Онкогематология №2 2011

ОНКО

2 0 1 1

Г Е М АТОЛ О Г И ЯН А У Ч Н О - П Р А К Т И Ч Е С К И Й Е Ж Е К В А Р Т А Л Ь Н Ы Й Р Е Ц Е Н З И Р У Е М Ы Й Ж У Р Н А Л

2

ISSN 1818-8346

Возможности лечениярезистентного хроническоголимфолейкоза

Гонадотоксичность терапиилимфомы Ходжкина

Материалы VII Российскогосимпозиума «Биологические основытерапии онкологическихи гематологическихзаболеваний»

2 2011

Журнал включен в Перечень ведущих рецензируемых научных

журналов, в которых публикуются основные научные результаты

диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОРпроф., д.м.н. Е.В. Самочатова

Заместители главного редакторад.м.н. В.В. Птушкин,

проф., д.м.н. Б.В. АфанасьевОтветственный секретарь

к.м.н. Ю.В. Румянцева

РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯпроф., д.м.н. О.В. Алейникова (Минск)

проф., д.м.н. А.К. Голенков (Москва)проф., д.м.н. А.И. Карачунский (Москва)

д.м.н. Е.Н. Паровичникова (Москва)проф., д.м.н. Ю.А. Криволапов (С.-Петербург)

доц., д.м.н. М.Л. Минков (Австрия)д.м.н. Н.В. Мякова (Москва)

к.м.н. Е.А. Никитин (Москва)проф., д.м.н. О.А. Рукавицын (Москва)

проф., д.м.н. С.А. Румянцев (Москва)д.м.н. Г.И. Сидорович (Москва)

к.м.н. Л.Г. Фечина (Екатеринбург)д.м.н. А.Л. Усс (Минск)

РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТпроф., д.м.н. Е.А. Лукина (Москва)

чл.-корр. РАМН И.В. Поддубная (Москва)чл.-корр. РАМН А.Г. Румянцев (Москва)

к.м.н. В.А. Россиев (Самара)проф., д.м.н. А.Г. Талалаев (Москва)

Адрес редакции:Москва, Каширское шоссе, д. 24,

стр. 15, НИИ канцерогенеза, 3-й этаж.Тел./факс: +7 (499) 929-96-19

www.abvpress.rue-mail: [email protected]

Заведующая редакцией Т.В. КлюковкинаКорректор В.В. Калинина

Дизайн Е.В. СтепановаВерстка А.Р. Комлев

Служба подписки и распространения В.Ю. Тимохина, +7 (499) 929-96-19

e-mail: [email protected]Служба рекламы

В.А. Клюковкин, +7 (499) 929-96-19e-mail: [email protected]

Журнал зарегистрированв Федеральной службе по надзору

в сфере связи, информационных технологийи массовых коммуникаций (Роскомнадзор)

ПИ № ФС77-36928 от 21 июля 2009 г.

При полной или частичной перепечатке материалов ссылка на журнал «Онкогематология» обязательна.

Редакция не несет ответственностиза содержание публикуемых рекламных материалов.

В статьях представлена точка зрения авторов, которая может не совпадать с мнением редакции.

ISSN 1818-8346Онкогематология. 2011. № 2. 1–60© ООО «ИД «АБВ-пресс», 2011

Подписной индекс в каталоге«Пресса России» — 42167

Отпечатано в типографииООО «Графика»

Тираж 3000 экз. 2

EDITOR-IN-CHIEFYe.V. Samochatova, MD, DMSci, Prof.Deputy EditorsV.V. Ptushkin, MD, DMSci,B.V. Afanasiev, MD, DMSci, Prof.Executive SecretaryYu.V. Rumyantseva, MD, CMSci

EDITORIAL BOARDO.V. Aleynikova, MD, DMSci, Prof. (Minsk)A.K. Golenkov, MD, DMSci, Prof. (Moscow)A.I. Karachunskiy, MD, DMSci, Prof. (Moscow)Ye.N. Parovichnikova, MD, DMSci (Moscow)Yu.A. Krivolapov, MD, DMSci, Prof. (St.-Petersburg)M.L. Minkov, MD, DMSci (Austria)N.V. Myakova, MD, DMSci (Moscow)Ye.A. Nikitin, MD, CMSci (Moscow)O.A. Rukavitsyn, MD, DMSci, Prof. (Moscow)S.A. Rumyantsev, MD, DMSci, Prof. (Moscow)G.I. Sidorovich, MD, DMSci (Moscow)L.G. Fechina, MD, CMSci (Yekaterinburg)A.L. Uss, MD, DMSci (Minsk)

EDITORIAL COUNCILYe.A. Lukina, MD, DMSci, Prof. (Moscow)I.V. Poddubnaya, MD, DMSci, Prof., RAMSci Corr. Mem. (Moscow)A.G. Rumyantsev, MD, DMSci, Prof., RAMSci Corr. Mem. (Moscow)V.A. Rossiyev, MD, CMSci (Samara)A.G. Talalayev, MD, DMSci, Prof. (Moscow)

С О Д Е Р Ж А Н И Е

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

Е.В. Катаева, А.К. Голенков, Е.В. Трифонова, Г.А. Дудина, Т.А. Митина, Л.Л. Высоцкая,

Т.Д. Луцкая, И.В. Буравцова, Р.В. Горенков, Ю.Ю. Чуксина, В.В. Яздовский

Лечение резистентных больных хроническим лимфолейкозом программами,

включающими алемтузумаб в виде монотерапии или в сочетании с флударабином . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

Р.А. Голубенко, Г.Б. Громов, В.И. Вишневский

Опыт применения ритуксимаба при рецидивах неходжкинских лимфом

у больных пожилого возраста в Орловской области . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

А.А. Винокуров, С.Р. Варфоломеева, Д.И. Тарусин

Гонадотоксичность терапии лимфомы Ходжкина у подростков и молодых мужчин:

актуальность проблемы и пути решения (обзор литературы) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Т.Т. Валиев, Л.А. Махонова, А.М. Ковригина, Е.Н. Шолохова,

Н.Н. Тупицын, И.Н. Серебрякова, Г.Л. Менткевич

Случай врожденного лангергансоклеточного гистиоцитоза у ребенка раннего возраста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ

А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, С.С. Бессмельцев

Новый подход к определению коэкспрессии антигенов клеток при проведении анализа

с использованием иммунологического биочипа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ

Материалы VII Российского симпозиума «Биологические основы терапии онкологических

и гематологических заболеваний», Москва, 1–4 июня 2011 г. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

От редакции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

ПРЕСС-РЕЛИЗ

Знать и применять: возможности хелаторной терапии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

C O N T E N T S

HEMATOLOGIC MALIGNANCIES: DIAGNOSIS, TREATMENT, SUPPORTIVE CARE

E.V. Kataeva, A.K. Golenkov, E.V. Trifonova, G.A. Dudina, T.A. Mitina, L.L. Vysotskaya,

T.D. Lutskaya, I.V. Buravtsova, R.V. Gorenkov, Yu.Yu. Chuksina, V.V. Yazdovskiy

Treatment of patients with refractory chronic lymphocytic leukemia with alemtuzumab,

alone or in combination with fludarabine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

R.A. Golubenko, G.B. Gromov, V.I. Vishnevskiy

Experience of using rituximab for recurrent non-Hodgkin lymphoma in elderly patients of the Orel region . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

A.A. Vinokurov, S.R. Varfolomeeva, D.I. Tarusin

Gonadal toxicity of Hodgkin lymphoma treatment in adolescents and young males:

issue relevance and ways of solve (literature review) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

T.T. Valiev, L.A. Makhonova, A.M. Kovrigina, E.N. Sholokhova,

N.N. Tupitsyn, I.N. Serebryakova, G.L. Mentkevich

Case of congenital Langerhans cells histiocytosis in an infant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

BASIC RESEARCH

A.V. Shishkin, N.G. Ovchinina, S.S. Bessmeltsev

Novel approach for detection of cell antigen coexpression using immunological biochip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

CONFERENCES, SYMPOSIUMS, MEETINGS

Proceedings of the VII Symposium «Biological bases for the therapy of oncological and hematological diseases»,

Moscow, June 1–4, 2011 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

From edition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

PRESS RELEASE

Know and use: chelation therapy possibilities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я42

’2

01

1

ВведениеХронический лимфолейкоз (ХЛЛ) представляет

собой неуклонно прогрессирующее заболевание,

особенностью которого является накопление опухо-

левых лимфоцитов в костном мозге, крови и других

органах. Современные программы лечения ХЛЛ

включают в себя алкилирующие агенты, аналоги

пурина, моноклональные антитела и комбинирован-

ную химио- и иммунотерапию. Указанные типы ле-

чения характеризуются различной клинической эф-

фективностью. Так, флударабин (Ф), применяемый

в качестве первой линии терапии у больных ХЛЛ, да-

ет 63 % объективных ответов (ОО), из них 20 % пол-

ных ремиссий (ПР). При сравнении его действия

с хлорамбуцилом (Хлб) выявлено, что Хлб дает 37 %

ОО и 4 % ПР [1]. Изучение эффективности Ф по срав-

нению с программами СНОР, САР также показало

лучший ответ при его использовании, но при этом не

было увеличения общей выживаемости больных [2].

Комбинация Ф и циклофосфамида (Ц) — ФЦ (FC)

оказалась эффективней монотерапии Ф, при ее ис-

пользовании было достигнуто 38 % ПР против 15 %

[3]. Добавление ритуксимаба (Р) к комбинации ФЦ

в качестве первой линии терапии увеличило число

ПР с 23 % до 44 %, а число ОО — с 85 % до 92 % [4].

Использование алемтузумаба (А) — Кэмпаса, явля-

ющегося рекомбинантным гуманизированным анти-

Лечение резистентных больных хроническим лимфолейкозом программами, включающими алемтузумаб

в виде монотерапии или в сочетании с флударабином

Е.В. Катаева, А.К. Голенков, Е.В. Трифонова, Г.А. Дудина, Т.А. Митина, Л.Л. Высоцкая,Т.Д. Луцкая, И.В. Буравцова, Р.В. Горенков, Ю.Ю. Чуксина, В.В. Яздовский

ГУ Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского, МоскваГУ Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского, Москва

Контакты: Елена Васильевна Катаева [email protected]

В настоящем исследовании изучены непосредственные и отдаленные результаты лечения 14 резистентных больных хрониче-

ским лимфолейкозом (ХЛЛ) программами, включающими алемтузумаб в виде монотерапии и в сочетании с флударабином.

Ключевые слова: хронический лимфолейкоз, резистентные больные, алемтузумаб, флударабин

Treatment of patients with refractory chronic lymphocytic leukemia with alemtuzumab,Treatment of patients with refractory chronic lymphocytic leukemia with alemtuzumab,alone or in combination with fludarabinealone or in combination with fludarabine

E.V. Kataeva, A.K. Golenkov, E.V. Trifonova, G.A. Dudina, T.A. Mitina, L.L. Vysotskaya, T.D. Lutskaya, I.V. Buravtsova, E.V. Kataeva, A.K. Golenkov, E.V. Trifonova, G.A. Dudina, T.A. Mitina, L.L. Vysotskaya, T.D. Lutskaya, I.V. Buravtsova, R.V. Gorenkov, Yu.Yu. Chuksina, V.V. YazdovskiyR.V. Gorenkov, Yu.Yu. Chuksina, V.V. Yazdovskiy

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute, MoscowM.F. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute, Moscow

In present study the immediate and long-term therapy results of 14 patients with refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL) are In present study the immediate and long-term therapy results of 14 patients with refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL) are

analyzed. Treatment program included alemtuzumab alone or in combination with fludarabine.analyzed. Treatment program included alemtuzumab alone or in combination with fludarabine.

Key words: chronic lymphocytic leukemia, resistant patients, alemtuzumab, fludarabine

телом против антигена CD52, в программах монотера-

пии первой линии ХЛЛ показало его высокую эффек-

тивность. По-видимому, это связано с тем, что CD52

в большом количестве (более 500 тыс. антигенов) пред-

ставлены на поверхности опухолевых клеток ХЛЛ.

Полный ответ среди первичных больных ХЛЛ был до-

стигнут у 24 %, а ОО — у 83% больных [5]. Результаты

клинических исследований показали, что в настоящее

время имеется широкий спектр противоопухолевых

препаратов, которые применяются для лечения ХЛЛ.

Очевидно, что классические алкилирующие препара-

ты менее эффективны, чем аналоги пурина или моно-

клональные антитела. Более эффективной является

комбинация ФЦ. Усиление клинического эффекта

происходит при добавлении к этой комбинации ритук-

симаба — ФЦР (FCR). Однако при выборе терапии

в конкретных клинических случаях следует учитывать

не только противоопухолевую эффективность препа-

ратов, но и профиль их токсичности, особенности те-

чения болезни, коморбидность и другие факторы.

В этих случаях оптимальными могут быть также про-

граммы на основе классических алкилирующих

препаратов. В одной из первых работ, касающихся кли-

нического применения А при ХЛЛ, была показана его

эффективность в комбинации с Ф [6]. У рефрактерных

больных ХЛЛ комбинация АФ была эффективна в 83 %

случаев, среди которых ПР была достигнута в 30 % [7].

Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 5

2’

20

11Таким образом, проведенный анализ показал,

что наибольшим клиническим эффектом при лече-

нии ХЛЛ обладает комбинация ФЦР. Пока еще нет

достаточных оснований определить точное место А

среди других химиотерапевтических программ.

В связи с этим целью настоящей работы было из-

учение клинической эффективности А в монорежи-

ме и в комбинации с Ф (АФ или FluCam) при рези-

стентном и рецидивном ХЛЛ.

Материалы и методыВ данное исследование было включено 14 боль-

ных, резистентных к проводимой ранее химиотера-

пии (ХТ): 7 мужчин и 7 женщин. Стадию болезни

определяли по системе Rai. Диагноз подтвержден

цитологическим исследованием костного мозга.

При проведении иммунофенотипирования перифе-

рической крови с широкой панелью моноклональ-

ных антител выявлена экспрессия СD5+/CD23+/

CD19+/CD20+. Также оценивался уровень экспрес-

сии прогностического антигена СD38+, повышение

этого показателя > 20 % считалось позитивным

и указывало на неблагоприятный прогноз.

Определение делеции короткого плеча 17-й хро-

мосомы (del(17p)) проводилось FISH-методом у 9

больных. Для уточнения зон поражения лимфатиче-

ских узлов применялись методы лучевой диагности-

ки (рентгенография, ультразвуковое исследование,

компьютерная томография).

В монорежиме А получали 5 (35,7 %) больных по-

сле предварительной эскалации дозы 3–10–30 мг

п/к по 30 мг 3 раза в нед в течение 2–16 нед. Двум

больным терапия А продолжалась от 2 до 4 нед, затем

лечение было прекращено в связи с прогрессией за-

болевания. У 3 пациентов длительность иммунотера-

пии составила 10, 13 и 19 нед соответственно.

Курс АФ проведен 9 больным (64,3 %). После

предварительной эскалации дозы А назначали по 30

мг 3 дня п/к, Ф — по 25 мг/м2 3 дня внутрь. Шести па-

циентам было проведено 4 курса, 3 больным — от 5

до 8 курсов. Межкурсовой интервал составил 28

дней. Всем больным проводилось исследование сы-

воротки крови на цитомегаловирусную инфекцию

(ЦМВ) методом полимеразной цепной реакции

(ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) до на-

чала лечения и каждые 2 нед при монотерапии А,

перед каждым курсом АФ и при возникновении ли-

хорадки. Также проводилась профилактика пневмо-

цистной пневмонии бисептолом 960 мг/сутки и аци-

кловиром 1200 мг/сутки.

Эффективность лечения оценивали по обнов-

ленным международным критериям 2008 г. [8] как

ПР, частичную ремиссию (ЧР), стабилизацию (СБ)

и прогрессирование заболевания (ПБ).

Расчет показателей общей выживаемости (ОВ)

проводился с помощью метода Каплана–Майера.

РезультатыПод нашим наблюдением находилось 14 больных

(табл. 1) в возрасте от 46 до 74 лет, средний возраст со-

ставил 60,6 года, из них 5 пациентов были старше 65

лет (35,7 %). У большей части больных — 9 (64,3 %) —

была II стадия заболевания, III стадия — у 1 (7 %), IV

стадия — у 4 (28,6 %) пациентов. Делеция 17р выявле-

на у 5 из 9 обследованных пациентов (56 %), а высо-

кий уровень экспрессии CD38+ определялся у 8 из 12

(67 %) больных.

Характеристика предшествующей терапии рези-

стентных больных представлена в табл. 2, из которой

видно, что 3 пациента получали Хлб, 1 больной —

преднизолон, монотерапия Ф проводилась 2 боль-

ным, курсы СОР — 3 больным, СНОР — 1, RFC — 2,

n Возраст М:Ж Стадия по Rai del(17р)(n = 9)

CD38+ позитивные пациенты (n = 12)

1446–74 (Ме 60,6) года

Из них > 65 – 35,7 %1:1

II стадия – 9 (64,3 %) больных III стадия – 1 (7 %) больной

IV стадия – 4 (28,6 %) больных 5/9 (56 %) 8/12

(67 %)

Таблица 1. Характеристика резистентных больных ХЛЛ (n = 14)

Препаратыи комбинации

Число больных,получивших данный вид ХТ

Время предлеченности(мес)

Количествокурсов

Количестволиний ХТ

Хлорамбуцил 3

3–37 (11) 3–14 (7) 1–3 (1,93)

Преднизолон 1СОР 3СНОР 1

FC 12F 2

RFC 2R-CHOP 1

Таблица 2. Предшествующая терапия резистентных больных ХЛЛ (n = 14)


’2

01

1 R-CHOP — 1 пациенту. Большей части больных — 12

(86 %) — на предыдущем этапе проводилась терапия

программой FC. Медиана (Ме) предлеченности со-

ставила 11 (3–37) мес. В среднем было проведено 7

(3–14) курсов. Количество предшествующих линий

ХТ составило от 1 до 3 (1,93).

Как видно из табл. 3, при суммарной оценке эф-

фективности лечения программами, включающими

А в виде монотерапии и АФ, было установлено, что

общее число ответивших больных было 10 (71,4 %).

При этом 3 (21,4 %) больных достигли ПР, 7 больных

(50 %) — ЧР. В группе ПР 2 из 3 больных проведено

FISH-исследование, которое в обоих случаях выяви-

ло del(17p), а 1 больной из 3 был СD38-позитивный.

Одному больному проведена монотерапия Кэмпа-

сом, двум другим было проведено 5 и 8 курсов АФ.

В группе ЧР из 7 пациентов 4 проведен FISH-анализ,

который выявил del(17p) у 2 больных, а 4 из 6 были

CD38-позитивны. Двум больным проводилась мо-

нотерапия А в течение 10 и 16 нед, 5 пациентам про-

ведено по 5 курсов АФ.

Нежелательное явление N (%)

Нейтропения* 4 (28,6)

Тромбоцитопения* 2 (14,3)

Анемия* 2 (14,3)

АИГА 2 (14,3)

Реактивация ЦМВ 1 (7)

Пневмония: 4 ( 28,6)

в том числе грибковая 1 (7)

Диспепсические явления 1 (7)

Кожные реакции 2 (14,3)

Таблица 4. Развитие нежелательных явлений при лечении А и АФ

больных ХЛЛ (n=14)

*Гематологическая токсичность III–IV степени.

Общая выживаемость больных ХЛЛ на терапии А и АФ (n = 14)

1

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

N = 14; Ме = 72 мес

4020 60 80 100 120

Ответ на ХТ ПР ЧР СБ ПБ

n = 14 3/21,4 % 7/50 % 2/14,3 % 2/14,3 %

del(17p) 2/2 2/4 0/2 1/1

CD38+ 1/3 4/6 2/2 1/1

Таблица 3. Эффективность терапии А и АФ у резистентных

больных ХЛЛ

Таким образом, среди ответивших на терапию

у 67 % (4/6) обследованных была выявлена del(17p)

и 56 % (5/9) были СD38-позитивны. У 2 (14,3 %)

больных наблюдалась СБ, ни у одного из обследо-

ванных методом FISH del(17p) не была определена,

оба были СD38-позитивны. У 2 (14,3 %) пациентов

быстро наступила прогрессия заболевания (через 2

и 4 нед монотерапии Кэмпасом). При этом FISH-

исследование, проведенное у 1 из 2 пациентов, выя-

вило del(17p); уровень CD38+ был высоким у одного

из 2 обследованных.

Следует отметить, что лечение А и АФ сопрово-

ждалось выраженными нежелательными явлениями

(табл. 4). Гематологическая токсичность III и IV сте-

пени выявлена у 8 из 14 (57 %) больных. Развитие

нейтропении наблюдалось у 4 (28,6 %), тромбоцито-

пении у 2 (14,3 %), анемии у 2 (14,3%) пациентов.

Реа ктивация ЦМВ имела место у одного больного

и была купирована назначением ганцикловира,

ауто иммунная гемолитическая анемия (АИГА) на-

блюдалась у 2 (14,3 %) пациентов в середине лечения.

Иммунотерапия осложнилась пневмонией у 4 (28,6 %)

больных, у 1 (7 %) пациента — грибковой. Кожные

реакции наблюдались у 2 (14,3 %) больных и не по-

требовали никаких назначений. Выявленные у 1

(7 %) пациента диспепсические явления были купи-

рованы назначением ферментных препаратов и Н2-

гистаминоблокаторов.

При анализе данных общей выживаемости (рис.)

у резистентных больных ХЛЛ установлено, что Ме

составила 72 мес.

ОбсуждениеТаким образом, проведенное исследование пока-

зало, что А в режиме монотерапии или в комбинации

с Ф — программа АФ — обладает высокой противо-

опухолевой активностью у больных с резистентными

и рецидивными формами ХЛЛ. Следует отметить,

что объективный противоопухолевый ответ (ПР

и ЧР) был получен у 71,4 % больных, включая ПР

в 21,4 % случаев. При изучении молекулярно-

биологических и иммунофенотипических рисков

неблагоприятного прогноза установлено, что среди

больных с объективным противоопухолевым отве-

том del(17p) выявлена в 67 % случаев, а повышенная

экспрессия CD38+ определена у 56 % больных. Это


2’

20

11свидетельствует о том, что программы монотерапии

А и АФ преодолевают резистентность, обусловлен-

ную этими серьезными негативными факторами

прогноза. Характеризуя резистентность у 14 пред-

ставленных больных ХЛЛ, следует подчеркнуть, что

ее тяжесть определяется не только медико-биоло-

гическими и иммунофенотипическими характери-

стиками, но и отсутствием ответа на адекватную

предшествующую терапию, в основном ФЦ.

Проведенный анализ осложнений, возникших

в процессе лечения, показал, что АФ и А обладают се-

рьезным токсическим воздействием на кроветворную

систему. Об этом свидетельствует высокий процент

(57 %) миелотоксических осложнений III–IV степени,

требующих в ряде случаев замещения компонентами

крови и введения гранулоцитарного колониестимули-

рующего фактора. Возникновение пневмоний у 28,6 %

больных в процессе лечения А и АФ свидетельствует

о выраженном иммуносупрессивном действии этих

программ. Лечение указанных осложнений потребова-

ло применения комбинированной антибактериальной

и противогрибковой терапии в сочетании с внутривен-

ными инфузиями человеческого иммуноглобулина.

Проведенное исследование делает оправданным на-

значение с профилактической целью в периоде лече-

ния и в последующие 4 мес после его окончания аци-

кловира и бисептола.

Анализ отдаленных результатов оценивали по

ОВ. Среди наблюдавшихся 14 больных за 3-летний

период живы 8 человек, 6 больных погибло: 2 паци-

ента, находясь в ремиссии ХЛЛ, погибли от второй

опухоли; 2 — от прогрессии заболевания; у 1 пациен-

та развилась фатальная грибковая пневмония;

1 больная умерла от сердечной недостаточности. Ме

выживаемости составила 72 мес от начала лечения,

включая предшествующую терапию. Так как Ме

предлеченности была 11 мес, Ме ОВ на терапии А

и АФ составила 61 мес. Ме наблюдения за больными

равна 18 мес.

Полученные нами результаты являются суще-

ственным прогрессом в лечении резистентных форм

ХЛЛ с использованием программ, включающих

алемтузумаб в виде монотерапии или в сочетании

с флударабином.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Rai K.R., Peterson B.L., Appelbaum F.R.

et al. Fludarabine compared with chlorambucil

as primary therapy for chronic lymphocytic

leukemia. N Engl J Med 2000;343:1750–7.

2. Leporrior M., Chevret S., Cazin B. et al.

Randomized comparison of fludarabin, CAP

and CHOP in 938 previously untreatedstage B

and C chronic lymphocytic leukemia patients.

Blood 2001;98(23):2319–25.

3. Catovsky D., Richard S., Matutes E. et al.

Assesment of fludarabin plus cyclophosphamide

for patients with chronic lymphocytic leukemia.

Lancet 2007;270:230–9.

4. Hallek M., Fingerle-Rowson G., Fink A.M.

et al. Immunochemotherapy with

fludarabine (F), cyclophosphamide (C) and

rituximab (R) (FCR) versus fludarabine and

cyclophosphamide (FC) impruves responses

rates and progression-freesurvival (PFS) of

previously untreated patients with advanced

chronic lymphocytic leukemia. Blood

2008;112:325.

5. Hillmen P., Skotnicki A.B., Robak T. et al.

Alemtuzumab compared with chlorambucil

as fist-line therapy for chronic lymphocytic

leukemia. J Clin Oncol 2007;2:5616–23.

6. Kennedy B., Raustron A., Carter C. et al.

Campath-1H and fludarabine in combination

are highly active in refractory chronic

lymphocytic leukemia. Blood 2002;99:2245–7.

7. Elter T., Borchmann P., Schultz H.

et al. Fludarabine in combination with

alemtuzumab is effective and feasible

in patients with relapsed or refractory

B-cell chronic lymphocytic leukemia:

result of a phase II trial. J Clin Oncol

2005;23:7024–31.

8. Hallek M., Cheson B.D., Catovsky D.

et al. Guidelines for the diagnosis and

treatment of chronic lymphocytic leukemia:

a report from the Internaional Workshop

on Chronic Lymphocytic Leukemia

updating the National Cancer Institute-

Working Group 1996 guidelines. Blood

2008;111:5446–56.


’2

01

1

В настоящее время сохраняется тенденция к увеличе-

нию заболеваемости злокачественными новообразова-

ниями. Не последнее место в структуре онкологической

заболеваемости занимают опухоли кроветворной систе-

мы, в их числе неходжкинские лимфомы (НХЛ). Ежегод-

но в России данной патологией заболевают более 10 тыс.

человек. Наиболее распространенной среди всех НХЛ яв-

ляется крупноклеточная лимфома (31 %), далее следует

фолликулярная лимфома (22 %), остальные типы лим-

фом встречаются с частотой менее 10 % [1].

НХЛ являются гетерогенной группой лимфопро-

лиферативных заболеваний, отличающихся по

морфологическим вариантам, биологическим харак-

теристикам (цитогенетике, экспрессии генов и он-

копротеинов), иммунофенотипу, степени агрессив-

ности и другим особенностям клинического течения.

Выбор тактики терапии зависит от иммунофенотипа

(В-клеточный или Т-клеточный), морфологическо-

го варианта, агрессивности течения (индолентные

Опыт применения ритуксимаба при рецидивах неходжкинских лимфом у больных пожилого возраста

в Орловской области

Р.А. Голубенко1,2, Г.Б. Громов3, В.И. Вишневский1

1Кафедра внутренних болезней медицинского института ГОУ ВПО Орловский государственный университет;Кафедра внутренних болезней медицинского института ГОУ ВПО Орловский государственный университет;2Орловская областная клиническая больница;Орловская областная клиническая больница;

3Кафедра хирургии медицинского института ГОУ ВПО Орловский государственный университетКафедра хирургии медицинского института ГОУ ВПО Орловский государственный университет

Контакты: Рамиля Ахметовна Голубенко [email protected]

В статье приведен анализ результатов лечения 10 больных (6 мужчин и 4 женщины), страдающих неходжкинской лимфомой.

Диагноз подтвержден в результате гистологического исследования с иммуногистохимией. Средний возраст пациентов соста-

вил 61,1 года.

Всем больным было проведено от 6 до 8 курсов полихимиотерапии и по 8 введений ритуксимаба, ни один больной не был снят

с лечения. Показано, что использование ритуксимаба в режиме с полихимиотерапией имело высокую результативность и было

успешным у 7 (70 %) из 10 больных. Основным ответом на терапию была высокая частота полных ремиссий — 40 %, незначи-

тельно превышающая частоту частичных ремиссий — 30 %. Ритуксимаб был успешно использован в лечении пожилых пациен-

тов без дополнительной токсичности, что делает возможным применение препарата в амбулаторных условиях.

Ключевые слова: неходжкинская лимфома, рецидив, ритуксимаб, пожилой возраст, полихимиотерапия

Experience of using rituximab for recurrent non-Hodgkin lymphoma in elderly patients of the Orel regionExperience of using rituximab for recurrent non-Hodgkin lymphoma in elderly patients of the Orel region

R.A. GolubenkoR.A. Golubenko1,21,2, G.B. Gromov, G.B. Gromov3, V.I. Vishnevskiy, V.I. Vishnevskiy1

1Internal medicine department, Medical Institute of Orel State University;Internal medicine department, Medical Institute of Orel State University;2Orel regional hospital; Orel regional hospital; 3Surgery department, Medical Institute of Orel State UniversitySurgery department, Medical Institute of Orel State University

This article summarizes the results of 10 patients (6 men and 4 women) with recurrent non-Hodgkin lymphoma treating with using of This article summarizes the results of 10 patients (6 men and 4 women) with recurrent non-Hodgkin lymphoma treating with using of

rituximab. The diagnosis was confirmed by histological examination with immunohistochemistry. The average patient age was 61.1 years.rituximab. The diagnosis was confirmed by histological examination with immunohistochemistry. The average patient age was 61.1 years.

All patients received from 6 to 8 chemotherapy courses and 8 rituximab injections, no one patient was withdrawn from therapy. Rituximab All patients received from 6 to 8 chemotherapy courses and 8 rituximab injections, no one patient was withdrawn from therapy. Rituximab

treatment in combination with chemotherapy was successful in 7 (70 %) of 10 patients. The major therapy response was a high frequency treatment in combination with chemotherapy was successful in 7 (70 %) of 10 patients. The major therapy response was a high frequency

of CR — 40 %, slightly exceeding the rate of PR — 30 %. Rituximab has been used successfully in the treatment of elderly patients without of CR — 40 %, slightly exceeding the rate of PR — 30 %. Rituximab has been used successfully in the treatment of elderly patients without

additional toxicity, which makes it possible to use the drug on an outpatient basis.additional toxicity, which makes it possible to use the drug on an outpatient basis.

Key words: non-Hodgkin’s lymphoma, relapse, rituximab, elderly, chemotherapy

и агрессивные НХЛ), степени распространенности

опухоли (стадия), наличия или отсутствия интокси-

кации (А и В симптомы), индивидуального прогно-

за, определяемого как степень риска по так называе-

мому международному прогностическому индексу

(IPI). Для выбора тактики лечения определяющим

служит иммунофенотип, характер и течение НХЛ —

индолентное, агрессивное и высокоагрессивное. Со-

временная классификация лимфом, принятая ВОЗ

[2], основывается не только на морфологических

критериях, но и учитывает, кроме иммунофенотипа,

молекулярно-биологические и клинические особен-

ности НХЛ.

Эта используемая в настоящее время повсемест-

но классификация в подробностях приведена в руко-

водствах и других материалах [3, 4]. Таким образом,

постановку диагноза опухоли лимфоидной ткани

следует основывать на гистологическом и иммуноги-

стохимическом исследовании биоптата, полученно-


2’

20

11го при инцизионной биопсии лимфатического узла.

Иммуногистохимическое исследование опухолей

лимфоидной ткани является методом выбора при

необходимости дифференциальной диагностики

опухолей с выраженным сходством гистологического

строения [5]. Отмечено, что различные типы лимфом

имеют неодинаковое происхождение и значительно

отличаются по своему клиническому поведению

и прогнозу. На выбор лечения также влияет объем

опухолевых поражений (более 5–10 см по наиболь-

шему диаметру и более 1/3 диаметра грудной клет-

ки — для медиастинальных масс), а также фактиче-

ски непредсказуемая до проведения начального этапа

лечения первичная или приобретенная рефрактер-

ность к «стандартной» для данного варианта НХЛ

химио- (ХТ) или лучевой терапии.

На прогнозе и, соответственно, принципах вы-

бора терапии сказываются также другие факторы ри-

ска, учитываемые в IPI, который был предложен

в 1993 г. [4]. На основании сочетания таких неблаго-

приятных факторов, как возраст > 60 лет, повышение

ЛДГ > нормы (обычно не менее чем в 2 раза), общий

статус > 1 (2–4) по шкале ECOG, стадия III/IV и чис-

ло экстранодальных поражений > 1, устанавливаются

4 группы по категориям риска: низкого (0–1 при-

знак), низкого промежуточного (2 признака), высо-

кого промежуточного (3 признака) и высокого (4–5

признаков), определяющие частоту ответа на лече-

ние, безрецидивную и общую 5-летнюю выживае-

мость [2]. Выбор лечения НХЛ требует многофактор-

ной оценки в каждой отдельной клинической

ситуации, тем не менее составление на основании

накопленного опыта общего алгоритма лечения ин-

долентных и агрессивных НХЛ возможно и должно

быть положено в основу терапевтических подходов.

Несмотря на все успехи и достижения многие во-

просы при выборе тактики лечения НХЛ все еще да-

леки от разрешения. Терапия рецидивов остается

одной из самых сложных проблем, так как рецидивы

развиваются после достижения полной ремиссии

(ПР) в результате адекватного лечения (ХТ) разных

вариантов индолентных, агрессивных и высоко-

агрессивных НХЛ. При этом продолжительность

безрецидивного периода варьирует от нескольких

месяцев до нескольких лет в зависимости от степени

злокачественности НХЛ и наличия неблагоприят-

ных прогностических факторов, в том числе показа-

телей IPI. К ранним рецидивам, имеющим самое не-

благоприятное течение, относят рецидивы,

возникающие в течение 6 мес от окончания лечения.

Для ранних рецидивов при НХЛ низкой степени зло-

качественности тактика лечения включает как ми-

нимум переход на стандартные режимы,

используемые при агрессивных лимфомах (напри-

мер, программы СОР или лейкерана, циклофосфана

и др. на СНОР или СНОР-подобные), а при отсут-

ствии ответа — альтернативные курсы комбиниро-

ванной ХТ с препаратами, обычно не используемы-

ми в первой линии, — митоксантроном, флудараби-

ном, этопозидом, цитарабином и аспарагиназой.

Подобные схемы или высокодозная ХТ показаны

при повторных быстровозникающих рецидивах, для

которых характерно постоянное снижение частоты

и полноты ответа. В поздних случаях при удовлетво-

рительных результатах — через 1 год и более после

окончания первичного лечения — можно повторить

использованную программу, как при индолентных,

так и при агрессивных лимфомах [6].

Рекомендации ESMO 2009 г. [7] предусматрива-

ют для больных с рецидивом В-крупноклеточной

лимфомы после антрациклинсодержащих программ

1-й линии проведение любого из химиотерапевтиче-

ских режимов «спасения» [5] с последующей высо-

кодозной ХТ и поддержкой кроветворения

стволовыми периферическими гемопоэтическими

клетками [2, 5].

