形态学研究及其

方 法 进 展

宋天保2006 年 10 月

•形态学研究思路和方法

•免疫组化方法进展

•基于 PCR 的原位检测技术

1. 形态学研究思路和方法

1.1 形态学发展简史

•解剖学的发展Galen(130 - 200) 《论解剖过程》 ,《论身体各部器官的功能》

Vesalius(1514 - 1564) 《人体的构造》 (1543)

•光学显微镜的发明

Leeuwenhoek(1632-1723)Hooke(1635-1702)《显微图谱》（ 1665 ）

1. 形态学研究思路和方法

•细胞学说的建立和完善Schleiden(1804-1881)“植物发生论”（ 1838 ）Schwann(1810-1882)“关于动植物的结构和生长一致性的显微研究” (1839)

Virchow(1821-1902)《细胞病理学》 (1858)

“omnis cellula e cellula”

1. 形态学研究思路和方法

1. 形态学研究思路和方法

•电子显微镜的发明和超微结构研究

Knoll 和 Ruska(1932)

Nobelprize1986

1. 形态学研究思路和方法

•现代形态学的发展

细胞 (组织 )化学 ,免疫细胞化学 ,原位分子杂交 ,细胞培养等

•向定量化、自动化和数字化发展

1. 形态学研究思路和方法

1.2 形态学的作用和地位

(1) 探索生命活动的结构基础

(2) 为某些学说的建立提供形态基础

如 :神经元学说 ,肌丝滑动学说

(3) 在生命科学研究中的地位逐渐上升

(4) 与机能学研究相辅相成

Nobelprize 1906

1. 形态学研究思路和方法

1.3 形态学研究的思路

(1) 水平：

大体观测 (器官 )—立体显微镜 (组织 )-- 光镜(细

胞 )—电镜 (亚细胞 )-- 扫描探针显微镜 (分子和原

子 )

(2) 对象：活体—离体培养

—固定组织

(3) 方法 :

1. 形态学研究思路和方法

选用形态学方法时的基本思考：

•研究目的

•有无必要

•选用何种方法

•有无条件

•高质量照片

•结合其他资料分析

•注意人工假象 ( 预成论 ,凤汉小体… )

1. 形态学研究思路和方法

1.4 形态学研究的方法

(1) 普通光镜术：

•常规方法 :固定—切片 --染色 (H-E)

•特殊染色 :

1. 形态学研究思路和方法

(2) 特殊光镜术：

•荧光显微镜

•相差显微镜

1. 形态学研究思路和方法

•暗视野显微镜 •激光共聚焦扫描显微镜

1. 形态学研究思路和方法

(3) 电镜术：

•透射电镜术 •扫描电镜术 •冷冻蚀刻术

1. 形态学研究思路和方法

(4) 组织 (细胞 )化学术：

糖 ,脂类 .蛋白 ,核酸 ,酶等

1. 形态学研究思路和方法

(5) 放射自显影术：

1. 形态学研究思路和方法

(6) 免疫组织 (细胞 )化学术：

PAP,ABC,SP

1. 形态学研究思路和方法

(7) 原位杂交：

•探针 :DNA,RNA,ODN

•标记物 :

放射性核素

非放射性

•显示 : 放射自显影

免疫组化

荧光

1. 形态学研究思路和方法

(8) 细胞培养术：

1. 形态学研究思路和方法

(9) 活体与活细胞染色：

1. 形态学研究思路和方法

(10) 形态研究的定量术：

•形态计量术 (体视学 )

•显微分光光度术

•图像分析术

•流式细胞术

2. 免疫组化方法进展

2.1 EPOS 法 (enhanced polymer one step method)

原理：酶 (HRP)+ 惰性聚合物 (葡聚糖 )→酶标聚合物

+ AB1 → 酶 -聚合物 -AB1

方法：酶 -聚合物 -AB1→显色。变法： (rapid microwave one step method,RAMOS) 加酶 -聚合物 -AB1→盖玻片

→微波炉→显色

2. 免疫组化方法进展

特点：只有 1步，特异性强； 敏感性高（ 70 mole 酶 /1 mole 聚合物）； 简便、快速 ; 适用于石蜡、冰冻切片，细胞涂 片等。 RAMOS 法还有： 试剂用量少，成本低； 无脱片现象； 无边缘现象，染色均匀。

