Онкогематология 2013 год № 1
DESCRIPTION
Молекулярный мониторинг хронического миелолейкоза Характеристики острого миелоидного лейкоза у детей первого года жизниСовременные подходы к лечению цитомегаловирусной инфекции у онкогематологических больныхTRANSCRIPT
ОНКО
2 0 1 3
Г Е М АТОЛ О Г И ЯН А У Ч Н О - П Р А К Т И Ч Е С К И Й Е Ж Е К В А Р Т А Л Ь Н Ы Й Р Е Ц Е Н З И Р У Е М Ы Й Ж У Р Н А Л
1
ISSN 1818-8346
Молекулярный мониторинг хронического миелолейкоза
Характеристики острого миелоидного лейкоза у детей первого года жизни
Современные подходы к лечению цитомегаловирусной инфекции у онкогематологических больных
Уверенность в результате при профилактике и лечении инванзивных микозов• Доказанное превосходство в профилактике инвазивных грибковых инфекций у пациентов с нейтропенией1
• Защита от инвазивных микозов пациентов после ТГСКb на фоне РТПХc2
• Наиболее широкий спектр активности – от Aspergillus до Zygomycetes3
• Проверенная эффективность в лечении рефрактерных микозов4
Международные руководства рекомендуют использование НОКСАФИЛА для профилактики ИГИa у пациентов группы высокого риска их развития
Профилактика НОКСАФИЛОМ ECIL-3A NCCNB IDSAC AGIOH/DGHOD
Пациенты с ОМЛd/МДСe в период нейтропении Al 1 Al Al
Пациенты после ТГСК на фоне РТПХ Al 1 Al Al
Краткая информация о препарате НОКСАФИЛ® (ПОЗАКОНАЗОЛ)Показания: Профилактика инвазивных грибковых инфекций у пациентов из группы высокого риска. Лечение инвазив-ных грибковых инфекций: инвазивный аспергиллёз, инвазивный кандидоз или кандидоз пищевода, рефрактерные к амфотерицину В или итраконазолу, а также при их непереносимости. Зигомикоз (мукормикоз), криптококкоз, фузариоз, хромомикоз и мицетома, кокцидиоидоз, рефрактерные к другим противогрибковым лекарственным средствам. Лече-ние орофарингеального кандидоза. Противопоказания: Повышенная чувствительность к какому-либо из компонентов препарата. Совместное применение с алкалоидами спорыньи, субстратами CYP3A4 – терфенадином, астемизолом, циза-придом, пимозидом, галофантрином или хинидином, ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы – симвастатином, ловастатином
и аторвастатином. С осторожностью: При повышенной чувствительности к азольным соединениям в анамнезе. При тяжёлом нарушении функции печени. При врождённом или приобретённом удлинении интервала Q-Tc; при кардиоми-опатии; при других аритмиях; при совместном приёме с лекарственными средствами, удлиняющими интервал Q-Tc. Подробную информацию о дозировании препарата смотрите в инструкции по медицинскому применению. Побочные явления: Частые (>1 %, но <10 %): тошнота, головная боль, повышение АСТ, АЛТ, сыпь, лихорадка, астения, нарушение электролитного баланса. Нечастые (>0,1 %, но <1 %): тромбоцитопения, лейкопения, аллергическая реакция, гиперг-ликемия, судороги, невропатия, расплывчатое зрение, удлинение интервала Q-T, изменения АД, панкреатит, поврежде-ние гепатоцитов, боль в спине, нарушение функции почек, слабость, изменение сывороточных концентраций других
лекарственных средств. Серьёзные нежелательные явления, зарегистрированные (с частотой 1 % каждое) у пациентов с инвазивными микозами, включали изменение концентрации других лекарственных средств, повышение печёночных ферментов, тошноту, сыпь и рвоту. Взаимодействие с другими лекарственными средствами: Позаконазол яв-ляется ингибитором CYP3A4. Следует соблюдать осторожность при совместном назначении позаконазола и субстратов изофермента CYP3A4, поскольку такое применение приводит к повышению плазменных концентраций последних, что может вызывать нежелательные явления.Использование позаконазола во время беременности противопоказано, если преимущества лечения для женщины значительно не перевешивают потенциальный риск для плода. При назначении позаконазола кормление грудью следует прекратить.
Список сокращений:a ИГИ – инвазивные грибковые инфекции; b ТГСК – трансплантация гемопоэтических стволовых клеток; c РТПХ – реакция «трансплантант против хозяина»; d ОМЛ – острый миелолейкоз; e МДС – миелодиспластический синдромЛитература: 1. Cornely OA, Maertens J, Winston DJ, et al. Posaconazole vs. fluconazole prophilaxis in patients with neutropenia. N Engl J Med. 2007;356:348–359. 2. Ullmann AJ, Lipton JH, Vesole DH, et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft versus host disease. N Engl J Med. 2007;356:335–347. 3. Lehrnbecher T. Current practice of antifungal prophylaxis and treatment in immunocompromised children and adults with malignancies: a single centre approach. Mycoses 52; 107-117. 4. Walsh TJ, Raad I, Patterson TF, et al. Treatment of invasive aspergillosis with posaconazole in patients who are refractory to or intolerant of conventional therapy: an externally controlled trial. Clin Infect Dis. 2007;44:2–12. 5. Инструкция по медицинскому препарату Ноксафил®.
Перед назначением препарата, пожалуйста, ознакомьтесь с инструкцией по его применению.Компания MSD не рекомендует применять препараты компании способами, отличными от описанных в инструкции по применению.
ООО «МСД Фармасьютикалс» 115093, г. Москва, ул. Павловская, д. 7, стр. 1Tел.: +7 (495) 916 71 00, Факс: +7 (495) 916 70 94.www.msd.ru
A ECIL – Европейская конференция по инфекциям у больных лейкозамиB NCCN – Национальная онкологическая сеть СШАC IDSA – Американское общество инфекционных болезнейD AGIOH/DGHO – Рекомендации рабочей группы по инфекционным забо-леваниям Немецкого общества гематологов и онкологов
07-2
013-
NO
X-07
-201
1-RU
S-01
2-EP
Журнал включен в Перечень ведущих рецензируемых научных
журналов, в которых публикуются основные научные результаты
диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОРпроф., д.м.н. Е.В. Самочатова
Заместители главного редакторапроф., д.м.н. В.В. Птушкин,
проф., д.м.н. Б.В. АфанасьевОтветственный секретарь
д.м.н. Ю.В. Румянцева
РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯпроф., д.м.н. О.В. Алейникова (Минск)
проф., д.м.н. А.К. Голенков (Москва)проф., д.м.н. А.И. Карачунский (Москва)
д.м.н. Е.Н. Паровичникова (Москва)проф., д.м.н. Ю.А. Криволапов (С.-Петербург)
доц., д.м.н. М.Л. Минков (Австрия)д.м.н. Н.В. Мякова (Москва)
к.м.н. Е.А. Никитин (Москва)проф., д.м.н. О.А. Рукавицын (Москва)
проф., д.м.н. С.А. Румянцев (Москва)д.м.н. Л.П. Менделеева (Москва)
к.м.н. Л.Г. Фечина (Екатеринбург)д.м.н. А.Л. Усс (Минск)
РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТпроф., д.м.н. Е.А. Лукина (Москва)
чл.-корр. РАМН И.В. Поддубная (Москва)чл.-корр. РАМН А.Г. Румянцев (Москва)
к.м.н. В.А. Россиев (Самара)проф., д.м.н. А.Г. Талалаев (Москва)
Адрес редакции:115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24,
стр. 15, НИИ канцерогенеза, 3-й этаж.Тел./факс: +7 (499) 929-96-19
www.abvpress.rue-mail: [email protected]
Заведующая редакцией Т.В. КлюковкинаКорректор В.В. Калинина
Дизайн Е.В. СтепановаВерстка О.В. Гончарук
Служба подписки и распространения И.В. Шургаева, +7 (499) 929-96-19
e-mail: [email protected]Служба рекламы
В.А. Клюковкин, +7 (499) 929-96-19e-mail: [email protected]
Журнал зарегистрированв Федеральной службе по надзору
в сфере связи, информационных технологийи массовых коммуникаций (Роскомнадзор)
ПИ № ФС77-36928 от 21 июля 2009 г.
При полной или частичной перепечаткематериалов ссылка на журнал«Онкогематология» обязательна.
Редакция не несет ответственностиза содержание публикуемыхрекламных материалов.
В статьях представлена точказрения авторов, которая можетне совпадать с мнением редакции.
ISSN 1818-8346Онкогематология. 2013. № 1. 1–72© ООО «ИД «АБВ-пресс», 2013
Подписной индекс в каталоге«Пресса России» — 42167
Отпечатано в типографииООО «Тверская Городская Типография»
Тираж 3000 экз.
EDITOR-IN-CHIEFProf. Ye.V. SamochatovaDeputy EditorsProf. V.V. Ptushkin,Prof. B.V. AfanasievExecutive SecretaryD. Sci. Yu.V. Rumyantseva
EDITORIAL BOARDProf. O.V. Aleynikova (Minsk)Prof. A.K. Golenkov (Moscow)Prof. A.I. Karachunskiy (Moscow)D. Sci. Ye.N. Parovichnikova (Moscow)Prof. Yu.A. Krivolapov (St.-Petersburg)D. Sci. M.L. Minkov (Austria)D. Sci. N.V. Myakova (Moscow)PhD Ye.A. Nikitin (Moscow)Prof. O.A. Rukavitsyn (Moscow)Prof. S.A. Rumyantsev (Moscow)D. Sci. L.P. Mendeleeva (Moscow)PhD L.G. Fechina (Yekaterinburg)D. Sci. A.L. Uss (Minsk)
EDITORIAL COUNCILProf. Ye.A. Lukina (Moscow)Prof. I.V. Poddubnaya (Moscow)Prof. A.G. Rumyantsev (Moscow)PhD V.A. Rossiyev (Samara)Prof. A.G. Talalayev (Moscow)
201311
С О Д Е Р Ж А Н И Е
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
Н.Р. Рябчикова, И.Р. Минниахметов, Г.Ш. Сафуанова, Д.В. Исламгулов, А.С. Карунас, Э.К. Хуснутдинова
Хронический миелолейкоз: молекулярный мониторинг в клинической практике . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Г.А. Цаур, А.М. Попов, О.М. Плеханова, А.М. Кустанович, О.В. Алейникова, Т.Л. Гиндина, А.С. Демина,
А.Е. Друй, С.Ю. Ковалев, К.Л. Кондратчик, А.В. Мисюрин, Н.В. Мякова, Т.О. Ригер, Л.И. Савельев,
О.И. Сокова, О.В. Стренева, М.В. Сучкова, Ю.П. Финашутина, Е.В. Флейшман, Е.В. Шориков,
Р.И. Юцкевич, C. Meyer, R. Marschalek, Л.Г. Фечина
Транслокация t(1;11)(p32;q23) с образованием химерного гена MLL-EPS15 при острых лейкозах: обзор литературы
и описание 6 новых случаев. Подходы к мониторированию минимальной остаточной болезни . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
А.М. Попов, Г.А. Цаур, Т.Ю. Вержбицкая, О.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина
Иммунофенотипическая характеристика острого миелоидного лейкоза у детей первого года жизни . . . . . . . . . . . . . 33
Л.М. Мещерякова, Л.Г. Ковалева, С.Р. Карагюлян, Л.Ю. Колосова, О.В. Пороткова, Е.А. Семенова
Отдаленные результаты спленэктомии при первичном миелофиброзе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Д.Н. Балашов
Современные подходы к лечению цитомегаловирусной инфекции у онкогематологических больных . . . . . . . . . . . . . . . 46
Е.А. Никитина, Н.Н. Климко, А.С. Колбин, Э.Г. Бойченко, И.А. Гарбузова, М.В. Голубева, Т.С. Богомолова
Случай успешного лечения мукормикоза легких у ребенка с апластической анемией . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
ФАРМАКОТЕРАПИЯ
В.В. Птушкин
Современное представление о биоаналогах в гематологии и онкологии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ
От редакции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
М.А. Орлова, Т.П. Трофимова, А.П. Орлов, О.А. Шаталов, Ю.К. Наполов, А.А. Свистунов, В.П. Чехонин
Фуллерены и апоптоз . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
C O N T E N T S
HEMATOLOGIC MALIGNANCIES: DIAGNOSIS, TREATMENT, SUPPORTIVE CARE
N.R. Ryabchikova, I.R. Minniakhmetov, G.Sh. Safuanova, D.V. Islamgulov, A.S. Karunas, E.K. Khusnutdinova
Chronic myelogenous leukemia: molecular monitoring in clinical practice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
G.A. Tsaur, A.M. Popov, O.M. Plekhanova, A.M. Kustanovich, O.V. Aleynikova, T.L. Gindina, A.S. Demina,
A.Ye. Druy, S.Yu. Kovalev, K.L. Kondratchik, A.V. Misyurin, N.V. Myakova, T.O. Riger, L.I. Savelyev, O.I. Sokova,
O.V. Streneva, M.V. Suchkova, Yu.P. Finashutina, Ye.V. Fleyshman, Ye.V. Shorikov, R.I. Yutskevich, C. Meyer,
R. Marschalek, L.G. Fechina
Translocation t(1;11)(p32;q23) with MLL-EPS15 fusion gene formation in acute leukemias:
a review and 6 new case reports. Approaches to minimal residual disease monitoring . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
A.M. Popov, G.A. Tsaur, T.Yu. Verzhbitskaya, O.V. Streneva, E.V. Shorikov, L.I. Saveliev, L.G. Fechina
Immunophenotypic investigation of infant acute myeloid leukemia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
L.M. Meshcheryakova, L.G. Kovaleva, S.R. Karagyulyan, L.Yu. Kolosova, O.V. Porotkova, Ye.A. Semenova
Long-term results of splenectomy in primary myelofibrosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
D.N. Balashov
Trends in the treatment of cytomegalovirus infection in oncohematological patients . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
E.A. Nikitina, N.N. Klimko, A.S. Kolbin, E.G. Boychenko, I.A. Garbuzova, M.V. Golubeva, T.S. Bogomolova
Successful treatment of pulmonary mucormycosis in a child with aplastic anemia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
PHARMACOTHERAPY
V.V. Ptushkin
Modern concepts of biosimilars in hematology and oncology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
NEW TRENDS IN MEDICAL SCIENCE
From edition. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
M.A. Orlova, T.P. Trofimova, A.P. Orlov, O.A. Shatalov, Yu.K. Napolov, A.A. Svistunov, V.P. Chekhonin
Fullerene and apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
CONFERENCES, SYMPOSIUMS, MEETINGS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Издательский дом «АБВ-пресс» специализируется на выпуске периодической научной медицинской литературы, книгопечатной продукции и создании сайтов медицинского направления
Москва, 2013
Книги и наши издания
можно заказать и приобрести
в редакции по адресу:
г. Москва, Каширское ш.,
д. 24, стр. 15
и по телефону:
+7 (499) 929-96-19.
Адрес электронной почты:
НАШИ ЖУРНАЛЫ и ГАЗЕТЫ
НАШИ КНИГИ
НАШИ САЙТЫ
www.hnonco.ru
www.roou.ruwww.oncoproct.ru
www.netoncology.ru
www.urotoday.ru www.neuromuscular.ru
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 7
1’
20
13Хронический миелолейкоз: молекулярный мониторинг
в клинической практике
Н.Р. Рябчикова1, И.Р. Минниахметов2, Г.Ш. Сафуанова1, Д.В. Исламгулов2, А.С. Карунас2, Э.К. Хуснутдинова2
1ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Уфа;2ФГБУН «Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра» РАН
Контакты: Гузель Шагбановна Сафуанова [email protected]
Применение ингибитора тирозинкиназ (ИТК) иматиниба у пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ) привело к быстрому
и значительному прогрессу в лечении данного заболевания. На сегодняшний день мониторинг терапии препаратами ИТК с помо-
щью генетических технологий является обязательным атрибутом контроля эффективности лечения ХМЛ. Целью исследования
было проведение комплексного молекулярно-генетического мониторинга с использованием методов стандартного цитогенети-
ческого исследования, полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и мутационного анализа для оценки эффектив-
ности лечения пациентов с ХМЛ, получающих терапию иматинибом. Показана корреляция цитогенетического и молекулярного
ответов и неоднородность структуры молекулярного ответа в каждой группе больных. Анализ характера мутаций гена BCR-ABL
показал, что мутации киназного домена были выявлены у 32 % больных ХМЛ, резистентных к иматинибу.
Ключевые слова: хронический миелолейкоз, молекулярно-генетический мониторинг, мутации в Рh-позитивных клетках
Chronic myelogenous leukemia: molecular monitoring in clinical practice
N.R. Ryabchikova1, I.R. Minniakhmetov2, G.Sh. Safuanova1, D.V. Islamgulov2, A.S. Karunas2, E.K. Khusnutdinova2
1Bashkortostan State Medical University, Ministry of Health of Russia, Ufa;2Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Scientific Center, Russian Academy of Sciences
Use of tyrosine kinase inhibitor imatinib has led to significant progress in chronic myeloid leukemia (CML) treatment. To date, genetic
monitoring is a mandatory attribute of therapy with tyrosine kinase inhibitors. The purpose of this study was to access the imatinib therapy
efficacy in CML patients using complete molecular genetic monitoring by standard cytogenetics, real-time polymerase chain reaction
and mutational analysis. Correlation between cytogenetic and molecular response was shown. Heterogeneity of molecular response in each
patient group was revealed by expression of BCR-ABL. Kinase domain mutations were detected in 32 % of CML patients resistant to
imatinib.
Key words: chronic myeloid leukemia, molecular genetic monitoring, Ph-positive cells mutations
Введение
Хронический миелолейкоз (ХМЛ) является формой
лейкоза, которая характеризуется усиленным и не-
регулируемым ростом преимущественно миелоидных
клеток в костном мозге с их накоплением в крови.
Основной причиной ХМЛ является реципрокная
транс локация t(9;22),(q34;q11) с образованием фила-
дельфийской хромосомы (Ph-хромосома) [1], обнару-
живаемой у 90–95 % больных. В результате трансло-
кации образуется химерный ген BCR-ABL, продуктом
которого является патологический белок, обладающий
выраженной тирозинкиназной активностью. Именно
белок BCR-ABL, продуцируемый химерным геном,
имеет ключевое значение в патогенезе ХМЛ [2].
Исследования молекулярных основ патогенеза ХМЛ
подготовили почву для развития таргетной (целена-
правленной) терапии этого заболевания, заключаю-
щейся в применении специфических ингибиторов
BCR-ABL-тирозинкиназы (ИТК). Создание первого
из них – иматиниба (STI571), стало революционным
событием в области целенаправленной противоопу-
холевой терапии [3]. Иматиниб селективно ингибиру-
ет BCR-ABL-тирозинкиназу, встраиваясь в аденозин-
трифосфат (АТФ)-связывающий карман киназного
домена белка. Благодаря этому АТФ не может встро-
иться в АТФ-связывающий карман, BCR-ABL-тиро-
зинкиназа остается в неактивном состоянии и тем
самым блокируется сигнальный путь пролиферации
опухолевых клеток [3, 4].
Несмотря на высокую эффективность препарата,
у некоторых больных в 20–30 % случаев наблюдается
первичная (рефрактерность) или вторичная (приобре-
тенная) резистентность к проводимой терапии [5].
Возникновение устойчивости к ИТК является следст-
вием взаимодействия многих факторов. Эти факторы
включают в себя схему лечения, фармакодинамику
ИТК, генетические изменения, мутации BCR-ABL
киназного домена [5]. Наиболее широко обсуждается
влияние мутаций химерного гена BCR-ABL на развитие
резистентности. По современным данным, частота
мутаций в гене BCR-ABL в разных группах больных
колеблется от 15 до 90 % и зависит от критериев опре-
деления резистентности, методов обнаружения мута-
ций и фазы течения ХМЛ [6]. Эти мутации делают
тирозинкиназу нечувствительной к действию имати-
ниба, при этом сохраняя трансформирующую актив-
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я81
’2
01
3 ность фермента. Предполагается, что возникновение
мутаций вызывает изменение конформации химерно-
го белка тирозинкиназы, что затрудняет связывание
иматиниба с аденозинтрифосфатным карманом белка
[7, 8]. На сегодняшний день разработаны ИТК 2-го
поколения, более эффективные по сравнению с има-
тинибом, 2 из которых уже зарегистрированы в России
в начале 2008 г. – нилотиниб и дазатиниб. Применение
ИТК 2-го поколения позволяет преодолеть проблемы
с резистентностью и непереносимостью иматиниба
у ряда больных, однако в некоторых случаях даже но-
вые препараты не улучшают ответ на лечение и явля-
ются неэффективными [9].
В настоящее время основными методами диагнос-
тики и мониторинга заболевания при ХМЛ являются
общий анализ крови, цитогенетическое определение
содержания Ph-позитивных клеток в костном мозге
и измерение уровня транскрипта гена BCR-ABL.
Гематологический подсчет клеток является наиме-
нее чувствительным методом и используется для оп-
ределения гематологического ответа (ГО) на лечение.
Если анализ показывает отсутствие опухолевых кле-
ток, ГО является полным; при наличии лейкозных
клеток – частичным ГО [10]. Для определения цито-
генетического ответа (ЦО) оценивается количество
Ph-позитивных клеток по отношению к числу клеток,
не несущих Ph-хромосомы [11]. Стандартное цитоге-
нетическое исследование (СЦИ) клеток является
единственным методом, позволяющим анализировать
весь хромосомный набор клетки. Посредством СЦИ
можно обнаружить дополнительные хромосомные
аберрации, которые в ряде случаев свидетельствуют
о неблагоприятном прогнозе заболевания. При этом
необходимо понимать, что разрешающая способность
этого метода относительно низкая и составляет 1–5 %
клеток. ЦО на лечение определяется по относитель-
ному содержанию Ph+-клеток в костном мозге: пол-
ный – 0 %, частичный – 1–35 %, малый – 36–65 %,
минимальный – 66–95 %, нет ответа – более 95 %.
Большой ЦО (БЦО) определяется при достижении
полного (ПЦО) или частичного ЦО при наличии
в костном мозге 0–35 % Ph+-клеток [12].
Высокочувствительный молекулярно-цитогене-
тический метод флуоресцентной in situ гибридизации
(FISH) хромосом позволяет обнаружить химерный
ген BCR-ABL у Ph-позитивных больных ХМЛ не
только в метафазе, но и в интерфазе митотического
деления клетки [13], с частотой 1 опухолевая клетка
на 200–500 клеток костного мозга. В соответствии
с рекомен дациями European Leukemia Net (ELN) конт-
рольное СЦИ или FISH-анализ (в случае отсутствия
митозов клеток костного мозга) необходимо прово-
дить на 3 и 6 мес терапии ХМЛ ИТК, затем каждые
6 мес до достижения и подтверждения ПЦО, далее –
каждые 12 мес в случаях, когда регулярная оценка
молекулярных изменений неосуществима, и всегда
при признаках миелодисплазии, субоптимальном от-
вете или неудаче лечения [12].
Кариотипирование с окрашиванием хромосом
методом G-banding в клетках костного мозга, нахо-
дящихся в стадии метафазы, необходимо проводить
на 3 и 6 мес, а затем каждые 6 мес до достижения
и подтверждения ПЦО, далее – каждые 12 мес в слу-
чаях, когда регулярная оценка молекулярных измене-
ний неосуществима, и всегда при признаках миелодис-
плазии, субоптимальном ответе или неудаче лечения [12].
Наиболее чувствительным методом оценки моле-
кулярного ответа (МО) на лечение является количест-
венная полимеразная цепная реакция (ПЦР). Боль-
шой МО определяется как тысячекратное снижение
количества транскриптов BCR-ABL по сравнению
с исходным (до начала терапии). Полным МО (ПМО)
считают случаи, когда BCR-ABL-транскрипты не вы-
являются [14].
Метод ПЦР применяется как для диагностики
ХМЛ, так и для мониторирования минимальной оста-
точной болезни в процессе терапии [15, 16]. Чувстви-
тельность этого метода высока и позволяет обнару-
жить одну единственную клетку со специфической
ДНК или РНК среди 104–106 клеток.
В пределах чувствительности цитогенетического
метода (10-2) оба метода (цитогенетический и молеку-
лярный) равноценны для количественной оценки лей-
кемических клеток. В исследовании S. Branford et al.
показано, что уровень экспрессии транскрипта гена
BCR-ABL в периферической крови коррелирует с чис-
лом Ph-позитивных лейкемических клеток костного
мозга (рис. 1) [17].
Молекулярный мониторинг уровня BCR-ABL-
транскрипта при помощи количественной ПЦР в ре-
альном времени (ПЦР-РВ) используется в качестве
оценки ответа на лечение у пациентов с ХМЛ [18, 19].
Этот метод особенно важен при терапии ХМЛ ИТК,
когда резидуальное количество лейкемических клеток
ниже уровня чувствительности цитогенетического ис-
следования [19–21].
Любая положительная динамика соотношения
BCR-ABL/ABL является МО, так как отражает динами-
ку соотношения нормальных и лейкемических клеток.
Следовательно, количественный метод ПЦР можно
использовать и на начальных этапах терапии ИТК [18,
20, 21].
Количественная ПЦР-РВ должна проводиться
на цельных клетках из лейкоконцентрата, а результаты
должны быть представлены в виде отношения BCR-
ABL/ABL (или другим конститутивным генам), выра-
женного в процентах [12].
Целью нашего исследования было проведение ком-
плексного молекулярно-генетического мониторинга
с использованием методов СЦИ, ПЦР-РВ и мутаци-
онного анализа для оценки эффективности лечения
пациентов с ХМЛ, получающих терапию иматинибом.
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 9
1’
20
13
Материалы и методы
Пациенты. Материалом исследования послужили
образцы РНК и кДНК, выделенные из перифериче-
ской крови 114 больных (55 мужчин и 59 женщин,
в возрасте от 14 до 76 лет, медиана – 43 года) с клини-
чески и цитогенетически установленным диагнозом
ХМЛ, обследовавшихся в Республиканской клини-
ческой больнице им. Г.Г. Куватова г. Уфы. Все больные
получали лечение препаратом ИТК иматинибом в до-
зе 400, 600 или 800 мг/сут (согласно рекомендациям
ELN) [12]. Максимальная длительность терапии со-
ставила 205 мес, минимальная – 6 мес; медиана дли-
тельности терапии – 65,5 мес.
Исследование одобрено Этическим комитетом
Института биохимии и генетики Уфимского научного
центра Российской академии наук. Все больные ХМЛ
дали информированное согласие на участие в иссле-
довании.
Выделение РНК. РНК выделяли из 5–7 мл веноз-
ной крови реагентом TriZol (Invitrogene) в соответ-
ствии с рекомендациями изготовителя. Эффектив-
ность выделения мРНК определяли с использованием
спектрофотометра NanoDrop. Качество препаратов
РНК оценивали по соотношению оптических плот-
ностей А260/A280 и электрофорезом в 1 % агарозном
геле по соотношению количества 28S и 18S рРНК [16].
Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой I, свобод-
ной от РНКазы (Sigma). Наличие в образце РНК при-
месей ДНК определяли с помощью ПЦР со специфи-
ческими праймерами к гену «домашнего хозяйства»
GAPDH (Fermentas).
Обратная транскрипция проводилась с использо-
ванием набора “RevertAid™ First Strand cDNA” (Fer-
mentas) с помощью гекса- и дексануклеотидных прай-
меров согласно рекомендациям производителя.
Цитогенетические исследования костного мозга. Цитогенетическое исследование костного мозга на эта-
пе постановки диагноза ХМЛ выполнено у 101 боль-
ного. Контрольные цитогенетические исследования
проведены через 6, 12 и 18 мес терапии иматинибом.
Образцы костного мозга транспортировали в лабора-
торию при температуре 4–8 °С в термоконтейнере
в течение 1–24 ч. В работе использовали общеприня-
тый прямой метод и метод культивирования костного
мозга в течение 24 ч. Для СЦИ препараты окрашива-
лись методом GTG (дифференциальная окраска G).
Результаты кариотипирования описывали в соответ-
ствии с требованиями Международной цитогенетичес-
кой номенклатуры ISCN 2009. ЦО, а также критерии
отсутствия ответа определяли в соответствии с реко-
мендациями ELN [12].
ПЦР-РВ осуществляли с помощью системы детек-
ции продуктов ПЦР-РВ CFX96™ (BioRad). Для ана-
лиза экспрессии гена BCR-ABL использовали набор
реагентов Онкоскрин-1-1-Q (ООО «ГеноТехнология»).
Определение интенсивности экспрессии химерного
онкогена BCR-ABL и контрольного гена ABL проводи-
ли согласно протоколу производителя. Метод не стан-
дартизирован по международной шкале (IS), результаты
анализа уровня экспрессии представлены в процентах.
Исследование мутаций в гене BCR-ABL. ПЦР про-
водили в 2 этапа с целью амплификации мутантного
транскрипта ABL, согласно рекомендациям Soverini
et al. [22]. На первом этапе амплифицировали участок
гена BCR-ABL длиной в 1,2 тыс. пар оснований (п. о.)
с использованием следующих праймеров: F-BCR-A
и R-ABL-A (таблица). На 2-м этапе проводили реам-
плификацию, используя в качестве матрицы амплифи-
кат от первого этапа с использованием 2 пар внутренних
праймеров (F-ABL-B/R-ABL-B и F-ABL-С/R-ABL-С)
Рис. 1. Оценка ответа на терапию молекулярным методом [18]
Log %
1012 100
1 1011 10
2 1010 1
3 109 0,1
4 108 0,01
5 107 0,001
6 106 0,0001
Заболевание в момент диагностики
Полный ГО
ПЦО
Большой МО
ПМО
0 %Log 3 = 0,1 % (большой МО)
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я101
’2
01
3
и образованием 2 фрагментов длиной 393 п. о. и 482 п. о.
соответственно.
Для амплификации использовали реакционную
смесь объемом 25 мкл, содержащую 2,5 мкл 10 × Taq-
буфера, 0,5 единиц Taq полимеразы, смесь dNTP (dATP,
dGTP, dCTP, dTTP по 200 мкМ каждого), 2,5 mM
MgCl2 и по 5 пM каждого праймера. В реакцию брали
1–3 мкг кДНК. В первом раунде ПЦР проводилась
при следующих условиях: после денатурации (94 °С,
5 мин) проводили 30 циклов амплификации в режиме
94 °С / 40 с; 60 °С / 60 с; 72 °С / 60 с; финальная до-
стройка 72 °С / 7 мин. Реамплификация проводилась
при следующих условиях: после первичной денатура-
ции (94 °С, 5 мин) проводили 35 циклов амплифика-
ции в режиме 94 °С / 30 с; 55 °С / 40 с; 72 °С / 40 с; фи-
нальная достройка 72 °С / 7 мин.
Определение нуклеотидной последовательности
кДНК гена BCR-ABL выполняли с помощью автома-
тического секвенатора ABI PRISM модель 310 (“Applied
Biosystems”) с использованием набора для флуорес-
центного мечения DYEnamicTM ET, согласно прото-
колу фирмы-производителя (“Amersham Pharmacia Bio-
tech” DYEnamicTM ET Terminator Cycle Sequencing Kit).
Наличие мутаций подтверждали с помощью ана-
лиза полиморфизма длины рестрикционных фрагмен-
тов (ПДРФ). Фрагменты гена BCR-ABL подвергали
рестрикции специфическими эндонуклеазами DdeI,
Ncol. Реакцию проводили согласно протоколу фирмы-
производителя (Fermentas). Продукты амплификации
и рестрикции анализировали в 7 % полиакриламидном
геле с последующей окраской в растворе бромистого
этидия (конечная концентрация 0,1 мкг/мл) и визу-
ализацией в проходящем УФ-свете при длине волны
312 нм.
Статистическая обработка данных осуществлялась
с использованием программы GraphPad Prism 3.0,
GraphPad Software.
Результаты и обсуждение
Цитогенетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза иматинибомЦитогенетическое исследование клеток костного
мозга позволяет наиболее точно определить размер
опухолевого клона клеток и оценить эффективность
терапии иматинибом в течение первых 12 мес лечения
[23]. Одним из самых важных критериев прогноза
ответа на терапию иматинибом является результат
цитогенетического исследования клеток костного
мозга после 6 мес лечения (рекомендации ELN 2006,
2009). В соответствии с данными рекомендациями
в эти сроки больные должны достичь БЦО (содержание
Ph-позитивных клеток менее 35 %) [12, 23].
В нашем исследовании эффективность лечения
иматинибом оценивалась после 6 мес лечения у 101 па-
циента с ХМЛ, из них в хронической фазе были
82 (81,2 %) пациента, из которых иматиниб в дозе
400 мг/сут получали 76 (92,7 %) больных и 600 мг/сут –
6 (7,3 %) пациентов. В фазе акселерации находились
16 больных ХМЛ, из которых 1 (6,25 %) пациент получал
терапию иматинибом в дозе 400 мг/сут, 12 (75 %) –
в дозе 600 мг/сут, 3 (18,75 %) больных – в дозе 800 мг/сут.
В бластном кризе – 3 пациента, которые получали
иматиниб в дозировке 400, 600 и 800 мг/сут соответ-
ственно.
Следует отметить, что достижение оптимального
ответа на терапию иматинибом у пациентов в хрони-
ческой фазе и особенно в фазе акселерации напрямую
зависит от назначенной дозы иматиниба. Больные
ХМЛ в хронической фазе должны получать иматиниб
в дозе не менее 400 мг/сут, в фазе акселерации – не
менее 600 мг/сут. Поэтому в нашем исследовании па-
циенты, получавшие иматиниб в фазе акселерации
и бластного криза в дозе 400 мг/сут, были исключены
из дальнейшего анализа.
Результаты проведенного анализа показали, что
после 6 мес лечения из 82 пациентов в хронической
фазе ХМЛ, получавших иматиниб в дозе 400–600 мг/сут,
43 (52,4 %) пациента достигли ПЦО и 6 (7,3 %) боль-
ных достигли частичного ЦО. Таким образом, БЦО
выявлен у 49 (59,7 %) пациентов, что в соответствии
с рекомендациями ELN (2009) рассматривается как
оптимальный ответ. Из 82 обследованных больных
ХМЛ в хронической фазе после 6 мес лечения 9 (11 %)
достигли малого ЦО и 4 (4,9 %) пациента имели мини-
мальный ЦО. Таким образом, малый или минималь-
ный ЦО, рассматриваемый в рекомендациях ELN
(2009) как субоптимальный ответ, был достигнут
у 13 пациентов (15,9 % случаев).
Из 15 больных ХМЛ, находившихся в фазе акселе-
рации и получавших иматиниб в дозе 600–800 мг/сут,
Праймеры для ПЦР
Название праймера
Последовательность, 5'–3'
ПозицияДлина
ампликона
F-BCR-AGAG CAG CAG AAG
AAG TGT TTC AGA
BCR
(3075–3098)
A* [1475 п. о.
(b3a2) или 1401
п. о. (b2a2)]
R-ABL-ACTC TAG CAG CTC
ATA CAC CTG GG
ABL
(1484–1506)
F-ABL-BCAT CAT TCA ACG
TGT GCC GAC GG
ABL
(748–770) B (393 п. о.)
R-ABL-BGTT GCA CTC CCT
CAG GTA GTC
ABL
(1120–1140)
F-ABL-CGAA GAA ATA CAG
CCT GAC GGT G
ABL
(930–951)
R-ABL-C CGT CGG ACT TGA
TGG AGA A
ABL
(1393–1411) C (482 п. о.)
Примечание. * – длина ампликона после первого этапа ПЦР варь-ирует в зависимости от типа транскрипта гена BCR-ABL (b3a2 или b2a2).
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 11
1’
20
13ПЦО после 6 мес лечения достиг только 1 (6,7 %) па-
циент, частичного ответа – 2 (13,3 %) пациента, мини-
мальный ЦО был достигнут у 2 (13,3 %) пациентов.
Таким образом, в группе больных в фазе акселерации
оптимальный ответ был выявлен у 3 (20 %) пациентов,
субоптимальный – у 2 (13,3 %) пациентов.
У 20 (24,4 %) больных ХМЛ в хронической фазе,
у 10 (66,7 %) пациентов с ХМЛ в фазе акселерации
и у всех больных, находящихся в бластном кризе, ЦО
отсутствовал, что определяется как «неудача терапии».
Отсутствие ГО после 3 мес и любого ЦО после 6 мес
терапии, а также потеря уже достигнутого ГО, ЦО
и МО рассматриваются как проявления резистентнос-
ти к терапии ИТК.
Анализ экспрессии гена BCR-ABL у больных хроническим миелолейкозомДля количественной оценки транскриптов BCR-
ABL у 114 больных ХМЛ был проведен анализ экс-
прессии методом ПЦР-РВ. Относительная экспрессия
гена BCR-ABL определялась как отношение среднего
числа копий гена BCR-ABL к среднему числу копий
гена ABL, умноженное на 100 %. Согласно рекоменда-
циям ELN, обнаружение гена BCR-ABL более чем
в 1 % клеток свидетельствует о выраженной экспрес-
сии BCR-ABL, оценить которую можно с помощью
СЦИ. Экспрессия гена BCR-ABL в 0,1–1 % клеток ха-
рактерна для умеренного уровня экспрессии, который
уже невозможно оценить с помощью СЦИ. Экспрес-
сия гена BCR-ABL на уровне менее 0,1 % свидетель-
ствует о достижении БМО [23]. Для удобства пред-
ставления данных по изменению уровня экспрессии
BCR-ABL в процессе лечения была также использована
логарифмическая шкала измерений. Результаты
выражали в виде десятичного логарифма (lg) снижения
экспрессии по отношению к базовому уровню. Сни-
жение экспрессии на 1 lg означало снижение уровня
BCR-ABL-транскрипта в 10 раз, на 2 lg – в 100 раз,
на 3 lg – в 1000 раз, на 4 lg – в 10 000 раз.
В результате проведенного нами анализа было вы-
явлено, что медиана экспрессии гена BCR-ABL в об-
щей выборке пациентов с ХМЛ составила 23,77 %
(10–90-й процентиль, 0–316,8 %), или 1,5 lg. У 32 (28 %)
больных ХМЛ был выявлен ПМО на терапию ИТК
(0 % гена BCR-ABL). Медиана снижения уровня экс-
прессии BCR-ABL составила 4,2 lg. Умеренный уровень
экспрессии был выявлен в 10 (9 %) случаях. Медиана
экспрессии гена BCR-ABL составила 0,15 % (10–90-й
процентиль, 0,05–0,93 %), или 2,5 lg. В группе больных
ХМЛ с высоким уровнем экспрессии гена BCR-ABL
(n = 72) медиана экспрессии составила 79,9 %, или 1,2 lg.
Сравнение значений цитогенетического и молекулярного ответа Сравнение данных МО и ЦО проводилось на 77 об-
разцах крови пациентов. Образцы были разделены
на группы, соответствующие уровню ЦО. Разброс
значений экспрессии BCR-ABL в каждой группе был
очень широким, но с уменьшением процентного со-
держания Ph-позитивных клеток увеличивалась доля
образцов с более слабым уровнем экспрессии. Срав-
нительный анализ данных ЦО и МО подтвердил на-
личие положительной корреляции между процентным
содержанием Ph-позитивных клеток и уровнем экс-
прессии BCR-ABL. Коэффициент ранговой корреля-
ции Спирмена для этих параметров составил 0,822
(p < 0,0001).
В группе пациентов с ПЦО в 43,8 % (14 из 32) об-
разцов транскрипты гена BCR-ABL не были выявлены;
в 15,6 % (5 образцов) экспрессия BCR-ABL составляла
от 0 до 0,1 %, в 40,6 % (13 образцов) – выше 1 %.
В группе с частичным ЦО в 28,6 % (2 из 7) образцов
экспрессия гена BCR-ABL не выявлялась, в 71,4 % (5 из
7) образцов экспрессия была выше 1 %. В группе с ма-
лым ЦО 14,3 % (1 из 7) образцов экспрессия была рав-
на нулю, в остальных 85,7 % (6 из 7) наблюдалась экс-
прессия свыше 1 %. В группе с минимальным ЦО
транскрипты BCR-ABL не выявлялись в 28,6 % (2 из 7)
случаев, экспрессия выше 1 % наблюдалась в 71,4 %
(5 из 7). В группе с отсутствием ЦО в 100 % (24 образ-
ца) случаев экспрессия была свыше 1 %. Таким обра-
зом, в нашем исследовании высокий уровень экспрес-
сии гена BCR-ABL (> 1 %) наблюдался во всех группах
больных, в том числе и в группе пациентов с ПЦО.
Пациенты с низким уровнем экспрессии (< 0,1 %)
имеются в группах с малым и частичным ЦО, в группе
с частичным ЦО есть также пациенты с отсутствием
экспрессии BCR-ABL. Доля образцов пациентов
с большим и ПМО значительно возрастает в группе
с ПЦО.
Анализ мутаций в гене BCR-ABLДля проведения анализа мутаций мы сформиро-
вали группу из 50 больных, соответствующих крите-
риям резистентности к иматинибу. В этой группе
пациентов медиана экспрессии гена BCR-ABL соста-
вила 141,6 %. В состав группы входили 22 мужчины
и 28 женщин с медианой возраста 46 лет.
С целью идентификации мутаций в гене BCR-ABL
у 50 пациентов с ХМЛ проведен анализ изменений
нуклеотидной последовательности тирозинкиназного
домена BCR-ABL путем прямого секвенирования
кДНК (рис. 2а и б). В результате проведенного нами
исследования у пациентов с резистентностью к има-
тинибу выявлены 4 миссенс-мутации (M244V, T315I,
M351T и H396R).
У 7 (14 %) больных с ХМЛ при секвенировании
кДНК обнаружена замена цитозина на тимин в 944-м
положении, приводящая к замене треонина на изолей-
цин в 315-м положении (T315I). Наличие мутации
у всех больных с выявленными при секвенировании
изменениями последовательности нуклеотидов под-
тверждено методом ПДРФ-анализа с помощью эндо-
нуклеазы рестрикции DdeI (рис. 2в и г). Анализ про-
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я121
’2
01
3
водили после амплификации фрагмента кДНК длиной
482 п. о., который в норме содержит 4 сайта рестрик-
ции для эндонуклеазы DdeI, гидролизующей кДНК
на 5 фрагментов длиной 35, 55, 114, 116, 162 п. о. При
возникновении замены цитозина на тимин пропадает
один из сайтов рестрикции DdeI (отмечен * на рис. 2г),
и у мутантного варианта ABL-транскрипта появляется
дополнительный негидролизованный фрагмент дли-
ной 197 п. о. В образцах с мутацией также были выяв-
лены фрагменты длиной 162 п. о. и 35 п. о., что свиде-
тельствует о клоновом характере мутаций, т. е. мутантные
образцы представлены разным соотношением транс-
криптов дикого и мутантного типов.
