РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕССНОГО БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО

МЕТОДА ОЦЕНКИ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА СПОРТСМЕНА НА

ФИЗИЧЕСКУЮ НАГРУЗКУ

Руководитель: профессор, д. б. н. Кратасюк В.А.

Научный консультант: м.н.с. Римацкая Н.В.

Выполнил: магистрант 2 года Иванова Г.В.

Проблема

Физическая нагрузка:

Эмоциональная нагрузка: Умственная нагрузка

Перегрузка организма

Травмы организма

Отсутствие объективных

экспресс методов контроля

Недостатки известных методов:• длительность, • сложность проведения анализа, • трудоемкость, • необходимость предварительной пробоподготовки в лаборатории, • инвазивность при анализе сыворотки и плазмы крови.

Сбор суточной мочи

ПульсометрыНаблюдения тренера

Анализ крови

Измерение гемодинамики

Определение максимального потребления кислорода (МНК), показателей анаэробного обмена (ПАНО) Фото электронного ресурса

www.google.ru

Цель работы:

Изучить закономерности влияния слюны на биолюминесцентную

биферментную реакцию НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-

люцифераза для разработки метода контроля стресса, связанного

с физическими и умственными перегрузками

Задачи:

1.Изучить влияние слюны на кинетику биолюминесцентной биферментной реакции: НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза

2.Определить факторы, влияющие на степень действия слюны на биолюминесцентную биферментную реакцию: НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза

3.Выбрать условия, обеспечивающие наибольшую чувствительность биолюминесцентного метода контроля стресса, связанного с физическими и умственными перегрузками

4.Изучить условия отбора и транспортировки проб слюны для получения повторяющихся результатов.

NADH:FMN-oxidoreductase (R)NADH:FMN-oxidoreductase (R)

NADH (NADPH) + H+ + FMN NAD(NADP)+ + FMNH2

Luciferase (L)Luciferase (L)

FMNH2 + RCHO + O2 FMN

+ RCOOH + H2О + h Состав реакционной смеси:50 мкл 0.0025%-ного водного раствора

альдегида;5мкл смеси ферментов L+R;300 мкл 0.25 M фосфатного буфера, рН

7.0;10 мкл 5,4х10-4M раствора FMN;100 мкл 4х10-4М раствора NADH;+ 50 мкл слюны

Материалы и методы

ПРОБОПОДГОТОВКА

Центрифуга Eppendorf Centrifuge 5810 r (Eppendorf , Германия)

Люминометр 20/20n (Turner BioSystems, США)

TriStar LB 941 Multimode Microplate ReaderФото электронного ресурса www.google.ru

6

Результаты

Данные Кратасюк В.А.

7

8

9

10

Диплом Черняева В.2011г.

Влияние слюны спортсменов (ориентирование) до и после тренировки

Диплом Черняев В. 2011г

Диплом Черняев В. 2011г

14

Пациент, №

Повторности

Воспроизводимость результатов анализа (Тип влияния слюны испытуемых на L+R при действии

физической нагрузки)1 2 3 Тип

Пациенты иппотерапии1 LI не изменяется LI не изменяется LI не изменяется 12 LI не изменяется LI не изменяется LI не изменяется 13 LI↓ LI ↓ LI не изменяется 24 LI не изменяется LI не изменяется LI не изменяется 15 LI ↓ LI ↓ LI ↓ 26 LI ↓ LI ↓ LI ↓ 27 LI не изменяется LI↓ LI ↓ 28 LI ↑ LI ↑ LI ↑ 3

Студенты1 LI не изменяется LI не изменяется LI не изменяется 12 LI не изменяется LI не изменяется LI не изменяется 13 LI ↓ LI ↓ LI ↓ 24 LI ↑ LI ↑ LI↑ 35 LI ↑ LI не изменяется LI ↑ 3

Диплом Черняев В. 2011г

Контроль эффективности лечения Контроль эффективности лечения методами иппотерапииметодами иппотерапии

III

I

IIIIII

III

III

I

№ пациента

LI,%

Диплом Черняев В. 2011г

СТУДЕНТЫ, ФИЗИЧЕСКАЯ НАГРУЗКА

2 человека

2 тип

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7

Повторности

ЛИ

до

во время

после

1 тип2 человека

2 тип

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7

Повторности

ЛИ

до

во время

после

2 тип

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7

Повторности

ЛИ до

во время

после

3 тип1 человек

Разделение на 3 группы:ЛИ увеличивается после нагрузкиЛИ уменьшается после нагрузкиЛИ почти не изменятся

Эффект сохраняется в нескольких экспериментах

Диплом Черняев В. 2011г

Сравнение результатов, полученных биолюминесцентным методом анализа слюны с результатами, полученными иными

экспериментальными и классическими методами (кардиограмма)

Исследование биохимического состава слюны на биохимических анализаторах

Диплом Гриценко Е.В.1998

РЕЗУЛЬТАТЫ•Использование метода атомно-абсорбционной спектроскопии для определения концентраций металлов в слюне.•Измерение активности ферментов слюны кинетическим методом на фотометре Humalyzer Junior.•Измерение физико-химических параметров слюны электрохимическим методом на газоанализаторе ABL50.Получение спектров поглощения слюны на двухлучевом регистрирующем спектрофотометре UVIKON 943.Получение ЯМР-спектра слюны.Показана зависимость величины ЛИ от концентрации ионов кальция, водородных ионов, активности ферментов: лактатдегидрогеназа, амилаза, аспартат-аминотрансфераза, креатинкиназа; концентрации ионов натрия, калия. Концентрация креатинина не связана с величиной ЛИ.

Получена динамика влияния слюны на биотест в течение дня, для людей живущих в одинаковых условиях(температура, питания, работа.)

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6 7

LI%

Участник

Динамика влияния слюны на биотест в течении дня.

утро

День

вечер

Диплом Черняева В.2011г.

ПОЛУЧЕНО ВЛИЯНИЕ СЛЮНЫ НА БИОТЕСТ ПОСЛЕ ПРИЕМА ПИЩИ

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5

Испытуемые(4,9,3,1,8)

ЛИ до еды

после еды

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6

Участник

LI%

до

после

Диплом Черняева В.2011г.

анализ биологической жидкости спортсмена, не употребляющего стероиды.

анализ биологической жидкости спортсмена, употребляющего стероиды

Эффект употребления стероидов на результаты биолюминесцентного теста

ВЛИЯНИЕ ВОЗРАСТА, ПОЛА, ВЕСА НА РЕАКЦИЮ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

Результаты

Хранение

ВЫВОДЫ

1 Обнаружена индивидуальная реакция организма на физическую и

умственную нагрузку, деление на 3 типа

2Предположено, что такие факторы как: концентрация химических

элементов, пол, вес, возраст, питание, применение препаратов влияют

на биферментную систему

3 Выбран оптимальный состав реакционной смеси для обеспечения

наибольшей чувствительности биолюминесцентного метода контроля

стресса, связанного с физическими и умственными перегрузками

4 Показано, что анализ слюны должен быть проведен в течение 4

часов после пробоотбора.