Достижение лишь частичной ремиссии (ЧР)

в результате ХТ 1-й линии или отсутствие положи-

тельной динамики после первых курсов стандартной

терапии, в особенности при агрессивных НХЛ, вы-

сокочувствительных к цитостатикам, является при-

знаком высокого риска резистентного течения

опухоли и указывает на необходимость изменения

программы — либо на адекватные для агрессивных

лимфом (при индолентных формах), либо на упомя-

нутые выше альтернативные программы, в том числе

высокодозные (для агрессивных НХЛ). Первичная

резистентность к лечению, выражающаяся в про-

грессировании процесса уже в период его проведе-

ния или в отсутствии ответа, требует перехода на аль-

тернативные, в том числе высокодозные режимы ХТ,

конкретные методы которой, в том числе с транс-

плантацией гемопоэтических стволовых клеток,

подробно и в самых разных аспектах рассматривают-

ся в специальных руководствах [2]. Такая тактика

возможна у пациентов молодого возраста; у лиц по-

жилого и старческого возраста, ввиду значительно

большей выраженности у них токсических эффектов

стандартной ХТ и менее благоприятного прогноза,

вопросы терапии рецидивов остаются очень актуаль-

ными. В результате этого интерес к возможности ис-

пользовать эффективную противоопухолевую тера-

пию без увеличения токсичности у данной категории

пациентов чрезвычайно важен. Решение этой задачи

стало возможным благодаря внедрению в практику

принципиально новых препаратов таргетного дей-

ствия. Для В-клеточных CD20-позитивных НХЛ

это — ритуксимаб. Ритуксимаб представляет собой

химерические анти-СD20 моноклональные антите-

ла, обладающие способностью специфически связы-

ваться с трансмембранным антигеном CD20 нор-

мальных и злокачественных В-лимфоцитов,

индуцируя антителозависимую и комплемент-

зависимую цитотоксичность.


’2

01

1 Более 90 % В-клеточных НХЛ экспрессируют

СD20, который присутствует на нормальных и зло-

качественных pre-В и зрелых В-клетках, но не обна-

ружен на гемопоэтических стволовых клетках, pro-

В-клетках и нормальных плазматических клетках.

Основными и наиболее изученными показаниями

к использованию ритуксимаба являются НХЛ низ-

кой степени злокачественности.

Интересны сведения об использовании ритукси-

маба в сочетании с курсом CHOP — R-CHOP.

M. Czuczman показал реальный шанс повышения

эффективности до 100 % (HP — 63%, медиана HP —

20 мес) при использовании схемы R-CHOP в 1-й ли-

нии терапии фолликулярной НХЛ с неблагоприят-

ными факторами прогноза [8]. Но еще более впечат-

ляющими являются результаты исследования GELA,

наглядно демонстрирующие, что ритуксимаб пер-

спективен и для агрессивных НХЛ; добавление маб-

теры к схеме CHOP (в виде однократного введения

в стандартной дозе 375 мг/м2 при проведении каждо-

го курса) достоверно увеличивало эффективность

лечения НХЛ высокой степени злокачественности

у пожилых больных: сравнение схемы CHOP

и R-CHOP у 328 больных (более половины в возрас-

те > 70 лет) показало увеличение общей выживаемо-

сти до 82 % по сравнению с 66 %, а частоты ПР — до

76 % против 60 %. Расширение терапевтических воз-

можностей не сопровождалось увеличением леталь-

ности в группе R-CHOP (5 % по сравнению с 7 %) [8].

В Орловском онкологическом диспансере пре-

парат ритуксимаб применяется с 2003 г. В данное ис-

следование включена группа больных, у которых

развились рецидивы или имели место рефрактерные

формы НХЛ в период с 2008 по февраль 2010 г. В ана-

лиз вошли 10 больных (6 мужчин и 4 женщины).

Диа гноз НХЛ во всех случаях устанавливали на

основании гистологического исследования биоптата

опухолевой ткани с иммуногистотипированием. Ле-

чение проведено пациентам в возрасте от 51 до 71 го-

да (средний возраст 61,1 года). Длительность заболе-

вания колебалась от 13 мес до 10 лет; cреднее время

до лечения ритуксимабом составило 3 года 1 мес. За

этот период больные неоднократно получали раз-

личные виды ХТ в количестве от 1 до 8 (в среднем 3)

курсов. Таким образом, ритуксимаб был использо-

ван у больных, многократно леченных стандартной

ХТ (табл. 1). Большинство пациентов (90 %) были

в удовлетворительном состоянии и в соответствии

с IPI отнесены в группу низкого и низкого/промежу-

точного риска в связи с наличием одновременно не

более 2 неблагоприятных факторов прогноза.

У 9 пациентов на основании морфологических

данных и иммуногистотипирования подтвержден

диа гноз фолликулярной лимфомы, у 1 больного была

В-крупноклеточная лимфома. К моменту начала те-

рапии ритуксимабом у 8 из 10 больных процесс был

распространенным и соответствовал III–IV стадии.

Характеристика рецидивов представлена в табл. 2.

Две трети больных (70 %) получили ритуксимаб при

возникновении первого рецидива. По времени воз-

никновения более половины (60 %) составили позд-

ние рецидивы, которые констатированы спустя 6–12

мес (2 случая) или более 12 мес (4 наблюдения). Ран-

ний рецидив был отмечен у 1 больного, в большин-

стве случаев это является показанием к интенсифика-

ции лечения, которая влечет за собой значительное

увеличение токсичности.

Лечение ритуксимабом осуществляли с исполь-

зованием стандартной премедикации (парацетамол,

антигистаминные препараты). Ритуксимаб вводили

в дозировке 375 мг/м2 в первый день лечения каждо-

го из 8 циклов ХТ (в 7 случаях — флударабин, в 2 —

режим CHOP и в 1 — DHAP). Лечение повторяли

каждые 3 нед. Больные, у которых отмечена IV сте-

пень нейтропении или фебрильная нейтропения по-

сле какого-либо цикла ХТ, получали гранулоцитар-

Признак Число больных

Всего 10

Возраст:

младше 60 лет

старше 60 лет

5

5

Пол:

мужской

женский

6

4

IPI

низкий и промежуточный риск

высокий риск

9

1

Стадия

I–II

III–IV

2

8

Экстранодальные проявления 2

Первичная рефрактерность 1 (10 %)

Рецидивы:

ранние

поздние

4

6

Таблица 1. Характеристика больных

Рецидив Число больных

Первый 7 (70 %)

Второй 1

Третий 1

Четвертый 1

Ранний – ремиссия < 6 мес 1

Поздний – ремиссия > 6–12 мес 6

Резистентный 2

Всего 10

Таблица 2. Характеристика рецидивов


2’

20

11ный колониестимулирующий фактор. Если нейтро-

пения IV степени сохранялась на протяжении следу-

ющего цикла, дозы циклофосфамида и доксорубицина

сокращали на 50 %. Если перед началом запланиро-

ванного цикла количество нейтрофилов было ниже

1,5 109/л или уровень тромбоцитов был ниже

100 109/л, цикл откладывали на срок до 2 нед. Дозы

ритуксимаба не снижали и не изменяли. Лечение

также прекращали в тех случаях, когда лимфома про-

грессировала или пациент отказывался от продолже-

ния лечения, а также из соображений безопасности,

когда предполагалось развитие побочных реакций.

РезультатыВсем больным было проведено от 6 до 8 курсов

полихимиотерапии и по 8 введений ритуксимаба, ни

один больной не был снят с лечения. Результаты оце-

нены у всех 10 пациентов (табл. 3).

Использование ритуксимаба в режиме с полихи-

миотерапией имело высокую результативность и бы-

ло успешным у 7 (70 %) из 10 больных. При этом

основным ответом на терапию была высокая частота

ПР — 40 %, незначительно превышающая частоту

ЧР — 30 % (табл. 3).

Следует акцентировать внимание на том, что до-

стигнутый эффект был стойким: медиана продолжи-

тельности ПР составила 21,5 (13–40) мес, а ЧР —

больше года (13 (4–13) мес). Нам удалось достичь

полного эффекта в 1 случае при экстранодальной ло-

кализации опухоли (при обширном двустороннем

вовлечении легочной ткани). Наиболее чувствитель-

ными к терапии были лимфатические узлы незави-

симо от их расположения.

Прогрессирование было выявлено также в про-

цессе лечения у 2 (20 %) пациентов. Оно проявлялось

в виде продолжающегося роста пораженных лимфа-

тических узлов.

Добавление ритуксимаба к стандартной ХТ не

увеличило ее токсичности. Переносимость препара-

та была удовлетворительной. Побочные реакции бы-

ли отмечены у 8 (80 %) пациентов, они развились

Эффективность Частота, %

Общий эффект 70

ПР 40

ЧР 30

Стабилизация 10

Прогрессирование 20

Длительность ремиссии: ПР ЧР

1,5–40 мес + (медиана – 21,5 мес)1,5–13 мес + (медиана – 13 мес)

Таблица 3. Эффективность лечения рецидивов —

полихимиотерапия + ритуксимаб

у всех больных только в период первого введения

препарата, были преходящими, возникали чаще все-

го при быстром введении препарата — 100–150 мг/ч,

не требовали отмены лечения и легко купировались

при временном прекращении инфузий с введением

дексаметазона (8–12 мг) в/в, димедрола и анальгина,

что позволяло через 20–30 мин возобновить и закон-

чить введение мабтеры. Инфузии ритуксимаба пре-

кращали при повышении температуры тела, лихо-

радке, появлении отеков, понижении давления или

в любых других неблагоприятных случаях и возоб-

новляли, когда симптомы были купированы.

Таким образом, лечение ритуксимабом было эф-

фективно, безопасно, легко осуществимо. Считаем

возможным применять препарат в амбулаторной прак-

тике. Ритуксимаб эффективен при различных клини-

ческих проявлениях и разных морфологических вари-

антах зрелоклеточных НХЛ. Переносимость препарата

удовлетворительная. Ритуксимаб успешно использо-

вался нами в лечении пожилых пациентов без допол-

нительной токсичности, что делает возможным ис-

пользование препарата в амбулаторных условиях.

Препарат также входит в федеральную программу

«7 нозологий», что дополнительно гарантирует обеспе-

ченность ритуксимабом всего курса лечения.


1. Хансон К.П. , Имянитов Е.Н. Эпи-

демиология и биология неходжкин-

ских лимфом. Практическая онкология

2004;5(3):163–8.

2. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L.

et al. World Health Organization Classification

of Tumours of Hae matopoietic and Lymphoid

Tissues. Lyon: IARC, 2008.

3. Поддубная И.В. Неходжкинские лимфо-

мы. В кн.: Клиническая гематология: руко-

водство для врачей. Под ред. М.А. Волковой.

М: Медицина, 2001. С. 336–75.

4. Federico M., Bellei M., Marcheselli L. et al.

Follicular lymphoma international prognostic

index 2: a new prognostic index for follicular

lymphoma developed by the international

follicular lymphoma prognos tic factor project.

J Clin Oncol 2009;27:4555–62.

5. Мазуров В.И. , Криволапов Ю.А. Клас-

сификация лимфом. Морфология, им-

мунофенотип, молекулярная генетика

неходж кинских лимфом. Практическая

онкология 2004;5(3):169–75.

6. Cheson B.D., Pfistner B., Juweid M.E. et al.

Revised response criteria for malignant

lymphoma. J Clin Oncol 2007;25:1–8.

7. Клинические рекомендации ESMO по ди-

агностике, лечению и наблюдению при пер-

вично диагностированной крупноклеточ-

ной неходжкинской лимфоме. В кн.: Мини-

мальные клинические рекомендации Евро-

пейского общества медицинской онколо-

гии (ESMO). Ред. русского перевода проф.

С.А. Тюляндин, проф. Н.И. Переводчикова,

к.м.н. Д.А. Носов. М.: РОНЦ

им. Н.Н. Блохина РАМН, 2009. С. 141–50.

8. Руководство по химиотерапии опухоле-

вых заболеваний. Под ред. Н.И. Перевод-

чиковой. Москва, 2005.


’2

01

1

Лимфома Ходжкина (ЛХ) является одним из наи-

более часто возникающих злокачественных заболева-

ний лимфоидной ткани. В России ежегодно заболевает

около 3,2 тыс. молодых пациентов обоего пола [1].

В странах Европы и США показатель заболеваемости

составляет 4–6 и 2,8 на 100 тыс. населения соответ-

ственно [2, 3]. В настоящее время выделяют один воз-

растной пик заболеваемости ЛХ в возрасте 15–35 лет,

с максимумом показателя заболеваемости в 25 лет 2, 4.ЛХ занимает особое место в истории онкологии

и гематологии. В 1940-х годах ХХ века общая 5-лет-

няя выживаемость едва достигала 5 % [5]. Ситуация

кардинально изменилась в конце 70-х годов, когда

в клиническую практику стали внедряться новые

цитостатические препараты и ЛХ явилась первым

потенциально излечиваемым онкологическим забо-

леванием [6]. Создание и внедрение программного

подхода в детской онкологии за последние 20 лет су-

щественно улучшило исходы лечения для детей

и подростков с ЛХ. Оптимизация и стандартизация

Гонадотоксичность терапии лимфомы Ходжкинау подростков и молодых мужчин: актуальность проблемы

и пути решения (обзор литературы)

А.А. Винокуров1, С.Р. Варфоломеева1, Д.И. Тарусин2

1ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологииФГУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии

Минздравсоцразвития России, Москва;Минздравсоцразвития России, Москва;2Научно-практический центр детской и подростковой андрологии Департамента здравоохранения города МосквыНаучно-практический центр детской и подростковой андрологии Департамента здравоохранения города Москвы

Контакты: Алексей Алексеевич Винокуров [email protected]

В настоящее время лимфома Ходжкина (ЛХ) – одно из наиболее курабельных опухолевых заболеваний, при этом более полови-

ны заболевших являются лицами мужского пола в возрасте до 35 лет. Гонадотоксичность служит одним из наиболее частых

отдаленных последствий терапии ЛХ, что ассоциировано со значительным ухудшением качества жизни больных. В настоящей

статье обобщены данные о частоте встречаемости и факторах риска развития гонадотоксичности у лиц мужского пола с ЛХ.

Показано, что проведение химиотерапии с включением алкилирующих препаратов и лучевая терапия могут приводить к раз-

витию гонадотоксичности у значительного числа больных. Рассмотрены современные возможности проведения криоконсерва-

ции спермы до начала противоопухолевой терапии.

Ключевые слова: лимфома Ходжкина, алкилирующие препараты, гонадотоксичность, криоконсервация спермы

Gonadal toxicity of Hodgkin lymphoma treatment in adolescents and young males: issue relevance and ways of solve Gonadal toxicity of Hodgkin lymphoma treatment in adolescents and young males: issue relevance and ways of solve (literature review)(literature review)

A.A. Vinokurov1, S.R. Varfolomeeva1, D.I. Tarusin2

1Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology;Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology;2Scientific and Practical Center of Children and Adolescents Andrology Moscow Department of Public Health, MoscowScientific and Practical Center of Children and Adolescents Andrology Moscow Department of Public Health, Moscow

Hodgkin`s Lymphoma (HL) is one of the most curable cancer disease. A half of all patients are young males under 35 years old. Gonadal Hodgkin`s Lymphoma (HL) is one of the most curable cancer disease. A half of all patients are young males under 35 years old. Gonadal

toxicity is one of the most frequent late effects of HL therapy and associated with significant decrease in patient’s quality of life. In present toxicity is one of the most frequent late effects of HL therapy and associated with significant decrease in patient’s quality of life. In present

article frequency and risk factors of gonadal toxicity in males with HL were summarized. It was shown that chemotherapy with alkylating article frequency and risk factors of gonadal toxicity in males with HL were summarized. It was shown that chemotherapy with alkylating

agents and radiotherapy may lead to gonadal toxicity in significant number of patients. Current possibilities of semen cryopreservation before agents and radiotherapy may lead to gonadal toxicity in significant number of patients. Current possibilities of semen cryopreservation before

start of the treatment are discussed. start of the treatment are discussed.

Key words: Hodgkin lymphoma, alkylate drugs, gonadal toxicity, semen cryopreservation

химиолучевого лечения, широкое использование

в клинической практике современных методов диа-

гностики, таких как компьютерная томография (КТ)

и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), по-

зволили повысить 5-летнюю выживаемость у под-

ростков и взрослых с ЛХ до 70–90 %, а также повы-

сить 20-летнюю безрецидивную выживаемость до

60 % [2, 7–9]. Но, несмотря на это лечение, ЛХ про-

должает оставаться токсичным и сопровождается

возникновением отсроченных побочных эффектов,

таких как вторые злокачественные новообразования

(ЗН) — лейкозы, неходжкинские лимфомы, солид-

ные опухоли (рак щитовидной железы); дисфункция

половых желез (дисспермии, азооспермии, гипоан-

дрогенемия); кардиотоксические проявления (бес-

симптомные перикардиты, миокардиты, инфаркты

миокарда); легочная токсичность (острые лучевые

пульмониты, хронические рестриктивные фибро-

зы); дисфункция щитовидной железы (гипотирео-

идизм); нарушения иммунной системы и связанные


2’

20

11с этим инфекционные осложнения (опоясывающий

лишай, инвазивные бактериальные инфекции, пнев-

моцистная пневмония, токсоплазмоз) и пр. [2, 8,

10–14].

Одной из значимых проблем, заслуживающих осо-

бого внимания, является высокая токсичность лечения

для органов репродуктивной системы (гонадотоксич-

ность). При этом следует отметить, что проблема гона-

дотоксичности у больных с ЛХ может развиваться как

у лиц женского, так и мужского пола.

Говоря о гонадотоксичности у лиц мужского пола

с ЛХ необходимо представлять основные этапы спер-

матогенеза, а также механизмы его регуляции.

Сперматогенез начинается с деления стволовых

клеток и заканчивается образованием зрелых спермато-

зоидов. В семенном канальце различные зародышевые

клетки группируются в соответствии со стадиями свое-

го созревания (стадиями сперматогенеза). Весь процесс

сперматогенеза разделен на 3 фазы.

1. Митотическая пролиферация и дифференци-

ровка зародышевых клеток (сперматогоний).

2. Мейотическое деление зародышевых клеток

(сперматоцитов).

3. Трансформация зародышевых клеток (сперма-

тид) в зрелые сперматозоиды (спермиогенез).

Среди сперматогоний различают клетки А-

и В-типа. Клетки А-типа разделяются на 2 вида: Ат

(темные сперматогонии) и Аб (бледные сперматого-

нии). Ат-клетки в нормальных условиях лишены про-

лиферативной активности и поэтому могут считаться

стволовыми клетками сперматогенеза. Но при резком

уменьшении общего количества сперматогоний, на-

пример вследствие облучения, в Ат-клетках начинают-

ся митозы. В отличие от них, Аб-сперматогонии делят-

ся, и каждый из них превращается в 2 В-сперматогонии.

Материнские и дочерние клетки сохраняют между со-

бой тесный контакт с помощью межклеточных мости-

ков. Тетраплоидные зародышевые клетки (спермато-

циты) проходят различные фазы мейоза и в результате

образуются гаплоидные зародышевые клетки — спер-

матиды. Сперматиды — круглые митотически

неактивные клетки, превращающиеся в результате

трансформации в дифференцированные удлиненные

сперматиды и сперматозоиды. Эти процессы включа-

ют конденсацию и структурное оформление клеточного

ядра, появление жгутика и освобождение от большей

части цитоплазмы. Выход сперматозоидов в просвет

канальца называют спермиацией. На процесс сперми-

ации оказывают особое влияние гормоны, температура

и токсины. Общая продолжительность дифференци-

ровки сперматогоний типа А в зрелые сперматозоиды

у человека составляет не менее 64 суток.

Продукция андрогенов и развитие сперматозои-

дов регулируются гипоталамусом и гипофизом по

механизму обратной связи. Ключевая роль в сперма-

тогенезе принадлежит лютеинизирующему (ЛГ)

и фолликулостимулирующему гормону (ФСГ), син-

тез и секреция которых находятся под контролем ги-

поталамического гонадотропин-рилизинг гормона

(ГнРГ). Под влиянием ЛГ клетки Лейдига, располо-

женные между семенными канальцами, синтезируют

и секретируют тестостерон. Тестостерон стимулиру-

ет созревание зародышевых клеток в семенных ка-

нальцах. ФСГ непосредственно действует на семен-

ные канальцы. В зародышевом эпителии рецепторы

тестостерона и ФСГ присутствуют только в клетках

Сертоли. Поэтому считается, что трофическое влия-

ние тестостерона и ФСГ на сперматогенез осущест-

вляется через соматические клетки Сертоли. Яички

и гипоталамо-гипофизарная система взаимодей-

ствуют с помощью стероидных и белковых гормо-

нов. Тестостерон ингибирует секрецию ГнРГ и гона-

дотропинов (ЛГ и ФСГ). Ингибин В и фоллистатин

избирательно подавляют секрецию ФСГ гипофизом,

тогда как активин стимулирует этот процесс. Поми-

мо влияния на сперматогенез тестостерон играет

важную роль в процессах роста волос, костного мета-

болизма, формирования мышечной массы и появле-

ния вторичных половых признаков, равно как и в де-

ятельности мужских половых органов [15].

Чувствительность клеток Лейдига и клеток Сертоли

к токсическому воздействию различна, это определяет-

ся их митотической активностью. Клетки Сертоли ак-

тивно пролиферируют, поэтому химиопрепараты, про-

никшие через гемато-тестикулярный барьер, способны

оказывать значительное влияние на клетки Сертоли,

а также на рост и развитие сперматогоний. Обменные

процессы в клетках Лейдига менее интенсивны, это

снижает их восприимчивость к токсическому воздей-

ствию и позволяет сохранять жизнеспособность про-

должительное время. Принято считать, что клетки

Сертоли организуют процесс сперматогенеза простран-

ственно и функционально, но последн ие данные ука-

зывают на ро ль зародышевых клеток в регуляции

функции клеток Сертоли. Разрыв межклеточных взаи-

модействий сперматогоний и клеток Сертоли,

вызванный проводимым лечением, способен приво-

дить к необратимому нарушению сперматогенеза и воз-

никновению стерильности пациента [16].

Гибель клеток герминативного эпителия или их

значительное повреждение проявляется изменением

уровней основных половых гормонов в плазме крови

и наиболее часто сопровождается снижением секреции

ингибина В клетками Сертоли и значительным увели-

чением секреции ФСГ [17]. Например, после оконча-

ния терапии ЛХ по схеме МОРР (мустарген в/в 6 мг/м2,

винкристин в/в 2 мг — вводятся в 1-й и 8-й дни; прокар-

базин внутрь 100 мг/м2, преднизолон внутрь 40 мг/м2 —

вводятся с 1-х по 14-е сутки) или ChlVPP (хлорамбуцил

внутрь 6 мг/м2; прокарбазин внутрь 50 мг/м2; преднизо-

лон внутрь 40 мг/м2 с 1-х по 14-е сутки; винбластин в/в

6 мг/м2 в 1-е и 8-е сутки) увеличение уровня ФСГ отме-

чалось у 89 % и ЛГ — у 24 % пациентов [18, 19]. После те-

рапии по схеме ВЕАСОРР 14 (циклофосфан в/в


’2

01

1 650 мг/м2, доксорубицин в/в 25 мг/м2 — вводятся в 1-й

день; вепезид в/в 100 мг/м2 вводится с 1-го по 3-й дни;

натулан внутрь 100 мг/м2 с 1-го по 7-й дни; преднизолон

внутрь 40 мг/м2 с 1-го по 14-й дни; винкристин в/в 2 мг,

блеомицин в/в 10 мг/м2 — вводятся на 8-й день) увели-

чение уровня ФСГ и ЛГ отмечено у 93 % и 21 % пациен-

тов, снижение тестостерона у 57 % больных [20]. Стоит

отметить, что даже в подростковом возрасте снижение

тестостерона способно сопровождаться не только сни-

жением минерализации костной ткани, уменьшением

мышечной массы, но и ослаблением либидо, а в слу чаях

значительной гипотестостеронемии эректильной дис-

функцией. Поэтому существует мнение, что пациенты

с явлениями гипотестостеронемии на фоне увеличения

ЛГ нуждаются в проведении андрогензаместительной

терапии [21].

Как уже отмечалось выше, основными направле-

ниями лечения пациентов с ЛХ служат полихимио-

терапия (ХТ) и лучевая терапия (ЛТ). При этом каж-

дый из указанных методов может оказывать влияние

на гонады. Алкилирующие препараты, в настоящее

время широко использующиеся в онкологии, отно-

сятся к базисным препаратам в терапии ЛХ и явля-

ются неотъемлемой частью практически всех тера-

певтических схем, известных или применяемых на

сегодняшний день (см. табл.). Механизм их действия

основан на возможности встраивания в структуру

молекулы ДНК и индукции множественных

разрывов, приводящих к прекращению синтеза и ре-

пликации наследственного материала [22, 23]. Не-

классические алкилирующие препараты, такие как

дакарбазин и прокарбазин, превращаются из неак-

тивного соединения в активное непосредственно

внутри клетки. Например, прокарбазин трансфор-

мируется в печени в активное соединение, и его по-

следующее воздействие на быстро делящиеся клетки

реализуется образованием множественных однони-

тевых разрывов, фрагментацией ДНК, генотоксиче-

ским эффектом, накоплением нерепарируемых по-

вреждений, что в конечном счете приводит к индукции

апоптоза [24, 25].

Наряду с высокой терапевтической эффективно-

стью, алкилирующие препараты играют основную

роль в токсическом воздействии на гонады у лиц

мужского пола. В зависимости от кумулятивной до-

зы алкилирующего препарата выраженность гонадо-

токсичности может различаться. Так, циклофосфа-

мид в кумулятивной дозе, не превышающей 400 мг/кг,

Схемы Препараты Доза мг/м2 День введения

ABVD Доксорубицин 25 в/в 1-й и 14-й

Блеомицин 10 в/в 1-й и 14-й

Винбластин 6 в/в 1-й и 14-й

Дакарбазин* 375 в/в 1-й и 14-й. Цикл возобновляют на 28-й день

МОРР Мустарген* 6 в/в 1-й и 8-й

Онковин (винкристин) 1,4 в/в (не более 2 мг) 1-й и 8-й

Прокарбазин* 100 внутрь 1–14-й ежедневно

Преднизолон 40 внутрь 1–14-й ежедневно. Цикл возобновляют на 28-й день

COPP Циклофосфан* 650 в/в 1-й и 8-й

Онковин 6 в/в 1-й и 8-й

Прокарбазин* 100 в/в 1–14-й ежедневно


МОРР/ABVD Мустарген* 6 в/в 1-й и 8-й

Онковин (винкристин) 1,4 в/в (не более 2 мг) 1-й и 8-й


Доксорубицин 25 в/в 1-й и 15-й

Блеомицин 10 в/в 1-й и 15-й


Дакарбазин* 375 в/в 1-й и 15-й


Схемы ХТ лимфомы Ходжкина 1-й линии [69]


2’

20

11

ВЕАСОРР

стандартный

(эскалирован-

ный – дозы

в скобках)

Циклофосфан* 650 (1250) 1-й

Доксорубицин 25 (35) в/в 1-й

Этопозид 100 (200) внутрь 1–3-й

Прокарбазин* 100 внутрь 1–7-й

Преднизолон 40 внутрь 1–8-й

Онковин (винкристин) 1,4 в/в (не более 2 мг) 8-й

Блеомицин 10 в/в 8-й. Цикл возобновляют на 21-й день

ВЕАСОРР 14 Циклофосфан* 650 (1250) 1-й

Доксорубицин 25 (35) в/в 1-й

Этопозид 100 (200) внутрь 1–3-й

Прокарбазин* 100 внутрь 1–7-й

Преднизолон 40 внутрь 1–8-й

Онковин (винкристин) 1,4 в/в (не более 2 мг) 8-й

Блеомицин 10 в/в 8-й. Цикл возобновляют на 15-й день

Stanford V Мустарген* 6 в/в 1, 29, 57-й

Доксорубицин 25 в/в 1, 15, 29, 43, 57, 71-й

Винбластин 6 в/в 1, 15, 29, 43, 57, 71-й

Онковин (винкристин) 1,4 в/в (не более 2 мг) 8, 22, 36, 50, 64, 78-й

Блеомицин 5 в/в 8, 22, 36, 50, 64, 78-й

Этопозид 60 в/в 22–23-й, 50–51-й, 71–72-й

Преднизолон 40 внутрь 1–84-й ежедневно

Колониестимулирующие

факторы5 мкг/кг подкожно 3–13-й, 17–26-й, 31–41-й, 45–54-й, 59–69-й, 73–82-й

ChlVPP Хлорбутин* 6 в/в (не > 10) 1–14-й ежедневно




CVPP Циклофосфан* 650 в/в 1-й и 8-й




VAPEC-B Онковин (винкристин) 1,4 в/в (не более 2 мг) 8-й, 22-й

Доксорубицин 35 в/в 1-й, 15-й

Преднизолон 40 внутрь 1–28-й ежедневно

Этопозид 100 внутрь 15-20-й ежедневно

Циклофосфан* 350 в/в 1-й

Блеомицин 10 в/в 8-й, 22-й

* — алкилирующие препараты.


’2

01

1 вызывает дисфункцию гонад у 10 % пациентов, тогда

как в дозе, превышающей 400 мг/кг, препарат спосо-

бен индуцировать значительные расстройства спер-

матогенеза у 30 % подростков в препубертатном пе-

риоде и у 68–95 % пациентов старшего возраста [26].

Эти данные подтверждаются множеством исследо-

ваний, оценивающих гонадотоксичность различных

химиотерапевтических протоколов. Так, например,

после терапии по схеме МОРР у 26 из 47 обследован-

ных пациентов азооспермия сохранялась через 12 лет

после окончания лечения. У большинства пациентов

лечение схемами ОРРА/СОРР также приводило

к стерильности [27]. Терапия 6–8 циклами ChlVPP

или СОРР стерилизует 99–100 % излеченных паци-

ентов на длительный срок [18, 19, 28].

Особую роль в терапии ЛХ занимают высокодоз-

ные схемы лечения, используемые при распространен-

ных стадиях заболевания. Так, например, после терапии

схемой ВЕАСОРР Base азооспермия отмечена у 93 %,

а после ВЕАСОРР Esc — у 87 % пациентов. Стоит отме-

тить, что исследования, проводимые после лечения

с целью прогностической оценки вероятности азоо-

спермии, не увенчались успехом и до сих пор однознач-

ного ответа на этот вопрос не получено [20].

Интересным вопросом является длительность про-

явлений гонадотоксичности у больных, получивших

терапию ЛХ, а также возможность восстановления

сперматогенеза, описанная у ряда больных. В цитируе-

мом выше исследовании у больных, которым проводи-

лась терапия по схеме МОРР, в 14 % случаев признаки

восстановления сперматогенеза наблюдались в интер-

вале от 1,5 до 5 лет, в других случаях частичное восста-

новление сперматогенеза определялось позднее 10 лет

от окончания терапии [29]. Терапия 6–8 циклами

ChlVPP или СОРР также приводит к длительным нару-

шениям сперматогенеза, даже спустя 10 лет после

окончания терапии признаки восстановления сперма-

тогенеза наблюдаются не у всех пациентов [18, 19, 28].

После терапии по схеме ABVD у большинства пациен-

тов восстановление с возвращением к исходным пока-

зателям сперматогенеза наблюдалось через 12–18 мес

[17, 30–33]. Предполагается, что способность к восста-

новлению сперматогенеза соотносится с возрастом

и количеством уцелевших стволовых клеток спермато-

генеза [34].

Нарушения сперматогенеза могут возникать как

при направленном, так и при рассеянном облучении,

исходящем от затронутых основным патологическим

процессом тканей. Например, при ЛТ брюшной поло-

сти и малого таза рассеянная лучевая нагрузка на гона-

ды может достигать 1–2 % от общей дозы [13, 35]. Мор-

фологические нарушения и изменения концентрации

сперматозоидов выявляются при разовом облучении

гонад в дозах < 0,1 Гр, в интервале от 2 до 3 Гр отмечает-

ся значительное снижение количества сперматоцитов

и сперматид. Разовое лучевое воздействие в дозах от 4

до 6 Гр приводит к тотальной гибели сперматид, являясь

причиной необратимой азооспермии [36]. Отмечено,

что после разового облучения гонад в дозе < 1 Гр восста-

новление сперматогенеза с возвращением к исходным

показателям наблюдалось через 9–18 мес, после облу-

чения в интервале 2–3 Гр — через 30 мес и при дозе об-

лучения > 4 Гр — через 5 и более лет [37].

Фракционированное облучение (ФО) в дозах 1,4–

2,6 Гр индуцирует азооспермию в 100 % случаев без при-

знаков восстановления сперматогенеза через 17–43

мес. В редких случаях после облучения гонад в дозе 1,2

Гр сперматогенез может восстанавливаться [38]. Малые

дозы ФО (< 0,2 Гр) вызывают повышение уровня ФСГ

в сочетании с падением показателей сперматогенеза.

В дозах от 0,2 до 0,7 Гр ФО стимулирует транзиторную

элевацию уровня ФСГ, сочетающуюся со снижением

концентрации сперматозоидов на 1–2 года [39].

Значительная распространенность и актуальность

проблемы возникновения бесплодия у излеченных от

ЗН мужчин отчасти нашла свое решение в возможности

криоконсервации спермы (КС) до начала ХТ. Указан-

ная методика в настоящее время является единствен-

ным действенным методом сохранения фертильности

перед началом терапии [42, 43]. Вследствие своей вы-

сокой эффективности и надежности КС получила ши-

рокое распространение во всем мире [44–47]. Основой

технологии является использование криопротектора,

позволяющего сперматозоидам сохранить жизнеспо-

собность после замораживания и оттаивания. Боль-

шинство используемых в настоящее время криопро-

текторов сочетают в себе комбинации глицерина,

яичного желтка и буферных растворов. Впервые за-

щитные свойства глицерина были открыты в 1940 г.,

когда было установлено, что сперматозоиды живот-

ных, смешанные с глицерином и замороженные при

t = –79 °С, способны выживать после размораживания

[48–50]. Тогда же было выяснено, что криопротекторы

уменьшают образование кристаллического льда вну-

три клетки [51], а так как концентрация внутриклеточ-

ной воды в сперматозоиде равна приблизительно 50 %,

при замораживании не происходит полного разруше-

ния клеточного содержимого. В дальнейшем использо-

вание жидкого азота для проведения КС дало начало

развитию этой технологии в разных странах, в том

числе и в коммерческих целях [44–47]. Но даже ступен-

чатое замораживание в жидком азоте не исключает

возникновения повреждений после оттаивания, про-

являющихся гибелью как минимум 50 % сперматозои-

дов [48, 49]. Влияние КС на целостность хроматина

ядра сперматозоидов обсуждается [52, 53], но достовер-

но известно, что низкое качество хроматина спермато-

зоидов (фрагментация хроматина) после проведенной

ХТ сниж ает вероятность самостоятельного оплодотво-

рения [54]. Однако восстановление сперматогенеза по-

сле терапии ЛХ не исключает наступления беременно-

стей естественным путем [55–57].

В настоящее время исследуются альтернативные

способы КС (лиофилизация, витрификация) и их


2’

20

11

1. Семочкин С.В., Лория С.С., Румянцев А.Г.

и соавт. Лечение лимфомы Ходжкина у

подростков и молодых взрослых. Онкоге-

матология 2008;1–2:18–26.

2. De Vita V.T., Hellman S., Rosenberg S.A.,

eds. Cancer: Principles and Practice

of Oncology. Volume 2–6. Chapter 45.

Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers,

2001, p. 917.

3. Ries L.A.G., Miller B.A., Hankey B.F.,

National Cancer Institute. NIH Publication

Number 94, 1994, p. 2789.

4. Bleyer W.A., O’Learly M., Barr R. &

Ries L.A., eds. (2006). Cancer Epidemiology

in Older Adolescents and Young Adults 15–29

Years of Age, Including SEER Incidence and

Survival, 1975–2000. Oncologist;11:590–601.

5. Двойрин В.В., Аксель Е.М.,

Трапезников Н.Н. Статистика злокаче-

ственных новообразований в России и не-

которых других странах СНГ в 1994 г.

(в 2 ч.). М., 1995.

6. Armitage J.O. Early-stage Hodgkin’s

lymphoma. N Engl J Med 2010 Aug

12;363(7):653–62.

7. Hewitt M., Weiner S.L., Simone J.V.

Childhood Cancer survivorship: improving

care and quality of life: institute of Medicine.

Washington DC: The National Academy

Press;2003:20–36.

8. Bailliere’s Clinical Haematology. Int

Pract and Res. Hodgkin’s Disease/ V. Diehl.

London-Philadelphia-Sydney: Bailliere Tindal,

1996, p. 232.

9. Donaldson S.S., Link M.P. Combined modality

treatment with low-dose radiation and MOPP

chemotherapy for children with Hodgkin disease.

J Clin Oncology 1987;5:742–9.

10. Armitage J.O. Long-term toxicity of the

treatment of Hodgkin’s disease. Ann Oncol

1998;9(Suppl 5):133–6.

11. Swerdlov A.J., Barber J.A., Hudson G.V.

et al. J Clin Oncol 2000;18(3):498–508.

12. Meistrich M.L., Vassilopoulou-Sellin R.,

Lipshultz L.I. Adverse effects of treatment:

gonadal dysfunction. In: De Vita V.T.,

Hellman S., Rosenberg S.A., eds. Cancer:

principles and practice of oncology. ed. 7.

Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins,

2005, p. 2560–74.

13. Schrader M., Muller M., Straub B.,

Miller K. The impact of chemotherapy on

male fertility: a survey of the biologic basis and

clinical aspects. Reprod Toxicol 2001;15:611–7.

14. Myrehaug S., Pintilie M. et al.

A population-based study of cardiac morbidity

among Hodgkin lymphoma patients with

preexisting heart disease. Blood 2010 Sep

30;116(13):2237–40. Epub 2010 Jul 1.

15. Нишлаг Э., Бере Г. и др. Андрология.

М.: МИА, 2005. Стр. 35–39.

16. Нишлаг Э., Бере Г. и др. Андрология.

М.: МИА, 2005. Стр. 48–49.

17. Muller H.L., Klinkhammer-Schalkie M.

et al. Gonadal function of young adults after

therapy of malignancies during childhood or

adolescence. Eur J Pediatr 1996;155(9):763–9.

18. Thomson A.B., Critchley H.O.,

Kelnar C.J., Wallace W.H. (2002). Late

reproductive sequelae following treatment

of childhood cancer and options for fertility

preservation. Best Pract Res Clin Endocrinol

Metab 16:311–34.

19. Brougham M.F., Kelnar C.J., Sharpe

R.M., Wallace W.H. Male fertility following

childhood cancer: current concepts and future

therapies. Asian J Androl 2003 Dec;5(4):325–37.

20. Sieniawski M., Reineke T., Nogova L.,


возможности до конца не изучены [50, 51]. Оптими-

зация технологии КС будет способствовать сниже-

нию степени повреждений структур сперматозоидов

и наследственного материала, что позитивно ска-

жется на количестве жизнеспособных клеток после

оттаивания и позволит увеличить вероятность насту-

пления беременности [58].

Подготовка к КС требует 2–4 дня, что может по-

влечь за собой незначительную отсрочку в начале тера-

пии. Как правило, это связано с необходимостью по-

вторного сбора материала при его изначально низком

качестве [59]. Также стоит отметить, что дозревающие

сперматозоиды имеют низкую митотическую актив-

ность, что в исключительных случаях дает возможность

провести КС сразу после или через непродолжительное

время от начала ХТ.

Заготовленные образцы эякулята могут нахо-

диться в криобанке длительный период времени. Ча-

сто возникает вопрос о безопасности воздействия

низких температур на генетический материал и воз-

можность его последующего использования. Прове-

денные исследования показали, что даже продолжи-

тельное хранение (до 30 лет) [60, 61] не сказывается

на возможности зачатия [62–64].

Нельзя отрицать, что терапия ЗН может стать для

пациента травмирующим психологическим факто-

ром, тогда как своевременно проведенная КС дает

положительный психологический эффект, предо-

ставляя ему в дальнейшем возможность появления

потомства [65]. Кроме этого, проведенные опросы

показали, что более половины всех пациентов после

окончания лечения ЗН планируют рождение перво-

го или второго ребенка [66–68].

ЗаключениеЛХ — заболевание, наиболее часто возникающее

у пациентов репродуктивного возраста, среди которых

половина заболевших — мужчины до 35 лет. Несмотря

на достигнутые успехи в лечении, большинство исполь-

зующихся схем ХТ по-прежнему включают препараты,

применение которых сопряжено с выраженной гонадо-

токсичностью (алкилирующие препараты). Курабель-

ность ЛХ и возраст, в котором возникает заболевание,

делают особенно значимой возможность сохранения

фертильности среди пациентов этой группы. Однако

низкая информированность врачей и больных зачастую

исключает своевременное проведение КС. Следствием

этого являются серьезные нарушения или полная утра-

та сперматогенеза, что может негативно повлиять на

дальнейшую судьбу излеченных мужчин. С другой сто-

роны, не меньшим препятствием служит длительное

хранение образцов спермы (особенно подростков), тре-

бующее финансовых затрат, непосильных для некото-

рых пациентов.

Как уже было упомянуто, в некоторых случаях воз-

никшие после лечения расстройства эндокринной ре-

гуляции и функции органов репродуктивной системы

могут потребовать квалифицированной помощи врача-

эндокринолога или андролога. Поэтому наблюдение

и своевременное решение вопроса о необходимости

коррекций нарушений должны стать неотъемлемой ча-

стью дальнейшего контроля здоровья пациентов. Под-

водя итог, хотелось бы отметить, что успех лечения ЛХ

складывается не только из достижений ХТ и ЛТ, но так-

же и из показателей качества жизни излеченных паци-

ентов, где одну из важнейших ролей играет сохранение

фертильности.


’2

01

1 Josting A., Pfistner A., Diehl V., Engert A.

Fertility in male patients with advanced

HL treated with BEACOPP. Blood 2008

Jan 1;111(1):71–6.

21. Schwartz C.L., Hobbie W.L. et al. Survivors

of Childhood And Adolescent Cancer, ed 2.

Chapter 3, p. 17–34.

22. Vogel E.W., Nivard M.J. International

Commission for Protection Against

Environmental Mutagens and Carcinogens.

The subtlety of alkylating agents in reactions

with biological macromolecules. Mutat Res

1994 Feb 1;305(1):13–32.

23. Vogel E.W., Barbin A., Nivard M.J.,

Bartsch H. Nucleophilic selectivity of

alkylating agents and their hypermutability

in Drosophila as predictors of carcinogenic

potency in rodents. Carcinogenesis 1990

Dec;11(12):2211–7.

24. Ehrenberg L. Covalent binding of genotoxic

agents to proteins and nucleic acids. IARC Sci

Pub 1984;(59):107–14.

25. Angerer J., Ewers U., Wilhelm M. Human

biomonitoring: state of the art. Int J Hyg

Environ Health 2007 May;210(3–4):201–28.

26. Puscheck E., Philip P.A., Jeyendran R.S.

Male fertility preservation and cancer

treatment. Cancer Treat Rev 2004

Apr;30(2):173–80.

27. Hamilton V.M., Norris C., Bunin N.,

Goldwein J.W., Bunin G.R., Lange B.,

Meadows A.T. Cyclophosphamide-based,

seven-drug hybrid and low-dose involved field

radiation for the treatment of childhood and

adolescent Hodgkin disease. J Pediatr Hematol

Oncol 2001;23(2):84–8.

28. Thomson A.B., Critchley H.O.,

Kelnar C.J., Wallace W.H. Late reproductive

sequelae following treatment of childhood

cancer and options for fertility preservation.

Best Pract Res Clin Endocrinol Metab

2002;16:311–34.

29. Marmor D., Duyck F. Male reproductive

potential after MOPP therapy for Hodgkin’s

Disease. Andrologia 1995;27:99–106.

30. Viviani S., Ragini G., Santoro A. et al.

Testicular disfunction in Hodgkin’s disease

before and after treatment. Eur J Cancer

1991;27:1389–92.

31. Bonadonna G., Santoro A., Vivani S.,

Lombardi G., Ragini G. Gonadal Damage in

Hodgkin’s disease for cancer chemotherapeutic

regimens. Arch Toxicol 1984;1:140–5.

32. Tal R., Botchan A., Hauser R., Yogev L.,

Paz G., Yavevetz H. Follow-up sperm

concentration and motility in patients

with lymphoma. Hum Reprod 2000

Sep;15(9):1985–8.

33. Donaldson S.S., Hudson M.M.,

Lamborn K.R., Link M.P., Kun L.,

Billett A.L., Marcus K.C., Hurwitz C.A.,

Young J.A., Tarbell N.J., Weinstein H.J. VAMP

and low-dose, involved-field radiation for

children and adolescents with favorable, early-

stage Hodgkin’s disease: results of a prospective

clinical trial. J Clin Oncol 2002;20:3081–7.

34. Hansen P.V., Trykker H. et al. Long-term

recovery of spermatogenesis after radiotherapy

in patients with testicular cancer. Radiother

Oncol 1990;18:117–25.

35. Lee S.J., Schover L.R., Partridge A.H.

et al. American Society of Clinical Oncology

recommendations on fertility preservation in

cancer patients. J Clin Oncol 2006;24:2917–31.

36. Kinsella T.J., Trivette G. et al. Long-term

follow-up of testicular function following

radiation therapy for early-stage Hodgkin’s

disease. J Clin Oncol 1989;7:718–24.

37. Howell S.J., Shalett S.M.

Spermatogenesis After Cancer Treatment:

Damage and Recovery. J Natl Cancer Inst

Monogr 2005;34:12–7.

38. Hahn E.W., Feingold S.M., Nisce L.

Aspermia and recovery of spermatogenesis in

cancer patients following incidental gonadal

irradiation during treatment: a progress report.

Radiology 1976;119:223–5.

39. Kinsella T.J., Trivette G., Rowland J.,

Sorace R., Miller R., Fraass B. et al. Long-

term follow-up of testicular function following

radiation therapy for early-stage Hodgkin’s

disease. J Clin Oncol 1989;7:718–24.

40. Anserini P.C.S., Spinelli S., Costa M.,

Conte N., Copello F., Bacigalupo A.Т. Semen

analysis following allogeneic bone marrow

transplantation. Additional data for evidence-

based counselling. Bone Marrow Transplant

2002;30:447–51.

41. Socie G., Salooja N. et al. Nonmalignant

late effects aftеr allogenetic stem cell

transplantation. Blood 2003;101:3373–85.

42. Res U., Res P., Kastelic D., Stanovnik M.,

Kmetec A., Merlo A. Birth after treatment of

a male with seminoma and azoospermia with

cryopreserved-thawed testicular tissue. Hum

Reprod 2000 Apr;15(4):861–4.

43. Dohle G.R., Colpi G.M., Hargreave T.B.

et al. Guidelines on male infertility. Eur Urol

2005;48:703–11.

44. Perloff W.H. et al. Conception with human

spermatozoa frozen by nitrogen vapor technic.

Fertility and Sterility 1964;15:501–4.

45. David G. et al. The success of A.I.D. and

semen characteristics: study of 1489 cycles

and 192 ejaculates. International Journal of

Andrology1980;3:613–9.

46. Clarke G.N. et al. Artificial insemination

and in-vitro fertilization using donor

spermatozoa: a report on 15 years of

experience. Human Reproduction

1997;12:722–6.

47. Leibo S.P. et al. Cryopreservation of

human spermatozoa. In: Vayena E. et al.,

eds. Current practices and controversies in

assisted reproduction. Geneva, World Health

Organization, 2002, p. 152–65.

48. Keel B.A., Webster B.W. Semen

cryopreservation methodology and results.

In: Barratt C.L.R., Cooke I.D. (eds). Donor

insemination. Cambridge University Press.

Cambridge, 1993, p.71–96.

49. Watson P.F. Recent developments

and concepts in the cryopreservation of

spermatozoa and the assessment of their post-

thawing function. Reproduction Fertility and

Development 1995;7:871–91.

50. Bagchi A., Woods E.J., Critser J.K.

Cryopreservation and vitrification: recent

advances in fertility preservation technologies.

Expert Rev Med Devices 2008 May;5(3):359–70.

51. Sherman J.K. Cryopreservation of human

semen. In: Keel B.A., Webster B.W., eds.

CRC handbook of the laboratory diagnosis

and treatment of infertility. Boca Raton, CRC

Press: 229–259.

52. Vutyavanich T., Piromlertamorn

W., Nunta S. Rapid freezing versus slow

programmable freezing of human spermatozoa.

Vol. 93, issue 6, p. 1921–8.

53. Zribi N., Feki Chakroun N., El Euch H.

et al. Effects of cryopreservation on human

sperm deoxyribonucleic acid integrity. Fertil

Steril 2010 Jan;93(1):159–66.

54. O’Flaherty C., Hales B.F. Impact of

chemotherapeutics and advanced testicular

cancer or Hodgkin lymphoma on sperm

deoxyribonucleic acid integrity. Fertility and

Sterility, vol. 94, issue 4, p. 1374–9.

55. Van der Kaaij M.A., Heutte N. et al.

Sperm quality before treatment in patients

with early stage Hodgkin’s lymphoma enrolled

in EORTC-GELA Lymphoma Group trials.

Haematologica 2009 Dec;94(12):1691–7.

56. Kulkarni S.S., Sastry P.S. et al. Gonadal

function following ABVD therapy for

Hodgkin’s disease. Am J Clin Oncol 1997

Aug;20(4):354–7. Hum Reprod 2004

Nov;19(11):2680.

57. Horne G., Atkinson A.D., Pease E.H. et al.

Live birth with sperm cryopreserved for 21 years

prior to cancer treatment: case report. Hum

Reprod 2004 Jun;19(6):1448–9.

58. Woods E.J. et al. Fundamental cryobiology

of reproductive cells and tissues. Cryobiology

2004;48:146–56.

59. Shin D., Lo K.C., Lipshultz L.I. Treatment

options for the infertile male with cancer.

J Natl Cancer Inst Monogr 2005;34:48–50.

60. Feldschuh J. et al. Successful sperm

storage for 28 years. Fertility and Sterility

2005;84:1017.

61. Horne G., Atkinson A.D., Pease E.H.,

Logue J.P., Brison D.R., Lieberman B.A. Live

birth with sperm cryopreserved for 21 years

prior to cancer treatment: case report. Hum

Reprod 2004 Jun;19(6):1448–9.

62. Clarke G.N. et al. Recovery of human

sperm motility and ability to interact with

the human zona pellucida after more than 28

years of storage in liquid nitrogen. Fertility and

Sterility 2006;86:721–2.

63. Agarwal A., Ranganathan P., Kattal

N., Pasqualotto F., Hallak J., Khayal S.,

Mascha E. Fertility after cancer: a prospective

review of assisted reproductive outcome with

banked semen specimens. Fertil Steril 2004

Feb;81(2):342–8.

64. Saito K., Suzuki K., Iwasaki A., Yumura Y.,

Kubota Y. Sperm cryopreservation before

cancer chemotherapy helps in the emotional

battle against cancer. Cancer 2005;104:521–4.

65. Schover L.R., Brey K., Lichtin A.

Knowledge and experience regarding cancer,

infertility, and sperm banking in younger male

survivors. J Clin Oncol 2002;20:1880–9.

66. Reinmuth S., Liebeskind A.K.,

Wickmann L., Bockelbrink A., Keil T., Henze

G., Borgmann A. Having children after

surviving cancer in childhood or adolescence —

results of a Berlin survey. Klin Paediatr 2008

May–Jun;220(3):159–65.

67. Schover L.R., Rybicki L.A., Martin B.A.

Having children after cancer: a pilot survey of

survivors’ attitudes and experiences. Cancer

1999;86:697–709.

68. Волкова М.А. Клиническая онкогемато-

логия: руководство для врачей. М.: Меди-

цина, 2007. С. 1120.


2’

20

11

История изучения лангергансоклеточного ги-

стиоцитоза (ЛКГ) насчитывает более 100 лет. За это

время взгляды на патогенетические основы этого за-

болевания претерпели серьезные изменения. Благо-

даря появлению методов электронной микроскопии,

иммуногистохимии, расширению панели диагно-

стических антител была установлена опухолевая

природа ЛКГ [1], в основе которой лежит инфиль-

трация различных органов и тканей злокачественной

популяцией активированных клеток Лангерганса, что

ведет к морфологическим и функциональным нару-

шениям. Иммунологическим субстратом ЛКГ явля-

ются CD1а+, S100+ и Langerin-позитивные дендритные

клетки [2]. Свое происхождение клетки ЛКГ ведут от

стволовой (CD34+) клетки, которая благодаря ми-

кроокружению дает начало двум популяциям клеток

моноцитарно-макрофагальной системы: CD14-

позитивные клетки (предшественники тканевых ма-

крофагов) и СD14-негативные клетки (предше-

ственники клеток Лангерганса) [3].

ЛКГ представляет собой редкое заболевание.

Сложности дифференциальной диагностики ведут

к тому, что данные о заболеваемости колеблются

в достаточно широких пределах и составляют, по

данным разных авторов, от 0,5 до 6 случаев на 1 млн

детского населения. Несколько чаще болеют маль-

Случай врожденного лангергансоклеточного гистиоцитозау ребенка раннего возраста

Т.Т. Валиев1, Л.А. Махонова1, А.М. Ковригина2, Е.Н. Шолохова2, Н.Н. Тупицын2,И.Н. Серебрякова1, Г.Л. Менткевич1

1НИИ детской онкологии и гематологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН;НИИ детской онкологии и гематологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН;2НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, МоскваНИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Контакты: Тимур Теймуразович Валиев [email protected]

В настоящей статье приведено детальное описание редкого случая моносистемной формы врожденного лангергансоклеточного

гистиоцитоза (ЛКГ) у девочки 3-недельного возраста. Впервые приводится описание локального поражения слизистой оболоч-

ки полости рта при ЛКГ у новорожденного. Авторы характеризуют морфологические, иммунологические, клинические особен-

ности данной редкой патологии и делают вывод о важности своевременной диагностики для назначения риск-адаптированной

терапии при ЛКГ у детей.

Ключевые слова: лангергансоклеточный гистиоцитоз, новорожденные, диагностика, лечение

Case of congenital Langerhans cells histiocytosis in an infantCase of congenital Langerhans cells histiocytosis in an infant

T.T. Valiev1, L.A. Makhonova1, A.M. Kovrigina2, E.N. Sholokhova2, N.N. Tupitsyn2, I.N. Serebryakova1, G.L. Mentkevich1

1Institute of Pediatric Oncology and Hematology, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences;Institute of Pediatric Oncology and Hematology, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences;2Institute of Clinical Oncology, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, MoscowInstitute of Clinical Oncology, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

In this article a rare case of monosystem form of congenital Langerhans cells histiocytosis (LCH) in 3 weeks of age girl was described. Local In this article a rare case of monosystem form of congenital Langerhans cells histiocytosis (LCH) in 3 weeks of age girl was described. Local

lesion of oral mucosa of the infant with LCH was first described. Morphological, immunological and clinical features of this rare disease lesion of oral mucosa of the infant with LCH was first described. Morphological, immunological and clinical features of this rare disease

have been characterized. Authors concluded that timely diagnostics is very important to risk-adapted therapy at children with LCH.have been characterized. Authors concluded that timely diagnostics is very important to risk-adapted therapy at children with LCH.

Key words: Langerhans cell histiocytosis, newborns, diagnosis, therapy

чики в возрасте от 0 до 4 лет [4, 5]. Клиническая кар-

тина ЛКГ разнообразна и характеризуется пораже-

нием костей скелета, кожи, печени, легких,

селезенки, лимфатических узлов, костного мозга,

центральной нервной системы, развитием дисфунк-

ции эндокринной системы [6]. Поражения кожи при

ЛКГ могут быть представлены эритематозными ве-

зикулопапулезными элементами, часто покрытыми

корками. При локализации ЛКГ в паренхиматозных

органах, по данным методов инструментальной ви-

зуализации, определяются очаговоподобные уплот-

нения. В случаях поражения костной системы при

проведении рентгенологических методов исследова-

ния выявляются очаги костной деструкции. Ранее

варианты ЛКГ с сочетанными висцеральными пора-

жениями назывались болезнью Абта–Леттерера–

Сиве, а генерализованные поражения костной си-

стемы — болезнью Хенда–Шюллера–Крисчена.

Степень выраженности поражений органов и их

прогностическое влияние различны. Выделяют ор-

ганы риска (печень, селезенка, костный мозг и лег-

кие), поражение которых является неблагоприят-

ным прогностическим фактором при терапии ЛКГ.

Кроме того, при поражении ЦНС, костей лицевого

скелета, передней или средней черепной ямки повы-

шается риск рецидива заболевания. Прогноз зависит


’2

01

1 от возраста на момент установления диагноза, рас-

пространенности процесса и степени повреждения

жизненно важных органов. Ранняя диагностика

улучшает ответ на терапию при ЛКГ у детей. У детей

до года течение ЛКГ крайне агрессивное, с быстрой

диссеминацией, поражением нескольких органов

и нарушением их функции [7, 8].

Целью терапии ЛКГ является подавление актив-

ности и пролиферации гистиоцитов, лимфоцитов

и макрофагов. В зависимости от распространенно-

сти опухолевого процесса, стратификации больных

по группам риска строятся современные программы

терапии ЛКГ, которые включают преднизолон, вин-

бластин, 6-меркаптопурин, метотрексат (группа

среднего риска) [9], тогда как в программу лечения

больных из группы высокого риска входит метотрек-

сат 500 мг/м2. В последние годы в терапию рециди-

вов и рефрактерных форм ЛКГ включают препарат

2-хлордезоксиаденозин, эффективность которого

у детей активно изучается [10, 11].

Современные представления о клинико-морфо-

иммунологических особенностях ЛКГ основывают-

ся на обобщении отдельными клиниками своего не-

большого опыта в диагностике и лечении этой

редкой патологии, а также описании отдельных кли-

нических случаев [12]. Каждый новый случай ЛКГ,

обследованный на современном уровне, вносит

большой вклад в расширение нашего понимания

этой редкой патологии детского возраста.

Больная В.А. родилась 23.10.2009 от доношенной

I беременности, которая протекала без осложнений.

Вес при рождении 3530 г, рост 51 см. С рождения роди-

тели отмечали у девочки в полости рта сероватое опу-

холевое образование, и когда ребенку исполнилось 3 не-

дели, обратились к стоматологу, который на основа-

нии пункции данного образования заподозрил ЛКГ.

При осмотре в НИИ детской онкологии и гемато-

логии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 01.12.2009 на

твердом небе слева определялось опухолевое образова-

ние грязно-серого цвета, выступающее в полость рта,

размером около 2,5 см, с ровными и четкими краями,

при контакте не кровоточило. Окружающие ткани

слизистой оболочки не были изменены (рис. 1). Темпера-

тура тела 36,8 ºС. Кожные покровы — физиологических

свойств, при пальпации периферические лимфатиче-

ские узлы не были увеличены, размеры печени и селезен-

ки соответствовали возрасту ребенка.

При цитологическом исследовании пунктата опу-

холи (08.12.2009) обращали на себя внимание крупные

клетки со складчатыми и дольчатыми ядрами, вокруг

которых в обильной эозинофильной цитоплазме опреде-

лялись мелкие гранулы. Нуклеолы были едва заметными

(рис. 2).

10.12.2009 была выполнена биопсия опухолевого обра-

зования полости рта. Морфологическая картина харак-

теризовалась скоплениями крупных клеток с наличием

ядерных борозд и широкой эозинофильной цитоплазмой

(рис. 3). Среди инфильтрата присутствовали нейтро-

фильные и эозинофильные гранулоциты.

Иммуногистохимически опухолевые клетки моно-

морфно экспрессировали CD1a, S-100, HLA-DR,

Langerin, многоядерные гистиоидные клетки — CD68

(рис. 4–7). Иммунофенотипирование опухолевого обра-

зования методом непрямой реакции иммунофлюорес-

ценции на криостатных срезах проводилось с использо-

ванием панели моноклональных антител CD7, CD79a,

Рис. 1. Опухоль слизистой оболочки полости рта больной В.

до начала терапии

Рис. 2. Цитологическая картина пунктата опухоли

ротовой полости

Рис. 3. Лангергансоклеточный гистиоцитоз. Окраска гематоксилин-

эозином: а — фрагмент слизистой оболочки, покрытой многослойным

плоским эпителием, субэпителиально — инфильтрат из крупных

клеток с округло-овальными и складчатыми/бобовидными ядрами,

широкой слабо эозинофильной цитоплазмой; б — среди инфильтрата

видны нейтрофильные и эозинофильные гранулоциты, присутствуют

отдельные гигантские многоядерные гистиоидные клетки.

a б


2’

20

11

CD68 и CD1a. Опухолевые клетки в 100 % экспрессиро-

вали антиген СD1a, на части опухолевых клеток от-

мечена экспрессия антигена СD68. В опухолевой ткани

присутствовали единичные T- и B-лимфоциты.

В связи с ранним возрастом ребенка радио-

изотопные исследования с Ga-67 и Tc-99 на предмет

Рис. 4. Клетки инфильтрата экспрессируют Langerin (CD207) —

перинуклеарная, гранулярная реакция. Иммуноферментный метод

Рис. 5. Клетки инфильтрата экспрессируют CD1a (мембранная

реакция). Иммуноферментный метод

Рис. 6. Клетки инфильтрата экспрессируют S-100 (ядерно-

цитоплазматическая реакция). Иммуноферментный метод

Рис. 7. Среди субстрата присутствуют отдельные многоядерные

гистиоидные клетки, экспрессирующие CD68, клетки инфильтрата

CD68 — негативны. Иммуноферментный метод

поражения костной системы не проводились, посколь-

ку в ряде работ была показана крайне низкая чувстви-

тельность и специфичность данного метода [13, 14].

По данным ультразвукового исследования (УЗИ)

и рентгеновской компьютерной томографии (РКТ) че-

репа и покровных костей лицевого скелета костно-

деструктивные изменения в исследованных отделах

скелета не выявлены.

В общем и биохимическом анализах крови патоло-

гических изменений обнаружено не было. По данным

коагулограммы — нормокоагуляция.

Таким образом, на основании клинико-лабора торных

и инструментальных методов исследования был установ-

лен диагноз: ЛКГ, монофокальная форма с поражением

слизистой твердого и мягкого неба слева.

С 14.12.2009 была начата терапия по протоколу

LCH-III для детей с локальным опухолевым процессом.

Данный протокол позволил получить высокие показатели

выживаемости и включает в себя интенсивную фазу I

(преднизолон 40 мг/м2/сут 1–28-й день, отмена к 42-му

дню per os; винбластин 6 мг/м2 введение в 1, 7, 14, 21, 28,

35-й дни в/в струйно), интенсивную фазу II (преднизолон

40 мг/м2/сут 1–3, 7–9, 14–16, 21–23, 28–30, 35–37-й

дни per os; винбластин 6 мг/м2 введение в 1, 7, 14, 21, 28,

35-й дни в/в струйно) и поддерживающую фазу, продол-

жающуюся 42 дня (преднизолон 40 мг/м2/сут 1–5-й дни

каждого цикла per os; винбластин 6 мг/м2 введение в 1-й

день каждого цикла в/в струйно; 6-меркаптопурин

50 мг/м2/сут ежедневно per os; метотрексат 20 мг/м2

введение в 1-й день каждого цикла per os) [15].

Лечение девочка переносила удовлетворительно

и по окончании интенсивной фазы I и II отмечено

уменьшение размеров опухоли до 2 см, отсутствие про-

мененции в ротовую полость.

По данным РКТ, проведенной в феврале 2010 г., де-

структивных изменений в костях черепа выявлено не

было, отмечено неравномерное утолщение мягких тка-

ней левой половины полости рта по ходу твердого

и мягкого неба.


’2

01

1 При проведении УЗИ в феврале 2010 г. данных за

опухолевое поражение других органов и систем не полу-

чено.

В ходе динамического наблюдения (март – декабрь

2010 г.) остаточная опухоль ротовой полости составляла

около 1,5 см. При РКТ (июль 2010 г.) поражений костей

черепа не выявлено, отмечалось утолщение мягких тка-

ней левой половины твердого неба. При биопсии места

бывшего опухолевого образования и цитологическом ис-

следовании опухолевые клетки не были обнаружены.

В настоящее время ребенок получает поддержива-

ющую фазу терапии. При осмотре на месте первичной

локализации опухоли определяется пятно, цвет кото-

рого приближается к цвету окружающих тканей

(рис. 8).

Таким образом, приведенный клинический слу-

чай является крайне редкой врожденной формой

ЛКГ, диагностированной на этапе локального про-

цесса. Изолированное поражение слизистой оболочки

твердого неба при ЛКГ у новорожденных не описа-

но, поэтому наше наблюдение расширяет современ-

ные представления о спектре клинических проявле-

ний данного заболевания.

У детей раннего возраста ЛКГ характеризуется

мультисистемным поражением с быстрой диссемина-

цией и вовлечением печени, легких, костного мозга.

Большая опухолевая масса, мультиорганный характер

поражения и нарушение функций жизненно важных

органов объясняют крайне неудовлетворительные ре-

зультаты терапии таких больных, что диктует необхо-

димость привлечения внимания педиатров и врачей

Рис. 8. Состояние слизистой оболочки ротовой полости больной В.

после окончания основного курса терапии

других специальностей к данной редкой патологии.

Наша клиника располагает данными диагностики и лече-

ния более 600 детей с впервые установленным диагно-

зом ЛКГ [16, 17], но ни в одном случае не наблюдалось

изолированного поражения слизистой оболочки рото-

вой полости у новорожденного. В нашем случае диа-

гностический этап удалось свести к минимуму, по-

скольку при обращении к стоматологу была выполнена

пункционная биопсия опухолевого образования и за-

подозрен ЛКГ. Девочка была направлена в специали-

зированное отделение, где на основании клинико-

морфоиммунологических характеристик опухоли был

установлен правильный диагноз и проведена терапия

по программе LCH-III с хорошим эффектом.

1. Махонова Л.А., Дурнов Л.А. Гистиоци-

тарные заболевания у детей. М.: МИА,

2004. С. 93.

2. Новичкова Г.А., Минков М.,

Масчан М.А. и др. Гистиоцитозы. В кн.:

Клиническая онкогематология. Под ред.

М.А. Волковой. М.: Медицина, 2007.

С. 891–911.

3. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L.

et al. WHO Classification of Tumours of

Haematopoietic and Lymphoid Tissues. 4th

Ed. International Agency for Research on

Cancer. Lyon, 2008. P. 439.

4. Волкова Е.Н., Бронин Г.О., Высоцкая Т.А.

и др. Результаты ретроспективного моно-

центрового исследования гистиоцитоза

из клеток Лангерганса у детей. Педиатрия

2009;87(3):33–40.

5. Buchman L., Emani A., Wei J.L. Primary

head and neck Langerhans cell histiocytosis

in children. Otolaryngol Head Neck

Surg;135:312–7.

6. Лукина Е.А. Гистиоцитоз из клеток Лан-

герганса. В рук. по гематологии под ред.

акад. А.И. Воробьева. М.: Ньюдиамед,

2003. С. 36–39.

7. Krstovski N., Janic D., Docmanovic L.

et al. Clinical characteristics and survival of

children with Langerhans cell histiocytosis.

Spr Arh Celok Lek 2008;136(9–10):514–8.

8. Mosterd K., van Marion A., van

Steensel M.A. Neonatal Langerhans

cell histiocytosis: a rare and potentially

life-threatening disease. Int J Dermatol

2008;47(1):10–2.

9. Солопова Г.Г., Байдильдина Д.Д.,

Жарикова Л.И. и др. Применение 2-хлор-

дезоксиаденозина в терапии гистиоцитоза

из клеток Лангерганса у детей. Онкогема-

тология 2010;3:8–15.

10. Imamura T., Sato T., Shiota Y. et al.

Outcome of pediatric patients with

Langerhans cell histiocytosis treated with 2

chlorodeoxyadenosine: a nationwide survey in

Japan. Int J Hematol 2010 May;91(4):646–51.

11. Weitzman S., Braier J., Donadieu J. et al.

2'-Chlorodeoxyadenosine (2-CdA) as salvage

therapy for Langerhans cell histiocytosis

(LCH). Results of the LCH-S-98 protocol of

the Histiocyte Society. Pediatr Blood Cancer

2009 Dec 15;53(7):1271–6.

12. Stein S.L., Paller A.S., Haut P.R. et al.

Langerhans Cell Histiocytosis Presenting in

the Neonatal Period. Arch Pediatr Adolesc

Med;155:778–83.

13. Connolly L.P., Treves S.T. Assessing the

limping child with skeletal scintigraphy. J Nucl

Med 1998 Jun;39(6):1056–61.

14. Freeman S.J., Sonoda L.I., Seshadri N.

et al. What is the significance of solitary bony

abnormalities on bone scintigrams of children

with malignancy? Pediatr Hematol Oncol 2010

Aug;27(5):380–6.

15. Allen C.E., McClain K.L. Langerhans

cell histiocytosis: a review of past, current and

future therapies. Drugs Today (Barc) 2007

Sep;43(9):627–43.

16. Махонова Л.А. Гистиоцитозы у детей.

В рук. по детской онкологии под ред. акад.

Л.А. Дурнова. М.: Миклош, 2003. С. 316–24.

17. Пичугина Л.Ю. Клиническое течение

и лечение диссеминированных форм лан-

гергансоклеточного гистиоцитоза у детей.

Дис. … канд. мед. наук. М., 1999. С. 163.


23

2’

20

11

Ф У Н Д А М Е Н Т А Л Ь Н Ы Е И С С Л Е Д О В А Н И Я В П Р А К Т И Ч Е С К О Й М Е Д И Ц И Н Е Н А С О В Р Е М Е Н Н О М Э Т А П Е

ВведениеВесьма перспективным направлением иммуно-

диагностики является исследование антигенов кле-

ток с использованием иммунологических биочипов.

Данный подход был реализован в ряде зарубежных

и отечественных работ [1–12]. Биочипы, описанные

в большинстве этих работ, имели сходную конструк-

цию (рис. 1). Они представляли собой подложки, на

которых в строго определенных тестовых участках

(«пятнах») были иммобилизованы антитела, специ-

фичные к поверхностным антигенам клеток.

Отличия заключались главным образом в количестве

тестовых участков и специфичности иммобилизо-

ванных антител, а также в использовании подложек

из разных материалов.

Анализ основан на связывании клеток, имеющих

определяемые антигены, в области участков биочи-

па, содержащих иммобилизованные антитела,

специ фичные к данным антигенам. Методика про-

ведения анализа включает инкубацию биочипа

с клеточной суспензией, отмывку биочипа от не свя-

завшихся с антителами клеток, считывание результа-

та и определение плотности связывания клеток в об-

ласти пятен биочипа. Исходя из величины плотности

связывания клеток в области каждого из пятен био-

чипа, может быть выполнена оценка содержания

в исследуемом образце клеток, имеющих соответ-

ствующие антигены.