2. 免疫组化方法进展

2.2 EnVision 法

原理：酶 (HRP)+ 惰性聚合物 (葡聚糖 )→酶标聚合物 + AB2 → AB2- 聚合物 -酶 (含 100个酶、 15个 Ab2分子 )

方法： AB1→ AB2- 聚合物 -酶→显色

2. 免疫组化方法进展

特点： 敏感性高 ; 背景低（体内无葡聚糖） ; 孵育时间短（ 37℃, 15

min ） ,适用于术中 病理诊断 ; Ab1最好用单抗，浓 度可大一点

2. 免疫组化方法进展

2. 免疫组化方法进展

2.3 CSA 法 (catalyzed signal amplification)原理：基本方法为 SP法 加用生物素标记酪胺 HRP催化酪胺使之沉积在 Ag-Ab结合位点

2. 免疫组化方法进展方法： AB1 → AB2-Bio → SA-HRP → 酪胺 -Bio →

SA-HRP → 显色

优点：敏感性高 ; Ab1稀释度高，背景染色低 ; 省时 ; 适用于信号弱的组织（戊二醛固定） ; 第 2次用的 SA亦可用荧光素、胶体金、 AKP 标记 ; 也可用于放大原位杂交信号 .

3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR

3.1 原位 PCR

定义：将 PCR 的高效扩增与 ISH 的细胞定位相结合，在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定 DNA或 RNA序列，同时对含靶序列的组织细胞进行形态学分析。

分类：•原位 PCR ：以 DNA 为起始模板→ PCR扩增→检测扩增产物。又分直接法和间接法•原位反转录 PCR ：以 mRNA 为起始物→反转录成 cDNA→以 cDAN 为模板行 PCR扩增→检测扩增产物。•原位再生式序列复制反应：以 mRNA 为模板直接扩增RNA靶序列。

3.2 直接法原位 PCR

特点： PCR扩增时用标记 dNTP或引物 ,使扩增产物直接

标记

标记物：常用同位素、生物素、地高辛

操作程序：

组织细胞制备：固定、预处理

原位扩增：引物 , TaqDNA 聚合酶 ,标记 dNTP

扩增产物检测：放射自显影， ICC

3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR

评价：

优点：操作简便、流程短、省时 缺点：特异性差，假阳性率高（固定、包埋、制片等使

标本内 DNA受损， DNA修复时，标记 dNTP 进入非靶

序列；引物与模板的错配）

扩增效率低 不适用于切片标本（切片比细胞标本 DNA受损重）

3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR

3.3 间接法原位 PCR

特点： PCR 体系中 dNTP 和引物均不标记

PCR扩增结束后用标记探针行原位杂交

标记物：以生物素、地高辛较为常用

操作程序：

组织细胞制备：固定、预处理

渗入和原位扩增：dNTP，引物 , Taq DNA 聚合酶

扩增产物检测：ICC

原位杂交： 用特异性标记探针

3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR

评价：目前最常用

优点：扩增效率高 特异性强（杂交探针特异性结合靶序列，不与扩增

产物中的非靶序列结合）

可用于细胞制备和石蜡切片标本

缺点：操作复杂

3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR

举例：石蜡切片， Dig标记标本制备： 10%福马林固定，石蜡切片 5 m。预处理：①脱蜡至水 ;

②0.2mol/L HCl， 10’;

③5 g/ml 蛋白酶 K 37 10’; ℃④RNase消化 37 30’; ℃⑤Alc脱水干燥。原位扩增：①PCR扩增反应液 30 l，加盖片封边 ;

②PCR热循环： 94 1’℃ ， 55 1’℃ ， 72 1.5’℃ ， 25-30个循环， 72℃延伸 10’； ③去盖片， 4% 多聚甲醛后固定 10’；

④ Alc脱水干燥。原位杂交： ①Dig 标记探针， 98 ℃变性 10’， -20 ℃退火 5’， 42 ℃杂交过夜；②洗涤： 2×SSC 10’ ×3， 1×SSC 10’ ×3，缓冲液洗 10’ ×3；③AKP-Dig-Ab， 37 ℃， 2h;