Мутация T315I в гене BCR-ABL является, по дан-
ным литературы, наиболее распространенной мутаци-
ей, вызывающей резистентность ко всем известным
ИТК [4, 5]. Треонин в положении 315 находится на пе-
риферии нуклеотид-связывающего сайта ABL1 и фор-
мирует ключевое взаимодействие через водородную
связь с иматинибом [24]. Мутация T315I разрывает это
взаимодействие, ослабляет связывание иматиниба
и приводит к полной нечувствительности к нему. Ре-
зистентность к терапии при этой мутации гена BCR-
ABL невозможно преодолеть увеличением дозы има-
тиниба, так же как и терапией ИТК 2-го поколения,
поэтому при наличии совместимого донора пациентам
с мутацией T315I показана аллогенная транспланта-
ция костного мозга [3].
В исследовании итальянской группы GIMEMA
(Italian Group for Hematologic Malignancies of the Adult)
[25] частота данной мутации у больных ХМЛ соста-
вила 12 %, в исследовании Catherine Roche-Lestienne
у больных ХМЛ из Франции мутация T315I была вы-
явлена с частотой 12,5 % [26], что коррелирует с ре-
зультатами нашего исследования. При исследовании
мутаций у больных из г. Ростова было обнаружено, что
частота мутации T315I составляет 4 % [4]. Достаточно
низкая частота этой мутации, возможно, связана
с тем, что авторами в исследование были отобраны
только больные с первичной резистент ностью к има-
тинибу (рефрактерность).
У 10 пациентов с ХМЛ при секвенировании
кДНК гена BCR-ABL нами была обнаружена замена
тимина на цитозин в 1052-м положении, приводящая
к замене метионина в положении 351 на треонин
(M351T) (рис. 3а и б). Для подтверждения наличия
мутации M351T проводился ПДРФ-анализ (рис. 3в и г)
с использованием специфической эндонуклеазы Ncol.
а 130A T C A C Т G A
130A T C A C Т G A
б
5΄ 3΄ 162 + 35 55 116 114
197
*в г
489 404
190 147 110
67
34
197 162 116 114
55
35
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 2. Секвенирование 2 образцов кДНК с мутацией T315I (а, б) с последующим ПДРФ-анализом (в, г): в – электрофореграмма ПДРФ-анализа
гена BCR-ABL1 с помощью эндонуклеазы рестрикции DdeI. Дорожка 1 – маркер молекулярного веса pUC19/MspI; 2 – контрольный образец, не
обработанный рестриктазой; 3, 4, 5, 7 – образцы кДНК с мутацией T315I; 6 – образец кДНК без мутации T315I; г – рестрикционная карта
фрагмента кДНК длиной 482 п. о. для эндонуклеазы DdeI. Сайты рестрикции показаны стрелками. При мутации T315I пропадает один из сайтов
узнавания для рестриктазы DdeI (отмечен *), с образованием фрагмента длиной 197 п. о.
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 13
1’
20
13
Гидролиз амплифицированного фрагмента кДНК без
мутации приводит к образованию 3 фрагментов дли-
ной 219, 215 и 48 п. о. При наличии мутации M351T
пропадает один из двух сайтов узнавания эндонукле-
азы Ncol и образуются 2 фрагмента длиной 434 п. о.
и 48 п. о.
Мутация M351T в гене BCR-ABL является одной
из часто встречаемых при ХМЛ мутаций, связанных
с развитием резистентности к терапии [3]. Данная му-
тация приводит к умеренному снижению чувствитель-
ности к иматинибу в тестах in vitro, которая восстанав-
ливается при концентрации препарата 1–4 мкмоль
(концентрация 4 мкмоль соответствует суточной дозе
иматиниба 800 мг/сут) [3, 27]. Предполагается, что
в основе развития резистентности при этой мутации
лежит нарушение связи между SH2- и киназным до-
менами ABL-киназы. В норме метионин в положении
351 связывается с SH2-доменом и стабилизирует не-
активную конформацию ABL-киназы. Показано, что
терапия высокими дозами иматиниба может привести
Рис. 3. Секвенирование 2 образцов кДНК с мутацией M351T (а, б) с последующим ПДРФ-анализом (в, г): в – электрофореграмма ПДРФ-анализа
гена BCR-ABL1 с помощью эндонуклеазы рестрикции Ncol. Дорожка 1 – маркер молекулярного веса pUC19/MspI; 2, 3 – контрольный образец, не
обработанный рестриктазой; 4, 6, 7, 8 – образцы кДНК с мутацией M351T; 5 – образец кДНК без мутации M351T; г – рестрикционная карта
фрагмента кДНК длиной 482 п. о. для эндонуклеазы Ncol. Сайты рестрикции показаны стрелками. При мутации M351T пропадает один из сайтов
узнавания для рестриктазы Ncol (отмечен *) и образуется дополнительный фрагмент длиной 434 п. о.
а 240C C A C G G A G
240C C A C G G
б
5΄ 3΄ 48 219 + 215
434
*в г
489
404 331
242
190
434
219 215
к преодолению резистентности, однако более эффек-
тивный результат достигается при применении
ИТК 2-го поколения [23].
По литературным данным, частота мутации M351T
у больных ХМЛ из Германии составляет 6 % [28],
в Италии и Австралии мутация M351T определяется
с частотой 11 % [25, 29]. У больных ХМЛ из Республи-
ки Башкортостан мутация M351T встречается с более
высокой частотой – 20 %, и является самой распро-
страненной мутацией.
Мутация H396R в гене BCR-ABL, возникающая
в результате замены аденина на гуанин в 1187-м поло-
жении, обнаружена у 1 (2 %) больного (рис. 4а). В ис-
следовании Hochhaus et al. (Германия, 2002) частота
мутации H396R составила 1,5 % [28], в то время как
в исследовании итальянской группы GIMEMA (Italian
Group for Hematologic Malignancies of the Adult) ее час-
тота была 0,7 % [25].
Показано, что наличие данной мутации может яв-
ляться причиной резистентности к терапии иматини-
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я141
’2
01
3
бом. Мутация H396R дестабилизирует расположение
активационной (А) петли так, что домен киназы не
может перейти в неактивную пространственную орга-
низацию, необходимую для связывания с иматини-
бом. Обнаружение данной мутации является основа-
нием для повышения дозы иматиниба. В случае
отсутствия положительного результата необходимо
перейти на терапию препаратами 2-го поколения (ни-
лотиниб и дазатиниб) [3].
У 1 больного ХМЛ нами выявлена замена аденина
на гуанин в 730-й позиции, приводящая к замене ме-
тионина в 244-м положении на валин (M244V) (рис. 4в).
Несмотря на то, что фосфорилирующая активность
ABL-киназы с данной мутацией незначительно отли-
чается от активности ABL-киназы дикого типа, в ра-
ботах A. Corbin и T. O’Hare et al. была доказана роль
мутации M244V в развитии резистентности при лече-
нии иматинибом у больных ХМЛ. По мнению авто-
ров, при обнаружении данной мутации у пациентов
необходимо увеличить дозу иматиниба или назначить
ИТК 2-го поколения [7, 27].
Частота мутации M244V в исследовании группы
GIMEMA достигла 4,4 % [25]. По данным Hochhaus
et al., мутация M244V определяется в 1,5 % случаев
[28]. В выборке больных ХМЛ из Республики Башкор-
тостан частота мутации M244V составила 2 %.
В целом, в результате проведенного исследования
мутаций в гене BCR-ABL у 16 резистентных к имати-
нибу пациентов из 50 (32 %) были выявлены 4 мутации
в киназном домене. У 7 пациентов с ХМЛ была обна-
ружена мутация M351T, у 4 пациентов – мутация
T315I, у 3 больных было выявлено по 2 мутации –
T315I и M351T, и у 2 пациентов было определено
по 1 мутации – M244V и H396R.
Частота встречаемости обнаруженных нами в гене
BCR-ABL мутаций варьировала при различных фазах
заболевания. У большинства резистентных пациентов
была хроническая фаза заболевания. У 7 (17 %) из них
были обнаружены мутации в гене BCR-ABL: M351T
(n = 4), T315I (n = 1), M244V (n = 1) и H396R (n = 1).
У 6 пациентов, находившихся в фазе акселерации, бы-
ли выявлены мутации: у 3 больных – мутация M351T,
у 2 – мутация T315I, у 1 – 2 мутации, T315I и M351T.
Из 3 пациентов, у которых наблюдался бластный криз,
у 1 была определена мутация T315I, у 2 – по 2 мутации,
T315I и M351T.
Нами проведен сравнительный анализ уровня экс-
прессии химерного гена у больных с различными му-
тациями в киназном домене BCR-ABL. Установлено,
что наиболее высокий средний уровень экспрессии
химерного гена наблюдается у пациентов с компаунд-
мутацией T315I + M351T (медиана экспрессии –
442,3 %), а также у пациентов с мутацией M351T
(меди ана экспрессии – 94,6 %).
Таким образом, в результате проведенного анали-
за мутаций в гене BCR-ABL у обследованной группы
больных ХМЛ было установлено, что мутации ки-
назного домена встречаются у 32 % больных ХМЛ,
резистентных к терапии иматинибом, что свидетельст-
вует о необходимости проведения своевременной
Рис. 4. Результаты секвенирования образцов кДНК с мутациями H396R (а), M244V (в) и в норме (б, г)
а 410C C C G T G C
110C C G T G A A
110C C A T G A A
C C A T G C T G
б
в г
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 15
1’
20
13диагностики данных мутаций и коррекции тактики
лечения.
Обсуждение
В результате проведенного исследования была по-
казана корреляция ЦО и МО, проявляющаяся в том,
что с уменьшением процентного содержания Ph-
позитивных клеток увеличивалась доля образцов с бо-
лее слабым уровнем экспрессии.
В то же время мониторинг эффективности лече-
ния иматинибом в группе больных с определенным
уровнем ЦО показал неоднородность в структуре МО:
разброс значений экспрессии гена BCR-ABL в каждой
группе пациентов был очень широким. Пациенты
с низким уровнем экспрессии (< 0,1 %) имеются
в группах с малым и частичным ЦО, в группе с частич-
ным ЦО есть также пациенты с отсутствием экспрес-
сии гена BCR-ABL. Тем не менее, с учетом низкой раз-
решающей способности цитогенетического метода
(10-2) и в особенности после достижения цитогенети-
ческой ремиссии, оценивать дальнейшую редукцию
лейкозного клона клеток можно только с помощью
молекулярного метода ПЦР.
Мониторинг лечения ХМЛ в настоящее время
должен включать как цитогенетические, так и молеку-
лярные исследования (определение уровня экспрессии
BCR-ABL, поиск мутаций в гене BCR-ABL) и прово-
диться регулярно. Такой подход позволяет оценить ди-
намику терапии и предсказать возможность раз вития
рецидива. Значимость молекулярного анализа опреде-
ляется также и тем, что уровень МО служит предикто-
ром безрецидивной выживаемости. Повышение уровня
экспрессии BCR-ABL-транскрипта во время терапии
иматинибом косвенно может указывать на наличие му-
таций в гене BCR-ABL, являющихся ведущей причиной
резистентности к препарату. Как следствие, молекуляр-
ный мониторинг целесообразно использовать в каче-
стве скрининговой стратегии для мутационного анализа.
Заключение
Мутации киназного домена гена BCR-ABL явля-
ются одной из основных причин резистентности к те-
рапии иматинибом у некоторых пациентов с ХМЛ, что
подтверждается данными, полученными в нашем
исследовании. Мутационный анализ необходим для
выяснения причин резистентности к иматинибу и по-
иска путей ее преодоления, определения прогноза те-
чения заболевания, особенно при продолжении тера-
пии иматинибом. В 14 % случаев у больных ХМЛ
встречается мутация T315I, приводящая к резистент-
ности к лечению всеми видами ИТК, что свидетель-
ствует о необходимости проведения скрининга данной
мутации у всех пациентов с ХМЛ, имеющих признаки
резистентности. Раннее и своевременное обнаружение
мутации T315I позволит изменить тактику лечения
в пользу трансплантации костного мозга.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Savona M., Talpaz M. Getting to the stem
of chronic myeloid leukaemia.
Nat Rev Cancer 2008;8:341–50.
2. Kurzrock R., Kantarjian H., Druker B.
et al. Philadelphia chromosome–positive
leukemias: from basic mechanisms to
molecular therapeutics. Ann Intern Med
2003;138:819–30.
3. Куцев С.И., Вельченко М.В.
Значение анализа мутаций гена BCR-ABL
в оптимизации таргетной терапии
хронического миелолейкоза. Клин
онкогематол 2008;1(3):190–9.
4. Куцев С.И., Вельченко М.В.,
Морданов С.В. Роль мутаций гена
BCR-ABL в развитии рефрактерности
к иматинибу у пациентов с хроническим
миелолейкозом. Клин онкогематол
2008;1(4):303–9.
5. Quintas-Cardama A., Kantarjian H.,
Cortes J. Mechanisms of primary and
secondary resistance to imatinib in chronic
myeloid leukemia. Cancer Control
2009;16(2):122–31.
6. Barnes D.J., Palaiologou D.,
Panousopoulou E. et al. BCR-ABL
expression levels determine the rate of
development of resistance to imatinib
mesylate in chronic myeloid leukemia.
Cancer Res 2005;65(19):8912–9.
7. Corbin A., La Rose P., Stoffregen E. et al.
Several BCR-ABL kinase domain mutants
associated with imatinib mesylate resistance
remain sensitive to imatinib. Blood
2003;101(11):4611–4.
8. Druker B.J., Sawyers C.L., Kantarjian H.
et al. Activity of a specific inhibitor of the
BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis
of chronic myeloid leukemia and acute
lymphoblastic leukemia with the Philadel-
phia chromosome. N Engl J Med
2001;344(14):1038–42.
9. Виноградова О.Ю., Туркина А.Г.,
Хорошко Н.Д. Организация терапии
хронического миелолейкоза. Первый
общероссийский регистр больных
хроническим миелолейкозом: анализ
и перспективы. Гематол и трансфузиол
2008;53(5):54–8.
10. Sessions J. Chronic myeloid leukemia in
2007. J Manag Care Pharm 2007;13(Suppl
S-a):S4–S7.
11. Аксенова Е.В., Крутов А.А.,
Солдатова И.Н. и др. Стандартизация
молекулярной диагностики хронического
миелолейкоза. Клин онкогематол
2010;3(2):160–5.
12. Baccarani M., Cortes J., Pane F. et al.
Chronic myeloid leukemia: an update of
concepts and management recommendations
of European LeukemiaNet. J Clin Oncol
2009;27:6041–51.
13. Jha C.B., Kucheria K., Choudhary V.P.
Diagnostic role of conventional cytogenetics
and fluorescence in situ hybridization
(FISH) in chronic myeloid leukemia
patients. KUMJ 2006;4(2):171–5.
14. Gabert J., Beillard E., van der
Velden V.H. et al. Standartisation and quality
control studies of «real-time» quantitative re-
verse transcriptase polymerase chain reaction
of fusion gene transcripts for residual disease
detection in leukemia. A Europe Against
Cancer program. Leukemia 2003;17:2318–57.
15. Туркина А.Г. Ингибитор сигнальных
путей STI 571 (Signal Transductor
Inhibitor) – новое направление в лечении
хронического миелолейкоза. Совр онкол
2001;3(2):46–8.
16. Мисюрин А.В., Аксенова Е.В.,
Крутов А.А. и др. Молекулярная
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я161
’2
01
3 диагностика хронического миелолейкоза.
Гематол и трансфузиол 2007;2:35–40.
17. Branford S., Hughes T.P., Rudzki Z.
Monitoring chronic myeloid leukaemia
therapy by real-time quantitative PCR in
blood is a reliable alternative to bone mar-
row cytogenetics. Br J Haematol
1999;107:587–99.
18. Дубина М.В., Куевда Д.А.,
Хомякова Т.Е. и др. Молекулярный
мониторинг эффективности терапии
больных хроническим миелолейкозом
в России. Совр онкол 2010;4(12):11–7.
19. Челышева Е.Ю., Туркина А.Г.,
Мисюрин А.В., Захарова А.В. Раннее
выявление цитогенетического рецидива
при динамическом исследовании уровня
BCR-ABL-транскрипта у больного хро-
ническим миелолейкозом. Гематол
и трансфузиол 2007;2:50–1.
20. Kaeda S.A., Chase A., Goldman J.M.
Cytogenetic and molecular monitoring of re-
sidual desease in chronic myeloid leukemia.
Acta Hematol 2002;107:64–75.
21. Goldman J., Gordon M. Why do chronic
myelogenous leukemia stem cells survive
allogeneic stem cell transplantation
or imatinib: does it really matter?
Leuk Lymphoma 2006;47:1–7.
22. Soverini S., Martinelli G., Amabile M.
et al. Denaturing-HPLC-based assay for
detection of ABL mutations in chronic
myeloid leukemia patients resistant to
Imatinib. Clin Chem 2004;50:1205–13.
23. Куцев С.И., Вельченко М.В.,
Зельцер А.Н. Молекулярно-генетический
мониторинг терапии хронического
миелолейкоза ингибиторами тирозин-
киназ. Онкогематол 2008;4:17–25.
24. Nagar B., Bornmann W.G., Pellicena P.
et al. Crystal structures of the kinase domain
of c-Abl in complex with the small molecule
inhibitors PD173955 and imatinib (STI-571).
Cancer Res 2002;62(15):4236–43.
25. Soverini S., Colarossi S., Gnan A. et al.
Contribution of ABL kinase domain
mutations to imatinib resistance in different
subsets of Philadelphia-positive patients: by
the GIMEMA working party on chronic
myeloid leukemia. Clin Cancer Res
2006;12(24):7374–9.
26. Roche-Lestienne C., Soenen-Cornu V.,
Grardel-Duflos N. at al. Several types
of mutations of the ABL gene can be found
in chronic myeloid leukemia patients resis-
tant to STI571, and they can pre-exist to the
onset of treatment. Blood 2002;100:1014–8.
27. O'Hare T., Eide C.A., Deininger M.
BCR-ABL kinase domain mutations, drug
resistance, and the road to a cure for chronic
myeloid leukemia. Blood 2007;110(7):2242–9.
28. Hochhaus A., Kreil S., Corbin A.S. et al.
Molecular and chromosomal mechanisms of
resistance to imatinib (STI571) therapy.
Leukemia 2002;16(11):2190–6.
29. Branford S., Rudzki Z., Walshet S. et al.
High frequency of point mutations clustered
within the adenosine triphosphate-binding
region of BCR/ABL in patients with chronic
myeloid leukemia or Ph-positive acute lym-
phoblastic leukemia who develop imatinib
(STI571) resistance. Blood 2002;99:3472–5.
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 17
1’
20
13
Транслокация t(1;11)(p32;q23) с образованием химерного гена
MLL-EPS15 при острых лейкозах: обзор литературы
и описание 6 новых случаев. Подходы к мониторированию
минимальной остаточной болезни
Г.А. Цаур1, 2, А.М. Попов1, 2, О.М. Плеханова1, А.М. Кустанович3, О.В. Алейникова3, Т.Л. Гиндина4, А.С. Демина1, 2, А.Е. Друй1, 2, 5, С.Ю. Ковалев6, К.Л. Кондратчик7, А.В. Мисюрин8, Н.В. Мякова8, Т.О. Ригер1, 2,
Л.И. Савельев1, 2, 5, О.И. Сокова9, О.В. Стренева1, 2, М.В. Сучкова10, Ю.П. Финашутина8, Е.В. Флейшман9, Е.В. Шориков1, 2, Р.И. Юцкевич3, C. Meyer11, R. Marschalek11, Л.Г. Фечина1, 2
1ГБУЗ CO «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург;2ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург;
3ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии», Минск, Республика Беларусь;4Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский
государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России;5ГБОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия», Екатеринбург;
6ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина», Екатеринбург;7Морозовская детская городская клиническая больница, Москва;
8ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии
им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва;9ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва;
10ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, Москва;11Diagnostic Center of Acute Leukemia, Institute of Pharmaceutical Biology / ZAFES, Goethe-University of Frankfurt,
Франкфурт-на-Майне, Германия
Контакты: Григорий Анатольевич Цаур [email protected]
На основании собственных исследований (6 пациентов) и данных литературы (27 случаев) представлена клинико-лабораторная
характеристика острых лейкозов с транслокацией t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15. Установлено, что наиболее часто транслока-
ция t(1;11)(p32;q23) обнаруживается у детей первого года жизни (медиана возраста составляет 8 мес). При остром лимфоблас-
тном лейкозе лица мужского пола болеют реже (соотношение 1:3), при остром миелоидном лейкозе соотношение полов 1:1.
Хромосомные аномалии, дополнительные к t(1;11)(p32;q23), выявлены в 38 % случаев. Наиболее часто зоной разрывов в ДНК гена
EPS15 является интрон 1. Описано 4 типа химерных транскриптов MLL-EPS15. Создана и успешно применена комбинация прай-
меров, флуоресцентных зондов и плазмиды для мониторирования химерного транскрипта MLL-EPS15 методом полимеразной
цепной реакции в режиме реального времени. Подобраны условия и проведен мониторинг минимальной остаточной болезни (МОБ)
по индивидуальным точкам разрыва в геномной ДНК у пациентов с наличием химерного гена MLL-EPS15. Сравнение данных оп-
ределения МОБ в геномной ДНК и кДНК показало высокую качественную сопоставимость результатов (92 %).
Ключевые слова: острый лейкоз, дети первого года жизни, перестройки гена MLL, транслокация t(1;11)(p32;q23), химерный ген
MLL-EPS15, минимальная остаточная болезнь
Translocation t(1;11)(p32;q23) with MLL-EPS15 fusion gene formation in acute leukemias: a review and 6 new case reports. Approaches to minimal residual disease monitoring
G.A. Tsaur1, 2, A.M. Popov1, 2, O.M. Plekhanova1, A.M. Kustanovich3, O.V. Aleynikova3, T.L. Gindina4, A.S. Demina1, 2, A.Ye. Druy1, 2, 5, S.Yu. Kovalev6, K.L. Kondratchik7, A.V. Misyurin8, N.V. Myakova8, T.O. Riger1, 2, L.I. Savelyev1, 2, 5, O.I. Sokova9, O.V. Streneva1, 2,
M.V. Suchkova10, Yu.P. Finashutina8, Ye.V. Fleyshman9, Ye.V. Shorikov1, 2, R.I. Yutskevich3, C. Meyer11, R. Marschalek11, L.G. Fechina1, 2
1Regional Childrenʼs Clinical Hospital №1, Yekaterinburg; 2Research Institute of Medical Cell Technologies, Yekaterinburg;
3Belarusian Research Center for Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Minsk, Republic of Belarus; 4Raisa Gorbacheva Memorial Institute of Children Hematology and Transplantation, St.-Petersburg I.P. Pavlov State Medical University,
Ministry of Health of Russia;5Ural State Medical Academy, Yekaterinburg;
6The first President of Russia Boris Yeltsin Ural Federal University, Yekaterinburg;7Morozov Children Municipal Clinical Hospital, Moscow;
8Dmitriy Rogachev Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of Russia, Moscow;9N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow;
10Hematology Research Center, Ministry of Health of Russia, Moscow;11Diagnostic Center of Acute Leukemia, Institute of Pharmaceutical Biology / ZAFES, Goethe-University of Frankfurt, Frankfurt on the Main, Germany
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я181
’2
01
3 We performed clinical and laboratory characterization of patients with rare translocation t(1;11)(p32;q23) leading to MLL-EPS15 fusion
gene formation. Study cohort consisted of 33 primary acute leukemia (AL) cases including 6 newly diagnosed and 27 patients previously
described in literature. Among study group patients t(1;11)(p32;q23) was found most frequently in infant AL cases (median age 8 months).
In acute lymphoblastic leukemia (ALL) male/female ratio was 1:3, in acute myeloid leukemia (AML) it was 1:1. Additional cytogenetic ab-
errations in 38 % of patients were revealed. The most frequent breakpoint position in EPS15 gene was intron 1. Four different types of MLL-
EPS15 fusion gene transcripts were detected. Primers-probe-plasmid combination for MLL-EPS15 fusion gene transcript monitoring by re-
al-time quantitative polymerase chain reaction (RQ-PCR) was developed and successfully applied. In 3 patients RQ-PCR was done on
genomic DNA for absolute quantification of MLL-EPS15 fusion gene. High qualitative concordance rate (92 %) was noted between minimal
residual disease data obtained in cDNA and genomic DNA for MLL-EPS15 fusion detection.
Key words: acute leukemia, infants, MLL rearrangements, translocation t(1;11)(p32;q23), MLL-EPS15 fusion gene, minimal residual disease
Введение
Перестройки 11q23/MLL встречаются примерно
в 10 % всех случаев острого лимфобластного лейкоза
(ОЛЛ) и в 3 % случаев острого миелоидного лейкоза
(ОМЛ) [1, 2]. На сегодняшний день на молекулярном
уровне охарактеризовано 64 различных перестройки
хромосомного района 11q23 с участием гена MLL,
встречающихся при острых лейкозах (ОЛ) и при мие-
лодиспластическом синдроме [3]. Наиболее частыми
партнерами MLL являются гены AFF1 (AF4), MLLT3
(AF9), MLLT1 (ENL), MLLT10 (AF10), MLLT4 (AF6),
ELL, на долю которых суммарно приходится около
85 % всех случаев MLL-позитивных ОЛ, как у детей,
так и у взрослых. Среди оставшихся 15 % случаев наи-
более часто обнаруживается транслокация t(1;11)
(p32;q23) с образованием химерного гена MLL-EPS15,
частота выявления которой составляет примерно 3 %
от общего числа перестроек гена MLL [3, 4]. Данная
транслокация встречается у детей и у взрослых как при
de novo, так и при вторичных ОЛ [4–22]. Также описа-
ны 2 случая миелодиспластического син дрома с нали-
чием аберраций хромосомного района 1p32 у лиц, пе-
реживших атомную бомбардировку в Японии: в одном
случае была выявлена делеция del(1)(p22p32), во втором
транслокация t(1;11)(p32;q23) [23].
Ген EPS15 (AF1P, AF-1P, MLLT5), располагающий-
ся в хромосомном регионе 1р32, кодирует один из ре-
цепторов эпидермального фактора роста, отвечающий
за эндоцитоз данного белка. Ген имеет протяженность
165 т. н., состоит из 25 экзонов и кодирует белок, со-
стоящий из 896 аминокислот с молекулярным весом
98 656 Да [24]. Транскрипция гена осуществляется в те-
ломерном направлении. Описано 10 транскриптных
вариантов, образующихся вследствие альтернатив ного
сплайсинга, однако только 4 из них кодируют белок [25].
У человека наиболее высокая экспрессия гена EPS15
выявлена в Т- и В-лимфоцитах, моноцитах и лимфо-
бластах [26]. Белок EPS15, как участник сигнального
пути рецептора эпидермального фактора роста (EGFR),
регулирует рост и пролиферацию клеток. Структура
белка EPS15 приведена на рис. 1.
Химерный ген MLL-EPS15 впервые описан O. Bernard
et al. [13]. В основе образования данного химерного
гена лежит реципрокная транслокация t(1;11)(p32;q23)
(рис. 2).
Известно, что существует 2 альтернативных меха-
низма активации онкогенного потенциала белка MLL
[29, 30]. Первый, более универсальный механизм, свя-
зан с воздействием на мотив белка-партнера MLL раз-
личных внешних факторов, что ведет к последующему
неконтролируемому синтезу белка. Данный механизм
реализуется в том случае, если белок-партнер локали-
зуется в ядре клетки. Второй механизм, предложенный
для MLL-EPS15 и ряда других химерных белков
с участием MLL, локализующихся в цитоплазме, –
двуспиральная олигомеризация функциональных до-
менов белка EPS15, приводящая к лейкозогенной
трансформации белка MLL, что, в свою очередь, ведет
к увеличенной способности клеток к самообновле-
нию. Было показано, что при ОЛ действие химерного
белка опосредуется через гены семейства HOX [31–34],
однако по отношению к ОЛЛ данная точка зрения раз-
деляется не всеми авторами [35].
В доступной нам литературе встретилось описание
всего 25 случаев de novo ОЛ, а также 2 рецидивов ОЛ
с наличием t(1;11)(p32;q23) [4–22]. Структура химер-
ного гена MLL-EPS15 была описана всего в 2 случаях,
а структура химерного транскрипта – в 5. Целью данной работы была клинико-лабораторная характе-
ристика пациентов с транслокацией t(1;11)(p32;q23)/
Рис. 1. Структура EPS15. В структуре данного белка выделяют: 1. Три N-концевых EPS15-гомологичных домена (EH1, EH2, EH3), которые
необходимы для присоединения к цитоплазматической мембране путем взаимодействия с белками и прямого связывания с фосфолипидами; 2. Би-
спиральный домен (ССD), ответственный за гомо- и гетеродимеризацию; 3. Аспартат-пролин-фенилаланиновые повторы (DPF), которые могут
связываться с α-субъединицей адапторного белка AP-2; С-концевой фрагмент представлен 4 убиквитин-связывающими мотивами (UIM), которые
необходимы для убиквитинилирования EGFR [27, 28]
ЕН1 ЕН2 ЕН3 ССD DPF UIM1 UIM2
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 19
1’
20
13
MLL-EPS15, а также разработка методики монитори-
рования минимальной остаточной болезни (МОБ)
у пациентов с этой транслокацией методом полиме-
разной цепной реакции (ПЦР). В отличие от других,
более часто встречающихся перестроек гена MLL, для
которых описаны различные комбинации праймеров
и зондов [36, 37], нам не встретилось методики мони-
торирования МОБ у пациентов с наличием химерного
гена MLL-EPS15 или его транскрипта.
Материалы и методы
За период с февраля 2000 по апрель 2012 г. было
обследовано 186 детей в возрасте от 1 до 365 дней с ОЛ,
включая 120 пациентов с ОЛЛ, 58 – с ОМЛ, 3 – с ост-
рым недифференцированным лейкозом, по 2 – с ост-
рым бифенотипическим и острым билинейным лей-
козами, еще в 1 случае тип ОЛ не был определен.
Транслокация t(1;11)(p32;q23) и/или химерный ген
MLL-EPS15 были выявлены нами в 6 случаях. Паци-
енты, у которых была обнаружена транслокация t(1;11)
(p32;q23), получали терапию по протоколам MLL-Baby
[38] или ALL IC-BFM 2002 в детских
онкогематологиче ских клиниках Российской Федера-
ции и Республики Беларусь. Информированное согла-
сие на проведение диагностических и лечебных про-
цедур было получено во всех случаях.
Для цитогенетического исследования использова-
ли клетки костного мозга, взятые до начала терапии.
Применялась техника краткосрочного культивирова-
ния клеток в течение 24 ч. Методом окраски хромо-
сомных препаратов был GTG-вариант. В большинстве
случаев анализировали не менее 20 метафазных плас-
тинок. Кариотипирование проводили в соответствии
с международной номенклатурой хромосом человека,
принятой на момент выполнения стандартного цито-
генетического исследования [39–41]. В ходе данной
работы все кариотипы были повторно оценены с уче-
том рекомендаций ISCN 2009 [41]. Дополнительными
хромосомными аберрациями считали все клональные
аномалии, сочетавшиеся с t(1;11)(p32;q23) [42]. Карио-
тип считали комплексным, если каждая клетка лей-
козного клона у пациентов с ОМЛ содержала не менее
3 хромосомных изменений, включая перестройки
района 11q23 [43, 44].
Флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) про-
водили с использованием гибридизационной системы
TermoBrite (StatSpin, США) на микроскопе DM 4000
(Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Германия) при по-
мощи программного обеспечения CW4000 FISH (Leica
Microsystems Wetzlar GmbH, Германия). Применяли
локус-специфичный зонд LSI MLL Dual Color
Rearrangement Probe 11q23 (Abbott Molecular, США),
а также цельнохромосомные зонды для полного ок-
рашивания 1-й и 11-й хромосом, меченные FITC
и TexasRed соответственно (Metasystems, Германия).
Длинную инвертированную ПЦР (long-distance
inverse PCR-LDI-PCR) выполняли по описанной ра-
нее методике [45]. В качестве исходного материала
использовали геномную ДНК в количестве 1 мкг, вы-
деленную из лейкоцитов и бластных клеток костного
мозга, взятого в момент установления диагноза.
ДНК обрабатывали экзонуклеазами рестрикции BamHI
и BglII, а затем лигировали. Полученный продукт
использовали для проведения нескольких инвертиро-
ванных ПЦР-реакций. Ампликоны секвенировали
с целью определения индивидуальной для каждого
пациента точки разрыва в MLL и гене-партнере.
Выделение РНК и обратную транскрипцию прово-
дили по ранее описанной методике [46]. Качество по-
лученной РНК оценивали методом капиллярного элек-
трофореза на биоанализаторе Agilent 2100 (Agilent,
США). В дальнейший анализ брали образцы с показа-
телем целостности РНК более 4,2, который, как было
доказано ранее, является достаточным для эффектив-
ного проведения ПЦР в режиме реального времени
(ПЦР-РВ) [47].
Обратно-транскриптазную ПЦР (ОТ-ПЦР) про-
водили с использованием набора HemaVision (DNA-
technology A/S, Дания) и TaqF ДНК-полимеразы
(ЦНИИ эпидемиологии, Россия) в 2 этапа, согласно
инструкции производителя. На первом этапе ставили
8 мультиплексных ПЦР-реакций. При получении по-
ложительного результата в одной из пробирок на вто-
ром этапе проводили несколько моноплексных реак-
ций. Результат расценивали как позитивный, если
на обоих этапах ПЦР обнаруживалось наличие специ-
фического ПЦР-продукта, совпадающего по размеру
с ожидаемым. Результат расценивали как отрицатель-
ный, если в ходе первого этапа ПЦР не было выявлено
продуктов амплификации и во всех пробирках присут-
ствовала полоса внутреннего контроля размером
911 п. н. Детекцию проводили методом горизонтального
электрофореза в 2 % агарозном геле. Дополнительно
Рис. 2. Основной механизм образования химерного гена у пациентов
с наличием MLL-EPS15 – реципрокная транслокация
1 (N) 11 (N) Der(1) Der(11)
MLL-EPS15EPS15-MLL
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я201
’2
01
3
Табл
ица
1. К
лин
ик
о-л
або
ра
то
рн
ая
ха
ра
кт
ери
сти
ка
па
ци
ент
ов
с О
Л и
на
лич
ием
t(1
;11
)(p
32
;q2
3)/
ML
L-E
PS
15
(н
ач
ало
)
№ п
а-ци
ента
Пол
Воз
-ра
стЛ
ейко
циты
(×
109 /л
)К
арио
тип
Вид
ОЛ
FIS
HХ
имер
ный
ген
Хим
ерны
й тр
анск
рипт
Исх
од т
ерап
ииИ
сточ
ник
1ж
НД
**
НД
46
,XX
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)
ВП
-ОЛ
Л—
——
НД
D.
Wil
lia
ms
et
al.
,
19
84
[5
]
2ж
8 м
ес
42
54
6,X
X,t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
)[6
]B
I-О
ЛЛ
——
—П
ац
иен
т ж
ив
в П
ПР
со
ср
ок
ом
на
бл
юд
ен
ия
19
мес
Y.
Ka
nek
o e
t a
l.,
19
86
[6
]3
м4
мес
10
44
6,X
Y,t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
)[1
7]/
46
,XY
[20
]B
IV-О
ЛЛ
——
—
См
ер
ть
в р
ем
ис
си
и о
т и
нф
ек
-
ци
и ч
ер
ез
9 м
ес
от н
ач
ал
а т
ер
ап
ии
4ж
< 1
го
да
НД
46
,XX
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)
НД
——
—Н
ДM
. G
rego
ire e
t a
l.,
19
87
[7
]
5ж
2 м
ес
26
0
46
,XX
,del(
1)(
p3
2),
del(
11
)(q
13
q2
3),
der(
4)
t(1
;11
;4)(
1p
ter
1p
32
::1
1q
23
11
q1
3::
4p
16
4q
ter)
[29
]/4
4,X
X,-
14
,-2
1[1
]
ОМ
Л—
——
НД
A.
Sely
pes
et
al.
,
19
87
[8
]
6ж
1 г
од
НД
46
,XX
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)
BI-
ОЛ
Л—
——
НД
A.
Ha
gem
eij
er
et
al.
, 1
98
7 [
9]
7ж
3,3
го
да
15
34
6,X
X,t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
)[5
]/4
6,X
X[1
8]
ВI-
ОЛ
Л—
——
См
ер
ть
от р
ец
ид
ив
а ч
ер
ез
5
мес
от н
ач
ал
а т
ер
ап
ии
S.
Ra
imo
nd
i et
al.
,
19
89
[1
0]
8ж
35
лет
НД
46
,XX
,t(X
;5)(
q2
6;p
15
),t(
1;1
1)(
p3
2;q
23
),i(
9)
(q1
0),
del(
17
)(p
11
)/4
6,X
X,i
(9)(
q1
0),
ad
d(1
2)
(p1
3),
del(
17
)(p
11
)
ОЛ
Л—
——
НД
C.
Sh
ipp
ey
et
al.
,
19
89
[1
1]
9м
НД
НД
50
,XY
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3),
+?7
,+2
1,+
2m
ar*
*О
ЛЛ
——
—Н
ДT
. A
bsh
ire e
t a
l.,
19
92
[1
2]
10
м4
го
да
46
54
6,X
Y,t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
)[1
1]/
46
,XY
[1]
ОМ
Л М
0—
—M
LL
эк
зон
9 –
EP
S1
5 э
кзо
н 2
НД
O.
Bern
ard
et
al.
,
19
94
[1
3]
11
ж4
3 г
од
аН
Д4
6,X
X,t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
),+
der(
1)t
(1;1
2)
(p1
2;q
12
),-1
2[5
]/4
6,X
X[4
]О
МЛ
M5
a—
—M
LL
эк
зон
9 –
EP
S1
5 э
кзо
н 2
НД
12
ж1
го
дН
Д4
6,X
X,t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
)О
ЛЛ
——
—
Со
бы
ти
е* ч
ер
ез
20
мес
от
на
ча
ла
тер
ап
ии
, с
мер
ть
чер
ез
24
мес
C.
Ha
rris
on
et
al.
,
19
98
[4
]1
3ж
5 м
ес
НД
46
,XX
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)
ВI-
ОЛ
Л—
——
Па
ци
ен
т ж
ив
в П
ПР
по
сл
е
пр
ов
ед
ен
ия
ТГ
СК
. С
ро
к н
а-
бл
юд
ен
ия
54
мес
14
ж8
мес
НД
46
,XX
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)
ВI-
ОЛ
Л—
——
Со
бы
ти
е ч
ер
ез
21
мес
от
на
ча
ла
тер
ап
ии
, с
мер
ть
чер
ез
32
мес
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 21
1’
20
13
№ п
а-ци
ента
Пол
Воз
-ра
стЛ
ейко
циты
(×
109 /л
)К
арио
тип
Вид
ОЛ
FIS
HХ
имер
ный
ген
Хим
ерны
й тр
анск
рипт
Исх
од т
ерап
ииИ
сточ
ник
15
ж2
мес
НД
46
,XX
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)
ОМ
Л М
0—
——
Со
бы
ти
е ч
ер
ез
4 м
ес
от н
ач
ал
а
тер
ап
ии
, с
мер
ть
чер
ез
6 м
ес
C.
Ha
rris
on
et
al.
,
19
98
[4
]1
6ж
67
лет
НД
46
,XX
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)/
47
,id
em
,+8
ОМ
Л М
5M
LL
R—
—
Па
ци
ен
т ж
ив
в П
ПР
. С
ро
к
на
бл
юд
ен
ия
5 м
ес
17
ж1
го
дН
Д4
6,X
X,t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
)О
МЛ
М4
——
—П
ац
иен
т ж
ив
в П
ПР
.
Ср
ок
на
бл
юд
ен
ия
37
мес
18
м3
мес
НД
46
,XY
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)[
16
]/4
6,X
Y[4
]**
ОБ
фЛ
НД
НД
НД
См
ер
ть
от л
ей
ко
за ч
ер
ез
9,7
мес
от н
ач
ал
а т
ер
ап
ии
C.
Feli
x e
t a
l.,
19
98
[14
]
19
м5
9 л
ет
НД
46
,XY
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)[
8]/
47
,id
em
,+1
8[2
]О
ЛЛ
ML
L R
——
НД
A.
von
Berg
h e
t a
l.,
20
00
[1
5]
20
ж6
мес
89
46
,XX
,der(
1)t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
),in
v(1
)
(p1
3q
21
),d
er(
11
)t(1
;11
)(p
32
;q2
3)
ОЛ
ЛН
Д—
—В
рем
я н
аб
лю
ден
ия
до
со
бы
ти
я
31
мес
J. C
hess
ell
s et
al.
,
20
02
[1
6]
21
м9
мес
18
9
46
,XY
,t(1
;4)(
q2
1;p
15
),−8
,del(
9)
(p1
1),
der(
11
)t(1
;11
)(p
32
;q2
3),
+1
3,d
el(
15
)
(q2
2)
ОМ
Л М
5Н
Д—
—П
ац
иен
т н
ах
од
итс
я в
ПП
Р с
о
ср
ок
ом
на
бл
юд
ен
ия
14
0 м
ес
22
м6
мес
18
7
46
,XY
,der(
1)t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
),d
er(
10
)
t(1
;11
;10
)(p
32
;q2
3q
14
;p1
1),
del(
10
)
(q2
2q
25
),r(
11
)(p
11
q1
4)
ОМ
Л М
5Н
Д—
—В
рем
я н
аб
лю
ден
ия
до
со
бы
ти
я
6 м
ес
23
ж2
го
да
87
46
,XX
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)[
17
]/4
6,X
X[3
]О
МЛ
М5
ML
L R
——
НД
K.