С помощью биочипа подобной конструкции мож-

но определить множество различных поверхностных

антигенов на разных клетках. Но на одной отдельно

взятой клетке по факту ее связывания в том или ином

пятне с иммобилизованными антителами может быть

определен только один антиген. В то же время во мно-

гих случаях очень важна информация о наличии или

отсутствии на каждой отдельно взятой клетке несколь-

Новый подход к определению коэкспрессии антигенов клеток при проведении анализа с использованием

иммунологического биочипа

А.В. Шишкин1, Н.Г. Овчинина1, С.С. Бессмельцев2

1ГОУ ВПО Ижевская государственная медицинская академия;ГОУ ВПО Ижевская государственная медицинская академия;2ФГУ Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России, Санкт-ПетербургФГУ Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России, Санкт-Петербург

Контакты: Александр Валентинович Шишкин [email protected]

В данной работе предложен новый подход, позволяющий определять большое число вариантов коэкспрессии антигенов клеток

при проведении анализа с использованием иммунологического биочипа. Рассматривается новая конструкция тест-системы для

исследования клеток, содержащей биочип с тестовыми участками, выполненными в виде линий, а также специальное приспо-

собление для проведения анализа. Приводятся примеры исследования клеток. При этом осуществляется сравнение полученных

результатов с результатами исследования, выполненного с использованием биочипов ранее известной конструкции.

Ключевые слова: иммунологический биочип, определение поверхностных антигенов клеток, определение коэкспрессии антигенов

Novel approach for detection of cell antigen coexpression using immunological biochipNovel approach for detection of cell antigen coexpression using immunological biochip

A.V. Shishkin1, N.G. Ovchinina1, S.S. Bessmeltsev2

1Izhevsk State Medical Academy; Izhevsk State Medical Academy; 2Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, St.-PetersburgRussian Research Institute of Hematology and Transfusiology, St.-Petersburg

New approach for detection of large number of different variants of cell antigen coexpression using the immunological biochip is suggested in New approach for detection of large number of different variants of cell antigen coexpression using the immunological biochip is suggested in

this work. Novel construction of immunological biochip for cell investigation with test zones as strips and new special device for incubation this work. Novel construction of immunological biochip for cell investigation with test zones as strips and new special device for incubation

are considered. Examples of cell analysis are given. Results are compared with data of investigation where previously known patterns of are considered. Examples of cell analysis are given. Results are compared with data of investigation where previously known patterns of

biochips were used.biochips were used.

Key words: immunological biochips, cell surface antigens, coexpression

Рис. 1. Устройство био-

чипа 1-го типа, использо-

ванного в данной работе:

1 — подложка;

2 — рабочая область био-

чипа; 3 — тестовые

участки (пятна) с иммоби-

лизованными антителами;

4 — фоновые участки под-

ложки, не содержащие им-

мобилизованных антител

242

’2

01

1Ф У Н Д А М Е Н Т А Л Ь Н Ы Е И С С Л Е Д О В А Н И Я В П Р А К Т И Ч Е С К О Й М Е Д И Ц И Н Е Н А С О В Р Е М Е Н Н О М Э Т А П Е

ких антигенов. В некоторых работах зарубежных авто-

ров [2, 7, 10], а также в ранее проведенных собственных

исследованиях [12] данная задача решалась за счет до-

полнительной обработки клеток антителами, конъю-

гированными с флуоресцентной меткой. При этом на

отдельно взятой клетке один антиген определялся по

факту связывания клетки в том или ином пятне биочи-

па, а второй антиген определялся по окрашиванию

клетки флуоресцентной меткой. Таким образом, для

определения на отдельно взятой клетке двух антигенов

достаточно было использовать меченые антитела одно-

го типа. На подложке биочипа было иммобилизовано

много видов антител с различной специфичностью.

Поэтому при дополнительной обработке мечеными

антителами, специфичными к одному антигену, на раз-

ных клетках определялась коэкспрессия этого антиге-

на в паре с другими антигенами, определяемыми с по-

мощью биочипа. Обработка биочипа со связанными

клетками смесью нескольких антител, имеющих раз-

личную специфичность и меченных разными метка-

ми, позволила бы определять большее число вариантов

коэкспрессии антигенов.

Вместе с тем такой подход имеет ряд серьезных не-

достатков. Во-первых, количество определяемых вари-

антов коэкспрессии недостаточно велико. Во-вторых,

в контакт с раствором меченых антител необходимо

приводить всю поверхность биочипа, которая содер-

жит не только участки с иммобилизованными антите-

лами, но и фоновые участки, не содержащие иммоби-

лизованных антител. Этим обусловлен высокий расход

дорогостоящих меченых антител. В результате, опреде-

ление коэкспрессии антигенов значительно повышает

стоимость проведения анализа.

Задачей данной работы является достижение

возможности одновременного определения больше-

го количества вариантов коэкспрессии антигенов

при меньшем расходе меченых антител во время про-

ведения анализа с использованием иммунологиче-

ского биочипа.

Материалы и методыВ процессе проведения данной работы использо-

вались биочипы 2 типов.

1. Биочипы базовой конструкции (рис. 1), анало-

гичные биочипам, использованным в наших преды-

дущих исследованиях [11, 12].

2. Биочипы, предназначенные для одновремен-

ного определения большого количества вариантов

коэкспрессии антигенов. Данные биочипы исполь-

зовались в комбинации со специальным устрой-

ством.

Проведение исследований с использованием биочипов 1-го типаКонструкция биочипа 1-го типаБиочип 1-го типа (рис. 1) представляет собой

твердую подложку, на которой в строго определен-

ных местах (тестовых участках, «пятнах») иммобили-

зованы молекулы антител. В каждом из тестовых

участков иммобилизованы антитела, специфичные

к одному поверхностному антигену клеток. Но раз-

ные тестовые участки отличаются друг от друга

специ фичностью иммобилизованных в них антител.

Тестовые участки отделены друг от друга фоновыми

участками, не содержащими иммобилизованных ан-

тител.

В данном случае для изготовления биочипов были

использованы прозрачные пластиковые подложки.

В тестовых участках подложки были адсорбированы

мышиные моноклональные антитела (IgG), специ-

фичные к следующим поверхностным антигенам лей-

коцитов человека: CD3, CD4, CD5, CD8, CD16,

СD19, CD20, CD23, CD45 (АО «Сорбент ЛТД»,

Россия). Размеры подложки составляли 8 8 мм.

Необходимо отметить, что в своих предыдущих

исследованиях [11, 12] мы применяли биочипы ана-

логичной конструкции, содержащие значительно

большее число видов иммобилизованных антител.

Изготовление биочипов 1-го типаПри изготовлении биочипов 1-го типа капли

растворов антител объемом 0,25 мкл наносили на

подложки в заранее отмеченные участки. Далее под-

ложки помещали в камеру со 100 % влажностью

и инкубировали при комнатной температуре в тече-

ние 1 часа, после чего высушивали на воздухе и замо-

раживали при –26 ºС в герметичных контейнерах.

При таком хранении биочипы не теряли своих

свойств по меньшей мере в течение 12 месяцев.

Получение клеточной суспензииЛейкоциты были выделены из периферической

крови путем центрифугирования в растворе фиколла

и урографина с плотностью 1,077 г/мл и трижды от-

мыты PBS. Полученные клетки ресуспензировали

в растворе, содержащем 20 % (по объему) инактиви-

рованной нагреванием человеческой сыворотки

и 1,5мМ ЭДТА в PBS.

Проведение анализа с использованием биочипа 1-го типа

После разморозки биочип закрепляли в кювете,

ополаскивали 1 % раствором BSA в буфере PBS, за-

тем проводили 3-кратную отмывку 0,05 % раствором

детергента Tween-20 на шейкере. После этого биочип

инкубировали с 1 % раствором BSA в PBS при ком-

натной температуре в течение 1 часа при перемеши-

вании на шейкере. Затем вновь проводили 3-крат-

ную отмывку 0,05 % раствором детергента Tween-20

и ополаскивали биочип буфером для удаления сле-

дов детергента.

В кювету с биочипом вносили клеточную су-

спензию и инкубировали в течение 60 минут без

какого-либо перемешивания. Концентрация клеток

25

2’

20

11


и объем суспензии подбирались таким образом, что-

бы при оседании клеток происходило полное покры-

тие ими поверхности биочипа. После завершения

инкубации для устранения клеток, не связавшихся

в участках с иммобилизованными антителами, био-

чипы несколько раз ополаскивали PBS. Качество от-

мывки оценивали при помощи стереомикроскопа

МБС-1. Отмывка считалась выполненной каче-

ственно, если клетки отсутствовали в участках под-

ложки, не содержащих иммобилизованных антител.

Далее в течение 12 минут осуществляли фиксацию

связанных клеток метанолом, после чего биочип вы-

сушивали на воздухе.

Затем биочип осторожно отделяли от дна кюветы

и размещали его на предметном стекле. Каждое пят-

но биочипа фотографировали с помощью цифрового

фотоаппарата через микроскоп на малом увеличе-

нии. В каждом из пятен биочипа определяли плот-

ность связывания клеток (отношение количества

клеток, к площади поверхности участка, на котором

они связаны). Для этого на микрофотографии каж-

дого пятна выбирали участки, соответствующие

участку подложки размерами 100 100 мкм и прово-

дили определение количества связанных клеток не

менее чем в 3–4 таких участках. Полученные значе-

ния усредняли.

Для удобства использования полученных резуль-

татов значения плотности заполнения поверхности

пятен связавшимися клетками выражали в процен-

тах. За 100 % принималась средняя плотность связы-

вания клеток в области пятен с антителами анти-

CD45. Исходя из этого осуществлялся пересчет

в проценты плотности связывания клеток в области

других пятен. Ранее было показано [11, 12], что при

проведении инкубации биочипа с клеточной суспен-

зией без перемешивания получаемые значения плот-

ности связывания клеток в области тестовых

участков биочипа оказываются пропорциональны

фактическому содержанию в исследуемом образце

клеток, имеющих соответствующие антигены. При

этом плотность связывания клеток в пятне биочипа,

выраженная в процентах, численно совпадает с про-

центным содержанием в исследуемом образце кле-

ток, имеющих определяемый антиген.

Проведение исследований с использованием биочипов 2-го типаУстройство биочипа 2-го типаБиочип был изготовлен на подложке из прозрач-

ного пластика размерами 22 22 мм. На подложке

биочипа были иммобилизованы мышиные монокло-

нальные антитела (IgG), специфичные к антигенам

CD4, CD5, CD8, CD16, CD19, CD23, CD45 (АО

«Сорбент ЛТД», Россия). Иммобилизация антител

осуществлялась за счет адсорбции. Тестовые участки

биочипа были нанесены на подложку в виде парал-

лельных полос (рис. 2).

Приспособление, предназначенное для проведения анализа с использованием биочипа 2-го типа

Для проведения анализа с использованием дан-

ного биочипа было разработано специальное при-

способление, конструкция которого представлена на

рис. 3.

Приспособление имеет корпус, представляющий

собой пластину, в которой выполнено отверстие, со-

ответствующее форме и размерам биочипа. К корпусу

крепится съемное дно, выполненное из прозрачного

материала и имеющее прозрачное клейкое покры-

тие. При креплении дна к корпусу образуется ем-

кость, форма и размеры горизонтального сечения

которой соответствуют форме и размерам биочипа.

К съемному дну крепится биочип за счет приклеива-

ния к клейкому покрытию. Жесткость фиксации

съемного дна к корпусу обеспечивает прижимающая

рама.

Приспособление снабжено съемной рамкой,

представляющей собой пластину, в которой выпол-

нены сквозные отверстия (прорези) вытянутой фор-

мы, расположенные параллельно друг другу. Рамка

устанавливается на поверхность биочипа. Она разде-

ляет емкость, в которой размещен биочип, на не-

сколько каналов, имеющих меньшие размеры. При

этом прорези имеют на концах расширения, предна-

значенные для введения растворов меченых антител

с помощью шприца Гамильтона. Рамка устанавлива-

ется таким образом, что ее прорези располагаются

перпендикулярно тестовым участкам биочипа. При

этом каждый канал пересекает все тестовые участки

Рис. 2. Схема биочипа 2-го типа, использованного при проведении

данного исследования. Указана специфичность антител, иммобили-

зованных в тестовых участках: 1 — подложка; 2 — рабочая область;

3 — края подложки; 4 — тестовые участки с иммобилизованными

антителами, нанесенные в виде полос; 5 — фоновые участки, не со-

держащие иммобилизованных антител

262

’2

01


(полосы) биочипа. Таким образом, на дне каждого

канала располагаются фрагменты всех тестовых

участков.

Рамка фиксируется к поверхности биочипа с помо-

щью прижимающей пластины, которая подвижно кре-

пится в пазах, выполненных в прижимающей раме.

Приспособление снабжено двумя съемными

крышками, предназначенными для уменьшения ис-

парения воды. Крышки несколько отличаются друг

от друга по форме. Одна из них используется при

установленной рамке с прорезями, а вторая — при

снятой рамке.

Проведение анализа с использованием биочипа 2-го типа

Биочип закрепляли в емкости приспособления,

ополаскивали 1 % раствором BSA в буфере PBS, за-

тем проводили 3-кратную отмывку 0,05 % раствором

детергента Tween-20 на шейкере. После этого биочип

инкубировали с 1 % раствором BSA в PBS при ком-

натной температуре в течение 1 часа при перемеши-

вании на шейкере. Затем вновь проводили 3-крат-

ную отмывку 0,05 % раствором детергента Tween-20

и ополаскивали биочип буфером для удаления сле-

дов детергента. В емкость приспособления вносили

клеточную суспензию и инкубировали в течение 60

минут без какого-либо перемешивания. Подготовка

исследуемой клеточной суспензии осуществлялась

точно так же, как и при работе с биочипами 1-го ти-

Рис. 3. Конструкция приспособления для проведения анализа с использованием биочипа 2-го типа: а — общий вид устройства сверху с установ-

ленной рамкой; б — продольный разрез устройства с установленной рамкой; в — поперечный разрез с установленной рамкой; г — вид устройства

сверху с установленными биочипом и съемной прозрачной крышкой и снятой рамкой; д — поперечный разрез устройства с установленными био-

чипом и съемной прозрачной крышкой и снятой рамкой; е — биочип; 1 — корпус; 2 — отверстие, соответствующее размерам биочипа;

3 — съемное дно; 4 — емкость для размещения биочипа; 5 — биочип; 6 — прижимающая рама; 7 — прозрачная вставка; 8 — съемная рамка;

9 — кана лы; 10 — корпус съемной рамки (8); 11 — герметизирующее покрытие; 12 — прорези съемной рамки (8); 13 — расширения прорезей (12)

съемной рамки (8); 14 — прижимающая пластина; 15 — пазы для крепления прижимающей пластины; 16 — отверстие прижимающей пласти-

ны; 17 — съемная крышка I; 18 — съемная крышка II; 19 — подложка биочипа; 20 — рабочая область биочипа; 21 — края биочипа; 22 — тесто-

вые участки биочипа; 23 — фоновые участки биочипа

а

г

б

д

в

е

па. Концентрация клеток и объем суспензии подби-

рались так, чтобы при оседании клеток происходило

максимальное заполнение ими поверхности биочи-

па. После завершения инкубации для устранения

клеток, не связавшихся в участках с иммобилизован-

ными антителами, биочип несколько раз ополаски-

вали PBS. Для этого емкость приспособления запол-

няли буфером, который сразу же сливали. Качество

отмывки оценивали при помощи стереомикроскопа

МБС-1. Отмывка считалась выполненной каче-

ственно, если клетки отсутствовали в участках под-

ложки, не содержащих иммобилизованных антител.

Затем биочип в течение 10 минут инкубировали с пи-

тательной средой RPMI-1640. Это повышало проч-

ность связывания с подложкой клеток, оставшихся

связанными с поверхностью биочипа после проведе-

ния отмывки. Затем проводили 3-кратное ополаски-

вание биочипа PBS. Биочип обрабатывали 1 % рас-

твором параформальдегида в PBS, а затем трижды

ополаскивали PBS. Буферный раствор сливали, а его

капли аккуратно удаляли со стенок емкости филь-

тровальной бумагой.

На поверхность биочипа устанавливали съемную

рамку таким образом, чтобы ее сквозные прорези

располагались поперек тестовых участков биочипа.

В результате каждый из образующихся каналов пере-

крывал все тестовые участки биочипа. С помощью

шприца Гамильтона в каналы вносили растворы флу-

оресцентно меченых антител. При этом находящиеся

27

2’

20

11


в разных каналах растворы антител не могли смеши-

ваться друг с другом. Были использованы антитела,

специфичные к антигенам CD3, CD5, CD16, CD19,

CD20, CD45 (АО «Сорбент ЛТД», Россия). Антитела

каждого вида были конъюгированы с FITC.

Инкубация с растворами антител осуществлялась

в течение 60 минут. При этом для предотвращения

испарения воды из каналов устройство помещали

в атмосферу с повышенной влажностью воздуха или

устанавливали крышку на рамку с прорезями. После

завершения инкубации удаляли жидкость из кана-

лов, прикладывая к рамке с прорезями фильтроваль-

ную бумагу, сложенную в несколько слоев. Далее

биочип ополаскивали 1 % раствором BSA в PBS, а за-

тем еще дважды ополаскивали только PBS. Рамку

и бортик снимали. На поверхность биочипа наноси-

ли каплю жидкости, накрывали биочип покровным

стеклом и проводили исследование его поверхности

с помощью люминесцентного микроскопа. С помо-

щью установленной на микроскопе цифровой фото-

камеры выполняли фотографирование тех участков

его поверхности, где пересекались тестовые участки

и каналы. При наличии коэкспрессии в местах пере-

сечения отмечалась флуоресценция связанных

с биочипом клеток (рис. 4).

При изучении микрофотографий, выполненных

при обычном и ультрафиолетовом освещении, опре-

деляли общее количество клеток, связанных на

участках определенной площади (плотность связы-

вания клеток), а также количество флуоресцирую-

щих клеток на тех же участках. Определение общего

числа клеток и флуоресцирующих клеток осущест-

вляли не менее чем в 3–4 участках (площадью 10 000

мкм2 каждый) в области каждого пересечения тесто-

вого участка и канала. Полученные значения усред-

няли. Для более удобной обработки и интерпретации

результатов полученные значения выражали в про-

центах. При этом за 100 % принималась средняя об-

щая плотность связывания клеток в области тестово-

го участка с антителами, специфичными к антигену

CD45, который присутствует на поверхности всех

типов лейкоцитов.

Ранее было показано [12], что выраженные

в процентах значения плотности связывания клеток

в области тестовых участков биочипов численно

практически равны фактическому процентному со-

держанию в образце клеток, имеющих соответствую-

щие антигены. Поэтому полученные значения ин-

терпретировали как содержание клеток.

Проведение контрольного исследования методомпроточной цитофлуориметрииДля проверки результатов исследования, выпол-

ненного с использованием биочипов 1-го и 2-го

типов, был проведен дополнительный анализ с ис-

пользованием проточной цитофлуориметрии.

Данное исследование выполнялось на проточном

цитофлуориметре FACSCanto II (Becton Dickinson,

США) с использованием антител, специфичных

к антигенам CD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD19,

CD20, CD23, CD45 (Daco, США).

РезультатыС помощью разработанного приспособления

и биочипов 2-го типа были исследованы клетки здо-

рового человека и клетки больной Ф. 52 лет, страда-

ющей хроническим B-клеточным лимфоцитарным

лейкозом (B-ХЛЛ).

Полученные результаты представлены в табл. 1

и 2, где указано содержание клеток, имеющих по-

верхностные антигены, определяемые по связыва-

нию с биочипом, а также содержание клеток, окра-

сившихся мечеными антителами с указанной специ-

фичностью.

Таким образом, на клетках здорового человека

определялась коэкспрессия антигенов CD3/CD4,

CD3/CD5, CD3/CD8, CD4/CD5, CD5/CD8, CD19/

CD20, CD3/CD45, CD4/CD45, CD5/CD45, CD8/

CD45, CD16/CD45, CD19/CD45, CD20/CD45, что

соответствует норме. CD23+ клетки не были обнару-

жены, что также является нормой.

При исследовании клеток больной, страдающей

В-ХЛЛ, определялись все вышеуказанные варианты

коэкспрессии. Но содержание СD3+, CD4+, CD8+,

CD16+ клеток было значительно меньше, чем у здо-

рового человека. Вместе с тем было велико содержа-

ние CD19+, CD20+ и CD23+ клеток. При этом боль-

шинство из них коэкспрессировало антиген CD5+.

Наличие коэкспрессии CD5/CD19, CD5/CD23,

CD19/CD23 характерно для клеток В-ХЛЛ.

Необходимо отметить, что на подложке биочи-

па были иммобилизованы антитела, специфичные

к антигенам CD5, CD16, CD19, специфичные

к этим же антигенам флуоресцентно меченые ан-

титела также вносились в каналы устройства. Это

было необходимо для того, чтобы проверить воз-

можное наличие перекрестной реактивности анти-

тел. В данном случае перекрестная реактивность

не была обнаружена.

Рис. 4. Микрофотографии поверхности биочипа в области пересе-

чения тестовых участков и каналов, в которые в процессе анализа

вносили растворы FITC-меченых антител. Рамка приспособления

снята. Микрофотографии выполнены при ультрафиолетовом осве-

щении: а — увеличение в 50 раз; б — увеличение в 100 раз

a б

282

’2

01


Результаты определения содержания клеток,

имеющих каждый из указанных антигенов, были со-

поставлены с данными, полученными при использо-

вании биочипов 1-го типа, и данными, полученными

методом проточной цитофлуориметрии (рис. 5, 6).

Результаты, полученные с помощью биочипов

обеих конструкций, хорошо соответствовали друг

другу. Результаты, полученные с помощью проточ-

ной цитофлуориметрии, также были близкими, не-

смотря на использование антител другого произво-

дителя.

При проведении исследования клеток больной

В-ХЛЛ методом проточной цитофлуориметрии

определялось высокое содержание клеток, имеющих

коэкспрессию CD5/CD19 (71 %), CD5/CD23 (70 %)

и CD19/CD23 (65 %).

ОбсуждениеПредставленные результаты демонстрируют воз-

можность определения нескольких вариантов ко-

экспрессии при использовании антител, конъюги-

рованных с флуорохромной меткой одного и того же

типа. В области пересечения каждого канала с тесто-

вым участком биочипа 2-го типа на связанных клет-

ках может быть определено наличие или отсутствие

коэкспрессии 2 антигенов при заполнении канала

раствором одного вида антител. Каждый канал пере-

секает все тестовые участки биочипа, поэтому сразу

определяется наличие или отсутствие коэкспрессии

нескольких пар антигенов.

Возможно заполнение одного и того же канала

раствором, содержащим несколько видов антител

с разной специфичностью, меченных разными мет-

ками. Также могут быть значительно увеличены ко-

Тестовые участки

биочипа

№ прорези рамки

1 2 3 4 5 6

Дополнительно добавленные меченые антитела

№

Иммобили-

зованные

антитела

Анти-CD3

FITC

Анти-CD5

FITC

Анти-CD16

FITC

Анти-CD19

FITC

Анти-CD20

FITC

Анти-CD45

FITC

1 Анти-CD4 65 ± 7/65 ± 7 67 ± 5/67 ± 5 63 ± 7/0 65 ± 5/0 62 ± 5/0 68 ± 6/68 ± 6

2 Анти-CD5 74 ± 6/70 ± 3 72 ± 5/72 ± 5 70 ± 7/0 73 ± 5/0 76 ± 5/0 71 ± 5/71 ± 5

3 Анти-CD8 28 ± 5/28 ± 5 30 ± 6/29 ± 6 27 ± 6/0 29 + 4/0 26 ± 5/0 27 ± 7/27 ± 7

4 Анти-CD16 12 ± 3/0 12 ± 5/0 13 ± 4/13 ± 4 14 ± 4/0 11 ± 4/0 13 ± 5/13 ± 5

5 Анти-CD19 15 ± 4/0 16 ± 5/0 14 ± 5/0 15 ± 6/15 ± 6 14 + 4/14 ± 4 13 ± 4/13 ± 4

6 Анти-CD23 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

7 Анти-CD45 100/73 ± 3 100/76 ± 5 100/13 ± 5 100/16 ± 6 100/15 ± 3 100/100

Таблица 1. Результат исследования клеток здорового человека с помощью биочипа 2-го типа

Примечание (здесь и в табл. 2): выделение цветом — наличие флуоресцирующих клеток; …/… — общее содержание клеток, имеющих

антиген (%) / содержание клеток, имеющих флуоресценцию (%). Приводятся ошибки среднего.

Тестовые участки

биочипа

№ прорези рамки

1 2 3 4 5 6

Дополнительно добавленные меченые антитела

№

Иммобили-

зованные

антитела

Анти-CD3

FITC

Анти-CD5

FITC

Анти-CD16

FITC

Анти-CD19

FITC

Анти-CD20

FITC

Анти-CD45

FITC

1 Анти-CD4 10 ± 3/10 ± 3 8 ± 3/7 ± 3 9 ± 4/0 10 ± 4/0 11 ± 4/0 8 ± 4/8 ± 4

2 Анти-CD5 74 ± 4/9 ± 4 75 ± 4/75 ± 4 76 ± 3/0 72 ± 4/60 ± 7 75 ± 5/62 ± 6 71 ± 6/71 ± 6

3 Анти-CD8 10 ± 3/10 ± 3 8 ± 3/8 ± 3 9 ± 3/0 11 ± 4/0 10 ± 4/0 12 ± 4/12 ± 4

4 Анти-CD16 0/0 1,4 ± 1/0 2 ± 1/2 ± 1 1 ± 1/0 0/0 2 ± 1/2 ± 1

5 Анти-CD19 92 ± 6/0 92 ± 7/63 + 7 90 ± 5/0 91 ± 6/91 ± 6 87 ± 7/83 ± 7 89 ± 5/89 ± 5

6 Анти-CD23 74 ± 6/0 68 ± 7/65 ± 5 70 ± 5/0 72 ± 4/72 ± 4 71 ± 6/71 ± 6 72 ± 3/72 ± 3

7 Анти-CD45 100/10 ± 4 100/76 ± 6 100/2 ± 1 100/88 ± 4 100/87 ± 5 100/100

Таблица 2. Результат исследования клеток больной В-ХЛЛ с помощью биочипа 2-го типа

29

2’

20

11


Рис. 5. Результаты исследования клеток здорового человека, полу-

ченные: а – при использовании биочипа 1-го типа; б – методом про-

точной цитофлуориметрии

110100

908070605040302010

0CD3 CD4 CD5

Антиген

Соде

ржан

ие к

лето

к (%

)

CD8 CD16 CD19 CD20 CD23 CD45

110100

908070605040302010

0

Соде

ржан

ие к

лето

к (%

)

CD3 CD4 CD5

Антиген


а

б

110100

908070605040302010

0CD3 CD4 CD5

Антиген

Соде

ржан

ие к

лето

к (%

)


110100

908070605040302010

0

Соде

ржан

ие к

лето

к (%

)

CD3 CD4 CD5

Антиген


а

б

Рис. 6. Результаты исследования клеток больной В-ХЛЛ, получен-

ные: а — при использовании биочипа 1-го типа; б — методом проточ-

ной цитофлуориметрии

личество каналов рамки и количество тестовых

участков (полос) биочипа 2-го типа. Таким образом,

при использовании данного подхода в дальнейшем

можно будет одновременно определять наличие или

отсутствие коэкспрессии нескольких антигенов на

каждой отдельно взятой клетке и десятки или сотни

различных вариантов коэкспрессии антигенов на

разных клетках.

При использовании существующего экспери-

ментального образца приспособления в каждый ка-

нал требовалось вносить не менее 5 мкл раствора ме-

ченых антител. Это достаточно много, но данный

объем можно будет значительно уменьшить при из-

менении конструкции некоторых элементов приспо-

собления. Безусловно, проведение анализа описанным

способом является достаточно трудоемким. Но в даль-

нейшем возможна его полная или частичная автома-

тизация. Поэтому представленное здесь приспосо-

бление, предназначенное для работы с биочипом

2-го типа, необходимо рассматривать как прототип

для последующего создания более совершенных

конструкций.

Необходимо отметить, что достаточно похожая

с технической точки зрения идея используется в тех-

нологии, известной как метод микропроточных сетей

(microfluidic network — μFN). Но ее применение сво-

дится к технологии изготовления биочипов и способу

приведения их поверхности в контакт с исследуемой

жидкостью. О работах, в которых подобный подход

использовался бы для определения коэкспрессии ан-

тигенов клеток, нам ничего не известно.

Необходимо отметить, что идея определения

множества вариантов коэкспрессии антигенов на

одном биочипе может быть реализована не только

при использовании описанного выше технического

решения, когда применяется комбинация биочипа

(одноразового использования), представленного на

рис. 2, и инкубационно-отмывочного приспособле-

ния (многоразового использования), представлен-

ного на рис. 3. Возможно также применение биочипа

(патент на полезную модель RU 92964) одноразового

использования, содержащего в своей конструкции

все основные элементы описанного выше приспосо-

бления. Экономически более оправдано применение

одноразового биочипа и многоразового инкубацион-

но-отмывочного устройства, которые описаны в этой

статье. Но после каждого использования будет необ-

ходима стерилизация данного устройства. Поэтому

выбор того или иного из вариантов должен быть обу-

словлен практической целесообразностью и сообра-

жениями безопасности при проведении конкретного

исследования.

При возможности определения даже несколько

большего количества антигенов на разных клетках

(по факту связывания клеток в тестовых участках)

биочип 1-го типа имел значительно меньшие разме-

ры. Поэтому для проведения исследования требова-

лось меньшее количество клеточной суспензии. Но

использование биочипов 2-го типа давало преиму-

щества, описанные выше. Поэтому выбор конструк-

ции используемых биочипов должен зависеть от

условий, необходимых для решения тех или иных

диагностических или исследовательских задач.

302

’2

01


Описанный способ проведения анализа намного

превосходит по своим возможностям общепринятые

методы иммунофлуоресцентного исследования кле-

ток [13, 14]. Но по сравнению с проточной цитофлуори-

метрией он требует большего расхода клеточной су-

спензии. Кроме того, данный способ будет заведомо

проигрывать ей в точности при определении содер-

жания очень малых иммунологических субпопуля-

ций клеток. Поэтому в существующем виде и при ис-

пользовании описанной методики данная разработка

не может быть использована для решения, напри-

мер, таких задач, как выявление минимальной оста-

точной болезни или определение концентрации

в крови стволовых клеток.

Однако ее применение позволяет проводить ана-

лиз без дорогостоящего проточного цитофлуориме-

тра с использованием гораздо более дешевого люми-

несцентного микроскопа. При этом возможно одно-

временное определение большего числа вариантов

коэкспрессии антигенов при использовании такого

же набора меченых антител.


1. Chang T.W. Binding of cells of distinct

antibodies coated on solid surface. Journal Of

Immunological Methods 1983;65:217–23.

2. Belov L., de la Vega O., dos Remedios C.G.,

Mulligan S.P., Christopherson R.I.

Immunophenotyping of leukemias using a

cluster of differentiation antibody microarray.

Cancer research 2001;61:4483–9.

3. Belov L., Huang P., Barber N.,

Mulligan S.P., Christopherson R.I.

Identification of repertoires of surface antigens

on leukemias using an antibody microarray.

Proteomics 2003;3:2147–54.

4. Belov L., Huang P., Chrisp J.S.,

Mulligan S.P., Christopherson R.I. Screening

microarrays of novel monoclonal antibodies

for binding to T-, B- and myeloid leukaemia

cells B. Journal of Immunological Methods

2005;305:10–9.

5. White S.L., Belov L., Barber N.,

Hodgkin P.D., Christopherson R.I.,

Immunophenotypic changes induced on

human HL60 leukaemia cells by la,25-

dihydroxyvitamin D3 and 12-O-tetradecanoyl

phorbol-13-acetate. Leukemia Research

2005;29:1141–51.

6. Campbell C.J., O'Looney N., Chong

Kwan M., Robb J.S., Ross A.J., Beattie J.S.,

Petrik J. & Ghazal P. A cell interaction

microarray for blood phenotyping. Anal Chem

2006;78:1930–8.

7. Ellmark P., Belov L., Huang P.,

Soon Lee С., Solomon M.J., Morgan D.K.,

Christopherson R.I. Multiplex detection

of surface molecules on colorectal cancers.

Proteomics 2006;6:1791–802.

8. Woolfson A., Stebbing J., Tom B.,

Stoner D.M., Gilks W.R., Kreil D.P.,

Mulligan S.P., Belov L., Chrisp J.S.,

Errington W., Wildfire A., Erber W.N.,

Bower M., Gazzard B., Christopherson R.I.,

Scott M.A. Conservation of unique cell-

surface CD antigen mosaics in HIV-1-infected

individuals. Blood 2005;106(3):1003–7.

9. Liu A.Y. Differential Expression of Cell

Surface Molecules in Prostate Cancer Cells.

Cancer Research 2000;60:3429–34.

10. Ko I.K., Kato K. & Iwata H. Antibody

microarray for correlating cell phenotype with

surface marker. Biomaterials 2005;26:687–96.

11. Шишкин А.В., Шмырев И.И.,

Кузнецова С.А., Овчинина Н.Г., Бутылин

А.А., Атауллаханов Ф.И., Воробьев А.И.

Иммунологические биочипы для параллель-

ного определения поверхностных антигенов

и морфологического исследования клеток.

Биологические мембраны 2008;4:277–84.

12. Шишкин А.В. Иммунологические био-

чипы для исследования клеток. Собствен-

ный опыт разработки. Некоторые но-

вые подходы к проведению анализа. LAP

Lambert Academic Publishing & Co. KG-2010.

158 с. ISBN 978-3-8433-0053-7.

13. Молекулярная клиническая диагности-

ка. Методы. Под редакцией С. Херингтона

и Дж. Макги. М.: Мир, 1999.

14. Саркисов Д.С., Петров Д.С. Микро-

скопическая техника. М.: Медицина, 1996.

544 с.

Помимо определения коэкспрессии антигенов

подобный подход в дальнейшем может быть исполь-

зован и для выполнения других типов комбиниро-

ванных исследований связавшихся клеток, требую-

щих приведения различных участков поверхности

биочипа в контакт с малыми объемами растворов

различных реагентов или красителей без их смеши-

вания друг с другом. Поэтому дальнейшее развитие

данного направления представляется нам перспек-

тивным.

Выводы1. Биочип 2-го типа в сочетании с разработан-

ным приспособлением позволяет проводить опреде-

ление нескольких вариантов коэкспрессии с исполь-

зованием антител, конъюгированных с одинаковой

флуоресцентной меткой.

2. Результаты анализа, выполненного с примене-

нием биочипов 1-го и 2-го типа, сопоставимы друг

с другом и результатами проточной цитофлуориме-

трии.

К О Н Ф Е Р Е Н Ц И И , С И М П О З И У М Ы , С О В Е Щ А Н И Я 31

2’

20

11

МатериалыV I I Р о с с и й с к о г о с и м п о з и у м а

« Б и о л о г и ч е с к и е о с н о в ы т е р а п и и о н к о л о г и ч е с к и х

и г е м а т о л о г и ч е с к и х з а б о л е в а н и й »

Москва, 1–4 июня 2011 г.