④BCIP/NBT 显色；⑤脱水、透明、封固。

3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR

3.4 原位 RT-PCR

原理： 逆转录酶 mRNA 为模板 cDNA Taq聚合酶 cDNA 为模板 扩增产物 直接（直接法）或原位杂交（间接法）检测扩增产物

注意：标本先以 DNase处理过夜，破坏 DNA

反转录条件 42℃,30’-60’反转录后加热 90℃以上灭活逆转录酶

3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR

程序：

组织细胞制备： 10% 福马林固定。

预处理： DNase消化过夜；蛋白酶 K消化（ 54℃,20’）；95℃,3’灭活蛋白酶 K。

逆转录反应：反应液含逆转录酶、引物、 dNTPs，并有 RNase抑制剂 ,42℃,30’-60’。 95℃10’灭活逆转录酶。

PCR扩增：加 Taq聚合酶、引物、 dNTPs扩增；扩增后烤 80℃, 15’-30’。

原位杂交：原位杂交后或直接用 ICC 检测扩增产物。

3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR

3.5 原位再生式序列复制反应 ( 原位 3SR反应 )

原理：直接进行 RNA扩增，检测细胞内低拷贝 mRNA特点： 3种工具酶： AMV逆转录酶、 RNase H 、 T7RNA 聚合酶

引物 5’端有 T7RNA 聚合酶启动子

扩增反应 42℃， 2h，不需热循环程序：细胞固定、脱水干燥； 制备 5’端含 T7启动子的引物； PCR制备标记探针（ Dig-11-dUTP ）； 原位扩增（反应液含引物、 dNTPs 、 3种酶等）； 原位杂交（加探针 95℃变性 10’， 40℃杂交过夜，显色 ）

3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR

3.6 原位 PCR 的对照试验

已知阳性、阴性对照试验

省去或用无关引物替代特异性引物

标本用 DNase或 RNase 预处理

直接、间接原位 PCR 中省去 DNA 聚合酶

原位 RT-PCR 和原位 3SR反应中省去逆转录酶

3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR

3.7 原位 PCR 的应用

检测内源性基因

固有基因定位 --最敏感，低拷贝

异常及变异基因 -- 与遗传性疾病的研究

检测外源性基因

感染（病毒、细菌）基因 --诊断

转基因，基因治疗 -- 基因定位、有无突变

3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR

3.8 原位 PCR存在问题及对策 敏感性：在细胞制备高 (单拷贝 )；在切片标本低，扩增效率低

特异性：间接法高，直接法低（假阳性）

原位扩增时采用热启动 PCR或套式 PCR可提高特异性

引物延伸时掺入 Bio-dNTPs→合成的新链体积大→不

易扩散

用针对同一靶序列不同片段的多对引物扩增→多个不

同长度扩增产物重叠交织→不易扩散，且敏感性提高

复杂性：需规范操作，需对照试验，需简化操作

定量分析：尚不成熟

3. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位 PCR

4.1 免疫 PCR概述：利用细胞工程和基因工程技术，将 Ag-Ab 反 应的特异性与 PCR 的敏感性结合，用以检测 Ag分子。原理：用一中介分子同时结合 DNA 和 Ab ， Ab与 Ag特异性 结合， DNA 用特异引物行 PCR扩增，通过显示扩增产 物对 Ag进行定性和定量。与 ELISA比较：本质为 ELISA，但 作用于底物的酶被结合于 Ab的标记 DNA 分子取代； 酶标显色被 PCR扩增取代。优点：敏感性提高近 1万倍，可检测含量极低的 Ag 。

4. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位免疫 PCR

4.2 中介分子的种类 蛋白 A(PA) 与链霉亲和素 (SA)嵌合分子： 利用基因工程表达的嵌合分子 PA可结合 IgG Fc段， SA可结合生物素化 DNA; 假阳性 :PA可能与标本和血清中残留 Ig结合 抗体只能是 IgG分子(Ab-Bio)-SA-(Bio-DNA) ： 将抗体和一段核苷酸分别生物素化，再以 SA连接二者 抗体结合 Ag ，核酸用引物 PCR扩增单链抗体 -SA融合蛋白： 利用基因工程将 McAb的重链和轻链连接成单链，再与 SA连接→ 单链抗体 -SA

4. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位免疫 PCR

4.3 原位免疫 PCR原理：将 PCR 与免疫组化结合，在组织细胞原位检测抗原 :

