸附差异,使各组分在色谱柱中的迁移速度不同而获得分离。
(一)色谱法的历史
第一节 概述
1938年 Izmailov 发明薄层色谱
1944年 Consden,Gordon & Martin 发明纸色谱
1952年Martin & Synge 发明气 -液色谱
1953年 Janak发明气 -固色谱
1957年Martin & Golay 发明毛细管色谱
1960年液相色谱技术完善
1954年我国研究成功第一台色谱仪
二、色谱法的分类1.按物理状态分类根据流动相的物态:气相色谱法 (GC) 和液相色谱法 (LC) 超临界流体色谱法根据固定相的物态:气 -固色谱法、气 -液色谱法 液 -固色谱法、液 -液色谱法2.按操作形式分类(1) 柱色谱法 (2) 平面色谱法 (3) 毛细管电泳法 3. 按分离机理分类
(1) 吸附色谱 (2) 分配色谱 (3) 离子交换色谱
(4) 空间排阻色谱
2. 分配系数与保留行为的关系
m
s
C
CK
)1(0m
sR V
VKtt
K 值与组分的性质、固定相和流动相的性质及温度有关
K 值小, tR 小,在固定相上保留时作用弱,迁移速度快,先流出色谱柱 K 值大, tR 大,在固定相上保留时作用强,迁移速度慢,后流出色谱柱
分配系数不等是分离的前提。
四、色谱法的特点(1) 高选择性 (2) 高效能 (3) 高灵敏度
五、色谱法的应用(1) 色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析;
(2) 色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术,常用于制备分离,得到高纯样品。
(3) 色谱—质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。
吸附色谱:利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同,用溶剂或气体洗脱,以使组分分离。
第二节 柱色谱法一、 液 -固吸附柱色谱法
1. 分离原理 吸附 -解吸 - 再吸附 -再解吸的过程
吸附能力弱的的组分在柱中迁移速度快,先流出色谱柱吸附能力强的的组分在柱中迁移速度慢,后流出色谱柱
分配系数与保留行为的关系
m
s
C
CK
K 值小, Cs 小,在固定相上保留时作用弱,迁移速度快,先流出色谱柱 K 值大, Cs 大,在固定相上保留时作用强,迁移速度慢,后流出色谱柱
K 与组分性质,固定相和流动相的性质、温度有关。一定条件下, K在低温下为常数,
要求:具有较大的吸附表面和一定的吸附能力,颗粒应有一定的细度且粒度要均匀 常用吸附剂:硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭
2.吸附剂的选择
( 1) 硅胶( SiO2·XH2O )
结构:内部——硅氧交联结构→多孔结构 表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心
特性: 1)与极性物质或不饱和化合物形成氢键 物质极性↑,吸附能力↑→强极性吸附中心,不易洗脱 吸附活性次序:活泼型 > 束缚型 > 游离型 2)吸水→失活 →105 ~ 110OC烘干 30分钟 (可逆失水 )→吸附力最大 →500OC烘干 ( 不可逆失水 )→活性丧失,无吸附力
适用:适用:分析酸性或中性物质
( 2) 氧化铝碱性氧化铝 pH 9 ~ 10 适于分析碱性、中性物质中性氧化铝 pH> 7.5 适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝 pH 4~ 5 适于分析酸性、中性物质
分离极性小的物质,选用活度大的吸附剂,吸附能力强,以免保留程度太小,难以分离。
硅胶与氧化铝的活性分为五级。含水量越少,活度越大,吸附能力越强。
常用Ⅱ、Ⅲ
3. 色谱分离条件的选择
( 1) 被测组分性质(极性大小): 烷烃<烯烃 <卤代烃<醚<硝基化合物<叔胺<酯<酮<醛<酰胺 <羧酸,醇
( 2) 吸附剂的活性: 吸附剂的活性↑大,对被测组分的吸附能力↑强 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂( 3) 流动相的极性: 流动相极性↑大,对被测组分的洗脱能力↑大 “相似相溶”原则 :根据组分性质、吸附剂的活性, 选择适当极性的流动相
( 4) 三者关系: 组分 吸附剂 流动相 极性 活性小 极性 非 (弱 )极性 活性大 非极性或弱极性
流动相极性递增的次序
石油醚 < 环己烷 <四氯化碳 < 苯 <甲苯 <乙醚 < 氯仿 <醋酸乙酯 <正丁醇 < 丙酮 <乙醇 < 甲醇 < 水
二、 液 -液分配柱色谱法 1. 原理 以液体作为固定相和流动相,利用被分离物质组分在固定相和流动相中的溶解度不同,造成分配系数上的差异而实现分离的色谱方法。
m
s
C
CK
2.载体(支持剂):硅胶、硅藻土及纤维素等 固体相 : 水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等极性溶剂
K 为分配系数
K越大,保留时间越长,后流出K越小,保留时间越短,先流出