Pa
rk e
t a
l.,
20
01
[17
] и
H.
Kim
et
al.
, 2
00
2 [
18
]
24
м6
2 г
од
а3
74
5,X
Y,t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
),-7
[9]/
46
XY
[4]
ОМ
Л М
4M
LL
R—
—
Рец
ид
ив
чер
ез
16
мес
от н
ач
ал
а
тер
ап
ии
. С
мер
ть
от р
ец
ид
ив
а
чер
ез
1 н
ед
N.
Do
uet-
Gu
ilb
ert
et
al.
, 2
00
5 [
19
]
25
м7
6 л
ет
25
5,X
Y,t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
),+
der(
1)t
(1;1
1)
x2
,ad
d(3
)(p
11
)+6
,+8
x3
,+2
1[]
О
МЛ
М5
ML
L R
—M
LL
эк
зон
9 –
EP
S1
5 э
кзо
н 2
См
ер
ть
от р
ец
ид
ив
а ч
ер
ез
13
мес
от н
ач
ал
а т
ер
ап
ии
M.
Sa
ga
wa
et
al.
,
20
06
[2
0]
26
ж2
мес
#1
02
46
,XX
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)[
13
]/4
6,X
X[7
]B
I-О
ЛЛ
ML
L R
ML
L э
кзо
н
10
– E
PS
15
и
нтр
он
9
ML
L э
кзо
н 9
–
EP
S1
5 э
кзо
н
10
См
ер
ть
от в
ен
оо
кк
лю
зио
нн
ой
бо
лезн
и н
а д
ен
ь +
8 п
ос
ле
ТГ
СК
R.
Ko
tec
ha
et
al.
,
20
12
[2
1,
22
]
27
ж2
мес
#1
56
46
,XX
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)
[8]/
47
,id
em
,+X
[4]/
46
,XX
[8]
B
I-О
ЛЛ
ML
L R
ML
L э
кзо
н
10
– E
PS
15
ин
тр
он
9
ML
L э
кзо
н 9
–
EP
S1
5 э
кзо
н
10
ЦН
С-р
ец
ид
ив
на
ср
ок
е 1
8 м
ес
по
сл
е Т
ГС
К.
Па
ци
ен
т ж
ив
28
ж5
мес
43
04
6,X
X,t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
)[1
1]
BI-
ОЛ
Л—
——
Па
ци
ен
т ж
ив
в П
ПР
со
ср
ок
о м
на
бл
юд
ен
ия
39
мес
На
сто
ящ
ая
ра
бо
та
29
м7
мес
НД
47
,XY
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3),
+8
[11
] Н
Д—
——
Отс
утс
тв
ие о
тв
ета
на
тер
ап
ию
,
см
ер
ть
чер
ез
2 м
ес
от н
ач
ал
а
леч
ен
ия
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я221
’2
01
3 всех пациентов с выявленным химерным геном MLL-
EPS15 тестировали в гнездной ОТ-ПЦР с праймерами,
предложенными N. Palisgaard et al. [36].
Полученные в ходе гнездной ОТ-ПЦР ампликоны
очищали при помощи «Wizard SV Gel and PCR Clean-
Up System» (Promega, Германия). Секвенирующую
реакцию ставили с применением праймеров, исполь-
зовавшихся во втором раунде гнездной ОТ-ПЦР, и на-
бора BigDye Terminator 3.1. (Applied Biosystems, США)
согласно инструкции производителя. Секвенирование
проводили в 2 направлениях на генетическом анали-
заторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США).
Для конструирования калибратора, используемо-
го для количественной оценки величины химерного
транскрипта MLL-EPS15 в ходе ПЦР-РВ, была ис-
пользована РНК пациента № 30 (табл. 1). После про-
ведения гнездной ОТ-ПЦР по описанной ранее ме-
тодике [36] визуализацию ампликонов проводили
методом электрофореза в 6 % полиакриламидном геле.
Выделение ДНК-фрагмента из геля выполняли путем
элюирования TE-буфером с последующим осажде-
нием 70 % этиловым спиртом по общепринятой мето-
дике. Перед процедурой лигирования проводили на-
ращивание «тупых» концов с использованием Taq
ДНК-полимеразы (ООО «Генотехнология») в присут-
ствии дезоксиаденозинтрифосфата. Полученный ам-
пликон лигировали в плазмидный вектор «pGEM-T
Еasy» (Promega, Германия) с последующей его транс-
формацией в бактериальную культуру Е. coli. Из ото-
бранных положительных клонов E. coli выделяли
плазмидную ДНК методом щелочного лизиса. Кон-
центрацию ДНК определяли спектрофотометрически.
Для использования в качестве калибратора для
ПЦР-РВ сделали 5 разведений (101, 102, 103, 105, 106
копий/5 мкл), аналогичных использованным в между-
народном проекте «Европа против рака» [48].
ПЦР-РВ для количественной оценки химерного
транскрипта выполняли в соответствии с ранее опи-
санными протоколами [48, 49]. В качестве калибрато-
ров применяли плазмиды, несущие фрагменты химер-
ного транскрипта MLL-EPS15 и контрольного гена
ABL1 (Ipsogen, Франция). Нуклеотидная последова-
тельность использовавшихся праймеров и зондов для
определения транскрипта MLL-EPS15 приведена
в табл. 2. Для количественной оценки величины МОБ
на основании данных, полученных путем ПЦР-РВ,
использовалась методика расчета, рекомендованная
консорциумом «Европа против рака» [49].
ПЦР-РВ для определения количества химерного
гена MLL-EPS15 в геномной ДНК проводили по ранее
описанному протоколу [50] с рядом модификаций.
ПЦР выполняли в мультиплексном формате: реакци-
онная смесь включала 2 пациент-специфичных прай-
мера и зонд, меченный карбоксифлуоресцеином (FAM),
комплементарных зоне слияния генов MLL и EPS15,
а также 2 праймера и зонд, меченный карбокси-Х-род-
амином (ROX), для амплификации контрольного гена
№ п
а-ци
ента
Пол
Воз
-ра
стЛ
ейко
циты
(×
109 /л
)К
арио
тип
Вид
ОЛ
FIS
HХ
имер
ный
ген
Хим
ерны
й тр
анск
рипт
Исх
од т
ерап
ииИ
сточ
ник
30
ж9
мес
91
46
,XX
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)[
11
]B
I-О
ЛЛ
ML
L R
ML
L и
нтр
он
10
– E
PS
15
ин
тр
он
1
ML
L э
кзо
н
10
– E
PS
15
эк
зон
2
Па
ци
ен
т ж
ив
в П
ПР
со
ср
ок
ом
на
бл
юд
ен
ия
64
мес
На
сто
ящ
ая
ра
бо
та
31
м1
ден
ь2
12
46
,XY
,t(1
;11
)(p
32
;q2
3)[
13
]/4
6,X
Y[1
]B
I-О
ЛЛ
ML
L R
ML
L и
нтр
он
11
– E
PS
15
ин
тр
он
1
ML
L э
кзо
н
11
– E
PS
15
эк
зон
2
Рец
ид
ив
на
ср
ок
е 1
8 м
ес
,
см
ер
ть
от р
ец
ид
ив
а ч
ер
ез
28
мес
от н
ач
ал
а т
ер
ап
ии
32
ж3
мес
49
—B
I-О
ЛЛ
ML
L R
ML
L и
нтр
он
11
– E
PS
15
ин
тр
он
1
ML
L э
кзо
н
11
– E
PS
15
эк
зон
2
Рец
ид
ив
на
ср
ок
е 7
мес
, с
мер
ть
от р
ец
ид
ив
а ч
ер
ез
9 м
ес
от
на
ча
ла
тер
ап
ии
33
ж4
мес
30
04
6,X
X,t
(1;1
1)(
p3
2;q
23
)[1
1]
BI-
ОЛ
ЛM
LL
RM
LL
ин
тр
он
10
– 1
p3
2
ML
L э
кзо
н
10
– E
PS
15
эк
зон
2
Па
ци
ен
т ж
ив
в П
ПР
со
ср
ок
ом
на
бл
юд
ен
ия
20
мес
При
меч
ание
. FIS
H –
рез
ульт
ат
ы ф
луо
рес
цен
тн
ой
ги
бр
ид
иза
ци
и i
n s
itu
c л
ок
ус-с
пец
иф
ич
ны
м з
он
до
м;
«НД
» –
нет
да
нн
ых;
«—»
– и
ссле
до
ван
ие
не
пр
ове
ден
о;
* –
ви
д н
ебла
гоп
ри
ят
но
го с
обы
ти
я н
е бы
л ук
аза
н а
вто
ра
ми
; #
– м
он
ози
гот
ны
е бли
знец
ы;
ОБ
фЛ
– о
стр
ый
би
фен
от
ип
ич
еск
ий
лей
ко
з; Т
ГС
К –
тр
ан
спла
нт
ац
ия
гем
оп
оэт
ич
еск
их с
тво
ловы
х
кле
то
к;
ПП
Р –
по
лна
я п
ро
до
лжа
ющ
ая
ся р
еми
сси
я;
**
– о
бра
зцы
№ 9
и 1
8 в
зят
ы о
т п
ац
иен
тов
при
рец
ид
иве
ОЛ
, и
ни
ци
аль
но у
па
ци
ент
а №
18
оп
ред
елялс
я н
орм
аль
ны
й к
ари
от
ип
, у
па
ци
ент
а №
9 –
слу
ча
йн
ая
тр
ан
сло
ка
ци
я 4
6,X
Y,t
(1;1
2)(
p3
2;q
24
).
Табл
ица
1. К
лин
ик
о-л
або
ра
то
рн
ая
ха
ра
кт
ери
сти
ка
па
ци
ент
ов
с О
Л и
на
лич
ием
t(1
;11
)(p
32
;q2
3)/
ML
L-E
PS
15
(о
ко
нч
ан
ие)
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 23
1’
20
13N-ацетилглюкозамин киназы (NAGK), располагающе-
гося на коротком плече хромосомы 2 в регионе 2p12.
Ген NAGK использовался для исключения случайной
ошибки. Нуклеотидные последовательности праймеров
и зондов приведены в табл 2. В ПЦР-смесь вносили
600 нг геномной ДНК. Амплификацию проводили с ис-
пользованием TaqF-полимеразы (ЦНИИ эпидемиоло-
гии, Россия) по следующей программе: 95 °С 15 мин,
45 циклов: 95 °С 15 с – 60 °С 60 с. Для создания калибро-
вочной кривой проводили амплификацию 10-кратных
разведений ДНК пациента в смеси ДНК, полученной
от 5 пациентов без онкогемато логических заболеваний,
взятых в общем количестве 600 нг в соотношениях от
1:10 до 1:100 000. Все образцы тестировали в 2 повторах.
Интерпретация результатов ПЦР-РВ проводилась
исходя из рекомендаций Европейской рабочей группы
по изучению МОБ при ОЛЛ ESG-MRD-ALL [51] c до-
полнениями T. Burmeister et al. [50]. Величина МОБ
была рассчитана как среднее значение числа копий
2 повторов каждого образца при следующих условиях.
1. Отсутствие амплификации в отрицательном
контроле (смесь ДНК, использованная для создания
разведений) или превышение значения порогового
цикла в образце пациента более чем на 3,0 от величи-
ны порогового цикла отрицательного контроля.
2. Разброс значений порогового цикла контрольно-
го гена NAGK в 2 повторах 1 образца не превышает 1,5.
3. Коэффициент корреляции (R2) выше 0,95.
4. Угол наклона калибровочной кривой укладыва-
ется в диапазон от –2,5 до –4,5. В каждом образце рас-
считывался количественный диапазон согласно реко-
мендациям ESG-MRD-ALL [51].
Таблица 2. Использованные праймеры и зонды
Нуклеотидная последовательность 5’-3’ Ген Экзон Локализация
Химерный транскрипт MLL-EPS15 (кДНК)
Прямой праймер AGGAGAATGCAGGCACTTTGA MLL 10 4135-4155
Обратный праймер AAGCCAACACCCTTCCAGTA EPS15 3 201-182
Зонд ROX-CATCCTCAGCACTCTCTCCAATGGCAATA-BHQ2 MLL 10 4157-4185
Контрольный ген ABL (кДНК)
Прямой праймер AGCTCCGGGTCTTAGGCTAT ABL 2 263-282
Обратный праймер TAGTTGCTTGGGACCCAGCC ABL 3 357-328
Зонд FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-BHQ1 ABL 3 323-296
Химерный ген MLL-EPS15 у пациента № 30 (ДНК)
Прямой праймер GCAGCAGTTATTTTTGGACTCATTGA MLL
Обратный праймер GATCTTTGTGACAGAGCAAGTCTTTA EPS15
Зонд FAM-TGATTACGCTTACAGTTACATGAACCCACACAT-BHQ1 EPS15
Химерный ген MLL-EPS15 у пациента № 31 (ДНК)
Прямой праймер TCCCTGTTTAAACCAGCTAAAGAAATGT MLL
Обратный праймер TCAAGTGTAATTTAAAACAAACACCATTTCC EPS15
Зонд FAM-TGCTACTCTAATAGCAGATTCCTTCCTAAAATCT-BHQ1 MLL
Химерный ген MLL-EPS15 у пациента № 32 (ДНК)
Прямой праймер AGTGGGCATGTAGAGGTAAG MLL
Обратный праймер GCAGGAGGATTGGTTGAG EPS15
Зонд FAM-TGCACTCTAGCCTGGGCAACAGAGTGAGA-BHQ1 EPS15
Контрольный ген NAGK (ДНК)
Прямой праймер TGGGCAGACACATCGTAGCA NAGK
Обратный праймер CACCTTCACTCCCACCTCAAC NAGK
Зонд ROX-TGTTGCCCGAGATTGACCCGGT-BHQ-2 NAGK
Примечание. Нуклеотидная последовательность и нумерация экзонов гена MLL дана I. Nilson et al. [52], EPS15 – согласно NM_001981.2, ABL – согласно NM_005157.
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я241
’2
01
3 Результаты терапии оценивались по кривым общей
(ОВ) и бессобытийной выживаемости (БСВ), постро-
енным по методу Каплана–Майера [52]. Для сравнения
кривых выживаемости использовался непараметричес-
кий log-rank критерий. Различия считались достовер-
ными при р < 0,05.
Результаты
Данные о 27 пациентах, представленных в литера-
туре, а также 6 вновь описываемых нами случаев, при-
ведены в табл. 1. Возраст на момент установления
диагноза был известен у 31 пациента. Среди них было
19 (62 %) детей первого года жизни, 6 (19 %) детей
в возрасте от 1 года до 4 лет и 6 (19 %) взрослых в воз-
расте от 35 до 76 лет. При этом медиана возраста во
всей исследуемой группе составила 8 мес (диапазон
1 день – 76 лет). У лиц женского пола транслокация
t(1;11)(p32;q23) выявлялась в 2 раза чаще по сравне-
нию с мужчинами: 22 и 11 человек соответственно.
В первую очередь это было связано с преобладанием
лиц женского пола среди пациентов с ОЛЛ, где соот-
ношение женщин и мужчин составило 3:1 (15 и 5 че-
ловек соответственно). Это же соотношение сохраня-
лось и у детей первого года жизни с ОЛЛ (10 девочек
и 3 мальчика). Для пациентов с ОМЛ вне зависимости
от возраста соотношение лиц женского и мужского
пола было близко к 1:1.
У 20 (63 %) пациентов диагностирован ОЛЛ,
у 11 (34 %) – ОМЛ, в 1 (3 %) случае – острый бифе-
нотипический лейкоз. У 1 пациента (№ 4 в табл. 1)
вариант ОЛ не был указан авторами. У детей первого
года жизни ОЛЛ встречался еще чаще. Из 18 пациен-
тов с известным типом ОЛ у 13 (72 %) был ОЛЛ,
у 4 (22 %) – ОМЛ и у 1 (6 %) – острый бифенотипи-
ческий лейкоз.
Иммунофенотип бластных клеток был известен
в 15 случаях ОЛЛ, в том числе полностью в 13 и час-
тично в 2 (№ 1 и 9 в табл. 1). У всех описанных паци-
ентов выявлен B-линейный иммунофенотип бластных
клеток, в том числе 14 случаев ОЛЛ из В-линейных
предшественников, в 1 случае (№ 3) нельзя исключить
зрелый B-ОЛЛ. BI-ОЛЛ выявлен у 10 (77 %) из 13 па-
циентов первого года жизни с ОЛЛ. FAB-вариант опи-
сан у 10 пациентов с ОМЛ. В эту группу вошли 2 па-
циента с ОМЛ с минимальной дифференцировкой
(М0 морфологический вариант по FAB-классифика-
ции), 2 – с острым миеломонобластным лейкозом
(М4) и 6 – с острым монобластным лейкозом (М5).
У детей первого года жизни с ОМЛ в 2 случаях выяв-
лен ОМЛ М5, в 1 – ОМЛ М0.
Данные об инициальном уровне лейкоцитов при-
ведены для 18 пациентов. У них превалировал иници-
альный гиперлейкоцитоз: уровень лейкоцитов выше
100 × 109/л на момент установления диагноза выявлен
в 12 (67 %) случаях. Медиана количества лейкоцитов
составила 156 × 109/л (диапазон 2–465). Дети первого
года жизни имели большую опухолевую массу: из
13 человек только трое имели уровень лейкоцитов
менее 100 × 109/л, а медиана количества лейкоцитов
в этой возрастной группе составила 187 × 109/л (диа-
пазон 49–425 × 109/л).
Цитогенетическое исследование показало, что
транслокация t(1;11)(p32;q23) как единственная ано-
малия выявлена в 20 (59 %) из 32 случаев.
У 1 пациента (случай № 5) найдена комплексная
транслокация с вовлечением хромосомных районов
1p32, 11q23 и 4p16. Дополнительные хромосомные
аномалии (ДХА) в опухолевых клетках пациентов
с наличием t(1;11)(p32;q23) и информативным цито-
генетическим исследованием выявлены у 12 (38 %)
из 32 пациентов. В 3 случаях (№ 8, 20, 22 в табл. 1)
обнаружены только количественные ДХА, в 6 (№ 16,
19, 24, 25, 27, 29) – только структурные; в 3 случаях –
сочетание количест венных и структурных (№ 9, 11,
24). Наиболее частой количественной ДХА являлась
трисомия 8 (3 случая). Комплексный кариотип об-
наружен у 4 (36 %) из 11 пациентов с ОМЛ (№ 11, 21,
22, 25) (рис. 3).
Молекулярно-генетические исследования выпол-
нены 15 пациентам, в том числе исследование мето-
дом FISH с локус-специфичным зондом проведено
у 11 больных, и во всех случаях была выявлена пере-
стройка гена MLL. В 3 случаях (№ 30, 32, 33) нами
проведен дополнительный анализ методом FISH
c использованием цельнохромосомных зондов для
хромосом 1 и 11, который также подтвердил присут-
ствие t(1;11) (рис. 4).
У пациентов № 14 и 18 перестройки MLL под-
тверждены методом гибридизации по Саузерну. Струк-
тура химерного транскрипта определена у 9 пациен-
тов, химерного гена – у 6. Выявлено по 2 случая
локализации точек разрыва в экзоне 10 (№ 26 и 27),
интроне 10 (№ 30 и 33) и интроне 11 (№ 31 и 32)
Рис. 3. Типы ДХА у пациентов с t(1;11)(p32;q23). Цифры соответ-
ствуют числу пациентов; * – разделение по количеству ДХА на более
3 (комплексный кариотип) и менее 3 проведено только для пациентов
с ОМЛ
ДХА(n = 12)
Несбалансиро-ванный кариотип
(n = 12)
Количественные(n = 3)
Количественныеи структурные
(n = 3)
Структурные(n = 3)
< 3 аберраций*(n = 4)
Комплексный кариотип*
(n = 4)
Сбалансиро ванный кариотип
(n = 12)
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 25
1’
20
13
Рис. 4. Результаты цитогенетического и молекулярно-генетических методов исследования: а – частичная кариограмма пациента с наличием
t(1;11)(p32;q23); б – результаты скрининговой (слева) и подтверждающей (справа) ОТ-ПЦР с использованием набора HemaVision (DNA-technology
A/S, Дания) у пациента с наличием химерного транскрипта MLL-EPS15. K- – негативный контроль. Также на каждой электрофореграмме
присутствует ДНК-маркер размерности ПЦР-продуктов; в – результат исследования методом FISH в интерфазных ядрах, характерный для
перестройки гена MLL; г – данные FISH c применением цельнохромосомных зондов к 1-й и 11-й хромосомам, показывающие наличие t(1;11)
в
а б
г
der(1) (p32)
der(11) (q23)
11
1
в ДНК гена MLL. В гене EPS15 в 3 случаях точка раз-
рыва находилась в пределах интрона 1 (№ 30–32),
в 1 случае в регионе 1p32 на расстоянии 1580 нуклео-
тидов от экзона 1 гена EPS15 (№ 33) (рис. 5a). Инте-
ресно отметить, что в этом случае точка слияния в хи-
мерном транскрипте располагалась во 2-м экзоне гена
EPS15 (рис. 5б).
Еще в 2 случаях у монозиготных близнецов точка
разрыва в гене EPS15 локализовалась в относительно
нетипичном месте – интроне 9 (№ 26 и 27). Выявлены
следующие типы химерных транскриптов MLL-EPS15:
e9e2 – 3 случая, и по 2 случая e9e10, e10e2, e11e2 (рис. 6).
Для проведения количественного мониторинга
МОБ нами была создана комбинация флуоресцентных
а б
Рис. 5. а – нуклеотидная последовательность зоны слияния гена MLL (выделен черным цветом) и хромосомного района 1p32 (выделен красным
цветом), полученные при проведении LDI-PCR у пациента № 33. Жирным шрифтом отмечен экзон 10 гена MLL. Синим цветом выделена тринук-
леотидная вставка; б – результат секвенирования химерного транскрипта у этого же пациента выявил слияние экзона 10 гена MLL c экзоном
2 гена EPS15
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я261
’2
01
3 зондов, праймеров и плазмиды, несущей фрагмент
химерного транскрипта MLL-EPS15. На основании
10-крат ных разведений плазмиды (рис. 7а) была получе-
на калибровочная кривая (рис. 7б и табл. 3). Специфич-
ность комбинации зондов и праймеров была проверена
исследованием 15 пациентов с ОЛ и нормальным кари-
отипом и 15 пациентов с ОЛ и другими химерными
транскриптами с участием MLL, в том числе 6 – с MLL-
AF4, 5 – с MLL-MLLT1, 2 – с MLL-MLLT4, 1 – с MLL-
MLLT3, 1 – с MLL-MLLT10. Ни в одном случае неспеци-
фической амплификации не выявлено. При разведении
РНК, выделенной из исходного образца костного мозга
пациента № 30, смесью РНК 10 пациентов без онкоге-
матологических заболеваний была определена чувстви-
тельность системы, созданной для выявления MLL-
EPS15 методом ПЦР-РВ. Она составила 1 × 10-5 (рис. 7в).
Мониторинг МОБ путем качественного и количе-
ственного определения химерного транскрипта MLL-
EPS15 проводили пациентам № 29–33. Во время про-
ведения первого курса консолидации ремиссии
пациенты № 30, 31, 32 (рис. 8а) достигли МОБ-нега-
тивности, однако 2 из них позднее рецидивировали
(№ 31 и 32) (рис. 8б). Пациент № 33 достиг МОБ-нега-
тивности во время проведения 3-го курса консолидации
ремиссии и находится в полной продолжающейся ре-
миссии (ППР) со сроком наблюдения 20 мес (рис. 8в).
У пациента № 29 мониторинг МОБ стал проводиться
через 5,5 мес от начала терапии. Для ис ключения слу-
чайных ошибок одновременно с ПЦР в этом случае
проводилось исследование методом FISH. Химерный
транскрипт MLL-EPS15 методом ПЦР и перестройки
гена MLL методом FISH ни разу не определялись.
MLL
3593 3658 4036 4110 4242 4356 126 168 258 306
EPS15NM_001981.2
Количество образцов
3
2
2(2*)
2(2*)
Всего: 9
4164-4187 273-294
4205-4228 256-276
Рис. 6. Типы химерных транскриптов MLL-EPS15. Белые прямоугольники – экзоны гена MLL, серые – экзоны гена EPS15. Нумерация экзонов
гена MLL дана по работе I. Nilson et al. [53], нумерация экзонов EPS15 – согласно референсной последовательности NM_001981.2. Праймеры для
проведения гнездной ОТ-ПЦР схематически представлены в виде черных прямоугольников. Цифры внутри черных прямоугольников соответствуют
местам начала и конца праймера по отношению к нормальной мРНК соответствующего транскрипта. Цифры под схематическим изображением
экзонов соответствуют началу экзона. * – цифры в скобках соответствуют числу пациентов, впервые описанных в данной работе
Рис. 7. Получение и оценка калибровочной кривой для последующего проведения количественного анализа химерного транскрипта MLL-EPS15 в кДНК пациентов: а – 10-кратные разведения плазмиды, несущей фрагмент транскрипта MLL-EPS15; б – калибровочная кривая, полученная на основании 10-кратных разведений плазмиды, с аналитическими характеристиками; в – чувствительность созданной комбинации прайме-ров и зонда методом 10-кратных лимитирующих разведений составила 1 × 10-5. Одно из разведений 1 × 10 -6 лежит за пределом линейности, во втором – амплификация отсутствует
б ва
Цикл ПЦР-РВ 10-кратные разведения плазмиды Цикл ПЦР-РВ
R squared = 0,999Slope = –3,356Y-intercept = 38,790
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Инт
енси
внос
ть ф
луор
есце
нции
, rfu
Инт
енси
внос
ть ф
луор
есце
нции
, rfu
Пор
огов
ый
цикл
100
101
102
103
104
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 27
1’
20
13
Таблица 3. Аналитические характеристики полученных калибровоч-
ных кривых
Коэффициент корреляции (R2)
Угол наклона кривой (Slope)
Точка пересечения
с осью ординат (Y-intercept)
ПЦР-РВ химерного транскрипта
0,999 –3,356 38,790
ПЦР-РВ химерного гена в ДНК
Пациент № 30 0,990 –3,323 25,602
Пациент № 31 0,992 –2,987 21,987
Пациент № 32 0,996 –3,244 21,491
б День 0 День 15 День 36 День 43 Консолидация I Рецидив
а День 0 День 15 День 36 День 43 Консоли- Консоли- Консоли- Поддерж. дация I дация II дация III терапия
МО
Б, %
Чу
вств
ител
ьнос
ть,%
в День 0 День 36 День 43 Консоли- Консоли- Консоли- Поддерж. дация I дация II дация III терапия
Рис. 8. Результаты мониторинга МОБ в кДНК пациентов № 30 (а), № 32 (б), № 33 (в). На всех графиках синим цветом показана величина МОБ, красным – чувствительность (нижний предел детекции), рас-считанные согласно рекомендациям консорциума «Европа против рака» [49]. В тех точках, где кривые чувствительности и МОБ сходятся, пациент становился МОБ-негативным
Для пациентов № 30, 31 и 33 проведено также
определение МОБ путем количественной оценки
химерного гена в геномной ДНК. Параметры калиб-
ро вочных кривых, полученные при использовании ин-
дивидуально подобранных комбинаций зондов и прай-
меров, приведены в табл. 3. Все значения укладываются
в диапазоны, рекомендованные рабочей группой ESG-
MRD-ALL [51] с дополнениями T. Burmeister et al. [50]
(рис. 9). Пример определения абсолютного количест-
ва MLL-EPS15 в геномной ДНК у пациента № 31 при-
веден на рис. 10.
Сравнение результатов качественного определе-
ния МОБ в кДНК и геномной ДНК у пациентов с на-
личием MLL-EPS15 проведено в 23 образцах. В 21 (92 %)
из них были получены идентичные результаты. В 2 слу-
чаях МОБ была выявлена только в кДНК, но не в ге-
номной ДНК, что, скорее всего, связано с более высо-
кой чувствительностью методики по определению
химерного транскрипта. Несмотря на различные ве-
личины МОБ, получаемые при использовании различ-
ных подходов для мониторирования MLL-EPS15, нами
была выявлена сходная кинетика МОБ при определе-
нии в геномной ДНК и кДНК (рис. 11).
Прогностическое значение транслокации t(1;11)
(p32;q23) в настоящее время трудно оценить, посколь-
б ва
Цикл ПЦР-РВ 10-кратные разведения Цикл ПЦР-РВ ДНК пациента до лечения
R squared = 0,992Slope = –2,987Y-intercept = 21,987
Инт
енси
внос
ть ф
луор
есце
нции
, rfu
Инт
енси
внос
ть ф
луор
есце
нции
, rfu
Пор
огов
ый
цикл
Рис. 9. Получение и оценка калибровочной кривой для последующего проведения количественного анализа химерного гена MLL-EPS15 в геномной
ДНК пациента № 31: а – 10-кратные разведения ДНК пациента, взятой до лечения в смеси ДНК от 5-го пациента без онкогематологических
заболеваний; б – калибровочная кривая, полученная на основании 10-кратных разведений с аналитическими характеристиками; в – амплифи-
кация контрольного гена NAGK во всех образцах, использовавшихся для получения калибровочной кривой
МО
Б, %
Чу
вств
ител
ьнос
ть,%
МО
Б, %
Чу
вств
ител
ьнос
ть,%
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я281
’2
01
3
Рис. 10. Определение МОБ в геномной ДНК. Динамика количества хи-
мерного гена MLL-EPS15 в геномной ДНК у пациента № 31. Красной
горизонтальной линией обозначен предел чувствительности, рассчи-
танный исходя из рекомендаций ESG-MRD-ALL [51]. Два образца,
значения которых лежат ниже уровня чувствительности, являются
негативными
День 0 День 8 День 15 День 36 День 43 Консоли- Консоли- Рецидив дация I дация II
Вели
чина
МО
Б
Предел чувствительности
Рис. 11. Сравнение результатов определения МОБ в кДНК и геномной
ДНК: а – сходимость в 23 образцах пациентов составила 92 %; б –
кинетика МОБ, определенной в кДНК (синий цвет) и ДНК (красный
цвет) у пациента № 32. Синей и красной горизонтальными линиями
указаны пределы чувствительности в кДНК и ДНК соответственно
б
а
негативно позитивно
ДН
Кне
гати
вно
поз
итив
но
кДНК
День 0 День 15 День 36 День 43 Консолидация I Рецидив
Предел чувствительности
ку эта аномалия является весьма редкой. Из доступной
литературы мы выбрали данные о выживаемости па-
циентов, начиная с середины 1980-х годов. За это вре-
мя терапевтические подходы претерпели значитель-
ные изменения, и, соответственно, улучшилась
эффективность лечения как ОЛЛ, так и ОМЛ. В ана-
лиз ОВ было включено 12 пациентов с ОЛЛ и 6 боль-
ных с ОМЛ. Внутри этой группы ОВ составила 0,37 ± 0,12
с медианой наблюдения 38 мес (диапазон 5–140 мес),
а БСВ – 0,33 ± 0,11. ОВ и БСВ в исследуемой группе
не зависели от типа ОЛ и возраста пациентов (рис. 12а
и 12б). Однако при более детальном разделении
на группы было показано, что ОВ и БСВ в группе
мальчиков с ОЛЛ младше 1 года были достоверно ни-
же, чем у девочек с ОЛЛ этой же возрастной группы
(0 и 0,64 ± 0,21, p = 0,033; 0 и 0,46 ± 0,18, p = 0,049
соответственно) (рис. 12в и 12г).
Обсуждение
Транслокация t(1;11)(p32;q23) – относительно ред-
кая генетическая перестройка, возможно, именно
с этим связано небольшое количество работ, посвя-
щенных этой хромосомной аномалии. Так, на круп-
нейшем онлайн-ресурсе – Базе данных хромосомных
аберраций и химерных генов F. Mitelman приводятся
данные всего о 32 пациентах с транслокацией t(1;11)
(p32;q23) [54]. Такие же цифры представлены в обзор-
ной статье J.-L. Huret [55]. К сожалению, в этих источ-
никах не разделены сведения о пациентах с первичны-
ми (n = 20) и вторичными ОЛ (n = 12), что затрудняет
детальную оценку случаев ОЛ de novo. Участники Ев-
ропейской рабочей группы по изучению перестроек
11q23 собрали информацию о 7 пациентах с транслока-
цией t(1;11)(p32;q23), включая 1 пациента со вторич-
ным ОМЛ [4]. Мы в своей работе не касались случаев
вторичных ОЛ из-за совершенно особой биологии опу-
холевого процесса у данной категории пациентов.
Мы подтвердили ранее опубликованные данные
о более высокой частоте t(1;11)(p32;q23) у лиц жен-
ского пола [4, 55]. Также необходимо отметить, что для
пациентов с наличием t(1;11)(p32;q23) характерны об-
щие черты всех MLL-позитивных ОЛ: преимуществен-
ное выявление у детей первого года жизни, домини-
рование CD10-негативного иммунофенотипа при
ОЛЛ и М5 морфологического варианта при ОМЛ, час-
тый инициальный гиперлейкоцитоз [56–58].
Согласно ранее опубликованным данным транс-
локация t(1;11)(p32;q23) наблюдается примерно с оди-
наковой частотой как при ОЛЛ, так и при ОМЛ [3, 4,
55]. Интересно, что нами ранее не выявлено ни одно-
го случая ОМЛ с данной хромосомной аномалией.
Отчасти это можно объяснить тем, что мы ограничили
свой выбор изучением только детей первого года жиз-
ни, хотя и в этой возрастной группе встречается ОМЛ
с t(1;11). Возможно, что отсутствие случаев с относи-
тельно редкой транслокацией t(1;11) объясняется ма-
лочисленностью (58 человек) нашей группы больных
с ОМЛ, среди которой перестройки 11q23/MLL выяв-
лены в половине случаев [59]. В то же время частота
обнаружения t(1;11)(p32;q23) среди всех перестроек
11q23/MLL у детей первого года жизни с ОЛЛ по на-
шим наблюдениям достигает 6 % [60], что значительно
выше, чем по литературным данным. Возможно, этот
вопрос требует отдель ного исследования на большем
числе пациентов.
Прогностическое значение t(1;11)(p32;q23)/MLL-
EPS15 трудно оценить, как в силу небольшого числа на-
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 29
1’
20
13а
в г
б
Рис. 12. Оценка прогностического значения t(1;11)(p32;q23) / MLL-EPS15: а – показатели БСВ в общей группе пациентов, а также пациентов
с ОЛЛ, ОМЛ и ОЛЛ в возрасте младше 1 года; б – показатели ОВ в вышеупомянутых группах; в и г – БСВ и ОВ соответственно у пациентов
первого года жизни с ОЛЛ в зависимости от пола. ППР — полная продолжающаяся ремиссия
0 20 40 60 80 100 120 140 Время наблюдения, мес
0 20 40 60 80 100 120 140 Время наблюдения, мес
р = 0,049 р = 0,033
Вся группа; n = 18; живы – 8; ОВ 0,37 ± 0,12ОЛЛ; n = 12; живы – 5; ОВ 0,33 ± 0,15ОМЛ; n = 6; живы – 3; ОВ 0,40 ± 0,21ОЛЛ младше 1 года; n = 10; живы – 5; ОВ 0,42 ± 0,17
Вся группа; n = 20; в ППР – 8; БСВ 0,33 ± 0,11ОЛЛ; n = 14; в ППР – 5; БСВ 0,29 ± 0,13ОМЛ; n = 6; в ППР – 3; БСВ 0,41 ± 0,22ОЛЛ младше 1 года; n = 12; в ППР – 5; БСВ 0,35 ± 0,15
ОЛЛ < 1 года мальчики; n = 3; в ППР – 0; БСВ 0ОЛЛ < 1 года девочки; n = 9; в ППР – 5; ОВ 0,46 ± 0,18
ОЛЛ < 1 года мальчики; n = 3; живы – 0; ОВ 0ОЛЛ < 1 года девочки; n = 7; живы – 5; ОВ 0,64 ± 0,21
Веро
ятно
сть
БСВ
Веро
ятно
сть
БСВ
Веро
ятно
сть
ОВ
Веро
ятно
сть
ОВ
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0 10 20 30 40 50 60 70 Время наблюдения, мес
0 20 40 60 80 100 120 140 Время наблюдения, мес
блюдений, так и гетерогенности терапевтических под-
ходов, использовавшихся у данной группы пациентов.
Мы, так же как и J.-L. Huret [55], при ОЛЛ выявили до-
стоверно более низкие показатели БСВ и ОВ у пациен-
тов мужского пола в возрасте младше 1 года по сравне-
нию с девочками данной возрастной группы, но следует
принимать во внимание, что в исследуемой группе было
всего 12 пациентов (9 девочек и 3 мальчика). Более того,
из-за отсутствия данных о том, живы ли 2 из 9 девочек,
они были исключены из расчета вероятности ОВ.
Целенаправленное исследование структуры химер-
ного гена MLL-EPS15 было выполнено лишь однажды:
C. Meyer et al. приводят собственные данные о 13 па-
циентах, включая 12 случаев ОЛ у детей [3]. Однако
в этой работе отсутствуют клинико-лабораторные
характеристики пациентов с MLL-EPS15 при ОЛ.
Точка разрыва в гене EPS15 у обследованных нами
пациентов локализовалась либо в интроне 1, на долю
которого приходится около 30 % всех случаев форми-
рования химерного гена MLL-EPS15 [3], либо в не-
кодирующей последовательности ДНК в хромосом-
ном районе 1p32 в непосредственной близости от
5’-конца гена MLL. В гене MLL точки разрыва у об-
следованных нами пациентов располагаются в 10-м
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я301
’2
01
3 и 11-м интронах, что хорошо согласуется с ранее опуб-
ликованными данными [3, 50, 61].
Несмотря на относительно небольшую частоту
встречаемости транслокации t(1;11)(p32;q23), важно
проводить ее молекулярный мониторинг, который,
как было показано ранее, позволяет прогнозировать
исходы терапии [62]. Технически определение МОБ
может быть проведено как методом FISH, так и ПЦР.
Первый метод более универсален, но обладает низкой
чувствительностью: в среднем он способен выявлять
1 бластную клетку среди 500–1000 нормальных. До-
вольно часто для оценки МОБ используется коли-
чественное определение индивидуальных клональных
перестроек генов Т-клеточных рецепторов (TCR) и тя-
желых цепей иммуноглобулинов (IgH) методом коли-
чественной ПЦР-РВ со специфичными для каждого
пациента праймерами и зондом. Однако ранее было
показано, что по сравнению со старшими детьми у де-
тей первого года этот метод имеет ограниченное при-
менение вследствие того, что в данной группе паци-
ентов перестройки IgH/TCR встречаются реже и часто
являются олигоклональными [63, 64]. Применение
проточной цитометрии, еще одного метода, широко
используемого для мониторинга МОБ у детей и взрос-
лых, также может быть затруднено в данной возраст-
ной группе вследствие совершенно особого иммуно-
фенотипа опухолевых клеток [65–67] и нестабильной
экспрессии антигенов под действием химиопрепара-
тов [68, 69]. Альтернативой может служить монито-
ринг МОБ путем определения химерного гена в ге-
номной ДНК методом ПЦР-РВ. Для этого
необходимо предварительно определить индивидуаль-
ную для каждого пациента точку слияния гена MLL
и гена-партнера и, исходя из сиквенса зоны слияния
2 генов, подобрать комбинацию праймеров и зонда
[51, 70]. Проведенное сопоставление показало хоро-
шее совпадение результатов с данными МОБ, получа-
емыми при использовании IgH/TCR [70]. Наконец,
в качестве мишени для оценки МОБ можно исполь-
зовать химерный транскрипт в мРНК/кДНК, опреде-
ляемый методом ПЦР-РВ [48, 71]. Нами в качестве
основного метода для мониторирования МОБ была
выбрана ПЦР с определением химерного гена MLL-EPS15
в геномной ДНК и химерного транскрипта в РНК/кДНК.
Наш выбор связан с тем, что и химерные гены, и хи-
мерные транскрипты представляют собой стабильные
мишени для определения МОБ [37, 48, 72], патогене-
тически связанные с развитием ОЛ, так как они выяв-
ляются только в опухолевых клетках.
Подобранные условия ПЦР позволили нам успеш-
но провести мониторинг МОБ во всех доступных об-
разцах пациентов, что дало возможность оценить от-
вет опухоли на химиотерапию. На основании данных,
получаемых при мониторинге МОБ, уже сегодня про-
водится стратификация пациентов с ОЛЛ, получаю-
щих терапию по большинству современных протоколов.
Заключение
Транслокация t(1;11)(p32;q23) при ОЛ наиболее час-
то выявляется у детей первого года жизни. Медиана воз-
раста составляет 8 мес. Соотношение девочек и мальчи-
ков 2:1. В 38 % случаев у пациентов с транслокацией
t(1;11)(p32;q23) обнаружены ДХА. Наиболее часто зоной
разрывов в гене EPS15 является интрон 1, в гене MLL –
интроны 10 и 11. Описано 4 типа химерных транскрип-
тов MLL-EPS15. Создана и успешно применена комби-
нация праймеров, флуоресцентных зондов и плазмиды
для мониторирования химерного транскрипта MLL-
EPS15 методом ПЦР-РВ. Подобраны условия и проведен
мониторинг МОБ по индивидуальным точкам разрыва
в геномной ДНК у пациентов с наличием химерного ге-
на MLL-EPS15. Сравнение результатов определения
МОБ в геномной ДНК и кДНК показало высокую ка-
чественную сопоставимость (92 %).
Благодарность. Авторы выражают искреннюю
благодарность врачам-гематологам, детским онко-
логам из Областной детской клинической больницы
№ 1 (Екатеринбург), Республиканского научно-прак-
тического центра детской онкологии, гематологии
и иммунологии (Минск), Российской детской клини-
ческой больницы (Москва), Морозовской детской
городской клинической больницы (Москва), предо-
ставившим данные о пациентах, описанных в этой
статье.
1. Armstrong S., Look A. Molecular genetics
of acute lymphoblastic leukemia. J Clin
Oncol 2005;23:6306–15.
2. Schoch C., Schnittger S., Klaus M. et al.
AML with 11q23/MLL abnormalities as
defined by the WHO classification:
incidence, partner chromosomes, FAB
subtype, age distribution, and prognostic
impact in an unselected series of 1897
cytogenetically analyzed AML cases. Blood
2003;102:2395–402.