中介分子连接 Ag-Ab 复合物和标记 DNA→Ag-Ab-DNA复合物→

PCR扩增 DNA→检测扩增产物→间接证明 Ag 存在

4. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位免疫 PCR

方法：石蜡切片脱蜡至水；

0.3%双氧水 -甲醇 20’；

3 mol/L尿素 30’；

10%小牛血清 37℃ 30’;

Ab1 37℃ 1-2h; PBS洗 ;

生物素化 Ab2 37℃1h; PBS洗 ;

SA 1:100, 1h;

生物素化 DNA （ 20ng/片） 37℃1h;

PBS洗后行原位 PCR扩增 (25l反应液加引物 , dNTPs, Bio-dUTP, Taq 酶等 )；

ABC 法呈色，复染、封片。

4. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位免疫 PCR

增加敏感性： 用放射性同位素、荧光素、酶标记物掺入 PCR产物 改变 Ab和中介连接物浓度 控制 PCR循环周期数、改进 PCR产物检测方法注意事项： 防止非特异性：外源性 DNA 和引物应与被检材料固有及外来基 因无互补序列 用尿素或微波替代蛋白酶消化：防止残存酶对 Taq酶的降解 充分洗涤：去除非特异结合 设立阳性、阴性对照

4. 基于 PCR 的原位检测技术 -原位免疫 PCR

5. 引物介导的原位标记技术

5.1 原理 (primed in situ labelling, PRINS)寡核苷酸引物或变性 DNA 片段与标本上靶 DNA互补复性在聚合酶作用下单次延伸（用标记 dUTP ），新合成 DNA即带有标记物，检测。

组织细胞制备：固定、预处理

复性与延伸：引物 , dNTP(含标记 dUTP)， Taq DNA 聚合酶

检测：荧光显微镜或 ICC

5. 引物介导的原位标记技术

5.2 方法5.2.1 染色体标本① 新鲜组织块胰酶消化成单细 胞，制备间期核或染色体 ;

② Alc脱水，空气干燥； ③ 94℃加热，并加上 50 l PCR

反应液 (含引物 , Bio-11-dUTP,

dNTP, Taq 酶 ), 加盖片 , 5 min;

④ 65℃湿盒 5’, 0.1×SSC 65℃洗 片 5 min;

⑤ 65℃干燥 10-20”, EDTA 5 min

终 止反应；

⑥ 4× SSC 含 0.1%吐温 20 42℃ 洗片 5 min,2次 ;

⑦ 30%BSA封闭 20 min;

⑧ FITC-亲合素或 CY5-亲合素 37 30’; ℃

⑨ SSC (4× 42 5 min 2℃ 次 ,

2×5 min)洗片 ;

⑩ 复染，甘油封片 ; 荧光显微镜 观察。

5. 引物介导的原位标记技术

5.2.2 石蜡切片① 脱蜡至水 ;

② 0.2mol/L HCl， 5’;

③ 25 g/ml 蛋白酶 K 37 15’; ℃ ④ Alc脱水干燥； ⑤ PCR反应液 25 l (含引物 ,

dNTP, Dig-11-dUTP, Taq 酶 ),

加盖片 , 94℃变性 5 min, 65℃湿 盒 5 min;

⑥ SSC洗 (0.1× 65 5 min, 4× ℃ 42 5min,2℃ 次 );

⑦ 20%羊血清封闭 30 min;

⑧ 地高辛抗体复合物 , RT 2h;

⑨ 洗后用 BCIP/NTB 显色 1-2h;

⑩ 中性红复染，封片。

结果：阳性信号蓝紫色， 背景细胞核红色

5. 引物介导的原位标记技术

5.3 对照试验•阳性对照：已知阳性细胞或组织；•阴性对照： 不加标记的 dUTP; 不加引物； 不加 Taq聚合酶

5. 引物介导的原位标记技术

5.4 评价•快速（扩增只需 5～ 10 min，全程只需 1～ 3h ）；•简便（ Taq酶驱动的单次延伸，只需特异性引物，不需探针）；•特异性高（避免原位 PCR 中标本上受损 DNA修复引起的非特异

性延伸和扩增，特异片段延伸和信号显示强而稳定）；•既可用于细胞和染色体标本，也可用于组织切片；•可使用 Dig-11-dUTP，代替荧光标记，可用普通显微 镜，便于推广和避免荧光褪色。