4. 按洗脱顺序: 正相分配色谱法:极性弱的组分先被洗脱,极性强的组分后被洗脱 反相分配色谱法:极性强的组分先被洗脱,极性弱的组分后被洗脱
3.分类:正相分配色谱法和反相分配色谱法正相分配色谱法:流动相的极性小于固定相的极性反相分配色谱法:流动相的极性大于固定相的极性
反相色谱:固定相:石蜡油,化学键合相(如十八烷基硅胶键合相)流动相:水、甲醇、乙腈等强极性有机溶剂洗脱顺序:极性大,先出柱;极性小,后出柱。应用:适合于脂溶性成分,如高级脂肪酸、油脂
正相色谱: 固定相:水、缓冲溶液 流动相:氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂 洗脱顺序:极性小的化合物先出柱,极性大的后出柱 应用:适用于水溶性或极性较大的化合 物,如生物碱、 苷、糖类、有机酸等。
三、离子交换色谱法:1.原理:可交换离子与树脂上的交换基团进行离子交换,并被吸附,用适当的溶剂从柱上洗脱下来,实现物质的分离。
2.固定相:离子交换树脂 ( 1) .分类:a.阳离子交换树脂 强酸性阳离子交换树脂( R—SO3H ) 弱酸性阳离子交换树脂( R—OH )
HNaRSONaHRSO
nHMRSOMHnRSO nn
33
33 )(
酚羟基在 pH>9.5羟基 pH>4
树脂可以再生
b.阴离子交换树脂 强碱性阴离子交换树脂 [R-N ( CH3) +
3OH-] 弱碱性阴离子交换树脂
)、、 OHCHNHROHCHNHROHCHNR 233233 )()()((
( 2)吸附规律 阳离子交换树脂——分离碱性成分 阴离子交换树脂——分离酸性成分
OHClCHNHRClOHCHNHR 2323 )()(
( 3)洗脱液:稀酸或稀碱溶液
(二)离子交换树脂的性能 1. 交联度:树脂中交联剂的含量。以重量百分数表示。 交联度高,孔隙小,,交换速度慢。 一般选择交联度较高的树脂。 阳离子交换树脂常用 8%交联度,阴离子交换树脂常用 4%交联度。
2. 交换容量:每克干树脂所含酸性或碱性基团的数目。 单位: mmol/g 或 mmol/ml
一般为 1~10 mmol/g
四、间排阻色谱法 空间排阻色谱法也称凝胶色谱法,是一种根据试样分子的尺寸大小进行分离的色谱技术。1. 原理 空间排阻色谱的色谱柱的填料是凝胶,它是一种表面惰性,含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。 对不同大小的组分分子,可分别渗入到凝胶孔内的不同深度,大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内,但进不了小孔甚至于完全被排斥。小个的组分分子,大孔小孔都可以渗入,甚至进入很深,一时不易洗脱出来。因此,大的组分分子在色谱柱中停留时间较短,很快被洗脱出来,它的洗脱体积很小,小的组分分子在色谱柱中停留时间较长,洗脱体积较大,直到所有孔内的最小分子到达柱出口,完成按分子大小而分离的洗脱过程。
2.凝胶的结构与选择
葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶
交联度大,孔隙小,吸水小,膨胀少,适于小分子物质的分离交联度小,孔隙大,吸水多,膨胀大,适于大分子物质的分离
凝胶在使用前,应在流动相溶剂中浸泡,使其充分溶胀,然后充分装入色谱柱中。
特点:分离效能高,斑点集中 灵敏度高 展开快 仪器简单,操作方便
第三节 薄层色谱法 将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上,形成薄层而将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上,形成薄层而进行色谱分离和分析的方法。进行色谱分离和分析的方法。
分类:吸附薄层色谱法 分配薄层色谱法离子交换色谱法 排阻薄层色谱法
固定相为吸附剂的薄层色谱。利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 固定相为液体,吸留在载体上的薄层色谱。利用被分离组分在固定相与流动相中的分 配系数不同而被分离。
0L
LR f
原点到溶剂前沿的距离心的距离原点到组分斑点质量中
比移值与相对比移值1. 比移值 Rf(retardation factor; Rf)
Rf范围: 0< Rf <1
Rf = 0.2~0.8(常用) Rf = 0.3~0.5(最佳)
2. 相对比移值 Rr
s
i
sf
if
L
L
R
RRr
的距离原点到参考物斑点中心距离原点到组分斑点中心的
)(
)(
例 1 :化合物 A 在薄层板上从原点迁移 7.6cm ,溶剂前沿距原点 16.2cm ,( 1 )计算化合物 A 的 Rf 。( 2 )在相同的薄层色谱展开系统中,溶剂前沿距原点 14.3cm ,化合物 A 的斑点应在此薄板何处?
cmf
RLL
L
LRf
72.647.03.140
47.02.16
6.7
0
解:
例 2 :样品和标准品经过薄层分离后,样品斑点中心距原点 9.0cm ,标准品斑点中心距离原点 7.5cm ,展开剂前沿距原点 15cm ,试求样品及标准品的 Rf值和 Rr 值?