3. Meyer С., Kowarz E., Hofmann J. et al.
New insights to the MLL recombinome of
acute leukemias. Leukemia 2009;23:1490–9.
4. Harrison C., Cuneo A., Clark R. et al. Ten
novel 11q23 chromosomal partner sites. Leu-
kemia 1998;12:811–22.
5. Williams D., Look A., Melvin S. et al.
New chromosomal translocations correlate
with specific lmmunophenotypes of child-
hood acute lymphoblastic leukemia. Cell
1984;36:101–9.
6. Kaneko Y., Maseki N., Takasaki N. et al.
Clinical and hematologic characteristics in
acute leukemia with 11q23 translocations.
Blood 1986;67:484–91.
7. Gregoire M., Peeters M., Bene M. et al.
Karyotype, immunophenotype, and clinical
outcome: correlations in childhood acute
lymphoblastic leukemia. Haematol Blood
Transfus 1987;30:504–8.
8. Selypes A., László A. A new translocation
t(1;4;11) in congenital acute nonlymphocytic
Л И Т Е Р А Т У Р А
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 31
1’
20
13leukemia (acute myeloblastic leukemia).
Hum Genet 1987;76:106–8.
9. Hagemeijer A., van Dongen J., Slater R.
et al. Characterization of the blast cells in
acute leukemia with translocation (4;11):
report of eight additional cases and of one
case with a variant translocation. Leukemia
1987;1:24–31.
10. Raimondi S., Peiper S., Kitchingman G.
et al. Childhood acute lymphoblastic leuke-
mia with chromosomal breakpoints at 11q23.
Blood 1989;73:1627–34.
11. Shippey C., Lawlor E., Secker-Walker L.
Isochromosome 9q in acute lymphoblastic
leukemia: a new non-random finding. Leu-
kemia 1989;3:195–9.
12. Abshire T., Buchanan G., Jackson J.
et al. Morphologic, immunologic and cyto-
genetic studies in children with acute lym-
phoblastic leukemia at diagnosis and relapse:
a Pediatric Oncology Group study. Leukemia
1992;6:357–62.
13. Bernard O., Mauchauffe M., Mecucci C.
et al. A novel gene, AF-1p, fused to HRX in
t(1;11)(p32;q23), is not related to AF-4,
AF-9 nor ENL. Oncogene 1994;9:
1039–45.
14. Felix C., Hosler M., Slater D. et al. MLL
genomic breakpoint distribution within the
breakpoint cluster region in de novo leukemia
in children. J Pediatr Hematol Oncol
1998;20:299–308.
15. Bergh von A., Emanuel B., Zelderen-
Bhola van S. et al. A DNA probe combination
for improved detection of MLL/11q23
breakpoints by double-color
interphase-FISH in acute leukemias. Genes
Chromosomes and Cancer 2000;28:14–22.
16. Chessells J., Harrison C., Kempski H.
et al. Clinical features, cytogenetics and
outcome in acute lymphoblastic and myeloid
leukaemia of infancy: report from the MRC
Childhood Leukaemia working party.
Leukemia 2002;16:776–84.
17. Park K., Lee D., Lee H. et al.
Granulocytic Sarcoma in MLL-Positive
Infant Acute Myelogenous Leukemia:
Fluorescence in Situ Hybridization Study of
Childhood Acute Myelogenous Leukemia for
Detecting MLL Rearrangement. Am J
Pathol 2001;159(6):2011–6.
18. Kim H., Cho H., Kim E. et al. A study
on 289 consecutive Korean patients with
acute leukaemias revealed fluorescence in
situ hybridization detects the MLL translo-
cation without cytogenetic evidence both
initially and during follow-up. Br J Haematol
2002;119(4):930–9.
19. Douet-Guilbert N., Morel F., Le Bris M.
et al. Rearrangement of the MLL gene in
acute myeloblastic leukemia: report of two
rare translocations. Cancer Genet Cytogenet
2005;157:169–74.
20. Sagawa M., Shimizu T., Shimizu T. et al.
Establishment of a new human acute
monocytic leukemia cell line TZ-1 with
t(1;11)(p32;q23) and fusion gene MLL-
EPS15. Leukemia 2006;20:1566–71.
21. Kotecha R., Ford J., Beesley A. et al.
Molecular characterization of identical,
novel MLL-EPS15 translocation and
individual genomic copy number alterations
in monozygotic infant twins with acute
lymphoblastic leukemia. Haematologica
2012;97:1447–50.
22. Kotecha R., Murch A. Kees U., Cole C.
Pre-natal, clonal origin of t(1;11)(p32;q23)
acute lymphoblastic leukemia in monozygotic
twins. Leuk Res 2012;36:46–50.
23. Nakamura H., Hata T., Tagawa M. et al.
Chromosome 1 abnormalities at band 1p32
in two atomic bomb survivors with myelodys-
plastic syndrome. Rinsho Ketsueki
2000;41:152–8.
24. http://www.genecards.org/cgi-bin/
carddisp.pl?gene=EPS15.
25. http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/
Gene/Summary?g=ENSG00000085832;
r=1:51819935-51985000.
26. Su A., Wiltshire T., Batalov S. et al.
A gene atlas of the mouse and human
protein-encoding transcriptomes. Proc Natl
Acad Sci USA 2004;101:6062–7.
27. Salcini A., Chen H., Iannolo G. et al.
Epidermal growth factor pathway substrate
15, Eps15. Int J Biochem Cell Biol
1999;31:805–9.
28. Parachoniak C., Park M. Distinct
recruitment of Eps15 via its coiled-coil
domain is required for efficient down-regula-
tion of the MET receptor tyrosine kinase.
J Biol Chem 2009;284(13):8382–94.
29. Hess J. MLL: a histone methyltransferase
disrupted in leukemia. Trends in Molecular
Medicine 2004;10(10):500–7.
30. Slany R. The molecular biology of mixed
lineage leukemia. Haematol 2009;94:984–93.
31. Armstrong S., Staunton J., Silverman L.
et al. MLL translocations specify a distinct
gene expression profile that distinguishes a
unique leukemia. Nat Genet 2002;30:41–7.
32. Ferrando A., Armstrong S., Neuberg D.
et al. Gene expression signatures in
MLL-rearranged T-lineage and B-precursor
acute leukemias: dominance of HOX
dysregu lation. Blood 2003;102:262–8.
33. Yeoh E., Ross M., Shurtleff S. et al.
Classification, subtype discovery, and prediction of out-come in pediatric acute
lymphoblastic leukemia by gene expression
profiling. Cancer Cell 2002;1:133–43.
34. Ayton P., Cleary M. Transformation of
myeloid progenitors by MLL oncoproteins is
dependent on Hoxa7 and Hoxa9. Genes and
Development 2003;17:2298–307.
35. Trentin L., Giordan M.,
Dingermann Th. et al. Two independent gene
signatures in pediatric t(4;11) acute lympho-
blastic leukemia patients. Euro J Haematol
2009;83:406–19.
36. Pallisgaard N., Hokland P., Riishoj D.
et al. Multiplex reverse transcription-
polymerase chain reaction for simultaneous
screening of 29 translocations and chromo-
somal aberrations in acute leukemia. Blood
1998;92:574–88.
37. Dongen van J., Macintyre E., Gabert J.
et al. Standardized RT-PCR analysis
of fusion gene transcripts from chromosome
aberrations in acute leukemia for detection
of minimal residual disease. Leukemia
1999;13:1901–18.
38. Fechina L., Shorikov E., Tsaur G. et al.
Contribution of all-trans retinoic acid to
improved early relapse-free outcome
in infant acute lymphoblastic leukemia
comparing to the chemotherapy alone.
Blood 2007;110(11):832А; abstr. 2828.
39. ISCN 1995: An International System for
Human Cytogenetic Nomenclature (1995).
Ed. Mitelman F. Basel: S. Karger, 1995.
40. ISCN 2005: An International System For
Human Cytogenetic Nomenclature (2005).
Eds.: Shaffer L., Tommerup N. Basel: S.
Karger, 2005.
41. ISCN 2009: An International System For
Human Cytogenetic Nomenclature (2009).
Eds.: Schaffer L., Slovak M., Campbell L.
Basel: S. Karger, 2009.
42. Coenen E., Raimondi S., Harbott J. et al.
Prognostic significance of additional
cytogenetic aberrations in 733 de novo
pediatric 11q23/MLL -rearranged AML
patients: results of an international study.
Blood 2011;117:7102–11.
43. WHO Classification of Tumours
of Haematopoietic and Lymphoid Tissues.
Eds.: Swerdlow S., Campo E., Harris N.
et al. Lyon, France: IARC, 2008.
44. Betts D., Ammann R., Hirt A. et al.
The prognostic significance of cytogenetic
aberrations in childhood acute myeloid
leukaemia. A study of the Swiss Paediatric
Oncology Group (SPOG). Eur J Haematol
2007;78(6):468–76.
45. Meyer C., Schneider B., Reichel M.
et al. Diagnostic tool for the identification of
MLL rearrangements including unknown
partner genes. Proc Natl Acad Sci USA
2005;102(2):449–54.
46. Цаур Г.А., Наседкина Т.В.,
Попов А.М. и др. Время достижения
молекулярной ремиссии как фактор
прогноза у детей первого года жизни
острым лимфобластным лейкозом.
Онкогематол 2010;2:46–54.
47. Цаур Г.А., Друй А.Е., Попов А.М.
и др. Возможность использования
микроструйных биочипов для оценки
качества и количества РНК у пациентов
с онкологическими и онкогематологи-
ческими заболеваниями. Вестн Урал мед
акад науки 2011;4:107–11.
48. Gabert J., Beillard E., Velden van der V.
et al. Standardization and quality control
studies of ‘real-time’ quantitative reverse
transcriptase polymerase chain reaction of
fusion gene transcripts for residual disease
detection in leukemia – a Europe Against
Cancer Program. Leukemia 2003;17:2318–57.
49. Beillard E., Pallisgaard N., Velden van der V.
et al. Evaluation of candidate control genes
for diagnosis and residual disease detection
in leukemic patients using ‘real-time’
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я321
’2
01
3 quantitative reverse-transcriptase polymerase
chain reaction (RQ-PCR) – a Europe
Against Cancer Program. Leukemia
2003;17:2474–86.
50. Burmeister T., Marschalek R., Schneider B.
et al. Monitoring minimal residual disease by
quantification of genomic chromosomal
breakpoint sequences in acute leukemias
with MLL aberrations. Leukemia
2006;20:451–7.
51. Velden van der V., Cazzaniga G.,
Schrauder A. et al. Analysis of minimal
residual disease by Ig/TCR gene
rearrangements: guidelines for interpretation
of real-time quantitative PCR data.
Leukemia 2007;21:604–11.
52. Kaplan E., Meier P. Non-parametric
estimation from incomplete observations.
J Am Stat Assoc 1958;53:457–81.
53. Nilson I., Loechner K., Siegler G. et al.
Exon/intron structure of ALL1 (MLL) gene
involved in translocations to chromosomal
region 11q23 and acute leukemias. Br J
Haematol 1996;94(4):966–72.
54. Mitelman database of chromosome
aberrations and gene fusions in cancer
(2012). Mitelman F., Johansson B.
Mertens F. (eds.). http://cgap.nci.nih.gov/
Chromosomes/Mitelman.
55. Huret J.-L. t(1;11)(p32;q23). Atlas
Genet Cytogenet Oncol Haematol
(September 2010). http://
AtlasGeneticsOncology.org/Anomalies/
t0111p32q23ID1046.html.
56. Chowdhury T., Brady H. Insights from
clinical studies into the role of the MLL gene
in infant and childhood leukemia. Blood
Cells Mol Dis 2008;40:192–9.
57. Forestier E., Schmiegelow K. The inci-
dence peaks of the childhood acute leuke-
mias reflect specific cytogenetic aberra-
tions. J Pediatr Hematol Oncol
2006;28:486–95.
58. Zweidler-McKay P., Hilden J. The ABCs
of Infant Leukemia. Curr Probl Pediatr
Adolesc Health Care 2008;38(3):78–94.
59. Цаур Г.А., Флейшман Е.В., Гиндина Т.Л.
и др. Характеристика перестроек
11q23/MLL при остром миелоидном
лейкозе у детей первого года жизни.
Клин онкогематол 2012;5(4):365–71.
60. Цаур Г.А., Попов А.М.,
Алейникова О.В. и др. Характеристика
перестроек 11q23 (MLL) у детей первого
года жизни с острым лимфобластным
лейкозом. Онкогематол 2011;3:57–64.
61. Meyer C., Schneider B., Jakob S. et al.
The MLL recombinome of acute leukemias.
Leukemia 2006;20:777–84.
62. Цаур Г.А., Попов А.М., Наседкина Т.В.
и др. Прогностическое значение
минимальной остаточной болезни,
определенной путем выявления химерных
транскриптов у детей первого года жизни,
больных острым лимфобластным лейко-
зом, получающих терапию по протоколу
MLL-BABY. Гематол и трансфузиол
2012;57(4):12–22.
63. Jansen M., Corral L., Velden van der V.
et al. Immunobiological diversity in infant
acute lymphoblastic leukemia is related
to the occurrence and type of MLL gene
rearrangement. Leukemia 2007;21:633–41.
64. Peham M., Panzer S., Fasching K. et al.
Low frequency of clonotypic Ig and T-cell
receptor gene rearrangements in t(4;11)
infant acute lymphoblastic leukaemia and its
implication for the detection of minimal
residual disease. Br J Haematol 2002;117:315–21.
65. De Zen L., Bicciato S., te Kronnie G.,
Basso G. Computational analysis of flow-
cytometry antigen expression profiles in
childhood acute lymphoblastic leukemia: an
MLL/AF4 identification. Leukemia
2003;17:1557–65.
66. Schwartz S., Rieder H., Schlaeger B.
et al. Expression of the human homologue of
rat NG2 in adult acute lymphoblastic leuke-
mia: close association with MLL rearrange-
ment and a CD10(-)/CD24(-)/CD65s(+)/
CD15(+) B-cell phenotype. Leukemia
2003;17:1589–95.
67. Attarbaschi A., Mann G., König M. et al.
Mixed lineage leukemia-rearranged child-
hood pro-B and CD10-negative pre-B acute
lymphoblastic leukemia constitute a distinct
clinical entity. Clin Cancer Res 2006;12:2988–94.
68. Попов А.М., Вержбицкая Т.Ю.,
Цаур Г.А. и др. Особенности мониторинга
минимальной остаточной болезни при
B-линейных острых лимфобластных
лейкозах методом проточной цитометрии
у детей первого года жизни. Дет онкол
2008;2:32–5.
69. Попов А.М., Вержбицкая Т.Ю.,
Цаур Г.А. и др. Возможности применения
NG2 для мониторинга минимальной
остаточной болезни методом проточной
цитометрии у детей первого года жизни
с острым лимфобластным лейкозом,
ассоциированным с реарранжировками
гена MLL. Гематол и трансфузиол
2009;6:19–22.
70. Velden van der V., Сorral L. Valsecchi M.
et al. Prognostic significance of minimal
residual disease in infants with acute lym-
phoblastic leukemia treated within the Inter-
fant-99 protocol. Leukemia 2009;23:1073–9.71. Jansen M., Velden van der V., Dongen van J.
Efficient and easy detection of MLL-AF4,
MLL-AF9 and MLL-ENL fusion gene
transcripts by multiplex real-time
quantitative RT-PCR in TaqMan and
LightCycler. Leukemia 2005;19(11):2016–18.
72. Szczepanski T. Why and how to quantify
minimal residual disease in acute
lymphoblastic leukaemia. Leukemia
2007;21:622–6.
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 33
1’
20
13
Иммунофенотипическая характеристика острого
миелоидного лейкоза у детей первого года жизни
А.М. Попов1, 2, Г.А. Цаур1, 2, Т.Ю. Вержбицкая1, 2, О.В. Стренева1, 2, Е.В. Шориков1, 2, Л.И. Савельев1, 2, 3, Л.Г. Фечина1, 2
1ГБУЗ СО ОДКБ № 1, Екатеринбург;2ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург;
3ГБОУ ВПО УГМА, Екатеринбург
Контакты: Александр Михайлович Попов [email protected]
Цель исследования – характеристика иммунофенотипа острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) у детей первого года жизни. В ис-
следование было включено 90 пациентов (40 мальчиков и 50 девочек) с острым лейкозом (ОЛ) в возрасте от 0 до 11 месяцев вклю-
чительно. Частота выявления ОМЛ составила 26,67 % от всех ОЛ у детей первого года жизни, что было значительно чаще, чем
у более старших детей (10,83 %; р = 0,0002). Отсутствие экспрессии CD61, а также высокая экспрессия CD99, CD15, CD133
и NG2 характеризовали иммунофенотип опухолевых клеток при наличии перестроек гена MLL. Диагностическая эффективность
выявления экспрессии CD99 и NG2 для прогнозирования наличия перестроек гена MLL оказалась наиболее высокой. Таким образом,
иммунофенотип ОМЛ у детей младше 1 года существенно различается в зависимости от наличия или отсутствия перестроек
гена MLL. Описанные особенности экспрессии антигенов позволяют прогнозировать наличие какой-либо перестройки гена MLL
при ОМЛ у детей первого года жизни, при этом наибольшей диагностической эффективностью обладает наличие экспрессии
CD99 или NG2.
Ключевые слова: острый миелоидный лейкоз, дети первого года жизни, проточная цитометрия
Immunophenotypic investigation of infant acute myeloid leukemia
A.M. Popov1, 2, G.A. Tsaur1, 2, T.Yu. Verzhbitskaya1, 2, O.V. Streneva1, 2, E.V. Shorikov1 ,2, L.I. Saveliev1, 2, 3, L.G. Fechina1, 2
1Regional Childrenʼs Clinical Hospital №1, Yekaterinburg;2Research Institute of Medical Cell Technologies, Yekaterinburg;
3Ural State Medical Academy, Yekaterinburg
Aim of the study – characterization of immunophenotype in infant acute myeloid leukemia (AML). 90 patients (40 boys and 50 girls) with
acute leukemia (AL) aged up to 365 days were included in the current study. AML was found more frequently in infants than in older chil-
dren (26.67 % and 10.83 % respectively; p = 0.0002). Significant immunophenotypic differences were observed in patients with and without
MLL gene rearrangements. Number of cases in those tumor cells expressed CD99, CD61, CD133, CD15, NG2 varied between MLL-positive
and MLL-negative groups. CD61-negativity, high CD99, CD15, CD133 and NG2 expression were immunophenotypic signatures of MLL-
rearranged infant AML, although CD99 and NG2 had the highest diagnostic efficacy. Thus infants’ AML immunophenotype differs signifi-
cantly due to the presence of MLL gene rearrangements. Diagnostic immunophenotyping of infants’ AML allows predicting presence of MLL
rearrangements by either CD99 or NG2 expression.
Key words: acute myeloid leukemia, infants, flow cytometry
Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) представляет
собой гетерогенную группу заболеваний, отличаю-
щихся друг от друга по морфологическим, иммунофе-
нотипическим, цитогенетическим и молекулярно-
генетическим характеристикам [1, 2]. У детей пик
заболеваемости ОМЛ приходится на первый год жиз-
ни. Доля пациентов этого возраста составляет по раз-
ным источникам до 20 % всех случаев ОМЛ у детей
[3–5].
Среди характерных признаков ОМЛ у детей перво-
го года жизни следует отметить относительно высокий
инициальный лейкоцитоз (более 100 × 109/л) [6–9], ге-
патоспленомегалию, инициальный нейролейкоз [6, 9,
10–12], частые случаи хлоромы [9, 13]. Среди всех мор-
фологических вариантов по франко-американо-бри-
танской (FAB) классификации у детей первого года жиз-
ни выявляются острый миеломонобластный (ОМЛ М4),
острый монобластный (ОМЛ М5) [6, 9, 14] и острый
мегакариобластный лейкозы (ОМЛ М7) [6, 10, 14, 15].
Примерно в половине случаев ОМЛ у детей первого
года жизни чаще всего выявляются перестройки 11q23/
MLL [4, 11, 12, 16–19]. Методами молекулярной био-
логии охарактеризована структура 64 химерных генов
с участием MLL [20], наиболее частыми из которых
при ОМЛ у детей являются MLL-MLLT3, MLL-MLLT10,
MLL-ELL, MLL-MLLT11, MLL-SEPT6 (даны в порядке
убывания частоты встречаемости) [16–20].
В работе S. Armstrong et al. было впервые показано,
что опухолевые клетки при острых лейкозах (ОЛ), ас-
социированных с перестройками гена MLL, по про-
филю экспрессии генов отличаются от бластов при
типичных ОМЛ и остром лимфобластном лейкозе
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я341
’2
01
3 (ОЛЛ) [21]. В дальнейшем было установлено, что по про-
филю экспрессии генов ОЛЛ и ОМЛ, ассоцииро-
ванные с перестройками гена MLL, ближе друг к дру-
гу по сравнению с ОЛЛ и ОМЛ без данных перестроек
соответственно [22–24]. Таким образом, наличие пе-
рестроек гена MLL обусловливает развитие биологи-
чески совершенно особенной опухоли [21–24].
Иммунофенотип опухолевых клеток при ОЛЛ с на-
личием перестроек гена MLL описан достаточно де-
тально [25–31], в то время как при ОМЛ чаще всего
в качестве типичной для наличия перестроек гена MLL
аберрации иммунофенотипа упоминается только экс-
прессия нейрогликана NG2, считающегося крайне
специфичным MLL-ассоциированным антигеном
[28, 32–34]. При этом комплексное описание имму-
нофенотипа ОМЛ у детей первого года жизни как с на-
личием перестроек гена MLL, так и с их отсутствием,
в литературе не встречается.
Цель исследования – характеристика иммунофе-
нотипа ОМЛ у детей первого года жизни.
Материалы и методы исследования
Исследование проводилось в Лаборатории имму-
нофенотипирования гемобластозов Отдела детской
онкологии и гематологии ОДКБ № 1 г. Екатеринбурга
с октября 2005 по ноябрь 2012 г. Из 441 ребенка, у ко-
торых было проведено исследование первичного им-
мунофенотипа, 90 детей (40 мальчиков и 50 девочек)
были в возрасте от 0 до 11 месяцев включительно. Эти
пациенты составили исследуемую группу.
Пациентам проводились: стандартное цитоморфо-
логическое исследование, иммунофенотипирование,
цитогенетическое исследование, включающее иссле-
дование методом флуоресцентной гибридизации in situ
(FISH), и молекулярно-генетические исследования.
Иммунофенотипирование опухолевых клеток
в костном мозге производилось методом 4–6-цветной
проточной цитометрии на приборах “FACS Canto”
и “FACS Canto II” (Becton & Dickinson (BD), США).
Настройка проточных цитометров производилась
с использованием калибровочной системы “7-color
Setup Beads” (BD). Мониторинг стабильности работы
приборов осуществлялся при помощи калибровочных
систем “Cytometer Setup and Tracking” (BD) и «DAKO
Fluorospheres» (Dako, Дания). Использовались моно-
клональные антитела (МКАТ), меченные флуоресце-
инизотиоцианатом (FITC), R-фикоэритрином (PE),
перидининхлорофилл протеином (PerCP), аллофико-
цианином (АРС), а также тандемными конъюгатами
PE с цианином 7 (Cy7), PerCP с цианином 5.5 (Cy5.5)
и APC с Су7. Для иммунофенотипирования применя-
лись МКАТ, представленные в табл. 1. Окрашивание
первично меченными МКАТ производилось согласно
инструкции производителя.
Результаты иммунофенотипирования оценивались
при помощи программного обеспечения FACS Diva
4.0-6.1 (BD). Анализировали не менее 10 000 ядро-
содержащих клеток. Опухолевые клетки выделяли
на точечных графиках по экспрессии CD45, значениям
параметра бокового светорассеяния и экспрессии ли-
нейно-ассоциированных маркеров (CD19, CD7, CD33).
Дальнейший анализ проводили при помощи гисто-
грамм. Согласно критериям группы EGIL [35], попу-
ляцию считали позитивной, если 20 % и более клеток
экспрессировали исследуемый антиген. В качестве
негативного контроля использовали сохранившиеся
в образце нормальные клетки. Определение иммуно-
логических вариантов производилось также согласно
критериям EGIL [35].
Всем пациентам проводилось цитогенетическое
исследование клеток костного мозга и/или перифери-
ческой крови, взятых до начала терапии. Применялась
техника приготовления «прямых препаратов» или
краткосрочное культивирование клеток (24 ч, 48 ч).
Методом окраски хромосомных препаратов был GTG-
вариант. В большинстве случаев анализировали не
менее 20 метафазных пластинок. Кариотипирование
проводили в соответствии с международной номенк-
латурой хромосом человека ISCN 2009 [36]. Для выяв-
ления перестроек гена MLL выполняли исследование
методом FISH с использованием локус-специфичного
зонда LSI MLL Dual Color Break Apart Rearrangement
Probe (Abbott Molecular, США).
Гнездная ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
выполнялась для выявления следующих типов химер-
ных транскриптов с участием гена MLL: MLL-AF4,
MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT4, MLL-MLLT10
по ранее описанным методикам [37–39]. У пациентов
с отсутствием указанных химерных транскриптов до-
Таблица 1. Моноклональные антитела, применявшиеся для первично-
го иммунофенотипирования ОЛ
Флуорохром Моноклональные антитела
FITC
CD58, CD45, CD99, CD7, CD7*, CD65*, CD15,
CD33, CD10, CD19, CD4, CD3, MPO, CD64,
CD66b, CD61, CD5, CD71
PE
CD10, CD7, CD34, NG2*, CD1a, CD45, CD22,
CD133**, CD13, CD8, CD58, CD20, CD79a, TdT,
CD38, CD11a, CD11b, CD11c, CD2, CD235a,
CD99, MPO
PerCP CD19, CD20, CD8, CD45, CD34
PerCP-Cy5.5 CD20, CD33, CD38, CD19, CD79a, CD5
PE-Cy7CD34, CD13, CD3, CD56, CD10, CD38, CD22*,
CD33*
APC
CD19, CD117, CD3, CD133**, CD56, CD2,
CD79a, CD79a*, CD10, CD11c, CD38, CD41a,
TdT, IgM
APC-Cy7 CD45, CD20, CD14, CD3, CD4
Примечание. * – антитела производства Beckman Coulter (США); ** – антитела производства Miltenyi Biotec (Германия); остальные антитела произведены Becton & Dickinson (США).
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 35
1’
20
13полнительно оценивали экспрессию MLL-MLLT6,
MLL-MLLT11, MLL-EPS15, MLL-ELL с использовани-
ем набора “HemaVision” (DNA-Technology A/S, Дания).
Для статистической обработки результатов приме-
няли программу Statistica 6.0. Статистическая значи-
мость различий определялась при помощи точного
критерия Фишера и другого непараметрического кри-
терия χ2. Достоверными считались различия при
р < 0,05. Для оценки возможности прогнозирования
наличия перестроек гена MLL для каждого иммуноло-
гического маркера рассчитывали диагностическую
чувствительность, специфичность, прогностическую
ценность положительного и отрицательного результа-
тов, а также общую диагностическую эффективность
теста [40].
Результаты исследования
Распределение вариантов ОЛ, по данным иммуно-
фенотипирования, у пациентов первого года жизни
(n = 90) и более старших детей (n = 351) показано
на рис. 1. У детей первого года жизни ОЛЛ выявлялся
достоверно реже (р < 0,0001), а ОМЛ и острый били-
нейный лейкоз (ОБлЛ) – достоверно чаще (р = 0,0002
и р = 0,0359 соответственно), чем у пациентов старше
1 года. Для острого бифенотипического лейкоза
(ОБфЛ) и острого недифференцированного лейкоза
(ОНдЛ) значимых различий в возрастных группах об-
наружено не было (р = 0,7787 и р = 0,8717 соответ-
ственно).
Среди 24 детей младше 1 года с ОМЛ данные ци-
томорфологического исследования были доступны
у 23 (95,8 %). Наиболее частыми цитологическими ва-
риантами (по FAB-классификации) были ОМЛ М5
и ОМЛ М7 – 7 (30,4 %) пациентов с каждым вариантом
соответственно; кроме того, были выявлены 3 (13,0 %)
случая ОМЛ М2; 2 (8,7 %) случая ОМЛ М4 и по 1 слу-
чаю ОМЛ М0 и ОМЛ М1 (по 4,3 %). У 1 (4,3 %) паци-
ента были определены бласты 2 типов: ОМЛ М5
и ОМЛ М6. Еще у 1 (4,3 %) ребенка опухолевые клет-
ки имели иммунофенотип ОМЛ, в то время как при
цитоморфологическом исследовании был определен
ОЛЛ L1.
В 14 (58,3 %) из 24 случаев были выявлены раз-
личные перестройки гена MLL. Шесть (42,9 %) паци-
ентов имели MLL-MLLT3, 4 (28,6 %) – MLL-MLLT10,
2 (14,3 %) – MLL-MLLT11, 1 (7,1 %) – MLL-MYO1F,
а у 1 (7,1 %) пациента ген-партнер гена MLL иденти-
фицировать не удалось.
Данные цитоморфологического исследования су-
щественно различались у пациентов с наличием пере-
строек гена MLL и пациентов, у которых эти пере-
стройки выявлены не были. Так, у 6 из 9 MLL(–)
пациентов был определен ОМЛ М7 (66,7 %), в то вре-
мя как среди MLL(+) пациентов данный цитологичес-
кий вариант был обнаружен лишь в 1 (7,1 %; р = 0,0050)
случае. В то же время в MLL(+) группе монобласты
определялись в 8 (57,1 %) случаях, а в MLL(–) группе –
не были определены ни у одного ребенка (р = 0,0061).
Иммунофенотип опухолевых клеток пациентов
с MLL(+) ОМЛ также существенно отличался от фе-
нотипа бластов пациентов MLL(–). Экспрессия анти-
генов опухолевыми клетками пациентов с MLL(+)
и MLL(–) ОМЛ приведена в табл. 2.
Наши данные позволяют утверждать, что экспрес-
сия NG2, CD99, CD15 и CD133, а также отсутствие
экспрессии CD61 могут прогнозировать наличие пе-
рестройки гена MLL. Типичные примеры экспрессии
антигенов представлены на рис. 2. Характеристики
параметров диагностической информативности опре-
деления экспрессии CD15, CD133, CD99, CD61 и NG2
ОЛЛ 67,78 % ОЛЛ 87,18 %
ОБфЛ 2,22 % ОБфЛ 1,14 %
ОНдЛ 0,57 %ОБлЛ 3,33 % ОБлЛ 0,28 %
ОМЛ 26,67 %
ОМЛ 10,83 %
а б
Рис. 1. Распределение вариантов ОЛ по данным иммунофенотипирования: а – у пациентов первого года жизни (n = 90); б – у более старших
детей (n = 351)
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я361
’2
01
3 для прогнозирования наличия перестроек гена MLL
представлены в табл. 3.
Экспрессия CD61 характерна для острого мегака-
риобластного лейкоза (ОМЛ М7 по FAB-класси-
фикации). Данный вариант ОМЛ редко ассоциирован
с перестройками гена MLL [41, 42], однако в исследуе-
мой группе среди MLL(+)-пациентов был выявлен
1 случай ОМЛ М7. Девочка, 6 месяцев, по ступила с вы-
раженными признаками интоксикации, анемией, ге-
моррагическим синдромом, увеличением печени и се-
лезенки, умеренным лейкоцитозом. В мие ло грамме
Таблица 2. Экспрессия антигенов опухолевыми клетками пациентов
с MLL(+) и MLL(–) ВП-ОЛЛ
MLL(+)* MLL(–)* p
CD13 5/14 4/9 0,5046
CD33 12/14 7/10 0,3320
CD117 5/13 3/9 0,5836
CD45 14/14 10/10 0,9999
CD34 3/14 5/9 0,1102
CD133 5/12 0/9 0,0389
CD99 10/11 1/6 0,0054
CD7 2/14 5/9 0,0517
CD19/22 3/14 0/9 0,2055
CD15 12/14 3/9 0,0166
CD65 10/12 1/4 0,0632
CD61 1/14 6/10 0,0088
NG2 11/14 0/7 0,0010
CD235a 1/14 0/9 0,6087
CD14 1/12 2/8 0,3439
CD4 11/12 5/9 0,0805
CD56 11/13 4/9 0,0642
MPO 4/14 2/10 0,5057
Примечание. Данные представлены в формате «число позитивных пациентов / общее число пациентов, которым проводилось опреде-ление экспрессии антигена». MLL(+)* – пациенты с наличием пе-рестроек гена MLL; MLL(–)* – пациенты, у которых перестройка гена MLL выявлена не была.
Таблица 3. Характеристики параметров диагностической инфор-
мативности определения экспрессии антигенов для прогнозирования
наличия перестроек гена MLL
ДЧ, % Сп, % ПЦПР, % ПЦОР, % ДЭТ, %
Экспрессия
CD13341,7 100 100 56,3 66,7
Экспрессия
CD9990,9 83,3 90,9 83,3 88,2
Экспрессия
CD1585,7 66,7 80,0 75,0 78,3
Отсутствие экс-
прессии CD6192,9 60,0 76,5 85,7 79,2
Экспрессия
NG278,6 100 100 70,0 85,7
Экспрессия
NG2 или CD99100 87,5 93,3 100,0 95,5
Примечание. ДЧ – диагностическая чувствительность, Сп – спе-цифичность, ПЦПР – прогностическая ценность положительного результата, ПЦОР – прогностическая ценность отрицательного результата, ДЭТ – диагностическая эффективность теста.
Рис. 2. Типичные примеры экспрессии антигенов при ОМЛ с наличием перестроек гена MLL и без них у детей первого года жизни
MLL +
MLL –
MLL +
MLL –
CD99 CD61 NG2
CD133 CD15
Коли
чест
во к
лето
к
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 37
1’
20
13при цитоморфологическом исследовании обнаружено
82 % бластных клеток, имеющих морфологические
признаки мегакариоцитарной линии дифференциров-
ки. Во всех опухолевых клетках выявлена цитохими-
ческая реакция на кислую фосфатазу, хлорацетат
эстеразу, неспецифическую α-нафтилацетат эстеразу,
в части клеток – позитивная ШИК-реакция. Реакции
на миелопероксидазу и липиды (окраска суданом чер-
ным В) была отрицательна. При иммунофеноти-
пировании определено, что все опухолевые клетки
экспрессировали CD45, однако экспрессия данного
маркера была снижена по сравнению с лейкоцитами.
Бласты также экспрессировали CD61, CD41a, CD7,
CD117, CD4, CD56 и гликофорин А (CD235a), 23,5 %
опухолевых клеток также слабо экспрессировали NG2.
Экспрессия других миелоидных, В- и Т-линейных ан-
тигенов, а также маркеров клеток-предшественников
(CD34 и CD133) не выявлена. По совокупности дан-
ных цитологического, цитохимического исследований
и иммунофенотипирования был поставлен диагноз
ОМЛ М7. При цитогенетическом исследовании была
определена транслокация t(9;11), а при проведении
ОТ-ПЦР – химерный транскрипт MLL-MLLT3. Нали-
чие перестройки гена MLL было также подтверждено
методом FISH. Таким образом, нами было выявлено
достаточно редкое сочетание перестройки гена MLL
с острым мегакариобластным лейкозом.
Обсуждение полученных результатов
ОМЛ у детей первого года жизни, как и ОЛЛ, ха-
рактеризуется особенной биологией опухоли [21–24].
Эти особенности обусловлены наличием перестроек
гена MLL, наиболее часто встречающихся именно
у пациентов младше 1 года. Однако частота встречае-
мости перестроек гена MLL при ОМЛ у детей первого
года жизни ниже таковой при ОЛЛ [4, 11, 12, 16–18].
На протяжении длительного времени ведутся ра-
боты по поиску иммунологических маркеров, позво-
ляющих с достаточно высокой вероятностью прогно-
зировать наличие молекулярно-генетических аберраций
с вовлечением региона 11q23. И если типичный имму-
нофенотип опухолевых клеток при ОЛЛ, ассоцииро-
ванном с перестройками гена MLL, описан достаточно
четко [25–31], то подобных данных относительно
ОМЛ сравнительно немного. Чаще всего описывается
только экспрессия опухолевыми клетками при MLL(+)
ОМЛ маркера NG2, считающегося очень специфич-
ным MLL-ассоциированным антигеном [28, 32–34].
В доступной нам литературе мы не встретили работ,
посвященных иммунофенотипированию ОМЛ у детей
первого года жизни, как имеющих MLL-перестройки,
так и без них. Обычно описывается иммунофенотип
только MLL-позитивных пациентов, вне зависимости
от возраста [32–34].
В нашей популяции больных выявление ОМЛ со-
ставило 26,67 % всех ОЛ у детей первого года жизни,
в то время как среди ОЛ у более старших детей ОМЛ
встречался значительно реже (10,83 %). Цитоморфо-
логические варианты и иммунофенотипы ОМЛ су-
щественно отличались внутри исследуемой группы,
в зависимости от наличия/отсутствия перестроек гена
MLL. Отсутствие экспрессии CD61, а также высокая
экспрессия CD99, CD15, CD133 и NG2 характеризо-
вали иммунофенотип опухолевых клеток при наличии
перестроек гена MLL. Диагностическая эффектив-
ность выявления экспрессии CD99 и NG2 для прогно-
зирования наличия перестроек гена MLL оказалась
наиболее высокой, в то время как диагностическая
эффективность остальных маркеров была значительно
ниже. Одновременное же определение экспрессии
NG2 и CD99 позволило по наличию на опухолевых
клетках хотя бы одного из этих антигенов правильно
прогнозировать перестройку гена MLL у 95,5 % паци-
ентов. Ранее было показано, что экспрессия CD15,
CD133 и NG2 характерна для наличия перестроек гена
MLL и при ОЛЛ [26–31], в то время как для CD99
такой зависимости выявлено не было [31]. Таким об-
разом, ОЛЛ и ОМЛ у детей первого года жизни с на-
личием перестроек гена MLL имеют ряд общих осо-
бенностей иммунофенотипа.
Среди пациентов с ОМЛ без перестроек гена MLL
преобладал острый мегакариобластный лейкоз с ха-
рактерной экспрессией CD61. Однако и среди паци-
ентов MLL(+)-группы был выявлен 1 случай ОМЛ М7.
Этот описанный выше случай является нетипичным,
поскольку при данном варианте ОМЛ перестройки
гена MLL обнаруживаются редко [41, 42]. Однако
и при ОМЛ М7 эффективность NG2 для прогнозиро-
вания наличия перестроек гена MLL оказалась очень
высока.
По данным литературы, при ОМЛ у детей первого
года жизни самым частым партнером гена MLL яв-
ляется ген MLLT3 (32,0 % случаев), несколько реже
выявляются MLLT10 (23,1 %), ELL (11,6 %), MLLT4
(7,5 %), MLLT11 (4,8 %), EPS15 и MLLT1 (по 3,4 %) [20].
На долю других химерных генов приходится менее
15 % всех случаев ОМЛ у детей, но именно за счет них
достигается чрезвычайно высокая вариабельность ти-
пов перестроек гена MLL, которых описано более 60 [20].
Это тем более важно, потому что прогноз при ОМЛ во
многом определяется геном-партнером [43–46]. Так,
роль t(9;11)(p21;q23)/MLL-MLLT3 при ОМЛ – скорее
благоприятная [45], хотя это показано не для всех про-
токолов терапии ОМЛ у детей младше 12 месяцев [44].
В то же время наличие t(6;11)(q27;q23)/MLL-MLLT4
и t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10 ассоциировано с не-
благоприятным прогнозом [46].
Поскольку в рутинной лабораторной практике ме-
тодом ОТ-ПЦР чаще всего проводится определение
только MLL-MLLT3, MLLT-MLLT4 и реже MLL-MLLT10,
MLL-ELL [38], то существует большая вероятность
«пропустить» имеющуюся перестройку гена MLL.
Важным исследованием, использующимся для скри-
нинга наличия перестроек MLL, является метод FISH
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я381
’2
01
3 [47–51], однако данный диагностический подход до-
ступен только в ограниченном числе лабораторий.
Таким образом, при проведении обычного рутин-
ного определения наиболее частых молекулярно-
генетических нарушений у пациентов младше 1 года
с ОМЛ у существенного количества MLL(+)-больных
перестройки данного гена выявлены не будут. В то же
время эффективность прогнозирования наличия лю-
бых перестроек гена MLL с помощью определения
экспрессии CD99 и NG2 в нашем исследовании соста-
вила 95,5 %, поэтому применение данных антигенов
при первичном иммунофенотипировании ОМЛ у де-
тей первого года жизни представляется крайне необ-
ходимым. Для максимально точной оценки прогноза
у пациентов с ОМЛ при обнаружении экспрессии опу-
холевыми клетками CD99 или NG2 следует проводить
более углубленный поиск перестроек гена MLL при
1. WHO Classification of Tumours
of Haematopoietic and Lymphoid Tissues.
Swerdlow S., Campo E., Harris N.L. et al.
(eds.). Lyon, France: IARC, 2008.
2. Vardiman J., Thiele J., Arber D. et al.
The 2008 revision of the World Health Orga-
nization (WHO) classification of myeloid
neoplasms and acute leukemia: rationale and
important changes. Blood 2009;111:937–51.
3. Ross J., Davies S., Potter J., Robison L.
Epidemiology of childhood leukemia, with a
focus on infants. Epidemiol Rev
1994;16:243–72.
4. Pui C.-H., Kane J., Crist W. Biology and
treatment of infant leukemias. Leukemia
1995;9:762–9.
5. Biondi A., Cimino G., Pieters R., Pui C.H.
Biological and therapeutic aspects of infant
leukemia. Blood 2000;96:24–33.
6. Webb D., Harrison C., Stevens R. et al.
Relationships between age at diagnosis,
clinical features, and outcome of therapy
in children treated in the Medical Research
Council AML 10 and 12 trials for acute
myeloid leukemia. Blood 2001;98:1714–20.
7. Pui C.-H., Kalwinsky D., Schell M. et al.
Acute nonlymphoblastic leukemia in infants:
clinical presentation and outcome. J Clin
Oncol 1988;6:1008–13.