К О Н Ф Е Р Е Н Ц И И , С И М П О З И У М Ы , С О В Е Щ А Н И Я322

’2

01

1

Уважаемые читатели!

Редакция журнала «Онкогематология» выражает благодарность всем авторам тезисов, прислан-ных участниками Российского симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и ге-матологических заболеваний», которые посвящены широкому кругу теоретических и практиче-ских проблем современной медицинской науки. Мы были рады предоставить страницы журнала молодым исследователям и маститым ученым, так как, на наш взгляд, эта информация отражает большие потенциальные возможности научного сообщества из многих регионов и позволяет на-деяться на дальнейшее развитие исследовательских программ, появление новых имен и серьез-ных научных достижений.

Экспертная комиссия провела обсуждение присланных в редакцию материалов и сочла возмож-ным отклонить ряд работ, в основном по причине их вторичности.

Считаем, что возможность представить результаты своих исследований на суд широкой профессио-нальной аудитории дает молодым ученым стимул к дальнейшему развитию и заставляет строже оценивать значимость и качество своего труда.

Желаем успехов участникам симпозиума.

Редакция журнала «Онкогематология»

ОТ РЕДАКЦИИ / FROM EDITION


2’

20

11Распространенность CMV-инфекции

у детей с билиарной атрезией

Ю.В. Аверьянова1, Е.В. Райкина2, В.О. Бобрынина2, А.Э. Степанов1, Г.И. Волкова1, Ю.Н. Иванова1,

С.П. Макаров1

1ФГУ Российская детская клиническая больница

Минздрав соцразвития России;2ФГУ Федеральный научно-клинический центр

детской гематологии, онкологии и иммунологии

Минздрав соцразвития России, Москва

Этиология и патогенез билиарной атрезии (БА)

до конца не изучены. В настоящее время наиболее

убедительной кажется теория генетически детерми-

нированного и вирус-ассоциированного пускового

механизма иммуноопосредованной фиброоблитера-

ции желчных протоков.

Цель работы. Исследование группы больных

с БА на наличие гепатотропных герпесвирусов и ана-

лиз распространенности вирусной инфекции.

Материалы и методы исследования. С 2004 по

2009 г. было обследовано 52 ребенка с БА в возрасте

от 3 недель до 4,5 месяцев. ДНК цитомегаловируса

(CMV), вируса Эпштейна–Барр (EBV) и вируса про-

стого герпеса 6-го типа (HHV-6) определяли мето-

дом полимеразной цепной реакции в реальном вре-

мени (ПЦР-РВ). Выделение ДНК, качественное

и количественное определение вирусов проводили

коммерческими наборами реагентов фирмы Интер-

ЛабСервис, Россия. Для амплификации и определе-

ния продуктов ПЦР использовали приборы «Rotor-

Gene 6000», Corbett Research, Австралия.

Материалом исследования служили кровь, слю-

на, моча, биоптат печени пациентов, а с 2007 г. —

грудное молоко матерей детей с БА, находящихся на

грудном вскармливании. Количественный монито-

ринг CMV и EBV проводили только в образцах крови

и грудном молоке. Положительным результатом счи-

тали наличие более 500 копий вируса в 1 мл биологи-

ческой жидкости.

Результаты. При анализе полученных результа-

тов обнаружено, что EBV и HHV-6 в крови выявлены

только у 3,8 % (2) и 1,9 % (1) больных соответственно.

В биоптате печени EBV и HHV-6 определены у 1,9 %

(1) больных. ДНК CMV присутствовала во всех био-

логических образцах у 54 % (28) детей.

В 73 % (38) случаев выявлена CMV-инфекция

в стадии репликации с титром от 500 до 30 000 копий

вируса в 1 мл крови. Из них у 58 % (22) ДНК CMV

также обнаружена и в биоптате печени.

Выводы. Наше исследование показало, что в по-

ловине случаев у пациентов с БА во всех биологиче-

ских образцах выявляли CMV. При большом титре

CMV в грудном молоке вопрос о прекращении груд-

ного вскармливания решался индивидуально. На

этапе эмбриогенеза CMV может служить основным

фактором, приводящим к запуску цепи патологиче-

ских реакций и формированию врожденных дефек-

тов, связанных с данным заболеванием.

По нашим данным, клинически значимым явля-

ется определение CMV в крови и биоптате печени,

что позволяет своевременно провести специфиче-

скую терапию. Эрадикация вируса и адекватное

лечение CMV-гепатита у больных с БА оказывают

существенное влияние на благоприятный исход за-

болевания. Выявление CMV в образцах слюны и мо-

чи у пациентов с БА клинически не оправданно, по-

скольку латентное течение CMV-инфекции не имеет

прогностического значения и не требует какого-

либо лечения.

Пространственный рост фибринового сгустка как новый метод диагностики

кровоточивости и тромбозов

Ф.И. Атауллаханов1,2, А.Н. Баландина1,2, М.А. Пантелеев1,2, В.М. Емельяненко1, Г.М. Галстян1,

К.Г. Копылов1, М.А. Кумскова1, С.С. Карамзин1, О.А. Фадеева1, Н.С. Сошитова2, Е.Н. Липец1,

И.Д. Тарандовский2, И.А. Щербина1

1ФГБУ Гематологический научный центр

Минздравсоцразвития России;2Центр теоретических проблем физико-химической

фармакологии РАН, Москва

Введение. Болезни системы кровообращения — ве-

дущая причина смертности населения в России. Часто

непосредственной причиной смерти при этом является

нарушение в работе системы свертывания — кровоте-

чение и тромбоз. Поэтому своевременная диагностика

и мониторинг состояния пациентов с риском таких на-

рушений представляют собой одну из актуальных задач

современной медицины. Важным аспектом свертыва-

ния крови в организме служит его пространственная

неоднородность. Свертывание активируется в месте

повреждения от экспрессирующих тканевый фактор

клеток. Далее сгусток распространяется от места акти-

вации вглубь сосуда, образуя объемную структуру, за-

крывающую место повреждения. Однако до сих пор

применяемые в клинической практике тесты для оцен-

ки статуса системы свертывания предполагают полное

перемешивание образца крови/плазмы с активатором

свертывания. Такие тесты не в состоянии корректно

оценить работу системы гемостаза.

Цель данной работы — исследовать возможности

метода регистрации пространственного роста сгуст-

ка в клинической практике и оценить его предсказа-

тельную силу.

Материалы и методы. В исследовании участвовали

пациенты с различными нарушениями свертывания,

включая патологии как с риском тромбоза (сепсис, он-

когематологические заболевания, сердечно-сосудис-


’2

01

1 тые заболевания), так и с риском кровотечения (гемо-

филии А и Б). Свертывание крови оценивали стандарт-

ными методами (активированное частичное тромбо-

пластиновое время, протромбиновый индекс,

Д-димеры, тромбоэластография) и с помощью прибо-

ра Тромбоимиджер, который позволяет регистриро-

вать формирование и рост фибринового сгустка от по-

верхности с иммобилизованным тканевым фактором

в тонком неперемешиваемом слое свободной от тром-

боцитов плазмы. Регистрация производится оптиче-

ским методом, по сигналу светорассеяния. Основным

параметром данного анализа является скорость рас-

пространения сгустка от активирующей поверхности.

Результаты. У части пациентов с рисками тромбоза

образование сгустка от активирующей поверхности со-

провождается сгустками, формирующимися вдали от

места активации в виде спонтанных центров роста. На

примере пациентов с сепсисом (N = 18), химиотерапи-

ей при онкогематологических заболеваниях (N = 36)

и сердечно-сосудистыми заболеваниями (N = 90) пока-

зано, что степень спонтанного свертывания коррели-

рует с тяжестью заболевания и риском тромботических

осложнений. Так, появление гиперкоагуляции на одни

сутки предшествует увеличению уровня Д-димеров

в 80 % случаев (N = 6), при этом не было случая, чтобы

пространственный рост сгустка не показал гиперкоагу-

ляцию при увеличении уровня Д-димеров. Это свиде-

тельствует о хорошей предсказательной силе метода

пространственного роста сгустка. В 2 случаях переход

системы свертывания в состояние гиперкоагуляции

сопровождался тромбозом и тромбоэмболией. Во всех

вариантах гиперкоагуляции и риска тромбоза стан-

дартные коагулологические тесты показывают суще-

ственно меньшую чувствительность к тромботическим

осложнениям, а в некоторых случаях показывают нор-

мокоагуляцию. Скорость роста сгустка у пациентов

с гемофилией существенно снижена и коррелирует

с тяжестью заболевания и частотой кровотечений

(N = 9). При этом уровень фактора VIII не отражает тя-

жести течения гемофилии и эффективность терапии

у данных пациентов. Также метод пространственного

роста сгустка имеет высокую чувствительность к кор-

ректирующей плазменный гемостаз терапии.

Выводы. Данные проведенного исследования де-

монстрируют, что учет пространственной неодно-

родности при формировании сгустка представляет

перспективный метод оценки гемостаза у пациентов

с широким спектром заболеваний, связанных с пато-

логиями системы свертывания.

Работа была частично поддержана грантом Пре-

зидента РФ для молодых кандидатов наук MK-

155.2010.4 и грантами РФФИ 09-04-00232, 09-04-

00357, 09-04-92427, 09-02-00018.

Определение клинически значимыхпараметров цитомегаловирусной

инфекции у реципиентовгемопоэтических стволовых клеток

И.М. Бархатов, В.Н. Вавилов, А.В. Акимова, И.С. Соломонова, Л.С. Зубаровская, Б.В. АфанасьевИнститут детской гематологии и трансплантологии

им. Р.М. Горбачевой ГОУ ВПО Санкт-Петербургский

государственный медицинский университет

им. акад. И.П. Павлова

Среди патогенов, вызывающих инфекционные

осложнения у пациентов после трансплантации

гемо поэтических стволовых клеток (ТГСК), одно из

важнейших мест в структуре посттрансплантацион-

ной заболеваемости и смертности занимают ослож-

нения, обусловленные цитомегаловирусом (ЦМВ).

В то же время, в силу широкого спектра побочных

действий противовирусных препаратов является ак-

туальным подбор адекватной стратегии терапии как

в зависимости от вирусной нагрузки, так и от сероло-

гического статуса донора и реципиента, что может

быть достигнуто на основе мониторинга ЦМВ-

инфекции (ЦМВИ) методом ПЦР.

Целью нашего исследования — определение кли-

нически значимых параметров ЦМВИ с помощью

измерения уровней и динамики вирусной нагрузки

(ВН) методом количественной ПЦР в реальном вре-

мени для выбора оптимальных схем противовирус-

ного лечения и профилактики.

Материалы и методы. В ходе работы были проана-

лизированы образцы крови и костного мозга 96 паци-

ентов, перенесших аллогенную ТГСК (59 HLA-

совместимых неродственных, 32 родственных и 7 от га-

плоидентичных доноров). Немиелоаблативные

режимы кондиционирования применялись в 61, мие-

лоаблативные — в 35 случаях. Все пациенты, транс-

плантированные от неродственного или гаплоиден-

тичного донора, получали антитимоцитарный

глобулин (АТГ). Проводилось определение ВН в лик-

воре и плазме крови (с определением количества ко-

пий вируса на 1 мл материала), а также в образцах кост-

ного мозга (с нормализацией копий ДНК ЦМВ на 106

ядросодержащих клеток) с использованием тест-

систем АмплиСенс CMV-монитор или АмплиСенс

CMV-скрин-титр (ИнтерЛабСервис, Россия).

Результаты. Реактивация ЦМВИ наблюдалась у па-

циентов в 85 % случаев в раннем и в 15 % случаев —

в позднем посттрансплантационном периоде. Реакти-

вация не зависела от интенсивности режимов конди-

ционирования, но была существенно выше

у пациентов, перенесших неродственную аллогенную

трансплантацию по сравнению с трансплантацией от

родственного донора (75 % и 40 % соответственно).

Профилактика реакции «трансплантат против хозяи-


2’

20

11на» с использованием АТГ ассоциировалась с увели-

ченным риском реактивации — 70 % с АТГ по сравне-

нию с 34 % без АТГ. Частота реактивации ЦМВИ в се-

ронегативных парах была существенно ниже (18 %) по

сравнению с трансплантациями, где донор или реци-

пиент имели специфические антитела. Копийность

ЦМВ в плазме находилась в прямой корреляционной

зависимости от количества копий вирусной ДНК, нор-

мализованной на 106 клеток костного мозга (p < 0,01).

Только у 2 пациентов определялся низкий титр ДНК

ЦМВ (до 103) в костном мозге на фоне неопределяемой

ВН в плазме.

Результаты исследований позволили сформули-

ровать следующие выводы:

1. Анализ плазмы не менее информативен по

сравнению с исследованием костного мозга и пока-

зан при мониторинге инфекции в период цитопе-

нии.

2. Поздняя реактивация ЦМВИ происходит зна-

чительно реже, чем ранняя.

3. Высокий уровень ВН чаще всего отмечается

после неродственной ТГСК, миелоаблативного ре-

жима кондиционирования, при комбинации сероло-

гического статуса реципиент/донор +/–.

4. Мониторинг развития инфекции позволяет

оптимально подбирать схемы противовирусного ле-

чения.

Опыт определения доли мутантного аллеля JAK2V617F

в клинической практике

О.В. БердюгинаГУЗ Свердловская областная клиническая больница № 1,

Екатеринбург

Связь уровня аллельной нагрузки с неблагопри-

ятным течением хронических миелопролифератив-

ных заболеваний — хМПЗ (истинной полицитемии,

идиопатической тромбоцитемии и идиопатического

миелофиброза) была обнаружена разными авторами

и в настоящее время является общепризнанным

фактом. В научной литературе встречаются единич-

ные упоминания о наличии мутации JAK2V617F

у больных с острым мегакариобластным лейкозом,

хроническим миеломоноцитарным лейкозом,

острым и хроническим миелолейкозом, миелодис-

пластическим синдромом, а также в единичных слу-

чаях при B-клеточном остром лейкозе с болезнью

Дауна.

Цель данной работы — определение диагностиче-

ского значения выявления мутации JAK2V617F

у больных с признаками поражения миелоидного

ростка кроветворения.

Лабораторное исследование проведено у 43 паци-

ентов: 46,5 % от общего числа (20 человек) составляли

мужчины, средний возраст которых был 58 ± 18 лет

(среднее ± среднее квадратичное отклонение); 53,5 %

от числа обследованных составляли женщины (23

больных) со средним возрастом 65 ± 12 лет. Кровь из

периферической вены забирали в пробирку с антикоа-

гулянтом (ЭДТА). Наличие точечного полиморфизма

определяли методом полимеразной цепной реакции

в TaqMan-варианте с детекцией в режиме реального

времени (амплификатор Rotor Gene, Cobbett Research)

с использованием реагентов MutaQuant, Ipsogen,

Франция. Количественное определение мутантного

аллеля V617F в гене JAK2 выражалось в процентах по

отношению к дикому типу.

Использование аллель-специфических праймеров,

способных различить мутантные варианты исследо-

ванного полиморфизма в гене JAK2, позволило устано-

вить следующее. У мужчин распределение аллельной

нагрузки было следующим: при МПЗ JAK2V617F встре-

чался у 12,5 % больных мужчин, при хМПЗ — у 57 %;

у женщин при МПЗ — в 42,8 %, при хМПЗ — у 75 %.

Выявлено по одному случаю наличия JAK2V617F

у мужчин и у женщин при хроническом миелолейкозе.

Определение точечной мутации JAK2V617F при лим-

фоме показало величину аллельной нагрузки 0,001 %,

что подтверждает ранее опубликованные данные. Еди-

ничные параллельные исследования на наличие мута-

ции JAK2V617F в периферической крови и костном

мозге показали их согласованность. Разница в величи-

не аллельной нагрузки составила менее 1,5 %. Изуче-

ние аллельной нагрузки в контрольной группе (здоро-

вые доноры) показало, что в норме данная величина

варьирует в пределах 0,7 ± 0,2 %.

Таким образом, использование методов молеку-

лярной диагностики точечной мутации JAK2V617F

позволяет верно определять даже незначительное

увеличение аллельной нагрузки у пациента, что мо-

жет быть использовано для определения минималь-

ной остаточной болезни.

Индукция иммунной толерантностиу детей с ингибиторной формой

гемофилии А

В.В. Вдовин1, П.В. Свирин1,2, Е.Э. Шиллер1, Э.В. Агеенкова1, Е.К. Донюш1, Л.Е. Ларина1,

Е.Н. Лучинкина1, О.В. Малкова1, В.Ю. Петров1, Г.И. Сосков1, Е.А. Яценко1

1Измайловская детская городская клиническая

больница № 3; 2ФГУ Федеральный научно-клинический центр


Минздравсоцразвития России, Москва

По современным данным, наиболее эффективным

способом лечения ингибиторной формы гемофи-

лии A является индукция иммунной толерантности

(ИИТ) по Боннскому протоколу с использованием


’2

01

1 концентратов фактора VIII, содержащих фактор

Виллебранда.

Мы наблюдали 25 детей из Москвы и Московской

области с ингибиторной формой гемофилии A. Из них

на ИИТ по Боннскому протоколу были взяты 17 паци-

ентов. К настоящему моменту курс ИИТ закончен у 8

больных с высокореагирующим ингибитором: 2 паци-

ента прекратили терапию в связи с отсутствием

эффекта, 1 пациент после получения хорошего ответа

прекратил лечение в связи с несоблюдением режима

терапии. У этого пациента сохраняется значительно

сокращенное время полувыведения и снижен тест вос-

становления, однако имеется хороший клинический

эффект на фоне получаемой им профилактической те-

рапии. У 5 пациентов ИИТ была полностью успешна,

и они переведены на высокодозную профилактику.

Медиана времени от начала ИИТ до того момента, ког-

да ингибитор перестал определяться прямым методом,

у этих пациентов составила 78 дней (14–194). Медиана

длительности ИИТ составила 1075 дней (1009–1299).

На курс лечения пациентам понадобилось 144362,6 ±

24040,7 МЕ/кг.

Выявление поражения костного мозгау больных нейробластомой

с использованием молекулярныхмаркеров

А.Е. Друй1,2, Г.А. Цаур1,2, А.М. Попов 1,2, Е.В. Шориков1,2, Л.И. Савельев3, Л.Г. Фечина1,2

1Областная детская клиническая больница № 1;2Институт медицинских клеточных технологий;

3ГОУ ВПО Уральская государственная медицинская

академия, Екатеринбург

Цель исследования — оценка возможности ис-

пользования экспрессии генов TH, GD2 и ELAVL4

для оценки поражения костного мозга (КМ) у паци-

ентов с нейробластомой в сравнении с геном

PHOX2B.

Методы. Мы проанализировали экспрессию мо-

лекулярных маркеров методом ПЦР в реальном

времени в 331 образце КМ от 57 больных нейробла-

стомой и 26 образцах КМ пациентов без злокаче-

ственных опухолей.

Результаты. Экспрессия PHOX2B и TH в нормаль-

ном КМ не была выявлена, экспрессия ELAVL4

определялась в 20, а GD2 — в 15 из 26 образцов КМ

пациентов без злокачественных новообразований.

Как истинно позитивные на основании обнаруже-

ния опухолевых клеток в цитологических препаратах

КМ или экспрессии гена PHOX2B были расценены

107 образцов КМ больных нейробластомой. Из этого

числа ген PHOX2B был экспрессирован в 105 образ-

цах, TH — в 96, ELAVL4 и GD2 — в 107 образцах. Экс-

прессия гена TH была выявлена в 5 из 224 негатив-

ных образцов, ELAVL4 — в 209, GD2 — в 197. Экс-

прессия ТН в позитивных образцах была выше, чем

в негативных, а экспрессия GD2 и ELAVL4 в позитив-

ных образцах была достоверно выше экспрессии

этих маркеров как в негативных, так и в контроль-

ных образцах. Экспрессия РНОХ2В, ТН и GD2 оста-

валась стабильной во время терапии нейробластомы,

а экспрессия ELAVL4 — снижалась. С помощью

ROC-анализа выявлена сходная диагностическая

информативность PHOX2B и TH. Определение экс-

прессии генов PHOX2B и TH характеризовалось вы-

сокими значениями прогностической ценности по-

ложительного (1,000 и 0,950) и отрицательного (0,991

и 0,952) результатов, а также диагностической эф-

фективности теста (ДЭТ, 0,994 и 0,952 соответствен-

но). Сочетанное применение PHOX2B и TH не имело

преимуществ перед использованием только PHOX2B

(ДЭТ = 0,985). Значения ДЭТ генов GD2 и ELAVL4

были относительно низкими (0,828 и 0,767) в силу

невысоких значений диагностической чувствитель-

ности (0,589 и 0,467). Конвергентность между дан-

ными цитологического исследования и определения

экспрессии PHOX2B составила 80,1 %, TH — 80,3 %.

Экспрессия данных генов была выявлена в 4 случаях

локализованной нейробластомы: у 2 пациентов

с I стадией, и 2 — с III. В силу малого количества на-

блюдений не удалось выявить прогностического зна-

чения PHOX2B и TH в случаях нейробластомы, в ко-

торых по данным цитологии опухолевые клетки

в КМ не выявлялись.

Использование экспрессии генов NKX2, STEAP1 и CCND1 для оценки поражения

костного мозга у пациентовс опухолями семейства саркомы

Юинга

А.Е. Друй1,2, Г.А. Цаур1,2, А.М. Попов1,2, Е.В. Шориков1,2, Л.И. Савельев3, Л.Г. Фечина1,2


3ГОУ ВПО Уральская государственная медицинская

академия, Екатеринбург

Опухоли семейства саркомы Юинга у детей ха-

рактеризуются агрессивным течением и ранним по-

явлением отдаленных метастазов. Наиболее частыми

объектами метастазирования являются легкие, кости

скелета, костный мозг (КМ).

Цель исследования — оценка возможности ис-

пользования экспрессии генов NKX2, STEAP1

и CCND1 для оценки поражения КМ у пациентов

с саркомой Юинга и примитивными нейроэктодер-

мальными опухолями.


2’

20

11Методы. Нами была проанализирована экспрес-

сия молекулярных маркеров методом ПЦР в реаль-

ном времени в 59 образцах КМ больных и 8 образцах

КМ здоровых пациентов без злокачественных опу-

холей.

Результаты. Экспрессия NKX2 в нормальном

КМ не была выявлена, а экспрессия STEAP1

и CCND1 определялась в 8 образцах КМ пациентов

без злокачественных новообразований. Как истин-

но позитивные на основании обнаружения опухо-

левых клеток в цитологических препаратах КМ или

химерного транскрипта (EWS1-FLI или EWS1-

ERG) методом гнездной ПЦР были расценены 17

образцов КМ больных. Из этого числа ген NKX2

был экспрессирован в 16 образцах, STEAP1

и CCND1 — в 17 образцах. В 2 негативных образцах

определялась мРНК гена NKX2, а экспрессия

STEAP1 и CCND1 была выявлена во всех 42 негатив-

ных образцах. С помощью ROC-анализа выявлена

наибольшая диагностическая информативность

определения экспрессии NKX2. Были получены вы-

сокие значения прогностической ценности поло-

жительного (0,889), отрицательного (0,976) резуль-

татов, диагностической чувствительности (0,941),

специфичности (0,952), а также диагностической

эффективности теста (ДЭТ = 0,949). Значения ДЭТ

генов STEAP1 и CCND1 были низкими (0,695

и 0,763), при этом диагностическая чувствитель-

ность составила 0,824 и 0,588, а специфичность —

0,643 и 0,833 соответственно. Единственный пози-

тивный образец КМ, в котором отсутствовала экс-

прессия гена NKX2, был получен в момент первич-

ной диагностики. Опухолевые клетки в нем не были

выявлены цитологически, но обнаруживался хи-

мерный транскрипт EWS1-FLI. При этом в одно-

временно взятых образцах КМ из двух других лока-

лизаций определялась экспрессия и NKX2,

и EWS1-FLI, а цитологически они были негативны.

Таким образом, NKX2 имеет наилучшие диагности-

ческие характеристики при выявлении поражения

КМ у пациентов с опухолями семейства саркомы

Юинга, как на момент диагностики, так и в ходе те-

рапии. STEAP1 и CCND1 имеют достоверно более

низкие диагностические характеристики и их при-

менение для оценки поражения КМ нецелесо-

образно.

Цитотоксическая активностьводорастворимых порфирин-фуллере-

нов и аминоспиртов в отношениилейкемических клеток in vitro

М.В. Ефименко, Н.А. Хрипкова, Е.Ю. Осипова, С.А. Румянцев

ФГУ Федеральный научно-клинический центр



Совершенствование химиотерапии идет по пути

повышения эффективности и снижения токсичности

химиопрепаратов. Препараты на основе водораствори-

мых порфирин-фуллеренов (ВПФ) обладают способ-

ностью селективно связываться с мембраной лейкеми-

ческих клеток (ЛК) и таким образом могут проявлять

селективную противолейкемическую активность. Пре-

параты на основе аминоспиртов (АС) способны прояв-

лять прямое цитотоксическое действие на раковые

клетки in vitro.

Цель работы. Оценить чувствительность ЛК

и нормальных клеток крови и костного мозга (КМ)

к препаратам на основе ВПФ и АС in vitro.

Материалы и методы. В исследовании были ис-

пользованы ЛК, выделенные из образцов КМ паци-

ентов в возрасте от 10 мес до 16 лет с впервые диагно-

стированными нелечеными ОЛЛ — 25 образцов.

В качестве контрольной группы использовались мо-

нонуклеарные клетки, выделенные из крови здоро-

вых доноров в возрасте от 20 до 25 лет (n = 7). Объек-

том исследования являлись 3 химиопрепарата на

основе ВПФ (PMC16 в комплексе с ионами Co, 24Mg

и 25Mg) и 2 производных АС (In445 и In449). Чувстви-

тельность клеток оценивалась с помощью МТТ-

теста. Определяли полулетальные концентрации

препаратов (LC50) и сравнивали цитотоксическую

активность на ЛК КМ и мононуклеарные клетки

крови здоровых доноров.

Результаты. Были получены статистически досто-

верные различия между чувствительностью ЛК КМ

и нормальных лимфоцитов крови к препаратам

PMC16(Co), PMC16(25Mg) и к препаратам In445

и In449; медианы LC50 составляют 0,44 мг/мл; 33,43

мг/мл; 52,9 мкг/мл и 57,9 мкг/мл соответственно.

Препарат PMC16(24Mg) также проявляет цитотокси-

ческую активность в отношении ЛК (медиана LC50 —

3,79 мг/мл). Однако не было получено статистически

значимых различий LC50 этого препарата для ЛК

и нормальных клеток крови. Наибольшей цитоток-

сической активностью из группы ВПФ обладает пре-

парат PMC16(Co). Производные АС обладают при-

мерно одинаковой цитотоксичностью на ЛК КМ.

Выводы. Препараты ВПФ и АС проявляют селек-

тивную цитотоксическую активность в отношении


’2

01

1 лейкемических клеток in vitro и являются перспек-

тивными для дальнейшего изучения в качестве про-

тиволейкемических средств.

Применение рекомбинантногочеловеческого эритропоэтина

для лечения анемии при туберкулезе легких (пилотное исследование)

Н.В. Инякова1, В.Г. Демихов1, Е.Н. Долженко2, Т.А. Кокунова2, Т.Ю. Мисюрева2, Е.Ф. Морщакова1

1Рязанский филиал ФГУ Федеральный научно-

клинический центр детской гематологии, онкологии

и иммунологии Минздравсоцразвития России;2Рязанский областной клинический

противотуберкулезный диспансер

Цель исследования — оценить эффективность те-

рапии анемий у пациентов с туберкулезом легких

(ТБ) рекомбинантным человеческим эритропоэти-

ном (рч-ЭПО).

Материалы и методы. В исследование вошли 13

взрослых пациентов с ТБ легких и анемией (9 муж-

чин и 4 женщины), в возрасте 22–78 (40,46 ± 4,45)

лет. Средний уровень Hb до начала лечения составил

83,23 ± 2,30 г/л. Для коррекции анемии мы исполь-

зовали рч-ЭПО (эпоэтин-альфа). Путь введения рч-

ЭПО у 8 пациентов был подкожный и у 5 пациентов

внутривенный. Подкожно рч-ЭПО вводили 3 раза

в неделю в течение 3–6 недель в стартовой разовой

дозе 200 МЕ/кг. При отсутствии полного терапевти-

ческого ответа через 2 недели лечения, определяемо-

го как повышение уровня гемоглобина (Hb) на

5–7 г/л от исходного, отсутствии трансфузий эри-

троцитарной массы, разовая доза препарата увели-

чивалась до 300 МЕ/кг. Внутривенно рч-ЭПО вводи-

ли 1 раз в неделю в дозе 600 МЕ/кг. При достижении

целевого уровня Hb 115–120 г/л введение препарата

прекращали. Дополнительно всем пациентам назна-

чали 200 мг сульфата железа (Fe2+) в сутки пер-

орально (Сорбифер дурулес). При неэффективности

терапии в течение 2 недель в группе с внутривенным

введением рч-ЭПО и наличием у пациента анемии,

определяемой как ЖДА, пероральный препарат же-

леза заменялся на железа (III)-гидроксид сахароз-

ный комплекс (Венофер).

Результаты. У 10 (76,9 %) из 13 больных ТБ на

фоне лечения рч-ЭПО было отмечено достоверное

повышение уровня Hb. В группе пациентов с под-

кожным введением рч-ЭПО 6 (75 %) из 8 человек от-

ветили на терапию. В группе больных с внутривенным

введением рч-ЭПО у 4 (80 %) из 5 пациентов отмеча-

лась положительная динамика. У пациентов, отве-

тивших на терапию, средний недельный прирост Hb

составил 6,62 ± 0,88 г/л. Максимальный средний

уровень ретикулоцитов составил 2,91 ± 0,42 % и от-

мечался на 2-й неделе рч-ЭПО-терапии. У 3 пациен-

тов повышение уровня Hb на фоне лечения рч-ЭПО

не отмечалось, однако увеличение количества рети-

кулоцитов на 2-й неделе терапии (ретикулоцитар-

ный криз) наблюдалось у всех пациентов. Побочных

эффектов на фоне лечения выявлено не было.

Выводы. Отмеченное повышение уровня Hb у 10 из

13 пациентов с ТБ свидетельствует о высокой эффек-

тивности рч-ЭПО в терапии анемий у пациентов с ТБ.

Эффективность высокодознойтерапии с аутологичной транспланта-

цией гемопоэтических стволовыхклеток у детей с саркомой Юинга / PNET

И.В. Казанцев1, Т.В. Юхта2, А.Ю. Зинченко1,А.Г. Геворгян1, Е.В. Морозова1, С.А. Сафонова2,

Л.С. Зубаровская1, Ю.А. Пунанов2, Б.В. Афанасьев1

1Институт детской гематологии

и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой ГОУ ВПО

Санкт-Петербургский государственный медицинский

университет им. акад. И.П. Павлова;2ФГУ Научно-исследовательский институт онкологии

им. Н.Н. Петрова Минздравсоцразвития России,

Санкт-Петербург

Введение. Клиническое течение саркомы

Юинга / PNET у детей и подростков характеризуется

быстрым ростом опухолевой массы и ранним мета-

стазированием, что обуславливает неблагоприятный

прогноз у значительной части пациентов. Современ-

ные программы, совмещающие полихимиотерапию

(ПХТ) с хирургическим лечением и лучевой терапи-

ей, позволяют достичь 70–80 % 5-летней безреци-

дивной выживаемости у детей с локализованной

формой заболевания, но в группе неблагоприятного

прогноза 5-летняя бессобытийная выживаемость не

превышает 20–30 %. Согласно данным отдельных

исследований возможно улучшение прогноза для

данной группы пациентов за счет использования вы-

сокодозной ПХТ (ВДПХТ) с аутологичной транс-

плантацией гемопоэтических стволовых клеток

(ауто-ТГСК).

Материалы и методы. С февраля 2003 по март

2010 г. на базе НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова по-

лучили терапию 23 ребенка и подростка с саркомой

Юинга / PNET: 16 пациентов мужского и 7 женского

пола (соотношение М:Ж — 2,8:1), средний возраст

на момент постановки диагноза составил 12,6 (3–18)

года. Во всех случаях диагноз был подтвержден

гистологически. У 17 были выявлены отдаленные

метастазы и у 6 больных диагностирована локализо-

ванная форма заболевания. У всех пациентов с лока-

лизованной формой объем исходной опухоли превы-

шал 200 см3. Программа лечения включала в себя 6

курсов ПХТ (ифосфамид, винкристин, доксоруби-


2’

20

11цин и этопозид), хирургическое удаление или ло-

кальное облучение первичной опухоли (48–56 Гр).

Восемь пациентов, достигшие полной ремиссии, по-

лучили 8 курсов поддерживающей ПХТ (винкри-

стин, дактиномицин, ифосфамид). ВДПХТ с ауто-

ТГСК проведена 15 пациентам. Применены

следующие режимы кондиционирования: бусульфан

16 мг/кг и мелфалан 140 мг/м2 (у 13 пациентов), мел-

фалан 140–200 мг/м2 (у 2 пациентов). Использованы

различные источники гемопоэтических стволовых

клеток: костный мозг (КМ) — у 7, стволовые клетки

периферической крови (СКПК) — у 3, КМ и СКПК —

у 4 пациентов. Средняя доза CD34+-клеток в транс-

плантате составила 3,15 106 (1,0–8,9 106).

Результаты. В группе пациентов, получавших под-

держивающую терапию (n = 8), у 5 больных произошел

рецидив с обширным метастатическим поражением,

все они умерли от прогрессии основного заболева-

ния через 19–36 мес с момента первичного заболева-

ния. У 3 пациентов выявлен локальный рецидив (12

и 32 мес), они получили терапию 2-й линии (одному

проведена ВДПХТ с ауто-ТГСК), 1 из пациентов

умер от инфекционных осложнений терапии.

В группе пациентов, получивших ВДПХТ с ауто-

ТГСК (n = 15), 12 живы (7–43 мес после ВДПХТ), у 6

сохраняется полная ремиссия. Рецидив зафиксиро-

ван у всех пациентов, не достигших ремиссии к мо-

менту проведения ВДПХТ. Из пациентов, находив-

шихся на момент проведения ВДПХТ в полной ре-

миссии (n = 10), поздние рецидивы выявлены у 4,

1 умер от прогрессии заболевания. Использованные

режимы ВДПХТ характеризовались приемлемой ток-

сичностью: у всех больных развился мукозит II–III

степени, у 12 пациентов — фебрильная нейтропения,

у 3 наблюдался токсический гепатит.

При сравнении групп пациентов, получавших

поддерживающую терапию, и пациентов, которым

была выполнена ВДПХТ с ауто-ТГСК, не выявлено

достоверных различий в общей выживаемости (0,78

и 0,22; p = 0,7) и безрецидивной выживаемости (0,32

и 0,0; p = 0,9). Тем не менее, следует отметить разни-

цу в прогнозе между группами реципиентов ТГСК,

находившихся на момент ВДПХТ в полной и частич-

ной ремиссии (0,6 и 0,18; p = 0,17). Также наблюдается

достоверная разница в безрецидивной выживаемо-

сти между пациентами, достигшими полной ремис-

сии после индукционной терапии, которые в даль-

нейшем получали поддерживающую и интенсивную

ПХТ (0,6 и 0,0; p=0,3).

Выводы. ВДПХТ с ауто-ТГСК для группы высо-

кого риска пациентов с саркомой Юинга / PNET об-

ладает приемлемой токсичностью и позволяет зна-

чительно снизить частоту рецидивов у пациентов,

достигших полной ремиссии на момент выполнения

ВДПХТ. Применение ВДПХТ в качестве терапии

«спасения» при резистентных формах заболевания

неэффективно.