2.15.0
6.0
5.00.15
5.7
0
2
6.00.15
0.9
0
1
标准品
样品
标准品
样品
Rf
RfRr
L
LRf
L
LRf
解:
二、吸附剂与展开剂
( 一)吸附剂1. 硅胶:硅胶 H 、硅胶 G 、硅胶 HF254
2. 氧化铝:可分为中性( pH7.5) 、碱性( pH9.0 )和酸( pH4.0) (二)展开剂
按极性由弱到强: 石油醚 < 环己烷 <二硫化碳 <四氯化碳 <三氯乙烷<苯 <甲苯 <二氯甲烷 <乙醚 < 氯仿 <乙酸乙酯 <正丁醇 < 丙酮 <乙醇 < 甲醇 < 吡啶 <酸 < 水
Rf值在 0.2-0.8Rf值都较小 , 靠近原点 , 可增大展开剂的极性Rf值都较大 , 靠近溶剂前沿 ,可减小展开剂的极性
(三)吸附剂与展开剂的选择
展开剂的选择: 根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性
吸附剂的选择:
根据被测物极性和吸附剂的吸附能力 被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
酸性物质:甲酸、醋酸、磷酸和草酸碱性物质:二乙胺、氨水和吡啶
四、操作方法
定性分析——18cm×6cm 制备纯品——20cm×20cm 硅胶 G——自含粘合剂硅胶 H—— 不含粘合剂,铺板时另加入 CMC-Na
硅胶 GF254—— 含荧光剂, 254nm紫外光照发绿光硅胶 FH365—— 含荧光剂, 365nm紫外光照发光
(一)薄层板的制备
硬板制备方法:1.倾注法2.括平法3.涂铺器法
(二)活化 105℃活化 1h,置于干燥器中备用。(三)点样:用毛细管或微量注射器, 0.5-1mm
点样位置距薄层底边 1.5-2cm处(四)展开:在密闭的色谱缸中进行 展开操作时应注意的事项: 1. 色谱缸密闭性能好。 2.注意防止边缘效应。 3.将薄板下端浸入展开剂中展开时,薄板上的点样点不 得浸入展开剂中。 4. 在展开过程中注意恒温恒湿。 边缘效应是指同一物质的斑点在同一薄板上出现的两边缘部分的 Rf 值大于中间部分的 Rf 值的现象。 展开之前,先将展开剂预饱和 15min 或在展开装置的内壁贴上浸湿了展开剂的滤纸。
展开:层析缸,预饱和,防止边缘效应,浸入展开剂深度 0.51.0cm ,展开至整板 3/4距离 , 标记。
1 , 2 样品 3 标准品
前沿
原点 • • •1.5-2.0cm2.0cm
1 2 3
(五)显色方法:1.具有荧光的物质及少数紫外吸收的物质在紫外灯 (254 、365nm)检测
2. 具有紫外吸收的物质采用荧光薄层板检测3.显色剂显色通用型显色剂:硫酸、碘专用型显色剂:茚三酮用于氨基酸的显色 三氯化铁 -铁氰化钾用于含酚羟基化合物的显色
薄层扫描法
薄层扫描法是用一定强度光束照射薄层上的斑点,用仪器测量照射前后光束强度的变化,从而求得物质含量的方法。
检测方法 吸收测定法和荧光测定法 测量方法 投射法和反射法 扫描方式 单波长和双波长 定量方法 外标两点法定量
第四节 纸色谱法一、基本原理 以纸做载体的色谱法
固定相:纸纤维吸附的水 流动相:与水不互溶的有机溶剂(饱和正丁醇) 分离机制:同液 -液分配色谱 定性参数: fR
各组分在固定相和流动相之间进行分配时,由于各组分分配系数的不同,使各组分的迁移速率不同,使之分离。
例 3 :用纸色谱分离由 A 、 B两组分组成的混合溶液,已知它们的 Rf 值分别为 0.45 、 0.63 ,欲使分离后两斑点中心距离不小于 2cm ,问滤纸最少要多长?
1145.0
50
5
45.0
63.02
ARf
AL
L
cmxA
RfB
Rf
x
x
解:设 A 组分斑点到原点的距离为 Xcm
滤纸最少要 13cm
1. 组分性质 化合物极性大或亲水性强,组分 K值大, Rf小 化合物极性小或亲脂性强,组分 K值小, Rf大2.pH 离解度越大,极性越强,引起组分 K的变化3.温度4.纸的性质5.展开的距离 展开距离↑, Rf ↑) 展开距离↓ , Rf ↓)
二、影响比移值的主要因素
三、实验条件的选择1.色谱滤纸的选择具备条件:表面洁白无污点,杂质少 有一定的机械强度 纸质均匀,边缘整齐 纸纤维松紧适宜2. 固定相的选择
极性小的物质:甲酰胺或二甲基甲酰胺、丙二醇作固定相极性大的物质:吸附纤维上的水作固定相 纸纤维起到一个惰性载体的作用