8. Chessells J., Harrison C., Kempski H.
et al. Clinical features, cytogenetics and
outcome in acute lymphoblastic and myeloid
leukaemia of infancy: report from the MRC
Childhood Leukaemia working party.
Leukemia 2002;16:776–84.
9. van Wering E., Kamps W. Acute leukemia
in infants. A unique pattern of acute nonlym-
phocytic leukemia. Am J Pediatr Hematol
Oncol 1986;8:220–4.
10. Vormoor J., Ritter J., Creutzig U. et al.
Acute myelogenous leukaemia in children
under 2 years – experiences of the West
German AML studies BFM-78, -83 and -87.
AML-BFM Study Group. Br J Cancer
1992;18(Suppl.):63–7.
11. Pui C-H., Raimondi S., Srivastava D.
et al. Prognostic factors in infants with acute
myeloid leukemia. Leukemia 2000;14:684–7.
12. Sorensen P., Chen C., Smith F. et al.
Molecular rearrangements of the MLL gene
are present in most cases of infant acute
myeloid leukemia and are strongly correlated
with monocytic or myelomonocytic
phenotypes. J Clin Invest 1994;93:429–37.
13. Park K., Lee D., Lee H. et al. Granulo-
cytic sarcoma in MLL-positive infant acute
myelogenous leukemia: fluorescence in situ
hybridization study of childhood acute
myelogenous leukemia for detecting MLL
rearrangement. Am J Pathol
2001;159(6):2011–6.
14. Pieters R. Biology and treatment of
infant leukemias. In: Pui С.-H. (editor),
Treatment of Acute Leukemias: New
Directions for Clinical Research. Totowa,
USA: Humana Press, 2003. Pp. 61–73.
15. Felix C., Lange B. Leukemia in infants.
Oncologist 1999;4:225–40.
16. Balgobind B., Raimondi S., Harbott J.
et al. Novel prognostic subgroups in child-
hood 11q23/MLL-rearranged acute myeloid
leukemia: results of an international retro-
spective study. Blood 2009;114:2489–96.
17. Harrison C., Hills R., Moorman A. et al.
Cytogenetics of childhood acute myeloid
leukemia: United Kingdom Medical
Research Council Treatment trials AML 10
and 12. J Clin Oncol 2010;28(16):2674–81.
18. Neuhoff von C., Reinhardt D., Sander A.
et al. Prognostic impact of specific
chromosomal aberrations in a large group of
pediatric patients with acute myeloid
leukemia treated uniformly according to trial
AML-BFM 98. J Clin Oncol
2010;28(16):2682–9.
19. Chantrain C.F., Poirel H.A. The genetic
signature of acute leukemia in infancy. Hem
Oncol 2010;1:1–8.
20. Meyer С., Kowarz E., Hofmann J. et al.
New insights to the MLL recombinome of
acute leukemias. Leukemia 2009;23:1490–9.
21. Armstrong S.A., Staunton J.E.,
Silverman L.B. et al. MLL translocations
specify a distinct gene expression profile that
distinguishes a unique leukemia.
Nat Genetics 2002;30:41–7.
22. Zangrando A., Dell’Orto M.C.,
te Kronnie G., Basso G. MLL rearrange-
ments in pediatric acute lymphoblastic and
myeloblastic leukemias: MLL specific and
lineage-specific signatures. BMC Med
Genom 2009;23:2–36.
23. Stam R.W., Schneider P.,
Hagelstein J.A.P. et al. Gene expression
profiling-based dissection of MLL translo-
cated and MLL germline acute lymphoblastic
leukemia in infants. Blood 2010;115:2835–44.
24. Qazi S., Uckun F.M. Gene expression
profiles of infant acute lymphoblastic
leukemia and its prognostically distinct
subsets. Br J Hematol 2010;149:865–73.25. Szczepanski T., Harrison C.J.,
van Dongen J.J.M. Genetic aberrations in
paediatric acute leukaemias and implication
for management of patients. Lancet Oncol
2010;11:880–9.
26. Borkhardt A., Vuchter C., Viehmann S.
et al. Infant acute lymphoblastic leukemia –
combined cytogenetic, immunophenotypical
and molecular analysis of 77 cases. Leukemia
2002;16:1685–90.
27. Hrusak O., Porwit-MacDonald A.
Antigen expression patterns reflecting
Л И Т Е Р А Т У Р А
помощи FISH, мультиплексной ОТ-ПЦР и длинной
инвертированной ПЦР, а не ограничиваться стандар-
тным определением наиболее частых химерных генов.
Выводы
Частота выявления ОМЛ у детей первого года жиз-
ни составила 26,67 % всех случаев ОЛ, что было зна-
чительно чаще, чем у старших детей (10,83 %).
Иммунофенотип ОМЛ у детей младше 1 года су-
щественно различается в зависимости от наличия или
отсутствия перестроек гена MLL.
У детей младше 1 года с ОМЛ экспрессия NG2,
CD99, CD133, CD15, а также отсутствие экспрессии
CD61 позволяют с уверенностью предполагать нали-
чие какой-либо перестройки гена MLL, при этом диа-
гностическая эффективность одновременного опре-
деления экспрессии CD99 и NG2 наиболее высока.
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 39
1’
20
13 genotype of acute leukemias. Leukemia
2002;16:1233–58.
28. De Zen L., Bicciato S., te Kronnie G.,
Basso G. Computational analysis of flow
cytometry antigen expression profiles in
childhood acute lymphoblastic leukemia:
an MLL/AF4 identification. Leukemia
2003;17:1557–65.
29. Schwartz S., Reider H., Schlager B. et al.
Expression of the human homologue of rat
NG2 in adult acute lymphoblastic leukemia:
close association with MLL rearrangements
and a CD10–/CD24–/CD65s+/CD15+ B-cell
immunophenotype. Leukemia
2003;17:1589–95.
30. Attarbaschi A., Mann G., Konig M. et al.
Mixed Lineage Leukemia – rearranged
childhood pro-B and CD10-negative pre-B
acute lymphoblastic leukemia constitute
a distinct clinical entity. Clin Cancer Res
2006;15(10):2988–94.
31. Попов А.М., Цаур Г.А., Вержбицкая Т.Ю.
и др. Иммунофенотипическая характе-
ристика острого лимфобластного лейкоза
у детей первого года жизни. Онкогематол
2012;2:16–23.
32. Smith F.O., Rauch C., Williams D.E.
et al. The human homologue of rat NG2,
a chondroitin sulphate chromosome band
11q23blasts from poor-prognosis patients
with abnormalities of hematopoietic cells but
is expressed by acute myeloid leukemia pro-
teoglycan, is not expressed on the cell surface
of normal. Blood 1996;87:1123–33.
33. Mauvieux L., Delabesse E., Bourquelot P.
et al. NG2 expression in MLL rearranged
acute myeloid leukaemia is restricted to
monoblastic cases. Br J Haematol
1999;107:674–6.
34. Wuchter C., Harbott J., Schoch C. et al.
Detection of acute leukemia cells with mixed
lineage leukemia (MLL) gene
rearrangements by flow cytometry using
monoclonal antibody 7.1. Leukemia
2000;14:1232–8.
35. Bene M., Castoldi G., Knapp W. et al.
Proposals for the immunological classifica-
tion of acute leukemias. European Group for
the Immunological Characterization of Leu-
kemias (EGIL). Leukemia 1995;
9(10):1783–6.
36. ISCN 2009: An International System
Human Cytogenetic Nomenclature (2009).
Eds.: Shaffer L.G., Slovak M., Campbell L.
Karger, Basel, Switzerland, 2009.
37. Borkhardt A., Repp R., Haupt E. et al.
Molecular analysis of MLL/AF4 recombina-
tion in infant acute lymphoblastic leukemia.
Leukemia 1994;8:549–53.
38. Pallisgaard N., Hokland P., Riishoj D.
et al. Multiplex reverse transcription-
polymerase chain reaction for simultaneous
screening of 29 translocations and
chromosomal aberrations in acute leukemia.
Blood 1998;92:574–88.
39. Цаур Г.А., Наседкина Т.В.,
Попов А.М. и др. Время достижения
молекулярной ремиссии как фактор
прогноза у детей первого года жизни
с острым лимфобластным лейкозом.
Онкогематол 2010;2:46–54.
40. Weinstein S., Obuchowski N.A.,
Lieber M.L. Clinical evaluation of diagnostic
tests. Am J Roentgenol 2005;184:14–9.
41. Bernstein J., Dastugue N., Haas O. et al.
Nineteen cases of the t(1;22)(p13;q13) acute
megakaryoblastic leukaemia of infants/chil-
dren and a review of 39 cases: report from
a t(1;22) study group. Leukemia 2000;14:216–8.
42. Матвеева Е.А., Казакова А.Н.,
Калинина И.И. и др. Методы
молекулярной цитогенетики для
диагностики острого мегакариобластного
лейкоза. Онкогематол 2012;2:51–6.
43. Hilden J., Smith F., Frestedt J. et al.
MLL Gene Rearrangement, Cytogenetic
11q23 Abnormalities, and Expression of the
NG2 Molecule in Infant Acute Myeloid
Leukemia. Blood 1997;89(10):3801–5.
44. Kawasaki H., Isoyama K., Eguchi M.
et al. Superior outcome of infant acute
myeloid leukemia with intensive
chemotherapy: results of the Japan Infant
Leukemia Study Group. Blood
2001;98(13):3589–90.
45. Rubnitz J., Raimondi S., Tong X. et al.
Favorable Impact of the t(9;11) in Childhood
Acute Myeloid Leukemia. J Clin Oncol
2002;20:2302–9.
46. Balgobind B., Zwaan C., Pieters R.,
van den Heuvel-Eibrink M. The hetero-
geneity of pediatric MLL-rearranged acute
myeloid leukemia. Leukemia 2011;25:1237–48.
47. Thirman M., Gill H., Burnett R. et al.
Rearrangement of the MLL gene in acute
lymphoblastic and acute myeloid leukemias
with 11q23 chromosomal translocations.
New Eng J Med 1993;329:909–14.
48. Cuthbert G., Thompson K., Breese G.
et al. Sensitivity of FISH in detection of
MLL translocations. Genes Chromosomes
Cancer 2000;29:180–5.
49. von Bergh A., Emanuel B., Zelderen-
Bhola van S. et al. A DNA probe combina-
tion for improved detection of MLL/11q23
breakpoints by double-color interphase-
FISH in acute leukemias. Genes
Chromosomes Cancer 2000;28:14–22.
50. Dyson M., Talley P., Reilly J. et al.
Detection of cryptic MLL insertions using
a commercial dual-color fluorescence in situ
hybridization probe. Cancer Genet
Cytogenet 2003;147:81–3.
51. Цаур Г.А., Плеханова О.М., Гиндина Т.Л.
и др. Применение метода флуоресцентной
гибридизации in situ для выявления
перестроек гена MLL при острых
лейкозах у детей первого года жизни.
Мед ген 2012;7:35–43.
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я401
’2
01
3
Отдаленные результаты спленэктомии
при первичном миелофиброзе
Л.М. Мещерякова1, Л.Г. Ковалева1, С.Р. Карагюлян1, Л.Ю. Колосова1, О.В. Пороткова2, Е.А. Семенова1
1ФГБУ ГНЦ Минздрава России, Москва;2БУЗ ВО «Воронежская областная клиническая больница № 1»
Контакты: Людмила Михайловна Мещерякова [email protected]
Приведена оценка ближайших и отдаленных результатов спленэктомии в зависимости от соблюдения показаний и противо-
показаний у 18 больных первичным миелофиброзом (ПМФ). Отмечено уменьшение интра- и послеоперационных осложнений при
соблюдении показаний и противопоказаний к спленэктомии у пациентов с ПМФ, а также при проведении профилактики тром-
ботических осложнений гепарином. Продолжительность жизни больных после спленэктомии увеличена при проведении в после-
дующем соответствующего специфического лечения.
Ключевые слова: первичный миелофиброз, спленэктомия, результаты
Long-term results of splenectomy in primary myelofibrosis
L.M. Meshcheryakova1, L.G. Kovaleva1, S.R. Karagyulyan1, L.Yu. Kolosova1, O.V. Porotkova2, Ye.A. Semenova1
1Hematologic Scientific Center, Ministry of Health of Russia, Moscow;2 Voronezh Regional Clinical Hospital № 1
The estimation of immediate and long-term results after splenectomy depending on indications and contra-indications for 18 primary myelo-
fibrosis (PMF) patients was shown. The reduction of intra- and postoperative complications in PMF patients was noted if the operation was
performed under strict indications and also with prophylactic heparin therapy. Life expectancy is extended after splenectomy during subse-
quent relevant specific treatment.
Key words: primary myelofibrosis, splenectomy, results
Первичный миелофиброз (ПМФ) впервые был
описан более 100 лет назад. К настоящему времени
показано, что при ПМФ имеет место поражение ство-
ловых полипотентных кроветворных клеток с даль-
нейшей неуправляемой пролиферацией клеток-пред-
шественников миелопоэза с повышенной продукцией
факторов, стимулирующих рост фибробластов и син-
тез коллагена, а именно пластиночный дериват фак-
тора роста, который затем трансформируется в усили-
вающий рост фибробластов фактор b и эпидермальный
ростовой фактор. Фактор b фибробластов усиливает
синтез коллагенов I и III типов, фибронектина, секре-
цию компонентов экстрамедуллярного матрикса, ко-
торый принимает непосредственное участие в образо-
вании фиброзной ткани. Миелоидная пролиферация
поддерживается за счет действия колониестиму-
лирующего фактора-1 (КСФ-1) и гранулоцитарно-
макрофагального колониестимулирующего фактора.
У больных ПМФ отмечается положительная корреля-
ция содержания КСФ-1 с размером селезенки.
У большинства больных ПМФ основными клини-
ческими проявлениями являются спленомегалия, не-
достаточность костномозгового кроветворения с угне-
тением эритро- и тромбоцитопоэза. В течение болезни
селезенка у 70 % пациентов достигает гигантских раз-
меров и занимает более половины брюшной полости,
что приводит к развитию компрессионного синдрома,
инфарктов селезенки, периспленитов, спонтанных
разрывов, синдрома мальабсорбции, катаболического
синдрома, анемии и тромбоцитопении, как аутоим-
мунного, так и гиперспленического характера. Кон-
сервативная терапия становится неэффективной,
проведение ее невозможно из-за цитопенического син-
дрома. Возникает вопрос о проведении спленэктомии,
извест ной с 1871 г. [1–3].
Целью настоящего исследования явилась оценка
ближайших и отдаленных результатов лечения боль-
ных ПМФ с включением спленэктомии в зависимо сти
от соблюдения предложенных показаний и противо-
показаний.
Материалы и методы
В поликлиническом и хирургическом отделениях
Гематологического научного центра (ГНЦ) Минздра-
ва России (Москва) в 2003 г. проанализировано 68 па-
циентов с ПМФ, которым произведена спленэктомия,
которая не являлась основным методом лечения
и применялась в программе терапии по следующим
показаниям: спленомегалия с компрессионным син-
дромом при невозможности применения средств, со-
кращающих размеры селезенки, однако без признаков
бластной трансформации; аутоиммунная гемолити-
ческая анемия, рефрактерная к иммунодепрессивной
терапии, или при значительной секвестрации эритро-
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 41
1’
20
13цитов в селезенке, не сокращаемой цитостатической
терапией; глубокая аутоиммунная тромбоцитопения
(тромбоциты менее 30 × 109/л) с геморрагическим
синдромом или без него, рефрактерная к глюкокорти-
коидам и препятствующая проведению адекватной
цитостати ческой терапии. К противопоказаниям
отнесены: бластная трансформация; быстрое про-
грессирование процесса на стадии предвестников
бластной трансформации, особенно с анемическим
синдромом и выраженным фиброзом костного мозга,
интоксикацией; наличие тяжелых некомпенсируемых
сопутствующих заболеваний [4].
Лейкоцитоз и умеренный тромбоцитоз (менее
1000 × 109/л) не являются абсолютными противопо-
казаниями при условии адекватной цитостатической
подготовки.
В процессе выполнения работы мы анализировали
послеоперационное течение ПМФ в зависимости от
учета показаний и противопоказаний при выполнении
спленэктомии. Тридцать четыре больных, опериро-
ванных в соответствии с выработанными показания-
ми, имели значительно более высокую выживаемость,
чем те больные, которым спленэктомию проводили
как экстренную диагностическую процедуру без учета
вышеперечисленных противопоказаний. Медиана вы-
живаемости пациентов, оперированных с соблюдени-
ем предложенных показаний и противопоказаний,
составила 154 мес, без их учета – 50 мес. Медиана до-
жития после спленэктомии, выполненной с учетом
показаний, составила 50 мес, а без учета – 8 мес.
В раннем послеоперационном периоде умерло
7 человек. Причины смерти были следующие: аспира-
ционная пневмония, абсцесс поджелудочной железы,
инсульт (2 больных), тромбоэмболия легочной ар-
терии (3 больных) [5]. В течение 6 мес после сплен-
эктомии умерло еще 6 пациентов. Причины смерти:
у 50 % больных прогрессирование заболевания в виде
бластной трансформации с поражением клапанов серд-
ца, перикарда, легких; печеночная недостаточность.
В последующие годы: 60 % больных прожили более
5 лет, все умерли от бластного криза. От инфекцион-
ных осложнений, хронической печеночной недоста-
точности умерли 40 % больных.
Продолжительность жизни после спленэктомии
определялась вариантом заболевания. Так, у больных
спленомегалическим вариантом показанием к опера-
ции был компрессионный синдром. Продолжитель-
ность жизни после операции составила 48 ± 4 мес.
Показанием к спленэктомии у пациентов с тромбоци-
топеническим и анемическим вариантами была цито-
пения. В данной группе продолжительность жизни
после операции составила 68 ± 2 мес.
Мы провели анализ историй болезни 18 больных
ПМФ (12 женщин и 6 мужчин), которым была выпол-
нена спленэктомия: в возрасте от 20 до 49 лет – 7 боль-
ных, от 50 до 70 лет – 11 пациентов. Показаниями
к операции были: у 4 больных хирургические (у 1 боль-
ной рецидивирующее кровотечение из вен пищевода
с последующей гастротомией и прошиванием вен пи-
щевода, у 1 пациентки – варикозное расширение вен
пищевода III степени и опасность кровотечения, у 2 –
тромбоз v. lienalis и мезентериальных сосудов); спле-
номегалия, не купируемая цитостатической терапией,
была показанием к спленэктомии у 9 больных; ауто-
иммунная анемия в сочетании с тромбоцитопенией –
у 5 пациентов. К моменту операции давность заболе-
вания до 1 года была у 2 больных, от 1 года до 7 лет – у 9,
от 8 до 9 лет – у 7 пациентов. В предоперационном
периоде селезенка была увеличена у всех больных; ги-
гантская селезенка, занимавшая более половины
брюшной полости и спускавшаяся в малый таз, отме-
чена у 70 % пациентов. Увеличение печени было от-
мечено у всех больных. Асцит был у 5 больных, вари-
козное расширение вен пищевода и желудка также
у 5 больных.
Результаты и обсуждение
Трепанобиопсия в процессе предоперационного
обследования была сделана в 14 случаях. По результа-
там гистологического исследования у 9 больных (1-я
группа) показанием к спленэктомии была спленоме-
галия (спленомегаличе ский вариант ПМФ); у 5 боль-
ных – цитопения (тромбоцитопения, анемия; цито-
пенический вариант). У 2 (25 %) больных 1-й группы
была снижена клеточность костного мозга, у осталь-
ных, несмотря на диффузный фиброз, содержание
элементов 3 ростков миелопоэза было близко к норме
(рис. 1). У больных с цитопеническим вариантом оп-
ределялся остеомиелосклероз с резким снижением
клеточности костного мозга (рис. 2, 3).
При гистологическом исследовании оперативно
удаленных селезенок выявлена редукция белой пуль-
пы, особенно у больных со спленомегалическим вари-
антом, инфильтрация элементами 3 ростков гемо по эза.
Эти изменения имели разную степень выраженности:
Рис. 1. Трепанобиоптат подвздошной кости. Объектив 200. ПМФ,
клеточная стадия (наблюдается в первые годы развития заболевания)
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я421
’2
01
3 во всех полях зрения обнаруживались наряду с лим-
фоидными и гистиоцитарными элементами мелкие
группы эритрокарио цитов, отдельные мегакариоци-
ты, уродливые и голоядерные, местами образующие
кластеры. В части удаленных селезенок найдены
склеропигментные узелки, свидетельствующие о дли-
тельности процесса, а также свежие и организующи-
еся инфаркты. Наблюдался фиброз ткани селезенки,
причем при спленомегалическом варианте грубово-
локнистый диффузный, а при цитопеническом вари-
анте – очаговый (рис. 4, 5).
У 6 больных в воротах удаленной селезенки обна-
руживали лимфатические узлы. В большинстве на-
блюдений при обоих вариантах рисунок строения
лимфатического узла был сохранен, в расширенных
синусах выявлялась пролиферация кроветворных эле-
ментов на всех стадиях созревания, проникающих из
синуса в ткань узла (рис. 6).Рис. 2. Трепанобиоптат подвздошной кости. Объектив 200. ПМФ,
стадия фиброза
Рис. 3. Трепанобиоптат подвздошной кости. ПМФ, стадия остео-
миелосклероза
Рис. 4. Биоптат оперативно удаленной селезенки при ПМФ. Объектив 400
Рис. 5. Фрагмент предшествующего препарата. Объектив 200
Рис. 6. Лимфатический узел ворот селезенки при ПМФ. Объектив 400
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 43
1’
20
13Во всех биоптатах печени изменения были одно-
типными: при сохранной дольковой структуре, незна-
чительная лимфоидная и гистиоцитарная инфильт-
рация в портальных трактах, умеренная дистрофия
гепатоцитов. В синусоидных капиллярах обнаружены
мелкие группы клеток эритро- и гранулоцитопоэза,
отдельные мегакариоциты. Между выраженностью
миелоинфильтрации селезенки и печени корреляции
нет. В печени она очень умеренная.
В предоперационный период в связи с тромбоци-
тозом и спленомегалией 12 больных принимали гидреа
(1000–2000 мг в сутки). Препараты α-интерферона
вводили 5 больным в дозе 3 млн МЕ 5 раз в нед (трем
из них в сочетании с гидреа). Эритропоэтин получали
3 больных в дозе 30 000 ЕД в нед, преднизолон –
2 больных в дозе 40 мг в сутки в связи с тромбоцито-
пенией и аутоиммунной гемолитической анемией [6].
В связи с опасностью тромботических осложнений
в ближайший и ранний послеоперационный период
все больные профилактически получали терапию ге-
парином в дозе 10 000–12 000 ЕД в сутки и трансфузии
свежезамороженной плазмы в первые 3–10 дней по сле
операции (в среднем по 1000 мл).
В раннем послеоперационном периоде у 40 % боль-
ных наблюдались следующие осложнения: рецидиви-
рующее кровотечение из ложа удаленной селезенки,
потребовавшее 2 повторных лапаротомий у 1 больной;
у 3 пациентов – нижнедолевая левосторонняя пневмо-
ния и у 3 – реактивный панкреатит. У остальных паци-
ентов ранних послеоперационных осложнений не было.
В позднем послеоперационном периоде у всех
больных была купирована тромбоцитопения, в отде-
льных случаях наблюдался тромбоцитоз до 2000 × 109/л.
Отмечены также изменения функциональных свойств
тромбоцитов в виде снижения агрегации с адренали-
ном, появления макроагрегатов, повышения скорости
агрегации тромбоцитов. В плазменном звене гемоста-
за выявлены: укорочение активированного частично-
го тромбопластинового времени, положительный эта-
ноловый тест, замедление фибринолиза, которое
сохранялось длительно и в отдаленном послеопера-
ционном периоде.
В связи с выраженными коагулологическими из-
менениями больным проводили исследование генети-
ческих факторов тромбофилии. У больного, у которого
в постоперационном периоде развилась тромботиче-
ская окклюзия ствола портальной и верхней брыже-
ечной вен с асцитом, при исследовании маркеров
тромбофилии выявлено гомозиготное наследование
в 2 ал лелях гена PAI-1 и гетерозиготная мутация в гене
метилентетрагидрофолатредуктазы.
В связи с гипертромбоцитозом у всех оперирован-
ных больных дозу гидреа сначала увеличивали до 3000 мг
в сутки, но из-за развития токсических осложнений
в виде анорексии, рвоты, диареи, повышения уровня
трансаминаз в 1,5 раза дозу снижали до 2000 мг в сутки
и сочетали с введением препаратов α-интерферона
по 3 млн МЕ ежедневно в течение 2 нед, затем по 3 млн
МЕ 3 раза в нед. У 1 пациентки указанная цитостати-
ческая терапия была неэффективна, что потребовало
назначения милерана по 4 мг в сутки до суммарной
дозы 450 мг. Лейкоцитоз от 23 × 109/л до 12 × 109/л
снижался под действием цитостатической терапии.
Анемия оставалась у 3 больных, что потребовало
трансфузий эритроцитарной массы в течение 4–6 нед
после операции с одновременным продолжением те-
рапии рекомбинантными эритропоэтинами (эпрекс,
рекормон) в дозе 30–40 тыс. в неделю до 10–12 мес [7].
Продолжительность жизни больных, оперирован-
ных по хирургическим показаниям (тромбозы v. lienalis,
инфаркты селезенки, разрывы селезенки), составила
в среднем 78 ± 4 мес. Двум пациентам проводили аде-
кватную предоперационную подготовку, осложнения
в ранний послеоперационный период вовремя купиро-
вали и в дальнейшем назначали сочетанную терапию
гидреа в дозе 1500 мг в сутки и реаферон в дозе 3 млн
МЕ 3 раза в неделю, а также прямые антикоагулянты
(гепарин 10 000 ЕД в сутки в течение 7 дней, затем
фраксипарин по 0,3 мл 2 раза в сутки в течение 4 мес
с последующим переводом на сулодексид по 1 капсуле
(250 ЛЕ) 2 раза в сутки). Также назначали дезагреганты:
тромбо асс 100 мг и/или плавикс 75 мг в сутки [8].
Продолжительность жизни больных после опера-
ций, проведенных по поводу спленомегалии с ком-
прессионным синдромом, составила 46 ± 7 мес. До
спленэктомии больным с тромбоцитозом проводили
цитостатическую терапию до снижения уровня тром-
боцитов до 300 × 109/л с целью уменьшения постопе-
рационных тромботических осложнений. При этом
в послеоперационный период цитостатиче скую тера-
пию продолжали, к гидреа добавляли пре параты
α-интерферона в стандартных дозировках, с одновре-
менной терапией антикоагулянтами и дезагрегантами.
В настоящее время, спустя 36 мес, 7 больным продол-
жается сочетанная терапия, 2 пациентам проводится
терапия только гидреа [9].
Больные, оперированные в связи с цитопениче-
ским синдромом, прожили 37 ± 6 мес. До сплен эк томии
больным анемией проводили терапию преднизоло-
ном, ретаболилом, рекомбинантным эритропоэтином
в дозе 12 000–30 000 МЕ в нед, трансфузии эритроци-
тарной массы. При исследовании с радио активным
хромом у 3 больных выявлено преимущественное раз-
рушение эритроцитов в селезенке. Положительная
проба Кумбса была у 2 больных. В послеоперацион-
ный период у 1 больной концентрация гемоглобина
увеличилась до 87 г/л, противоанемическая терапия
включала в себя витамины группы В и фолиевую кис-
лоту. Остальным 4 больным в 1-й месяц после операции
продолжали выполнять трансфузии эритроцитарной
массы с одновременным введением рекомбинантных
эритропоэтинов в дозе 30 000 ЕД в нед, 2 больным
в сочетании с препаратами α-интерферона 3 млн МЕ
3 раза в нед с последующим назначением одному
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я441
’2
01
3 1500 мг гидреа ежедневно в связи с ростом тромбоци-
тоза. У 1 больного зависимость от гемотрансфузий
значительно уменьшилась, но через год после сплен-
эктомии имеются признаки бластной трансформации.
После спленэктомии у больных наблюдался тромбо-
цитоз и гипертромбоцитоз, максимально до 5000 × 109/л.
Тромбоцитопения является неблагоприятным приз-
наком фазы бластной трансформации, которая явля-
ется причиной смерти больных после спленэктомии
в отдаленные сроки. В остальных случаях причинами
смерти были: инфаркт миокарда, сепсис, не купируе-
мая эритропоэтинами анемия.
Таким образом, спленэктомия не излечивает ПМФ,
но улучшает качество жизни больных, влияя на физи-
ческое, психологическое и социальное функциониро-
вание больного. В связи с ликвидацией компрессион-
ного синдрома исчезают боли, приступы почечной
колики, явления пиелонефрита, цистита, нормализу-
ется работа кишечника, имеет место прибавка массы
тела. Больные становятся более активными, исчезает
чувство страха из-за угрозы разрыва селезенки.
В исследовании влияния эритропоэтина на пара-
метры качества жизни в ходе лечения отмечено умень-
шение и исчезновение зависимости от гемотранс-
фузий, повышение активности повседневной жизни.
В заключение следует отметить, что у всех анали-
зируемых нами больных, которым спленэктомия была
проведена по показаниям, не наблюдалось интра-
операционных осложнений. Применение прямых
антикоагулянтов в достаточных дозах и длительно,
назначение цитостатической терапии в ранний после-
операционный период позволили избежать таких
жизнеугрожающих осложнений, как тромбоэмболия
легочной артерии и инфаркт миокарда. После сплен-
эктомии возможна коррекция глубокой анемии, свя-
занной с недостаточностью кроветворения вследствие
остеомиелофиброза и остеомиелосклероза костного
мозга при длительном применении рекомбинантных
эритропоэтинов в адекватных дозах.
В качестве примера адекватной тактики выполне-
ния спленэктомии при ПМФ, проведенной по строгим
показаниям, приводим историю болезни больного З., 64 лет,
который обратился в поликлинику по месту житель-
ства в декабре 2001 г. с жалобами на одышку при незна-
чительной физической нагрузке и слабость. В анализе
крови при обследовании в поликлинике: гемоглобин 92 г/л,
эритроциты 3,7 × 1012/л, цветной показатель 0,75, ре-
тикулоциты 16 0/00, лейкоциты 3,8 × 10 9/л, палочко-
ядерные нейтрофилы 2 %, сегментоядерные нейтрофилы
52 %, эозинофилы 2 %, лимфоциты 35 %, моноциты 9 %,
СОЭ 23 мм/ч. Диагностирована железодефицитная ане-
мия. Проводилось лечение препаратами железа. Несмотря
на проводимое в течение 4 мес лечение, состояние боль-
ного ухудшалось, в повторном анализе крови: гемоглобин
51 г/л, лейкоциты 3,4 × 109/л, тромбоциты 55 × 10 9/л.
Госпитализирован в гематологическое отделение с диа-
гнозом панцитопения неясного генеза, выявлена сплено-
мегалия 190 × 83 мм, сниженная клеточность костного
мозга с остеомиелосклерозом. Установлен диагноз ПМФ
и сопутствующее заболевание – желчекаменная болезнь.
Проводилась терапия трансфузиями эритроцитарной
массы, преднизолоном 40 мг в сутки. Анемический синд-
ром частично купирован, но больной оставался зависим
от гемотрансфузий, развился гемолитический синдром,
резистентный к кортикостероидной терапии, и глубо-
кая тромбоцитопения до 25 × 10 9/л. В ГНЦ 25.07.2002
проведены спленэктомия и холецистэктомия, биопсия
печени. Операционный и послеоперационный периоды про-
текали без осложнений. Микроскопически в селезенке
определялись немногочисленные фолликулы небольших
размеров, сформированные малыми лимфоцитами. Крас-
ная пульпа очагово полнокровна и неравномерно клеточ-
на. Наряду с малыми лимфоцитами выявлялись очаго-
вые скопления эритроидных клеток с выраженными
признаками дисплазии, промежуточных и незрелых кле-
ток гранулоцитопоэза и отдельных мегакариоцитов.
Указанные клетки локализовались преимущественно
в пульпарных тяжах и местами в синусах (см. рис. 6).
В печени имелась дискомплексация печеночных балок,
участки фиброза, дистрофические изменения гепато-
цитов. В синусоидных капиллярах были скопления кле-
ток эритро- и гранулоцитопоэза, единичных дистро-
фически измененных мегакариоцитов. В желчном
пузыре картина хронического холецистита с очагами
обострения.
В течение последующих 3 мес после операции у боль-
ного сохранялась тяжелая анемия (гемоглобин 69–75 г/л),
он получал трансфузии эритроцитарной массы (3–4 ра-
за в мес) и рекормон в дозе 10 000–20 000 ЕД в нед. Учи-
тывая низкую эффективность лечения, больному прове-
ден курс иммуносупрессивной терапии циклоспорином А
в дозе 300 мг в сутки, суммарно – 4200 мг. В результате
отмечено стойкое повышение гемоглобина до 92 г/л,
эритроциты 3,2 × 10 12/л, ретикулоциты 110/00, тромбо-
циты 259 × 10 9/л, лейкоциты 4,7 × 10 9/л. Затем, в свя-
зи с побочными явлениями, терапия циклоспорином А
была прервана, а доза рекормона увеличена до 30 000 ЕД
в нед. На этой терапии больной находился в течение 24 мес,
трансфузии не проводили. При обследовании в сентябре
2004 г.: в анализе крови – гемоглобин 95 г/л, эритроциты
3,35 × 10 12/л, тромбоциты 141 × 10 9/л, ретикулоциты
15 0/00, лейкоциты 7,2 × 10 9/л, бласты 1 %, миелоциты
8 %, метамиелоциты 2 %, палочкоядерные нейтрофилы
16 %, сегментоядерные нейтрофилы 30 %, лимфоциты
32 %, моноциты 11 %, нормобласты 190:100, СОЭ 32 мм/ч,
тельца Жолли. В костном мозге эритроидный росток
составлял 70,8 %, в трепанобиоптате картина диффуз-
ного миелофиб роза. С 2004 г. на 3 года терапии доза
реаферона уменьшена до 9 млн МЕ в неделю для поддер-
жания суб нормального уровня гемоглобина. С октября
2007 г. отмечено ухудшение состояния, снижение гемо-
глобина до 80 г/л, в трепанобиоптате нарастание явле-
ний остеосклероза и угнетение миелопоэза. Возобновлена
терапия рекормоном в дозе 30 000 ЕД в неделю, которая
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 45
1’
20
13продолжается в сочетании с препаратами α-интерфе-
рона до настоящего времени.
Таким образом, в результате проводимой терапии,
включающей спленэктомию с последующей терапией
рекомбинантным эритропоэтином в сочетании с пре-
паратами α-интерферона, получена стойкая клинико-
гематологическая ремиссия.
Больная Г., 55 лет. Диагноз ПМФ установлен в 2004 г.
на основании спленомегалии (размер селезенки по данным
ультразвукового исследования 23 × 10 см); изменений
в гемограмме в виде умеренной нормохромной анемии:
гемоглобин 105 г/л, эритроциты 3,5 × 1012/л, ретикуло-
циты 12 0/00, лейкоциты 15,9 × 10 9/л, сдвиг в лейкофор-
муле до миелоцитов; гистологического анализа костно-
го мозга. Костная ткань с явлениями новообразования
в виде напластования остеоида на старую кость. Костно-
мозговые полости сужены, заполнены фиброзной тканью.
На этом фоне видны в увеличенном числе деформирован-
ные мегакариоциты и группы клеток эритро- и грануло-
поэза. Проводили терапию гидреа в дозе 1000 мг в сутки.
Несмотря на проводимую терапию, наблюдалось про-
грессивное увеличение размеров селезенки. В феврале
2006 г. в связи с немотивированным похуданием (на 5 кг
за 2 мес), углублением анемии до 90 г/л, изменением ха-
рактера анемии с нормохромного на гипохромный произ-
ведена гастроскопия, при которой выявлен неопласти-
ческий процесс в желудке. 18.07.2006 в ГНЦ проведена
операция: расширенная гастрэктомия и спленэктомия –
удалена селезенка массой 4500 г. Гистологическое заклю-
чение: в желудке картина перстневидноклеточного рака.
В селезенке и лимфа тических узлах изменения, характер-
ные для ПМФ. Пост операционный период осложнился
тромбоцитозом до 1200 × 10 9/л, что потребовало уве-
личения дозы гидреа до 2000 мг в сутки. Был назначен
гепарин 10 000 ЕД в сутки и тромбо асс 100 мг в сутки.
Больная была выписана на 15-е сутки после операции
в удовлетворительном состоянии. Наблюдалась гемато-
логом по месту жительства, сохранялась умеренная
анемия (гемоглобин 103 г/л, эритроциты 3,9 × 10 12/л,
ретикулоциты 15 0/00, лейкоциты 13,5 × 10 9/л, тромбо-
цитоз 670–850 × 10 9 /л, поэтому было отменено лечение
гидреа и назначен продимин по 100 мг в день, на курс –
8000 мг. Под влиянием проведенной терапии количество
тромбоцитов снизилось до 300 × 10 9/л, лейкоцитов
до 6,0 × 10 9/л. В связи со снижением гемоглобина до 85 г/л
с апреля 2008 г. больной проводится терапия рекормоном
по 10 000 ЕД 3 раза в нед, уровень гемоглобина сохраня-
ется в пределах 105–110 г/л. В настоящее время само-
чувствие и качество жизни удовлетворительные.
Таким образом, своевременно проведенная сплен-
эктомия позволила избежать компрессионных ос-
ложнений со стороны органов брюшной полости
и избавить больную от 2-го злокачественного новооб-
разования. Назначенная цитостатическая терапия
позволит сдерживать миелопролиферативный процесс
в печени и костном мозге.
Наш небольшой опыт подтверждает возможность
лечения больных ПМФ препаратами, воздействующими
на ангиогенез (леналидомид, талидомид). В результате их
применения сокращается миелопролиферация и фиброз
в костном мозге, печени и селезенке. В связи с этим пред-
полагается лечение этими препаратами больных с выра-
женной спленомегалией, у которых невозможна спле-
нэктомия из-за наличия стадии акселерации, а также
пациентов с развившейся гепатомегалией после спленэк-
томии при возникшей резистентности к цитостатиче-
ским препаратам. Использование этих лекарственных
средств может ограничить применение спленэктомии.
1. Бутояну Е. Миелоидная метаплазия
с миелосклерозом. В кн.: Клиническая
гематология (под ред. Ш.Т. Берчану).
Изд-во «Бухарест», 1985. С. 672–693.
2. Демидова А.В., Хорошко Н.Д.
Сублейкемический миелоз. В кн.:
Руководство по гематологии
(под ред. А.И.Воробьева). М.: Нью-
диамед, 2007. С. 276–280.
3. Демидова А.В. Хронический
идиопатический миелофиброз. В кн.:
Клиническая онкогематология (под ред.
М.А. Волковой). М.: Медицина, 2007.
С. 616–630.
4. Ковалева Л.Г., Карагюлян С.Р.,
Колосова Л.Ю. и др. Спленэктомия при
сублейкемическом миелозе. Гематол
и трансфузиол 2004;49(5):14–21.
5. Ковалева Л.Г., Мещерякова Л.М.,
Колосова Л.Ю. Профилактика и лечение
тромбозов при хронических миелопроли-
феративных заболеваниях. V съезд
гематологов и трансфузиологов Украины
с международным участием «Итоги
и перспективы развития гематологии
и трансфузиологии в Украине», Украина,
Винница, 20–22 мая 2008 г. В сб.:
Гематология и переливание крови
2008;1:197–200.
6. Мещерякова Л.М., Ковалева Л.Г.,
Колосова Л.Ю. Сублейкемический
миелоз – течение и лечение пожилых
больных. Научно-практическая
конференция «Заболевания крови у по-
жилых людей: диагностика, лечение, осо-
бенности иммуносупрессии», Москва,
25 марта 2004 г. В сб.: Заболевания крови
у пожилых людей: диагностика, лечение,
особенности иммуносупрессии, 2004.
С. 42–45.
7. Колосова Л.Ю., Ковалева Л.Г.,
Мещерякова Л.М. Лечение анемической
формы сублейкемического миелоза.
Научно-практическая конференция
«Заболевания крови у пожилых людей:
диагностика, лечение, особенности
иммуносупрессии», Москва, 25 марта
2004 г. В сб.: Заболевания крови у пожи-
лых людей: диагностика, лечение, осо-
бенности иммуносупрессии, 2004.
С. 45–47.
8. Мещерякова Л.М. Система гемостаза
у больных миелопролиферативными
заболеваниями с тромбоцитозом при
различных режимах терапии.
Конференция «Атеротромбоз – проблема
современности», Москва, 24–26 марта
1999 г. В сб.: Атеротромбоз – проблема
современности, 1999. С. 81–82.
9. Мещерякова Л.М., Ковалева Л.Г.
Патофизиологические основы лечения
сублейкемического миелоза. В кн.:
Патофизиология крови, экстремальные
состояния (под ред. акад. А.И. Воробьева
и проф. Н.А. Горбуновой). М.: Бивитэк,
2004. С. 122–135.
Л И Т Е Р А Т У Р А
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я461
’2
01
3
Современные подходы к лечению цитомегаловирусной
инфекции у онкогематологических больных
Д.Н. БалашовФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва
Контакты: Дмитрий Николаевич Балашов [email protected]
Проблема цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции является чрезвычайно серьезной и актуальной у иммунокомпрометированных
пациентов. Препаратом, рутинно используемым для контроля ЦМВ-инфекции в данной когорте пациентов, является ганцикло-
вир. К сожалению, такие проблемы, как миелотоксичность и развитие лекарственной резистентности, нередко ограничивают
возможность его применения. Хорошей альтернативой является валганцикловир, эффективность которого подтверждена в кли-
нических исследованиях.
Проблема контроля ЦМВ-инфекции не является решенной, даже несмотря на внедрение в практику высокоэффективных мето-
дов ранней диагностики и упреждающей терапии. Использование иммуноаблативных препаратов (таких как алемтузумаб или
антитимоцитарный глобулин), а также трансплантация гемопоэтических стволовых клеток от альтернативных доноров
являются факторами высокого риска развития жизнеугрожающих висцеральных ЦМВ-ассоциированных осложнений. Новые
методы контроля ЦМВ активно исследуются в настоящее время. В частности, одним из перспективных направлений является
культивирование и клиническое использование ЦМВ-специфических Т-лимфоцитов.