Актуальность определенияB- и T-лимфоцитарной клональностипри верификации диагноза лимфомы

Н.А. Казило1, Е.С. Захарова1, Д.Н. Стефанов2, М.Н. Синицына2, А.М. Ковригина2

1Институт биологии гена РАН;2Российский онкологический научный центр

им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Лимфомы — опухоли, происходящие из лимфо-

идных клеток иммунной системы. Своевременная

диагностика лимфопролиферативных заболеваний

актуальна в свете появления новых терапевтических

препаратов, нацеленных на определенные мишени

в опухолевой клетке. Одной из задач диагностики B-

и T-клеточных лимфом является применение

молекулярно-генетических методов верификации

диагноза, в частности метода определения клональ-

ности в популяции лимфоцитов. Определение В-

и Т-лимфоцитарной клональности часто играет зна-

чительную роль при верификации диагноза

в сложных и спорных случаях лимфопролифератив-

ных заболеваний, когда другие методы исследования

не могут однозначно отличить лимфому от реактив-

ных состояний.

В норме в тканях присутствует поликлональная

популяция В- и/или Т-лимфоцитов с разными вари-

антами генов иммуноглобулинов и Т-клеточных ре-

цепторов. При злокачественной трансформации

одна из клеток с одной конкретной конфигурацией

генов начинает размножаться, образуя монокло-

нальную популяцию.

Цель данной работы — исследование на лимфо-

цитарную клональность образцов тканей пациентов

в сложных случаях установки и верификации диа-

гноза.

В исследование был включен 41 пациент с лим-

фопролиферативными заболеваниями различной

природы (28 пациентов с В-клеточными лимфомами,

13 — с Т-клеточными). Было исследовано 43 образца

биоптата различных тканей пациентов, заключен-

ных в парафиновые блоки. Для определения кло-

нальности лимфоцитов использовали ПЦР-метод

исследований реаранжировок генетических локусов

тяжелых цепей иммуноглобулина (IGH) и -цепи

Т-клеточного рецептора (TCR). Результаты опреде-

лялись методом капиллярного гель-электро фореза

с использованием автоматического генетического

анализатора.

В результате проведенного исследования моно-

клональные перестановки гена тяжелой цепи имму-

ноглобулина были выявлены в 70 % случаев (21/30),

используя 2 мишени Fr3 (12/30, 40 %) и Fr2 (17/30,

57 %). Моноклональность по двум мишеням выявля-

лась в 69 % лимфом постгерминального и постфол-


’2

01

1 ликулярного происхождения, которые представляют

особую сложность при установлении точной нозоло-

гической формы заболевания. Данные заболевания

характеризуются большим количеством соматиче-

ских гипермутаций, что может приводить к наруше-

нию сайтов связывания праймеров.

Моноклональные перестановки были обнаруже-

ны для гена -цепи T-клеточного рецептора в 46 %

случаев (6/13 образцов). В частности, лимфоцитар-

ная клональность, выявленная в тканях пациентов,

страдающих грибовидным микозом, составляла

29 %, и в этих случаях подтверждался диагноз злока-

чественной лимфомы по целому спектру диагности-

ческих признаков. Грибовидный микоз, особенно на

ранних стадиях заболевания, часто схож по проявле-

ниям с многочисленными доброкачественными

кожными заболеваниями. Метод выявления лимфо-

цитарной клональности при данном заболевании

позволяет на ранних стадиях дифференцировать

грибовидный микоз от многочисленных кожных но-

зологий. Рассмотренный метод исследования кло-

нальности В- и Т-лимфоцитов помогает установить

правильный диагноз в сложных клинических ситуа-

циях, составляющих примерно 10 % от всех лимфо-

идных пролифераций.

Изоформы лиганда WNT11и их функциональные свойства

А.В. Кибардин, А.В. Посвятенко, К.В. Куликова, Н.В. Гнучев, Г.П. Георгиев, С.С. ЛаринИнститут биологии гена РАН, Москва

Сигнальный путь Wnt является мощным сиг-

нальным каскадом, играющим важную роль как

в раннем эмбриональном развитии, так и при разви-

тии онкологических заболеваний. «Каноническим»

называют сигнальный путь, регулирующий актив-

ность транскрипционных факторов семейства TCF/

Lef, ключевой молекулой которого является бета-

катенин. В отсутствие активации бета-катенин фос-

форилируется в результате связывания с дестабили-

зирующим комплексом белков, состоящим из APC,

Axin, GSK3b и CK1a, что приводит к его протеосом-

ной деградации. Активация «канонического» сиг-

нального пути происходит при связывании лигандов

семейства Wnt с трансмембранными рецепторами

Frizzled и ко-рецепторами LRP5/6, что приводит

к опосредованному Dishevelled разрушению дестаби-

лизирующего комплекса. В результате происходит

накопление бета-катенина и его транслокация в кле-

точное ядро, где он может регулировать транскрип-

ционную активность факторов семейства TCF. Мо-

лекулярные механизмы, в которых задействованы

компоненты сигнального пути Wnt, также могут ока-

зывать влияние на реорганизацию клеточного цито-

скелета, клеточную подвижность и клеточную поля-

ризацию независимо от транскрипционной актив-

ности TCF/Lef. Такие процессы относят к «некано-

ническому» сигнальному пути Wnt. Считается, что

«неканонический» сигнальный путь может вызывать

активацию малых ГТФ-аз Rac и Rho, кроме того,

описана возможность его влияния на уровень вну-

триклеточного кальция.

Выбор конкретного пути передачи сигнала зави-

сит от набора клеточных рецепторов, и в случае «не-

канонического» сигнального пути ко-рецепторами

для семейства Frizzeled вместо LRP5/6 служат

ROR1/2 или Ryk. Способность лиганда вызывать

взаимодействие рецептора и ко-рецептора определя-

ет выбор между «каноническим» и «неканониче-

ским» путем передачи сигнала, и возможна

комбинация рецепторов, при которой «неканониче-

ский» лиганд может активировать «канонический»

сигнальный путь.

Wnt11 является лигандом, способным активиро-

вать «неканонический» сигнальный путь Wnt. В дан-

ной работе нами была изучена возможная роль ли-

ганда Wnt11 в процессах, оказывающих влияние на

формирование опухолевого фенотипа. Также был

обнаружен механизм регуляции функциональной

активности лиганда Wnt11, основанный на альтерна-

тивном сплайсинге.

Содержание D-димера в перифериче-ской крови как один из критериев

физиологического течения беремен-ности и раннего послеродового

периода

П.А. Кирющенков, М.А. Тамбовцева, Е.В. АндамоваФГУ Научный центр акушерства,

гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова


Во время беременности происходят адаптацион-

ные изменения в системе гемостаза, выражающиеся

в повышении общего коагуляционного потенциала

крови, снижении содержания естественных ингиби-

торов свертывания, угнетении фибринолиза, сопро-

вождающиеся повышением содержания конечных

продуктов этого процесса.

Среди различных маркеров внутрисосудистого

тромбообразования наибольший научно-практический

интерес представляет определение D-димера, посколь-

ку его концентрация в периферической крови доста-

точно высока, а период циркуляции в кровотоке со-

ставляет до 8 часов.

Цель исследования — оценка гемостазиологиче-

ских показателей при физиологической беременно-

сти и в раннем послеродовом периоде и динамиче-

ский контроль содержания D-димера как одного из


2’

20

11основных маркеров внутрисосудистого свертыва-

ния.

Материалы и методы. Ретроспективное исследова-

ние. Критерии включения: здоровые беременные и ро-

женицы в раннем послеродовом периоде. Критерии

исключения: отягощенный тромбогеморрагический

семейный анамнез, врожденные и приобретенные

тромбогеморрагические состояния, тяжелые сомати-

ческие заболевания, осложненное течение предыду-

щих беременностей.

Взятие образцов крови производилось в сроки

6–8 недель, 23–25 недель, 32–34 недели и на третьи

сутки после родоразрешения, что соответствовало

так называемым «критическим» срокам беременно-

сти и послеродового периода.

Исследование системы гемостаза включало:

определение концентрации фибриногена, АЧТВ,

АВР, тромбоэластографию, определение уровня

РКМФ, оценку функциональной активности тром-

боцитов с использованием стимуляторов

АДФ 1·10-3 М, коллагена 0,04 мг/мл.

Определение D-димера производилось на ком-

мерческой тест-системе D-Dimer Innovance (Siemens,

Германия), которая основана на так называемом ме-

тоде микролатексной агглютинации (иммунотурби-

динеметрический метод).

Результаты. Проведенный ретроспективный ана-

лиз показал отсутствие существенных отклонений

в течении беременности и раннего послеродового

периода у обследованных женщин (56 наблюдений).

Средний возраст обследованных составлял 25,3 ± 1,3

года, первородящих было 39 женщин, повторноро-

дящих — 17.

Динамическое гемостазиологическое исследова-

ние выявило адаптационные изменения в системе

гемостаза во время беременности, проявляющиеся

со II триместра. Это характеризовалось увеличением

концентрации фибриногена с 3,5 ± 0,4 г/л до 5,7 ±

0,5 г/л (р < 0,05). По данным тромбоэластографии

хронометрические показатели (r + k) уменьшились

с 20,8 ± 0,2 мм до 16,6 ± 0,2 мм (р < 0,05), показатели

структурной коагуляции (И.Т.П.) увеличились

с 10,1 ± 0,5 у. е. до 14,2 ± 0,3 у. е. (р < 0,05). По мере

прогрессирования беременности отмечалась тенден-

ция к повышению функциональной активности

тромбоцитов. Об активности образования тромбина

свидетельствовало увеличение частоты встречаемо-

сти положительных проб на РКМФ. На третьи сутки

после родоразрешения отмечалась даже тенденция

к нарастанию тромбофилии.

Наибольший интерес представляют данные

о динамике содержания D-димера как маркера внутри-

сосудистого свертывания. Если в I триместре его содер-

жание практически не отличалось от уровня у небере-

менных женщин и составляло 341,4 ± 22,6 мкг/л, то во

II триместре увеличилось до 1085,4 ± 65,4 мкг/л (р <

0,05), в III триместре — 1705,2 ± 88,5 мкг/л, а на третьи

сутки после родов оно достигало максимальных значе-

ний — 1884,0 ± 65,5 мкг/л. Подобные особенности вне

беременности можно было бы охарактеризовать как

хроническую форму ДВС-синдрома.

Выводы:1. Важным преимуществом определения уровня

D-димера является отсутствие значительных техни-

ческих сложностей при выполнении методики, воз-

можность динамического мониторинга, что крайне

необходимо в акушерской практике.

2. Превышение содержания D-димера в перифе-

рической крови по сравнению с гестационными

нормативами и параметрами в раннем послеродовом

периоде является маркером патологического тром-

бообразования и может рассматриваться как преди-

ктор различных акушерских осложнений, таких как

преэклампсия, плацентарная недостаточность, пре-

ждевременная отслойка плаценты, а также тромбо-

тических осложнений в послеродовом периоде.

Akt/mTOR-зависимое ингибированиесупрессора опухолевого роста Pdcd4

в клетках рака легкогои его молекулярные механизмы

И.В. Коробко, П.Н. Вихрева, М.В. Шепелев, Е.В. Коробко

Институт биологии гена РАН, Москва

Экспрессия супрессора опухолевого роста Pdcd4

часто снижена или потеряна в опухолевых клетках

различного происхождения. Снижение экспрессии

Pdcd4 коррелирует с прогрессией опухоли и может

сопровождаться резистентностью опухолевых кле-

ток к действию ряда химиотерапевтических препара-

тов. В различных экспериментальных моделях вос-

становление экспрессии Pdcd4 в опухолевых клетках

приводило к ряду позитивных с клинической точки

зрения эффектов: снижению пролиферативной ак-

тивности, увеличению чувствительности к химиоте-

рапевтическим препаратам, индукции апоптоза. Это

определяет интерес к Pdcd4 как к диагностическому

и прогностическому маркеру, а также как к мишени

для противоопухолевой терапии. Считается, что цен-

тральную роль в супрессии Pdcd4 играют 2 механиз-

ма: микроРНК miR-21-зависимая деградация транс-

крипта Pdcd4 и ингибирование трансляции с него,

а также Akt/mTOR/S6K1-зависимая протеолитиче-

ская деградация белка Pdcd4. Однако существен-

ность этих молекулярных механизмов в клетках рака

легкого остается неясной. В то же время именно для

опухолей легкого снижение уровня транскрипта

Pdcd4 является значимым прогностическим факто-

ром, и подобные опухоли рассматриваются как одна

из первоочередных мишеней для генной терапии


’2

01

1 с использованием Pdcd4. Нами продемонстрирова-

но, что Akt-сигнальный путь действительно играет

существенную роль в супрессии Pdcd4 в клетках рака

легкого. Однако в отличие от ранее описанных меха-

низмов активация Akt-сигнального пути не вызыва-

ет выраженной протеолитической деградации Pdcd4.

В то же время нами впервые обнаружено, что инги-

бирование Akt-сигнального пути приводит к увели-

чению уровня транскрипта Pdcd4, вероятно, влияя

непосредственно на транскрипцию Pdcd4, а не буду-

чи опосредованным изменением стабильности

транскрипта. Таким образом, нами выявлена суще-

ственная роль Akt/mTOR-сигнального пути в су-

прессии Pdcd4 в клетках рака легкого и описан

новый молекулярный механизм Akt-зависимой су-

прессии Pdcd4. С практической точки зрения, уста-

новленная значимость Akt-зависимой супрессии

Pdcd4 в клетках рака легкого в совокупности с про-

тивоопухолевыми эффектами от восстановления

экспрессии Pdcd4 еще раз подчеркивают значимость

Akt-сигнального пути как одной из мишеней в лече-

нии рака легкого.

Частоты аллелей генов главногокомплекса гистосовместимостиу детей с онкогематологическимизаболеваниями и их родственников

в Российской Федерации

В.В. Красавина1, О.А. Шрагина2, В.О. Бобрынина1

1ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской

гематологии, онкологии и иммунологии

Минздравсоцразвития России;2ФГУ Российская детская клиническая больница


Система HLA (Human Leukocyte Antigen) — ком-

плекс генов главного комплекса гистосовместимо-

сти человека — обеспечивает регуляцию иммунного

ответа, осуществляет такие важнейшие физиологи-

ческие функции, как взаимодействие иммунокомпе-

тентных клеток организма, распознавание своих,

в том числе измененных, и чужеродных клеток, за-

пуск и реализация иммунного ответа и, в целом, обе-

спечивает выживание человека как вида в условиях

экзогенной и эндогенной агрессии. Комплекс генов

HLA компактно расположен на коротком плече 6-й

хромосомы, занимает 3500 kb (тысяч пар оснований)

и содержит более 220 генов. Областью практическо-

го применения знаний о системе HLA в настоящее

время в первую очередь является трансплантация ор-

ганов и тканей, где совместимость по антигенам

HLA важна при подборе доноров.

Цели работы. Определение HLA-генотипов ре-

ципиентов для поиска родственного или нерод-

ственного донора костного мозга, а также донорских

гемопоэтических клеток пуповинной крови при по-

мощи технологии PCR-SSP (Polymerase Chain

Reaction with Sequence-Specific Primers) — аллель-

специфическая амплификация с последующей де-

текцией методом электрофореза.

Типирование проводилось как в низком, так

и в высоком разрешении по 17 группам аллелей ло-

куса HLA-A, по 28 группам аллелей локуса HLA-В,

по 15 группам аллелей локуса HLA-Сw, по 13 груп-

пам аллелей локуса HLA-DRB1 и по 5 группам алле-

лей локуса HLA-DQB1.

Результаты. За период 05.2009–04.2011 в лабора-

тории молекулярной биологии ФГУ ФНКЦ ДГОИ

проведено определение HLA-антигенов 608 реципи-

ентов и возможных доноров. Для поиска нерод-

ственного донора 168 пациентам было проведено ти-

пирование высокого разрешения по 5 локусам. Для

поиска донорских гемопоэтических клеток пупо-

винной крови 23 пациента были типированы в низ-

ком разрешении по 5 локусам и в высоком разреше-

нии — по локусу DRB1.

Были обследованы 150 пациентов и их сиблинги

для поиска родственного HLA-совместимого донора

костного мозга. Все пациенты и сиблинги были ти-

пированы в низком разрешении по II классу HLA-

антигенов (HLA-DRB1 и HLA-DQB1), а при совпа-

дении полученных результатов и по I классу (HLA-A,

HLA-B и HLA-Cw). По данным исследования пол-

ностью идентичными HLA-фенотипами обладали 40

пар сиблингов (24 % от общего числа обследованных

групп), что полностью соотносится с законом рас-

щепления признаков при условии наследования

генов главного комплекса гистосовместимости как

гаплотипов. В одной семье была выявлена двойная

рекомбинация, произошедшая у матери, в результате

чего гены HLA-B, HLA-C и DRB4 были перемещены

с одной хромосомы на другую.

Частоты аллелей генов HLA-системы представ-

лены в таблице. Для определения полного спектра

аллелей генов главного комплекса гистосовместимо-

сти представителей российской популяции потребу-

ется дальнейшее типирование.

Ошибки в диагностике острыхлейкозов на догоспитальном этапе

у детей в Москве и Московскойобласти

Я.А. Круглова, Т.А. Астрелина, М.В. Яковлева, Е.В. Клеина, Н.В. ЕвдачеваГУЗ Банк стволовых клеток

Департамента здравоохранения города Москвы

Одну из главных ролей в своевременной диагно-

стике острых лейкозов играет онкологическая насто-


2’

20

11A* % A* % B* % B* % DRB1* % DRB1* %

76,9 1010 22,1 1014 97,9 101001 10,65 0103 0,3

41 2 45,2 2010 25,1 2014

97,5 2044 33,42 102001 11,41

0103 0,51 41,8 1030 59,8 30 22,1 3044 80,2 502002 26,75 33,4 1040 3,0 5044 91,1 6020 87,1 2040 3,0 1144 82,11 1030

0302 1,19

44 8,44

35,1 3040 16,0 724403 14,98 45,2 4040 16,0 1054 33,0 54 3,0 8630 20,1 5040 16,0 1064 55,0 64 51,4 101111 6,44 72,1 7040 44,0 74 3,0 6611

23 1,33 2301 0,59 48 0,33

04 15,02

0408 0,25 2402 13,35 49 1,55 4901 1,83 07 14,7 0701 15,01

8,2 1080 38,1 1005 2 05 3,0 3042 4,6 1015 95,0 4042

08 3,12 0803 0,51

24 11,65

2430 0,3 51 6,22

72,1 1090 3,0 501525 4,66 2501 6,23 52 3,55 5201 3,05

09 2,13 0906 0,25

2601 5,64 53 0,33 5301 0,91 10 1,07 1001 3,05 26 5,66 6,5 1011 16,0 1055 44,1 55 3,0 8062 52,0 2011 19,0 1065 76,0 65 91,1 2092 22,1 92 15,0 3011 53,3 1075 84,1 1003

3002 0,59 57 3,33

90,5 4011 3,0 207530 2 3004 0,59 58 1,44 5801 1,83

11 12,89

1116 0,25 45,2 1021 3,0 1037 22,0 37 79,2 1013

3106 0,59 Cw* % Cw* % 12 1,89

1206 0,25 31 3,22 63,6 1031 97,4 2010 3,0 8013

32 2,66 3201 1,19 01 4,64

65,3 2031 91,0 3010 14,4 2020 84,1 1033

13 10,43 1303 1,27 33 1,66

3303 0,89 02 5,59

15,0 1041 91,0 8020 67,0 3041 35,1 2030 22,0 34 52,0 5341 20,4 3030 98,0 1066 44,0 66

15,6 4030 79,2 1086

14 3,45

1454 1,02 6802 1,19

03 14,05

76,9 1051 83,0 613068 6,33 6824 1,19 04 11,05 0401 11,49

15 12,07 1502 2,8

8,2 1061 78,2 61 12,4 1050 3,0 1096 11,0 96B* % B* %

05 4,23 93,7 1020 83,0 025048,01 2020 6,31 206028,21 60 10,7 207007 9,66

43,01 1070 3,0 507002 20,32

0204 0,25 49,02 103037,01 2070 17,6 1080 88,5 80

13 7,1 1302 6,4 07 23,33

95,01 2030 35,1 4070 61,6 3030 43,1 2080 47,2 2041 98,1 41

1501 4,57 08 2,05

52,0 4030 83,0 5280 94,0 6030 83,0 4011 72,0 11 16,0 505115 7,88 52,0 8030 54,3 2021 16,0 1151

18 5,77 1801 8,23 12 12,41

52,0 313037,01 3021 77,0 2041 16,0 2072

03 38,05

0319 0,25 2703 0,3

14 1,36 1403 0,38

0401 0,49 43,1 2051 44,2 5072

04 2,16 0402 2,22

27 5,88

92,41 1050 91,0 4051 3,0 4172 79,1 2050 51,1 5051 88,4 1053 27,1 3050 91,0 6051 44,2 205335 9,43

3503 3,35

15 3

1513 0,19

05 18,4

0504 0,99 54,3 1060 77,0 1061 31,2 1073 11,1 7343,01 2060 69,0 2061 72,4 1083 22,4 83

3901 0,61 16 2,86

86,4 3060 77,0 406139 1,89 79,1 4060 75,0 1071 16,0 6093

4001 2,74 17 2,05

1703 1,72

06 21,07

0609 0,25 40 6,44 4002 4,27 18 0,27 1802 0,38


’2

01

1 роженность врачей первичного звена. Крайне необ-

ходимо знание начальных клинических проявлений

заболевания, «масок» острого лейкоза и показателей

периферической крови при данной патологии.

Цель исследования — проанализировать возмож-

ные ошибки, связанные с интерпретацией гемо-

грамм и начальными клиническими проявлениями,

в диагностике острых лейкозов у детей.

Материалы и методы. Были проанализированы

данные анамнеза заболевания 220 детей МДКБ № 1

(Москва) и МООД (Балашиха) за период с 01.10.2008

по 31.05.2010. Выполнен анализ количества дней от

начала клинических проявлений до госпитализации

детей больных острым лейкозом (ОЛ) в специализи-

рованные гематологические отделения.

Результаты. Интервал времени от начала проявле-

ния клинической симптоматики до госпитализации

ребенка в специализированное гематологическое от-

деление составил от 3 дней до 4 месяцев, в зависимо-

сти от клинической картины и тяжести состояния

больного. Основной причиной диагностических оши-

бок было несвоевременное назначение исследования

общего анализа периферической крови (ОАК). У 9

(4,09 %) пациентов диагноз ОЛ был выявлен при дис-

пансерном плановом обследовании и при плановом

патронаже педиатра. Самый короткий период поста-

новки диагноза у 16 (7,27 %) детей с геморрагическим

и острым абдоминальным синдромами составил 3–4

дня. В хирургическое отделение с подозрением на

острый аппендицит были госпитализированы 7

(3,18 %) пациентов с острым абдоминальным синдро-

мом, одному (0,35 %) из них провели аппендэктомию.

Самый длительный период до госпитализации в ста-

ционар у 21 (9,55 %) пациента с артралгическим и ос-

салгическим синдромами составил 3–4 мес. У 124

(56,36 %) пациентов с вирусной инфекцией (ОРВИ,

пневмония, бронхит, рецидивирующий отит, ларин-

готрахеит, лимфоаденопатия) период госпитализации

составил от 2 до 6 недель. У 4 (1,81 %) пациентов ОЛ

дебютировал с экзофтальма, обследование проходило

в МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца. У 3

(1,36 %) пациентов заболевание начиналось с инфек-

ции мочеполовых путей. Неврологическая симптома-

тика наблюдалась у 3 (1,36 %) пациентов и период до

госпитализации составил в среднем 4–6 недель. Роди-

тели 3 (1,36 %) детей самостоятельно обратились к ге-

матологу в связи с нарастающей бледностью ребенка.

Пять пациентов (2,27 %) лечились амбулаторно по ме-

сту жительства с диагнозом анемия в течение 4–8 не-

дель. Одному больному (0,45 %) через месяц от начала

заболевания был установлен диагноз менингококце-

мия с последующей госпитализацией в инфекцион-

ное отделение, где был поставлен диагноз ОЛ. Прак-

тически во всех случаях ОАК назначали не ранее чем

через 3–5 недель от начала клинических проявлений

или первично уже в стационаре. Очень часто дети по-

ступали в специализированный стационар пролечен-

ные гормональной терапией, что значительно затруд-

няло окончательную диагностику с верификацией ва-

рианта по FAB-классификации и отягощало течение

заболевания с ухудшением прогноза. При проведении

ОАК в диагностических лабораториях диагностика

ОЛ была затруднена в связи с использованием гемато-

логических автоматических анализаторов без подсчета

количества бластных клеток в ПК. Выявлять бласт-

ные клетки можно только при банальной иммерсион-

ной микроскопии, которая в клинической диагности-

ческой лаборатории делается выборочно.

Заключение. Основной причиной ошибок несво-

евременной диагностики ОЛ является недостаточ-

ное обследование детей (ОАК), отсутствие индиви-

дуального подхода к лабораторным исследованиям

и отсутствие онкологической настороженности

у врачей первичного звена. Необходимо помнить,

что: «нет такого заболевания, маску которого не при-

нял бы острый лейкоз» (И.А. Кассирский).

Выявление роли лигандов WNTв формировании агрессивного

опухолевого фенотипалиний меланомы человека

К.В. Куликова, А.В. Кибардин, А.В. Посвятенко, Н.В. Гнучев, Г.П. Георгиев, С.С. ЛаринИнститут биологии гена РАН, Москва

Несмотря на то, что меланома составляет лишь

небольшую часть всех кожных новообразований, она

является основной причиной смерти среди пациен-

тов с заболеваниями кожи. Высокая смертность боль-

ных меланомой связана с агрессивным характером

опухолей данного вида. Разрушение межклеточных

контактов, перестройка цитоскелета, увеличение

подвижности клеток и устойчивость к апоптозу дают

возможность трансформированным клеткам распро-

страниться по всему организму. На молекулярном

уровне эти процессы сопровождаются ингибирова-

нием экспрессии маркеров эпителиальных клеток

и супрессора метастазирования KISS-1, усилением

продукции маркеров, ассоциированных с клеточной

подвижностью, и протеаз, деградирующих внекле-

точный матрикс, а также изменениями в экспрессии

генов WNT. Считается, что сигнальный путь, активи-

руемый белками семейства WNT, принимает участие

в формировании и развитии меланом. В процессе эм-

брионального развития сигнальный путь WNT задей-

ствован в регуляции межклеточных взаимодействий,

кроме того, существуют данные, описывающие его

роль в контроле подвижности клеток. Известно, что

при меланоме экспрессия лигандов сигнального пути

WNT часто повышена. Изучение экспрессии марке-

ров, ассоциированных с изменениями клеточной

подвижности, может дать ценные знания для пред-


2’

20

11сказания степени прогрессии заболевания, а также

для оценки шансов на выживание пациентов.

В рамках данной работы набор клеточных линий

меланомы человека был охарактеризован на основа-

нии наличия и уровня экспрессии маркеров, ассоци-

ированных с регуляцией клеточной подвижности,

а также по наличию и уровню экспрессии различных

лигандов сигнального пути WNT. Было обнаружено,

что, несмотря на то, что характер экспрессии изучен-

ных генов значительно варьирует в исследованных

клеточных линиях, экспрессия некоторых маркеров,

ассоциированных с повышенной клеточной под-

вижностью, коррелирует с экспрессией лигандов

сигнального пути WNT. Полученные данные говорят

как о возможном существовании различных меха-

низмов формирования агрессивного опухолевого

фенотипа меланом, так и о характере участия белков

семейства WNT в формировании агрессивного фе-

нотипа клеточных линий меланомы человека.

Тромболизат как альтернативафетальной бычьей сыворотке

при экспансии стромальных клетоккостного мозга in vitro

К.В. Лепик, О.В. Бурданова, И.М. Бархатов, Б.В. Афанасьев

Институт детской гематологии и трансплантологии

им. Р.М. Горбачевой ГОУ ВПО Санкт-Петербургский

государственный медицинский университет

им. акад. И.П. Павлова

В настоящее время в большинстве протоколов

для экспансии мезенхимальных стволовых клеток

(МСК) костного мозга используются питательные

среды с добавлением фетальной телячьей сыворотки

(ФТС), которая может являться источником ксено-

генных антигенов и инфекционных агентов.

В качестве альтернативы ФТС можно рассматривать

тромболизат (ТЛ), получаемый из обогащенной

тромбоцитами плазмы человека.

Цель работы. Отработка методики получения ТЛ,

оценка его биологической активности и возможно-

сти использования в качестве альтернативы ФТС.

Материалы и методы. Изучалась пролифератив-

ная активность МСК; оценивался иммунофенотип,

экспрессия ряда генов, способность к дифференци-

ровке и поддержке гемопоэза при использовании

ФТС в качестве суплемента, ТЛ, а также бессыворо-

точной среды.

Результаты. При оценке колониеобразования

в первичной культуре МСК было выявлено, что при

использовании ТЛ количество колониеобразующих

единиц фибробластов было выше по сравнению

с ФТС. При долговременном культивировании раз-

личий в пролиферативной активности МСК не на-

блюдалось. На фоне культивирования в среде с ТЛ

по сравнению с ФТС отмечалось снижение доли

CD14+-клеток, а также снижение экспрессии генов

NGF, osteopontin, ITGA7, NTF3. Способность к диф-

ференцировке в остеобласты у МСК после экспан-

сии с использованием ТЛ была выше по сравнению

с ФТС.

Выводы. При экспансии с использованием ТЛ

отмечается изменение дифференцировочного по-

тенциала МСК, сопровождаемого снижением экс-

прессии ряда генов на фоне сопоставимых с ФТС

пролиферативных характеристик.

Анализ динамики плавления продуктовполимеразной цепной реакции

для поиска гистосовместимогородственного донора

В.В. Мустяца1, В.О. Бобрынина2

1Физический факультет Московского государственного

университета им. М.В. Ломоносова;2ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской



Цель исследования. Разработать условия приме-

нения метода анализа динамики плавления в высо-

ком разрешении (HRM) для поиска гистосовмести-

мого родственного донора.

Материалы и методы. В ходе исследования были

проанализированы образцы ДНК 57 человек из 20

семей. Для каждого образца были проведены 3 неза-

висимые полимеразные цепные реакции (ПЦР)

в присутствии интеркалирующего флуоресцентного

красителя EvaGreen для амплификации вторых экзо-

нов генов DRB1 и DQB1 II класса главного комплек-

са гистосовместимости (HLA): одна ПЦР для DRB1

и две — для DQB1. После ПЦР полученные фрагмен-

ты плавились в диапазоне 75–95 °С. ПЦР и плавле-

ние в высоком разрешении (HRM) проводились на

приборе Rotor Gene 6000 производства Corbett

Research (Австралия). Анализ динамики плавления

продуктов ПЦР осуществлялся при помощи стан-

дартного программного обеспечения прибора.

Результаты. Анализ динамики плавления ПЦР-

продуктов проводился внутри каждой семьи, были

определены сибсы, имеющие такие же кривые плав-

ления в трех ПЦР, как и пациенты. В дальнейшем эти

данные были сопоставлены с результатами сиквенс-

специфической ПЦР (PCR-SSP) генов DRB1 и DQB1,

полученных с использованием реактивов для HLA-

типирования производства Invitrogen. При совпаде-

нии кривых плавления совпадали и аллели, опреде-

ленные методом PCR-SSP, а при различии

в динамике плавления результаты HLA-типирования

также различались. Таким образом, результаты груп-


’2

01

1 пировки, полученные методом HRM, полностью со-

впали с группировкой по результатам сиквенс-

специфической ПЦР.

Выводы. Полученные данные свидетельствуют,

что метод HRM позволяет устанавливать совпадение

или несовпадение аллелей генов DRB1 и DQB1 HLA

II класса у пациентов и их родственников.

Данный метод имеет следующие преимущества

перед стандартным HLA-типированием:

• возможность одновременного тестирования

большого количества образцов;

• отсутствие необходимости проведения фореза;

• снижение вероятности контаминации лабора-

тории ПЦР-продуктом;

• снижение фактической стоимости данного

этапа исследования.

Получаемый методом HRM качественный ре-

зультат позволяет быстро выявить возможного род-

ственного донора. Применение данного метода не

исключает необходимости дальнейшего типирова-

ния всех генов главного комплекса гистосовмести-

мости, но дает возможность проводить это исследо-

вание только для гистосовместимых родственников

пациента.

Значение теста генерации тромбинав клинической практике

Ю.А. Наместников, О.Г. Головина, Л.П. ПапаянФГУ Российский научно-исследовательский

институт гематологии и трансфузиологии

ФМБА России, Санкт-Петербург

Значимость лабораторной оценки состояния си-

стемы свертывания крови в современной клиниче-

ской практике сложно переоценить. Сегодня на 1-е

место среди причин смертности выступают заболе-

вания, в патогенезе которых большую роль играет

повышенная способность крови к образованию

тромбов — состояние гиперкоагуляции. Поэтому

особенно важным представляется выявление имен-

но гиперкоагуляционных проявлений при различ-

ных заболеваниях.

Для широкой клинической практики важными

представляются данные так называемых супрамоле-

кулярных методов исследования гемостаза — таких

тестов, которые оценивают систему в целом, во взаи-

модействии, и дают функциональную характеристи-

ку ее состояния. Одним из таких методов является

тест генерации тромбина (ТГТ). В этом исследова-

нии оценивается динамика образования и инактива-

ции ключевого энзима гемостаза — тромбина. Пока-

затели этого процесса отражают функциональное

состояние, возникающее при взаимодействии между

собой как про-, так и антикоагулянтных факторов.

Показатели коагулограммы могут находиться в пре-

делах нормы, в то время как в функциональном ТГТ

выявляется повышение параметров, что свидетель-

ствует о наличии гиперкоагуляции.

Обратную ситуацию можно наблюдать в случае,

когда изменения отдельных показателей коагулограм-

мы не сопровождаются изменением ТГТ. Так, напри-

мер, у пациента могут быть повышены фактор VIII,

фактор Виллебранда и уровень D-димера, на основа-

нии чего клиницист может предположить наличие ги-

перкоагуляции и назначить антикоагулянтную терапию

для профилактики тромбоза. Но увеличение активно-

сти отдельных прокоагулянтных факторов может быть

нивелировано повышением активности антикоагу-

лянтных факторов. Показатели ТГТ в таком случае бу-

дут в пределах нормы. Следовательно, руководствуясь

данными коагулограммы, можно получить ложнополо-

жительное представление о наличии у пациента гипер-

коагуляции при ее реальном отсутствии.

Другая клиническая проблема связана с монито-

рингом антикоагулянтной терапии. Например, у па-

циентов, получающих варфарин, руководствуются

правилом достижения целевого значения МНО, при

котором терапия считается адекватной. Но как объ-

яснить, что у пациентов с одинаковыми значениями

МНО показатели ТГТ могут значительно отличать-

ся? Равнозначен ли эффект при достижении одного

и того же целевого значения МНО у 2 пациентов.

Можно ли считать терапию у них одинаково эффек-

тивной?