Ключевые слова: цитомегаловирусная инфекция, упреждающая терапия, токсичность, лекарственная резистентность, иммуно-
компрометированные пациенты
Trends in the treatment of cytomegalovirus infection in oncohematological patients
D.N. Balashov
Dmitriy Rogachev Federal Research Center of Pediatric Hematology,
Oncology and Immunology, Ministry of Health of Russia, Moscow
Cytomegalovirus (CMV)-related complications remain an extremely serious and urgent problem in immunocompromised patients. Ganciclo-
vir (GCV) is efficient for the treatment of CMV-infection, but myelotoxicity limits the possibilities of their application. In addition, prolonged
or intermittent courses of antiviral drugs predispose to the development of CMV drug-resistant strains. Valganciclovir is a safe and effective
alternative to intravenous GCV.
Despite the well-spread application of effective methods of early detection and pre-emptive treatment, the issue of the control of CMV-infection
is not resolved. High intensive immunoablative therapy (alemtuzumab, ATG, еtс.) and hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) from
alternative donors greatly increase the risk of life-threatening visceral CMV-infections in patients. Thereby, studies of new therapeutic ap-
proaches (for example, transfusion of CMV-specific T-cells) are actually in process.
Key words: cytomegalovirus (CMV)-infection, pre-emptive treatment, toxicity, drug-resistant strains, immunocompromised patients
Цитомегаловирус (ЦМВ) относится к семейству
β-герпесвирусов и известен также как вирус герпеса-5
(HHV-5). ЦМВ является самым крупным из известных
вирусов, имеет диаметр вирионов, равный 120–150 нм,
геном представлен двуспиральной ДНК. ЦМВ отно-
сительно термолабилен, инактивируется при темпера-
туре +56 °С, его оптимальный рН 7,2–8,0 [1]. Вирус-
ная матрица представляет собой главный протеин
pp65, который и является основной мишенью для ге-
нерации иммунного ответа.
ЦМВ чрезвычайно широко распространен в чело-
веческой популяции, по различным данным к первому
году жизни инфицируется каждый 5-й житель плане-
ты, а в зрелом возрасте серопозитивность населения
варьирует в пределах от 40 до 100 % [2].
У иммунокомпетентного хозяина после первично-
го инфицирования и формирования иммунного отве-
та ЦМВ пожизненно персистирует в виде латентной
инфекции. Естественным резервуаром вируса являет-
ся строма солидных органов, однако есть данные, что
гемопоэтические предшественники также могут вы-
полнять эту функцию и передавать вирусный геном
периферическим клеткам [3–5].
ЦМВ чаще других известных герпесвирусов явля-
ется причиной тяжелых и даже жизнеугрожающих
инфекций, однако последние встречаются только
у пациентов с выраженными дефектами иммунной
системы. К группам риска по развитию клинически
значимых ЦМВ-инфекций относятся: недоношенные
дети в периоде новорожденности, а также пациенты
с первичными и вторичными иммунодефицитными
состояниями, в том числе онкогематологические
больные и пациенты после трансплантации гемопо-
этических стволовых клеток (ТГСК). В контексте
ТГСК проблема клинически значимой ЦМВ-инфек-
ции стоит наиболее остро, а в некоторых случаях даже
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 47
1’
20
13выходит на ведущие позиции по частоте развития тя-
желых поражений и смертности пациентов.
Факторами, влияющими на риск развития и тя-
жесть течения вирусных инфекций у реципиентов
ТГСК, являются особенности и интенсивность подго-
товительной миело/иммуноаблативной терапии, сте-
пень HLA-совместимости донора и реципиента, тип
донора (неродственный, родственный, гаплоидентич-
ный и т. д.), а также целый ряд проблем, отдаляющих
сроки восстановления специфического иммунологи-
ческого ответа, в числе которых особое место занима-
ет реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ)
и специфическая терапия, направленная на профи-
лактику и лечение этого осложнения.
Актуальность ЦМВ-инфекции у пациентов после
аутологичной ТГСК не является высокой [6–8]. Ос-
новным фактором риска при таком виде трансплан-
тации является ЦМВ-серопозитивность пациента.
Вероятность ЦМВ-виремии без клинических прояв-
лений в этом случае может достигать 25 % [9], однако
частота развития тяжелых висцеральных осложнений
невелика и составляет не более 1,6 % [10].
Вероятность развития тяжелых ЦМВ-ассоцииро-
ванных осложнений после аллогенной ТГСК сущест-
венно выше. К факторам, имеющим одно из ключевых
значений при определении риска развития ЦМВ-ин-
фекции, относят ЦМВ-серопозитивность пациента
при ЦМВ-серонегативности донора гемопоэтических
стволовых клеток (ГСК). По данным Ljungman et al.
[11], риск развития ЦМВ при такой комбинации «до-
нор – реципиент» достигает 16 %.
Другим фактором риска, влияющим на вероят-
ность развития или реактивации ЦМВ-инфекции по-
сле ТГСК, является тип донора ГСК. Трансплантация
от неродственного или парциально совместимого до-
нора, как правило, увеличивает риск развития ЦМВ-
инфекции [11, 12]. Естественно, что риск определяет
не сам по себе тип донора, а ассоциированные с дан-
ным фактором проблемы, такие как тяжесть РТПХ,
длительность иммуносупрессивной терапии, сроки
иммунореконституции и т. д. [13].
Одним из методов профилактики тяжелой РТПХ
у пациентов после трансплантации от парциально
совместимого донора является удаление Т-клеток
из трансплантата, что может достигаться либо Т-кле-
точной деплецией, либо CD34+-позитивной селекцией
продукта, достигаемыми с помощью иммуномагнит-
ных методик. Естественно, что удаление Т-кле ток,
в числе которых содержатся ЦМВ-специфические
цитотоксические клетки, может стать триггером раз-
вития или реактивации ЦМВ-инфекции. Кроме того,
такой вариант ТГСК сопровождается чрезвычайно
длительным периодом иммунологической рекон-
ституции, в том числе отсроченным восстановлением
CD3+, CD4+ и CD8+-клеток, что также компроме-
тирует противовирусный потенциал реципиента
ГСК [14].
Иммуносупрессивная терапия также представляет
собой угрозу в отношении развития ЦМВ-инфекции
и, безусловно, имеет значение не только у больных
после ТГСК, но и в других когортах пациентов. Боль-
шое значение играют дозы иммуносупрессивных
препаратов и продолжительность их использования
[15]. Применение высоких доз кортикостероидов
(> 1 мг/кг/сут), микофенолата мофетила, препаратов,
направленных на эрадикацию Т-клеток (например,
антитимоцитарного глобулина или алемтузумаба),
расце ниваются как факторы высокого риска разви-
тия ЦМВ-инфекции [16]. Интересными свойствами
обладает микофенолата мофетил, который не только
нарушает иммунологический ответ, но и оказывает
непо средственный эффект собственно на ЦМВ-вири-
он, способствуя ускорению процесса репликации
ЦМВ (процесс up-регуляции) [17].
Клинические проявления ЦМВ-инфекции доста-
точно разнообразны. Наиболее часто встречаются ин-
терстициальная пневмония (рисунок) и поражение
гастроинтестинального тракта [16]. По данным Meyers
et al. [17], частота развития поражения гастроинтести-
нального тракта после ТГСК составляет 8–30 %. Не-
смотря на то, что ЦМВ-пневмония регистрируется
несколько реже, смертность от этого осложнения
чрезвычайно высока и достигает 30–52 % [18], а по
данным отдельных клинических центров – 100 % [19].
К более редким осложнениям относят ЦМВ-ассоци-
ированные гепатиты, ретиниты, энцефалиты, гемор-
рагические циститы, эндотелиальное поражение,
тромботическую микроангиопатию [20, 21].
ЦМВ-инфекция у пациентов после ТГСК может
стать также причиной развития недостаточности
трансплантата и, как следствие, причиной бактериаль-
ных и грибковых суперинфекций. По данным Nguyen
et al. [22], у 54 % пациентов с ЦМВ-пневмонией, воз-
никшей на поздних сроках после ТГСК, имели место
те или иные конкурентные инфекции, причем леталь-
ность в этой группе составляла 100 %. ЦМВ-ассоции-
рованная недостаточность трансплантата протекает
в виде гипоплазии или тяжелой панцитопении, что
нередко связывают с поражением ГСК и с поврежде-
нием клеток микроокружения [23].
Если пациентов после ТГСК относят к когорте
больных сверхвысокого риска развития ЦМВ-инфек-
ции, то аналогичные проблемы у нетрансплантацион-
ных больных нередко уходят на 2-й план и данной
проблеме часто не уделяется достаточного внимания.
Однако, в соответствии с опубликованными результа-
тами исследования, проведенного в MD Anderson
Cancer Center (Хьюстон, США), тяжелые висцераль-
ные ЦМВ-инфекции, в первую очередь, пневмонии,
были зарегистрированы у 2,9 % из 2136 онкогематоло-
гических пациентов, которым проводилась терапия
в рамках программного лечения без использования
ТГСК [24]. Причем наибольшая частота развития
ЦМВ-заболевания (16 %) зарегистрирована в группе
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я481
’2
01
3
пациентов с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ),
компрометирующим фактором развития ЦМВ у кото-
рых являлось применение алемтузумаба. Частота ре-
активации инфекции после терапии данным препара-
том достигает по некоторым данным 30 % [25].
Среди пациентов, которым не проводилась ТГСК,
реактивация ЦМВ чаще встречается при миеломной
болезни, ХЛЛ, остром лимфобластном лейкозе и раз-
личных лимфомах (13,6 %), в то время как при миело-
идных лейкозах данный показатель не превышает
3,9 % [26]. Таким образом, проблема ЦМВ-инфекций
актуальна и у пациентов, не получающих ТГСК, но
имеющих такие факторы риска, как серопозитивность
пациента и проведение иммуноаблативной терапии,
в том числе с применением алемтузумаба [27].
Современные алгоритмы контроля ЦМВ неод-
нократно претерпевали изменения. Важной мерой
профилактики первичного инфицирования ЦМВ-се-
ронегативного пациента является использование пре-
паратов крови, полученных от ЦМВ-серонегативных
доноров. При отсутствии возможности подбора доно-
ра по ЦМВ-серологическому статусу важным требо-
ванием является применение для компонентов крови
современных лейкоцитарных фильтров IV поколения.
Риск инфицирования как в первом, так и во втором
случае не превышает 3 % [28].
Применение препаратов гипериммунных ЦМВ-
иммуноглобулинов по данным большинства исследо-
ваний, изучавших эффективность ЦМВ-специфических
внутривенных иммуноглобулинов для профилактики
инфекции, не приводит к уменьшению частоты раз-
вития ЦМВ-инфекции и улучшению выживаемости
пациентов [29–32].
Существует целый ряд исследований, посвящен-
ных оценке эффективности медикаментозной профи-
лактики ЦМВ-инфекции у пациентов после ТГСК.
В частности, в исследованиях Ljungman et al. [21] было
продемонстрировано, что использование ацикловира
и валацикловира может быть эффективным, однако
при применении 2-го препарата были зарегистриро-
ваны некоторые преимущества.
Активная профилактика с использованием ган-
цикловира у пациентов после ТГСК обычно не про-
водится в связи с миелотоксичностью препарата
в отношении трансплантата и более поздней специ-
фической противовирусной реконституции в пост-
трансплантационный период.
Наиболее адекватным и хорошо зарекомендовав-
шим себя подходом к контролю ЦМВ-инфекции у па-
циентов после ТГСК является упреждающая терапия,
основанная на рутинном использовании полимераз-
ной цепной реакции в режиме реального времени для
раннего выявления ЦМВ-виремии c ее количествен-
ной оценкой и начала специфической вирусостатиче-
ской терапии до появления признаков висцеральной
инфекции. Точно так же, как и у пациентов транс-
плантационных центров, многие клинические центры
рекомендуют использовать принципы упреждающей
терапии ЦМВ у больных, получавших алемтузумаб
[33–35]. Однако есть данные и об эффективности
медикаментозной профилактики, в частности валган-
цикловиром, у пациентов с ХЛЛ после курса алемту-
зумаба [25].
Не так давно единственным вирусостатиком, ру-
тинно используемым в контексте упреждающей тера-
пии и лечения ЦМВ-инфекции, являлся ганцикловир.
К сожалению, одним из ведущих побочных эффектов
данного препарата является его миелотоксичность и,
как следствие, нейтропения и увеличение частоты
развития тяжелых бактериальных и грибковых инфек-
Компьютерная томография органов грудной клетки. ЦМВ-пневмония у пациента с синдромом Краббе–Бенеке после алло-ТГСК (собственное
наблюдение)
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 49
1’
20
13ций [36]. Снижение уровня нейтрофилов ниже 1000/мкл
на фоне применения ганцикловира, по данным неко-
торых публикаций, регистрируется у 41–58 % больных
[37, 38]. Альтернативой ганцикловиру является фос-
карнет, имеющий другой токсический профиль (неф-
ротоксичность и электролитные нарушения), часто
лимитирующий возможность его использования [39].
Одной из серьезных проблем, связанных с дли-
тельным и частым использованием ганцикловира,
является развитие лекарственной резистентности, ко-
торая связана с появлением у пациента либо мутации
в гене вирусной киназы (UL97), отвечающей за фос-
форилирование и активацию ганцикловира, либо
мутации в гене вирусной полимеразы (UL54), отвеча-
ющем за ингибирование ганцикловиром ДНК-поли-
меразы ЦМВ, либо мутаций в обоих генах одно-
временно. Есть данные, что частота развития такой
ситуации достигает 10 % [40]. Кроме того, известно,
что появление мутации в гене UL54 может вызывать
резистентность не только к ганцикловиру, но и к фос-
карнету [40].
В настоящее время достаточно активную позицию
в решении вопроса профилактики и лечения ЦМВ за-
нимает препарат валганцикловир, который представ-
ляет собой пероральную форму L-валилового эфира
(про-препарат) ганцикловира. Его биодоступность
чрезвычайно высока и составляет приблизительно
60 % при сравнении с внутривенной формой ганцик-
ловира, и более чем в 10 раз выше, чем биодоступность
у пероральной формы ганцикловира [40]. Токсический
профиль валганцикловира схож с ганцикловиром, од-
нако уровень тромбоцитов, как правило, не снижает-
ся, а частота тяжелых валганцикловир-индуцирован-
ных нейтропений при упреждающей терапии после
ТГСК по некоторым данным ниже, чем при исполь-
зовании ганцикловира [41, 42].
Несмотря на то, что валганцикловир является про-
препаратом ганцикловира, есть интересные сведения
об отличительных особенностях этих 2 препаратов.
В частности, T. Allice et al. [40] провели сравнительное
исследование ганцикловира и валганцикловира в от-
ношении потенциала развития мутаций в генах UL97
и UL54, приводящих к резистентности ЦМВ к прово-
димой терапии, в результате чего доказательств о раз-
витии резистентности к валганцикловиру получено не
было, в отличие от пациентов, получавших ганцикло-
вир, где частота появления мутаций составила 7,7 %.
Результаты исследований валганцикловира у па-
циентов после ТГСК выглядят многообещающе [42–45].
По данным P.L. van der Heiden et al. [41], частота эли-
минации вируса при упреждающей терапии ганцик-
ловиром в дозе 10 мг/кг/сут составила 76 %, а при при-
менении валганцикловира в дозе 1800 мг/сут – 80 %,
при схожем профиле побочных эффектов. В исследо-
вании E. Ayala et al. [42] был проведен анализ био-
доступности валганцикловира в зависимости от наличия
или отсутствия признаков острой РТПХ с поражением
желудочно-кишечного тракта. Полученные результаты
свидетельствовали, что биодоступность валганцикло-
вира снижалась на 15 %, однако различий в токсич-
ности или частоте развития ЦМВ-инфекций при срав-
нении с группой пациентов без РТПХ получено не
было.
У больных, которым не проводилась ТГСК, при-
менение валганцикловира также может быть обосно-
ванным и эффективным. По результатам исследова-
ния S. O’Brien et al. [25], изучавших возможности
различных режимов профилактики ЦМВ у больных
ХЛЛ после терапии алемтузумабом, частота реактива-
ции инфекции в группе, получавшей валганцикловир,
составила 0 % (0 из 20 пациентов), а в группе валацик-
ловира – 35 % (7 из 20 пациентов).
Одной из весьма интересных и прогрессивных
стратегий контроля ЦМВ-инфекции в группах риска
является разработка и внедрение в практику методов
искусственного моделирования ЦМВ-специфическо-
го иммунитета. Не так давно начаты исследования
эффективности вакцинации от ЦМВ донора ГСК,
когда в качестве вакцин используют препараты, содер-
жащие ослабленные вирусы, рекомбинантные вирусы
и наиболее часто встречающиеся ЦМВ-протеины. Ве-
дутся активные работы в отношении развития техно-
логии культивирования и последующих трансфузий
ЦМВ-специфических Т-лимфоцитов [46, 47].
До появления и внедрения в практику активного
мониторинга реактивации ЦМВ и актуальных сегодня
принципов профилактики и упреждающей терапии
данная инфекция довольно часто являлась причиной
тяжелых органных дисфункций и высокой смертности
в группах пациентов высокого риска. Исследования,
направленные на оптимизацию алгоритмов контроля
ЦМВ-инфекции, позволили некоторое время назад
приблизить проблему ЦМВ к решению. Тем не менее
появление новых высокоинтенсивных протоколов ле-
чения онкогематологических заболеваний, подразуме-
вающих активное применение препаратов с выражен-
ными иммуноаблативными свойствами, в том числе
в контексте ТГСК, а также широкое использование
трансплантаций от «альтернативных» доноров, вновь
способствовало увеличению серьезности проблемы
контроля ЦМВ. Использование сегодня современных
методов диагностики и активных в отношении ЦМВ
вирусостатических препаратов, таких как ганцикло-
вир, фоскарнет и валганцикловир, является достаточно
эффективным, однако по-прежнему не снимает акту-
альность данного осложнения, что является веским
аргументом для продолжения исследований, направ-
ленных на отработку новых подходов и альтернатив-
ных принципов контроля ЦМВ-инфекции в группах
риска.
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я501
’2
01
3
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Avery R.K., Bolwell B.J., Yen-Lieberman B.
et al. Use of leflunomide in an allogeneic
bone marrow transplant recipient with
refractory cytomegalovirus infection. Bone
Marrow Transplant 2004;34:1071–5.
2. Stocchi R.,Ward K.N., Fanin R.,
Baccarani M., Apperley J.F. Management of
human cytomegalovirus infection and disease
after allogeneic bone marrow
transplantation. Haematol 1998;84:71–9.
3. Taylor-Wiedeman J., Sissons J.G.,
Borysiewicz L.K., Sinclair J.H. Monocytes
are a major site of persistence of human
cytomegalovirus in peripheral blood
mononuclear cells. J Gen Virol
1991;72:2059–64.
4. Soderberg-Naucler C., Fish K.N.,
Nelson J.A. Reactivation of latent human
cytomegalovirus by allogeneic stimulation of
blood cells from healthy donors. Cell
1997;91:119–26.
5. Michelson S. Interaction of human CMV
with monocytes/macrophages: a love-hate
relationship. Pathol Biol Paris 1997;
45:146–58.
6. Meyers J.D., Flournoy N., Thomas E.D.
Risk factors for cytomegalovirus infection
after human marrow transplantation. J Infect
Dis 1986;153:478–88.
7. Reusser P., Fisher L.D., Buckner C.D.
et al. Cytomegalovirus infection after
autologous bone marrow transplantation:
occurrence of cytomegalovirus disease and
effect on engraftment. Blood 1990;75:1888–94.
8. Ljungman P., Biron P., Bosi A. et al.
Cytomegalovirus interstitial pneumonia in
autologous bone marrow transplant
recipients. Infectious Disease Working Party
of the European Group for Bone Marrow
Transplantation. Bone Marrow Transplant
1994;13(2):209–12.
9. Konoplev S., Champlin R.E., Giralt S.
et al. Cytomegalovirus pneumonia in adult
autologous blood and marrow transplant
recipients. Bone Marrow Transplant
2001;27:877–81.
10. Osarogiagbon R.U., Defor T.E.,
Weisdorf M.A. et al. CMV antigenemia
following bone marrow transplantation: risk
factors and outcomes. Biol Blood Marrow
Transplant 2000;6:280–8.
11. Ljungman P., Aschan J., Lewensohn-
Fuchs I. et al. Results of different strategies
for reducing cytomegalovirus-associated
mortality in allogeneic stem cell transplant
recipients. Transplantation 1998;66:1330–4.
12. Takenaka R., Gongo H., Tanimoto K.
et al. Increased incidence of cytomegalovirus
(CMV) infections and CMV-associated
disease after allogeneic bone marrow
transplantation from unrelated donors. Bone
Marrow Transplant 1997;19:241–8.
13. Reusser P., Riddell S., Meyers J.,
Greenberg P.D. Cytotoxic T-lymphocyte
response to cytomegalovirus after human
allogeneic bone marrow transplantation:
pattern of recovery and correlation with
cytomegalovirus infection and disease. Blood
1991;78:1373–80.
14. Small T.N., Papadopoulos E.B.,
Boulad F. et al. Comparison of immune
reconstitution after unrelated and related
T-celldepleted bone marrow transplantation:
effect of patient age and donor leukocyte
infusions. Blood 1999;93:467–80.
15. Rubin R.H. Clinical approach
to infection in the compromised host. In:
Infection in the Organ Transplant Recipient;
Rubin R.H., Young L.S. (eds.). New York,
NY, Kluwer Academic Press, 2002.
Pp. 573–679.
16. Boeckh M., Nichols W.G.,
Papanicolaou G. et al. Cytomegalovirus in
hematopoietic stem cell transplant
recipients: current status, known challenges,
and future strategies. Biol Blood Marrow
Transplant 2003;9:543–58.
17. Meyers J.D., Ljungman P., Fisher L.D.
Cytomegalovirus excretion as a predictor of
cytomegalovirus disease after marrow
transplantation: importance of
cytomegalovirus viremia. J Infect Dis
1990;162:373–80.
18. Ljungman P., Engelhard D., Link H.
et al. Treatment of interstitial pneumonitis
due to cytomegalovirus with ganciclovir and
intravenous immune globulin: experience of
European Bone Marrow Transplant Group.
Clin Infect Dis 1992;14:831–5.
19. Yanada M., Yamamoto K., Emi N. et al.
Cytomegalovirus antigenemia and outcome
of patients treated with preemptive
ganciclovir: retrospective analysis of 241
consecutive patients undergoing allogeneic
hematopoietic stem cell transplantation.
Bone Marrow Transplant 2003;32:801–7.
20. Takatsuka H., Wakae T., Mori A. et al.
Endothelial damage caused by
cytomegalovirus and human herpesvirus-6.
Bone Marrow Transplant 2003;31:475–9.
21. Ljungman P., Griffiths P., Paya C.
Definitions of CMV infection and disease in
transplant recipients. Clin Infect Dis
2002;34:1094–7.
22. Nguyen Q., Champlin R., Giralt S. et al.
Late cytomegalovirus pneumonia in adult
allogeneic blood and marrow transplant
recipients. Clin Infect Dis 1999;28:618–23.
23. Randolph-Habecker J., Iwata M,
Torok-Storb B. Cytomegalovirus mediated
myelosuppression. J Clin Virol 2002;25
(Suppl 2):S51–6.
24. Nguyen Q., Estey E., Raad I. et al.
Cytomegalovirus pneumonia in adults with
leukemia: an emerging problem. Clin Infect
Dis 2001;32:539–45.
25. O’Brien S., Ravandi F., Riehl T. et al.
Valganciclovir prevents cytomegalovirus
reactivation in patients receiving. Blood
2008;111(4):1816–9.
26. Han X.Y. Epidemiologic analysis
of reactivated cytomegalovirus antigenemia
in patients with cancer. J Clin Microbiol
2007;45:1126–32.
27. Ljungman P., de la Camara R.,
Cordonnier C. et al. Management of CMV,
HHV-6, HHV-7 and Kaposi-sarcoma
herpesvirus (HHV-8) infections in patients
with hematological malignancies and after
SCT. Bone Marrow Transplant 2008;42:
227–40.
28. Bowden R.A., Slichter S.J., Sayers M.
A comparison of filtered leukocyte-reduced
and cytomegalovirus (CMV) seronegative
blood products for the prevention of
transfusion-associated CMV infection after
marrow transplantation. Blood
1995;86:3598–603.
29. Bass E.B., Powe N.R., Goodman S.N.
et al. Efficacy of immune globulin in
preventing complications of bone marrow
transplantation: a meta-analysis. Bone
Marrow Transplant 1993;12:273–82.
30. Guglielmo B.J., Wong-Beringer A.,
Linker C.A. Immune globulin therapy in
allogeneic bone marrow transplant: a critical
review. Bone Marrow Transplant
1994;13:499–510.
31. Messori A., Rampazzo R., Scroccaro G.,
Martini N. Efficacy of hyperimmune anti-
cytomegalovirus immunoglobulins for the
prevention of cytomegalovirus infection in
recipients of allogeneic bone marrow
transplantation: a meta-analysis. Bone
Marrow Transplant 1994;13:163–7.
32. Zikos P., Van Lint M.T., Lamparelli T.
et al. A randomized trial of high dose
polyvalent intravenous immunoglobulin
(HDIgG) vs. cytomegalovirus (CMV)
hyperimmune IgG in allogeneic hemopoietic
stem cell transplants (HSCT).
Haematologica 1998;83:132–7.
33. Keating M.J., Flinn I., Jain V. et al.
Therapeutic role of alemtuzumab
(Campath-1H) in patients who have failed
fludarabine: results of a large international
study. Blood 2002;99:3554–61.
34. Rai K.R., Freter C.E., Mercier R.J. et al.
Alemtuzumab in previously treated chronic
lymphocytic leucemia patients who also had
received fludarabine. J Clin Oncol
2002;20:3891–7.
35. Osterborg A., Dyer M.J., Bunjes D. et al.
Phase II multicenter study of human CD52
antibody in previously treated chronic
lymphocytic leukemia: European study
group of CAMPATH-1H Treatment in
chronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol
1997;15:1567–74.
36. Boeckh M., Zaia J.A., Jung D. et al.
A study of the pharmacokinetics, antiviral
activity, and tolerability of oral ganciclovir
for CMV prophylaxis in marrow
transplantation. Biol Blood Marrow
Transplant 1998;4:13–9.
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 51
1’
20
1337. Goodrich J.M., Bowden R.A., Fisher L.
et al. Ganciclovir prophylaxis to prevent
cytomegalovirus disease after marrow
transplant. Ann Intern Med 1993;118:173–8.
38. Winston D.J., Ho W.G., Bartoni K. et al.
Ganciclovir prophylaxis of cytomegalovirus
infection and disease in allogeneic bone
marrow transplant recipients. Results of
placebo-controlled, double-blind trial. Ann
Intern Med 1993;118:179–84.
39. Reusser P., Einsele H., Lee J. et al.
Infectious Diseases Working Party of the
European Group for Blood and Marrow
Transplantation. Randomized multicenter
trial of foscarnet versus ganciclovir for
preemptive therapy of cytomegalovirus
infection after allogeneic stem cell
transplantation. Blood 2002;99:
1159–64.
40. Allice T., Busca A., Locatelli F. et al.
Valganciclovir as pre-emptive therapy for
cytomegalovirus infection post-allogenic
stem cell transplantation: implications for
the emergence of drug-resistant
cytomegalovirus. J Antimicrob Chemother
2009;63(3):600–8.
41. van der Heiden P.L., Kalpoe J.S.,
Barge R.M. et al. Oral valganciclovir
as pre-emptive therapy has similar efficacy
on cytomegalovirus DNA load reduction
as intravenous ganciclovir in allogeneic stem
cell transplantation recipients. Bone Marrow
Transplant 2006;37:693–8.
42. Ayala E., Greene J., Sandin R. et al.
Valganciclovir is safe and effective as pre-
emptive therapy for CMV infection in
allogeneic hematopoietic stem cell
transplantation. Bone Marrow Transplant
2006;37:851–6.
43. Busca A., de Fabritiis P., Ghisetti V. et al.
Oral valganciclovir as preemptive therapy for
cytomegalovirus infection post allogeneic
stem cell transplantation. Transpl Infect Dis
2007;9:102–7.
44. Candoni A., Simeone E., Tiribelli M.
et al. What is the optimal dosage of
valganciclovir as preemptive therapy for
CMV infection in allogeneic hematopoietic
SCT. Bone Marrow Transplant 2008;42:207–8.
45. Takenaka K., Eto T., Nagafuji K. et al.
Fukuoka Blood and Marrow Transplant
Group (FBMTG). Oral valganciclovir as
preemptive therapy is effective for
cytomegalovirus infection in allogeneic
hematopoietic stem cell transplant
recipients. Int J Hematol 2009;89:231–7.
46. Peggs K.S., Verfuerth S., Mackinnon S.
Induction of cytomegalovirus (CMV)-
specific T-cell responses using dendritic cells
pulsed with CMV antigen: a novel culture
system free of live CMV virions. Blood
2001;97:994–1000.
47. Zaia J.A., Sissons J.G., Riddell S. et al.
Status of cytomegalovirus prevention and
treatment in 2000. Hematology (Am Soc
Hematol EducProgram) 2000;2000:339–55.
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я521
’2
01
3
Случай успешного лечения мукормикоза легких у ребенка
с апластической анемией
Е.А. Никитина1, Н.Н. Климко2, А.С. Колбин3, Э.Г. Бойченко1, И.А. Гарбузова1, М.В. Голубева1, Т.С. Богомолова2
1Детская городская больница № 1, Санкт-Петербург;2ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова»
Минздрава России, Санкт-Петербург;3медицинский факультет ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»
Контакты: Екатерина Андреевна Никитина [email protected]
Мукормикоз (зигомикоз) характеризуется высокой летальностью у иммунокомпрометированных больных. Представлен клини-
ческий случай успешного лечения мукормикоза у 11-летнего ребенка со сверхтяжелой формой идиопатической апластической
анемии. Диагноз инвазивного микоза был установлен на основании критериев EORTC 2008. При компьютерной томографии
определена субтотальная инфильтрация правого легкого. При исследовании бронхоальвеолярного лаважа выделили Lichtheimia
corymbifera. В результате длительной комбинированной антифунгальной терапии липидным комплексом амфотерицина B и по-
законазолом удалось добиться полного купирования клинико-лабораторных и инструментальных проявлений мукормикоза и про-
должить успешное лечение апластической анемии.
Ключевые слова: мукормикоз, апластическая анемия, амфотерицин B, позаконазол, дети
Successful treatment of pulmonary mucormycosis in a child with aplastic anemia
Ye.A. Nikitina1, N.N. Klimko2, A.S. Kolbin3, E.G. Boychenko1, I.A. Garbuzova1, M.V. Golubeva1, T.S. Bogomolova2
1Children Municipal Hospital № 1, Saint Petersburg;2I.I. Mechnikov North-Western State Medical University, Ministry of Health of Russia, Saint Petersburg;
3Saint Petersburg State University
Mucormycosis (zygomycosis) is a frequently fatal fungal infection in immunocompromized patients. We describe a case of a successfull treat-
ment of pulmonary mucormycosis in 11-year-child with a very severe aplastic anemia. The diagnosis of invasive mycosis has been proved
according to EORTC 2008 criteria. Computed tomography showed bilobar right-sided pulmonary infiltration. Lichtheimia corymbifera
cultured from BAL. The child achieved complete clinical, laboratory and instrumental response on long-term amphotericin B lipid-formula-
ted therapy combined with posaconazole.
Key words: mucormycosis, aplastic anemia, amphotericin B, posaconazole, children
Актуальность
У больных с онкогематологической патологией
проблема инвазивных микозов (ИМ) приобрела осо-
бую актуальность после внедрения в клиническую
практику программ интенсивной полихимиотерапии.
Частота грибковых инфекций в отделениях онколо-
гии, гематологии и трансплантации достигает 15–20 %
[1]. До недавнего времени наиболее частыми этиоло-
гическими агентами были Candida spp. и Aspergillus spp.
Однако в последние годы отмечено нарастание часто-
ты выделения возбудителей, вызывающих такие ред-
кие инфекции, как мукормикоз. Количество сообще-
ний о результатах лечения мукормикоза у детей
в отечественной и зарубежной литературе крайне ог-
раниченно. В связи с этим целью настоящей публика-ции явилось описание собственного клинического
наблюдения успешного лечения доказанного легочно-
го мукормикоза у ребенка со сверхтяжелой формой
апластической анемии.
Пациенты и методы
Представлено описание клинического случая ус-
пешного лечения мукормикоза у ребенка, получивше-
го курс иммуносупрессивной терапии (ИСТ) по пово-
ду апластической анемии в отделении гематологии,
онкологии и химиотерапии Детской городской боль-
ницы № 1 г. Санкт-Петербурга. Для постановки диаг-
ноза ИМ использовали критерии Европейской орга-
низации по изучению и лечению рака (EORTC)
и Национального института здоровья США (NIH) [2].
Общим клиническим критерием мукормикоза явля-
лась персистирующая более 96 ч лихорадка, рефрак-
терная к назначению антибиотиков широкого спектра
действия. Клиническими критериями мукормикоза
нижних дыхательных путей считали признаки инфек-
ции нижних дыхательных путей, такие как кашель,
хрипы в легких и обнаружение инфильтратов при ком-
пьютерной томографии (КТ). Мукормикоз считали
доказанным, если при гистопатологическом исследо-
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 53
1’
20
13вании была установлена инфекция глубоких тканей:
присутствие в тканях широких (10–15 мкм), нечасто
септированных тонкостенных гиф и выделение из сте-
рильного в норме биосубстрата грибов рода Mucor
культуральным методом.
Описание клинического случая
Пациент 11 лет поступил в клинику 01.09.2011 с жа-
лобами на бледность кожных покровов, кожный геморра-
гический синдром, рецидивирующие лакунарные ангины
(2 эпизода за предшествующие 3 мес). В анализе крови при
поступлении – панцитопения, агранулоцитоз (таблица).
При цитологическом и гистологическом исследовании
кост ного мозга – аплазия кроветворения. На основании
клинико-гематологических данных был установлен диаг-
ноз сверхтяжелой формы апластической анемии. Через
неделю от момента поступления у ребенка на фоне агра-
нулоцитоза развилась фебрильная лихорадка и тяжелая
некротическая ангина, потребовавшая массивной анти-
бактериальной терапии (меропенем, амикацин, ванкомицин).
Лабораторные показатели пациента при поступлении и через 8 мес
от начала лечения
Лабораторный параметр При поступлении Через 8 мес
Гемоглобин (г/л) 57 100
Лейкоциты (× 109/л) 1,5 5,2
Абсолютное число
нейтрофилов (кл/мкл)< 200 > 1500
СОЭ (мм/ч) 75 16
Тромбоциты (× 109/л) 10 60
Мочевина (мг/дл) 36 57
Креатинин (мг/дл) 0,5 1,1
В связи с отсутствием родственного совместимого
донора после купирования инфекционного процесса был
инициирован курс ИСТ антитимоцитарным иммуногло-
булином (ATGAM), циклоспорином и глюкокортикосте-
роидами. Перед началом ИСТ было проведено обследова-
ние для исключения ИМ: мультиспиральная КТ (МСКТ)
грудной клетки и исследование крови на галактоманнан.
Признаков очагового или инфильтративного поражения
легких выявлено не было. Галактоманнан в сыворотке –
отрицательный. С 16-х суток пребывания в стационаре
ребенку была инициирована первичная антифунгальная
профилактика вориконазолом с учетом высокого риска
развития инвазивного аспергиллеза. Через 2 нед от на-
чала ИСТ развился сухой малопродуктивный кашель. При
аускультативном обследовании определялось ослабление
дыхания и влажные мелкопузырчатые хрипы в нижних
отделах правого легкого. При рентгенографии легких
выявлена инфильтрация в средней доле (S4, S5) правого
легкого (рис. 1). На МСКТ грудной клетки – тотальная
инфильтрация правого легкого смешанного характера
(интерстициальная с элементами альвеолярной), симп-
том «булыжной мостовой», участок уплотнения легочной
ткани по типу «матового стекла» на фоне выраженного
усиления и оте ка междолькового интерстиция, а также
выраженная прикорневая инфильтрация с элементами
адено патии бронхопульмональных лимфатических узлов
(рис. 2).
При бронхоскопии визуализированы грибковые раз-
растания в нижнедолевом бронхе справа, обтурирующие
просвет. При микроскопии биоптата был обнаружен
обильный несептированный мицелий, ветвящийся под
прямым углом, а при посеве бронхоальвеолярного лаважа
(БАЛ) выделена Lichtheimia corymbifera.
В связи с развившимся угрожающим жизни инфек-
ционным осложнением терапия циклоспорином и глю-
кокортикостероидами была приостановлена. Начата
терапия липидным комплексом амфотерицина B (ЛКАB,
5 мг/кг/сут), которая сопровождалась персистирую-
щими признаками нефротоксичности: гипокалиемия
(K = 2,7–3,2 μm/l), нарушение азотовыделительной функ-
ции (мочевина max = 88,8 mg/dl, креатинин = 1,1 mg/dl).
Проводилась постоянная стимуляция миелопоэза коло-
ниестимулирующим фактором (G-CSF), на фоне которой
через 3 нед от начала курса ИСТ уровень гранулоцитов
достиг 500 кл/мкл. Состояние пациента характеризо-
валось высокой лихорадкой, периодическими болями
в правой половине грудной клетки и частым непродук-
тивным кашлем. Признаков дыхательной недостаточ-
ности и кровохарканья не отмечалось. По данным ультра-
звукового исследования (УЗИ) выявлялось умеренное
количество плеврального выпота в правом синусе, не
требующее дренирования. На 15-й день терапии ЛКАB,
в связи с сохранением стойкой фебрильной лихорадки
с тенденцией к нарастанию количества фебрильных
подъемов, антифунгальная терапия была усилена поза-
коназолом в дозе 800 мг/сут.
При повторной фибробронхоскопии через месяц от
начала противогрибковой терапии была выявлена язва
в устье промежуточного бронха справа, без признаков
Рис. 1. Рентгенограмма грудной клетки через двое суток от появления
дыхательной симптоматики
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я541
’2
01
3
кровотечения, диаметром 2 × 1 см. При посеве и микро-
скопии БАЛ грибов выявлено не было. УЗИ в динамике
установило нарастание количества жидкости в правой
плевральной полости. Под УЗИ-контролем произведена
плевральная пункция, получено 1100 мл мутного гемор-
рагического экссудата, клеточный состав которого со-
ставляли: эритроциты – 5 %, нейтрофилы – 56 %, эози-
нофилы – 1 %, гистиоциты – 24 %. Грибы не обнаружены.
Через 2 мес от момента диагностики мукормикоза
МСКТ в режиме ангиографии с контрастированием
(рис. 3) продемонстрировала субтотальные деструктив-
ные изменения в нижней и средней долях правого легкого
с максимальными изменениями в S6 по типу «абсцедиро-
вания». Умеренное количество плеврального выпота
справа с признаками организации. В левом легком очаго-
вых и инфильтративных изменений не было.
Клинически состояние пациента оставалось ста-
бильным, фебрильная лихорадка регрессировала, кашель
не нарастал, кровохарканья не отмечалось.
С учетом полученной динамики изменений с форми-
рованием деструкции правого легкого в непосредствен-
ной близости к крупным сосудам, у ребенка имелся высо-
кий риск развития угрожающего жизни кровотечения.
В связи с этим интенсивно обсуждался вопрос о прове-
дении срочного оперативного вмешательства при усло-
вии обеспечения адекватной трансфузионной поддержки
компонентами донорской крови. На этот момент ребе-
нок находился в постоянной зависимости от переливания
компонентов крови, базальный уровень тромбоцитов
на тот момент составлял 10 × 10 9/л. Родители приняли
решение о переводе ребенка в зарубежную клинику
для проведения хирургического лечения. С 20.12.2011
по 30.12.2011 ребенка наблюдали в отделении торакаль-
ной хирургии университетской клиники Гейдельберга
(Германия), где было принято решение отказаться от
проведения хирургического вмешательства и рекомендо-
вано продолжить антимикотическую терапию по месту
жительства. С 31.12.2011 ребенок наблюдался в ДГБ
№ 1 г. Санкт-Петербурга, продолжая антимикотиче-
скую терапию (ЛКАB и позаконазол), прием циклоспо-
рина А не возобновляли. От проведения хирургического
лечения родители ребенка отказались. Состояние ребен-
Рис. 2. МСКТ грудной клетки на момент установления диагноза ИМ
Рис. 3. МСКТ легких в режиме ангиографии через 2 мес от постановки диагноза ИМ
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 55
1’
20
13ка оставалось достаточно стабильным, кровохарканья
не наблюдали. Отмечено достижение частичной ремис-
сии апластической анемии: с конца декабря не получал
G-CSF, уровень гранулоцитов стабильно > 2500 кл/мкл,
больной перестал нуждаться в трансфузиях эритроци-
тарной массы. Однако сохранялась глубокая тромбоци-
топения и зависимость от трансфузий тромбокон-
центрата. По данным миелограммы, через 4 мес от
проведения курса ИСТ получено восстановление всех рост-
ков кроветворения, увеличение клеточности костного
мозга. В середине января при аускультации отмечено
увеличение зоны проведения дыхания над средней долей
правого легкого.
МСКТ (рис. 4) продемонстрировала восстановление
пневматизации верхней и средней долей правого легкого,
с сохранением тотальной инфильтрации нижней доли.
По данным фибробронхоскопии: язва в устье промежу-
точного бронха справа в стадии рубцевания, просвет
промежуточного бронха частично обтурирован грануля-
циями слизистой, но проходимость его восстановилась.
При микроскопии БАЛ были выявлены гифы мукормице-
та. Клинически получена отчетливая положительная
динамика: самочувствие хорошее, состояние пациента
ближе к удовлетворительному, кровохарканье и приз-
наки дыхательной недостаточности отсутствовали.
По данным функциональных дыхательных проб пневма-
тизация правого легкого улучшилась, что было обуслов-
лено восстановлением проходимости промежуточного
и среднедолевого бронхов. С учетом полученной регрессии
воспалительного процесса в легких и высокого риска по-
тенцирования нефротоксических осложнений на фоне
планируемого возобновления ИСТ циклоспорином, было
принято решение о снижении дозы ЛКАB с 5 до 2,5 мг/
кг/сут. Пациент получал ЛКАB в дозе 5 мг/кг/сут в те-
чение 3 мес, еще 1,5 мес – в 50 % дозе. Всего терапию
ЛКАB проводили почти 5 мес (суммарная доза состави-
ла 23 г), и прервали в связи с прогрессирующей нефроток-
сичностью: нарушением азотовыделительной функции
и снижением концентрационной способности почек. Те-
рапию позаконазолом в суточной дозе 800 мг проводили
непрерывно в течение 6 мес, нежелательных явлений от-
мечено не было. Позднее, через 5 мес от момента его от-
мены, по улучшении скорости клубочковой фильтрации
с 32 до 56 мл/мин × 1,73 м2, был возобновлен прием цик-
лоспорина А в дозе 2,5 мг/кг (50 % от расчетной). По
данным легочных проб функция внешнего дыхания вос-
становилась полностью. Клинически, по данным аускуль-
тативного исследования, наблюдалась дальнейшая поло-
жительная динамика. МСКТ через 8 мес от момента
диагностирования мукормикоза продемонстрировала
уменьшение размеров зоны инфильтративных изменений
в виде полной регрессии фокуса уплотнения легочной
ткани по типу «матового стекла» в средней доле пра вого
легкого, сохранялась картина тотального ателектаза
нижней доли на фоне перераздутой верхней доли правого
легкого (рис. 5). При бронхоскопии выявлено уменьшение
в объеме грануляций в промежуточном бронхе. При мик-
роскопии и посеве БАЛ мукормицеты не обнаружены.
Рис. 4. МСКТ грудной клетки через 4 мес от начала антифунгальной терапии
Рис. 5. МСКТ грудной клетки через 8 мес от начала заболевания
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я561
’2
01
3 Таким образом, на основании данных комплексного
обследования через 8 мес от постановки диагноза мукор-
микоза противогрибковая терапия позаконазолом была
отменена.
В настоящее время, спустя 15 мес от развития
апластической анемии и мукормикоза легких, у ребенка
сохраняется ремиссия заболевания, независимость от
трансфузий гемокомпонентов, самочувствие ребенка не
страдает, дыхательная симптоматика отсутствует,
одышки нет.
Обсуждение
Мукормикоз является наиболее агрессивной, быс-
тро прогрессирующей инвазивной грибковой инфек-
цией, вызываемой мицелиальными возбудителями [3, 4].
Заболевание характеризуется высокой атрибутивной
летальностью. Описано около 867 разновидностей му-
кормицетов, однако более 80 % культурально доказан-
ных случаев мукормикоза вызывают Rhizopus oryzae
(arrhizus), R. microsporus var., Rhizopodiformis, Lichtheimia
corymbifera и Rhizomucor pusillus.
Основными факторами риска развития мукорми-
коза являются длительный агранулоцитоз, ИСТ и вы-
сокодозная цитостатическая терапия, длительное при-
менение глюкокортикостероидов, хелаторная терапия
дефероксамином, а также диабетический кетоацидоз
[5]. Таким образом, основной группой риска развития
мукормикоза являются пациенты с гемобластозами,
апластической анемией и реципиенты трансплантатов
гемопоэтических стволовых клеток.
Поражение нижних дыхательных путей – наибо-
лее частый вариант локализации инвазивного мукор-
микоза у пациентов с длительной нейтропенией
и иммуносупрессией [6]. Клинические проявления
неспецифичны и сходны с любой грибковой инфек-
цией нижних дыхательных путей: гипертермия, не
отвечающая на массивную антибактериальную тера-
пию, хрипы и кашель, возможны боли в грудной клет-
ке и кровохарканье. При КТ в легких определяются
инфильтраты. Ангиоинвазивный рост мукормицетов
приводит к некрозу паренхимы легких, появлению
полостей и кровотечения, которое может быть фаталь-
ным при поражении крупного сосуда [7]. Общая ле-
тальность при легочном мукормикозе составляет око-
ло 65 % [8], а при диссеминированном процессе,
который чаще является осложнением инфекции ниж-
них дыхательных путей, почти 100 % [9].
Успех в лечении мукормикоза зависит от несколь-
ких факторов: это, прежде всего, – ранняя диагности-
ка, активная антифунгальная терапия, устранение
факторов риска и своевременная хирургическая сана-
ция очагов. К сожалению, не существует серологиче-
ских тестов или методов полимеразной цепной реак-
ции, позволяющих быстро установить предполагаемый
диагноз мукормикоза. Для постановки диагноза дока-
занного мукормикоза необходимым является биопсия
и гистологическое исследование тканей. Большое зна-
чение имеет устранение или коррекция предраспола-
гающих факторов, таких как нейтропения, а также
отмена или снижение дозы глюкокортикостероидов
и иммуносупрессивных препаратов. Третье и четвертое
звено успеха – это немедленное начало интенсивной
противогрибковой терапии и хирургическое лечение.
В одном из исследований летальность при мукорми-
козе в случае применения только противогрибковой
терапии составила 68 %, в то время как в группе, где
противогрибковую терапию сочетали с адекватным
хирургическим удалением очагов, летальность снизи-
лась до 11 % [10]. К сожалению, применение агрессив-
ных хирургических методов может быть затруднено
у онкогематологических пациентов и реципиентов
трансплантатов гемопоэтических стволовых клеток
в связи с сопутствующей тромбоцитопенией и коагу-
лопатией.
Возбудители мукормикоза полирезистентны, по-
этому перечень противогрибковых препаратов для
лечения этого заболевания крайне ограничен. Лекар-
ственными средствами (ЛС) выбора для стартовой
терапии являются липидные формы амфотерицина В.
Для ЛКАB стандартная дозировка при мукормикозе
составляет 5 мг/кг/сут как у детей, так и у взрослых.
Для обычной формы амфотерицина В, который явля-
ется альтернативным ЛС, максимальная дозировка
составляет 1,5 мг/кг/сут [11].
Позаконазол – пероральное ЛС из группы азолов,
показал эффективность против мукормицетов in vitro
при экспериментальном мукормикозе, а также в кли-
нических исследованиях у пациентов, которые были
рефрактерны или не переносили лечение различными
формами амфотерицина B. Позаконазол применяют
как в комбинации с липидными формами амфотери-
цина B при мукормикозе, рефрактерном к стартовой
терапии, так и в качестве монотерапии при неперено-
симой токсичности амфотерицина B [12, 13].
Немногочисленные обзоры по мукормикозу у де-
тей основываются на единичных или небольших
серийных описаниях случаев. Тем не менее они сум-
мируют имеющийся опыт лечения и способствуют
пониманию течения такого редкого заболевания, как
мукормикоз.
В одном из опубликованных обзоров, посвящен-
ных мукормикозу у детей, общее число включенных
пациентов составило 157 (медиана возраста – 5 лет) [14].
В группу анализа летальности вошли 33 новорожден-
ных; смертность новорожденных с мукормикозом со-
ставила 64 %. В группе детей в возрасте от 1 месяца
до 18 лет имела место летальность 56 %, сравнимая
с показателями у взрослых, – 53 % (408/772) [15]. У де-
тей и новорожденных, которым был рано установлен
диагноз и начата антифунгальная терапия (большин-
ство выживших пациентов получали липидные формы
амфотерицина B), смертность снизилась до 36 %
по сравнению с 88 % среди пациентов, которые не по-
лучали антифунгальной терапии (р < 0,0001) [16]. Еди-
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 57
1’
20
13
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Климко Н.Н. Микозы: диагностика
и лечение. Руководство для врачей.
2-е изд. перераб. и доп. М.: Премьер МТ,
2008. 336 с.
2. De Pauw B., Walsh T.J., Donnelly J.P.
et al. Revised definitions of invasive fungal
disease from the European Organization for
Research and Treatment of Cancer/Invasive
Fungal Infections Cooperative Group and
the National Institute of Allergy and Infec-
tious Diseases Mycoses Study Group
(EORTC/MSG) Consensus Group. Clin In-
fect Dis 2008;46:1813–21.
3. Климко Н.Н., Васильева Н.В.,
Елинов Н.П. и др. Перечень основных
методов и критериев диагностики мико-
зов. СПб., 2001. 24 с.
4. Gonzalez C.E., Rinaldi M.G., Sugar A.M.
Zygomycosis. Infect Dis Clin North Am
2002;16(4):895–914.
5. Kontoyiannis D.P., Lionakis M.S.,
Lewis R.E. et al. Zygomycosis in a tertiary-
care cancer center in the era of Aspergillus-
active antifungal therapy: A case-control
observational study of 27 recent cases.
J Infect Dis 2005;191:1350–60.
6. Marr K.A., Carter R.A., Crippa F. et al.
Epidemiology and outcome of mould
infections in hematopoietic stem cell trans-
plant recipients. Clin Infect Dis
2002;34:909–17.
7. Harada M., Manabe T., Yamashita K.
et al. Pulmonary mucormycosis with fatal
massive hemoptysis. Acta Pathol Jpn
1992;42:49–55.
8. Tedder M., Spratt J.A., Anstadt M.P. et al.
Pulmonary mucormycosis: Results of medi-
cal and surgical therapy. Ann Thorac Surg
1994;57:1044–50.
9. Gleissner B., Schilling A.,
Anagnostopolous I. et al. Improved outcome
of zygomycosis in patients with hematologi-
cal diseases? Leukemia Lymphoma
2004;45:1351–60.
10. Tedder M., Spratt J.A., Anstadt M.P.
et al. Pulmonary mucormycosis: results of
medical and surgical therapy. Ann Thorac
Surg 1994;57:1044–50.
11. Spellberg B., Walsh T.J.,
Kontoyiannis D.P. et al. Recent advances in
the management of mucormycosis: from
bench to bedside. Clin Infect Dis
2009;48(12):1743–51.
12. Van Burik J-A., Hare R.S., Solomon H.F.
et al. Posaconazole is effective as salvage
therapy in zygomycosis: a retrospective
summary of 91 cases. Clin Infect Dis
2006;42:e61–5.
13. Spellberg B., Ibrahim A., Roilides E.
et al. Combination therapy for
mucormycosis: why, what, and how? Clin
Infect Dis 2012;54 Suppl 1:S73.
14. Zaoutis T.E., Roilides E., Chiou C.C.
et al. Zygomycosis in children: a review and
analysis of reported cases. Pediatr Infect
Dis J 2007;26:723–7.
ничные опубликованные случаи применения терапии
позаконазолом у детей с диагностированным мукор-
микозом показали хорошую его эффективность, как
для лечения, так и для профилактики при высоком
риске внутригоспитальной инфекции, и отсутствие
побочных явлений даже у пациентов младшего возрас-
та [17].
У представленного в нашей статье пациента воз-
будителем заболевания был Lichtheimia corymbifera
(другие названия – Absidia corymbifera, Mycocladus
corymbifer), микромицет, ассоциированный с более
высоким риском диссеминации легочного мукорми-
коза у реципиентов после органной трансплантации
[18]. Успех лечения данного больного, как нам пред-
ставляется, обусловлен многими факторами, как со
стороны макроорганизма и характеристик самого воз-
будителя, так и со стороны активной тактики ведения
пациента. Безусловно, большую роль сыграло и то, что
в ходе ИСТ по поводу апластической анемии был до-
стигнут быстрый ответ: в ранние сроки после прове-
дения курса ATGAM восстановились гранулоциты,
а с ними и напряженность иммунитета в борьбе с воз-
никшим жизнеугрожающим инфекционным осложне-
нием. Наряду с эффективностью курса лечения по по-
воду основного заболевания, быстрая специфическая
диагностика и активное начало терапии мукормикоза
адекватными дозами ЛКАB, усиленной затем позако-
назолом, а также длительная суммарная продолжитель-
ность терапии (5 мес терапии ЛКАB в суммарной дозе
23 г и почти 8 мес непрерывной терапии позаконазо-
лом) позволили в данном случае справиться с легочным
мукормикозом. Этому также способствовала своевре-
менная отмена глюкокортикостероидов и циклоспори-
на. Безусловно, при подобном массивном легочном
поражении целесообразным представлялось добавле-
ние к консервативному лечению хирургического уда-
ления очагов, однако в нашем случае это было невоз-
можным из-за отказа родителей пациента от операции.
Таким образом, мукормикоз является жизнеугро-
жающей инфекцией у детей и новорожденных, при
которой наиболее целесообразной стратегией лечения
является раннее начало комбинированной антифун-
гальной терапии липидными формами амфотерицина
B и позаконазолом, с добавлением хирургического
удаления очагов вовлечения.
Выводы и рекомендации
1. У онкогематологических пациентов и реципи-
ентов трансплантатов гемопоэтических стволовых
клеток с длительной нейтропенией и выраженной им-
муносупрессией существует вероятность развития му-
кормикоза.
2. Мукормикоз – это агрессивная, быстро (в тече-
ние 2–3 нед) прогрессирующая и нередко фатальная
инфекция.
3. Для ранней диагностики мукормикоза необхо-
димо проведение прямой микроскопии и посева ма-
териала (БАЛ, мокрота, выделения из носа, аспират из
пазух носа) из очага поражения.
4. Для эффективного лечения мукормикоза необ-
ходимы стабилизация основного заболевания, умень-
шение выраженности нейтропении и иммуносупрес-
сии, адекватная антифунгальная терапия, а также
хирургическое удаление пораженных тканей.
Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я581
’2
01
3 15. Roden M.M., Zaoutis T.E.,
Buchanan W.L. et al. Epidemiology and
outcome of zygomycosis: a review of 929
reported cases. Clin Infect Dis 2005;41:634–53.
16. Roilides E., Zaoutis T.E. and Walsh T.J.
Invasive zygomycosis in neonates and
children. Clin Microbiol Infect 2009;15:50–4.
doi: 10.1111/j.1469-0691.2009.02981.x
17. Garner D., Machin K. Investigation and
management of an outbreak of
mucormycosis in a paediatric oncology unit.
J Hosp Infect 2008;70(1):53–9.
18. Sun H.Y., Aguado J.M., Bonatti H. et al.
Zygomycosis Transplant Study Group.
Pulmonary zygomycosis in solid
organ transplant recipients in the
currentera. Am J Transplant 2009;9(9):
2166–71.
59
1’
20
13
Ф А Р М А К О Т Е Р А П И Я
Современное представление о биоаналогах
в гематологии и онкологии
В.В. ПтушкинФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва
Контакты: Вадим Вадимович Птушкин [email protected]
Биопрепараты – крупные белковые или полипептидные молекулы, продуцируемые живыми организмами – во многом определяют
эффективность современной противоопухолевой терапии. Биопрепараты, разрушающие злокачественные клетки и биопрепара-
ты, защищающие нормальные ткани пациента, позволили добиться максимального прогресса в лечении целого ряда нозологий:
рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, злокачественных лимфом. К негативным сторонам применения био-
препаратов относятся их высокая стоимость и сложности производства. Истечение срока патентной защиты ряда биопрепа-
ратов создает предпосылки снижения их стоимости при выпуске альтернативным производителем. В то же время биоаналоги,
как и оригинальные белковые молекулы, являются продуктами производства живых клеток, что создает серьезные трудности
в достижении их идентичности. Для того чтобы исключить риск недостатка эффективности или повышения токсичности
лечения этими препаратами, в Европейском союзе были разработаны специальные правила для регистрации данной категории
лекарственных средств. Разработанные Европейским медицинским агентством, они включают регламенты по применяемым
методикам для определения качества биопродукта, подробное описание требований к доклиническим и клиническим исследова-
ниям, в зависимости от его специфических свойств, а также требования по фармаконадзору. Реализация подобной стратегии
позволила зарегистрировать в странах Евросоюза несколько биоаналогов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора,
один из которых – Зарсио – в нескольких клинических исследованиях показал полностью сопоставимую с оригинальным биопре-
паратом эффективность и переносимость, что позволило говорить о значимом снижении стоимости лечения при равной эффек-
тивности и токсичности.
Ключевые слова: онкология, биологические препараты, биоаналоги, нейтропения, гранулоцитарный колониестимулирующий фак-
тор, Зарсио
Modern concepts of biosimilars in hematology and oncology
V.V. Ptushkin
Dmitry Rogachev Federal Research Center of Pediatric Hematology,
Oncology and Immunology, Ministry of Health of Russia, Moscow
Biologics are large protein or polypeptide molecules produced by living organisms, which largely determine the efficiency of modern antican-
cer therapy. Biological products that destroy cancer cells and protect normal patient tissue led to progress in the treatment of breast cancer,
colon cancer, kidney cancer, malignant lymphomas and other diseases. But the high cost and complexity of production limit their use. The
expiration of patent protection for a number of biological products resulting to the possibility of reduces their costs when issuing an alternative
manufacturer. At the same time, biosimilars are produced by living cells (as the original protein molecules), which led to serious difficulties in
reaching their identity. The European Union has developed special registration rules for these preparations in order to avoid lack of efficacy
or increased toxicity. They include regulations to determine the quality of biological products, requirements for pre-clinical and clinical stu-
dies, according to its specific characteristics, as well as the requirements for pharmacovigilance. Implementation of such a strategy has to
register in the EU several biosimilars of granulocyte colony-stimulating factor. For one of them – Zarzio – in several clinical studies fully
comparable efficacy and tolerability with the original preparation was shown, thus providing a significant reduction of treatment cost with
equal efficacy and toxicity.
Key words: oncology, biological agents, biosimilars, neutropenia, granulocyte colony-stimulating factor, Zarzio
По определению Управления по контролю качес-
тва пищевых продуктов и лекарственных препаратов
США (Food and Drug Administration, FDA, USFDA)
биологические лекарственные препараты, также на-
зываемые биологические продукты, представляют
собой лекарственные средства, такие как вакцины,
производные крови или соматических клеток, продук-
ты генной терапии, ткани, рекомбинантные терапев-
тические белки, или живые клетки, применяемые для
лечения заболеваний [1]. Общим в этой крайне разно-
родной группе является то, что они продуцируются
живыми организмами или клетками, а не синтезиру-
ются химически.
Ассоциация международных фармацевтических
производителей (AIPM) предлагает свое определение.
Биологическое лекарственное средство – лекарствен-
ное средство, действующим началом которого являет-
ся вещество белковой структуры, полученное или вы-
деленное из биологического источника, в том числе
при помощи одного или нескольких перечисленных
биотехнологических методов: технология рекомби-
нантной ДНК (рДНК); контролируемая экспрессия
601
’2
01
3
Ф А Р М А К О Т Е Р А П И Я
генов, кодирующих выработку биологически актив-
ных белков; методы гибридизации и моноклональных
антител [2]. Это определение несколько сужает круг
препаратов, относящихся к биологическим, но фоку-
сирует внимание на самой быстроразвивающейся
и технологичной подгруппе этого гетерогенного се-
мейства.
За последние 20 лет биологические препараты за-
воевали прочные позиции в медицине и терапевтиче-
ские достижения в таких областях, как онкология,
аутоиммунные заболевания, нефрология, эндокрино-
логия, во многом связаны именно с этой лекарствен-
ной группой [3]. В онкологии биопрепараты, разруша-
ющие злокачественные клетки, и биопрепараты,
защищающие нормальные ткани пациента, позволили
добиться максимального прогресса в лечении целого
ряда наиболее значимых нозологий: рака молочной
железы, колоректального рака, рака почки, злокачест-
венных лимфом [4]. К сожалению, сложности разра-
ботки, производства и тестирования лекарств данной
группы определяют их высокую стоимость. Сегодня
по приблизительным оценкам доля биопрепаратов
в лекарственном бюджете современных онкологичес-
ких центров составляет до 70 %. Это приводит к его
существенному обременению и, как следствие, не все
больные, выигрывающие от назначения биопрепара-
тов, получают их в полном объеме. Особенно остро эта
проблема стоит в развивающихся странах в связи
с ограниченностью средств на лекарственное обеспе-
чение. В то же время первое поколение биофармацев-
тических препаратов, являющихся копиями челове-
ческих эндогенных белков, таких как эритропоэтин,
гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
(Г-КСФ), инсулин, гормон роста, которые были раз-
работаны с использованием рДНК или гибридомной
техники, исчерпало сроки патентной защиты. Это от-
крыло рынок для воспроизведенных версий этих про-
дуктов, так называемых «биоаналогов», во всем мире.
Создание копий биологических препаратов позволяет
рассчитывать на существенное снижение их стоимос-
ти за счет сокращения затрат на разработку и провер-
ку клинической эффективности. Однако в отличие от
традиционных лекарственных малых молекул, вклю-
чающих от 20 до 100 атомов и легко воспроизводящих-
ся на современном химическом производстве, биопре-
параты существенно больше и сложнее. Даже такие
относительно простые биопрепараты, как гормоны,
включают от 200 до 3000 атомов, а большие (антитела)
включают до 50 000 атомов. Можно представить соот-
ношение структурной комбинационности аспирина
(малая молекула), соматотропина (гормон роста чело-
века) и трастузумаба (антитело к рецептору эпидер-
мального фактора роста, применяемое при лечении
рака молочной железы) на примере велосипеда, авто-
мобиля и реактивного самолета. Число деталей в этих
устройствах приблизительно соответствует количеству
атомов в сравниваемых молекулах. Этот пример пока-
зывает, насколько сложны молекулы биопрепаратов
и потенциальные проблемы при их воспроизводстве.
Получение биопрепаратов значительно отличает-
ся от производства малых лекарственных молекул.
Малые молекулы синтезируются с использованием
химических реакций. Биопрепараты, как правило,
производят искусственно измененные клетки. Малые
молекулы легко охарактеризовать, очистить и прове-
рить с помощью обычных лабораторных тестов. Био-
препараты – особенно большие – производятся в со-
ставе смесей молекул, которые отличаются очень
незначительно, что затрудняет их выделение, очистку
и контроль качества [5]. Отсюда следует, что свойства
биопрепаратов часто напрямую зависят от характера
производственного процесса, который может длиться
очень долго (до года) и зависеть от небольших изме-
нений условий в реакторе. Кроме того, белки имеют
уникальную третичную структуру, которая влияет
на их работу в организме, и молекулы, полностью
идентичные химически, могут иметь различные био-
логические эффекты. Примером этого может служить
различие между сырым яйцом и сваренным: химичес-
ки они идентичны, но физически и биологически
очень разные. В связи с вышеизложенным во многих
странах, включая ЕЭС и США, требования к разработ-
ке и лицензированию биоаналогов значительно серь-
езнее, чем к генерическим препаратам малых молекул.
В последнем случае, как правило, достаточно физико-
химической идентичности и сходности фармакокине-
тического профиля (биоэквивалентности).
Европейский союз принял законы, а Европейское
медицинское агентство (ЕМЕА) разработало норма-
тивные принципы для утверждения биоаналогов [6, 7].
Из-за существенных различий между биофармацевти-
ческими продуктами процесс утверждения варьирует
в зависимости от препарата. В частности, характер
и объем клинических исследований могут зависеть от
изменчивости молекулы действующего вещества, кри-
териев эффективности и наличия подтвержденных
суррогатных маркеров терапевтической действеннос-
ти. В общем, утверждение биоаналогов основано
на демонстрации сопоставимой эффективности и бе-
зопасности нового продукта в соответствующей попу-
ляции пациентов (т. е. «сопоставимости»). Руководс-
тво ЕМЕА по биоаналогам позволяет, при наличии
надлежащего обоснования, экстраполировать данные
по эффективности и безопасности применения ново-
го препарата по одному терапевтическому показанию
на другие, принятые для референтного биопрепарата,
показания, позволяя использовать биоаналоги в по-
казаниях, для которых они не были официально изу-
чены [8].
Применение биофармацевтических препаратов
может быть связано с серьезными побочными эф-
фектами [9], поэтому в руководстве ЕМЕА требуется
проведение исследования иммуногенности и после-
дующего фармаконадзора после вывода препарата
61
1’
20
13
Ф А Р М А К О Т Е Р А П И Я
на рынок – программы для мониторинга эффектив-
ности и безопасности биоаналогов после их утвержде-
ния. В США первоначально биоаналоги приравни-
вались к референтным препаратам и должны были
проходить все процедуры регистрации, необходимые
для нового лекарственного вещества. В настоящее вре-
мя разрабатываются правовые пути для утверждения
биоаналогов по сходным с ЕМЕА принципам [10].
Как и дженерики, биоаналоги предназначены для
использования в той же дозе и таком же режиме вве-
дения для лечения того же заболевания, как и рефе-
рентный (оригинальный) биопрепарат. Таким обра-
зом, основная цель проверки биоаналога состоит не
в установлении для пациента выгоды как таковой, это
уже было сделано для оригинального продукта, а в де-
монстрации высокого сходства с эталонным продук-
том, опираясь, в частности, на его эффективность
и безопасность. По этим причинам дизайн иссле-
дований, направленных на подтверждение сходства
биологических продуктов, может отличаться от ис-
следований референтных образцов. Тип и объем кли-
нических данных, требуемых для биоаналогов, варьи-
рует в зависимости от сложности активного вещества
и возможности его характеристики, наличия приня-
того суррогатного критерия эффективности, от типа
и серьезности проблем безопасности, а также от воз-
можности экстраполировать эффективность и безо-
пасность данных, полученных при одном показании,
на другие, которые не были проверены. Проведение
исследований для всех показаний не является обяза-
тельным и даже может считаться неэтичным, хотя для
ряда клинических ситуаций это положение дискути-
руется [11]. Следует подчеркнуть, что принципы, ле-
жащие в основе подтверждения сопоставимости для
референтных препаратов и биоаналогов, используют-
ся и для референтного образца при внесении измене-
ния в процесс его производства. Однако, учитывая тот
факт, что новый производитель биоаналога разраба-
тывает собственную технологию, то требования для
демонстрации его соответствия референтному препа-
рату, как правило, более объемные, чем для демон-
страции сопоставимости референтного биологиче-
ского препарата до и после внесения изменений
в технологию производства у того же производителя.
Выполнение всех тестов, входящих в перечень необ-
ходимых исследований для каждого конкретного био-
препарата, позволит производителю биоаналога полу-
чить уверенность в том, что его препарат окажется
эффективным и не опасным для больного. В короткой
истории биоаналогов накопился уже определенный
опыт как положительный, так и отрицательный,
на основании которого можно проиллюстрировать
плюсы и минусы создания этой группы лекарствен-
ных средств [12].
Одним из широко востребованных в онкологии
рекомбинантных белков является Г-КСФ. Еще в се-
редине прошлого века было установлено, что сниже-
ние содержания нейтрофилов в периферической кро-
ви после интенсивной химиотерапии (ХТ) значительно
повышает риск присоединения инфекции [13]. Как
следствие, существенно возрастают затраты на лече-
ние и снижается качество жизни пациентов. Коррек-
ция нейтропении возможна благодаря применению
Г-КСФ – человеческого белка, производимого по ре-
комбинантной технологии и способного поддержать
выживание и пролиферацию предшественников ней-
трофилов в костном мозге. С 1990-х годов Г-КСФ ши-
роко применяется во всем мире, включая Россию.
Значение этих препаратов как непременной составля-
ющей сопроводительной терапии в современных
интенсивных протоколах лечения опухолей трудно
переоценить. Фармакоэкономические исследования
показали, что применение Г-КСФ снижает риск раз-
вития инфекций, особенно тяжелых, вследствие свое-
временной коррекции нейтропении и в итоге умень-
шает потребность в повторных госпитализациях,
позволяет выиграть в затратах на лечение [14]. При
этом применение Г-КСФ позволяет снизить раннюю
и инфекционную летальность после ХТ, обеспечивая
предпосылки продления жизни, особенно для пожи-
лых (старше 65 лет) и ослабленных пациентов [15].
Высокая стоимость референтного препарата Нейпо-
ген® ограничивала его назначение всем нуждающимся
пациентам, что косвенно способствовало снижению
дозоинтенсивности ХТ и повышению риска неудачи
противоопухолевого лечения [16]. Это послужило
основанием для инициирования процедуры регистра-
ции в ЕЭС биоаналогов препарата Нейпоген® после
истечения срока его патентной защиты. Эти новые
препараты – Зарсио®, Теваграстим® и Рациограстим® –
перед получением разрешения на клиническое ис-
пользование должны были пройти преклинический
и затем клинический этап оценки. Конкретные ре-
зультаты можно проиллюстрировать на примере био-
аналога Г-КСФ Зарсио®. На первом этапе в соответ-
ствии с рекомендациями ЕМЕА препарат был подвергнут
тщательному контролю на молекулярном уровне. Пеп-
тидное картирование показало сопоставимость следу-
ющих параметров – аминокислотная последователь-
ность и расположение дисульфидных соединений
частей молекулы – препарата Зарсио® и референтного
образца.
В ядерном магнитно-резонансном исследовании
препарат Зарсио® демонстрирует подобный референт-
ному продукту спектр ядерного магнитного резонанса,
что подтверждает сопоставимость их вторичной и тре-
тичной структур [17]. Кроме того, оба препарата
показали равно высокую аффинность к рецепторам
Г-КСФ на клеточной модели, что открыло возмож-
ности для клинического этапа испытаний.
В I фазе клинических испытаний в 4 перекрестных
исследованиях эффективности и токсичности препа-
рата Зарсио® по сравнению с референтным продуктом
было включено 146 здоровых добровольцев (81 муж-
621
’2
01
3
Ф А Р М А К О Т Е Р А П И Я
чина и 65 женщин). Ответ на сравниваемые препараты
оценивали по увеличению абсолютного числа нейтро-
филов крови (АЧН) после однократного и многократ-
ного введения препаратов в интервале доз 1–10 мкг/кг,
а также по уровню миграции CD34+-клеток из кост-
ного мозга в периферическую кровь после их много-
кратного введения в интервале доз 2,5–10 мкг/кг [18].
Кроме того, в этих исследованиях анализу подверга-
лись все возможные побочные действия и формиро-
вание нейтрализующих антител. Полученные резуль-
таты показали, что и кривые увеличения содержания
АЧН крови, и концентрации CD34+-клеток после под-
кожных и внутривенных однократных и многократ-
ных введений бионалога и референтного продукта
были сопоставимы. Не было также отмечено значи-
мых различий в выраженности, тяжести и спектре по-
бочных действий между препаратами Зарсио® и Ней-
поген®.
Биоаналог Г-КСФ Зарсио® прошел испытания
в контролируемом клиническом исследовании [18]
у 170 пациенток, страдающих раком молочной железы
II стадии высокого риска (3 %), III стадии (66 %),
а также IV стадии при наличии метастазов (30 %).
ХТ включала 4 цикла доксорубицина 60 мг/м2 и доце-
таксела 75 мг/м2 каждые 3 нед. Препарат вводился со
2-го дня после окончания ХТ подкожно ежедневно
до 14-го дня или до достижения АЧН крови 10 × 109/л.
Средний период назначения Зарсио® составил 31 день
(от 6 до 48 дней) в ежедневной дозе 300 μg (30 MIU)
или 480 μg (48 MIU) в зависимости от того, была ли
масса больного менее или более 60 кг. Средняя доза
препарата составила, таким образом, 6,1 ± 0,9 мкг/кг
массы тела в день (от 3,7 до 8,4 мкг/кг). Учитывая ко-
лебания доз, был проведен дополнительный анализ
эффекта препарата Зарсио® в зависимости от массы
тела пациента. Общая частота нейтропении III или
IV степени (АЧН < 1,0 × 109/л) при стратификации
по массе тела и реально полученной дозе не менялась
(p = 0,66). Всего в исследовании было зафиксировано
10 (6 %) случаев развития фебрильной нейтропении
(ФН) (95 % ДИ от 2,9 до 10,6 %) – все в течение пер-
вого цикла ХТ [18]. Во время последующих циклов
случаев ФН не наблюдалось. Госпитализация по при-
чине ФН потребовалась 6 (3,5 %) больным и длитель-
ность ее составила 12 ± 8,1 дня. Состояние ни одной
из этих пациенток не потребовало перевода в отделе-
ние интенсивной терапии. Антибиотики внутривенно
получали лишь 9 (5,3 %) из лихорадивших пациентов
и только 1 (0,6 %) пациент потребовал трансфузион-
ной заместительной терапии в связи с анемией. Сред-
няя продолжительность тяжелой нейтропении у боль-
ных, получавших Зарсио®, составила 1,8 дня в цикле 1
по сравнению с 7 днями в контроле без поддержки
факторами роста [18]. Продолжительность тяжелой
нейтропении в данном исследовании была сопостави-
ма с данными, полученными в исследованиях препа-
рата Нейпоген® [19, 20], хотя частота тяжелой нейтро-
пении на протяжении нескольких циклов ХТ была
несколько ниже по сравнению с опубликованными
данными для референтного продукта (47 % в цикле 1
для Зарсио® по сравнению с 79 % и 83 % для препара-
та Нейпоген®). В то же время низкую частоту тяжелой
нейтропении можно объяснить гетерогенностью ха-
рактеристик включенных пациентов: в исследование
с препаратом Зарсио® были включены больные, не
получавшие ранее ХТ и не имевшие предшествующе-
го миелотоксического фона, в отличие от исследова-
ния сравнения, где около 20 % пациентов получали ХТ
и ранее [19].
В исследовании у здоровых добровольцев [18]
ожидаемые побочные действия препарата (костно-
мышечная боль, лейкоцитоз, тромбоцитопения и го-
ловные боли) наблюдали с равной частотой в сравне-
нии с Нейпогеном®. Все осложнения в основном были
легкими (89 %) или умеренными (11 %) по степени
тяжести. В ходе исследований серьезных нежелатель-
ных явлений не было, равно как и случаев смерти. Кро-
ме того, анализ ожидаемых побочных действий, свя-
занных с применением Г-КСФ, не показал различий
в частоте их возникновения в зависимости от реально
полученной дозы при высокой или низкой массе тела
пациента.
Результаты лабораторных исследований, монито-
рирование жизненно важных функций и физикальное
обследование подтвердили отсутствие заметных изме-
нений в состоянии добровольцев и пациентов. В ходе
клинических исследований с применением препарата
Зарсио® для выявления образования антител к препа-
рату были протестированы методом радиоиммуно-
преципитации в общей сложности 1060 проб сыворот-
ки в период начального скрининга и 29 тестовых проб
для подтверждающего анализа [18]. Среди них 3 пробы
дали положительный результат на антитела. Эти 3 об-
разца принадлежали здоровым добровольцам в иссле-
довании EP06-102 и были взяты до лечения. Увеличе-
ния содержания антител к Г-КСФ в процессе терапии
Зарсио® не отмечено. Не было обнаружено образова-
ния нейтрализующих антител в этих образцах сы-
воротки с помощью NAB-анализа. В заключение
следует отметить, что ни у одного из участвующих
в исследовании пациентов не было образования свя-
зывающих RHg-CSF антител. Данные этих исследо-
ваний позволили ЕМЕА разрешить применение био-
аналога Г-КСФ Зарсио® для лечения пациентов
в странах Евросоюза по всем показаниям, зарегистри-
рованным для референтного препарата Нейпоген®.
С 2009 г. препарат успешно используется у онко-
логических и гематологических больных, что позво-
лило в рамках расширенного фармаконадзора провес-
ти ретроспективный анализ карт пациентов после
перехода с референтного препарата Г-КСФ (Нейпо-
ген®) на биоаналог Г-КСФ (Зарсио® / Филграстим
Hexal®) в широкой онкологической практике [21].
В общей сложности были оценены медицинские
63
1’
20
13
Ф А Р М А К О Т Е Р А П И Я
документы 77 пациентов с различными новообразова-
ниями, получавших в связи с нейтропенией после ХТ
биоаналог Г-КСФ Зарсио®. Полученные данные срав-
нивали с результатами 25 пациентов, получавших ре-
ферентный Г-КСФ в том же центре. Средний возраст
пациентов в группе биоаналога Зарсио® составил
67 (20–83) лет. В этой группе 48 % пациентов получали
режимы ХТ с риском развития ФН более 20 %. У боль-
шинства больных (в 52 % случаев) биоаналог Г-КСФ
был назначен в качестве первичной профилактики.
В остальных случаях имела место вторичная профи-
лактика ФН. В части случаев Г-КСФ назначали при
режимах ХТ с риском развития нейтропении и инфек-
ции менее 20 %, в этих случаях причиной назначения
являлись пожилой возраст и эпизоды ФН в анамнезе,
равно как и другие факторы, повышающие опасность
инфекции в период постцитостатической нейтропе-
нии. Проведение профилактики нейтропении у боль-
шинства пациентов оказалось успешным. ФН разви-
лась только у 1 пациента. Выраженное снижение АЧН
привело к редукции дозы цитостатиков у 5 (6,5 %) па-
циентов и прекращению ХТ у 2 (2,5 %) пациентов. Не
было отмечено каких-либо побочных действий, выхо-
дящих за рамки стандартных осложнений при назна-
чении Г-КСФ. Интенсивную ХТ с вероятностью раз-
вития ФН более 20 % получали только 24 % пациентов,
36 % больных получали Нейпоген® в качестве первич-
ной профилактики. ФН развилась у 1 пациента. Ре-
дукция дозы химиопрепаратов потребовалась у 2 (8 %)
пациентов, лечение было преждевременно прекраще-
но также у 2 (8 %) пациентов.
Выводы авторов данного исследования свидетель-
ствуют о высокой эффективности биоаналога Г-КСФ
Зарсио® и доказанной эквивалентности – химической,
биологической и терапевтической – по сравнению
с референтным образцом.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Center for Biologics Evaluation and
Research (2007-10-29). “What is a biological
product?” U.S. Food and Drug
Administration. Retrieved 2007-12-17.
2. Avidor Y., Mabjeesh N.J., Matzkin H.
Biotechnology and drug discovery: from
bench to bedside. South Med J
2003;96:1174–86.
3. Guide to Biological Medicines Guide
to Biological Medicines http://www.
europabio.org/sites/default/files/report/
guide_to_biological_medicines_a_focus_
on_biosimilar_medicines.pdf.
4. Cheson B.D., Leonard J.P. Monoclonal
antibody therapy for B-cell non-Hodgkin's
lymphoma. N Engl J Med 2008;359:613–26.
5. Crommelin D.J., Bermejo T., Bissig M.
et al. Pharmaceutical evaluation
of biosimilars: important differences from
generic low-molecular weight pharm. Eur J
Hosp Pharm Sci 2005;1:11–7.
6. European Medicines Agency, Committee
for Medicinal Products for Human Use.
Biosimilar Guidelines. https://www.ema.
europa.eu/ema/ index.jsp?curlpages/
regulation/general/general_ content_
000408.jsp&murlmenus/regulations/
regulations.jsp&midWC0b01ac058002958c.
Accessed October 20, 2012.
7. Combe C., Tredree R.L., Schellekens H.
Biosimilar epoetins: an analysis based on
recently implemented European Medicines
Evaluation Agency guidelines on compara-
bility of biopharmaceutical proteins.
Pharmacotherapy 2005;25:954–62.
8. European Medicines Agency. Annex to
guideline on similar biological medicinal
products containing biotechnology-derived
proteins as active substance: non-clinical and
clinical issues. Guidance on similar
medicinal products containing recombinant
granulocyte colony stimulating factor
(G-CSF) 2006. http://www.emea.europa.eu/
pdfs/human/biosimilar/3132905en.pdf.
9. Deechongkit S., Aoki K.H., Park S.S.
et al. Biophysical comparability of the same
protein from different manufacturers: a case
study using Epoetin alfa from Epogen and
Eprex. J Pharm Sci 2006;95:1931–43.
10. U.S. Food and Drug Administration.
Draft guidance on biosimilar product
development. http://www.fda.gov/Drugs/
DevelopmentApproval Process/HowDrugsare
DevelopedandApproved/ApprovalApplicati-
ons/TherapeuticBiologicApplications/Bio-
similars/default.htm. Accessed October 20, 2012.
11. Cri-report - Risk – Reward of
Developing a Herceptin Biosimilar –
A Thorough Assessment. http://www.
basearticles.com/Art/1026247/24/Crireport--
Risk--Reward-of-Developing-a-Herceptin-
Biosimilar--A-Thorough-Assessment.html.
12. Boven K., Stryker S., Knight J. et al.
The increased incidence of pure red cell
aplasia with an Eprex formulation in
uncoated rubber stopper syringes. Kidney Int
2005 Jun;67(6):2346–5398.
13. Bodey G.P., Buckley M., Sathe Y.S. et al.
Quantitative relationships between circulating
leukocytes and infection in patients with acute
leukemia. Ann Intern Med 1966;64:328–40.
14. Lyman G.H., Lyman C.G.,
Sanderson R.A. et al. Decision analysis of
hematopoietic growth factor use in patients
receiving cancer chemotherapy.
J Nattl Cancer Inst 1993;85:488–93.
15. Kuderer N.M., Dale D.C., Crawford J.
et al. Impact of primary prophylaxis with
granulocyte colony-stimulating factor on
febrile neutropenia and mortality in adult
cancer patients receiving chemotherapy: a
systematic review. JCO 2007;25:3158–67.
16. Lyman G.H., Dale D.C., Crawford J.
et al. Incidence and predictors of low dose-
intensity in adjuvant breast cancer
chemotherapy: a nationwide study of
community practices. JCO 2003;21:4524–31.
17. Sörgel F., Lerch H., Lauber T.
Physicochemical and biologic comparability
of a biosimilar granulocyte colony-
stimulating factor with its reference product.
BioDrugs 2010;24:347–57.
18. Gascon P., Fuhr U., Sörgel F. et al.
Development of a new G-CSF product based
on biosimilarity assessment. Ann Oncol
2010;21:1419–29.
19. Green M.D., Koelbl H., Baselga J. et al.
A randomized double-blind multicenter
phase III study of fixed-dose single-
administration pegfilgrastim versus daily
filgrastim in patients receiving
myelosuppressive chemotherapy. Ann Oncol
2003;14:29–35.
20. Holmes F.A., O’Shaughnessy J.A.,
Vukelja S. et al. Blinded, randomized,
multicenter study to evaluate single
administration pegfilgrastim once per cycle
versus daily filgrastim as an adjunct to
chemotherapy in patients with high-risk
stage II or stage III/IV breast cancer. J Clin
Oncol 2002;20:727–31.
21. Verpoort K., Möhler T.M. A non-inter-
ventional study of biosimilar granulocyte co-
lony-stimulating factor as prophylaxis for
chemotherapy-induced neutropenia in
a community oncology centre. Ther Adv
Med Oncol 2012;4(6):289–93.