Существует мнение, что мониторинг терапии

низкомолекулярными гепаринами (НМГ) не обяза-

телен по причине линейной зависимости их влияния

на активный фактор Х. В случае необходимости

предлагается проводить мониторинг по исследова-

нию изменения анти-Ха активности. Об изменении

свойств системы гемостаза предлагается судить по

изменению активности только одного фактора. Как

показали Al Dieri et al. (2006), при назначении одина-

ковых доз фраксипарина даже здоровым лицам недо-

статочная доза наблюдалась в 13 %, а передозировка —

в 11 % случаев. Эта работа демонстрирует необходи-

мость лабораторного контроля за эффектом от вве-

дения НМГ с помощью глобальных тестов, а также

неправомерность суждения о гемостазе в целом по

изменению всего лишь одного показателя — анти-

Ха-активности.

Большое значение в клинической практике се-

годня придается выявлению у пациентов врожден-

ной тромбофилии. Но всегда ли их присутствие со-

провождается развитием гиперкоагуляции? Какие

результаты можно получить при функциональном

исследовании гемостаза, например у гетерозиготных

носителей мутации фактора V Лейден, которая на се-

годняшний день признана клинически значимой

в развитии гиперкоагуляционного состояния. Изве-

стен следующий факт: у одного из сибсов, у которых

выявлена данная мутация, развиваются тромбоэмбо-

лические осложнения, а у другого нет. Как показыва-


2’

20

11ет ТГТ, у одного из них имеет место гиперкоагуляция

и APC-резистентность, в то время как у другого по-

казатели ТГТ в норме. Это позволяет объяснить раз-

личную реализацию одного и того же генетического

дефекта компенсаторными механизмами.

Таким образом, использование метода глобальной

оценки системы гемостаза, в данном случае ТГТ, по-

зволяет получить представление о состоянии гемостаза

в целом, выявить гиперкоагуляцию, а также оценить

эффективность антитромботической терапии.

Иммуногенная эффективностьвакцинопрофилактики вирусного

гепатита B среди детейс онкогематологическими

заболеваниями: cравнительная оценкадвух режимов

Н.В. Опалева1, Е.В. Полевиченко2, К.С. Асланян1, Е.В. Васильева1, Л.Д. Орешкина1, А.Х. Хаспекян1, И.В. Яценко1, О.В. Салмашова2, Л.В. Гончарова1,

Н.В. Краснянская1

1Областная детская больница;2ГОУ ВПО Ростовский государственный

медицинский университет, Ростов-на-Дону

Высокое медико-социальное значение вирусно-

го гепатита B (ВГB), вакциноуправляемый характер

данной инфекции и отсутствие единых националь-

ных рекомендаций по вакцинопрофилактике для де-

тей с онкогематологическими заболеваниями (ОГЗ)

определяют поиск оптимальных протоколов специ-

фической иммунопрофилактики ВГВ в комплексе

сопроводительной терапии.

Цель исследования. Сравнительное изучение им-

муногенной эффективности 2 режимов вакцинопро-

филактики (ВП) ВГВ: 1) рутинной ВП ВГВ, прове-

денной в анамнезе больных ОГЗ на первом году

жизни; 2) ВП ВГВ, выполненной по эпидпоказани-

ям у ранее не привитых пациентов на фоне про-

граммной ПХТ гемобластозов и солидных опухолей.

Материалы и методы. Проведено динамическое

ИФА-исследование диагностической панели сероло-

гических маркеров ВГВ (HBsAg, HBeAg, anti-HBs,

anti-HBe, anti-HB-corAgIgG, anti-HB-cor-AGIgM)

и количественная оценка уровня anti-HBs (мМЕ/мл)

в 2 группах больных: 1-я группа — дети с ОГЗ (n = 192),

без ВП в анамнезе, привитые по схеме 0–1–2–6–12

месяцев удвоенной дозой рекомбинантной вакцины

для профилактики ВГВ с первых дней программной

ПХТ; 2-я группа — дети с ОГЗ (n = 47), ранее рутинно

вакцинированные по схеме 0–3–6 месяцев.

Результаты. При оценке иммуногенной эффек-

тивности ВП ВГВ через 3 месяца после ее заверше-

ния у детей с ОГЗ в 1-й группе уровень серопротек-

ции (> 10 мМЕ/мл) составил 58,0 % при среднем по-

казателе anti-HBs — 54,3 ± 9,8 мМЕ/мл, что свиде-

тельствовало о достаточной эффективности ВП. Во

2-й группе уровень серопротекции составил 42,6 %,

а средние значения anti-HBs — 57,8 ± 12,2 мМЕ/мл

на сроке после завершения ВП ВГВ, равном 36,8 ±

5,7 мес. Отмечена умеренная отрицательная корре-

ляция по Пирсону (p < 0,05) между уровнем anti-HBs,

количеством CD3+-лимфоцитов ( 109/л) и IgG (г/л)

у детей 2-й группы. Таким образом, в дебюте ОГЗ от-

мечен относительно невысокий уровень серопротек-

ции против ВГВ у детей с завершенной в анамнезе

ВП ВГВ, проведенной в рамках Национального ка-

лендаря, хотя средние значения anti-HBs в данной

группе достоверно превышают протективный уро-

вень, принятый у здоровых лиц (10 мМЕ/мл). Мож-

но предположить, что оптимальное сочетание двух

режимов вакцинации в дебюте ОГЗ у детей, не имею-

щих серопротективного уровня защиты против ВГВ

(т. е. их ревакцинация по эпидпоказаниям), успешно

модифицировало бы стандартный подход к иммуно-

профилактике ВГВ для данной категории иммуносу-

прессированных лиц.

–подобная ДНК-полимеразаклеток HL-60

А.П. Орлов1, Д.А. Кузнецов1, В.П. Чехонин1, И.С. Берсенев2, Л.Дж. Немер-Гергели3, Ш. Удварди3

1Кафедра медицинских нанобиотехнологий, Россий-

ский государственный медицинский университет

им. Н.И. Пирогова, Москва;2Институт белка РАН, Пущино;

3Биологический исследовательский центр Венгерской

академии наук, Сегед, Венгрия

Несмотря на серьезное внимание, уделяемое ро-

ли ДНК-полимераз семейства «Бета» в процессах

канцерогенеза, ни один из ферментов этой группы

не был до сих пор выделен и охарактеризован в слу-

чае широко используемой линии клеток миелоидно-

го лейкоза человека HL-60.

В настоящей работе эта задача впервые решена

благодаря оригинальной методике фракционирова-

ния хроматина, включающей ряд этапов его нуклеаз-

ной и химической обработки (нуклеаза S/рибонукле-

аза А; 0,5 М NaCl/фенол-хлороформная экстракция;

ацетон-преципитация; +37 ºС/80 КГц/60 мин; сту-

пенчатый 30–70 % градиент насыщения сульфатом

аммония; диализ; лиофилизация), завершающихся

гель-хрома тографией на колонке TOYOPEARL HW-55F

1,6 7 0 cм. В результате был выделен высокоочищен-

ный SDS–PAGE-гомогенный белок-мономер (66.5

кДа, pI = 8.35), обладающий высокой ДНК-полиме-

разной каталитической активностью.

При этом для данного фермента характерны та-

кие идентификационные параметры, специфиче-


’2

01

1 ские для представителей семейства «Бета» (К.Ф.

2.7.7.7.), как:

— отсутствие 3’,5’-экзонуклеазной активности

мономера;

— гиперактивация в присутствии 200 mM KCl;

— устойчивость к Амфидиколину (5,0 мкг/мл)

и N-этилмалеимиду (0,5 mM);

— низкий уровень процессирования при ограниче-

нии размеров формируемых фрагментов ДНК до 300 n.

Степень очистки фермента по отношению к об-

щему белку клеток составила 1:122 000.

Реакция системы крови на различные варианты воспаления

М.В. Пешикова, Е.В. Жуковская, И.И. ДолгушинГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская

академия Федерального агентства по здравоохранению

и социальному развитию

Цель. Изучить пролиферативный потенциал

CD34+-клеток у людей на фоне различных воспали-

тельных процессов с учетом типа (острый или хро-

нический) и распространенности (локальный или

генерализованный) воспалительного ответа.

Материалы и методы. В ретроспективное иссле-

дование вошли 933 женщины от 16 до 85 лет (средний

возраст 38,9 ± 0,5 года) и 767 мужчин от 17 до 88 лет

(средний возраст 37,5 ± 0,5 года) с различными вос-

палительными заболеваниями (острые инфекцион-

ные заболевания, хронические неспецифические

гнойно-воспалительные заболевания в стадии ре-

миссии, хронические аллергические заболевания

в стадии ремиссии). Группу контроля составили 63

здоровые женщины от 16 до 50 лет (средний возраст

19,8 ± 0,4 года) и 63 здоровых мужчины от 17 до 67 лет

(средний возраст 28,2 ± 1,8 года). Иммунофенотипи-

рование лимфоцитов периферической крови прово-

дилось методом флюоресцентной микроскопии с по-

мощью реакции прямой иммунофлюоресценции

в модификации С.В. Сибиряка и соавт. (1997).

Результаты. Анализ особенностей мобилизации

CD34+-клеток у людей на фоне различных воспали-

тельных процессов выявил следующие тенденции:

1. Достоверное повышение процентного числа

CD34-лимфоцитов в периферической крови паци-

ентов на фоне острых тяжелых вирусных инфекций.

2. У пациентов на фоне различных хронических

заболеваний в периоде ремиссии процентное число

CD34-лимфоцитов в кровотоке не отличается от по-

казателей здоровых людей.

3. Не отмечено значительных колебаний в про-

центном соотношении циркулирующих CD34-

лимфоцитов у исследуемого контингента в зависи-

мости от возрастных параметров человека.

4. У пациентов на фоне ареактивных состояний,

как и у здоровых лиц, существуют различия в соот-

ношении данной популяции лимфоцитов в зависи-

мости от пола, а именно: у женщин процентное чис-

ло циркулирующих CD34+-клеток выше, чем у муж-

чин.

Заключение. Соответствие между содержанием

CD34+-клеток в периферической крови и особенно-

стью воспалительного ответа формирует предпосыл-

ки для использования кинетики клеточного пула

стволовых кроветворных клеток для биомонитори-

рования тяжести воспаления.

Определение минимальной остаточной болезни методом проточной

цитометрии и выявления химерного транскрипта в ходе ПЦР у детей

с острым лимфобластным лейкозом из В-линейных предшественников:результаты сравнения методов

А.М. Попов1,2, Г.А. Цаур1,2, Т.Ю. Вержбицкая1,2, Е.В. Шориков1,2, Л.И. Савельев3, Л.Г. Фечина1,2


3ГОУ ВПО Уральская государственная

медицинская академия, Екатеринбург

Цель исследования — оценить сопоставимость

результатов определения минимальной остаточной

болезни (МОБ) при остром лимфобластном лейкозе

из В-линейных предшественников (ВП-ОЛЛ) у де-

тей методами многоцветной проточной цитометрии

и ПЦР с выявлением химерных транскриптов (ХТр).

Материалы и методы. Было исследовано 229 об-

разцов костного мозга, взятых на разных стадиях

программной терапии, а также непрограммного ле-

чения у 56 пациентов. МОБ определяли одновремен-

но методом проточной цитометрии, ПЦР с обратной

транскрипцией (ОТ-ПЦР) и ПЦР в режиме реально-

го времени (ПЦР-РВ).

Результаты. При использовании всех методов МОБ-

позитивны были 130 образцов, а МОБ-негативны —

77. В 20 образцах МОБ была выявлена только методом

ПЦР, в 2 — только методом проточной цитометрии.

Качественная сходимость результатов проточной ци-

тометрии и ОТ-ПЦР составила 90,4 %. Детальный ана-

лиз результатов показал, что сходимость результатов

определения МОБ не зависела от типа определяемой

молекулярной перестройки, иммунофенотипа опухо-

левых клеток и наличия в образце нормальных

В-линейных предшественников. Однако во время ин-

дукционной терапии сопоставимость результатов ока-

залась достоверно ниже, чем на более поздних этапах

лечения (83,8 % и 93,9 % соответственно, р = 0,024).

В образцах, в которых МОБ была выявлена только ме-


2’

20

11тодом ПЦР, уровень МОБ был достоверно ниже, чем

в конкордатных образцах (p < 0,001). Несмотря на то,

что прямое количественное сопоставление результатов

определения МОБ методами проточной цитометрии

и ПЦР-РВ невозможно, кинетика величины МОБ во

время терапии была сходна. Вследствие этого одновре-

менное применение данных методов может с успехом

использоваться у пациентов, у которых определяется

ХТр. У таких больных, с нашей точки зрения, во время

индукционной терапии и в начале консолидации/ин-

тенсификации, когда необходимо количественное

определение МОБ, предпочтительнее использовать

данные проточной цитометрии. В то же время в после-

дующих точках наблюдения, когда достаточно каче-

ственного определения МОБ, предпочтительнее ис-

пользовать результаты определения ХТр в ходе ПЦР

вследствие более высокой чувствительности метода.

Экспрессия сплайс-вариантов WNT11в клетках линии колоректального рака

(HT29)

А.В. Посвятенко, К.В. Куликова, А.В. Кибардин, Г.П. Георгиев, Н.В. Гнучев, С.С. ЛаринИнститут биологии гена РАН, Москва

Аномальная активация сигнального пути Wnt

показана при различных онкологических заболева-

ниях, включая 90 % случаев колоректального рака.

Аберрантная активация канонического сигнального

каскада в большинстве случаев происходит в резуль-

тате мутаций генов APC, CTNNB1 или Axin. Показа-

но, что при колоректальном раке также активирован

путь планарной клеточной полярности (Caldwell

et al., 2008). Установлено, что в клетках линий опухо-

лей прямой и ободочной кишки экспрессируются

различные лиганды семейства Wnt, включая Wnt11

(Suzuki et al., 2004). Белок Wnt11 считается лигандом,

активирующим путь планарной клеточной полярно-

сти, определяющим поляризацию клеток и их ми-

грацию в процессе гаструляции.

Наша работа посвящена изучению особенностей

экспрессии Wnt11 в клетках линии колоректального

рака.

ОТ-ПЦР анализ экспрессии Wnt11 в клетках ли-

нии колоректального рака (HT29) выявил, что ис-

пользование разных пар праймеров приводит к ам-

плификации разных вариантов кДНК. Секвенирование

последовательности обнаруженных кДНК показало,

что они являются результатом альтернативного

сплайсинга. Используя экспрессионные конструк-

ции с полученными сплайс-вариантами, мы устано-

вили, что белок дикого типа и сплайс-варианты обла-

дают разными свойствами. Новый сплайс-вариант

Wnt11 не детектируется в кондиционированной сре-

де, благодаря чему мы предполагаем, что он не явля-

ется секретируемым белком. Использование двойно-

го люциферазного теста (репортерный ген под кон-

тролем TCF/LEF промотора и отрицательный кон-

троль с мутантной областью связывания TCF/LEF)

продемонстрировало, что сплайс-вариант теряет спо-

собность ингибировать канонический сигнальный

путь, присущий Wnt11 дикого типа.

Эти данные дают возможность предположить су-

ществование нового механизма взаимного влияния

различных ветвей сигнального пути Wnt в процессе

формирования и прогрессии опухоли. В то же время

возникают новые вопросы, касающиеся причин

и последствий альтернативного сплайсинга в опухо-

левых клетках.

Клиническая гемостазиология.Рекомендации, регистры, экономика

Е.В. РойтманНаучное общество «Клиническая гемостазиология»,

ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской



Актуальность проблем патологии свертывания

крови при различных заболеваниях и состояниях

в дополнительной аргументации не нуждается. Про-

шедшие 10 лет показали интенсивное развитие гемо-

стазиологии в РФ, позволившее свести к минимуму

отставание от развитых стран по доступности для

применения современных средств диагностики

и коррекции патологии гемостаза. Патология гемо-

стаза не является специфичной для какой-то одной

области медицины. Всеобщее внимание к данной

проблеме обусловливает интенсивное развитие ее

доказательной базы, которая становится основой

для международных и российских Рекомендаций.

Также все шире в рутинную практику внедряется

и другой подход — Регистры, декларирующие инди-

видуализацию оценки. Данные подходы (на основе

Рекомендаций и на основе Регистров) не противопо-

ложны, не взаимоисключают друг друга. Оба подхо-

да обладают своими достоинствами и своими недо-

статками, но оптимальный для пациента результат

достигается именно при их совместном применении.

Другое дело, что специалист, ежедневно сталкиваю-

щийся с нарушениями свертывания крови у своих

больных, должен разбираться в обоих подходах и на-

учиться адекватно их применять. Постепенно эти

подходы внедряются и в нашей стране, о чем свиде-

тельствует разработка российских Рекомендаций

и формирование отечественных Регистров (напри-

мер, по тромбозам и тромбофилиям).

Клиническая гемостазиология во многом

основана на неразрывной связи между «клиникой»

и «лабораторией», предполагающей тесное взаимо-

действие лечащих врачей и специалистов по лабора-


’2

01

1 торной диагностике. Такой комплекс определяет по-

требность в одинаковой подготовке и тех, и других

по вопросам патологии гемостаза. Приятно, что

в нашей стране отмечается положительная динамика

в направлении подобной кооперации.

Применение нового доплерографиче-ского временного показателя длявыявления начальных проявлений

диастолической дисфункции левого желудочка у детей с острым

лимфобластным лейкозом

А.А. Сависько, Н.Ю. Неласов, Е.Д. Теплякова, С.П. Пармон, Н.Е. Тарасова, А.В. Шестопалов

ГОУ ВПО Ростовский государственный медицинский

университет, Ростов-на-Дону

Одним из серьезных неблагоприятных действий

полихимиотерапии (ПХТ) и токсико-инфекционных

процессов у детей с острыми лейкозами является

развитие сердечно-сосудистых осложнений, кото-

рые возникают на разных этапах терапии и в тяжелых

случаях могут приводить к развитию прогрессирую-

щей дисфункции миокарда и сердечной недостаточ-

ности. Своевременная диагностика появляющейся

минимальной дисфункции миокарда левого желу-

дочка дает возможность начать профилактическую

терапию и предупредить появление угрожающих

жизни осложнений.

Материалы и методы. Обследовано 94 ребенка

в возрасте от 3 до 17 лет (средний возраст 10,4 года)

с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). Паци-

енты с ОЛЛ относились к группе стандартного ри-

ска и получали ПХТ по протоколам ALL-MB-2002,

ALL-MB-2008. Все пациенты обследовались трех-

кратно: до начала ПХТ, после проведения индукции

ремиссии, после окончания интенсивной ПХТ.

Контрольную группу составили 47 здоровых детей.

Обследованные были сопоставимы по возрасту

и полу. Всем детям была проведена доплер-

эхокардиография (ДЭхоКГ). Измерены следующие

стандартные ДЭхоКГ-показатели: фракции выброса

(ФВ) и фракции укорочения (ФУ) левого желудочка

(ЛЖ), конечный систолический (КСР) и диастоли-

ческий размеры (КДР) ЛЖ, минутный объем (МО),

ударный объем (УО). Диастолическую функцию

(ДФ) миокарда оценивали с помощью отношения

трансмитрального кровотока Е/А (общепринятый

оптимальный положительный критерий < 1,0),

и В(Е-Еа) (временной интервал E-Ea от начала пе-

риода раннего диастолического наполнения ЛЖ по

трансмитральному кровотоку до начала пика Ea вы-

сокоамплитудных отраженных сигналов движения

(ВОСД)).

Результаты. Данные средних значений традицион-

ных ДЭхоКГ-показателей, характеризующих систоли-

ческую функцию миокарда, у здоровых детей мало чем

отличались от этих показателей у детей, больных ОЛЛ.

Среднее значение ФУ у здоровых обследуемых и детей

с ОЛЛ было не меньше 28 %, а значение ФВ — не ниже

50 % (р > 0,05). При анализе КДР и КСР ЛЖ установле-

но, что они находились в зоне возрастной нормы. Это

объясняет и отсутствие достоверных различий в показа-

телях МО (здоровые — 5,0 ± 1,4 л/мин; больные — 4,8 ±

1,7 л/мин; р = 0,63), УО (здоровые — 62,7 ± 18,2 мл;

больные — 58,21 ± 17,7; р = 0,17) в изучаемых группах.

При анализе ДФ установлено, что при использовании

показателя трансмитрального кровотока Е/А ее нару-

шение у детей с ОЛЛ удалось выявить всего в 4,3 % слу-

чаев, а при использовании показателя В(Е-Еа) —

в 74,5 % (р < 0,00001) случаев. При этом установлено,

что среднее значение В(Е-Еа) у детей в контрольной

группе составило 20,4 ± 8,5 мс, в 1-й группе (пациенты

до начала химиотерапии) — 19,1 ± 11,2 мс, во 2-й груп-

пе (конец индукции ремиссии) — 24,0 ± 15,8 мс,

а у больных после окончания полихимиотерапии — уже

32,3 ± 14,4 мс. Достоверные различия между группой

здоровых детей и 1-й и 2-й группой пациентов с ОЛЛ

отсутствуют (р > 0,05). Но наблюдается явное различие

показателей в этих группах с группой детей после про-

ведения полихимиотерапии (p < 0,001). Полученные

данные позволяют прийти к заключению, что доплеро-

графический параметр В(E-Ea) дает возможность уло-

вить начальные кардиотоксические эффекты у детей

с ОЛЛ, проявляющиеся в изменении ДФ ЛЖ.

Спектр мутаций глобиновых генову детей в Российской Федерации

И.О. Саделов1, М.В. Красильникова1,2, В.О. Бобрынина1, Н.С. Сметанина1,2





Гемоглобинопатии — это гетерогенная группа за-

болеваний, которые характеризуются качественным

(аномальные Hb) или количественным (талассемии)

нарушением синтеза гемоглобина. Они являются

наиболее распространенными моногенными заболе-

ваниями, создающими главную проблему здравоох-

ранения во многих странах мира.

Цель работы. Анализ спектра мутаций в -

и -глобиновых локусах у детей РФ, обратившихся

в поликлинику РДКБ.

Материалы и методы. С мая 2009 по февраль 2011 г.

были обследованы 142 пациента поликлиники РДКБ

с подозрением на гемоглобинопатию, а также члены их

семей. Общее число обследованных составило 198 че-


2’

20

11ловек, анализ их национальной принадлежности не

проводился. В 127 случаях анализировались -глоби-

новый локус и ген -глобина, а в 15 случаях исследо-

вался только ген -глобина. Методом ПЦР

с последующим анализом полученных фрагментов ме-

тодом электрофореза в 1 % агарозном геле в -глоби-

новом локусе определялись 7 наиболее распространен-

ных делеций (3.7, 4.2, 20.5, MED, SEA, THAI, FIL),

а методом прямого секвенирования исследовались му-

тации в гене -глобина (HBB).

Результаты. В 16 семьях (12,6 %) были выявлены

делеции в локусе -глобиновых генов: 3.7 в 13 се-

мьях (10,2 %), 20.5 в 5 семьях (3,9 %) и 4.2 в 2 се-

мьях (1,6 %). В 62 семьях (43,7 %) были обнаружены

мутации в гене HBB, из них 54 (42,5%) описаны в ли-

тературе как приводящие к -талассемии, а 8 (5,6 %)

связаны с экспрессией аномального гемоглобина

(Hb). В таблице приведены мутации, выявленные

у обследованных, и их доля от числа всех обнаружен-

ных мутаций в гене НВВ; частоты этих мутаций в не-

которых популяциях по данным HbVar: A database of

Human Hemoglobin Variants and Thalassemias (http://

globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html).

Однократно были зарегистрированы следующие

мутации: CD5 –CT, CD6 –A, CD16 –C, CD24 –G,

CD26 GAGAAG, CD28 CTGCCG, CD29

GGCGGT, CD30 AGGAGT, IVS-1-6 TC, IVS

1-130 GC, CD30 AGGAGT, CD36 CCTTCT, CD

36/37 –T, CD39 CAGTAG, CD63 CATTAT, TermCD

+96 TC. Следует отметить, что в 2 семьях были одно-

временно выявлены делеции в -глоби новом локусе

и мутации в гене НВВ, в 4 семьях одновременно обна-

ружены делеции 3.7 и 20.5, и в 6 семьях были зареги-

стрированы 2 разные мутации в гене НВВ.

Выводы. У детей, обратившихся в поликлинику

РДКБ, из 7 исследованных делеций были выявлены

только 3: 3.7, 20.5 и 4.2. В гене HBB не было вы-

явлено областей с повышенной частотой возникно-

вения мутаций, что вызвано гетерогенностью группы

обследованных. В связи с выраженной националь-

ной гетерогенностью популяции РФ необходимо

продолжить определение всех наиболее часто встре-

чаемых делеционных мутаций -глобиновых генов

и проводить секвенирование всей последовательно-

сти гена -глобина, в которых зарегистрированы му-

тации, имеющие клиническое значение.

Нарушение гемостаза у детейпри кардиохирургических операциях

Н.Н. СамсоноваНаучный центр сердечно-сосудистой хирургии

им. А.Н. Бакулева РАМН, Москва

Сложность выполняемых операций при врожден-

ных пороках сердца, малый объем циркулирующей

крови, несовершенство физиологических и защитных

механизмов у младенцев требуют четкого представле-

ния о системе гемостаза и реологии крови в периопера-

ционном периоде для прогнозирования возможных

осложнений и выбора мер их профилактики и коррек-

ции. Необходимо учитывать, что новорожденные и де-

ти первых месяцев жизни имеют особенности

клеточного и плазменного звеньев системы гемостаза.

Диффузные микрососудистые кровотечения остаются

одной из основных проблем, возникающих после кар-

диохирургических операций с искусственным крово-

обращением. Являясь многофакторными коагулопа-

тиями, кровотечения влияют на развитие полиорганной

недостаточности и, в конечном счете, на выживае-

мость пациента. Основные причины кровотечений —

хирургические, связанные с гемодилюцией, с избыточ-

ной антикоагуляцией гепарином, тромбоцитопенией

и тромбоцитопатией, фибринолизом, синдромом дис-

семинированного внутрисосудистого свертывания.

Для дифференциальной диагностики кровотечений

Мутация % выявленных мутаций

Частоты мутаций в популяциях по данным HbVar

Русские Турки Итальянцы Тайцы

Cap +20 3,2 – – – –

CD6 GAG GTG 3,2 – ? ? –

CD8 -AA 29,0 38,71 6,6 0,05 –

CD 8/9 +G 8,1 – 1,55 – 0,12

СD15 TGG TGA 4,8 6,45 – – –

IVS-1-1 G A 6,5 10,59 4,4 3,99 0,24

IVS-1-110 G A 6,5 6,45 42,29 11,21 –

IVS-2-1 G A 12,9 4,84 7,41 1,48 –


’2

01

1 нами используется алгоритм, включающий оценку

плазменного и клеточного звена гемостаза, выявляющий

избыток гепарина в крови, активизацию фибринолиза.

В сложных ситуациях дополнительно используется

тромбоэластография. В соответствии с результатами

лабораторного и клинического исследования рекомен-

дуется дополнительная нейтрализация гепарина,

трансфузионная терапия компонентами крови, на-

правленное использование препаратов крови, фарма-

котерапия или реторакотомия. Высоким является риск

тромботических осложнений в послеоперационном

периоде у детей при хирургической коррекции, связан-

ной с наложением анастомозов, протезированием кла-

панов сердца.

Наследственные тромбофилииу беременных

А.В. Соловьева, В.Е. РадзинскийКафедра акушерства и гинекологии с курсом

перинатологии Российского университета

дружбы народов, Москва

Беременность сопровождается повышением свер-

тывающего потенциала, снижением антикоагулянт-

ной активности и фибринолиза. Тромботический по-

тенциал беременности усугубляют венозный застой

в нижних конечностях за счет сжатия увеличенной

маткой нижней полой и тазовых вен, гормон-

опосредованное увеличение венозной емкости, рези-

стентность к инсулину и гиперлипидемия. Венозная

тромбоэмболия осложняет беременность с частотой

примерно 1 случай на 1600 рождений и приводит к ма-

теринской заболеваемости и смертности.

Существует тесная связь между наследственны-

ми тромбофилиями и венозной тромбоэмболией,

что делает обнаружение этих мутаций логической

мишенью для стратегий профилактики. Однако вы-

зывает сомнение, существует ли связь между наслед-

ственными тромбофилиями и неблагоприятными

исходами беременности.

В то время как метаанализ и ретроспективные

когортные исследования выявили ассоциацию меж-

ду наследственными тромбофилиями и потерями в I

триместре беременности, проспективные когортные

исследования не обнаружили связи между наслед-

ственными тромбофилиями и гибелью плода (Rey E.

et al., 2003; Dudding T.E., Attia J., 2004; Lissalde-

Lavigne G. et al., 2005).

В некоторых клинических исследованиях сооб-

щалось о связи между содержанием фактора

V Лейдена и преэклампсией, тяжелой преэклампси-

ей и преэклампсией до 37 недель беременности

(Kupferminc M.J. et. al., 1999; Nurk E. et al., 2006). Од-

нако несколько других исследований «контроль-

случай» не смогли доказать связь между фактором V

мутации Лейдена и преэклампсией (Currie L. et al.,

2002; Dizon-Townson D. et al., 2005; Kahn S.R. et al.,

2009). Многочисленные исследования также не

смогли установить связь между мутацией протром-

бина G20210A и преэклампсией или тяжелой преэ-

клампсией (Livingston J.C., 2001; Morrison E.R. et al.,

2002; Lin J., August P., 2005). В нескольких мета-

анализах обнаружена связь между дефицитом проте-

инов С/S и преэклампсией, однако эти выводы осно-

ваны на небольшом числе исследований, которые

содержат малое число участников (Alfirevic Z. et al.,

2002).

Исследования «случай-контроль», когортные

и систематические обзоры не обнаружили значи-

тельной связи между фактором V Лейдена и ограни-

чением роста плода (D’Elia A.V. et al., 2002; Howley H.E.

et al., 2005). Отсутствие связи было отмечено между

мутациями гена G20210A протромбина и ЗВУР

[Franchi F. et al., 2004; Verspyck E. et al., 2004].

Существует достаточно доказательств, устанавли-

вающих связь между тромбофилией и отслойкой пла-

центы. Метаанализ исследований «случай-контроль»

выявил связь между отслойкой плаценты и гомозигот-

ностью и гетерозиготностью для мутации фактора V

Лейдена и связь между гетерозиготностью при мутации

гена протромбина G20210A и отслойкой плаценты

(Alfirevic Z. et al., 2002). Обнаружена связь между пла-

центарной отслойкой и гипергомоцистеинемией более

15 мкмоль/л (Vollset S.E. et al., 2000), но минимальная

связь между гомозиготностью для MTHFR C677T-

полиморфизма и отслойкой плаценты (Nurk E. et al.,

2004).

Таким образом, увеличение частоты скрининга

тромбофилий у беременных не привело к оптимиза-

ции исходов беременности.

Влияние аллогенных мезенхимальных стволовых клеток на способность

лейкемических клеток к спонтанному и индуцированному апоптозу

и чувствительность к противолейке-мическим препаратам in vitro

О.С. Татаринова1, Е.Ю. Осипова1, Т.В. Шаманская1, С.А. Плясунова1, В.В. Калинина1, З.М. Дышлевая2,

Е.В. Скоробогатова2, С.А. Румянцев1





Введение. В последние годы метод транспланта-

ции мезенхимальных стволовых клеток (МСК), как

аутологичных, так и аллогенных, все чаще использу-

ется в клинической практике в целях ускорения при-


2’

20

11живления гемопоэтических предшественников и для

коррекции реакции «трансплантат против хозяина»

(РТПХ) при онкогематологических заболеваниях.

Это заставляет задуматься, какое влияние МСК мо-

гут оказывать на лейкемические клетки, присутству-

ющие в костном мозге в форме минимальной рези-

дуальной болезни.

Цель работы. Определение влияния аллогенных

мезенхимальных стволовых клеток костного мозга

доноров на пролиферативную активность нормаль-

ных гранулоцитарно-макрофагальных (ГМ) предше-

ственников, чувствительность лейкемических кле-

ток при острых лейкозах к противолейкемическим

препаратам in vitro и способность лейкемических

клеток пациентов к спонтанному и индуцированно-

му цитарабином апоптозу.

Материалы и методы. Лейкемические клетки,

выделенные из костного мозга пациентов (6 меся-

цев — 17 лет) с впервые диагностированными неле-

чеными острыми лейкозами: B-ОЛЛ — 15, T-ОЛЛ —

4, ОМЛ — 9. МСК (от 23 здоровых доноров) культи-

вировали в среде ДМЕМ с 20 % ЭТС до 3–5-го

пассажа по стандартной методике. Клоногенное ис-

следование ГМ-предшественников костного мозга

проводили в полутвердой агаровой среде. Чувстви-

тельность бластных клеток к цитотоксическим пре-

паратам исследовали в MTT-тесте. Для определения

уровней спонтанного и индуцированного апоптоза

в лейкемических клетках использовали Apoptosis

Detection Kit II (BD). Количественное содержание

цитокинов и ростовых факторов в культурах МСК

определяли на проточном цитофлюориметре с ис-

пользованием реагентов Cytometric Bead Array (СВА)

BD. Статистическая компьютерная обработка полу-

ченного материала проводилась при помощи пакета

программ Microsoft Excel и Statistica 8.0.

Результаты. Использование подслоя из МСК сти-

мулирует пролиферацию ГМ-предшественников кост-

ного мозга более эффективно, чем добавление такого

стандартного источника колониестимулирующих фак-

торов, как кондиционированная среда от ФГА-

стимулированных лейкоцитов. Эффективность клони-

рования составляла 27,9 и 22,9 соответственно. При

культивировании лейкемических клеток на подслое из

МСК в течение 4 суток доля жизнеспособных клеток

была выше на 47,2 % при ОЛЛ и на 63,1 % при ОМЛ по

сравнению с контрольными культурами. Инкубация

лейкемических клеток в присутствии МСК приводила

к снижению чувствительности к цитозару в 2 раза при

В-ОЛЛ. Под влиянием МСК чувствительность к дау-

норубицину снижалась во всех группах лейкемических

клеток. МСК увеличивали чувствительность бластных

клеток при ОЛЛ к метилпреднизолону. При определе-

нии уровней спонтанного и индуцированного апопто-

за отмечалось снижение доли апоптотических клеток

под действием МСК в сравнении с группами, инкуби-

рованными без подложки из МСК. Исследование

культур МСК с помощью СВА показало, что МСК

продуцируют широкий спектр цитокинов и раствори-

мых молекул адгезии, которые могут опосредовать вли-

яние МСК на жизнеспособность кроветворных пред-

шественников и лейкемических клеток. Концентрации

цитокинов и растворимых молекул адгезии в кондици-

онной среде монослойных культур МСК на 6-е сутки

после пассирования составили: IL-2 — 38,7 нг/мл;

IL-4 — 53,6 нг/мл; IL-6 — 145,2 нг/мл; IL-10 — 145,2

нг/мл; sVCAM — 8,73 нг/мл; ICAM — 13,7 нг/мл;

sPECAM — 10,3 нг/мл.

Заключение. В ходе проведенного исследования

показано, что МСК костного мозга доноров могут

оказывать влияние на чувствительность лейкемиче-

ских клеток пациентов к противолейкемическим

препаратам in vitro: статистически значимо снижают

чувствительность лейкемических клеток миелоид-

ного ряда к даунорубицину и способствуют выжива-

емости всех групп лейкемических клеток. Широкое

применение трансплантации мезенхимальных кле-

ток в клинической практике, особенно у онкогема-

тологических пациентов, диктует необходимость

проведения широкомасштабных исследований для

изучения механизмов влияния МСК на лейкемиче-

ские клетки.

Стандартизация молекулярногомониторинга хронического миелолей-коза, основанного на количественном определении маркера BCR-ABL (P210) методом ПЦР в реальном времени

О.Б. Трофимова1, Д.А. Куевда1, А.Ю. Зарицкий2, А.С. Улитина2, Т.Е. Хомякова3

1ФГУН Центральный научно-исследовательский

институт эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва;2ФГУ Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии

им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург;3ООО «Новартис Фарма», Москва

«Лейкоз Квант M-bcr-FRT» — набор реагентов,

позволяющий оценивать количество мРНК транс-

крипта химерного гена BCR-ABL по отношению

к количеству транскрипта неизмененного гена ABL.

Набор был разработан с учетом правил и требований

European Leukemia Net (ELN), однако европейский

опыт показал, что даже при использовании одинако-

вых реагентов разные условия работы в лабораториях

приводят к возникновению различий в получаемых

результатах. Критерии оценки ответа на терапию бы-

ли определены в ходе широкомасштабных исследо-

ваний для значений отношения BCR-ABL/ABL, вы-

раженных в единой международной шкале. В связи

с этим точность и сопоставимость получаемых лабо-

раторией результатов со значением по международ-


’2

01

1 ной шкале крайне важны для коррекции терапии

и прогноза течения заболевания.

Цель и задачи. Для применения эффективных

принципов терапии, разработанных в Европе, необ-

ходима стандартизация российской лабораторной

сети диагностики хронического миелоидного лейко-

за (ХМЛ): сопоставление и международное шкали-

рование результатов, получаемых в России по срав-

нению с референс-лабораторией ELN. В рамках

стандартизации исследований предусмотрено

2 основных этапа: 1-й — вычисление конверсионно-

го фактора между значениями BCR-ABL/ABL, полу-

чаемыми в России и получаемыми в Европе, и 2-й —

получение коэффициентов пересчета между всеми

лабораториями России.

Материалы и методы. Для выполнения первой за-

дачи в ФГУ ФЦСКиЭ им. В.А. Алмазова собраны 30

образцов от пациентов с ХМЛ с разным процентным

содержанием BCR-ABL к ABL, далее они были дважды

измерены в ФГУ ФЦСКиЭ им. В.А. Алмазова, а также

в ЦНИИЭ по принятому стандартному протоколу.

Порции этих образцов отправлены в лабораторию, ак-

кредитованную ELN, в Германии. По результатам дву-

стороннего тестирования 30 образцов будет вычислен

поправочный коэффициент между российскими и ев-

ропейскими исследованиями. Для выполнения второй

задачи в ЦНИИЭ разработаны контрольные панели,

приготовленные из крови здорового донора и крови

пациента с ХМЛ, смешанной в разных пропорциях для

получения образцов с отношением BCR-ABL/ABL по-

рядка 10 %, 1 %, 0,1 % и 0,01 %. Данные панели разосла-

ны в 15 лабораторий на территории РФ. К настоящему

моменту 12 лабораторий успешно измерили контроль-

ные образцы. Также в рамках второй задачи все 15 рос-

сийских лабораторий в настоящий момент коллекцио-

нируют образцы крови пациентов с соотношением

BCR-ABL/ABL порядка 10 %, 1 %, 0,1 % и 0,01 %. Эти об-

разцы будут измерены в каждой лаборатории дважды,

порции тех же образцов будут измерены в ЦНИИЭ.

Результаты и выводы. По результатам тестирова-

ния 30 образцов в России и Европе, а также по ре-

зультатам тестирования образцов контрольной пане-

ли и 5 образцов пациентов в каждой из российских

лабораторий будет вычислен индивидуальный кон-

версионный фактор пересчета результатов, который

обеспечит сопоставимость всех результатов, получае-

мых в РФ, а также позволит корректировать терапев-

тические мероприятия, ориентируясь на рекоменда-

ции, определенные для значений в рамках единой

международной шкалы результатов.

Прогностическое значениеопределения минимальной остаточной

болезни выявлением химерныхтранскриптов у детей первого года

жизни, получавших терапиюпо протоколу MLL-Baby

Г.А. Цаур1,3, А.М. Попов1,3, Т.В. Наседкина2,О.В. Каленник2, А.М. Кустанович4, О.В. Алейникова4,

Т.О. Ригер1,3, Е.В. Шориков1,3, Л.И. Савельев5, Л.Г. Фечина1,3

1Областная детская клиническая больница № 1,

Екатеринбург; 2Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва; 3Институт

медицинских клеточных технологий, Екатеринбург; 4Республиканский научно-практический центр

детской онкологии и гематологии, Минск; 5ГОУ ВПО

Уральская государственная медицинская академия,

Екатеринбург

Цель работы — оценка прогностического значе-

ния минимальной остаточной болезни (МОБ), вы-

являемой методом обратно-транскриптазной ПЦР

(ОТ-ПЦР) с определением различных химерных

транскриптов (ХТр) гена MLL у детей, включенных

в протокол MLL-Baby.

Методы. Наличие перестроек гена MLL выявля-

лось методами гнездной ОТ-ПЦР, FISH и подтверж-

далось длинной инвентированной ПЦР. Выявление

ХТр проводилось одновременно методами каче-

ственной гнездной ОТ-ПЦР и количественной ПЦР

в реальном времени по ранее описанным протоко-

лам. Под МОБ-негативностью понимали отсутствие

ХТр в обоих исследованиях с чувствительностью не

ниже 1 10–4. В исследование включены 23 пациен-

та, у которых образцы костного мозга были взяты не

менее чем в 4 точках наблюдения (ТН). Медиана на-

блюдения составила 30 (7–90) мес.

Результаты. В исследуемой группе было 13 паци-

ентов с наличием ХТр MLL-AF4, 3 — с MLL-EPS15,

по 2 — с MLL-MLLT10 и MLL-MLLT1 и 1 — с MLL-

MLLT3. Образцы костного мозга были взяты на мо-

мент диагностики, на 15-й (ТН1) и 36-й (ТН2) дни

индукционной терапии и далее после каждого курса

полностью транс-ретиноевой кислоты. Производил-

ся расчет бессобытийной выживаемости (БСВ). Ис-

ходя из качественных результатов определения

МОБ, пациенты подразделялись на МОБ-

позитивных и МОБ-негативных. Самой ранней ТН,

для которой были получены статистически значи-

мые различия в БСВ МОБ-позитивных и МОБ-

негативных пациентов, являлась ТН3. В зависимо-

сти от наличия МОБ в ТН3 и ТН4 пациенты были

разделены на 3 группы. Группа стандартного риска,

выделенная по результатам определения МОБ,


2’

20

11включала 8 пациентов, которые были МОБ-

негативными в обеих ТН. Пять пациентов, остав-

шихся МОБ-позитивными в ТН4, были отнесены

в группу высокого риска. Группа промежуточного

риска состояла из 10 пациентов, которые были МОБ-

позитивны в ТН3, но стали МОБ-негативными

в ТН4. Исходы терапии в этих группах были различ-

ны. БСВ в 1-й группе составила 1,00; во 2-й — 0,70 ±

0,14 и в 3-й — 0,20 ± 0,17 (p = 0,002). Таким образом,

мониторинг МОБ путем определения ХТр имеет

важное прогностическое значение для пациентов

первого года жизни с ОЛЛ и наличием перестроек

гена MLL, получавших терапию по протоколу MLL-

Baby. Результаты определения МОБ позволили раз-

делить пациентов на 3 группы с различными исхода-

ми терапии.

Результаты цитогенетическойи молекулярно-генетической

диагнос тики острых лейкозов у детейпервого года жизни

Г.А. Цаур1,2, Е.В. Флейшман3, А.М. Попов1,2,4, О.И. Сокова3, О.В. Алейникова5, Э.Г. Бойченко6, Е.В. Волочник5, А.С. Иванова1,2, О.В. Каленник7,

Н.П. Кирсанова5, К.Л. Кондратчик8, А.М. Кустанович5, Е.C. Лапотентова5, Д.В. Литвинов9, И.С. Мартынкевич10, Н.В. Мякова9, Т.В. Наседкина7, В.А. Овсепян11, Ю.В. Ольшанская9, О.М. Плеханова1,

А.В. Попа3, Т.О. Ригер1,2, Л.И. Савельев1,2,4, О.В. Стренева1,2, М.В. Стригалева1, И.В. Шмунк12,

Е.В. Шориков1,2, Л.Г. Фечина1,2

1Областная детская клиническая больница № 1,

Екатеринбург; 2Институт медицинских клеточных

технологий, Екатеринбург; 3Российский онкологиче-

ский научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва; 4ГОУ ВПО Уральская государственная медицинская

академия, Екатеринбург; 5Республиканский научно-

практический центр детской онкологии и гематологии,

Минск; 6Детская городская больница № 1,

Санкт-Петербург; 7Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва; 8Морозовская

детская городская клиническая больница, Москва; 9ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской

гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоц-

развития России, Москва; 10Российский научно-

исследовательский институт гематологии и транс-

фузиологии ФМБА России, Санкт-Петербург; 11ФГУ

Кировский научно-исследовательский институт

гематологии и переливания крови ФМБА России;12Челябинская областная станция переливания крови

В исследуемую группу вошло 155 детей в возрасте

от 1 дня до 12 мес (медиана — 6,5 мес), включая 117

пациентов с ОЛЛ, 31 — с ОМЛ и 7 — с другими типа-

ми острого лейкоза. Среди выявленных генетических

аберраций наиболее часто обнаруживали транслока-

ции с участием района 11q23/MLL. Они доминирова-

ли как при ОЛЛ — 63,2 %, так и при ОМЛ — 48,4 %.

Частота отдельных специфических транслокаций

с участием 11q23/MLL различалась при ОЛЛ и ОМЛ.

Среди группы с наличием транслокаций 11q23/MLL

преобладала t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4 — 63,5 % слу-

чаев, реже встречались t(11;19)(q23;p13)/MLL-

MLLT1 — 18,9 % случаев, t(10;11)(p12;q23)/MLL-

MLLT10 и t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15 — по 6,8 %.

В возрасте младше 6 мес транслокации 11q23/MLL

были выявлены в 84,0 % случаев, что достоверно ча-

ще, чем возрасте 6–12 мес — 47,8 % случаев (р < 0,001).

Структура химерного транскрипта определена у 26

пациентов с ОЛЛ. В 14 из 26 (53,8 %) случаев точка

слияния располагалась в 11 экзоне гена MLL. Самой

частой перестройкой при ОМЛ была t(10;11)(p12;q23)/

MLL-MLLT10, которая обнаружена у 6 (19,4 %) паци-

ентов. В 5 случаях ОМЛ выявлена t(1;22)(p13;q13).

Сложный кариотип — 3 или более числовых и/или

структурных аномалии, в том числе перестройки

11q23 с отсутствием маркеров благоприятного про-

гноза — обнаружен у 4 пациентов с ОМЛ. В 6 случаях

у пациентов с нормальным кариотипом использова-

ние ОТ-ПЦР и FISH помогло выявить наличие кри-

тических вариантов транслокаций района 11q23. Ци-

тогенетические и молекулярно-генетические изменения,

прогностически важные при острых лейкозах у детей

более старших возрастных групп, у детей первого года

жизни наблюдались чрезвычайно редко: выявлено по

1 случаю t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL и t(1;19)(q23;p13)/

TCF3-PBX, 2 случая inv(16)(p13q22), 2 случая высокой

гипердиплоидии, 1 случай гиподиплоидии.

Особенности энергетическогообмена у детей с онкологическими

заболеваниями

Г.Я. Цейтлин1, М.В. Коновалова1, А.Ю. Вашура1, Е.В. Скоробогатова2, Д.В. Литвинов1





Питание — важный фактор, влияющий на состо-

яние здоровья и эффективность адаптации организ-

ма к неблагоприятным условиям. Рационы питания,

разработанные для детских ЛПУ, нельзя считать со-

ответствующими потребностям конкретного паци-

ента онкопедиатрической клиники в энергии и пи-

щевых ингредиентах, поскольку их расчет базируется

на усредненных значениях и в минимальной степени

позволяет учитывать индивидуальные показатели

состояния питания и нарушения метаболизма у кон-


’2

01

1 кретного ребенка. По данным разных авторов, ну-

тритивная недостаточность (НН) отмечается у 20–

50 % детей со злокачественными новообразования-

ми уже при первичном поступлении в клинику,

а в процессе химиотерапии эти нарушения имеют

место практически у 100 % пациентов. В специаль-

ных исследованиях установлена существенная связь

НН с повышенным риском развития осложнений

полихимиотерапии (ПХТ), плохим заживлением

операционных ран, нарушениями иммунного стату-

са и т. д.

Цель работы. Оценить величину энергопотреб-

ности покоя (Еп) у детей с онкологическими заболе-

ваниями в процессе химиотерапии и в посттранс-

плантационном периоде.

Материалы и методы. Еп измерялась в динамике

у 37 детей в возрасте от 5 до 17 лет (медиана — 11,7

лет), получавших ПХТ (5 человек) или находивших-

ся в посттрансплантационном периоде (32 ребенка);

всего произведено 102 измерения. Еп оценивали ме-

тодом непрямой калориметрии с использованием

метаболографа Ultima CCM (Medgraphics, USA).

Результаты и обсуждение. В 63,7 % наблюдений

отмечено существенное снижение Еп по сравнению

с расчетным, причем в 25,5 % случаев снижение но-

сило выраженный характер — от 30 до 50 %; в 4,9 %

случаев Еп была увеличена на 10–20 %; только

в 31,4 % наблюдений значение Еп практически не

отличалось от расчетного. Следовательно, оценка Еп

детей, получающих ПХТ и/или находящихся в пост-

трансплантационном периоде, с использованием

расчетных формул может приводить к серьезным

ошибкам, что нужно учитывать при проведении ну-

тритивной поддержки этих пациентов.

Заключение. Полученные данные обосновывают

необходимость постоянного мониторинга энергопо-

требности детей с онкологическими заболеваниями

в процессе специального лечения для выработки ин-

дивидуальной программы нутритивной поддержки.

Атипичная Rho ГТФаза Chp/RhoV:новый участник канцерогенеза?

М.В. Шепелев, И.В. КоробкоИнститут биологии гена РАН, Москва

Белки семейства Rho ГТФаз участвуют в регуляции

многих клеточных процессов, включая перестройку ак-

тинового цитоскелета, установление полярности кле-

ток, прогрессию клеточного цикла и др., а также играют

существенную роль в прогрессии опухолей. Chp/RhoV

является малоизученной атипичной Rho ГТФазой.

К настоящему времени было выявлено, что экспрессия

Chp индуцирует формирование ламеллиподий и фо-

кальных контактов, а также активирует про-онкогенную

протеинкиназу Pak1. Это предполагает, что экспрессия

Chp может вносить существенный вклад в процессы

развития и прогрессии опухолей. Действительно, ис-

следование панели опухолей немелкоклеточного рака

легкого выявило частое (в 76 % случаев) увеличение

экспрессии Chp в ткани опухолей по сравнению с при-

легающей нормальной тканью легкого. Таким образом,

экспрессия Chp может быть ассоциирована с опухоле-

выми клетками, что предполагает участие Сhp в канце-

рогенезе. Исследуя молекулярные механизмы действия

Chp, нами было установлено, что экспрессия Chp

вызывает образование филоподий, что вместе с ранее

описанным Chp-зависимым формированием ламелли-

подий и фокальных контактов предполагает участие

Chp, сходно с другими Rho ГТФазами, в контроле ми-

грационных и инвазивных свойств клеток. Исследуя

молекулярные механизмы, лежащие в основе участия

Chp в контроле динамики цитоскелета, нами было уста-

новлено, что Chp взаимодействует с белком IRSp53, ко-

торый в зависимости от молекулярного контекста

может вызывать формирование как филоподий, так

и ламеллиподий. Кроме того, нами было выявлено вза-

имодействие Chp с тубулином и микротрубочками, что

является механистической основой для возможной

роли Chp как координатора актинового и микротрубоч-

кового цитоскелетов клеток. Наконец, нами было про-

демонстрировано, что Chp обладает способностью ак-

тивировать JNK-сигнальный каскад, играющий важ-

ную роль в прогрессии опухолей. Суммируя результаты

наших исследований, мы впервые выявили увеличен-

ную экспрессию ГТФазы Chp при раке легкого, что по-

зволяет рассматривать Chp как новый молекулярный

маркер опухолей легкого. Полученные нами данные

предполагают участие Chp как в контроле миграцион-

ных и инвазивных свойств клеток, так и в регуляции

внутриклеточных сигнальных путей, гиперактивация

которых наблюдается в опухолевых клетках. Получен-

ные результаты служат основанием для дальнейшего

исследования роли Chp в процессах возникновения

и прогрессии опухолей и как потенциально новой ми-

шени в противоопухолевой терапии.

Фенотип пациентовс миелопролиферацией,

имеющих мутацию V617F гена JAK2

И.В. Шмунк1, Е.П. Конева1, Т.А. Суслова1,М.Н. Русаков2, В.Э. Ботвиновский2,

С.Н. Андриевских3, О.В. Коробицына4, А.В. Коробкин4

1ОГУП Челябинская областная станция переливания

крови; 2Городская клиническая больница № 1,

Челябинск; 3Городская клиническая больница № 8,

Челябинск; 4Челябинская областная клиническая

больница

Введение. Определение мутации V617F гена JAK2

включено в перечень диагностических критериев

WHO для миелопролиферативных заболеваний


2’

20

11(MPN): истинной полицитемии (PV), эссенциаль-

ной тромбоцитемии (ET), первичного миелофибро-

за (PMF). Эта мутация не является специфичной для

определенного типа MPN, но подтверждает кло-

нальную природу пролиферации.

Материалы и методы. V617F определяли в геном-

ной ДНК методом ПЦР в режиме реального времени

с использованием реактивов ООО НПФ Синтол

(Москва) и Ipsogen (France). Минимальное опреде-

ляемое количество мутантного аллеля составляет

2 %. Соотношение мутантного аллеля и аллеля дико-

го типа оценивали по Ct=Ct(G)-Ct(T). Для оценки

статистической значимости различий использовали

t-тест Стьюдента и точный критерий Фишера.

Результаты. На наличие мутации обследовано

645 пациентов с подозрением на миелопролифера-

цию. Выявлено 167 пациентов с мутацией V617F:

35 — с диагнозом PV (15 мужчин / 20 женщин); 43 —

с ET (16 мужчин / 27 женщин); 9 — с PMF (2 мужчи-

ны / 7 женщин) и 80 (37 мужчин / 43 женщины) — не

были верифицированы по конкретному типу MPN.

Медиана (m) возраста пациентов с мутацией соста-

вила 60 (19–84) лет. Пациентов в возрасте до 40 лет

в группе с ET было 14 % (только женщины), в группе

с PV — 5,7 %, в группе с MPN — 8,8 %. Уровень гемо-

глобина у пациентов с PV составил m(Hb) = 179

(165–216) г/л. Повышенное количество тромбоци-

тов периферической крови (ПК) имели 60 % пациен-

тов с PV: m(tr PV) = 567 109/л (450–1325 109/л), что

ниже уровня тромбоцитов у пациентов с ET:

m(tr ET) = 734 109/л (480–3000 109/л) р = 0,038.

Также повышенное количество тромбоцитов имели

62 % пациентов с недифференцированной миело-

пролиферацией (MPN): m(tr MPN) = 653 109/л

(450–3420 109/л), достоверные различия с ET отсут-

ствуют. Повышенный уровень лейкоцитов ПК отме-

чен в группе с MPN: m(L MPN) = 16,7 109/л (4,7–

74,0 109/л) против m(L PV) = 10,0 109/л (4,9–36,5

109/л), p = 0,011; m(L ET) = 11,5 109/л (4,8–22,7 109/л), p = 0,001. Спленомегалия отмечена в 22 % слу-

чаев PMF, в 10 % случаев MPN и у 3,8 % пациентов

с PV + ET. Соотношение мутантного аллеля и аллеля

дикого типа различается в группах с разными типами

MPN: более 50 % мутантного аллеля присутствует

у 54 % пациентов с PV (m( Ct) = 0,9 (–8 – +23))

и 60 % MPN (m(Ct) = 0,25 (–13 – +23)). Преоблада-

ние аллеля дикого типа над мутантным имело место

в группе ET (m( Ct) = –1,5 (–14 – +3)) и PMF

(m(Ct) = –1,7 (–10 – +1,5)) — у 76,7 % и 77,8 % па-

циентов соответственно. Различия достоверны для

ET с PV (p = 0,001) и с MPN (р = 0,001).

Вывод. Мутация V617F гена JAK2 определяется

у пациентов с различным клиническим фенотипом

BCR/ABL-негативной миелопролиферации. Более

низкая аллельная нагрузка характерна для пациен-

тов с эссенциальной тромбоцитемией.

582

’2

01

1

Одна из причин образования избыточного количества

железа — неоднократные переливания эритроцитов (гемо-

трансфузии). По оценкам, вторичная перегрузка железом

вследствие регулярной заместительной терапии трансфузия-

ми эритроцитной массы может развиваться у 500 больных де-

тей и 2000 взрослых в России. Заменить гемотрансфузию

зачастую нечем — пациенты с различными формами наслед-

ственных, врожденных и вторичных анемий, как правило,

находятся в стойкой зависимости от постоянных перелива-

ний компонентов крови. К числу подобных заболеваний

можно отнести редкие, но все же встречающиеся в РФ талас-

семии и другие гемоглобинопатии, врожденные и вторичные

апластические анемии, сидеробластную анемию и миелоди-

спластические синдромы (МДС). Все эти заболевания призна-

ны Orphanet* редкими (орфанными**).

Диагноз врожденных и наследственных анемий, как

правило, устанавливается вскоре после рождения, и уже

к двум годам пациенты не могут обходиться без регуляр-

ных гемотрансфузий. Перегрузка организма железом при-

водит к ранней инвалидизации детей и их ранней гибели —

уже к 10 годам. Причинами смерти часто становятся

осложнения лечения основного заболевания, связанные

с перегрузкой железом, — сердечная недостаточность

и кардиомиопатии (60 % всех летальных исходов), цирроз

печени, печеночная недостаточность, сахарный диабет.

Однако при правильном, адекватном и своевремен-

ном лечении продолжительность жизни пациента увели-

чивается до 50–60 лет. Единственная возможность, даю-

щая шанс если не излечить, но стабилизировать основное

заболевание, — активное удаление избытка железа из орга-

низма. Своевременное назначение лечения, направленного

на элиминацию избыточного железа (хелаторная терапия)

позволяет предотвращать или уменьшать его накопление

в тканях и органах. Тот же способ — удаление избытка же-

леза из организма — высоко эффективен в лечении друго-

го редкого заболевания — наследственного гемохромато-

за, как правило, выявляемого у взрослых.

Настоящим прорывом в лечении посттрансфузион-

ной перегрузки железом стало создание и внедрение

в практику в 2005 г. первого перорального хелатора железа

для однократного суточного приема — препарата Эксид-

жад (деферазирокс).

«Эксиджад относится к группе лекарств-комплексо-

нов, — пояснил д.м.н., член-корреспондент РАМН директор

Федерального научно-клинического центра детской гема-

тологии, онкологии и иммунологии А.Г. Румянцев. — Он

связывает и выводит из организма избыточное железо, по-

зволяя серьезно улучшить выживаемость пациента,

который нуждается в постоянных гемотрансфузиях — пе-

реливаниях компонентов крови, и по разным причинам

накапливает железо в организме».

Эксиджад позволяет проводить лечение в течение дли-

тельного времени, в том числе и амбулаторно. Препарат

выпускается в форме растворимых в жидкости таблеток,

и потому обладает существенными преимуществами за

счет удобства применения (особенно для детей).

«Только благодаря тому, что сегодня на рынок выведе-

на пероральная форма, удобная для приема, гематологиче-

ская общественность стала медленно, но уверенно

двигаться к решению проблемы гемотрансфузионной пе-

регрузки железом», — объяснил д.м.н., главный научный

сотрудник Российского НИИ гематологии и трансфузио-

логии (Санкт-Петербург) С.В. Грицаев.

Успешный опыт применения хелатора железа позво-

ляет утверждать, что своевременная и правильная терапия

продляет и делает полноценной жизнь пациентов, страда-

ющих талассемией и врожденными наследственными ане-

миями. Больные, получающие препарат амб улаторно, мо-

гут полноценно участвовать в жизни общества, учиться,

работать.

П Р Е С С - Р Е Л И З

Вопросы эффективной помощи пациентам с редкими гематологическими заболеваниями были подняты в рам-

ках научной конференции «Хелаторная терапия: вчера, сегодня, завтра». Речь шла о современных технологиях

и средствах лечения больных, страдающих от вторичной перегрузки железом в результате переливаний эритроцит-

ной массы, которая как у детей, так и у взрослых ведет к тяжелым последствиям. Однако сегодня уже широко досту-

пен препарат, способный эффективно выводить избыток железа из организма, предотвращая и купируя осложнения

перегрузки железом, — пероральный хелатор железа Эксиджад.

* Orphanet — информационный портал о редких заболеваниях, необходимых для их лечения «лекарствах-сиротах» и редко применяемых

медицинских технологиях.

** Орфанные заболевания — заболевания, которые считаются редкими, если имеют распространенность не более 5 случаев на 100 тыс.

населения. Лечение таких болезней осуществляется за счет государственного бюджета, государство также обеспечивает заболевших

лекарствами. Орфанные препараты — фармацевтические средства, разработанные для лечения редких заболеваний.

Знать и применять: возможности хелаторной терапии

59

2’

20

11

П Р Е С С - Р Е Л И З

Эксиджаду присвоен орфанный статус на территории

европейских стран, США, Австралии и Турции — это озна-

чает, что больные обеспечиваются препаратом бесплатно

на протяжении всей жизни за счет государства. В 2007 г.

Эксиджад был зарегистрирован на территории РФ для

применения при хронической посттрансфузионной пере-

грузке железом у взрослых и детей в возрасте от 2 лет.

Однако до сих пор одно из наиболее неблагоприятных

осложнений гемотрансфузионной терапии не имеет офи-

циально принятого в России стандарта лечения — в отли-

чие от большинства зарубежных стран, — отметили

участники конференции. В настоящее время идет работа

над обновленными стандартами медицинской помощи

при гематологических заболеваниях, которые приблизят

возможности лечения наших пациентов к международным

рекомендациям; создается регистр трансфузионно-

зависимых анемий.

В ходе скрининговой диагностической программы

в России выявлено более 2000 пациентов, страдающих

гема тологическими заболеваниями и регулярно получаю-

щих заместительные гемотрансфузии, и определено коли-

чество пациентов, нуждающихся в хелаторной терапии.

Учитывая тот факт, что в 2011 г. Эксиджад внесен в пере-

чень жизненно необходимых и важнейших лекарственных

препаратов (ЖНВЛП), полученные данные позволят орга-

нам здравоохранения выяснить, какое количество средств

необходимо для пациентов, нуждающихся в лечении,

и сделать помощь государства адресной.

Какие же проблемы остаются нерешенными? Прежде

всего, необходимо обеспечить хелаторной терапией всех

без исключения нуждающихся пациентов: до сих пор та-

ких больных гораздо больше, чем тех, кто получает

препарат. Насущной является необходимость включения

в перечень орфанных (редких) заболеваний талассемии,

апластической и гемолитической анемий, МДС для обе-

спечения пациентов жизнеспасающей хелаторной терапи-

ей. Проблема заключается и в неопределенности группы

орфанных заболеваний в новой редакции закона «О лекар-

ственных средствах».

Повсеместная доступность диагностики перегрузки

железом и выработка четких показаний к хелаторной тера-

пии (особенно у пациентов с МДС и пациентов, нуждаю-

щихся в трансплантации костного мозга) — также в числе

самых актуальных проблем помощи гематологическим

больным. По мере решения этих вопросов разница между

числом нуждающихся в терапии Эксиджадом и числом па-

циентов, получающих хелаторную терапию, будет умень-

шаться. А это означает, что врачи получат уверенность

в своих возможностях, и, соответственно, в хорошем про-

гнозе для своих пациентов — достойной жизни при любом

заболевании, даже если оно редкое.

«Компания «Новартис» видит свою социальную от-

ветственность в том, что производит редкий препарат,

способный помочь только ограниченной группе пациен-

тов. Но, с другой стороны, это значит, что медицина ста-

новится персонализированной — мы можем предлагать

конкретному пациенту предназначенные только для него

лечебные препараты, и это огромный прогресс», — увере-

на Н.В. Лободенко, генеральный менеджер департамента

онкологических препаратов ООО «Новартис Фарма».

В состав президиума конференции вошли ученые — ведущие специалисты в области онкогематологии

602

’2

01

1

И н ф о р м а ц и я д л я а в т о р о в

При оформлении статей, направляемых в журнал «Онкогема-тология», следует руководствоваться следующими правилами:

1. Статья должна быть представлена в электронном виде (компакт-диск или дискета) с распечаткой на бумаге формата А4 в двух экземпля-рах (таблицы, графики, рисунки, подписи к рисункам, список литературы, резюме — на отдельных листах).

Шрифт — Times New Roman, 14 пунктов, через 1,5 интервала. Все страницы должны быть пронумерованы.

2. На первой странице должно быть указано: название статьи, ини-циалы и фамилии всех авторов, полное название учреждения (учрежде-ний), в котором (которых) выполнена работа, город.

Обязательно указывается, в каком учреждении работает каждый из авторов.

Статья должна быть подписана всеми авторами. В конце статьи должны быть обязательно указаны контактные телефоны, рабочий адрес с указанием индекса, факс, адрес электронной почты и фа-милия, имя, отчество полностью, занимаемая должность, уче-ная степень, ученое звание автора (авторов), с которым редакция будет вести переписку.

3. Объем статей: оригинальная статья — не более 12 страниц; опи-сание отдельных наблюдений, заметки из практики — не более 5 стра-ниц; обзор литературы — не более 20 страниц; краткие сообщения и письма в редакцию — 3 страницы.

Структура оригинальной статьи: введение, материалы и мето-ды, результаты исследования и их обсуждение, заключение (выводы).

К статьям должно быть приложено резюме на русском языке, отра-жающее содержание работы, с названием статьи, фамилиями и инициа-лами авторов, названием учреждений. Объем резюме — не более 1/3 машинописной страницы с указанием ключевых слов.

4. Иллюстративный материал:• Фотографии должны быть контрастными; рисунки, графики и диаграм-мы — четкими.• Фотографии представляются в оригинале или в электронном виде в фор-мате TIFF, JPG, CMYK с разрешением не менее 300 dpi (точек на дюйм).• Графики, схемы и рисунки должны быть представлены в формате EPS Adobe Illustrator 7.0—10.0. При невозможности представления файлов в данном формате необходимо связаться с редакцией.• Все рисунки должны быть пронумерованы и снабжены подрисуночны-ми подписями. Подписи к рисункам даются на отдельном листе. На ри-сунке указываются «верх» и «низ»; фрагменты рисунка обозначаются строчными буквами русского алфавита — «а», «б» и т. д. Все сокращения и обозначения, использованные на рисунке, должны быть расшифрова-ны в подрисуночной подписи.• Все таблицы должны быть пронумерованы, иметь название. Все сокра-щения расшифровываются в примечании к таблице.

Уважаемые коллеги! • Ссылки на таблицы, рисунки и другие иллюстративные материалы при-водятся в надлежащих местах по тексту статьи в круглых скобках, а их расположение указывается автором в виде квадрата на полях статьи слева.

5. Единицы измерений даются в СИ. Все сокращения (аббревиатуры) в тексте статьи должны быть пол-

ностью расшифрованы при первом употреблении. Использование необ-щепринятых сокращений не допускается.

Название генов пишется курсивом, название белков — обычным шрифтом.

6. К статье должен быть приложен список цитируемой литературы, оформленный следующим образом:• Список ссылок приводится в порядке цитирования. Все источники должны быть пронумерованы, а их нумерация — строго соответствовать нумерации в тексте статьи. Ссылки на неопубликованные работы не допу-скаются.• Для каждого источника необходимо указать: фамилии и инициалы авто-ров (если авторов более 4, указываются первые 3 автора, затем ставится «и др.» в русском или «et al.» – в английском тексте).• При ссылке на статьи из журналов указывают также название ста-тьи; название журнала, год, том, номер выпуска, страницы.• При ссылке на монографии указывают также полное название книги, место издания, название издательства, год издания.• При ссылке на авторефераты диссертаций указывают также полное название работы, докторская или кандидатская, год и место издания.• При ссылке на данные, полученные из Интернета, указывают элек-тронный адрес цитируемого источника.• Все ссылки на литературные источники печатаются арабскими цифрами в квадратных скобках (например, [5]).• Количество цитируемых работ: в оригинальных статьях желательно не более 20—25 источников, в обзорах литературы — не более 60.

7. Представление в редакцию ранее опубликованных статей не до-пускается.

8. Все статьи, в том числе подготовленные аспирантами и соискате-лями ученой степени кандидата наук по результатам собственных иссле-дований, принимаются к печати бесплатно.

Статьи, не соответствующие данным требованиям, к рассмотрению не принимаются.

Все поступающие статьи рецензируются.Присланные материалы обратно не возвращаются.Редакция оставляет за собой право на редактирование ста-

тей, представленных к публикации.

Авторы могут присылать свои материалы по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, стр. 15 либо по электронной почте на адрес редакции: [email protected] с обязатель-ным указанием названия журнала.

ТЕРАПИЯ ВЫСОКИХ ДОСТИЖЕНИЙ

ЗАО «Рош-Москва» Официальный дистрибьютор «Ф. Хоффманн - Ля Рош Лтд.» (Швейцария) Россия, 107031 МоскваТрубная площадь, дом 2 Бизнес-центр «Неглинная Плаза» Тел.: + 7 (495) 229-29-99Факс: + 7 (495) 229-79-99 www.roche.ru

Показания. Неходжкинская лимфома Рецидивирующая или химиоустойчивая В-клеточная, СD20-положительная неходжкинская лимфома низкой степени злокачественности или фолликулярная. Фолликулярная лимфома III-IV стадии в комбинации с химиотерапией у ранее нелеченных пациентов. Фолликулярная лимфома в качестве поддерживающей терапии после ответа на индукционную терапию. СD20-положительная диффузная В-крупноклеточная неходжкинская лимфома в комбинации с химиотерапией по схеме CHOP. Хронический лимфолейкоз в комбинации с химиотерапией у пациентов, ранее не получавших стандартную терапию. Рецидивирующий или химиоустойчивый хронический лимфолейкоз в комбинации с химиотерапией. Ревматоидный артрит (активная форма) у взрослых в комбинации с метотрексатом при непереносимости или неадекватном ответе на текущие режимы терапии, включающие один или более ингибиторов фактора некроза опухолей (ФНО-а). Безопас-ность и эффективность препарата у детей не установлены. Противопоказания. Гиперчувствительность к ритуксимабу, любому компоненту препарата или к белкам мыши, острые инфекционные заболевания, выраженный первичный или вторичный иммунодефицит. Правила приготовления и хранения раствора. Необходимое количество препарата набирают в асептических условиях и разводят до расчетной концентрации (1-4 мг/мл) в инфузионном флаконе (пакете) с 0.9% раствором натрия хлорида для инфузий или 5% раствором декстрозы (растворы должны быть стерильными и апирогенными). Приготовленный инфузионный раствор Мабтеры физически и химически стабилен в течение 12 ч при комнатной температуре или в течение не более 24 ч при температуре от 2 до 8 °С. Мабтеру вводят внутривенно, инфузионно (медленно), через отдельный катетер. Нельзя вводить в/в болюсно или в виде в/в инъекций. Дополнительная информация в инструкции по применению.

Онкогематология №2 2011

Documents