641
’2
01
3
Н О В Ы Е Н А П Р А В Л Е Н И Я М Е Д И Ц И Н С К О Й Н А У К И
Уважаемые коллеги!
Продолжаем публиковать краткие лекции, которые можно назвать введением в проблему науки о наночастицах.Нет сомнений, что достижения наномедицины – которых пока реально нет – придут, прежде все-го, в теорию и практику онкологии и гематологии, что становится очевидным уже при беглом про-смотре списка литературных источников. Возможности использования наночастиц изучают или на моделях опухолевого роста, или на гемопоэтических культуральных системах.Поэтому нам кажется важным, чтобы первичное знакомство с тайнами нанонауки произошло на страницах журнала «Онкогематология». Надеемся, что эта информация найдет своих читателей.Начинаем, естественно, с участия наночастиц в процессах апоптоза – удивительного процесса жизни клеток, КОТОРЫЙ ЗАВЕРШАЕТ ИХ СУЩЕСТВОВАНИЕ, являясь феноменом запрограммирован-ной клеточной смерти. Это тот процесс, который мечтают задержать, направить в нужное русло, ускорить или вообще отменить, и без понимания которого нельзя решать практические задачи лечения и профилактики всех болезней.Итак, продолжаем!
Научный совет журнала
ОТ РЕДАКЦИИ / FROM EDITION
65
1’
20
13
Н О В Ы Е Н А П Р А В Л Е Н И Я М Е Д И Ц И Н С К О Й Н А У К И
Фуллерены и апоптоз
М.А. Орлова1, Т.П. Трофимова1, А.П. Орлов2, О.А. Шаталов3, Ю.К. Наполов3, А.А. Свистунов3, В.П. Чехонин2
1Химический факультет, кафедра радиохимии ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; 2медико-биологический факультет, кафедра медицинских нанобиотехнологий ГБОУ ВПО
«Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва; 3фармацевтический факультет, кафедра фармакологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский
университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России
Контакты: Марина Алексеевна Орлова [email protected]
Многие представители обширного семейства водорастворимых аддуктов фуллеренов и наночастиц на их основе привлек ают
серьезное внимание как противовирусные агенты, противоопухолевые агенты и средства адресной доставки лекарств. Сегодня
получено огромное количество таких производных фуллерена С60
. Однако для внедрения фуллереновых производных в медицинскую
практику необходимо понимание причин и механизмов прямых и отдаленных последствий их эффектов in vivo. В первую очередь
это касается их влияния на регуляцию процессов пролиферации, апоптоза и некроза. Огромное значение имеют способ получения,
функционализации и морфология фуллереновых наночастиц (их размеры, форма, рельеф поверхности, аффинность к клеточным
структурам), т. е. параметры, в зависимости от которых биологические эффекты наночастиц могут меняться от цитопро-
текторного до цитотоксического. В данной лекции содержится анализ современных представлений о влиянии фуллеренов и их
производных на сигнальные пути апоптоза нормальных и опухолевых клеток.
Ключевые слова: фуллерены, апоптоз, сигнальные пути
Fullerene and apoptosis
M.A. Orlova1, T.P. Trofimova1, A.P. Orlov2, O.A. Shatalov3, Yu.K. Napolov3, A.A. Svistunov3, V.P. Chekhonin2
1M.V. Lomonosov Moscow State University;2N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russia, Moscow;
3I.M. Sechenov Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia
Fullerene derivatives superfamily attracts a serious attention as antiviral and anticancer agents and drug delivery carriers as well. A large
number of such fullerene С60
derivatives obtained to date. However, there is an obvious deficit of information about causes and mechanisms
of immediately and long-term consequences of their effects in vivo which is a true obstacle on the way leading to practical medical use of
them. First, this concerns their impact on the proliferation, apoptosis and necrosis regulation. Fullerene nanoparticle functionalization type,
their sizes and surface nanopathology are of great importance to further promoting of either cytoprotective or cytotoxic effects. This lecture
provides modern concept analysis regarding fullerenes effects on apoptosis pathway in normal and tumor cells.
Key words: fullerenes, apoptosis, signaling pathway
Апопто�з (греч. απόπτωσις – опадание листьев) –
программируемая клеточная смерть, регулируемый
процесс самоликвидации на клеточном уровне, в ре-
зультате которого клетка фрагментируется на отдель-
ные апоптотические тельца, ограниченные плазмати-
ческой мембраной. Фрагменты погибшей клетки
обычно очень быстро (в среднем за 90 мин) фагоцити-
руются макрофагами либо соседними клетками, минуя
развитие воспалительной реакции. Морфологически
регистрируемый процесс апоптоза продолжается 1–3 ч.
Одной из биологических «задач» апоптоза является
уничтожение дефектных (поврежденных, мутантных,
инфицированных) клеток. В многоклеточных орга-
низмах апоптоз задействован в процессах дифферен-
цировки и морфогенеза, в поддержании клеточного
гомеостаза, в обеспечении развития и функциони-
рования иммунной системы. Апоптоз присущ всем
эукариотам, начиная от одноклеточных простейших
вплоть до высших организмов. Апоптоз регулируется
каскадом внутриклеточных молекул, взаимодействие
которых приводит к активации или торможению про-
цесса. Этот каскад последовательных взаимодействий
и превращений называется сигнальным путем. Основ-
ная задача системы, регулирующей апоптоз, – держать
эффекторные ферменты – каспазы, демонтирующие
клетки, в неактивном состоянии, но быстро перево-
дить их в активную форму в ответ на минимальное
действие соответствующих индукторов.
Тенденция исследований в области фуллереновых
производных в основном направлена на расширение
их классов, в то время как механизм и интенсивность
воздействия на пролиферативные процессы, а также
взаимосвязь с действием других про- или антиапопто-
тических факторов изучена недостаточно. Нет четкой
прогностической модели того, какие производные
фуллерена и в каких условиях будут проявлять анти-
апоптотические свойства, а какие можно сразу причи-
слять к возможным антиопухолевым агентам. Приве-
денная ниже градация условна, однако она помогает
выделить некоторые взаимосвязи.
661
’2
01
3
Н О В Ы Е Н А П Р А В Л Е Н И Я М Е Д И Ц И Н С К О Й Н А У К И
Показано, что дендритные однозамещенные фул-
лерены с большим количеством гидроксильных групп
(-ОН) в заместителе, а также С3-карбоксифуллерены
являются ингибиторами апоптоза [1]. Однако для всех
ли клеток это справедливо, и насколько универсально
это действие, остается под вопросом. Водораствори-
мые фуллерены влияют на ионный гомеостаз, тогда
как некоторые производные С60
проявляют свойства
блокаторов ионных каналов биомембран [2, 3], за ис-
ключением ClC-3 каналов. Ингибирование носит об-
ратимый характер, и, как предполагают, взаимодей-
ствие происходит во внеклеточных участках канала.
Чтобы оценить возможность проникновения наночас-
тиц сквозь мембрану, вычислили величину энергии
Гиббса, необходимой для переноса С60
вдоль оси, пер-
пендикулярной к поверхности двойного слоя мембра-
ны [4], и была показана принципиальная возможность
проникновения С60
. В целом, водорастворимые про-
изводные фуллерена легко проникают через биологи-
ческие мембраны различных типов клеток [5].
Митоген-активируемые протеинкиназы (MAPK)
осуществляют контроль клеточного деления и явля-
ются критическими регуляторами процессов транс-
крипции [6], участвуя в нескольких сигнальных путях
апоптоза. Токсическое действие n-C60
аналогично вли-
янию на апоптоз одностенных углеродных нанотрубок
[7] и может быть связано с активацией MAPK, что,
в свою очередь, взаимосвязано с активацией транс-
крипционного фактора NF-κB. Процесс зависит от
дозы препарата [8].
Водорастворимые фуллерены in vitro и in vivo [9]
выступают в роли защитных агентов от индукции ос-
теокластогенеза по RANK (receptor activator NF-κB)-
сигнальному пути и деструкции костных остеокластов
при артритах. В экспериментах показано, что у крыс
они способны понижать RANK-индуцированную
дифференцировку остеокластов и подавлять их разру-
шение при внутриартикулярном введении.
Наночастицы С60
(С(СООН)2)
2 подавляют апоптоз,
связанный с JNK (с-Jun amino-terminal kinases)-сиг-
нальными путями, уменьшая JNK-фосфорилирование,
активацию АР-1 (активатора протеина 1) и каспазы-3
(рис. 1). При этом не наблюдалось влияния на актива-
цию классической митоген-активируемой киназы
(ERK). Имеются данные, что протекторная роль n-C60
может быть опосредована активацией p38 [10, 11].
Каспазный путь апоптоза является наиболее рас-
пространенным, к активации каспазного каскада могут
приводить изменения многочисленных компонентов
биосистемы. Однако эти пути прослежены в очень не-
многих работах по фуллеренам, чаще рассматривают-
ся отдельные факторы, способные привести к актива-
ции каспаз, или констатируется активация каспазы-3.
Вопрос о влиянии заместителя рассматривали на при-
мере апоптоза человеческих моноцитов (линия THP1)
под действием разных производных фуллерена [12].
Рис. 1. Схема событий в CMECs, индуцированных пероксидом водорода и обработкой наночастицами C60
(C(COOH)2 )
2. Изменения опосредованы
уменьшением фосфорилирования JNK и ингибированием ROS-продукции. Наблюдается супрессия данного сигнального пути с уменьшением акти-
вации c-Jun и каспазы-3 и с ингибированием гидролиза PARP, высвобождающего цитохром С митохондрий [57]
H2O2 С60 (C(COOH)2)2 nanoparticles ROS Cyt c
67
1’
20
13
Н О В Ы Е Н А П Р А В Л Е Н И Я М Е Д И Ц И Н С К О Й Н А У К И
Оказалось, что роль заместителя особенно важна для
регуляции апоптоза.
Некоторые фуллерены способны, по крайней ме-
ре, частично защищать клетки от апоптоза, вызванно-
го оксидативным стрессом, путем повышения экс-
прессии антиоксидантных белков.
При действии n-С60
на рост опухолевых клеток ме-
ланомы мышей В16 in vitro наблюдали оксидативный
стресс, митохондриальную деполяризацию и, как ре-
зультат, активацию каспазного каскада [13]. Наоборот,
наночастицы С60
(С(СООН)2)
2 ингибировали расщеп-
ление поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP) и вы-
ход митохондриального цитохрома С, что приводило
к эффективному подавлению каспаззависимого апо-
птоза, вызванного окислительным стрессом.
Производные С60
-гексакарбоновой кислоты опи-
саны как блокаторы апоптозного сигнала тромбоци-
тарного фактора роста β (TGF-β) в клетках человечес-
кой гепатомы [14].
С60
(С(СООН)2)
2 может ингибировать апоптоз, ини-
циированный TNF-α в клетках HeLa, с помощью стаби-
лизации лизосом. При интернализации С60
(С(СООН)2)
2
повышается экспрессия молекулярного шаперона Hsp70,
что способствует выживаемости клеток путем ингиби-
рования пермеабилизации лизосомальных мембран.
Важным фактором является кислая среда внутри ли-
зосом, которая оказывает заметное, хотя и временное
влияние на агрегированность наночастиц. Распреде-
ление по размерам изменяется в среднем со 100 до 10 нм
и даже до отдельных молекул. Дезагрегированные час-
тицы могут встраиваться в лизосомальные мембраны,
образуя фуллерен-содержащие смешанные бислойные
мембраны. Это стабилизирует лизосомы, уменьшая
проницаемость их мембран, в частности для деструк-
тирующих факторов. Происходит снижение выпуска
катепсина из лизосом и ингибирование апоптоза, ин-
дуцированного TNF-α (рис. 2) [15].
Исследования, проведенные на гепатоцитах крыс,
показали, что фуллеролы С60
(ОН)24
проявляют зави-
симую от концентрации препарата (0–0,25 ммоль)
и времени экспозиции (0–3 ч) цитотоксичность вследст-
вие индукции процесса перекисного окисления липи-
дов, потери клеточного аденозинтрифосфата (ATФ)
и глутатиона, увеличения уровней малонового диаль-
дегида и окисленного глутатиона (GSSG) [16]. Счита-
ется, что основной мишенью фуллеролов являются
митохондрии, поэтому на ранней стадии наблюдается
митохондриальная недостаточность, деполяризация
и ингибирование синтеза АТФ. Лишь на более позд-
ней стадии наблюдается перекисное окисление липи-
дов в результате оксидативного стресса.
Для производных С60
-аминокислоты показана кон-
центрационная зависимость при воздействии на ли-
нию человеческих эпидермальных кератиноцитов
в культуре. В концентрации 0,4 и 0,04 мг/мл они сни-
жали жизнеспособность клеток и развитие воспали-
тельной реакции, а в концентрации ниже 0,04 мг/мл
инициировали потерю активности цитокинов и под-
держивали жизнеспособность клеток [17].
Перспективными можно признать исследования
с целью оценки возможности использовать фуллерены
в качестве модулятора действия лекарств. Например,
гибрид С60
-дексаметазон сохраняет противовоспали-
тельную активность дексаметазона, но оказывает го-
раздо более низкое иммуносупрессивное действие [18].
Фуллерен [Gd2C
82(OH)
22]n может вызвать феноти-
пическое созревание дендритных клеток. Эти нано-
частицы являются мощным активатором как для
Рис. 2. Влияние С60
(С(СООН)2 )
2 на лизосомально-митохондриальный апоптотический путь [35]
Aggregate[С60 (C(COOH)2)2]n
pH 7.0
С60 (C(COOH)2)2
nanoparticles
Lysosomalmembranepore
Lysosomal lipidmembrane
681
’2
01
3
Н О В Ы Е Н А П Р А В Л Е Н И Я М Е Д И Ц И Н С К О Й Н А У К И
дендритных клеток, так и для Th1-опосредованного
иммунного ответа. Препарат вызывает увеличение
продукции IFN-γ, IL-1β, IL-12, p70 и IL-2 и ко-стиму-
ляторов СD80, CD83, CD86 [19].
Механохимически солюбилизированный С60
спо-
собен выступать цитопротектором против NO-индуци-
рованной цитотоксичности, но не в результате прямого
взаимодействия [20]. Предполагают, что происходит
нейтрализация митохондриально-продуцированных
супероксид радикалов, и это пресекает цепочку обра-
зования пероксинитрита и активации каспаз. Показа-
но, что именно индукция пероксинитрита может быть
критическим сигнальным событием для генотоксич-
ности нано-С60
[21].
Растворимые фуллерены, модифицированные
β-аланином, валином и фолиевой кислотой, проявля-
ют непосредственную акцепторную активность по от-
ношению к NO-радикалам [22]. NO-индуцированные
события при контакте клеток феохромоцитомы крыс
с 1 ммоль/л нитропруссида натрия (SNP), который
вызывал заметное снижение митохондриального мем-
бранного потенциала, активности супероксиддисму-
тазы (SOD), каталазы (CAT) и глутатионпероксидазы
(Gpx), уменьшение жизнеспособности клеток, уве-
личение уровня накопления внутриклеточного NO
и малонового диальдегида и повышение активности
каспазы-3, заметно ингибировались предобработкой
клеток до контакта с SNP аминокислота-С60
-произ-
водными. Степень ингибирования зависела от морфо-
логии агрегации фуллереновых наночастиц, которая
влияла и на их защитный эффект против Н2О
2-инду-
цированного апоптоза. Сульфонат-производные С60
после внутривенного введения повышали содержание
NO в плазме крови [23].
Фуллеролы С60
(ОН)24
и С60
(ОН)х вызывали прямое
NO-тушение [24], результатом чего явилось уменьше-
ние NO-индуцированного снижения активностей
антиоксидантов – CAT, глутатион-S-трансферазы
(GST) и Gpx в денуклеированной фракции интерсти-
циальных тестикулярных клеток взрослых крыс после
инъекции SNP. Предполагается, что in vivo может про-
исходить конкуренция между аргиназой и индуци-
бельной NO-синтазой (iNOS) за аргинин как субстрат.
В подтверждение этого для С60
(ОН)х действительно
наблюдалось увеличение активности аргиназы и по-
давление продукции NO.
Полигидроксилированные C60-производные [25],
С60
-(глюкозамин)6 [26], карбоксифуллерены [20, 24]
и С60
-(цистин)5 показали способность включаться во
взаимосвязи и реакции с белками и биоструктурами,
что приводит к модуляции апоптоза в различных типах
клеток, включая нейроны. Известно воздействие на-
ночастиц модифицированных фуллеренов на клеточ-
ный ионный гомеостаз [27] и репликацию вирусов [2],
а также их участие в расщеплении ДНК [28], ингиби-
ровании амилоидных образований [29].
Пытаются моделировать взаимодействие С60
и ря-
да белков, представляющих возможные мишени для
лекарств [30], с целью создания в дальнейшем био-
конъюгатных материалов. На основании компьютер-
ного моделирования получены структуры комплексов
С60
с NOS, GST (рис. 3), β-секретазой-1, гипоксантин
фосфорибозил трансферазой [31], с некоторыми
другими белками. Имеются экспериментальные под-
тверждения участия производных фуллеренов в инги-
бировании NOS [32], глутатион-редуктазы [33],
а также цистеиновых и сериновых протеаз [34]. Извес-
тна анти-ВИЧ (ингибиторная) активность фуллерен-
производных [2, 35, 36], а также образование фулле-
рен-специфичных антител [37].
Таким образом, С60
-производные способны вме-
шиваться в биохимические процессы организма за счет
связывания с белками и ферментами. С одной сторо-
ны, важно научиться использовать эти возможности
в терапевтических целях, предсказывая докингом на-
иболее благоприятные мишени для целенаправленно-
го действия с использованием производных фулле-
рена. Однако эти же процессы могут представлять
Рис. 3. Кристаллографическая структура глутатион-S-трансферазы с интеркалированной молекулой глутатиона (а) и докинг-комплексы
С60
-глутатион-S-трансфераза (б) и С60
-NO-синтаза (в) [58]
а б в
69
1’
20
13
Н О В Ы Е Н А П Р А В Л Е Н И Я М Е Д И Ц И Н С К О Й Н А У К И
опасность для организма, непредсказуемо нарушая
пролиферацию и вмешиваясь в сигнальные пути апо-
птоза, которые до сих пор изучены недостаточно.
Особую важность представляет способность
фуллеренов взаимодействовать с BSA (бычий сыво-
роточный альбумин) [38, 39], HSА (человеческий
сывороточный альбумин, коэффициент связывания
Ксвяз.
= 1,2 × 107 моль-1) [40] и лизоцимом [41], так как
BSA и HSА выполняют в организме функцию универ-
сального транспортера белков и биологически важных
микроэлементов (металлов) [42]. Высокое сродство
к HSA показали органофосфат-содержащие фуллеро-
лы [43]. При этом происходило изменение третичной
структуры HSА в сторону большей компактности
с увеличением процента α-спиралей и β-складок и уве-
личением полярности окружения триптофанового
остатка. HSА может обеспечивать доставку наночас-
тиц к органам и тканям. Однако одновременно созда-
ется конкуренция другим физиологически важным
компонентам за счет изменения конформационного
состояния молекулы и простой конкурентности.
О реальном влиянии фуллеренов на структуру
и функции белков пока известно мало. Более того,
хотя некоторые белки и взаимодействуют с фулле-
ренами, до настоящего времени кристаллической
структуры таких комплексов не было получено. Одна-
ко докингом было показано [44] высокое сходство
между физико-химическими свойствами и геометрией
поверхности сайтов связывания фуллерена с ВИЧ-
протеазой, BSA и HSA (рис. 4).
Известно образование комплекса карбоксифулле-
рена с β-лактоглобулином (типичным представителем
семейства белков барьерной жидкости) [45], и показа-
на возможность переноса карбоксифуллерена из об-
разованного комплекса в альбумин, что расширяет
представление о модели транспорта наночастиц в био-
логической системе.
При прямом измерении митохондриальной Mg2+-
АТФазной активности оказалось, что фермент инги-
бируется фуллеролом с IC50
= 7,1 ± 0,3 μмоль/л [46]
и процесс является концентрационно-зависимым.
Применение водорастворимых гексасульфонатных
производных фуллерена С60
у крыс оказывало ней-
ропротективное действие, снижая концентрацию лак-
татдегидрогеназы в крови [23].
Фуллеропирролидины являются неконкурентны-
ми ингибиторами по отношению к ацетилхолинэсте-
разе, IC50
варьируют в пределах 15,6–31,4 μмоль/л [47],
а смешанный карбоксифуллерен-С60
проявлял инги-
биторную активность против цистеиновых и серино-
вых протеиназ. Ингибирование тромбина составляло
24 % при концентрации препарата 10 μмоль/л [44, 48].
Как ингибиторы, такие фуллерены могут использо-
ваться при ожогах и в качестве радиопротекторов, т. е.
в тех случаях, когда происходит сильнейшая актива-
ция протеиназ.
Водорастворимые фуллерены, имеющие в качест-
ве боковой группы спиртовую, аминную или амино-
кислотную, являются ингибиторами Zn-содержащего
фермента карбоангидразы (CAs) [49]. Механизм свя-
зан с закупоркой входа в активный центр сеткой фул-
лерена (размер и того и другого ~ 1 нм), при этом бо-
ковые фрагменты осуществляют взаимодействия
с аминокислотными остатками активного центра, сре-
ди которых гистидин в положении 64, 94 и 96, валин
в положении 121 и тирозин в положении 200.
Получен урациловый аддукт С60
[50], способный
к комплементарному связыванию с аденином, адено-
зином и АТФ. Разнообразные свойства могут прояв-
лять и порфирин-фуллерены. Образуя металлоком-
Рис. 4. Докинг-прогнозируемый сайт связывания карбоксифуллерена с HSA [59]
His440
His288
His288Trp214
Trp214His440
701
’2
01
3
Н О В Ы Е Н А П Р А В Л Е Н И Я М Е Д И Ц И Н С К О Й Н А У К И
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Lebovits R., Rosenblum M. Substuted
fullerenes and their use as inhibitors of cell
death, US Patent, № 0197950 A1, 2009.
2. Friedman S.H., De Camp D.L.,
Sijbesma R.P. et al. Inhibition of the HIV-1
protease by fullerene derivatives: model
building studies and experimental
verification. J Am Chem Soc
1993;115:6506–9.
3. Park K.H., Chhowalla M., Iqbal Z.,
Sesti F. Single-walled carbon nanotubes are
a new class of ion channel blockers. J Biol
Chem 2003;278:50212–6.
4. Redmill P.S., McCabe C. Molecular
dynamics study of the behavior of selected
nanoscale building blocks in a gel-phase lipid
bilayer. J Phys Chem B 2010;114:9165–72.
5. Andreev I., Petrukhina A., Garmanova A.
et al. Penetration of fullerene C60
derivatives
through biological membranes. Fullerenes
Nanotubes & Carbon Nanostructures
2008;16:89–102.
6. Johnson G.L., Lapadat R.L. Mitogen-
activated protein kinase pathways mediated
by ERK, JNK and p38 protein kinases.
Science 2002;298:1911–2.
7. Фатхутдинова Л.М., Халиулин Т.О.,
Зальялов Р.Р. Токсичность инженерных
наночастиц. Казанский мед журн
2009;90:578–84.
8. Manna S.K., Sarkar S., Barr J. et al.
Single-walled carbon nanotube induces
oxidative stress and activates nuclear
transcription factor-κB in human keratino-
cytes. Nano Lett 2005;5:1676–84.
9. Yudoh K., Karasawa R., Masuko K.,
Kato T. Water-soluble fullerene (C60
) inhibits
the osteoclast differentiation and bone
destruction in arthritis. Int J Nanomed
2009;4:233–9.
10. Okada T., Otani H., Wu Y. et al. Role of
F-actin organization in p38 MAPkinase-
mediated apoptosis and necrosis in neonatal
rat cardiomyocytes subjected to simulated
ischemia and reoxygenation. Am J Physiol
Heart Circ Physiol 2005;289:2310–8.
11. Luschen S., Scherer G., Ussat S. et al.
Inhibition of p38 mitogen-activated protein
kinase reduces TNF-induced activation of
NF-kB, elicits caspase activity, and enhances
cytotoxicity. Exp Cell Res 2004;293:196–206.
12. Rebecca M., Hsing-Lin W., Jun G. et al.
Impact of physicochemical properties of
engineered fullerenes on key biological
responses. Toxicol Appl Pharmacol 2009;234:58–67.
13. Zogovic N.S., Nikolic N.S.,
Vranjes-Djuric S.D. et al. Opposite effects of
nanocrystalline fullerene (C60
) on tumour
cell growth in vitro and in vivo and a possible
role of immunosupression in the cancer-
promoting activity of C60
. Biomaterials 2009;30:6940–6.
14. Huang Y.L., Shen C.K.F., Luh T.Y. et al.
Blockage of apoptotic signaling of transfor-
ming growth factor-beta in human hepatoma
cells by carboxy-fullerene. Eur J Biochem
1998;254:38–43.
15. Li W., Zhao L., Wei T. et al.
The inhibition of death receptor mediated
apoptosis through lysosome stabilization
following internalization of carboxyfullerene
nanoparticles. Biomaterials 2011;32:
4030–41.
16. Nakagawa Y., Suzuki T., Ishii H. et al.
Cytotoxic effects of hydroxylated fullerenes
on isolated rat hepatocytes via mitochondrial
dysfunction. Arch Toxicol 2011;85:1429–40.
17. Rouse J.G., Yang J.Z., Barron A.R.,
Monteiro-Riviere N.A. Fullerene-based
amino acid nanoparticle interactions with
human epidermal keratinocytes. Toxicol In
Vitro 2006;20(8):1313–20.
18. Liu R.L., Cai X.Q., Wang J.D. et al.
Research on the bioactivities of C60
-
dexamethasone. J Nanosci Nanotechnol
2009;9:3171–6.
19. Yang D., Zhao Y., Guo H. et al.
[Gd@C82(OH)22]n nanoparticles induce
dendritic cell maturation and activate Th1
плексы, они способны встраиваться в белки, например,
в апо-миоглобин, с получением С60
-миоглобина [51].
Один из наиболее известных путей апоптоза ре-
ализуется через повреждения ДНК, что активирует как
минимум р53-сигнальный путь [52]. Показано, что
водорастворимые производные C60
могут резко усили-
вать эффективность полимеразной реакции при отно-
сительно низкой концентрации ДНК [53], что способ-
но помешать нормальной репликации ДНК in vivo
и приводит в действие различные сигнальные пути
апоптоза.
Моно- и бис-метанофосфонаты С60
выступают
в ряде случаев ингибиторами ДНК-рестриктивных
эндонуклеаз. Ингибирование ДНК-эндонуклеазы
Exo III бис-метанофосфонатом-С60
(BMPF) прямо за-
висит от дозы фуллерена, а ингибирование полиме-
разной цепной реакции (ПЦР) с Taq ДНК-полимеразой
(IC50
= 2,7 μмоль/л) с помощью BMPF уменьшалось
при увеличении концентрации Taq полимеразы в си-
стеме ПЦР [54]. Предполагается, что этот процесс
ингибирования не коррелирует с АФК и зависит от
связывания фуллеренового аддукта с полимеразой,
а не с ДНК.
При рН < 9 размер фуллерола удобен для связыва-
ния с бактериальной ДНК [55]. В этом случае проис-
ходит увеличение термической и ферментативной (по
отношению к ДНКазе I и Hind III рестриктазе) ста-
бильности ДНК дозозависимым образом. Защитная
концентрация фуллерола составляла 50–500 нг/μл.
В то же время при связывании этой же ДНК с нано-С60
для защиты от ферментативного расщепления требо-
валась концентрация не менее 500 нг/μл. Наблюдалась
также зависимость влияния размеров фуллереновых
наночастиц на результат воздействия на ДНК и на ток-
сичность. Например, нано-С60
с размером 100 нм яв-
ляются неблагоприятными для связывания с ДНК.
ДНК-фуллерен связывание способно изменять
третичную структуру молекул ДНК и усложнять их
узнавание белками, которое базируется на специфи-
ческой и строго определенной форме молекулы
ДНК [56]. Конкретные изменения были продемонс-
трированы на примере комплекса С60
(ОН)24
-ДНК, где
фуллерол прочно связывался с фосфатным остовом
за пределами цепи нативной ДНК и с парами основа-
ний в пределах главного канала между спиралями [57].
Благодаря способности вызывать в определенных
условиях гибель клеток фуллерены являются потен-
циальными противоопухолевыми агентами. Однако
однозначное прогнозирование про- и антиапоптоти-
ческих свойств различных производных фуллерена,
тем более для различных типов клеток, пока еще не-
возможно.
71
1’
20
13
Н О В Ы Е Н А П Р А В Л Е Н И Я М Е Д И Ц И Н С К О Й Н А У К И
immune responses. ACS Nano
2010;4(2):1178–86.
20. Misirkic M.S., Todorovic-Markovic B.M.,
Vucicevic L.M. et al. The protection of cells
from nitric oxide-mediated apoptotic death
by mechanochemically synthesized fullerene
(C60
) nanoparticles. Biomaterials 2009;30:2319–28. 21. Xu A., Chai Y., Nohmi T., Hei T.K.
Genotoxic responses to titanium dioxide
nanoparticles and fullerene in gpt delta
transgenic MEF cells. Part Fibre Toxicol 2009;6:3–16.
22. Hu Z., Huang Y., Guan W. et al. The
protective activities of water-soluble C60
derivatives against nitric oxide-induced
cytotoxicity in rat pheochromocytoma cells.
Biomaterials 2010;31:8872–81.
23. Huang S.S., Tsai S.K., Chin C.L. et al.
Neuroprotective effect of hexasulfobutylated
C60
on rats subjected to focal cerebral ischemia.
Free Rad Biol Med 2001;30(6):643–9. 24. Bisaglia M., Natalini B.L., Pellicciari R.
et al. Carboxyfullerenes as neuroprotective
agents C3-fullerotris-methanodicarboxylic
acid protects cerebellar granule cells from
apoptosis. J Neurochem 2000;74:1197–204.
25. Chen Y.W., Hwang K.C.H., Yen C.C.,
Lai Y.L. Fullerene derivatives protect against
oxidative stress in RAW 264.7 cells and
ischemia-reperfused lungs. Am J Physiol
2004;287:21–6.
26. Chien C.T., Chen C.F., Hsu S.M. et al.
Forced expression of bcl-2 and bcl-xL by
novel water-soluble fullerene,
C60
(glucosamine)6, reduces renal ischemia/
reperfusion-induced oxidative stress. Fuller
Nanotub Car 2001;9:77–88.
27. Kotelnikova R.A., Kotelnikov A.I.,
Bogdanov G.N. et al. Membranotropic
properties of the water soluble amino acid
and peptide derivatives of fullerene C60
.
FEBS Lett 1996;389:111–4.
28. Boutorine A.S., Tokuyama H.,
Takasugi M. et al. Fullerene-oligonucleotide
conjugates: photoinduced sequence-specific
DNA cleavage. Angew Chem Int Ed
1994;33:2426–65.
29. Kim J.E., Lee M. Fullerene inhibits-
amyloid peptide aggregation. Biochem Bio-
phys Res Commun 2003;303:576–9.
30. Calvaresi M., Zerbetto F. Baiting pro-
teins with C60
. ACS Nano 2010;4:2283–99.
31. Gupta S., Dhawan A., Shanker R.
In silico approaches: prediction of biological
targets for fullerene derivatives. J Biomed
Nanotechnol 2011;7:91–2.
32. Wolff D.J., Barbieri C.M.,
Richardson C.F. et al. Trisamine C60
-fullerene
adducts inhibit neuronal nitric oxide
synthase by acting as highly potent
calmodulin antagonists. Arch Biochem
Biophys 2002;399:130–41.
33. Mashino T., Okuda K., Hirota T. et al.
Inhibitory effect of fullerene derivatives on
glutathione reductase. Fullerene Sci Technol
2001;9:191–6.
34. Tokuyama H., Yamago S., Nakamura E.
et al. Photoinduced biochemical-activity of
fullerene carboxylic-acid. J Am Chem Soc
1993;115:7918–9.
35. Marcorin G.L., Da Ros T., Castellano S.
et al. Design and synthesis of novel [60]
fullerene derivatives as potential HIV aspartic
protease inhibitors. Org Lett 2000;2:3955–8.
36. Schuster D.I., Wilson S.R., Schinazi R.F.
Anti-human immunodeficiency virus activity
and cytotoxicity of derivatized buckminster-
fullerenes. Bioorg Med Chem Lett
1996;6(11):1253–6.
37. Braden B.C., Goldbaum F.A., Chen B.X.
et al. X-Ray crystal structure of an
anti-buckminsterfullerene antibody fab
fragment: biomolecular recognition of C60
.
Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2000;97:12193–7.
38. Rozhkov S.P., Goryunov A.S.,
Sukhanova G.A. et al. Protein interaction
with hydrated C60
fullerene in aqueous
solutions. Biochem Biophys Res Commun
2003;303:562–6.
39. Belgorodsky B., Fadeev L., Kolsenik J.,
Gozin M. Formation of a soluble stable
complex between pristine C60
-fullerene and a
native blood protein. Chembiochem
2006;7:1783–9.
40. Belgorodsky B., Fadeev L., Ittah V. et al.
Formation and characterization of stable hu-
man serum albumin-tris-malonic acid [C60
]
fullerene complex. Bioconjug Chem
2005;16:1058–62.
41. Yang S.T., Wang H., Guo L. et al.
Interaction of fullerenol with lysozyme
investigated by experimental and computa-
tional approaches. Nanotechnology
2008;19:395–401.
42. Zhang X.F., Shu C.Y., Xie L. et al.
Protein conformation changes induced by
a novel organophosphate-containing water-
soluble derivative of a C60
fullerene nanopar-
ticle. J Phys Chem C 2007;111:14327–33.
43. Benyamini H., Shulman-Peleg A.,
Wolfson H.J. et al. Interaction of C60
-fullerene
and carboxyfullerene with proteins: docking
and binding site alignment. Bioconjug Chem 2006;17:378–86.
44. Belgorodsky B., Fadeev L., Kolsenik J.,
Gozin M. Biodelivery of a fullerene deriva-
tive. Bioconjug Chem 2007;18:1095–100.
45. Ueng T.H., Kang J.J., Wang H.W. et al.
Suppression of microsomal cytochrome
P450-Dependent monooxygenases and
mitochondrial oxidative phosphorylation by
fullerenol, a polyhydroxylated fullerene C60
.
Toxicol Lett 1997;93:29–37.
46. Pastorin G., Marchesan S., Hoebeke J.
et al. Design and activity of cationic fullerene
derivatives as inhibitors of acetylcholines-
teras. Org Biomol Chem 2006;4:2556–62.
47. Iwata N., Mukai T., Yamakoshi Y.N.
et al. Effect of C60
, a fullerene, on the
activities of glutathione S-transferase and
glutathion-related enzymes. Fullerenes,
Nanotubes, Carbon Nanostruct 1998;
6:213–26. 48. Innocenti A., Durdagi S., Doostdar N.
et al. Nanoscale enzyme inhibitors:
fullerenes inhibit carbonic anhydrase by
occluding the active site entrance. Bioorg
Med Chem 2010;18:2822–8.
49. Marczak R., Hoang V.T., Noworyta K.
et al. Molecular recognition of adenine,
adenosine and ATP at the air–water interface
by a uracil appended fullerene. J Mater
Chem 2002;12:2123–9.
50. Ito M., Nakashima N. Design, synthesis
and photophysical properties of C60
-modified
proteins. J Mater Chem 2002;12:2026–33.
51. Желтухин А.О., Чумаков П.М. По-
вседневные и индуцированные функции
гена p53. Усп биол наук 2010;50:447–516.
52. Liang Y., Luo F., Lin Y. et al. C60
affects
DNA replication in vitro by decreasing the
melting temperature of DNA templates.
Carbon 2009;47:1457–65.
53. Kang F., Song G.G. Inhibition of Taq
DNA polymerase and DNA exonuclease
ExoIII by an aqueous nanoparticle suspension
of a bis-methanophosphonate fullerene.
Mater Sci Forum 2011;685:345–51.
54. An H., Jin B. DNA exposure to
buckminsterfullerene (C60
): toward DNA
stability, reactivity, and replication. Environ
Sci Technol 2011;45:6608–16.
55. Rohs R., West S.M., Sosinsky A. et al.
The role of DNA shape in protein-DNA
recognition. Nature 2009;461:1248–53.
56. Pinteala M., Dascalu A., Ungurenasu C.
Binding fullerenol C60
(OH)24
to dsDNA. Int
J Nanomed 2009;4:193–9.
57. Shinohara N., Matsumoto K., Endoh S.
et al. In vitro and in vivo genotoxicity tests on
fullerene C60
nanoparticles. Toxicol Lett
2009;191:289–96.
58. Baker G.L., Gupta A., Clark M.L. et al.
Inhalation toxicity and lung toxicokinetics of
C60
fullerene nanoparticles and microparticles.
Toxicol Sci 2008;101:122–31.
59. Seki M., Fujishima S., Gondo Y. et al.
Acute toxicity of fullerene C60
in aquatic
organism. Environ Sci 2008;21:53–62.
К О Н Ф Е Р Е Н Ц И И , С И М П О З И У М Ы , С О В Е Щ А Н И Я721
’2
01
3
Научно-практическая конференция
«Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии»
К.И. Киргизов1, С.Р. Варфоломеева1, Г.И. Бишарова2
1ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва;2Читинский филиал Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН
15–16 января 2013 г. в Чите состоялось открытие Клиники детской онкогематологии в новом корпусе Забайкальского краевого онкологического диспансера, а также была проведена научно-практическая конфе-ренция «Актуальные вопросы детской онкологии и ге-матологии».
Клиника детской онкогематологии Читинского
филиала Научного центра проблем здоровья семьи
и репродукции человека Сибирского отделения РАМН
является одним из ведущих центров в области детской
онкологии/гематологии Сибири.
15 января 2013 г. во вновь построенном корпусе
Забайкальского краевого онкологического диспансера
состоялось открытие отделения детской онкогемато-
логии, где предусмотрены специальные асептические
палаты для проведения трансплантации гемопоэти-
ческих стволовых клеток. Отделение оснащено совре-
менным оборудованием, созданы условия для прове-
дения афереза стволовых клеток.
Открытие отделения привлекло большое внима-
ние общественности, на торжественной церемонии
присутствовали губернатор края Р.Ф. Гениатулин
и ми нистр здравоохранения краевого правительства
Б.П. Сормолотов. Руководитель московской делега-
ции, директор Федерального научно-клинического
центра детской гематологии, онкологии и иммуно-
логии им. Дмитрия Рогачева, академик РАМН
А.Г. Румянцев отметил, что открытие такого отделения
в Забайкальском крае позволит вывести на новый уро-
вень краевую науку и практику.
Семинар по программе «Дальние регионы» тради-
ционно открыли заместитель министра здравоохра-
нения Забайкальского края, начальник отдела мате-
ринства и детства Н.Г. Игнатьева и главный врач
Забайкальского краевого онкологического диспансе-
ра С.В. Лесков. С докладом о приоритетных направ-
лениях развития детской онкогематологии выступил
акад. А.Г. Румянцев. Особое внимание он уделил изу-
чению молекулярно-генетических механизмов раз-
вития заболеваний и современных способов их ди-
агностики и лечения. Профессор Читинского филиала
Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции
человека Сибирского отделения РАМН Г.И. Бишарова рассказала о развитии детской онкогематологии в За-
байкальском крае, отметив значение нового отделения
в развитии данного направления. Представители за-
байкальской школы детской гематологии-онкологии
О.И. Кряжева и Е.П. Мацеха рассказали об особен-
ностях эпидемиологии злокачественных новообра-
зований в Забайкальском крае и организации их мо-
ниторинга с помощью канцер-регистра. В рамках
программы «Дальние регионы» состоялся научно-
практический семинар и консультация пациентов,
организованные ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева,
благотворительным фондом «Подари Жизнь» и Нацио-
нальным обществом детских гематологов и онкологов.
ТЕРАПИЯ ВЫСОКИХ ДОСТИЖЕНИЙ
ЗАО «Рош-Москва» Официальный дистрибьютор «Ф. Хоффманн - Ля Рош Лтд.» (Швейцария) Россия, 107031 МоскваТрубная площадь, дом 2 Бизнес-центр «Неглинная Плаза» Тел.: + 7 (495) 229-29-99Факс: + 7 (495) 229-79-99 www.roche.ru
Показания. Неходжкинская лимфома Рецидивирующая или химиоустойчивая В-клеточная, СD20-положительная неходжкинская лимфома низкой степени злокачественности или фолликулярная. Фолликулярная лимфома III-IV стадии в комбинации с химиотерапией у ранее нелеченных пациентов. Фолликулярная лимфома в качестве поддерживающей терапии после ответа на индукционную терапию. СD20-положительная диффузная В-крупноклеточная неходжкинская лимфома в комбинации с химиотерапией по схеме CHOP. Хронический лимфолейкоз в комбинации с химиотерапией у пациентов, ранее не получавших стандартную терапию. Рецидивирующий или химиоустойчивый хронический лимфолейкоз в комбинации с химиотерапией. Ревматоидный артрит (активная форма) у взрослых в комбинации с метотрексатом при непереносимости или неадекватном ответе на текущие режимы терапии, включающие один или более ингибиторов фактора некроза опухолей (ФНО-а). Безопас-ность и эффективность препарата у детей не установлены. Противопоказания. Гиперчувствительность к ритуксимабу, любому компоненту препарата или к белкам мыши, острые инфекционные заболевания, выраженный первичный или вторичный иммунодефицит. Правила приготовления и хранения раствора. Необходимое количество препарата набирают в асептических условиях и разводят до расчетной концентрации (1-4 мг/мл) в инфузионном флаконе (пакете) с 0.9% раствором натрия хлорида для инфузий или 5% раствором декстрозы (растворы должны быть стерильными и апирогенными). Приготовленный инфузионный раствор Мабтеры физически и химически стабилен в течение 12 ч при комнатной температуре или в течение не более 24 ч при температуре от 2 до 8 °С. Мабтеру вводят внутривенно, инфузионно (медленно), через отдельный катетер. Нельзя вводить в/в болюсно или в виде в/в инъекций. Дополнительная информация в инструкции по применению.